CN111662885A - 两株基因组高度同源猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染性克隆构建、拯救与应用 - Google Patents

两株基因组高度同源猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染性克隆构建、拯救与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111662885A
CN111662885A CN202010571894.5A CN202010571894A CN111662885A CN 111662885 A CN111662885 A CN 111662885A CN 202010571894 A CN202010571894 A CN 202010571894A CN 111662885 A CN111662885 A CN 111662885A
Authority
CN
China
Prior art keywords
prrsv
infectious
virus
virulent
infectious clone
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010571894.5A
Other languages
English (en)
Inventor
陈南华
叶梦雪
朱建中
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yangzhou University
Original Assignee
Yangzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yangzhou University filed Critical Yangzhou University
Priority to CN202010571894.5A priority Critical patent/CN111662885A/zh
Publication of CN111662885A publication Critical patent/CN111662885A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

两株基因组高度同源猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染性克隆构建、拯救与应用，属于生物工程技术领域。本发明所构建的两个感染性克隆病毒是基于HP‑PRRSV基因组高度同源但毒力有显著差异的XJ17‑5强毒株和JSTZ1712‑12天然弱毒株。所构建感染性克隆的方法简单便捷，直接进行DNA转染，不需要体外转录成病毒RNA再转染，克服了RNA体外不稳定和易降解等缺点。所获得HP‑PRRSV感染性克隆平台可应用于体外病毒复制机制与致病机理研究。所构建HP‑PRRSV天然弱毒株感染性克隆病毒可用于研制更安全高效的新型PRRSV基因工程疫苗，有利于我国PRRSV的防控。

Description

两株基因组高度同源猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染 性克隆构建、拯救与应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及两株猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染性克隆构建、拯救、改造及其应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍和所有年龄猪呼吸道症状为主要特征的动物传染病，俗称“猪蓝耳病”。1987年，该病最早在美国报道，随后在全世界各地蔓延，严重危害养猪业的发展。1995年，我国首次分离到PRRSV。2006年，我国暴发“猪高热病”，引起高热(≥41℃)、50-100％发病率和20-100％死亡率，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。该病病原为毒力显著增强的高致病性PRRSV变异株(HP-PRRSV)。
PRRSV是一种单股正链RNA病毒，基因组大小约为15kb，5’端有帽子结构，3’端有Poly(A)尾，中间有10个开放阅读框(ORF)。ORF1a和ORF1b编码非结构蛋白，ORF2-7编码结构蛋白。PRRSV可分为PRRSV1和PRRSV2两个种(species)，每个种都可再细分为多个基因亚型(sub-genotypes)。我国的HP-PRRSV属于PRRSV2。HP-PRRSV的主要遗传标记是非结构蛋白2(nsp2)上存在30个氨基酸的不连续缺失。但是这一标志性缺失与HP-PRRSV高致病力无关。有研究表明，HP-PRRSV的高致病力与nsp9和nsp10相关。然而，HP-PRRSV毒力相关基因具体有哪些目前尚未完全阐明。
HP-PRRSV自2006年出现至今，一直是我国猪群中流行的优势毒株之一。HP-PRRSV引发疫情的防控是我国猪病防控的重点。此外，随着HP-PRRSV不断演化，新型变异毒株不断涌现，已呈现多样性并存态势。目前，疫苗免疫是有效防控PRRS的主要手段之一。PRRS灭活疫苗安全，但是免疫保护效果较差。PRRS弱毒疫苗同源保护效果好，但是交叉保护不佳。此外，由于现有HP-PRRSV商品化弱毒疫苗均由高致病力分离株体外传代致弱而来，存在毒力返强的风险，其安全性令人担忧。因此，研制更安全、更具交叉保护力的新型疫苗已成为我国PRRSV防控的重点。
