CN101463396A

CN101463396A - 非洲猪瘟病毒荧光定量pcr检测试剂及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN101463396A
Application number: CNA2009100676206A
Authority: CN
Inventors: 董志珍; 侯艳梅; 赵祥平; 李琳; 陈本龙; 肖妍; 黄金海; 张霞
Original assignee: Tianjin Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Animals Plants and Food Inspection Center
Current assignee: Tianjin Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Animals Plants and Food Inspection Center
Priority date: 2009-01-06
Filing date: 2009-01-06
Publication date: 2009-06-24
Anticipated expiration: 2029-01-06
Also published as: CN101463396B

Abstract

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂及其制备方法和用途，设计合成了一套特异性的引物及Taqman探针，用来检测猪相关制品中的ASFV P54。发明中绘制的标准曲线为ASFV P54的定量检测提供了标准。本发明建立了一种快速简便、特异性强、灵敏度高的实时荧光定量PCR检测体系，检测时间仅为数小时，检测下限可达15个拷贝，可直接应用于口岸对进境猪相关制品的诊断和检疫技术，为无ASF国家的进口检疫工作提供了可靠、有效的技术条件。

Description

非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于动物病原检测领域，尤其是一种以非洲猪瘟基因片段为靶目标设计的生物制剂，使用实时荧光定量PCR(real-time fluorescencequantitative PCR)技术检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)中P54基因的方法，即非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂及其制备方法和用途。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触的烈性传染性疾病。其特征为病程短、病死率高率，可高达100％，临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，在诊断时极易误诊，表现高热、皮肤充血发绀、流产、水肿及脏器出血。(William，Hess Adv.African swine fever：a reassessment[J].Vet Sci Comp Med，1981，25：39~69)世界动物组织(OIE)列为A类疫病，我国规定为动物一类疾病，受到世界各国的高度重视(孙怀昌.中国预防兽医学报，1999，21(2)：117～119)。

本病自1921年在肯尼亚发现以来，一直存在于撒哈拉以南的非洲国家，1957年先后流传至西欧和拉美国家，多数被及时扑灭，单在葡萄牙，西班牙西南部和意大利的撒丁岛仍有流行，截至目前已在非洲、欧洲和美洲等数十个国家流行，而且有不断蔓延趋势。2007年，亚美尼亚连续发生六起非洲猪瘟，我国尚无该病。

非洲猪瘟在国际病毒分类委员会第四次报告中归于虹彩病毒科，在该委员会第五次报告中将其列在痘病毒科之下，置于该科的脊椎动物痘病毒亚科及昆虫痘病毒亚科之外。但DNA序列分析表明，ASF病毒具有介于痘病毒和虹彩病毒之间的特征，ASFV的这一特性表明它不属于国际病毒分类委员会所核定的任何一科，是个新科，1995年第9次国际病毒分类委员第六次报告，将非洲猪瘟病毒列入“类非洲猪瘟病毒属”，非洲猪瘟是唯一已知的代表种。

非洲猪瘟病毒是一种大的、有囊膜的双链DNA病毒，是唯一的虫媒DNA病毒。其基因组为末端共价闭合的单分子线状双链DNA，病毒基因组全长为170kb～190kb，中央有125kb左右的保守区，两端为可变区，含有末端反转重复序列，这些重复序列的增加或者缺失是造成不同分离株基因组长度差异的主要原因(Rafacl，Yancz，Javier M，et al.Analysis of the completeNucleotide Sequence of Afican Swine Fever Virus[J].Virology，1995，208：249～279)。ASF病毒基因组有5个编码基因，包括假定膜蛋白、分泌性蛋白、参与核甘酸和核酸代谢(DNA修复)以及蛋白修饰的酶，整个基因组含有151个0RF，可以编码150～200种蛋白质，已从ASFV感染的细胞中分离鉴定出86种病毒蛋白多肽(曲连东，于康震，非洲猪瘟研究进展，中国兽医科技，1998，28(11)：42～43)。

