CN113122654A - 非洲猪瘟病毒的检测靶标以及荧光定量pcr检测引物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了非洲猪瘟病毒的检测靶标以及荧光定量PCR检测引物。本发明以ASFV中国流行毒株为对象，选择多基因家族中相对保守又具研究和应用前景的MGF360‑13L基因为靶标，建立了ASFV MGF360‑13L TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。本发明方法可实现对最低15.6拷贝/μL ASFV核酸的检测，与多种病原不存在交叉反应，相比常规PCR检测方法，本发明检测方法在敏感性上高出3个数量级。本发明所建立的检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好，与已有的经典检测方法符合率高，能够对可疑样品进行二次确认，不仅丰富了ASFV现有检测靶标，也能鉴别ASFV MGF基因趋势疫苗毒与野毒感染。
Description
技术领域
本发明涉及病毒的检测靶标，尤其涉及非洲猪瘟病毒的检测靶标、荧光定量PCR检测引物以及由此建立的非洲猪瘟病毒MGF360-13L基因TaqMan荧光定量PCR检测方法，属于非洲猪瘟病毒的检测或诊断领域。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)感染猪引起的一种接触传染性、广泛出血性、烈性传染病，最急性和急性型感染死亡率可高达100％，是养猪业的头号杀手。该病目前已呈现出跳跃式传播，自2007年再次传入欧洲后，迅速扩散至俄罗斯、乌克兰、拉脱维亚、波兰等十多个东欧国家。2018年8月传入中国后，不到一年时间扩散至蒙古、朝鲜、以及越南、柬埔寨、老挝、缅甸韩国、泰国、东帝汶等多个亚洲国家。该病已呈现出全球流行趋势，对全球养猪业的健康发展造成了重大威胁。截止目前，中国已累计爆发ASF疫情158起，扑杀猪只超过数百万头，保守估计造成直接经济损失数百亿元。由于无商品化疫苗可用，加之ASFV污染面积较广，中国ASF的防控和根除形式异常严峻(王涛,孙元,罗玉子,仇华吉.非洲猪瘟防控及疫苗研发:挑战与对策.生物工程学报,2018,34(12):1931-1942.DIXON L K,ISLAM M,NASH R,REIS A L.Africanswine fever virus evasion of host defences.Virus Research,2019,266:25-33.)。
ASFV是目前所知唯一虫媒DNA病毒(GALINDO I,ALONSO C.African swine fevervirus:a review.Viruses,2017,9(5):103.)，也是非洲猪瘟相关病毒科的唯一成员，成熟的病毒粒子结构复杂，主要感染单核巨噬细胞(DIXON L K,CHAPMAN D A,NETHERTON C L,UPTON C.African swine fever virus replication and genomics.Virus Research,2013,173(1):3-14.GALINDO I,ALONSO C.African swine fever virus:areview.Viruses,2017,9(5):103.PENRITH M L,VOSLOO W.Review of African swinefever:transmission,spread and control.Journal of the South African VeterinaryAssociation,2009,80(2):58-62.)。ASFV基因组为170-194kb的双链线性DNA，可编码近200个蛋白，末端含有5个多基因家族，其中MGF360和MGF505基因对ASFV的复制、免疫逃逸及毒力有重要作用。有研究表明，MGF360和MGF505基因可增强ASFV在软蜱细胞内的复制，也可抑制Ⅰ型干扰素的产生(O'DONNELL V,HOLINKA LG,GLADUE DP,SANFORD B,KRUG PW,LU X,ARZT J,REESE B,CARRILLO C,RISATTI GR,BORCA MV.African swine fever virusGeorgia isolate harboring deletions of MGF360 and MGF505 genes is attenuatedin swine and confers protection against challenge with virulent parentalvirus.Journal of Virology,2015,89(11):6048-6056.)。