CN109810976B - 猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备方法及应用，包括如下步骤：（1）SVV/GD05株基因组全序列的扩增；（2）pSVV‑GD05病毒感染性克隆质粒的构建；（3）pSVV‑GD05‑iLOV重组质粒的构建；（4）亲本病毒（SVV‑GD05）与重组病毒（SVV‑GD05‑iLOV）拯救。本发明利用一株分离自中国猪群的SVV毒株，构建出以细菌质粒为骨架的病毒感染性克隆pSVV‑GD05，并能成功拯救出病毒。同时，将报告基因iLOV插入SVV感染性克隆病毒基因组中，成功拯救出能表达该报告基因的重组SVV病毒。本发明为深入开展SVV的基础和应用研究提供了有效的平台，具有重要的科学应用价值。

Description

猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备方法及应用。

背景技术

塞内卡病毒(Seneca Valley Virus,SVV)属于小RNA病毒科(Picorna viridae)塞内卡病毒属 (Senecavirus)的唯一成员，其基因组为单股正链RNA，长度约为7.28kb。病毒基因组由5’端非编码区(0.66Kb)，开放阅读框(ORF，6.54Kb)，3’端非编码区(0.07Kb)和多聚腺苷酸(polyA)组成。ORF是由L基因、P1结构蛋白基因、P2和P3非结构蛋白基因组成,共同编码一条长的多聚蛋白。这条聚合蛋白遵循L-4-3-4模式，经蛋白酶剪切后能被加工成12个结构和非结构蛋白，分别是L，1A(VP4)，1B(VP2)，1C(VP3)，1D(VP1)，2A，2B，2C，3A， 3B，3C，3D。

SVV-VP1基因序列分析显示，现有的SVV毒株可分为3个分支，分支1包括2002年分离的SVV-001株，分支2包括1988-1997年美国分离株，分支3包括巴西、加拿大、中国分离株和2001-2015年美国分离株。遗传进化树分析表明，近30年来SVV已发生变异，致病性明显增强。迄今为止，国内外研究人员对SVV在病毒生物学特性、致病机理、诊断试剂和疫苗研究等方面做了一些工作。但是，目前仍然缺乏有效的防控手段。因此，深入开展病毒的分子生物学特性、复制机制、致病机理等研究，将有利于我们全面透彻的了解SVV，从而为开发高效的SVV诊断试剂和疫苗提供理论依据。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明的目的是提供一种猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备方法及应用。本发明利用一株分离自中国猪群的SVV毒株，构建出以细菌质粒为骨架的病毒感染性克隆并能成功拯救出病毒。同时，将报告基因iLOV插入SVV感染性克隆病毒基因组中，成功拯救出能表达该报告基因的重组SVV病毒。本发明为深入开展SVV的基础和应用研究提供了有效的平台，具有重要的科学应用价值。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备用引物，包括如下引物：

本发明还提供一种猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备方法，包括如下步骤：

(1)SVV/GD05株基因组全序列的扩增；

(2)pSVV-GD05重组质粒的构建；

(3)pSVV-GD05-iLOV重组质粒的构建；

(4)亲本病毒(SVV-GD05)与重组病毒(SVV-GD05-iLOV)拯救；

步骤(1)、(2)和(3)中，使用权利要求1所述的猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备用引物。

步骤(1)和(2)中，提取SVV/GD05株的RNA，经过反转录得到cDNA；以cDNA 为模板分别用扩增片段B、C、E、F的引物通过PCR扩增得到B、C、E、F片段；以A、 D的引物扩增分别得到A、D片段；分别用引物对CMV-F/967R、7381F/8213R通过overlap，得到AB、CD片段后，将AB片段克隆至pEGFP-C3载体，得到pC3-GD05-AB；将CD片段插入pC3-GD05-AB，得到重组质粒pC3-GD05-ABCD；最后将E，F片段插入 pC3-GD05-ABCD，得到pSVV-GD05。

步骤(3)中，用引物对VP-1465F/LOV-R3扩增得到P片段；以pSVV-GD05质粒为模板，用引物对2B-F3/2B-R，2B-F2/3C-R1分别扩增得到Q1和2C-3C；将Myc-T2A-F与 Q1基因片段先进行三个PCR循环后,加入引物Myc-F1/2B-R，进行PCR扩增，通过overlap 得到Q片段；将P、Q、2C-3C插到pSVV-GD05，最后得到pSVV-GD05-iLOV。

步骤(4)中，pSVV-GD05转染BHK-21细胞后，可拯救亲本病毒SVV-GD05；而 pSVV-GD05-iLOV转染BHK-21细胞后，可拯救重组病毒SVV-GD05-iLOV。

本发明还提供前述的引物或前述的制备方法在制备SVV诊断试剂和/或疫苗中的应用，以及前述的制备方法制备的猪塞内卡病毒全长感染性克隆。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明利用一株分离自中国猪群的SVV毒株，构建出以细菌质粒为骨架的病毒感染性克隆并能成功拯救出病毒。同时，将报告基因iLOV插入SVV感染性克隆病毒基因组中，成功拯救出能表达该报告基因的重组SVV病毒。本发明为深入开展SVV的基础和应用研究提供了有效的平台，具有重要的科学应用价值。

