CN111187353B - 一种高效表达PCV2Cap、PCV3Cap融合蛋白的方法 - Google Patents

一种高效表达PCV2Cap、PCV3Cap融合蛋白的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111187353B
CN111187353B CN202010052203.0A CN202010052203A CN111187353B CN 111187353 B CN111187353 B CN 111187353B CN 202010052203 A CN202010052203 A CN 202010052203A CN 111187353 B CN111187353 B CN 111187353B
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
pcv2cap
pcv3cap
recombinant
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010052203.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111187353A (zh
Inventor
李俊
王硕
吴晓燕
时建立
彭喆
李琛
徐绍建
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Original Assignee
Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS filed Critical Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Priority to CN202010052203.0A priority Critical patent/CN111187353B/zh
Priority to NL2025015A priority patent/NL2025015B1/en
Publication of CN111187353A publication Critical patent/CN111187353A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111187353B publication Critical patent/CN111187353B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

本发明提供了一种高效表达PCV2 Cap、PCV3 Cap融合蛋白的方法，首先构建高效表达PCV2Cap和PCV3Cap蛋白的重组杆状病毒：将截去核定位信号的PCV2Cap蛋白的核酸序列与PCV3Cap蛋白的核酸序连接，中间用一段疏水的柔性蛋白linker连接，在PCV2Cap和PCV3Cap序列的N端加入蜂素信号肽序列，促使其分泌表达。重组阳性杆状病毒感染sf9昆虫细胞表达的蛋白进行了多种翻译后修饰，接近于天然的病毒编码蛋白，具有较高的生物学活性，而且杆状病毒具有高度的种属特异性，仅感染昆虫细胞，对脊椎动物细胞无感染性，其表达产物安全可靠，经简单处理即可用于后续试验，比传统方式更加安全有效。

Description

一种高效表达PCV2Cap、PCV3Cap融合蛋白的方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种高效表达PCV2 Cap、PCV3 Cap融合蛋白的方法。
背景技术
猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）主要侵害断奶仔猪和育肥猪，可以引起多种猪圆环病毒相关性疾病，养猪业的健康发展带来巨大威胁。按照抗原性、致病性以及基因同源性的不同，将PCV划分成猪圆环病毒1型（Porcine circovirus 1，PCV1）、猪圆环病毒2型（Porcine circovirus 2，PCV2）以及猪圆环病毒3型（Porcine circovirus 2, PCV2）三种基因型。已知PCV1无致病性，而PCV2有较强的致病性，可引起多种猪圆环病毒相关性疾病（Porcine circovirus-as sociated diseases, PCVADs），其中最主要的是断奶仔猪多系统衰弱综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS），该病在我国乃至世界猪群中广泛存在，已成为一种常见病和多发病，且多与其它病原发生混合感染，给养猪业带来了巨大损失。PCV3 感染可引起猪的皮炎肾病综合征、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。患病母猪受孕率降低，流产率增加，生下不同胎龄的死胎、木乃伊胎；患病仔猪出现多器官系统的功能紊乱，严重影响全世界的生猪养殖业的发展。PCV2与PCV3 Cap蛋白氨基酸同源性仅为30%，两者间存在交叉免疫保护可能性较低，目前，仍没有可同时预防和控制PCV2与PCV3的疫苗和药物。因此研发一种安全有效的预防PCV2与PCV3的疫苗对预防和控制PCV的感染具有重要的意义。
