CN113736746B - 非洲猪瘟病毒细胞系适应毒株的制备、特性分析及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了在传代细胞系中良好复制的非洲猪瘟病毒(ASFV)适应毒株及其应用。本发明通过不同传代细胞系的感染实验发现ASFV野毒株(ASFV‑WT)可在HEK293T细胞中低水平复制。将ASFV‑WT在HEK293T细胞中连续传代适应获得了可在HEK293T细胞高效增殖的ASFV适应毒株ASFV‑P61，其病毒滴度最高可以达到107 . 5TCID50/mL，该适应毒株的微生物保藏编号是CCTCC NO：V202153。此外，该适应毒株基因组5’端的多基因家族缺失基因(包含多个毒力相关基因)序列达20kb左右，表明其毒力可能已经致弱，具有研制成为非洲猪瘟疫苗候选株的潜能。

Description

非洲猪瘟病毒细胞系适应毒株的制备、特性分析及其应用
技术领域
本发明涉及非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)细胞系适 应毒株，尤其涉及在传代细胞系中良好复制的ASFV适应毒株及其可能应 用，属于ASFV细胞系适应毒株及其应用领域。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)引起猪的一种接触传染性、广泛出血性、烈性传染病， 最急性和急性型感染死亡率可高达100％(Galindo I,Alonso C.African Swine Fever Virus:AReview.Viruses,2017,9(5).pii:E103.)。ASFV是非 洲猪瘟相关病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)的唯一成 员，也是目前所知唯一可经虫媒传播的DNA病毒(Dixon LK,Chapman DA, Netherton CL,Upton C.African swine fever virusreplication and genomics. Virus Res,2013,173(1):3-14.)。ASFV主要感染单核-巨噬细胞，可通过巨 胞饮或网格蛋白介导的内吞完成其入侵细胞。成熟的ASFV病毒粒子结构复杂，主要由基因组、内核心壳、内膜、衣壳和囊膜5部分组成。ASFV 的基因组是约190kb的双链线性DNA分子，可编码近200种蛋白，主要 由3部分组成：末端的发卡环结构、紧邻末端由多基因家族构成的可变区 以及中间比较稳定的保守区。多基因家族基因拷贝数的不同会造成ASFV 不同分离株基因组大小存在差异。ASFV的基因型复杂多变，目前已鉴定 出24种基因型(Quembo CJ,Jori F,Vosloo W,Heath L.Genetic characterization ofAfrican swine fever virus isolates from soft ticks at the wildlife/domesticinterface in Mozambique and identification of a novel genotype.TransboundEmerg Dis.2018,65(2):420-431.)。东欧及高加索地 区流行的主要是基因II型，西非地区主要是基因I型，东非和南非则有20 多种基因型。根据ASFV红细胞吸附抑制特性，可将其分为8个血清群。
ASFV野毒株具有严格的细胞嗜性，主要感染单核巨噬细胞，因此原 代单核细胞或者肺泡巨噬细胞是体外研究ASFV与宿主互作的主要靶细 胞。然而原代细胞的制备费时费力花费巨大、批间重复性差、易污染的特 性限制了ASFV的基础和应用研究。缺乏可支持ASFV良好复制的细胞系 严重制约了ASFV基因功能的研究、毒力相关因子的挖掘、病毒分离和活 疫苗的大规模制备(Sánchez EG,Riera E,Nogal M,Gallardo C,Fernández P,Bello-Morales R,López-Guerrero JA,Chitko-McKown CG,Richt JA,RevillaY.Phenotyping and susceptibility of established porcine cells lines toAfrican swine fever virus infection and viral production.Sci Rep.2017；7(1):10369.)。 在异种细胞传代适应是解决上述问题的途径之一。