插入报告基因到小RNA病毒基因组中，一般病毒传至3-5代后，报告基因出现大量的缺失，表明外源基因在病毒基因组中不稳定；而本发明的SVV-GD05-iLOV，传到第10代，报告基因仍然稳定存在于病毒基因组，未发现基因缺失现象。此种报告病毒可用作工具，在该病毒的基础和应用研究中起重要作用。

附图说明

图1:SVV基因组结构图：A:SVV-GD05基因组结构图；B:SVV-GD05-iLOV基因组结构图；

图2:病毒感染ST-R细胞：A:SVV-GD05病毒感染ST-R细胞IFA(20×)；B:正常ST-R细胞(20×)；C:SVV-GD05-iLOV病毒感染ST-R细胞(10×),D:SVV-GD05-iLOV病毒感染ST-R细胞(20×)；

图3:SVV-GD05-iLOV感染ST-R细胞，RT-PCR验证SVV-GD05-iLOV在ST-R细胞上的遗传稳定性：1:pSVV-GD05；2:pSVV-GD05-iLOV；3、4、5分别是SVV-GD05-iLOV感染 ST-R细胞，获得的P3、P6和P10代病毒液；

图4:SVV-GD05-iLOV感染ST-R IFA(63×)：A：使用抗Myc标签兔单克隆抗体检测；B: 使用抗VP1蛋白单克隆抗体检测；C:正常ST-R DAPI染色；

图5:SVV-GD05与SVV-GD05-iLOV感染ST-R细胞，Western Blot检测分析结果；

图6:SVV-GD05和SVV-GD05-iLOV在ST-R细胞上的空斑：A:SVV-GD05,B：SVV-GD05-iLOV；

图7:SVV-GD05和SVV-GD05-iLOV在ST-R细胞上的生长动力学曲线。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

1材料与方法

1.1病毒、细胞、菌株及参考序列

SVV/GD05毒株(GenBankaccession numbers:MH316116)于2017年底分离自广东某猪场，由本实验室分离保存。BHK-21细胞、ST-R细胞(猪睾丸细胞)、pEGFP-C3载体、大肠杆菌TOP10感受态细胞由本实验室保存。

1.2主要试剂和仪器

限制性内切酶、Prime STARTM DNA Polymerase、Taq^TM、TaKaRa MiniBEST ViralRNA/DNA Extraction Kit、PrimeScript^TM1st Strand cDNA Synthesis Kit、DL5000DNAmarker 均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；Agarose Gel DNA Purification Kit购自Axygen； Gibson Assembly Kit购自NEB；VP1单抗由本实验室提供；Dylight549,GoatAnti-Rabbit IgG 购自Abbkine；VersaDoc凝胶成像系统、PCR仪购自Bio-Rad公司；荧光显微镜购自德国LeiCa公司。

1.3引物设计

根据已经公布的SVV毒株全基因组序列设计引物，由南京擎科生物有限公司合成(如表1)。

表1全长感染性克隆所需引物

注：F正向引物，R：反向引物.引物中的限制性内切酶位点用下划线标出.

所述的长度(bp)指各基因片段的长度。

表1中，引物从上至下依次为SEQ ID No.1-20。

1.4 SVV/GD05株基因组全序列的扩增

首先按TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit说明书操作，提取SVV/GD05 的RNA，然后按PrimeScript^TM1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书操作，得到cDNA。以 cDNA为模板，分别用引物B(SEQ ID No.3-4)、C(SEQ ID No.5-6)、E(SEQ ID No.9-10)、 F(SEQ ID No.11-12)通过PCR扩增，得到B、C、E、F片段；用引物A(SEQ ID No.1-2)、 D(SEQ ID No.7-8)扩增，分别得到A、D片段；凝胶纯化回收A、B、C、D、E、F片段备用。利用引物对CMV-F/967R、7381F/8213R，将片段A、B、C、D通过overlap方法得到AB、CD片段；将AB片段克隆至pEGFP-C3载体，得到pC3-GD05-AB；将CD片段插入到pC3-GD05-AB，得到pC3-GD05-ABCD；最后通过Gibson Assembly方法，将E、F 片段插入到pC3-GD05-ABCD，得到pSVV-GD05，将其送到南京擎科生物有限公司进行全长测序。

pSVV-GD05感染性克隆质粒中病毒全长基因组序列见SEQ ID No.21。

1.5 pSVV-GD05-iLOV重组质粒的构建

用引物VP-1465F/LOV-R3扩增，得到P片段；以pSVV-GD05质粒为模板，用引物 2B-F3/2B-R，2B-F2/3C-R1分别扩增，得到Q1片段和2C-3C片段；将引物Myc-T2A-F按 1:100稀释，与Q1片段先进行三个PCR循环，然后加引物Myc-F1/2B-R进行PCR扩增，得到Q片段；最后，利用Gibson Assembly方法连接P、Q、2C-3C和pSVV-GD05，得到 pSVV-GD05-iLOV，将其送到南京擎科生物有限公司进行全长测序。

pSVV-GD05-iLOV感染性克隆质粒中重组病毒全长基因组序列见SEQ ID No.22；基因组结构图见图1。

1.6病毒拯救

按Lipofectamine^TM3000Reagent试剂盒说明书操作，当单层BHK-21细胞生长铺满至70％-80％时，取2.5μg样品进行转染，同时设置不进行转染的阴性孔做对照，转染后6h弃去细胞上清液，加入2mL含10％胎牛血清的DMEM培养基，放置到37℃,5％CO₂培养箱继续培养；pSVV-GD05转染72h后收获上清，将上清吸取200μL接种到ST-R细胞上，2h 后换液，加入2mL含2％胎牛血清的DMEM培养基，放置到37℃5％CO₂培养箱继续培养，每天观察病变，24h发现大部分细胞变圆皱缩，48h发现80％细胞单层脱落，然后离心收集病毒，将拯救出的病毒命名为SVV-GD05；而pSVV-GD05-iLOV转染48h后观察荧光， 60h荧光达到高峰，72h将其离心收集病毒，病毒命名为SVV-GD05-iLOV，置于-80℃备用。