目前，利用大肠杆菌优化密码子表达融合蛋白的方法较为常见。因具有培养条件简单经济、生长繁殖快速、基因改造工具及宿主种类多样等显著优势，一直作为外源蛋白表达的首选系统。但在很多实际应用过程中，其融合蛋白生产效率及产品质量随具体体系不同存在较大差异。有些体系中的蛋白表达效率低下，产物浓度低，收集和纯化困难，难以满足实际生产和应用需要；有些体系中外源蛋白虽然能高水平表达，但却形成大量无活性的包涵体，具有生物活性的可溶性蛋白有限，甚至完全检测不到活性表达，造成物质和能量的浪费。蛋白质的后续加工涉及到对无活性的包涵体蛋白进行体外复性、纯化等，但蛋白体外复性一方面增加了实际生产过程的复杂程度，另一方面其生产成本高、产量低，无法广泛地推广应用。
采用CHO细胞所生产PCV2 Cap-PCV3 Cap融合蛋白表达量高，但是也存在很多弊端。由于目前利用CHO细胞生产目的蛋白的技术水平尚不能满足生物药品的开发以及生产需求，在其上游生产中还存在诸多问题，例如：①某些糖基化表达产物不稳定、不易纯化；②重组CHO细胞上游构建与下游纯化脱节，主要表现在上游构建主要考虑其高效表达而对产物能否有效的提取出来即分离纯化考虑较少；③重组细胞培养费用昂贵。自动化水平低。目前采用CHO细胞生产PCV2 Cap-PCV3 Cap融合蛋白其表达量为0.8mg/mL，该产量是经过放大培养并优化培养条件、补料时间和补料量并经过亲和层析、生理盐水透析之后的最大产量，应用于疫苗生产中时仍存在表达量低、生产、纯化过程复杂等问题。虽然国内已有利用重组杆状病毒进行PCV2 ORF2基因的表达，表达量均在0.1-0.4mg/mL左右，重组蛋白表达量比较低成为进一步开发利用的障碍。
发明内容
针对目前PCV2 Cap-PCV3 Cap融合蛋白表达量低、纯化过程复杂等问题，本发明提供一种新的表达PCV2 Cap、PCV3 Cap融合蛋白的方法，病毒纯化和鉴定步骤简单，蛋白经过多种翻译后修饰，接近于天然的病毒编码蛋白，具有较高的生物学活性。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种PCV2 Cap、PCV3 Cap融合蛋白，包括截短PCV2 Cap蛋白段、接头序列（Linker）、PCV3 Cap蛋白段和蜂素信号肽区域。所述截短PCV2 Cap蛋白段为去除核定位信号的PCV2 Cap蛋白。
所述接头序列优选为疏水柔性肽链。所述接头序列如SEQ ID NO: 1所示。
一种上述融合蛋白的核酸序列。优选的，所述核酸序列包括如SEQ ID NO: 2所示的序列。
所述核酸序列还可以包括限制性内切酶的酶切位点。
一种包含上述核酸序列的载体、重组杆粒和重组杆状病毒。
优选的，所述核酸序列在载体、重组杆粒或重组杆状病毒中为双拷贝。
优选的，所述载体为pFastBacTM质粒；更优选为pFastBacTM Dual质粒。
一种上述载体、重组杆粒或重组杆状病毒用于表达PCV2 Cap、PCV3 Cap融合蛋白。
所述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
通过含上述核酸序列的载体转染含杆粒骨架的感受态细胞获得重组杆粒；重组杆粒转染昆虫宿主细胞，获得含重组杆状病毒的上清液；含重组杆状病毒的上清液接种昆虫宿主细胞，培养后获得上清液；上清液分离纯化后获得PCV2 Cap、PCV3 Cap融合蛋白。
所述昆虫宿主细胞选自Sf9细胞，Sf21细胞，Hi-5细胞或S2细胞。
所述接种的接种量为MOI为0.1-1.0，昆虫宿主细胞的密度为2.5×106个/mL，培养时间为接种后1-5天。
所述分离纯化可以选择常规的蛋白纯化方法，如离心、透析、超滤、亲和柱层析等，以去除细胞或细胞残体、杂蛋白、培养基成分等杂质。
具体的，包括以下步骤：
（1）将含有如SEQ ID NO: 2所示的序列插入pFastBacTM Dual质粒的两个启动子之后，获得重组质粒pFD-H-2Cap-3Cap；
（2）将重组质粒pFD-H-2Cap-3Cap转化进DH10Bac大肠杆菌感受态，筛选并提取获得重组杆粒rBacmid-H-2Cap-3Cap；
（3）将重组杆粒rBacmid-H-2Cap-3Cap转染昆虫宿主细胞，培养获得含重组杆状病毒rpFB-H-2Cap-3Cap的上清液；
（4）将步骤（3）的上清液接种昆虫宿主细胞培养后获得含有PCV2 Cap、PCV3 Cap融合蛋白的上清液，分离纯化后获得PCV2 Cap、PCV3 Cap融合蛋白。
一种上述融合蛋白在制备猪圆环病毒疫苗、抗体、抗原、检测试剂盒中的应用。
一种含有上述融合蛋白的猪圆环病毒疫苗。
本发明具有以下优点：
本发明构建了一株高效表达PCV2Cap蛋白和PCV3Cap蛋白的重组杆状病毒。昆虫杆状病毒表达系统不但能够加快外源蛋白表达速度，既使外源蛋白具有较高的表达效率，又使其尽可能地以活性可溶形式存在，缩短了后期纯化蛋白的时间，降低了生产成本，使融合蛋白达最佳表达效果。而且昆虫细胞悬浮生长，容易放大培养，有利于大规模表达重组蛋白，对于开发PCV2与PCV3 Cap蛋白疫苗具有重要的经济和社会价值。
