CN110305852A - 表达猪流行性腹泻病毒s1基因重组伪狂犬病病毒的构建 - Google Patents

表达猪流行性腹泻病毒s1基因重组伪狂犬病病毒的构建 Download PDF

Info

Publication number
CN110305852A
CN110305852A CN201910524213.7A CN201910524213A CN110305852A CN 110305852 A CN110305852 A CN 110305852A CN 201910524213 A CN201910524213 A CN 201910524213A CN 110305852 A CN110305852 A CN 110305852A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rprv
gene
virus
epidemic diarrhea
porcine epidemic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910524213.7A
Other languages
English (en)
Inventor
陈素娟
郑思文
彭大新
秦涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yangzhou University
Original Assignee
Yangzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yangzhou University filed Critical Yangzhou University
Priority to CN201910524213.7A priority Critical patent/CN110305852A/zh
Publication of CN110305852A publication Critical patent/CN110305852A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16721—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Abstract

本发明涉及生物技术领域，提供了表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建方法，用于猪伪狂犬病和流行性腹泻的防控。其构建方法包括：重组病毒rPRV‑TX‑gE‑/TK‑的构建与重组病毒rPRV‑gE‑/TK‑‑S1的构建。研制的表达猪流行性腹泻病毒主要保护性抗原基因S1基因的重组伪狂犬病毒疫苗rPRV‑gE‑/TK‑‑S1，与常规疫苗相比，不仅可以为这两种猪病的防控提供疫苗候选株，而且可以起到一针防两病的功能。

