CN102108420A - 一种检测登革1型病毒的荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物化学领域，提供一种检测登革1型病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有特异性扩增登革1型病毒NS2A区域的引物：5’-GATGAGATCCAGATGGAGTAGAAAG-3’(SEQ NO.1)，5’-TCAGTTGTCCCATTATAAGAAGGAG-3’(SEQ NO.2)；和荧光探针：5’FAM-ACAGCCAGTGTTCCAGTCATCAGCA-Eclipse3’(SEQ NO.3)。该试剂盒对登革1型病毒具有良好的敏感性和特异性，重复性很好，完全适用于登革1型病毒的临床检测。

Description

一种检测登革1型病毒的荧光定量PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体涉及包含核酸、酶或微生物的测定或检验方法的检测试剂。

背景技术

登革病毒属黄病毒属，为单股正链RNA病毒，可导致登革热(DF)、登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)。登革病毒病每年约有5-10千万人感染，已成为全球公共卫生关注的焦点之一。本病感染潜伏期为2～15天，平均5～6天，通常3～5天，发病前尽管体内有病毒存在，而前驱症状却不明显。登革热表现为突然起病，畏寒、迅速发热等症状。登革出血热有典型登革热表现，2～4病日内可见散在出血点。病情进展中有鼻腔、牙龈、消化道、泌尿道或子宫等任何一个以上器官的较大量出血，常见肝肿大，脑出血的病例也有发现。异常严重出血的病例可导致死亡。登革休克综合征具有DHF表现的少数病人，在发热过程中或热退后，病情突然加重，出现皮肤湿冷、脉数弱、烦燥或昏迷，血压下降出现休克或脉压低于2.67Kpa(20mm汞柱以下)等危象，甚至血压和脉搏测不出，病情凶险，病死率高。

登革热的诊断目前主要采取病毒分离定型以及血清中特异性IgM、IgG抗体测定的方法。但由于患者早期抗体阳性率低，往往要7-10d后IgM抗体才能达到一个较高的水平，因此在早期诊断中受到一定的限制。近年来发展起来的荧光定量RT-PCR技术可实现早期诊断，而且与常规PCR相比，荧光定量PCR方法更灵敏，且不需要电泳分析，同时因加入特异的荧光标记探针可对PCR扩增产物进行实时检测，因而更省时、特异，减少了交叉污染，并能精确地对多个样本进行定量分析。

在以往的研究中有在登革1型病毒3’非编码区(3’NC)、NS5区、衣壳蛋白(C)区域设计引物探针。目前一般认为3’NC和NS5区设计的引物探针敏感性较差；C区保守性较差，设计出来的引物探针容易受到其它三型登革病毒的干扰；E区变异性很大，会出现假阴性或者敏感性较差。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种登革1型病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒对登革1型病毒具有特异性和敏感性好的优点。

本发明解决上述问题的技术方案具体是：一种检测登革1型病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒由定量阳性模板、一对特异性扩增登革1型病毒NS2A区域的引物、荧光探针、荧光定量聚合酶Premix Ex Taq^TM和参比染料ROX Reference Dye II组成，其特征在于：

(1)所述的引物是特异性扩增登革1型病毒NS2A区域的引物，其中，

上游引物序列为：5’-GATGAGATCCAGATGGAGTAGAAAG-3’(SEQ NO.1)，

下游引物序列为：5’-TCAGTTGTCCCATTATAAGAAGGAG-3’(SEQ NO.2)；

(2)所述的荧光探针序列为：

5’FAM-ACAGCCAGTGTTCCAGTCATCAGCA-Eclipse3’(SEQ NO.3)，

其中FAM为标记在探针5’端的荧光基团，Eclipse为标记在探针3’端的荧光淬灭基团；

(3)所述的定量阳性模板为含有下列DNA片段的pMD18-T重组质粒：

GATGAGATCCAGATGGAGTAGAAAGATGCTGATGACTGGAACACTGGCTGTTTTCCTCCTTCTTATAATGGGACAACTGA(SEQ NO.4)。

本发明所述的特异性扩增登革1型病毒NS2A区域的引物可以由本领域常用的方法合成。

本发明所述的荧光探针可以由本领域常用的方法合成。

本发明所述的荧光定量聚合酶Premix Ex Taq^TM由Takara公司提供、参比染料ROXReference Dye II由Takara公司提供。

本发明所述的定量阳性模板的构建方法是将DNA片段SEQ NO.4插入到质粒载体中构建重组质粒得到。

上述方法中，所述的质粒载体是T克隆载体，如pMD19-T载体；所述的将DNA片段SEQ NO.4插入到质粒载体的方法为本领域的常规方法，具体的步骤和工艺参数视所选的质粒载体而定。