1.7拯救病毒的鉴定

1.7.1 SVV-GD05-iLOV在ST-R细胞上的遗传稳定性分析

取拯救的SVV-GD05-iLOV在ST-R细胞上连续传代10次，获得P1至P10代病毒液；传代期间观察荧光稳定性，待病毒能够稳定传代后，分别提取P3，P6和P10代病毒液RNA，采用RT-PCR分析病毒液，检测SVV-GD05-iLOV在ST-R细胞上的遗传稳定性。

1.7.2间接免疫荧光检测抗原

取SVV-GD05-iLOV的P3代病毒液，按MOI＝0.1接种到ST-R细胞上，同时设置空白对照，接毒后2h换维持液，18h后用PBS洗2遍，加4％多聚甲醛室温固定10min，用PBS 洗2遍；终浓度用2％BSA和0.1％TritonX-100封闭打孔，用PBS洗2遍；用抗VP1蛋白的单克隆抗体和抗Myc标签兔单克隆抗体按1:1000稀释，37℃孵育1h，用PBS洗3遍； Dylight 549Goat Anti-Mouse/Rabbit IgG按1:1000稀释，37℃孵育1h，用PBS洗2遍；用DAPI按1:10稀释，室温染色3min，用PBS洗2遍；滴加甘油封片，用共聚焦显微镜观察并拍照。

1.7.3 Western Blot检测蛋白表达

取SVV-GD05-iLOV的P3代病毒液与SVV-GD05病毒液，按MOI＝0.1接种到ST-R 细胞上，接毒后2h换维持液，然后分别在病毒感染后18h和24h收集蛋白样品。其中，一抗使用抗Myc标签兔单克隆抗体，二抗使用HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG。

1.7.4空斑表型

取SVV-GD05-iLOV的P3代病毒液与SVV-GD05病毒液，稀释成100TCID₅₀、200TCID₅₀、400TCID₅₀，接种到ST-R细胞上，将接种好病毒液的六孔板置于37℃5％CO₂的培养箱中吸附2h，弃掉上清，将2×DMEM(含有4％FBS+2％双抗)和2％Agarose等体积混匀，每孔加入4mL，置于室温凝固，然后倒置于37℃，5％CO₂的培养箱中静置培养，48h后用1％福尔马林固定过夜，将培养基弃掉，用0.5％的结晶紫染色20min。

1.7.4生长曲线的测定

取SVV-GD05-iLOV的P3代病毒液与SVV-GD05病毒液，按MOI＝0.1接种到ST-R细胞上(六孔板)，每个孔设置复孔，2h换维持液，然后分别在接种病毒液毒后6h、12h、24h、 36h、48h、60h收毒，测TCID₅₀。

2.结果

2.1拯救病毒的鉴定

2.2 SVV-GD05-iLOV遗传稳定性分析及用免疫荧光检测SVV-GD05

取拯救的SVV-GD05-iLOV在ST-R细胞上连续传代10次，获得P0至P10代病毒液，传代期间观察荧光稳定性，发现荧光较稳定(图2)；采用RT-PCR分析SVV-GD05-iLOV 在ST-R细胞上获得的P3，P6和P10代病毒液，证实SVV-GD05-iLOV在ST-R细胞上能够稳定遗传(图3)；取拯救的SVV-GD05接种到ST-R细胞上，用抗VP1蛋白的单克隆抗体检测，倒置荧光显微镜下观察有特异性的绿色荧光(图2)。

2.2间接免疫荧光检测抗原

取SVV-GD05-iLOV的P3代病毒液，按MOI＝0.1接种到ST-R细胞上，同时设置空白对照，分别对其进行间接免疫荧光染色，检测病毒蛋白的表达。共聚焦显微镜观察，结果表明，将SVV-GD05-iLOV接种在ST-R细胞上，有红色荧光产生，而作为空白对照的正常ST-R细胞，无特异荧光产生(图4)。表明SVV-GD05-iLOV感染的ST-R细胞，有SVV蛋白的表达，同时也表明拯救出了具有感染性的SVV病毒。

2.3 Western Blot检测蛋白表达

取SVV-GD05和SVV-GD05-iLOV感染ST-R细胞，制备全细胞裂解物通过Western 印迹分析。探测SVV-GD05-iLOV感染的ST-R细胞样品中存在目的蛋白(图5)。

2.3空斑表型分析

为了描述病毒的生长特性和复制能力，分别对SVV-GD05和SVV-GD05-iLOV进行了空斑表型分析。空斑实验表明，SVV-GD05和SVV-GD05-iLOV均可在ST-R细胞上形成空斑，但SVV-GD05-iLOV的空斑形态较SVV-GD05小(图6)。