Description

表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建
技术领域
本发明涉及生物技术领域，提供了一株表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒疫苗候选株，用于猪伪狂犬病和流行性腹泻的防控。
背景技术
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种高度接触性传染病，该病以猪腹泻、呕吐、脱水为特征，不同年龄的猪群均易感染，但对哺乳仔猪的危害最为严重。自2010年以来，我国很多免疫过PEDV经典疫苗的猪群再次爆发流行性腹泻，并且仔猪的发病率和死亡率均明显升高，给我国养猪业造成了严重的经济损失，所以传统疫苗已不足以保护变异株感染的猪群。PEDV S基因编码的S蛋白属于I型膜糖蛋白，是PEDV的主要中和表位区，能够介导机体产生中和抗体，是疫苗研究中的首选靶蛋白，而S蛋白的S1区，包含病毒主要的保护性抗原表位，且它们多属于暴露性抗原表位，是免疫的优势区。
近几年，伪狂犬病毒(PRV)已被开发成强大的载体系统，PRV基因组中存在大量非必需基因，允许同时插入多个外源基因，它们不仅能够表达它们自身的保护性抗原，而且还能表达任何插入的外源基因。因为它们使用宿主机体来复制和表达蛋白质，所得到的外源基因产物在翻译后具有更高的被正确修饰或折叠的可能性。使用PRV基因缺失疫苗的风险很小，安全性高。PRV宿主比较广泛，包括猪，牛，山羊和狗等，这使得可以在多个宿主中靶向动物疾病而无需借助多种载体构建体来表达抗原。天然PRV诱导细胞免疫并引起潜伏感染。因此，rPRV可以在给定宿主中长期维持，从而提供对保护性免疫应答的持续刺激。目前已有多种类型的蛋白在重组伪狂犬病毒中得到表达，如猪瘟病毒(CSFV)的E2蛋白(Lei JL,XiaSL,Wang Y et al.2016)、猪圆环病毒2型(PCV2)的Cap蛋白(杜文娟，刘长明et al.2016)、乙型脑炎病毒(JEV)的PrM-E蛋白(王波,陈焕春et al.2013)等，以表达外源基因的PRV进行免疫，在动物模型小鼠或猪上均可提供特异性的免疫保护。2017年吴旺霞等用当前流行毒株重组伪狂犬病毒，肌肉注射免疫小鼠，发现其能够产生较好的免疫原性。但自2011年以来，我国多个省份接种现有商品化疫苗Bartha-K61株的猪群仍然发生严重的PR，意味着现有疫苗不能对当前流行株提供有效保护，毒株发生了变异。更值得关注的是，在以往的研究里PRV均被认为是不感染高等灵长类动物的，而在2018年却报道出中国上海出现首例人类感染PRV的情况。因此，对PRV的研究和防控越来越受相关学者的重视。
因此，本研究首先构建PRV gE/TK基因双缺失株，随后将PEDV S1基因插入至PRV双缺失株中，旨在构建出能够表达PEDV S1蛋白的重组伪狂犬病毒，为有效防控变异株导致的猪伪狂犬病和猪流行性腹泻病提供二联DIVA疫苗候选株。
发明内容
本研究针对当前流行的伪狂犬病毒变异毒株与流行性腹泻病毒变异毒株构建表达猪流行性腹泻病毒S1基因的重组猪伪狂犬病毒基因工程疫苗，为克服现有疫苗不能有效给当前流行毒株提供良好保护力的问题。
为实现本发明的目的，本发明采用的技术方案是：
表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建方法，步骤如下：
(一)重组病毒rPRV-TX-gE-/TK-的构建：
(1)合成针对TK基因的鉴定验证引物；
(2)提取rPRV-TX-gE-基因组DNA和pSKTKRL-GFP载体质粒；
(3)转染与纯化；
(4)双基因报告基因的剔除；
(5)双缺失株rPRV-TX-gE-/TK-的鉴定；
(6)抗原纯化；
(7)检测血清抗体；
(8)小鼠的免疫攻毒试验；
(二)重组病毒rPRV-gE-/TK--S1的构建：
(1)针对PEDV的S1基因设计并合成引物；
(2)提取病毒RNA；
(3)RT-PCR扩增病毒基因片段；
(4)利用闪电克隆的原理设计引物；
(5)目的片段的PCR扩增与载体pSKTKRL-GFP PCR线性化；
(6)构建重组质粒pSKTKRL-PEDV-S1；
(7)转染与纯化；
(8)重组病毒rPRV-gE-/TK--S1中S1基因的鉴定。
进一步的，所述针对TK基因的鉴定验证引物为：上游引物序列为TK-F，如SEQ IDNO.1所示；下游引物序列为TK-R，如SEQ ID NO.2所示。
进一步的，所述针对PEDV的S1基因设计并合成的引物为：上游引物序列为PEDV-S1-F，如SEQ ID NO.3所示；下游引物序列为PEDV-S1-R，如SEQ ID NO.4所示。
进一步的，采用磷酸钙方法进行转染。
进一步的，细胞总DNA和转移载体的量比例为10:1。
进一步的，用Cre重组酶作用于带有loxP位点的rPRV-TX-gE-/TK-/GFP基因组DNA。
进一步的，双缺失株rPRV-TX-gE-/TK-的鉴定方法为：提取rPRV-TX-gE-/TK-基因组DNA，取2μL DNA模板进行PCR扩增，同时以单基因缺失株rPRV-TX-gE-和rPRV-TX-gE-/TK-/GFP基因组DNA作为对照；体系如下：12.5μL 2×Taq Master Mix，引物TK-F、TK-R各0.5μL，SW 9.5μL；反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min 30s，共35个循环，72℃延伸10min，4℃保存；PCR扩增后，经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
进一步的，重组病毒rPRV-gE-/TK--S1中S1基因的鉴定方法为：用rPRV-gE-/TK--S1感染生长至90％单层的PK15细胞，提取病毒DNA，以rPRV-gE-/TK--S1DNA为模板，以TK基因的引物扩增重组病毒rPRV-gE-/TK--S1、rPRV-TX-gE-/TK-和rPRV-TX-gE-/TK-/GFP，反应程序：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸2min 30s，进行35个循环，最后72℃延伸10min，取PCR反应产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