非洲猪瘟病毒大多数毒株的毒力都很强，但是免疫原性很低，只有少数几个蛋白具有免疫原性。

ASFV P54蛋白是由E183L基因编码的，约25kD的多肽，含有一段跨膜区域，主要集中在衍生的内质网膜处。P54蛋白可以在体外培养，并能感染细胞。而且在感染细胞后在内质网膜处短暂表达。P54蛋白的跨膜结构在病毒蛋白经内质网膜转化成病毒包膜前体时起着十分重要的作用(RodriguezJM，Garcia Escudero African Swine Fever Virus Structural Protein p54Is Essential for the Recruitment of Envelope Precursors to AssemblySites.Journal of Virology，2004，78(8)：4299～4313)。另外ASFVP54蛋白与8kD的轻链细胞质动力蛋白DLC8存在特殊的交叉反应，并在细胞内摄作用及病毒加工过程中起重要作用。感染病毒后复制早期，病毒可激活细胞凋亡蛋白酶而诱发细胞脱噬作用(Alonso C，J Miskin AfricanSwine Fever Virus Protein p54 Interacts with the Microtubular MotorComplex through Direct Binding to Light-Chain Dynein.Journal ofVirology 2001，75：9819～9827)。为了分析结构蛋白P54在细胞脱噬中所起的作用，2004年Hernaez B和Diaz-Gil G将其在非洲绿猴肾细胞内短暂表达，实验表明可激活细胞凋亡蛋白酶，诱发细胞脱噬作用(HernaezB，Diaz Gil G.The African swine fever virus dynein-binding proteinp54 induces infected cell apoptosis.FEBS Letters 2004，569(123)：224～228)。但P54的突变体缺失13aa而失去激活细胞凋亡蛋白酶的功能(Alejo A，GAndrés，ML Salas.African Swine Fever VirusProteinase Is Essential for Core Maturation and Infectivity Journalof Virology，2003，77：5571～557)。

目前，针对ASFV的检测和诊断技术主要有两大类，即基于病毒抗原、抗体反应的免疫学方法和包括病毒分离、病毒抗原和基因组DNA的核酸检测技术。试验方法的选择主要依据本国或本地区的疾病情况而定。在没有ASF但又怀疑该病存在的国家，实验室诊断必须应用无感染性的诊断方法，即应用聚合酶链反应(PCR)检测病毒基因组DNA和应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清抗体。用免疫学方法检测抗体可以了解病毒感染以及疾病发生、发展的进程，然而，由于抗体只有在病毒感染至一定时期后才会出现，因此，抗体检测在作为快速控制ASFV暴发的方法时存在局限性。PCR可以检测出各种样本(血液、粪便、分泌物、组织切片)中ASFV的遗传物质DNA，从而实现早期诊断，在ASFV的诊断和检测中具有重要的作用。

近几年发展起来的实时荧光定量PCR检测方法将PCR与荧光检测结合起来(李维彬等，非洲猪瘟病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立.宁夏大学学报，2007，28)。在荧光定量PCR中，常使用的荧光标记有SYBRGreenI和TaqMan探针两种。前者在分析中荧光值常受到线性扩增产物(由一侧引物延伸到底)和引物二聚体等的影响(Chen Y J，HU C J and ZhaoM Q.Construction of realtime quantitative polymerase chain reactionplatform with SYBRGreenI(J).Practical Journal of Medicine &Pharmacy，2004，21(11)：997～999)，从而使定量的准确性和灵敏度降低。而以TaqMan探针在定量灵敏度方面要优于前者，但存在探针设计、合成技术要求高和实验成本高的不足。Scott M Reidb和Geoffrey H等在2003年以ASFV VP72为目的基因，建立了实时荧光定量PCR检测技术，将荧光探针与PCR方法结合起来，使实验更加快速灵敏简便，可用于快速检测疑似非洲猪瘟的病例，作为鉴别诊断的有效方法(King DP，Reid SM.J VirolMethods，2003，107(1)：53～61)，但对于P54基因的荧光定量PCR技术，现无论在国内还是国外都尚无报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种检测非洲猪瘟P54基因的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂及其制备方法和用途。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂，包含一对特异性引物和一条特异性探针，扩增目标长度为218bp，引物和探针序列为：