2.4拯救病毒的生长曲线

为了进一步了解SVV-GD05-iLOV的生长特性，将拯救的SVV-GD05-iLOV的P3代病毒液与SVV-GD05，按MOI＝0.1接种到ST-R细胞上，做病毒生长曲线分析(图7)。结果表明，SVV-GD05-iLOV与SVV-GD05具有相似的复制能力和增殖特性，均在感染后12h达到最高滴度。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备方法及应用

<130> xhx2019021201

<141> 2019-02-12

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

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<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ctgtgcctct agcaaacaca gccggtt 27

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gatctagtca ctctggcctc tctc 24

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gacgtggaag agaacccagg acctgcttct gacaacccaa tcttgg 46

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ccacctcttt gactaggtca cgaac 25

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gagcagaaac tcatctctga agaggatctg gaaggtcgag ggtctttgct gacatgtggg 60

gacgtggaag agaacccagg a 81

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<212> DNA

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<213> Seneca Valley Virus

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ccaactcagt ttattctgct gatggttggt ttagcctgca caagctgacc aaaattactc 2580

taccacctga ctgcccacag agtccctgta ttctcttttt tgcctctgct ggtgaggact 2640

acaccctccg tctccctgtt gattgtaatc cttcctacgt gttccactct actgacaacg 2700

ccgagactgg ggttattgag gcaggtaaca ctgacaccga tttctctggt gaactggcgg 2760

ctcctggctc taaccacact aatgtcaagt tcctgtttga tcgatctcga ctactgaatg 2820

taattaaggt actggagaag gacgccgtct tcccccgtcc tttccccaca gcaacaggtg 2880

cacagcagga cgatggttac ttttgtcttc taacaccccg cccaacggtc gcctcccgac 2940

ccgccactcg tttcggcctg tacgtcaatc cgtctgacag tggcgttctc gctaacactt 3000

cactggattt caatttttac agcttggcct gtttcactta ctttagatca gaccttgaag 3060

tcacggtggt ctcactagag ccagacttgg aattcgctgt agggtggttc ccctctggca 3120

gtgaatacca agcttctagc tttgtctacg accaactgca tgtaccctac cactttactg 3180

ggcgtactcc ccgcgctttc accagcaagg gtggaaaggt atctttcgtg ctcccttgga 3240

actctgtctc atccgtgctt cccgtgcgct gggggggcgc ttccaagctt tcttctgcca 3300

cgcggggtct gccggctcat gctgactggg ggaccattta cgcctttatc ccccgtccta 3360

atgagaagaa aggcaccgct gtaaagcacg tggcggtgta cgttcggtac aagaacgcgc 3420

gtgcttggtg ccccagcatg cttccctttc gcagctacaa gcagaagatg ctgatgcaat 3480

caggcgacgt cgagaccaac cctggccctg cttctgacaa cccaatcttg gagtttcttg 3540

aagcggaaaa cgatctagtc actctggcct ctctctggaa gatggtacac tctgttcaac 3600

agacttggag aaagtatgtg aagaacgaca gtttttggcc taatttgctc agtgagctag 3660

tgggggaagg ctccatcgcc ttggccgcca cgctatctaa ccaagcttca gtaaaagctc 3720

tcttgggcct gcattttctc tctcgaggac tcaattacac agatttttat tctttactga 3780

tagagaaatg ctctagtttc tttactgtag aaccgcctcc tccaccagct gaaaatctga 3840

tgaccaagcc ctccgtgaag tcgaaattcc gtaagctgtt taagatgcaa ggacccatgg 3900

acacagtcaa agactggaac caaatagccg ccggcctgaa gaatttccaa tttgttcgtg 3960

acctagtcaa agaggtggtc gactggctcc aggcctggat taataaagag aaagccagcc 4020

ctgtcctcca gtaccagttg gagatgaaga aactcgggcc cgtggctttg gctcatgatg 4080

ccttcatggc cggttccggg ccccctcttg gtgacgacca aattgaatac ctccagaacc 4140

tcaaatctct tgccctaaca ctggggaaga ctaacttggc ccaaagtctc accactatga 4200

tcaatgccaa gcaaagctcc gcccaacgag tcgaacccgt tgtggtggtc cttagaggca 4260

agccgggatg cggcaaaagc ttggcctcca cgttgattgc ccaggctgtg tccaagcgtc 4320

tctacggctc acaaagtgtg tattctcttc ctccggatcc agacttcttc gacggataca 4380

aaggacagtt tgtaaccttg atggacgatc tgggacaaaa cccggatggg caagattttt 4440

ccaccttttg tcagatggtg tcgaccgccc aatttcttcc caacatggcg gaccttgcag 4500

