CN104312983A

CN104312983A - 一种重组流感病毒及其应用

Info

Publication number: CN104312983A
Application number: CN201410559367.7A
Authority: CN
Inventors: 周剑芳; 秦堃; 朱云; 白天; 王大燕; 舒跃龙
Original assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2014-10-20
Filing date: 2014-10-20
Publication date: 2015-01-28
Anticipated expiration: 2034-10-20
Also published as: CN104312983B

Abstract

本发明公开了一种重组流感病毒及其应用。本发明提供了一种制备重组病毒的方法，包括如下步骤：将HA6亚型流感病毒血凝素的编码基因、流感病毒神经氨酸酶NA基因、流感病毒内部6个基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS共同导入宿主细胞，包装，即得到重组病毒。本发明公开了利用该类重组病毒检测抑制季节性流感N1、N2、2009H1N1N1、2013H7N9N9酶活抗体的检测方法，包括样本处理、结果分析。该发明能快速有效的测定人群对NA免疫应答，操作简单、应用方便，为临床检测、疫苗评估提供了可行的技术支持。

Description

一种重组流感病毒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种重组配流感病毒及其应用。

背景技术

流感病毒为正粘病毒科，为分节段负链RNA病毒。根据病毒的核蛋白(NP)和基质蛋白(M)不同分为甲型、乙型、丙型。甲型流感具有高度变异、广泛的感染宿主范围，对公众健康的威胁最大。根据病毒表面的血凝素(HA)甲型流感病毒又分为HA1-16亚型，依据神经氨酸酶NA分为NA1-9亚型。目前在人群中流行的甲型流感病毒主要有H1、H2、H3及N1、N2亚型，近年来感染人的新型流感病毒2009H1N1、H7N9禽流感病毒,前者造成流感大流行，后者的致死率达27.2％。这些NA能否诱导机体免疫应答，能否用于无症状隐性感染的筛查指标尚不明确。

HA、NA糖蛋白在病毒感染、复制过程中起着重要作用,也是重要抗原，能刺激机体产生中和性保护抗体。抗HA抗体是目前用于评估流感疫苗有效性的重要指标，尽管抗NA抗体能减轻临床症状，但既往基于β甲醛丙酮酸的生色反应，由于使用试剂有毒、操作繁琐，不适合大批量筛查，因而抗NA抗体检测未被广泛推广。1990年，Claude R.Lambré报道基于花生四烯酸结合半乳糖基团检测的酶链免疫检测法，随后发现抗HA抗体如与病毒相互作用，该作用也能构象上影响与NA的结合，从而出现抗NA抗体假阳性。2009年，Sandbulte MR研究团队使用仅含流感病毒NA的病毒样颗粒(VLP)用于抗NA抗体检测，该方法已申请专利，因制备的VLP产量受限，体系中也可能有杆状病毒，对VLP技术缺乏掌握的实验室或疫苗厂家难以开展。近年来，广谱中和抗体、NA酶活抑制性抗体、NA免疫原性的研究推动了抗NA抗体检测的发展，利用流感病毒研究最通用的反向遗传学技术，开发具有我国自主知识产权的抗NA抗体检测平台尤为重要，从而为临床检测、疫苗评估提供技术支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备重组病毒的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将HA6亚型流感病毒血凝素的编码基因、流感病毒神经氨酸酶NA基因、流感病毒内部6个基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS共同导入宿主细胞，包装，即得到重组病毒。

上述方法中，所述NA基因为NA1-9亚型流感病毒中任一种的神经氨酸酶的编码基因；

所述NA1-9亚型流感病毒中任一种的神经氨酸酶的编码基因具体为NA1、NA2或NA9亚型流感病毒的神经氨酸酶编码基因。

上述方法中，所述HA6亚型流感病毒血凝素的编码基因为H6基因，其来源于流感病毒A/Env/2029/2011(H6N1)，其核苷酸序列具体为序列表中序列1；

所述NA1亚型流感病毒神经氨酸酶的编码基因为2007季节性H1N1流感病毒NA基因(NA2007H1N1)或2009H1N1流感病毒NA基因(NA2009H1N1)，

所述2007季节性H1N1流感病毒NA基因来源于流感病毒A/Brisbane/59/2007，其核苷酸序列具体为序列表中序列2；

所述2009H1N1流感病毒NA基因来源于流感病毒A/California/04/2009，其核苷酸序列具体为序列表中序列5；

所述NA2亚型流感病毒神经氨酸酶的编码基因为2007季节性H3N2流感病毒NA基因(NA2007H3N2)，其来源于流感病毒A/Brisbane/10/2007，其核苷酸序列具体为序列表中序列3；

所述NA9亚型流感病毒神经氨酸酶的编码基因为2013H7N9禽流感病毒NA基因(NA2013H7N9)，其来源于流感病毒A/Anhui/1/2013，其核苷酸序列具体为序列表中序列4；