ASFV Malawi Lil-20/1株缺失MGF360和MGF505基因可降低病毒毒力(NEILAN JG,ZSAK L,LU Z,KUTISH GF,AFONSO CL,ROCK DL.Novel swine virulence determinant in the left variable region of theAfrican swine fever virus genome.Journal of Virology,2002,76(7):3095-3104.AFONSO CL,ZSAK L,CARRILLO C,BORCA MV,ROCK DL.African swine fever virusNL gene is not required for virus virulence.Journal of General Virology,1998,79(10):2543-2547.)，缺失ASFV Georgia 2007株MGF360和MGF505(MGF)的6个基因(MGF505-1R、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、MGF505-2R和MGF505-3R)可使病毒显著致弱，并可对亲本强毒株的致死性攻击提供完全保护(O'DONNELL V,HOLINKA LG,GLADUEDP,SANFORD B,KRUG PW,LU X,ARZT J,REESE B,CARRILLO C,RISATTI GR,BORCAMV.African swine fever virus Georgia isolate harboring deletions of MGF360and MGF505 genes is attenuated in swine and confers protection againstchallenge with virulent parental virus.Journal of Virology,2015,89(11):6048-6056.)。中国分离的ASFV SY18株，缺失MGF基因可以显著降低病毒毒力，与国外报道一致；在此基础上进一步缺失CD2v基因后表现出了较好的安全性和保护效果(张艳艳,周鑫韬,齐宇,缪发明,王立冬,米立娟,杨金梅,张静远,张守峰,杨金金,王述超,蒋依倩,陈腾,扈荣良.非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗构建和免疫保护特性研究,中国兽医学报,2019,1-5.)。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所构建的MGF缺失和CD2v与MGF双基因缺失病毒，均能对中国流行的ASFV强毒株提供100％的免疫保护，可作为安全、有效的防控中国ASF疫情的候选疫苗株(步志高,陈伟业,赵东明,何希君,刘任强,柳金雄.基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的应用:CN110093324A.2019-04-26.)。
ASF对养猪业危害严重，且无安全有效疫苗及治疗药物可用，因此亟需开展综合防控技术及疫苗研发。现阶段，ASF的防控只能依靠加强生物安全措施、早期检测和严格的扑杀。由于ASF的临床症状与多种病毒及细菌性疾病感染极为相似。因此，其确诊必须借助实验室检测。针对ASF的检测技术主要有间接免疫荧光试验、红细胞吸附试验、病毒分离、聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR等(ARIAS M,DE LA TORRE A,DIXON L,GALLARDO C,JORI F,LADDOMADA A,MARTINS C,PARKHOUSE RM,REVILLA Y,RODRIGUEZ FAJ；SANCHEZ-VIZCAINO.Approaches and perspectives for development of African swine fevervirus vaccines.Vaccines(Basel),2017,5(4):35.OURA CA,EDWARDS L,BATTENCA.Virological diagnosis of African swine fever comparative study ofavailable tests.Virus Research,2013,173(1):150-158.)。
实时荧光定量PCR具有极高的灵敏性和特异性，广泛应用于包括ASFV在内的多种病原检测。目前，ASF的PCR及荧光定量PCR检测主要是针对ASFV B646L(p72)基因，诊断靶标相对单一(LUO Y,ATIM SA,SHAO L,AYEBAZIBWE C,SUN Y,LIU Y,JI S,MENG X Y,LI S,LIY,MASEMBE C,
K,
F,LIU L,QIU H J.Development of an updated PCRassay for detection of African swine fever virus.Archives of Virology,2017,162(1):191-199.)
