CN103555680B - 一种具有免疫原性的prrsv病毒样颗粒及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有免疫原性的PRRSV病毒样颗粒及其制备与应用，属于农业兽用生物技术领域。通过将猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白和GP5蛋白的编码序列克隆入杆粒中，获得重组的杆粒；重组的杆粒染昆虫细胞，培养转染的昆虫细胞，得到重组杆状病毒。采用该重组杆状病毒感染昆虫细胞来表达N蛋白和GP5蛋白，可获得具有较好空间构型的蛋白，且可以自动组装为PRRSV病毒样颗粒。本发明的病毒样颗粒具有高的免疫原性，可用于制备预防猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的疫苗。本发明的PRRSV病毒样颗粒免疫保护率高，能产生对PRRSV强毒株的攻毒保护；本发明的PRRSV病毒样颗粒更加安全有效，不存在毒力返强的风险。

Description

一种具有免疫原性的PRRSV病毒样颗粒及其制备与应用

技术领域

本发明属于农业兽用生物技术领域，具体涉及一种具有免疫原性的PRRSV病毒样颗粒及其制备与应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种严重危害养猪业的传染病。该病于1987年最早发现于美国。1991年，荷兰中央兽医研究所确定该病的病原是一种新的RNA病毒，并命名为Lelystad病毒。1996年郭宝清等首次从国内疑似PRRS感染猪群中分离出PRRSV，从而证实了本病在我国的存在。2006年4月我国猪群暴发了高致病性猪繁殖与呼吸综合征，高致病性猪繁殖与呼吸综合征是由高度变异的PRRSV引起的猪的烈性传染病，是我国新出现的重大动物疫病，已成为当前危害我国养猪业的主要疾病之一。目前国内用于预防PRRS的疫苗毒株至少有9株，生产厂家近20家。其中包括经典PRRS灭活苗和弱毒苗，HP-PRRS灭活苗和弱毒苗，由于活疫苗普遍存在毒力可能返强的问题，而灭活疫苗存在的主要问题是免疫效力欠佳。世界上尚没有一种满意的疫苗用于该疾病的预防，而目前，我国政府大量采购的疫苗是高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（JXA1-R株），该疫苗株是由高致病性强毒株经过细胞连续传代至弱而成的，其疫苗也存在毒力返强的风险。因此研发确实、可靠、高效的新一代疫苗也是未来一个方向。

PRRSV是动脉炎病毒科、动脉炎病毒属的单股正链RNA病毒。其全基因组长约15kb，含有8个开放阅读框（ORFs），ORFla和ORFlb编码蛋白聚合酶，ORF2～7分别编码结构蛋白GP2、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白。其中，N蛋白也称核衣壳蛋白，由ORF7编码，在病毒粒子中含量较高，N基因高度保守。N蛋白约15kD，至少有5个抗原决定簇，其中包括两型的共同决定簇和特异性决定簇，具有一个糖基化位点，但它不是糖基化蛋白。N蛋白的C端在维持蛋白构象上起重要作用。其N端半段是由Arg、Lys、His3种碱性氨基酸组成，可能和RNA基因组间的相互作用有关。N蛋白之间形成同源二聚体，对病毒的组装至关重要。GP5蛋白约25kD，由ORF5编码，是一个糖基化蛋白，含有4个糖基化位点，且非常不保守，三次跨膜，并有一个70个氨基酸残基的胞外区，有6个抗原决定簇。有证据表明GP5在PRRSV的抗体识别过程中起关键作用，是诱导机体产生中和抗体的主要结构蛋白，病毒中和作用与抗GP5抗体效价呈显著相关性，同时GP5还可诱导细胞凋亡，是公认的PRRSV的主要保护性抗原。N蛋白和GP5蛋白同时在体外表达时可自主装配，能自动形成完整的病毒样颗粒，具有良好的免疫原性，成为病毒疫苗研究的主要方向。病毒样颗粒（virus-likeparticles，VLPs）是某种病毒的一个或多个结构蛋白装配成的空心颗粒，它既有类似天然病毒的稳定性和免疫原性，又具备携带外源蛋白或多肽的潜能，不含有病毒的核酸，没有感染性，使其有望成为构建多价疫苗的良好载体。