上游引物：ASFV P54-1：5’-GCAATGGGCAGAAGTCACT-3’

下游引物：ASFV P54-2：5’-GTGTAAGGCTCAGTCGGATGA-3’

探针：ASFV P54-probe：5’-FAM-AGTGCAGGCAAACCAGTCACGGGCA-TAMRA-3’。

所述的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)选择非洲猪瘟病毒的P54基因序列保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，为：

GCAATGGGCAGAAGTCACTCCACAACCAGGTACCTCTAAACCGGCTGGAGCGACTACAGCAAGT

GCAGGCAAACCAGTCACGGGCAGACCGGCAACAAACAGACCAGCAACAAACAAACCAGTCACGG

ACAACCCAGTTACGGACAGACTAGTCATGGCAACTGGCGGGCCAGCGGCCGCACCTGCGGCCGC

GAGTGCTCATCCGACTGAGCCTTACAC；

(2)根据P54基因特点和引物、探针设计原则，设计引物和探针；

(3)探针的合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA；

(4)设计含内切酶位点的非洲猪瘟病毒的P54基因PCR扩增引物，以之构建重组质粒pET-P54，引物序列如下：

上游引物：pET-P54-1：5’-GCGGATCCAATGGATTCTGAAT-3’

下游引物：pET-P54-2：5’-AGCTCGAGCAAGGAGTTTTCTA-3’；

(5)经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，确定反应最佳条件、引物及探针的特异性和灵敏度。

所述(5)中的反应最佳条件为上下游引物及探针的使用浓度为25pmol/μL，50μL体系中加入1μL引物及探针，引物及探针的特异性使其可区别于猪源其它病毒，灵敏度达到15个拷贝。

所述的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂在检测非洲猪瘟病毒方面及生产标准化试剂盒中的应用。

所述的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂在绘制非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测标准曲线的用途。

所述的绘制非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测标准曲线的用途，绘制非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测标准曲线包括以下步骤：

(1)重组质粒pET-P54的定量，并换算成拷贝数；

(2)重组质粒pET-P54的梯度稀释；

(3)以所述的引物及探针对各浓度梯度重组质粒pET-P54进行实时荧光PCR检测，记录数据生成标准曲线。

本发明的有益效果是：研究建立特异、敏感、安全、准确、快速的检测方法，在检疫、诊断、分子流行病学研究具有重要意义。对样品中的低含量的非洲猪瘟病毒、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测的方法必须具备高敏感、高特异性和高准确性。

附图说明

图1为重组质粒pET-P54及不同病毒DNA实时荧光PCR曲线。

图2为标准模板荧光定量扩增动力学曲线。

图3为ASFV P54标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细描述。

上游引物：ASFV P54-1：5’-GCAATGGGCAGAAGTCACT-3’

下游引物：ASFV P54-2：5’-GTGTAAGGCTCAGTCGGATGA-3’

探针：ASFV P54-probe：5’-FAM-AGTGCAGGCAAACCAGTCACGGGCA-TAMRA-3’。

GCAATGGGCAGAAGTCACTCCACAACCAGGTACCTCTAAACCGGCTGGAGCGACTACAGCAAGT

GCAGGCAAACCAGTCACGGGCAGACCGGCAACAAACAGACCAGCAACAAACAAACCAGTCACGG

ACAACCCAGTTACGGACAGACTAGTCATGGCAACTGGCGGGCCAGCGGCCGCACCTGCGGCCGC

GAGTGCTCATCCGACTGAGCCTTACAC；

上游引物：pET-P54-1：5’-GCGGATCCAATGGATTCTGAAT-3’