因此，建立一种针对ASFV的新的检测靶标基因的ASFV荧光定量PCR检测方法对于早期检测防控该病，深入研究ASFV致病机制以及将来疫苗株与野毒感染的鉴别诊断都至关重要。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种诊断或检测ASFV的新的检测靶标基因；
本发明的目的之二提供用于荧光定量PCR检测ASFV的阳性质粒标准品；
本发明目的之三是提供扩增所述检测靶标基因的PCR引物；
本发明的目的之四是针对ASFV的新的诊断靶标基因，建立一种针对新的检测靶标基因的ASFV荧光定量PCR检测方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明以ASFV中国流行毒株为对象，选择多基因家族中相对保守又具研究和应用前景的MGF360-13L基因为靶标，构建了阳性质粒标准品并设计了荧光定量PCR检测引物建立了ASFV MGF360-13L TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。
本发明提供了一种用于检测非洲猪瘟病毒的阳性质粒标准品，包括骨架载体和检测靶标基因，其中，所述的检测靶标基因是MGF360-13L基因；作为一种参考，所述的骨架载体可以是pOK12载体。
本发明还提供了一种扩增非洲猪瘟病毒MGF360-13L基因的PCR引物，由SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列组成。
本发明进一步提供了用于检测或诊断非洲猪瘟病毒的实时荧光定量PCR试剂盒，包括SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列组成的定量PCR引物和SEQ ID NO.5所示的探针序列；其中，SEQ ID NO.5所示的探针的5'端连有FAM荧光集团，其3'端连有TAMRA淬灭集团。
ASFV结构复杂、基因组庞大，绝大部分基因功能未知严重制约了ASF疫苗和相关研究的开展。已有研究表明，MGF家族的6个基因(MGF505-1R、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、MGF505-2R和MGF505-3R)为ASFV的重要毒力因子。国内相关研究也已证实，该部分基因也是我国ASFV流行毒株的毒力基因，该部分基因缺失的疫苗将有较大的研究和应用前景。有研究报道，将ASFV MGF360-13L和MGF360-14L替换为增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)构建的荧光报告病毒不影响病毒在细胞中的复制，同时具备和亲本毒株相似的致病性，可应用于研究ASFV与宿主的相互作用及致病性研究(BORCA MV,O'DONNELL V,HOLINKA LG,SANFORD B,AZZINARO PA,RISATTI GR,GLADUE DP.Development of a fluorescent ASFV strain that retains the abilityto cause disease in swine.Scientific Reports,2017,7:46747.)。也有研究表明，MGF360-13L可抑制cGAS-STING信号通路(王西西.非洲猪瘟病毒蛋白对cGAS-STING信号通路抑制作用研究[D].北京:中国农业科学院,2019.)，但具体机制仍不清楚。序列比对结果显示，MGF360-13L基因在中国及东欧多个国家流行的11个毒株中同源性高达100％。
基于以上分析，本发明选择MGF360-13L为靶基因，建立其TaqMan实时荧光定量PCR检测方法；经实验条件的优化，本发明建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法可实现对最低15.6拷贝/μL ASFV核酸的检测，具有较高的灵敏性；同时，与CSFV、PRV、PRRSV、TGEV、PCV-1和PCV-2等多种病原不存在交叉反应，具有潜在应用价值。本发明建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法相比常规PCR检测方法在敏感性上高出3个数量级，与广泛应用的针对ASFVp72基因的荧光定量检测方法相比，具有较高的符合率，因此也可应用该方法对可疑样品进行二次确认。
ASFV作为一个结构复杂、基因组庞大、危害严重的DNA病毒，除p72基因外，目前已建立的ASF荧光定量检测靶标主要有早期基因E184L(崔贝贝,李霆,仇松寅,梅琳,韩雪清,吴绍强,林祥梅.非洲猪瘟病毒E184L基因实时荧光定量PCR检测方法的建立.动物医学进展,2019,41:1-7.)、K205R基因(郭少平,刘建,吴绍强.非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测技术的研究与评价.中国畜牧兽医,2010,37(4):76-80.和CP530R基因(王建华,董志珍,赵丹,王玉玲,肖妍,张俊哲,陈小金,王乃福,陈本龙,赵祥平.一种基于CP530R序列非洲猪瘟病毒TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法的建立.黑龙江畜牧兽医,2016,卷(3):22-26.)等，相对较少，本发明不仅丰富了ASFV现有检测靶标，也能够在将来为区分MGF基因缺失ASFV疫苗株感染与野毒感染提供技术支持。本发明也将为后续MGF360-13L基因功能探索以及缺失病毒纯度鉴定等提供技术支持。
