CN111235114B - 一种ev71复制缺陷型病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及重组病毒基因工程技术领域，具体涉及一种EV71复制缺陷型病毒及其制备方法和应用，在Vero细胞基因组上插入EV71的部分衣壳蛋白编码基因，在体外构建表达EV71非部分衣壳蛋白基因的真核表达载体，并使用该载体转染表达EV71部分衣壳蛋白的细胞系从而构建一种仅能在细胞系复制且包装成完整病毒粒子的EV71复制缺陷型病毒。本发明的EV71复制缺陷型病毒仅能在本发明构建的表达EV71部分衣壳蛋白基因的稳定表达Vero细胞系中复制且包装成完整病毒粒子，具有良好的安全性，可以作为预防EV71感染的疫苗候选株。

Description

一种EV71复制缺陷型病毒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及重组病毒基因工程技术领域，具体涉及一种EV71复制缺陷型病毒及其制备方法和应用。
背景技术
手足口病(HFMD)是儿童常见传染病，重症者可以引发神经系统损伤、甚至死亡。HFMD的致病原主要为小RNA病毒科肠道病毒属成员，以往认为柯萨奇病毒A组16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71)是导致HFMD的主要致病原，但近年来对其它型别的肠道病毒监测研究发现，柯萨奇病毒A组6型(CA6)已成为引起HFMD的优势毒株。我们前期对东莞地区的HFMD进行临床监测，发现CA6为主要致病原。疫苗的使用可以有效的防控病毒的传播，但由于引发HFMD的病原型别众多，目前临床使用的EV71灭活疫苗对其它型别肠道病毒引起的HFMD及相关疾病的保护作用有限，已证实不同肠道病毒血清型之间缺乏有效的交叉保护作用。因此，研制安全有效的HFMD多价疫苗具有重要意义。
通过对肠道病毒结构信息及生物学特性研究，研发能够同时预防多种肠道病毒感染的疫苗，已成为当前研究的重点。目前有关预防HFMD疫苗的研究主要有四种。第一种是全病毒灭活疫苗；第二种是体外重组表达或转基因载体在体内表达的病毒样颗粒(VLPs)疫苗；第三种是基于表位的疫苗；第四种是基于中和抗原VP1的疫苗。尽管这几种疫苗对预防肠道病毒感染具有一定作用，但都存在一定不足，如免疫原性不持久，需要多次免疫，VLPs疫苗的制备成本昂贵，一般表达系统无法对病毒蛋白进行糖基化修饰，单个表位刺激机体所产生的抗体效价低。有研究表明，EV71、CA16的嵌合VLPs疫苗可以保护机体免受EV71、CA16感染，但是由于其使用的真核表达系统制备VLPs，因此，疫苗的制备的成本较昂贵。如果在EV71感染性克隆的基础上，制备EV71-CA16嵌合活病毒疫苗，那么将大大降低疫苗生产成本。然而，由于EV71具有噬神经作用，目前缺乏能够应用于临床的EV71减毒疫苗，基于减毒疫苗的嵌合型多价疫苗则更无从谈起。鉴于肠道病毒衣壳蛋白可以嵌入外源氨基酸片段，且其免疫原性与所嵌入的抗原表位的数量以及构象等密切相关，因此近年来部分研究者聚焦于新型肠道病毒疫苗的研究并已取得积极进展。如：已发现CA16的中和抗原表位替换EV71VP1蛋白SP70表位，获得嵌合型病毒可以作为预防EV71和CA16的双价疫苗；我们构建了肠道病毒感染性克隆，为基于EV71载体制备嵌合活疫苗的研究奠定了基础。这些研究为制备新型HFMD多价疫苗提供了新思路。然而在保证效果良好的同时如何保证疫苗的安全性是当今疫苗研究面临的主要难题。