进一步的，检测血清抗体的方法为：
包被：用包被液将抗原稀释：0.05mg/mL包被到96孔酶标板，100μL/孔，37℃温育2h，4℃过夜，弃去孔内液体，PBST洗涤3次，5min/次，在吸水纸上拍干；
封闭：用2％BSA作封闭液，200μL/孔，37℃温育3h，PBST洗涤3次，5min/次，在吸水纸上拍干；
加抗体：将血清按1:320稀释后加入96孔酶标板，100μL/孔，同时设阳性血清和阴性血清对照，37℃温育1h，PBST洗涤3次，5min/次，在吸水纸上拍干；
加酶标二抗：加入1:8000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃温育1h，PBST洗涤3次，5min/次，在吸水纸上拍干；
显色与终止：加入TMB的显色液，100μL/孔，室温反应10min；最终加入2M H2SO4 50μL/孔，终止反应，用酶标仪测定OD450。
本发明的另一目的是提供一种表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建方法制备的疫苗。
本发明利用已构建的带有绿色荧光蛋白EGFP标记的pSKTKRL-GFP转移载体，通过蛋白酶K消化和苯酚抽提法提取了本实验室2016年分离到的PRV-TX变异株为亲本构建的rPRV-TX-gE-单基因缺失株的总DNA，运用磷酸钙沉淀法，将细胞总DNA和转移载体的量以10:1的比例共转染PK15细胞，待细胞出现80％病变时收获病毒，通过空斑纯化法筛选得到带有报告基因的重组病毒rPRV-TX-gE-/TK-/GFP。再运用Cre重组酶剔除报告基因，经空斑纯化获得剔除报告基因的双缺失株病毒。纯化病毒TK基因的序列测定显示TK基因缺失并留下了一个loxP位点，证明双缺失株病毒构建成功，该病毒命名为rPRV-TX-gE-/TK-。
再根据GenBank发表的PEDV CV777基因序列设计引物，扩增PEDV的纤突蛋白S1基因，利用闪电克隆试剂盒通过将载体质粒pSKTKRL-GFP线性化，用PCR法将与载体质粒同源区(约15bp)导入插入片段(PEDV S1基因)两端，混合后加入重组酶，将PEDV S1基因克隆至含有PRV的TK基因上、下游同源臂的转移载体pSKTKRL-GFP中，构建重组PRV转移质粒pSKTKRL-PEDV-S1。将重组质粒pSKTKRL-PEDV-S1与构建的带有荧光标记的双缺失株病毒rPRV-TX-gE-/TK--GFP基因组DNA，采用磷酸钙转染法共转染PK15细胞，通过反向筛选EGFP阴性蚀斑，纯化得到表达PEDV S1蛋白的重组伪狂犬病毒rPRV-gE-/TK--S1，经PCR、间接免疫荧光试验(IFA)试验和Western-blot鉴定，S1基因是否已成功插入重组病毒rPRV-gE-/TK--S1的基因组中并得以表达。通过小鼠LD50的测定确定外源基因S1的插入是否影响母本株的安全性。
相对于现有技术，本申请取得了以下有益效果：
利用同源重组的方法构建表达PEDV S1蛋白的重组伪狂犬病毒rPRV-gE-/TK-S1，经PCR、间接免疫荧光试验(IFA)试验和Western-blot证实，S1基因已成功插入重组病毒rPRV-TX-gE-/TK-的基因组中并得以表达。rPRV-TX-gE-/TK-和rPRV-gE-/TK--S1的LD50均为>1×106TCID50。rPRV-gE-/TK--S1中外源基因S1的插入并未影响母本病毒的安全性。
研制的表达猪流行性腹泻病毒主要保护性抗原基因S1基因的重组伪狂犬病毒疫苗rPRV-gE-/TK--S1，与常规疫苗相比，不仅可以为这两种猪病的防控提供疫苗候选株，起到一针防两病的功能，而且它是一种DIVA的标记疫苗，有利于国家根除PR计划的实施。
该产品研制成功可替代现有的商品化重组伪狂犬病毒疫苗，具有较大的市场潜力。
附图说明
图1为重组病毒在PK15细胞上产生的荧光：A-C共转染后第1轮空斑纯化观察到的荧光(图A可见光；图B荧光；图C组图)；D-F空斑纯化后观察到的荧光(图D可见光；图E荧光；图F组图)；
图2为剔除荧光报告基因的重组病毒图：A-C共转染后第1轮空斑纯化观察到的空斑(图A可见光；图B荧光；图C组图)；D-F第6轮空斑纯化观察到的空斑(图D可见光；图E荧光；图F组图)；G-I单缺失株rPRV-TX-gE-观察到的空斑(图G可见光；图H荧光；图I组图)；
图3为rPRV-TX-gE-/TK-的PCR鉴定结果图(M：1Kb Marker；1：rPRV-TX-gE-/TK-；2：rPRV-TX-gE-；3：rPRV-TX-gE-/TK-/GFP；4：SW)；
图4免疫小鼠后抗PRV-TX抗体的ELISA检测(**表示差异极显著(p<0.01))；
图5免疫小鼠后抗PRV-SZ抗体的ELISA检测(**表示差异极显著(p<0.01))；
图6为PEDV S1基因的PCR扩增图(M：1Kb DNA Marker；1：S1基因产物；2：阴性对照)；
图7为PEDV S1基因与pSKTKRL-GFP线性化的PCR扩增结果图(M：1Kb Marker；1-2：PEDV S1基因；3：pSKTKRL-GFP)；
图8为重组质粒pSKTKRL-PEDV-S1酶切鉴定图(M：1Kb Marker；1：EcoRI/HindIII；2：EcoRI/XhoI；3：BamHI/XhoI)；
图9为重组病毒rPRV-gE-/TK--S1的纯化：A-C共转染后第1轮空斑纯化观察到的荧光空斑(图A可见光；图B荧光；图C组图)；D-F第3轮空斑纯化观察到的荧光空斑(图D可见光；图E荧光；图F组图)；G-I双缺失株rPRV-TX-gE-/TK-观察到的荧光空斑(图G可见光；图H荧光；图I组图)；
图10为重组病毒rPRV-gE-/TK--S1的PCR鉴定图(M：1Kb Marker；1：rPRV-gE-/TK--S1；2：rPRV-TX-gE-/TK-；3：rPRV-TX-gE-/TK-/GFP)；
图11为IFA检测rPRV-gE-/TK--S1中S1蛋白的表达(A-B：rPRV-gE-/TK--S1；C：PEDV阳性对照；D：rPRV-TX-gE-/TK-；E：不接毒只加血清；F：接毒不加血清；G：阴性血清；H：空白对照)；
图12为Western-blot检测PEDV S1蛋白的表达(1-2：rPRV-gE-/TK--S1；3：rPRV-TX-gE-/TK-)。
