CN110894242B - 重组cl7-cvn蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

重组cl7-cvn蛋白及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组CL7‑CVN蛋白及其制备方法与应用。重组CL7‑CVN蛋白制备方法包括：将其编码序列克隆到表达载体上，得到重组表达载体；将重组表达载体转化到宿主细胞中进行表达和纯化，得到重组CL7‑CVN蛋白。本发明通过合成的CVN基因和基因组装方法，构建了融合表达载体，实现其在大肠杆菌中的高效可溶性表达；根据重组CL7‑CVN蛋白的耐热性，通过热处理及3C蛋白酶酶切，可通过一步亲和层析快速得到重组CL7‑CVN蛋白和CVN蛋白，纯度可达99％。本发明提供的制备方法可使重组蛋白表达量显著提高、活性更稳定、纯化方法更简单；本发明制备的重组CL7‑CVN蛋白和CVN蛋白都具备抗病毒活性。

Description

重组CL7-CVN蛋白及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于重组基因蛋白药物技术领域，具体涉及一种重组CL7-CVN蛋白及其制备方法与应用。
背景技术
蓝藻抗病毒蛋白(Cyanovirin-N，CVN)是一种从蓝藻中分离得到的一种水溶性糖蛋白，其独特的抗病毒活性最初是在一项抗人类免疫缺陷病毒(HIV)天然药物筛选计划中发现的，后来的研究表明其具有广泛的抗囊膜病毒作用，能抑制流感病毒、埃博拉病毒、疱疹病毒和丙型肝炎病毒对宿主细胞的感染，同时具有稳定的理化特性，能抵抗变性剂、去垢剂和有机溶剂的处理。CVN与病毒表面糖蛋白上甘露寡糖有高亲合性，它能阻止宿主细胞表面受体与病毒的结合，阻止了病毒的传播，这一特点使它可以不受病毒变异的干扰，这使得CVN蛋白成为一种很有价值的抗病毒药物。
CVN蛋白分子量11kDa，且分子中有2个二硫键，使得该蛋白在大肠杆菌中表达困难。早在CVN发现之初，CVN的重组表达研究就已经开始，目前已在大肠杆菌、酵母菌和植物细胞中表达成功，但这些重组表达方法存在表达产量低、易形成包涵体蛋白且复性困难、易形成无活性的二聚体形式、融合表达出现氨基酸缺失、纯化方法复杂等缺点。
为了解决以上问题，本发明构建了CL7蛋白融合表达体系，这样以CL7融合蛋白的形式在大肠杆菌细胞质中，以可溶形式高效表达，融合的重组CL7-CVN蛋白有完全生物学活性，表明重组CL7-CVN蛋白在胞质中能正确折叠，并且重组稳定性更好(100℃超过2h，鸡血清中半衰期超过30h)，避免了纯化时对重组蛋白进行变性、复性等复杂操作，同时为后处理带来方便，更适于放大生产。
伪狂犬病(Pseudorabies)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的猪和多种家畜共患的一种急性，热性传染病。PRV主要感染猪，能够导致仔猪的高死亡率和种猪繁殖障碍，对养猪业危害极大。本发明进一步探讨了获得的重组CL7-CVN对伪狂犬病病毒的抗毒活性，结果表明，本发明提供的重组CL7-CVN具备作为抗伪狂犬病病毒药物的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种重组蓝藻抗病毒蛋白的编码序列，同时通过所述编码序列得到一种重组CL7-CVN蛋白，并进一步提供所述重组蓝藻抗病毒蛋白的应用，其技术方案如下：
一种重组CL7-CVN蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
一种包含编码所述重组CL7-CVN蛋白的核苷酸序列的重组CL7-CVN蛋白表达载体。
一种包含所述重组CL7-CVN蛋白表达载体的宿主细胞。
一种重组CL7-CVN蛋白的制备方法，通过将编码所述重组CL7-CVN蛋白的核苷酸序列克隆到表达载体上，得到重组表达载体；将所述重组载体转化到宿主细胞中进行表达，分离纯化，得到所述重组CL7-CVN蛋白。
一种CVN蛋白的制备方法，通过将编码所述重组CL7-CVN蛋白的核苷酸序列克隆到表达载体上，得到重组表达载体；将所述重组载体转化到宿主细胞中进行表达，分离纯化，得到所述CVN蛋白，所述分离纯化过程中包括用3C蛋白酶和3C酶切缓冲液洗涤并重悬镍柱的处理步骤。
一种所述重组CL7-CVN蛋白和所述CVN蛋白在制备预防或治疗抗病毒耐热性药物中的应用，所述的病毒为伪狂犬病病毒或艾滋病毒。
本发明提供的技术方案至少包括以下有益效果：
1、本发明利用突变体CL7蛋白具有促进重组蛋白可溶性表达和热稳定性高的特点，将CVN的编码序列通过密码子优化合成CVN基因，结合突变体CL7基因，同时融合His和3C标签，通过分子设计及优化构建了CL7-linker-His-3C-CVN重组融合表达体系，并实现重组CL7-CVN蛋白在大肠杆菌中可溶性表达。
2、利用表达重组CL7-CVN蛋白具备较高的热稳定性，通过水浴热处理简化对表达后重组CL7-CVN蛋白的纯化；同时融合His和3C标签，可以通过一步亲和纯化得到重组CL7-CVN蛋白和CVN蛋白，使得纯化效率更高，纯度高达99％。