近年来基于甲病毒等正链RNA病毒的RNA复制子作为疫苗载体已有较多研究，这种RNA复制子载体具有无DNA整合、高表达效率等优点。RNA复制子载体包含病毒基因组5’和3’末端的非编码区、非结构蛋白基因编码区，其结构区被外源基因所取代，外源基因由病毒基因组启动子控制表达。表达外源抗原的RNA复制子可有3种形式：①质粒，由细胞RNA聚合酶体内转录成复制子RNA，该形式最简单，但需要脂质体等将质粒转入细胞；②裸RNA，将RNA复子载体进行体外转录得到复制子RNA后注射入体内，该形式最安全，但RNA易降解；③病毒颗粒，额外提供病毒结构蛋白，将复制子RNA包装入病毒样颗粒，病毒外壳蛋白将RNA保护起来且能将复制子RNA带入细胞，这不同于在非互补细胞中的基因组复制缺陷型病毒，这种带有病毒样颗粒的复制子RNA在非互补细胞中由于缺乏病毒的结构蛋白，其基因虽然可以复制，但不能包装产生感染性子代，是一种包装缺陷型病毒。肠道病毒为单股正链RNA病毒，删除其结构蛋白基因后不会影响基因组的复制和多聚蛋白的翻译；且病毒复制周期完全不涉及到DNA，因此不会整合到细胞基因组上，而且不携带质粒载体通常携带的抗生素基因，安全性更高。脊髓灰质炎病毒同属肠道病毒科，其基因组结构与EV71等类似，有研究将脊髓灰质炎病毒结构蛋白去除，插入外源抗原基因，制备脊髓灰质炎病毒RNA复制子用于疫苗载体和溶瘤病毒。目前通过基因工程的手法制备包装缺陷型肠道病毒从而研发相应的疫苗还未见报道。随着EV71等肠道病毒反向遗传技术的发展，以及肠道病毒基因功能的明确，使得构建结构蛋白基因缺失的包装缺陷型肠道病毒成为可能。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种EV71复制缺陷型病毒及其制备方法和应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种表达EV71部分衣壳蛋白基因的稳定表达Vero细胞系，所述稳定表达Vero细胞系在Vero细胞基因组上插入EV71的部分衣壳蛋白编码基因。
一种表达EV71部分衣壳蛋白基因的稳定表达Vero细胞系的构建方法，将EV71部分衣壳蛋白基因构建到慢病毒基因组中，通过包装获得重组慢病毒；将重组慢病毒感染正常Vero细胞，通过筛选获得表达EV71部分衣壳蛋白基因的稳定表达Vero细胞系。
优选的，以EV71 cDNA为模板，PCR扩增VP4-VP2-VP3编码区基因，然后克隆到慢病毒表达载体，构建表达VP4-VP2-VP3的慢病毒；将构建好的慢病毒感染Vero细胞，48小时后加药筛选，单克隆化后通过RT-qPCR和Western Blot方法检测mRNA及蛋白表达，鉴定获得表达EV71 VP4-VP2-VP3蛋白基因的稳定表达Vero细胞系。
一种EV71复制缺陷型病毒，所述EV71复制缺陷型病毒在上述所述的稳定表达Vero细胞系中复制且包装成完整病毒粒子。
一种EV71复制缺陷型病毒的制备方法，在体外构建表达EV71非部分衣壳蛋白基因的真核表达载体，并使用该载体转染表达EV71部分衣壳蛋白基因的稳定表达Vero细胞系，获得一种在稳定表达Vero细胞系中复制且包装成完整病毒粒子的EV71复制缺陷型病毒。
优选的，采用分子克隆技术制备缺失VP4、VP2、VP3区编码基因的EV71基因组cDNA，构建pEV71VP1-dEV71 VP4-VP2-VP3质粒，用构建好的质粒转染表达EV71 VP4-VP2-VP3蛋白基因的稳定表达Vero细胞系，获得一种在稳定表达Vero细胞系中复制且包装成完整病毒粒子的EV71复制缺陷型病毒；将EV71复制缺陷型病毒转接到EV71互补细胞系和普通Vero细胞，采用RT-qPCR检测其基因组复制和病毒传代特性，采用Western Blot检测VP1结构蛋白的表达情况。
一种EV71复制缺陷型病毒体在制备EV71病毒疫苗中的应用。
一种手足口病疫苗，所述手足口病疫苗含有上述所述的EV71复制缺陷型病毒。
本发明的有益效果在于：本发明基于已有的EV71基因组结构，首次创建一种仅能在稳定表达EV71其他基因元件的细胞系中复制且能包装的缺陷型病毒，该病毒将为后HFMD的研究及复制缺陷嵌合型病毒的研究奠定基础。
由于体外机体或正常细胞缺乏EV71部分衣壳蛋白基因，当本发明的EV71复制缺陷型病毒粒子感染时其基因仅能复制，但缺乏必要酶等蛋白的修饰，因而不能包装成完整的病毒粒子。本发明的EV71复制缺陷型病毒仅能在本发明构建的表达EV71部分衣壳蛋白基因的稳定表达Vero细胞系中复制且包装成完整病毒粒子，具有良好的安全性，可以作为预防EV71感染的疫苗候选株。