agaaggggcg tcccttcacc tccaatctta tcattgcaac tacaaacctc cctcacttca 4560

gccctgtcac catcgctgat ccttctgcag tctctcgtcg tatcaactac gacctgactc 4620

tagaagtatc tgaggcctac aagaagcaca cacggctgaa ttttgacctg gctttcagac 4680

gcacagacgc cccccccatt tatccttttg ctgcccatgt gcctttcgtg gacgtggctg 4740

tgcgcttcaa aaatggtcac cagagcttca atctcctaga gttggtcgac tctatttgtg 4800

cagacattcg agccaagcaa caaggtgccc gaaatatgca gactctggtt ctacagagcc 4860

ctaatgagaa cgacgacacc cccgtcgacg aggcgttagg tagagttctc acccccgctg 4920

cggtcgacga ggcgcttgtc gatctcgctc cggatgccga cccggttggc cgcttggctg 4980

ttctcgccaa gctaggtctt gccctagctg cggtcacccc tggtttgata atcttggcag 5040

tcggactcta caggtacttc tctggctctg atacagacca agaagaaaca gaaagcgagg 5100

agcctgctaa agcgcctagg agcgagaatg cttatgacgg tccgaagaaa aactctaagc 5160

cccctggagc gctctctctt atggaaatgc aacagcccaa cgtggacatg ggctttgagg 5220

ctgcggttgc taagaaggtg gtcgtcccca ttaccttcat ggttcccaac agaccttctg 5280

gacttacaca gtccgctctt cttgtggccg gccggacctt cctaattaat gagcatacgt 5340

ggtccaaccc ctcctggacc agcttcacaa tccgtggtga ggtgcacact cgtgatgagc 5400

ctttccaaac ggttcatttt actcaccatg gtattcccac agatctggtg atggtacgtc 5460

tcggaccggg caactctttc cctaacaatc tagacaagtt tggacttgac cagatgccgg 5520

cacgtaactc ccgtgtggtt ggcgtttcgg ctagttacgg taatttcttc ttctctggga 5580

acttcctcgg atttgttgac tccatcacct ctgaccaagg aacttatgcg agacttttta 5640

ggtacagggt gacgacttac aagggatggt gcggttcggc cctggtctgt gaggccggtg 5700

gtgtccggcg catcattggc ttgcattctg ctggtgccgc tggtatcggc gccgggactt 5760

acatctcaaa attaggactg atcaaagccc ttaaacacct cggtgagcct ctggctacaa 5820

tgcaaggact aatgactgag ctagagcctg gagtcaccgt acatgtaccc cgaaaatcta 5880

aattgagaaa gacgaccgca cacgcggtgt acaaaccgga gtttgaacct gctgtgttgt 5940

caaaatttga tcccagactg aacaaggatg ttgacctaga tgaggtaatt tggtctaaac 6000

acactgccaa cgtcccttat caacctcctt tgttctacac atacatgtca gagtatgctc 6060

atcgggtttt ctcttttttg ggaaaagaca atgacatttt gaccgtcaaa gaagcaatct 6120

tgggcatccc tggactagac cctatggatc cccacacagc tccgggtctg ccctacgccg 6180

ttagcggcct tcgacgcact gatctcgtcg attttgcgag cggcacggta gacccggcac 6240

tggccatgca aatccagaag ttcttgaacg gtgactactc tgatcatgtc ttccaaactt 6300

ttctgaaaga tgaaatcaga ccctcagaga aggtccgagc gggaaaaacc cgcattgtcg 6360

atgtgccctc cctggcgcac tgtattgtgg gcagaatgtt gcttgggcgc tttgccgcca 6420

agtttcaatc ccatcctggc tttctccttg gctccgctat cgggtctgac cctgatgtct 6480

tctggaccgt cataggggct cagctcgagg gaagaaagaa cacgtatgac gtggactata 6540

gtgcctttga ctcttcacac ggcactggct ccttcgaggc tctcatctct cactttttca 6600

ccgtggacaa tggttttagc cctgcgctgg gaccgtatct cagatccctg gctgtctcgg 6660

tgcacgccta cggcgagcgt cgcatcaaga ttaccggagg cctcccctct ggttgtgccg 6720

cgaccagcct gctgaacaca gtgctcaaca atgtgatcat caggactgct ctggcattga 6780

cctacaagga atttgaatat gacatggttg atatcatcgc ctacggtgac gaccttctgg 6840

ttggtacgga ttacgatctg gacttcaatg aggtggcgcg gcgcgctgcc aaactggggt 6900

ataagatgac tcctgccaac aagggttctg tcttccctcc gacttcctct ctctccgatg 6960

ctgtttttct aaaacgcaaa ttcgtccaaa acaatgacgg cttatataaa ccagttatgg 7020

atttaaagaa tttggaagcc atgctctcct acttcaaacc aggaacacta ctcgagaagc 7080

tgcaatctgt ttctatgttg gctcaacatt ctggaaaaga agaatatgat agattgatgc 7140

accccttcgc tgactacggt gccgtaccga gtcacgagta cctgcaggca agatggaggg 7200

ccttgttcga ctgacctaga tagcccaacg cgcttcggtg ctgccggcga ttctgggaga 7260

actcagtcgg aacagaaaag ggaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 7312