在ASF疫苗的众多研发策略中，绝大多数是在原代猪肺泡巨噬细胞中 通过基因工程手段制备的活疫苗，此类疫苗可以提供不同程度的同源或者 异源保护，其他策略的疫苗候选株保护效率差强人意(Wang T,Sun Y,Qiu HJ.African swine fever:anunprecedented disaster and challenge to China. Infect Dis Poverty,2018,7(1):111.)。然而，ASFV基因缺失活疫苗的安全 性需要全面、系统的评估。在异种细胞上传代适应获得的ASFV弱毒株通 常伴随着免疫原性的丧失，无法对ASFV强毒株的攻击提供保护(Krug PW, Holinka LG,O'Donnell V,Reese B,Sanford B,Fernandez-Sainz I,GladueDP, Arzt J,Rodriguez L,Risatti GR,Borca MV.The progressive adaptation of ageorgian isolate of African swine fever virus to vero cells leads to agradual attenuation of virulence in swine corresponding to majormodifications of the viral genome.J Virol.2015；89(4):2324-2332.)。目前仍然缺乏支持ASFV有 效增殖并保持其免疫原性和基因组稳定性的传代细胞系(Sánchez EG,RieraE,Nogal M,Gallardo C,Fernández P,Bello-Morales R,López-Guerrero JA, Chitko-McKown CG,Richt JA,Revilla Y.Phenotyping and susceptibility of establishedporcine cells lines to African swine fever virus infection and viralproduction.Sci Rep.2017；7(1):10369.)。该问题严重限制了ASFV与宿主相 互作用的研究，未知功能基因的鉴定和ASF活疫苗的规模化生产。因此， 获得可以在传代细胞系良好增殖的ASFV适应毒株对于ASFV基础和应用 研究等具有重要的价值。
发明内容
本发明的主要目的是提供一株在传代细胞系上良好增殖的ASFV适应 毒株。
本发明的目的之二是将所述的ASFV细胞系适应毒株作为模式毒株应 用于ASFV基因功能、适应机制、致病机制等方面的研究或者应用于制备 ASF活疫苗等。
本发明通过不同传代细胞系的感染实验发现ASFV野毒株 ASFV/HLJ-18(ASFV-WT)可在HEK293T细胞中低水平复制。将ASFV-WT 在HEK293T细胞中连续传代适应，获得了可在该细胞系上良好增殖的 ASFV适应毒株。在HEK293T细胞上连续传代过程中，适应毒的复制能力 逐渐增加，但在猪原代肺泡巨噬细胞(PAM)中的复制能力降低。对不同 代次ASFV细胞系适应毒株的生物学特性研究发现，与ASFV-WT相比， 第31代(ASFV-P31)及后续适应毒株均可在HEK293T细胞良好增殖并 具有致细胞病变效应，病毒滴度可达107.5TCID50/mL以上；但适应毒株在 猪原代肺泡巨噬细胞的复制能力逐渐降低。不同代次适应毒株基因组高通量测序的结果表明，ASFV在适应HEK293T的过程中，基因组5’端的多基 因家族基因逐步缺失。其中，ASFV-P61基因组5’端的多基因家族缺失基 因(包含多个毒力相关基因)序列达20kb左右，表明其毒力可能已经致弱， 具有研制成为非洲猪瘟疫苗候选株的潜能。
本发明将第61代细胞系适应毒株(ASFV-P61)提交到专利认可的机 构进行保藏，其微生物保藏编号是CCTCC NO：V202153；保藏时间2021 年6月24日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉. 武汉大学。
本发明提供的非洲猪瘟病毒细胞系适应毒株主要包括以下几方面的 用途：
(Ⅰ)作为减毒株应用于制备防治非洲猪瘟的疫苗，尤其是制备防治 非洲猪瘟的减毒活疫苗。
(Ⅱ)作为研究工具(譬如模式毒株)应用于研究非洲猪瘟病毒基因 功能、适应机制、致病机制及免疫逃逸等。
本发明整体技术方案详述
为了选择ASFV的易感细胞系，本发明首先将ASFV-WT在HEK293T 细胞、Vero细胞、MA-104细胞、PK-15细胞、Marc-145细胞和3D4/21 细胞连续盲传5代，检测每代次病毒基因组拷贝数。结果表明，只有在 HEK293T细胞上ASFV-WT的基因组拷贝数从第3代(P3)开始增加，其 余均呈下降趋势。ASFV感染HEK293T细胞的间接免疫荧光和红细胞吸附 试验结果进一步表明，ASFV-WT可在HEK293T细胞低水平的复制。因此， 本研究选择将ASFV-WT在HEK293T细胞上连续传代适应。在传代适应 的过程中，从25代开始ASFV细胞系适应毒可以产生明显的细胞变圆、脱 落的致细胞病变效应，同时保留红细胞吸附特性。各代次适应毒的毒价逐 渐增加，P31代次的适应毒毒价达可达107.5TCID50/mL，之后不同代次的 适应毒毒价保持稳定，但是在原代PAM细胞的毒价呈逐渐降低的趋势。
本发明将ASFV-WT和各代次适应病毒以5MOI的剂量感染 HEK293T细胞，收取不同时间点的细胞上清和细胞，检测各代次适应毒的 基因组拷贝数和病毒滴度，结果表明随着传代次数的增加，ASFV在 HEK293T细胞的增殖能力逐渐提高，P31之后的不同代次适应毒均可在该 细胞系上进行良好复制，接毒后5d可达最高滴度(约107.5TCID50/mL)。 细胞上清与细胞内病毒滴度的结果相似，表明经传代适应后ASFV可有效 释放到细胞上清中。虽然ASFV-P11和ASFV-P21的病毒滴度低于 ASFV-P31，却显著高于野毒株在HEK293T细胞上的滴度，表明已经开始 逐步适应HEK293T细胞。将ASFV-WT和各代次适应病毒以5MOI感染 PAM细胞，收取不同时间点的细胞上清和细胞，检测各代次适应毒的基因 组拷贝数和病毒滴度，结果表明随着传代次数的增加ASFV各代次适应病 毒在原代PAM细胞的增殖能力逐渐降低。
为了进一步探究ASFV在适应HEK293T细胞过程中生物学特性改变 的机制，本发明利用高通量测序技术对不同代次适应毒的基因组进行测序 和组装。结果发现ASFV在适应HEK293T细胞过程中，基因组5’端MGF 基因逐渐缺失，如果缺失序列超过基因长度的50％则被认为是功能性失活。 首先ASFV-P11未发现基因缺失，缺失序列最早发现在ASFV-P21，缺失 序列导致MGF300-2R、MGF300-4L、MGF360-8L 3个基因功能失活。在 ASFV-P31进一步缺失了MGF300-1L和MGF360(9L、10L、11L)基因。 ASFV-P41与ASFV-P51基因组缺失基因与ASFV-P31相似，其中ASFV-P41 多缺失了MGF360-6L和X69R基因，而ASFV-P51多缺失了MGF100-1R 基因。在ASFV-P61中发现MGF110家族的9L、10-14L、12L、13La和13Lb 基因进一步缺失。
ASFV在适应HEK293T细胞的过程中，ASFV基因组的5'端不稳定区 中的基因逐渐缺失。本发明还发现，在ASFV适应HEK293T细胞的过程 中，基因组中的3'末端突变主要集中在I7L、I8L、I9L、I10L和MGF100-3L 基因上。然而，这些基因的功能尚不清楚，这些基因的突变是否影响ASFV 适应HEK293T细胞需进一步研究。
本发明发现ASFV适应HEK293T后基因的缺失主要在5'末端可变区 的多基因家族基因，这表明MGF基因大片段的缺失可能与ASFV异种细 胞的适应有关。更重要的是，本发明发现ASFV在适应HEK293T细胞的 过程中最早突变和缺失的基因序列是MGF300家族基因(1L、2R和4L) 和MGF360家族中的四个基因(8L、9L、10L和11L)。表明上述基因的 缺失对于ASFV在传代细胞的适应可能具有重要作用。
附图说明
图1ASFV的传代适应及其生物学特性试验结果；ASFV在HEK293T 细胞、Vero细胞、MA-104细胞、PK-15细胞、Marc-145细胞、3D4/21细 胞连续传代(A)；ASFV-WT感染HEK293T细胞的间接免疫荧光和红细 胞吸附检测(B)；ASFV-P61的致细胞病变(C)、ASFV-P61的红细胞吸附(D)、各代次适应毒的病毒滴度(E)。
图2各代次适应毒在HEK293T细胞复制动力学试验结果；ASFV-WT 和各代次适应毒感染HEK293T细胞的上清基因组拷贝数(A)与病毒滴度 (B)以及细胞内的基因组拷贝数(C)与病毒滴度(D)。
图3各代次适应毒在PAMs细胞复制动力学试验结果；ASFV-WT和 各代次适应毒感染原代PAM细胞的病毒滴度(A)与基因组拷贝数(B)。
图4各代次ASFV适应毒株基因组MGF基因缺失示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会 随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围 构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和 范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均 落入本发明的保护范围内。
试验例1在传代细胞系中良好复制的非洲猪瘟病毒适应毒株的筛选以及 性能测定
1材料和方法
1.1病毒、细胞和主要试剂
ASFV分离株ASFV HLJ/18毒株(Zhao D,Liu R,Zhang X,Li F,Wang J,Zhang J,Liu X,Wang L,Zhang J,Wu X,Guan Y,Chen W,Wang X,He X, Bu Z.Replication andvirulence in pigs of the first African swine fever virus isolated inChina.Emerg Microbes Infect.2019；8(1):438-447.)(GenBank登 录号：MK333180.1)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪烈性传染病创 新团队(本团队)保存。无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)猪的 原代肺泡巨噬细胞(PAMs)由本团队制备和保存。HEK293T细胞、PK-15 细胞、Marc-145细胞、3D4/21细胞、MA-104细胞和Vero细胞由本团队保存。RPMI 1640含L-谷氨酰胺培养基、DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco 公司。DNA提取试剂盒购自康宁生命科学有限公司。ASFV感染后的康复 猪阳性血清由本团队分离鉴定和保存。FITC标记的兔抗猪IgG购自 Sigma-Aldrich公司。TritonX-100购自Sigma-Aldrich公司(货号： 9002-93-1)。4％多聚甲醛固定液本团队配制。
1.2 ASFV的传代适应
将ASFV HLJ/18原液(约107TCID50/mL)1mL感染长满T25细胞瓶 的HEK293T细胞，37℃条件下培养2-3d，37℃/-80℃条件下冻融1次， 收取病毒命名为ASFV-P1。取ASFV-P1原液0.5mL感染长满T25细胞瓶 的HEK293T细胞，37℃条件下培养2-3d，37℃/-80℃条件下冻融1次， 收取病毒命名为ASFV-P2，以相同的方法连续传代，获得各代次适应毒株。
1.3原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)的分离与培养
按照如下操作制备猪原代肺泡巨噬细胞：
(1)无菌取肺，用含2％抗生素的RPMI 1640培养液进行灌洗。
(2)收集灌洗液，2000rpm/min，室温，离心5min。
(3)弃上清，加适量含2％抗生素的RPMI 1640培养液悬浮沉淀，管 数减半，2000rpm/min，室温，离心5min。(重复此步骤两次)
(4)弃上清，悬浮沉淀，2％抗生素的RPMI 1640培养液加至40mL， 用70μm细胞滤器过滤悬液。
(5)细胞计数后，加入细胞冻存液(90％FBS和10％DMSO)冻存细 胞。
(6)PAM细胞的复苏，将冻存的PAM细胞取出后，于37℃水浴中进 行解冻，室温条件下350×g离心3min，然后用1mL含10％FBS、2％双 抗的RPMI 1640培养液重悬细胞，计数后铺细胞板备用。
1.4间接免疫荧光
将ASFV感染HEK293T细胞，培养3-5d后弃去培养基，加入4％的 多聚甲醛固定液，500μL/孔，室温固定30min。弃去固定液，PBS清洗3 次，加入0.3％的Triton工作液，100μL/孔，室温通透15min，弃去0.3％ 的Triton工作液，PBS清洗3次，加入1:200稀释的ASFV阳性血清(一 抗)，200μL/孔，37℃孵育1h；弃去一抗，PBS清洗3次，避光条件下 加入1:300稀释的FITC标记的兔抗猪IgG二抗，200μL/孔，用锡箔纸包 裹后，37℃孵育1h。弃去二抗，PBS清洗3次，加入500μL PBS后，在 倒置荧光显微镜下观察。
1.5红细胞吸附试验(HAD)
将ASFV-WT和ASFV-P61感染24孔板中长满的HEK293T细胞，感 染后2-3d，按100μL/孔(106个红细胞)的量加入猪红细胞，继续培养2-3 d观察红细胞吸附情况。红细胞分离步骤如下：取5mL的肝素抗凝血加 45mL PBS中，室温1000rpm离心5min，弃上清，重复离心4次，获得 猪红细胞。
1.6 ASFV的毒价测定
(1)复苏原代PAM或者HEK293T细胞，每孔100μL/孔，铺96孔板。
(2)5％CO2培养箱中培养24h。
(3)取病毒原液100μL加入900μL含10％FBS 2％双抗的1640培养 液涡旋混匀(10-1)。
(4)同样稀释至10-8。
(5)弃去96孔细胞培养板中的培养液，将稀释好的病毒100μL每孔 加入96孔板中，一个稀释度加8孔。
(6)5％CO2培养箱中培养5d。
(7)按照1.4的方法测定病毒毒价。
1.7一步生长曲线
将HEK293T细胞铺24孔板，复苏PAM细胞铺24孔板。将ASFV HLJ/18和各代次适应毒以5MOI的剂量感染HEK293T细胞和PAM细胞， 将细胞置于37℃、5％CO2的37℃温箱中培养。在接毒后2h、24h、72h、 120h和168h分别收取上清和细胞，采用Reed-Muench法计算半数组织培 养感染剂量(TCID50)，按照1.6的方法测定各时间点病毒毒价，绘制一 步生长曲线。
1.8荧光定量PCR(Q-PCR)
取待检测的样品200μL，按照AxyPrepTM Body Fluid viral DNA/RNA 提取试剂盒说明书提取ASFV核酸。使用Takara公司生产的荧光定量试剂 盒和德国AppliedBiosystems公司生产的荧光定量PCR仪 (QuantStudio3&5)，并按照OIE推荐的检测方法进行定量检测(King DP, Reid SM,Hutchings GH,Grierson SS,Wilkinson PJ,Dixon LK,Bastos AD, Drew TW.Development of a TaqMan PCR assay with internalamplification control for the detection of African swine fever virus.J VirolMethods. 2003；107(1):53-61.)。
1.9高通量测序及分析
取200μL不同代次的ASFV适应毒株和野毒株感染细胞的上清，按照 TIANampVirus DNA/RNA Kit试剂盒说明书提取基因组，按照已报道的方 法(Wang L,Luo Y,ZhaoY,Gao GF,Bi Y,Qiu HJ.Comparative genomic analysis reveals an'open'pan-genomeof African swine fever virus. Transbound Emerg Dis.2020；67(4):1553-1562.)利用二代测序技术进行 ASFV病毒的全基因组测序和组装。利用MAFFT v7.471软件按照默认参数进行序列比对，SnpEff软件进行单核苷酸突变(SNP)分析。
1.10数据统计学分析
应用GraphPad Prism 8.0统计学软件对所有数据进行统计学分析，比 较各组间的差异。其中，p≥0.05为差异不显著；*，p<0.05为差异显著， **，p<0.01为差异极显著。
2试验结果
2.1 ASFV适应HEK293T细胞及其生物学特性
为了选择ASFV的易感细胞系，ASFV-WT首先在HEK293T细胞、 Vero细胞、MA-104细胞、PK-15细胞、Marc-145细胞和3D4/21细胞连续 盲传5代，检测每代次病毒基因组拷贝数。结果表明，只有在HEK293T 细胞ASFV-WT的基因组拷贝数从第3代(P3)开始增加，其余均为下降 趋势(图1A)。ASFV感染HEK293T细胞的间接免疫荧光和红细胞吸附 试验结果进一步表明ASFV-WT可在HEK293T细胞低水平的复制(图1 B)。因此，本试验选择将ASFV-WT在HEK293T细胞连续传代适应，获 得各代次适应毒。ASFV-P61可以产生明显的细胞变圆、脱落的致细胞病 变效应(图1C)，同时也未失去红细胞吸附特性(图1D)。在适应HEK293T 细胞的过程中，各代次适应毒的毒价逐渐增加，P31代次的适应毒毒价达 到最高，可达107.5TCID50/mL，之后不同代次的适应毒毒价保持稳定，但 是在原代PAM细胞的毒价逐渐降低(图1E)。
将ASFV-WT和各代次适应病毒以5MOI的剂量感染HEK293T细胞， 收取不同时间点的细胞上清和细胞，检测各代次适应毒的基因组拷贝数和 病毒滴度，结果表明随着传代次数的增加，ASFV在HEK293T细胞的增殖 能力逐渐提高，P31之后的不同代次适应毒均可在该细胞系上进行良好复 制，接毒后5d可达最高滴度。细胞上清与细胞内结果相似，表明经传代 适应后ASFV可有效释放到细胞上清中(图2)。虽然ASFV-P11和 ASFV-P21的病毒滴度低于ASFV-P31，却显著高于野毒株，表明已经开始 逐步适应HEK293T细胞。
同将ASFV-WT和各代次适应病毒以5MOI感染PAM细胞，收取不 同时间点的细胞上清和细胞，检测各代次适应毒的基因组拷贝数和病毒滴 度，结果表明随着传代次数的增加ASFV各代次适应病毒在原代PAM细 胞的增殖能力逐渐降低，表明其可能已经致弱。
2.2 ASFV适应HEK293T细胞过程中基因组的改变
为了进一步探究ASFV在适应HEK293T细胞过程中生物学特性改变 的机制，利用高通量测序技术对不同代次适应毒的基因组进行测序和组装。 结果发现ASFV在适应HEK293T细胞过程中，基因组5’端MGF的基因逐 渐缺失(图4)，首先ASFV-P11未发现基因缺失，缺失序列最早发现在 ASFV-P21，缺失序列导致MGF300-2R、MGF300-4L、MGF360-8L 3个基 因功能失活。在ASFV-P31进一步缺失了MGF300-1L和MGF360(9L、10L、 11L)基因。ASFV-P41与ASFV-P51基因组缺失基因与ASFV-P31相似， 其中ASFV-P41多缺失了MGF360-6L和X69R基因，而ASFV-P51多缺失 了MGF100-1R基因。在ASFV-P61中发现MGF110家族的9L、10-14L、12L、13La和13Lb基因进一步缺失。

Claims (5)

1.在传代细胞系上良好增殖的非洲猪瘟病毒细胞系适应毒株，其特征在于，其微生物保藏编号是CCTCC NO：V202153。
2.按照权利要求1所述的非洲猪瘟病毒细胞系适应毒株，其特征在于，所述的传代细胞是HEK293T细胞。
3.权利要求1所述的非洲猪瘟病毒细胞系适应毒株作为减毒株在制备防治非洲猪瘟疫苗中的用途。
4.按照权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的非洲猪瘟疫苗是非洲猪瘟病毒活疫苗。
5.权利要求1所述的非洲猪瘟病毒细胞系适应毒株在制备模式毒株中的用途。
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