所述基因PB2的核苷酸序列具体为序列表中序列6；

所述基因PB1的核苷酸序列具体为序列表中序列7；

所述基因PA的核苷酸序列具体为序列表中序列8；

所述基因NP的核苷酸序列具体为序列表中序列9；

所述基因M的核苷酸序列具体为序列表中序列10；

所述基因NS的核苷酸序列具体为序列表中序列11。

上述方法中，

所述HA6亚型流感病毒血凝素的编码基因、NA1-9亚型流感病毒中任一种的神经氨酸酶的编码基因、及内部6个基因片段PB2、PB1、PA、NP、M和NS分别通过含有HA6亚型流感病毒血凝素的编码基因重组载体、含有NA1-9亚型流感病毒中任一种的神经氨酸酶的编码基因重组载体、含有PB2重组载体、含有PB1重组载体、含有PA重组载体、含有NP重组载体、含有M重组载体、含有NS重组载体共同导入宿主细胞中；

所述含有HA6亚型流感病毒血凝素的编码基因的重组载体为将H6基因插入表达载体中得到的载体；

所述含有NA1-9亚型流感病毒中任一种的神经氨酸酶的编码基因重组载体为将NA1-9亚型流感病毒中任一种的神经氨酸酶的编码基因插入表达载体中得到的载体；

所述含有PB2重组载体为将基因PB2插入表达载体中得到的载体；

所述含有PB1重组载体为将基因PB1插入表达载体中得到的载体；

所述含有PA重组载体为将基因PA插入表达载体中得到的载体；

所述含有NP重组载体为将基因NP插入表达载体中得到的载体；

所述含有M重组载体为将基因M插入表达载体中得到的载体；

所述含有NS重组载体为将基因NS插入表达载体中得到的载体；

所述表达载体具体为pHW2000。

上述方法中，所述含有HA6亚型流感病毒血凝素的编码基因重组载体、含有NA1-9亚型流感病毒中任一种神经氨酸酶的编码基因重组载体、含有PB2重组载体、含有PB1重组载体、含有PA重组载体、含有NP重组载体、含有M重组载体、含有NS重组载体为等质量混合共同导入。

上述方法中，所述宿主细胞为由MDCK细胞和293T细胞混合得到的混合细胞群；

所述MDCK细胞和293T细胞的细胞数目比具体为1:1.5-2。

所述含有A/Env/2029/2011(H6N1)HA基因的重组载体为pHW2000-A/Env/2029/2011_HA；

所述含有季节性流感A/Brisbane/59/2007(H1N1)NA基因重组载体pHW2000-A/Brisbane/59/2007_NA；

所述含有季节性流感A/Brisbane/10/2007(H3N2)NA基因重组载体pHW2000-A/Brisbane/10/2007_NA；

所述含有禽流感病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)NA基因的重组载体为pHW2000-A/Anhui/1/2013_NA；

所述含有流感病毒A/California/04/2009(H1N1)NA基因的重组载体为pHW2000-A/California/04/2009_NA。

上述方法具体为如下A)-D)：

A)包括如下步骤：将含有HA6基因的重组载体pHW2000-A/Env/2029/2011_HA、含有2007H1N1病毒NA基因重组载体pHW2000-A/Brisbane/59/2007_NA、含有A/PuertoRico/8/1934(PR8)流感病毒内部6个基因片段的pHW2000-PB2重组载体、pHW2000-PB1重组载体、pHW2000-PA重组载体、pHW2000-NP重组载体、pHW2000-M重组载体、pHW2000-NS重组载体共同导入宿主细胞,包装,即得到重组病毒RGH6N1(Br59NA)；

B)包括如下步骤：将含有HA6亚型的编码基因重组载体A/Env/2029/2011_HA、含有2007H3N2病毒NA基因重组载体A/Brisbane/10/2007_NA、含有PR8流感病毒内部6个基因片段的pHW2000-PB2重组载体、pHW2000-PB1重组载体、pHW2000-PA重组载体、pHW2000-NP重组载体、pHW2000-M重组载体、pHW2000-NS重组载体共同导入宿主细胞,包装,即得到重组病毒RGH6N2(Br10NA)；

C)包括如下步骤：将含有HA6亚型的编码基因重组载体A/Env/2029/2011_HA、含有2013H7N9病毒NA基因重组载体pHW2000-A/Anhui/1/2013_NA、含有PR8流感病毒内部6个基因片段的pHW2000-PB2重组载体、pHW2000-PB1重组载体、pHW2000-PA重组载体、pHW2000-NP重组载体、pHW2000-M重组载体、pHW2000-NS重组载体共同导入宿主细胞,包装,即得到重组病毒RGH6N9(AH1NA)；

D)包括如下步骤：将含有HA6亚型的编码基因重组载体A/Env/2029/2011_HA、含有2009H1N1病毒NA基因重组载体pHW2000-A/California/04/2009_NA、含有PR8流感病毒内部6个基因片段的pHW2000-PB2重组载体、pHW2000-PB1重组载体、pHW2000-PA重组载体、pHW2000-NP重组载体、pHW2000-M重组载体、pHW2000-NS重组载体共同导入宿主细胞，包装，即得到重组病毒RG H6N1(CA04NA)。

上述方法制备的重组病毒也是本发明保护的范围。

上述的重组病毒在制备检测待测血清中抗神经氨酸酶抗体产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述的重组病毒在制备临床检查和/或评估流感疫苗产品中的应用也是本发明保护的范围；所述流感疫苗具体为季节性H1N1、H3N2、2009H1N1、禽流感H7N9病毒疫苗。

