CN115433741A - 盖他病毒为载体表达报告蛋白的重组病毒的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了盖他病毒用作外源基因的表达载体。据此，基于GETV反向遗传操作平台，还建立了相应构建方法。根据盖他病毒的基因组序列及外源报告蛋白的基因序列，设计相应系列引物，利用基因工程方法，分别在病毒Cap蛋白与E3蛋白之间、E1蛋白的3'端，构建表达报告蛋白的重组质粒，并拯救出表达报告蛋白的重组病毒；或者同时在病毒的Cap蛋白与E3蛋白之间、E1蛋白的3'端分别插入不同的报告蛋白基因，构建同时表达两种不同报告蛋白的重组质粒，并拯救出表达两种不同报告蛋白重组病毒。对重组病毒进行一系列病毒特性分析及遗传稳定性检测，并与亲本病毒进行比较分析表明，本发明所得重组病毒可表达报告蛋白且稳定高效，为深入研究盖他病毒提供了技术支持。

Description

盖他病毒为载体表达报告蛋白的重组病毒的构建方法
技术领域
本发明属于重组病毒技术领域，尤其涉及一种盖他病毒为载体表达报告蛋白的重组病毒的构建方法。
背景技术
盖他病毒(Getah virus,GETV)最早于1955年从马来西亚雪背库蚊(Culexgelidus)中分离到。血清学检测结果显示，欧洲、亚洲和大洋洲的猪、马、牛及袋鼠等多种动物体内检测到GETV抗体。在中国，自从海南省首次从蚊虫中鉴定出GETV以来，该病毒已广泛分布于中国西南部到华北地区的多个省份。由于GETV地域分布广泛且可感染多个宿主，或可成为危害我国畜牧业的潜在威胁。目前，商品化的疫苗尚未在我国批量生产及使用。国外也仅有日本报道用于马匹的盖他病毒灭活苗和盖他病毒-乙型脑炎二联灭活疫苗，用于猪的盖他病毒弱毒活疫苗和盖他病毒-乙型脑炎-细小病毒三联弱毒活疫苗，疫苗的保护效率也因为毒株的不同而有所限制。
GETV是一种单股正链RNA病毒，属于披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Alphavirus)成员。病毒基因组的长度在11000-12000核苷酸之间，具有5’帽子结构和3'Poly(A)尾，5’端非编码区和3'端非编码区分别为约为78个nt和411个nt,非编码区之间包含2个独立的开放阅读框，分别编码病毒的结构蛋白和非结构蛋白。非结构蛋白和结构蛋白编码区之间有44个nt组成的连接区，连接区可形成亚基因组启动子。甲病毒在感染细胞过程中，5’末端2/3的基因组RNA首先翻译，产生RNA复制和转录所需要的4种非结构蛋白(nsp1-4)，然后在nsps和亚基因组启动子作用下转录出亚基因组mRNA，后者进一步翻译出结构蛋白多聚蛋白。结构蛋白多聚蛋白在病毒编码蛋白酶和宿主的蛋白酶的联合作用下裂解成5种结构蛋白：C、E3、E2、6K和E1蛋白，这些结构蛋白与病毒基因组mRNA装配成病毒粒子后以出芽方式释放到细胞外。
反向遗传操作系统是研究病毒的生物学特性、致病机理以及开发新型疫苗的有利工具。甲病毒载体具有许多优势，被认为是最成功、最具前景的RNA病毒载体之一。目前，国内外已经报道甲病毒感染性克隆有辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SIN)、西门利克森林病毒(Semliki Frost virus,SFV)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitisvirus,VEE)和基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)。用甲病毒表达外源基因的一种途径是将额外的亚基因启动子插入病毒基因组中，可以启始额外的亚基因组RNA的转录和翻译，从而开发出具有双亚基因组的表达载体。应用此种策略，邓玲玲以辛徳毕斯病毒为载体，在病毒结构蛋白与非结构蛋白之间插入绿色荧光蛋白基因，成功拯救出表达绿色荧光的重组病毒；Ian J Caley等以委内瑞拉马脑炎病毒为载体，分别在病毒结构蛋白与非结构蛋白之间，非结构蛋白与3'UTR之间成功表达HIV-1的基质/衣壳(MA/CA)蛋白；Tsetsarkin等以基孔肯雅病毒为载体，分别在病毒结构蛋白与非结构蛋白之间，非结构蛋白与3'UTR之间表达绿色荧光蛋白；Thomas J M等以辛徳比斯病毒为载体，成功在非结构蛋白与3'UTR之间表达绿色荧光蛋白与蓝舌病毒(Bluetongue virus)的VP7蛋白。但是，使用双亚基因组表达的外源蛋白时，外源基因并不能稳定存在于病毒基因组中，随着病毒传代而逐渐丢失。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种盖他病毒为载体表达报告蛋白的重组病毒的构建方法，所得重组病毒可表达报告蛋白且稳定高效，为深入研究盖他病毒提供了技术支持。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
盖他病毒用作外源基因的表达载体。
上述盖他病毒用作外源基因的表达载体，盖他病毒为猪盖他病毒GETV-GX201808，保藏编号为CCTCC NO：V 202069。
上述表达载体，为GETV-GX201808的全长感染性克隆pGETV-GX。