RNA病毒感染性克隆是通过体外构建病毒cDNA分子克隆，进而在DNA水平上对病毒基因组进行人工操作，再通过转染易感细胞在体外拯救出具有感染性的病毒粒子。PRRSV感染性克隆的成功构建及遗传操作可用于病毒复制和致病机理解析以及新型基因工程疫苗研制等工作。尽管前人研究中已经建立了PRRSV经典毒株以及HP-PRRSV强毒株的反向遗传操作平台，然而，基因组高度同源但致病力却差异显著的HP-PRRSV变异毒株反向遗传操作平台至今未有报道。
发明内容
针对我国HP-PRRSV毒力决定因子尚未明确的科学问题，本发明提供两株基因组高度同源但致病力差异显著的HP-PRRSV感染性克隆病毒，为研究HP-PRRSV毒力决定因子提供关键生物学材料和遗传操作平台。同时针对目前缺乏安全、交叉保护好PRRS疫苗的实际问题，本发明的HP-PRRSV天然弱毒株的感染性克隆平台，还可用于研制更加安全高效的新型PRRSV基因工程疫苗。
本发明是通过以下技术方案实现的：
在本发明的一个方面，提供了一种重组载体，包含HP-PRRSV基因组全长cDNA序列，该全长cDNA序列的5’端加有巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)真核启动子序列，3’端Poly(A)尾下游加有丁肝炎病毒核酶(Hepatitis D virus ribozyme)序列以及牛生长激素多聚腺苷酸信号(Bovine Growth Hormone(BGH)polyadenylation signal)转录终止序列。
本发明优选的载体为pACYC177低拷贝载体。经过基因合成和同源重组等方法在pACYC177载体上插入四个单一限制性酶切位点(PacI,AflII,AscI和NotI)用于HP-PRRSV强毒株XJ17-5和弱毒株JSTZ1712-12的感染性克隆构建。
在本发明的另一个方面，提供了一种简单制备PRRSV感染性克隆的方法。将上述重组载体与高效转染试剂混合后可直接转染Marc-145细胞或者转染BHK-21细胞后再感染Marc-145细胞，均拯救获得XJ17-5或者JSTZ1712-12感染性克隆病毒。
在本发明的另一个方面，还提供了一种人工构建的强弱毒株在研究HP-PRRSV体外复制效力差异上的应用。利用感染性克隆平台，通过在HP-PRRSV毒株非结构蛋白和结构蛋白编码基因之间引入特异性荧光标记，使其可应用于实时监测病毒复制过程。并借助感染性克隆平台进一步分析其复制力相关关键基因及位点。
在本发明的另一个方面，还提供了一种人工克隆的强弱毒株在研究HP-PRRSV毒力相关基因上的应用。利用感染性克隆平台，通过将HP-PRRSV强毒株与弱毒株进行相应基因片段互相替换，解析HP-PRRSV的毒力相关基因。
在本发明的另一个方面，还提供了一种人工改造的天然弱毒疫苗候选株，所述人工改造的天然弱毒疫苗候选株是HP-PRRSV天然弱毒株JSTZ1712-12的感染性克隆病毒。该人工改造天然弱毒疫苗候选株可应用于制备新型PRRSV基因工程疫苗。
本发明涉及一株天然弱毒株感染性克隆平台的建立，该平台可用与后续研制更加安全高效的新型PRRSV基因工程活疫苗。为有效防控PRRS疫情提供关键技术支持和备选预防策略。新型安全高效的PRRSV基因工程活疫苗的研制具有巨大经济价值和良好的市场前景。本发明的显著特点包含：
1、所构建的两个感染性克隆病毒是基于HP-PRRSV基因组高度同源但毒力有显著差异的XJ17-5强毒株和JSTZ1712-12天然弱毒株。
2、所构建感染性克隆的方法简单便捷，直接进行DNA转染，不需要体外转录成病毒RNA再转染，克服了RNA体外不稳定和易降解等缺点。此外，还利用丁型肝炎病毒核酶自我剪切功能获得精确HP-PRRSV基因组3’末端的感染性克隆。是快速、简便、精准的PRRSV遗传操作平台。
3、所获得HP-PRRSV感染性克隆平台可应用于体外病毒复制机制与致病机理研究。
4、所构建HP-PRRSV天然弱毒株感染性克隆病毒可用于研制更安全高效的新型PRRSV基因工程疫苗，有利于我国PRRSV的防控。
附图说明
图1是本发明实施例1中对pACYC177载体进行改造的示意图；
图2是本发明实施例1中HP-PRRSV强毒株XJ17-5和弱毒株JSTZ1712-12基因组全长cDNA连接构建示意图；
图3是本发明实施例1中XJ17-5和JSTZ1712-12毒株全基因片段PCR扩增结果图(M:DNA Marker；1-3:XJ17-5 F1,F2,F3片段；4-6：JSTZ1712-12 F1,F2,F3片段)；
图4是本发明实施例1中感染性克隆病毒rXJ17-5和rJSTZ1712-12感染Marc-145细胞后的细胞病变图；
图5是本发明实施例1中利用针对PRRSV的N蛋白单克隆抗体的间接免疫荧光检测法检测拯救的rXJ17-5和rJSTZ1712-12感染性克隆病毒结果图；
图6是本发明实施例2中pAscI-KpnI-EGFP-BclI-BglII质粒构建示意图；
图7是本发明实施例2中pAscI-KpnI-RFP-BclI-BglII质粒构建示意图；
图8是本发明实施例2中在感染性克隆病毒rXJ17-5和rJSTZ1712-12的非结构蛋白和结构蛋白编码基因之间插入不同荧光蛋白序列的构建示意图。
具体实施方式
下列实施例中的常规实验方法，参见Sambrook等编写的《分子克隆实验指南》第三版(北京：科学出版社，2002)，仪器的使用参照仪器操作说明书。
在本发明的实施例中，病毒有XJ17-5和JSTZ1712-12分离株。细胞有Marc-145和BHK21细胞系。
在本发明实施例中，质粒和菌株：pACYC177质粒购自优宝生物，pDsRed-Express-C1质粒保存于本实验室，Trans1-T1感受态细胞购自北京全式金生物有限公司。