E.H.J.Wissink等认为PPRSV的GP5和M蛋白是组成病毒粒子所不可或缺的部分（JOURNALOFVIROLOGY，2005年，第79卷，第19期，12495–12506）。Hae-MiNam等公开了含有PPRSVGP5和M蛋白的病毒样颗粒，上述两种蛋白通过重组杆状病毒表达，再组装而成病毒样颗粒，可用于制备疫苗（ArchVirol.，2013年，第158卷，1275–1285）。李杨将PRRSV的ORF5和ORF6两个基因或ORF5、ORF6和ORF7三个基因或ORF5、ORF6、ORF7和NSP2a四个基因组合后都可以在杆状病毒表达载体中形成病毒样颗粒（华中农业大学2012届硕士研究生学位论文）。吕风林等人（专利申请号201110000815.6）将编码PRRSV的M蛋白、N蛋白和GP5蛋白的基因分别克隆到真核表达载体（如pHWD2000、pOPI3CAT、pCAGGS、pcDNA6/TR、pCMV-HA）中同时转染同一细胞系表达3种蛋白能够形成病毒样颗粒，并能产生良好的细胞免疫和体液免疫。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种更加可靠、高效的预防猪繁殖与呼吸综合征病毒感染具有免疫原性的PRRSV病毒样颗粒。

本发明的另一目的在于提供上述PRRSV病毒样颗粒的制备。

本发明的再一目的在于提供上述PRRSV病毒样颗粒的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

在本发明的第一方面，提供一种表达载体，其包括第一表达盒和第二表达盒，所述的第一表达盒含有猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的编码序列，所述的第二表达盒含有猪繁殖与呼吸综合征病毒的GP5蛋白的编码序列。

在另一优选例中，所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒广东分离株（PRRSVGD株，GenBank:EU109503.1），N蛋白和GP5蛋白的编码序列分别如SEQIDNO：1和2所示。

在另一优选例中，所述的表达载体是pFastBacDaul（pFBD）载体。

在本发明的另一方面，提供一种重组杆状病毒，其可用于感染昆虫细胞而获得重组蛋白，所述的重组杆状病毒的基因组中含有至少一个上述第一表达盒和至少一个上述第二表达盒。

在另一优选例中，所述的重组杆状病毒仅包括上述第一表达盒和第二表达盒。

在另一优选例中，所述的重组杆状病毒仅表达猪繁殖与呼吸综合征病毒的N蛋白和GP5蛋白。

在另一优选例中，所述的重组杆状病毒包含上述表达载体。

在另一优选例中，所述的重组杆状病毒通过以下步骤制备：（A）将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒广东分离株N蛋白的编码序列和GP5蛋白的编码序列克隆入杆粒中，获得重组的杆粒；（B）将（A）获得的重组的杆粒转染昆虫细胞，培养转染的昆虫细胞；和（C）收获重组杆状病毒。

在另一优选例中，所述的杆粒是Bac-mid杆粒。更优选的是，Bac-mid杆粒来源于大肠杆菌DH10Bac株。

在另一优选例中，所述的昆虫细胞是sf9昆虫细胞。

在本发明的另一方面，本发明提供上述表达载体或上述重组杆状病毒的应用，用于制备PRRSV病毒样颗粒。

在本发明的另一方面，提供一种生产PRRSV病毒样颗粒的系统，包括：（1）上述重组杆状病毒；和（2）昆虫细胞。

在另一优选例中，所述的昆虫细胞是sf9昆虫细胞。

在本发明的另一方面，提供一种制备PRRSV病毒样颗粒的方法，包括：（a）将上述重组杆状病毒感染昆虫细胞；（b）从昆虫细胞的裂解物中分离获得病毒样颗粒。

在另一优选例中，通过蔗糖密度梯度离心分离病毒样颗粒。

在本发明的另一方面，提供一种具有免疫原性的PRRSV病毒样颗粒，该病毒样颗粒由猪繁殖与呼吸综合征病毒的N蛋白和GP5蛋白组成。

在另一优选例中，所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒广东分离株，N蛋白和GP5蛋白的氨基酸序列分别如SEQIDNO：3和4所示。

