CN112143754B - 猪盖塔病毒感染性克隆及其建构方法及应用 - Google Patents

猪盖塔病毒感染性克隆及其建构方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112143754B
CN112143754B CN202011055355.2A CN202011055355A CN112143754B CN 112143754 B CN112143754 B CN 112143754B CN 202011055355 A CN202011055355 A CN 202011055355A CN 112143754 B CN112143754 B CN 112143754B
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
infectious clone
getv
hun1
porcine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011055355.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112143754A (zh
Inventor
陈振海
鹿田原
牟春晓
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yangzhou University
Original Assignee
Yangzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yangzhou University filed Critical Yangzhou University
Priority to CN202011055355.2A priority Critical patent/CN112143754B/zh
Publication of CN112143754A publication Critical patent/CN112143754A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112143754B publication Critical patent/CN112143754B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36151—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2770/36152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae
    • G01N2333/181—Alphaviruses or Group A arboviruses, e.g. sindbis, VEE, EEE, WEE or semliki forest virus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于分子生物学领域，涉及盖塔病毒的全长基因组感染性克隆及其构建方法和应用，本发明针对HuN1株盖塔病毒全长基因序列设计特异性引物，并在上下游分别插入相应的酶切位点，通过RT‑PCR方法扩增HuN1株GETV基因片段，逐步克隆到质粒载体pACYC‑177上，得到病毒全长基因组感染性克隆pAC‑GETV。将该感染性克隆转染至真核细胞BHK21，成功拯救出病毒rGETV，其与亲本病毒具有相似的生长特性，并且可以在BHK21上连续传代至少6代。本发明所述感染性克隆有利于甲病毒载体疫苗的研究，对于改善甲病毒载体疫苗具有一定的意义。

Description

猪盖塔病毒感染性克隆及其建构方法及应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及盖塔病毒的全长基因组感染性克隆及其构建方法和应用，同时也涉及应用GETV载体重组病毒表达外源基因的技术领域。
背景技术
猪盖塔病毒(GETV)在全球各地都有分布，主要侵害对象为猪和马。感染猪的临床症状表现为成年猪发热、厌食、抑郁，母猪流产，仔猪腹泻甚至死亡等；感染马的临床症状表现为发烧、后肢水肿、肌肉僵硬、腹痛等；此外也有本病毒侵害野熊和蓝狐的报告。近年来，我国各地养殖场不断分离到盖塔病毒的新毒株，并且常为混合感染。该病毒对于我国养殖业的危害愈加突出。
RNA病毒感染性克隆技术是利用病毒感染性cDNA克隆研究RNA病毒结构与功能的一项新技术，包括病毒基因组全长cDNA克隆构建和病毒RNA的感染性转录体制备及导入。该技术的发展实现了对RNA病毒在分子水平上的操作，为RNA病毒基因组的结构和功能研究提供了有效的方法。
发明内容
本发明的目的是构建一株可用于GETV特性研究的感染性克隆，并且探究外源基因在其中高效表达的条件，用于进一步的盖塔病毒载体或者蛋白功能研究。
针对HuN1株盖塔病毒全长基因序列设计特异性引物，分别引入相应的酶切位点，通过RT-PCR方法扩增GETV基因片段和CMV启动子，逐步插入到质粒载体pACYC-177上，并转化至感受态细胞Stbl3中进行克隆，得到病毒全长基因组感染性克隆pAC-GETV。测序正确后，将该感染性克隆转染至真核细胞 BHK21，成功拯救出病毒rGETV，其与亲本病毒具有相似的生长特性，并且可以在BHK21上连续传代。
