CN109266786A

CN109266786A - 基于e184l基因的非洲猪瘟病毒检测试剂盒和检测方法

Info

Publication number: CN109266786A
Application number: CN201811202105.XA
Authority: CN
Inventors: 李霆; 崔贝贝; 仇松寅; 王娜; 冯春燕; 韩雪清; 吴绍强; 林祥梅
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2018-10-16
Filing date: 2018-10-16
Publication date: 2019-01-25
Anticipated expiration: 2038-10-16
Also published as: CN109266786B

Abstract

本发明公开一种基于E184L基因的非洲猪瘟病毒检测试剂盒和检测方法，涉及病毒检测技术领域。本发明提供一组新的用于检测非洲猪瘟病毒的QPCR组合物，包括以下引物和与引物配合使用的探针：E184L上游引物为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；E184L下游引物为SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；探针为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。利用该组合物可以高效快速地检测样品中是否含有非洲猪瘟病毒，且检测的灵敏度高，特异性强。本发明还提供一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒及利用本发明的QPCR组合物检测非洲猪瘟病毒的方法。

Description

基于E184L基因的非洲猪瘟病毒检测试剂盒和检测方法

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域。更具体地，涉及一种基于E184L基因的非洲猪瘟病毒的检测试剂盒和检测方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起猪的一种急性、高度接触性传染病。非洲猪瘟病毒属非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)，是一种有囊膜的单分子线状双链DNA病毒,也是虫媒病毒中唯一的DNA病毒，基因组长约170-190kb，编码150-200种蛋白质，不同病毒株的基因组长度差异位于基因组左端38-47kb、右端13-22kb的可变区域，中央为保守区。野猪和软蜱是非洲猪瘟病毒的野生储存宿主和传播媒介。非洲猪瘟具有和经典猪瘟相似的临床症状和病理变化，表现为发热、皮肤发绀和淋巴结、肾、胃肠黏膜明显出血，强毒株感染的潜伏期短，死亡率高达100％。非洲猪瘟目前无有效的疫苗用于防疫，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须通报疾病，我国将其列为一类动物疫病。

目前，已建立的非洲猪瘟病毒检测方法包括病毒分离鉴定、病毒抗原检测和病毒核酸检测(OIE)。其中，非洲猪瘟病毒的分离鉴定试验周期长，不适合快速检测。采用荧光抗体试验和抗原捕获试验检测非洲猪瘟病毒抗原，具备快速、准确的特点，但敏感性偏低，易出现假阴性结果；常规PCR方法的特异性高，成本低，但是敏感性低；荧光定量PCR技术具有高效快捷、敏感性高、特异性强等优点，已在非洲猪瘟病毒核酸检测方面得到应用。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一组用于检测非洲猪瘟病毒的QPCR组合物，利用该组合物可以高效快速地检测样品中是否含有非洲猪瘟病毒，且检测的灵敏度高，特异性强。

本发明的第二个目的在于提供一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒。

本发明的第三个目的在于提供一种利用本发明的QPCR组合物检测非洲猪瘟病毒的方法。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

一组用于检测非洲猪瘟病毒的QPCR组合物，包括以下引物和与引物配合使用的探针：

E184L上游引物为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；

E184L下游引物为SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；

探针为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

优选地，所述探针在5’端标记FAM，3’端标记BHQ。

本发明还提供一种如上所述的QPCR组合物在制备非洲猪瘟病毒检测试剂盒中的应用。

根据本发明的第二个目的，本发明还提供一种基于E184L基因的非洲猪瘟病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的QPCR组合物。

优选地，所述试剂盒还包括阳性对照。

优选地，所述阳性对照为包括E184L基因序列的重组质粒。

根据本发明的第三个目的，本发明还提供一种基于E184L基因的非洲猪瘟病毒检测方法，所述检测方法包括：

提取样品的基因组DNA；

配制QPCR反应体系，所述反应体系包括如上所述QPCR组合物；

将配制的QPCR反应体系转移至96孔板中，进行QPCR扩增反应；

结果判定。

优选地，所述QPCR反应体系中E184L上游引物和E184L下游引物的浓度均为0.4μM，所述探针的浓度为0.2μM。

优选地，所述QPCR扩增反应的退火温度为59.5℃。

本发明的有益效果如下：

本发明提供的QPCR组合物以及利用该QPCR组合物检测非洲猪瘟病毒的方法，是用于检测非洲猪瘟病毒早期表达基因E184L的产品和方法。由于E184L基因的转录本在病毒感染早期就可以在感染动物的血液中检测到，且E184L基因的编码产物也是非洲猪瘟病毒的一种免疫显著抗原，且该基因还具有较高的序列保守性，所以E184L基因作为非洲猪瘟病毒早期检测靶基因，可以更早更及时地检测出非洲猪瘟病毒。

此外，本发明提供的QPCR组合物可以高效快速地检测样品中是否含有非洲猪瘟病毒，且检测的灵敏度高，特异性强。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出本发明实施例4中得到的ASFV E184L基因熔解曲线。

图2示出本发明实施例4中ASFV E184L基因不同Tm值扩增曲线图。

图3示出本发明实施例4中ASFV E184L基因不同引物浓度得到的扩增曲线。

图4示出本发明实施例4中ASFV E184L基因不同探针浓度得到的扩增曲线。

图5示出本发明实施例4中ASFV E184L基因的扩增曲线。

图6示出本发明实施例4中ASFV E184L基因的标准曲线。

图7示出本发明实施例4中不同病毒中ASFV E184L基因扩增曲线。其中，1是指阳性对照重组质粒(0.6×10⁴copies)；2是指伪狂犬病毒；3是指PCV2；4是指PPV；5是指阴性对照。

图8示出本发明实施例4中不同细胞系的ASFV E184L扩增曲线。其中，1是指阳性对照重组质粒(0.6×10⁵copies)；2是指整合E184L基因PK-15细胞系184-2；3是指整合E184L基因PK-15细胞系184-13。

具体实施方式

目前已报道的荧光定量PCR方法所采用的引物和标记探针，主要是针对非洲猪瘟病毒的P54、VP72、K205R、CP530R和CP204L等基因序列设计制备的，而用于检测非洲猪瘟病毒早期表达基因E184L的荧光检测试剂产品及其使用方法尚未见报道。E184L基因是非洲猪瘟病毒的一个早期表达基因，该基因的转录本在病毒感染早期就可以在感染动物的血液中检测到。此外，E184L基因的编码产物也是非洲猪瘟病毒的一种免疫显著抗原，因此E184L基因具有作为非洲猪瘟病毒早期检测靶基因的良好前景。鉴于此，本发明提供一组新的用于检测非洲猪瘟病毒的QPCR组合物及检测方法。

根据GenBank中公布的格鲁吉亚猪ASFV的基因组序列(FR682468.1)的E184L基因序列选定E184L基因的扩增区域(如SEQ ID No.1所示)，设计六对特异性引物、一条特异性探针。本发明中的序列和探针均由华大基因合成。

E184L基因的扩增区域如SEQ ID No.1所示：

ATGAAGACGTTTATTACATGCACTTCGGTGAAAAACTACTTTCGCCAACATTTGAAAACCAACCAAAGAATCAGCTCAGAGCTTATTAGCTACGTGTGCACCATTCTAAACCATATCTGCCATCAGTATCTTCAGAATCCGCAAGCCCAAGAGGAGGAATGGTTTGCCCTGATCAAGGAACTTCCCATCATCAAAGATGGGCTCTCGAAGGAGGAAAGATTCTTCTCCTCAGGTGTGAAACACTTTCTACATGAATATAAAATCACACCCGAAAACCAAGAAAAATTCCAGAAAATGCTTAACGCCATTACAGAACAACTGATGAGTCGGCTTTGCAAGGTGTTTTCAATTATGATTCAACGTCAGGGTTTTCTTAAAACGCAAACCCTTATGTATTCTCACCTGTTTACCATTCTAAGCATCCTTATGGTCGCAGATAACCTGTACGGGGAACAAGATCCCACGGAGTTCTTTTCCCTTATTATAGAACAAACAAAAACGATTAAGAAAAAGAAGAAGAGTGGCTCGGAGGAGGAAGAGAGCCACGAGGAGTGA

表1 QPCR组合物序列

经过大量的对比实验，得到如下表所示的实验数据。

表2不同引物对的监测数据

其中，Eff％是指引物对的扩增效率，R²是指相关系数。通过检测数据对比，可以确定最适引物对：

E184L上游引物为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；

E184L下游引物为SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；

探针为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

最终扩增得到的目标片段的长度为86bp，其基因序列如SEQ ID No.15所示：CATTTGAAAACCAACCAAAGAATCAGCTCAGAGCTTATTAGCTACGTGTGCACCATTCTAAACCATATCTGCCATCAGTATCTTCA

优选地，探针的5’端标记荧光报告基团FAM,，3’端标记非荧光淬灭基团BHQ。

根据本发明的第二个目的，本发明还提供一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的QPCR组合物。

优选地，所述试剂盒还包括阳性对照。进一步优选地，所述阳性对照为包括E184L基因序列的重组质粒。在本发明的一个优选实施方式中，通过北京六合华大基因科技有限公司合成了阳性对照：pUC57-ASFV-E184L重组质粒。

根据本发明的第三个目的，本发明还提供一种检测非洲猪瘟病毒的方法，所述方法包括：

提取样品的基因组DNA；

配制QPCR反应体系，所述反应体系包括如上所述QPCR组合物；

将各组QPCR反应体系进行QPCR扩增反应；

结果判定，当Ct值小于35个循环为阳性。

优选地，所述QPCR反应体系中E184L上游引物和E184L下游引物的浓度均为0.4μM，所述探针的浓度为0.2μM。优选地，所述QPCR扩增反应的退火温度为59.5℃。以上优选实验条件是经过大量的对比试验和反应条件确定的，可以最大程度地提升反应的特异性和灵敏度。引物及探针的特异性使其区别于猪源其它病毒，使该检测方法的灵敏度达到个拷贝。

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

病毒株及细胞系

伪狂犬病活疫苗(Kartha-K61株)购自齐鲁动物保健品有限公司；猪细小病毒病灭活疫苗(WH-1)购自中牧实业股份有限公司；猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株)购自兽药集团生物疫苗有限公司；整合E184L的细胞系由中国检验检疫科学研究院动检所构建。

主要试剂与仪器

QuantiNova SYBR Green PCR Kit(Cat No.208052)、QuantiNova Probe PCR Kit(Cat No.208254)、DNeasy Blood&Tissue Kit(Cat No.69506)，jetPRIME DNA&siRNATransfection Reagent等均购自北京宏捷科技有限公司；ABI 7500荧光定量PCR仪(美国ThermoFisher)、酶标仪(BIO-RAD)等仪器均由中国检验检疫科学研究院提供。

实施例1引物和探针的设计

参考GenBank中公布的格鲁吉亚猪ASFV的全基因组系列，针对E184L基因核苷酸序列设计一对特异性引物和一条探针。特异性引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，探针序列如SEQ ID No.2所示，并在探针的5’端标记FAM，3’端标记BHQ。引物序列和探针均由华大基因合成。E184L基因序列如SEQ ID No.1所示。

实施例2试剂盒中阳性对照的制备

阳性对照质粒pUC57-ASFV-E184L由华大基因合成并测序，测序结果与GenBank序列比对无误后，采用全自动酶标仪测定质粒的浓度和纯度。

实施例3病毒基因组DNA提取

按照病毒基因组DNA提取试剂盒操作说明，提取伪狂犬病活疫苗(Kartha-K61株)、猪细小病毒病灭活疫苗(WH-1)和猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株)的全基因组。

实施例4实时荧光定量PCR分析系统的建立

1、PCR反应体系条件优化

采用20μL的反应体系，退火温度设置为56、58、59、59.5、60、60.5、61、62、64℃的9个温度梯度，按照QuantiNova Probe PCR试剂盒说明书提供的反应体系，优化退火温度。通过对不同退火温度扩增曲线的Ct值进行比较，如图2所示，结果显示59.5℃时的Ct值为15.568，是9个退火温度中的最小值，因此退火温度为59.5℃时pUC57-ASFV-E184L阳性对照重组质粒的扩增效率最高。

通过对200、300、400、500、600nmol/L5个不同浓度的上下游引物按照QuantiNovaProbe PCR试剂盒说明书提供的反应体系，得到的扩增曲线，如图3所示。分别统计Ct值和ΔR值，得到在上下游引物浓度为0.4μM时，pUC57-ASFV-E184L阳性重组质粒的扩增效率最高。所以上下游引物的最佳浓度为0.4μM。

探针浓度按照50、100、200、300、400nmol/L，稀释5个浓度梯度。根据QuantiNovaProbe PCR试剂盒说明书提供的反应体系，在ABI 7500仪器上扩增，得到如图4所示的扩增曲线。依据最低的Ct值和最高的ΔR值，ASFV E184L基因探针的最佳浓度为0.2μM。

循环条件为：预变性95℃、2min；以95℃、5s，60℃、30s，扩增40个循环。扩增结束后，验证反应体系及其引物的特异性。

表3 Real-time PCR反应体系

2、标准曲线的建立

pUC57-ASFV-E184L阳性对照重组质粒由北京六合华大基因科技有限公司合成，测定pUC57-ASFV-E184L质粒浓度，用以下公式换算出该质粒的拷贝数，保存于-20℃中备用。拷贝数换算公式如下：

拷贝数(copies/μL)＝6.02×10²³(copies/mol)×质粒浓度(g/μL)/MW(g/mol)

对阳性重组质粒进行10的倍比稀释，得到10⁰～10⁸copies/μL等9个稀释度的重组质粒作为标准品模板，进行TaqMan荧光实时定量PCR扩增，绘制标准曲线。利用如SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示扩增引物以及如SEQ ID No.2所示的探针对pUC57-ASFV-E184L阳性对照重组质粒进行扩增，扩增结果如图1所示，图中显示E184L基因的熔解曲线在Tm值为76.15处有单一峰，可知所用引物无非特异性扩增。

3、灵敏性试验

以重组质粒pUC57-ASFV-E184L为标准阳性质粒，分别做10倍的倍比稀释，每个模板浓度作3个平行样。根据已经建立的TaqMan qPCR的反应体系和反应参数进行相应的PCR扩增，通过观察扩增曲线来确定检测到重组质粒的最低拷贝数，并最终以Ct值为纵坐标，两种基因拷贝数的对数为横坐标，建立标准曲线，对整个PCR体系的灵敏性进行评价。

以不同拷贝数的重组质粒为模板进行的检测结果显示，该基因的扩增曲线呈现较为典型的S型，各曲线间距均匀。基于E184L基因qPCR方法最低检测量是1.5个拷贝，如图5所示；而基于E184L基因的方法扩增效率是99.83％，回归方程为Y＝-3.326X+42.297，r²＝0.992，如图6所示。

4、qPCR方法的特异性检测

采用TaqMan实时荧光定量PCR反应体系，以pUC57-ASFV-E184L的重组质粒DNA作为标准的阳性对照。伪狂犬病毒、PCV2、PPV基因组模板DNA作为其他毒株模板，无菌水作为阴性对照；使用ABI 7500 qPCR仪进行扩增，以验证所建立诊断方法的特异性。

对伪狂犬病毒、PCV2以及PPV的全基因组和pUC57-ASFV-E184L阳性重组质粒同时进行检测，结果表明，只有pUC57-ASFV-E184L阳性对照重组质粒可产生特异性荧光曲线，其余皆为阴性，证明该方法中设计的引物和探针均有着较强的特异性，如图7所示。

5、重组表达质粒的构建

用设计的特异性引物对提取重组质粒pUC57-ASFV-E184L DNA进行PCR扩增，采用25μL的PCR反应体系：PremixTaq 12.5μL；ddH₂O 9.5μL；上、下游引物各1μL；提取的重组质粒pUC57-ASFV-E184L DNA模板1μL，扩增目的片段。

反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；56℃退火45s，68℃延伸2min，35个循环；68℃终延伸7min，4℃保持。目的片段为555bp。取10μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，经凝胶成像系统照相并记录结果。利用DNA凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行切胶纯化，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。取纯化的PCR产物与载体pcDNA4-Flag连接，连接后的产物转化至Top10感受态细胞中，并均匀涂在含有Amp的LB琼脂平板，37℃倒置过夜培养，挑其中的单个菌落，接种于含有1‰Amp的LB液体培养基中，37℃200r/min过夜培养。用质粒小提取试剂盒提取质粒，经酶切鉴定，将阳性克隆质粒送北京六合华大基因有限公司测序，测序结果与GenBank序列比对无误后，采用全自动酶标仪测定其质粒浓度和纯度。-20℃保存备用。

6、细胞系的构建

用按照DNA&siRNA转染试剂说明书，将构建的E184L质粒转入提前准备好的PK-15细胞中，待6h后更换新的含10％FBS的DMEM培养基。24h后将细胞用胰酶消化后，分别按照1×10⁵个/mL，2×10⁵个/mL，4×10⁵个/mL，6×10⁵个/mL的细胞浓度，将细胞铺在20mm×100mm的细胞培养皿中，每个平皿中加入终浓度为30ng/mL的Zeocine。

待培养皿中长出单克隆，将单克隆细胞移入6孔板中，加入含有30ng/mL Zeocine的10％FBS的DMEM培养基，并做好标记。

待细胞长满后取出一部分细胞做western bloting鉴定，在±22kDa处的细胞为阳性的细胞，做好标记，将培养皿中的细胞扩大培养并冻存。

7、模拟临床样品的检测

对鉴定为阳性的整合E184L基因的细胞系，按照DNeasy Blood&Tissue Kit(CatNo.69506)说明书提取细胞的全基因组，采用优化后的反应体系及条件，利用如SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示扩增引物以及如SEQ ID No.2所示的探针进行qPCR扩增，即ASFV感染的模拟样品的全基因组进行检测。pUC57-ASFV-E184L阳性重组质粒作为阳性对照。如图8所示扩增曲线，均可检测到较强的信号，说明该方法可应用于临床样品的检测。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

序列表

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 基于E184L基因的非洲猪瘟病毒检测试剂盒和检测方法

<130> JLC18I0792E

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 555

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 2

atgaagacgt ttattacatg cacttcggtg aaaaactact ttcgccaaca tttgaaaacc 60

aaccaaagaa tcagctcaga gcttattagc tacgtgtgca ccattctaaa ccatatctgc 120

catcagtatc ttcagaatcc gcaagcccaa gaggaggaat ggtttgccct gatcaaggaa 180

cttcccatca tcaaagatgg gctctcgaag gaggaaagat tcttctcctc aggtgtgaaa 240

cactttctac atgaatataa aatcacaccc gaaaaccaag aaaaattcca gaaaatgctt 300

aacgccatta cagaacaact gatgagtcgg ctttgcaagg tgttttcaat tatgattcaa 360

cgtcagggtt ttcttaaaac gcaaaccctt atgtattctc acctgtttac cattctaagc 420

atccttatgg tcgcagataa cctgtacggg gaacaagatc ccacggagtt cttttccctt 480

attatagaac aaacaaaaac gattaagaaa aagaagaaga gtggctcgga ggaggaagag 540

agccacgagg agtga 555

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agctcagagc ttattagcta cgtgtgcac 29

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catttgaaaa ccaaccaaag aat 23

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgaagatact gatggcagat atggt 25

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caacatttga aaaccaacca aag 23

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tactgatggc agatatggtt tagaat 26

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gccaacattt gaaaaccaac c 21

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aagatactga tggcagatat ggtttag 27

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaaactactt tcgccaacat ttg 23

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttctgaagat actgatggca gatatg 26

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgaaaaacta ctttcgccaa catt 24

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cggattctga agatactgat ggc 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggtgaaaaac tactttcgcc aac 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gcttgcggat tctgaagata ctg 23

<210> 15

<211> 86

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 15

catttgaaaa ccaaccaaag aatcagctca gagcttatta gctacgtgtg caccattcta 60

aaccatatct gccatcagta tcttca 86

Claims

1.一组用于检测非洲猪瘟病毒的QPCR组合物，其特征在于，包括以下引物和与引物配合使用的探针：

E184L上游引物为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；

E184L下游引物为SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；

探针为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的QPCR组合物，其特征在于，所述探针在5’端标记FAM，3’端标记BHQ。

3.一种如权利要求1或2所述的QPCR组合物在制备非洲猪瘟病毒检测试剂盒中的应用。

4.一种基于E184L基因的非洲猪瘟病毒检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括如权利要求1或2所述的QPCR组合物。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括阳性对照。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为包括E184L基因序列的重组质粒。

7.一种基于E184L基因的非洲猪瘟病毒检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：

提取样品基因组DNA；

配制QPCR反应体系，所述反应体系包括如权利要求1或2所述QPCR组合物；

将配制的QPCR反应体系转移至96孔板中，进行QPCR扩增反应；

结果判定。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述QPCR反应体系中E184L上游引物和E184L下游引物的浓度均为0.4μM，所述探针的浓度为0.2μM。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述QPCR扩增反应的退火温度为59.5℃。