在另一优选例中，所述的PRRSV病毒样颗粒其由所述制备病毒样颗粒的方法产生，所述病毒样颗粒的平均直径为45～65nm。

在本发明的另一个方面，提供所述PRRSV病毒样颗粒的应用，用于制备预防猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的疫苗。

在本发明的另一方面，提供一种预防猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的疫苗，所述的疫苗包含：（a）所述具有免疫原性的PRRSV病毒样颗粒；和（b）辅助剂，所述的辅助剂是保护剂、稳定剂或佐剂。

在本发明的另一方面，提供一种制备预防高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的方法，所述方法包括：给予需要预防的对象有效量的所述的具有免疫原性的病毒样颗粒，或所述的疫苗。

本发明具有如下优点和效果：

本发明采用杆状病毒感染昆虫细胞来表达PRRSVGD株的结构蛋白GP5和N蛋白，可获得具有较好空间构型的蛋白，可以自动组装为PRRSV病毒样颗粒。

本发明的PRRSV病毒样颗粒具有高的免疫原性；制备的病毒样颗粒疫苗相对于现有的灭活疫苗，其免疫保护率高，能产生对PRRSV强毒株的攻毒保护。本发明的PRRSV病毒样颗粒制备的疫苗相对于现有的活疫苗，更加安全有效，不存在毒力返强的风险。

附图说明

图1是pFBD-N-GP5杆状病毒表达载体Tn7内片段结构示意图。

图2是pFBD-M-GP5杆状病毒表达载体Tn7内片段结构示意图。

图3是pFBD-N-M-GP5杆状病毒表达载体Tn7内片段结构示意图。

图4是免疫荧光检测杆状病毒系统表达N和GP5目的蛋白表达；Sf9昆虫细胞用重组杆状病毒感染，3天后收集细胞用GP5抗体和N抗体进行免疫荧光检测：A是GP5抗体免疫荧光，B是N抗体免疫荧光。

图5是病毒样颗粒的蔗糖密度梯度离心分析；细胞裂解物被铺在10～50%的蔗糖梯度上进行超速离心后，从上到下收集6个组分分别用PRRSV-N蛋白抗体和PRRSV-GP5蛋白抗体进行Westernblot分析，A是PRRSV-N蛋白抗体Westernblot；B是PRRSV-GP5蛋白抗体Westernblot；其中蛋白Marker条带从上到下依次为170、130、100、70、55、40、35、25、15kD。

图6是Bac-N-GP5病毒样颗粒的电镜图。

图7是Bac-M-GP5病毒样颗粒的电镜图。

图8是Bac-N-M-GP5病毒样颗粒的电镜图。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，发现采用杆状病毒感染昆虫细胞来表达高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒广东分离株的GP5糖基化结构蛋白和N蛋白，可获得较好空间构型的蛋白，并可以自动组装为病毒样颗粒，得到的病毒样颗粒具有高的免疫原性。在此基础上完成了本发明。

杆状病毒

本发明提供了一种重组的杆状病毒，其可用于感染昆虫而获得蛋白。所述的杆状病毒的基因组中含有至少一个含有高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒广东分离株N蛋白的编码序列的第一表达盒；和至少一个含有高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒广东分离株的GP5蛋白的编码序列的第二表达盒。

所述重组的杆状病毒可以稳定传代，零下70℃可以长期保存并具有高的滴度。利用该病毒感染昆虫细胞后3-4天后可以得到重组蛋白，且表达稳定。

作为本发明的优选方式，所述杆状病毒通过以下步骤制备：

（A）将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒广东分离株的N蛋白的编码序列SEQIDNO：1和GP5蛋白的编码序列SEQIDNO：2克隆入杆粒中，获得重组的杆粒；

（B）将（A）获得的重组的杆粒转染昆虫细胞，培养转染的昆虫细胞；

（C）收获重组的杆状病毒。

作为本发明的优选方式，所述的杆粒是Bac-mid杆粒。更优选的是，Bac-mid杆粒来源于大肠杆菌DH10Bac株。

作为本发明的优选方式，所述的昆虫细胞选自sf9昆虫细胞，HighFive昆虫细胞；最优选的是，所述的昆虫细胞为sf9昆虫细胞。

作为本发明的优选方式，将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒广东分离株N蛋白的编码序列和GP5蛋白的编码序列及其两端重组序列，在转座酶的作用下重组入Bacmid杆粒的Tn7位点。更优选的，所述的转座酶由大肠杆菌DH10Bac中携带的辅助质粒所表达。

