CN110066806A - 重组藏猪IFN-λ3成熟肽的克隆及表达方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种重组藏猪IFN‑λ3成熟肽的克隆及表达方法和应用，通过提取IFN‑λ3总RNA，进行PCR扩增，将产物转化至感受态细胞中培养，以获得的质粒进行PCR扩增，产物转化感受态细胞中培养。通过将pMD19‑T‑mZPoIFN‑λ3双酶切并与pET‑32a(+)连接，进行转化培养，得到其表达载体。本发明重组藏猪IFN‑λ3成熟肽经试验证明，对PoRV具有较高的抗病毒效应，可应用于制备抗猪轮状病毒活性药物。

Description

重组藏猪IFN-λ3成熟肽的克隆及表达方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种重组藏猪IFN-λ3成熟肽的克隆及表达方法和应用，具体为重组藏猪IFN-λ3成熟肽的基因克隆，及其表达、纯化、包涵体复性方法。
背景技术
干扰素是一种功能多样的糖蛋白。目前，根据干扰素的来源、核苷酸和氨基酸序列、结构、受体以及生物学功能的不同，将其分为Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)、Ⅱ型干扰素(IFN-γ)以及Ⅲ型干扰素(IFN-λ)。一直以来，由于III型干扰素具有与I型干扰素相似的生物学功能和信号通路重叠而未被受到重视，随后的研究发现，与I型干扰素受体在机体内广泛分布不同的是，III型干扰受体特异性广泛分布在上皮组织和器官中，这意味这III型干扰在上皮组织和器官中的作用比I型干扰素更加特异，而且III型干扰受体在造血系统和神经系统分布较少，在临床应用中可能不会产生相关的副作用。I型干扰素本身也有缺点，其在体内的活性不稳定，半衰期短。基于此，III型干扰素有望成为I型干扰素的替代品应用于各种临床疾病的治疗，然而相较于对人的IFN-λ研究，对猪IFN-λ的研究起步较晚，仅发现IFN-λ1和IFN-λ3两个亚型。在对III型干扰素各成员的抗病毒活性研究中发现，IFN-λ3的抗病毒活性显著强于IFN-λ1。
由于常年受腹泻的影响，我国养猪业受到了巨大的经济损失，而轮状病毒便是导致婴幼儿和多种幼龄动物病毒学腹泻的主要病原的之一，猪轮状病毒是轮状病毒的成员，常造成猪场仔猪高发病率和死亡率，临床症状主要为腹泻、呕吐和脱水等，且猪轮状病毒常与其他能够引起腹泻的病毒以及细菌混合感染，导致猪场疫情加重，成年猪常隐性感染，不断向外排毒，导致疫情反复，给世界养猪业造成巨大经济损失。目前我国虽广泛接种各种猪病疫苗，仍不能有效控制该病的流行。IFN-λ3成熟肽能有效的增加猪仔的免疫功能，提高机体对病毒防御作用，且拥有无残留与无副作用等特点，深受临床兽医和养殖户的喜爱。奈何IFN-λ3的生物效应具有高度的种属特异性，且天然的IFN-λ3在机体内表达甚微，尤其是藏猪体内，难以直接从体内大量表达提取供临床研究与应用。因此，本发明通过基因工程手段提供了一种成本低廉且可大量表达重组藏猪IFN-λ3成熟肽的方法。
近年来，基因工程研究发展迅猛。许多异源蛋白已经被成功的表达，并且已经被投入生产应用当中。pET系统是被大量研究的表达系统，在许多研究中都有举足轻重的地位，拥有很高的诱导效率，其目标蛋白产物能够在几小时就达到极高的水平。藏猪是一类我国特有的特种经济动物。其特点表现为适应恶劣环境程度高、抗病力强及耐粗等特点。因此，本发明通过基因工程手段提供了一种成本低廉且可大量表达重组藏猪IFN-λ3成熟肽表达系统和方法。同时，鉴于原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，产物以生物活性较低的包涵体的形式产生，本发明提供包涵体纯化与复性技术。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术不足之地，提供一种可在大肠杆菌内高效表达重组藏猪IFN-λ3成熟肽的基因克隆，及其表达、纯化、包涵体复性方法。
为了实现上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
一种藏猪IFN-λ3成熟肽的克隆方法，具体包括以下步骤：
1)以从藏猪肺脏与肠道中提取的IFN-λ3总RNA为模板，P1、P2为引物，反转录后进行PCR扩增；
上游引物P1:atggccctgggtggct；
下游引物P2:tcagacacacaggtctccac；
2)对扩增的藏猪IFN-λ3基因进行纯化，与载体pMD19-T 16℃连接过夜，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中培养，获得的菌液抽提质粒命名为pMD19-T-ZPoIFN-λ3；
3)以上述的pMD19-T-ZPoIFN-λ3的质粒为模板，P3和P4为上下游引物，进行PCR扩增，将产物纯化后转化至DH5α感受态细胞中培养。
上游引物P3:cgcggatccgtgcctgtccctgaagccc；
下游引物P4:cccaagctttcagacacacaggtctccac。
在本发明的另一方面，本发明还提供了用以扩增IFN-λ3全长基因的引物，所述的引物为P1和P2。
在本发明的另一方面，本发明还提供了用以扩增IFN-λ3成熟肽基因的引物，所述的引物为P3和P4。
在本发明的另一方面，本发明还提供了包含了上述所述编码重组藏猪IFN-λ3基因的载体，所述的载体为原核表达，优选为pET-32a(+)。