上述的重组病毒在制备流感疫苗中的应用；所述流感疫苗具体为具体为季节性H1N1、H3N2、2009H1N1、禽流感H7N9病毒疫苗。

本发明的实验证明，基于ELISA显色技术的NA活性检测同最早用于NA抗体检测的化学显色法比较(Methods for the quantitative estimation of N-acetylneuraminic acid and theirapplication to hydrolysates of sialomucoids.AMINOFF D.Biochem J.81:384-92.1961)，所使用的检测试剂无毒无害，步骤简单。本发明中所使用的H6重配流感病毒，其包膜含有待测目标病毒NA蛋白,具有与野生病毒相同的NA酶功能特性，HA则是与含NA的亲代病毒上的HA抗原性明显不同，这种重配方式具有以下优点：1)反向遗传技术简单可行，可以在鸡胚第一代就获得病毒，获得的病毒滴度在128HAU/50ul以上，病毒产量高，也能使用BPL灭活，方便实验检测；2)使用不同于亲代病毒HA或抗原性差别大的HA用于重配病毒，该重配病毒同抗亲代病毒HA抗体无交叉反应性，避免机体已有的抗HA抗体对NA抗体检测的干扰；3)本发明中用于拯救病毒的PHW2OOO载体为双向表达编码载体，可编码正粘病毒vRNA及病毒蛋白，是用于正粘病毒拯救最常用的载体。拯救步骤是同时转染流感病毒8段基因，在293T细胞上包装病毒，进而感染MDCK细胞，再在鸡胚细胞上扩增，操作简单，大多数流感病毒实验室具备该技术；4)本发明中选用的H6，基于在人群中H6感染非常罕见，一般人群或感染人群血清中基本不存在抗H6抗体，H6基因位于H1a分支，该分支的基因与本研究中使用的N1、N2、N9基因的重配能兼容，能够拯救出病毒。

附图说明

图1为重组病毒RGH6N1(Br59NA),RGH6N2(Br10NA),RGH6N1(CA04NA),RGH6N9(AH1NA)NA酶活

图2为H7N9患者血凝抑制抗体(HI)、NA酶活抑制抗体(NI)、中和抗体滴度(MN)变化动力学

图3为H7N9患者NA酶活抑制抗体(NI)与血凝抑制抗体(HI)的相关性

图4为NA酶活抑制(NI)抗体与中和抗体滴度(MN)的相关性

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、重组病毒RGH6N1(Br59NA)、RGH6N2(Br10NA)制备及其对NA抗体的反应

一、重组病毒RGH6N1(Br59NA)、RGH6N2(Br10NA)拯救

1、流感病毒H6、NA基因的扩增

HA基因有不同的亚型，其中之一为H6；

使用RNeasy Mini Kit(Qiagen，cat#74104)提取病毒RNA，病毒200μL加入500μL裂解液，病毒RNA50μL，以一步法RT-PCR扩增。

H6基因以A/Env/2029/2011(H6N1，该病毒由中国疾病预防控制中心病毒病控制所流感室采集)RNA为模板进行重叠PCR扩增获得PCR产物。

NA基因分别以不同亚型的病毒株的RNA为模板进行一步PCR扩增，不同亚型的病毒株分别为A/Brisbane/59/2007(H1N1),A/Brisbane/10/2007(H3N2),A/California/04/2009(H1N1)，A/AH1/2013(H7N9)RNA扩增,前三种病毒由美国CDC提供，中国疾病预防控制中心病毒病控制所流感室保存,A/AH1/2013(H7N9)由中国疾病预防控制中心病毒病控制所流感室分离保存。

上述基因的扩增引物如下表1所示：

表1为扩增引物

下标线为与载体PHW2000序列互补的序列。

上述PCR反应体系和反应条件如下：

取PCR管，加5×Reaction Buffer10μl，dNTPs(10μM)2μl，RNA template2-5μl，上下游引物(10Μm)各2μl，酶混合物2μl，ddH2O 27-30μl，总反应体积50μl。反应条件：55℃30分钟；95℃15分钟；95℃1分钟，56℃1分钟，72℃1.5分钟，40个循环；72℃10分钟。

具体扩增如下：

1)、流感病毒H6基因的获得

以A/ENV/2029/2011(H6N1)的RNA为模板，用INF-HA-F和OL-H6-R为引物进行RT-PCR扩增，得到843bp的片段1，

以A/ENV/2029/2011(H6N1)的RNA为模板，用OL-H6-F和INF-HA-R为引物进行RT-PCR扩增，得到914bp的片段2，

以片段1和片段2为模板，用INF-HA-F和INF-HA-R为引物，得到1743bp的H6基因PCR产物(经过测序，具有序列表中序列1所示的核苷酸)。

2)、NA基因的获得

以A/Brisbane/59/2007(H1N1)的RNA为模板，INF-NA-F和INF-NA-R为引物进行RT-PCR扩增，得到1443bp的NA基因(H1N12007)PCR产物(经过测序，具有序列表中序列2所示的核苷酸)；

以A/Brisbane10/2007(H3N2)的RNA为模板，INF-NA-F和INF-NA-R为引物进行RT-PCR扩增，得到1467bp的NA基因(H3N2)PCR产物(经过测序，具有序列表中序列3所示的核苷酸)。