本发明的重组杆状病毒将截去核定位信号的PCV2Cap蛋白的核苷酸序列与PCV3Cap蛋白的核苷酸序连接，中间用一段疏水的柔性蛋白linker序列连接，在PCV2Cap蛋白和PCV3Cap蛋白序列的N端加入一段蜂素信号肽序列，促使其分泌表达。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统采用杆状病毒穿梭载体技术，极大缩短了病毒纯化和鉴定的时间。重组阳性杆状病毒感染sf9昆虫细胞表达的蛋白进行了多种翻译后修饰，接近于天然的病毒编码蛋白，具有较高的生物学活性，而且杆状病毒具有高度的种属特异性，仅感染昆虫细胞，对脊椎动物细胞无感染性，其表达产物安全可靠，经简单处理即可用于后续试验。因此，利用该系统同时表达PCV2 Cap蛋白与PCV3 Cap蛋白，并进行后续纯化及疫苗的研制，比传统方式更加安全有效。相比于其他利用杆状病毒系统生产融合蛋白的方法，该方法操作简单，只需简单离心即可纯化，节省了后期放大培养的成本与时间，是目前其他方法的表达量的2-8倍，极大的增加了表达效率，有益于后续产品的开发。
附图说明
图1为目的基因的凝胶电泳图片；
图2为重组质粒酶切后的凝胶电泳图片；
图3为重组质粒pFD-H-2Cap-3Cap的结构示意图；
图4为含重组质粒pFD-H-2Cap-3Cap的DH10Bac蓝白斑筛选；
图5为正常与转染重组杆状病毒后的sf9细胞显微图像；
图6为转染重组杆状病毒的sf9细胞间接免疫荧光鉴定；
图7为不同样品上清的SDS-PAGE电泳图片；
图8为不同样品上清的Western-Blot图片；
图9为不同MOI接种细胞的上清SDS-PAGE电泳图片。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 杆状病毒的构建
1. 目的基因的获得
参照“猪圆环病毒2型SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立”、“猪圆环病毒3型SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立”等文献中的方法构建2型和3型猪圆环病毒全基因组的质粒pEASY-Blunt-PCV2、pEASY-Blunt-PCV3，并-80℃保存备用。
表1 目的基因PCR引物序列
Figure 130657DEST_PATH_IMAGE002
。
按照表1合成引物，以pEASY-Blunt-PCV2为模板，以HBM-PCV2Cap F、Linker1-PCV2Cap R为引物进行PCV2 Cap碱基序列的扩增，将扩增后的产物用胶回收试剂盒进行回收，命名为2Cap。以pEASY-Blunt-PCV3为模板，以Linker2-PCV3Cap-phF、PCV3Cap-phR为引物进行PCV3 Cap碱基序列的扩增，将扩增后的产物用胶回收试剂盒进行回收，命名为3Cap。然后再以上述回收产物为模板，分别以Ph-HBM和PCV3CapR PH；p10-HBM 和PCV3CapR-p10为引物，分别扩增重组序列。命名为Ph-H-2Cap-3Cap、p10-H-2Cap-3Cap，其基因序列结构为：载体同源臂序列-酶切位点-PCV2 Cap-Linker- PCV3 Cap-加蜂素信号肽-酶切位点-载体同源臂序列，电泳图如图1所示，其中，1为Marker，2、3均为Ph-H-2Cap-3Cap，4、5均为p10-H-2Cap-3Cap，根据图片可知，获得了一段大小为1495bp的片段，符合重组序列大小，将PCR产物用胶回收试剂盒进行回收。
PCR体系和反应条件如下：
50×PCR体系：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
；
PCR扩增反应条件：
Figure 985481DEST_PATH_IMAGE004
。
2. 重组质粒的构建
（1）将pFastBacTM Dual用BamH I、Pst I对载体的Ph启动子下游序列进行酶切，并将酶切后的线性载体用胶回收试剂盒进行回收。用无缝连接试剂盒按照以下体系配置并进行线性载体与重组序列Ph-H-2Cap-3Cap的连接：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
；
（2）将DH5ɑ感受态细胞置于冰上，加入十分之一体积的连接产物轻柔混匀，在冰上静置30 min，放入42℃恒温水浴锅热激90 s，冰浴2-3 min，在无菌操作台中加入提前预热至37℃的无抗性LB液体培养基900 μL，37℃恒温摇床震荡培养1 h，12 000 rpm离心1 min，弃去700 μL上清，重悬沉淀，取50 μL重悬菌液涂布Amp+抗性的LB固体培养基，37℃倒置培养12 h。挑取单克隆，在Amp+ LB培养基中，37℃震荡培养12 h，利用质粒小提试剂盒提取质粒。将提取的质粒用双酶切鉴定，并送至上海生工生物公司测序鉴定，测序正确的重组质粒保存备用；
（3）用SphI、Kpn I将步骤（2）获得的重组质粒的p10启动子下游基因序列进行双酶切，并用同样的方法将线性质粒与p10-H-2Cap-3Cap重组质粒进行DNA连接酶进行连接、转化、提质粒鉴定。得到的质粒用双酶切验证并，核酸电泳结果如图2所示，其中，1为Marker，2、3均为BamH I和Pst I双酶切后，4、5均为Sph I和Kpn I双酶切后，由图片可知：载体片段和目的片段大小均与预期结果相符，表明重组片段已正确克隆至pFastBac Dual载体。从而构建出含有双重组序列供体质粒，并命名为pFD-H-2Cap-3Cap，重组质粒的结构示意图如图3所示。
3. 重组杆粒的制备
将鉴定正确的重组质粒pFD-H-2Cap-3Cap转化进DH10Bac感受态，涂布于三抗蓝白斑LB固体培养基，37℃倒置培养48 h（如图4）。挑取白斑菌落划线涂布于蓝白斑筛选LB固体培养基进行纯化筛选，再次挑取单克隆白斑接种于三抗LB液体培基，37℃震荡培养16 h，菌液中提取重组杆粒rBacmid-H-2Cap-3Cap。按照表2中引物序列进行PCR扩增，产物电泳显示成功扩增出与目的片段大小相符的片段，测序正确，证明重组杆粒利构建成功。