在本发明实施例中，使用的其他试剂：RNase Free H2O、胰酶细胞消化液(酚红)购自Solarbio公司；TRIpure Reagent总RNA提取试剂购自艾德莱生物公司；PrimeScript1stStrand cDNA Synthesis Kit、2×PrimeSTAR MAX DNA Polymearse购自TAKARA公司；FastPure Plasmid Mini Kit购自诺维赞生物科技有限公司；DMEM培养基购自HyClone生物化学制品有限公司；胎牛血清购自Sigma公司；DyLight 594,Goat anti-Mouse IgG(H+L)Secondary Antibody购自Invitrogen；DNA Marker购自浙江博而金科技股份有限公司；2×BioGold Tag Plus PCR MasterMix购自浙江博而金科技股份有限公司；Gel ExtractionKit购自北京康为世纪生物科技有限公司；DNA限制性内切酶购自New England BioLabs公司；T4 DNA Ligase、LipofectamineTM3000Transfection Reagent购自Invitrogen。
实施例1—猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株XJ17-5和JSTZ1712-12基因组全长cDNA克隆构建与拯救
1.1pACYC177-New载体构建
参照前人已报道的感染性克隆构建方法，并在原有的基础上进行改进，设计构建XJ17-5和JSTZ1712-12感染性克隆平台的方法。使用DNAMAN软件比对分析XJ17-5和JSTZ1712-12全基因组序列，选取PacⅠ、AflⅡ、AscⅠ和NotⅠ4个单一酶切位点，用于XJ17-5和JSTZ1712-12感染性克隆平台构建时基因全长的分段插入。如图1载体改造示意图所示，选择低拷贝质粒pACYC177作为原始载体，将一个包含CMV启动子、对应的4个酶切位点(PacⅠ、AflⅡ、AscⅠ和NotⅠ)和牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸信号的900bp片段插入载体pACYC177,位于其限制性酶切位点BamHⅠ之后。重组载体由苏州金唯智合成并经测序验证后命名为pACYC177-New。
1.2引物设计
根据GenBank中XJ17-5和JSTZ1712-12的全基因序列(GenBank登录号：MK759853和MK906026)，使用Primer 5.0设计3对包含其PRRSV全基因的扩增引物(如下表1)，其中引物R3-1、R3-2-NotⅠ引入丁型肝炎病毒(HDV Ribozyme)序列。
表1.本发明构建感染性克隆中扩增PRRSV全基因的引物
Figure BDA0002549922500000071
1.3XJ17-5和JSTZ1712-12感染性克隆构建
1.3.1XJ17-5和JSTZ1712-12全基因分段扩增
以XJ17-5为模板，分别以F1-PacⅠ和R1-AflⅡ；F2-AflⅡ和R2-AscⅠ配对扩增F1和F2片段。扩增F3片段需要分两步进行，首先使用F3-AscⅠ和R3-1配对扩增F3-1片段，随后以F3-1扩增产物作为模板，以F3-AscⅠ和R3-2-NotⅠ配对扩增F3片段以加入丁型肝炎病毒(HDVRibozyme)序列。以XJ17-5全基因分段扩增为例，具体操作如下：
PCR反应体系为：XJ17-5 cDNA模板2μL,上下游引物对(10uM)各1μL,2×PrimeSTARMAX DNA Polymearse 20μL,RNase Free H2O补至40μL。
PCR反应程序为：98℃ 10s,60℃ 30s,72℃ 6min，35个循环。
按照上述方法，分段扩增JSTZ1712-12全基因。如图3所示，取PCR反应产物5μL，使用浓度为0.9％的琼脂糖凝胶进行电泳，分别获得片段大小为6112bp,5415bp和3562bp的三个基因片段。
1.3.2XJ17-5和JSTZ1712-12各片段连接
将上述扩增产物使用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，纯化产物和PACYC177-New质粒双酶切，依次连接到PACYC177-New载体，构建策略如图2所示。具体操作步骤如下：
首先使用PacⅠ和AflⅡ双酶切PACYC177-New质粒和XJ17-5 F1，PACYC177-New酶切体系为：PACYC177-New质粒(100ng/μL)20μL,PacⅠ2μL,AflⅡ2μL,10×CutSmart Buffer 4μL,RNase Free H2O补至40μL。XJ17-5 F1酶切体系为：XJ17-5 F1纯化产物(200ng/μL)10μL,PacⅠ2μL,AflⅡ2μL,10×CutSmart Buffer 4μL,RNase Free H2O补至40μL。反应条件：37℃水浴2h。
利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收。胶回收的线性载体pACYC177-New和酶切产物XJ17-5 F1按摩尔比为1:8,以T4 DNA连接酶连接，转化Trans1-T1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用检测引物进行菌液PCR检测。选取PCR阳性菌过夜增菌培养，提取质粒DNA，使用PacⅠ和AflⅡ进行双酶切鉴定，0.8％琼脂糖凝胶电泳，挑取酶切大小正确的的质粒进行下一步片段连接。
XJ17-5 F2和F3片段的连接方法与XJ17-5 F1连接方法相似，按照图2所示构建策略图进行连接，获得含XJ17-5全基因的感染性克隆质粒rXJ17-5。按照上述方法完成JSTZ1712-12感染性克隆构建，并命名为rJSTZ1712-12。