二、9个用于包装重组病毒的重组载体的获得

pHW2OOO载体记载于如下文献中，A DNA transfection system for generation ofinfluenza A virus from eight plasmids.PNAS(97)11；6108–6113；公众可从中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所获得。

对1μg pHW2OOO载体、酶切缓冲液3(NEB3)，BsmB I10U,总体积50ul，55℃酶切过夜。电泳胶回收3500左右大小的片段，即为线性化pHW2OOO载体。用线性化后和H6基因PCR产物进行Infusion连接，得到重组载体pHW2000-A/Env/2029/2011_HA(经过测序，该载体为将序列1所示的H6基因插入PHW2OOO载体得到的重组载体)；

用BsmB I线性化PHW2OOO载体后和NA基因(H1N12007)PCR产物进行Infusion连接，得到重组载体pHW2000-A/Brisbane/59/2007_NA(H1N1)(经过测序，该载体为将序列2所示的NA基因(H1N12007)插入PHW2OOO载体得到的重组载体)；

用BsmB I线性化PHW2OOO载体后和NA基因(H3N2)PCR产物进行Infusion连接，得到重组载体pHW2000-A/Brisbane/10/2007_NA(H3N2)(经过测序，该载体为将序列3所示的NA基因(H3N2)插入PHW2OOO载体得到的重组载体)；

其余6个用于包装病毒的重组载体如下：

pHW2000-PB2为将基因PB2(核苷酸序列为序列6)插入表达载体PHW2OOO中得到的载体；

pHW2000-PB1为将基因PB1(核苷酸序列为序列7)插入表达载体PHW2OOO中得到的载体；

pHW2000-PA为将基因PA(核苷酸序列为序列8)插入表达载体PHW2OOO中得到的载体；

pHW2000-NP为将基因NP(核苷酸序列为序列9)插入表达载体PHW2OOO中得到的载体；

pHW2000-M为将基因M(核苷酸序列为序列10)插入表达载体PHW2OOO中得到的载体；

pHW2000-NS为将基因NS(核苷酸序列为序列11)插入表达载体PHW2OOO中得到的载体。

具体如下：

将BsmB I线性化PHW2OOO载体、H6基因PCR产物和各种基因PCR产物分别进行1％琼脂糖电泳(TBE电泳缓冲液:Tris108克、Na₂EDTA·2H2O 7.44克、硼酸55克，去离子水定容至1L)；切下回收目标片断和载体至以称重的1.5ml EP管中，用QIAEXⅡGel Extraction Kit纯化：加入3倍体积的Buffer QX1(100mg加300ul QX1)。加30ul Buffer QIAEX II然后50℃水浴10分钟,期间每两分钟漩涡振荡一次。13000rpm离心30秒，弃去上清，加500ul QIAEX I洗一次，加Buffer PE500ul洗两次弃去上清，空气干燥15分钟直至沉淀变白。加入20ulTE漩涡振荡30秒培育5分钟，13000rpm，离心30秒将上清移入1.5mlEP管，测量浓度。

根据Infusion技术原理，线性化PHW2000载体与HA、NA片段有15个碱基重合Infusion技术能使其根据重合部分定向拼接。使用Clonetech公司的Infusion试剂盒，具体操作如下：5×In-Fusion buffer2ul，Enzyme1ul，线性化PHW200载体，HA或NA片段，水，总体积10ul。载体与各片段的用量满足其摩尔比2:1。Infusion混合液37℃处理15分钟，50℃处理15分钟，加入40ul TE缓冲液，补足50ul，取2.5ul转化至trans10。经转化的trans10冰中放置30分钟，42℃加热45秒钟后，再冰中放置1分钟。加入LB培养基，37℃振荡培养60分钟。取100ul涂含有氨苄青霉素的L-琼脂平板培养基，37℃培养16小时，形成单菌落，挑单菌落至含氨苄青霉素LB培养基培养8小时，将培养8小时的菌液用QIAprep Spin Miniprep Kit小提质粒：将菌液倒入标记好的1.5ml离心管中，13000rpm，4℃，3分钟，离心弃去上清；加250ul Buffer P1，混匀，加250ul Buffer P2，迅速轻轻颠倒4-6次；加入350ul Buffer N3，颠倒4-6次混匀，有白色絮状物析出，13000rpm，4℃，10分钟；把QIAprep spin column放于1.5ml EP管中(收集废液)然后将上清移入QIAprep spin column中，8000rpm4℃1分钟；弃去废液，加750ulBuffer PE，13000rpm，4℃，1分钟，弃去废液，13000rpm，4℃，1分钟离心，将QIAprep spincolumn移入新的1.5ml离心管中，竖直加30ul Buffer EB于膜上，放置1分钟后，4℃，13000rpm，1min离心获得液体单克隆的质粒。

测序鉴定正确,得到重组载体pHW2000-A/Env/2029/2011_HA、pHW2000-A/Brisbane/59/2007_NA(H1N1)、pHW2000-A/Brisbane/10/2007_NA(H3N2)、pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-NP、pHW2000-M、pHW2000-NS。