附图说明
图1是正常Vero细胞及转基因Vero细胞形态图，其中，A为正常Vero细胞，B为稳定表达EV71 VP4-VP2-VP3的Vero细胞。
图2是稳定表达目的基因的Vero细胞的RT-qPCR检测结果图，其中，blank为正常的Vero细胞组；NC为接种慢病毒的Vero细胞组；target为接种表达EV71 VP4-VP2-VP3的Vero细胞组。
图3是稳定表达目的基因的Vero细胞的Western Blot检测结果图，其中，左侧为所使用的Marker的标准条带；1为接种慢病毒的Vero细胞蛋白样品；2为接种表达EV71VP4-VP2-VP3的Vero细胞蛋白样品；M为Marker的标准分子量。
图4是pcDNA3.1-EV71d423-VP1酶切鉴定质粒酶切图谱，其中，M为DL15000DNAMarker；1为pcDNA3.1-EV71d423-VP1-XhoI。
图5是接种包装缺陷型病毒感染细胞的形态图(100X)，其中，A为使用稳定表达EV71VP4-VP2-VP3的Vero细胞；B为使用的Vero细胞。
图6是包装缺陷型病毒感染细胞后的Western Blot检测结果图，其中，M为Marker的标准分子量；1为包装缺陷型病毒感染稳定表达目的基因的Vero细胞蛋白样品；2为包装缺陷型病毒感染正常Vero细胞蛋白样品。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图1-6对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)：D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南：吕鸿声，科学出版社，1982，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：稳定表达EV71部分衣壳蛋白基因的Vero细胞系的构建
将EV71的VP4、VP2和VP3基因序列插入到慢病毒表达载体，将获得的慢病毒粒子感染正常的Vero细胞后，经过10μg/mL的嘌呤霉素三轮筛选后，分别对稳转细胞进行RT-qPCR及Western Blot检测，经过筛选的细胞培养48h后观察细胞的形态，结果如图1所示。图1表明两个问题，一是目的基因可能在细胞内得以表达，二是慢病毒及表达目的基因的慢病毒粒子不会破坏正常的细胞形态。为了进一步验证目的基因的表达情况，发明人设计了检测EV71的VP4-VP2-VP3的特异性引物，分别对接种表达EV71 VP4-VP2-VP3慢病毒的Vero细胞，正常的Vero细胞及接种慢病毒的Vero细胞的总RNA进行RT-qPCR检测，结果如图2所示，实验结果表明接种表达EV71 VP4-VP2-VP3慢病毒的Vero细胞的基因拷贝数明显高于其他两组。之后，发明人对接种表达EV71 VP4-VP2-VP3慢病毒的Vero细胞及接种慢病毒的Vero细胞的蛋白进行Western Blot检测，检测用的一抗抗体使用EV71的VP2特异性抗体，结果如图3所示，结果表明，EV71 VP4-VP2-VP3在Vero细胞内获得表达。
实施例2：复制缺陷型病毒的包装及免疫学试验
对EV71的感染性克隆的基因组进行PCR操作，分别扩增去除EV71整个结构蛋白基因而保留载体及EV71非结构蛋白基因的核酸片段含有扩增的EV71 VP1的核酸片段，通过DNA无缝克隆技术构建仅表达EV71 VP1及其他非结构蛋白基因质粒(pcDNA3.1-EV71d423-EV71VP1)。首先通过酶切的方法对所构建的质粒进行检测，结果如图4所示，核酸电泳结果显示酶切后的核酸片段与预期结果相符，同时将构建的质粒通过测序比对序列。之后，将所构建的质粒分别转染到Vero细胞以及构建的稳定表达EV71 VP4-VP2-VP3蛋白的Vero细胞上，转染72h后收集细胞并反复冻融后将细胞上清液分别重新接种到Vero及表达EV71VP4-VP2-VP3的细胞上，37℃吸附1小时后，用PBS清洗细胞表面3次，填加维持培养基继续培养至48h，观察细胞的形态，在100X物镜，明场下进行细胞形态的观察，结果如图5所示，发现接种转染后细胞上清的稳定表达目的基因的Vero细胞出现细胞皱缩，变圆的形态，而接种转染后细胞上清液的Vero则细胞形态未见改变。