CN110527669B

CN110527669B - 一种猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN110527669B
Application number: CN201910840948.0A
Authority: CN
Inventors: 李玲; 张彤; 吴冬荀; 马良; 李静; 王飞; 向王震; 张欣; 张国栋; 肖进; 黄书林; 许磊; 齐鹏
Original assignee: China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Current assignee: China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Priority date: 2019-09-06
Filing date: 2019-09-06
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2039-09-06
Also published as: CN110527669A

Abstract

本发明公开了一种猪伪狂犬病病毒变异株基因缺失毒株及其构建方法和应用。该猪伪狂犬病病毒变异株基因缺失毒株是以猪伪狂犬病病毒变异株PRV HNxy为亲本毒株，使其gI、gE、US9和US2蛋白失活而获得的减毒株。本发明猪伪狂犬病病毒变异株的基因缺失毒株可制备成活疫苗或灭活疫苗，对猪伪狂犬病具有很好的免疫保护效果，接种猪只没有出现任何临床症状，安全性高，适于作为防控伪狂犬病的疫苗候选株。

Description

一种猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株及其构建方法和应用

技术领域

发明涉及一种猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株的构建，还涉及该基因缺失毒株在制备和防治伪狂犬病中的应用，属于基因工程技术和病毒学领域。

背景技术

猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)或者说猪疱疹病毒1型(suid herpesvirus 1,SuHV-1)感染猪或其他动物引起的高死亡率的急性传染病，是严重危害我国养猪业的重大疫病之一。PRV是双链线状DNA病毒，基因组大约150kb，含有特异的UL和US区域、末端重复序列和内部重复序列。

PRV能够感染哺乳动物(包括反刍动物、肉食动物和啮齿类)，但是猪是唯一能够潜伏携带该病毒的动物。感染了PRV的猪体，其临床表现和死亡亚临床症状不同：PRV感染对新出生的小猪和其他易危物种都是致死的，并且是死于中枢神经系统疾病；相反地，年长的猪体发展成为主要的呼吸系统症状；跟α-疱疹病毒一样，PRV通常在宿主的周围神经系统建立终身潜伏感染，当潜伏的病毒基因组自发或者通过应激和病毒出芽触发而被再次激活，潜伏感染的动物将成为再次感染的源头；PRV感染怀孕的母猪后可能会导致生殖障碍，比如流产或者死胎。

从2011年以来，国内许多免疫了Bartha-K61的猪群出现了PRV新的变种，免疫和攻毒实验结果表明传统的Bartha-K61疫苗株已不再能够对当前的PRV变种提供完全保护。

发明内容

发明人对变种分离株与之前的包括Bartha-K61在内的PRV毒株基因组进行比对和分析，发现大多数的病毒蛋白出现了基因替换、插入或缺失，这暗示着当前的PRV流行分离株发生了变异。当前，市场急切需要基于现有流行毒株开发的PRV疫苗。

为了解决当前市场缺乏伪狂犬病病毒变异株疫苗不足的现状，本发明的目的之一是提供一株与当前流行变异株同源性很高，能代表当前流行变异特点，与猪伪狂犬病病毒经典株差异明显的强毒株。该毒株可作为基因改造的亲本毒株，为开发针对流行毒株的PRV疫苗提供亲本材料。

本发明的亲本毒株猪伪狂犬病毒PRV HNxy是2016年从中国河南信阳某猪场免疫Bartha-K61疫苗后发病的猪脑组织中分离得到的。该毒株与当前流行的猪伪狂犬病病毒变异株同源性很高，但是与猪伪狂犬病病毒经典株差异明显，gE基因第316位氨基酸为苏氨酸，在第48位和494位氨基酸分别突变插入一个天冬氨酸。动物实验结果表明，PRV HNxy株对小鼠和仔猪都表现出强致死性；仔猪感染PRV HNxy株后，出现猪伪狂犬病典型症状。