3、转染拯救病毒

将上述2获得的重组载体分别按照如下分组转染MDCK细胞和293T细胞的混合细胞群，包装得到病毒RGH6N1(Br59NA)和病毒RGH6N1(Br10NA)。

A组混合载体：将pHW2000-A/Env/2029/2011_HA、pHW2000-A/Brisbane/59/2007_NA(H1N1)、pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-NP、pHW2000-M、pHW2000-NS各0.5μg混合，得到A组混合载体；

B组混合载体：将pHW2000-A/Env/2029/2011_HA、pHW2000-A/Brisbane/10/2007_NA(H3N2)、pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-NP、pHW2000-M、pHW2000-NS各0.5μg混合，得到A组混合载体；

RGH6N1(Br59NA)为A组混合载体转染得到，对应的NA基因来源于病毒A/Brisbane/59/2007_NA(H1N1)；

病毒RGH6N1(Br10NA)为B组混合载体混合载体转染得到，对应的NA基因来源于病毒A/Brisbane/10/2007_NA(H3N2)。

1)取生长状态良好的MDCK(ATCC CRL-2936)细胞和293T细胞(ATCC-CRL-3216)T75各1瓶，用0.25％EDTA-胰酶消化后，1000rpm离心10min。离心后打散，分别用10mL的opti-MEM重悬。取重悬后的293T、MDCK细胞各1mL混匀，补足opti-MEM至20mL，取一六孔板，每孔加入3mL重悬的293T细胞悬液和MDCK细胞悬液(使293T细胞和MDCK细胞的个数为1.5-2:1)后放入37℃孵箱培养过夜。

2)将上述2获得的重组载体各取0.5ug混合，使载体等质量混合；

3)分别将上述A组混合载体和B组混合载体加入脂质体10μL，室温放置20min后，补足opti-MEM至1mL。吸出六孔板内废液，加入混有质粒的opti-MEM，放入37℃5％CO₂孵箱过夜。次日早晨，每孔补1mL含有2ug/mL TPCK-Trypsin的opti-MEM，并放在生物安全二级实验室内37℃5％CO₂孵箱内培养48小时后收取细胞悬液。

4)选取9-11日龄SPF级鸡胚，照检以观察鸡胚情况。在胚胎面和气室交界边缘处，避开血管以及鸡胚做标记，即为注射点。用75％酒精消毒标记处及周围，用钻蛋器钻孔，勿伤壳膜。

5)以0.4mL收获的细胞悬液接种鸡胚尿囊腔，每个样品接种2枚鸡胚。

6)用白板胶封口后放37℃孵箱培养，48h收获鸡胚尿囊液，使用1％火鸡红细胞测定血凝滴度(World Health Organization，Manual on Animal Influenza Diagnosis andSurveillance，Serologic diagnosis of influenza virus infections by hemagglutinationinhibition，edition4,78-79,2004。，血凝阳性即为包装得到的重组病毒RGH6N1(Br59NA)和重组病毒RGH6N1(Br10NA)，病毒代次为鸡胚1代(E1)。所获得的重组病毒RGH6N1(Br59NA)和重组病毒RGH6N1(Br10NA)滴度在128HAU/50μL以上。

裂解重组病毒RGH6N1(Br59NA)和重组病毒RGH6N1(Br10NA)测序验证HA,NA序列正确(含有目的H6和NA基因，为阳性病毒)。

二、重组病毒在检测血液中NA抗体滴度中的应用

1、重组病毒滴度的选择

用50μg/mL胎蛋白(Sigma,cat#F3385)包被高亲和力96孔ELISA板，4度过夜，PBS洗涤6次。在第1-12列中，各自加入含钙镁PBS60μL，在第1列中加入重组病毒RGH6N1(Br59NA)或重组病毒RGH6N1(Br10NA)，做2倍稀释，再补充含钙镁PBS60μL。最后在第12列的各孔中加入含钙镁PBS120μL作为阴性对照。将稀释好的重组病毒混合液100μL转移至胎蛋白包被的96孔板，37℃作用4小时，PBST洗涤6次。加入HRP标记的花生四烯酸3ug/mL(Sigma,cat#L7759)，室温避光1小时，PBST洗涤6次。每孔加入OPD底物100μL。室温放3min左右显色，直至细胞阳性对照孔变成橙黄色，而细胞阴性对照孔尚未变色时，每孔加入100μL终止液终止反应。用酶标仪(492nm)读出每孔OD值。取2为底的病毒滴度作为X轴，OD值为Y轴，选择线性区间最大OD值的90-95％的对应的病毒滴度来稀释，用于血清学检测(见图1)，因而取OD值0.9-1.0对应的病毒滴度来稀释，选取1:4稀释的重组病毒RGH6N1(Br59NA)和重组病毒RGH6N1(Br10NA)用于检测血清中NA抗体滴度。

2、重组病毒检测血液中NA抗体滴度

1-12号的待测血清，分别为样本1和10为同一来源的人静脉高效丙球，用于验证实验批内、批间差别，样本2为转人基因超敏免疫牛血浆，对N1、N2抗体反应阳性，其余为人血清标本，标本3、6、7、8为<5岁儿童血清，对NA抗体反应阴性。