在本发明的另一方面，重组藏猪IFN-λ3成熟肽在大肠杆菌中的表达方法，利用BamHⅠ和HindⅢ双酶切pMD19-T-mZPoIFN-λ3得到mZPoIFN-λ3片段，与pET-32a(+)连接后转入大肠杆菌培养得到表达质粒pET-32a-mZPoIFN-λ3；将质粒pET-32a-mZPoIFN-λ3转化表达菌株BL21(DE3)感受态细胞中培养，离心处理收集菌体沉淀。
在本发明的另一方面，本发明还提供了重组藏猪IFN-λ3成熟肽包涵体的纯化方法，包括：洗涤上述收集到的菌体沉淀，纯化得到包涵体。
在本发明的另一方面，本发明还提供了重组藏猪IFN-λ3成熟肽包涵体复性与浓缩方法，包括：将包涵体置于处理后的透析袋中进行进行缓慢透析，逐渐降低尿素浓度，最后置于无尿素的缓冲液透析，随后取适量的PEG-20000置于平皿中，将透析袋放入其中进行浓缩。
在本发明的另一方面，重组藏猪IFN-λ3成熟肽在制备抗猪轮状病毒活性药物中的用途。通过重组藏猪IFN-λ3成熟肽体外对PoRV的抗病毒活性实验，得出重组藏猪IFN-λ3成熟肽对PoRV具有较高的抗病毒效应，且抗病毒活性呈现剂量与时间的依赖。
本发明的有益效果为：
本发明通过基因工程手段提供了一种成本低廉且可大量表达重组藏猪IFN-λ3成熟肽表达系统和方法。同时，鉴于原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，产物以生物活性较低的包涵体的形式产生，本发明提供包涵体纯化与复性技术。
附图说明
图1是藏猪IFN-λ3的PCR扩增电泳图；1：PCR产物，2：阴性对照M:DNAMarker；
图2是pMD19-T-ZPoIFN-λ3的PCR鉴定；M：DNA Marker，1-5：PCR产物，6：阴性对照；
图3是藏猪IFN-λ3成熟蛋白基因的PCR扩增；M：DNA Marker；1：阴性对照；2：PCR产物；
图4是pMD19-T-mZPoIFN-λ3的PCR鉴定；M：DNA Mrker，1-5:PCR产物，6：阴性对照；
图5是重组质粒pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3的酶切鉴定；M：DNA Mrker，1:BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3产物，2：pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3；
图6是重组质粒pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3表达产物SDS-PAGE分析；M：标准蛋白质分子，1：未诱导表达pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3/BL21(DE3)产物，2:诱导表达pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3/BL21(DE3)产物；
图7是诱导时间对重组蛋白表达影响；M：标准蛋白质分子，1-5：诱导时间为1、2、3、4、5h；
图8是IPTG浓度对重组蛋白表达影响；M：标准蛋白质分子，1-5：PTG浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L；
图9是检测复性浓缩后藏猪IFN-λ3重组蛋白；M：标准蛋白质分子，1：SDS-PAGE检测纯化后藏猪IFN-λ3重组蛋白，2：重组藏猪IFN-λ3蛋白Western-blot检测；
图10是pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3表达蛋白抗VSV活性研究；
图11是MA104细胞感染PoRV SC-R株36h时的细胞病变；
图12是荧光定量PCR标准曲线；
图13是ZPoIFN-λ3抑制PoRV SC-R株mRNA的qRT-PCR；A：不同浓度ZPoIFN-λ3在MA104细胞和IPEC-J2细胞抗PoRV SC-R株活性研究；B：ZPoIFN-λ3处理后对PoRV SC-R株不同感染时间的抗病毒活性研究；
图14是ZPoIFN-λ3和IFN-α单独或联合应用对PoRV SC-R株滴度影响；
图15是ZPoIFN-λ3和IFN-α单独或联合应用后干扰素刺激基因的表达。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1藏猪IFN-λ3基因的克隆
1试验方法
1.1引物设计
根据已发表的GenBank公布的猪IFN-λ3序列(NM_001166490)，设计扩增藏猪IFN-λ3全长序列引物。引物序列如下：P1:5’-ATGGCCCTGGGTGGCT-3’；P2:5’-TCAGACACACAGGTCTCCAC-3’。
1.2藏猪IFN-λ3基因扩增
1.2.1藏猪肺脏和肠道总RNA提取
使用眼科剪剪碎藏猪的肺脏和肠道组织，加入液氮将其研磨成细粉状。取100mg组织置于EP管中，加入1mL RNAisoTMPlus，在涡旋振荡仪上剧烈震荡混匀，在室温静置10min。加入200uL氯仿，在涡旋振荡仪上震荡混匀并于室温静置10min，放入高速离心机中，以12000r/min转速离心15min。取400uL上清于EP管中，同时加入400uL异丙醇，缓慢上下颠倒混匀，置于冰上静置10min，放入高速离心机中，12000r/min转速离心15min。吸弃上清，加入1mL75％的使用DEPC水配置的冰乙醇，轻轻混匀，12000r/min离心5min。去除剩余的乙醇，倒立EP管，室温干燥数分钟，待扇闻无酒精味后，加入30uL无RNA酶的双蒸水，溶解RNA，将抽取的RNA置于-80℃保存。