之后在pAC-GETV的基础上，分别在C基因的上游和E1基因的下游插入 EGFP基因，得到感染性克隆pAC-Get-EGFP/C和pAC-Get-EGFP/E1，并在BHK21 上拯救出重组病毒，分别命名为rGETV-EGFP/C和rGETV-EGFP/E1。对以上三种拯救病毒进行生长特性研究，并与亲本病毒作对比。另外，我们还对外源基因插入在不同位置对于其表达水平和稳定性进行探究。结果表明，将外源基因插入在E1基因下游时具有较好的稳定性和滴度。
一种猪盖塔病毒感染性克隆，其特征在于，包含如SEQ ID NO:1所示的序列。
一种猪盖塔病毒感染性克隆，其特征在于，包含如SEQ ID NO:2所示的序列。
根据权利要求1或2所述的猪盖塔病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
HuN1株GETV基因组全序列扩增；
重组质粒的构建；
重组病毒的拯救。
进一步的，采用下列引物：
Figure GDA0003005568550000021
Figure GDA0003005568550000031
进一步的，HuN1株GETV基因组全序列扩增方法为：将全长基因分为4 段扩增，分别设计上、下游引物，并加入保护性碱基；将各组分加入PCR管，混匀瞬离后放入PCR仪中进行扩增。
进一步的，重组质粒的构建包括如下步骤：
将扩增的片段克隆至T载体中，并且通过Overlap PCR，在基因组5’端引入CMV启动子及其增强子序列；将酶切的基因片段和载体片段切胶回收，转化至Stbl3感受态细胞，挑取单个菌落接种于LB+K液体培养基中过夜培养。
进一步的，合成含有限制性核酸内切酶酶切位点的小片段stuffer，其序列为 CTCTTAGGATCCTACCTAGAATTCAGTAGTCTTAAGCTAGCAAGATCTATCACTACGCGTACTCAGCTGCAGTACTAG；相应的酶切位点为BamHI、EcoRI、 AflII、BglII、MluI、PstI。
进一步的，分别扩增EGFP片段及其插入位点附近的片段F1、F2，通过 Overlap PCR连接，获得片段F；SwaI+FseI双酶切连接至pAC-GETV。
进一步的，分别扩增EGFP片段及其插入位点附近的片段E1、E2、E3，通过OverlapPCR连接，获得片段E；ApaI+MluI双酶切连接至pAC-GETV。
本发明还提供猪盖塔病毒感染性克隆在制备猪盖塔病毒诊断试剂和/或疫苗中的应用。
有益效果
本发明针对HuN1株盖塔病毒全长基因序列设计特异性引物，并在上下游分别插入相应的酶切位点，通过RT-PCR方法扩增HuN1株GETV基因片段，逐步克隆到质粒载体pACYC-177上，得到病毒全长基因组感染性克隆 pAC-GETV。将该感染性克隆转染至真核细胞BHK21，成功拯救出病毒rGETV，其与亲本病毒具有相似的生长特性，并且可以在BHK21上连续传代至少6代。
近年来，国内GETV的报告数量有所上升，GETV对我国养猪业的威胁日益增加。本专利中涉及的感染性克隆研究，有助于开展GETV特性研究以防治 GETV。另外，甲病毒载体作为一种新型的载体疫苗，具有蛋白表达效率高，宿主范围广泛，免疫次数少等优点。本研究构建了该病毒的第一个病毒感染性克隆，并且明确了外源基因插入位点对于其稳定性和病毒滴度的影响，为进一步开发利用该病毒载体重组疫苗等奠定基础。
附图说明
图1为感染性克隆pAC-GETV、pAC-Get-EGFP/C和pAC-Get-EGFP/E1的病毒基因组示意图。
图2为PCR检测rGETV-EGFP/C和rGETV-EGFP/E1外源基因稳定性结果。
图3为rGETV-EGFP/C和rGETV-EGFP/E1在BHK21上表达EGFP的荧光图像。
图4为分别使用E2单抗和6K单抗通过IFA鉴定pGETV和rGETV。
具体实施方式
实施例1
1.生物材料与试剂：
1.1生物材料
ST-R细胞(IFN-β受体敲除的猪睾丸细胞)，BHK21细胞，HuN1株GETV， Stbl3感受态细胞，质粒pACYC-177。
1.2实验试剂与耗材
DMEM培养基，胎牛血清，青链霉素，胰酶，RNA提取试剂盒，反转录试剂盒，TakaraPrimeSTAR Max DNA Polymerase，DL5000 DNA Maker，胰蛋白胨，酵母提取物，氯化钠，限制性核酸内切酶AflII、BglII、FseI、XhoI、BamHI、EcoRI、 MluI、PstI，T4 DNA连接酶，50×TAE电泳缓冲液，琼脂糖，PCR产物回收试剂盒，胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒，质粒转染试剂盒。
2.实验方法
2.1 RT-PCR扩增目的基因
根据HuN1株GETV基因序列，将全长基因分为4段扩增，分别设计上、下游引物，并加入保护性碱基。将各组分加入PCR管，混匀瞬离后放入PCR仪中进行扩增。反应程序：95℃5min；95℃30s，55℃15s，72℃1min，33个循环；72℃5min。反应结束后取2μL产物，利用1％琼脂糖凝胶电泳分析，经凝胶成像系统观察。其余产物于-20℃保存。
表1克隆所需引物
Figure GDA0003005568550000051
2.2感染性克隆的构建
将扩增的片段克隆至T载体中，并且通过Overlap PCR，在基因组5’端引入 CMV启动子及其增强子序列。将酶切的基因片段和载体片段切胶回收，T4连接酶4℃作用过夜(其中pACYC-177已预先插入合适的酶切位点)，转化至Stbl3 感受态细胞，挑取单个菌落接种于4mL LB+K液体培养基中(Kan浓度100μ g/mL)，37℃，220rpm过夜培养。每步提取质粒后使用相应的双酶切鉴定。
2.3病毒的拯救
将构建的重组质粒转染至真核细胞，具体步骤如下：