3、本发明制备的重组CL7-CVN蛋白和CVN蛋白都具备抗伪狂犬病毒活性，处理浓度为0.5u-1uM时，抗病毒效果最好。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明提供的融合表达体系CL7-linker-His-3C-CVN结构示意图；
图2为本发明提供的重组CL7-CVN蛋白和CVN蛋白的制备流程图；
图3为本发明提供的线性载体和目的基因片段PCR扩增结果电泳图(SDS-PAGE)：图中1、2泳道分别为原始载体pET28a、PCR扩增得到的线性载体pET28a；3、4泳道分别为PCR扩增得到CL7-linker-His、3C-CVN线性片段，M泳道为DL5000 marker；
图4为本发明提供的转化后大肠杆菌DH5a菌落的PCR鉴定结果电泳图(SDS-PAGE)：1泳道为原始载体PCR对照；2、3、4、5泳道分别为不同菌落的PCR鉴定结果；M泳道为DL5000marker；
图5为本发明提供的转化后质粒鉴定结果电泳图(SDS-PAGE)：1泳道为PCR扩增得到的线性pET28a载体；2、3、4、5泳道分别为不同菌落的质粒鉴定结果；M泳道为DL5000marker；
图6为本发明提供的37℃条件下pET28a、pET28a-CVN、pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN三种表达载体诱导表达结果电泳图(SDS-PAGE)：1、2、3泳道分别为pET28a诱导的全蛋白、上清蛋白、沉淀蛋白；4、5、6泳道分别为pET28a-CVN诱导的全蛋白、上清蛋白、沉淀蛋白；7、8、9泳道分别为pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN诱导的全蛋白、上清蛋白、沉淀蛋白；M泳道为蛋白marker；
图7为本发明提供的表达载体pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN在不同温度条件下1mM IPTG诱导表达结果电泳图(SDS-PAGE)：1、2、3泳道分别为18℃自诱导的全蛋白、上清蛋白、沉淀蛋白；4、5、6泳道分别为28℃自诱导的全蛋白、上清蛋白、沉淀蛋白；7、8、9泳道分别为37℃自诱导的全蛋白、上清蛋白、沉淀蛋白；M泳道为蛋白marker；
图8为本发明提供的表达载体pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN不同浓度IPTG条件下18℃诱导表达结果电泳图(SDS-PAGE)：1、2、3泳道分别为0.25mM/LIPTG诱导的全蛋白、上清蛋白、沉淀蛋白；4、5、6泳道分别为0.5mM/LIPTG诱导的全蛋白、上清蛋白、沉淀蛋白；7、8、9泳道分别为1mM/LIPTG诱导的全蛋白、上清蛋白、沉淀蛋白；M泳道为蛋白marker；
图9为本发明提供的表达载体pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN在18℃、1mM/LIPTG条件下诱导不同时间表达结果电泳图(SDS-PAGE)：1、2、3泳道分别为诱导12h的全蛋白、上清蛋白、沉淀蛋白；4、5、6泳道分别为诱导16h的全蛋白、上清蛋白、沉淀蛋白；7、8、9泳道分别为诱导20h的全蛋白、上清蛋白、沉淀蛋白；M泳道为蛋白marker；
图10为本发明提供的重组CL7-CVN蛋白的热稳定性图(SDS-PAGE)；A为90℃处理组，1泳道为破菌上清蛋白，2-9泳道分别为15、30、45、60、75、90、105、120min、B)中的1泳道为破菌上清蛋白；B为100℃处理组，1泳道为破菌上清蛋白，2-9泳道分别为处理15、30、45、60、75、90、105、120min；M泳道为蛋白marker；
图11为本发明提供的重组CL7-CVN蛋白在鸡血清中稳定性图(Western blot)：图11A为等摩尔CVN蛋白和CL7-CVN蛋白在鸡血清中孵育不同时间的Western blot检测图；图11B图等摩尔CVN蛋白和CL7-CVN蛋白在鸡血清中孵育不同时间相对含量图；
图12为本发明提供的重组CL7-CVN蛋白的纯化电泳图(SDS-PAGE)：1泳道为破菌上清；2泳道为80℃水浴处理30min后的蛋白上清液；3泳道为镍柱结合后流穿液；4泳道为200mM咪唑缓冲液洗脱液；M泳道为蛋白marker；
图13为本发明提供的CVN蛋白的酶切释放图(Tricine-SDS-PAGE)：1泳道为加入3C蛋白酶的镍柱重悬液；2泳道为加3C蛋白酶酶切后的镍柱重悬液；3泳道为3C蛋白酶酶切后的流穿液；4泳道为3C酶切缓冲液洗脱液；5，6泳道为1MNaCl洗脱液；M泳道为蛋白marker；
图14为本发明提供的重组CL7-CVN蛋白和CVN蛋白处理PRV(GFP标记)后病毒感染复制结果(荧光显微镜观察结果)；
图15为本发明提供的重组CL7-CVN蛋白和CVN蛋白处理PRV(GFP标记)病毒后细胞的病变形态(显微镜观察结果)；
图16为本发明提供的病毒mRNA相对表达量实验测定结果：1uM的重组CL7-CVN蛋白、CVN蛋白、CL7蛋白分别处理病毒，病毒感染细胞后病毒mRNA相对表达量；
