CN103397105A

CN103397105A - 一种检测gii型诺如病毒的试剂盒及其用途

Info

Publication number: CN103397105A
Application number: CN2013102719240A
Authority: CN
Inventors: 王永杰; 喻勇新; 严淑玲; 潘迎捷
Original assignee: Shanghai Maritime University
Current assignee: Shanghai Maritime University; Shanghai Ocean University
Priority date: 2013-07-01
Filing date: 2013-07-01
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2033-07-01
Also published as: CN103397105B

Abstract

本发明涉及一种检测GII型诺如病毒的试剂盒及其用途，具体提供了一种检测GII型诺如病毒的引物对和探针，及包含所述引物对和探针的试剂盒。本发明利用重组酶聚合酶扩增反应可成功检测样品中GII型诺如病毒的存在，且通过荧光强度可对样品中GII型诺如病毒进行定量，具备灵敏度高、特异性强、检测时间短、反应温度恒定且低温的优点，可用于临床样品、食品、水产品、水体等样品中GII型诺如病毒的定性筛查和定量检测，因此可制备成GII型诺如病毒诊断试剂盒。

Description

一种检测GII型诺如病毒的试剂盒及其用途

技术领域

本发明涉及分子生物学和病毒检测技术领域，具体地说，是一种检测GII型诺如病毒的试剂盒及其用途。

背景技术

诺如病毒是世界上引起非细菌性胃肠炎暴发的最主要的病原体，感染力极强，可导致小范围的暴发，也可导致高达数十万人感染的大流行，并且可感染各年龄组的人群。诺如病毒是一种基因变异较大的病毒，根据其抗原性和核苷酸序列的变异程度可分成5个组（Genogroup G），GI、GII、GIV可感染人，其中GI和GII是感染人的主要遗传组，根据核苷酸的变异程度可进一步细分为不同基因型(GI.1、GI.2、GI.3、GI.4、GI.5、GI.6、GI.7、GI.8、GII.1、GII.2、GII.3、GII.4、GII.5、GII.6、GII.7、GII.8、GII.9、GII.10、GII.11、GII.12、GII.13、GII.14、GII.15、GII.16、GII.17、GII.18、GII.19等)。一般情况下衣壳蛋白全基因序列同源性高于80%或聚合酶区域核苷酸相似性大于85%（G）或90%（GII）则为同一型。由于诺如病毒基因变异大，基因型也较多，GI组的基因型在8个以上(GI.1、GI.2、GI.3、GI.4、GI.5、GI.6、GI.7、GI.8)，GII组基因型较多，在17个以上(GII.1、GII.2、GII.3、GII.4、GII.5、GII.6、GII.7、GII.8、GII.9、GII.10、GII.11、GII.12、GII.13、GII.14、GII.15、GII.16、GII.17、GII.18、GII.19等)。一般认为聚合酶基因片段是较为保守的区域，该区域的保守性也使其成为检测和分子流行病学分析的常用靶区域，因此国内外多个实验室都将这个区域作为分子分型的主要区域。

目前用于检测GII型诺如病毒的方法主要有RT-PCR、Real-time RT-PCR、LAMP、ELISA方法等。ELISA检测方法的株型特异性太强，准确性和灵敏度均偏低，检测不稳定，所以应用范围比较窄，难以胜任现代检测诊断技术的要求。PCR方法（包括RT-PCR和Real-time RT-PCR）虽然弥补了ELISA的不足，但限制其应用的主要技术因素在于仪器精密昂贵，依赖于精准的变温条件，因此该方法只能局限于专业实验室的使用，且检测速度也难以提高。LAMP方法需要在65℃反应45-90分钟，简单、便携性不足。而采用重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification，RPA）技术进行基因的扩增，扩增反应在常温下（25-42℃）即可进行，且RPA基因扩增与荧光检测仪较为轻便、易于携带，使得该检测技术在野外也可实施，同时操作简便，检测灵敏度高，有望广泛应用于医疗诊断、食品检测、动物健康、农业、环境测试、生物防御、科学研究等领域。

中国专利文献CN 201210360341.0，申请日2012.09.25，发明名称“一种诺如病毒实时等温扩增检测试剂盒及其引物和探针”，涉及一种基于实时核酸序列依赖性扩增（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）技术的肠道病原体快速检测技术，具体提供了一种诺如病毒实时等温扩增检测试剂盒及其一对引物和一条分子信标探针，引物序列如下：正向引物F1：5’-TGGAAYTCCATYGCCCACTG-3’；反向引物R1：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGTRCTNACAATYTCATCATCACC-3’；分子信标探针P1：5’-ROX-CCGAGCTGTGCVCTBTCYGARRTBACGCTCGG-DABCYL-3’，所述分子信标探针P1在其寡核苷酸DNA分子的5’端标记荧光报告基团ROX，3’端标记荧光淬灭基团DABCYL。但是目前尚未见结合RPA技术用于检测GII型诺如病毒的引物和探针的相关报道。而研发适用于PRA技术，检测GII型诺如病毒的引物、探针及试剂盒将为GII型诺如病毒的诊断提供一种更加方便、快捷、灵敏的手段，充分弥补现有技术的不足。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种检测GII型诺如病毒的核苷酸序列对。

本发明的再一的目的是，提供一种上述核苷酸序列对的用途。

本发明的另一的目的是，提供一种检测GII型诺如病毒的试剂盒。

本发明的第四个目的是，提供上述试剂盒的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种检测GII型诺如病毒的核苷酸序列对，所述的核苷酸序列对包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。所述的核苷酸序列对还可以包括SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：如上所述的检测GII型诺如病毒的核苷酸序列对在制备检测GII型诺如病毒的试剂中的用途。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：一种用于检测GII型诺如病毒的试剂盒，所述的试剂盒包含如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。所述的试剂盒还可以包含如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。所述的试剂盒还可进一步包含重泡胀缓冲液、DNA重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白、磷酸激酶、ATP、dNTP。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：如上任一所述的试剂盒在制备检测GII型诺如病毒的试剂中的用途。

本发明的主要原理为：（1）设计可以特异性识别GII型诺如病毒靶标序列的寡聚核酸引物对和荧光探针；（2）扩增反应中，引物与重组酶结合形成一种核蛋白体复合物（nucleoprotein），此复合物在双链DNA模板链上进行搜索，识别模板链上与之互补的序列并在单链结合蛋白（SSB）的辅助下与之进行结合，从而使得互补区域的双链模板进行解链；（3）单链结合蛋白与解链后的另一条模板链进行结合，以防止双链的复性，从而形成一个D型环状结构（D-loop）；（4）DNA聚合酶在引物的引导下由5’端向3’端进行链的合成与延伸，直到合成一条完整的新的互补链；（5）随着反应的不断循环重复，模板的数量呈指数增长，即可达到对模板链的扩增。上述反应过程都在低温等温（37-42℃）条件下进行，在20分钟内即可获得一定数量的产物累计，通过荧光探针的信号强度可对扩增结果进行检测。

本发明优点在于：

本发明提供了用于检测GII型诺如病毒的引物对及探针，通过重组酶聚合酶扩增反应可成功检测样品中GII型诺如病毒的存在，且通过荧光强度可对样品中GII型诺如病毒进行定量，具备灵敏度高、特异性强、检测时间短、反应温度恒定且低温的优点，可用于临床样品、食品、水产品、水体等样品中GII型诺如病毒的定性筛查和定量检测，因此可制备成GII型诺如病毒诊断试剂盒。

附图说明

附图1是本发明的诺如病毒RPA探针结构示意图。图中圆球表示荧光基团，以FAM修饰碱基T；圆环表示淬灭基团，以BHQ1修饰碱基T；等角符号表示四氢呋喃残基（THF），以THF取代A；正方形表示3’端block，以P元素取代，K代表简并碱基G或者C。

附图2是GII型诺如病毒cDNA的RPA扩增曲线。横坐标表示反应的时间，纵坐标表示荧光信号的强度。NTC表示未添加模板的阴性对照组，其余10⁵-10²分别代表四个反应体系中含有的GII型诺如病毒RNA模板的数量，分别为10⁵、10⁴、10³、10²拷贝。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1 本发明引物和探针的设计及其验证

1、实验材料

反转录酶和1×RT reaction buffer，由Roche公司生产；RNaseOut inhibitor由Invitrogen公司生产；TwistDx公司生产的TwistAmp DNA amplification kit试剂盒，包括Rehydration Buffer反应缓冲溶液、DNA重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白、磷酸激酶、ATP等试剂，其中DNA重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白、磷酸激酶、ATP等试剂以干粉的形式贮存在反应离心管内。

2、实验方法

2.1 引物及探针的设计

根据GII型诺如病毒靶标序列（NCBI登录号：X86557），设计如下特异性识别该靶标序列的引物及探针：

正向引物(FP2)：5’-TGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGG-3’（SEQ ID NO.1）；

反向引物(RP3)：5’-TTGACCTCTGGGACGAGGTTGGCTGCGGACCCATCAG-3’ （SEQ ID NO.2）；

探针：5’-GGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAKCTTTG[FAM-dT]G[THF]A[BHQ1-dT]GAAGATGGCGTCGAA-3’（SEQ ID NO.3），其中，K代表简并碱基G或者C，FAM-dT表示以FAM修饰碱基T，BHQ1-dT表示以BHQ1修饰碱基T，THF为四氢呋喃残基。该探针结构示意图如图1所示。

上述引物和探针由宝生物工程（大连）有限公司合成。

2.2 GII型诺如病毒cDNA的RPA扩增

2.2.1 GII型诺如病毒cDNA的合成

GII型诺如病毒RNA标准品由体外转录实验获得，并经过荧光染料进行绝对定量。将GII型诺如病毒RNA标准品设置成10⁵、10⁴、10³、10²分子/微升四个浓度梯度，用于cDNA的合成，共四个合成体系。具体为：取2μL GII型诺如病毒RNA，加入100nmol/L浓度的引物RP3，10μmol/L的dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸等比例混合），20U的RNaseOut inhibitor，10U的反转录酶和1×RT reaction buffer，加水至反转录体系为20μL。在恒温加热仪上设置相应温度程序，即55℃反应30分钟，然后在85℃下反应5分钟；再将反转录产物cDNA放置冰上备用。

2.2.2 RPA反应液的配制

分别移取29.5μL的Rehydration Buffer反应缓冲液、0.6μL 10μmol/L RPA反应的荧光探针、2.1μL 10μmol/L RPA上游引物（FP2）、2.1μL 10μmol/L RPA下游引物（RP3）、11.2μL ddH₂O（无核酸酶灭菌双蒸水）到200μL的含有混合酶干粉的反应管中。随后，将反应管盖上盖子进行充分混匀，并短暂离心。将合成的诺如病毒cDNA取出2μL加入到含有RPA反应液的反应管中，同时在反应管盖上（内侧）加入2.5μL 280nmol/L醋酸镁溶液，立刻小心盖上管盖进行简短离心，再进行涡旋振荡混匀并简短离心。

2.2.3 RPA扩增反应

将反应管迅速置于扩增检测仪中，反应温度设为42℃，反应时间为20分钟。随着反应时间的增加样品的扩增信号得到实时的监测。

2.3 特异性实验

根据NCBI网站登录的GI-1型、GI-2型、GI-3型、GI-4型、GII-1型、GII-2型、GII-3型、GII-4型、GII-5型、GII-6型、GII-7型、GII-8型、GII-9型、GII-10型、GII-11型、GII-12型、GII-13型、GII-14型、GIII-1型、GIII-2型、GIV型、GV型诺如病毒的RNA序列，以及A组轮状病毒、B组轮状病毒、星状病毒、扎如病毒的RNA序列，人工合成RNA，按照步骤2.2进行RPA扩增，其中RNA的浓度设定为10³分子，以无菌水为阴性对照，验证本发明引物及探针的特异性。

3、实验结果

2.1 GII型诺如病毒cDNA的RPA扩增

GII型诺如病毒cDNA的RPA扩增曲线如图2所示。结果表明：在20分钟内RPA扩增可以检测到GII型诺如病毒的浓度范围为10⁵-10²分子，检测灵敏度为100个病毒分子。

2.2 特异性实验

将本发明设计的引物分别与各基因型诺如病毒的RNA按照RT-RPA扩增体系进行反应，观察分别的扩增反应情况，结果具体如表1所示，初步证明了本发明的引物和探针具备较好的特异性。

表1 特异性实验结果

*Strain*	RPA扩增结果	*Strain*	RPA扩增结果
				GI-1型	N	GII-10型	Y
GI-2型	N	GII-11型	Y
				GI-3型	N	GII-12型	Y
GI-4型	N	GII-13型	Y
				GII-1型	Y	GII-14型	Y
GII-2型	Y	GIII-1型	N
				GII-3型	Y	GIII-2型	N
GII-4型	Y	GIV型	N
				GII-5型	Y	GV型	N
GII-6型	Y	A组轮状病毒	N
				GII-7型	Y	B组轮状病毒	N
GII-8型	Y	星状病毒	N
				GII-9型	Y	扎如病毒	N

注：Y表示阳性反应，N表示阴性反应。

实施例2 本发明的试剂盒一

试剂盒中含有下列试剂和材料：

引物溶液：正向引物FP2（SEQ ID NO.1，5μmol/L）；反向引物RP3（SEQ ID NO.2，5μmol/L）。

实施例3 本发明的试剂盒二

试剂盒中含有下列试剂和材料：

引物溶液：正向引物FP2（SEQ ID NO.1，5μmol/L）；反向引物RP3（SEQ ID NO.2，5μmol/L）；探针（SEQ ID NO.3，5μmol/L）。

实施例4 本发明的试剂盒三

试剂盒中含有下列试剂和材料：

引物溶液：正向引物FP2（SEQ ID NO.1，5μmol/L）；反向引物RP3（SEQ ID NO.2，5μmol/L）；探针（SEQ ID NO.3，5μmol/L）；1×重泡胀缓冲液；DNA重组酶（8,000 units/ml）；DNA聚合酶（8,000 units/ml）；单链结合蛋白；磷酸激酶（8,000 units/ml）；ATP；dNTP（2.5mol/L）。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海海洋大学

<120> 一种检测GII型诺如病毒的试剂盒及其用途

<130> /

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tggatgagat tctcagatct gagcacgtgg gaggg 35

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttgacctctg ggacgaggtt ggctgcggac ccatcag 37

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gggcgatcgc aatctggctc ccakctttgt gatgaagatg gcgtcgaa 48

Claims

1.一种检测GII型诺如病毒的核苷酸序列对，其特征在于，所述的核苷酸序列对包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的检测GII型诺如病毒的核苷酸序列对，其特征在于，所述的核苷酸序列对还包括SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

3.权利要求1或2所述的检测GII型诺如病毒的核苷酸序列对在制备检测GII型诺如病毒的试剂中的用途。

4.一种用于检测GII型诺如病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包含如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包含重泡胀缓冲液、DNA重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白、磷酸激酶、ATP、dNTP。

7.权利要求4-7任一所述的试剂盒在制备检测GII型诺如病毒的试剂中的用途。