具体实施方式
实施例1
(一)重组病毒rPRV-TX-gE-/TK-的构建
(1)引物的设计
合成针对TK基因的鉴定验证引物，上下游引物5'端分别有BamHI和XhoI酶切位点(划横线处为酶切位点)，引物由南京擎科新业生物技术有限公司合成：
TK-F 5'-AAAGGATCCGCATCCTCCGGATCTACCTC-3'
TK-R 5'-TTTCTCGAGGCGTCGAAGGCCACGAGCT-3'
(2)rPRV-TX-gE-基因组DNA的提取和pSKTKRL-GFP载体质粒的提取
将病毒液接种到长至80％的单层PK15细胞，待细胞病变达80％以上时弃去培养基，PBS缓冲液洗涤三次，加入裂解液，室温作用10min左右，将细胞裂解物转移至50mL离心管，37℃水浴2h；加入等体积的酚氯仿(饱和酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)轻轻混匀，8000r/min离心15min；吸取上清于新离心管中，再加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)抽提杂蛋白，8000r/min离心5min；吸取上清液，加入2倍体积预冷的无水乙醇和1/10体积的3moL/L醋酸钠(pH5.2)，-20℃作用20min沉淀基因组DNA，4500r/min离心5min，弃上清，加入1mL 70％乙醇洗涤沉淀，4500r/min离心10min，弃上清，瞬离，吸干上清，自然干燥后溶解于一定量的TE溶液中，取少量DNA用分光光度计测定核酸浓度，等量分装，-20℃保存备用。同时，按照QIAGEN公司的质粒提取试剂盒QIAprep Spin Miniorep Kit说明书提取转移载体pSKTKRL-GFP。
(3)转染与纯化
采用磷酸钙方法进行转染，具体步骤如下，预先在60mm平皿中培养PK15细胞使之生长至80％-90％，于转染前3-4h更换新鲜的生长培养基。
在2mL指形管中依次加入下列试剂：超纯水388μL，rPRV-TX-gE-基因组DNA 10μg，转移载体pSKTKRL-GFP 1μg，TE溶液补足至50μL；混匀后从管底缓慢加入62μL 2mol/LCaCl2，吹泡混合；逐滴加入500μL 2×HBSP缓冲液，用移液枪轻轻从管底吹出数个气泡以混匀溶液；室温静置30min，期间可观察到白色浑浊。将CaPO4-DNA沉淀轻轻悬起混匀，每个平皿加入500μL混合液，边滴加边摇转入平皿中，置37℃5％CO2培养箱中继续培养。同时设PRV-TX基因组共转染为阳性对照。
培养4h后，弃去平皿中的转染液，用PBS缓冲液洗涤一次，加入1mL新鲜配制的15％甘油休克液，室温作用2min，吸去休克液，立即用PBS缓冲液洗涤三次，加入含4％胎牛血清的DMEM培养基，培养24h后换成维持液，置37℃5％CO2培养箱中继续培养。转染24h后开始出现病变，在荧光显微镜下观察可见，部分病变细胞呈现绿色荧光；PRV-TX基因组DNA共转染后部分病变细胞呈现绿色荧光，初步认为转染成功。待细胞出现80％病变后收获病毒液，取上清稀释后接种PK15细胞，反复空斑纯化病毒，直至所有病变细胞均呈现绿色荧光，获得重组病毒rPRV-TX-gE-/TK-/GFP，见图1。
(4)双基因报告基因的剔除
用Cre重组酶作用于带有loxP位点的rPRV-TX-gE-/TK-/GFP基因组DNA，反应体系如下：2.0μL 10×Cre Buffer，2.5μL Cre Recombinase(1U/μL)，10μg重组病毒rPRV-TX-gE-/TK-/GFP基因组DNA，SW补足至20μL。37℃下作用1h后再次抽提DNA，使用磷酸钙法转染PK15细胞，筛选没有荧光的病变细胞进行空斑纯化，经过6轮筛选，获得无荧光的双基因缺失株rPRV-TX-gE-/TK-。荧光下观察，剔除EGFP的双基因缺失株rPRV-TX-gE-/TK-在PK15细胞上的所有病变部位均不呈现绿色荧光，见图2。
(5)双缺失株rPRV-TX-gE-/TK-的鉴定
常规方法提取rPRV-TX-gE-/TK-基因组DNA，取2μL DNA模板进行PCR扩增，同时以单基因缺失株rPRV-TX-gE-和rPRV-TX-gE-/TK-/GFP基因组DNA作为对照。体系如下：12.5μL 2×Taq Master Mix，引物TK-F、TK-R各0.5μL，SW 9.5μL。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min 30s，共35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。PCR扩增后，经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，单缺失株rPRV-TX-gE-的TK基因扩增大小为1480bp，rPRV-TX-gE-/TK-和rPRV-TX-gE-/TK-/GFP株的TK基因扩增大小分别为1018bp和2632bp，与预期相符，见图3。测序结果表明，rPRV-TX-gE-/TK-在TK基因内部留下了一个loxP位点。
(6)抗原的纯化
将500mL的病毒液反复冻融3次，6000r/min 4℃离心30min，去除细胞杂质和沉淀。将收获的上清液装入处理过的透析袋内，用PEG12000包埋透析袋，4℃作用数小时，待透析袋内液体量浓缩至原来的1/5-1/10时将其吸出，-70℃保存备用。采用蔗糖密度梯度超速离心法纯化病毒，方法如下：将浓缩的病毒上清液28700r/min 4℃离心2.5h，收集病毒沉淀，加入适量的0.1M PBS重悬沉淀溶解过夜。铺设蔗糖梯度，在离心管中依次缓慢加入60％至20％(m/v)蔗糖，其中20％蔗糖位于最上层，4℃静置过夜。将上一步重悬的病毒液轻轻加入梯度界面上，28700r/min离心3h。小心取出离心管，可见在40％-60％界面处出现了1条明显的乳白色蛋白条带，用移液枪吸取蛋白带，用5倍体积的0.1M PBS重悬超速离心，28700r/min 4℃离心2.5h除去蔗糖，收集沉淀溶解过夜，分光光度计测定蛋白浓度，纯化后的PRV-TX浓度为7.42mg/mL；PRV-SZ浓度为4.18mg/mL。
(7)ELISA检测血清抗体