作为本发明的优选方式，在步骤（A）中，所述重组的杆粒通过以下步骤获得：

（a）将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒广东分离株N蛋白的编码序列SEQIDNO：1和GP5蛋白的编码序列SEQIDNO：2插入穿梭载体（优选pFASTBacDual载体）的多克隆位点中，获得插入了外源编码序列的重组载体；

（b）将（a）获得的重组载体转入宿主细胞DH10Bac，获得转化的宿主细胞，所述转化的宿主细胞中含有重组杆粒，所述的重组杆粒携带所述的外源编码序列；

（c）从所述转化的宿主细胞中提取重组杆粒。

所述的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒广东分离株的N蛋白具有SEQIDNO：3所示的氨基酸序列。所述的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒广东分离株GP5蛋白具有SEQIDNO：4所示的氨基酸序列。

作为本发明的优选方式，所述的杆状病毒是通过将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒广东分离株的N蛋白的编码基因和GP5蛋白的编码基因克隆进入pFASTBac的多克隆位点内，然后将pFASTBac转化DH10Bac基因工程菌，在转座酶的作用下发生重组，获得杆粒后转染昆虫细胞获得的。将这种病毒感染昆虫细胞后数小时，病毒即可进入昆虫细胞，开始复制病毒，并且转录病毒重组区域中蛋白翻译区的外源核酸序列。感染3-4天后表达具有病毒重组区域中蛋白翻译区所对应的氨基酸序列的蛋白。

此外，在所述的杆状病毒感染昆虫细胞并表达外源蛋白后，还可以通过例如密度梯度离心等方法从培养物中回收重组杆状病毒，用于下次感染。

具有免疫原性的PRRSV病毒样颗粒

本发明提供了一种制备PRRSV病毒样颗粒的方法，该方法包括步骤：

（1）将所述的杆状病毒感染昆虫细胞，培养感染后的昆虫细胞，使之表达所述的外源蛋白。

（2）从昆虫细胞的裂解物中分离获得病毒样颗粒。

作为本发明的优选方式，所述的昆虫细胞选自sf9昆虫细胞，HighFive昆虫细胞；最优选的，所述的昆虫细胞是sf9昆虫细胞。

本发明还提供所述的具有免疫原性的PRRSV病毒样颗粒的用途，用于制备预防高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的疫苗。

疫苗

本发明还提供一种预防高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的疫苗，所述的疫苗包含：有效量的本发明所述的具有免疫原性的PRRSV病毒样颗粒和辅助剂，所述的辅助剂是保护剂、稳定剂或佐剂。

动物试验表明，利用本发明的具有免疫原性的病毒样颗粒制成疫苗免疫动物后，可在动物体内产生高效价的抗体。

使用时，是将安全有效的本发明所述的具有免疫原性的病毒样颗粒注射给猪，其中该安全有效量通常至少约15μg/头，而且在大多数情况下不超过60μg/头。

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

下述实施例中所用到的材料如下：

病毒与细胞：本发明所使用的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒广东分离株（PRRSVGD株）（基因组序列见GenBank登录号：EU109503.1），中国兽医药品监察所分离鉴定并提供；本发明所使用的昆虫细胞sf9购于美国Invitrogen公司。

基因与蛋白质：本发明所使用的N蛋白编码基因、GP5蛋白编码基因克隆自高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒广东分离株（PRRSVGD），其具体序列参见SEQIDNO.1～2，其编码蛋白序列分别参见SEQIDNO.3～4。

培养基质：采用SF900ⅡSFM培养基（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）于27℃培养昆虫细胞sf9。

抗体：抗PRRSVN蛋白的鼠单克隆体购于美国VMRD公司，Prod:P080728-004；抗PRRSVGP5蛋白的兔多抗购于英国ABCAM公司，Prod:RS-4504R；HRP标记兔抗鼠二抗购自SIGMA-ALORICH公司，Prod:A0168；FITC标记羊抗鼠二抗购自Thermo公司，Prod:31569；FITC标记羊抗兔二抗购自Thermo公司，Prod:31583。

