CN102912038B

CN102912038B - 一种检测禽流感病毒的rt-hda试剂盒及引物

Info

Publication number: CN102912038B
Application number: CN201210413477.3A
Authority: CN
Inventors: 蒲静; 张伟; 刘环; 乔彩霞; 高志强; 汪琳; 谷强
Original assignee: Beijing Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Peoples Republic of China
Current assignee: Beijing Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Peoples Republic of China
Priority date: 2012-10-25
Filing date: 2012-10-25
Publication date: 2014-05-28
Anticipated expiration: 2032-10-25
Also published as: CN102912038A

Abstract

本发明公开了一种检测禽流感病毒的RT-HDA试剂盒及引物。所述检测禽流感病毒的引物为序列表SEQ ID No：1和序列表SEQ ID No：2所示的寡核苷酸序列。本发明首次将新型恒温扩增技术HDA应用于禽流感病毒的检测中，与AIV现有的检测方法相比：①HDA检测方法更快、更便捷，安全可靠。传统的病毒分离和血清学方法耗时较长，且存在生物安全危险性；HDA方法模仿体内天然的复制机制，安全性高，且反应快速，最多仅需2h即可完成检测；②与PCR相比不需要PCR仪，设备要求简单，仅需要一台水浴锅，从技术层面上讲更便于掌握和操作，更便于在条件不足的地区推广应用，更有利于对禽流感病毒的诊断和监控。

Description

一种检测禽流感病毒的RT-HDA试剂盒及引物

技术领域

本发明涉及一种检测禽流感病毒的RT-HDA试剂盒及引物，属于检验检疫领域。

背景技术

禽流感（Avian Influenza，AI）是由正黏病毒科、流感病毒属、A型流感病毒引起的禽类感染和/或疾病综合症。禽流感历史悠久，第一次发现是1878年，Perroncito首次报道禽流感在意大利发生，已被国际兽医局（OIE）列为A类烈性传染病，世界卫生组织(WHO)认为AI是对人类造成潜在威胁的最主要的疾病之一，我国也将高致病性禽流感（HPAI）列入一类动物传染病进行防制。近些年来，我国很多地区都存在禽流感的流行，给养禽业带来不同程度的打击，迄今为止已经发生多起高致病性禽流感感染人致死的事件，对养殖业发展和人类健康造成巨大威胁。目前，全世界已有15个国家和地区发现禽流感人类感染病例，死亡率高达60％以上。因此，建立禽流感快速检测技术，将对禽流感的监测与防控发挥重要作用。

目前，我国使用的禽流感检测标准有2项行标和7项国标，主要检测方法有病毒分离、各类血清学试验及免疫学试验（琼扩、血凝血抑、ELISA）、分子生物学检测方法（RT-PCR和荧光RT-PCR）等。但是，每种检测方法均存在一定的局限性。传统的病毒分离和血清学方法繁琐耗时，不适于流行病学普查和高通量口岸检疫。PCR和荧光PCR方法已经得到广泛应用，并在疾病检测和过境检疫中发挥了重要作用。但是，传统的PCR技术仍然存在一些不足：需要昂贵的设备，尤其是荧光PCR仪造价不菲；容易受到多种因素的影响；扩增时间往往需要几个小时。上述问题使得传统的PCR技术难以在基层推广应用，不利于疾病的“早发现、早报告、早处理”。

近年来，分子诊断技术日新月异，产生了多种新型分子扩增技术，推动着分子诊断技术向操作简单、仪器设备要求不高的方向发展。其中，依赖解旋酶恒温基因扩增技术（Helicase-Dependent Isothermal Amplification，HDA）是2004年BioHelix的研究人员模拟动物体内DNA的复制机制发明的一种新的体外恒温扩增技术。该技术利用DNA双链解旋酶打开双链DNA，同时在单链结合蛋白（SSB）和DNA聚合酶的作用下，扩增靶片段，实现目的基因的体外扩增。HDA技术与其他基因扩增技术比较，具有如下优势：