一种盖他病毒为载体表达报告蛋白的重组病毒的构建方法，根据盖他病毒的基因组序列及外源报告蛋白的基因序列，设计相应系列引物，利用基因工程方法，分别在病毒Cap蛋白与E3蛋白之间、E1蛋白的3'端，构建表达报告蛋白的重组质粒，并拯救出表达报告蛋白的重组病毒；或者同时在病毒的Cap蛋白与E3蛋白之间、E1蛋白的3'端分别插入不同的报告蛋白基因，构建同时表达两种不同报告蛋白的重组质粒，并拯救出表达两种不同报告蛋白的重组病毒。
上述构建方法，
<1>在病毒Cap蛋白与E3蛋白之间插入报告基因RFP构建重组质粒pGECRFP；
<2>在病毒E1蛋白的3'端插入报告基因GFP构建重组质粒pGEEGFP；
<3>同时在病毒的Cap蛋白与E3蛋白之间、E1蛋白的3'端分别插入报告基因RFP与GFP构建重组质粒pGECRFPEGFP；
<4>表达报告基因的重组质粒的拯救。
<1>中，通过SOE-PCR的方法，将外源蛋白的基因序列插入Cap蛋白和E3蛋白之间，同时在外源基因的3'端融合插入明脉扁刺蛾病毒(Thosea asigna virus,TaV)的T2A水解酶序列，从而使成熟的外源蛋白能够水解出来，构建出重组感染性克隆质粒pGECRFP。
<2>中，通过SOE-PCR的方法，将TaV的T2A水解酶序列插入E1蛋白的3'端，紧随其后插入外源蛋白的基因序列，构建出重组感染性克隆质粒pGEEGFP。
<3>中，使用SwaI和SrfI同酶切时pGECRFP与pGEEGFP，回收酶切产物后进行等位替换连接，构建出重组质粒pGECRFPEGFP。
<4>中，将<1>至<3>中的重组质粒转染BHK-21细胞后拯救得到重组病毒rGECRFP、rGEEGFP、rGECRFPEGFP。
上述构建方法及其所得重组病毒在研究病毒分子生物学特性、复制机制、致病机理、制备盖他病毒诊断试剂、盖他病毒基因工程疫苗中的应用。
在前期对猪盖他病毒GETV-GX201808研究的基础上，发明人根据甲病毒复制特点，深入研究了盖他病毒用作外源基因的表达载体。据此，基于GETV反向遗传操作平台，还建立了相应构建方法。根据盖他病毒的基因组序列及外源报告蛋白的基因序列，设计相应系列引物，利用基因工程方法，分别在病毒Cap蛋白与E3蛋白之间、E1蛋白的3'端，构建表达报告蛋白的重组质粒，并拯救出表达报告蛋白的重组病毒；或者同时在病毒的Cap蛋白与E3蛋白之间、E1蛋白的3'端分别插入不同的报告蛋白基因，构建同时表达两种不同报告蛋白的重组质粒，并拯救出表达两种不同报告蛋白的重组病毒。对重组病毒进行一系列病毒特性分析及遗传稳定性检测，并与亲本病毒进行比较分析表明，本发明通过将重组质粒转染BHK-21细胞，可以拯救出表达报告蛋白的重组病毒，并且重组病毒具有和亲本病毒rGETV-GX相似的生物学特性。在连续传代的过程中，可以观测到明显的荧光，未发现插入的报告蛋白的荧光丰富度降低，说明重组病毒可以稳定高效的表达外源蛋白。
综上，本发明建立了一套盖他活病毒载体系统，可单独或同时插入两种外源基因，且遗传相对稳定，表达报告蛋白的重组病毒有望今后作为一种标记病毒，用于盖他病毒的分子生物学特性、复制机制以及致病机理的研究、盖他病毒抗病毒药物筛选、制备盖他病毒诊断试剂或盖他病毒基因工程疫苗方面的制备。
附图说明
图1是GETV基因组结构示意图，图中：A：Cap蛋白与E3蛋白之间插入报告蛋白基因示意图；B：E1蛋白的3'端插入报告蛋白基因示意图；C：同时在病毒的Cap蛋白与E3蛋白之间、E1蛋白的3'端插入报告蛋白基因示意图。
图2是重组病毒第3代感染BHK-21细胞的病变图(20X)。
图3是病毒感染BHK-21细胞IFA图(20X)，图中：同一行中，每3张图片从左至右分别为使用GETV E2蛋白多克隆抗体的荧光图，DAPI细胞核染图，Merge图。
图4是表达单个报告蛋白的重组病毒在BHK-21细胞上的不同时间点的荧光观察图(20X)。
图5是不同代次表达单个报告蛋白的重组病毒在BHK-21细胞上的荧光观察图(20X)。
图6是不同代次表达双荧光报告蛋白的重组病毒在BHK-21细胞上的荧光观察图(20X)。
图7是表达外源报告蛋白的重组病毒遗传稳定性分析图，图中：左为rGECRFP遗传稳定性分析图，其中M为DNA Marker 2000，P1-P10为rGECRFP P1-P10代病毒，pGECRFP为Cap蛋白与E3蛋白之间插入RFP全长质粒，rGETV-GX为亲本毒株；右为rGECGFP遗传稳定性分析图，其中M为DNA Marker 2000，P1、P3、P6、P10为rGECRFP P1、P3、P6、P10代病毒，pGEEGFP为E1蛋白3’端之间插入GFP全长质粒，rGETV-GX为亲本毒株。
图8是表达报告蛋白的重组病毒在BHK-21细胞上的多步生长曲线图。
保藏信息说明
猪盖他病毒GETV-GX201808，保藏编号为CCTCC NO：V 202069，保藏日期：2020年10月13日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。
具体实施方式
以下通过实施例具体说明本发明如何实施，其中未注明具体条件的实验方法，按照常规操作和条件进行，如《分子克隆:实验室手册》(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)。