抗体检测试剂盒：PRRSVGP5抗体检测试剂盒，法国LSI公司，Batch:5-VRTPRA-028；PRRSVN抗体检测试剂盒，美国IDEXX公司，Prod:Z411。

实施例1杆状病毒的构建

按照TakaRMiniBESTViralRNA/DNA（code:DV819A）试剂盒说明书提取高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒广东分离株RNA，以oligo(dT)为引物，用M-MLV反转录酶（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）进行反转录，获得cDNA。

参考GenBank登录号：EU109503.1基因序列，设计带酶切位点的上游引物5’-GGATCCATGCCAAATAACAACGGCAAGC-3’和下游引物5’-AAGCTTTCATGCTGAGGGTGATGCTGTG-3’，以cDNA为模板扩增编码PRRSVGD株N蛋白的基因片段，扩增片段命名为PRRSV-N；用BamHⅠ和HindⅢ双酶切回收，亚克隆到同样酶切处理的pFastBacDual载体（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）（缩写为pFBD）中，构建得到pFBD-PRRSV-N重组载体。

参考GenBank登录号：EU109503.1基因序列，设计带酶切位点的上游引物5’-CTCGAGATGTTGGGGAAGTGCTTGACC-3’和下游引物5’-GGTACCCTAGAGACGACCCCATCGTTC-3’，以cDNA为模板扩增编码PRRSVGD株GP5蛋白的基因片段，扩增片段命名为PRRSV-GP5；用XhoⅠ和KpnⅠ双酶切回收，亚克隆到同样酶切处理的pFBD-PRRSV-N载体上，成功构建了同时转载两个基因的pFBD-PRRSV-N-GP5重组表达载体，其可以在同种细胞里共同有效表达两种蛋白。PRRSV-N基因通过polyhedrin启动子调控，PRRSV-GP5基因由p10启动子直接调控，其构建示意图见图1。

将pFBD-PRRSV-N-GP5重组表达载体通过Bac-to-Bac系统（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）转染到DH10感受态构建成重组的杆状病毒，按照Invitrogen说明书鉴定重组载体，将重组杆状病毒表达载体命名为Bac-PRRSV-N-GP5。

现有技术中已经存在了由GP5和M蛋白组成的病毒样颗粒以及由GP5、M、N蛋白组成的病毒样颗粒。按照上述方法设计带BamHⅠ酶切位点的上游引物5’-GGATCCATGGGGTCGTCTCTAGAC-3’和带HindⅢ酶切位点的下游引物5’-AAGCTTTTATTTGGCATATTTAACAA-3’扩增M蛋白基因，构建了同时表达GP5和M蛋白的重组杆状病毒（Bac-PRRSV-M-GP5），构建示意图见图2。以及设计带BamHⅠ酶切位点的上游引物5’-GGATCCATGGGGTCGTCTCTAGAC-3’和带HindⅢ酶切位点的下游引物5’-AAGCTTTCATGCTGAGGGTGATGC-3’一起扩增M蛋白和N蛋白基因，构建同时表达GP5、M和N蛋白的重组杆状病毒（Bac-PRRSV-N-M-GP5），构建示意图见图3。

实施例2在昆虫细胞内表达PRRSVVLPs

按Invitrogen说明书指定的MOI用Bac-PRRSV-N-GP5重组杆状病毒表达载体感染SF9昆虫细胞。重组病毒感染SF9细胞72h后，PBS洗细胞两次，80%（v/v）冷丙酮固定细胞20min，PBS洗三次，加抗PRRSVN蛋白的鼠单克隆体或抗PRRSVGP5蛋白的抗体（抗PRRSVGP5蛋白的兔多抗）的一抗（1:100）37℃作用1h，PBS洗三次，FITC标记羊抗鼠二抗或羊抗兔二抗（1:500）37℃作用1h，PBS洗三次，50%（v/v）甘油封片，荧光显微镜观察。

抗PRRSVGP5蛋白的抗体通过免疫荧光方法来检测感染昆虫细胞中目的蛋白的表达，结果如图4（A）所示；抗PRRSVN蛋白的抗体通过免疫荧光方法来检测感染昆虫细胞中目的蛋白表达，结果如图4（B）所示。Bac-PRRSV-N-GP5感染SF9细胞后有明亮绿色荧光，将感染后的病毒命名为PRRSV-GD-N-GP5病毒；空白组并未检测到荧光信号。