<210> 22

<211> 7726

<212> DNA

<213> Seneca Valley Virus

<400> 22

tttgaaatgg ggggctgggc cctcatgccc agtccttcct ttccccttcc ggggggtaaa 60

ccggctgtgt ttgctagagg cacagaggag caacatccaa cctgctcttg tggggaacgg 120

tgcggctcca attcctgcgt cgccaaaggt gttagcgcac ccaaacggcg catctaccaa 180

tgctattggt gtggtctgcg agttctagcc tactcgtttc tcccctatcc actcactcac 240

gcacaaaaag tgtgttgtaa ccgcaagatt tagccctcgc acgagatgtg cgataaccgc 300

aagattgact caagcgcgga aagcgctgta accacatgct gttagtccct ttatggctgc 360

gagatggcta tccacctcgg atcactgaac tggagctcga ccctccttag taagggaacc 420

gagaggcctt cttgcaacaa gctccgacac agagtccacg tgattgctac caccatgagt 480

acatggttct cccctctcga cccaggactt ctttttgaat atccacggct cgacccagag 540

ggtggggcat gatcccccta gcatagcgag ctacagcggg aactgtagct aggccttagc 600

gtgctttgga tactgcctga tagggcgacg gcctagtcgt gtcggttcta taggtagcac 660

atacaaatat gcagaactct catttttctt tcgatacagc ctctggcacc tttgaagacg 720

taaccggaac aaaagtcaag atcgttgaat accctagatc ggtgaacaat ggtgtttacg 780

attcgtccac tcatttggag atactgaacc tacagggtga aattgaaatt ttaaggtctt 840

tcaatgaata ccaaattcgc gccgccaaac aacaacttgg actggacatc gtatatgaac 900

tacagggtaa tgttcagaca acctcaaaga atgatttcga ttcccgcggc aataatggta 960

acatgacctt caattactat gcaaacactt atcagaattc agtagacttc tcgacctcct 1020

cgtcggcgtc aggcgccggg cccgggaact cccggggcgg attagcgggt ctcctcacaa 1080

atttcagtgg aatcttgaac cctcttggct acctcaaaga ccacaatacc gaagaaatgg 1140

aaaactctgc tgatcgagtc ataacacaaa cggcgggcaa cactgccata aacacgcaat 1200

catcactggg tgtgttgtgt gcctacgttg aagacccgac caaatctgac cctccgtcca 1260

gcagcacaga tcaacccacc accaccttta ctgccatcga taggtggtac actggacgcc 1320

tcaattcttg gacaaaagct gtaaaaacct tctcttttca ggccgtcccg ctccctggag 1380

ccttcctgtc tagacaggga ggcctcaatg gaggggcctt cacggccacc ctacatagac 1440

atttcttaat gaagtgcggg tggcaggtgc aggtccaatg caatttgaca caattccacc 1500

aaggtgctct tcttgttgcc atggtccccg aaaccaccct tgatgtcaag cccgacggca 1560

aggcaaagag cctacaggag ctgaatgaag aacagtgggt agaaatgtct gacgattacc 1620

ggaccgggaa aaacatgcct tttcagtctc ttggcacata ctatcggccc cctaactgga 1680

cttggggccc caatttcatc aacccctatc aagtaacagt tttcccacac caaattctga 1740

acgcgagaac ctctacctcg gtagatataa gtgtcccata catcggggag actcctacac 1800

aatcctcaga gacacagaac tcctggaccc tcctcgttat ggtgcttgtc cccctggact 1860

ataaggaggg agccacaact gacccagaaa ttacattttc tgtaaggcct acaagtcctt 1920

acttcaatgg gcttcgtaac cgtttcacga ccgggacgga cgaggaacag gggcccattc 1980

ccacagcacc cagagaaaat tcgcttatgt ttctctcaac catccctgac gacactgtcc 2040

ctgcttacgg gaatgtgcgt acccctcccg tcaattacct tcctggcgaa ataaccgacc 2100

tcttacaact ggcccgtata cccactctca tggcgtttgg gcgggtgtcc gaacccgagc 2160

ctgcctcaga cgcatatgtg ccctacgttg cggttcctgc ccagttcgac gacaagcctc 2220

tcatctcctt cccgatcacc ctttcagatc ctgtctacca gaacaccctg gtaggcgcca 2280

tcagttcgaa tttcgccaac taccgggggt gtatccaaat cactctgaca ttttgtggac 2340

ccatgatggc aagagggaaa ttcctactct cgtattctcc cccaaatgga acacaaccac 2400

agaccctttc tgaagctatg cagtgcacat actctatttg ggatataggc ttgaactcta 2460

gttggacctt tgtcatcccc tacatctcgc ccagtgatta ccgtgaaact cgggctatta 2520

ccaactcagt ttattctgct gatggttggt ttagcctgca caagctgacc aaaattactc 2580

taccacctga ctgcccacag agtccctgta ttctcttttt tgcctctgct ggtgaggact 2640

acaccctccg tctccctgtt gattgtaatc cttcctacgt gttccactct actgacaacg 2700

ccgagactgg ggttattgag gcaggtaaca ctgacaccga tttctctggt gaactggcgg 2760

ctcctggctc taaccacact aatgtcaagt tcctgtttga tcgatctcga ctactgaatg 2820