1.4rXJ17-5和rJSTZ1712-12感染性克隆病毒拯救
预先使用含10％FBS的DMEM培养基将BHK21细胞按2×105cells/孔的密度接种于24孔细胞培养板，置于37℃,5％CO2的培养箱培养至细胞密度达到80％左右。按照LipofectamineTM 3000Transfection Reagent说明进行细胞转染，具体操作如下：
首先在一个EP管中配置质粒预混液：感染性克隆质粒500ng,P3000 1μL,DMEM 25μL；在另一个EP管中配置Lip3000预混液：Lip3000 1.5μL,DMEM 25μL；最后将上述两步获得的预混液混合，室温静置15min,加入待转染的细胞。
预先使用含10％FBS的DMEM培养基将Marc-145细胞按2×105cells/孔的密度接种于12孔细胞培养板，置于37℃,5％CO2的培养箱培养，至细胞密度达到80％左右，换用含2％FBS的DMEM培养基。
细胞转染后36-48h,将整个培养板冻于－80℃,反复冻融两次后取全部细胞悬液，10,000×g离心1min。取全部上清加入Marc-145细胞，继续培养，每天观察细胞情况。如图4所示，拯救病毒接种Marc-145后72h后可见细胞出现皱缩、聚集、脱落等CPE现象，阴性对照组细胞无明显CPE产生。rXJ17-5和rJSTZ1712-12拯救病毒与亲本毒株(XJ17-5和JSTZ1712-12)CPE特征基本一致。如图5所示，取第3代拯救病毒接种Marc-145,48hpi后使用PRRSV抗N蛋白单克隆抗体15A1检测，可见亲本毒株与拯救病毒出现特异性红色荧光，阴性对照组无荧光产生，再次验证病毒拯救成活。
实施例2—含特异性荧光标记的猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆rXJ17-5-EGFP和rJSTZ1712-12-RFP毒株构建与拯救
1.1质粒构建
为了便捷的判定感染性克隆病毒的拯救情况和分析拯救病毒的复制，本研究在rXJ17-5和rJSTZ1712-12感染性克隆的基础上分别插入增强型绿色荧光蛋白(Enhancedgreen fluorescent protein,EGFP)和红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)。如图6所示，一段全长为1100bp且包含4个酶切位点(分别为AscI,KpnI,BclI和BglII)和EGFP的基因片段由苏州金唯智公司合成并插入到pUC57载体，命名其为pAscI-KpnI-EGFP-BclI-BglII。根据实验室保存的pDsRed-Express-C1质粒设计的一对引物(RFP-F-KpnⅠ:5’-ATTGAAGGTACCGCCACCATGGCCTCCTCCGAGGA-3’和RFP-R-BclⅠ:5’-TGCCGCGGAATGATCACTACAGGAACAGGTGGTGGC-3’)扩增RFP基因，扩增后产物经琼脂糖凝胶电泳验证大小后，替换pAscI-KpnI-EGFP-BclI-BglII中的EGFP片段，命名其为pAscI-KpnI-RFP-BclI-BglII。
1.2rXJ17-5-EGFP和rJSTZ1712-12-RFP感染性克隆构建
鉴于BglII仅在XJ17-5 F3片段中为单酶切位点，因此使用AscI、BglⅡ对已构建质粒pXJ17-5-F3和合成的pAscI-KpnI-EGFP-BclI-BglII质粒进行双酶切。将切下的EGFP连接到pXJ17-5-F3中，得到pXJ17-5-F3-EGFP。最后通过AscⅠ和NotⅠ对其进行双酶切，并与rXJ17-5感染性克隆全长质粒进行替换，完成rXJ17-5-EGFP的构建。
rJSTZ1712-12-RFP感染性克隆构建方法与上述方法基本一致，详见图7所示构建策略图。
1.3rXJ17-5-EGFP和rJSTZ1712-12-RFP感染性克隆病毒拯救rXJ17-5-EGFP和rJSTZ1712-12-RFP感染性克隆病毒拯救方法参见实施例1，因插入不同的荧光蛋白基因，可直接利用荧光显微镜判断病毒是否拯救成功和观察拯救病毒接种Marc-145后的复制情况。如图8所示，取第3代拯救病毒接种Marc-145,48hpi后拯救病毒出现特异性荧光信号，rXJ17-5-EGFP感染细胞浆出现特异性绿色荧光，rJSTZ1712-12-RFP感染细胞浆出现特异性红色荧光，阴性对照组无荧光产生，再次验证重组病毒拯救成功。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 两株基因组高度同源猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染性克隆构建、拯救与应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agctcgttaa ttaatacatg acgtataggt gttggct 37
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cataggtgct taagttcatt accacctgta acggat 36
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atccgttaca ggtggtaatg aacttaagca cctatg 36
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctttctggc gcgcccgaaa c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtttcgggcg cgccagaaag g 21
<210> 6