本发明选择目前中国流行的ASFV多基因家族中相对保守、功能重要又兼具研究前景的MGF360-13L基因为靶标，建立其TaqMan荧光定量PCR检测方法，该方法特异性强、灵敏度高、重复性好，与已有的经典检测方法符合率高，不仅丰富了ASFV现有检测靶标，也能够鉴别ASFV MGF基因趋势疫苗毒与野毒感染。
附图说明
图1目的基因扩增结果；M：2000bp分子量标准M:DL2000 DNA Marker；1：MGF-360-13L基因MGF-360-13L gene；2：阴性对照Negativecontrol。
图2 ASFV MGF-360-13L基因标准曲线。
图3 ASFV MGF360-13L基因与相关病毒基因扩增曲线。
图4 ASFV MGF360-13L基因的扩增曲线；A-H：质粒标准品1.56×108-1.56×101拷贝/μL standard plasmid 1.56×108-1.56×101copies/μL。
图5 PCR琼脂糖凝胶电泳图；M：000bp分子量标准M:DL2000DNA Marker；1-10：质粒标准品1.56×1010-1.56×101拷贝/μL1.56×1010-1.56×101copies/μL standardplasmid；11：阴性对照Negative control；12：阳性对照Positive control。
图6 ASFV疫苗毒与野毒感染PAM细胞检测扩增曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1非洲猪瘟病毒MGF360-13L基因TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及验证
1材料与方法
1.1病毒与细胞
ASFV核酸由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪烈性传染病创新团队(本实验室)提取并保存；ASFV/LN-18由本实验室分离鉴定保存，ASFV MGF基因缺失疫苗毒(ASFV/LN-18-ΔMGF)由本实验室构建及鉴定；无特定病原体(SPF)猪肺泡巨噬细胞(PAM)由本实验室分离并保存；猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪圆环病毒1型(PCV-1)和猪圆环病毒2型(PCV-2)核酸由本发明人实验室保存。
1.2主要仪器与试剂
DNA凝胶回收试剂盒、AxyPrepTM Body Fluid Viral DNA/RNA提取试剂盒均购自康宁生命科学(吴江)有限公司；Premix PrimeSTAR HS、Premix Ex TaqTM荧光定量试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；DH5α感受态、pOK12载体、质粒小提试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司。荧光定量PCR仪(QuantStudio3&5)购自美国Thermo公司；紫外凝胶成像仪(AlphaImager HP)购自美国ProteinSimple公司；超微量分光光度计
购自德国Implen公司；ClonExpress II One Step Cloning Kit一步同源重组试剂盒购自Vazyme公司。Antibiotic-Antimycotic和RPMI 1640含L-谷氨酰胺培养基购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
1.3引物和探针
根据GenBank中收录的ASFV全基因组(登录号：MK128995.1)，选择MGF360-13L基因序列设计扩增引物，13L-F：5'-ggtacccgggagctcgaattcCCTCTTCAAAGGCATTACCA-3'(SEQ IDNO.1)；13L-R：5'-gtctgcagaagcttcgaattcCATTTTGAAATATTGTGGCCTA-3'(SEQ ID NO.2)(小写为左右同源臂序列)；扩增片段大小800bp；定量PCR引物信息如下：F：5'-TCCTCTAGTTTCTTTGG-3'(SEQ ID NO.3)，R：5'-TCGTGTGGCATTAATAATAG-3'(SEQ ID NO.4)，片段大小159bp；双标探针信息如下：5'-(FAM)CAACTCTCGGATGTGCTTCGTATTG(TAMRA)-3'(SEQ ID NO.5)；以上引物和探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成与验证。
1.4阳性质粒标准品的构建
以本发明人实验室保存的ASFV核酸为模板，利用引物对13L-F/13L-R扩增MGF360-13L基因，反应体系为50μL：Premis PrimeSTAR HS 25μL、ddH2O 21μL、上、下游引物各1μL、模板2μL；反应条件为：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min；将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳；回收目的条带，利用限制性核酸内切酶EcoRI切割pOK12载体，利用一步同源重组试剂盒将目的基因连接至pOK12载体上，并转化至大肠杆菌DH5α感受态中，挑取单菌落提质粒并进行测序验证。
