CN104830810B - 一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE/gI三基因缺失株 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种猪伪狂犬病病毒疫苗，由抗原和保护剂组成的，其中抗原包含有由保藏编号为CGMCC No.10266的猪伪狂犬病病毒株进行毒力基因TK、gE和gI缺失后制成的减毒病毒株。本发明制备的疫苗可有效预防猪伪狂犬病，而且作为抗原的猪伪狂犬病病毒为基因缺失株，通过水平传播感染在小鼠体连续传代，均未见毒力返强现象，遗传性稳定，符合猪伪狂犬病病毒缺失疫苗株无毒力返强的标准，制成的疫苗能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。

Description

一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE/gI三基因缺失株

技术领域

本发明属于家畜疫苗制备技术领域，具体涉及一种猪伪狂犬病病毒疫苗。

背景技术

猪伪狂犬病病毒PRV(Pseudorabies virus)属于疱疹病毒科a疱疹病毒亚科水泡病毒属猪疱疹病毒I型，猪是该病毒的唯一自然宿主，引起猪的伪狂犬病(Pseudorabies,PR)。该病在猪群多呈暴发流行，主要危害母猪群，引起母猪流产或垂直传播给仔猪，造成初生仔猪大量死亡，给我国乃至全球的养猪业带来了巨大的经济损失。目前尚无治疗PR的有效药物，因此疫苗接种成为控制该病发生和流行的主要措施。世界上使用最广泛的疫苗主要是PRV Bartha-K61株疫苗，然而近几年我国猪伪狂犬疫病流行现状为现有该疫苗不能完全保护新流行PRV的攻击，给免疫猪场造成了一定的经济损失。因此，需要提供最新流行毒株制备的疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪伪狂犬病病毒疫苗，即由筛选出的猪伪狂犬病病毒基因缺失株作为抗原制备的疫苗，本发明的疫苗对目前流行的猪伪狂犬病病毒的攻击能够提供良好的免疫保护效力。

本发明的猪伪狂犬病病毒疫苗，由抗原和保护剂组成的，其中抗原包含有由保藏编号为CGMCC No.10266的猪伪狂犬病病毒株进行毒力基因缺失后制成的减毒病毒株。

所述的毒力基因优选为TK、gE和gI基因。

其中的保护剂为目前使用的病毒疫苗用保护剂，其一种实施例具体成分为蔗糖和明胶的水溶液，其在疫苗中的质量百分比终浓度分别为20％和4.8％。

上述的疫苗中加入了抗生素，青霉素、链霉素终浓度为200单位/ml；

上述的疫苗的制备方法，是采用基因工程的方法将猪伪狂犬病病毒基因组的毒力基因进行缺失，在细胞上进行拯救，扩毒获得的病毒液，加入保护剂制成的。

本发明制备的疫苗可有效预防猪伪狂犬病，而且作为抗原的猪伪狂犬病病毒为基因缺失株，通过水平传播感染在小鼠体连续传代，均未见毒力返强现象，遗传性稳定，符合猪伪狂犬病病毒缺失疫苗株无毒力返强的标准，制成的疫苗能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本领域的普通技术人员在本发明技术方案的基础上，可以选用本领域常用的方法步骤，而不仅限于本发明说明书实施例的具体记载。

实施例1：猪伪狂犬病病毒株的选育

近年来，我国多个猪场都发生了伪狂犬病，其中大部分是种猪场，而发病猪群之前已经注射了伪狂犬疫苗，推测感染的病毒发生了变异；因此从发病猪群中进行了猪伪狂犬病毒的筛选。

取发病猪内脏样本，包括：心脏、肝脏、肺脏、脾脏、扁桃体和淋巴结等。将内脏样本与PBS(0.1M,pH7.2)以V/V1:5制成匀浆，反复冻融3次，3000r/min离心15min，取上清中加双抗，37℃感作1h，经0.22μm滤膜过滤除菌。取1ml病毒滤液接种于长成单层的Vero细胞，盲传三代，观察细胞病变(CPE)。将出现CPE的细胞培养液进行空斑纯化，纯化后的病毒分装保存至-70℃备用，并测定病毒含量。选取作为疫苗研制的候选毒株，将猪伪狂犬病病毒QD株(疱疹病毒Ⅰ型Porcine herpesvirus TypeⅠ)已于2015年3月6日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10266。

