CN112063633A - 一种天然免疫抑制基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒株及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种天然免疫抑制基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒株及应用。本发明发现ASFV MGF‑110‑9L具有抑制干扰素产生的功能，在非洲猪瘟原始病毒株中缺失ASFV MGF‑110‑9L基因，能够降低亲本毒株的毒力，获得了一种减毒非洲猪瘟病毒株；所述的减毒非洲猪瘟病毒株对猪的毒力显著致弱，提升了毒株的安全性。通过在亲本毒株中缺失了基因ASFV MGF‑110‑9L，进而降低了亲本毒株的毒性，为未来成功制备非洲猪瘟疫苗提供了理论依据和实践参考，研究人员可以通过同时敲除ASFV MGF‑110‑9L及已公开的一种或几种毒力基因(例如CD2V、MGF360‑12L、MGF360‑13L、MGF360‑14L、MGF360‑505R等)，最终制备出安全有效的非洲猪瘟疫苗候选株。

Description

一种天然免疫抑制基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒株及应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种天然免疫抑制基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒株及应用。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种以猪发热和猪全身脏器出血为特征的急性烈性传染病，对于家猪的病死率高达100％。该病首先于1921在肯尼亚爆发，随后在整个非洲的家猪和野猪中广泛流行。20世纪50年代传入欧洲，整个欧洲用了40年消除该病。然而，该病自2007年再次从东非传入格鲁吉亚，随后便广泛在东欧散播，并于2017年传入俄罗斯远东地区伊尔库斯克。2019年8月初，扈荣良研究员率先报道我国第一例非洲猪瘟疫情，短短一年之内，该病蔓延至全国30个省市自治区，继续对养猪业构成威胁，其中与2018年8月相比，2019年9月中国生猪产量下降了40％，猪肉价格自2019年8月以来上涨了一倍，已造成全国40％以上减产率，损失严重。
因为当前没有合适的疫苗，非洲猪瘟疫情一旦发生，只能根据前期对于非洲猪瘟的防控经验，通过扑杀手段进行彻底根除。但是这种方式仅导致经济损失，而且需要花费漫长的时间。因此，疫苗作为预防和控制病毒传染病最有效、最经济的手段，对于非洲猪瘟的防治至关重要。
目前对于非洲猪瘟疫苗的制备主要通过两种方式：一、直接对原始非洲猪瘟病毒进行灭活；二、采用基因缺失手段，敲除毒力基因后获得重组病毒疫苗。其中第一种方法是制备病毒疫苗最常用、最直接的方法，但是，由于非洲猪瘟是双链DNA病毒，拥有超大基因组，能够编码150-167种蛋白，且具有复杂的免疫逃逸机制，一般是由多个毒力基因共同发挥作用，这就必然会使多种毒力基因残留在ASFV灭活的疫苗中，导致灭活疫苗的毒性作用大于预防效果，在接种灭活疫苗后，容易导致猪的死亡。而为了获得既具有免疫原性，又能降低毒性，保持猪存活的非洲猪瘟疫苗，目前一般采用基因缺失的方式来制备减毒疫苗，例如，中国专利CN110551695A提供了一种非洲猪瘟病毒四基因缺失弱毒株，该弱毒株是非洲猪瘟病毒SY18分离株的四基因缺失弱毒株，其缺失以下基因的功能蛋白：CD2v基因编码产物和三个多基因家族基因(MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L)编码产物，接种仔猪免疫28天后，以ASFV亲本毒进行攻毒试验，结果免疫猪群均获得完全保护；中国专利CN110093324B又公开了一种基因II型的非洲猪瘟病毒MGF360-505R缺失和CD2V与MGF360-5 05R联合缺失的基因缺失病毒，这两种毒株均能提供对非洲猪瘟中国流行强毒株的100％免疫保护，这两株基因缺失病毒免疫后21天能够提供充分的强毒攻击保护。
综上，对于猪瘟病毒毒力基因的敲除往往需要考虑到对免疫反应的影响，又要兼顾致病性和安全性能。但是现有技术中猪瘟病毒毒力基因敲除疫苗还是存在如下问题：①不同毒株缺失同一基因产生的效果不同，缺失不充分引起的免疫副反应以及多基因缺失造成的过度致弱，病毒滴度低，也会使致弱毒株降低免疫原性或保护作用等风险；②敲除的毒力基因较多，不仅操作复杂，成本高，而且基因是否敲除成功也是必须考虑的问题，而敲除的基因越多，容易造成基因敲除成功率的下降，一旦敲除不完全，又会引发安全性问题；③非洲猪瘟的全基因组测序工作虽然已经完成，但是组成非洲猪瘟病毒的调控基因和结构基因高达151个，全面研究每一个调控基因和结构基因的功能对其致病机理和疫苗研制至关重要，能够明确基因功能，进而驱动疫苗种毒的改造和提升。
因此，在非洲猪瘟减毒疫苗的制备过程中，鉴定基因功能，对于敲除基因的选择也是至关重要的，而基因缺失重组病毒的构建也是制备减毒疫苗的关键步骤。本发明首先发现了A SFV MGF-110-9L基因具有抑制天然免疫的功能，通过在亲本猪瘟病毒中单一敲除ASFV M GF-110-9L基因，获得了重组减毒非洲猪瘟病毒。重组减毒非洲猪瘟病毒的毒力显著致弱，具有良好的安全性能，研究人员可以通过同时敲除ASFV MGF-110-9L及已公开的一种或几种毒力基因(例如CD2V、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、MGF360-505R等)，最终制备出安全有效的非洲猪瘟疫苗。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种ASFV MGF-110-9L基因，所述ASFVMGF-110-9L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的另一目的在于提供一种通过在非洲猪瘟病毒中缺失或突变ASFV MGF-110-9L 基因降低毒株免疫抑制性和致病性的应用。所述的ASFV MGF-110-9L基因的具有天然免疫抑制的功能，能够抑制干扰素产生。
