CN105132583B - 一种以流感病毒为载体的hcv核酸检测用质控品及其制备方法 - Google Patents

一种以流感病毒为载体的hcv核酸检测用质控品及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种以流感病毒为载体的HCV核酸检测用质控品及其制备方法，质控品由携带HCV保守基因的重组流感病毒经扩大培养灭活纯化而得。制备方法包括：(1)构建用于流感病毒拯救的在PR8病毒NS基因上插入HCV保守基因的质粒；(2)将上述构建好的质粒，与分别转录表达PR8病毒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M的质粒共转染293T细胞，拯救获得携带HCV 5’UTR的重组流感病毒；(3)将上述重组流感病毒进行扩大培养、灭活、纯化，即得。本发明可真实模拟HCV病原体，实现对HCV检测的全方位监测；易于大规模制备，降低成本，稳定性好，易于保存和运输，具有良好的应用前景。

Description

一种以流感病毒为载体的HCV核酸检测用质控品及其制备 方法
技术领域
本发明属于HCV核酸检测领域，特别涉及一种以流感病毒为载体的HCV核酸检测用质控品及其制备方法。
背景技术
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是一种经血液传播的RNA病毒，可以引发各种慢性肝病，其中包括肝硬化和肝细胞癌。据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3％，估计约1.7亿人患有慢性丙肝，每年新发丙型肝炎病例约3.5万例。我国是HCV慢性感染率高发国家之一，约有3800万HCV感染者。HCV慢性感染导致肝脏发生慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可能发展成肝硬化乃至肝癌，可严重影响生命健康。因此，对其进行快速、准确、有效的检测至关重要。
实时荧光定量RT-PCR因其灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确与高通量等优点，已逐步成为HCV检测的一线方法，广泛用于疾病的早期诊断、病情估计、指导用药和疗效监测中。
实时荧光定量RT-PCR包括样本核酸提取、RNA逆转录为cDNA、cDNA扩增和产物分析四个步骤，检测过程较为复杂，容易受到多种因素的影响。这些因素可能源自于样本自身，如标本中血红素、肝素、尿素等干扰物质会对PCR反应产生抑制作用。也可来源于人为因素，如实验人员操作失误造成样本核酸抽提质量不佳或者核酸丢失，可导致靶值偏低乃至假阴性结果。另外，保存、运输环境中RNA酶和温度等因素引起的病毒核酸降解也不容忽视。因此，核酸扩增实验中必须采用严格的质量控制措施，需要特定的阳性质控品防止假阴性结果，这对于保证核酸检测结果的准确、可靠具有重要的意义。
目前HCV核酸检测用质控品主要有以下几种：裸露的RNA、阳性病人血清或血浆、人工制备的假病毒颗粒。裸露的RNA由cDNA经体外转录得到，极易被环境中的核糖核酸酶(RNase)所降解而难于长期保存，且其不参与核酸抽提过程，因而不能反映病毒的提取效率。阳性病人血清或血浆相对稳定，可对标本核酸提取及反转录过程进行监测，但因其有潜在生物安全性、样本来源有限等问题限制了其在临床检测中的应用。为此，相关政府职能部门鼓励生产厂家研发人工合成质控品以替代上述质控品。
近些年来国内外学者进行了大量探索，当前最具代表性的就是Armored RNA技术制备的假病毒颗粒。它利用MS2噬菌体衣壳蛋白自我组装的特性，采用原核表达技术将特定病毒RNA包装到MS2噬菌体衣壳蛋白内得到带有检测靶标的噬菌体样颗粒。噬菌体颗粒RNA由衣壳蛋白保护，能够抵抗核酸酶及各种理化环境因素，具有稳定性好、无生物传染隐患、可全程监测核酸检测过程等特点，因而解决了传统HCV RNA质控品自身存在的一些问题。目前已有研究机构利用此技术平台人工合成能模拟临床标本的HCV质控品，在HCV临床分子诊断中展示了较好的应用前景。
然而，Armored RNA技术生产的噬菌体病毒颗粒在实际应用中仍存在一些不足。首先，在国外Armored RNA技术因专利保护问题导致商品化质控品价格昂贵(http://asuragen.com/)，非普通临床检验实验室所能承担，这大大限制该产品的临床应用。而在国内，因缺失相应的产品标准和质量管理规范，目前尚未有Armored RNA技术制备的商品化HCV质控品，仅有部分机构自行制备，质控品质量不能得到有效保证。其次，对于有包膜RNA病毒，如HCV，其包膜为脂质双分子层，与噬菌体颗粒表面坚固的衣壳蛋白结构不同，使用衣壳蛋白噬菌体不能准确反映样本处理检测过程中的变化，因而不能简单地使用衣壳病毒噬菌体作为此类病毒检测中的质控品。因此，理想质控品的制备应需符合相应质量管理标准，还应与检测对象具有相同的生物学特性，这对于确保HCV核酸检测的可信性具有重要意义。
病毒学研究近些年获得了巨大发展，如流感病毒反向遗传学技术。特别是Hoffmann等建立的8质粒反向遗传操作系统，利用同一质粒模板同时生成流感病毒的vRNA和mRNA，共转染293T细胞后可成功拯救得到流感病毒。相比之前拯救系统，8质粒系统大大减少了质粒的使用数量，从而显著提高了病毒拯救效率。该技术使得人们可以对病毒基因直接进行修饰，按预期计划获得目标重配病毒，目前已广泛用于病毒基因组结构与功能、病毒的转录表达和致病机制研究，侯选疫苗毒株的研制等方面。
当前，已有大量关于流感病毒作为外源基因载体用于基因治疗和传染病防控等方面的报道，如流感嵌合副流感、衣原体、结核杆菌、呼吸道合胞病毒、艾滋病毒和肿瘤等。但目前国内外尚无流感病毒作为载体用于质控品方面的报道。因此，利用流感反向遗传技术拯救含有HCV保守目的基因的突变流感病毒，然后参考流感疫苗生产过程制备HCV质控品将是核酸检测用质控品研究领域新的里程碑。从病毒检测诊断角度看，流感病毒自身即是脂质双分子层包裹内部核酸，它真实反映了HCV的结构特性，比外裹衣壳蛋白的噬菌体更能反映HCV及其在样本中的真实情况。同时，质控品的制备模拟流感疫苗的生产及其质量控制要求，这些均有相应的国家标准(参见中国药典中“流感全病毒灭活疫苗”相关内容)。因此，流感病毒为载体的HCV质控品可以最大程度模拟真实病毒核酸检测过程，包括同样的特异性和灵敏度，真正实现对HCV核酸检测的全方位监测，对于保证HCV RNA检测结果的准确可靠具有重要的实际应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种以流感病毒为载体的HCV核酸检测用质控品及其制备方法，该质控品可真实模拟HCV病原体，实现对HCV检测的全方位监测；易于大规模制备，降低成本，稳定性好，易于保存和运输，具有良好的应用前景。
本发明的一种以流感病毒为载体的HCV核酸检测用质控品，所述质控品由携带HCV保守基因的重组流感病毒经扩大培养灭活纯化而得。携带HCV基因的重组流感病毒能通过病毒拯救方法在细胞内进行拯救，并能在鸡胚中大量扩增。
所述流感病毒载体为(A/Puerto Rico/8/34)PR8病毒，也可以是其他亚型流感病毒骨架。
所述HCV保守基因插入的基因片段为PR8病毒基因组的NS基因(编码流感病毒NS1和NEP蛋白的RNA片段8，序列信息详见GeneBank，序列号：AF389122)。
所述HCV保守基因为HCV 5’UTR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(序列信息详见GeneBank，序列号：AF176573)。
所述携带HCV保守基因的重组流感病毒的NS基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。自5’到3’端序列依次为：PR8病毒NS基因的5’非编码区，NS1蛋白编码区(缺失NS1终止密码子)，GSG linker序列，HCV 5'UTR的反向互补序列，GSG linker序列，猪捷申病毒(porcineteschovirus–1，PTV-1)的2A肽序列，NEP蛋白编码区，PR8病毒NS基因的3’非编码区。
本发明的一种以流感病毒为载体的HCV核酸检测用质控品的制备方法，包括：
(1)构建用于流感病毒拯救的在PR8病毒NS基因上插入HCV保守基因的质粒；
(2)将上述构建好的质粒，与分别转录表达PR8病毒PB2(AF389115)、PB1(AF389116)、PA(AF389117)、HA(AF389118)、NP(AF389119)、NA(AF389120)、M(AF389121)的质粒共转染293T细胞，拯救获得携带HCV 5’UTR的重组流感病毒；
(3)将上述重组流感病毒进行扩大培养、灭活、纯化，制备成HCV核酸检测用质控品(参照中国药典中“流感全病毒灭活疫苗”相关内容)。
有益效果
(1)易于大规模制备，降低成本。因重组流感病毒在鸡胚中生长良好，参照流感全病毒灭活疫苗生产工艺，2～3天即可获得高浓度病毒粒子，从而实现批量生产供应，显著降低质控品成本。
(2)稳定性好，易于保存和运输。由于基因组RNA包裹在流感病毒包膜蛋白内，因而具有耐RNase的特点，可避免被外界环境中RNase降解。室温条件下可保存一个月，4℃可保存至少8个月，作为质控品具有良好的稳定性。
(3)无生物传染性，安全可靠。质控品成品经甲醛灭活，在鸡胚中经灭活验证无传染性，不会对环境造成污染，也不会对临床实验室人员造成危害。
(4)可真实模拟HCV病原体，实现对HCV检测的全方位监测。因流感病毒与HCV都为有包膜RNA病毒，结构特性相似，可真实的全程监测反应过程，保证检测结果的准确可靠。
附图说明
图1是构建以流感病毒为载体的HCV质控品/标准品的重组策略示意图；
图2是RT-PCR检测灭活嵌合流感病毒NS、HCV和NP基因；
图3是rPR8-NS-HCV质控品对RNase的稳定性结果；
图4是rPR8-NS-HCV质控品在不同温度下的稳定性结果；
图5是rPR8-NS-HCV质控品与试剂盒固有质控品的对比结果；
图6是rPR8-NS-HCV质控品的线性分析结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下述实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2005)等本领域常用工具书中所述方法进行，或按照试剂生产厂家建议条件进行。
实施例1
pHW-NS-HCV质粒的构建
一、引物设计
根据pMD18-HCV质粒中的HCV 5’UTR基因序列、pHW-NS质粒中的NS节段序列，分别设计用于扩增HCV 5’UTR的反向互补序列、NS1和NEP的引物。为保证NEP蛋白独立于NS1-HCV蛋白表达，在HCV-NEP基因间插入PTV-12A肽因序列(5’-gcgaccaactttagcctgctgaaacaggcgggcgatgtggaagaaaacccgggcccg-3’)。同时为确保NEP蛋白准确表达，对NS基因剪接受体位点(碱基524到527)进行定点突变(5’-TCCA-3’变为5’-CCCG-3’)。具体的引物序列及扩增产物见表1。
表1 PCR扩增引物
a下划线表示限制性内切酶BsmB的识别位点，粗体字表示碱基524到527进行无义突变。二、HCV 5’UTR反向互补序列、NS1和NEP片段扩增
以pMD18-HCV为模板，用引物HCV-OL-F(NS1)和HCV-OL-R(NEP)扩增HCV 5’UTR反向互补序列(含PTV-12A肽编码序列)。以pHW-NS为模板，分别用引物对NS-F/NS1-OL-R(HCV)和NEP-OL-F(HCV)/NS-R扩增NS1和NEP片段。
PCR反应体系为：10×PCR buffer 5μl，10mmol/L dNTPs 1μl，引物(50μmol/L)各0.25μl，质粒模板2μl，High Fidelity PCR Enzyme Mix酶(Thermo Scientific)0.5μl，加ddH2O至50μl，进行PCR扩增。反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。
反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，目的条带大小与预期结果一致。
三、重叠PCR扩增NS-HCV片段
利用DNA片段回收试剂盒(Takara公司)纯化、回收以上步骤中所得的3个PCR片段。先取HCV 5’UTR和NEP各3μl，混合后作为模板，加入10×PCR buffer 5μl，l0mmol/L dNTPs1μl，引物HCV-OL-F(NS1)和NS-R各0.25μl，High Fidelity PCR Enzyme Mix酶0.5μl，加ddH2O至50μl，进行PCR扩增。反应条件为同步骤二。
将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，纯化回收HCV-NEP目的片段，将HCV-NEP和步骤二中的NS1片段各3μl混合后作为模板，加入10×PCR buffer 5μl，10mmol/L dNTPs 1μl，引物NS-F和NS-R各0.25μl，High Fidelity PCR Enzyme Mix酶0.5μl，加ddH2O至50μl，进行PCR扩增。反应条件为同步骤二。
反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，目的条带大小与预期结果一致。
四、重叠PCR对NS-HCV基因中剪切受体位点进行突变
利用DNA片段回收试剂盒回收纯化步骤三中的片段，利用NS-F/NS1-M-R和NS1-M-F/NS-R分别扩增F和R两片段，反应体系与条件同步骤二。
将上述片段分别回收，取F和R两片段各3ul混合后作为模板进行重叠PCR扩增，反应体系与反应条件同步骤三。
反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，目的目的条带大小与预期结果一致。
五、PCR产物的克隆与鉴定
纯化、回收步骤四中的NS-HCV基因，回收产物取2μg，10×FastDigest buffer 2μl，限制性内切酶Bsm BI(Thermo Scientific)1μl，水8μl，37℃酶切1小时。同时取pHW2000质粒2μg，同等反应体系，37℃酶切1小时。
纯化、回收酶切产物，取PCR片段酶切产物12μl，加入pHW2000质粒酶切产物5μl，10×T4buffer 2μl，22℃连接3h，取连接产物20μl，加入到100μl DH5α感受态细胞中，冰浴30min后42℃热激90s。加入900μl无抗性培养基培养60min后涂于Amp抗性LB平皿，37℃培养过夜。
挑取菌落，加入10×PCR buffer 2μl，10mmol/L dNTP(2.5mM)1.6μl，引物NS-F各NS-R各0.1μl，rTaq(TaKaRa)0.1μl，加水至20μl，进行PCR鉴定。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，25个循环；72℃延伸10min。
反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，将电泳条带正确(大小约为1500bp)的菌落进行摇菌培养约8h，小抽质粒送样测序。测序结果证实插入序列正确无误，将重组质粒命名为pHW-NS-HCV(结构示意图见图1)。
实施例2
突变流感病毒rPR8-NS-HCV的拯救与鉴定
一、突变病毒的拯救
准备A/Puerto Rico/8/34流感病毒其他7个片段的双向表达质粒的pHW-PB2、pHW-PB1、pHW-PA、pHW-HA、pHW-NP、pHW-NA和pHW-M。取实施例1中构建的重组质粒pHW-NS-HCV和上述七个质粒各1μg均匀混合，稀释至100μl Opiti-MEMⅠ中。取20μl转染试剂lipofectamine 2000(Invitrogen)按说明书稀释到100μl Opiti-MEMⅠ中，室温放置5min。然后将稀释的混合质粒加至转染试剂中，室温结合20min。将6孔板中己培养约18～24h，90％密度、分布均匀、生长状况良好的293T细胞用Opiti-MEMⅠ洗1次，在200μL DNA与脂质体的混合物中再加入800μL OPTI-MEMⅠ混匀后加入各孔，均匀覆盖于细胞上，在37℃、5％CO2培养箱中培养4～6h，换入含5％血清的Opiti-MEMⅠ1m1，在37℃、5％CO2培养箱中培养48～72h后准备接种鸡胚尿囊液。
转染上清经尿囊腔接种于9～11日龄SPF鸡胚中，每胚0.2m1，每个样品接种3只鸡胚，置34℃培养48-72hr，收集尿囊液，用0.5％鸡红细胞进行HA血凝测定(具体方法参见郭元吉程小雯著《流行性感冒病毒及其实验技术》第100页)。收集HA阳性的尿囊液备用。
二、RT-PCR鉴定突变病毒
取200μl尿囊液，用Trizol(Ambion)分别提取突变病毒和野生型病毒的基因组RNA，用AMV Reverse Transcriptase试剂盒(Promega)进行反转录。
反转录体系及条件如下：取上述提取的病毒基因组RNA 5μl，加0.1μl Unit 12引物(50μmol/l)，70℃变性5min，立即置0℃。然后依次加入下列试剂：5×RT buffer 5μl，RNasin(40U/μl)1μl，l0mmol/L dNTPs 2μl，AMV反转录酶(10U/μl)1μl，加DEPC水至25μl。42℃温育60min；99℃，5min。RT-PCR产物可立即使用或置-20℃备用。
PCR反应体系：取上述RT-PCR产物5μl，加入10×PCR buffer 5μl，10mmol/L dNTPs1μl，NS-F(50μmol/L)0.25μl，NS-R(50μmol/L)0.25μl，High Fidelity PCR Enzyme Mix酶0.5μl，加ddH2O至50μl。扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；4℃运行10min。
反应结束后，取PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果表明成功拯救得到携带5’UTR基因的重组流感病毒rPR8-NS-HCV。
实施例3
rPR8-NS-HCV病毒的灭活与纯化
突变病毒接种9～11日龄SPF鸡胚，72h后收集鸡胚尿囊液。尿囊液以5000g低速离心去除细胞碎片后，以0.1％的甲醛溶液4℃灭活7天。随后取原倍、10-1及10-2倍稀释的病毒液分组接种鸡胚尿囊腔，每组接种10个9～11日龄鸡胚，每胚接种0.2ml，置33～35℃培养72h。24h内死亡的不计数，每组鸡胚须至少存活80％。自存活的鸡胚中每胚取0.5ml尿囊液，按组混合后，再盲传一代，每组各接种10个胚，每胚接种0.2ml，经33～35℃培育72h后，取尿囊液进行血凝试验，应不出现血凝反应。灭活的病毒经10-50％蔗糖密度梯度超速离心纯化，收集纯化后病毒，用PH7.2的PBS稀释并用300KD的超滤膜去除蔗糖，最后用0.22μm一次性滤器过滤除菌得到rPR8-NS-HCV质控品原液，置4℃冰箱备用。
实施例4
rPR8-NS-HCV质控品的定值与分装
将上述已纯化好的rPR8-NS-HCV原液用阴性血浆(抗HCV、抗HIV、HBsAg阴性)倍比稀释，稀释比例为1:10、1:100、1:1000。选用丙型肝炎病毒(HCV)核酸定量检测试剂盒检测(湖南圣湘)，以国家一级丙型肝炎病毒核糖核酸(HCV RNA)血清标准物质(GBW09151a)为溯源，通过标准PCR定量检测，确定待测标本的含量。
生物安全柜清洁消毒，紫外照射30分钟。用无RNase的螺口离心管在生物安全柜内分装新型HCV质控品，依据之前定值浓度用阴性血清将其稀释至106、105、104、103IU/ml，分装量为每支0.2ml。在生物安全柜内加盖螺口管盖，分装完毕后，每支样本粘贴唯一编码标签，-20℃冻存。
实施例5
rPR8-NS-HCV质控品的耐酶性实验
取上述分装好的rPR8-NS-HCV质控品，每个稀释度分别取两个，分两组进行实时荧光定量RT-PCR(上海科华)。其中一组在样品处理前加/不加终浓度为1μg/μL的RNase A(Qiagen)，37℃温育1h，再进行样品处理、反转录和实时荧光定量PCR扩增。另一组直接进行样品处理，抽取的RNA加/不加RNase，37℃温育1h，而后进行反转录和实时荧光定量PCR扩增。在ABI 7500全自动荧光定量PCR扩增分析仪上进行扩增检测，对两组中测定结果进行比较(图3)。结果显示rPR8-NS-HCV质控品具有耐受RNase的特性。
实施例6
rPR8-NS-HCV质控品的稳定性实验
分装好的质控品分别放于指定温度下(2-8℃、室温(20-25℃)、37℃)。从第0周开始，每周抽取2支样本，每支样本从核酸提取开始平行做双份，用HCV RNA荧光定量PCR试剂盒检测(湖南圣湘)，结果如图4所示。结果显示质控品在37℃可稳定7天，25℃可稳定45天，4度条件下至少可稳定8个月。
实施例7
rPR8-NS-HCV作为阳性质控品的临床验证实验
将rPR8-NS-HCV质控品用阴性血浆稀释到104IU/ml，每管1ml，置于4℃条件下备用。然后将rPR8-NS-HCV与试剂盒所带的低浓度阳性质控品一起应用COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan系统进行定量检测，结果如图5所示。结果显示rPR8-NS-HCV质控品CV为19.7％，而试剂盒阳性质控品的CV为17.9％，两者相近，因而rPR8-NS-HCV可作为阳性质控品用于临床检测。
实施例8
rPR8-NS-HCV质控品的线性分析结果
将rPR8-NS-HCV质控品用阴性血浆进行10倍倍比稀释，获得一系列稀释浓度：2×107,2×106,2×105,2×104,2×103IU/ml，然后用HCV核酸定量检测试剂盒检测(湖南圣湘)。每种浓度分别测定三个样品后取平均值，结果如图6所示。结果显示经线性回归分析得y＝1.04x-0.29，R2＝0.999，说明rPR8-NS-HCV在检测范围内有很好的线性，可用于临床检测。

Claims (2)

1.一种以流感病毒为载体的HCV核酸检测用质控品，其特征在于：所述质控品由携带HCV保守基因的重组流感病毒经扩大培养灭活纯化而得；具体为由HCV 5’UTR基因插入PR8病毒基因组的NS基因得到的rPR8-NS-HCV质控品，rPR8-NS-HCV质控品的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
2.一种以流感病毒为载体的HCV核酸检测用质控品的制备方法，包括：
(1)构建用于流感病毒拯救的在PR8病毒NS基因上插入HCV保守基因的质粒；其中，所述HCV保守基因为HCV 5’UTR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)将上述构建好的质粒，与分别转录表达PR8病毒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M的质粒共转染293T细胞，拯救获得携带HCV 5’UTR的重组流感病毒；
(3)将上述重组流感病毒进行扩大培养、灭活、纯化，制备成HCV核酸检测用质控品。
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