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agcgaggagg ctgggaccat gccggccttt tttttttttt ttttttttaa ttacggccgc 60
atggttct 68
<210> 7
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acaggcggcc gcgtcccatt cgccattacc gaggggacgg tcccctcgga atgttgccca 60
gccggcgcca gcgaggaggc tgggaccat 89

Claims (5)

1.两株基因组高度同源猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染性克隆构建，其特征是，提供了一种重组载体，包含HP-PRRSV基因组全长cDNA序列，该全长cDNA序列的5’端加有巨细胞病毒真核启动子序列，3’端Poly(A)尾下游加有丁肝炎病毒核酶序列以及牛生长激素多聚腺苷酸信号转录终止序列；
上述载体为pACYC177低拷贝载体，在pACYC177载体上插入四个单一限制性酶切位点PacI, AflII, AscI和NotI，用于HP-PRRSV强毒株XJ17-5和弱毒株JSTZ1712-12的感染性克隆构建。
2.如权利要求1所述的两株基因组高度同源猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染性克隆拯救，其特征是，将上述重组载体与高效转染试剂混合后直接转染Marc-145细胞或者转染BHK-21细胞后再感染Marc-145细胞，均拯救获得XJ17-5或者JSTZ1712-12感染性克隆病毒。
3.如权利要求1所述的两株基因组高度同源猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株的应用，其特征是，提供了一种人工构建的强弱毒株在研究HP-PRRSV体外复制效力差异上的应用:利用感染性克隆平台，通过在HP-PRRSV毒株非结构蛋白和结构蛋白编码基因之间引入特异性荧光标记，使其可应用于实时监测病毒复制过程；并借助感染性克隆平台进一步分析其复制力相关关键基因及位点。
4.如权利要求1所述的两株基因组高度同源猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株的应用，其特征是，提供了一种人工克隆的强弱毒株在研究HP-PRRSV毒力相关基因上的应用：利用感染性克隆平台，通过将HP-PRRSV强毒株与弱毒株进行相应基因片段互相替换，解析HP-PRRSV的毒力相关基因。
5.如权利要求1所述的两株基因组高度同源猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株的应用，其特征是，提供了一种人工改造的天然弱毒疫苗候选株，所述人工改造的天然弱毒疫苗候选株是HP-PRRSV天然弱毒株JSTZ1712-12的感染性克隆病毒，该人工改造天然弱毒疫苗候选株可应用于制备新型PRRSV基因工程疫苗。
CN202010571894.5A 2020-06-22 2020-06-22 两株基因组高度同源猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染性克隆构建、拯救与应用 Pending CN111662885A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010571894.5A CN111662885A (zh) 2020-06-22 2020-06-22 两株基因组高度同源猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染性克隆构建、拯救与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010571894.5A CN111662885A (zh) 2020-06-22 2020-06-22 两株基因组高度同源猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染性克隆构建、拯救与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111662885A true CN111662885A (zh) 2020-09-15

Family

ID=72389266

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010571894.5A Pending CN111662885A (zh) 2020-06-22 2020-06-22 两株基因组高度同源猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染性克隆构建、拯救与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111662885A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114134179A (zh) * 2021-12-13 2022-03-04 扬州大学 表达g2型猪流行性腹泻病毒s/s1的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒及其应用
CN114317574A (zh) * 2021-12-28 2022-04-12 扬州大学 Marc-145细胞适应型1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的培育及其应用