1.5荧光定量PCR标准曲线的建立及其特异性和敏感性验证
采用超微量分光光度计测定标准品浓度，根据公式：(6.02×1023拷贝/mol)×DNA量(g)/[DNA长度(碱基数)×660g/(mol·碱基)]＝拷贝数，计算标准品拷贝数。将标准品连续10倍梯度稀释至10-10，并将其作为模板按照如下条件进行荧光定量PCR检测，反应体系为25μL：Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5μL、ddH2O 8.25μL、上、下游引物各0.5μL、探针1.0μL、模板2μL、ROX 0.25μL；反应条件为：预变性95℃30s，变性95℃5s，退火55℃10s，延伸72℃20s，其他条件跟随仪器自设系统，40个循环，设置三个阴性对照孔。
另取CSFV、PRV、PRRSV、TGEV、PCV-1、PCV-2和ASFV的核酸按已优化的方法同时进行TaqMan荧光定量PCR检测，以评价其特异性。此外，将构建的质粒标准品梯度稀释后，利用引物对13L-F/13L-R进行常规PCR扩增，然后用1％琼脂糖凝胶电泳检测，以比较所建立的ASFVMGF360-13L基因TaqMan荧光定量PCR检测方法的敏感性。
1.6临床样品检测
对发生ASF猪场采集的30份样品，每份取200μL按照AxyPrepTMBody Fluid ViralDNA/RNA提取试剂盒说明书操作提取DNA。利用本实验室先前发表的方法(LUO Y,ATIM SA,SHAO L,AYEBAZIBWE C,SUN Y,LIU Y,JI S,MENG X Y,LI S,LI Y,MASEMBE C,
K,
F,LIU L,QIU H J.Development of an updated PCR assay for detection ofAfrican swine fever virus.Archives of Virology,2017,162(1):191-199.)及本次建立的非洲猪瘟病毒MGF360-13L基因TaqMan荧光定量PCR检测方法同时进行检测，利用SPSS13.0软件进行一致性和配对卡方检验，比较两种检测方法结果之间的符合率。
1.7 ASFV疫苗毒与野毒感染PAM细胞检测鉴定
PAM细胞使用含2％双抗和10％胎牛血清的RPMI 1640含L-谷氨酰胺培养基进行培养，以1MOI的ASFV与ASFV/LN-18-ΔMGF接种，48h收取细胞上清。按照1.6方法提取DNA，每个样品进行3次重复，利用本发明建立的检测方法进行检测。
2试验结果
2.1标准品的制备
以本发明人实验室保存的ASFV核酸为模板，利用引物13L-F/13L-R进行PCR扩增，可以得到一条大小为800bp的目的条带，如图1所示。利用一步克隆试剂盒将目的片段克隆至pOK12载体上，构建MGF360-13L基因标准品，经测序验证后，提取标准品质粒并测得浓度为504ng/μL，经计算每微升拷贝数为1.56×1011。
2.2 ASFV MGF360-13L基因TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立
2.2.1标准曲线的建立
对1.56×101-1.56×108拷贝/μL质粒标准品进行荧光定量PCR检测，以Ct值为纵坐标，MGF360-13L基因标准品拷贝数为横坐标，利用QuantStudioTM Design&AnalysisSoftware v1.4.3分析软件绘制其标准曲线(图2)。建立的ASFV MGF360-13L荧光定量PCR线性回归方程为：y＝-3.295x+45.995，R2为0.997，扩增效率为98.12％，最低可检测到15.6拷贝/μL的病毒核酸。
2.2.2 ASFV MGF360-13L基因荧光定量PCR的特异性
对CSFV、PRV、PRRSV、TGEV、PCV1、PCV2和ASFV的核酸(cDNA/DNA)以本发明建立的TaqMan荧光定量PCR进行检测，除ASFV的DNA对应孔外，其余病毒核酸对应孔均未出现扩增曲线(图3)。结果表明，本发明建立的ASFV MGF360-13L基因TaqMan荧光定量PCR检测方法扩增效果良好，特异性强。
2.2.3 ASFV MGF360-13L基因荧光定量PCR的重复性
将构建的质粒标准品10倍梯度稀释至1.56×101拷贝/μL，取1.56×108-1.56×101拷贝/μL共8个梯度的质粒标准品，按照相同的条件进行扩增；经计算组内变异系数(CV)小于1.5％，组间变异系数(CV)小于1.23％，并且最低出现扩增曲线的稀释度为1.56×101，结果表明本检测方法具有良好的重复性(图4)。
2.2.4 ASFV MGF360-13L基因荧光定量PCR的敏感性
将10倍梯度稀释的标准品，进行常规PCR扩增，并将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，反应条件和体系参照1.4。结果表明，常规PCR最低能够检测到1.56×104拷贝/μL的病毒核酸(图5)。本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法相比常规PCR检测方法在敏感性上高出3个数量级。
2.3临床样品检测及符合率比较
在30份临床样品的检测中，本发明人实验室建立的针对ASFV p72基因检出阳性样品16个，检出率为53.3％；本次建立的针对ASFV MGF360-13L检出阳性样品14个，未出现假阳性，检出率为46.7％，McNemer检验的结果，P＝0.5，表明两种检测方法结果无统计学差异；Kappa检验的结果，Kappa＝0.867>0.75，提示两种方检测方法结果符合率较好。
2.4 ASFV疫苗毒与野毒感染检测结果
利用本发明方法检测感染ASFV/LN-18的PAM细胞上清CT值平均为23.5，未感染和感染ASFV/LN-18-ΔMGF的PAM细胞上清无CT值。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)
<120> 非洲猪瘟病毒的检测靶标以及荧光定量PCR检测引物
<130> HLJ-2001-191109A
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 1
ggtacccggg agctcgaatt ccctcttcaa aggcattacc a 41
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 2
gtctgcagaa gcttcgaatt ccattttgaa atattgtggc cta 43
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 3
tcctctagtt tctttgg 17
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 4
tcgtgtggca ttaataatag 20
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 5
caactctcgg atgtgcttcg tattg 25
Claims (10)
1.MGF360-13L基因作为检测靶标基因在制备检测或诊断非洲猪瘟病毒试剂中的用途。
2.一种用于检测非洲猪瘟病毒的阳性质粒标准品，包括骨架载体和检测靶标基因，其特征在于，所述的检测靶标基因是MGF360-13L基因。
3.权利要求2所述的阳性质粒标准品在制备检测非洲猪瘟病毒试剂中的应用。
4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于，采用所述的阳性质粒标准品构建荧光定量PCR标准曲线。
5.一种扩增非洲猪瘟病毒MGF360-13L基因的PCR引物，其特征在于：由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列组成。
6.用于检测或诊断非洲猪瘟病毒的TaqMan实时荧光定量PCR引物，其特征在于，包括SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列组成的定量PCR引物和SEQ ID NO.5所示的探针序列。
7.按照权利要求6所述的用于检测或诊断非洲猪瘟病毒的TaqMan实时荧光定量PCR引物，其特征在于，SEQ ID NO.5所示的探针的5'端连有FAM荧光集团，其3'端连有TAMRA淬灭集团。
8.一种检测或诊断非洲猪瘟病毒的TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，包括：阳性质粒标准品、定量PCR引物和探针序列；其特征在于：所述定量PCR引物为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列组成；所述探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。
9.按照权利要求8所述的检测或诊断非洲猪瘟病毒的TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，SEQ ID NO.5所示的探针的5'端连有FAM荧光集团，其3'端连有TAMRA淬灭集团。
10.按照权利要求8所述的检测或诊断非洲猪瘟病毒的TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述阳性质粒标准品包括骨架载体和检测靶标基因，其中，所述的检测靶标基因是MGF360-13L基因。
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| CN113736746A (zh) * | 2021-07-13 | 2021-12-03 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 非洲猪瘟病毒细胞系适应毒株的制备、特性分析及其应用 |
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-
2019
- 2019-12-30 CN CN201911389079.0A patent/CN113122654A/zh active Pending
Patent Citations (4)
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