下游引物：pET-P54-2：5’-AGCTCGAGCAAGGAGTTTTCTA-3’；

(1)重组质粒pET-P54的定量，并换算成拷贝数；

(2)重组质粒pET-P54的梯度稀释；

实施例1 非洲猪瘟病毒DNA的提取

发明中使用的非洲猪瘟病毒DNA为意大利Institut zooprofilatticsperimenTALE DELLA SARDEGNA惠赠，按照Roche旋转柱DNA提取试剂盒说明书提取病毒DNA。

实施例2 ASFV P54基因PCR扩增引物与Taqman检测引物及探针的设计与合成

根据GenBank ASFV P54基因序列(GenBank收录号：DQ028323)，设计、合成含BamHI和XhoI酶切位点和保护性碱基的引物，以扩增P54全序列长度为552bp的片段，引物序列如下：

pET-P54-1：5，-GCGGATCCAATGGATTCTGAAT-3’(画横线处表示引入的BamHI酶切位点)

DET-P54-2：5’-AGCTCGAGCAAGGAGTTTTCTA-3’(画横线处表示引入的XhoI酶切位点)

根据GenBank ASFV P54基因序列(GenBank收录号：DQ028323)，设计、合成特异性的引物及Taqman探针，以检测P54，探针荧光基团选取FAM，淬灭基团选取TAMRA，探针及引物序列如下：

ASFV P54-probe：5’-FAM-AGTGCAGGCAAACCAGTCACGGGCA-TAMRA-3’

上游引物：ASFV P54-1：5’-GCAATGGGCAGAAGTCACT-3’

下游引物：ASFV P54-2：5’-GTGTAAGGCTCAGTCGGATGA-3’

所有引物及探针均委托invitrogen公司合成。

实施例3：ASFV P54目的基因的扩增：

PCR扩增使用的rTaq聚合酶及dNTP均为TaKaRa产品，PCR仪是BIO-RAD公司出品。

1 PCR反应混合液的配制

以实施例1中提取的病毒DNA为模板，以实施例2中设计的P54扩增引物进行PCR反应，选取50μL如下PCR反应体系：

10×Buffer(含MgCl₂)：5μL；模板病毒DNA：1μL；上游引物(25pmol/μL)：1μL；下游引物(25pmol/μL)：1μL；dNTPs：1μL(10mmol/L)；Taq聚合酶：0.5μL(2.5U/μL)；双蒸水补齐。

2 PCR反应程序为

94℃预变性3min；

94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸60s，共5个循环；

94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸60s，共30个循环；

72℃延伸6min；

4℃保温6min。

取10μ LPCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，120V电泳25分min紫外检测扩增产物。

实施例4 ASFV P54目的基因重组质粒的构建

DNA片段回收使用的玻璃奶回收试剂盒为博大泰克公司产品，内切酶、连接酶为Fermentas产品。

将实施例3中凝胶电泳获得的目的条带切割下来，照DNA片段玻璃奶回收试剂盒说明，纯化回收目的DNA片段。将目的基因P54(552bp)和载体质粒pET 28b分别用限制性内切酶BamH I/XhoI进行双酶切，酶切反应体系如为：

目的基因P54的双酶切体系：

目的基因P54：10μL；

BamH I：2μL；

Xho I：2μL；

Buffer BamH：2μL；

双蒸水：4μL.

载体质粒pET 28b的双酶切体系：

载体质粒pET 28b：4μL；

BamH I：2μL；

Xho I：2μL；

Buffer BamH：2μL；

双蒸水：10μL。

将整个酶切体系37℃，水浴作用3h。

用DNA片段玻璃奶回收试剂盒回收酶切产物，并以适宜比例连接，转化TOP10感受态细胞，利用Kan抗性筛选重组转化体。以ASFV P54目的基因扩增引物和BamH I/Xho I对重组转化子分别进行进行PCR鉴定和酶切鉴定，并将重组质粒委托华大基因测序。重组质粒序列含有如SEQ ID NO.1所示检测序列。

实施例5 ASFV P54目的基因重组质粒pET-P54的稀释与定量

将重组质粒pET-P54依次进行10～10¹²稀释，使用SHIMADZM公司BIO-SPECMIN DNA分析仪对各稀释度质粒质量进行测定，并按照如下公式将质粒质量换算成拷贝数：