对于本发明筛选的毒株进行PCR检测，测序后进行blast分析，发现保藏编号为CGMCC No.10266的猪伪狂犬病病毒的gE基因与2012年之后报道的猪伪狂犬病病毒的相对应的序列虽然存在至少2个氨基酸的差异，但是亲缘关系较近，均处于一个相对独立的分支中，与之前分离的毒株亲缘关系较远。且与最近分离的毒株具有相同的分子特征，即在gE基因第48位和第492-496位各有1个天冬氨酸的插入，其他报道也证实也这一点。而以前分离到的毒株只个别有一个位置插入氨基酸，绝大部分没有插入。因此可以推测上述的差异正是导致已有的猪伪狂犬病病毒疫苗免疫效果不佳的原因所在。

该毒株作100倍稀释后，与等量猪伪狂犬病病毒抗血清中和，病毒均能被高免血清特异性中和；而与等量猪细小病毒、猪流感病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒抗血清中和组，细胞呈现明显的细胞病变，可见该病毒特异性好。该毒株制备的疫苗免疫BALB/C小鼠后，能降低小鼠的死亡率。

实施例2：重组猪伪狂犬病毒TK/gE/gI双基因缺失株的构建

从分离的猪伪狂犬病病毒(CGMCC No.10266)中提取该分离株的DNA，采用基因工程的方法对该分离株进行毒力基因TK、gE和gI基因的缺失，并在细胞上进行拯救后命名为PRV/TK^-/gE^-/gI^-，繁毒，加入保护剂后作为种子毒。具体实施方式如下：

1 PCR引物

参考PRV全基因组序列(BK001744),自行合成系列引物,分别用来扩增TK基因左右同源臂，以及位于US7(gI)基因和US8(gE)基因两侧(含部分gI和gE基因)的可用于同源重组的左臂片段(L)和右臂片段(R)。另外同时设计引物扩增EGFP和EGFP真核表达盒,以及用于鉴定基因缺失的引物。引物序列及预期PCR产物的大小见表1。

表1：本研究中用到的引物

2 TK基因转移载体的构建

以PRV QD株基因组为模板，利用引物TKLF/TKLR和TKRF/TKRR，分别扩增出位于TK两侧的序列(含部分TK基因)作为左右重组臂TKL、TKR，其中TKL、TKR的一端分别带有一个loxP位点。将其克隆到pMD19-T后对其进行PCR和酶切鉴定，鉴定正确后测序，对测序正确的阳性克隆T-TKL采用Hind III和Pst I进行双酶切，将该片段克隆到同样酶切处理的pBluescript SK载体上，鉴定正确后采用Spe I和Xba I分别对该重组质粒和连有右侧同源臂的重组质粒载体进行双酶切，分别回收含有左侧同源臂的线性化重组质粒和右侧同源臂，将二者进行连接。PCR和酶切进行鉴定。鉴定正确后送测序，测序结果正确的命名为pSKTKLR。

以pCDNA 3.1-EGFP质粒为模板，采用引物EorfF/EorfR扩增EGFP阅读框，连入真核表达载体pVAX1，鉴定正确后采用引物cassetteF/cassetteR扩增出含有EGFP的真核表达盒，连入pMD19-T载体，鉴定正确后命名为pMDEV。

采用Pst I和Spe I对pMDEV进行双酶切，回收真核表达盒，连入同样双酶切的pSKTKLR，鉴定正确后即为TK基因转移载体，命名为pSKTK-EGFP。

3 TK基因单缺失株病毒的构建及纯化拯救

3.1 转染

重组病毒拯救在六孔细胞培养板上进行，待Vero细胞长满90％时进行转染。取PRVQD株基因组3μg，与1μg转移质粒pSKTK-EGFP混合后，按常规方法共转染，详细方法参见Lipofectamine^TM 2000说明书。同时设仅含转移质粒的对照组。

3.2 鉴定

PRV QD株基因组与pSKTK-EGFP共转染48h后，观察转染细胞病变形成情况及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有细胞病变和绿色荧光，初步判断重组病毒拯救成功。重组病毒经噬斑纯化和PCR鉴定，命名为PRV/TK^-/EGFP。

3.3 单缺失株报告基因的剔除

利用Cre-loxP系统介导的位点特异性重组技术剔除报告基因EGFP。取10μg经Cre酶处理过的DNA，采用磷酸钙方法转染Vero细胞，置37℃CO₂培养箱中培养2-3d，待细胞产生80％病变时收获病毒液。将病毒液反复冻融三次后取上清，按2uL/孔接种于24孔板长成单层的Vero细胞，在幵始出现细胞病变时铺上低熔点琼脂糖，荧光显微镜下挑取没有荧光的空斑。如此反复的纯化病毒，直至所有病毒空斑均不带有绿色突光，命名该缺失株为PRV/TK^-。

