CN110468130B - 流感长链非编码RNA-lnc330及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了流感长链非编码RNA‑lnc330及其应用。本发明提供了长链非编码RNA，为如下任一：SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或将其核苷酸经一个或几个残基的取代、缺失和/或添加或具99％、95％、90％、85％或80％以上同源性且具相同功能的RNA。克隆LncRNA‑330，构建过表达载体，转染A549、MDCK，通过TCID₅₀及血凝试验，证实过表达可降低病毒复制能力。此外在小鼠体内利用腺病毒相关载体过表达LncRNA‑330三天后，滴鼻感染流感病毒，证实过表达的小鼠肺部及鼻咽拭子中的病毒载量降低。本发明针对流感自身基因NA设计的长链非编码RNA可以作为一种潜在的抗流感病毒药物。

Description

流感长链非编码RNA-lnc330及其应用

技术领域

本发明涉及病毒领域，具体涉及流感长链非编码RNA-lnc330及其应用。

背景技术

众所周知，流行性感冒(流感)是由流感病毒引发的，在全世界范围内流行的一种严重危害人类健康的呼吸道疾病。世界卫生组织(WHO)估计每年由流感病毒引起的严重呼吸道疾病约有300-500万例，并且有约25～50万例死亡。此外，流感病毒自上世纪以来在全世界范围内爆发了多次大流行，包括1918年西班牙爆发H1N1疫情，1957年亚洲爆发H2N2疫情，1968年香港爆发H3N2疫情，2009年墨西哥爆发H1N1疫情，2013年我国爆发的H7N9疫情，造成了大量的人类伤亡和经济损失^[2]。2016年年底至2017年年初我国又爆发了新的H7N9疫情，2017年底至今年年初我国乃至全球又爆发了甲型流感和乙型流感混合的流感疫情。据中国疾病预防控制中心的数据显示，今年流感的发病率是过去三年平均数据的2倍以上，我国病毒监测结果显示，今年甲型H1N1流感和B型(Yamagata)同为优势毒株，H3N2亚型和B型(Victoria)以低水平共同流行。因此，流感已成为一种传播性极强的“杀手”，流感病毒引起的流行病已对公众健康和经济带来巨大损失，并将持续带来危害，甚至是潜在的生物恐怖战剂，这为我们敲响了警钟，流感防控的局势依然异常严峻。

流感病毒是一种属于正黏病毒科的单负链RNA病毒，分为甲型(A型)、乙型(B型)和丙型(C型)3种。甲型流感病毒(Influenza A virus，IAV)依据其病毒表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同，可进一步分为16个H亚型(H1-H16)和9个N亚型(N1-N9)。甲型流感病毒由于其血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)易发生变异(抗原漂移和抗原转移)，因此其在全世界范围内爆发了多次大流行^[3]。由于甲型流感病毒的变异特性，现在没有针对流感病毒通用的疫苗，而市场上的流感疫苗因流感的易变异性和快速传播性在使用和预防上存在很大的局限。虽然目前市场上已有关于抗流感病毒药物，这些药物主要分为M2抑制剂(金刚烷胺和金刚乙胺)，NA抑制剂(扎那米韦，奥司他韦，帕拉米韦，辛酸拉尼米韦)，病毒RNA聚合酶抑制剂(利巴韦林和法匹拉韦)，但是由于甲型流感的变异性，容易对这些药物耐受，并且这类药物的副作用较大。一旦爆发新型变异流感，目前缺少有效的控制手段。因此，寻找新的治疗流感的药物靶点势在必行。