包被：用包被液将抗原稀释：0.05mg/mL包被到96孔酶标板，100μL/孔，37℃温育2h，4℃过夜，弃去孔内液体，PBST洗涤3次，5min/次，在吸水纸上拍干。
封闭：用2％BSA作封闭液，200μL/孔，37℃温育3h，PBST洗涤3次，5min/次，在吸水纸上拍干。
加抗体：将血清按1:320稀释后加入96孔酶标板，100μL/孔，同时设阳性血清和阴性血清对照，37℃温育1h，PBST洗涤3次，5min/次，在吸水纸上拍干。
加酶标二抗：加入1:8000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃温育1h，PBST洗涤3次，5min/次，在吸水纸上拍干。
显色与终止：加入TMB的显色液，100μL/孔，室温反应10min；最终加入2M H2SO4 50μL/孔，终止反应，用酶标仪测定OD450。以P/N值(阳性孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性；P/N值小于1.5为阴性。结果显示，rPRV-TX-gE-/TK-免疫组在免疫后14d和21d均可检测到针对变异毒株PRV-TX与经典毒株PRV-SZ较高的特异性抗体；Bartha-K61免疫组在免疫后14d和21d可检测到针对经典毒株PRV-SZ较高的特异性抗体，而针对变异毒株PRV-TX的特异性抗体较低。见图4、图5。
(8)应用：小鼠的免疫攻毒试验
将rPRV-TX-gE-/TK-和Bartha-K61以104TCID50的剂量大腿后肢肌肉注射接种6周龄的BALB/C小鼠，每组10只并称重，同时设对照小鼠每只注射100μL DMEM。免疫后每天观察小鼠的临床症状，于7d、14d和21d称重，免疫后21d分别用PRV-SZ和PRV-TX以104TCID50的剂量攻毒，攻毒后连续观察7d。结果显示，变异毒株PRV-TX攻毒后7d，rPRV-TX-gE-/TK-和BarthaK61组的保护率分别为100％和0；经典毒株PRV-SZ攻毒后7d，rPRV-TX-gE-/TK-和Bartha K61组的保护率分别为20％和70％。表明，rPRV-TX-gE-/TK-双缺失株针对变异毒株的致死性攻击7d内能够提供完全保护；对经典毒株的攻毒也能起到一定的保护作用。而Bartha-K61株只对经典毒株有较好的保护作用，对目前流行的变异毒株没有保护作用。见表1。
表1攻毒后缺失株针对PRV-SZ与PRV-TX的免疫保护
(二)重组病毒rPRV-gE-/TK--S1的构建
(1)引物的设计
根据实验目的，针对PEDV的S1基因设计引物。上下游引物5'端分别有BamHI和EcoRI酶切位点(划横线处为酶切位点)，引物由南京擎科新业生物技术有限公司合成：
PEDV-S1-F CGCGGATCCAATGAAGTCTTTAAATTACTTCTGGTTG
PEDV-S1-R GGCGAATTCAATACTCATACTAAAGTTGGTGGG
(2)病毒RNA的提取
取处理好的PEDV组织样品上清200μL，加入800μL Trizol，上下颠倒混匀，室温静置15min；加入200μL氯仿，剧烈震荡30s，室温放置3min，12000r/min 4℃离心10min上清于新的EP管中，加入两倍体积的异丙醇混匀，在-20℃放置20min；12000r/min 4℃离心10min；弃上清，加入1mL 75％乙醇，颠倒混匀，12000r/min 4℃离心10min弃上清，吹干，加30μLDEPC水溶解RNA，反转录或-80℃保存备用。以RNA为模板在M-MLV反转录酶的作用下逆转录获得病毒cDNA。
(3)RT-PCR扩增病毒基因片段
取2μL cDNA模板进行PCR扩增，体系如下：12.5μL 2×Taq Master Mix，引物PEDV-S1-F、PEDV-S1-R各1μL，SW 8.5μL。反应程序：95℃预变性30s；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸2min 30s，进行35个循环，最后72℃延伸10min。取PCR扩增产物25μL，点样于1％琼脂糖凝胶，以1Kb DNA Marker作为标准参照，切胶送测序，扩增出大小约2376bp的片段，见图6。
(4)利用闪电克隆的原理设计引物
本发明根据(3)测序结果以及GenBank登录的PEDV S1基因序列与转移载体序列，在插入片段引物两端分别加入线性化转移载体pSKTKRL约15bp的重叠区域，并通过优化PEDV S1基因的碱基序列，在S1区前端加Kozak序列，提高其在真核载体中的蛋白表达能力，分别设计引物扩增S1基因(2376bp)与转移载体pSKTKRL-GFP(4947bp)。引物由南京擎科新业生物技术有限公司合成：
表2 PEDV S1基因和pSKTKRL-GFP载体扩增引物
(5)目的片段的PCR扩增与载体pSKTKRL-GFP PCR线性化
以(2)反转录(RT)的cDNA为模板，PEDV-S1-F1和PEDV-S1-R1为引物，然后进行目的基因的扩增；同时以pSKTKRL-GFP质粒为模板，pSKTKRL-F和pSKTKRL-R为引物进行PCR扩增。体系如下：12.5μL 2×phanta Max Buffer，dNTP Mix、高保真酶和上、下游引物各0.5μL，3.0μL模板，SW 7.5μL。反应程序：95℃预变性30s；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸2min 30s，进行35个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，分别扩增出PEDV S1基因大小为2376bp和转移载体pSKTKRL大小为4947bp的片段，与预期结果相符，见图7。阳性片段切胶，使用Agarose Gel DNA Purification Kit回收。
(6)重组质粒pSKTKRL-PEDV-S1的构建