1材料与方法
1.1细胞、质粒、菌株及参考序列
BHK-21细胞、pGETV-GX、含GFP和RFP基因的载体pGX-RFP-GFP由申请人实验室保存，感受态细胞菌DH5α购自康为试剂公司。其中，
pGETV-GX与中国专利申请“盖他病毒全长感染性克隆、复制子系统及其制备和应用”(专利申请号202011308509.4，公开日20210309)一致。
pGX-RFP-GFP与中国专利申请“猪繁殖与呼吸综合征病毒双荧光标记基因重组毒株的构建方法”(专利申请号202110165215.9，公开日2021.08.06)一致。
1.2主要仪器和试剂
RNA酶抑制剂(RRI,ThermoFisher)、dNTP Mixture、Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)、DNA Marker(TaKaRa)、Green Taq Mix(Vazyme)、限制性内切酶(NEB)、T4DNA Ligase(NEB)、Plasmid Mini Kit、Gel Extraction Kit、Viral RNA Kit、Total RNAKit(OMEGA)、Lipofectamine 2000(Invitrogen)、CO2恒温培养箱(Thermo Fisher)、倒置显微镜(Olympus CKX41)、核酸电泳仪(北京君意东方电泳设备)。
1.3引物设计
根据GETV-GX201808毒株全基因组序列及外源报告蛋白基因设计相关引物(如表1)，由擎科生物有限公司合成。
表1表达报告蛋白的重组盖他所需引物
Figure BDA0003710035980000051
Figure BDA0003710035980000061
1.4在病毒Cap蛋白与E3蛋白之间表达报告基因RFP的重组质粒pGECRFP的构建
以pGETV-GX为模板，使用A引物(SEQ.ID.No.1-2)与B引物(SEQ.ID.No.3-4)，扩增出片段A与B，以pGX-RFP-GFP为模板，使用C引物(SEQ.ID.No.5-6)，扩增出C片段，以片段B与C为模板，使用引物Cap-RFP-2F与GETV-SrfI-R经SOE-PCR，扩增出片段BC；以片段A与BC为模板，经SOE-PCR，使用引物GETV-SwaI-F与GETV-SrfI-R扩增出目的片段ABC(SEQ.ID.No.17)；将片段ABC与载体pGETV-GX经SwaI和SrfI双酶切后，利用T4 DNA连接酶连接，构建重组质粒pGECRFP。
1.5在病毒E1蛋白的3'端表达报告基因GFP的重组质粒pGEEGFP的构建
以pGETV-GX为模板，使用D引物(SEQ.ID.No.7-8)、E引物(SEQ.ID.No.9-10)，分别扩增出片段D、E，以pGX-RFP-GFP为模板，使用F引物(SEQ.ID.No.11-12)扩增出F片段，以片段D与F为模板，用引物TY-BstBI-F与GFP-3UTR-2R通过SOE-PCR，扩增的到DF片段，以片段DF与E为模板，使用引物TY-BstBI-F与TY-MluI-R经SOE-PCR，扩增得到片段DEF(SEQ.ID.No.18)，将DEF片段与pGETV-GX同时使用BstBI与MluI酶切，将DEF片段替换插入pGETV-GX得到重组质粒pGEEGFP。
1.6同时在病毒的Cap蛋白与E3蛋白之间、E1蛋白的3'端分别表达报告基因RFP与GFP重组质粒pGECRFPEGFP的构建。
使用SwaI和SrfI同酶切时pGECRFP与pGEEGFP，回收酶切产物后进行等位替换连接，获得pGECRFPEGFP。
1.7表达报告基因的重组质粒的拯救
选择6孔板内生长良好的、密度约为70％左右的BHK-21细胞，按照lipofectamine2000说明书，将构建好的质粒转染到BHK-21细胞，转染剂量为2μg，转染前，将6孔板中更换300μL无血清的opti-MEM培养液，将转染后的细胞板放置于含有5％CO2的37℃恒温培养箱中培养，6h后更换2mL含有2％FBS的DMEM(2％DMEM)维持液，转染48h后收取细胞上清，离心后于-80℃保存。将拯救病毒分别命名为rGECRFP、rGEEGFP、与rGECRFPEGFP。
1.8病毒的传代
将转染后的48h收集的细胞上清视为P0代病毒，将300μL P0代病毒重新接种到生长良好的6孔板内BHK-21细胞上，孵育1h后，弃去细胞板内的液体，细胞经PBS洗两次，加入2mL 2％DMEM，放置于含有5％CO2的37℃培养箱中培养，每12h观察细胞病变。当细胞脱落60％时收细胞取上清，记为P1代病毒，离心后于-80℃保存。将P1代病毒稀释1000倍后，用同样的方法将300μL稀释后的病毒液接种于新的BHK-21细胞，当细胞出现明显CPE，收集细胞上清，记为P2代病毒，以此类推连续传代。将重组病毒传代10次，获得P1至P10代病毒液，传代期间观察细胞内荧光，若第一代无明显CPE出现，盲传3代后观察。按照Viral RNA Kit说明书中的操作方法分别提取各代次病毒RNA，采用RT-PCR检测外源报告蛋白在重组病毒内的遗传稳定性，分别使用G引物(SEQ.ID.No.13-14)，H引物(SEQ.ID.No.15-16)，以亲本毒株cDNA为模板扩增G与H作为对照。
1.9间接免疫荧光试验(IFA)鉴定重组病毒
将病毒用2％DMEM培养基进行1000倍稀释，取100μL稀释后的病毒接种于铺满12孔板上的单层BHK-21细胞，同时设置未接毒细胞作为阴性对照。接毒18-24h后，冰甲醇固定细胞15min。固定结束后，每孔加入300μL的5％BSA溶液，室温封闭置30min。孵育一抗：将抗GETV E2蛋白的兔多克隆抗体按1:1000的比例进行稀释，37℃孵育2h；孵育二抗：在暗室条件下将FITC标记的山羊抗兔IgG(H+L)按照1:500的比例进行稀释，37℃孵育1h。DAPI染色：二抗孵育结束，将DAPI用PBS溶液按照相关使用说明进行稀释，染色15min后，利用倒置荧光显微镜在避光条件下进行观察、拍照。
1.10病毒细胞(半数感染量)TCID50测定
取P3代病毒，用2％DMEM作10倍系列稀释后，将10-1-10-9连续稀释的病毒接种96孔细胞培养板上单层培养的BHK-21细胞，每稀释度接种8孔，每孔0.1mL，设阴性对照(即用维持液代替病毒液)，置含有5％CO2的37℃培养箱中培养，2-4天后观察感染细胞，记录出现细胞病变的孔数，并按Reed-Muench法计算TCID50。
1.11病毒多步生长曲线测定
以低剂量(0.01MOI)病毒感染BHK-21细胞，分别在感染后的6h、12h、18h、24h、36h、48h、60h收取细胞培养上清，测定每个时间点病毒的TCID50，并根据不同时间点病毒的滴度，绘制病毒多步生长曲线。
2结果
2.1重组病毒的拯救
将拯救的表达报告蛋白的重组病毒接种在BKH-21细胞上，可以观察到明显的细胞病变(图2)，且可以稳定传代，表明病毒拯救成功。
2.2间接免疫荧光试验(IFA)鉴定重组病毒
取P3代病毒液接种到BHK-21细胞上，同时设置阴性对照，分别对其进行间接免疫荧光染色，检测病毒蛋白的表达。结果表明，将表达单个不同报告蛋白的重组病毒接种在BHK-21细胞上，使用合适的二抗孵育，分别有绿色与红色荧光产生，而作为空白对照的正常BHK-21细胞，无特异荧光产生(图3)。表明重组病毒感染的BHK-21细胞，有GETV蛋白的表达，同时也表明拯救出了具有感染性的重组GETV。
2.3细胞内荧光观察
在荧光显微镜下观察被表达单个报告蛋白的重组病毒感染的细胞，随着被感染的时间的增加，可以观察到细胞内荧光表达的强度也逐渐增强(图4)，表明报告蛋白随着病毒的复制而不断表达从而积累。
在病毒的传代期间，观察不同代次重组病毒感染细胞后细胞内的荧光，可以观察到，在病毒的Cap蛋白与E3蛋白之间、E1蛋白的3'端表达的蛋白荧光强度并没有随着病毒传代而减弱，表明外源蛋白可以持续表达(图5-6)。
2.4拯救病毒的生长曲线
为了进一步了解重组病毒的生长特性，将P3代病毒亲本毒株(rGETV-GX)和表达报告蛋白的重组病毒，按照MOI＝0.01接种到BHK-21细胞上，作病毒多步生长曲线分析(图8)。结果表明，表达1个或者2个报告蛋白的重组病毒具有和亲本毒株(rGETV-GX)相似的复制能力和增殖特性，当达到最高病毒滴度时后，重组病毒的病毒滴度低于亲本病毒。
2.5报告蛋白基因在病毒基因组遗传稳定性分析
采用RT-PCR分析外源蛋白基因在病毒基因组中的稳定性，结果表明(图7)，在Cap蛋白与E3蛋白之间表达外源蛋白时，RFP在第一代就有所缺失，但是将病毒连续传代10次，依然有可观的基因保留；在E1蛋白的3'端表达报告蛋白时，GFP可以稳定存在到P10代。
序列表
<110> 广西大学
<120> 盖他病毒为载体表达报告蛋白的重组病毒的构建方法
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctacctacc ggtacaagat ttaaattcgg 30
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccattcttct gttccttc 18
<210> 3
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg cccttccgcc gccttgatga tg 52
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcgagcaga tcgtagtagc ccgggcggtc 30
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggaacag aagaatggat ggtgagcaag ggcgag 36
<210> 6
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgtcaccgc atgttagaag acttcctctg ccctcgtttc cggacttgta cag 53
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgctgtccat tctcattcga atgtagccac catacaggag gc 42
<210> 8
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agggccggga ttctcctcca cgtcaccgca tgttagaaga cttcctctgc cctcgcggcg 60
catagtcaca ca 72
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccgggaggct tgacataa 18
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgccatgcc gacccacgcg tttttttttt ttttttgt 38
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaggagaatc ccggccctat gcccgccatg aagatc 36
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttatgtcaag cctcccggtt aggcgaatgc gatcgg 36
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtggcaggtt cacaatcc 18
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctcgagcaga tcgtagtagc ccgggcggtc 30
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgctgtccat tctcattcga atgtagccac catacaggag gc 42
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtaaaatatt aaaaaaacaa attagacgcc 30
<210> 17
<211> 2364
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tctacctacc ggtacaagat ttaaattcgg tgctatgatg aagtcaggaa tgtttcttac 60
actcttcatc aacacgctgc tgaacattgt catagcatgc cgcgtcttac gcgacaaatt 120
atcgtcatcg gcgtgcgccg ccttcatagg cgatgacaac atagtgcacg gcgtgaggtc 180
agacccgcta atggcagaaa ggtgtgcgag ttgggtcaac atggaagtga agatcatcga 240
tgccacaatg tgtgagaaac caccatactt ttgtggtgga ttcatcctgt acgacagcgt 300
cgccggtaca gcgtgtaggg ttgcagatcc actaaagagg ctgttcaaac tcgggaaacc 360
gctcccggcg gacgacaacc aggacgaaga cagaagaagg gcactaaagg atgaaacagt 420
taagtggtcc cgcataggat tgagagagga attagacgtg gcactgagct caagatacca 480
agtcagtggc gtcgggaaca tcactagagc gatgtccacg ctgtctaaga atttgaagtc 540
ttttaggaaa ataagaggtc ccatcgtaca tctgtacggc ggtcctaaat agatgcagga 600
ttacactaca tctaaagacc acgtattaca gacatcatga attacatccc aactcaaacc 660
ttttacggac gccgttggcg accacgcccg gcgtaccgtc catggcgggt gccgatgcag 720
ccggccccac ccatggtgat tcctgagctg caaactccga tcgtccaggc ccaacagatg 780
cagcagctaa tcagtgcagt ttctgccctg acgaccaagc aaaatggcaa agcaccgaag 840
aagccaaaga agaagccaca aaaagcgaag gctaagaaaa acgaacagca aaagaaaaac 900
gagaacaaga aaccaccacc taagcagaag aatccggcta agaagaagaa accaggaaaa 960
agggaacgca tgtgcatgaa gatagagaat gattgcatct tcgaggtcaa gcttgacggt 1020
aaggtaacgg gctacgcctg cctagtcggg gataaagtga tgaagccggc acacgttaaa 1080
ggtgtgatcg acaaccccga cctagcgaag cttacctaca agaaatcgag caagtatgac 1140
ctagagtgcg cccagatacc ggtgcacatg aagtcagatg cttcaaagta cacccatgaa 1200
aaaccagaag ggcactacaa ttggcatcac ggtgcagtgc agtacagcgg tggcaggttc 1260
acaatcccga caggcgcagg taaaccagga gacagcggcc ggccgatctt cgacaacaaa 1320
ggacgtgtgg tggccattgt cctgggaggg gccaacgaag gagccaggac tgccctatct 1380
gtcgtgacct ggaccaaaga catggtcaca cggtacaccc cagaaggaac agaagaatgg 1440
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 1500
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 1560
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 1620
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 1680
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 1740
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 1800
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 1860
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 1920
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 1980
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 2040
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 2100
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagtc cggaaacgag 2160
ggcagaggaa gtcttctaac atgcggtgac gtggaggaga atcccggccc ttccgccgcc 2220
ttgatgatgt gcgtcttagc caacgttaca ttcccatgct cagagcccgc atgtgcaccc 2280
tgttgctatg aaaaacaacc agaacagaca ctgaggatgt tggaggacaa cgtggaccgc 2340
ccgggctact acgatctgct cgag 2364
<210> 18
<211> 1493
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgctgtccat tctcattcga atgtagccac catacaggag gcagctgtgg acatcaaaac 60
agatggcaag ataaccctgc atttctctac agcatctgca tccccggcat tcaaggtatc 120
tgtgtgcagt gccaaaacga catgcatggc agcgtgtgag ccgccgaagg atcacatcgt 180
cccttatggg gcgagccaca acaaccaagt ttttcctgac atgtctggca cggcaatgac 240
atgggtgcag cgggtagccg gcggactcgg cgggctaaca ctcgccgcag tggcagtact 300
tatactggtg acgtgtgtga ctatgcgccg cgagggcaga ggaagtcttc taacatgcgg 360
tgacgtggag gagaatcccg gccctatgcc cgccatgaag atcgagtgcc gcatcaccgg 420
caccctgaac ggcgtggagt tcgagctggt gggcggcgga gagggcaccc ccgagcaggg 480
ccgcatgacc aacaagatga agagcaccaa aggcgccctg accttcagcc cctacctgct 540
gagccacgtg atgggctacg gcttctacca cttcggcacc taccccagcg gctacgagaa 600
ccccttcctg cacgccatca acaacggcgg ctacaccaac acccgcatcg agaagtacga 660
ggacggcggc gtgctgcacg tgagcttcag ctaccgctac gaggccggcc gcgtgatcgg 720