taattaaggt actggagaag gacgccgtct tcccccgtcc tttccccaca gcaacaggtg 2880

cacagcagga cgatggttac ttttgtcttc taacaccccg cccaacggtc gcctcccgac 2940

ccgccactcg tttcggcctg tacgtcaatc cgtctgacag tggcgttctc gctaacactt 3000

cactggattt caatttttac agcttggcct gtttcactta ctttagatca gaccttgaag 3060

tcacggtggt ctcactagag ccagacttgg aattcgctgt agggtggttc ccctctggca 3120

gtgaatacca agcttctagc tttgtctacg accaactgca tgtaccctac cactttactg 3180

ggcgtactcc ccgcgctttc accagcaagg gtggaaaggt atctttcgtg ctcccttgga 3240

actctgtctc atccgtgctt cccgtgcgct gggggggcgc ttccaagctt tcttctgcca 3300

cgcggggtct gccggctcat gctgactggg ggaccattta cgcctttatc ccccgtccta 3360

atgagaagaa aggcaccgct gtaaagcacg tggcggtgta cgttcggtac aagaacgcgc 3420

gtgcttggtg ccccagcatg cttccctttc gcagctacaa gcagaagatg ctgatgcaat 3480

caggcgacgt cgagaccaat cctggtccaa tcgagaagaa cttcgtgatt actgatcctc 3540

gtttacccga taaccccatc atcttcgcct ccgacggctt tttagagctg accgagtact 3600

ctcgtgagga gattttaggt cgtaacgcca gattcctcca aggccccgaa acagaccaag 3660

ctaccgtgca gaagattcgt gacgccattc gtgaccagag ggagaccacc gttcaattga 3720

ttaactatac taagagcggc aagaaatttt ggaatttatt acatttacaa cccgttcgtg 3780

atcaaaaggg cgaattacaa tacttcatcg gcgttcaatt agatggttct gatcacgtgg 3840

agcagaaact catctctgaa gaggatctgg aaggtcgagg gtctttgctg acatgtgggg 3900

acgtggaaga gaacccagga cctgcttctg acaacccaat cttggagttt cttgaagcgg 3960

aaaacgatct agtcactctg gcctctctct ggaagatggt acactctgtt caacagactt 4020

ggagaaagta tgtgaagaac gacagttttt ggcctaattt gctcagtgag ctagtggggg 4080

aaggctccat cgccttggcc gccacgctat ctaaccaagc ttcagtaaaa gctctcttgg 4140

gcctgcattt tctctctcga ggactcaatt acacagattt ttattcttta ctgatagaga 4200

aatgctctag tttctttact gtagaaccgc ctcctccacc agctgaaaat ctgatgacca 4260

agccctccgt gaagtcgaaa ttccgtaagc tgtttaagat gcaaggaccc atggacacag 4320

tcaaagactg gaaccaaata gccgccggcc tgaagaattt ccaatttgtt cgtgacctag 4380

tcaaagaggt ggtcgactgg ctccaggcct ggattaataa agagaaagcc agccctgtcc 4440

tccagtacca gttggagatg aagaaactcg ggcccgtggc tttggctcat gatgccttca 4500

tggccggttc cgggccccct cttggtgacg accaaattga atacctccag aacctcaaat 4560

ctcttgccct aacactgggg aagactaact tggcccaaag tctcaccact atgatcaatg 4620

ccaagcaaag ctccgcccaa cgagtcgaac ccgttgtggt ggtccttaga ggcaagccgg 4680

gatgcggcaa aagcttggcc tccacgttga ttgcccaggc tgtgtccaag cgtctctacg 4740

gctcacaaag tgtgtattct cttcctccgg atccagactt cttcgacgga tacaaaggac 4800

agtttgtaac cttgatggac gatctgggac aaaacccgga tgggcaagat ttttccacct 4860

tttgtcagat ggtgtcgacc gcccaatttc ttcccaacat ggcggacctt gcagagaagg 4920

ggcgtccctt cacctccaat cttatcattg caactacaaa cctccctcac ttcagccctg 4980

tcaccatcgc tgatccttct gcagtctctc gtcgtatcaa ctacgacctg actctagaag 5040

tatctgaggc ctacaagaag cacacacggc tgaattttga cctggctttc agacgcacag 5100

acgccccccc catttatcct tttgctgccc atgtgccttt cgtggacgtg gctgtgcgct 5160

tcaaaaatgg tcaccagagc ttcaatctcc tagagttggt cgactctatt tgtgcagaca 5220

ttcgagccaa gcaacaaggt gcccgaaata tgcagactct ggttctacag agccctaatg 5280

agaacgacga cacccccgtc gacgaggcgt taggtagagt tctcaccccc gctgcggtcg 5340

acgaggcgct tgtcgatctc gctccggatg ccgacccggt tggccgcttg gctgttctcg 5400

ccaagctagg tcttgcccta gctgcggtca cccctggttt gataatcttg gcagtcggac 5460

tctacaggta cttctctggc tctgatacag accaagaaga aacagaaagc gaggagcctg 5520

ctaaagcgcc taggagcgag aatgcttatg acggtccgaa gaaaaactct aagccccctg 5580

gagcgctctc tcttatggaa atgcaacagc ccaacgtgga catgggcttt gaggctgcgg 5640

ttgctaagaa ggtggtcgtc cccattacct tcatggttcc caacagacct tctggactta 5700