LncRNA是一类长度大于200nt，不具有编码能力的RNA。与mRNA相似，多数lncRNA由RNA聚合酶II转录，5’端加帽、3’端具有ployA尾，具有外显子。根据lncRNA与其临近mRNA的位置，lncRNA又分为lincRNA、intronic lncRNA、sense lncRNA、antisense lncRNA、enhancer RNA、bidirectional lncRNAs、pseudogene lncRNA等。目前GENCODE数据库已注释了15787条人基因组中的lncRNA，然而大部分的lncRNA功能都尚不清楚。近年来，越来越多的报道发现lncRNA在多种生命过程及疾病的发生发展中发挥着重要的调节作用，如干细胞的多能性与分化肿瘤的发生发展与转移、免疫细胞的分化及免疫反应调控、基因印迹码一些有功能的短肽来发挥调控功能。

现在已发现多种lncRNA在宿主抗病毒过程中发挥着重要的调节作用。首先lncRNA可与病毒直接作用。一方面，病毒可诱导宿主产生lncRNA帮助病毒自身复制及感染机体。如IAV(H1N1，H3N2，H7N7)和VSV可刺激人肺上皮细胞lincRNA VIN高表达，促进病毒自身的复制及病毒蛋白的合成。另一方面，在病毒感染中有些lncRNA的产生可直接作用于病毒进而在宿主抗病毒作用中发挥重要的调控功能。如lncRNA 7SL可被选择性的包装至HIV-I的核糖核蛋白复合体内，而7SL作为一个支架可结合病毒Gag蛋白、病毒RNA及胞苷脱氨酶APOBEC3G，APOBEC3G通过7SL的连接靶向结合至病毒核糖核蛋白进而抑制HIV的复制。其次，lncRNA可通过调节转录因子的迁移和活性、IFN和细胞因子的表达、ISGs的转录及免疫细胞的分化等生物过程调控抗病毒作用。如LncRNA(NKILA)由NFκB激活后上调，其可以结合至IκB封闭其磷酸化位点，进而抑制NFκB的激活，形成负反馈循环，抑制NFκB的过度激活。曹雪涛院士课题组发现lnc-DC通过在胞质中直接结合STAT3，通过抑制STAT3与SHP1的结合促进STAT3的磷酸化，进而促进DC细胞的分化；多项研究发现lincRNA-Cox2参与调节了多种免疫相关基因的调控，包括模式识别受体(TLR1)，趋化因子(IL-6，IL-23，CCL5)，趋化因子受体(CCR1)及ISGs(IRF7，IFI204，ISG15)。Carpenter等报道lincRNA-Cox2不影响其临近基因COX2，但其通过结合hnRNP A/B和hnRNP A2/B1抑制CCL5的表达同时增强IL-6的表达；陈吉龙课题组发现lncRNA NRAV在多种病毒如IAV，仙台病毒(Sendai virus，SEV)，番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus，MDRV)，单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)刺激后显著低表达，其通过影响ISGs的组蛋白修饰抑制多种ISGs如MxA、IFITM3、IFIT2、IFIT3、OASL的表达。

lncRNA是一类近年来研究进展非常迅猛的非编码RNA，由于其长度较长(>200nt)，且很多lncRNA都具有保守的二级结构、剪切方式和亚细胞定位，所以lncRNA不像miRNA的作用方式主要通过碱基互补配对的方式靶向结合于靶基因进而调控其转录或翻译，其作用方式多种多样，主要有以下几个方面：1、其可以作用于临近基因的上游启动子区，通过抑制RNA聚合酶II的募集或诱发染色体重塑，抑制或增强其临近基因的表达；2、lncRNA可作为反义RNA通过与编码转录本的互补结合，影响mRNA的剪切，从而产生不同的剪切体；3、长度较长的lncRNA可作为小RNA的前体，在Drosha酶和Dicer酶的作用下产生小RNA，如siRNA、miRNA及piRNA等；4、通过与蛋白质的特异性的结合，影响蛋白的功能，或作为结构组分形成RNA-蛋白复合体，以及通过特异性结合影响蛋白的亚细胞定位等；5、lncRNA可作为“分子海绵”竞争性结合转录因子、miRNA等，从而抑制转录因子或miRNA的功能；6、有些lncRNA可通过编码短肽来发挥特定的功能。