1.与PCR技术相比，HDA技术模仿自然界DNA合成方式，凭借DNA解旋酶解开双链并完成扩增，而传统PCR是通过变性-退火-延伸过程的多次循环实现。由于原理的不同，使得HDA的优点尤其突出：①HDA反应在同一温度下进行，因而不需要昂贵的PCR仪，有利于在基层实验室推广应用。②由于只用一种温度扩增使得HDA反应时间明显缩短，仅需1h左右。③HDA技术采用去除了5’-3’外切酶活性的BstDNA聚合酶，该酶兼具耐高温性、高效扩增反应性、极好的条带均一性及高准确性等特点，不易引起非特异性扩增，使得HDA技术具有更高的特异性和敏感性。

2.与其他恒温扩增技术相比，HDA是一种真正意义上的恒温基因扩增方法。例如：SDA、LAMP等均需要热变性，而HDA不需此步即可完成反应。此外，尽管HDA的反应体系组稍显复杂，但操作并不繁琐。尤其HDA技术的引物设计简单。SDA技术需要四条引物，靠一组限制性酶消化和置换合成达到扩增目的，同时还需经修饰过的dNTP作底物，而且靶序列的复杂性也限制了其应用范围。TMA技术需要三种酶来完成恒温基因扩增，反应复杂性也限制其使用范围。LAMP技术虽具有简便、快速、高效、特异性很强等优点，但引物设计复杂，难度较大，且对识别靶序列要求极高：目的序列长度限制在200bp左右，从中设计的四至六条引物Tm互有差别，且能识别6个不同的区域。而HDA技术的引物设计与常规PCR方法相同，仅需两条普通引物即可。总之，与同类新型PCR技术相比，HDA技术更简单，更有效，是一种崭新的基因扩增方法，极具应用价值和市场前景。

据最新研究报道，现有的HDA技术还包括一种不仅可扩增大分子DNA片段，还可直接扩增完整环状质粒DNA的环HDA法（The circular helicase-dependent amplification，cHDA）。利用cHDA的特异性扩增环状DNA能力，可直接从临床标本和特定的病原体中检测含有环状DNA的病毒等。HDA技术与荧光标记技术相结合还可以实现实时检测。研究表明，HDA技术能够扩增微生物基因组DNA、病原DNA和RNA、质粒DNA和cDNA等。HDA方法扩增能力强，现用的Uvrd系统扩增可达100多万倍，能够从基因组DNA中检测到低于10个拷贝的靶基因。综上所述，HDA技术是一种不可比拟的真正实用的恒温基因扩增方法，有望成为一种重要的诊断工具。

目前，国际上对于HDA技术的研究尚处于起步阶段，国内外还没有关于HDA检测动物病毒的研究。我们将首次建立起快速检测禽流感病毒的HDA技术。该项研究成果将成为动物疫病分子诊断领域的突破性技术，是动物传染病检疫技术体系的进一步完善和发展。HDA技术的建立将真正实现简单、便捷的临床和实验室诊断，适用于基层检疫，可全面提升口岸检疫的检测能力，缩短检疫时间，真正实现高通量检测，为我国禽流感的有效防制作出重大贡献。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一组作为引物使用的、检测禽流感病毒的寡核苷酸序列。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种特异、灵敏、高效的检测禽流感病毒的试剂盒。

为解决第一个技术问题，本发明采用以下技术方案：

一组检测禽流感病毒的引物，为序列表SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的寡核苷酸序列，详见表1。

表1.引物序列

注：胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）、腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）。

其中引物I和引物II分别为检测禽流感病毒的正义引物和反义引物。

为解决第二个技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种检测禽流感病毒的RT-HDA试剂盒，保存于-20℃，由以下试剂组成：

（1）TriZol裂解液；

（2）RT-HDA反应液，其包括：HDA缓冲液、MgSO₄、NaCl、dNTP、引物I、引物II；进一步地，优选为1×HDA缓冲液、4.0mM MgSO₄、40mM NaCl、0.21mMdNTP、100nM引物I、100nM引物II；

其中，1×HDA缓冲液由10×HDA缓冲液稀释制备而成，所述10×HDA缓冲液包括10mmol/L KCl、20mmol/L Tris-Cl（pH8.8，25°C）；引物I的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，引物II的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；

（3）酶混合物，其包括：DNA解旋酶、Bst DNA扩增酶和反转录酶，其中，所述DNA解旋酶10μg，Bst DNA扩增酶1000U，反转录酶优选为ThermoScript反转录酶，100U；

（4）无RNA酶的灭菌纯化水；

（5）阴性对照：无核酸灭菌水；

（6）阳性对照：为体外转录的非感染性RNA片段。回收禽流感病毒A/Duck/HB/(H5N1)株M基因的RT-PCR扩增产物，长度为1002bp，与pMD-T20载体(购自TAKARA公司)进行连接，转化TOP10感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为pMD-T20-AIV-M。以纯化的质粒为模板，将质粒线性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA ProductionSystem-SP6试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNase除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到制备禽流感病毒阳性对照品所需的RNA阳性对照品母液；

禽流感病毒株A/Duck/HB/(H5N1)株M基因片段如序列表中SEQ ID NO：3所示。

本发明还提供了一种检测禽流感病毒RT-HDA的方法，包括如下步骤：

1）提取样品RNA；

2）对提取的样品RNA进行RT-HDA扩增：

引物序列为①5’-GTAGACGCTTTGTCCAGAATGCCCTAA-3’

②5’-GACCTCCTTAGCCCCATGGAATGTTAT-3’

3）反应条件：65℃，90~120min；

4）琼脂糖凝胶电泳：

称取2g琼脂糖于100mL 1×TAE电泳缓冲液中，充分加热溶化，加入3μLGoldView Ⅰ型核酸染色剂（或者相似产品），倒板制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5μL HDA扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样，并点5μL Marker DL2000或20bp DNA Marker作为对照；9V/cm恒压，电泳20min~30min。紫外检测仪下观察电泳结果并记录。

5）结果描述及判定

①质控标准：

阳性对照在119bp处有特异性扩增条带；

阴性对照无特异性扩增条带；

如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次试验视为无效。

②结果判断：

阳性：在119bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽流感病毒。必要时对RT-HDA扩增产物测序，进行确认试验。

阴性：无特异性扩增条带，表明样品中无禽流感病毒。

本发明中发明人以RT-HDA对模板进行检测，验证了该方法的特异性。

本发明以通过对阳性对照提取RNA进行系列稀释的模板检测，开展了敏感性实验。实验结果显示，最低可以检测到100拷贝/反应的RNA模板量，具有较高的灵敏度。

用该方法对实验室保存的50份鸡场拭子、10份组织病料和4份禽流感病毒增殖的尿囊液进行检测。实验结果表明，该方法是一种特异、灵敏、高效的检测方法。这项技术在临床疫病的监控和诊断中都具有极大的应用前景，尤其对于基层养殖场或者实验条件不能满足检验检疫要求的地区或实验室。

本发明的优点是：首次将新型恒温扩增技术HDA应用于禽流感病毒的检测中，与AIV现有的检测方法相比：①HDA检测方法更快、更便捷，安全可靠。传统的病毒分离和血清学方法耗时较长，且存在生物安全危险性；HDA方法模仿体内天然的复制机制，安全性高，且反应快速，最多仅需2h即可完成检测；②与PCR相比不需要PCR仪，设备要求简单，仅需要一台水浴锅，从技术层面上讲更便于掌握和操作，更便于在条件不足的地区推广应用，更有利于对禽流感病毒的诊断和监控，也更加符合“绿色环保”的理念。且通过反应条件的优化，该HDA方法最低可检测至100个拷贝/反应的病毒核酸。该方法还对实验室采集保存的50份鸡场拭子、10份组织病料和4份禽流感病毒增殖的尿囊液进行了检测，实验结果表明，AIV RT-HDA方法是一种特异、灵敏、高效的检测方法。这项技术在临床疫病的监控和诊断中都具有极大的应用前景，尤其对于基层养殖场或者实验条件不能满足检验检疫要求的地区或实验室，是一种极具推广应用价值的诊断工具。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为AIV RT-HDA反应体系优化后，得到的特异性电泳条带；其中，M1：20bpDNA Marker；1：阳性样品；2：阴性样品；M2：Marker D2L000；

图2为检测禽流感病毒的RT-HDA检测试剂盒的特异性试验结果；其中，M：Marker DL2000；1：禽流感病毒H5亚型；2：禽流感病毒H7亚型；3：禽流感病毒H9亚型；4：新城疫病毒；5：鸡传染性支气管炎病毒；6：阴性对照；

图3为检测禽流感病毒的RT-HDA检测试剂盒的灵敏性检测结果；其中，M1：20bp DNA Marker；1~8：10⁸-1.0拷贝/微升（依次作10倍梯度稀释）9：阴性对照。M2：Marker D2L000；

具体实施方式

本发明所用禽流感病毒H5亚型、禽流感病毒H7亚型、禽流感病毒H9亚型、新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒，均为北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心保存。

实施例1：HDA引物的设计与合成

根据Genbank中登录的禽流感病毒基因序列，用DNAMAN软件进行比对分析，选择AIV-M基因高度保守的区域，使用在线软件Primer3（http://frodo.wi.mit.edu/）进行引物设计，并结合Oligo6.0软件对引物进行分析评价，设计出针对禽流感病毒的通用型引物。引物序列同表1。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

实施例2：禽流感病毒RNA的提取

使用RNA提取试剂提取禽流感病毒RNA。

具体操作如下：

①取n个1.5mL灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。

②每管加入600μL TRIZOL裂解液，然后分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照各200μL，一份样本换用一个吸头；再加入200μL三氯甲烷，混匀器上震荡混匀5s。于4℃条件下，12000r/min离心15min。

③取与①中相同数量的1.5mL灭菌Eppendorf管，加入500μL异丙醇（-20℃预冷），对每个管进行编号。吸取5.3.2离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液至少吸取500μL，注意不要吸出中间层，颠倒混匀。

④于4℃条件下，12000r/min离心15min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加入600μL 75％乙醇，颠倒洗涤。

⑤于4℃条件下，12000r/min离心10min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。

⑥4000r/min离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3min。不宜过于干燥，以免RNA不溶。

⑦加入11μL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增或放置于-70℃冰箱备用。

实施例3：RT-HDA的建立

一、对引物浓度、MgSO₄浓度和NaCl浓度分别进行了优化，建立了RT-HDA的反应体系。

按照实施例2方法获得禽流感病毒RNA，模板浓度约为10⁴拷贝/微升，进行RT-HDA，优化反应体系。对各成分的优化范围见表2，反应体系见表3，所用引物和探针序列见表1。

表2AIV RT-HDA反应体系中各成分的优化范围

表3AIV RT-HDA反应体系的优化

二、结果：

经过多次试验最终引物浓度确定为100nM；MgSO₄浓度确定为4.0mM；NaCl浓度为40mM。

图1为RT-HDA反应体系优化后，得到的禽流感病毒特异性电泳条带（119bp）。

实施例4：一种检测禽流感病毒的RT-HDA试剂盒及其使用

一、试剂盒的组成（保存于-20℃）

（1）TriZol裂解液：15ml/瓶×2；购自INVITROGEN公司

（2）RT-HDA反应液，750μL×1管，包括：1×HDA缓冲液、4.0mM MgSO4、40mMNaCl、0.21mM dNTP、100nM引物I、100nM引物II；

（3）酶混合物，其包括：DNA解旋酶10μg，Bst DNA扩增酶1000U，反转录酶ThermoScript 100U；均购自New England Biolabs公司。

（4）无RNA酶的灭菌纯化水，1mL×1管；

（5）阴性对照：1mL×1管：无核酸灭菌水；

（6）阳性对照：1mL×1管；为体外转录的非感染性RNA片段。回收禽流感病毒A/Duck/HB/(H5N1)株M基因的RT-PCR扩增产物，长度为1002bp，与pMD-T20载体(购自TAKARA公司)进行连接，转化TOP10感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为pMD-T20-AIV-M。以纯化的质粒为模板，将质粒线性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNAProduction System-SP6试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNase除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到制备禽流感病毒阳性对照品所需的RNA阳性对照品母液。禽流感病毒株A/Duck/HB/(H5N1)株M基因片段如序列表中SEQ ID NO：3所示。

二、试剂盒的使用

（1）提取样品的RNA，即模板RNA具体操作如下：

（2）进行RT-HDA反应，最适反应体系如表4：

表4AIV RT-HDA最佳反应体系

（3）反应条件：65℃，90~120min。

（4）琼脂糖凝胶电泳：

称取2g琼脂糖于100mL 1×TAE电泳缓冲液中，充分加热溶化，加入3μLGoldView Ⅰ型核酸染色剂（或者相似产品），倒板制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5μL HDA扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样，并点5μL Marker DL2000或20bp DNA Marker作为对照。9V/cm恒压，电泳20min～30min。紫外检测仪下观察电泳结果并记录。

（5）结果描述及判定

①质控标准：

阳性对照在119bp处有特异性扩增条带。

阴性对照无特异性扩增条带。

②结果判断：

阴性：无特异性扩增条带，表明样品中无禽流感病毒。

实施例5：一种检测禽流感病毒的RT-HDA试剂盒的特异性试验

一、方法

提取禽流感病毒H5亚型、禽流感病毒H7亚型、禽流感病毒H9亚型、新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒（见表5）的RNA做为模板，用实施例4所建立的试剂盒和方法对提取的RNA进行RT-HDA检测，以确定检测试剂盒的特异性。

表5方法研究过程中应用到的毒株

二．结果

结果见图2。结果显示3株禽流感病毒均出现了特征性的扩增电泳条带，其他2种禽类常见病毒结果均为阴性。由此证明该方法有较强的特异性。

实施例6：一种检测禽流感病毒的RT-HDA试剂盒的敏感性试验

一．方法：

用实施例4所建立的试剂盒和方法对实施例4所述的阳性对照进行RT-HDA检测，以确定反应的灵敏度。提取阳性对照RNA并稀释后，得到的RNA浓度分别为10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10，1.0拷贝/微升的溶液。

二．结果

对稀释的阳性对照（10⁸-1.0拷贝/微升）进行RT-HDA检测，结果如图3所示。结果表明，RT-HDA对系列梯度稀释的阳性对照（从左至右分别为10⁸-1.0拷贝/反应对应的结果）进行检测，在模板浓度为10²拷贝/反应时，有较弱的特异性条带，10拷贝/反应的模板浓度时无特异性条带。故RT-HDA对禽流感病毒最低可检测至10²拷贝/反应。

实施例7：临床样品的检测

一．方法

参照国家标准GB/T 19438.1-2004《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》对实验室采集保存的临床样品进行检测。同时对这些临床样品参照实例4的方法进行RT-HDA检测。

二．结果

表6使用RT-HDA和国标荧光RT-PCR方法对临床样本的检测结果汇总

实验结果表明，AIV RT-HDA方法是一种特异、灵敏、高效的检测方法。这项技术在临床疫病的监控和诊断中都具有极大的应用前景，尤其对于基层养殖场或者设备条件不能满足检验检疫要求的地区或实验室，是一种极具推广应用价值的诊断工具。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1.一种检测禽流感病毒的RT-HDA试剂盒，其特征在于，由以下组分组成：

（1）TriZol裂解液；

（2）RT-HDA反应液，其包括：1×HDA缓冲液、4.0mM MgSO₄、40mM NaCl、0.21mM dNTP、100nM引物I和100nM引物II；其中，1×HDA缓冲液由10×HDA缓冲液稀释制备而成，所述10×HDA缓冲液包括10mmol/L KCl和20mmol/L Tris-Cl，pH 8.8，所述引物I的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，引物II的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；

（3）酶混合物，其包括：DNA解旋酶，Bst DNA扩增酶和反转录酶；

（4）无RNA酶的灭菌纯化水；

（5）阴性对照：无核酸灭菌水；

（6）阳性对照：为体外转录的非感染性RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的检测禽流感病毒的RT-HDA试剂盒，其特征在于：所述反转录酶为ThermoScript反转录酶。