之后，收集细胞，反复冻融，取各自的细胞上清液进行Western Blot检测，使用EV71 VP1特异性单克隆抗体对各自的细胞上清液进行Western Blot检测，结果如图6所示，在接种转染后细胞上清的稳定表达EV71VP4-VP2-VP3基因的Vero细胞中检测到EV71 VP1蛋白，而接种转染后细胞上清液的Vero则细胞则无VP1蛋白表达。实验表明包装缺陷型病毒可以在表达EV71 VP4-VP2-VP3的Vero上复制、表达并可以引起细胞病变。而包装缺陷型病毒在接种正常Vero后，EV71 VP1基因可能复制、表达，但由于正常的Vero细胞不能为包装缺陷型EV71 VP1的RNA提供完整的衣壳，使其RNA可能发生降解，不能用于多次病毒传代，导致EV71 VP1蛋白无法被检测到。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种EV71复制缺陷型病毒的制备方法，其特征在于：采用分子克隆技术制备缺失VP4、VP2、VP3区编码基因的EV71基因组cDNA，构建pEV71VP1-dEV71VP4-VP2-VP3质粒，用构建好的质粒转染表达EV71 VP4-VP2-VP3蛋白基因的稳定表达Vero细胞系，获得一种在稳定表达Vero细胞系中复制且包装成完整病毒粒子的EV71复制缺陷型病毒；将EV71复制缺陷型病毒转接到普通Vero细胞和表达EV71 VP4-VP2-VP3蛋白基因的稳定表达Vero细胞系，采用RT-qPCR检测其基因组复制和病毒传代特性，采用Western Blot检测VP1结构蛋白的表达情况；
所述稳定表达Vero细胞系的构建方法为：以EV71cDNA为模板，PCR扩增VP4-VP2-VP3编码区基因，然后克隆到慢病毒表达载体，构建表达VP4-VP2-VP3的慢病毒；将构建好的慢病毒感染Vero细胞，48小时后加药筛选，单克隆化后通过RT-qPCR和Western Blot方法检测mRNA及蛋白表达，鉴定获得表达EV71VP4-VP2-VP3蛋白基因的稳定表达Vero细胞系。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112522287B (zh) * 2020-12-08 2023-04-11 吉林大学 肠道病毒缺损基因组、缺损干扰颗粒及其制备方法和应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102284058A (zh) * 2011-01-17 2011-12-21 中国科学院武汉病毒研究所 复制缺陷型抗ev71和ca16病毒双价疫苗的制备方法
CN102337289A (zh) * 2011-09-30 2012-02-01 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 肠道病毒71型vp1蛋白的原核表达及含有该蛋白的疫苗
CN105219740A (zh) * 2015-09-29 2016-01-06 东莞市第八人民医院 一种重组人3型腺病毒及制备方法和应用
WO2016145087A1 (en) * 2015-03-09 2016-09-15 National Health Research Institutes High-growth enterovirus 71 strains and vaccines
CN106282082A (zh) * 2016-09-08 2017-01-04 东莞市儿童医院 一种重组人肠道病毒71型vp1乳酸球菌、其构建方法及其应用
CN106554965A (zh) * 2015-09-28 2017-04-05 斯澳生物科技（苏州）有限公司 用于制备ev71病毒样颗粒的核酸构建体和方法