CN114395583A (zh) * 2021-11-01 2022-04-26 扬州大学 一种表达分泌型荧光素酶的猪繁殖与呼吸综合征病毒的cDNA克隆及其构建方法与应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030148325A1 (en) * 1999-12-03 2003-08-07 Sanchez Luis Enjuanes Infectious clones
CN101984061A (zh) * 2010-11-25 2011-03-09 中国农业科学院上海兽医研究所 猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆疫苗株及其应用
CN102085377A (zh) * 2003-03-26 2011-06-08 惠氏公司 免疫原性组合物及方法
CN103695465A (zh) * 2013-12-16 2014-04-02 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株cDNA感染性克隆及其应用
CN103773740A (zh) * 2013-12-19 2014-05-07 广东省农业科学院动物卫生研究所 猪呼吸与繁殖综合征病毒复制缺陷性病毒疫苗株的构建及应用
CN103805634A (zh) * 2014-03-05 2014-05-21 中国科学院武汉病毒研究所 一种带有绿色荧光蛋白基因的ca16感染性克隆及构建方法和应用
CN111676247A (zh) * 2020-06-30 2020-09-18 扬州大学 一株猪繁殖与呼吸综合征病毒1型分离株感染性克隆构建、拯救与应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030148325A1 (en) * 1999-12-03 2003-08-07 Sanchez Luis Enjuanes Infectious clones
CN102085377A (zh) * 2003-03-26 2011-06-08 惠氏公司 免疫原性组合物及方法
CN101984061A (zh) * 2010-11-25 2011-03-09 中国农业科学院上海兽医研究所 猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆疫苗株及其应用
CN103695465A (zh) * 2013-12-16 2014-04-02 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株cDNA感染性克隆及其应用
CN103773740A (zh) * 2013-12-19 2014-05-07 广东省农业科学院动物卫生研究所 猪呼吸与繁殖综合征病毒复制缺陷性病毒疫苗株的构建及应用
CN103805634A (zh) * 2014-03-05 2014-05-21 中国科学院武汉病毒研究所 一种带有绿色荧光蛋白基因的ca16感染性克隆及构建方法和应用
CN111676247A (zh) * 2020-06-30 2020-09-18 扬州大学 一株猪繁殖与呼吸综合征病毒1型分离株感染性克隆构建、拯救与应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN N.等: "Porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate JSTZ1712-12, complete genome", 《GENBANK》 *
CHEN N.等: "Porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate XJ17-5, complete genome", 《GENBANK》 *
NANHUA CHEN等: "The infectious cDNA clone of commercial HP-PRRS JXA1-Rattenuated vaccine can be a potential effective live vaccine vector", 《TRANSBOUNDARY AND EMERGING DISEASES》 *
叶梦雪: "新型PRRSV变异株鉴定及其致病力研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *
叶梦雪等: "猪繁殖与呼吸综合征病毒受体及其在病毒感染中的作用研究进展", 《动物医学进展》 *
尹杰超等: "《病毒重组与突变技术实例》", 31 July 2011 *
赵瑜: "三株PRRSV的生物学特性、全基因组测序及PRRSV/JSyx/2006株全长感染性克隆的构建", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114395583A (zh) * 2021-11-01 2022-04-26 扬州大学 一种表达分泌型荧光素酶的猪繁殖与呼吸综合征病毒的cDNA克隆及其构建方法与应用
CN114395583B (zh) * 2021-11-01 2024-03-29 扬州大学 一种表达分泌型荧光素酶的猪繁殖与呼吸综合征病毒的cDNA克隆及其构建方法与应用
CN114134179A (zh) * 2021-12-13 2022-03-04 扬州大学 表达g2型猪流行性腹泻病毒s/s1的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒及其应用