将PRRSV-GD-N-GP5病毒感染SF9细胞后3天收集细胞进行超声裂解，12000rpm4℃离心15min，收集上清加到10～50%的蔗糖梯度上层，Beckman离心机39000rpm4℃离心3h，分别收集15%、20%、25%、30%、35%、40%的6个蔗糖梯度（0.4mL/梯度），做Westernblot分析PRRSV-GD-N-GP5感染后病毒样颗粒的构成，用PRRSV-N蛋白抗体检测（图5A）和PRRSV-GP5蛋白抗体检测（图5B）到目的蛋白主要存在梯度4#，证明病毒样颗粒的存在（即为Bac-N-GP5病毒样颗粒）。为直接确定病毒样颗粒的形成，梯度4#样品涂布在被有Formvar薄膜的铜网上，经喷金和喷碳处理，再用磷钨酸负染液（2%PTA）处理后，用TecnaiG220200KV透射电子显微镜分析。电镜观察分析，结果观察到直径约45～65nm的病毒样颗粒（图6）。

按照同样的方法分别将Bac-PRRSV-M-GP5和Bac-PRRSV-N-M-GP5重组杆状病毒表达载体感染SF9昆虫细胞来表达PRRSV病毒样颗粒，电镜观察分析，观察到直径约45～65nm的Bac-M-GP5病毒样颗粒（图7）和Bac-N-M-GP5病毒样颗粒（图8）。

实施例3三种PRRSV病毒样颗粒在小鼠中的免疫原性

用粗提纯的三种病毒样颗粒分别免疫小鼠评价其病毒样颗粒的免疫原性，于第1和第14天分别用粗提纯的三种病毒样颗粒皮下注射1μg/只小鼠，铝佐剂为佐剂（与抗原的比例为3:7）。对照组免疫的为不含外源基因的pFBD空载体表达的物质与铝佐剂。于免疫后7、14、21、28天收集小鼠血清，用PRRSVN抗体检测试剂盒进行N抗体的测定（表1）和用PRRSVGP5抗体检测试剂盒进行GP5抗体的测定（表2），结果表明制备的Bac-N-GP5病毒样颗粒疫苗免疫组21天和28天的血清N抗体和GP5抗体阳性最高，免疫原最好。

表1小鼠N抗体ELISA测定结果

注：OD值＞1.0为阳性

表2小鼠GP5抗体ELISA测定结果

注：OD值＞1.242为阳性。

实施例4三种PRRSV病毒样颗粒疫苗对仔猪的免疫保护效果试验

动物试验评价三种PRRSV病毒样颗粒疫苗对仔猪的免疫保护，25头蓝耳抗原抗体阴性28日龄健康仔猪分为5组，每组5头，第一组、第二组和第三组于第1和第14天分别用粗提纯的Bac-N-GP5、Bac-M-GP5和Bac-N-M-GP5病毒样颗粒肌肉注射15μg/头/次，铝佐剂为佐剂（与抗原的比例为3:7）。第四组于第1天免疫商品化的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（JXA1-R株）（武汉中博生物股份有限公司生产）1头份/头，第五组设对照组免疫的为不含外源基因的pFBD空载体表达的物质与铝佐剂。于第一次免疫后28天所有猪各肌肉注射强毒PRRSVGD株的病毒培养液（10^4.5TCID₅₀/mL）3mL观察临床症状并测温21日，于攻毒后21日剖检肺部病变，计算免疫保护率（发病猪判定标准：同时出现以下情形判为发病，①至少3日体温在41℃以上或出现咳喘等临床症状；②大体剖检，肺部出现片状实变）。结果显示，本发明制备的三种病毒样颗粒疫苗免疫仔猪攻毒后，其中Bac-N-GP5病毒样颗粒疫苗的免疫保护率最高（表3）。相比PRRSVJXA1-R株活疫苗，本发明的制备Bac-N-GP5病毒样颗粒疫苗更加安全有效，不存在毒力返强的风险。