1.2.2RT-PCR反应
以提取藏猪肠道和肺脏的总RNA为模板，按照宝日医生物技术(北京)有限公司反转录试剂盒的说明书进行RT-PCR反应：
反应体系：5×PrimeScriptBuffer 2.0μL，Prime Script RT Enzyme Mix I 0.5μL，Oligo dT Primer 0.5μL，Random 6mers 2.0μL，ddH2O 2.0μL，RNA模板3.0μL，Total10.0μL。反应条件：混匀后进行反转录，37℃，15min；85℃，5S，4℃保存备用。
1.2.3PCR扩增及检测
以步骤1.2.2当中得到的反转录产物为模板，P1、P2为上下游引物，使用PCR扩增藏猪IFN-λ3基因。反应体系为25.0μL：Prime STAR Max Premix 12.5μL，P1、P2各1.0μL，cDNA2.0μL，ddH2O8.5μL。反应程序为：95℃，预变性5min；95℃，变性30s；54℃，退火30s；72℃，延伸40s；共35个循环；72℃，终延伸10min；4℃，保存。对产物使用琼脂糖电泳检测条带。
2目的片段克隆及鉴定
2.1目的片段纯化
按照宝日医生物技术(北京)有限公司的DNA纯化试剂盒说明书对扩增的藏猪IFN-λ3基因进行纯化。使用50uL体系大量扩增目的片段，并使用2％凝胶电泳进行分离。在紫外灯下切取目的条带，并称量胶块的质量，按照每1:3mg/μL的比例加入溶胶液，置于50℃金属浴，期间每隔2-3min进行上下颠倒。待胶块完全融化后静置至室温，加入High Pure FilterTube中，12000r/min离心1min，弃掉液体。随后加入500uLWashing Buffer后，再次12000r/min离心1min。重复上一步骤一次。加入30μL的Elution Buffer溶解DNA。
2.2藏猪IFN-λ3克隆
将回收的藏猪IFN-λ3DNA与克隆载体pMD19-T16℃连接过夜。pMD19-T 0.5μLSolution Ⅰ 5.0μL PCR纯化产物4.5μL Total 10.0μL。
2.3连接产物转化大肠杆菌DH5α
将连接产物全部加入从超低温冰箱取出的DH5α感受态细胞中，置于冰上30min，随后于42℃水浴90s，取出后迅速放于冰上5min。向EP管中加入900uL无抗性的LB液体培养基，置于空气摇床37℃培养1h。低速离心菌液，弃去部分上清，剩余部分混匀后，使用涂布棒均匀涂布在蓝白斑平板上。将培养皿倒置于37℃培养箱中培养16-24h，直至长出单个菌落，挑取白色单个菌落于含有Amp+抗性的LB液体培养基中培养。
2.4重组质粒鉴定
2.4.1质粒提取
按照宝日医生物技术(北京)有限公司质粒提取试剂盒说明书对培养菌液进行质粒抽提。取5ml的过夜培养的菌液离心之后得到菌体。加250μL的含RNase A的Solution Ⅰ并涡旋震荡；之后加入250μLSolution Ⅱ并将其上下翻转混合6次，待溶液澄清后表明完全裂解。加入350μLSolution Ⅲ，上下翻转混合6次过后，EP管中出现紧实的白色团状物体。室温静置2min过后离心取上清。将上清液转移至Spin Column中，离心弃液体。加入500μL的Buffer WA，离心弃液体；加入700μL的Buffer WB离心弃液体并重复一次。干燥以完全去除乙醇；加入50μLElutionBuffer洗脱质粒DNA。将质粒命名为pMD19-T-ZPoIFN-λ3。
2.4.2pMD19-T-ZPoIFN-λ3 PCR鉴定
以上一步骤抽取的质粒为模板，P1、P2为上下游引物，进行PCR鉴定，反应体系和条件如2.3。PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测。
2.4.3序列测定
将呈阳性的重组质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
3结果分析
3.1藏猪IFN-λ3基因扩增
提取藏猪肠道和肺脏总RNA，RT-PCR方法将RNA反转录为cDNA，以此cDNA为模板，P1、P2为引物，PCR扩增出一条约为600bp左右的片段，与预期值相符(图1)。
3.2pMD19-T-ZPoIFN-λ3PCR鉴定
以抽取的质粒为模板进行PCR扩增，扩增出与预期目标一致的片段(图2)。
3.3藏猪IFN-λ3测序结果
将测序结果通过NCBI网站进行Blast比对，其与GenBank中收录的野猪IFN-λ3基因序列同源性达100％，表明克隆成功。
实施例2藏猪IFN-λ3基因的原核表达
1藏猪IFN-λ3基因的原核表达
1.1扩增藏猪IFN-λ3成熟肽序列的引物设计
根据前面克隆的藏猪IFN-λ3基因序列，设计扩增藏猪IFN-λ3成熟肽基因的引物。并分别在上游引物(P3)和下游引物(P4)的5’端加上BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点。P3:5’-CGCGGATCCGTGCCTGTCCCTGAAGCCC-3’；P4:5’-CCCAAGCTTTCAGACACACAGGTCTCCAC-3’。
1.2扩增藏猪IFN-λ3成熟肽序列
以上述得到的pMD19-T-ZPoIFN-λ3质粒为模板，P3和P4为上下游引物，通过PCR扩增藏猪IFN-λ3成熟肽基因。反应体系为25.0μL：Prime STAR Max Premix 12.5μL，P3、P4各1.0μL，pMD19-T-ZPoIFN-λ3 2.0μL，ddH2O 8.5μL。反应程序为：5℃，预变性7min；95℃，变性30s；65℃，退火30s；72℃，延伸40s；共30个循环；72℃，终延伸10min；4℃，保存。PCR结束使用1％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。
1.3藏猪IFN-λ3成熟肽基因的克隆
PCR产物经琼脂糖电泳鉴定后，参照前面方法进行纯化，并将产物克隆至pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞中，将鉴定正确的质粒命名为pMD19-T-mZPoIFN-λ3。
1.4pMD19-T-mZPoIFN-λ3和pET-32a(+)质粒的提取
参照前面质粒抽提方法分别抽提pMD19-T-mZPoIFN-λ3和pET-32a(+)质粒。
1.5质粒DNA的酶切和回收
分别用Quick CutTMBamH Ⅰ、Quick CutTMHindⅢ双酶切pMD19-T-mZPoIFN-λ3和pET-32a(+)质粒。酶切体系如下：质粒DNA 1ug，Quick CutTMBamH Ⅰ 1uL，Quick CutTMHindⅢ 1uL，10×Quick Cut Buffer 2uL，H2O top to 20uL。在PCR管中加样离心混匀，置于金属浴上37℃酶切30min。按照前面方法对酶切产物分别进行回收。
1.6mZPoIFN-λ3与表达载体pET-32a(+)的连接
将酶切纯化后的mZPoIFN-λ3片段和pET-32a(+)使用Solution Ⅰ于PCR管中混匀，16℃连接过夜。连接体系如下：mZPoIFN-λ3双酶切回收产物0.3pmol，pET-32a(+)双酶切回收产物0.03pmol，Solution Ⅰ 12.5μL，ddH2O top to 25uL。
1.7连接产物转化
按照前面的方法，将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并涂布于蓝白斑平板中，置于培养箱中培养12-24h。
1.8重组质粒鉴定
于蓝白斑筛选平板中挑取数个白色菌落，分别置于含有Amp+抗性的LB的液体培养基中，于空气摇床37℃过夜培养，使用宝日医生物技术(北京)有限公司质粒抽提试剂盒抽提质粒。
1.8.1重组质粒PCR鉴定
以疑似阳性的质粒为模板，进行PCR鉴定，反应体系条件按前文所述。
1.8.2重组质粒酶切鉴定
取经PCR鉴定为阳性的质粒，使用Quick CutTMBamH Ⅰ、Quick CutTMHind Ⅲ按照前文体系和方法进行双酶切鉴定。
1.8.3原核表达重组质粒的序列测定
将鉴定为阳性的质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定，命名为pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3。
1.9pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3的诱导表达
1.9.1pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3初步表达
将pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3转化表达菌株BL21(DE3)感受态细胞中，挑取经过PCR和双酶切鉴定为阳性的菌株进行保种。将保种菌液接种于10mL LB Amp+(100ug/mL)培养基中，于空气摇床37℃200r/min进行过夜培养。按照1：100比例将过夜培养的菌液加入10mLLBAmp+液体培养基中，置于空气摇床中37℃200r/min扩大培养，并对菌液OD600进行测定，当菌液OD600达到0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，诱导4h。取1mL菌液，通过离心收集菌体，菌体使用PBS洗涤离心两遍，加入80uLPBS悬浮菌体，向其中加入20uL 5×SDS-PAGE LoadingBuffer混匀，置于锅中煮沸10min后，静置至室温，以12000r/min离心10min，吸取上清进行SDS-PAGE分析表达情况。
1.9.2表达条件优化
诱导时间的优化过夜培养的菌液100uL加入10mLLB Amp+液体培养基中，设置5个重复，于空气摇床中37℃培养，待OD600检测约为0.6时，加入IPTG至终浓度为1mM，置于摇床进行诱导，分别在诱导1、2、3、4、5h各取1mL菌液，离心收集菌体，加入80uLPBS重悬菌体后，向其中加入20uL 5×Loading Buffer，在锅中煮沸10min，静置至室温，以12000r/min离心10min，吸取上清进行SDS-PAGE分析蛋白表达情况。
IPTG浓度的优化取过夜培养的菌液100uL加入10mL LB Amp+液体培养基中，设置5个重复，于空气摇床中37℃培养，待OD600检测约为0.6时，分别向5个离心管中加入IPTG至终浓度为：0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L诱导培养5h，各取1mL菌液，离心收集菌体，加入80uLPBS重悬菌体后，向其中加入20uL 5×Loading Buffer，在锅中煮沸10min，静置至室温，以12000r/min离心10min，吸取上清进行SDS-PAGE分析蛋白表达情况。
2.0融合蛋白的纯化及复性浓缩
2.0.1包涵体的制备洗涤和溶解
将保存的菌种加入Amp+LB液体培养基中，于空气摇床37℃200r/min过夜培养。次日取过夜菌液按照1％的比例加入1LAmp+LB培养基中，培养至对数生长期，按照优化条件加入IPTG诱导培养。收集菌液离心，收集菌体，50mmol/L Tris-HCl清洗，随后置于冰水中，使用超声波破碎大肠杆菌，离心弃上清。沉淀使用洗涤液洗涤(50mmol/L Tris-HCl、0.5％Triton X-100、1mmol/L EDTA，PH＝8.0)，洗涤后离心去上清，重复操作。将洗涤后的包涵体使用8mol/L尿素溶解，SDS-PAGE分析蛋白纯度。
2.0.2Ni-NTA纯化目的蛋白
将上一步骤得到的包涵体使用滤膜过滤，使用中高压层析系统纯化目的蛋白。(1)平衡：用5个柱子体积Binding Buffer以5mL/min速度平衡柱子；(2)上样：以2.5mL/min速度，将变性后的蛋白上柱；(3)漂洗：用5个柱子体积的Washing Buffer以3mL/min速度洗出未结合蛋白；(4)洗脱：用Elution Buffer以2mL/min速度洗脱结合蛋白。
2.0.2Ni-NTA纯化目的蛋白
将上一步骤得到的包涵体使用滤膜过滤，使用中高压层析系统纯化目的蛋白。(1)平衡：用5个柱子体积Binding Buffer以5mL/min速度平衡柱子；(2)上样：以2.5mL/min速度，将变性后的蛋白上柱；(3)漂洗：用5个柱子体积的Washing Buffer以3mL/min速度洗出未结合蛋白；(4)洗脱：用Elution Buffer以2mL/min速度洗脱结合蛋白。
2.0.3藏猪IFN-λ3融合蛋白的复性及浓缩
将经镍柱纯化的藏猪IFN-λ3融合蛋白置于处理后的透析袋中，在复性缓冲液中进行缓慢透析，透析温度保持4℃，并且每隔4个小时换一次复性液，逐渐降低尿素浓度，最后置于无尿素的缓冲液(10mmol/L Tris-HCl,0.15mmol/L NaCl,PH＝9.0)透析24h，随后取适量的PEG-20000置于平皿中，将透析袋放入其中进行浓缩，随时观察是否有的蛋白聚集。将浓缩好的蛋白使用滤头过滤，保存于-80℃。
2.0.4目的蛋白浓度测定
(1)分别制备50ug/mL，100ug/mL，150ug/mL，200ug/mL，250ug/mL，300ug/mL BSA标准品。(2)吸去不同浓度BSA标准品0.1mL，加入Bradford 0.9mL，混匀后静置2min，同时以ddH2O作为对照。(3)将重组蛋白以1:5，1:10倍稀释，取0.1mL，加入Bradford 0.9mL。与标准品颜色进行对比。Smart SpecTM-3000核酸蛋白检测仪测定蛋白浓度。
2.1制备鼠ZPoIFN-λ3多克隆抗体
首免：将纯化的藏猪IFN-λ3融合蛋白与弗氏完全佐剂等量混合，待乳化完全，以50ug/只蛋白含量的蛋白对小鼠进行腹腔注射；二免：首免两周后，将纯化的藏猪IFN-λ3融合蛋白与弗氏不完全佐剂按照1:1的比例乳化完全，每只昆明鼠按照50ug蛋白含量进行腹腔注射；三免：首免四周后，方法同二免相同；四免：首免六周后，方法同二免；于四疫后第7天进行心脏采血，并分离血清，将收集到的血清置于-80℃保存。
2.2Western Blotting检测
将复性的藏猪IFN-λ3融合蛋白在12％浓度分离胶进行SDS-PAGE电泳分离后，置于转印槽中，以90V电压冰浴转印40min至PVDF膜上，进行Western Blotting鉴定。
2藏猪IFN-λ3融合蛋白抗病毒效价测定
使用细胞病变抑制法，测定藏猪IFN-λ3融合蛋白在MDBK细胞抗VSV病毒效价。将生长良好的MDBK细胞使用胰酶消化，接种于96孔细胞培养板，置于培养箱中培养直到长至80％，将藏猪IFN-λ3融合蛋白用含2％胎牛血清的DMEM培养基进行2倍连续梯度稀释，以100uL/孔剂量加入培养孔中，每个浓度设置8个重复孔，置于培养箱24h后弃去液体，VSV病毒使用无血清DMEM培养基稀释，接种100TCID50病毒，于接毒后24h开始观察细胞病变，连续观察3d，同时设正常细胞对照和病毒对照，按照Reed-Muench法计算藏猪IFN-λ3融合蛋白的抗病毒效价。
3结果与分析
3.1藏猪IFN-λ3成熟肽基因克隆
通过Signal P分析藏猪IFN-λ3存在23个氨基酸的信号肽，根据编码ZPoIFN-λ3成熟肽基因重新设计引物，扩增成熟肽基因片段，在500bp左右获得目的条带。与预期大小一致(图3)。将ZPoIFN-λ3成熟肽基因克隆至pMD19-T(pMD19-T-mZPoIFN-λ3)。
3.2藏猪IFN-λ3成熟肽基因原核表达载体的构建
将藏猪IFN-λ3成熟肽基因与pET-32a(+)双酶切回收后，使用Solution Ⅰ进行过夜连接，转化至DH5α感受态细胞，对转化后菌株抽提质粒，对质粒进行PCR鉴定(图4)，以及双酶切鉴定(图5)，均可获得与目标一致的片段。将阳性质粒命名为pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3。
3.3藏猪IFN-λ3重组蛋白原核表达
将经鉴定为阳性的重组质粒pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3转化至表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含Amp+抗性的LB平板上，待长出单个菌落后，挑取阳性菌落扩大培养，测定OD600为0.6时,加入终浓度为1mM的IPTG在空气摇床中37℃诱导4h，SDS-PAGE电泳检测，结果显示在25-35KD之间出现一条特异性条带。表明重组质粒pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3经诱导后得到了表达，目的蛋白大小约为34KD(图6)。
3.3.1藏猪IFN-λ3融合蛋白诱导时间优化
pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3转化BL21(DE3)的菌株培养至对数生长期，加入IPTG至终浓度为1mM，在37℃条件于空气摇床中进行诱导，在诱导后1h、2h、3h、4h、5h分别取样进行SDS-PAGE分析，结果显示在不同诱导时间均有目的蛋白表达，且呈现一定的时间依赖，诱导5h蛋白表达量最多(图7)。因此选择诱导5h作为诱导的最佳时间。
3.3.2藏猪IFN-λ3融合蛋白IPTG浓度优化
pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3转化BL21(DE3)的菌株培养至对数生长期，使用终浓度为0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM或1.0mM的IPTG，在摇床中37℃诱导5h。SDS-PAGE结果显示(图8)，IPTG终浓度为0.4mM时目的蛋白表达量最大。
3.3.3重组蛋白纯化和Westren blotting鉴定
利用融合蛋白的组氨酸标签，将洗涤后的包涵体通过Ni-NTA亲和层析法去除杂蛋白，用含250mmol/L咪唑洗脱液洗脱，洗脱液通过SDS-PAGE检测为单一条带(图9)。洗脱蛋白通过透析法复性以及PEG-20000浓缩，使用考马斯亮蓝G250法测定蛋白浓度为1.13mg/ml。使用纯化后融合蛋白制备鼠ZPoIFN-λ3多克隆抗体，将纯化的pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3表达的藏猪IFN-λ3成熟蛋白经12％SDS-PAGE电泳分离后，置于转膜槽中冰浴转膜，90V电压转膜40min，使用制备的鼠高免血清作为一抗，进行Western Boltting鉴定。结果显示在目的蛋白处出现条带(10)，说明原核表达的藏猪IFN-λ3融合蛋白具有良好的免疫原性。
3.4重组藏猪IFN-λ3蛋白抗病毒活性效价测定
如表1和图3-8，pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3表达的藏猪IFN-λ3融合蛋白的抗病毒效价采用细胞病变抑制法，使用MDBK/VSV系统进行测定。通过计算可得：距离比＝高于50％的百分比一50/高于50％的百分比一低于50％的百分比＝75—50/75—25＝0.5，pET-32a(+)-mPoIFN-λ3表达蛋白在MDBK/VSV系统的抗病毒效价为10×24.5IU/0.1mL，蛋白质浓度为1.13mg/mL，比活力为2×103IU/mg。
表1 ZPoIFN-λ3抗病毒活性效价测定
实施例3藏猪IFN-λ3抗猪轮状病毒活性研究
1试验方法
1.1轮状病毒SC-R株的培养及TCID50测定
1.1.1轮状病毒SC-R株培养
将猴胚胎肾细胞MA104置于37℃，5％CO2培养箱中，待细胞长至90％。PoRV SC-R株病毒液中加入胰酶使胰酶终浓度为25ug/mL，置于培养箱中处理1h，吸取处理后的病毒液100uL接种与MA 104细胞中，37℃吸附1h后，加入含有10ug/mL胰酶的无血清DMEM培养基，待细胞病变达到80％左右时，即可收获病毒液。
1.1.2轮状病毒SC-R株TCID50测定
将MA104细胞经胰酶消化后均匀铺于96孔板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养直至长至90％，将PoRVSC-R株加入胰蛋白酶25ug/mL，置于培养箱中处理1h。在EP管中将病毒液用含有10ug/mL胰蛋白酶的无血清DMEM培养基连续10倍稀释，将每个稀释度设置8个重复孔，同时以未接毒的细胞设置为对照。随后将接毒后的96孔培养板置于培养箱中，每日在显微镜下观察和记录出现细胞病变的细胞孔数，连续观察5天。按照Reed-Muench法计算轮状病毒SC-R株的TCID50。
1.2引物设计
1.2.1轮状病毒荧光定量引物设计
根据NCBI公布的PoRV序列，选取VP6基因片段作为扩增目标片段，利用Primer 5.0设计扩增引物。引物序列如下：PoRV-F:5’-TTCGGATTACTTGGCACTA-3’；PoRV-R:5’-TAGCCATTTCATCCATACAC-3’。
1.2.2ISGs荧光定量引物设计
根据GeneBank公布的猪β-actin、ISG15、MxA、OASL序列，设计检测这些序列的实时荧光定量PCR引物。引物序列如表2所示。
表2 ISGs Real-time PCR引物序列
1.2.3猪轮状病毒荧光定量标准曲线构建
提取培养的PoRVSC-R株病毒RNA，对其进行反转录，并以反转录的cDNA为模板，PoRV-F和PoRV-R为上下游引物进行PCR扩增，得到单一的目的条带。对目的条带进行纯化后克隆至pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH5α中，进行鉴定。并抽取鉴定为阳性菌株的质粒作为标准品。以阳性质粒为模板进行反应条件优化，50℃～60℃优化反应退火温度，调节引物比例优化反应体系。从而确定最佳反应体系及退火温度。使用核酸蛋白仪测定标准品浓度，使用双蒸水将其进行连读10倍梯度稀释得到标准样品，使用一下公式计算其拷贝数。参照优化的反应体系及退火温度进行定量PCR扩增，就各浓度及对应的Ct值建立标准曲线，得到线性方程。
1.2.4ZPoIFN-λ3在MA104和IPEC-J2抗PoRVSC-R株活性研究
取生长状态良好的MA104细胞和IPEC-J2细胞，2×105每孔分别均匀铺于24孔板，置于37℃，5％CO2培养箱中，待细胞长至80％，分别加入10、100、1000ng/mL的ZPoIFN-λ3，置于培养箱中24h，同时设定空白对照组，每孔3个重复。接种0.1MOI剂量的PoRVSC-R株于MA104细胞和IPEC-J2细胞，36h后收获细胞悬液，反复冻融三次。Q-PCR方法测定病毒含量，并计算抑制率。
取生长状态良好的MA104细胞，置于37℃，5％CO2培养箱中，待细胞长至80％，分别加入100ng/mL的ZPoIFN-λ3，置于培养箱中24h，同时设定空白对照组。接种0.1MOI剂量的PoRVSC-R株于MA104细胞，于接毒后12、24、36h收获病毒。Q-PCR方法测定病毒核酸拷贝数。
1.2.5IFN-α与ZPoIFN-λ3联合使用对抗PoRVSC-R株活性研究
取生长状态良好的IPEC-J2细胞，置于37℃，5％CO2培养箱中，待细胞长至80％，单独加入0、0.1、1、10ng/mLZPoIFN-λ3或者0、10、100、1000IU/mL猪IFN-α重组蛋白或者联合IFN-α+ZPoIFN-λ3(10IU/mL+0.1ng/mL，100IU/mL+1ng/mL，1000IU/mL+10ng/mL)预处理IPEC-J2细胞，置于培养箱中24h，同时设定空白对照组。接种0.01MOI剂量的PoRVSC-R株于IPEC-J2细胞，36h后收获病毒。按照前述方法测定病毒的TCID50。
1.2.6IFN-α与ZPoIFN-λ3联合使用抗病毒蛋白转录情况
取生长状态良好的IPEC-J2细胞，置于37℃，5％CO2培养箱中，待细胞长至80％，单独加入0、0.1、1、10ng/mLZPoIFN-λ3或者0、10、100、1000IU/mL猪IFN-α重组蛋白或者联合加入IFN-α+ZPoIFN-λ3(10IU/mL+0.1ng/mL，100IU/mL+1ng/mL，1000IU/mL+10ng/mL)置于培养箱中，同时设定空白对照组，24h后收获细胞，以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法相对定量测定干扰素下游抗病毒蛋白ISG15、MxA、OASL的转录情况。
2结果与分析
2.1猪轮状病毒SC-R株培养
MA104细胞接种PoRV后24小时，开始出现典型的细胞病变，具体表现为有合胞体形成，出现大量细胞碎片，细胞核固缩，空泡化，大片脱落，没有脱落的细胞出现拉网现象，细胞变细，胞浆相连(图11)，当CPE达80％以上时，收集病毒液。
2.2猪轮状病毒SC-R株TCID50测定
按照Reed-Muench法对PoRV SC-R株的TCID50进行测定。选择生长良好的MA104细胞接种于96孔细胞培养板孔中，待细胞长满至90％后，将PoRVSC-R株加入胰蛋白酶25ug/mL，置于培养箱中处理1h。在EP管中将病毒液用含有10ug/mL胰蛋白酶的无血清DMEM培养基连续10倍稀释，以100uL/孔剂量接种于96孔细胞培养板中，每个病毒稀释度加入8个细胞孔，同时设置8个细胞孔不接毒作为对照。置于细胞培养箱中。每日在显微镜下观察并记录出现CPE的细胞孔数，连续观察5天，结果如下表3。通过计算可得，该毒株的TCID50为10-5.29/0.1mL。
表3 PoRV SC-R株TCID50测定
2.3猪轮状病毒荧光定量方法建立
以PoRVSC-R株RNA反转录的cDNA为模板，通过PCR方法成功扩增约118bp的目的片段。将目的产物胶回收连接到pMD19-T载体转化至大肠杆菌DH5α中，通过挑斑纯化筛选出阳性克隆。将阳性克隆子扩大培养后抽提质粒。对反应条件和体系进行优化，确定最佳退火温度为54℃，最适引物浓度10pM。对已知浓度的标准阳性质粒进行10倍连续稀释，通过荧光定量PCR方法，以优化的反应条件和反应体系进行扩增，得到标准曲线，方程式为y＝-3.315x+38.919(E＝100.3％，R2＝1.000)(图12)。各反应熔融温度均为75.00℃，出现单一熔融峰，证明无引物二聚体及非特异性扩增。
2.4ZPoIFN-λ3抗PoRVSC-R株活性研究
将ZPoIFN-λ3原核表达产物以0、10、100、1000ng/mL的剂量预处理IPEC-J2细胞和MA104细胞24h后，接种0.1MOIPoRVSC-R株，于接种后36h收集细胞悬液，反复冻融三次后，Q-PCR检测样品PoRVVP6基因的mRNA水平，结果不同剂量的原核表达产物在病毒接种IPEC-J2细胞和MA104细胞后均能有效地抑制PoRV SC-R株的增殖，并呈现剂量依赖性，且低浓度的ZPoIFN-λ3(100ng/mL和10ng/mL)在IPEC-J2细胞的抗PoRV活性显著强于在MA104细胞的活性，高浓度(1000ng/mL)则差异不显著(图13A)。将100ng/mL的ZPoIFN-λ3原核表达产物预处理MA104细胞，置于细胞培养箱中24h，随后于接种0.1MOIPoRVSC-R株后第12h、24h和36h分别收获细胞悬液，经过三次反复冻融，抽取总RNA，Q-PCR检测PoRVSC-R株VP6基因mRNA的水平，结果显示在接毒后36h内，ZPoIFN-λ3原核表达均能有效抑制PoRVSC-R株的增殖，并且呈现时间依赖，但接种病毒后12h时对病毒的抑制率最高(图13B)。