该猪伪狂犬病毒PRV HNxy已于2019年05越29日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)保藏，包保藏编号为CGMCCNo.17696。

本发明的另一个目的是提供一株基于上述猪伪狂犬病毒PRV HNxy经基因工程方法构建的缺失gI、gE、US9和US2基因的猪伪狂犬病病毒变异株基因缺失毒株。该毒株为针对当前流行的猪伪狂犬病病毒强毒株变异株的弱毒株，可用于制备PRV疫苗。

本发明的猪伪狂犬病病毒变异株基因缺失毒株是以猪伪狂犬病病毒变异株HNxy为出发毒株，使其gI、gE、US9和US2蛋白失活获得的减毒株。其中，所述gI基因序列如序列表中序列1所示；所述gE基因序列如序列表中序列2所示；所述US9基因序列如序列表中序列3所示；所述US2基因序列如序列表中序列4所示。

该猪伪狂犬病病毒变异株基因缺失毒株通过将猪伪狂犬病病毒变异株HNxy的gI、US2基因部分缺失，gE、US9基因全部缺失而获得所述的猪伪狂犬病病毒变异株基因缺失毒株。

在本发明的一个实施例中，所述缺失的基因序列为：PRV HNxy变异株基因组中gI基因CDS区的第268位碱基至US2基因CDS区的第284位碱基之间的DNA序列。

本发明提供的针对当前流行的猪伪狂犬病病毒变异株的弱毒株是一株猪伪狂犬病病毒变异株的基因缺失毒株，名称为PRV HNxy-ΔgIgE，该毒株已于2018年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.16900。

本发明的再一个目的是提供一种猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株的构建方法。

发明通过以下技术方案实现：

发明以PRV变异株PRV HNxy作为亲本毒株，利用分子生物学和细胞生物学的方法构建了gI、gE基因缺失的猪伪狂犬病病毒变异株基因缺失毒株PRV HNxy-ΔgIgE，发明构建的缺失病毒PRV HNxy-ΔgIgE缺失了PRV HNxy变异毒株的基因组中gI基因的部分序列、US2基因的部分序列、gE基因的全部序列和US9基因的全部序列。

所述的猪伪狂犬病病毒变异株HNxy株的基因缺失毒株的构建方法，其构建步骤为：

(1)转移质粒的构建，以自行分离的PRV变异株PRV HNxy株为亲本，以pCloneEZ载体为骨架载体，构建转移载体：PRV HNxy株基因组中gI基因缺失位点之前的部分序列作为左同源臂、US2基因缺失位点之后的部分序列作为右同源臂，分别将左同源臂和右同源臂插入pCloneEZ，然后在左同源臂和右同源臂之间插入EGFP基因表达框，得到转移载体；将转移载体命名为pCloneEZ-gI-EGFP-US2，

(2)以pCDNA3.1载体为骨架载体，插入重组酶Cre的表达框得到构建表达Cre重组酶的真核表达质粒，命名为pCDNA3.1-Cre；

(3)转移载体pCloneEZ-gI-EGFP-US2转染经亲本HNxy病毒感染的Vero细胞，通过蚀斑筛选，获得表达绿色荧光蛋白的缺失病毒PRV HNxy-ΔgIgE-EGFP；

(4)表达Cre重组酶的真核表达质粒pCDNA3.1-Cre转染经缺失病毒PRV HNxy-ΔgIgE-EGFP感染的PK-15细胞，通过蚀斑筛选，获得HNxy变异株缺失病毒PRV HNxy-ΔgIgE。

优选的，所述步骤(1)中，所述左同源臂的序列为序列表中序列5，所述右同源臂的序列为序列表中序列6。

本发明的目的之三是提供了一种病毒载体，其特征在于作为病毒载体可插入一种和/或多种核酸序列，以获得的表达基因的重组病毒，在制备重组载体基因工程疫苗中的应用。

本发明的目的之四是提供构建的伪狂犬病病毒变异株基因缺失毒株在制备防治伪狂犬病病毒引起的动物传染病药物中的应用。

本发明所构建的PRV变异株基因缺失毒株可制备成活疫苗或者灭活疫苗，对猪伪狂犬病病毒都具有很好的免疫保护效果，接种猪只没有出现任何临床症状，安全性高，免疫后能够迅速产生PRV特异性抗体，能够对当前PRV变异株的攻击提供完全保护。

附图说明

图1是猪场病猪脑组织样品的PCR鉴定结果图。泳道1为DL5000Ladder，泳道2为gE基因扩增条带，泳道3为gB基因扩增条带。

图2为脑组织匀浆液感染PK-15细胞产生的细胞病变图。图A为接种脑组织匀浆液的PK-15细胞，图B为正常PK-15细胞。

图3是基因缺失病毒构建示意图。

图4是表达绿色荧光蛋白的中间过渡病毒和基因缺失病毒感染PK-15细胞后荧光或细胞病变观察图。图A和B分别是表达绿色荧光蛋白的中间过渡病毒PRV HNxy-ΔgIgE-EGFP的明视野和荧光视野图；图C是基因缺失病毒PRV HNxy-ΔgIgE细胞病变观察图；图D是未感染病毒的PK-15对照图。

图5是亲本病毒和基因缺失病毒PCR扩增鉴定结果图。泳道1为DL5000 Ladder，泳道2为亲本病毒扩增条带，泳道3为基因缺失病毒PRV HNxy-ΔgIgE扩增条带。

图6是基因缺失病毒制备成活疫苗后接种阴性仔猪不同时间点体温变化图。

图7是基因缺失病毒制备成活疫苗后接种阴性仔猪gB抗体检测结果图。

图8是基因缺失病毒制备成活疫苗后接种阴性仔猪gE抗体检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的优选实施方式进行进一步的说明。

下述实施例中所用的实验材料和实验试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的pEGFP-N1、pCDNA3.1购自美国CIontech公司；pCloneEZ平末端载体购自中美泰和；Cre载体购自Santa cruz(货号sc-418923)；猪肾细胞系(PorcineKidney,PK-15)和非洲绿猴肾细胞系Vero购自美国菌种中心ATCC；

实施例1、猪伪狂犬病病毒变异株PRV HNxy株的分离鉴定

从我国河南信阳某猪场免疫Bartha-K61疫苗的疑似PRV感染的病猪体取脑组织样品，取其中的部分组织提取基因组DNA，分别利用特异性引物对P1F/P1R、P2F/P2R进行PCR扩增PRV gE和gB基因，结果呈阳性(图1)，扩增条带大小分别是1740bp、2893bp，与预期相符合；同时将gE基因的PCR产物测序，将测序结果与NCBI公布的多株PRV gE基因进行序列比对，结果显示其基因序列与当前的PRV变异株同源性极高，在第48位和494位氨基酸分别突变插入一个天冬氨酸，此外gE基因第316位氨基酸突变为苏氨酸。将组织样品加DMEM培养基匀浆后离心、过滤，取滤液接种单层PK-15细胞，孵育2小时后换为含2％胎牛血清的DMEM培养基，于5％CO₂、37℃条件下继续培养3-5天，可观察到细胞病变(图2)，待细胞病变95％时收获病毒液，取该原代病毒，命名为PRV HNxy株。PRV HNxy株接种PK-15细胞扩增，分装后冻于-80℃保存。

该猪伪狂犬病毒PRV HNxy已于2019年05月29日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)保藏，保藏编号为CGMCCNo.17696。

动物实验结果表明，PRV HNxy株对小鼠和仔猪都表现出强致死性；选取PRV抗体和抗原阴性的30日龄健康易感仔猪5头，分别颈部肌肉注射10⁵TCID₅₀ PRV HNxy株，接种后连续观察14日，观察、记录临床症状。5头仔猪在均接种后第1天体温升高，并相继出现显著的精神萎靡、不喜运动、久卧不起、食欲不振，接种后14天其中3头仔猪死亡。结果表明，仔猪感染PRV HNxy株后，出现典型猪伪狂犬病症状，PRV HNxy株是强毒力毒株。

实施例2、PRV HNxy株基因缺失毒株的构建

本发明的猪伪狂犬病病毒变异株基因缺失毒株是以实施例1分离的猪伪狂犬病病毒变异株PRV HNxy为亲本毒株，通过将该猪伪狂犬病病毒变异株HNxy的gI、US2基因部分缺失，gE、US9基因全部缺失(PRV HNxy变异株基因组中gI基因CDS区的第268位碱基至US2基因CDS区的第284位碱基之间的DNA序列)，使其gI、gE、US9和US2蛋白失活而获得的减毒株，。所述gI、gE、US9和US2蛋白的序列分别为序列1、序列2、序列3和序列4。

一、包含GFP基因的同源重组转移质粒的构建与鉴定

1、根据NCBI公布的PRV序列，分别设计并合成引物对P3F/P3R、P4F/P4R，以亲本病毒PRV HNxy DNA为模板，通过P3F/P3R扩增包含gI基因的左同源臂gI-L(序列5)，P4F/P4R扩增包含US2基因的右同源臂US2-R(序列6)。将PCR产物左同源臂gI-L平末端克隆到载体pCloneEZ，得到亚克隆pCloneEZ-gIL；然后将右同源臂US2-R经HindIII和MluI酶切位点克隆到pCloneEZ-gIL，获得转移质粒pCloneEZ-gIL-US2R。

2、以pEGFP-N1质粒为模板，通过引物P5F/P5R扩增质粒的全长，利用ToYoBo点突变试剂盒KOD-Plus-Mutagenesis Kit对其进行小片段缺失突变，缺失594-668位碱基，以去除多克隆位点，得到质粒pEGFP-N1-del；然后，以pEGFP-N1-del质粒为模板，通过引物P6F/P6R扩增EGFP完整的表达框，得到PCR产物EGFP。

3、将片段EGFP经HindIII酶切位点克隆到转移质粒pCloneEZ-gIL-US2R，获得最终的转移质粒pCloneEZ-gI-EGFP-US2。

二、表达Cre重组酶的真核表达质粒pCDNA3.1-Cre的构建和鉴定

以Cre载体为模板，通过引物P7F/P7R扩增Cre基因，利用HindⅢ和Xba I酶切位点克隆到真核表达载体pCDNA3.1，得到重组真核表达质粒pCDNA3.1-Cre。

三、表达绿色荧光蛋白标记重组病毒的构建

单层Vero细胞于6孔细胞培养板中长至95％，以MOI为0.1感染亲本PRV HNxy病毒1-2小时，然后将2.5μg转移载体pCloneEZ-gI-EGFP-US2和10μL Lipofectamine^TM 2000试剂按照Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen)说明书进行转染，在转染后24小时观察细胞的病变和绿色荧光蛋白的表达(图4)，反复冻融三次后收获细胞裂解物。将转染后的细胞裂解物接种于6孔板单层PK-15细胞，在接种后1-2小时弃去培养基并用PBS清洗一遍，加入2mL含1％低熔点琼脂糖、2％FBS的DMEM培养基后持续培养3-5天；当肉眼可见直径为1-2mm的蚀斑时，荧光显微镜下观察，挑取表达绿色荧光蛋白的蚀斑于500μL DMEM培养基。将以上的蚀斑纯化步骤重复至少15轮进行筛选，获得表达绿色荧光蛋白的缺失病毒PRV HNxy-ΔgIgE-EGFP。

四、无标记基因缺失病毒的构建与鉴定

按照Lipofectamine^TM 2000说明书，将质粒pCDNA3.1-Cre转染经表达绿色荧光蛋白的重组缺失病毒PRV HNxy-ΔgIgE-EGFP感染的PK-15细胞，转染后3-5天观察细胞病变和荧光蛋白的表达情况，反复冻融三次后收获细胞裂解物；连续重复该转染步骤至少3次，收获细胞裂解物上清；通过蚀斑纯化步骤，将该细胞裂解物上清蚀斑纯化至少15轮进行筛选，获得HNxy变异株缺失病毒PRV HNxy-ΔgIgE(图4)。将得到的无标记基因缺失病毒提取基因组，通过引物P8F/P8R扩增基因替换区域，并进行测序以确定目的基因片段的缺失。结果表明，得到的缺失病毒PRV HNxy-ΔgIgE其缺失区域与预期一致，gI、US2基因部分缺失，gE、US9基因全部缺失(图5)(序列23是以PRV HNxy-ΔgIgE为模板，用引物P8F/P8R扩增包含缺失区域的序列，与亲本毒株PRV HNxy相比片段小了很多，证明gI、US2基因部分缺失，gE、US9基因全部缺失)。

本发明提供的针对当前流行的猪伪狂犬病病毒强毒株变异株的弱毒株是一株猪伪狂犬病病毒变异株的基因缺失毒株，名称为PRV HNxy-ΔgIgE，该毒株已于2018年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.16900。

表1本发明所涉及的相关引物信息

实施例3、基因缺失病毒PRV HNxy-ΔgIgE CGMCC No.16900制备成活疫苗在猪体的安全性和免疫效力评价

一、对仔猪的安全性试验

选取PRV抗体和抗原阴性的30日龄健康易感仔猪8头，随机分成2组。其中，实验组5头/组，各分别颈部肌肉注射基因缺失活疫苗PRV HNxy-ΔgIgE 1.0mL(10⁵TCID₅₀)；同时，设对照组仔猪3头，颈部肌肉注射1.0mL DMEM培养基。免疫后连续观察14日，免疫前、免疫后每天对所有接种猪只进行体温测定，并观察、记录临床症状。接种PRV HNxy-ΔgIgE基因缺失毒株疫苗后，实验组所有仔猪存活、体温正常，未表现出食欲低下、精神萎靡及伪狂犬病临床症状；对照组3头仔猪在接种后出现明显的精神萎靡、不喜运动、久卧不起、食欲不振，攻毒后第1天体温升高(图6)，接种后14天其中1头仔猪死亡。

二、对仔猪的免疫效力评价

选取PRV抗体和抗原阴性的30日龄健康易感仔猪8头，随机分成2组。其中，实验组5头/组，各分别颈部肌肉注射基因缺失活疫苗PRV HNxy-ΔgIgE CGMCC No.16900 1.0mL(10⁵TCID₅₀)；同时，设对照组仔猪3头，颈部肌肉注射1.0mL DMEM培养基。免疫后2周对所有仔猪用PRV HNxy毒株滴鼻攻毒1mL(10⁶TCID₅₀)，免疫后和攻毒后每天对所有猪进行临床症状观察，在免疫后第0、7、14、21、28天用IDEXX试剂盒进行gB和gE特异性抗体检测。

实验组在免疫接种至14天时都不能检测到gE抗体，表明血清学检测结果与实验设计一致，基因缺失毒株PRV HNxy-ΔgIgE中gE基因缺失。实验组在攻毒后7天gE抗体仍为阴性，在攻毒后14天其中1头抗体转阳；对照组3头仔猪在攻毒后7天死亡1头，另外2头仔猪攻毒后14天gE抗体呈现阳性(图7)。此外，实验组在免疫接种后7、14天均能检测到gB抗体阳性，攻毒后7、14天gB抗体仍呈现阳性；对照组仔猪攻毒后7天和14天gB抗体呈现阳性(图8)。

实施例4、基因缺失病毒PRV HNxy-ΔgIgE CGMCC No.16900制备成灭活疫苗在猪体的免疫效力评价

一、基因缺失PRV HNxy-ΔgIgE CGMCC No.16900灭活疫苗的制备

将PRV HNxy-ΔgIgE CGMCC No.16900病毒以MOI为0.1接毒PK-15细胞，在细胞病变为95％时收获，3次冻融后取细胞培养裂解物上清，测定病毒滴度；加入甲醛溶液时期终浓度为0.2％(v/v)，37℃灭活18小时；然后以体积比1:1加入206佐剂(法国赛比克)制备成灭活疫苗。

二、对仔猪的免疫效力评价

选取PRV抗体和抗原阴性的30日龄健康易感仔猪8头，随机分成2组。其中，实验组5头/组，各分别颈部肌肉注射基因缺失PRV HNxy-ΔgIgE灭活疫苗1.0mL(10⁸TCID₅₀)；同时，设对照组仔猪3头，颈部肌肉注射1.0mL DMEM培养基。免疫后2周对所有仔猪用PRV HNxy毒株滴鼻攻毒1mL(10⁶TCID₅₀)，免疫后和攻毒后每天对所有猪进行临床症状观察，并记录成活率。

实验组仔猪在攻毒后出现了短暂的体温升高，随即恢复正常，5头动物均存活，能为仔猪提供100％的免疫保护；对照组3头动物攻毒后均发病，体温升高，精神萎靡，四肢呈划水状，出现伪狂犬病典型症状，其中1头在攻毒后7天死亡。

序列表

<110> 中牧实业股份有限公司

<120> 一种猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株及其构建方法和应用

<130> WHOI190091

<160> 23

<170> Patent-In 3.5

<210> 1

<211> 1101

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus）

<400> 1

atgatgatgg tggcgcgcga cgtgacccgg ctccccgcgg ggctcctcct cgccgccctg 60

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ctgcgcctcg accccaagcg cgcctgctac acgcgcgagt acgccgccga gtacgacctc 300

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ctgacggccc tggtgccgcc gagggggcgc cccgtcccca cgtcgccgcc cgcggacgag 540

tgccggcccg tcgtcggatc gtggcacgac agcctgcgcg tcgtggaccc cgccgaggac 600

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accatcgcag aagaacaata a 1101

<210> 2

<211> 1740

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus）

<400> 2

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acgaatggac ccaactatgg cgtgaccgcc aaccgcctgt tgatgtcccg ccccgcttaa 1740

<210> 3

<211> 297

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus）

<400> 3

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caggcggcgc gtcggagacg ccgccgctgc ctgatgggcg tcgcgatcag cgccgccgcg 240

ctggtcatct gctcgctgtc cgcgctactc gggggcatcg tcgccaggca cgtgtag 297

<210> 4

<211> 771

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus）

<400> 4

atgggggtga cggccatcac cgtggtcacg ctgatggacg gggccgggcg catccccgcc 60

ttcgtgggcg aggcgcaccc ggacctgtgg aaggtgctca ccgagtggtg ctacgcgtcg 120

atggtgcagc agcggcgcgc cgccgacgag aactcgccgc ggcagcacgt ggtgctgcgc 180

tcctcggaga tctcccccgg ctcgctggcc ctgctgccgc gcgccgtgcg ccccgtcgtg 240

cggacgcggt ccgaccccac ggcgccgttc tacatcacca ccgagacgca cgagctgacg 300

cggcgccccc cggcggacgg ctcgaagccc ggggagcccc tcaggatcag cccacccccg 360

cggctggaca cggagtggtc gtccgtcctg aacgggatcc agtacctgaa ctcgggggcc 420

cggggcacgg cccccgtcca cctgtggatc ctgggcgccg ccgacctctg cgaccaggtg 480

ctcctggccg cctcccgcag caccgccgcc ggagcctccc acgcccagac gggcgcgcgc 540

ctgacccggc gccggcccgg gctgacggac gccgacgccc tggacgtgat cgtcgccggg 600

atccaggcga cccgcgccat gttcgcgcgg gtccacaacc gctcctggcg ccacgccggc 660

gagtggacgg aggccctgca ctcccagatc gtgacccggg gcgacgtgcg ccggcgccga 720

ggcgggcgcg gcaacggacg cgagcgcgcc ccgcgatgta ccatctccta g 771

<210> 5

<211> 1352

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus）

<400> 5

ggaattcggt ggtggcgctg atctccgacc cgcaggtgga ccggctgctg aacgaggcgg 60

tggcccaccg gcggcccacg taccgcgccc acgtggcctg gtaccgcatc gcggacgggt 120

gcgcgcacct gctgtacttt atcgagtacg ccgactgcga ccccaggcag atctttgggc 180

gctgccggcg ccgcaccacg ccgatgtggt ggaccctgtc cgcggactac atgctcccca 240

cggaggacga gctggggctg ctcatggtgg ccccggggcg gttcaacgag ggccagtacc 300

ggcgcctggt gtccgtcgac ggcgtgaaca tcctcaccga cttcatggtg gcgctccccg 360

aggggcaaga gtgcccgttc gcccgcgtgg accagcaccg cacgtacaag ttcggcgcgt 420

gctggagcga cgacagcttc aagcggggcg tggacgtgat gcgattcctg acgccgttct 480

accagcagcc cccgcaccgg gaggtggtga actactggta ccgcaagaac ggccggacgc 540

tcccgcgggc ctacgccgcc gccacgccgt acgccatcga ccccgcgcgg ccctcggcgg 600

gctcgccgag gcccaggccc cggccccggc ccaggccccg gccgaagccc gagcccgccc 660

cggcgacgcc cgcgcccccc ggccgcctgc ccgagccggc gacgcgggac cacaccgccg 720

gggggcgccc cacgccgcga cccccgaggc ccgagacgcc gcaccgcccc ttcgccccgc 780

cggccgtcgt gcccagcggg tggccgcagc ccgcggagcc gttcccgccc cggaccaccg 840

ccgcgccggg cgtctcgcgc caccgctcgg tgatcgtcgg cacgggcacc gcgatgggcg 900

cgctcctggt gggcgtgtgc gtctacatct tcttccgcct gaggggggcg aaggggtatc 960

gcctcctggg cggtcccgcg gacgccgacg agctaaaagc gcagcccggt ccgtagcctc 1020

cgcagtaccg gcgtcgatga tgatggtggc gcgcgacgtg acccggctcc ccgcggggct 1080

cctcctcgcc gccctgaccc tggccgccct gaccccgcgc gtcgggggcg tcctcttcag 1140

gggcgccggc gtcagcgtgc acgtcgccgg cagcgccgtc ctcgtgcccg gcgacgcgcc 1200

caacctgacg atagacggga cgctgctgtt tctggagggg ccctcgccga gcaactacag 1260

cgggcgcgtg gagctgctgc gcctcgaccc caagcgcgcc tgctataact tcgtatagta 1320

taccttatac gaagttataa gcttacgcgt cg 1352

<210> 6

<211> 618

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus）

<400> 6

cccaagctta taacttcgta tagtatacct tatacgaagt tatagacgca cgagctgacg 60

cggcgccccc cggcggacgg ctcgaagccc ggggagcccc tcaggatcag cccacccccg 120

cggctggaca cggagtggtc gtccgtcctg aacgggatcc agtacctgaa ctcgggggcc 180

cggggcacgg cccccgtcca cctgtggatc ctgggcgccg ccgacctctg cgaccaggtg 240

ctcctggccg cctcccgcag caccgccgcc ggagcctccc acgcccagac gggcgcgcgc 300

ctgacccggc gccggcccgg gctgacggac gccgacgccc tggacgtgat cgtcgccggg 360

atccaggcga cccgcgccat gttcgcgcgg gtccacaacc gctcctggcg ccacgccggc 420

gagtggacgg aggccctgca ctcccagatc gtgacccggg gcgacgtgcg ccggcgccga 480

ggcgggcgcg gcaacggacg cgagcgcgcc ccgcgatgta ccatctccta gacggcagga 540

tctctccgcg tcccccaccc ccccccaaaa aaaaacaata aacgctctcg ctctggcacc 600

cgatgacacg acgcgtcg 618

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgcggccct ttctgctgcg c 21

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttaagcgggg cgggacatca acag 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tttccatctg cggggagggg gcta 24

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gatatatccg cgagctggtg ctggcg 26

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggaattcggt ggtggcgctg atctccgacc cg 32

<210> 12

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgacgcgtaa gcttataact tcgtataagg tatactatac gaagttatag caggcgcgct 60

tggggtcgag 70

<210> 13

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cccaagctta taacttcgta tagtatacct tatacgaagt tatagacgca cgagctgacg 60

cggcgc 66

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgacgcgtcg tgtcatcggg tgccagagcg agagcg 36

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cggtcgccac catggtgagc aag 23

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gcggatctga cggttcacta aaccagctc 29

<210> 18

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cccaagcttt tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attag 45

<210> 18

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cccaagcttc tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg 40

<210> 19

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tttaagcttg ccaccatgaa cctgctgact gtgcaccaaa ac 42

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aaatctagat cagtccccat cctcgagcag cc 32

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcgacgcgcc caacctgacg a 21

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggcccccgag ttcaggtact ggatcc 26

<210> 23

<211> 285

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gcgacgcgcc caacctgacg atatacggga cgctgctgtt tctggagggg ccctcgccga 60

gcaactacgg cgggcgcgtg gagctgctgc gcctcgaccc caagcgcgcc tgctataact 120

tcgtatagta taccttatac gaagttatag acgcacgagc tgacgcggcg ccccccggcg 180

gacggctcga agcccgggga gcccctcagg atcagcccac ccccgcggct ggacacggag 240

tggtcgtccg tcctgaacgg gatccagtac ctgaactcgg gggcc 285

Claims

1.一株猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus）变异强毒株，命名为PRV HNxy，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC No. 17696。

2.一株猪伪狂犬病病毒变异株的基因缺失毒株，所述猪伪狂犬病病毒变异株的基因缺失毒株名称为HNxy-ΔgIgE，该毒株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 16900。

3.权利要求2所述的猪伪狂犬病病毒变异株HNxy株的基因缺失毒株的构建方法，其特征在于，该毒株的构建步骤为：

(1)转移质粒的构建，以pCloneEZ载体为骨架载体，构建转移载体：在pCloneEZ载体中插入权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒变异株PRV HNxy株基因组中gI基因缺失位点之前的部分序列作为左同源臂、US2基因缺失位点之后的部分序列作为右同源臂，左右同源臂间插入EGFP基因表达框；

(2)表达Cre重组酶的真核表达质粒pCDNA3.1-Cre的构建，以pCDNA3.1载体为骨架载体，插入重组酶Cre的表达框；

(3)绿色荧光标记的缺失病毒的构建，转移载体pCloneEZ-gI-EGFP-US2转染经亲本HNxy病毒感染的Vero细胞，通过蚀斑筛选，获得表达绿色荧光蛋白的缺失病毒PRV HNxy-ΔgIgE-EGFP；

(4)猪伪狂犬病病毒变异株HNxy株的基因缺失毒株的构建，表达Cre重组酶的真核表达质粒pCDNA3.1-Cre转染经缺失病毒PRV HNxy-ΔgIgE-EGFP感染的PK-15细胞，通过蚀斑筛选，获得HNxy变异株缺失病毒PRV HNxy-ΔgIgE；

所述步骤（1）中，所述左同源臂的序列为序列表中序列5，所述右同源臂的序列为序列表中序列6。

4.一种疫苗组合物，其特征在于，由权利要求2所述的猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗株和药学上可接受的佐剂组成。

5.权利要求2所述的猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗株在制备预防猪伪狂犬病疫苗中的应用。

6.权利要求2所述的猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗株在制备诊断或检测猪伪狂犬病试剂中的应用。