(1)提前在6孔板接种BHK21细胞，待生长密度达到50％时即可进行转染。取测序正确的重组质粒1μg与25μL转染试剂混合后室温静置15min，然后加入到6孔板培养的BHK21细胞中，轻轻晃动培养板使液体与培养基混匀，置于37℃培养箱中4h后弃去培养基，并加入2mL新的完全培养基继续培养，同时设不转染的组为对照。
(2)毎12h观察细胞生长状态，待CPE达到80～90％时，吸出培养基，12000g 离心2min，吸取上清即为病毒液，取500μL上清液接种至新的BHK21细胞中继续传代。
(3)同上方法，连续传代至6代，并且保存每代病毒液。
2.4含外源基因的感染性克隆构建
(1)pAC-Get-EGFP/C构建：分别扩增EGFP片段及其插入位点附近的片段F1、F2，通过Overlap PCR连接，获得片段F。SwaI+FseI双酶切连接至 pAC-GETV。
(2)pAC-Get-EGFP/E1构建：分别扩增EGFP片段及其插入位点附近的片段E1、E2、E3，通过Overlap PCR连接，获得片段E。ApaI+MluI双酶切连接至pAC-GETV。
2.5重组病毒的拯救
将构建的重组质粒转染至真核细胞，方法同2.3。将拯救出的重组病毒分别命名为rGETV-EGFP/C和rGETV-EGFP/E1。rGETV-EGFP/C包含如SEQ ID NO:1 所示的序列；rGETV-EGFP/E1包含如SEQ ID NO:2所示的序列。连续传代，观察毎代荧光表达情况，同时测定病毒滴度。
实验案例一：pACYC-177质粒的改造
根据GETV基因序列选择合适的限制性核酸内切酶识别位点。合成含有这些酶切位点的小片段stuffer，其序列为CTCTTAGGATCCTACCTAGAATTCAGTAGTCTTAAGCTAGCAAGATCTATCA CTACGCGTACTCAGCTGCAGTACTAG。相应的酶切位点为BamHI、EcoRI、 AflII、BglII、MluI、PstI。将pACYC-177质粒和stuffer使用BamHI+PstI双酶切，纯化片段连接过夜，转化至感受态细胞Stbl3，在LB+K平板上分离单菌落，提取质粒，获得pAC-Get-1。此质粒用于后续逐步安插GETV基因片段。
实验案例二：病毒滴度测定
为比较重组病毒与亲本病毒间的差异，取相同代数亲本病毒pGETV、拯救病毒rGETV、外源基因插入C基因上游的重组病毒rGETV-EGFP/C、外源基因插入E1基因下游的重组病毒rGETV-EGFP/E1，于BHK21细胞上测定病毒滴度。具体方法如下：
在96孔细胞培养板中均匀接种16列BHK21细胞，于37℃培养，待密度生长至60％左右时即可准备病毒接种。取pGETV、rGETV、rGETV-EGFP/C、 rGETV-EGFP/E1 F4代接种。以pGETV为例：取5μL病毒液，加入495μL维持培养基中制成102倍稀释的病毒液，涡旋均匀后取50μL加入至450μL维持培养基中制成103倍稀释的病毒液；以同样的方法制成直至109倍稀释液。每种稀释度各吸取100μL/孔加入到培养板同一行的4个孔中。所有病毒液滴加完毕后，将培养板置于37℃培养箱中静置2h，弃去培养基，每孔加入100μL新鲜的预热维持培养基，放入培养箱继续培养。观察并统计每种病毒72h内出现CPE 的孔数。
按下列公式计算每种病毒的滴度：
lgTCID50＝L-D(S-0.5)
L：最高稀释度的对数；D：稀释度对数之间的差；S：阳性孔比率总和
滴度结果见表2。
表2 pGETV、rGETV、rGETV-EGFP/C和rGETV-EGFP/E1 F4在BHK21上病毒滴度
Figure GDA0003005568550000071
Figure GDA0003005568550000081
实验案例三：重组病毒外源基因稳定性的PCR检测
为比较两种重组病毒在传代过程中外源基因稳定性，取相同代数(F1、F3、 F5、F10)的外源基因分别插入C基因上游的重组病毒rGETV-EGFP/C、插入 E1基因下游的重组病毒rGETV-EGFP/E1，提取RNA后，RT-PCR扩增含有EGFP 片段的区域，结果见图2。结果发现，rGETV-EGFP/C外源基因稳定性较差，在 3代时已有外源基因遗失，而rGETV-EGFP/E1外源基因稳定性相对较好，可在 5代内保持稳定性。同时，后者的滴度也高于前者，因此将外源基因插入在E1 基因下游为更优选择。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 猪盖塔病毒感染性克隆及其建构方法及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1096
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtcagtggc gtcggaaaca tcactagagc gatgtccacg ctgtctaaga atttgaagtc 60
ttttaggaaa ataagaggtc ccatcataca tctgtacggc ggtcctaaat agatgcagga 120
ttacactaca tctaaagacc acgtattaca gacatcgttt aaaccatggt gagcaagggc 180
gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 240
cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 300
aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 360
acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 420
aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 480
aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 540
ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 600
tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 660
ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 720
aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 780
tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 840
accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaattaat taatgaagtc 900
ttttaggaaa ataagaggtc ccatcataca tctgtacggc ggtcctaaat agatgcagga 960
ttacactaca tctaaagacc acgtattaca gacatcatga attacatccc aactcaaacc 1020
ttttacggac gccgttggcg accacgcccg gcgtaccgtc catggcgggt gccgatgcag 1080
ccggccccac ccatgg 1096
<210> 2
<211> 977
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgggctaaca ctcgccgcag tggcagtact tatactggtg acgtgtgtga ctatgcgccg 60
ctaaatcata catctgtacg gcggtcctaa atagatgcag gattacacta catctaaaga 120
ccacgtatta cagacatcgt ttaaaccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg 180
gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc 240
ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc 300
ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc 360
ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa 420
ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc 480
gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc 540
aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc 600
tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac 660
atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac 720
ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac 780
cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact 840
ctcggcatgg acgagctgta caagtaatta attaaacgtg tgtgactatg cgccgctaac 900
cgggaggctt gacttaatgt atatatataa gcatcatagt tttagtaaag catataaata 960
atcaagtaga tcaaagg 977

Claims (4)

1.一种猪盖塔病毒HuN1株感染性克隆，其特征在于，所述猪盖塔病毒HuN1株感染性克隆包含如SEQ ID NO:2所示的序列。
2.根据权利要求1所述的猪盖塔病毒HuN1株感染性克隆的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
HuN1株GETV基因组全序列扩增：将全长基因分为4段扩增，分别设计上、下游引物，并加入保护性碱基；将各组分加入PCR管，混匀瞬离后放入PCR仪中进行扩增；
重组质粒的构建：将扩增的片段克隆至T载体中，并且通过Overlap PCR，在基因组5’端引入CMV启动子及其增强子序列；将酶切的基因片段和pACYC-177载体片段切胶回收并连接，转化至Stbl3感受态细胞，挑取单个菌落接种于含有Kan的LB液体培养基中过夜培养；得到病毒全长基因组感染性克隆pAC-GETV，其中pACYC-177预先插入酶切位点：合成含有限制性核酸内切酶酶切位点的小片段stuffer，其序列为CTCTTAGGATCCTACCTAGAATTCAGTAGTCTTAAGCTAGCAAGATCTATCACTACGCGTACTCAGCTGCAGTACTAG；所述的酶切位点为BamHI、EcoRI、AflII、BglII、MluI、PstI；将pACYC-177质粒和stuffer使用BamHI+PstI双酶切，纯化片段连接过夜，转化至感受态细胞Stbl3，分离单菌落，提取质粒；用于安插GETV基因片段；