发明内容

本发明的目的是提供一种流感长链非编码RNA-lnc330及其应用。

第一方面，本发明要求保护一种长链非编码RNA。

本发明所要求保护的长链非编码RNA，具体可为如下任一：

(a1)SEQ ID No.3所示的RNA；

(a2)SEQ ID No.4所示的RNA；

(a3)将SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA；

(a4)与(a1)或(a2)或(a3)所限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的RNA。

第二方面，本发明要求保护能够转录成前文第一方面中所述长链非编码RNA的DNA。

进一步地，所述DNA具体可为如下中任一：

(b1)SEQ ID No.1所示的DNA；

(b2)SEQ ID No.2所示的DNA；

(b3)将SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA；

(b4)与(b1)或(b2)或(b3)所限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的DNA。

第三方面，本发明要求保护含有前文第一方面中所述长链非编码RNA或前文第二方面中所述DNA的表达盒、重组载体或重组菌。

其中，所述表达盒由启动子、所述DNA和转录终止序列组成。所述重组载体可为重组表达载体或重组克隆载体。

第四方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的长链非编码RNA或前文第二方面中所述的DNA或前文第三方面中所述表达盒、重组载体或重组菌在如下任一中的应用：

(A1)制备抗流感病毒产品；

(A2)抗流感病毒。

在本发明的具体实施方式中，所述抗流感病毒具体体现为预防性抗流感病毒。

第五方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的长链非编码RNA或前文第二方面中所述的DNA或前文第三方面中所述表达盒、重组载体或重组菌在如下任一中的应用：

(B1)制备能够预防和/或治疗流感病毒感染的产品；

(B2)预防和/或治疗流感病毒感染。

第六方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的长链非编码RNA或前文第二方面中所述的DNA或前文第三方面中所述表达盒、重组载体或重组菌在如下任一中的应用：