图17为本发明提供的病毒TCID50测定实验结果：不同浓度(0、0.25、0.5、1、2uM)的重组CL7-CVN蛋白和CVN蛋白处理病毒，病毒感染细胞后测定病毒的感染性滴度结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明实施例涉及的主要材料如下：大肠杆菌Rosetta(DE3)(Merck公司)、pET28a质粒(Merck公司)、pET23a质粒(Merck公司)，由本室保存；3C蛋白酶、PfuDNA聚合酶由本实验室表达纯化，T5核酸外切酶购自NEB公司，超低分子蛋白质分子量标准蛋白购自博士德公司、引物购自上海生工生物公司；伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)、PK15细胞由华中农业大学赠予本实验室保存，PBS缓冲液(8mM Na2HPO4,136mM NaCl,2mM KH2PO4,2.6mMKCL)，咪唑缓冲液(5-200mM imidazole,40mM NaH2PO4,300mMNaCl)，1M IPTG溶液，3C酶切缓冲液(25mM Tris-HCl,pH 7.0,150mM NaCl,0.5mM EDTA,and 1mM DTT)。
实施例1重组CL7-CVN蛋白原核表达载体的构建
1、第一PCR扩增：通过定点突变得到突变体CL7基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，突变体蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)；
以pET23a-CL7质粒为模板，如SEQ ID NO:6所示的F1和如SEQ ID NO:7所示的R1为引物同时引入linker、His及末端同源序列，进行PCR扩增，得到CL7-linker-His线性片段，参见图3中3泳道；根据gene bank公布的CVN基因序列，进行密码子优化设计合成CVN基因，并以构建的pET28a-CVN载体为模板，以如SEQ ID NO:8所示的F2和如SEQ ID NO:9所示的R2为引物，同时引入3C及末端同源序列，进行PCR扩增，得到3C-CVN线性片段，参见图3中4泳道。引物设计如下：
F1:5’-AGAAGGAGATATACCATGGGCAGCAAAAGCA-3’，如SEQ ID NO:6所示；
R1:5’-GTGATGGTGATGACTGCCCCCTCCACCGCTCCCTCCGCCACCGCCTTCAATATCAATGTT-3’，如SEQ ID NO:7所示；
F2:5’-AGTCATCACCATCACCATCACTTGGAGGTTTTGTTCCAGGGTCCACTTGGTAAATTCTCCC-3’，如SEQ ID NO:8所示；
R2:5’-CGGATCCTCGAGTCATTCGTATTTTAGTGTACCGTCT-3’，如SEQ ID NO:9所示。
2、第二PCR扩增：以实验室保存的pET28a质粒为模板，F3/R3为引物进行载体PCR扩增，获得pET28a载体的线性片段，结果见图3中2泳道，引物设计如下：
F3:5’-TGACTCGAGGATCCGGCTGCT-3’，如SEQ ID NO:10所示；
R3:5’-GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAA-3’，如SEQ ID NO:11所示。
3、将所述第一PCR扩增和所述第二PCR扩增获得的CL7-linker-His、3C-CVN和pET28a载体的三个线性片段用T5核酸外切酶在冰水浴中进行同源末端消化5min，产物进行常规转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取单菌落培养进行菌液PCR(图4)和质粒鉴定(图5)，筛选阳性克隆，以得到pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN的重组质粒，CL7-linker-His-3C-CVN的融合基因序列如SEQ ID NO:2，图4中3泳道为PCR鉴定的阳性克隆，图5中3泳道为质粒鉴定的pET28a-CL7-CVN的阳性重组质粒。
上述引物中，F1(5’端的AGAAGGAGATATACC)和R3(5’端的GGTATATCTCCTTCT)为同源序列，F2(5’端的AGTCATCACCATCAC)和R1(5’端的GTGATGGTGATGACT)为同源序列，F3(5’端的TGACTCGAGGATCCG)和R2(5’端的CGGATCCTCGAGTCA)为同源序列，经过第一PCR扩增和第二PCR扩增得到的三个片段，通过T5核酸外切酶进行同源末端消化，在大肠杆菌DH5a感受态细胞内进行重组结合成环状，构建表达载体。
实施例2重组CL7-CVN蛋白的诱导表达及表达条件优化