登革病毒非结构蛋白NS2A可能参与多聚蛋白的水解过程，本发明人通过Clustal W2对不同株的登革病毒基因进行比对，发现四型登革病毒在NS2A基因处的差别较大，而且与其它黄热病毒之间也存在很大差别，同时登革1型病毒型内的NS2A基因则比较保守，本发明试剂盒正是通过检测这段序列来判断病人是否被登革1型病毒感染，扩增的引物序列为SEQ NO.1和SEQ NO.2，其位置如图1示。

本发明所述的试剂盒的使用方法为：

(1)Real-time PCR，反应体系如下：

表1本发明试剂盒Real-Time PCR反应体系

反应程序：95℃30s

(2)定量标准曲线制备：将定量阳性模板按10倍稀释法稀释成10¹⁰～10⁴copies/ml 7个浓度梯度，按照上述反应体系和反应程序，反应结束后计算机自动绘制标准曲线Y＝aX+b，R²，Eff，其中X表示起始模板拷贝数的对数，Y表示C(t)值。

(3)样品检测：首先采用MiniBEST Viral RNA Extraction kit ver.4.0病毒RNA提取试剂盒从病人血清中提RNA；然后选用Takara公司的PrimerScript^TM RT reagent kit扩增试剂盒将上述RNA反转录为cDNA，得到模板DNA；最后按照上述反应体系和反应程序进行扩增即可。

(4)结果判断：设置阴性对照和空白对照，取待测样本进行荧光定量PCR检测，C(t)值小于35.0为阳性，大于35.0时为阴性，其中阴性对照样本是未接种的乳鼠鼠脑或者健康人血清，其中当检测样本是鼠脑，阴性对照样本是未接种的乳鼠鼠脑；当检测样本是病人样本时，阴性对照样本是健康人血清。

本发明具有以下优点：

(1)本发明设计的引物探针具有很好的重复性。

(2)与其它三型登革病毒以及乙型脑炎病毒之间并无交叉反应，具有很好的特异性。能够避免假阴性的出现。

(3)敏感性可达1copy/μl，具有很好的敏感性。

附图说明

图1是本发明试剂盒扩增的DNA片段的在登革1型病毒基因组中的位置图，图中剖面线方框所示的部位是本发明试剂盒扩增的DNA片段。

图2是阳性质粒单酶切后琼脂糖凝胶电泳结果，质粒大小约2774bp。

图3是利用阳性质粒制作标准曲线时，不同稀释度的质粒荧光定量PCR扩增曲线，从左至右各条曲线代表10¹⁰、10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴个/ml拷贝数质粒扩增曲线。

图4是荧光定量PCR标准曲线结果，标准曲线回归方程Y＝-3.410logX+45.10，相关系数R²＝0.999，扩增效率Eff＝96.5％。

图5是敏感性检测结果，不同质粒稀释的结果，从左至右各条曲线代表10⁴、10³、10²、10¹个/μl质粒，最低可检测1copy/μl。

具体实施方式

下面将结合实施例来说明本发明具有的有益效果。

实施例1：本发明所述的试剂盒的制备

1.检测登革1型病毒的荧光定量PCR试剂盒的组成：

上游引物：5’-GATGAGATCCAGATGGAGTAGAAAG-3’，10μM

下游引物：5’-TCAGTTGTCCCATTATAAGAAGGAG-3’，10μM

荧光探针：5’FAM-ACAGCCAGTGTTCCAGTCATCAGCA-Eclipse3’，3μM

定量阳性模板：含有扩增片段的PMD18-T重组载体浓度是10¹⁰copies/ml。

Premix Ex Taq^TM(2×)：购自Takara公司。

Rox Reference Dye II：购自Takara公司。

2.阳性模板制备

(1)从登革1型病毒标准株提取RNA，并反转录，用序列为SEQ NO.1和SEQ NO.2的引物扩增出序列为SEQ NO.4的DNA片段，扩增程序为：93℃变性3min后进入下述循环，94℃30s、55℃30s、72℃60s，共30个循环；

(2)使用DNA胶回收试剂盒回收纯化扩增所得的DNA片段SEQ NO.4；

(3)将DNA片段SEQ NO.4插入到pMD18-T载体中，具体方法是：

a.DNA片段SEQ NO.4与T载体的连接和转化：

1)在微量离心管中加入：

PMD18-T Vector    1μl

目的DNA SEQ NO.4  5μl

dH₂O              3μl；

2)加入9μl的Ligation Mix；

3)16℃反应过夜；

4)把感受态细胞DH5α从-80℃冰箱中取出，置于冰中。60μl移至灭菌处理的试管内；

5)加入目的DNA 10μl；

6)冰中放置30min；

7)42℃60S；

8)冰中放置2～3min；

9)加入37℃LB液体培养基1ml；

10)37℃振荡1h(120r/min)；

11)取200μl培养基涂板于LB氨苄青霉素固体培养基中；

12)37℃过夜培养；

13)取3个菌落放入LB氨苄青霉素液体培养基3ml中摇菌扩增24h。

b.重组质粒提取：

1)取扩增菌液2ml离心12000rpm 1min；

2)弃上清，加入250μl溶液P1(已加入RNaseA)悬浮细胞；

3)加入250μl溶液P2，轻轻混均，上下颠倒4～6次；

4)加入350μl溶液P3，轻轻混均，上下颠倒直到白色絮状物形成；

5)离心12000rpm 10min；

6)小心把清澈的上清加入到干净的吸附柱中，离心12000rpm 1min；

7)去液，加500μl去蛋白液PD，离心12000rpm 1min；

8)弃液，加入600μl漂洗液PW，离心12000rpm 1min；

9)重复步骤8)；

10)再离心空管12000rpm 2min；

11)把空管放入干净的1.5ml离心管中，加入TE 50-100μl，离心12000rpm 1min。

3、鉴定：将所得重组质粒用限制性内切酶Xba I进行单酶切，用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。所得产物大小为2774bp。结果见附图1。

实施例2：体外检测实验

1、模板cDNA的制备：

a.试剂：RNA提取试剂盒以及RT-PCR试剂盒，购自Takara公司。

b.标准病毒株制备：

登革1型病毒标准株：DEN-1夏威夷株由本实验室保存；

阴性对照菌株：登革病毒2-4型毒株标准株(DEN-2-NGC株、DEN-3-H87株和DEN-4-H241株)由本实验室保存，乙型脑炎减毒活疫苗由成都生物制品研究所生产。

c.RNA提取：标准株为乳鼠鼠脑保种，按照Takara组织提取试剂盒提取病毒RNA，乙型脑炎直接按照液体提取试剂盒提取。

d.反转录为cDNA：采用Takara RT-PCR试剂盒将RNA反转录为cDNA，-80℃保存。

2、荧光定量PCR反应：

1)反应体系如发明内容中的表1所示。

2)方法：每批反应设一个空白对照和阴性对照，取待测样本进行荧光定量PCR反应，其中空白对照样为双蒸水，阴性对照样是未接种的乳鼠鼠脑。反应程序为：

95℃30s

仪器：Mx3005P荧光定量PCR仪，Stratagene公司。

3、标准曲线制备

将定量阳性模板线性化后10倍倍比稀释，依次从10¹⁰稀释到10⁴copies/ml。各取2μl进行荧光定量PCR，制作标准曲线。结果见附图说明图2和图3。荧光定量PCR标准曲线相关系数R²＝0.999，扩增效率Eff＝96.5％，回归方程Y＝-3.410logX+45.10。从图可以看出，用阳性质粒所作的标准曲线的C(t)值与初始浓度有较好的线性关系。

4、特异性验证

用建立的荧光定量RT-PCR方法对登革1-4型病毒以及乙型脑炎减毒活疫苗提取的RNA进行检测，登革1型病毒检测结果C(t)值为15.28，而其它三型病毒以及乙型脑炎病毒并无C(t)值，表明建立的荧光定量RT-PCR方法不会受乙型脑炎病毒干扰。

5、重复性和再现性

线性化后的阳性质粒10倍倍比稀释6个浓度，从1.01×10¹⁰稀释到1.01×10⁵copies/ml，分不同的时间重复三次，每次做三个重复孔，并计算均值(Mean)、标准差(SD)以及相对标准差(RSD)，并列出理论值和检测值(见表2)。以上数据充分表明建立的方法具有很好的重复性和再现性。

表2各个浓度的C(t)值的均值以及变异系数

^aRSD(relative standard deviation)是指标准差除以平均值，以百分数表示。SD^r，重复性标准差；SD^R，再现性标准差。

4.敏感性检测

阳性质粒从1.01×10⁵copies/μl 10倍倍比稀释，荧光定量PCR检测，敏感性可达1Copy/μl。见图4。

实施例3：临床标本检测

1、实验方法：

1)临床标本收集：

常规临床标本收集应该是取病人静脉血约2ml、3000rpm离心30min，分别取300μl、400～600μl血清分装在无菌1.5mlEP管中，编号登记，标本可立即用于测试，4℃可保存6个小时，长期保存可保存在-20℃，但避免反复冻融。

2)临床标本检测：

(a)对广州市第八人民医院提供的166份登革1型病毒感染者cDNA标本进行荧光定量PCR检测，并且用常规PCR进行验证。

常规PCR反应体系如表3所示：

表3本实例中常规PCR反应体系

反应方法：每批反应设一个空白对照和阴性对照，取待测样本进行荧光定量PCR反应，其中空白对照样为双蒸水，阴性对照样是健康人血清。反应程序为：

(b)本发明所述的试剂盒验证

临床标本检测：广州市第八人民医院提供的病人标本为cDNA，故省去标本收集、提RNA以及逆转录步骤。

荧光定量PCR反应体系如发明内容中的表1所示。

反应程序为：

95℃30s

仪器：Mx3005P荧光定量PCR仪，Stratagene公司。

C(t)值小于35.0为阳性，大于35.0时为阴性。

2、实验结果：

采用实例1所述的试剂盒对166份标本检测检测到126份为阳性，阳性率为75.9％，常规PCR检测到36份为阳性，阳性率只有21.7％(见表4)。以上数据表明设计的引物探针能够很好的检测登革1型病毒，适用于临床的快速检测。

表4临床标本不同检测方法的比较

a阳性标本数/检测样本数

上述实验结果表明，本发明试剂盒，在保证检测特异性的情况下，大大提高了敏感性，可见，本发明试剂盒应用于登革1型病毒感染的诊断具有快速且更准确的优点。

Claims (1)

1.一种检测登革1型病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒由定量阳性模板、一对特异性扩增登革1型病毒NS2A区域的引物、荧光探针、荧光定量聚合酶Premix Ex Taq^TM和参比染料ROX Reference Dye II组成，其特征在于：

(1)所述的引物是特异性扩增登革1型病毒NS2A区域的引物，其中，

上游引物序列为：5’-GATGAGATCCAGATGGAGTAGAAAG-3’，

下游引物序列为：5’-TCAGTTGTCCCATTATAAGAAGGAG-3’；

(2)所述的荧光探针序列为：

5’FAM-ACAGCCAGTGTTCCAGTCATCAGCA-Eclipse3’，

其中FAM为标记在探针5’端的荧光基团，Eclipse为标记在探针3’端的荧光淬灭基团；

(3)所述的定量阳性模板为序列为SEQ NO.4的DNA片段的pMD19-T重组质粒，GATGAGATCCAGATGGAGTAGAAAGATGCTGATGACTGGAACACTGGCTGTTTTCCTCCTTCTTATAATGGGACAACTGA。

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