CN110004178A - 一种牛病毒性腹泻病毒样颗粒的制备的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种牛病毒性腹泻病毒样颗粒的制备方法。通过将I型BVDV的结构蛋白C、Erns、E1、E2编码基因克隆至pFastBacTMDual构建pFBD‑BVDV重组杆状病毒穿梭载体，转染昆虫细胞，感染昆虫细胞表达BVDV的结构蛋白C、Erns、E1、E2，制备由结构蛋白C、Erns、E1、E2自组装形成的BVDV病毒样颗粒(VLP)。

Description

一种牛病毒性腹泻病毒样颗粒的制备的制备方法
技术领域
本发明涉及一种牛病毒性腹泻病毒样颗粒、一种牛病毒性腹泻病毒基因重组杆状病毒的制备。
背景技术
牛病毒性腹泻(粘膜病)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus简写 BVDV属于黄病毒科瘟病毒属)引起的牛、羊和猪的一种接触性传染病。牛、羊以消化道黏膜糜烂、坏死，胃肠炎和腹泻为特征，各种年龄的牛都易感染、以幼龄牛易感性最高；猪则表现为怀孕母猪的不孕、产仔数下降和流产，以及仔猪的生长迟缓和先天性震颤等。一旦感染，可造成持续感染，持续感染牛处于免疫耐受状态时，临床上不表现任何症状，但仍然带毒、排毒，可严重损坏机体的免疫机能，引起牛的生产性能下降，还可以诱发其他病原体的感染而导致继发感染或混合感染等，给养牛业造成了巨大的经济损失，是危害养牛业的主要疫病之一(Yilmaz H，Altan E，Ridpath J，et al.Genetic diversity and frequencyof bovine viral diarrhea virus(BVDV)detected in cattle in Turkey[J].Comparative immunology，microbiology and infectious diseases，2012，35(5):411-416.)。
BVDV属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，为正链、单股RNA病毒，全长约12.5kb，基因组只含有一个开放阅读框，编码11种蛋白，其中P14(C)、gP48(Erns)、gP25(El)、gP53(E2)4个蛋白为病毒结构蛋白，其余为非结构蛋白(Neill J D.Molecularbiology of bovine viral diarrhea virus[J].Biologicals，2013，41(1):2-7.)。Erns、El、E2三个结构蛋白位于病毒表面，因此组成病毒囊膜结构的三种囊膜蛋白(Uryvaevaev LV， Ionova K S，Dedova A V，et al.Analysis of the cell tissue culturecontamination with the bovine viral diarrhea virus and mycoplasmas[J].Voprosyvirusologii，2012，57(5):15-21.)。其中，E2位于病毒粒子的外表面，含有病毒重要的抗原决定簇，免疫原性最强，是病毒主要的免疫保护性抗原，能诱导机体产生细胞免疫与体液免疫，同时产生保护性的中和抗体 (Harpin S，Hurley D J，Mbikay M，et al.Vaccinationof cattle with a DNA plasmid encoding the bovine viral diarrhoea virus majorglycoprotein E2[J].Journal of general Virology， 1999，80(12):3137-3144.)，介导免疫中和反应，参与宿主细胞识别，吸附过程，因此作为诊断抗原具有良好的前景。Bolin SR等早在1996年就利用昆虫细胞表达的BVDV E2 蛋白免疫牛，结果表明，E2蛋白能够有效的保护免疫动物免受同源毒株的攻击(Bolin S R， Ridpath J F.Glycoprotein E2ofbovine viral diarrhea virus expressed in insect cells provides calveslimited protection from systemic infection and disease[J].Archives ofvirology，1996， 141(8):1463-1477.)。Harpin S等用含有E2基因的重组质粒免疫牛，结果表明，免疫动物能够产生特异性免疫应答(Harpin S，Hurley D J，Mbikay M，etal.Vaccination of cattle with a DNA plasmid encoding the bovine viraldiarrhoea virus major glycoprotein E2[J].Journal of general Virology，1999，80(12):3137-3144.)。Ferrer等利用杆状病毒蛋白表达体系 (Rachiplusia nuperos)获得E2重组蛋白，通过免疫小鼠，该蛋白可诱导中和抗体的产生 (Ferrer F，Zoth S C，CalamanteG，et al.Induction of virus-neutralizing antibodies by immunization withRachiplusia nu per os infected with a recombinant baculovirus expressing theE2glycoprotein of bovine viral diarrhea virus[J].Journal of virologicalmethods，2007， 146(1-2):424-427.)。
发明内容
本发明提供一种重组杆状病毒，同时本发明提供这种重组杆状病毒可高效表达并能产生免疫反应的病毒样颗粒，以及病毒样颗粒的制备。
本发明提供的具有免疫原性的牛病毒性腹泻病毒样颗粒，其特征在于：由I型BVDV的结构蛋白C、Erns、E1、E2组成。
本发明所述的重组杆状病毒的制备方法为：将I型BVDV的结构蛋白C、Erns、E1、 E2编码基因克隆至pFastBacTMDual构建pFBD-BVDV重组杆状病毒穿梭载体，转染昆虫细胞，培养后将获得重组杆状病毒Bac-BVDV。
本发明的重组杆状病毒在制备防治牛病毒性腹泻病毒免疫疫苗中的应用。
本发明所述的具有免疫原性的BVDV病毒样颗粒的制备方法是用所述的重组杆状病毒感染昆虫细胞，从昆虫细胞裂解物中分离获得病毒样颗粒。
本发明的具有免疫原性的BVDV病毒样颗粒在制备预防牛病毒性腹泻病毒感染的疫苗中的应用。
本发明提供了一种重组杆状病毒穿梭载体pFBD-BVDV，含有I型BVDV的结构蛋白C、Erns、E1、E2的编码序列。进一步，所述的重组杆状病毒穿梭载体pFBD-BVDV是通过将含有I型BVDV的结构蛋白C、Erns、E1、E2的编码序列利用Bam HI和Xho I酶切位点插入载体pFastBacTMDual而获得的。
利用本发明获得的BVDV重组杆状病毒可以用于感染昆虫细胞而获得BVDV的重组蛋白C、Erns、E1、E2，从而利用重组病毒表达的重组蛋白获得了病毒样颗粒。
一种牛病毒性腹泻病毒样颗粒的制备方法。通过将I型BVDV的结构蛋白C、Erns、E1、E2编码基因克隆至pFastBacTMDual构建pFBD-BVDV重组杆状病毒穿梭载体，转染昆虫细胞，感染昆虫细胞表达BVDV的结构蛋白C、Erns、E1、E2，制备由结构蛋白C、 Erns、E1、E2自组装形成的BVDV病毒样颗粒(VLP)。本发明获得的病毒样颗粒通过免疫动物后，刺激机体产生抗原特异性细胞免疫反应。所获得的病毒样颗粒可以采用蔗糖密度梯度离心的方式进行纯化，与其他表达系统相比，有利于提高效率和节约成本，节省了病毒结构蛋白分别纯化与细胞外组装的过程，同时在生产过程中不需要感染性的活病毒，从而安全性得到了提高。本发明中BVDV病毒样颗粒不仅可作为诊断抗原应用于牛病毒性腹泻病血清学诊断，而且为牛病毒性腹泻病毒样颗粒疫苗的研发奠定了良好基础，也为研发牛病毒性腹泻病毒新型疫苗进行了有益的探索。
附图说明
图1重组杆状病毒穿梭载体pFBD-BVDV酶切鉴定图
图2免疫小鼠血清中Ig G水平的分析结果图
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细叙述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1：真核系统中BVDV新疆流行株病毒样颗粒表达载体的构建
1.BVDV结构蛋白C、Erns、E1、E2的获得
分别用BVDV新疆流行株(shihezi132株和MS株)感染MDBK细胞，提取RNA，通过RT-PCR技术，获得2株BVDV新疆流行株的结构蛋白C、Erns、E1、E2。通过融合 PCR技术获得BVDV新疆流行株C-Erns-E1-E2编码基因。
2.C-Erns-E1-E2编码基因与信号肽序列融合
通过融合PCR技术在C-Erns-E1-E2编码基因前添加乙脑病毒信号肽序列，使病毒样颗粒得以成功分泌表达。
3.杆状病毒穿梭载体的构建
将步骤2得到的重组序列与载体pFastBacTMDual用Bam HI和Xho I分别进行双酶切，纯化回收，利用DNA连接酶在16℃下进行连接，转化，鉴定。将获得的重组质粒分别命名为 pSHZ132、pMS。重组质粒的酶切鉴定图参见附图1。
4.重组杆状病毒的获得
分别将重组质粒pSHZ132、pMS转染sf9细胞，扩大培养，收集培养上清进行PCR鉴定。分别获得重组杆状病毒BacSHZ132株、BacMS株。
实施例2：BVDV新疆流行株病毒样颗粒制备
1.BVDV病毒样颗粒表达载体转染Sf9细胞
Sf9细胞密度达到2x106时将其传至6孔板中，贴壁30min，细胞密度达到70％融合生长时进行转染；杆状病毒线性化DNA与重组质粒DNA轻轻混匀，室温静置5min，加入BaculoGold共转染试剂盒中B液，轻轻混匀；将转染混合液逐滴加入至6孔板中，将6孔板置于湿盒中，27℃孵育4h，换新鲜的SF900IISFM培养基，置湿盒中27℃培养6-7天；收获转染上清，并以其作为毒种继续感染Sf9细胞；收获第3代染毒细胞及上清，以进行检测。利用BacPAK快速杆状病毒检测滴度试剂盒，对两种重组病毒滴度进行测定。第三代后病毒滴度趋于稳定，为3×108IFU/m L、5.3×108IFU/m L，与前两代相比表现为接毒Sf9昆虫细胞病变迅速而严重，48h后开始能观察到明显病变，分别命名为BVDV-VLPs132、BVDV-VLPsMS。
2.间接免疫荧光检测BVDV病毒样颗粒在真核细胞内的表达
收集转染48h后染毒的第三代Sf9细胞，将细胞悬液滴于免疫荧光用载玻片上，丙酮固定10min，制备抗原片；以BVDV新疆分离株鼠单克隆腹水为一抗(l:100稀释)，滴加于抗原片上，37℃孵育30min，PBS浸泡3遍；以伊文斯蓝稀释的FITC标记的抗鼠IgG 为二抗，滴加于抗原片上，37℃孵育30min；PBS浸泡3遍，荧光显微镜下观察抗原片。结果发现被BVDV-VLPs132、BVDV-VLPsMS感染后的Sf9细胞经C-Erns-E1-E2蛋白多抗孵育可以观察到高强度的绿色荧光，而对照组细胞未见绿色荧光，以上结果均证实所获得的重组病毒BVDV-VLPs132、BVDV-VLPsMS可以表达目的蛋白。
3.Western blot检测BVDV病毒样颗粒的分泌表达
收集转染48h后Sf9细胞第三代染毒上清，加入至30000D的超滤管浓缩10倍，进行SDS-PAGE电泳；转膜、封闭；以重组C-Erns-E2蛋白兔免疫血清作为第一抗体，作用1小时；以HRP即标记的羊抗兔血清作为第二抗体，作用1小时；加入DAB底物显色液中显色，照相后避光保存。BVDV-VLPs132、BVDV-VLPsMS感染的Sf9细胞上清液经以BVDV全病毒多抗为一抗，通过Western blotting检测出一条特异性条带。
实施例3：BVDV新疆流行株病毒样颗粒的纯化
首先浓缩收获的BVDV病毒样颗粒上清，然后用蔗糖密度梯度离心法纯化BVDV病毒样颗粒；离心管中加入60％蔗糖溶液，再在其上层缓慢加入20％蔗糖溶液，将浓缩后的转染上清缓慢加入到20％蔗糖层面之上；4℃，38000rpm/min离心4h；分别使用注射器小心抽取超速离心管中各层，SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。纯化后发现在40％与60％蔗糖浓度之间，存在白色的目的条带，为病毒样颗粒在蔗糖梯度中分布条带。
实施例4：BVDV新疆流行株病毒样颗粒的免疫原性研究
1.ELISA检测免疫小鼠血清中BVDV病毒特异性IgG抗体应答
以原核表达纯化的C-Erns-E2蛋白为抗原，4℃过夜包被；37℃封闭1-2小时；将0，14， 28，42天收集的小鼠血清稀释，加入96孔板中，37℃孵育lh；以HRP标记的羊抗鼠IgG 为二抗37℃孵育lh；显色之后酶标仪进行检测。
2.间接免疫荧光检测免疫小鼠血清中BVDV病毒特异性IgG抗体应答
同实施例2步骤2制备细胞抗原片，以各组小鼠免疫血清作为一抗滴加于抗原片，37℃孵育3Omin；PBS浸泡3遍，用伊文斯蓝稀释的FITC标记的抗鼠IgG抗体作为二抗，滴加于抗原片，37℃孵育30min；PBS浸泡3遍，风干，荧光显微镜下观察。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变化和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种具有免疫原性的BVDV牛病毒性腹泻病毒样颗粒的制备方法，其特征在于：
将BVDV的结构蛋白C、Erns、E1、E2编码基因克隆至pFastBacTMDual构建pFBD-BVDV重组杆状病毒穿梭载体，转染昆虫细胞，培养后将获得重组杆状病毒Bac-BVDV；将重组杆状病毒Bac-BVDV感染昆虫细胞，从昆虫细胞裂解物中分离获得病毒样颗粒。
2.如权利要求1所述的具有免疫原性的BVDV牛病毒性腹泻病毒样颗粒的制备方法，其特征在于：所述的重组杆状病毒穿梭载体pFBD-BVDV是通过将含有I型BVDV的结构蛋白C、Erns、E1、E2的编码序列利用Bam HI和Xho I酶切位点插入载体pFastBacTMDual而获得的。
3.如权利要求1所述的具有免疫原性的BVDV牛病毒性腹泻病毒样颗粒的制备方法，其特征在于：BVDV重组杆状病毒用于感染昆虫细胞而获得BVDV的重组蛋白C、Erns、E1、E2，从而利用重组病毒表达的重组蛋白获得了病毒样颗粒。
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