表3仔猪的免疫保护试验结果

注：“无”表示无精神食欲下降、无眼结膜炎、无咳嗽、无喘气等临床症状；“A”表示精神食欲下降；“B”表示结膜炎；“C”表示咳喘。

实施例5Bac-N-GP5病毒样颗粒疫苗对PRRSV经典强毒株的交叉保护性试验

评价Bac-N-GP5病毒样颗粒疫苗免疫仔猪后对PRRSV经典强毒株VR-2332毒株攻毒的免疫保护，15头蓝耳抗原抗体阴性28日龄健康仔猪分为3组，每组5头，第一组于第1天和第14天用粗提纯的Bac-N-GP5病毒样颗粒肌肉注射15μg/头/次，铝佐剂为佐剂（与抗原的比例为3:7）。第二组于第1天免疫商品化的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（CH-1R株）1头份/头（国内某公司生产），第三组设对照组免疫的为不含外源基因的pFBD空载体表达的物质与铝佐剂。于第一次免疫后28天所有猪各用强毒PRRSVVR-2332株的病毒培养液（10^4.5TCID₅₀/mL）肌注1mL+滴鼻1mL，观察临床症状并测温14日，于攻毒后14日剖检肺部病变，计算免疫保护率（发病猪判定标准：同时出现以下情形判为发病，①至少1日体温在41℃以上；②大体剖检，肺部出现片状实变）。结果显示，本发明制备的Bac-N-GP5病毒样颗粒疫苗免疫仔猪能够产生对PRRSV经典强毒株的攻毒保护，其免疫保护率达80%（表4）。相比PRRSVCH-1R经典株活疫苗，本发明的制备Bac-N-GP5病毒样颗粒疫苗更加安全有效，不存在毒力返强的风险。

表4对经典毒株的免疫保护试验结果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种重组杆状病毒，其特征在于：通过以下步骤制备：

(A)提取高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒广东分离株RNA，通过反转录获得cDNA；以cDNA为模板分别扩增编码高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒广东分离株N蛋白的基因片段PRRSV-N和GP5蛋白的基因片段PRRSV-GP5；其中，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒广东分离株的GenBank登录号：EU109503.1，扩增PRRSV-N的引物为：

上游引物1：5’-GGATCCATGCCAAATAACAACGGCAAGC-3’，

下游引物1：5’-AAGCTTTCATGCTGAGGGTGATGCTGTG-3’；

扩增PRRSV-GP5的引物为：

上游引物2：5’-CTCGAGATGTTGGGGAAGTGCTTGACC-3’，

下游引物2：5’-GGTACCCTAGAGACGACCCCATCGTTC-3’；

将片段PRRSV-N用BamHⅠ和HindⅢ双酶切回收，亚克隆到同样酶切处理的pFastBacDual载体中，构建得到pFBD-PRRSV-N重组载体；将片段PRRSV-GP5用XhoⅠ和KpnⅠ双酶切回收，亚克隆到同样酶切处理的pFBD-PRRSV-N载体上，构建得到pFBD-PRRSV-N-GP5重组表达载体；

将pFBD-PRRSV-N-GP5重组表达载体通过Bac-to-Bac系统转染到DH10感受态构建重组杆状病毒表达载体Bac-PRRSV-N-GP5；

(B)用Bac-PRRSV-N-GP5转染SF9昆虫细胞，培养转染的昆虫细胞；

(C)收获重组杆状病毒。

2.权利要求1所述的重组杆状病毒在制备具有免疫原性的PRRSV病毒样颗粒中的应用。

3.一种生产具有免疫原性的PRRSV病毒样颗粒的系统，其特征在于：包括权利要求1所述的重组杆状病毒和昆虫细胞。

4.由权利要求1所述重组杆状病毒制备得到的具有免疫原性的PRRSV病毒样颗粒。

5.权利要求4所述的具有免疫原性的PRRSV病毒样颗粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(a)用权利要求1所述的重组杆状病毒感染昆虫细胞；(b)从昆虫细胞的裂解物中分离获得病毒样颗粒。

6.权利要求4所述的具有免疫原性的PRRSV病毒样颗粒在制备预防猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的疫苗中的应用。

7.一种预防猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的疫苗，其特征在于：包含权利要求4所述的具有免疫原性的PRRSV病毒样颗粒和辅助剂；所述的辅助剂是保护剂、稳定剂或佐剂。