CN103993102A

CN103993102A - 一种同时检测人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN103993102A
Application number: CN201410083239.XA
Authority: CN
Inventors: 崔淑娟; 田丽丽; 石伟先; 张代涛; 王海滨; 张玉松; 李爱华; 孙玉兰
Original assignee: Individual
Current assignee: Beijing Center for Disease Prevention and Control
Priority date: 2014-03-07
Filing date: 2014-03-07
Publication date: 2014-08-20
Anticipated expiration: 2034-03-07
Also published as: CN103993102B

Abstract

本发明属于生物技术应用领域，涉及一种同时检测人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒的含内质控的多重荧光PCR方法及试剂盒。本发明针对人腺病毒HP基因(hexonprotein)、人肺炎支原体RP基因(repetitive element RepMP5e)、人博卡病毒NP1(nucleoprotein)基因的保守序列设计特异性引物和探针，建立了含内质控的一步法多重荧光RT-PCR快速检测方法，操作简便快捷，克服了常规单重荧光RT-PCR单孔单检的繁琐，简化了操作程序，节省了试验成本，利用其较高的特异性、灵敏度、高效性和稳定性为病毒的现场检测、卫生评价、临床诊断等方面提供了有力的技术支撑。

Description

一种同时检测人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术应用领域，特别是可用于人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒的同时检测与鉴定。

背景技术

人腺病毒(Human Adenovirus，HAdV)是一群无包膜的双链DNA病毒，分为1～55个血清型，分别划入A～F共6个血清学分组。人腺病毒经呼吸道和消化道传播，引起多种感染，对小儿和免疫缺陷者危害严重。腺病毒感染人体可能引发的疾病包括：急性腺病毒肺炎、急性胃肠炎、眼角膜炎、乳糜泻和急性间质性肾炎等。

人腺病毒基因组长约36kb，其衣壳(Capsid)呈规则的20面体结构，直径约80～110nm，没有包膜。腺病毒衣壳共252个壳粒，包括240个六邻体(Hexon)、12个五邻体(PentonBase)及12(或24)根纤突(Fiber)，此外还有一些较小的蛋白，如VI、VIII、IX、IIIa和IVa2等。六邻体是形成病毒衣壳20个体面的主要蛋白，每个六邻体由3个亚基组成，腺病毒二十面体衣壳的12个顶点是由五邻体和纤突组成的复合物，其中每个五邻体由5个亚基构成，每条纤突由3个亚基构成。纤突以五邻体蛋白为基底由衣壳表面向外伸出，纤突顶端形成头节区(Knob)。壳粒之间存在着若干种分子量较小的蛋白，主要起连接作用以使二十面体的病毒衣壳更为稳定。六邻体是腺病毒主要的中和抗原，抗六邻体抗体引发中和反应的能力极强，由六邻体引发的中和抗体具有型别特异性，它的特异性很可能是由六邻体蛋白一级结构的氨基酸序列决定的。腺病毒六邻体的型特异性和组特异性表位可能主要位于腺病毒六邻体近N端和中段，C端相对比较保守。

支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3～0.5之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。它不同于细胞，也不同于病毒。支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰氏染色为阴性。支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长，营养要求比细菌高。支原体的种类繁多、分布广泛、造成的危害相当大，涉及人、动物、植物及昆虫等多个领域，从人体分离的16种支原体中，5种对人有致病性，即肺炎支原体(M.pneumoniae)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)、人型支原体(M.homins)、生殖支原体(M.genitalium)及发酵支原体(M.fermentans)，给人类健康和科研工作带来不利影响。

人博卡病毒(human bocavirus，HBOV)是2005年瑞典科学家Allander等对呼吸道感染患儿鼻咽分泌物进行大规模检测时发现的一种新病毒，主要导致儿童喘息性疾病和支气管肺炎症状，引起了广泛关注。人的博卡病毒属于细小病毒科，为无包膜、十二面体的小颗粒，直径为20～26nm，基因组是线性单链DNA，其复制完全依赖于宿主细胞。HBoV的基因全长约为5.2kb，基因组含4个功能蛋白：NS1(非结构蛋白)、VP1和VP2(均为衣壳蛋白)、NP1(核蛋白)，细小病毒5’端的独特区域具有磷脂酶A2样活性，这种活性与病毒的感染性有关。