实施例6 ASFV P54目的基因的荧光PCR检测

荧光PCR试剂是TaKaRa公司的rTaq聚合酶及dNTP，实时荧光PCR仪是ABI PRISM 7000型，荧光PCR管和管盖购自ABI公司。

1 PCR反应混合液的配制

以实施例4中构建的重组质粒pET-P54，非洲猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒、传染性胸膜肺炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒DNA为模板，以实施例2中设计的P54荧光引物及探针进行荧光定量PCR反应，选取50μL如下PCR反应体系：

10×Buffer(含MgCl₂)：5μL；模板质粒或病毒DNA：1μL；上游引物(25pmol/μL)：1μL；下游引物(25pmol/μL)：1μL；探针(25pmol/μL)：1μL；dNTPs：1μL(10mmol/L)；Taq聚合酶：0.5μL(2.5U/μL)；双蒸水补齐。

2 PCR反应程序为

95℃ 预变性10min；

94℃ 变性15s，60℃退火延伸1min，共40个循环；

退火、延伸阶段采集数据。

3 结果分析

在ABI公司提供的分析软件SDS version 2.0的Analyze界面下选择FAM荧光标记，TAM淬灭标记。若样品种含有如SEQ ID NO.1所示序列，荧光PCR即可检测出阳性扩增曲线。非洲猪瘟病毒DNA、重组质粒pET-P54的△Rn曲线出现阳性增长，而以猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒、传染性胸膜肺炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒DNA为模板的△Rn曲线及阴性对照均为平的直线，这表明引物和TaqMan探针的特异性很高。从图1可见，扩增曲线呈现典型的S型荧光定量动力学曲线。荧光定量动力学曲线基线平整，无引物二聚体产生；对数区较明显，斜率大且固定(为平行线)，为较理想的扩增曲线，表明本发明建立的实时荧光定量PCR方法检测ASFVP54具有较好的准确性。图1中曲线部分对应扩增模板按照右侧端由上至下依次为重组质粒pET-P54和两种ASFV P54阳性样品DNA，平的多条直线为古典猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒、传染性胸膜肺炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒DNA为模板的扩增曲线和阴性对照。

实施例7 ASFV P54目的基因的荧光定量PCR检测标准曲线的绘制

1 标准曲线的生成

选取实施例5中10²～10⁸倍稀释的pET-p54质粒作为标准品模版，按照实施例6中的条件进行荧光定量PCR反应，同时在荧光定量PCR仪中输入相应浓度梯度的质粒拷贝数。通过这7个标准品得到的反应数据，所有反应信息资料被ABI PRISM 7000型荧光定量PCR扩增仪收集并储存于其附件电脑(含相应的分析软件)中，反应结束后该电脑根据阳性定量标准模板的扩增情况，以Ct值为纵坐标，pET-p54质粒拷贝数的对数为横坐标，自动绘制标准曲线。标准品拷贝数对应各循环阈值(Ct值)见下表。

表1 荧光定量PCR各拷贝数对应Ct值

2 结果分析

图2为生成标准曲线的质粒模板的荧光定量扩增动力学曲线，从图中可见，扩增曲线呈现典型的S型荧光定量动力学曲线。荧光定量动力学曲线基线平整，无引物二聚体产生；对数区较明显，斜率大且固定(为平行线)，为较理想的扩增曲线。图2中曲线部分按照右侧端由上至下模板拷贝数依次为：1.48×10¹¹，1.48×10⁹，1.48×10¹⁰，1.48×10⁷，1.48×10⁸，1.48×10⁶，1.48×10⁵，平的直线为阴性对照。反应体系中含有1.48×10⁵至1.48×10¹¹质粒时，扩增反应Ct值与拷贝数对数呈线性关系(图3)，得到的标准曲线斜率为-3.115，截距为47.472，直线方程为Y＝-3.115X+47.472，其中Y代表Ct值，X代表质粒的模板的拷贝数对数值；一致性系数为0.991。结果显示，本实验扩增效果好，结果具有很高的可靠性。另外，研究中还发现当反应体系中含有低于15个拷贝时，能够扩增出阳性曲线，即本发明中的引物、探针对荧光定量PCR测定P54基因有较好的敏感性，灵敏度可达到15个拷贝。