CN114134179B (zh) * 2021-12-13 2023-09-01 扬州大学 表达g2型猪流行性腹泻病毒s/s1的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒及其应用
CN114317574A (zh) * 2021-12-28 2022-04-12 扬州大学 Marc-145细胞适应型1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的培育及其应用
CN114317574B (zh) * 2021-12-28 2023-12-08 扬州大学 Marc-145细胞适应型1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的培育及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Andersson et al. A defined subgenomic fragment of in vitro synthesized Moloney sarcoma virus DNA can induce cell transformation upon transfection
CN111662885A (zh) 两株基因组高度同源猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染性克隆构建、拯救与应用
CN113215192B (zh) 猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法
CN111676247A (zh) 一株猪繁殖与呼吸综合征病毒1型分离株感染性克隆构建、拯救与应用
Van Gennip et al. Recovery of infectious classical swine fever virus (CSFV) from full-length genomic cDNA clones by a swine kidney cell line expressing bacteriophage T7 RNA polymerase
EP3158060B1 (en) Method for rapid generation of an infectious rna virus
CN110951778B (zh) 犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆及其构建方法和应用
CN110468155B (zh) 一种用于拯救猪肠道甲型冠状病毒的系统、方法及应用
CN116656730B (zh) 一种表达狂犬病病毒g、m蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法
CN113736799B (zh) 山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆构建方法及其应用
CN110904055A (zh) 猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株prrsv-sp及其制备方法与应用
CN115433741A (zh) 盖他病毒为载体表达报告蛋白的重组病毒的构建方法
MXPA05001644A (es) Replicones de pestivirus que no expresan proteina c y/o e1, y particulas virales infecciosas que los contienen y pueden usarse en vacunas.
CN114395568A (zh) 一种猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆及其构建方法与应用
CN113584080A (zh) 一种Nluc标记的重组猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建及其应用
AU736586B2 (en) An infectious clone for human parainfluenza virus type 3
CN115584352A (zh) 猪流行性腹泻病毒（pedv）orf3和e蛋白反式互补单轮感染系统及应用
Zhao et al. Successful establishment of a reverse genetic system for QX-type infectious bronchitis virus and technical improvement of the rescue procedure
CN111235114A (zh) 一种ev71复制缺陷型病毒及其制备方法和应用
CN114395583B (zh) 一种表达分泌型荧光素酶的猪繁殖与呼吸综合征病毒的cDNA克隆及其构建方法与应用
CN117925707A (zh) 一株NADC30-like猪繁殖与呼吸综合征病毒强毒株感染性克隆病毒及其应用
CN114606207B (zh) 一种不依赖胰酶的猪流行性腹泻病毒变异毒株及其构建与应用
CN117025675B (zh) 一种提高Admax重组腺病毒包装系统的外源基因表达量的方法及应用
CN116785422B (zh) 含有新型冠状病毒联合抗原的麻疹减毒疫苗及其拯救方法
CN116426489A (zh) 一种基于CRISPR-Cas9技术的表达新型鹅星状病毒ORF2蛋白C端的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200915