以(5)中得到的胶回收产物为模板，按照闪电克隆说明书建立一个10μL闪电克隆反应体系，体系如下：线性化载体1μL，目的片段2μL，Lightening Cloning Master Mix 5μL，SW 2μL。在50℃水浴锅内放置45min。完成后放置在冰上进行下一步转化。冰上溶解100μLTrans-T1感受态细菌，加入2μL冰预冷的闪电克隆反应液，冰上静置30min。42℃水浴锅内热击45s，立即置于冰上2min。往里面加入950μL平衡至室温的LB培养液(不含抗生素)，37℃摇床中振荡(220rpm)培养60min。取100μL涂平板(含氨苄抗生素)，将平板倒置于37℃培养箱培养过夜。挑斑、摇菌，按照QlAGEN公司的质粒提取试剂盒QlAprep Spin Miniorep KIt说明书操作提取质粒，分别用EcoRI/HindIII、EcoRI/XhoI和BamHI/XhoI进行双酶切鉴定，构建的重组质粒大小为7324bp，用EcoRI和HindIII酶切可以得到大小约为3249bp和4075bp的片段；EcoRI和XhoI酶切可以得到大小约为3897bp和3427bp的片段；BamHI和XhoI酶切可以得到大小约为4324bp和3000bp的片段，所得结果与预期一致，说明构建的质粒正确，见图8。
(7)转染与纯化
采用磷酸钙方法进行转染，具体步骤如下，预先在60mm平皿中培养PK15细胞使之生长至80％-90％，于转染前3-4h更换新鲜的生长培养基。
在2mL指形管中依次加入下列试剂：超纯水388μL，rPRV-TX-gE-/TK-/GFP基因组DNA10μg，重组质粒pSKTKRL-PEDV-S1 1μg，TE溶液补足至50μL；混匀后从管底缓慢加入62μL2mol/L CaCl2，吹泡混合；逐滴加入500μL 2×HBSP缓冲液，用移液枪轻轻从管底吹出数个气泡以混匀溶液；室温静置30min，期间可观察到白色浑浊。将CaPO4-DNA沉淀轻轻悬起混匀，每个平皿加入500μL混合液，边滴加边摇转入平皿中，置37℃5％CO2培养箱中继续培养。同时设rPRV-TX-gE-/TK-/GFP基因组共转染为阴性对照。
培养4h后，弃去平皿中的转染液，用PBS缓冲液洗涤一次，加入1mL新鲜配制的15％甘油休克液，室温作用2min，吸去休克液，立即用PBS缓冲液洗涤三次，加入含4％胎牛血清的DMEM培养基，培养24h后换成维持液，置37℃5％CO2培养箱中继续培养。转染24h后开始出现病变，在荧光显微镜下观察，部分病变细胞不呈现绿色荧光，初步认为转染成功。待细胞出现80％病变后收获病毒液，取上清稀释后接种PK15细胞，反复空斑纯化病毒，直至所有病变细胞均不呈现绿色荧光，命名该重组毒为rPRV-gE-/TK--S1，见图9。
(8)重组病毒rPRV-gE-/TK--S1中S1基因的鉴定
用rPRV-gE-/TK--S1感染生长至90％单层的PK15细胞，按常规方法提取病毒DNA，以rPRV-gE-/TK--S1DNA为模板，以TK基因的引物扩增重组病毒rPRV-gE-/TK--S1、rPRV-TX-gE-/TK-和rPRV-TX-gE-/TK-/GFP，反应程序：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸2min 30s，进行35个循环，最后72℃延伸10min。取PCR反应产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，大小分别为4278bp、1018bp和2632bp，与预期相符，见图10。
用rPRV-gE-/TK--S1感染生长至90％单层的Vero细胞，同时设野毒PEDV阳性对照与双缺失株rPRV-TX-gE-/TK-为阴性对照。培养至细胞出现病变后弃去培养基，用PBS洗涤3次，每次5min。加入-20℃预冷的甲醇200μL/孔4℃固定15min，弃去冷甲醇；用PBS洗涤3次，每次5min，拍干。加入1:1000稀释的单抗腹水，200μL/孔，37℃作用1h；PBS洗涤3次，每次5min，拍干。避光加入1:500稀释的羊抗鼠FITC-IgG，50μL/孔，作用1h；用PBS洗涤3次，每次5min，拍干，在荧光显微镜下观察，见图11。
用rPRV-gE-/TK--S1感染生长于6孔板单层的PK15细胞，设双缺失株rPRV-TX-gE-/TK-作对照，待细胞完全病变后收样，与SDS上样缓冲液混合煮沸10min制样，使用中国农业科学院上海兽医研究所童光志研究员惠赠的PEDV S1单抗腹水作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗，进行Western-blot。结果可见rPRV-gE-/TK--S1有明显的反应条带，S1基因在伪狂犬病毒中成功表达，见图12。
(9)应用：重组病毒rPRV-gE-/TK--S1的半数致死量测定试验
将重组病毒rPRV-gE-/TK--S1、缺失株rPRV-TX-gE-/TK-与商品化弱毒活疫苗Bartha-K61，分别按103TCID50、104TCID50、105TCID50和106TCID50的剂量大腿后肢肌肉注射接种6周龄的BALB/C小鼠，每组5只，同时设健康对照组，每只小鼠注射100μL DMEM。接种病毒后连续观察两周，记录病情及死亡情况，用Karber法测定毒株的半数致死量(LD50)。结果显示Bartha-K61、rPRV-TX-gE-/TK-和rPRV-gE-/TK--S1的LD50分别为3.5×104TCID50、>1×106TCID50和>1×106TCID50，说明rPRV-TX-gE-/TK-和rPRV-gE-/TK--S1毒株在106TCID50高剂量下对小鼠仍然是安全的，且S1基因的插入并未改变rPRV-TX-gE-/TK-的致病性，见表3。
表3重组毒的半数致死量
注：LD50＝lg-1[Xm-i(∑P-0.5)]，式中Xm为最大剂量的对数，i为相邻两组剂量对数值之差，∑P为各组动物死亡率之和。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaggatccg catcctccgg atctacctc 29
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttctcgagg cgtcgaaggc cacgagct 28
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcggatcca atgaagtctt taaattactt ctggttg 37
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcgaattca atactcatac taaagttggt ggg 33

Claims (10)

1.表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建方法，其特征在于，步骤如下：
(一)重组病毒rPRV-TX-gE-/TK-的构建：
(1)合成针对TK基因的鉴定验证引物；
(2)提取rPRV-TX-gE-基因组DNA和pSKTKRL-GFP载体质粒；
(3)转染与纯化；
(4)双基因报告基因的剔除；
(5)双缺失株rPRV-TX-gE-/TK-的鉴定；
(6)抗原纯化；
(7)检测血清抗体；
(8)小鼠免疫攻毒试验；
(二)重组病毒rPRV-gE-/TK--S1的构建：
(1)针对PEDV的S1基因设计并合成引物；
(2)提取病毒RNA；
(3)RT-PCR扩增病毒基因片段；
(4)设计引物；
(5)目的片段的PCR扩增与载体pSKTKRL-GFP PCR线性化；
(6)构建重组质粒pSKTKRL-PEDV-S1；
(7)转染与纯化；
(8)重组病毒rPRV-gE-/TK--S1中S1基因的鉴定。
2.根据权利要求1所述的表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建方法，其特征在于，所述针对TK基因的鉴定验证引物为：上游引物序列为TK-F，如SEQ ID NO.1所示；下游引物序列为TK-R，如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建方法，其特征在于，所述针对PEDV的S1基因设计并合成的引物为：上游引物序列为PEDV-S1-F，如SEQ ID NO.3所示；下游引物序列为PEDV-S1-R，如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建方法，其特征在于，采用磷酸钙方法进行转染。
5.根据权利要求4所述的表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建方法，其特征在于，细胞总DNA和转移载体的量比例为10:1。
6.根据权利要求1所述的表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建方法，其特征在于，用Cre重组酶作用于带有loxP位点的rPRV-TX-gE-/TK-/GFP基因组DNA。
7.根据权利要求1所述的表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建方法，其特征在于，双缺失株rPRV-TX-gE-/TK-的鉴定方法为：提取rPRV-TX-gE-/TK-基因组DNA，取2μL DNA模板进行PCR扩增，同时以单基因缺失株rPRV-TX-gE-和rPRV-TX-gE-/TK-/GFP基因组DNA作为对照；体系如下：12.5μL 2×Taq Master Mix，引物TK-F、TK-R各0.5μL，SW 9.5μL；反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min 30s，共35个循环，72℃延伸10min，4℃保存；PCR扩增后，经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
8.根据权利要求1所述的表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建方法，其特征在于，重组病毒rPRV-gE-/TK--S1中S1基因的鉴定方法为：用rPRV-gE-/TK--S1感染生长至90％单层的PK15细胞，提取病毒DNA，以rPRV-gE-/TK--S1 DNA为模板，以TK基因的引物扩增重组病毒rPRV-gE-/TK--S1、rPRV-TX-gE-/TK-和rPRV-TX-gE-/TK-/GFP，反应程序：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸2min 30s，进行35个循环，最后72℃延伸10min，取PCR反应产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
9.根据权利要求1所述的表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建方法，其特征在于，检测血清抗体的方法为：
包被：用包被液将抗原稀释：0.05mg/mL包被到96孔酶标板，100μL/孔，37℃温育2h，4℃过夜，弃去孔内液体，PBST洗涤3次，5min/次，在吸水纸上拍干；
封闭：用2％BSA作封闭液，200μL/孔，37℃温育3h，PBST洗涤3次，5min/次，在吸水纸上拍干；
加抗体：将血清按1:320稀释后加入96孔酶标板，100μL/孔，同时设阳性血清和阴性血清对照，37℃温育1h，PBST洗涤3次，5min/次，在吸水纸上拍干；
加酶标二抗：加入1:8000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃温育1h，PBST洗涤3次，5min/次，在吸水纸上拍干；
显色与终止：加入TMB的显色液，100μL/孔，室温反应10min；最终加入2M H2SO4 50μL/孔，终止反应，用酶标仪测定OD450。
10.根据权利要求1-9所述的表达猪流行性腹泻病毒S1基因重组伪狂犬病病毒的构建方法制备的疫苗。
CN201910524213.7A 2019-06-18 2019-06-18 表达猪流行性腹泻病毒s1基因重组伪狂犬病病毒的构建 Pending CN110305852A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910524213.7A CN110305852A (zh) 2019-06-18 2019-06-18 表达猪流行性腹泻病毒s1基因重组伪狂犬病病毒的构建

