CN106119423A - 检测禽呼肠孤病毒的通用pcr引物及其检测试剂盒 - Google Patents

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徐美玉
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Abstract

本发明公开了一种检测禽呼肠孤病毒的通用PCR引物及其检测试剂盒，该PCR引物包括上游引物5’‑ACTGTTGTAAGGCTAAGRTC‑3’和下游引物5’‑ACAGAATGGAGACRGAAT‑3’，该检测试剂盒包含了上述PCR引物。该检测试剂盒操作简便，通用性好，特异性强，灵敏度高，成本低，可以同时进行大批量样本分析。

Description

检测禽呼肠孤病毒的通用PCR引物及其检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对禽呼肠孤病毒进行快速检测的通用PCR引物、通用RT-PCR方法及其检测试剂盒。
背景技术
禽呼肠孤病毒(Avian reovirus，ARV)是双链RNA病毒，属呼肠孤病毒科(Reoviridae)，正呼肠孤病毒属(Orthoreivirus)。呼肠孤病毒可引起鸡的多种疾病，包括病毒性关节炎、矮小综合征、呼吸道疾病、肠道疾病和所谓吸收不良综合征，既可通过水平传播使鸡感染，亦可通过种蛋垂直传播，给养殖业造成巨大经济损失。ARV为无囊膜，呈20面体对称的双衣壳结构，基因组为线性双股RNA，由分节段的10个基因片段组成，根据核酸电泳迁移率可分成3组，即大基因节段(L)、中基因节段(M)的和小基因节段(S)。S基因组分S1、S2、S3和S4基因段，其中S1基因全长1643bp，其编码的σC蛋白是外壳蛋白中最小的一个结构蛋白，携带有特异性中和反应的表面抗原，能诱导产生型特异性中和抗体，增强蛋白合成，促进病毒增长，对ARV的感染及其致病性起关键作用。ARV各毒株之间虽然有共同的群特异性抗原，但各毒株的致病性却存在很大差异，既存在高致病性的毒株，同时也存在无致病性毒株。通常高致病性毒株多引起病毒性关节炎和生长受阻，而无致病性的毒株与这些症状无相关性。
ARV诊断有传统的病毒分离方法(鸡胚接种、细胞培养)和血清学方法(琼扩试验、免疫荧光抗体技术、ELISA等)。病毒分离鉴定准确可靠，可作为确诊依据，但耗时较长，操作复杂；血清学方法并不能作为确诊的依据，主要用于鸡群抗体和感染情况的监测。
生物技术的飞速发展极大地推动了生命科学各个领域的发展，疾病的诊断、病原的检测已从细胞水平进入分子水平。ARV分子结构与致病性关系研究的日益深入为ARV的特异性诊断技术研究奠定了基础。根据不同致病性毒株存在的分子结构差异，相继建立了特异、快速的分子诊断技术，包括核酸探针技术和基因片段的体外扩增技术等。这些技术不仅应用于ARV的检测、鉴定和特性研究及致病性的检测，还可以追踪病毒的来源及流行情况。
聚合酶链式反应(PCR)是一种体外扩增特异性基因片段的技术，在疾病的检测方面有着广阔的应用前景，现已被广泛应用。反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)能够选择性地将病毒基因组的一个特异性短片段放大10万倍以上，极大地增强了检测的敏感性。1997年，谢芝勋建立了检测ARV的RT-PCR方法，2001年建立了更敏感的半套式PCR，可检测到1fg的RNA；2002年，廖敏建立了一步法RT-PCR检测ARV，缩短了检测的时间，最低可检测出0.16ng的ARV RNA。大量研究结果证明，利用特异性引物对ARV进行RT-PCR扩增不失为一种快速、准确的检测方法。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测禽呼肠孤病毒的通用PCR引物，以及使用了该引物的PCR扩增反应体系、RT-PCR检测方法和检测试剂盒，该PCR扩增反应体系、RT-PCR检测方法和检测试剂盒操作简便，通用性好，特异性强，灵敏度高，成本低，可以同时进行大批量样本分析。
为实现上述目的，本发明提供了一对检测禽呼肠孤病毒的PCR引物，包括上游引物5’-ACTGTTGTAAGGCTAAGRTC-3’(如序列表SEQ ID No.1所示)和下游引物5’-ACAGAATGGAGACRGAAT-3’(如序列表SEQ ID No.2所示)。其中上游引物和下游引物中的R为简并引物，R＝A/G。
本发明还提供了一种包含上游引物5’-ACTGTTGTAAGGCTAAGRTC-3’和下游引物5’-ACAGAATGGAGACRGAAT-3’的检测试剂盒。
本发明还提供了一种检测禽呼肠孤病毒的PCR扩增的反应体系，包括以下组分：
其中：上游引物5’-ACTGTTGTAAGGCTAAGRTC-3’和下游引物5’-ACAGAATGGAGACRGAAT-3’。20μM的上下游引物是指引物自身的浓度，而非其在PCR扩增的反应体系中的终浓度。
在上述反应体系另外一种可能的实现方式中，所述反应体系进行PCR扩增的反应程序为：预变性94℃5min；30个循环，每个循环为94℃45s，51.3℃45s，72℃45s；最后经过72℃10min延伸。
在上述反应体系另外一种可能的实现方式中，所述样本取自待测菌悬液或家禽临床病料，如：鸡、鸭、鹅的临床病料。
在上述反应体系另外一种可能的实现方式中，当样本取自家禽临床病料时，样本总RNA提取前还包括样本预处理的步骤，所述样本预处理的方式为：取脏器组织样本、泄殖腔拭子样本或口咽拭子样本，将样本在灭菌生理盐水中研磨均匀并混悬，离心取上清。
在上述反应体系另外一种可能的实现方式中，总RNA进行反转录的方式为：加入总RNA 4μl和随机引物1μl轻轻混匀，70℃水浴5min，冰浴2min，然后依次加入下列成分：5×反应缓冲液4μl，dNTP混合物2μl，核酸酶抑制剂1μl，反转录酶0.5μl和DEPC处理水7.5μl，之后轻轻混匀，在37℃作用1h，得到样本cDNA。
本发明还提供了一种检测禽呼肠孤病毒的RT-PCR方法，包括如下步骤：
1)样本总RNA的提取；
2)对步骤1)的总RNA进行反转录，得到样本cDNA；
3)利用上游引物5’-ACTGTTGTAAGGCTAAGRTC-3’和下游引物5’-ACAGAATGGAGACRGAAT-3’，对步骤2)所得cDNA进行PCR扩增；
4)分析步骤3)所得PCR产物，如果扩增产物包含710bp的片段，则样本为禽呼肠孤病毒检测阳性，否则为检测阴性。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳结果确定样本中能否扩增出目的条带，目的条带即为710bp。
以NCBI数据库中ARV-SD09-1株(GenBank登录号为KP288853)S1片段全基因序列作为参考，设计和筛选新型引物，上游引物在S1基因的209nt-228nt之间，下游引物在901nt-918nt之间。以该新型引物扩增ARV S1基因中保守区序列长度约710bp的核苷酸序列，整体思路为：提取样本总RNA并进行反转录(RT)合成cDNA后，利用上述引物进行聚合酶链式反应(PCR)，采用下列反应程序：预变性94℃5min，30个循环(94℃45s，51.3℃45s，72℃45s)，最后经过72℃10min延伸，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，利用紫外凝胶成像仪检测目的条带，如果扩增出目的条带则证明为ARV检测阳性，否则为检测阴性。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)扩增的目的片段位于ARV的S1蛋白的高度保守区，且核苷酸序列为710bp，因而敏感性好、操作方便，对不同地区ARV分离株均有较好检出、通用性好且片段大小适中，非常适合用于检测组织；
2)该方法对其它常见禽病病原，如禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、禽腺病毒、禽传染性喉气管炎病毒和滑液囊支原体的检测结果皆为阴性，没有交叉反应，表明该方法亦具有良好的特异性；
3)本发明方法适用于养禽生产中进行ARV的检测，临床试验证明此方法具有高特异性、高灵敏度、高效率、低成本的特点，可在6h内对临床病料进行快速鉴别诊断，克服了传统检测方法需要接种10日龄鸡胚绒毛尿囊膜96h后观察胚变，以及进行琼脂扩散试验等，耗时较长缺点；对ARV的早期快速诊断为进一步开展全国范围内ARV的分子流行病学调查研究提供技术手段。
附图说明
图1是对禽呼肠孤病毒进行检测的电泳结果，点样顺序为M：DNA Maker II；P：阳性对照；N：阴性对照；1：禽呼肠孤病毒活疫苗株1133；2：样本1(山东分离株)；3：样本2(河北分离株)；4：样本3(广东分离株)；
图2是用本发明中的特异性引物对其它常见禽病病原进行PCR检测的电泳结果，点样顺序为M：DNA Maker II；P：阳性对照；N：阴性对照；1：H5亚型禽流感病毒；2：H7亚型禽流感病毒；3：H9亚型禽流感病毒；4：新城疫病毒(NDV)；5：传染性支气管炎病毒(IBV)6：传染性法氏囊病毒(IBDV)；7：禽腺病毒(FadV)；8：禽传染性喉气管炎病毒(ILTV)；9：滑液囊支原体(MS)。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下列实施例中常规的实验方法，参见Sambrook等编写的分子克隆。仪器的使用参照仪器操作说明。本申请中实施例中所使用的各个毒株和菌株均由中国农业大学畜禽疫病诊断中心保藏和提供。
实施例1 家禽临床病料样本的预处理
1、实验试剂和主要仪器
主要试剂：灭菌生理盐水；
主要仪器：LEGEND MICRO 17R低温台式离心机，为Thermo公司产品；VS-1涡旋振荡器购自鼎昊源科技有限公司；TL-2010S组织研磨震荡器购自鼎昊源科技有限公司。
2、实验步骤
(1)组织样本处理：取100mg脏器组织样本加入0.5ml灭菌生理盐水并用研磨器进行研磨混悬，组织悬液3000rpm离心30min后取上清用于检测。
(2)泄殖腔或口咽拭子样本处理：将拭子样本加入0.5ml灭菌生理盐水并用涡旋振荡器振荡混悬，样本悬液3000rpm离心30min后取上清用于检测。
实施例2 样本总RNA的提取
1、实验试剂和主要仪器
主要试剂：Trizol RNA提取试剂，为Invitrogen产品，购北京索莱宝科技有限公司；DEPC处理水，购自北京明豪至远有限公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇、75％乙醇，购自北京华美智博科技有限公司；Rnase-free的离心管与枪头北京购自华夏远洋科技有限公司。
主要仪器：LEGEND MICRO 17R低温台式离心机，为Thermo公司产品；1300SEVIESA2生物安全柜，为Thermo公司产品。
2、实验步骤
(1)取实施例1预处理所得家禽临床病料样本悬液250μl，加入750μl Trizol，加入200μl氯仿，手动颠倒混匀30s，室温静置5min；
(3)混合液以12000rpm，4℃离心15min，混合液分为三相，即上层水相，中间相和下层有机相；
(4)吸取上层水相加入另一离心管内，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温放置10min；
(5)混合液13500rpm，4℃离心10min，沉淀RNA；
(6)小心尽弃上清，用DEPC水配制的75％乙醇1ml轻轻漂洗沉淀，轻轻颠倒混匀1次；
(7)将混合液13500rpm，4℃离心5min,弃去上清，再用200μl枪头吸取剩余液体底层沉淀即为洗净的RNA；
(8)将RNA沉淀置超净台内风干，约10min；
(9)用DEPC水处理的灭菌水9μl溶解沉淀，再加入1μl RNasin；
(10)提取的RNA直接用于cDNA的合成或分装后-80℃保存备用。
实施例3 反转录生成cDNA
1、实验试剂和主要仪器
主要试剂：反转录酶(Reverse Transcriptase)200U/μl(Promega)、核酸酶抑制剂(Rnase Inhibitor)50U/μl(Takara)、5倍体积的反应缓冲液(5×Reaction Buffer)、dNTP混合物2.5mM和随机引物(Random Primer)500μg/ml(Promega)均购自北京爱普锐晟科技有限公司；DEPC处理水，购自北京明豪至远有限公司。
主要仪器：Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR扩增仪为Applied Biosystems公司产品，购自北京诚茂兴业科技发展有限公司；MINI-Smart小型台式离心机为HERO公司产品；HW·SYII-KP3型电热恒温水槽(北京长风仪器仪表公司)。
2、实验步骤
(1)在0.2ml离心管内加入下列成分：
RNA溶液 4μl
随机引物 1μl
轻轻混匀，70℃水浴5min，冰浴2min，然后依次加入下列成分：
轻轻混匀，37℃作用1h，得到样本cDNA。
实施例4 目的片段的PCR扩增
1、实验试剂和主要仪器
主要试剂：cDNA溶液；2×Easy Taq PCR Super Mix，购自全式金生物技术有限公司；特异性引物(上游引物5’-ACTGTTGTAAGGCTAAGRTC-3’和下游引物5’-ACAGAATGGAGACRGAAT-3’)；Marker II DNA Ladder购自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。
主要仪器：Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR扩增仪为Applied Biosystems公司产品，购自北京诚茂兴业科技发展有限公司；MINI-Smart小型台式离心机为HERO公司产品；DYY-8C电泳仪购自北京市六一仪器厂；α凝胶成像仪购自鼎昊源科技有限公司。
2、实验步骤
在0.2ml离心管中加入下列成分：
轻轻混匀后，进行如下反应：94℃预变性5min；94℃45s，51.3℃45s，72℃45s，进行30个循环；循环结束72℃延伸10min。
PCR反应结束后，用1×TAE电泳缓冲液制备1％琼脂糖凝胶并按照参考比例混入荧光染料Gelsafe。按照比例将7μl PCR产物加入凝胶孔中，选择合适的电压(4V/cm-10V/cm)进行电泳，电泳时间为20-30分钟，电泳结束后将凝胶块置于凝胶成像仪上观察并拍照，根据电泳结果确定样本中能否扩增出目的条带，如果扩增出目的条带则证明为禽呼肠孤病毒检测阳性，否则为检测阴性。
利用上述方法分别对分离自不同地点和时间的禽呼肠孤病毒进行检测，结果均有较好的检出，电泳结果如图1所示，表明本方法具有良好的敏感性和通用性。
实施例5 特异性检测
1、实验试剂和主要仪器
主要试剂：cDNA溶液；2×Easy Taq PCR Super Mix，购自全式金生物技术有限公司；dd H2O；特异性引物(上游引物5’-ACTGTTGTAAGGCTAAGRTC-3’和下游引物5’-ACAGAATGGAGACRGAAT-3’)；Marker II DNA Ladder购自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。
主要仪器：Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR扩增仪为Applied Biosystems公司产品，购自北京诚茂兴业科技发展有限公司；MINI-Smart小型台式离心机为HERO公司产品；DYY-8C电泳仪购自北京市六一仪器厂；α凝胶成像仪购自鼎昊源科技有限公司。
2、实验步骤
在0.2ml离心管中加入下列成分：
轻轻混匀后，进行如下反应：94℃预变性5min；94℃45s，51.3℃45s，72℃45s，进行30个循环；循环结束72℃延伸10min。
PCR反应结束后，用1×TAE电泳缓冲液制备1％琼脂糖凝胶并按照参考比例混入荧光染料Gelsafe。取7μl PCR产物加入凝胶孔中，选择合适的电压(4V/cm-10V/cm)进行电泳，电泳时间为20-30min，电泳结束后将凝胶块置于凝胶成像仪上观察并拍照，根据电泳结果确定样本中能否扩增出目的条带，如果扩增出目的条带则证明为禽呼肠孤病毒检测阳性，否则为检测阴性。
利用上述方法对其它常见的禽病病原，如禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、禽腺病毒、禽传染性喉气管炎病毒和滑液囊支原体进行检测，其结果如图2所示，结果皆为阴性，表明本方法具有良好的特异性。
实施例7 对临床样本的检测
表1 PCR检测方法对临床病料检测的应用
由表1可以看出，本申请建立禽呼肠孤病毒的PCR方法与病毒分离结果或测序结果均符合，准确性高，同时对来自不同采样时间和地点的病料样本均适用。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一对检测禽呼肠孤病毒的PCR引物，其特征在于，包括上游引物5’-ACTGTTGTAAGGCTAAGRTC-3’和下游引物5’-ACAGAATGGAGACRGAAT-3’。
2.一种包含权利要求1所述PCR引物的检测试剂盒。
3.一种PCR扩增的反应体系，其特征在于，包括以下组分：
4.一种检测禽呼肠孤病毒的RT-PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)样本总RNA的提取；
2)对步骤1)的总RNA进行反转录，得到样本cDNA；
3)利用权利要求1所述PCR引物，对步骤2)所得cDNA进行PCR扩增；
4)分析步骤3)所得PCR产物，如果扩增产物包含710bp的片段，则样本为禽呼肠孤病毒检测阳性，否则为检测阴性。
5.根据权利要求4所述RT-PCR方法，其特征在于，cDNA进行PCR扩增的反应体系为：
6.根据权利要求3所述的反应体系或权利要求5所述的RT-PCR方法，其特征在于，所述反应体系进行PCR扩增的反应程序为：预变性94℃5min；30个循环，每个循环为94℃45s，51.3℃45s，72℃45s；最后经过72℃10min延伸。
7.根据权利要求3所述的反应体系或权利要求5所述的RT-PCR方法，其特征在于，所述样本取自待测菌悬液或家禽临床病料。
8.根据权利要求3所述的反应体系或权利要求5所述的RT-PCR方法，其特征在于，所述样本为鸡、鸭或鹅的临床病料。
9.根据权利要求3所述的反应体系或权利要求5所述的RT-PCR方法，其特征在于，当样本取自家禽临床病料时，样本总RNA提取前还包括样本预处理的步骤，所述样本预处理的方式为：取脏器组织样本、泄殖腔拭子样本或口咽拭子样本，将样本在灭菌生理盐水中研磨均匀并混悬，离心取上清。
10.根据权利要求3所述的反应体系或权利要求5所述的RT-PCR方法，其特征在于，样本总RNA进行反转录的方式为：加入总RNA 4μl和随机引物1μl轻轻混匀，70℃水浴5min，冰浴2min，然后依次加入下列成分：5×反应缓冲液4μl，dNTP混合物2μl，核酸酶抑制剂1μl，反转录酶0.5μl和DEPC处理水7.5μl，之后轻轻混匀，在37℃作用1h，得到样本cDNA。
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