将上述待测血清56℃灭活45min。在96孔板中第3-11列加入含钙镁PBS60μL。第2列中加入钙镁PBS102μL，从第2列吸取60μL液体到第3列，用排枪上下吹吸5次混合均匀后再吸60μL液体至第4列，如此重复操作直至第11列的时，将液体混合均匀后，弃掉60μL液体，使待测血清作系列倍比稀释，使之成为1:10.1:20.1:40……1:1280。在第1列加入已稀释的病毒(即1:4倍稀释，使病毒NA酶活OD值在0.9-1.0)60μL，并用钙镁PBS补充到120μL，作为病毒阳性对照；用2-11列中已稀释的血清中加入已稀释的病毒(即1:4倍稀释，使病毒NA酶活OD值在0.9-1.0)60μL，第12列120μL钙镁PBS作为阴性对照。37℃作用1小时。第1列为病毒阳性对照，第12列为PBS阴性对照。37℃作用1小时。将混合液100μL转移至胎蛋白包被的96孔板，37℃作用4小时。PBST洗涤6次。加入HRP标记的花生四烯酸3ug/mL(Sigma,cat#L7759)，室温避光1小时，PBST洗涤6次。每孔加入OPD底物100μL。室温放3min左右显色，每孔加入100μL终止液终止反应。用酶标仪(492nm)读出每孔OD值。使用曲线拟合法及两点法计算血清抗体滴度即IC₅₀值。

1)分析方法一：曲线拟合法

使用GraphPad Prism软件拟合。

对血清稀释度进行取2为底的对数转化，这些值作为X值；

打开Prism软件，选择XY图，Y值选择单点值建立文件；

Y值为加入血清样品孔OD值，即血清孔OD值-阴性对照值(PBS孔)；

选择“non-linear regression(curve fit)”,“log(inhibitor)vs response-variableslope”分析，再设定bottom constrain为0.0,top constrain为第1列病毒OD值-阴性对照值(PBS孔)；

在结果表中的LogIC₅₀进行2的指数转换，求得血清抗体滴度即IC₅₀值。

2)分析方法二：两点法

在EXCEL里进行数据转换与计算。

对血清稀释度进行取2为底的对数转化，这些值作为X值

计算(血清样品孔OD值-阴性对照OD值)/(病毒阳性对照孔-OD值-阴性对照OD值)，作为Y值。

选择邻近50％的两点计算，即Y1值>50％，Y2值<50％，计算a＝(Y1-Y2)/(X1-X2)；b＝Y1-(a*X1)；LogIC₅₀＝(0.5-b)/a

在结果表中的LogIC₅₀进行2的指数转换，求得血清中NA抗体滴度即IC₅₀值。

结果如表2所示，从表2结果看，两种计算方法差别不大，但曲线拟合某些情况无法拟合，这时选择两点法计算。

表2为血清抗体滴度

数值为两次独立实验中四次重复实验结果的均值±标准差。NT,为未测试。RG:为重配。NC表示无法计算。

根据测定值及个检测标本背景信息，使用重配病毒检测NA酶活抑制性抗体特异性高，即能明确区分抗体阳性(滴度>10)；根据样本1与10结果，该方法对N1抗体同一批检测值相比在0.77-1.20，符合血清抗体滴度差别<2，提示两个标本N1抗体滴度无差别；对N2抗体同一批检测值相比在2.02-2.32，差别接近2，提示对N2抗体检测的变异大于N1抗体检测，这类差别可能同人群对不同NA亚型流感病毒应答差别有关。

实施例2、重组病毒RGH6N9(AH1NA)制备及其对抗N9抗体的反应

一、重组病毒H6N9(AH1NA)拯救

1、流感病毒H6、NA基因的扩增

1)、流感病毒H6基因的获得

与实施例1的一、1、1)相同，得到H6基因PCR产物(序列1)。

2)、NA基因的获得

以A/AH1/2013(H7N9)的RNA为模板，INF-NA-F和INF-NA-R为引物进行RT-PCR扩增，得到1444bp的NA基因(H7N9)PCR产物(经过测序，具有序列表中序列4所示的核苷酸)；

反应体系和条件同实施例1。

二、8个用于包装重组病毒的重组载体的获得

用BsmB I线性化PHW2OOO载体和H6基因PCR产物进行Infusion连接，得到重组载体PHW2OOO-A/Env/2029/2011_HA(经测序，将序列表中序列1所示的H6基因插入PHW2OOO载体得到的重组载体)；

用BsmB I线性化PHW2OOO载体和NA基因(H7N9)PCR产物进行Infusion连接，得到重组载体PHW2OOO-AH1N9(经测序，将序列表中序列4所示的NA基因(H7N9)插入PHW2OOO载体得到的重组载体)；

方法同实施例1。

3、转染拯救病毒RGH6N9(AH1NA)

将上述2获得的重组载体PHW2OOO-A/Env/2029/2011_HA、PHW2OOO-AH1N9和pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-NP、pHW2000-M、pHW2000-NS各0.5μg混合，共同转染MDCK细胞和293T细胞的混合细胞群，包装得到病毒RGH6N9(AH1NA)。

方法同实施例1。

使用1％火鸡红细胞测定血凝滴度(World Health Organization，Manual on AnimalInfluenza Diagnosis and Surveillance，Serologic diagnosis of influenza virusinfections by hemagglutination inhibition，edition4,78-79,2004。血凝阳性即为包装得到的重组病毒RGH6N9(AH1NA)，病毒代次为鸡胚1代(E1)。重组病毒RGH6N滴度在128HAU/50μL以上，裂解重组病毒RGH6N9(AH1NA)测序验证(含有目的基因H6和N9基因，为阳性病毒)。。

二、重组病毒在检测血液中NA抗体滴度中的应用

1、重组病毒滴度的选择

采用实施例1的方法选择重组病毒RGH6N9(AH1NA)滴度，对亲代病毒1:4倍稀释，使病毒NA酶活OD值在0.9-1.0的重组病毒RGH6N9(AH1NA)作为检测血清中NA抗体的滴度(图1)。

2、重组病毒检测血液中NA抗体滴度

采用实施例1的方法用重组病毒RGH6N9(AH1NA)滴度检测H7N9患者(经病毒分离、核酸鉴定确诊)47份血清、87份健康人(n＝27,3-5岁；n＝30,18-59岁；n＝30,≥60岁)血清中NA抗体滴度，使用两点法计算血清抗体滴度即IC₅₀值。

结果如图2-4所示，同抗HA抗体(HI抗体滴度)一样，在H7N9患者恢复期(7天之后)可检测到抗N9(H7N9亚型)抗体应答(见图2)，部分病例在发病6天就明显升高。与HI抗体滴度正相关(见图3)，提示机体对病毒HA、NA免疫应答同步增高。与中和抗体(MN抗体滴度)一致，说明抗N9抗体也具有中和保护效应(见图4)。87份健康人血清中抗N9抗体均<10。

对发病7天后及发病14天后的血清抗N9抗体检测(以血清抗体滴度≥10为阳性)，其敏感性和特异性见下表3。发病7天后、14天后抗N9抗体均有较好的敏感性(>80％)。

表3为H7N9患者血清N9酶活抑制性抗体检测的特异性及敏感性

H7N9患者抗N9抗体应答的年龄、及应答强度如表4。发病7天后、14天后抗N9抗体滴度无明显差别。

表4为H7N9患者N9酶活抑制性抗体滴度

三、重配病毒RGH6N9(AH1NA)酶学特性

重组病毒RGH6N9(AH1NA)与野生A/AH1/2013(H7N9)病毒均对NA抑制剂达菲(Oseltamivir)、扎钠米维(Zanamivir)敏感，IC₅₀在1nM以下(表5)，对MUNANA底物的亲和系数(K_M)相近。表5中其余病毒为对照。

表5为重配病毒NA酶常数及其对NA抑制剂的反应

数值为两次独立实验中四次重复实验结果的均值±标准差。NT,为未测试。RG:为重配。

四、重配病毒RGH6N9(AH1NA)对单抗的反应

使用重配病毒H6N9测定抗N9抗体不受抗H7抗体影响，能反应NA抗原的交叉性。

用抗H7N7HA兔单抗检测病毒NA酶活，发现该单抗在5.59ug/ml以上能干扰野生型A/AH1/2013(H7N9)N9酶活，因该抗体不与RGH6N9、及野生型A/Env/JX/2009(H11N9)相互作用，即使浓度在100ug/ml也不影响病毒的N9酶活(见表6)。

N3、N7、N9属于Group2NA,其抗原性可能高度相似，从表6结果看出，感染人的H7N7、H7N3病毒NA抗原性同2013H7N9相近，但同A/Env/JX/2009(H11N9)N9抗原性不同；H7N9患者血清抗体滴度可看出2013H7N9NA抗原性同A/Env/JX/2009(H11N9)N9抗原性不同(血清抗体滴度差别在4倍以上)。灭活2013H7N9免疫雪貂血清抗体能与A/Env/JX/2009(H11N9)N9反应，提示该血清特异性不如活病毒感染的血清。

表6重配病毒H6N9对血清或单抗的反应

实施例3、重组病毒RG H6N1(CA04NA)制备及其对抗NA抗体的反应

一、重组病毒RG H6N1(CA04NA)拯救

1、流感病毒H6、NA基因的扩增

1)、流感病毒H6基因的获得

与实施例1的一、1、1)相同，得到H6基因PCR产物(序列1)。

2)、NA基因的获得

以A/California/04/2009(H1N1)的RNA为模板，INF-NA-F和INF-NA-R为引物进行RT-PCR扩增，得到1458bp的NA基因(2009H1N1)PCR产物(经过测序，具有序列表中序列5所示的核苷酸)；

反应体系和条件同实施例1。

二、8个用于包装重组病毒的重组载体的获得

用BsmB I线性化PHW2OOO载体和NA基因(2009H1N1)PCR产物进行Infusion连接，得到重组载体PHW2OOO-AH1N1(经测序，将序列表中序列5所示的NA基因(2009H1N1)插入PHW2OOO载体得到的重组载体)；

方法同实施例1。

3、转染拯救病毒RGH6N9(AH1NA)

将上述2获得的重组载体PHW2OOO-A/Env/2029/2011_HA、PHW2OOO-AH1N1和pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-NP、pHW2000-M、pHW2000-NS各0.5μg混合，共同转染MDCK细胞和293T细胞的混合细胞群，包装得到病毒RG H6N1(CA04NA)。

方法同实施例1。

使用1％火鸡红细胞测定血凝滴度(World Health Organization，Manual on AnimalInfluenza Diagnosis and Surveillance，Serologic diagnosis of influenza virusinfections by hemagglutination inhibition，edition4,78-79,2004。血凝阳性即为包装得到的重组病毒RGH6N1(CA04NA)，病毒代次为鸡胚1代(E1)。重组病毒滴度在128HAU/50μL以上。

裂解重组病毒RG H6N1(CA04NA)测序验证(含有目的基因H6和NA基因，为阳性病毒)。

二、重组病毒在检测血液中NA抗体滴度中的应用

1、重组病毒滴度的选择

采用实施例1的方法选择重组病毒RG H6N1(CA04NA)滴度，对亲代病毒1:4倍稀释，使病毒NA酶活OD值在0.9-1.0的重组病毒RG H6N1(CA04NA)作为检测血清中NA抗体的滴度(图1)。

2、重组病毒检测血液中NA抗体滴度

采用实施例1的方法用重组病毒RG H6N1(CA04NA)，检测50对接种2009pdmH1N1疫苗，18-60健康人群抗CA04N1抗体水平(接种0天，接种后21天)中NA抗体滴度，使用两点法计算血清抗体滴度即IC₅₀值。

使用两点法计算血清抗体滴度即IC₅₀值，结果如表7所示。

表7为2009H1N1疫苗免疫人群抗N1抗体滴度

Claims

1.一种制备重组病毒的方法，包括如下步骤：将HA6亚型流感病毒血凝素的编码基因、流感病毒神经氨酸酶NA基因、流感病毒内部6个基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS共同导入宿主细胞，包装，即得到重组病毒。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述NA基因为NA1-9亚型流感病毒中任一种的神经氨酸酶的编码基因；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述HA6亚型流感病毒血凝素的编码基因为H6基因，其来源于流感病毒A/Env/2029/2011(H6N1)，其核苷酸序列具体为序列表中序列1；

所述NA1亚型流感病毒神经氨酸酶的编码基因为NA 2007H1N1基因或NA 2009H1N1基因，所述NA H1N12007基因来源于流感病毒A/Brisbane/59/2007，其核苷酸序列具体为序列表中序列2；

所述NA H1N12009基因来源于流感病毒A/California/04/2009，其核苷酸序列具体为序列表中序列5；

所述NA2亚型流感病毒神经氨酸酶的编码基因为H3N2NA基因，其来源于流感病毒A/Brisbane/10/2007，其核苷酸序列具体为序列表中序列3；

所述NA9亚型流感病毒神经氨酸酶的编码基因为H7N9NA基因，其来源于流感病毒A/AH1/2013，其核苷酸序列具体为序列表中序列4；

所述基因PB2的核苷酸序列具体为序列表中序列6；

所述基因PB1的核苷酸序列具体为序列表中序列7；

所述基因PA的核苷酸序列具体为序列表中序列8；

所述基因NP的核苷酸序列具体为序列表中序列9；

所述基因M的核苷酸序列具体为序列表中序列10；

所述基因NS的核苷酸序列具体为序列表中序列11。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特性在于：

所述HA6亚型流感病毒血凝素的编码基因、NA1-9亚型流感病毒中任一种神经氨酸酶的编码基因、及内部6个基因片段PB2、PB1、PA、NP、M和NS分别通过含有HA6亚型流感病毒血凝素的编码基因重组载体、含有NA1-9亚型流感病毒中任一种的神经氨酸酶的编码基因重组载体、含有PB2重组载体、含有PB1重组载体、含有PA重组载体、含有NP重组载体、含有M重组载体、含有NS重组载体共同导入宿主细胞中；

所述含有PA重组载体为将基因PA插入表达载体中得到的载体；

所述含有NP重组载体为将基因NP插入表达载体中得到的载体；

所述含有M重组载体为将基因M插入表达载体中得到的载体；

所述含有NS重组载体为将基因NS插入表达载体中得到的载体；

所述表达载体具体为pHW2000。

5.根据权利要求4所述的方法，其特性在于：所述含有HA6亚型流感病毒血凝素的编码基因重组载体、含有NA1-9亚型流感病毒中任一种的神经氨酸酶的编码基因重组载体、含有PB2重组载体、含有PB1重组载体、含有PA重组载体、含有NP重组载体、含有M重组载体、含有NS重组载体为等质量混合共同导入。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特性在于：所述宿主细胞为由MDCK细胞和293T细胞混合得到的混合细胞群；

所述MDCK细胞和293T细胞的细胞数目比具体为1:1.5-2。

7.由权利要求1-6任一所述方法制备的重组病毒。

8.权利要求7所述的重组病毒在制备检测待测血清中抗神经氨酸酶抗体产品中的应用。

9.权利要求7所述的重组病毒在制备临床检查和/或评估流感疫苗产品中的应用；所述流感疫苗具体为季节性H1N1、H3N2、2009H1N1、禽流感H7N9病毒疫苗。

10.权利要求7所述的重组病毒在制备流感疫苗中的应用；所述流感疫苗具体为具体为季节性H1N1、H3N2、2009H1N1、禽流感H7N9病毒疫苗。