将实施例1中构建的重组质粒pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN、空载质粒pET28a、对照质粒pET28a-CVN分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，获得表达菌株。将表达菌株接种于6ml含卡那霉素的液体LB培养基中，在37℃，220rpm摇床上培养，至OD600值为0.6时，加入诱导物IPTG，分别于37℃摇床220rpm继续诱导培养，通过SDS-PAGE电泳方法检测重组蛋白表达，结果见图6，诱导后的pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)在28kDa左右处出现明显目的条带，与预期大小一致，并且表达蛋白可溶；同时无CL7标签的对照组pET28a-CVN在11kDa左右处出现目的条带，但是绝大部分蛋白不可溶；空载体pET28a，无明显表达条带。结果表明重组CL7-linker-His-3C-CVN能在大肠杆菌中能高效可溶性表达。
将pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN表达菌株分别接种于6ml含卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养至OD600值为0.6时，分别加入终浓度1mM/L IPTG，于18℃、28℃、37℃摇床220rpm诱导离心收集菌体，PBS缓冲液重悬，超声破菌，制备蛋白样品，通过SDS-PAGE电泳方法检测重组蛋白表达，结果见图7，表明在18℃诱导条件最优。
将pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN表达菌株分别接种于6ml含卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养至OD600值为0.6时，分别加入终浓度0.25mM/L、0.5mM/L、1mM/L IPTG，于18℃摇床220rpm诱导20h后离心收集菌体，PBS缓冲液重悬，超声破菌，制备蛋白样品，通过SDS-PAGE电泳方法检测重组蛋白表达，结果见图8，表明0.5mM/L IPTG诱导条件最优。
将pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN表达菌株分别接种于6ml含卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养至OD600值为0.6时，分别加入终浓度0.5mM/L IPTG，于18℃摇床分别诱导12h、16h、20h后收集菌体，PBS缓冲液重悬，超声破菌，制备蛋白样品，通过SDS-PAGE电泳方法检测重组蛋白表达，结果见图9，表明诱导16h最优。
本实施例的实验结果表明，重组表达载体pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的最优诱导表达条件为：温度18℃，0.5mM/L IPTG，诱导时间16h。
实施例3重组CL7-CVN蛋白的稳定性研究
将pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN表达菌株分别接种于200ml含卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养至OD600值为0.6时，加入终浓度1mM/LIPTG，于18℃摇床分别诱导20h后收集菌体；用20ml裂解液重悬菌体，超声破菌，离心收集上清；分别取500ul上清于EP管中，分别在90℃，100℃，水浴15min、30min、45min、60min、75min、90min、105min、120min，离心收集上清，制备蛋白样品，通过SDS-PAGE电泳方法检测重组蛋白稳定性。结果见图10(A、B)，经过90℃，100℃高温处理2h后，大部分杂蛋白变性，而重组CL7-CVN蛋白仍然结构完整，说明重组CL7-CVN蛋白热稳定性好，便于后期蛋白纯化。
为了进一步探究重组蛋白的稳定性，将等摩尔的CVN蛋白和重组CL7-CVN蛋白与等体积鸡血清混合，分别在37℃孵育0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、30h后，Western blot分析重组蛋白活性。结果见图11(A、B)，在鸡血清中随着孵育时间的延长，有活性的目的蛋白有所减少，并且CVN蛋白在鸡血清中的半衰期超过24h，而重组CL7-CVN蛋白在鸡血清中的半衰期超过30h，表明重组CL7-CVN蛋白比CVN蛋白更稳定。
本实施例的实验结果表明，融合CL7标签提高了重组CL7-CVN蛋白稳定性，这对重组CL7-CVN蛋白的生产与应用具有重要意义。
实施例4重组CL7-CVN蛋白和CVN蛋白的纯化
重组CL7-CVN蛋白：
将pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN表达菌株分别接种于200ml含卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养至OD600值为0.6时，加入终浓度0.5mM/L IPTG，于18℃摇床分别诱导16h后离心收集菌体，用20mlPBS缓冲液重悬菌体，超声对菌体进行破碎处理，离心收集上清；收集的上清液于50ml离心管中80℃水浴加热30min，离心取上清；
湿法装柱1mlNi-NTA填料，使用10倍柱床体积纯水冲洗柱子，流速1.5ml/min；用5倍柱床体积PBS缓冲液平衡镍柱，1.5ml/min；