表2 重组质粒鉴定PCR引物
Figure DEST_PATH_IMAGE007
。
4. 重组杆状病毒的拯救
sf9细胞用含10%胎牛血清（FBS）、1%双抗的sf900 II培养基27℃培养，48-72h进行一次细胞传代。转染前，将细胞铺于6孔板中，确保细胞生长状态良好并处于对数生长期，细胞计数板控制细胞培养密度（密度为1×106-2×106细胞/mL）。利用Cellfectin II Reagent转染试剂进行rBacmid-H-2Cap-3Cap重组杆粒DNA转染，27℃培养72-96 h；收获细胞培养上清，4℃、3000 rpm离心30 min去除细胞碎片，即为P1代，将重组杆状病毒命名为rpFB-H-2Cap-3Cap。图5为转染重组质粒的sf9细胞与正常sf9细胞培养96h后的显微图片。结果显示，与正常的贴壁sf9相比，转染后的sf9细胞在显微镜下观察到细胞膨大变圆，细胞核充满整个细胞，最终解离等明显病变现象。
随后将P1代重组杆状病毒重在sf9细胞中传代。具体方法为：sf9细胞27℃培养12h，按1%浓度接种，27℃培养，72-96h收获上清。重组杆状病毒盲传至P4代。在4℃避光保存，长期保存放置-80℃。
5. 重组杆状病毒的鉴定
5.1 重组杆状病毒滴度测定
扩大培养P2代毒，用TCID50方法测定重组杆状病毒滴度，显微镜下观察细胞病变情况并根据公式计算病毒滴度：
距离比例=(高于50％病变率的百分数-50%)/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）
Log（TCID50）=距离比例×稀释度对数之间的差＋Log（高于50%病变率的稀释度）。
表3 P2代病毒滴度测定
Figure DEST_PATH_IMAGE009
结果如表3所示，结果表明，成功拯救重组杆状病毒，经测定其P2代病毒滴度为1×106.5IFU/mL。
5.2 间接免疫荧光鉴定
将P1代重组杆状病毒rBac-H-2Cap-3Cap盲传3代，提取基因组进行PCR鉴定后，将P4代接种至贴壁sf9细胞继续培养48 h按照如下方法进行间接免疫荧光鉴定：将收获的第四代病毒液按照病毒培养的方法接种到6孔板中，每孔100μL；72h后，弃去营养液，使用PBS洗涤3次；每孔加入4%预冷的多聚甲醛固定液，固定30min，使用PBS洗涤3次，每次静置2min；每孔加入0.2% TritonX-100 200μL，静置15 min，对细胞进行通透；每孔加入配制的1% BSA液封闭30 min；使用PBS洗涤3次，每次静置2min；加入按1:200例稀释的小鼠抗PCV2 Cap蛋白的单克隆抗体以及小鼠抗PCV3 Cap蛋白的单克隆抗体，37℃孵育1h，使用PBS洗涤3次，每次静置2min；每孔加入按1:5000比例稀释的Alexa Fluor® 488标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗室温孵育1h，使用PBS洗涤3次，每次静置2min；使用倒置荧光显微镜进行观察。
结果如图6所示，其中，A为加入PCV2 Cap单抗的染毒细胞，B为加入PCV3 Cap单抗的染毒细胞，C和D为未接毒细胞。结果显示：与正常细胞对照相比，接种杆状病毒rBac-H-2Cap-3Cap的在荧光显微镜下观察到明显的绿色荧光，表明rBac-H-2Cap-3Cap能够与相应的抗PCV2 Cap鼠血清和抗PCV3 Cap鼠血清特异性结合，重组杆状病毒rBac-H-2Cap-3Cap构建成功。
5.3 SDS-PAGE 和Western-Blot鉴定
将接P2代病毒培养72h、96h后的上清液与未接入病毒的sf9细胞的细胞裂解液三组样品利用抗鼠单抗进行SDS-PAGE以及Western-Blot鉴定。
5.3.1 SDS-PAGE分析
取样品上清，每孔20μL样品。将电压调至90V开始电泳，待样品进入分离胶后，将电压升高至120V继续电泳，溴酚蓝指示剂到达底部时停止电泳。切取分离胶，并加入加入适量的考马斯亮蓝染色液，慢速振荡染色1-2h。取出染色后的分离胶，加入适量脱色液，慢速振荡脱色，直至脱色液无色后，拍照并分析实验结果，结果如图7所示，其中，1为蛋白Marker，2为培养72h的上清，3为培养96h的上清，4为细胞裂解液。表明，重组杆状病毒rBac-H-2Cap-3Cap构建成功，并且能够表达大小约为60kDa的外源蛋白。
5.3.2 Western-Blot分析
将收集的重组杆状病毒rBac-H-2Cap-3Cap储液与4×SDS上样缓冲液以4:1的比例混合均匀后，放置水浴锅内煮沸10 min；向电泳槽加入的l×蛋白电泳缓冲液，分别将20 μL蛋白样品和7 μL预染Marker加入胶孔，连接电泳仪；将初始电压设置为90V，开始进行电泳。待溴酚蓝带完成浓缩，进入分离胶后（约30 min）将电压调至120V，当溴酚蓝带移动到分离胶的最底端时（约1.5 h-2 h），停止电泳；电泳结束后，根据凝胶的大小，剪取两张厚滤纸及一张NC膜，将两者均放置在转膜液里充分浸泡，使其湿润。将厚滤纸-NC膜-蛋白凝胶-厚滤纸按照从下往上的顺序放置。叠放完成后，用玻璃棒赶走滤纸、NC膜及凝胶之间的气泡。