3.4 PRV/TK^-的鉴定

提取PRV/TK^-基因组DNA，用引物TKF/TKR和引物gBF/gBR进行PCR扩增，鉴定TK基因内部片段是否缺失，设亲本株、PRV/TK^-/EGFP基因组DNA作为对照。

4 gE和gI基因转移载体的构建

以PRV QD株基因组为模板，利用引物gEILF/TKLR和gEIRF/TKRR，分别扩增出位于gE和gI两侧的序列(含部分gE和gI基因)作为左右重组臂gEIL、gEIR,其中gEIL、gEIR的一端分别带有一个loxP位点。将其克隆到pMD19-T后对其进行PCR和酶切鉴定，鉴定正确后测序，对测序正确的阳性克隆T-gEIL采用Hind III和Pst I进行双酶切,将该片段克隆到同样酶切处理的pBluescript SK载体上，鉴定正确后采用Spe I和Xba I分别对该重组质粒和连有右侧同源臂的重组质粒载体进行双酶切，分别回收含有左侧同源臂的线性化重组质粒和右侧同源臂，将二者进行连接。PCR和酶切进行鉴定。鉴定正确后送测序，测序结果正确的命名为pSKgEILR。

以pCDNA 3.1-EGFP质粒为模板，采用引物EorfF/EorfR扩增EGFP阅读框，连入真核表达载体pVAX1，鉴定正确后采用引物cassetteF/cassetteF扩增出含有EGFP的真核表达盒，连入pMD19-T载体，鉴定正确后命名为pMDEV。

采用Pst I和Spe I对pMDEV进行双酶切，回收真核表达盒，连入同样双酶切的pSKgEILR，鉴定正确后即为gE和gI基因转移载体，命名为pSKgEI-EGFP。5TK、gE和gI基因缺失株病毒的构建及纯化拯救

5.1 转染

重组病毒拯救在六孔细胞培养板上进行，待Vero细胞长满90％时进行转染。取PRV/TK^-基因组3μg，与1μg转移质粒pSKgEI-EGFP混合后，按常规方法共转染，详细方法参见Lipofectamine^TM 2000说明书。同时设仅含转移质粒的对照组。

5.2 鉴定

PRV/TK^-基因组与pSKgEI-EGFP共转染48h后，观察转染细胞病变形成情况及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有细胞病变和绿色荧光，初步判断重组病毒拯救成功。重组病毒经噬斑纯化和PCR鉴定，命名为PRV/TK^-/gE^-/gI^-/EGFP。

5.3 缺失株报告基因的剔除

利用Cre-loxP系统介导的位点特异性重组技术剔除报告基因EGFP。取10μg经Cre酶处理过的DNA，采用磷酸钙方法转染Vero细胞，置37℃CO₂培养箱中培养2-3d，待细胞产生80％病变时收获病毒液。将病毒液反复冻融三次后取上清，按2uL/孔接种于24孔板长成单层的Vero细胞，在幵始出现细胞病变时铺上低熔点琼脂糖，荧光显微镜下挑取没有荧光的空斑。如此反复的纯化病毒，直至所有病毒空斑均不带有绿色突光，命名该缺失株为PRV/TK^-/gE^-/gI^-。

5.4 PRV/TK^-/gE^-/gI^-的鉴定

提取PRV/TK^-/gE^-/gI^-基因组DNA，用引物gEIF/gEIR和引物gBF/gBR进行PCR扩增，鉴定拯救的病毒基因内部片段是否缺失，设亲本株、PRV/TK^-/gE^-/gI^-/EGFP基因组DNA作为对照。

6 重组病毒的遗传稳定性检测

将筛选获得的初代PRV/TK^-/gE^-/gI^-重组病毒在Vero细胞上连续传代，每5代提取感染细胞总DNA，进行缺失部分基因的PCR检测。

7 PRV/TK^-/gE^-/gI^-毒种安全性试验

用PBS将抗原稀释10倍，肌肉接种100克小鼠四只，每只0.2mL，观察14天，其反应或死亡的不得超过两只。

8 PRV/TK^-/gE^-/gI^-的免疫效力检测

将6周龄的BALB/C小鼠随机分成3组，每组5只并称重，分别注射疫苗株Bartha-K61、缺失株PRV/TK^-/gE^-/gI^-和DMEM。对照组每只注射100μL DMEM，其它两组后肢肌肉注射10⁴TCID₅₀病毒剂量的疫苗。免疫后每日观察小鼠的临床症状，有无精神萎靡、厌食、瘙痒、震颤等，21d再次称重，并于14d、21d尾静脉采血，分离血清，用PRV QD株全病毒包被的ELISA板检测血清抗体水平。免疫后21d用PRV QD株攻毒，以10⁴TCID₅₀的剂量接种各试验组及对照组，采用后肢肌肉注射，接种病毒后连续观察14d。

9 结果

以PRV QD株病毒为模板，成功获得TK基因转移载体；随后将其与PRV基因组同源重组，成功拯救并纯化出含有EGFP标记基因的TK基因单缺失株病毒；采用Cre重组酶去除EGFP标记基因后，成功拯救并纯化出不含有EGFP标记基因的TK基因单缺失株病毒(PRV/TK^-)。

以PRV QD株株病毒为模板，成功获得gE和gI基因转移载体；随后将其与PRV/TK^-基因组同源重组，成功拯救并纯化出含有EGFP标记基因的gE和gI基因缺失株病毒；采用Cre重组酶去除EGFP标记基因后，成功拯救并纯化出不含有EGFP标记基因的TK、gE和gI基因缺失株病毒(PRV/TK^-/gE^-/gI^-)。

将筛选获得的PRV/TK^-/gE^-/gI^-初代重组病毒在Vero细胞上连续传代，每5代提取感染细胞总DNA，缺失部分基因的PCR检测结果表明基因的大小均为缺失片段后的大小，表明该重组病毒稳定性好。

毒种安全性试验结果表明该疫苗对小鼠是安全的，无伪狂犬特异性症状，不影响生长发育。本发明改造的猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗(PRV/TK^-/gE^-/gI^-)是安全的，可以用来制备疫苗。

免疫后21d，Bartha-K61、PRV/TK^-/gE^-/gI^-组及DMEM对照组小鼠平均增重分别为4.4g、3.8g、4.5g，增重差异不大，说明缺失株对小鼠的增重无抑制作用。免疫后14d时仍未检到抗体，21d时PRV/TK^-/gE^-/gI^-组抗体水平明显升高，其他组仍没有明显变化。表明PRV/TK^-/gE^-/gI^-缺失株可诱导小鼠产生明显的免疫反应。免疫21d后用PRV QD株攻毒，PRV/TK^-/gE^-/gI^-组保护率明显高于Bartha-K61组，保护率分别为100％和20％。

实施例3猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗的制备及应用

1 材料

1.1 毒种

制造疫苗用猪伪狂犬病病毒，保藏编号为：CGMCC No.10266。

1.2 试验动物

BALB/C小白鼠，购自山东大学实验动物中心。

1.3 制苗用其它仪器、试剂

均由山东信得科技股份有限公司提供。

2 方法

2.1 制苗过程

Vero细胞按常规方法培养,以5-10PFU病毒感染细胞,当细胞病变(CPE)达90％左右时收获病毒，置-80℃反复冻融三次，测定病毒的TCID₅₀。根据收获病毒液的毒价，进行适当的稀释，稀释后的病毒液与保护剂的体积比为1:1.5，充分混合，其中蔗糖终浓度为20％，明胶终浓度为4.8％。每瓶装2.5mL，并置冻干机中进行冻干。

2.2 成品检验

2.2.1 性状

观察疫苗的外观颜色、性状、与瓶壁脱离情况及加稀释液后溶解情况。

2.2.2 无菌检验

按2010年版《中国兽药典》附录方法进行检验。

2.2.3 支原体检验

按2010年版《中国兽药典》附录方法进行检验。

2.2.4 外源病毒检验

按2010年版《中国兽药典》附录方法进行检验。

2.2.5 安全检验

用6周龄的BALB/C小鼠10只，肌肉注射0.2ml(含10羽份)疫苗，观察21日，应全部健活，无任何局部或全身不良反应。

2.2.6 效力检验

下列方法任择其一。

2.2.6.1 用细胞检验

按瓶签注明的羽份，将疫苗用10％DMEM稀释至l羽份/0.2ml，再作10倍系列稀释，取10^-2、10^-3、10^-4、10^-5四个稀释度，分别接种生长状态良好的Vero细胞，每个稀释度接种8个孔，每孔0.2m1，另取8孔为接种10％DMEM作为对照。37℃孵育CO₂培养箱中进行孵育3日后，观察病变情况，按Reed-Muench法计算TCID₅₀，病毒含量应≥10^4.0TCID₅₀/0.2ml。

2.2.6.2 用小鼠检验

取6周龄BALB/C小鼠10只，每只肌肉注射疫苗1羽份。21日后，连同10只对照小鼠，后肢肌肉注射10^4.0TCID₅₀/只，观察14日。对照组应至少8只死亡或出现伪狂犬特异性症状，免疫组应至少8只保护。

2.2.7 剩余水分测定

按2010年版《中国兽药典》附录方法进行。

2.2.8 真空度测定

按2010年版《中国兽药典》附录方法进行。

2.2.9 疫苗使用效果检验

试验前选取15头30日龄仔猪，随机分成3组，每组5头并称重，分别注射疫苗株Bartha-K61、缺失株PRV/TK^-/gE^-疫苗和DMEM。对照组每头注射2mL DMEM，其它两组后肢肌肉注射10^5.0TCID₅₀病毒剂量的疫苗。免疫后第4周进行攻毒，肌肉注射10^7.0TCID₅₀PRV QD株病毒,观察临床症状，计算保护率情况。

3 结果

3.1 病毒含量测定

猪伪狂犬病病毒含量为10^6.5TCID₅₀/0.2ml。

3.2 成品检验结果

3.2.1 性状

微黄色海绵状疏松团块，上下摇晃时，样品很容易与瓶壁脱离。加入稀释液后均迅速溶解。

3.2.2 无菌检验

疫苗随机取样10瓶，分别用10％DMEM恢复原量，每瓶分别按2010年版《中国兽药典》附录方法进行检验。均无细菌、霉菌生长。

3.2.3 支原体检验

疫苗随机取样5瓶，分别用10％DMEM恢复原量并混合，按2010年版《中国兽药典》附录方法进行检验。疫苗均无支原体生长。

3.2.4 外源病毒检验

提取细胞毒基因组，进行外源病毒的PCR鉴定，结果均为阴性，表明疫苗外源病毒检验合格。

3.2.5 安全检验

疫苗取样3瓶，分别用10％DMEM恢复原量后作适当稀释，各肌肉注射0.2ml疫苗，观察21日。结果显示，接种小鼠均无任何不良反应，且10/10健活。

3.2.6 效力检验

3.2.6.1 用细胞检验

按瓶签注明的羽份，将疫苗用10％DMEM稀释至l羽份/0.2ml，再作10倍系列稀释，接种细胞后按照Reed-Muench法计算TCID₅₀，结果表明每羽份为10⁴TCID₅₀。对照小鼠均无伪狂犬的特异性临床症状。

3.2.6.2 用小鼠检验

取6周龄BALB/C小鼠10只，每只肌肉注射疫苗1羽份。21日后，连同10只对照小鼠，后肢肌肉注射10^4.0TCID₅₀/只，观察14日。结果：对照组10只死亡或出现伪狂犬特异性症状。

3.2.7 剩余水分测定

疫苗取样4瓶用真空干燥法进行检验。结果检验样品剩余水分含量在2.0％～2.7％，均≤4％。说明疫苗剩余水分测定检验均合格。

3.2.8 真空度测定

疫苗分别用真空检漏仪进行检验。结果检验样品均呈紫色辉光。说明疫苗真空度测定检验均合格。

3.2.9 疫苗使用效果

对30日龄仔猪分别免疫疫苗株Bartha-K61、缺失株PRV/TK^-/gE^-/gI^-疫苗和DMEM，免疫后第4周进行攻毒，攻毒结果表明，PRV/TK^-/gE^-/gI^-组保护率明显高于Bartha-K61组，保护率分别为100％和20％。表明本发明的PRV/TK^-/gE^-/gI^-疫苗在临床上的免疫效果明显优于现在广泛使用的Bartha-K61疫苗。而且，检测效果表明，本发明制备的疫苗对猪伪狂犬病病毒(CGMCC No.10266)的免疫效果明显好于其它疫苗(p＜0.05)；证明作为出发菌株的猪伪狂犬病病毒(CGMCC No.10266)具有遗传上的特异性。

Claims (6)

1.一种猪伪狂犬病减毒病毒株，其特征在于，所述的减毒病毒株是由保藏编号为CGMCCNo.10266的猪伪狂犬病病毒株进行毒力基因缺失后制成的减毒病毒株；所述的毒力基因为TK、gE和gI基因。

2.权利要求1所述的减毒病毒株在制备疫苗中的应用。

3.一种疫苗，其特征在于，所述的疫苗由抗原和保护剂组成的，其中抗原包含有权利要求1所述的减毒病毒株；所述的保护剂为蔗糖和明胶的水溶液。

4.如权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述的蔗糖和明胶在疫苗中的质量百分比终浓度分别为20％和4.8％。

5.如权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述的保护剂中添加有抗生素。

6.如权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述的抗生素为青霉素和链霉素。