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910524213.7A CN110305852A (zh) 2019-06-18 2019-06-18 表达猪流行性腹泻病毒s1基因重组伪狂犬病病毒的构建

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110305852A true CN110305852A (zh) 2019-10-08

Family

ID=68076472

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910524213.7A Pending CN110305852A (zh) 2019-06-18 2019-06-18 表达猪流行性腹泻病毒s1基因重组伪狂犬病病毒的构建

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110305852A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111607572A (zh) * 2020-05-27 2020-09-01 上海市农业科学院 一种猪流行性腹泻病毒重组疫苗株及其制备方法
CN113637648A (zh) * 2021-07-29 2021-11-12 河南农业大学 同时表达pedv变异株s1基因cs区和猪il-18的重组猪伪狂犬病毒株及其应用
CN114317815A (zh) * 2021-09-30 2022-04-12 江苏蓬祥畜禽生态养殖有限公司 一种用于扩增猪流行性腹泻病毒s基因n末端高变区的pcr方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107345222A (zh) * 2017-06-27 2017-11-14 浙江省农业科学院 表达猪流行性腹泻病毒s1蛋白的重组伪狂犬病毒及其构建方法和应用
CN107815441A (zh) * 2017-08-31 2018-03-20 浙江大学 一种ⅱ型伪狂犬病毒减毒株及其制备方法和应用
CN109337874A (zh) * 2018-12-10 2019-02-15 四川华神兽用生物制品有限公司 一种重组猪伪狂犬病毒及其应用和重组猪伪狂犬病活疫苗

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107345222A (zh) * 2017-06-27 2017-11-14 浙江省农业科学院 表达猪流行性腹泻病毒s1蛋白的重组伪狂犬病毒及其构建方法和应用
CN107815441A (zh) * 2017-08-31 2018-03-20 浙江大学 一种ⅱ型伪狂犬病毒减毒株及其制备方法和应用
CN109337874A (zh) * 2018-12-10 2019-02-15 四川华神兽用生物制品有限公司 一种重组猪伪狂犬病毒及其应用和重组猪伪狂犬病活疫苗

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
姜平 主编: "《兽医生物制品学 第2版》", 31 July 2003, 中国农业出版社 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111607572A (zh) * 2020-05-27 2020-09-01 上海市农业科学院 一种猪流行性腹泻病毒重组疫苗株及其制备方法
CN113637648A (zh) * 2021-07-29 2021-11-12 河南农业大学 同时表达pedv变异株s1基因cs区和猪il-18的重组猪伪狂犬病毒株及其应用
CN114317815A (zh) * 2021-09-30 2022-04-12 江苏蓬祥畜禽生态养殖有限公司 一种用于扩增猪流行性腹泻病毒s基因n末端高变区的pcr方法
CN114317815B (zh) * 2021-09-30 2023-10-20 江苏蓬祥畜禽生态养殖有限公司 一种用于扩增猪流行性腹泻病毒s基因n末端高变区的pcr方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103756977B (zh) 猪伪狂犬病变异株gE和gI基因缺失病毒株及其应用
CN110551695A (zh) 非洲猪瘟病毒四基因缺失弱毒株及其应用
CN102994458B (zh) 猪伪狂犬病病毒强毒株、其基因缺失疫苗株及其应用
CN104877972B (zh) 一种重组猪伪狂犬病毒gE/gI双基因缺失株及其应用
CN104826103B (zh) 一种猪伪狂犬病病毒疫苗
CN104830810B (zh) 一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE/gI三基因缺失株
WO2022007742A1 (zh) 一种重组的伪狂犬病病毒及其疫苗组合物
CN110305852A (zh) 表达猪流行性腹泻病毒s1基因重组伪狂犬病病毒的构建
CN107841507A (zh) 一种高效表达的猪圆环病毒2型Cap‑穿膜肽融合蛋白基因及其应用
CN105368791A (zh) 一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用
CN102757942A (zh) A型口蹄疫重组疫苗株及其制备方法和应用
CN104561049A (zh) 一种表达猪细小病毒vp2蛋白的重组杆状病毒及制备方法与应用
CN103509761B (zh) 表达猪圆环病毒ⅱ型orf2基因的重组猪伪狂犬病毒毒株及其制备方法
CN102787100B (zh) 一种高繁殖能力猪圆环病毒2型毒株及其应用
CN106244602A (zh) 一种携带两个g基因和vp2基因的重组狂犬病病毒及其应用
CN109207441A (zh) 重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型Cap蛋白及其构建方法与引物
CN102363769A (zh) 鸡马立克氏病毒Meq基因缺失疫苗株，其构建方法及应用
CN105695423B (zh) 表达传染性法氏囊病毒vp2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株及其构建方法和应用
CN101210248A (zh) 一种ILTV gD糖蛋白核苷酸序列和氨基酸序列及其重组的病毒疫苗以及该疫苗的应用
CN105400745B (zh) 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程毒株及其灭活疫苗和疫苗制备方法
CN101914502A (zh) Ⅰ型犬腺病毒弱毒疫苗株及其应用
CN107881153A (zh) 一种o型口蹄疫耐酸疫苗毒株及其构建方法
CN104436187A (zh) 表达兔病毒性出血症病毒vp60蛋白疫苗
CN102363770A (zh) 融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素的重组杆状病毒及其亚单位疫苗
CN106929487A (zh) 一种口蹄疫病毒嵌合病毒样颗粒及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20191008