cacagtccgc tcttcttgtg gccggccgga ccttcctaat taatgagcat acgtggtcca 5760

acccctcctg gaccagcttc acaatccgtg gtgaggtgca cactcgtgat gagcctttcc 5820

aaacggttca ttttactcac catggtattc ccacagatct ggtgatggta cgtctcggac 5880

cgggcaactc tttccctaac aatctagaca agtttggact tgaccagatg ccggcacgta 5940

actcccgtgt ggttggcgtt tcggctagtt acggtaattt cttcttctct gggaacttcc 6000

tcggatttgt tgactccatc acctctgacc aaggaactta tgcgagactt tttaggtaca 6060

gggtgacgac ttacaaggga tggtgcggtt cggccctggt ctgtgaggcc ggtggtgtcc 6120

ggcgcatcat tggcttgcat tctgctggtg ccgctggtat cggcgccggg acttacatct 6180

caaaattagg actgatcaaa gcccttaaac acctcggtga gcctctggct acaatgcaag 6240

gactaatgac tgagctagag cctggagtca ccgtacatgt accccgaaaa tctaaattga 6300

gaaagacgac cgcacacgcg gtgtacaaac cggagtttga acctgctgtg ttgtcaaaat 6360

ttgatcccag actgaacaag gatgttgacc tagatgaggt aatttggtct aaacacactg 6420

ccaacgtccc ttatcaacct cctttgttct acacatacat gtcagagtat gctcatcggg 6480

ttttctcttt tttgggaaaa gacaatgaca ttttgaccgt caaagaagca atcttgggca 6540

tccctggact agaccctatg gatccccaca cagctccggg tctgccctac gccgttagcg 6600

gccttcgacg cactgatctc gtcgattttg cgagcggcac ggtagacccg gcactggcca 6660

tgcaaatcca gaagttcttg aacggtgact actctgatca tgtcttccaa acttttctga 6720

aagatgaaat cagaccctca gagaaggtcc gagcgggaaa aacccgcatt gtcgatgtgc 6780

cctccctggc gcactgtatt gtgggcagaa tgttgcttgg gcgctttgcc gccaagtttc 6840

aatcccatcc tggctttctc cttggctccg ctatcgggtc tgaccctgat gtcttctgga 6900

ccgtcatagg ggctcagctc gagggaagaa agaacacgta tgacgtggac tatagtgcct 6960

ttgactcttc acacggcact ggctccttcg aggctctcat ctctcacttt ttcaccgtgg 7020

acaatggttt tagccctgcg ctgggaccgt atctcagatc cctggctgtc tcggtgcacg 7080

cctacggcga gcgtcgcatc aagattaccg gaggcctccc ctctggttgt gccgcgacca 7140

gcctgctgaa cacagtgctc aacaatgtga tcatcaggac tgctctggca ttgacctaca 7200

aggaatttga atatgacatg gttgatatca tcgcctacgg tgacgacctt ctggttggta 7260

cggattacga tctggacttc aatgaggtgg cgcggcgcgc tgccaaactg gggtataaga 7320

tgactcctgc caacaagggt tctgtcttcc ctccgacttc ctctctctcc gatgctgttt 7380

ttctaaaacg caaattcgtc caaaacaatg acggcttata taaaccagtt atggatttaa 7440

agaatttgga agccatgctc tcctacttca aaccaggaac actactcgag aagctgcaat 7500

ctgtttctat gttggctcaa cattctggaa aagaagaata tgatagattg atgcacccct 7560

tcgctgacta cggtgccgta ccgagtcacg agtacctgca ggcaagatgg agggccttgt 7620

tcgactgacc tagatagccc aacgcgcttc ggtgctgccg gcgattctgg gagaactcag 7680

tcggaacaga aaagggaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 7726

Claims (5)

1.猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备用引物，其特征在于，包括如下引物：

2.一种猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备方法，包括如下步骤：

(1)SVV/GD05株基因组全序列的扩增；

(2)pSVV-GD05重组质粒的构建；

(3)pSVV-GD05-iLOV重组质粒的构建；

(4)亲本病毒SVV-GD05与重组病毒SVV-GD05-iLOV拯救；

步骤(1)、(2)和(3)中，使用权利要求1所述的猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备用引物；

步骤(1)和(2)中，提取SVV/GD05株的RNA，经过反转录得到cDNA；以cDNA为模板，分别用引物对通过PCR扩增得到B、C、E、F片段；以A、D的引物扩增分别得到A、D片段；分别用引物对CMV-F/967R、7381F/8213R通过overlap，得到AB、CD片段；然后将AB片段克隆至pEGFP-C3载体，得到pC3-GD05-AB；将CD片段插入pC3-GD05-AB，得到重组质粒pC3-GD05-ABCD；最后将E、F片段插入pC3-GD05-ABCD，得到pSVV-GD05；

步骤(3)中，用引物对VP-1465F/LOV-R3扩增得到P片段；以pSVV-GD05质粒为模板，用引物对2B-F3/2B-R，2B-F2/3C-R1分别扩增得到Q1和2C-3C；将Myc-T2A-F与Q1基因片段先进行三个PCR循环后,加入引物Myc-F1/2B-R，进行PCR扩增，通过overlap得到Q片段；最后将P、Q、2C-3C插入pSVV-GD05，得到pSVV-GD05-iLOV。

3.根据权利要求2所述的一种猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，pSVV-GD05转染BHK-21细胞后，可拯救亲本病毒；而pSVV-GD05-iLOV转染BHK-21细胞后，可拯救重组病毒。

4.权利要求2或3所述的制备方法制备的猪塞内卡病毒全长感染性克隆。

5.权利要求4所述的猪塞内卡病毒全长感染性克隆在制备猪塞内卡病毒诊断试剂和/或疫苗中的应用。