取热处理后的上清，0.45um滤膜过滤，过滤后的液体与Ni-NTA室温结合1h，过柱；用5倍柱床体积含5～30mM咪唑缓冲液洗涤2-3次；用200mM咪唑缓冲液洗脱重组CL7-CVN蛋白，收集洗脱液用PBS缓冲液超滤换液，得到重组CL7-CVN蛋白，纯化结果如图12，重组CL7-CVN蛋白经过80℃处理30min，纯度大于80％，再通过一步亲和纯化，纯度可达99％。
CVN蛋白：
将pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN表达菌株分别接种于200ml含卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养至OD600值为0.6时，加入终浓度0.5mM/L IPTG，于18℃摇床分别诱导16h后离心收集菌体，用20mlPBS缓冲液重悬菌体，超声对具体进行破碎处理，离心收集上清；收集的上清液于50ml离心管中80℃水浴加热30min，离心取上清；
湿法装柱1mlNi-NTA填料，使用10倍柱床体积纯水冲洗柱子，流速1.5ml/min；用5倍柱床体积裂解液平衡柱子，1.5ml/min；
将热处理后的上清液与镍柱结合，用5～30mM咪唑缓冲液洗涤镍柱，5倍柱床体积3C酶切缓冲液洗涤2-3次；用5倍柱床体积3C酶切缓冲液重悬Ni-NTA，加入3C蛋白酶室温酶切2h，CVN蛋白释放到流穿液中，而CL7和3C蛋白酶留在镍柱上；收集流穿液进行超滤换液，浓缩得到酶切释放的CVN蛋白，纯化结果如图13，CVN蛋白纯度可达99％。
实施例5重组CL7-CVN蛋白和CVN蛋白的抗PRV(GFP标记)病毒活性检测
200xTCID50的PRV病毒分别与实施例4制备的等摩尔的重组CL7-CVN蛋白、CVN蛋白，以及CL7蛋白充分混合后孵育2h，将孵育后的病毒感染PK-15细胞1h，更换新鲜培养基继续培养，分别在培养12h时用荧光显微镜观察细胞感染情况，结果见图14，重组CL7-CVN蛋白处理组和CVN蛋白处理组相对于对照组荧光强度强度明显减弱；根据绿色荧光强度及荧光分布状况，表明重组CL7-CVN蛋白和CVN蛋白明显抑制了PRV感染PK15细胞。
用同样的处理方法，细胞培养24h时，显微镜观察细胞病变形态，结果见图15，无重组CL7-CVN蛋白处理组和无CVN处理组，细胞绝大部分病变死亡，而重组CL7-CVN蛋白处理组、CVN处理组、无病毒处理组大部分细胞形态良好，结果表明，纯化制备的重组CL7-CVN蛋白与CVN蛋白都具备抗病毒活性。
实施例6重组CL7-CVN蛋白抗病毒活性RT-PCR分析
1)200xTCID50的PRV病毒分别与实施例4制备的等摩尔的重组CL7-CVN蛋白和CVN，以及CL7蛋白的充分混合后孵育2h；其中，CL7蛋白是通过pET23a-CL7为载体，转化大肠杆菌Rosetta(DE3)表达后纯化得到的；
2)将孵育后的病毒感染PK-15单层细胞，于37℃培养箱中吸附培养1h；
3)更换新鲜培养基继续培养；
4)培养24h后收集细胞，抽提总RNA，测定RNA浓度，反转录成cDNA，进行RT-PCR定量分析。
结果见图16，重组CL7-CVN蛋白和天然CVN处理组与对照组相比，mRNA相对表达量显著降低，说明制备的重组CL7-CVN蛋白与CVN蛋白一样能有效抑制PRV病毒感染PK15细胞，与实施例5结果一致。
实施例7重组CL7-CVN蛋白抗病毒活性病毒的感染性滴度检测分析
1)将实施例4制备的重组CL7-CVN蛋白、CVN蛋白分别与病毒共孵育，蛋白浓度分别为0、0.25、0.5、1、2uM，弃除六孔板中培养的PK15细胞的培养基，并用1mL PBS缓冲液清洗细胞2次，加入450ml无血清DMEM高糖培养基，把孵育好的蛋白与病毒加入六孔板中；
2)把六孔板放入37℃恒温培养箱中培养1h，每隔10min摇晃一次，使病毒能充分感染细胞；1h后弃去培养基，加入800uL的维持液(含血清2％)，放入37℃恒温培养箱中培养；30h后出现细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)，将细胞取出，放入-20℃冰箱，反复冻融三次，收集细胞液；
3)将T25瓶中生长密度为80％左右的PK15细胞消化后，用10mL高糖DMEM培养基重悬细胞并均匀铺在96孔板中；24h后，弃去96孔板中的培养基，用200mL的PBS缓冲液清洗两次；
4)取10支EP管，每孔加入900uL高糖DMEM培养基，向第一个管中加入100uL病毒原液，混合均匀。从第一管中取出混匀后的病毒稀释液100uL加入第二孔中，混合均匀，取100uL加入第三管中，混匀。逐步稀释至10-10，五个样品均做相同处理；
5)稀释后的病毒液加入96孔板中，把96孔板放入37℃恒温培养箱中培养1h，每隔十分钟摇晃一次，使病毒能充分感染细胞；
6)1h后弃去培养基，加入1mL的维持液(含血清2％)，放入37℃恒温培养箱中培养。放入37℃恒温培养箱中培养，30h后观察出现CPE孔数，记录并计算TCID50数值。
TICD测定结果见图17，重组CL7-CVN蛋白处理浓度为0.5u-1uM时，LgTCID50明显减少，此时抗病毒效果最好，进一步印证了实施例6的结论。