重组病毒的拯救：将测序正确的感染性克隆质粒转染至BHK-21细胞，培养获得GETV拯救病毒；
含外源基因的感染性克隆构建：分别扩增EGFP片段及其插入位点附近的片段E1、E2、E3，通过Overlap PCR连接，获得片段E，ApaI+MluI双酶切连接至pAC-GETV。
3.根据权利要求2所述的猪盖塔病毒HuN1株感染性克隆的构建方法，其特征在于，采用下列引物：
Figure FDA0003009026770000011
Figure FDA0003009026770000021
4.权利要求1所述的猪盖塔病毒HuN1株感染性克隆在制备猪盖塔病毒诊断试剂和/或疫苗中的应用。
CN202011055355.2A 2020-09-30 2020-09-30 猪盖塔病毒感染性克隆及其建构方法及应用 Active CN112143754B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011055355.2A CN112143754B (zh) 2020-09-30 2020-09-30 猪盖塔病毒感染性克隆及其建构方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011055355.2A CN112143754B (zh) 2020-09-30 2020-09-30 猪盖塔病毒感染性克隆及其建构方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112143754A CN112143754A (zh) 2020-12-29
CN112143754B true CN112143754B (zh) 2021-05-18

Family

ID=73895268

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011055355.2A Active CN112143754B (zh) 2020-09-30 2020-09-30 猪盖塔病毒感染性克隆及其建构方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112143754B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112458064A (zh) * 2020-11-20 2021-03-09 广西大学 盖他病毒全长感染性克隆、复制子系统及其制备和应用
CN113403318B (zh) * 2021-05-18 2023-10-27 扬州大学 一种猪BRS3基因CDs序列全长分段克隆的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0562136A1 (en) * 1992-03-24 1993-09-29 Division Of Microbiology, Kyoto Biken Laboratories, Inc. Live vaccine to getah virus infectious disease, and trivalent live vaccine to Japanese encephalitis virus, porcine parvovirus and getah virus infectious diseases
WO2012170431A2 (en) * 2011-06-06 2012-12-13 Bluebird Bio, Inc. Improved geneswitch systems
CN106520790A (zh) * 2016-11-24 2017-03-22 河北农业大学 一种猪脑心肌炎病毒bd2株全长感染性克隆的构建方法及应用
CN106636012A (zh) * 2016-12-23 2017-05-10 河南农业大学 一种猪盖他病毒毒株、疫苗组合物及其制备方法和应用
CN109810976A (zh) * 2019-02-12 2019-05-28 扬州大学 猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备方法及应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7998733B2 (en) * 2004-10-05 2011-08-16 Merial Limited Chimeric vectors
CN102250924A (zh) * 2010-05-17 2011-11-23 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 盖塔病毒全基因组序列、扩增方法及引物