本发明的另一目的在于提供一种通过在非洲猪瘟病毒中缺失或突变ASFV MGF-110-9L 基因制备非洲猪瘟减毒病毒株的应用。制备的非洲猪瘟减毒病毒株可以单独缺失或突变ASF V MGF-110-9L基因，也可以同时缺失或突变ASFV MGF-110-9L基因及其他毒力基因，例如CD2V、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L或MGF360-505R。
本发明的另一目的在于提供一种通过在非洲猪瘟病毒中缺失ASFV MGF-110-9L基因制备非洲猪瘟减毒病毒株的应用。制备的非洲猪瘟减毒病毒株可以单独缺失ASFV MGF-110-9 L基因，也可以同时缺失ASFV MGF-110-9L基因及一种或几种其他毒力基因，例如CD2V、 MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L或MGF360-505R。
本发明的另一目的在于提供一种通过在非洲猪瘟病毒中缺失或突变ASFV MGF-110-9L 基因制备非洲猪瘟疫苗的应用。制备的非洲猪瘟疫苗可以单独缺失ASFV MGF-110-9L基因，也可以同时缺失ASFV MGF-110-9L基因及一种或几种其他毒力基因，例如CD2V、MGF360 -12L、MGF360-13L、MGF360-14L或MGF360-505R。
本发明的另一目的在于提供一种通过在非洲猪瘟病毒中缺失ASFV MGF-110-9L基因制备非洲猪瘟疫苗的应用。制备的非洲猪瘟疫苗可以单独缺失ASFV MGF-110-9L基因，也可以同时缺失ASFV MGF-110-9L基因及一种或几种其他毒力基因，例如CD2V、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L或MGF360-505R。
优选地，所述的非洲猪瘟病毒包括基因II型非洲猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒CN/GS/2018 分离株。
优选地，所述的猪瘟病毒为非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株。
本发明的另一目的在于提供一种制备减毒非洲猪瘟病毒株的方法，所述的方法是通过基因工程手段将原始毒株的ASFV MGF-110-9L基因序列缺失，所述ASFV MGF-110-9L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述ASFV MGF-110-9L基因序列的缺失方法包括如下步骤：
(1)pX330优化；通过ClonExpress II一步法克隆法去除pX330的Cas9酶两端的核定位信号NLS，命名为pX330ΔN；
(2)设计针对ASFV MGF-110-9L基因的靶向寡核苷酸MGF1109L-gRNA-LF和MGF1109L-gRNA-R，将寡核苷酸配对插入pX330-ΔN载体中，制备阳性克隆质粒pX330ΔN-9LL 和pX330ΔN-9LR；其中，所述MGF1109L-gRNA-LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，MGF1109L-gRNA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(3)设计ASFV MGF-110-9L基因上下游序列各1.0kb作为同源重组臂，并同时克隆入 pUC19载体中，获得ASFV MGF-110-9L重组转移载体；
(4)在ASFV MGF-110-9L重组转移载体左、右臂基因序列中间插入eGFP筛选表达盒基因片段p72-eGFP-SV40poly，获得同源重组转移载体p9LLR-eGFP；
(5)将同源重组转移载体p9LLR-eGFP、pX330ΔN-9LL、pX330ΔN-9LR和
Figure RE-GDA0002481761680000031
rophage DNA转染试剂充分混匀，共转染至取自2-4月龄健康SPF巴马小型猪的BMDM细胞，直接感染非洲猪瘟原始病毒株；
(6)病毒株筛选：利用9L-check-F/R引物对重组病毒株筛选，获得ASFV MGF-110-9L 基因序列缺失的减毒非洲猪瘟病毒株MGF-Δ9L，所述9L-check-F/R引物对为的核苷酸序列如 SEQ ID NO.13-14所示。
优选地，所述原始毒株为非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株。
优选地，所述减毒非洲猪瘟病毒株MGF-Δ9L相较于非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株的全长序列缺失了第11627-12499位的核苷酸。
本发明的另一目的在于提供一种根据上述方法制备获得的减毒非洲猪瘟病毒株。
本发明的另一目的在于提供一种根据上述方法制备获得的非洲猪瘟疫苗。
本发明的另一目的在于提供一种ASFV MGF-110-9L基因缺失或突变的非洲猪瘟疫苗。
优选地，所述非洲猪瘟疫苗除了缺失或突变ASFV MGF-110-9L基因外，还同时缺失或突变包括CD2V、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L或MGF360-505R中一种或多种毒力基因。
本发明的有益效果是：①本发明通过缺失ASFV MGF-110-9L后，降低了非洲猪瘟病毒株的免疫抑制性和致病性，促进干扰素的产生；②本发明通过仅缺失ASFV MGF-110-9L后，获得了一种减毒非洲猪瘟病毒株；③所述的减毒非洲猪瘟病毒株毒力显著致弱，具有良好的安全性能；④通过在亲本毒株中缺失ASFV MGF-110-9L，进而降低了亲本毒株的毒性，为未来成功制备非洲猪瘟疫苗提供了理论依据和实践参考，研究人员可以通过同时敲除ASFV MGF-110-9L及已公开的一种或几种毒力基因(例如CD2V、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、MGF360-505R等)，最终制备出安全有效的非洲猪瘟疫苗。
附图说明
图1ASFV MGF-110-9L基因敲除策略示意图；
图2转染供体载体、Cas9打靶载体6h后，接种1MOI CN/GS/2018分离株并继续培养48h 后疑似重组毒感染细胞的荧光成像图；
图3单个GFP阳性细胞接种96孔板中PAM细胞72h后的荧光成像图；
图4检测减毒非洲猪瘟病毒株MGF-Δ9L是否构建成功的结果图；
图5ASFV MGF-110-9L基因抑制HT-DNA诱导的IFN-β的活性结果图；
图6非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株和减毒非洲猪瘟病毒株MGF-Δ9L感染动物后血液带毒结果对比图；
图7减毒非洲猪瘟病毒株MGF-Δ9L攻毒实验的致死结果图；
图8非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株和减毒非洲猪瘟病毒株MGF-Δ9L感染动物后血液中I FN-β含量结果对比图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。
定义
术语“基因缺失”是指缺失是指染色体上某一区段及其带有的基因一起丢失，从而引起变异的现象，本发明通过缺失ASFV MGF-110-9L基因获得了减毒非洲猪瘟重组病毒，降低了亲本毒株的毒性。
术语“基因突变”是指基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，就是在一个位点上，突然出现了一个新基因，代替了原有基因，这个基因叫做突变基因，基因突变导致后代的表现中也就突然地出现从未有的新性状。在本发明中通过缺失ASFV MGF -110-9L基因获得了减毒非洲猪瘟重组病毒，降低了亲本毒株的毒性的基础上，本领域技术人员通过将ASFV MGF-110-9L基因突变，也能使ASFV MGF-110-9L基因原有的性能消失，实现减毒非洲猪瘟重组病毒的构建。
基因缺失的方法一般是指基因敲除，是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。基因敲除的方法一般包括：同源重组技术、随机插入突变技术以及RNA 干扰技术；
其中，同源重组技术又叫基因打靶，是指外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组，并整合到预定的位置上，从而改变某些遗传特性的方法，重组的目的是为了敲除某个基因；随机插入突变技术是指利用某些能随机插入基因序列的病毒、细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞；RNA干扰技术是指由与生物体内源靶基因mRNA同源的双链RN A特异性引发的靶mRNA降解，导致目的基因表达沉默的一种反向遗传学技术。
本发明虽然仅通过同源重组技术对ASFV MGF-110-9L基因进行敲除，但是通过上述随机插入突变技术以及RNA干扰技术也能够对ASFV MGF-110-9L基因进行敲除。
术语“疫苗”是指能够在动物中提供保护性应答的生物制剂，其中所述疫苗已经被递送并且不能造成严重疾病。本发明的疫苗是遗传工程改造的基因缺失减毒病毒疫苗，其中所述缺失的基因为ASFV MGF-110-9L，应当理解的是所述缺失的基因还可以包括毒力基因(例如CD2V、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、MGF360-505R等)中的任何一种或几种；
突变被理解为在亲本CN/GS/2018ASFV毒株中野生型或未修饰的ASFV MGF-110-9L基因的遗传信息中的变化。应当理解的是，由ASFV MGF-110-9L基因突变获得重组突变体也可以作为减毒病毒疫苗。
以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和非洲猪瘟实验室活动许可：
中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL-3)和非洲猪瘟相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报，获得农业部关于开展高致病性ASFV病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。
以下实施例中所述的实验细胞、病毒以及质粒来源：
原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)及原代骨髓巨噬细胞(BMDM)取自2-4月龄健康长白猪，无菌采集细胞后，用红细胞裂解液(购自Biosharp公司)，去除红细胞，低速离心后，弃上清，将细胞沉淀重悬于含有10％FBS(购自PAN公司)的RPMI 1640完全培养基(购自Gibco 公司)中，置于37、℃5％CO2培养箱中培养。BMDM细胞培养需在RPMI 1640完全培养基中额外添加10ng/mL终浓度的重组猪GM-CSF(购自R&D Systems公司)，置于37℃、5％ CO2培养箱中诱导，每2-3天洗涤一次，将未贴壁细胞离心后重新加入新的细胞皿中，换液继续诱导，经3-7天后冻存或使用。利用PAM细胞扩增ASFV，并进行病毒含量的滴定，B MDM细胞用于质粒转染和病毒重组实验。
ASFV CN/GS/2018分离株为中国农业科学院兰州兽医研究所非洲猪瘟区域实验室分离株，属于基因II型，病毒效价为5×107TCID50/mL，为PAM细胞扩繁后的第4代种毒，分装保存于-80℃备用。
pX330载体、peGFP-N1载体、pUC19载体、IFN-β报告质粒、PCMV质粒均购买于兰州瑞博莱生物科技有限公司；无内毒素的质粒提取试剂盒，购于OMEGA公司。
HEK293细胞，购于ATCC公司；ELISA试剂盒(SEKP-0046)，购于索莱宝公司；Lipofectamine TM 2000，购于Invitrogen公司；HT-DNA，购于Sigma公司。
实验中其他的材料没有说明均为市售产品，其他的操作如果没有特别说明均是本领域知晓的操作方法。
实施例1重组病毒MGF-Δ9L的构建及纯化鉴定
1.CRISPR/Cas9载体构建
(1)pX330载体优化：由于非洲猪瘟病毒主要在细胞质病毒工厂内复制，因此在构建p CRISPR/Cas9载体时，首先将pX330进行优化；通过ClonExpress II一步法克隆法去除其Ca s9酶两端的核定位信号(NLS)，命名为pX330ΔN。
(2)设计针对ASFV MGF-110-9L基因的靶向gRNAs，其寡核苷酸名称和序列分别为：MGF1109L-gRNA-LF：CTCCTGTTCCTGGAAAAGATTGG’(SEQ ID NO.3所示)和MGF1 109L-gRNA-RF：TTAATTGTACAGTTTCCCGGTGG(SEQ ID NO.4所示)。
(3)参照文献(Ran FA,Hsu PD,Wright J,Agarwala V,Scott DA,Zhang F.Genomeengineering using the CRISPR-Cas9system.NatProtoc.2013；8(11):2281-2308)推荐的克隆方法，将寡核苷酸MGF1109L-gRNA-LF和MGF1109L-gRNA-RF分别插入到pX330-ΔN载体中，提取质粒DNA，经测序正确后，分别将阳性克隆质粒命名为：pX330ΔN-9LL和pX330 ΔN-9LR。用无内毒素的质粒提取试剂盒提取DNA，测定浓度，-20℃保存备用。
2.筛选表达盒构建
为了便于筛选，共构建一套筛选标记基因的表达盒，即增强型绿色荧光蛋白(Enhance Green fluorescent protein，eGFP)基因筛选表达盒构建：
参照文献(O'Donnell V,Holinka LG,Krug PW,Gladue DP,Carlson J,SanfordB,Alfa no M,Kramer E,Lu Z,Arzt J,Reese B,Carrillo C,Risatti GR,BorcaMV.African Swine Fever Virus Georgia 2007with a Deletion of Virulence-Associated Gene 9GL(B119L),when Administered at Low Doses,Leads to VirusAttenuation in Swine and Induces an Effective Protection against HomologousChallenge.JVirol.2015；89(16):8556-66)，通过PCR扩增p 72启动子(从p72基因上游的-196nt到+17之前序列)，备用；扩增引物为：正向引物5’-TT ATAAAACATATGTTCATAAAAAGGGTCGCCGGAGGAAAAGTC-3’(SEQ ID NO.5所示)和反向引物5’-CTCCTCGCCCTTGCTCACCATATATAATGTTATAAAAATAATT-3’(SEQ ID NO. 6所示)；以peGFP-N1载体为模板，扩增eGFP基因，备用，扩增引物为：正向引物5’-ATG GTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’(SEQ ID NO.7所示)和反向引物5’-ACCACAACTAGAAT GCAGTG-3’(SEQ ID NO.8所示)；
参照文献(Borca MV,Holinka LG,Berggren KA,Gladue DP.CRISPR-Cas9,a toolto efficiently increase the development of recombinant African swine feverviruses.Sci Rep.20 18；8(1):3154.)，将上述步骤扩增获得的p72启动子和eGFP两个基因通过融合PCR的方法连接，获得eGFP筛选表达盒基因片段，命名为p72-eGFP-SV40polyA，该表达盒序列含SV40p olyA终止序列。
3.同源重组转移载体的构建
利用pUC19载体作为骨架载体，构建ASFV MGF-110-9L基因敲除用同源重组转移载体，所述的ASFV MGF-110-9L基因的核苷酸序如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述的ASFV MGF-110-9L基因位于非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株全基因序列的11627-12499，构建策略见图1。
具体步骤为：设计ASFV MGF-110-9L基因上下游序列各1.0kb作为同源重组左臂(Lef t arm)和右臂(Right arm)，并分别克隆入pUC19载体中，获得ASFV MGF-110-9L的重组转移载体；在ASFV MGF-110-9L的重组转移载体左、右臂基因序列中间插入eGFP筛选表达盒基因片段p72-eGFP-SV40poly；经测序正确后，将该同源重组转移载体命名为p9LLR-eGFP；用无内毒素的质粒提取试剂盒提取DNA，测定浓度，-20℃保存备用。
4.细胞转染和重组病毒筛选
将同源重组转移载体p9LLR-eGFP(2μg)、pX330ΔN-9LL(1μg)、pX330ΔN-9LR(1μg)和12μL的
Figure RE-GDA0002481761680000081
DNA转染试剂充分混匀，共转染至猪BMDM细胞(细胞数约为106个/孔)，转染6h后，直接感染非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株(按1MOI感染量)，不换液，至感染48h，在荧光显微镜下观察荧光细胞数。结果如图2中A所示，在荧光显微镜下可见有零星荧光，即视为可疑重组毒感染的细胞；对照可见光(如图2B所示)，挑取所有单孔中的荧光细胞，在新的培养皿中小心吹散，沉降1h，挑取单个荧光细胞，收集后反复冻融3次，接种预先铺好的96孔板PAM细胞中，每12h观察一次，观察出现荧光的细胞孔并标记，继续观察至72h。结果如图3所示，部分孔中荧光细胞数量比例可达100％，为全阳性孔，这说明重组毒构建基本成功。
对该全阳性孔进行6次有限稀释扩大培养，挑取第8代重组病毒孔消化成单个细胞，小心吸取10个荧光细胞，分别接种于预先铺好的96孔板PAM细胞中，继续生长72h。挑取GFP荧光细胞较多的两孔细胞，提取基因组DNA，利用9L基因的p72-eGFP定点整合检测引物对进行PCR鉴定，检测p72-eGFP-SV40pA原件是否整合到了9L基因位点；同时利用9L- check-F/R引物对其纯净度进行PCR鉴定，其中p72-eGFP定点整合检测引物对包括：左同源臂插入的检测引物对ASFV-20-LA-R：ATGTGGATAAGTATGGGATGTTGG(SEQ ID NO.9 所示)和ASFV-recomb-LA-F：TGCTTTAAAAAACCTCCCACACCT(SEQ ID NO.10所示)；右同源臂插入的检测引物对ASFV-recomb-RA-R：ATGGCGGTTTATGCGAAGGATCTT(SE Q ID NO.11所示)和ASFV-20-RA-F：ACACAACATGAAGGTTCTAGGACT(SEQ ID NO. 12所示)。纯净性检测的9L-check-F/R引物对为：MGF-110-9L-check-F：TACGCATTTGCAT CGGATTA(SEQ ID NO.13所示)和MGF-110-9L-check-R：ATGCAAGCCGCTACAAGACT (SEQ ID NO.14所示)。
实验结果如图4所示，其中A为跨同源臂PCR检测两株△M GF110-9L重组病毒中p72- eGFP是否正确插入到9L基因靶点的结果图，其中wt为非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株， 1和2代表△MGF110-9L重组毒，结果表明，这两个单细胞接种细胞后得到了重组病毒，并且p72-eGFP-SV40pA原件均有正确插入到9L基因位点；B为通过设在内源9L基因中的引物检测这两株△M GF110-9L重组毒是否还存在非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株的结果图，其中wt为非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株，1和2代表△MGF110-9L重组病毒，结果表明，这两个孔的重组病毒的基因组中均已经检测不到9L基因，说明ASFV MGF-110-9L基因敲除成功；以上结果表明这两株重组病毒已重组成功，并且已纯化。并将重组病毒命名为MGF- Δ9L。
实施例2 ASFV MGF-110-9L免疫抑制实验
将状态良好的HEK293细胞用胰酶消化后铺于48孔板，放到37℃，5％CO2细胞恒温箱培养培养12h，待细胞密度将近70％-80％即可进行Lipofectamine TM 2000转染，将100ng 的IFN-β报告质粒，10ng的内参TK，和100ng的MGF-110-9L质粒(将ASFV MGF-110-9L基因插入到PCMV质粒中，获得PCMV-MGF-110-9L质粒)同步转染到HEK293细胞中，转染24h后，将转染成功的细胞再次转染HT-DNA(1μg/mL)，转染12h。实验中至少设置三个平行孔以保证实验结果的可靠性。每孔加入50μL1×passive lysis buffer室温裂解15-20min，充分裂解后检测双荧光素酶报告基因活性。结果如图5所示，ASFV MGF-110-9L能够显著抑制HT-DNA诱导的IFN-β的活性，具有免疫抑制作用。
实施例3病毒滴度的滴定
非洲猪瘟病毒的滴定采用半数血球吸附量(50％haemadsorption，HAD50)方法进行操作。参照文献(Borca MV,Ramirez-Medina E,Silva E,Vuono E,Rai A,Pruitt S,Holinka LG, Velazquez-Salinas L,Zhu J,GladueDP.Development of a highlyeffective African swine feve r virus vaccine by deletion of the I177L generesults in sterile immunity against the current epidemic Eurasiastrain.JVirol.2020.pii:JVI.02017-19)进行HAD50试验操作，并作适当调整：在96孔细胞培养板中接种原代PBMC(Mason,D.W.,W.J.Penhale,and J.D.Sedgw ick,1987:Preparation of lymphocytes subpopulations.In:Klaus,G.G.B.(ed.)Lymphocytes: aPractical Approach,pp.35-54.IRL Press,Oxford.)，将待检样品进行10倍梯度稀释，每孔接种0.02ml，病毒感染可根据红细胞在感染细胞周围聚集形成的玫瑰花环进行判定，观察 7天，根据Reed and Muench方法(Reed，L.andH.Muench，A simple method of estimaing fifty percent endpoints.American Journal of Epidemiology 1938.27：p.493-497)计算半数血球吸附剂量(HAD50)，滴度测定合格，进行致病性评价。
实施例4缺失病毒ASFV MGF-Δ9L毒力评价
为了检测ASFV MGF-110-9L基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株MGF-Δ9L的毒力，本实验用10HAD50剂量经肌肉注射仔猪对其毒力进行评价。
本实验用10头非洲猪瘟抗原抗体阴性的健康长白仔猪，共分为2组每组五头分别攻非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株和ASFV MGF-110-9L基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株MGF-Δ9L，攻毒后每天测量体温变化情况，采集外周血和唾液，参照文献(King DP,Reid SM,Hutchin gs GH,Grierson SS,Wilkinson PJ,Dixon LK,Bastos AD,DrewTW.2003.Development of a TaqMan PCR assay with internal amplification controlfor the detection of African swi ne fever virus.J Virol Methods 107:53-61)，通过荧光定量PCR方法测定血液中的ASFV病毒含量，观察至19天终止，实验结果如图6所示。
攻缺失毒后存活的三头猪的病毒载量均处于较低水平，且ASFV MGF-110-9L基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株MGF-Δ9L组与非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株组有显著性差异，实验结果证明，非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株缺失ASFV MGF-110-9L基因后，获得的ASFV MGF-110-9L基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株MGF-Δ9L的毒力相较于非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株的毒力大部分致弱。
非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株经过肌肉注射10HAD50后出现ASFV典型症状，高温发热，到后期全部死亡，而ASFV MGF-110-9L基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株MGF-Δ9L组的结果显示大部分动物经过高温发热后下降到正常体温，只有两头显示ASFV典型症状而死，存活率为60％，结果如图7所示。
实施例5 ASFV MGF-110-9L基因缺失毒株MGF-Δ9L的免疫抑制实验
为了评价ASFV MGF-110-9L基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株MGF-Δ9L的免疫抑制活性，分别采用ELISA实验检测实施例4中攻非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株和ASFV MGF-110-9L基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株MGF-Δ9L十天后的仔猪血清中的IFN-β的含量，结果如图8所示，与攻毒亲本毒株十天后仔猪血清中的IFN-β的含量相比，攻毒ASFV MGF-110-9L基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株MGF-Δ9L十天后仔猪血清中的IFN-β的含量显著增加，解除了基因ASFV MGF-110-9L对仔猪的免疫抑制。
综上所述，研究人员可以通过同时敲除ASFV MGF-110-9L及已公开的一种或几种毒力基因(例如CD2V、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、MGF360-505R等)，最终制备出安全有效的非洲猪瘟疫苗。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种天然免疫抑制基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒株及应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 873
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 1
atgaaggtga ttgtgttcct tttggtactg gcggtcatgc agccggtcat tcaaagccaa 60
tcttttccag gaacaggaga gttaccaatg acccggagac ctccaaagag agagcttgag 120
tattggtgca cctatgcaaa atcgtgtgac ttctgctgga attgtcgaca cggggtttgt 180
aaaaataagg tttttgaaaa acaccctctc atcaaaaaaa atgattacat acaaatatgt 240
agggtttctc gctataatga aagatgtagc tactttacag actctaggat acgccgcttt 300
cacatcatga gctgtacaaa tcccacatat tatgattggt ttgatgagtt aatgcaaata 360
aaggaggata gggtcattga cactgagaat atcaaacata cttgtctttg tatgatagct 420
accattgctc tcataagcta tgttcgcaaa caatactcac gaatgcgaat gcaagccgct 480
acaagactgc ttatctttct tggcttctat gttcttttag gaattttgat gacgaacata 540
ataatgaacc tacctctttc cacagataat ccgatgcaaa tgcgtaggcc tcctgaaagg 600
gatctcaagt tctggtgcac ctatgcaaaa cactgtgact tctgctggac ctgtaaagat 660
ggaatgtgta aaaataaagt gtttagtgac caccctatta ttacgcaaaa tgattatatt 720
gttaattgta cagtttcccg gtggcatgac cggtgtatgt atgaagctca ctttaggata 780
cactatcaac ataacatgaa ttgttcacaa cccaaagatt tagaatggtt cattgagtta 840
aaacgacatg tgattaatca agatgatttg taa 873
<210> 2
<211> 290
<212> PRT
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 2
Met Lys Val Ile Val Phe Leu Leu Val Leu Ala Val Met Gln Pro Val
1 5 10 15
Ile Gln Ser Gln Ser Phe Pro Gly Thr Gly Glu Leu Pro Met Thr Arg
20 25 30
Arg Pro Pro Lys Arg Glu Leu Glu Tyr Trp Cys Thr Tyr Ala Lys Ser
35 40 45
Cys Asp Phe Cys Trp Asn Cys Arg His Gly Val Cys Lys Asn Lys Val
50 55 60
Phe Glu Lys His Pro Leu Ile Lys Lys Asn Asp Tyr Ile Gln Ile Cys
65 70 75 80
Arg Val Ser Arg Tyr Asn Glu Arg Cys Ser Tyr Phe Thr Asp Ser Arg
85 90 95
Ile Arg Arg Phe His Ile Met Ser Cys Thr Asn Pro Thr Tyr Tyr Asp
100 105 110
Trp Phe Asp Glu Leu Met Gln Ile Lys Glu Asp Arg Val Ile Asp Thr
115 120 125
Glu Asn Ile Lys His Thr Cys Leu Cys Met Ile Ala Thr Ile Ala Leu
130 135 140
Ile Ser Tyr Val Arg Lys Gln Tyr Ser Arg Met Arg Met Gln Ala Ala
145 150 155 160
Thr Arg Leu Leu Ile Phe Leu Gly Phe Tyr Val Leu Leu Gly Ile Leu
165 170 175
Met Thr Asn Ile Ile Met Asn Leu Pro Leu Ser Thr Asp Asn Pro Met
180 185 190
Gln Met Arg Arg Pro Pro Glu Arg Asp Leu Lys Phe Trp Cys Thr Tyr
195 200 205
Ala Lys His Cys Asp Phe Cys Trp Thr Cys Lys Asp Gly Met Cys Lys
210 215 220
Asn Lys Val Phe Ser Asp His Pro Ile Ile Thr Gln Asn Asp Tyr Ile
225 230 235 240
Val Asn Cys Thr Val Ser Arg Trp His Asp Arg Cys Met Tyr Glu Ala
245 250 255
His Phe Arg Ile His Tyr Gln His Asn Met Asn Cys Ser Gln Pro Lys
260 265 270
Asp Leu Glu Trp Phe Ile Glu Leu Lys Arg His Val Ile Asn Gln Asp
275 280 285
Asp Leu
290
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcctgttcc tggaaaagat tgg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttaattgtac agtttcccgg tgg 23
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttataaaaca tatgttcata aaaagggtcg ccggaggaaa agtc 44
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctcctcgccc ttgctcacca tatataatgt tataaaaata att 43
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tggtgagcaa gggcgaggag 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
accacaacta gaatgcagtg 20
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgtggataa gtatgggatg ttgg 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgctttaaaa aacctcccac acct 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggcggttt atgcgaagga tctt 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acacaacatg aaggttctag gact 24
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tacgcatttg catcggatta 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atgcaagccg ctacaagact 20

Claims (16)

1.一种ASFV MGF-110-9L基因，其特征在于，所述ASFV MGF-110-9L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.通过在非洲猪瘟病毒中缺失或突变如权利要求1所述的ASFV MGF-110-9L基因降低非洲猪瘟病毒株免疫抑制性和致病性的应用。
3.通过在非洲猪瘟病毒中缺失或突变如权利要求1所述的ASFV MGF-110-9L基因制备非洲猪瘟减毒病毒株的应用。
4.通过在非洲猪瘟病毒中缺失如权利要求1所述的ASFV MGF-110-9L基因制备非洲猪瘟减毒病毒株的应用。
5.通过在非洲猪瘟病毒中缺失或突变如权利要求1所述的ASFV MGF-110-9L基因制备非洲猪瘟疫苗的应用。
6.通过在非洲猪瘟病毒中缺失如权利要求1所述的ASFV MGF-110-9L基因制备非洲猪瘟疫苗的应用。
7.如权利要求2-6任一所述的应用，其特征在于，所述的非洲猪瘟病毒包括基因II型非洲猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述猪瘟病毒为非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株。
9.一种制备减毒非洲猪瘟病毒株的方法，其特征在于，所述的方法是通过基因工程手段将非洲猪瘟原始毒株的ASFV MGF-110-9L基因序列缺失，所述ASFV MGF-110-9L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述ASFV MGF-110-9L基因序列的缺失方法包括如下步骤：
(1)pX330优化；通过ClonExpress II一步法克隆法去除pX330的Cas9酶两端的核定位信号NLS，命名为pX330ΔN；
(2)设计针对ASFV MGF-110-9L基因的靶向寡核苷酸MGF1109L-gRNA-LF和MGF1109L-gRNA-R，将寡核苷酸配对插入pX330-ΔN载体中，制备阳性克隆质粒pX330ΔN-9LL和pX330ΔN-9LR；其中，所述MGF1109L-gRNA-LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，MGF1109L-gRNA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(3)设计ASFV MGF-110-9L基因上下游序列各1.0kb作为同源重组臂，并同时克隆入pUC19载体中，获得ASFV MGF-110-9L重组转移载体；
(4)在ASFV MGF-110-9L重组转移载体左、右臂基因序列中间插入eGFP筛选表达盒基因片段p72-eGFP-SV40poly，获得同源重组转移载体p9LLR-eGFP；
(5)将同源重组转移载体p9LLR-eGFP、pX330ΔN-9LL、pX330ΔN-9LR和
Figure FDA0002430164260000021
-Macrophage DNA转染试剂充分混匀，共转染至取自2-4月龄健康SPF巴马小型猪的BMDM细胞，直接感染非洲猪瘟原始毒株；
(6)病毒株筛选：利用9L-check-F/R引物对对重组病毒株筛选，获得ASFV MGF-110-9L基因序列缺失的减毒非洲猪瘟病毒株MGF-Δ9L，所述9L-check-F/R引物对的核苷酸序列如S EQ ID NO.13-14所示。
11.如权利要求9-10任一所述的方法，其特征在于，所述非洲猪瘟原始毒株为非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的减毒非洲猪瘟病毒株MGF-Δ9L相较于非洲猪瘟病毒CN/GS/2018分离株的全长序列缺失了第11627-12499位的核苷酸。
13.根据权利要求9-10任一所述的方法制备获得的减毒非洲猪瘟病毒株。
14.根据权利要求9-10任一所述的方法制备获得的非洲猪瘟疫苗。
15.一种ASFV MGF-110-9L基因缺失或突变的非洲猪瘟疫苗。
16.如权利要求15所述的非洲猪瘟疫苗，其特征在于，还包括CD2V、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L或MGF360-505R中一种或多种毒力基因的缺失或突变。
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WO2022218325A1 (zh) * 2021-04-13 2022-10-20 金宇保灵生物药品有限公司 一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株及其构建方法和应用

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