综上所述，本发明构建的重组CL7-CVN蛋白，在大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)中表达成功，并通过融合CL7标签蛋白实现其高效可溶性表达，同时CL7使得重组CL7-CVN蛋白具备强的热稳定性，有利于下游的分离纯化及工业化生产；克服了传统表达方法表达量低、易形成包涵体、结构折叠不完全、纯化工艺复杂等缺点；并且制备的重组CL7-CVN蛋白和CVN蛋白都具备抗伪狂犬病毒的活性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 重组CL7-CVN蛋白及其制备方法与应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Gly Ser Lys Ser Asn Glu Pro Gly Lys Ala Thr Gly Glu Gly Lys
1 5 10 15
Pro Val Asn Asn Lys Trp Leu Asn Asn Ala Gly Lys Asp Leu Gly Ser
20 25 30
Pro Val Pro Asp Arg Ile Ala Asn Lys Leu Arg Asp Lys Glu Phe Glu
35 40 45
Ser Phe Asp Asp Phe Arg Glu Thr Phe Trp Glu Glu Val Ser Lys Asp
50 55 60
Pro Glu Leu Ser Lys Gln Phe Ser Arg Asn Asn Asn Asp Arg Met Lys
65 70 75 80
Val Gly Lys Ala Pro Lys Thr Arg Thr Gln Asp Val Ser Gly Lys Arg
85 90 95
Thr Ser Phe Glu Leu Asn His Gln Lys Pro Ile Glu Gln Asn Gly Gly
100 105 110
Val Tyr Asp Met Asp Asn Ile Ser Val Val Thr Pro Lys Arg Asn Ile
115 120 125
Asp Ile Glu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His His
130 135 140
His His His His Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Leu Gly Lys Phe
145 150 155 160
Ser Gln Thr Cys Tyr Asn Ser Ala Ile Gln Gly Ser Val Leu Thr Ser
165 170 175
Thr Cys Glu Arg Thr Asn Gly Gly Tyr Asn Thr Ser Ser Ile Asp Leu
180 185 190
Asn Ser Val Ile Glu Asn Val Asp Gly Ser Leu Lys Trp Gln Pro Ser
195 200 205
Asn Phe Ile Glu Thr Cys Arg Asn Thr Gln Leu Ala Gly Ser Ser Glu
210 215 220
Leu Ala Ala Glu Cys Lys Thr Arg Ala Gln Gln Phe Val Ser Thr Lys
225 230 235 240
Ile Asn Leu Asp Asp His Ile Ala Asn Ile Asp Gly Thr Leu Lys Tyr
245 250 255
Glu
<210> 2
<211> 771
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgggcagca aaagcaatga accgggtaaa gcaaccggtg aaggtaaacc ggttaataac 60
aaatggctga acaatgccgg taaagatctg ggtagtccgg ttccggatcg tattgcaaat 120
aaactgcgtg ataaagaatt cgagagcttc gatgattttc gtgaaacctt ttgggaagaa 180
gttagcaaag atcctgaact gagcaaacag tttagccgca ataacaatga tcgtatgaaa 240
gttggtaaag caccgaaaac acgtacccag gatgttagcg gtaaacgtac ctcatttgaa 300
ctgaatcatc agaaaccgat tgaacagaat ggtggcgttt atgatatgga taacattagc 360
gttgttaccc cgaaacgcaa cattgatatt gaaggcggtg gcggagggag cggtggaggg 420
ggcagtcatc accatcacca tcacttggag gttttgttcc agggtccact tggtaaattc 480