CN106636001A (zh) * 2016-12-29 2017-05-10 汕头大学医学院 一种重组肠道病毒表型混合系统的构建方法和应用
CN110699380A (zh) * 2019-09-04 2020-01-17 广州医科大学附属第一医院 一种ev71病毒核酸质粒及其构建方法及应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102284058A (zh) * 2011-01-17 2011-12-21 中国科学院武汉病毒研究所 复制缺陷型抗ev71和ca16病毒双价疫苗的制备方法
CN102337289A (zh) * 2011-09-30 2012-02-01 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 肠道病毒71型vp1蛋白的原核表达及含有该蛋白的疫苗
WO2016145087A1 (en) * 2015-03-09 2016-09-15 National Health Research Institutes High-growth enterovirus 71 strains and vaccines
CN106554965A (zh) * 2015-09-28 2017-04-05 斯澳生物科技（苏州）有限公司 用于制备ev71病毒样颗粒的核酸构建体和方法
CN105219740A (zh) * 2015-09-29 2016-01-06 东莞市第八人民医院 一种重组人3型腺病毒及制备方法和应用
CN106282082A (zh) * 2016-09-08 2017-01-04 东莞市儿童医院 一种重组人肠道病毒71型vp1乳酸球菌、其构建方法及其应用
CN106636001A (zh) * 2016-12-29 2017-05-10 汕头大学医学院 一种重组肠道病毒表型混合系统的构建方法和应用
CN110699380A (zh) * 2019-09-04 2020-01-17 广州医科大学附属第一医院 一种ev71病毒核酸质粒及其构建方法及应用

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A highly conserved amino acid in VP1 regulates maturation of enterovirus 71;Yong-Xin Zhang等;《PLOS ONE》;20170922;第13卷(第09期);第1-23页 *
Efficient expression of enterovirus 71 based on virus-like particles vaccine;Hye-Jin Kim等;《PLOS ONE》;20190307;第14卷(第03期);第1-12页 *
EV71临床毒株分离及其VP1单克隆抗体制备;黄薇园等;《中国热带医学》;20190617;第19卷(第06期);第512-515页 *
应用生物反应器培养Vero细胞制备EV71病毒初探;范秀娟等;《微生物学免疫学进展》;20130402;第40卷(第06期);第1-3页 *
手足口病病原微生物EV71病毒株的分离与鉴定;张鑫瑜等;《中国临床医学》;20110625;第18卷(第03期);第275-278页 *
稳定表达EV71 VP4-VP2-VP3衣壳蛋白的Vero细胞系的构建;蒋再学等;《医药前沿》;20201027;第10卷(第11期);第103-105页 *
肠道病毒71型北京分离株VP4基因序列及蛋白抗原性分析;李玉运等;《病毒学报》;20110515;第27卷(第03期);第207-214页 *
肠道病毒71型衣壳蛋白VP1基因部分序列在大肠杆菌中的表达;唐启慧等;《热带医学杂志》;20080128;第2008卷(第01期);第15-18页 *

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