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0562136A1 (en) * 1992-03-24 1993-09-29 Division Of Microbiology, Kyoto Biken Laboratories, Inc. Live vaccine to getah virus infectious disease, and trivalent live vaccine to Japanese encephalitis virus, porcine parvovirus and getah virus infectious diseases
WO2012170431A2 (en) * 2011-06-06 2012-12-13 Bluebird Bio, Inc. Improved geneswitch systems
CN106520790A (zh) * 2016-11-24 2017-03-22 河北农业大学 一种猪脑心肌炎病毒bd2株全长感染性克隆的构建方法及应用
CN106636012A (zh) * 2016-12-23 2017-05-10 河南农业大学 一种猪盖他病毒毒株、疫苗组合物及其制备方法和应用
CN109810976A (zh) * 2019-02-12 2019-05-28 扬州大学 猪塞内卡病毒全长感染性克隆的制备方法及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
An outbreak of Getah virus infection among pigs in China，2017;T. Yang et al.;《Transbound Emerg Dis.》;20181231;第65卷;摘要，第634页左栏第1段 *
贵州省2017年蚊虫及蚊传虫媒病毒调查研究;宋颂等;《中国媒介生物学及控制杂志》;20181031;第29卷(第5期);第428-435、461页 *
黄病毒检测工程细胞系的构建及功能鉴定;尉研等;《中国生物工程杂志》;20151231;第35卷(第9期);第35-41页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112143754A (zh) 2020-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112143754B (zh) 猪盖塔病毒感染性克隆及其建构方法及应用
CN112080521B (zh) 一种表达外源蛋白的重组伪狂犬病毒载体构建及重组伪狂犬病毒制备方法
WO2023227124A1 (zh) 一种构建mRNA体外转录模板的骨架
CN113583876B (zh) EYFP敲入到Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备
CN105087645A (zh) M蛋白三氨基酸位点突变的猪用vsv病毒载体构建和应用
CN110144334B (zh) 一种共表达草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白vp4和vp35的重组杆状病毒的制备方法和应用
CN111662885A (zh) 两株基因组高度同源猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染性克隆构建、拯救与应用
CN117511888A (zh) 一种基于CRISPR-Cas9技术的表达鸡传染性贫血病病毒T1P6毒株VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法
CN111690669A (zh) Sva 3c蛋白在促进猪源病毒复制中的应用
CN110628725B (zh) 柑橘黄化脉明病毒突变体及其构建方法
CN114507277B (zh) 一种具有抗病毒效果的甜菜夜蛾基因及其应用
CN105925613B (zh) 促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体及其构建方法
CN113584080A (zh) 一种Nluc标记的重组猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建及其应用
CN114395568A (zh) 一种猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆及其构建方法与应用
CN108486115B (zh) 一种用于淡水螯虾细胞外源基因表达的转染方法及其应用
CN117126818B (zh) 利用ABE构建gE基因缺失PRV毒株的方法和应用
CN111471657A (zh) 一种表达ASFV P30蛋白的PRV gE/gI双基因缺失株的构建方法
CN114606207B (zh) 一种不依赖胰酶的猪流行性腹泻病毒变异毒株及其构建与应用
CN116716322B (zh) 一种denv-3全长感染性克隆及其构建方法与应用
CN113862287B (zh) 一种3a型丙型肝炎病毒全长感染性克隆突变体及其应用
CN118086288A (zh) 多顺反子的自放大rna及制备方法
CN113493797B (zh) 一种利用贝氏柯克斯体质粒缺失突变体制备抗原的方法
CN111117974B (zh) 一种可视化绿色荧光猪伪狂犬病毒及其构建方法
CN1150322C (zh) 番茄花叶病毒弱毒疫苗k基因组的两个致弱突变及用途
CN114807061A (zh) 鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株及其制备方法、疫苗

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant