CN105886529A - 一种重组冷适应减毒流感疫苗株的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组冷适应减毒流感疫苗株的方法及应用。本发明的方法包括如下步骤：将流感病毒血凝素HA基因、流感病毒神经氨酸酶NA基因、流感病毒内部7个基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS1和NS2共同导入宿主细胞，培养，即得到重组病毒。通过试验证明：本发明利用7+2质粒拯救系统制备的流感减毒四价疫苗经鼻免疫后取得了很好的免疫效果，利用7+2质粒拯救系统来重组流感病毒具有时效性，能根据每年流感病毒的流行特点，针对性的制备有效的流感疫苗，且该制备方法快速，免疫原性、免疫保护效果显著，具有很好的安全性，解决了传统方法制备流感减毒疫苗的安全性和稳定性的问题，使流感疫苗保护谱更全面。

Description

一种重组冷适应减毒流感疫苗株的方法及应用
技术领域
本发明属于疫苗生产领域，具体涉及一种重组冷适应减毒流感疫苗株的方法及应用，特别是涉及一种多质粒系统拯救的重组流感病毒及其制备方法与应用。
背景技术
流感是一种由流感病毒引起的急性发热性呼吸道传染病，可引起严重的并发症。流感病毒的抗原不断发生变化，具有较强的传染性，经常造成大范围流行。在正常的流行季节，全球约10％的人口即6亿多人患流感，目前还未找到十分理想的防治药物，接种流感疫苗仍是当今预防流感的有效手段。给健康人群接种流感疫苗，70-80％的人会起到预防发病的效果(当传播的病毒毒株与疫苗采用毒株相同时)，更重要的是，给高危人群接种疫苗可以明显降低流感的发生，减少住院及死亡率，所以研制高效、安全的新一代流感疫苗对预防流感发生具有重要意义。目前投放市场的流感疫苗主要有流感灭活三价全病毒疫苗、流感三价裂解病毒疫苗、亚单位疫苗及流感三价减毒活疫苗。但流感灭活三价全病毒疫苗、流感三价裂解病毒疫苗、亚单位疫苗注射免疫不能诱发有效的细胞免疫，经鼻或口服免疫必须高浓度剂量免疫才能激发机体产生免疫应答，其效果远不及减毒疫苗的免疫保护效果。应用于临床的流感病毒冷适应性减毒活疫苗采用鼻通道免疫途径，其抗原的制备通过重配技术，将每年相应的甲乙型流感病毒流行株的HA、NA基因整合到减毒的冷适应性的宿主病毒中，这种制备方法费时、费力。另外，减毒活疫苗存在毒力恢复的问题。发展起来的多质粒拯救系统针对流感病毒这一特点，利用反义遗传学的方法，可针对当年流行的病毒株快速制备有效的流感病毒减毒疫苗，制备快速、省力、相对安全，为新一代流感减毒活疫苗的研制提供新的思路和方法。
流感病毒属于正粘病毒科，其基因组为单股负义RNA，分为八个片段，胞质连接蛋白与脂膜相连。A型流感病毒的基因组最少包括七个多肽，片段1-3编码了RNA依赖的RNA多聚酶。片段1编码多聚酶复合体蛋白PB2。片段2、3编码多聚酶剩余部分蛋白PB1和PA。另外，有些流感病毒的流行株还编码一种小的蛋白，PB1-F2由PB1读码框中的一段编码。片段4编码血凝素HA，它是一种与病毒附着感染有关的表面糖蛋白。片段5编码核蛋白NP，是病毒RNA的主要结构部分。片段6编码神经氨酸酶NA，是一种包膜蛋白。片段7编码两种胞质结合蛋白M1和M2，由两段不同拼接的mRNA翻译而来。片段8编码两种非结构蛋白NS1、NS2，也是由不同变异的mRNA拼接体翻译过来的。B型流感病毒的8个基因片段编码了11种蛋白，最大的基因片段编码了RNA多聚酶的成分，PB1、PB2、PA。片段4编码蛋白HA。片段5编码NP。片段6编码NA、NB蛋白，这两种蛋白是由biscistronicmRNA重叠的读码框编译。片段7也编码两种蛋白，分别是M1、BM2。B型流感病毒最小的片段编码两种蛋白，NS1是由全长的RNA翻译而来，NS2是由变异拼接后的mRNA翻译而来。正因为流感病毒的基因组是负义RNA，因而不具有感染性，各个RNA片段必须与聚合酶蛋白(PB2、PB1、PA，统称为P蛋白)及核蛋白(NP)结合在一起形成核糖核蛋白复合物即RNPs才有活性。流感病毒感染时，首先与宿主细胞表面的特异性HA受体结合，通过融膜进入细胞后释放出RNPs，RNPs进入细胞核才开始病毒基因组的复制和转录，每个RNA片段单独组成一个转录单位，转录出mRNA和互补RNA(cRNA)，mRNA翻译合成病毒蛋白，cRNA复制生成病毒负链子代RNA，进而在细胞浆中组装成完整的病毒粒子。
由于流感病毒的两个表面抗原：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)经常发生抗原漂移和转换，流感病毒变异现象时有发生，这也是现有疫苗无法应对所有流感爆发的主要原因。WHO在全世界建立了完整的监测网络，分离、鉴定世界各地的流感毒株，并每年2-3月份组织专家召开会议，推荐流感流行季节疫苗中应包括的毒株，以便生产厂家在疫苗制备过程中采用与流行株一致的毒株，使疫苗达到最佳保护效力。然而即使这样，生产流感病毒疫苗仍存在许多亟待解决的问题：
1、生产周期较长，生产的流感疫苗往往错过流感流行季节。等再一次流感流行时，或许生产的疫苗已经失效。目前，美国所有商品化的流感疫苗都是由鸡胚来培养的。虽然流感病毒在鸡胚中生长良好，但疫苗的产量仍有赖于鸡胚的可获得性及其质量。鸡胚的提供必须有组织性，疫苗的生产周期较长，因为鸡胚供应不及时而限制了该种疫苗的生产。
2、近几年来，用细胞培养的方法生产疫苗也得到了发展。选择好的宿主细胞可以永久传代，这就克服了由鸡胚培养所带来的不便。然而，并不是所有的流感病毒株在组织细胞中都能很好生长。例如，像一些适合制备疫苗的病毒株，如温度敏感株等，用现有的方法并不能在组织细胞中培养。
3、全病毒灭活疫苗、裂解流感疫苗和亚单位疫苗免疫保护效果远不及减毒疫苗，而利用传统方法制备的流感减毒疫苗又存在着毒力恢复等缺陷。
基于以上情况，为了克服现有流感病毒疫苗生产中的不足，基于反向遗传操作技术，利用多质粒拯救系统能够显著增加流感疫苗生产的灵活性，同时能将组织细胞培养的方法更好地应用于该种疫苗的生产，使得制备的疫苗具有很好的时效性。同时利用反义遗传学和基因定点突变的方法，既保存了流感病毒减毒疫苗的免疫原性，又提高了其安全性。
反向遗传操作技术(reverse genetics)是近几年快速发展的一项新的生物技术，应用于病毒研究又叫“病毒拯救(virus rescue)”，病毒拯救技术是在了解病毒复制特点等基础上利用分子生物学技术而建立和完善起来的，是指通过人工操作基因，用病毒核酸的适当形式，在一定条件下转染细胞产生有感染性的病毒子。由于RNA不稳定，病毒拯救技术尤其是完全以质粒为基础的操作技术实现了在cDNA水平上对RNA病毒的操作和方便地人工制造病毒，这是20世纪90年代RNA病毒研究中的重大突破，成为至今生命科学研究热点。现在，病毒拯救指的就是使用以质粒为基础的系统，即从克隆的cDNA产生病毒的过程，在对病毒的生活周期、基因结构与功能、致病基础、新型疫苗构建、表达外源蛋白等方面的研究中显示了良好的应用前景。
流感病毒的反向遗传操作技术的建立难度较大，因为要同时在细胞内形成8个功能性核糖核蛋白复合物(RNPs)，而且与大多数其它负义RNA病毒不同，流感病毒基因组在细胞核内复制，因此流感病毒拯救技术的发展落后于其它负义RNA病毒，但经过10年的发展，终于在1999年Neumann等和Fodor等分别报道了完全以多质粒为基础的技术，这是流感病毒拯救技术发展史上的转折点。其优点是不再像早期的方法那样，需要为RNA合成提供功能蛋白的辅助病毒一起感染细胞，从而避免了大量的筛选工作。我们创新性提出9质粒流感病毒拯救系统用于A型和B型流感病毒的拯救，能够有效提高病毒拯救效率。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种制备重组病毒的方法。
本发明提供的制备重组病毒的方法包括如下步骤：将流感病毒血凝素HA基因、流感病毒神经氨酸酶NA基因、流感病毒内部7个基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS1和NS2共同导入宿主细胞，培养，即得到重组病毒。
上述方法中，
所述流感病毒血凝素HA基因和所述流感病毒神经氨酸酶NA基因均来源于A型流感病毒疫苗株或B型流感病毒疫苗株；
所述流感病毒内部7个基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS1和NS2均来源于A型流感病毒冷适应株或B型流感病毒冷适应株。
上述方法中，
所述A型流感病毒疫苗株为A/California/7/2009或A/Teaxs/50/2012；所述B型流感病毒疫苗株为B/Massachusetts/2/2012-like或B/Brisbane/60/2008；
所述流感病毒血凝素HA基因为HA1基因、HA2基因、HA3基因或HA4基因；所述HA1基因来源于流感病毒A/California/7/2009，其核苷酸序列为序列表中序列4；所述HA2基因来源于流感病毒A/Teaxs/50/2012，其核苷酸序列为序列表中序列10；所述HA3基因来源于流感病毒B/Massachusetts/2/2012-like，其核苷酸序列为序列表中序列15；所述HA4基因来源于B/Brisbane/60/2008，其核苷酸序列为序列表中序列22；
所述流感病毒神经氨酸酶NA基因为NA1基因、NA2基因、NA3基因或NA4基因；所述NA1基因来源于流感病毒A/California/7/2009，其核苷酸序列为序列表中序列6；所述NA2基因来源于流感病毒A/Teaxs/50/2012，其核苷酸序列为序列表中序列9；所述NA3基因来源于流感病毒B/Massachusetts/2/2012-like，其核苷酸序列为序列表中序列17；所述NA4基因来源于B/Brisbane/60/2008，其核苷酸序列为序列表中序列23。
上述方法中，
所述A型流感病毒冷适应株为A/AnnArbor/6/60变异体；所述B型流感病毒冷适应株为B/AnnArbor/1/66；
所述PB2基因为APB2基因或BPB2基因；所述APB2基因来源于流感病毒A/AnnArbor/6/60变异体，其核苷酸序列为序列表中序列1；所述BPB2基因来源于流感病毒B/AnnArbor/1/66，其核苷酸序列为序列表中序列12；
所述PB1基因为APB1基因或BPB1基因；所述APB1基因来源于流感病毒A/AnnArbor/6/60变异体，其核苷酸序列为序列表中序列2；所述BPB1基因来源于流感病毒B/AnnArbor/1/66，其核苷酸序列为序列表中序列13；
所述PA基因为APA基因或BPA基因；所述APA基因来源于流感病毒A/AnnArbor/6/60变异体，其核苷酸序列为序列表中序列3；所述BPA基因来源于流感病毒B/AnnArbor/1/66，其核苷酸序列为序列表中序列14；
所述NP基因为ANP基因或BNP基因；所述ANP基因来源于流感病毒A/AnnArbor/6/60变异体，其核苷酸序列为序列表中序列5；所述BNP基因来源于流感病毒B/AnnArbor/1/66，其核苷酸序列为序列表中序列16；
所述M基因为AM基因或BM基因；所述AM基因来源于流感病毒A/AnnArbor/6/60变异体，其核苷酸序列为序列表中序列7；所述BM基因来源于流感病毒B/AnnArbor/1/66，其核苷酸序列为序列表中序列18；
所述NS1基因为ANS1基因或BNS1基因；所述ANS1基因来源于流感病毒A/AnnArbor/6/60变异体，其核苷酸序列为序列表中序列8；所述BNS1基因来源于流感病毒B/AnnArbor/1/66，其核苷酸序列为序列表中序列19；
所述NS2基因为ANS2基因或BNS2基因；所述ANS2基因来源于流感病毒A/AnnArbor/6/60变异体，其核苷酸序列为序列表中序列9；所述BNS2基因来源于流感病毒B/AnnArbor/1/66，其核苷酸序列为序列表中序列20。
上述方法中，所述方法为如下(1)-(4)中任一种：
1)将HA1基因、NA1基因、APB2基因、APB1基因、APA基因、ANP基因、AM基因、ANS1基因和ANS2基因共同导入宿主细胞，培养，得到重组A型H1N1亚型流感病毒；
2)将HA2基因、NA2基因、APB2基因、APB1基因、APA基因、ANP基因、AM基因、ANS1基因和ANS2基因共同导入宿主细胞，培养，得到重组A型H3N2亚型流感病毒；
3)将HA3基因、NA3基因、BPB2基因、BPB1基因、BPA基因、BNP基因、BM基因、BNS1基因和BNS2基因共同导入宿主细胞，培养，得到重组B型Yamagata lineage系流感病毒；
4)将HA4基因、NA4基因、BPB2基因、BPB1基因、BPA基因、BNP基因、BM基因、BNS1基因和BNS2基因共同导入宿主细胞，培养，得到重组B型Victoria lineage系流感病毒。
上述方法中，
所述HA1基因、所述NA1基因、所述APB2基因、所述APB1基因、所述APA基因、所述ANP基因、所述AM基因、所述ANS1基因和所述ANS2基因是通过含有HA1基因的重组载体、含有NA1基因的重组载体、含有APB2基因的重组载体、含有APB1基因的重组载体、含有APA基因的重组载体、含有ANP基因的重组载体、含有AM基因的重组载体、含有ANS1基因的重组载体和含有ANS2基因的重组载体共同导入宿主细胞中；
所述HA2基因、所述NA2基因、所述APB2基因、所述APB1基因、所述APA基因、所述ANP基因、所述AM基因、所述ANS1基因和所述ANS2基因是通过含有HA2基因的重组载体、含有NA2基因的重组载体、含有APB2基因的重组载体、含有APB1基因的重组载体、含有APA基因的重组载体、含有ANP基因的重组载体、含有AM基因的重组载体、含有ANS1基因的重组载体和含有ANS2基因的重组载体共同导入宿主细胞中；
所述HA3基因、所述NA3基因、所述BPB2基因、所述BPB1基因、所述BPA基因、所述BNP基因、所述BM基因、所述BNS1基因和所述BNS2基因是通过含有HA3基因的重组载体、含有NA3基因的重组载体、含有BPB2基因的重组载体、含有BPB1基因的重组载体、含有BPA基因的重组载体、含有BNP基因的重组载体、含有BM基因的重组载体、含有BNS1基因的重组载体和含有BNS2基因的重组载体共同导入宿主细胞中；
所述HA4基因、所述NA4基因、所述BPB2基因、所述BPB1基因、所述BPA基因、所述BNP基因、所述BM基因、所述BNS1基因和所述BNS2基因是通过含有HA4基因的重组载体、含有NA4基因的重组载体、含有BPB2基因的重组载体、含有BPB1基因的重组载体、含有BPA基因的重组载体、含有BNP基因的重组载体、含有BM基因的重组载体、含有BNS1基因的重组载体和含有BNS2基因的重组载体共同导入宿主细胞中；
所述含有流感病毒血凝素HA1基因的重组载体为将HA1基因插入表达载体的多克隆位点中得到的载体；
所述含有流感病毒血凝素HA2基因的重组载体为将HA2基因插入表达载体的多克隆位点中得到的载体；
所述含有流感病毒血凝素HA3基因的重组载体为将HA3基因插入表达载体的多克隆位点中得到的载体；
所述含有流感病毒血凝素HA4基因的重组载体为将HA4基因插入表达载体的多克隆位点 中得到的载体；
所述含有流感病毒血凝素NA1基因的重组载体为将NA1基因插入表达载体的多克隆位点中得到的载体；
所述含有流感病毒血凝素NA2基因的重组载体为将NA2基因插入表达载体的多克隆位点中得到的载体；
所述含有流感病毒血凝素NA3基因的重组载体为将NA3基因插入表达载体的多克隆位点中得到的载体；
所述含有流感病毒血凝素NA4基因的重组载体为将NA3基因插入表达载体的多克隆位点中得到的载体；
所述含有流感病毒血凝素APB2基因的重组载体为将APB2基因插入表达载体的多克隆位点中得到的载体；
所述含有流感病毒血凝素BPB2基因的重组载体为将BPB2基因插入表达载体的多克隆位点中得到的载体；
所述含有流感病毒血凝素APB1基因的重组载体为将APB1基因插入表达载体的多克隆位点中得到的载体；
所述含有流感病毒血凝素BPB1基因的重组载体为将BPB1基因插入表达载体的多克隆位点中得到的载体；
所述含有流感病毒血凝素APA基因的重组载体为将APA基因插入表达载体的多克隆位点中得到的载体；
所述含有流感病毒血凝素BPA基因的重组载体为将BPA基因插入表达载体的多克隆位点中得到的载体；
所述含有流感病毒血凝素ANP基因的重组载体为将ANP基因插入表达载体的多克隆位点中得到的载体；
所述含有流感病毒血凝素BNP基因的重组载体为将BNP基因插入表达载体的多克隆位点中得到的载体；
所述含有流感病毒血凝素AM基因的重组载体为将AM基因插入表达载体的多克隆位点中得到的载体；
所述含有流感病毒血凝素BM基因的重组载体为将BM基因插入表达载体的多克隆位点中得到的载体；
所述含有流感病毒血凝素ANS1基因的重组载体为将ANS1基因插入表达载体的多克隆位点中得到的载体；
所述含有流感病毒血凝素BNS1基因的重组载体为将BNS1基因插入表达载体的多克隆位点中得到的载体；
所述含有流感病毒血凝素ANS2基因的重组载体为将ANS2基因插入表达载体的多克隆位点中得到的载体；
所述含有流感病毒血凝素BNS2基因的重组载体为将BNS2基因插入表达载体的多克隆位点中得到的载体；
所述表达载体为pIW3000。
上述方法中，
所述宿主细胞为293T/MDCK细胞或COS-1/MDCK细胞；
所述293T/MDCK细胞是将293T细胞和MDCK细胞按照2：1的体积比混匀得到的细胞；
所述COS-1/MDCK细胞是将COS-1细胞和MDCK细胞按照2：1的体积比混匀得到的细胞。
本发明的另一个目的是提供由上述方法制备的重组病毒。
本发明还有一个目的是提供上述重组病毒的新用途。
本发明提供了上述重组病毒在制备预防和/或治疗流感病毒的产品中的应用。
上述应用中，所述产品为药物或试剂盒；所述药物具体为疫苗。
本发明的最后一个目的是提供一种流感病毒疫苗。
本发明提供的流感病毒疫苗的活性成分为上述重组A型H1N1亚型流感病毒、上述重组A型H3N2亚型流感病毒、上述重组B型Yamagata lineage系流感病毒和上述重组B型Victorialineage系流感病毒中至少一种。
上述流感病毒疫苗中，所述至少一种为任一个或全部。
上述流感病毒疫苗中，所述流感病毒疫苗由上述重组A型H1N1亚型流感病毒、上述重组A型H3N2亚型流感病毒、上述重组B型Yamagata lineage系流感病毒和上述重组B型Victorialineage系流感病毒组成；所述重组A型H1N1亚型流感病毒、所述重组A型H3N2亚型流感病毒、所述重组B型Yamagata lineage系流感病毒和所述重组B型Victoria lineage系流感病毒中以TCID50滴度按1:1:1:1等量混合。
本发明的优势：
1、本发明利用7+2质粒拯救系统(流感病毒血凝素HA基因、流感病毒神经氨酸酶NA基因、流感病毒内部7个基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS1和NS2)来重组流感病毒，该重组流感病毒可用细胞培养的方法来大量扩增，且不需任何处理可直接用于疫苗的制造。
2、本发明的9质粒系统中7个质粒携带的病毒基因片段来源于流感冷适应减毒株，但另2个质粒所携带的表面抗原HA和NA基因片段则来源于当年流行的流感病毒株(如当年WHO确定流行的流感病毒株)。HA和NA基因片段可来源于H1、H3、B型Yamagata lineage系流感病毒或者B型Victoria lineage系流感病毒，四者循序用于流感减毒四价疫苗的生产。同时HA和NA基因片段也可来源于当时发病的其它亚型毒株，例如H2(H2N2)、H5(H5N1)、H7(H7N7)、H9(H9N3)等。利用7+2质粒拯救系统可以迅速针对季节性流感病毒的流行情况，重组出可用于疫苗制备的病毒参考株。
3、本发明用于拯救流感病毒所采用的反向遗传操作技术先进而成熟，具有方便简捷、定位可控等优点。目前，人用流感灭活疫苗毒株要通过传统的重排技术，由于抗原的变异，每年都要对人用疫苗进行评价，然后用经评价确定使用的流行毒株与高度鸡胚适应株A/PR/8/34(PR8)同时感染鸡胚，经过传代反复筛选，最终得到含有流行毒株HA和NA基因的重组病毒作为新疫苗株。这个过程费时又费力，但反向遗传操作技术可以大大加速进程，只需将用流行株的HA和NA基因与冷适应株病毒的内部基因构建的质粒组合共转染细胞即可。
4、本发明用细胞培养系统替代鸡胚生产疫苗病毒抗原，可以解决由鸡胚培养带来的异源蛋白和标准化等问题。
5、由于流感灭活疫苗注射免疫不能激活有效的粘膜免疫和细胞免疫，以减毒弱毒活疫苗是一个重要的研究方向，但流感病毒抗原易变的特点，难以预测其毒力变化的特性制约着这个方向的研究，且安全性上难以保证。冷适应致弱活疫苗在临床有过尝试，它对小孩的保护力超过常规的灭活苗，其特性又不在体内大量扩增，对成人的保护效果也明显优于灭活疫苗。又由于自然减毒的流感病毒它只包含有限的少量氨基酸的替代变化，大量使用时可能会有毒 力返强的潜在危险。本发明的重组病毒减毒疫苗保持了冷适应株病毒的特点，同时又具备多种流感病毒HA/NA表面抗原的活性、及快速制备的优势。本发明制备的流感减毒疫苗更具备广泛的适用性，并可激活有效的粘膜免疫和系统免疫，有效性、安全性更加确切。
通过试验证明：本发明利用7+2质粒拯救系统制备的流感减毒四价疫苗经鼻免疫后取得了很好的免疫效果，同时利用7+2质粒拯救系统来重组流感病毒具有时效性，能根据每年流感病毒的流行特点，针对性的制备有效的流感疫苗，且该制备方法快速，免疫原性、免疫保护效果显著，具有很好的安全性，人为的解决传统方法制备流感减毒疫苗的安全性、稳定性的问题，并且使流感疫苗保护谱更全面。
附图说明
图1为反向遗传操作系统建立的技术路线。
图2为重组A型H1N1、重组A型H3N2亚型流感病毒、重组B型Yamagata lineage系流感病毒和重组B型Victoria lineage系流感病毒电镜照片。其中，图2A为重组A型H1N1亚型流感病毒电镜照片；图2B为重组A型H3N2亚型流感病毒电镜照片；图2C为重组B型Yamagatalineage系流感病毒电镜照片；图2D为重组B型Victoria lineage系流感病毒电镜照片电镜照片。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的流感病毒冷适应株A/AnnArbor/6/60变异体和B/AnnArbor/1/66变异体均购自中国华兰生物工程股份有限公司。
下述实施例中的流感病毒疫苗株A/California/7/2009(H1N1)、A/Teaxs/50/2012(H3N2)、B/Massachusetts/2/2012-like和B/Brisbane/60/2008均购自NIBSC，A/California/7/2009(H1N1)、A/Teaxs/50/2012(H3N2)、B/Massachusetts/2/2012-like和B/Brisbane/60/2008的编号分别为13/198、13/264、14/106、14/154。
实施例1、重组A型H1N1、H3N2流感减毒病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒的制备
一、流感病毒的9质粒拯救系统的构建
1、pIW3000载体的构建
运用分子生物学的基本方法，在载体PHW2000的基础上构建pIW3000。即将pHW2000中的多聚A信号序列BGH(bovine growth hormone)改建成SV40(simian virus 40)。具体步骤如下：
以载体pcDNA3.1(Invitrogen公司)为模板，采用引物1和引物2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。引物序列如下：引物1：5’-AACAATTGAGATCTCGGTCACCTCAGACATGATAAGATACATTGATGAGT-3’；引物2：5’-TATAACTGCAGACTAGTGATATCCTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTA-3’。
PCR扩增的程序为：先94℃ l0min；然后94℃ 45s，55℃ 30s，72℃ 45s，共25个循环；最后72℃ 5min。
用限制性内切酶EcoRV和BstEII对上述PCR扩增产物进行双酶切，得到大小为138bp的DNA片段；用限制性内切酶PvuII和BstEII双酶切pHW2000载体(pHW2000载体的构建参照文献“Hoffmann E,Neumann G,Kawaoka Y,Hobom G,Webster RG.A DNAtransfectionsystem for generation of influenza A virus from eightplasmids.Proc Natl Acad SciU SA.2000May 23；97(11):6108-13”中的方法)，得到载体大片段，连接大小为138bp的DNA片段和载体大片段，得到pIW3000载体，并送公司测序。
测序结果表明：pIW3000载体为将PHW2000中的PvuII和BstEII酶切位点间的DNA片段替换为SV40(simian virus 40)多聚A信号序列，且保持PHW2000载体的其他序列不变得到的载体。pIW3000载体在核苷酸序列为序列表中序列21所示。
2、流感病毒的制备
分别将流感病毒冷适应株A/AnnArbor/6/60变异体、冷适应株B/AnnArbor/1/66、疫苗株A/California/7/2009(H1N1)、疫苗株A/Teaxs/50/2012(H3N2)、疫苗株B/Massachusetts/2/2012-like或疫苗株B/Brisbane/60/2008接种于SPF鸡胚，按常规方法培养流感病毒，收集尿囊液300mL，6000rpm(30#转子)离心15min，取上清，18000rpm，4℃离心1.5h，用40ml STE(10mM pH8.0Tris-HCl，100mM NaCl，5mM pH 8.0EDTA)悬浮沉淀。用10％蔗糖垫底，小心加入悬浮液，18000rpm 4℃离心1.5h去杂蛋白，去上清，沉淀用30mlSTE悬浮，18000rpm，4℃离心lh，去蔗糖，沉淀用7ml STE悬浮，得到纯化尿囊液，分装，每管450μL。
3、流感病毒基因组RNA的提取
取450μL的纯化尿囊液，加入10％SDS 50μL，颠倒混匀，静置5min，中间轻轻振动数次。加入饱和酚500μL，混匀，5000×g离心15min，取上清，再加入饱和酚500μL，混匀，5000×g离心15min，取上清(约350μL)，加入DEPC处理的2M NaAc、4M LiCl各25μL和无水乙醇1000μL，颠倒混匀，-20℃过夜，12000×g离心15min，弃去上清，置超净台挥发干，用60μL DEPC水悬浮沉淀，可立即使用或置于-20℃备用，得到流感病毒RNA。
4、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增各基因片段及表达载体的构建
以步骤3获得的流感病毒RNA为模板，采用一步法RT-PCR试剂盒(Qiagen，Valencia，CaliF)反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增各基因片段。RT条件是50℃50min，PCR条件是先94℃ 15min；然后94℃ lmin，54℃ lmin，72℃ 3min，25循环。回收PCR产物进行酶切、测序，连于构建好的PIW3000载体上。流感病毒冷适应株A/AnnArbor/6/60异构体和B/AnnArbor/1/66分别作为主要的供体病毒来提供7个基因片段(PB2基因片段、PB1基因片段、PA基因片段、NP基因片段、M基因片段、NS1基因片段、NS2基因片段)。WHO确定的当年季节性流行疫苗株A/California/7/2009(H1N1)、A/Teaxs/50/2012(H3N2)、B/Massachusetts/2/2012-like、B/Brisbane/60/2008作为流行毒株来提供2个基因序列(NA、HA)。具体步骤如下：
(1)以冷适应株A/AnnArbor/6/60异构体的基因组RNA为模板，采用表1中的引物分别进行RT-PCR扩增，分别得到A型流感病毒的APB2基因片段、APB1基因片段、APA基因片段、ANP基因片段、AM基因片段、ANS1基因片段、ANS2基因片段。
将序列表中序列1所示的APB2基因片段反向插入pIW3000载体的Aarl和Aarl识别位点间，且保持pIW3000载体的其他序列不变，得到含有具有序列表中序列1的核苷酸序列的PB2基因的重组载体，将其命名为pIWAPB2；
将序列表中序列2所示的APB1基因片段反向插入PIW3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，且保持pIW3000载体的其他序列不变，得到含有具有序列表中序列2的核苷酸序列的PB1基因的重组载体，将其命名为pIWAPBl；
将序列表中序列3所示的APA基因片段反向插入pIW3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，且保持pIW3000载体的其他序列不变，得到含有具有序列表中序列3的核苷酸序列的PA基因的重组载体，将其命名为pIWAPA；
将序列表中序列5所示的ANP基因片段反向插入pIW3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，且保持pIW3000载体的其他序列不变，得到含有具有序列表中序列5的核苷酸序列的NP基因的重组载体，将其命名为pIWANP；
将序列表中序列7所示的AM基因片段反向插入pIW3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，且保持pIW3000载体的其他序列不变，得到含有具有序列表中序列7的核苷酸序列的M基因的重组载体，将其命名为pIWAM；
将序列表中序列8所示的ANS1基因片段反向插入pIW3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，且保持pIW3000载体的其他序列不变，得到含有具有序列表中序列8的核苷酸序列的NS1基因的重组载体，将其命名为PIWANS1；
将序列表中序列9所示的ANS2基因片段反向插入pIW3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，且保持pIW3000载体的其他序列不变，得到含有具有序列表中序列9的核苷酸序列的NS2基因的重组载体，将其命名为PIWANS2；
(2)以冷适应株B/AnnArbor/1/66的基因组RNA为模板，采用表2中的引物分别进行RT-PCR扩增，分别得到B型流感病毒的BPB2基因片段、BPB1基因片段、BPA基因片段、BNP基因片段、BM基因片段、BNS1基因片段、BNS2基因片段。
将序列表中序列12所示的BPB2基因片段反向插入pIW3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，且保持pIW3000载体的其他序列不变，得到含有具有序列表中序列12的核苷酸序列的PB2基因的重组载体，将其命名为pIWBPB2；
将序列表中序列13所示的BPB1基因片段反向插入PIW3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，且保持pIW3000载体的其他序列不变，得到含有具有序列表中序列13的核苷酸序列的PB1基因的重组载体，将其命名为pIWBPBl；
将序列表中序列14所示的BPA基因片段反向插入pIW3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，且保持pIW3000载体的其他序列不变，得到含有具有序列表中序列14的核苷酸序列的PA基因的重组载体，将其命名为pIWBPA；
将序列表中序列16所示的BNP基因片段反向插入pIW3000的Bsal和Bsal识别位点间，且保持pIW3000载体的其他序列不变，得到含有具有序列表中序列16的核苷酸序列的NP基因的重组载体，将其命名为pIWBNP；
将序列表中序列18所示的BM基因片段反向插入pIW3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，且保持pIW3000载体的其他序列不变，得到含有具有序列表中序列18的核苷酸序列的M基因的重组载体，将其命名为pIWBM；
将序列表中序列19所示的BNS1基因片段反向插入pIW3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，且保持pIW3000载体的其他序列不变，得到含有具有序列表中序列19的核苷酸序列的NS1基因的重组载体，将其命名为pIWBNS1；
将序列表中序列20所示的BNS2基因片段反向插入pIW3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，且保持pIW3000载体的其他序列不变，得到含有具有序列表中序列20的核苷酸序列的NS2基因的重组载体，将其命名为pIWBNS2；
(3)以疫苗株A/California/7/2009(H1N1)的基因组RNA为模板，采用表3中的扩增HA的引物AHA-1和AHA-2、扩增NA的引物ANA-1和ANA-2分别进行RT-PCR扩增，分别得到A型H1N1亚型流感病毒的HA1基因片段、NA1基因片段。
以疫苗株A/Teaxs/50/2012(H3N2)的基因组RNA为模板，采用表3中的扩增HA的引物AHA-1和AHA-2、扩增NA的引物ANA-1和ANA-2分别进行RT-PCR扩增，分别得到A型H3N2亚型流感病毒的HA2基因片段、NA2基因片段。
将序列表中序列6所示的A/California/7/2009(H1N1)的NA1基因片段反向插入pIW3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，且保持pIW3000载体的其他序列不变，得到含有具有序列表中序列6的核苷酸序列的NA1基因的重组载体，将其命名为pIWA1NA；
将序列表中序列4所示的A/California/7/2009(H1N1)的HA1基因片段反向插入pIW3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，且保持pIW3000载体的其他序列不变，得到含有具有序列表中序列4的核苷酸序列的HA1基因的重组载体，将其命名为pIWA1HA；
将序列表中序列9所示的A/Teaxs/50/2012(H3N2)的NA2基因片段反向插入pIW3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，且保持pIW3000载体的其他序列不变，得到含有具有序列表中序列9的核苷酸序列的NA2基因的重组载体，将其命名为pIWA2NA；
将序列表中序列10所示的A/Teaxs/50/2012(H3N2)HA2基因片段反向插入pIW3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，且保持pIW3000载体的其他序列不变，得到含有具有序列表中序列10的核苷酸序列的HA2基因的重组载体，将其命名为pIWA2HA。
(4)以疫苗株B/Massachusetts/2/2012-like中的基因RNA为模板，采用表3中的扩增HA的引物BHA-1和BHA-2、扩增NA的引物BNA-1和BNA-2分别进行RT-PCR扩增，分别得到B型流感病毒的HA3基因片段和NA3基因片段。
以疫苗株B/Brisbane/60/2008中的基因RNA为模板，采用表3中的扩增HA的引物BHA-1和BHA-2、扩增NA的引物BNA-1和BNA-2分别进行RT-PCR扩增，分别得到B型流感病毒的HA4基因片段和NA4基因片段。
将序列表中序列17所示的B/Massachusetts/2/2012-like的NA3基因片段反向插入PIW3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，且保持pIW3000载体的其他序列不变，得到含有具有序列表中序列17的核苷酸序列的NA3基因的重组载体，将其命名为pIWB3NA；
将序列表中序列15所示的B/Massachusetts/2/2012-like的HA3基因片段反向插入PIW3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，且保持pIW3000载体的其他序列不变，得到含有具有序列表中序列15的核苷酸序列的HA3基因的重组载体，将其命名为pIWB3HA。
将序列表中序列23所示的B/Brisbane/60/2008的NA4基因片段反向插入PIW3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，且保持pIW3000载体的其他序列不变，得到含有具有序列表中序列23的核苷酸序列的NA4基因的重组载体，将其命名为pIWB4NA；
将序列表中序列22所示的B/Brisbane/60/2008的HA4基因片段反向插入PIW3000的BsmBI和BsmBI识别位点间，且保持pIW3000载体的其他序列不变，得到含有具有序列表中序列22的核苷酸序列的HA4基因的重组载体，将其命名为pIWB4HA。
表1、扩增A型H1N1亚型流感病毒A/AnnArbor/6/60异构体的7个基因片段的引物
注：1代表正向引物；2代表反向引物。
表2、扩增B/AnnArbor/1/66型流感病毒的7个基因片段的引物
注：1代表正向引物；2代表反向引物。
表3、扩增A和B型流感病毒HA和NA基因的引物序列
注：1代表正向引物；2代表反向引物。
二、重组流感病毒制备、复活及培养
1、质粒提取
用QIAGEN公司生产的小提质粒试剂盒，按说明操作提取质粒。最后用灭菌EB(2mMTris·HC1)无菌操作洗脱质粒。用NANO DROP 2000(美国Thermo)测定质粒的含量和纯度，含量在100ug/ml以上、OD260/OD280为1.70-2.00的质粒备转染用。
2、反向遗传操作技术制备重组流感病毒
(1)分组
如图1所示，把上述构建好的9个质粒及阴性对照的质粒按设计的基因重排组合，等量混匀，共转染的质粒分为如下八组：
第一组：A型H1N1亚型流感病毒共转染质粒组：pIWAPB2、pIWAPBl、pIWAPA、pIWANP、pIWAM、pIWANS1、pIWANS2、pIWA1NA和pIWA1HA；
第二组：A型H1N1亚型流感病毒共转染质粒阴性对照组：pIWAPB1、pIWAPA、pIWANP、pIWAM、pIWANS1、pIWANS2、pIWA1NA和pIWA1HA；
第三组：A型H3N2亚型流感病毒共转染质粒组：pIWAPB2、pIWAPBl、pIWAPA、pIWANP、pIWAM、pIWANS1、pIWANS2、pIWA2NA和pIWA2HA；
第四组：A型H3N2亚型流感病毒共转染质粒阴性对照组：pIWAPB 1、pIWAPA、pIWANP、pIWAM、pIWANS1、pIWANS2、pIWA2NA和pIWA2HA；
第五组：B型Yamagata lineage系流感病毒共转染质粒组：pIWBPB2、pIWBPB1、pIWBPA、pIWBNP、pIWBM、pIWBNS1、pIWBNS2、pIWB3HA和pIWB3NA；
第六组：B型Yamagata lineage系流感病毒共转染质粒的阴性对照组：pIWBPBl、pIWBPA、pIWBNP、pIWBM、pIWBNS1、pIWBNS2、pIWB3HA和pIWB3NA。
第七组：B型Victoria lineage系流感病毒共转染质粒组：pIWBPB2、pIWBPB1、pIWBPA、pIWBNP、pIWBM、pIWBNS1、pIWBNS2、pIWB4HA和pIWB4NA；
第八组：B型Victoria lineage系流感病毒共转染质粒的阴性对照组：pIWBPBl、pIWBPA、pIWBNP、pIWBM、pIWBNS1、pIWBNS2、pIWB4HA和pIWB4NA。
(2)细胞的培养
将293T细胞(ATCC编号为CRL-3216TM)与DMEM+10％FBS培养基(购自美国Sigma公司)混匀，得到293T细胞培养体系；将COS-1细胞(ATCC编号为CRL-1650TM)与DMEM+10％FBS培养基(购自美国Sigma公司)混匀，得到COS-1细胞培养体系；将MDCK细胞(ATCC编号为CRL-2935TM)与1XDMEM+10％FBS培养基(购自美国Sigma公司)混匀，得到MDCK细胞培养体系。
将293T细胞培养体系与MDCK细胞培养体系按照体积比2：1的比例混匀，得到293T/MDCK细胞；(293T细胞数为2×105；MDCK细胞数为1×105)。
将COS-1细胞培养体系与MDCK细胞培养体系按照体积比2：1的比例混匀，得到COS-1/MDCK细胞；(COS-1细胞数为2×105；MDCK细胞数为1×105)。
将上述293T/MDCK细胞或COS-1/MDCK细胞均置于37℃，5％CO2孵箱培养，24h后观察细胞状态，待细胞长到80％-90％时进行下一次传代培养。
(3)转染
将上述步骤(1)中的每组质粒分别转入如下细胞：293T/MDCK细胞或COS-1/MDCK细胞中，分别得到各组质粒的转染细胞。具体方法如下：
293T/MDCK细胞或COS-1/MDCK细胞分别铺入六孔细胞板，培养过夜，当细胞长成单层，加入新鲜DMEM培养基清洗3次，再次加入新鲜DMEM培养基2mL/孔，然后将上述步骤(1)中的每组质粒均稀释至250ng/μL，各质粒等量混合，按照Effectene转染试剂(购自美国QIAGEN公司，目录号：301425)说明书分别共转染到293T/MDCK细胞或COS-1/MDCK细胞中。
(4)重组病毒的获得
转染后24h，去掉上清，代之以终浓度为1μg/μL的TPCK-trypsin(美国Sigma公司，货号：T1426)的1×DMEM，在转染后3天后，对上述各组质粒共转染的细胞观察发现，第一组共转染质粒组、第三组共转染质粒组、第五组共转染质粒组、第七组共转染质粒组转染后的293T/MDCK细胞或COS-1/MDCK细胞均有细胞病变(CPE)，均为阳性，且第二组共转染质粒组、第四组共转染质粒组、第六组共转染质粒组、第八组共转染质粒组转染后的293T/MDCK细胞和COS-1/MDCK细胞均没有发生细胞病变。说明病毒拯救成功。
分别收集第一、三、五、七组转染组的细胞上清液，分别得到重组A型H1N1亚型流感减毒病毒(第一组质粒转染293T/MDCK细胞得到)、重组A型H1N1亚型流感减毒病毒(第一组质粒转染COS-1/MDCK细胞得到，简称AH1)、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒(第三组质粒转染293T/MDCK细胞得到)、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒(第三组质粒转染COS-1/MDCK细胞得到，简称AH3)、重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒(第五组质粒转染293T/MDCK细胞得到)、重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒(第五组质粒转染COS-1/MDCK细胞得到，简称By)、重组B型Victoria lineage系流感减毒病毒(第七组质粒转染293T/MDCK细胞得到)、重组B型Victoria lineage系流感减毒病毒(第七组质粒转染COS-1/MDCK细胞得到，简称Bv)。
其中，重组A型H1N1亚型流感减毒病毒(第一组质粒转染293T/MDCK细胞得到)和重组A型H1N1亚型流感减毒病毒(第一组质粒转染COS-1/MDCK细胞得到)的病毒形态均如图2中A所示；
重组A型H3N2亚型流感减毒病毒(第三组质粒转染293T/MDCK细胞得到)和重组A型H3N2亚型流感减毒病毒(第三组质粒转染COS-1/MDCK细胞得到)的病毒形态均如图2中B所示；
重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒(第五组质粒转染293T/MDCK细胞得到)和重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒(第五组质粒转染COS-1/MDCK细胞得到)的病毒形态均如图2中C所示。
重组B型Victoria lineage系流感减毒病毒(第七组质粒转染293T/MDCK细胞得到)和重组B型Victoria lineage系流感减毒病毒(第七组质粒转染COS-1/MDCK细胞得到)的病毒形态均如图2中D所示。
(5)重组病毒的初步验证
为了证明这个拯救系统的效应，对转染后7天的细胞上清液(验证为阳性)中的重组A型H1N1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒、重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒和重组B型Victoria lineage系流感减毒病毒进行验证。具体步骤如下：收集lmL上述(4)制备的细胞上清液，5000rpm离心5min，再取离心后的上清，倍比稀释每孔500mL加入MDCK细胞中；上清与细胞共培养lh后去掉上清，代之以终浓度为1μg/μL的TPCK-trypsin的1×DMEM，然后进行血凝(HA)试验和空斑试验。具体步骤参照文献“Wagner R,Wolff T,Herwig A,et al.Independence of Hemagglutimmin glycosylation andNeuraminidase as regulators of influence virus growth:a study by reversegenetic.Journal of virology,2000,74:6313-6323”中的方法。
结果表明：A型H1N1亚型流感病毒共转染质粒组，A型H3N2亚型流感病毒共转染质粒组、B型Yamagata lineage系流感病毒共转染质粒组和B型Victoria lineage系流感病毒共转染质粒组的HA试验和空斑试验结果均为阳性，而阴性对照组(A型H1N1亚型流感病毒共转染质粒阴性对照组，A型H3N2亚型流感病毒共转染质粒阴性对照组和B型Yamagatalineage系流感病毒共转染质粒阴性对照组和B型Victoria lineage系流感病毒共转染质粒阴性对照组)结果均为阴性。
(6)转染效率
上述第一组、第三组、第五组、第七组的9质粒重组流感病毒的方法，转染20个35mm2dish，17个能成功拯救出流感病毒，重组效率(转染效率)均约为85％，而专利授权公告号为CN1810961中用8质粒重组流感病毒的方法，转染20个35mm2dish，12个能成功拯救出流感病毒，重组效率(转染效率)约为60％。因此本发明重组流感病毒的方法的重组效率(转染效率)显著提高。
三、重组流感减毒病毒的验证
下述重组A型H1N1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒无特殊说明，均是转染COS-1/MDCK细胞得到的重组病毒。
1、鸡胚传代流感减毒病毒的感染性
将HA试验和空斑试验阳性的重组A型H1N1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒的转染上清，-20℃和20℃冻融2次，经尿囊腔接种于10日龄SPF鸡胚，每胚0.2mL，每个样品接种2个胚，置33℃培养至72h，收集尿囊液，参考0IE推荐的标准、用0.8％鸡红细胞进行HA试验，HA阳性者用H1、H3、B型Yamagata系流感病毒、B型Victoria系流感病毒阳性血淸(购于中国CDC国家流感中心)进行血凝抑制试验(HI)。并以上述第二、四、六、八组的转染上清为对照。
结果表明：重组A型H1N1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒转染上清的HI效价均在1:28以上，而对照组HI实验均阴性。检测的阳性尿囊液代次及其HA效价见表4，阳性组的转染上清接种鸡胚在第一代(F1)尿囊液检测为阳性，检测阳性时的鸡胚平均HA效价范围为1:27-1:211，经上述传代后重组A型H1N1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒的HA效价没有改变，说明重组H1N1流感减毒病毒、重组H3N2流感减毒病毒、重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒具有很高的滴度和很好的稳定性。
表4、HA/HI实验检测鸡胚传代、血凝滴度及病毒亚型
注：F1/F2鸡胚代次；AH1表示重组A型H1N1亚型流感减毒病毒，AH3表示重组A型H3N2亚型流感减毒病毒，By表示重组B型Yamagata系流感减毒病毒，Bv表示重组B型Victoria系流感减毒病毒，NC代表A/California/7/2009。
2、重组流感减毒病毒全基因序列分析
分别提取鸡胚传代的第2代阳性尿囊液的重组A型HIN1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒的RNA、用表1、表2和表3所示的通用引物进行RT-PCR扩增，分别得到PB2、PB1、PA、NP、M、NS1、NS2、HA、NA的9个基因片段，并对其进行测序，未经反转录的RNA作为对照，以排除尿囊液中转染质粒DNA的存在。
结果表明：A型H1N1亚型流感病毒共转染质粒组、A型H3N2亚型流感病毒共转染质粒组和B型Yamagata系流感病毒共转染质粒组、B型Victoria系流感病毒共转染质粒组转染293T/MDCK细胞或COS-1/MDCK细胞的转染上清得到的尿囊液经RT-PCR均能扩增出PB2、PB1、PA、NP、M、NS1、NS2、HA、NA的9基因片段，经测序及序列分析与预期结果相符；而未经反转录的RNA均不能扩增出9个基因片段，说明尿囊液中无质粒DNA的存在；A型流感病毒共转染质粒阴性对照组和B型流感病毒共转染质粒阴性对照组转染的293T/MDCK细胞或COS-1/MDCK细胞的转染上清得到的尿囊液经RT-PCR不能扩增出9基因片段，未经反转录的RNA也不能扩增出9基因片段；说明尿囊液中无拯救病毒的存在。
3、重组流感减毒病毒感染MDCK细胞的CPE病变观察
将鸡胚传代的第2代阳性尿囊液的重组A型HIN1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒在不加胰酶的情况下感染MDCK细胞，观察96h内的病变。
结果表明：重组A型HIN1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒感染72h后均使MDCK产生变圆、死亡、小块脱落并以丝相连等特征性病变。
4、重组流感减毒病毒在鸡胚上传代的稳定性
进一步用SPF鸡胚(或细胞)传代20代，A/California/7/2009毒株(2013-2014野毒株NIBSC code：12/174)做对照。HA试验检测每批次鸡胚(或细胞)的血凝效价，对每代次取平均值。
HA试验结果如表5所示：重组A型HIN1亚型流感减毒病毒的鸡胚平均HA效价范围为1:210-1:211，重组A型H3N2亚型流感减毒病毒的鸡胚平均HA效价范围为1:27-1:28，重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒的鸡胚平均HA效价范围为1:27-1:28，对照毒株A/California/7/2009的鸡胚平均HA效价范围为1:210-1:211。说明重组A型HIN1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒对鸡胚(或细胞)有很好的感染性。
表5、重组A型HIN1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒和A/California/7/2009用鸡胚
传平均HA效价
注：F1-代表第2代、F2-代表第6代、F3-代表第12代、F4-代表第20代，AH1-表示重组A型H1N1亚型流感减毒病毒，AH3-表示重组A型H3N2亚型流感减毒病毒，By表示重组B型Yamagata系流感减毒病毒，Bv表示重组B型Victoria系流感减毒病毒，NC代表A/California/7/2009。
同时对重组A型HIN1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒的EID50和序列进行分析。
结果表明：传20代后重组A型HIN1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒的EID50分别为10-11/0.2ml、10-8/0.2ml和10-9.25/0.2mL，且序列分析结果显示重组A型HIN1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒均无基因突变。
上述结果均表明重组A型HIN1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒均具有很好的稳定性。
5、鸡胚半数感染剂量(EID50)的测定
将共转染产生的重组A型HIN1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒和野生型病毒A/California/7/2009的第1代尿囊液作10倍递进稀释，经尿囊腔接种于10日龄非免疫鸡胚，每个稀释度接种4个胚，每胚0.2mL、33℃培养，取出24h后的死胚和培养至84h的胚，血凝效价在1:16以上的判定为鸡胚感染阳性，用Reed-Muench法计算EID50。
结果表明：共转染产生的重组A型HIN1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒的EID50分别为10-7/0.2mL、10-6.75/0.2mL和10-10.75/0.2mL。鸡胚感染和死亡情况见表6。说明9个质粒采用反向遗传学方法获得重组A型HIN1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒较野生病毒株相比，EID50较低，具有良好的安全性。
表6、EID50测定中鸡胚感染和死亡数(n/4)
注：AH1表示重组A型H1N1亚型流感减毒病毒，AH3表示重组A型H3N2亚型流感减毒病毒，By表示重组B型Yamagata系流感减毒病毒，Bv表示重组B型Victoria系流感减毒病毒，NC代表A/California/7/2009。
6、电镜观察重组流感减毒病毒形态
用重组A型HIN1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒分别感染MDCK细胞，72小时后分别用负染法(参考应国华主编的《电镜技术与细胞超微结构》)进行处理，透射电镜下观察。
结果表明：重组A型HIN1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒的形态与野生型病毒无任何差异，符合流感病毒典型特征，具有包膜，直径在80-120nm之间。
7、重组流感减毒病毒的安全性
按照2005年版《中国生物制品规程》要求，对不同代次重组A型HIN1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒进行安全性实验(无菌实验、毒力实验、外源致热原)。
结果表明：无菌实验、毒力实验、外源致热原的检测结果均为阴性，说明重组A型HIN1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒作为疫苗株具有很好的安全性。
8、重组流感减毒病毒的冷适应及温度敏感表型
在不同的温度培养条件下测定重组A型HIN1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒的TCID50滴度。在不同的温度条件下，在96孔板内用重组流感减毒病毒感染细胞的CPE来决定TCID50滴度，具体步骤如下：
用含有5％的FCS(HYCLONE)的MEM(SIGMA)(每95mLMEM培养基中加入5mLFCS)悬浮PCK(primary chicken kidney)细胞(ATCC编号：CRL-12203TM)，并将其种植于96孔板，48h后单克隆细胞数需达到90％以上，用含有1mM L-谷氨酰胺的非必需氨基酸的无血清的MEM来洗细胞lh。然后种植96孔板，稀释10倍的病毒样品(重组A型HIN1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒)来感染96孔板中的细胞，设6个孔。以未加病毒的细胞做阴性对照，也设6个孔；以冷适应病毒及温度敏感毒株A/AnnArbor/6/60、B/AnnArbor/1/66变异体为阳性对照。为了决定重组减毒病毒的温度敏感性，加入病毒的板子分别在33℃、37℃的温度条件的CO2孵箱内培养6天，测定其冷适应性需要在25℃培养10天。病毒滴度用Karber方法计算，用log10平均值(n＝4)TCID50Titer/ml土SD来表示。在33-37℃之间的TCID50值差异大于等于100倍代表温度敏感现象，在25-33℃之间的TCID50值差异小于等于100倍代表冷适应性。
结果如表7：重组A型HIN1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒既有温度敏感现象，也有冷适应性。25-33℃之间病毒滴度的差异在0.3-0.5log10，说明了其具有冷适应性。37℃病毒生长滴度小于33℃病毒滴度21og10，33-37℃之间病毒滴度的差异在原病毒和重组病毒之间的差异是3.4-3.81og10。说明重组A型HIN1亚型流感病毒，重组A型H3N2亚型流感病毒和重组B型Yamagata系流感减毒病毒、重组B型Victoria系流感减毒病毒在人体温下不会大量繁殖，可以直接用于流感减毒疫苗的生产。
表7、重组流感减毒病毒株稳定敏感及冷适应型结果
注：Ca-ts代表冷适应性和温度敏感性，NC代表A/California/7/2009。
实施例2、重组流感四价减毒活疫苗病毒的制备
本实施例中的重组A型H1N1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒、重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒和重组B型Victoria lineage系流感减毒病毒均是转染COS-1/MDCK细胞得到的重组病毒。
一、重组流感四价减毒活疫苗病毒的制备
1、病毒接种液的制备
用PBS溶液(0.01mol/L，pH7.2)分别将上述实施例1中的重组A型H1N1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒和重组B型Victoria lineage系流感减毒病毒进行1:104稀释，分别得到各病毒接种液。
2、接种
分别用步骤1得到的各病毒接种液接种9-11日龄鸡的鸡胚。每个鸡胚接种0.2mL的病毒接种液，接种好病毒的鸡胚在33℃下孵育48-96小时，在结束时，把鸡胚放在2-8℃冰箱12-60小时使鸡胚冻死。
3、流感病毒的收获
从冻死的鸡胚中收获尿囊液，通常一个鸡胚可以收获8-10mL。收获的鸡胚尿囊液4000-14000g离心。
4、浓缩纯化
将尿囊液离心后经300kD分子量超滤膜包浓缩，蔗糖梯度超速离心进行纯化，分别得到纯化后的重组A型H1N1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒和重组B型Victoria lineage系流感减毒病毒。
5、对纯化的重组A型H1N1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒和重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒和重组B型Victoria lineage系流感减毒病毒进行病毒滴度、HA含量、外源因子、纯度等理化性质检测。检测结果如表8所示，检测合格用于流感四价减毒活疫苗的制备。
表8、重组流感减毒病毒的理化性质检测结果
二、细胞培养生产流感四价减毒活疫苗病毒
1、微载体大规模培养MDCK细胞生产重组流感减毒病毒株
使用的主要设备是7.5L生物反应器(美国NBS公司)，工作体积为4L。在生物反应器罐体中加入40g cytodex 3型微载体(GE Healthcare)，同时加入2L磷酸盐缓冲液PBS，8磅高压40min，排空PBS，加入10％胎牛血清DMEM细胞培养液，调整生物反应器转速、温度和通气，预培养过夜。消化4个10层细胞工厂的细胞接种入罐内，将培养温度设为37℃，搅拌转速设为65rpm，溶氧设为40％，pH设为7.4，进行培养，间隔8h测定培养液中葡萄糖含量，当葡萄糖含量<1g/L时排出罐内培养液，换新鲜培养液继续培养。待细胞长满微载体，全部排空罐内培养液，用Hank'液将罐体和微载体洗3次，加入含1ug/ml TPCK-Trypsin的细胞维持液4L，同时接种流感病毒(感染指数MOI＝0.001-0.005)。间隔8h测定维持液葡萄糖浓度，低于1g/L时补加葡萄糖至4g/L，72h后收集病毒培养液，培养液中含有高浓度流感病毒。收获的病毒培养液经300kD分子量超滤膜包浓缩、蔗糖密度梯度离心纯化、超离脱糖、甲醛灭活、Triton X-100裂解，免疫单扩测定血凝素含量。
结果表明：重组流感减毒病毒株适应在用微载体大规模培养的MDCK细胞内大量增殖，提高了病毒产量，可为工业化生产流感疫苗奠定基础。
实施例3、重组流感四价减毒活疫苗的制备与效果评价
1、重组流感四价减毒活疫苗
将实施例2的步骤一获得的纯化后的重组A型HIN1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒、重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒和重组B型Victorialineage系流感减毒病毒以TCID50滴度按1:1:1:1等量混合，得到重组流感四价减毒活疫苗；向重组流感四价减毒活疫苗中加入保护剂(质量分数为0.1-0.5％海藻糖或壳聚糖，质量分数为0.1-0.3％明胶，质量分数为0.2-0.8％蔗糖，质量分数为0.1-0.3％乳胶蛋白和质量分数为0.1-0.8％白蛋白)，制备得到重组流感四价减毒活疫苗的滴鼻剂，或不加佐剂制备成注射剂型，或加入10-20％CTB制备成透皮剂型。
重组A型HIN1亚型流感减毒病毒、重组A型H3N2亚型流感减毒病毒、重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒和重组B型Victoria lineage系流感减毒病毒分别制成重组A 型H1N1亚型流感减毒活疫苗(重组H1N1流感病毒减毒活疫苗)、重组A型H3N2亚型流感减毒活疫苗(重组H3N2流感病毒减毒活疫苗)或重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒活疫苗和重组B型Victoria lineage系流感减毒病毒活疫苗的滴鼻剂、注射剂或透皮剂。
2、疫苗的免疫原性评价
将上述步骤1制备的重组流感四价减毒活疫苗、重组A型H1N1亚型流感减毒活疫苗、重组A型H3N2亚型流感减毒活疫苗、重组B型Yamagata lineage系流感减毒病毒活疫苗和重组B型Victoria lineage系流感减毒病毒活疫苗分别进行喷鼻免疫，同时以A/AnnArbor/6/60作为重组A型H1N1亚型流感病毒减毒活疫苗和重组A型H3N2亚型流感病毒减毒活疫苗的阳性对照，B/AnnArbor/1/66作为重组B型流感病毒减毒活疫苗的阳性对照，流感四价疫苗(购自北京科兴生物技术有限公司)作为重组流感四价减毒活疫苗的阳性对照，以未接种病毒的鸡胚尿囊液为阴性对照。免疫方案如表10。具体步骤如下：
表10、小鼠免疫方案
分别于0d、28d喷鼻免疫Balb/c小鼠二次，于第42天分别收集小鼠鼻、肺灌洗液标本，测定每份标本的抗体效价，IgG和IgA效价测定使用商品化甲型或乙型流感病毒ELISA检测试剂盒(Genzyme Virotech)。37℃孵育2小时后加入羊抗鼠IgG或IgA抗体(Pharmigen)及底物液和显色液检测特异性IgG和IgA抗体效价。HAI效价测定：取小鼠血液，按照Palmer etal指定方法测定甲型和乙型流感病毒HAI(红细胞凝集抑制实验)效价。
小鼠鼻、肺灌洗液中IgA抗体效价和血清中IgG与HAI效价测定结果如表11所示。结果表明：重组流感四价减毒活疫苗免疫原性好于重组A型H1N1亚型流感减毒活疫苗、重组A型H3N2亚型流感减毒活疫苗、重组B型Yamagata lineage系流感减毒活疫苗和重组B型Victoria lineage系流感减毒活疫苗的效果，且重组流感四价减毒活疫苗、重组A型H1N1亚型流感减毒活疫苗、重组A型H3N2亚型流感减毒活疫苗和重组B型流感病毒活疫苗都好于流感四价疫苗的效果。
表11、鼻粘膜免疫后抗体滴度的检测
3、疫苗免疫保护效果评价
3.1疫苗在小鼠上的保护效果评价
将上述步骤1制备的重组流感四价减毒活疫苗、重组流感三价减毒活疫苗(专利授权公告号为CN1810961)、重组A型H1N1流感病毒减毒活疫苗、重组A型H3N2流感病毒减毒活疫苗、重组B型Yamagata lineage系流感减毒活疫苗和重组B型Victoria lineage系流感减毒活疫苗分别喷鼻免疫小鼠，0，21天，免疫二次，于二免后21d，分别用50LD50甲、乙型流感病毒野生株A/Beijing/501/2009(BJ501)(购自中国CDC)、B/Massachusetts/2/2012(编号：13/134，购自NIBSC)滴鼻感染小鼠，检测其免疫保护效果。以流感四价疫苗(购自北京科兴生物技术有限公司)为对照。
免疫保护效果如表12所示：重组流感四价减毒疫苗的保护率高于重组A型H1N1流感病毒减毒活疫苗、重组A型H3N2流感病毒减毒活疫苗、重组B型Yamagata lineage系流感减毒活疫苗、重组B型Victoria lineage系流感减毒活疫苗和重组流感三价减毒活疫苗(专利授权公告号为CN1810961)，且重组A型H1N1流感病毒减毒活疫苗、重组A型H3N2流感病毒减毒活疫苗、重组B型Yamagata lineage系流感减毒活疫苗和重组B型Victoria lineage系流感减毒活疫苗的保护率均高于流感四价疫苗。
表12、重组流感四价减毒活疫苗、重组A型H1N1、H3N2和重组B型流感病毒减毒活疫苗和流感三价灭活疫苗的免疫保护效果
3.2疫苗在雪貂上的保护性研究
将上述步骤1制备的重组流感四价减毒活疫苗、重组流感三价减毒活疫苗(专利授权公告号为CN1810961)、重组A型H1N1流感病毒减毒活疫苗、重组A型H3N2流感病毒减毒 活疫苗、重组B型Yamagata lineage系流感减毒活疫苗和重组B型Victoria lineage系流感减毒活疫苗分别滴鼻免疫雪貂(8-10月龄，购自安哥鲁公司)，剂量为106.5TCID50，0，21天，免疫二次，评价其在雪貂上的减毒表型和免疫保护性。于一免后4天，采用TCID50的方法检测不同时间点的各个器官的病毒载量，结果发现：重组流感四价减毒活疫苗、重组流感三价减毒活疫苗(专利授权公告号为CN1810961)、重组A型H1N1流感病毒减毒活疫苗、重组A型H3N2流感病毒减毒活疫苗、重组B型Yamagata lineage系流感减毒活疫苗和重组B型Victorialineage系流感减毒活疫苗初次免疫后雪貂的精神状态、死亡率、体重没有变化，雪貂鼻腔内无病毒复制，表明重组流感四价减毒活疫苗、重组流感三价减毒活疫苗(专利授权公告号为CN1810961)、重组A型H1N1流感病毒减毒活疫苗、重组A型H3N2流感病毒减毒活疫苗、重组B型Yamagata lineage系流感减毒活疫苗和重组B型Victoria lineage系流感减毒活疫苗在雪貂上无致病性，具有减毒表型。
同时，重组流感四价减毒活疫苗滴鼻免疫雪貂于二免21天后，分别用50LD50甲、乙型流感病毒野生株BJ501、B/Massachusetts/2/2012滴鼻感染雪貂，检测其免疫保护效果。发现攻击野毒株BJ501、野毒株B/Massachusetts/2/2012在鼻腔、肺中的毒力(TCID50)显著降低。通过雪貂免疫保护性实验证明，重组流感四价减毒活疫苗、重组流感三价减毒活疫苗(专利授权公告号为CN1810961)、重组A型H1N1流感病毒减毒活疫苗、重组A型H3N2流感病毒减毒活疫苗、重组B型Yamagata lineage系流感减毒活疫苗和重组B型Victoria lineage系流感减毒活疫苗在雪貂体内具有一定的免疫保护效果。
4、疫苗的稳定性评价
在不同温度下检测上述步骤1制备的重组流感四价减毒活疫苗、重组A型H1N1流感病毒减毒活疫苗、重组A型H3N2流感病毒减毒活疫苗、重组B型Yamagata lineage系流感减毒活疫苗、重组B型Victoria lineage系流感减毒活疫苗的稳定性(病毒形态、HA效价、TCID50病毒滴度、HA含量、动物体内免疫原性等)。
通过电镜观察病毒形态、HA效价、病毒滴度、HA含量、免疫原性结果可知，重组流感四价减毒活疫苗、重组A型H1N1流感病毒减毒活疫苗、重组A型H3N2流感病毒减毒活疫苗、重组B型Yamagata lineage系流感减毒活疫苗、重组B型Victoria lineage系流感减毒活疫苗放-70℃可保存三年，-20℃可保存两年，4℃可保存一年，表明重组流感四价减毒活疫苗、重组A型H1N1流感病毒减毒活疫苗、重组A型H3N2流感病毒减毒活疫苗和重组B型Yamagatalineage系流感减毒活疫苗、重组B型Victoria lineage系流感减毒活疫苗具有很好的稳定性。
5、疫苗的安全性评价
将上述步骤1制备的重组流感四价减毒活疫苗、重组A型H1N1流感病毒减毒活疫苗、重组A型H3N2流感病毒减毒活疫苗、重组B型Yamagata lineage系流感减毒活疫苗、重组B型Victoria lineage系流感减毒活疫苗通过喷鼻或腹腔分别免疫Balb/c小鼠、SD大鼠、豚鼠和雪貂。免疫剂量是0.5-1.0mL，共三次。
免疫结果表明：免疫后的动物均没有出现异常毒性和过敏反应，表明重组流感四价减毒活疫苗、重组A型H1N1流感病毒减毒活疫苗、重组A型H3N2流感病毒减毒活疫苗、重组B型Yamagata lineage系流感减毒活疫苗、重组B型Victoria lineage系流感减毒活疫苗均具有很好的安全性。

Claims (10)

1.一种制备重组病毒的方法，包括如下步骤：将流感病毒血凝素HA基因、流感病毒神经氨酸酶NA基因、流感病毒内部7个基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS1和NS2共同导入宿主细胞，培养，即得到重组病毒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述流感病毒血凝素HA基因和所述流感病毒神经氨酸酶NA基因均来源于A型流感病毒疫苗株或B型流感病毒疫苗株；
所述流感病毒内部7个基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS1和NS2均来源于A型流感病毒冷适应株或B型流感病毒冷适应株。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述A型流感病毒疫苗株为A/California/7/2009或A/Teaxs/50/2012；所述B型流感病毒疫苗株为B/Massachusetts/2/2012-like或B/Brisbane/60/2008；
所述流感病毒血凝素HA基因为HA1基因、HA2基因、HA3基因或HA4基因；所述HA1基因来源于流感病毒A/California/7/2009，其核苷酸序列为序列表中序列4；所述HA2基因来源于流感病毒A/Teaxs/50/2012，其核苷酸序列为序列表中序列10；所述HA3基因来源于流感病毒B/Massachusetts/2/2012-like，其核苷酸序列为序列表中序列15；所述HA4基因来源于B/Brisbane/60/2008，其核苷酸序列为序列表中序列22；
所述流感病毒神经氨酸酶NA基因为NA1基因、NA2基因、NA3基因或NA4基因；所述NA1基因来源于流感病毒A/California/7/2009，其核苷酸序列为序列表中序列6；所述NA2基因来源于流感病毒A/Teaxs/50/2012，其核苷酸序列为序列表中序列9；所述NA3基因来源于流感病毒B/Massachusetts/2/2012-like，其核苷酸序列为序列表中序列17；所述NA4基因来源于B/Brisbane/60/2008，其核苷酸序列为序列表中序列23。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：
所述A型流感病毒冷适应株为A/AnnArbor/6/60变异体；所述B型流感病毒冷适应株为B/AnnArbor/1/66；
所述PB2基因为APB2基因或BPB2基因；所述APB2基因来源于流感病毒A/AnnArbor/6/60变异体，其核苷酸序列为序列表中序列1；所述BPB2基因来源于流感病毒B/AnnArbor/1/66变异体，其核苷酸序列为序列表中序列12；
所述PB1基因为APB1基因或BPB1基因；所述APB1基因来源于流感病毒A/AnnArbor/6/60变异体，其核苷酸序列为序列表中序列2；所述BPB1基因来源于流感病毒B/AnnArbor/1/66变异体，其核苷酸序列为序列表中序列13；
所述PA基因为APA基因或BPA基因；所述APA基因来源于流感病毒A/AnnArbor/6/60变异体，其核苷酸序列为序列表中序列3；所述BPA基因来源于流感病毒B/AnnArbor/1/66变异体，其核苷酸序列为序列表中序列14；
所述NP基因为ANP基因或BNP基因；所述ANP基因来源于流感病毒A/AnnArbor/6/60变异体，其核苷酸序列为序列表中序列5；所述BNP基因来源于流感病毒B/AnnArbor/1/66变异体，其核苷酸序列为序列表中序列16；
所述M基因为AM基因或BM基因；所述AM基因来源于流感病毒A/AnnArbor/6/60变异体，其核苷酸序列为序列表中序列7；所述BM基因来源于流感病毒B/AnnArbor/1/66变异体，其核苷酸序列为序列表中序列18；
所述NS1基因为ANS1基因或BNS1基因；所述ANS1基因来源于流感病毒A/AnnArbor/6/60变异体，其核苷酸序列为序列表中序列8；所述BNS1基因来源于流感病毒B/AnnArbor/1/66变异体，其核苷酸序列为序列表中序列19；
所述NS2基因为ANS2基因或BNS2基因；所述ANS2基因来源于流感病毒A/AnnArbor/6/60变异体，其核苷酸序列为序列表中序列9；所述BNS2基因来源于流感病毒B/AnnArbor/1/66变异体，其核苷酸序列为序列表中序列20。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：
所述方法为如下(1)-(4)中任一种：
1)将HA1基因、NA1基因、APB2基因、APB1基因、APA基因、ANP基因、AM基因、ANS1基因和ANS2基因共同导入宿主细胞，培养，得到重组A型H1N1亚型流感病毒；
2)将HA2基因、NA2基因、APB2基因、APB1基因、APA基因、ANP基因、AM基因、ANS1基因和ANS2基因共同导入宿主细胞，培养，得到重组A型H3N2亚型流感病毒；
3)将HA3基因、NA3基因、BPB2基因、BPB1基因、BPA基因、BNP基因、BM基因、BNS1基因和BNS2基因共同导入宿主细胞，培养，得到重组B型Yamagata lineage系流感病毒；
4)将HA4基因、NA4基因、BPB2基因、BPB1基因、BPA基因、BNP基因、BM基因、BNS1基因和BNS2基因共同导入宿主细胞，培养，得到重组B型Victoria lineage系流感病毒。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：
所述HA1基因、所述NA1基因、所述APB2基因、所述APB1基因、所述APA基因、所述ANP基因、所述AM基因、所述ANS1基因和所述ANS2基因是通过含有HA1基因的重组载体、含有NA1基因的重组载体、含有APB2基因的重组载体、含有APB1基因的重组载体、含有APA基因的重组载体、含有ANP基因的重组载体、含有AM基因的重组载体、含有ANS1基因的重组载体和含有ANS2基因的重组载体共同导入宿主细胞中；
所述HA2基因、所述NA2基因、所述APB2基因、所述APB1基因、所述APA基因、所述ANP基因、所述AM基因、所述ANS1基因和所述ANS2基因是通过含有HA2基因的重组载体、含有NA2基因的重组载体、含有APB2基因的重组载体、含有APB1基因的重组载体、含有APA基因的重组载体、含有ANP基因的重组载体、含有AM基因的重组载体、含有ANS1基因的重组载体和含有ANS2基因的重组载体共同导入宿主细胞中；
所述HA3基因、所述NA3基因、所述BPB2基因、所述BPB1基因、所述BPA基因、所述BNP基因、所述BM基因、所述BNS1基因和所述BNS2基因是通过含有HA3基因的重组载体、含有NA3基因的重组载体、含有BPB2基因的重组载体、含有BPB1基因的重组载体、含有BPA基因的重组载体、含有BNP基因的重组载体、含有BM基因的重组载体、含有BNS1基因的重组载体和含有BNS2基因的重组载体共同导入宿主细胞中；
所述HA4基因、所述NA4基因、所述BPB2基因、所述BPB1基因、所述BPA基因、所述BNP基因、所述BM基因、所述BNS1基因和所述BNS2基因是通过含有HA4基因的重组载体、含有NA4基因的重组载体、含有BPB2基因的重组载体、含有BPB1基因的重组载体、含有BPA基因的重组载体、含有BNP基因的重组载体、含有BM基因的重组载体、含有BNS1基因的重组载体和含有BNS2基因的重组载体共同导入宿主细胞中。
7.由权利要求1-6中任一所述方法制备的重组病毒。
8.权利要求7所述的重组病毒在制备预防和/或治疗流感病毒的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述产品为药物或试剂盒；所述药物具体为疫苗。
10.一种流感病毒疫苗，其活性成分为权利要求5中的所述重组A型H1N1亚型流感病毒、权利要求5中的所述重组A型H3N2亚型流感病毒、权利要求5中的重组B型Yamagata lineage系流感病毒和权利要求5中的重组B型Victoria lineage系流感病毒中至少一种。
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