2.5ZPoIFN-λ3联合IFN-α抗PoRVSC-R株活性研究
以0、0.1、1、10ng/mL ZPoIFN-λ3或者0、10、100、1000IU/mL猪IFN-α重组蛋白单独或者联合加入IFN-α+ZPoIFN-λ3(10IU/mL+0.1ng/mL，100IU/mL+1ng/mL，1000IU/mL+10ng/mL)预处理IPEC-J2细胞24h，接0.01MOI PoRV SC-R株，于接种后36h收集细胞悬液，反复冻融三次后，以TCID50测定病毒滴度。结果显示所有剂量二者联合应用均没有ZPoIFN-λ3单独应用抑制PoRV SC-R株增殖的活性强(图14)。
2.6抗病毒蛋白转录
以0、0.1、1、10ng/mLZPoIFN-λ3或者0、10、100、1000U/mL IFN-α单独或者联合加入IFN-α+ZPoIFN-λ3(10IU/mL+0.1ng/mL,100IU/mL+1ng/mL,1000IU/mL+10ng/mL)预处理IPEC-J2细胞，24h后收获细胞，反复冻融三次，以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法相对定量测定干扰素下游抗病毒蛋白ISG15、MxA、OASL的转录情况。结果显示单独使用ZPoIFN-λ3诱导的抗病毒蛋白转录高于联合应用，与抗病毒结果趋势一致(图15)。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 重组藏猪IFN-λ3成熟肽的克隆及表达方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggccctgg gtggct 16
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcagacacac aggtctccac 20
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcggatccg tgcctgtccc tgaagccc 28
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccaagcttt cagacacaca ggtctccac 29

Claims (8)

1.一种藏猪IFN-λ3成熟肽的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以从藏猪肺脏与肠道中提取的IFN-λ3总RNA为模板，P1、P2为引物，反转录后进行PCR扩增；
上游引物P1:5’-ATGGCCCTGGGTGGCT-3’；
下游引物P2:5’-TCAGACACACAGGTCTCCAC-3’；
2)对扩增的藏猪IFN-λ3基因进行纯化，与载体pMD19-T16℃连接过夜，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中培养，获得的菌液抽提质粒命名为pMD19-T-ZPoIFN-λ3；
3)以上述的pMD19-T-ZPoIFN-λ3的质粒为模板，P3和P4为上下游引物，进行PCR扩增，将产物纯化后转化至DH5α感受态细胞中培养。
上游引物P3:5’-CGCGGATCCGTGCCTGTCCCTGAAGCCC-3’；
下游引物P4:5’-CCCAAGCTTTCAGACACACAGGTCTCCAC-3’。
2.一种用以扩增IFN-λ3全长基因的引物，其特征在于，所述的引物为P1和P2。
3.一种用以扩增IFN-λ3成熟肽基因的引物，其特征在于，所述的引物为P3和P4。
4.一种藏猪IFN-λ3基因的载体，其特征在于，所述的载体为pET-32a(+)。
5.权利要求1重组藏猪IFN-λ3成熟肽在大肠杆菌中的表达方法，其特征在于，利用BamHⅠ和HindⅢ双酶切pMD19-T-mZPoIFN-λ3得到mZPoIFN-λ3片段，与pET-32a(+)连接后转入大肠杆菌培养得到表达质粒pET-32a-mZPoIFN-λ3；将质粒pET-32a-mZPoIFN-λ3转化表达菌株BL21(DE3)感受态细胞中培养，离心处理收集菌体沉淀。
6.重组藏猪IFN-λ3成熟肽包涵体的纯化方法，其特征在于，洗涤权利要求7收集到的菌体沉淀，纯化得到包涵体。
7.重组藏猪IFN-λ3成熟肽包涵体复性与浓缩方法，其特征在于，将包涵体置于处理后的透析袋中进行进行缓慢透析，逐渐降低尿素浓度，最后置于无尿素的缓冲液透析，随后取适量的PEG-20000置于平皿中，将透析袋放入其中进行浓缩。
8.权利要求1所述的藏猪IFN-λ3成熟肽在制备抗猪轮状病毒活性药物中的用途。
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CN118165125A (zh) * 2024-05-14 2024-06-11 北京伟杰信生物科技有限公司 一种重组猪干扰素λ1、猪干扰素γ和猪SA的融合蛋白及其应用

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