目前，国内外检测相应病原体的经典方法是病毒的分离培养，但是其操作烦琐，耗费时间长；电镜、免疫组化、ELISA、常规PCR等具有各自突出的优点，但都很难检测微量核酸和准确定量，20世纪末发展起来的实时荧光定量PCR技术(Real-time fluorescentquantitative PCR)是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，该技术不仅实现了对模板的定性和定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实验多重反应、自动化程度高、无污染性、具有实时性和准确性等特点。因而，在呼吸道病原体检测中具有巨大应用优势。相对普通PCR及单荧光PCR，多重荧光PCR具有以下优点：(1)检测效率高，即多重荧光PCR可以实现一管多检，通过收集的不同波长的荧光信号来区分不同的检测对象，从而简化操作流程；(2)节省试剂成本和人员操作时间，尤其在开展大量样品检测时，可以显著地降低检测成本和操作时间。(3)本方法中含内质控基因的监控，在各类标本中，存在各种影响或抑制PCR反应的因素，且在标本的采集处理、核酸提取、扩增和分析过程中，也可能因人为操作失误而导致产生假阴性检测结果。因此本申请采用内质控的方法，在标本中含有的内质控基因(LDHA)经历检测标本核酸提取、加样、PCR扩增及信号检测的全过程，从而可对每一份标本实施监控。

本研究将建立的人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒一步法多重荧光PCR检测方法，采用LDHA作为内质控，可以有效监控样本中的PCR抑制因素以及由操作误差所造成的假阴性结果。另外，该方法检测所需要RNA量较少且操作简便快速，在病原体的现场检测、卫生评价、临床诊断等方面显示出良好的应用前景。并有利于进一步深入研究相关病原体感染的分子机理和免疫调节机理、开展有效的临床治疗等方面显示出良好的应用前景。

发明内容

本发明是由国家“十二五”科技重大专项2012ZX10004206-002支持的。本发明针对人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒特异性引物和探针。基于此引物和探针，我们建立了一步法含内质控的一步法多重荧光PCR检测方法。该方法通过对多种呼吸道病毒的检测、标准曲线的构建、重复性试验以及与商品化单重荧光PCR诊断试剂盒进行比较，说明该方法具有较高的特异性、灵敏度和稳定性。

在本发明的第一方面，提供了一种针对人腺病毒Hexon基因、人肺炎支原体RP基因、人博卡病毒NP1基因的特异性引物和探针序列，如SEQ NO：1至12所示。

在本发明的第二方面，提供一种同时检测人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒的试剂盒，该试剂盒中含有第一方面所述引物和探针。

在一个实施方案中，所述试剂盒包括以下成份：

a)反应缓冲液，所述缓冲液为常规PCR反应缓冲液；

b)反应酶，所述反应酶为常规PCR反应酶；

c)SEQ NO：1、2、4、5、7、8、10、11所示的引物；

d)SEQ NO：3、6、9、12所示的探针

e)无RNA酶的水。

其特征在于如SEQ NO：3所示的人腺病毒代表株Hexon基因探针5’端由FAM标记，3’端由BHQ1标记；如SEQ NO：6所示的人肺炎支原体代表株RP基因探针5’端由JOE标记，3’端由BHQ1标记；如SEQ NO：9所示的人博卡病毒代表株NP1基因探针5’端由ROX标记，3’端由BHQ2标记；如SEQ NO：12所示的质控基因LDHA基因探针5’端由CY5标记，3’端由BHQ2标记。

在一个具体实施方案中，所述方法为多重荧光PCR检测试剂盒的具体应用，并使用所述引物和探针作为检测序列。

在本发明的第三方面，提供一种同时检测人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒的PCR扩增方法，该方法使用第二方面所述的试剂盒。

在一个实施方案中，所述方法包括以下程序：

a)四个荧光通道的设置；

b)预热的温度与时间；

c)热循环(预热温度与时间、退火温度与时间、荧光收集温度、循环数)；

在一个具体实施方案中，所述方法为多重荧光PCR扩增程序，并使用所述配制体系作为反应体系。

在本发明的第四方面，提供一种人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒的诊断试剂盒，该试剂盒包括第一方面所述引物和探针。

在本发明的第五方面，提供第一方面所述引物和探针在制备人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒的检测试剂中的应用。

附图说明

图1.人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒一步法含内质控的多重荧光PCR检测方法的特异性鉴定，其中：

图1A为同时加入人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒阳性模板的荧光扩增图。

图1B为加入其他5种呼吸道多病原的阳性模板的荧光扩增图(以甲型流感病毒为例)。

具体实施方式

本发明所述人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒多重荧光PCR检测方法，是基于相应亚型的Hexon基因、RP基因、NP1基因保守区设计的特异性引物和探针。

本发明首先利用Applied Biosystems(ABI)公司开发的Primer Express3.0软件、针对人腺病毒代表株Hexon基因、人肺炎支原体代表株RP基因、人博卡病毒代表株NP1基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针序列，并且通过调整引物、探针浓度及上机程序来优化最佳的反应条件，并且进行特异性、灵敏度及稳定性等验证实验，成功建立了人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒一步法多重荧光PCR快速检测方法。

下面结合优选实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体的实验方法，通常按照常规条件和方法，如分子克隆实验室手册(Sambrook，et al.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)及实时荧光PCR技术(李金明，2007)中所述方法或试剂制造商提供的方法。

同时，需要指出的是，本发明所述的检测方法和试剂盒不仅应用于对患者(人、动物)的样品进行检测，也包括对环境中的水样品、食物样品、空气样品、微生物样品、动物细胞样品等多种样品的非诊断目的的检测。其应用也都是本领域技术的常用技术手段，并不需要进行特别的、富有创造性的改变。

实施例

实施例1.人腺病毒代表株Hexon基因、人肺炎支原体代表株RP基因、人博卡病毒代表株NP1基因特异性引物和探针设计与合成

1.1人腺病毒代表株Hexon基因、人肺炎支原体代表株RP基因、人博卡病毒代表株NP1基因的选择及保守区的确定

本研究所用的序列选自NCBI GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，主要选择依据为：(a)年代较近毒株；(b)具有全长序列毒株；(c)同亚型序列比对后选取具有代表性的毒株；(d)优先选择感染人的毒株。选取的人腺病毒代表株Hexon基因、人肺炎支原体代表株RP基因、人博卡病毒代表株NP1基因信息见表1-1、1-2及1-3。

本研究分别将所选择的人腺病毒代表株Hexon基因、人肺炎支原体代表株RP基因、人博卡病毒代表株NP1基因输入到DNAssist软件中进行同源比对，确定了人腺病毒代表株Hexon基因、人肺炎支原体代表株RP基因、人博卡病毒代表株NP1基因的保守区，为引物和探针设计提供了靶区。

表1-1.选取人腺病毒代表株Hexon基因信息

表1-2.选取人肺炎支原体代表株RP基因信息

表1-3.选取人博卡病毒代表株NP1基因信息

1.2引物和探针的设计、评估与合成

引物和探针是利用Applied Biosystems(ABI)公司研发的Primer Express3.0软件、针对人腺病毒代表株Hexon基因、人肺炎支原体代表株RP基因、人博卡病毒代表株NP1基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针序列，并对引物和探针质量进行评估，将选定检测人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒的特异性引物和探针序列以及内质控基因LDHA的引物和探针序列由TakaRa宝生物(大连)公司合成。其中如SEQ NO：3所示的人腺病毒代表株Hexon基因探针5’端由FAM标记，3’端由BHQ1标记；如SEQ NO：6所示的人肺炎支原体代表株RP基因探针5’端由JOE标记，3’端由BHQ1标记；如SEQ NO：9所示的人博卡病毒代表株NP1基因探针5’端由ROX标记，3’端由BHQ2标记；如SEQ NO：12所示的质控基因LDHA基因探针5’端由CY5标记，3’端由BHQ2标记。

为了降低反应体系的干扰，合成的引物和探针采用HPLC进行纯化(见表2)。

表2.选定检测人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒及内质控基因LDHA的引物和探针序列及标记基团

实施例2.人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒一步法多重荧光PCR检测体系的建立

2.1按照英杰公司的核酸提取试剂盒(DNA Mini Kit)来提取样本核酸。

2.2人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒一步法多重荧光PCR检测体系的配制配制试剂采用Ambion公司的AgPath-IDTM One-step PCR Kit，体系为50μl：

2×PCR buffer 25μl

25×PCR Enzyme 2μl

Detection Enhancer 3μl

引物、探针同时加入如SEQ NO：1、2、4、5、7、8、10、11所示的引物各0.5μl，引物终浓度为300nM；加入如SEQ NO：3、6、9、12所示的探针引物各0.5μl，终浓度为150nM

模板 6μl(三种阳性模板各加2μl，并且每种模板以10-1倍数稀释后加入，终浓度1pg-100ng。以呼吸道合胞病毒阳性核酸作为阴性对照模板)

无RNA酶的水补足体系至50μl

2.3人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒一步法多重荧光PCR检测方法的上机扩增程序

采用罗氏公司的Roche480仪进行上机扩增，其程序如下：

先设置FAM、JOE、ROX、CY5四个荧光采集通道；

预变性温度与时间：95℃，20min；

结果判定标准为：Ct值≤33，判定为阳性；Ct值≥35，判断为阴性；Ct值在33～35之间为可疑。

实施例3.人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒一步法多重荧光PCR检测方法的特异性鉴定

利用实施例2建立的一步法多重荧光PCR反应体系分别对人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肠道病毒的阳性核酸进行检测，其结果表明，只有人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒分别在FAM、JOE、ROX检测通道出现相应的特异性荧光扩增曲线，并且没有出现交叉反应，而其他5株病毒除了内质控CY5通道有扩增曲线，其他三个通道则无扩增曲线，说明该方法具有很强的特异性(见图1)。

实施例4.人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒一步法多重荧光PCR检测方法的灵敏度鉴定

4.1一步法多重荧光PCR检测方法的检测限度

用针对人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒的各自Hexon基因、RP基因及NP1基因特异性引物，进行普通PCR方法扩增(其扩增范围包括荧光定量PCR扩增区域)，将其产物利用XhoI和HindIII(New England Biolabs公司)连接到pcDNAII载体(Invitrogen公司)上，再进行克隆，提取质粒，分别命名为pcDNAII-Adv-Hexon、pcDNAII-MP-RP、pcDNAII-hBov-NP1，并将质粒送宝生物(大连)公司测序确证，将测序正确的质粒用于建立多重荧光PCR检测方法的标准曲线。pcDNAII-Adv-Hexon、pcDNAII-MP-RP、pcDNAII-hBov-NP1阳性质粒用微量核酸定量仪NanoDrop(型号：ND-1000)进行定量，取10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸拷贝/μl的重组质粒作为标准品模板，分别加入到实施例2建立的一步法多重荧光PCR反应体系中进行扩增，根据Ct值与模板浓度的Log值构建标准曲线。结果表明，由pcDNAII-Adv-Hexon阳性质粒构建的标准曲线的Ct值与模板浓度Log值在(10¹～10⁶)具有良好的线性关系，相关系数为0.9982，根据多重荧光PCR检测方法结果判定标准，检测限度为20拷贝。由pcDNAII-MP-RP阳性质粒构建的标准曲线的Ct值与模板浓度Log值在(10¹～10⁶)具有良好的线性关系，相关系数为0.9963，根据多重荧光PCR检测方法结果判定标准，检测限度为40拷贝。由pcDNAII-hBov-NP1阳性质粒构建的标准曲线的循环阈值(Ct值)与模板浓度Log值在(10¹～10⁶)具有良好的线性关系，相关系数为0.9971，根据多重荧光PCR检测方法结果判定标准，检测限度为40拷贝。由此说明，一步法多重荧光PCR检测方法具有较高的灵敏度。

4.2一步法多重荧光PCR与普通PCR检测灵敏度的比较

人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒的阳性核酸进行10倍梯度系列稀释(10^-3～10^-8)，用实施例2建立的一步法多重荧光PCR方法和普通PCR方法对其进行检测。通过对人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒阳性核酸模板不同稀释倍数的同步检测，其结果表明，多重荧光PCR方法比普通PCR方法检测灵敏度提高100～1000倍(见表3)。

表3.一步法多重荧光PCR方法与普通PCR方法检测灵敏度的比较

“*”表示检测结果为阳性；“#”表示检测结果为阴性。

实施例5.人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒一步法多重荧光PCR方法检测效率的鉴定

利用实施例2建立的一步法多重荧光PCR方法对大量样本进行检测，并与上海之江公司人腺病毒核酸测定试剂盒、人肺炎支原体核酸测定试剂盒、人博卡病毒核酸测定试剂盒的单重荧光PCR方法进行比较。结果表明，多重荧光PCR与之江试剂盒比较其敏感性为95.35％、特异性100％、一致性98.89％(见表4)。本研究中，全部样本中的LDHA检测均为阳性，表明检测过程中没有因操作失误或存在PCR反应抑制因子而造成假阴性结果的出现。目前，较成熟的一步法多重荧光PCR方法建立的较少，而单重荧光PCR检测方法应用广泛，在其灵敏度、特异性及一致性相当的情况下，多重荧光PCR方法实现了一管四检，简化操作程序，耗时为单重荧光PCR的1/3，达到了省时、省力、省核酸、省成本的效果，更具高效性和通量性，尤其是进行大量样本筛检时，其优势更明显。

表4.多重荧光PCR与单重荧光PCR(商品化的试剂盒)检测结果的比较

实施例6.多重荧光PCR检测方法的稳定性鉴定

在同一次试验中(同一个PCR板)，对10倍梯度稀释的人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒阳性核酸(设置10^-1、10^-3、10^-5稀释梯度)进行多重荧光PCR检测，每个样本做3个重复；另外在不同PCR板上重复3次，结果各个稀释度样品的批内三个重复反应获得的Ct值的变异系数在(0.23％～0.34％)之间，批间重复的变异系数在(0.27％～0.85％)之间，表明本发明所建立的多重荧光PCR检测方法误差小、重复性好，可对人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒进行稳定、可靠的检测(表5)。

表5.多重荧光PCR检测方法的批内重复试验和批间重复试验结果

Claims

1.一种同时检测人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒的方法，其特征在于是含内质控的一步法多重荧光RT-PCR，其特异性引物和探针序列分别为：

1)SEQ NO：1、2、4、5、7、8、10、11所示的引物；

2)SEQ NO：3、6、9、12所示的探针。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于如SEQ NO：3所示的人腺病毒代表株Hexon基因探针5’端由FAM标记，3’端由BHQ1标记；如SEQ NO：6所示的人肺炎支原体代表株RP基因探针5’端由JOE标记，3’端由BHQ1标记；如SEQ NO：9所示的人博卡病毒代表株NP1基因探针5’端由ROX标记，3’端由BHQ2标记；如SEQ NO：12所示的质控基因LDHA基因探针5’端由CY5标记，3’端由BHQ2标记。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述多重荧光RT-PCR的反应体系：

a)反应缓冲液；

b)反应酶；

c)SEQ NO：1、2、4、5、7、8、10、11所示的引物；

d)SEQ NO：3、6、9、12所示的探针

e)无RNA酶的水补足体系要求的体积。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述多重荧光RT-PCR的反应条件如下：

a)四个荧光通道的设置；

b)反转录的温度与时间；

c)预热的温度与时间；

d)热循环(预热温度与时间、退火温度与时间、荧光收集温度、循环数)；

e)以界定的Ct值来判定检测结果。

5.如权利要求1所述方法在检测食品及原料、环境样本中人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒中的用途。

6.权利要求1所述的引物和探针序列在制备人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒的检测试剂中的应用。

7.一种同时检测人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有特异性引物和探针，其序列分别为：

1)SEQ NO：1、2、4、5、7、8、10、11所示的引物；

2)SEQ NO：3、6、9、12所示的探针。

8.权利要求7所述的试剂盒在制备人腺病毒、人肺炎支原体、人博卡病毒的诊断试剂中的应用。