tcccagacct gctacaactc cgctatccag ggttctgttc tgacctctac ctgcgaacgt 540
accaacggtg gttataacac ctcctctatc gacctgaact ccgttattga aaacgttgac 600
ggttctctga aatggcagcc atctaacttc atcgaaacct gccgtaacac ccagctggct 660
ggttcctctg aactggctgc tgaatgcaaa acccgtgctc agcagttcgt ttctaccaaa 720
atcaacctag acgaccatat agctaacata gacggtacac taaaatacga a 771
<210> 3
<211> 396
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgggcagca aaagcaatga accgggtaaa gcaaccggtg aaggtaaacc ggttaataac 60
aaatggctga acaatgccgg taaagatctg ggtagtccgg ttccggatcg tattgcaaat 120
aaactgcgtg ataaagaatt cgagagcttc gatgattttc gtgaaacctt ttgggaagaa 180
gttagcaaag atcctgaact gagcaaacag tttagccgca ataacaatga tcgtatgaaa 240
gttggtaaag caccgaaaac acgtacccag gatgttagcg gtaaacgtac ctcatttgaa 300
ctgaatcatc agaaaccgat tgaacagaat ggtggcgttt atgatatgga taacattagc 360
gttgttaccc cgaaacgcaa cattgatatt gaaggc 396
<210> 4
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Gly Ser Lys Ser Asn Glu Pro Gly Lys Ala Thr Gly Glu Gly Lys
1 5 10 15
Pro Val Asn Asn Lys Trp Leu Asn Asn Ala Gly Lys Asp Leu Gly Ser
20 25 30
Pro Val Pro Asp Arg Ile Ala Asn Lys Leu Arg Asp Lys Glu Phe Glu
35 40 45
Ser Phe Asp Asp Phe Arg Glu Thr Phe Trp Glu Glu Val Ser Lys Asp
50 55 60
Pro Glu Leu Ser Lys Gln Phe Ser Arg Asn Asn Asn Asp Arg Met Lys
65 70 75 80
Val Gly Lys Ala Pro Lys Thr Arg Thr Gln Asp Val Ser Gly Lys Arg
85 90 95
Thr Ser Phe Glu Leu Asn His Gln Lys Pro Ile Glu Gln Asn Gly Gly
100 105 110
Val Tyr Asp Met Asp Asn Ile Ser Val Val Thr Pro Lys Arg Asn Ile
115 120 125
Asp Ile Glu Gly
130
<210> 5
<211> 303
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cttggtaaat tctcccagac ctgctacaac tccgctatcc agggttctgt tctgacctct 60
acctgcgaac gtaccaacgg tggttataac acctcctcta tcgacctgaa ctccgttatt 120
gaaaacgttg acggttctct gaaatggcag ccatctaact tcatcgaaac ctgccgtaac 180
acccagctgg ctggttcctc tgaactggct gctgaatgca aaacccgtgc tcagcagttc 240
gtttctacca aaatcaacct agacgaccat atagctaaca tagacggtac actaaaatac 300
gaa 303
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agaaggagat ataccatggg cagcaaaagc a 31
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtgatggtga tgactgcccc ctccaccgct ccctccgcca ccgccttcaa tatcaatgtt 60
<210> 8
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agtcatcacc atcaccatca cttggaggtt ttgttccagg gtccacttgg taaattctcc 60