cgacttcaag gtggtgggca ccggcttccc cgaggacagc gtgatcttca ccgacaagat 780
catccgcagc aacgccaccg tggagcacct gcaccccatg ggcgataacg tgctggtggg 840
cagcttcgcc cgcaccttca gcctgcgcga cggcggctac tacagcttcg tggtggacag 900
ccacatgcac ttcaagagcg ccatccaccc cagcatcctg cagaacgggg gccccatgtt 960
cgccttccgc cgcgtggagg agctgcacag caacaccgag ctgggcatcg tggagtacca 1020
gcacgccttc aagaccccga tcgcattcgc ctaaccggga ggcttgacat aatgtatata 1080
tataagcatc atagttttta gtaaagcata taaataatca agtagatcaa agggctacct 1140
aacccctgaa tagtaacaaa acgcaaaata caaaaacatt agttcaaagg gccagtaacc 1200
cctgaatagt aacaaaacat aaaaaccaaa aacagtagtt caaagggcta tacaacccct 1260
gaatagtaac aaaatacaga aaaaccataa aaattataaa aatcaactaa tcagatcatc 1320
taaatttgac caattggaaa tagccgaact ctacggagat gtaggcgtcc gaactccacg 1380
gagacgtagg acaaaattct gccgaacccc agaccatcgg ggacgtaggc gtctaatttg 1440
tttttttaat attttacaaa aaaaaaaaaa aaacgcgtgg gtcggcatgg cat 1493

Claims (10)

1.盖他病毒用作外源基因的表达载体。
2.权利要求1所述盖他病毒用作外源基因的表达载体，其特征在于：所述盖他病毒为猪盖他病毒GETV-GX201808，保藏编号为CCTCC NO：V 202069。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于为GETV-GX201808的全长感染性克隆pGETV-GX。
4.一种盖他病毒为载体表达报告蛋白的重组病毒的构建方法，其特征在于：根据盖他病毒的基因组序列及外源报告蛋白的基因序列，设计相应系列引物，利用基因工程方法，分别在病毒Cap蛋白与E3蛋白之间、E1蛋白的3'端，构建表达报告蛋白的重组质粒，并拯救出表达报告蛋白的重组病毒；或者同时在病毒的Cap蛋白与E3蛋白之间、E1蛋白的3'端分别插入不同的报告蛋白基因，构建同时表达两种不同报告蛋白的重组质粒，并拯救出表达两种不同报告蛋白的重组病毒。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：
<1>在病毒Cap蛋白与E3蛋白之间插入报告基因RFP构建重组质粒pGECRFP；
<2>在病毒E1蛋白的3'端插入报告基因GFP构建重组质粒pGEEGFP；
<3>同时在病毒的Cap蛋白与E3蛋白之间、E1蛋白的3'端分别插入报告基因RFP与GFP构建重组质粒pGECRFPEGFP；
<4>表达报告基因的重组质粒的拯救。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于所述<1>中，通过SOE-PCR的方法，将外源蛋白的基因序列插入Cap蛋白和E3蛋白之间，同时在外源基因的3'端融合插入明脉扁刺蛾病毒(Thosea asigna virus,TaV)的T2A水解酶序列，从而使成熟的外源蛋白能够水解出来，构建出重组感染性克隆质粒pGECRFP。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于所述<2>中，通过SOE-PCR的方法，将TaV的T2A水解酶序列插入E1蛋白的3'端，紧随其后插入外源蛋白的基因序列，构建出重组感染性克隆质粒pGEEGFP。
8.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于所述<3>中，使用SwaI和SrfI同酶切时pGECRFP与pGEEGFP，回收酶切产物后进行等位替换连接，构建出重组质粒pGECRFPEGFP。
9.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于所述<4>中，将<1>至<3>中的重组质粒转染BHK-21细胞后拯救得到重组病毒rGECRFP、rGEEGFP、rGECRFPEGFP。
10.权利要求3所述构建方法及其所得重组病毒在研究病毒分子生物学特性、复制机制、致病机理、制备盖他病毒诊断试剂、盖他病毒基因工程疫苗中的应用。
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