放置在半干式电转印仪器中，接通电源，15 V，30 min；取出NC膜，加入封闭缓冲液置于摇床，室温下轻摇2 h封闭；弃掉封闭液，用TBST快速洗涤NC膜，清洗5次，每次5min；倒掉TBST后，用Western一抗稀释液1000倍稀释单克隆抗体，在摇床上轻摇2 h后，再放于4 ℃层析柜中过夜孵育；用TBST快速洗涤NC膜，清洗5次，每次5min；用封闭缓冲液5000倍稀释HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，在摇床上轻摇1 h；倒掉二抗后，用TBST快速洗涤NC膜，清洗5次，每次5min；用ECL发光液进行显色，通过ChemiDoc MP凝胶成像系统进行曝光，结果如图8所示，其中，图8-（a）为加抗PCV2 Cap鼠血清图片；（b）为抗PCV3 Cap鼠血清图片，图8中，M为蛋白Marker，1和2均为样品，3为空白对照。结果表明，杆状病毒表达的外源蛋白为PCV2 Cap和PCV3 Cap的融合蛋白，且具有免疫原性。
实施例2 融合蛋白的表达
分别将P2重组杆状病毒以MOI=1、0.5、0.1病毒量接种到密度为2.5×106个/mLsf9细胞中。每隔24小时收取200μL细胞上清液，连续收集5天，将蛋白样品离心纯化，步骤如下：
1）将收集的上清4℃，5000×g离心30 min以除去细胞碎片及杂质，收集培养物上清液；
2）离心后的细胞上清30000 rpm离心1 h，收获沉淀，即无菌PBS重悬沉淀；
3）无菌PBS重悬沉淀后加入到10%-30%-50%蔗糖密度梯度的上层液面，35 000 rpm离心1.5 h进行纯化，小心收集30%-50%蔗糖层之间的白色絮状条带，用PBS重悬，30 000rpm，离心1.5 h去除蔗糖，收集沉淀，2 mL无菌PBS重悬，-80℃保存备用。按照实施例1中5.3中所述方法进行SDS-PAGE电泳分析；用BCA法测定蛋白的总浓度：
1）配制工作液：根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀(混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失)。BCA工作液室温24小时内稳定；
2）稀释标准品：取10微升BSA标准品用PBS稀释至100微升，使终浓度为0.5mg/mL。将标准品按0，2，4，6，8，12，16，20微升加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足至20微升；
3）将样品作2倍、4倍、8倍稀释，加20微升到96孔板的样品孔中，并尽可能的让样品点落在标准线1/2后；
4）各孔加入200微升BCA工作液，37℃放置15-30分钟。用酶标仪测定A562nm，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
用BCA法测定每个样品的总蛋白含量，根据标准品做出标准曲线得到线性回归方程为c=0.511A-0.046，相关系数为r=0.9001，并通过吸光度值计算样品中的总蛋白浓度，不同MOI值各时期总蛋白含量的如表4所示：
表4 不同MOI值不同时间段表达的总蛋白含量
Figure DEST_PATH_IMAGE011
。
参考图像分析系统分析目的蛋白占总蛋白的比例得出目的蛋白的具体表达量。SDS-PAGE样品电泳结果如图9所示。结果显示，以不同MOI接种病毒时，sf9细胞胞感染24h时开始表达重组蛋白；随着培养时间的延长，目的蛋白表达量增加，72-96小时达到峰值，随后趋于平稳。结合分析软件通过计算目的条带占总条带的比例分析目的蛋白含量可知，当MOI=0.1时，sf9细胞后期细胞密度较之前增加，感染的细胞在重组蛋白表达水平上表现出明显优势，目的蛋白条带平均占总蛋白的38%，平均表达量在0.7mg/mL左右；最高表达量可达0.85mg/mL，当MOI=0.5时，目的蛋白条带平均占总蛋白的38%，目的蛋白的平均表达量在0.6mg/mL左右；当MOI=1时，目的蛋白条带平均占总蛋白的29%，目的蛋白的平均表达量在0.4mg/mL左右，感染第5天时，sf9细胞大量破碎，细胞存活率小于50%，此时细胞的密度低于之前的细胞密度，可明显看到细胞脱落，由于细胞裂解死亡，总蛋白含量有所升高，但目的蛋白降解明显、含量降低。因此，较优的融合蛋白获取条件为：MOI=0.1接种2.5×106个/mL的sf9细胞，在接种后4天收获融合蛋白，平均表达量可达0.7mg/mL，最高表达量可达0.85mg/mL。
序列表
<110> 山东省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种高效表达PCV2 Cap、PCV3 Cap融合蛋白的方法
<130> 20200109
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 1
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 2
<211> 1452
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-2Cap-3Cap
<400> 2
atgaaattct tagtcaacgt tgcccttgtt tttatggtcg tgtacatttc ttacatctat 60
gcgatgacgt atccaaggag gcgtttccgc agacgaagac accgcccccg cagccatctt 120
ggccagatcc tccgccgccg cccctggctc gtccaccccc gcctccgtta ccgctggaga 180
aggaaaaatg gcatcttcaa cacccgcctc tcccgcacca tcggttatac tgtcaagaaa 240
accacagtca gaacgccctc ctggaatgtg gacatgatga gatttaatat taatgatttt 300
cttcccccag gagggggctc aaaccccctc actgtgccct ttgaatacta cagaataagg 360
aaggttaagg ttgaattctg gccctgctcc ccaatcaccc agggtgacag gggagtgggc 420
tccactgctg ttattctaga tgataacttt gtaacaaagg ccaatgccct aacctatgac 480
ccctatgtaa actactcctc ccgccatacc ataacccagc ccttctccta ccactcccgg 540
tactttaccc caaaacctgt cattgatagg acaatcgatt acttccaacc caataacaaa 600
agaaatcaac tctggctgag actacaaact actggaaatg tagaccatgt aggcctcggc 660
actgcgttcg aaaacagtat atacgaccag gactacaata tccgtataac catgtatgta 720
caattcagag aatttaatct taaagacccc ccacttaacc ctaaggcttc ctcctcctcc 780
gcttcctcct cctccgcttc ctcctcctcc atgagacaca gagctatatt cagaagaaga 840
ccccgcccaa ggagacgacg acgccacaga aggcgctatg ccagaagaag actattcatt 900
aggaggccca cagctggcac atactacaca aagaaatact ccaccatgaa cgtcatttcc 960
gttggaaccc ctcagaataa taagccctgg cacgccaacc acttcattac ccgcctaaac 1020
gaatgggaaa ctgcaattac ctttgaatat tataagatac taaagatgaa agttacactc 1080
agccctgtaa tttctccagc tcagcaaaca aaaactatgt tcgggcacac agccatagat 1140
ctagacggcg cctggaccac aaacacttgg ctccaagacg acccttatgc ggaaagttcc 1200
actcgtaaag ttatgacttc taaaaaaaaa cacagccgtt acttcacccc caaaccactt 1260
ctggcgggaa ctaccagcgc tcacccagga caaagcctct tctttttctc cagacccacc 1320
ccatggctca acacatatga ccccaccgtt caatggggag cactgctttg gagcatttat 1380
gtcccggaaa aaactggaat gacagacttc tacggcacca aagaagtttg gattcgctac 1440
aagtccgttc tc 1452
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ph-HBM
<400> 3
tcccaccatc gggcgcggat ccatgaaatt cttagtcaac gttgcccttg tttttatg 58
<210> 4
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HBM-PCV2Cap F
<400> 4
tgtttttatg gtcgtgtaca tttcttacat ctatgcgatg acgtatccaa ggagg 55
<210> 5
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker1-PCV2Cap R
<400> 5
gcttcctcct cctccgcttc ctcctcctcc ttagggttaa gtggggggt 49
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker2-PCV3Cap-phF
<400> 6
tcctcctcct ccgcttcctc ctcctccatg agacacagag cta 43
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCV3CapR Ph
<400> 7
acaagcttgt cgagactgca ggagaacgga cttgtag 37
<210> 8
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p10-HBM
<400> 8
atcccaactc cataagcatg catgaaattc ttagtcaacg ttgcccttgt ttttatg 57
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCV3CapR-p10
<400> 9
gcctccccca tctcccggta ccgagaacgg acttgtag 38
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> phF
<400> 10
cgcggatcca tgaaattctt agtc 24
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> phR
<400> 11
aactgcagga gaacggactt g 21
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p10 F
<400> 12
catgcatgca tgaaattctt agtc 24
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p10 R
<400> 13
ggggtaccga gaacggactt gt 22

Claims (1)

1.一种PCV2 Cap、PCV3 Cap融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）通过含目的基因核酸序列的载体转染含杆粒骨架的感受态细胞获得重组杆粒；重组杆粒转染昆虫宿主细胞，获得含重组杆状病毒的上清液；
（2）含重组杆状病毒的上清液接种昆虫宿主细胞，培养后获得上清液；
（3）上清液分离纯化后获得PCV2 Cap、PCV3 Cap融合蛋白；
所述融合蛋白包括截短PCV2 Cap蛋白段、接头序列、PCV3 Cap蛋白段和蜂素信号肽区域；所述截短PCV2 Cap蛋白段为去除核定位信号的PCV2 Cap蛋白；
所述接头序列为疏水柔性肽链；所述接头序列如SEQ ID NO: 1所示；
所述融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO: 2所示；
所述载体为pFastBacTM Dual质粒；
所述感受态细胞为DH10Bac；
所述昆虫宿主细胞为Sf9细胞；
所述接种的接种量为MOI为0.1，昆虫宿主细胞的密度为2.5×106个/mL，培养时间为接种后4天。
CN202010052203.0A 2020-01-17 2020-01-17 一种高效表达PCV2Cap、PCV3Cap融合蛋白的方法 Active CN111187353B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010052203.0A CN111187353B (zh) 2020-01-17 2020-01-17 一种高效表达PCV2Cap、PCV3Cap融合蛋白的方法
NL2025015A NL2025015B1 (en) 2020-01-17 2020-02-28 Method for Efficiently Expressing PCV2 Cap and PCV3 Cap Fusion Protein

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010052203.0A CN111187353B (zh) 2020-01-17 2020-01-17 一种高效表达PCV2Cap、PCV3Cap融合蛋白的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111187353A CN111187353A (zh) 2020-05-22
CN111187353B true CN111187353B (zh) 2021-11-30

Family

ID=70549866

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010052203.0A Active CN111187353B (zh) 2020-01-17 2020-01-17 一种高效表达PCV2Cap、PCV3Cap融合蛋白的方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN111187353B (zh)
NL (1) NL2025015B1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111558037A (zh) * 2020-06-08 2020-08-21 武汉科前生物股份有限公司 一种二价亚单位疫苗及其制备方法和应用
CN114262720B (zh) * 2021-12-27 2023-07-25 河南兴华生物技术有限公司 杆状病毒表达系统的信号肽及其应用
CN115044613A (zh) * 2022-06-20 2022-09-13 岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心 一种表达猪圆环病毒cap蛋白的基因工程细胞系及其构建方法和应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102517331A (zh) * 2011-12-26 2012-06-27 武汉中博生物股份有限公司 一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法和其应用