c 61
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cggatcctcg agtcattcgt attttagtgt accgtct 37
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgactcgagg atccggctgc t 21
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggtatatctc cttcttaaag ttaaacaaaa 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggtggcggag ggagcggtgg agggggcagt 30

Claims (10)

1.一种重组CL7-CVN蛋白，其特征在于，所述重组CL7-CVN蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
2.一种编码如权利要求1所述重组CL7-CVN蛋白的核酸，其特征在于，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种包含如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的重组CL7-CVN蛋白表达载体。
4.一种包含如权利要求3所述重组CL7-CVN蛋白表达载体的宿主细胞。
5.一种如权利要求2所述重组CL7-CVN蛋白的制备方法，其特征在于，通过将如SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列克隆到原始表达载体上，得到重组CL7-CVN蛋白表达载体；将所述重组CL7-CVN蛋白表达载体转化到宿主细胞中进行诱导表达，分离纯化，得到所述重组CL7-CVN蛋白。
6.根据权利要求5所述重组CL7-CVN蛋白的制备方法，其特征在于，所述重组CL7-CVN蛋白表达载体为pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN，其制备方法如下：
(1) 第一PCR扩增：以pET23a-CL7质粒为模板，如SEQ ID NO: 6所示的F1，如SEQ IDNO: 7所示的R1为引物，进行PCR扩增，得到CL7-linker-His线性片段；根据gene bank公布的CVN基因序列，进行密码子优化设计合成CVN基因，并以构建的pET28a-CVN载体为模板，以如SEQ ID NO: 8所示的F2和如SEQ ID NO: 9所示的R2为引物，同时引入3C及末端同源序列，进行PCR扩增，得到3C-CVN线性片段；
(2) 第二PCR扩增：以pET28a质粒为模板，如SEQ ID NO: 10所示的F3和如SEQ ID NO:11所示的R3为引物进行载体PCR扩增获得pET28a载体的线性片段；
(3) 将所述第一PCR扩增和所述第二PCR扩增获得的CL7-linker-His、3C-CVN和pET28a载体的三个线性片段用T5核酸外切酶进行同源末端消化，产物进行常规转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选，得到所述重组CL7-CVN蛋白表达载体pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN。
7.根据权利要求6所述重组CL7-CVN蛋白的制备方法，其特征在于，所述表达步骤为：将所述重组表达载体pET28a-CL7-linker-His-3C-CVN转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到表达菌株，将所述表达菌株接种于含卡那霉素的液体LB培养基中，培养至OD600值为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.25-1mM，18-37℃诱导表达12-20h。
8.根据权利要求7所述重组CL7-CVN蛋白的制备方法，其特征在于，所述分离纯化步骤为：离心收集诱导后的菌体，重悬后超声破碎，将破碎液离心后得到的上清液进行水浴热处理；再经离心处理，上清液与镍柱结合，依次用由低浓度到高浓度的咪唑缓冲液洗脱镍柱，收集高浓度的咪唑缓冲液，超滤浓缩后获得重组CL7-CVN蛋白。
9.一种CVN蛋白的制备方法，其特征在于，离心收集权利要求7诱导后的所述表达菌株菌体，重悬后超声破碎，将破碎液离心后得到的上清液进行水浴热处理；再经离心处理，上清液与镍柱结合，先用咪唑缓冲液洗脱镍柱，再用3C蛋白酶和3C蛋白酶切缓冲液洗涤并重悬镍柱，收集流穿液，超滤浓缩后获得所述CVN蛋白。
10.权利要求1-2、5-8任一项所述重组CL7-CVN蛋白、或权利要求9所述CVN蛋白在制备预防或治疗抗病毒耐热性药物中的应用，其特征在于，所述的病毒为伪狂犬病病毒。
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