本发明设计使用的引物及探针，建立了编码非洲猪瘟病毒P54蛋白的基因的快速简便、特异性强、灵敏度高的实时荧光定量PCR检测体系，可用于非洲猪瘟病毒核酸的快速检测，检测时间仅为数小时，可直接应用于口岸对进境猪相关制品的诊断和检疫技术，为无ASF国家的进口检疫工作提供了可靠、有效的技术条件。

本发明选用TaqMan作为探针对非洲猪瘟P54基因建立了实时荧光定量PCR检测体系，通过条件优化和设置标准品，得到了较理想的标准曲线和检测效果。它克服了传统PCR费时、易污染，扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点，可对样品中的核酸进行准确的定量检测，具有简单、易操作、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好等优点，已在生命科学的各个领域都得到了广泛应用，近年来又被应用于转基因产品的定性与定量检测。

本发明以ASFV DNA为模板，设计P54的PCR扩增引物，构建重组质粒，并对其定量，以之作为实时荧光定量PCR的模板，从而获得标准曲线。另外，本发明中还收集了古典猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒、传染性胸膜肺炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒DNA来进行交叉反应，从而确证了荧光定量PCR引物的特异性。

建立ASFV P54的快速简便、灵敏度高、特异性强的实时荧光定量PCR方法，灵敏度可达到15个拷贝，检测时间缩短为几个小时。同时，建立了标准曲线，为P54基因的定量提供了可靠依据。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心

<120>非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂及其制备方法和用途

<130>

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>219

<212>DNA

<213>非洲猪瘟病毒(Afican Swine FeVer Virus)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(219)

<400>1

Claims

1、一种非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，包含一对特异性引物和一条特异性探针，扩增目标长度为218bp，引物和探针序列为：

上游引物：ASFV P54-1：5’-GCAATGGGCAGAAGTCACT-3’

下游引物：ASFV P54-2：5’-GTGTAAGGCTCAGTCGGATGA-3’

探针：ASFV P54-probe：5’-FAM-AGTGCAGGCAAACCAGTCACGGGCA-TAMRA-3’。

2、权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

GCAATGGGCAGAAGTCACTCCACAACCAGGTACCTCTAAACCGGCTGGAGCGACTACAGCAAGT

GCAGGCAAACCAGTCACGGGCAGACCGGCAACAAACAGACCAGCAACAAACAAACCAGTCACGG

ACAACCCAGTTACGGACAGACTAGTCATGGCAACTGGCGGGCCAGCGGCCGCACCTGCGGCCGC

GAGTGCTCATCCGACTGAGCCTTACAC；

上游引物：pET-P54-1：5’-GCGGATCCAATGGATTCTGAAT-3’

下游引物：pET-P54-2：5’-AGCTCGAGCAAGGAGTTTTCTA-3’；

3、根据权利要求2所述的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂的制备方法，其特征在于，所述(5)中的反应最佳条件为上下游引物及探针的使用浓度为25pmol/μL，50μL体系中加入1μL引物及探针，引物及探针的特异性使其区别于猪源其它病毒，灵敏度达到15个拷贝。

4、权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂在检测非洲猪瘟病毒方面及生产标准化试剂盒中的应用。

5、权利要求1所述的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂在绘制非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测标准曲线的用途。

6、根据权利要求5所述的绘制非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测标准曲线的用途，其特征在于，绘制非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测标准曲线包括以下步骤：

(1)重组质粒pET-P54的定量，并换算成拷贝数；

(2)重组质粒pET-P54的梯度稀释；

(3)以权利要求1所述的引物及探针对各浓度梯度重组质粒pET-P54进行实时荧光PCR检测，记录数据生成标准曲线。