CN102827289B (zh) * 2012-08-30 2014-04-09 青岛蔚蓝生物股份有限公司 猪圆环病毒2型Cap蛋白和胸腺素α1融合蛋白及应用
CN103739717B (zh) * 2014-01-15 2015-07-22 北京市农林科学院 一种抗猪2型圆环病毒病的重组蛋白亚单位疫苗
CN109306360B (zh) * 2017-07-28 2022-07-15 普莱柯生物工程股份有限公司 一种利用杆状病毒表达外源蛋白的方法及其应用
CN107841507B (zh) * 2017-11-23 2021-05-11 南京农业大学 一种高效表达的猪圆环病毒2型Cap-穿膜肽融合蛋白基因及其应用
CN108359677A (zh) * 2018-02-01 2018-08-03 福建农林大学 提高猪圆环病毒2型和3型Cap蛋白串联表达效率的方法
CN113527511A (zh) * 2018-09-19 2021-10-22 天康生物股份有限公司 融合蛋白及其制备方法、应用、表达系统和疫苗
CN109694857B (zh) * 2018-12-20 2023-08-18 哈药集团生物疫苗有限公司 表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒及其应用
CN110358742B (zh) * 2019-07-05 2020-12-22 武汉科前生物股份有限公司 猪圆环病毒2b型和2d型的二价亚单位疫苗及其制备方法
CN110423269B (zh) * 2019-07-08 2022-03-11 华南农业大学 一种串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白及其应用
CN110606873B (zh) * 2019-09-09 2021-05-04 武汉科前生物股份有限公司 猪圆环病毒2d型与3型Cap蛋白二联亚单位疫苗及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111187353A (zh) 2020-05-22
NL2025015A (en) 2020-04-30
NL2025015B1 (en) 2022-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111187353B (zh) 一种高效表达PCV2Cap、PCV3Cap融合蛋白的方法
US20230285535A1 (en) Recombinant Pseudorabies Virus and Vaccine Composition thereof
CN103585625A (zh) 一种猪流行性腹泻重组杆状病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用
CN113845576B (zh) 重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白及其应用
CN107227311B (zh) 重组猪细小病毒样粒子及其制备方法和应用
CN113461788B (zh) 猫冠状病毒重组抗原、其基因工程亚单位疫苗及应用
CN111349179B (zh) 禽呼肠孤病毒基因工程疫苗
CN110256539B (zh) O型口蹄疫病毒新型基因工程亚单位疫苗
CN104826100A (zh) 一种猪瘟病毒重组亚单位疫苗的制备方法与应用
CN109601007A (zh) 一种口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法
CN114774372B (zh) 柯萨奇病毒a10型毒株及其疫苗和应用
CN102719453B (zh) 一种hpv18l1多核苷酸序列及其表达载体、宿主细胞和应用
CN110423269A (zh) 一种串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白及其应用
CN108794583B (zh) 貉细小病毒病毒样颗粒、其制备方法与应用以及该病毒样颗粒制备的疫苗
CN113896773B (zh) 重组fcv抗原及猫嵌杯病毒基因工程亚单位疫苗
CN102586287A (zh) 一种hpv16l1多核苷酸序列及其表达载体、宿主细胞和应用
CN106754981B (zh) 一种利用大肠杆菌系统制备小鹅瘟病毒样颗粒的方法
CN112679586A (zh) H5、h7亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用
CN111729078B (zh) 鸡传染性贫血病毒基因工程疫苗
CN112891528B (zh) 一种鸡传染性支气管炎疫苗株
CN113855795A (zh) 禽戊型肝炎病毒orf2亚单位疫苗
CN107245105B (zh) HN-VP233-221aa融合蛋白及其制备方法和应用
CN111533811B (zh) 禽脑脊髓炎病毒新型基因工程疫苗
CN111560386A (zh) 一种可溶性猪圆环病毒2型Cap蛋白及应用
CN110066806A (zh) 重组藏猪IFN-λ3成熟肽的克隆及表达方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant