CN114395583B - 一种表达分泌型荧光素酶的猪繁殖与呼吸综合征病毒的cDNA克隆及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法及其应用，属于生物技术领域。本发明通过两次体外同源重组试验，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的病毒RNA反转录产物的基因片段插入pACYC177载体中，得到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性cDNA克隆，并且病毒基因组上游和下游分别添加了CMV早期启动子和丁型肝炎病毒的核酶序列。本发明构建方法效率高，得到的感染性cDNA克隆拯救的病毒感染后分泌gaussia luciferase到细胞外，便于对病毒滴度的检测，且保持遗传稳定。

Description

一种表达分泌型荧光素酶的猪繁殖与呼吸综合征病毒的cDNA 克隆及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的cDNA克隆及其构建方法与应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，又称“蓝耳病”，是猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)感染导致的猪病毒性传染病，给各国养猪业造成重大经济损失。据统计，PRRS每年给美国造成的经济损失约6.5亿美元。基于我国的养殖规模以及该病在我国的流行情况，该病每年给我国造成的经济损失远远超过这个数字。PRRS的主要临床症状以各生长阶段呼吸道疾病以及母猪繁殖障碍为特征，常表现为发热、厌食、呼吸困难等，还会导致严重的免疫抑制。PRRS于1995年首次在我国上海、北京爆发，随后向其周围地区和省份蔓延。随着这些年来猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速演化，我国临床上的主要流行毒株包括经典毒株、高致病性毒株(HP-PRRSV)、类NADC30毒株和类NADC34毒株等。商品化的疫苗能够提供良好的同源保护，但是对异源毒株保护非常有限。不断出现的新毒株大大降低了商品化疫苗的保护效果，这已成为PRRS防控急需克服的困难。
反向遗传操作系统是一种定向改造和修饰病毒基因组的重要基因工程技术，该技术已成为病毒学基础研究和疫苗研发必不可少的技术平台。迄今，各国科学家已经成功构建了PRRSV的反向遗传操作系统，并将其用于解析PRRSV的复制机制、致病机制以及病毒宿主相互作用机制。PRRSV感染性cDNA克隆也被用作病毒载体表达外源基因。据报道，PRRSV基因组中多个区域可用于表达外源基因，包括nsp2的高度变异区、nsp12/GP2a之间、ORF4/ORF5a之间和 ORF7/3’UTR之间等位置。以PRRSV为载体，成功表达了多种报告基因，包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶等。与上述报告基因相比，gaussia luciferase(Gluc)作为一种分泌性荧光素酶，细胞中合成的80％以上荧光素酶均能分泌至细胞外，细胞上清中的荧光素酶活性可以反应Gluc的表达情况。并且，Gluc反应产生的荧光强度是萤火虫和海肾荧光素酶的 100倍以上。本发明建立猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性cDNA克隆，并且将 PRRSV TRS6和Gluc基因组成的表达框插入到ORF7和3’UTR之间，构建了表达Gluc的标记病毒，将该病毒应用于抗病毒药物的快速评价。本发明为深入解析HP-PRRSV的致病机制和特异性抗病毒药物筛选奠定了基础。
发明内容
发明目的：本发明要解决的技术问题是提供一种表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的cDNA克隆；
本发明还要解决的技术问题是提供上述表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒cDNA克隆的构建方法；
本发明最后要解决的技术问题是提供上述表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒cDNA克隆的应用。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性cDNA克隆构建方法，包括以下步骤：
(1)本发明优选的载体为pACYC177低拷贝载体，将人工合成的SEQ ID NO:1插入pACYC177质粒，得到重组质粒pCMV-TA-vector；
(2)以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TA-12株的病毒RNA反转录产物为模板，用引物F1-F和F1-R扩增F1片段，用引物F2-F和F2-R扩增F2片段，用引物F3-F和F3-R扩增F3片段，用引物F4-F和F4-R扩增F4片段；
(3)通过体外同源重组试验，将F1和F2片段插入到pCMV-TA-vector的 MluI和AflII位点之间，得到重组质粒pCMV-TA12-F1～F2；通过体外同源重组试验，将F3和F4片段插入到pCMV-TA--F1～F2的AflII和EcoRV位点之间，得到感染性克隆质粒pCMV-TA-12；
(4)以pCMV-TA-12质粒为模板，用引物对TA-12-EcoRV-F/TA-12- dBsrGI-R和TA-12-dBsrGI-F/TA-12-dBsrGI-R分两段扩增TA-12基因组的 12408～13404nt区域、突变12621nt处的碱基A为C；
(5)通过体外同源重组试验，将上述获得的两个片段替换pCMV-TA-12 中的相对应的区域，得到含有遗传标记(BsrGI灭活)的感染性克隆质粒 pCMV-TA-12M。
表达gaussia luciferase基因的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法，包括以下步骤：
(1)以pCMV-Gluc质粒为模板(Gluc基因序列如SEQ ID NO.：3所示)，用引物TA-12-TRS6/Gluc-F和TA-12-Gluc/UTR-R扩增Gluc基因序列；以 pCMV-TA-12质粒为模板，用引物对TA-12-BsrGI-F/TA-12-N/TRS6-R和TA- 12-Gluc/UTR-F/TA-12-NotI-R分别扩增病毒序列；
(2)通过体外同源重组试验，将(1)中获得的DNA片段插入pCMV- TA-12M中的BsrGI和NotI位点之间，得到感染性克隆质粒pCMV-TA-Gluc。
本发明还提供了上述方法得到的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性 cDNA克隆质粒以及其在拯救高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及标记病毒中的应用。
本发明中，所述应用包括如下步骤：利用转染试剂LipofectamineTM 3000将感染性cDNA克隆质粒(pCMV-TA-12M或pCMV-TA-Gluc)转染BHK-21细胞，收获细胞培养上清，再将上清感染MARC-145细胞，获得拯救的感染性高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒rTA-12M或rTA-Gluc。
本发明中，所述应用涉及基于rTA-Gluc抗病毒药物平台，包括如下步骤：将病毒吸附至MARC-145细胞单层，覆盖培养基并加入待筛选药物进行孵育24 h，然后收集细胞培养上清，通过检测上清中Gluc活性测定病毒滴度，从而评价药物对HP-PRRSV的抗病毒作用。
该构建方法简便、高效，该感染性cDNA克隆拯救的重组病毒rTA-Gluc感染MARC-145细胞后表达Gluc并且分泌到细胞培养上清中，其生长特性与亲本病毒基本一致，且保持遗传稳定；该重组病毒提供一个新型的HP-PRRSV抗病毒药物的快速筛选方法，该方法快速简便、敏感性高、可靠性好，可以进行高通量样本分析，具有很好的应用前景。
有益效果：本发明的显著特点包含：
(1)本发明提供的感染性cDNA克隆质粒在大肠杆菌中有良好的稳定性，该质粒中病毒基因组上游的巨细胞病毒早期启动子(CMV)在哺乳动物细胞中能启动RNA转录，通过DNA转染BHK-21细胞直接拯救重组病毒，不需要体外转录成病毒RNA再转染，克服了RNA体外不稳定和易降解等缺点。
(2)本发明提供的感染性cDNA克隆质粒中病毒基因组下游的丁型肝炎病毒核酶序列自我剪切获得精确病毒基因组3′末端，大大提高病毒拯救效率。
(3)本发明提供的表达Gluc的HP-PRRSV标记病毒表达的荧光素酶分泌至胞外，无需裂解细胞即可快速检测荧光信号。
(4)本发明提供的表达Gluc的HP-PRRSV标记病毒能用于抗病毒药物的快速筛选和评价，为开发特异性的抗PRRSV药物奠定基础。
附图说明
图1为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TA-12株感染性cDNA克隆构建策略示意图。
图2为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TA-12株的基因组片段RT-PCR 扩增的凝胶电泳图。
图3为表达Gluc的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性cDNA克隆 pCMV-TA-12M质粒的构建示意图。
图4为重组病毒vTA-12M和vTA-Gluc的间接免疫荧光鉴定。
图5为感染性cDNA克隆拯救病毒的多步生长曲线与空斑试验。
图6为重组病毒vTA-Gluc表达外源基因稳定性检测。
图7为重组病毒vTA-Gluc在评价干扰素α抑制HP-PRRSV中的应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
下列实施例中的常规实验方法，参见Sambrook等编写的《分子克隆实验指南》第三版(北京：科学出版社，2002)，仪器的使用方法参照仪器操作说明书。
在本发明的实例中，病毒有HP-PPRSV TA12分离株；细胞有BHK-21细胞系和Marc-145细胞系。
在本发明实施例中，质粒和毒株：pACYC177购自New England Biolabs， pCMV-TA12，pCMV-TA12M,pCMV-TA12-Gluc2质粒保存于本实验室，Top10 感受态细胞购自上海昂羽生物科技有限公司。
在本发明实施例中，使用的其他试剂：TIANamp Virus DNA/RNA Kit购自天根生化科技(北京)有限公司；Lipofectamine 3000 Transfection Reagent、IVFirst-Strand cDNA Synthesis Reaction、Opti-MEM购自赛默飞世尔科技；/>High-Fidelity DNA Polymerase、dNTPs、/>HiFi DNA Assembly Master Mix、DNA限制性核酸内切酶购于New England Biolabs； 50×TAE缓冲液、20×PBS缓冲液、LB Broth、Kanamycin购于生工生物工程 (上海)股份有限公司；RNase-free H2O、DNA Marker/Ladder、Ultra GelRed (10000×)、FastPure Plasmid Mini Kit购于诺唯赞生物科技有限公司；引物合成于南京金斯瑞生物科技有限公司；/>Spin Miniprep Kit购自QIAGEN； DMEM培养基购自HyClone生物化学制品有限公司；胎牛血清购自Sigma公司；Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)购自Jacksonimmune research Inc。
实施例1：高致病性繁殖与呼吸综合征病毒TA-12株感染性cDNA克隆质粒的构建
构建策略如图1所示。
选择低拷贝质粒pACYC177(购自NEB)作为原始载体，将SEQ ID NO:1 插入至载体pACYC177中的AscI和BglI位点之间，得到重组质粒pCMV-TA-vector。SEQ ID NO:1由苏州金唯智生物科技有限公司，包含CMV早期启动子、多个限制性内切酶位点、TA-12株的部分3’UTR和丁型肝炎病毒核酶序列。
根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TA-12株的全基因组序列 (GenBank登录号：MZ342900)，使用SnapGene软件设计4对特异性引物 (见表1)分段RT-PCR扩增病毒基因组F1、F2、F3和F4四个片段。
按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书提取HP-PRRSV TA-12株的病毒基因组RNA。以病毒基因组RNA为模板，按照IV First-Strand cDNA Synthesis Reaction(Thermo Fisher Scientific)说明制备流行性腹泻病毒HM株cDNA。反应体系为：2μM gene-specific reverse primer(TA-12-R2或TA-12-R4)1μL，10μM dNTP Mix 1μL，模板RNA 11μL。反应程序为：65℃5min，置于冰上1min。之后反应体系为： 5×SSIV Buffer 4μL，100mM DTT 1μL，Recombinant RNase Inhibitor 1μL，Reverse Transcriptase(200U/μL)1μL。反应程序为：50℃10min，80℃10min，将至室温。加入1μL RNase H，37℃20min去除RNA。
扩增F1和F2片段时，以cDNA(TA-12-R2)为模板，分别用两对引物 TA-12-F1/TA-12-R1和TA-12-F2/TA-12-R2进行扩增；扩增F3和F4片段时，以cDNA(TA-12-R4)为模板，分别用两对引物TA-12-F3/TA-12-R3和TA-12-F4/TA-12-R4进行扩增；反应体系为：cDNA 1μL，上游引物(40μM)和下游引物(40μM)各0.625μL，100mM dNTP Mix 1μL，5×Q5 ReactionBuffer 10 μL，Q5 High Fidelity DNA Polymerase 0.5μL，ddH2O补至50μL。扩增程序为：98℃30s；98℃10s，58℃-63℃20s，72℃5min，循环30次；72℃2min。目的条带大小分别为3317bp，3224bp，5646bp，3236bp，结果如图2所示。
利用HiFi DNA Assembly Master Mix(购自NEB)体外同源重组试剂盒，将回收纯化后的F1和F2片段插入至pCMV-TA-vector中的MluI和 AflII位点之间，得到重组质粒pCMV-TA-F1～F2；再利用/>HiFi DNA Assembly Master Mix，将回收纯化后的F3和F4片段插入至pCMV-TA- F1～F2中的AflII和EcoRI位点之间，得到感染性cDNA克隆质粒pCMV-TA-12。
以pCMV-TA-12质粒为模板，用引物对TA-12-EcoRV-F/TA-12-dBsrGI-R 和TA-12-dBsrGI-F/TA-12-dBsrGI-R分两段扩增TA-12基因组的12408～13404nt 区域、突变12620nt处的碱基A为C；利用HiFi DNA Assembly Master Mix体外同源重组试验，将回收纯化后的上述两个片段替换pCMV-TA- 12中的相对应区域，得到含有遗传标记(BsrGI灭活)的感染性克隆质粒 pCMV-TA-12M。
表1引物名称及序列
实施例2表达gaussia luciferase的高致病性繁殖与呼吸综合征病毒感染性cDNA克隆质粒的构建
构建策略如图3所述。
以pCMV-Gluc质粒(购自Thermo Fisher Scientific)为模板，用引物TA- 12-TRS6/Gluc-F和TA-12-Gluc/UTR-R扩增Gluc基因序列；以pCMV-TA-12质粒为模板，用引物对TA-12-BsrGI-F/TA-12-N/TRS6-R和TA-12-Gluc/UTR-F/TA-12-NotI-R分别扩增A和B片段。反应体系为：cDNA 1μL，上游引物 (40μM)和下游引物(40μM)各0.625μL，100mM dNTP Mix 1μL，5×Q5 Reaction Buffer 10μL，Q5 High Fidelity DNA Polymerase 0.5μL，ddH2O补至50 μL。扩增程序为：98℃30s；98℃10s，58℃-63℃20s，72℃5min，循环30次； 72℃2min。
利用HiFi DNA Assembly Master Mix体外同源重组试剂盒，将上述回收纯化后的Gluc、A和B片段替换pCMV-TA-12M中BsrGI和NotI位点之间的病毒序列，得到感染性克隆质粒pCMV-TA-Gluc。
实施例3高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TA-12株重组病毒及Gluc标记病毒的拯救与生物学特征鉴定
1.重组病毒的拯救与扩增
将BHK-21细胞按5×105cells/孔的密度接种于12孔细胞培养板，在含10％ FBS的DMEM培养基中培养。当细胞密度达到60～70％，按照Lipofectamine 3000转染试剂说明进行质粒转染，每孔的质粒(pCMV-TA-12M或pCMV-TA- Gluc)用量为2μg。于转染后48h，收集病毒上清，并命名为P0代病毒。
将拯救的病毒在MARC-145细胞连续传代，每一代培养物均保存在-80℃冰箱中。具体步骤如下：将MARC-145细胞接种于12孔细胞培养板，待细胞长成细胞单层，用含有2％FBS的MEM感染培养基稀释病毒液，按每孔500 μL接种于MARC-145细胞，待细胞病毒达到80％，收集细胞培养上清为病毒液。
2.间接免疫荧光试验检测病毒N蛋白表达
用冰冻甲醇将DNA转染的BHK-21细胞或者病毒感染的MARC-145细胞， 15min后弃上清，待细胞完全风干，加入PRRSV N蛋白的单克隆抗体4A5(购自Median Diagnostics)，37℃孵育1h，用PBS漂洗5次，再加入Alexa 488 conjugated Goat Anti-Mouse IgG H&L二抗(购自Jackson immune research Inc)，用PBS洗5次，加入DAPI染色5min，PBS洗2次，用荧光显微镜观察并记录实验结果(图4)。
3.病毒滴度测定(TCID50)
在96孔板细胞培养板中接种MARC-145细胞，用含有10％FBS(购自 Sigma)的MEM培养基培养，待长成细胞单层接种病毒。具体步骤如下：用含有2％FBS的MEM培养基10倍梯度稀释病毒液(10-2～10-7)，每个稀释度的病毒液各接种4个细胞孔、每孔100μL，将培养板置于37℃培养箱继续培养。逐日观察感染细胞，感染后5～7天记录出现细胞病变的细胞孔数。按照Reed- Muench方法计算病毒滴度TCID50。
4.多步生长曲线
将MARC-145细胞接种至24孔板中，置于含5％CO2的37℃培养箱中培养，待细胞密度达到100％进行病毒感染。将rTA-12M和rTA-Gluc的P3代病毒以0.01MOI分别感染细胞，每个病毒感染12个孔。分别于感染后0h、12、 24h、36h、48h、60h和72h，收集两个孔的病毒上清，保存于-80℃备用。将收集的病毒上清分别进行10倍梯度稀释，将稀释好的病毒液加入到长满 MARC-145单层的96孔板中，每孔加入100μL，各稀释度的病毒设4个重复，培养基继续在37℃培养。逐日观察并记录病变，于感染后5～7天观察细胞病变并按照Reed-Muench方法计算TCID50，绘制病毒的生长曲线(如图5)。结果表明，与亲本病毒(rTA-12M)相比，rTA-Gluc在细胞上的生长特性基本一致。但是，在感染后12h～60h rTA-Gluc的病毒滴度比亲本病毒低0.5log左右。
5.病毒蚀斑试验
将MARC-145细胞接种至12孔板中，置于含5％CO2的37℃培养箱中培养，待细胞密度达到100％进行病毒感染。将rTA-12M和rTA-Gluc的P3代病毒分别用MEM培养基进行10倍梯度稀释，将稀释好的病毒液加入到12孔板中，37℃、5％CO2的条件下孵育。感染2h后，弃去病毒液，将含有4％FBS 的MEM培养基和2％UltraPureTM LMP Agarose等比例混匀后加入12孔板中，待完全凝固后倒置于37℃、5％CO2培养箱中培养。感染3天后，用4％多聚甲醛固定过夜，第二天弃去4％多聚甲醛与凝胶，每孔加入300μL 1％结晶紫染色液，染色10min，弃去结晶紫溶液、用水清洗，干燥后拍照记录(如图7)。结果表明，两个病毒的空斑形态和大小没有显著差异。
6.rTA-Gluc中外源基因稳定性检测
按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书提取rTA-12M和rTA-Gluc的P5和P10病毒的基因组RNA。以病毒RNA为模板，利用HiScript II OneStep RT-PCR Kit(南京诺唯赞生物科技有限公司)，用引物PRRSV-F1和PRRSV-R进行一步RT-PCR扩增Gluc编码基因序列。反应体系如下：2×One step Mix 12.5μL，表1中的PRRSV-F1(40μM)和PRRSV- R(40μM)各0.25Μl，One step Enzyme Mix 1.25mL，加入ddH2O补至25Μl；反应条件为：50℃30min，94℃预变性3min；94℃30s，60℃30s，72℃ 1min20s，循环30次；72℃7min。rTA-Gluc中的Gluc可以稳定传代10次以上，具有良好的遗传稳定性。
实施例4标记病毒rTA-Gluc应用于评价IFN-α对HP-PRRSV的抑制作用
比较标记病毒rTA-Gluc和亲本病毒rTA-12M对I型干扰素IFN-α的敏感性。具体方法如下：
将MARC-145细胞接种于96孔细胞培养板中，待长成细胞单层，将IFN-α (上海生工)稀释至103IU/μL、102IU/μL、101IU/μL和100IU/μL，随后各取 100Μl感染，每个浓度设置3个重复。
待IFN-α刺激14h后，进行病毒感染。分别取亲本病毒(rTA-12M)和标记病毒(rTA-Gluc)感染MARC-145细胞，每孔的感染剂量为200 TCID50。孵育1h后弃上清，用PBS洗2遍，每孔加入150μl含有2％FBS和相应浓度的 IFN-α的MEN培养基，再孵育24h后收集上清。通过病毒滴度测定与Gluc荧光素酶活性测定来评价不同浓度的IFN-α对HP-PRRSV的抑制能力，利用 GraphPad prism 8软件计算IFN-α对rTA-12M和rTA-Gluc的半数抑制剂量(IC50)。如图7所示，根据病毒滴度测序，IFN-α对rTA-12M和rTA-Gluc的 IC50分别为6.64IU/μL和2.08IU/μL，可见两个病毒对IFN-α的敏感性一致。另外，基于病毒液中Gluc的荧光素酶活性，IFN-α对rTA-Gluc的IC50为13.22 IU/μL，与病毒滴度测定的结果基本一致。因此，标记病毒rTA-Gluc可以代替亲本病毒rTA-12M用于抗HP-PRRSV药物筛选，具有简便、快速、经济等特点。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种表达分泌型荧光素酶的猪繁殖与呼吸综合征病毒的cDNA克隆及其构建方法与应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 853
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atattggcgc gccatgcatt agttttaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag 60
cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 120
caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 180
gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 240
tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 300
ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 360
attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata 420
gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt 480
ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca 540
aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctacgc gtcttaagga 600
tatcgaattc ctattcaatt agggcgaccg tgtgggggta aagtttaatt ggcgagaacc 660
atgcggccgt aattaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaggccgg catggtccca gcctcctcgc 720
tggcgccggc tgggcaacat tccgagggga ccgtcccctc ggtaatggcg aatgggacgc 780
ggccgcttta agcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc 840
gtgggtctcg cgg 853
<210> 2
<211> 15342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgacgtata ggtgttggct ctatgccacg gcatttgtat tgtcaggagc tgtgaccatt 60
agcacagccc aaaacttgct gcacgggaac accctcctgt gacagccctc ttcagggaga 120
ttaggggtct gtccctaaca ccttgcttcc ggagttgcac tgctttacgg tctctccacc 180
cctttaacca tgtctgggat acttgatcgg tgcacgtgta cccccaatgc cagggtgttt 240
gtggcggagg gccaggtcta ctgcacacga tgtctcagtg cacggtctct ccttcctctg 300
aatctccaag ttcctgagct tggggtgctg ggtctatttt ataggcccga agagccactc 360
cggtggacgt tgccacgtgc attccccact gtcgagtgct cccccgccgg ggcctgctgg 420
ctttctgcga tctttccgat tgcacggatg actagtggaa acctgaactt tcaacaaaga 480
atggtgcggg tcgcagctga aatctacaaa gccggccaac tcacccctac agttctaaaa 540
actctacaag tttatgaacg gggttgtcgc tggtacccca ttgtcgggcc cgtccctggg 600
gtgggcgtct acgccaactc cctgcatgtg agtgacaaac ctttcccggg agcaactcat 660
gtgttaacca acttgccgct cccgcagagg cccaaacctg aggacttttg cccttttgag 720
tgtgctatgg ctgacgtcta tgacattggt cgtggcgccg tcatgtatgt ggccggagga 780
aaggtctctt gggcccctcg tggtgggaat gaagtgaaat ttgaacctgt ccccaaggag 840
ttgaagttgg ttgcgaaccg actccacacc tccttcccgc cccatcacgt agtggacatg 900
tccgagttta ccttcatgac ccctgggagt ggtgtctcca tgcgggttga gtaccaatac 960
ggttgcctcc ccgctgacac tgtccctgaa ggaaactgct ggtggcgctt gtttgactcg 1020
ctcccaccgg aagttcagta caaagaaatt cgccatgcta accaatttgg ctaccaaacc 1080
aagcatggtg tccctggcaa gtacctacag cggaggctgc aagttaatgg tcttcgggca 1140
gtgaccgaca cacatggacc tatcgtcata cagtacttct ctgttaagga gagttggatc 1200
cgccacctga agttggtgga agagcccagc ctccccgggt ttgaggatct tctcagaatc 1260
agggttgagc ccaatacgtc accactggct ggaaaggatg agaagatttt ccggtttggc 1320
agtcataagt ggtacggtgc cggaaagaga gcaaggaaag cacgctctgg tgcgactact 1380
atggtcgctc atcacgcttc gtccgctcat gaaacccggc aggccacgaa gcacgagggt 1440
gccggcgcta acaaggttga gcatctcaag cgctactctc cgcctgccga agggaactgt 1500
ggttggcact gcatttccgc catcgccaac cggatggtga attccaactt tgagaccacc 1560
cttcctgaaa gagtaaggcc ttcagatgac tgggccactg acgaggatct tgtgaacatc 1620
atccaaatcc tcaggctccc tgcggccttg gacaggaacg gcgcttgcgg tagcgccaag 1680
tacgtgctta aactggaggg tgagcattgg actgtctctg tgatccctgg gatgtcccct 1740
actttgctcc cccttgaatg tgttcagggt tgttgtgagc ataagggcgg tcttgtttcc 1800
ccggatgcgg tcgaaatttc cggatttgat cctgcctgcc ttgaccgact ggctaaggta 1860
atgcacttgc ctagcagtac catcccagcc gctctggccg aattgtccga cgactccaac 1920
cgtccggttt ccccggccgc tactacgtgg actgtttcgc aattctatgc tcgtcataga 1980
ggaggagatc atcatgacca agtgtgctta gggaaaatca tcagcctttg tcaagttatt 2040
gaggattgct gctgccatca gaataaaacc aaccgggcta ctccggaaga ggtcgcggca 2100
aagattaatc agtacctccg tggcgcaaca agtcttgagg aatgcttggc caaacttgag 2160
agagtttccc cgccgagcgc tgcggacacc tcctttgatt ggaatgttgt gcttcctggg 2220
gttgaggcgg cgaatcagac aaccgaacaa cctcacgtca actcatgctg caccctggtc 2280
cctcccgtga ctcaagagcc tttgggcaag gactcggtcc ctctgaccgc cttctcactg 2340
tccaattgct attaccctgc acatggtgac gaggttcatc accgtgagag gttaaatttc 2400
gtactctcta agttggaaga ggtcgtcctg gaagaatatg ggctcatgtc cactgggctt 2460
ggcccgcgac ccgtgctgcc gagcgggctc gacgagctta aagaccagat ggaggaggat 2520
ctgctagaac tagccaacac ccaggcgact tcagaaatga tggcctgggc ggctgagcag 2580
gtcgatttaa aagcttgggt caaaagctac ccgcggtgga caccaccacc ccctccacca 2640
agagttcaac ctcgcagaac aaagtctgtc aaaagcttgc cagaggacaa gcctgtccct 2700
gctccgcgca ggaaggtcag atccgattgc ggcagcccgg ttttgatggg cgacaatgtc 2760
cctaacggtt cggaagaaac tgtcggtggt cctctcaatt ttccgacacc atccgaaccg 2820
atgacaccta tgagtgagcc cgtacttgtg cccgcgtcgc gacgtgtccc caagctgatg 2880
acacctttga gtaggtcggc accagttcct gcaccgcgta gaactgtgac aacaacgctg 2940
acgcaccagg atgagcctct ggatttgtct gcgtcctcac agacggaatg tgaggctttc 3000
cccctagcac catcgcagaa catgggcatc ctggaggcgg gggggcaaga agctgaggaa 3060
gtcctgagtg aaatctcgga tatactaaat gacaccaacc ctgcacctgt gtcatcaagc 3120
agctccctgt caagtgttaa gatcacgcgc ccaaaatact cagctcaagc catcatcgac 3180
tctggcgggc cttgcagtgg gcatctccaa aaggaaaaag aagcatgcct cagcatcatg 3240
cgtgaggctt gtgatgcgtc caagcttagt gatcctgcta cgcaggagtg gctctctcgc 3300
atgtgggata gggttgacat gctgacttgg cgcaacacgt ctgcttacca ggcgtttcgc 3360
atcttaaatg gcaggcttga gtttctccca aagatgattc tcgagacacc gccgccccac 3420
ccgtgcgggt ttgtgatgtt acctcacacg cctgcacctt ccgtgagtgc agagagtgat 3480
ctcaccattg gttcagtggc caccgaggat gttccacgca tcctcgggaa aataggagac 3540
actgatgagc tgcttgaccg gggtccctcg gcaccctcca agggagaacc ggtctgtgac 3600
caacctgcca aagatccccg gatgtcgccg cgggagtctg acgagagcat aatagctccg 3660
cccgcagatg caggtggtgt cggctcattc actgatttgc cgtcttcaga tggtgtggat 3720
gtggacgggg gggggccgtt aagaacggta aaaacaaaag caggaaggct tttagaccaa 3780
ctgagctgcc aggtttttag cctcgtttcc catctcccta ttttcttctc acacctcttc 3840
aaatctgaca gtggttattc tccgggtgat tggggttttg cagcttttac tctattttgc 3900
ctctttctat gttacagtta cccattcttc ggttttgctc ccctcttggg tgtattttct 3960
gggtcttctc ggcgtgtgcg aatgggggtt tttggctgct ggttggcttt tgctgttggt 4020
ctgttcaagc ctgtgtccga tccagtcggc actgcttgtg agtttgactc gccagagtgt 4080
aggaacgtcc ttcattcttt tgagcttctc aaaccttggg accctgtccg cagccttgtt 4140
gtgggccccg tcggtctcgg ccttgccatt cttggcaggt tactgggcgg ggcacgctac 4200
atctggcact ttttgcttag gcttggcatt gttgcagact gtatcttggc tggagcttat 4260
gtgctttctc aaggtaggtg taaaaagtgc tggggatctt gtgtaagaac tgctcctaat 4320
gagatcgcct tcaacgtgtt cccttttaca cgtgcgacca ggtcgtcact catcgacctg 4380
tgcgatcggt tttgcgcacc aaaaggcatg gaccccattt ttctcgccac tgggtggcgt 4440
gggtgctgga ccggccggag tcccattgag caaccttctg aaaaacccat cgcgttcgcc 4500
cagctggatg agaagaggat tacggctaga actgtggtcg ctcagcctta tgaccccaac 4560
caggccgtaa agtgcttgcg ggtattacag gcgggtgggg cgatggtggc cgaggcagtc 4620
ccaaaagtgg tcaaagtttc cgccattcca ttccgagctc ctttttttcc cgctggagtg 4680
aaagttgatc ctgagtgcag aatcgtggtt gatcccgata cttttactac agccctccgg 4740
tctggctatt ccaccgcgaa cctcgtcctt ggtacggggg actttgccca gctgaatgga 4800
ctaaagatca ggcaaatttc caagccttca gggggaggcc cacacctcat tgctgccttg 4860
catgttgcct gctcgatggc gttacacatg cttgctggtg tttatgtaac tgcagtgggg 4920
tcctgcggta ccggtaccaa cgatccgtgg tgcactaacc cgtttgccgt ccctggctac 4980
ggacctggct ctctttgcac gtctagattg tgcatctccc aacacggcct caccttgccc 5040
ttgacagcac ttgtggcggg attcggcctt caagagattg ccttggtcgt tttgattttt 5100
gtctccatcg gaggcatggc tcataggttg agttgtaaag ctgacatgtt gtgcatctta 5160
cttgcaatcg ctagttatgt ttgggtacct cttacctggt tgctttgtgt gtttccgtgt 5220
tggttgcgct ggttctcttt gcaccccctc accatcctgt ggttggtgtt tttcttgatt 5280
tctgtaaata taccctcggg aatcttggcc gtggtgttat tggtttctct ctggctttta 5340
ggtcgttata ctagcattgc tggtctcgtc accccctatg acattcatca ttacaccagt 5400
ggcccccgcg gtgtcgccgc cttggccacc gcaccagatg gaacctactt ggctgccgtc 5460
cgccgtgctg cactgactgg tcgtaccatg ctgttcaccc cgtctcagct cgggtccctc 5520
cttgagggtg ctttcagaac tcaaaagccc tcactgaaca ccgtcaatgt ggtcgggtcc 5580
tccatgggct ctggcggagt gttcactatt gacgggaaaa tcaagtgcgt gactgccgca 5640
catgtcctta cgggtaactc agctagggtt tccggggtcg gtttcaatca aatgcttgac 5700
tttgatgtaa aaggggactt cgccatagct gattgcccga attggcaagg ggttgctccc 5760
aaggcccagt tctgcgagga tgggtggact ggtcgcgcct attggctgac atcctctggc 5820
gttgaacccg gtgttattgg gaatgggttc gccttttgct tcaccgcgtg tggcgattct 5880
ggatccccag tgattaccga agccggtgag cttgtcggcg ttcacacagg atcaaacaaa 5940
caaggaggag gcattgtcac gcgcccctca ggccagtttt gtaatgtgaa gcccatcaag 6000
ctgagcgagt tgagtgaatt cttcgctgga cctaaggttc cgctcggtga tgtgaaaatt 6060
ggcagtcaca tgattaaaga cgcatgcgag gtgccttcag atctttgtgc cctgcttgct 6120
gccaaacccg aactggaagg aggcctttct acagttcaac ttctgtgtgt gtttttcctc 6180
ctgtggagaa tgatggggca tgcttggacg cccttggttg ctgtggggtt tttcatcctg 6240
aatgagattc tcccagctgt cctggtccgg aatgttttct cctttgggat gtttgtgcta 6300
tcttggctca caccatggtc tgcgcaagtc ctgatgatca ggcttctgac agcagccctt 6360
aacagaaaca gatggtctct tggtttttac atccttggtg cagtaaccag ttttgtcgca 6420
gatcttgcgg taactcaagg gcatccgtta caggtggtaa tgaacttaag cacctatgcc 6480
ttcctgcccc ggatgatggt tgtggcctcg ccagtcccag tgatcgcgtg tggtgttgtg 6540
cacctccttg ccataatttt gtacttgttt aagtaccgct gccttcacaa tgtccttgtt 6600
ggcgatgggg tgttctcttc ggctttcttc ttgcgatact ttgctgaggg aaagttgagg 6660
gaaggggtgt cgcaatcctg cgggataaat catgagtcgc tgactggtgc cctcgccatg 6720
agactcactg acgaggacct ggatttcctt acgaaatgga ctgattttaa gtgctttgtt 6780
tctgcgtcca acatgaggaa tgcagcgggc caatttatcg aggctgctta tgcaaaagca 6840
ctaagaattg aacttgctca gttggtacag gttgaaaagg tccgaggcac catggccaaa 6900
ctcgaggctt ttgccgatac cgtggcaccc caactctcgc ccggtgacat tgttgttgcc 6960
cttggccaca cgcctgttgg cagcatcttc gacctaaagg ttggtagcac caagcatact 7020
ctccaagcca ttgagactag agtccttgcc gggtccaaaa tgactgtggc gcgtgtcgtt 7080
gacccaaccc ccgcaccccc acccgtacct gtgcccatcc ctctcccacc gaaagttctg 7140
gagaacggtc ccaatgcctg gggggatgag gaccgtttga acaagaagaa gaggcgcagg 7200
atggaagccg tcggcatttt tgttatggac gggaaaaagt accagaaatt ttgggacaag 7260
aattccggtg atgtgtttta tgaggaggtc catattagca cagacgagtg ggagtgcctt 7320
agaactggcg accctgtcga ctttgatcct gagacaggga ttcagtgtgg gcacatcacc 7380
attgaagaca aggtttacaa tgtctttacc tccccatccg gtaggagatt cttggtcccc 7440
gccaaccccg agaatagaag agctcagtgg gaagccgcca agctttccgt ggagcaagcc 7500
cttggtatga tgaacgtcga cggcgaactg actgccaaag aactggagaa actgaaaaga 7560
ataattgaca aactccaggg cctgactaag gagcagtgtt taaactgcta gccgccagcg 7620
gcttgacccg ctgtggtcgc ggcggcttag ttgttactga gacagcggta aaaatagtca 7680
aattccacaa ccggaccttc accctaggac ctgtgaactt aaaagtggcc agtgaggttg 7740
agctaaaaga cgcggttgag aacaaccaac atccggtagc cagaccggtt gatggtggtg 7800
ttgtgctcct gcgctctgca gttccttcgc ttatagatgt cttgatctcc ggcgctgacg 7860
catctcctaa gttactcgcc cgccacgggc ctggaaacac tgggattgat ggcacgcttt 7920
gggattttga ggccgaggct actaaagagg aagttgcact cagtgcgcaa ataatacagg 7980
cttgtgacat taggcgcggc gacgcgcctg aaattggtct cccttataag ttgtaccctg 8040
ttaggggcaa ccctgagcgg gtaaaaggag ttttacagaa tacaaggttt ggagacatac 8100
cttacaaaac ccccagtgac actggaagcc cggtgcacgc ggctgcctgc ctcacgccta 8160
atgctactcc ggtgactgat gggcgctccg tcttggctac aaccatgccc tctggctttg 8220
agttgtatgt gccgaccatt ccagcgtccg tccttgatta tcttgattct aggcctgact 8280
gccctaaaca gttaacagag cacggttgtg aggatgctgc attaagagac ctctccaagt 8340
atgatttgtc cacccaaggc tttgttttgc ctggagttct tcgcctcgtg cggaagtacc 8400
tgttcgccca cgtgggtaag tgcccgcccg ttcatcggcc ttccacttac cctgctaaga 8460
attctatggc tggaataaat gggaacaggt ttccaaccaa ggacattcag agcgtccctg 8520
aaatcgacgt tctgtgcgca caggctgtgc gagaaaactg gcaaactgtt accccttgta 8580
ccctcaagaa acagtactgt gggaagaaga agactaggac aatacttggg accaataatt 8640
ttattgcgtt ggcccaccgg gcagcgttga gtggtgttac ccagggcttc atgaaaaaag 8700
cgttcaactc gcccatcgcc ctcgggaaaa acaaatttaa ggagctacaa gccccggtcc 8760
taggcaggtg ccttgaagct gatcttgcgt cctgcgatcg atccacacct gcaattgtcc 8820
gctggtttgc cgccaatctt ctttatgaac tcgcctgtgc tgaggagcat ctaccgtcgt 8880
acgtgctgaa ctgctgccac gacttactgg tcacgcagtc cggcgcggtg actaagagag 8940
gtggcctgtc gtctggcgac ccgatcacct ctgtgtcaaa caccatttac agcttagtga 9000
tatatgcaca gcacatggta ctcagttact tcaaaagtgg tcaccctcat ggccttttgt 9060
ttctgcaaga ccagctaaag tttgaggaca tgctcaaggt tcaacccctg atcgtctatt 9120
cggacgacct tgtgctgtat gccgagtctc cctccatgcc aaactaccac tggtgggttg 9180
aacatctgaa tcttatgctg ggtttccaga cggacccaaa gaagacaacc atcacagatt 9240
caccatcatt cctaggttgc aggataataa atgggcgcca gctggtcccc aaccgtgaca 9300
ggatcctcgc ggccctcgcc taccacatga aggcaagtaa tgtttctgaa tactacgcct 9360
cggcggctgc aatactcatg gacagctgtg cttgtttaga gtatgatcct gaatggtttg 9420
aagagctcgt ggttgggatg gcgcagtgcg cccgcaagga cggctacagc tttcctggcc 9480
caccgttctt cttgtccatg tgggagaaac tcaggtccaa tcatgagggg aagaagtcca 9540
gaatgtgcgg gtactgcggg gccccggctc cgtacgccac tgcctgtggt ctcgatgtct 9600
gtgtttacca cacccacttc caccagcatt gtcctgttat aatctggtgt ggccacccgg 9660
cgggttctgg ttcttgtagt gagtgcgaac cccccctagg aaaaggcaca agccctctag 9720
atgaggtgtt agaacacgtt ccgtacaagc ctccgcggac tgtgatcatg catgtggagc 9780
agggtctcac ccctcttgac ccaggtagat accagactcg ccgcggatta gtctccgtta 9840
ggcgtggcat caggggaaat gaagtcgacc taccagacgg tgattacgct agcaccgcct 9900
tgctccctac ttgtaaagag atcaacatgg tcgctgtcgc ctctaacgtg ttgcgcagca 9960
ggtttatcat cggcccaccc ggtgctggga aaacacactg gcttcttcaa caagtccagg 10020
atggtgatgt catttacacg ccaactcacc agaccatgct cgacatgatt agggctttgg 10080
ggacgtgccg gttcaacgtt ccagcaggta caacgctgca attccctgcc ccctcccgta 10140
ccggcccatg ggttcgcatc ttggccggcg gttggtgtcc tggcaagaac tccttcctgg 10200
atgaagcggc gtattgcaat caccttgatg tcttgaggct tctcagcaaa acaactctta 10260
cttgcctagg ggacttcaaa caactccacc ctgtgggttt tgactcccat tgctatgtat 10320
ttgacatcat gcctcagacc caattagaga ccatctggag gttcgggcag aatatctgtg 10380
atgccattca accagattac agggacaaac ttatgtccat ggtcaacacg acccgtgtga 10440
cctacgtgga aaaacctgtc aggtatgggc aagtcctcac cccctaccac agggaccggg 10500
aggacggcgc cattactatc gactccagtc aaggcgccac atttgatgtg gttacactgc 10560
atttgcccac taaagattca ctcaacaggc aaagagctct tgttgctatc accagggcaa 10620
gacatgctat cttcgtgtat gacccacaca ggcaattgca gagcttgttt gatcttcccg 10680
cgaaaggcac acccgtcaac ctcgcagtgc accgtgacga acagctgatc gtattagaca 10740
gaaacaacag agaaatcacg gttgctcagg ctctaggcaa tggagataaa ttcagggcca 10800
cagataagcg cgttgtagat tctctccgcg ctatttgcgc agatctggaa gggtcgagct 10860
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<211> 15940
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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tgttcgccca cgtgggtaag tgcccgcccg ttcatcggcc ttccacttac cctgctaaga 8460
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ccctcaagaa acagtactgt gggaagaaga agactaggac aatacttggg accaataatt 8640
ttattgcgtt ggcccaccgg gcagcgttga gtggtgttac ccagggcttc atgaaaaaag 8700
cgttcaactc gcccatcgcc ctcgggaaaa acaaatttaa ggagctacaa gccccggtcc 8760
taggcaggtg ccttgaagct gatcttgcgt cctgcgatcg atccacacct gcaattgtcc 8820
gctggtttgc cgccaatctt ctttatgaac tcgcctgtgc tgaggagcat ctaccgtcgt 8880
acgtgctgaa ctgctgccac gacttactgg tcacgcagtc cggcgcggtg actaagagag 8940
gtggcctgtc gtctggcgac ccgatcacct ctgtgtcaaa caccatttac agcttagtga 9000
tatatgcaca gcacatggta ctcagttact tcaaaagtgg tcaccctcat ggccttttgt 9060
ttctgcaaga ccagctaaag tttgaggaca tgctcaaggt tcaacccctg atcgtctatt 9120
cggacgacct tgtgctgtat gccgagtctc cctccatgcc aaactaccac tggtgggttg 9180
aacatctgaa tcttatgctg ggtttccaga cggacccaaa gaagacaacc atcacagatt 9240
caccatcatt cctaggttgc aggataataa atgggcgcca gctggtcccc aaccgtgaca 9300
ggatcctcgc ggccctcgcc taccacatga aggcaagtaa tgtttctgaa tactacgcct 9360
cggcggctgc aatactcatg gacagctgtg cttgtttaga gtatgatcct gaatggtttg 9420
aagagctcgt ggttgggatg gcgcagtgcg cccgcaagga cggctacagc tttcctggcc 9480
caccgttctt cttgtccatg tgggagaaac tcaggtccaa tcatgagggg aagaagtcca 9540
gaatgtgcgg gtactgcggg gccccggctc cgtacgccac tgcctgtggt ctcgatgtct 9600
gtgtttacca cacccacttc caccagcatt gtcctgttat aatctggtgt ggccacccgg 9660
cgggttctgg ttcttgtagt gagtgcgaac cccccctagg aaaaggcaca agccctctag 9720
atgaggtgtt agaacacgtt ccgtacaagc ctccgcggac tgtgatcatg catgtggagc 9780
agggtctcac ccctcttgac ccaggtagat accagactcg ccgcggatta gtctccgtta 9840
ggcgtggcat caggggaaat gaagtcgacc taccagacgg tgattacgct agcaccgcct 9900
tgctccctac ttgtaaagag atcaacatgg tcgctgtcgc ctctaacgtg ttgcgcagca 9960
ggtttatcat cggcccaccc ggtgctggga aaacacactg gcttcttcaa caagtccagg 10020
atggtgatgt catttacacg ccaactcacc agaccatgct cgacatgatt agggctttgg 10080
ggacgtgccg gttcaacgtt ccagcaggta caacgctgca attccctgcc ccctcccgta 10140
ccggcccatg ggttcgcatc ttggccggcg gttggtgtcc tggcaagaac tccttcctgg 10200
atgaagcggc gtattgcaat caccttgatg tcttgaggct tctcagcaaa acaactctta 10260
cttgcctagg ggacttcaaa caactccacc ctgtgggttt tgactcccat tgctatgtat 10320
ttgacatcat gcctcagacc caattagaga ccatctggag gttcgggcag aatatctgtg 10380
atgccattca accagattac agggacaaac ttatgtccat ggtcaacacg acccgtgtga 10440
cctacgtgga aaaacctgtc aggtatgggc aagtcctcac cccctaccac agggaccggg 10500
aggacggcgc cattactatc gactccagtc aaggcgccac atttgatgtg gttacactgc 10560
atttgcccac taaagattca ctcaacaggc aaagagctct tgttgctatc accagggcaa 10620
gacatgctat cttcgtgtat gacccacaca ggcaattgca gagcttgttt gatcttcccg 10680
cgaaaggcac acccgtcaac ctcgcagtgc accgtgacga acagctgatc gtattagaca 10740
gaaacaacag agaaatcacg gttgctcagg ctctaggcaa tggagataaa ttcagggcca 10800
cagataagcg cgttgtagat tctctccgcg ctatttgcgc agatctggaa gggtcgagct 10860
ccccgctccc caaggtcgcg cataacttgg gattctattt ctcacctgat ttgactcagt 10920
ttgctaaact cccggcagaa cttgcacccc actggcccgt ggtgacaacc cagaacaatg 10980
aaaggtggcc agatcggctg gtagccagcc ttcgccctat ccataaatat agccgcgcgt 11040
gcattggtgc cggctatatg gtgggcccct cggtgttttt aggcatccct ggggttgtgt 11100
catactatct cacaaagttt gttagaggcg aggctcaagt gcttccggag acagttttca 11160
gcaccggccg aattgaggta gattgtcgag agtatcttga tgatcgggag cgagaagttg 11220
ctgagtccct cccacatgcc ttcatcggcg atgtcaaagg taccaccgtt gggggatgtc 11280
atcacgttac ctccaaatac cttccacgct tccttcccaa ggaatcagtt gcggtggtcg 11340
gggtttcgag ccccgggaaa gccgcgaaag cagtttgcac attgacggat gtgtacctcc 11400
cagaccttga agcgtacctc cacccagaga cccagtccag gtgctggaaa gtgatgttgg 11460
actttaagga ggttcgactg atggtatgga aagacaagac ggcctatttt caacttgaag 11520
gccgccattt tacctggtat caacttgcaa gctacgcctc atacatccga gttcctgtta 11580
attctactgt gtacttggac ccctgcatgg gccctgctct ttgcaacaga agggttgtcg 11640
ggtccaccca ttggggagct gacctcgcag tcacccctta tgattacggt gccaaaatta 11700
ttctgtctag tgcataccat ggtgaaatgc ctccaggtta caaaattctg gcgtgcgcgg 11760
agttctcgct tgatgatcca gtaaggtaca aacacacctg gggatttgaa tcggatacag 11820
cgtatctgta cgagtttact ggaaatggtg aggactggga ggattacaat gatgcgtttc 11880
gggcgcgcca gaaagggaaa atttataaag ctaatgccac cagcatgagg tttcattttc 11940
ccccgggccc tgtcattgaa ccaactttag gcctgaattg aaatgaaatg gggtctatgc 12000
aaagcctctt taacaaaatt ggccaacttt ttgtggatgc tttcacggaa tttctggtgt 12060
ccattgttga tatcatcata tttttggcca ttttgtttgg cttcacaatc gccggttggc 12120
tggtggtctt atgcatcaga ctggtttgct ccgcggtact ccgtgcgcgg tctaccgttc 12180
accctgagca attacagaag atcttatgag gcctttcttt ctcagtgtca ggtggacatt 12240
cccacctggg gcgtcaaaca ccctttgggg atactttggc accatagggt gtcaaccctg 12300
attgatgaaa tggtgtcgcg tcgaatgtac cgcatcatgg aaaaagcagg tcaggctgcc 12360
tggaaacagg tggtgagcga ggctacattg tctcgcatta gtggtttgga tgtggtggct 12420
cactttcaac atcttgccgc tattgaagcc gagacttgta aatatttggc ttctcggcta 12480
cccatgctgc acaacctgcg cttgacaggg tcaaatgtaa ccatagtgta taatagtact 12540
ttggatcagg tgtttgccat tttcccaacc cctggttccc ggccaaagct tcatgatttt 12600
cagcaatggc taatagctgt ccattcctcc atattttcct ccgttgcagc ttcttgtact 12660
ctttttgttg tgctgtggtt gcgaattcca atgctacgtt ctgtttttgg tttccgctgg 12720
ttaggggcaa tttttctttt gaactcatgg tgaattacac ggtatgcccg ctttgcccaa 12780
cccggcaggc agccgctgag atccttgaac ccagcaagtc tttttggtgc aggatagggc 12840
atgaccggtg tagtgagaac gatcatgacg aactagggtt catggttccg cctggcctct 12900
ccagcgaagg ccacttgacc agtgtctatg cctggttggc gttcctgtcc ttcagctaca 12960
cggcccagtt ccatcccgag atatttggga tagggaatgt gagtcgaatt tatgttgaca 13020
tcaagcacca attcatctgc gctgttcacg acggggataa cgccaccttg cctcgccatg 13080
acaatatttc agccgtattt cagacctact accaacacca ggtcgacggc ggcaattggt 13140
ttcacctgga atggctgcgc cctttctttt cctcttggtt ggttttaaat gtttcgtggt 13200
ttctcaggcg ttcgcctgca agccatgttt cagttcgagt ctttcggaca tcaaaaccaa 13260
caccaccgca gcatcaaact tcgttgtcct ccaggacatc agctgcctta ggcatggcga 13320
ctcgtcctct ccgacgattc gcaaaagtcc tcagtgccgc acggcgatag ggacgcccgt 13380
gtacatcacc atcactgcca atgtcacaga tgaaaattat ctacattctt ctgatctcct 13440
catgctttct tcttgccttt tctatgcttc cgagatgagt gaaaagggat tcaaagtggt 13500
gtttggcaat gtgtcaggca tcgtggctgt gtgcgtcaac tttaccagct acgtccaaca 13560
cgtcaaggag tttacccaac gctccttagt ggtcgatcat gtgcgactgc ttcatttcat 13620
gacacctgta accatgaggt gggcaaccgt attagcctgt ctttttgcca tcctactggc 13680
aatttgaatg ttcaagtatg ttggggaagt gcttgaccgc gtgctgttgc tcgcgattgc 13740
tttttttgtg gtgtatcgtg ccgtcttatc ttgctgtgct cgtcaacgcc agcaacaaca 13800
acagctctca tattcagttg atttataact taacgctatg tgagctgaat ggcacagatt 13860
ggctggcaca aaaatttgac tgggcagtgg agacttttgt catcttcccc gtgttgactc 13920
acattgtttc ctatggggca ctcaccacca gccatttcct tgacacagtt ggtctggtca 13980
ctgtgtccac cgccggatat tatcacgggc ggtatgtctt gagtagcatt tacgcagtct 14040
gtgctctggc tgcgctgatt tgctttgtca ttaggcttgc gaagaactgc atgtcctggc 14100
gctactcttg taccagatat accaacttcc ttctggacac taagggcaga ctctatcgtt 14160
ggcggtcgcc cgtcattgtg gagaaagggg gtaaggttga ggtcgaaggt cacctgatcg 14220
acctcaagag agttgtgctt gatggttccg cggcaacccc tttaaccaga gtttcagcgg 14280
aacaatgggg tcgtctctag acgacttctg caatgatagc acagctccac agaaggtgct 14340
tttggcgttt tccattacct acacgccagt gatgatatat gctctaaagg taagtcgcgg 14400
ccgactgcta gggcttctgc accttttgat cttcctgaat tgtgctttta ccttcgggta 14460
catgacattc gtgcactttg agagcacaaa tagggtcgcg ctcactatgg gagcagtagt 14520
tgcacttctt tggggagtgt actcagccat agaaacctgg aaattcatca cctccagatg 14580
ccgtttgtgc ttgctaggcc gcaagtacat tctggcccct gcccaccacg tcgaaagtgc 14640
cgcgggcttt catccgattg cggcaaatga taaccacgca tttgtcgtcc ggcgtcccgg 14700
ctccactacg gtcaacggca cattggtgcc cgggttgaaa agcctcgtgt tgggtggcag 14760
aaaagctgtt aagcagggag tggtaaacct tgttaaatat gccaaataac aacggcaagc 14820
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agatcatcgc ccaacaaaac cagtccagag gcaagggacc ggggaagaaa aataggaaga 14940
aaaacccgga gaagccccat ttccctctag cgactgaaga tgacgtcagg catcacttta 15000
cccctagtga gcggcaattg tgtctgtcgt cgatccagac tgccttcaat cagggcgctg 15060
gaacttgtgc cctgtcagat tcagggagga taagttacac tgtggagttt agtttgccga 15120
cgcaacatac tgtgcgtctg atccgcgcca cagcatcacc ctcagcatga gttccgcggc 15180
aaccccttta accagagttt cagcggaaca atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc 15240
tgcatcgctg tggccgaggc caagcccacc gagaacaacg aagacttcaa catcgtggcc 15300
gtggccagca acttcgcgac cacggatctc gatgctgacc gcgggaagtt gcccggcaag 15360
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aggggctgtc tgatctgcct gtcccacatc aagtgcacgc ccaagatgaa gaagttcatc 15480
ccaggacgct gccacaccta cgaaggcgac aaagagtccg cacagggcgg cataggcgag 15540
gcgatcgtcg acattcctga gattcctggg ttcaaggact tggagcccat ggagcagttc 15600
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ctttggcacc gcagtgttag aattgggaga atgtgtggtg aatggcactg attgacactg 15840
tgcctctaag tcacctattc aattagggcg accgtgtggg ggtaaagttt aattggcgag 15900
aaccatgcgg ccgtaattaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 15940

Claims (1)

1.表达分泌型荧光素酶的猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性cDNA克隆在抗病毒药物筛选中的应用，所述表达分泌型荧光素酶的猪繁殖与呼吸综合征病毒cDNA克隆的构建方法如下：
(1)将SEQ ID NO:1所示序列克隆至pACYC177质粒中的AscI和BglI位点之间，得到重组质粒pCMV-TA-vector；
(2)以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TA-12株的RNA的反转录产物cDNA为模板，分别用F1-F/F1-R、F2-F/F2-R、F3-F/F3-R和F4-F/F4-R进行扩增，扩增得到F1、F2、F3、F4四个片段；
(3)将步骤(2)得到的F1、F2、F3、F4 4个片段克隆至重组质粒pCMV-TA-vector中，得到重组质粒pCMV-TA-12；
(4)以pCMV-TA-12质粒为模板，用引物对TA-12-EcoRV-F/TA-12-dBsrGI-R和TA-12-dBsrGI-F/TA-12-BsrGI-R分两段扩增，得到F5、F6两个片段，利用体外同源重组，将回收纯化后的F5、F6替换pCMV-TA-12中的相对应区域，得到含有遗传标记的感染性克隆质粒pCMV-TA-12M；
(5)以pCMV-Gluc质粒为模板，用引物TA-12-TRS6/Gluc-F和TA-12-Gluc/UTR-R扩增Gluc基因序列；
以pCMV-TA-12质粒为模板，用引物对TA-12-BsrGI-F/TA-12-N/TRS6-R和TA-12-Gluc/UTR-F/TA-12-NotI-R分别扩增A和B片段，回收纯化后Gluc基因序列、A和B片段，利用体外同源重组将Gluc基因序列、A和B片段替换pCMV-TA-12M中BsrGI和NotI位点之间的病毒序列，得到感染性克隆质粒pCMV-TA-Gluc，即表达分泌型荧光素酶的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的cDNA克隆；
步骤(2)中，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TA-12株的RNA的反转录产物cDNA的序列如SEQ ID NO：2所示；
步骤(3)中，所述重组质粒pCMV-TA-12的构建方法如下：
将回收纯化后的F1和F2片段插入至pCMV-TA-vector中的MluI和AflII位点之间，得到重组质粒pCMV-TA-F1～F2；
将回收纯化后的F3和F4片段插入至pCMV-TA-F1～F2中的AflII和EcoRI位点之间，得到感染性cDNA克隆质粒pCMV-TA-12；
上述引物序列见下表：
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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆的构建及其在病毒可视化示踪上的研究和应用;黄柏成;《中国博士学位论文全文数据库》;第28-30页"3.1.4 PRRSV SD16 株 cDNA 感染性克隆的构建"，第39-41页"4.1.4 引入荧光蛋白的 BAC-PRRSV 质粒构建"，第46-47页"4.2.2 病毒的拯救"，第47-48页"4.2.3 拯救病毒的鉴定"，第49-50页"4.2.4 拯救病毒的生物学特性分析"，第41页"4.1.5 病毒的拯救"，第30-31页"3.1.5 病毒的拯救"，第52-53页"4.2.5.2 使用 rSD16/TRS6/EGFP 进行抗病毒药物的验证" *

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