(C1)制备能够抑制流感病毒复制的产品，或抑制流感病毒复制；

(C2)制备能够帮助宿主清除流感病毒的产品，或帮助宿主清除流感病毒；

(C3)制备能够减轻流感病毒介导的急性肺损伤的产品，或减轻流感病毒介导的急性肺损伤；

(C4)制备能够减轻流感病毒感染引起的体重降低的产品，或减轻流感病毒感染引起的体重降低；

(C5)制备能够降低流感病毒感染所致死亡率的产品，或降低流感病毒感染所致死亡率。

在本发明的具体实施方式中，(C1)-(C5)所述应用均为预防性应用。(C1)中，所述抑制流感病毒复制可提现为细胞水平和/或动物水平抑制流感病毒复制。

第七方面，本发明要求保护一种产品。

本发明所要求保护的产品，其有效成分为前文第一方面中所述的长链非编码RNA；所述产品具有如下功能中的至少一种：

(D1)抗流感病毒；

(D2)预防和/或治疗流感病毒感染；

(D3)抑制流感病毒复制；

(D4)帮助宿主清除流感病毒；

(D5)减轻流感病毒介导的急性肺损伤；

(D6)减轻流感病毒感染引起的体重降低；

(D7)降低流感病毒感染所致死亡率。

第八方面，本发明要求保护一种产品。

本发明所要求保护的产品，含有前文第二方面中所述的DNA或前文第三方面中所述表达盒、重组载体或重组菌；所述产品具有如下功能中的至少一种：

(D1)抗流感病毒；

(D2)预防和/或治疗流感病毒感染；

(D3)抑制流感病毒复制；

(D4)帮助宿主清除流感病毒；

(D5)减轻流感病毒介导的急性肺损伤；

(D6)减轻流感病毒感染引起的体重降低；

(D7)降低流感病毒感染所致死亡率。

在本发明的具体实施方式中，(D3)-(D7)所示功能均为预防性功能。

在本发明中，所述减轻流感病毒介导的急性肺损伤具体可体现为如下任一：减轻流感病毒感染所致肺部炎性细胞浸润、减轻流感病毒感染所致肺部水肿程度(以肺部湿干比表征)。

在上述各方面中，所述流感病毒为H1N1亚型流感病毒、H3N2亚型流感病毒、H7N9亚型流感病毒或H5N1亚型流感病毒。

在本发明的具体实施方式中，所述H1N1亚型流感病毒具体为A/Beijing/501/2009毒株或A/California/07/2009毒株；所述H3N2亚型流感病毒具体为A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016毒株；所述H7N9亚型流感病毒具体为A/Anhui/1/2013毒株；所述H5N1亚型流感病毒具体为A/Jiangsu/1/2007。

本发明通过深度测序获得源于流感病毒长链非编码RNA的差异表达基因，经过PCR验证，证实一条靶向流感病毒NA的长链非编码RNA客观存在,将其命名为lnc330。克隆LncRNA-330，构建过表达载体，转染A549、MDCK，通过TCID₅₀及血凝试验，证实过表达LncRNA-330降低病毒复制能力。此外在小鼠体内利用腺病毒相关载体过表达LncRNA-330三天后，滴鼻感染流感病毒，证实过表达的小鼠肺部及鼻咽拭子中的病毒载量降低。本发明针对流感自身基因NA设计的长链非编码RNA可以作为一种潜在的抗流感病毒药物。

附图说明

图1为利用Coding Potential Calculator预测LncRNA 330(SEQ ID No.1与SEQID No.2)编码能力示意图。A为SEQ ID No.1编码能力预测结果；B为SEQ ID No.2编码能力预测结果。

图2为利用sfold预测LncRNA 330(SEQ ID No.1与SEQ ID No.2)结构示意图。A为SEQ ID No.1结构及丰度示意图；B为SEQ ID No.2结构及丰度示意图。

图3为采用PCR扩增LncRNA330。泳道1-10分别为PCR产物连接T载体后不同克隆。

图4为RACE方法获得Lnc330全长示意图。

图5为BJ501按照不同MOI感染A549、MDCK及CNE-2Z，实时定量检测24小时复制情况示意图。

图6为实时定量PCR检测Lnc330在不同细胞系中流感复制检测。pcDNA3.1 Medium表示转染载体质粒pcDNA3.1(+)未感染病毒组；pcDNA3.1-lnc330 Medium表示转染过表达质粒pcDNA3.1-lnc330未感染病毒组；pcDNA3.1 BJ501表示转染载体质粒pcDNA3.1(+)感染病毒组；pcDNA3.1-lnc330 BJ501表示转染过表达质粒pcDNA3.1-lnc330 BJ501感染病毒组。

图7为TCID50检测Lnc330在不同细胞系中流感复制情况。pcDNA3.1 BJ501表示转染载体质粒pcDNA3.1(+)感染病毒组；pcDNA3.1-lnc330 BJ501表示转染过表达质粒pcDNA3.1-lnc330 BJ501感染病毒组。

图8为实时定量PCR检测Lnc330在A549细胞中不同流感病毒株复制情况示意图。pcDNA3.1 infection表示转染载体质粒pcDNA3.1(+)感染病毒组；pcDNA3.1-lnc330infection表示转染过表达质粒pcDNA3.1-lnc330 BJ501感染病毒组。

图9为TCID50检测Lnc330在A549细胞中不同流感病毒株复制情况示意图。pcDNA3.1 infection表示转染载体质粒pcDNA3.1(+)感染病毒组；pcDNA3.1-lnc330infection表示转染过表达质粒pcDNA3.1-lnc330 BJ501感染病毒组。

图10为小鼠感染BJ501株流感病毒后体重变化。CTL,MOCK表示注射空载腺病毒，未感染组；Lnc330,MOCK表示注射过表达Lnc330腺病毒，未感染组；CTL,BJ501表示注射空载腺病毒，感染BJ501组；Lnc330,BJ501表示过表达Lnc330腺病毒，感染BJ501组。

图11为小鼠感染BJ501株流感病毒后死亡率。CTL,MOCK表示注射空载腺病毒，未感染组；Lnc330,MOCK表示注射过表达Lnc330腺病毒，未感染组；CTL,BJ501表示注射空载腺病毒，感染BJ501组；Lnc330,BJ501表示过表达Lnc330腺病毒，感染BJ501组。

图12为小鼠感染BJ501株流感病毒后肺部病理。

图13为小鼠感染BJ501株流感病毒后肺部炎性细胞浸润计数。CTL,MOCK表示注射空载腺病毒，未感染组；Lnc330,MOCK表示注射过表达Lnc330腺病毒，未感染组；CTL,BJ501表示注射空载腺病毒，感染BJ501组；Lnc330,BJ501表示过表达Lnc330腺病毒，感染BJ501组。

图14为小鼠感染BJ501株流感病毒后肺部湿干比。CTL,BJ501表示注射空载腺病毒，感染BJ501组；Lnc330,BJ501表示过表达Lnc330腺病毒，感染BJ501组。

图15为小鼠感染BJ501株流感病毒后肺脏病毒滴度。CTL,MOCK表示注射空载腺病毒，未感染组；Lnc330,MOCK表示注射过表达Lnc330腺病毒，未感染组；CTL，BJ501表示注射空载腺病毒，感染BJ501组；Lnc330，BJ501表示过表达Lnc330腺病毒，感染BJ501组。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1、实验动物

SPF级4周龄野生型C57BL/6(wild-type mice，WT，体重10-12g)购于为通利华公司，实验动物饲养于军事医学科学院动物中心SPF级环境中，所有的相关实验通过军事医学科学院动物伦理委员会审核。

2、细胞系

实验所用的A549细胞系，MDCK细胞系及CNE-2Z细胞系均为ATCC产品，存放于军事医学研究院微生物流行病研究所感染与免疫研究室。MDCK及CNE-2Z细胞培养于DMEM(Hyclone)培养基，A549培养于DMEM/F12(Hyclone)培养基，消化细胞所用胰蛋白酶购于Gibco公司，配制成终浓度为0.25％胰酶，其中含有2％EDTA，经0.22μm滤膜过滤除菌。

3、病毒株

本发明中使用的甲型H1N1流感病毒株为BJ501株(A/Beijing/501/2009)、H3N2(A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016)、H7N9(A/Anhui/1/2013)、H1N1(A/California/07/2009)、H5N1(A/Jiangsu/1/2007)毒种由军事医学科学院微生物流行病研究所病毒库提供。H1N1流感病毒株接种于9-11日龄SPF级鸡胚，扩增并建立病毒库保存于实验室-80℃。病毒滴度通过MDCK细胞感染半数致死剂量计算(Reed-Muench法)。本发明中所有涉及到病毒的实验均在生物安全二级实验室进行。

4、表达载体

pcDNA3.1(+)由实验室保存。

5、主要实验相关试剂

(1)表达载体构建及质粒线性化所用所有的限制性核酸内切酶(EcoR I,BamHI,)均为NEB公司产品，T4连接酶及PMD-19T为Takara公司产品；

(2)胶回收试剂盒为达科为公司产品，无内毒素质粒提取试剂盒为QIAGEN公司产品；

(3)6×DNA loading Buffer购自GenStar，Trans 2K plus DNA Ladder为全式金产品；

(4)转染质粒所用的转染试剂为jetPRIME Transfection Regent为PolyPlus公司产品；

(5)其他试剂为军事医学科学院条件处商品。

6、主要仪器和设备

(1)二氧化碳孵箱(日本三洋)

(2)电热恒温水浴锅(北京长风仪器)

(3)低温高速离心机(Sigma)

(4)NanoDrop 2000(Thermo)

(5)ABI 7500实时定量PCR仪(ABI)

(6)生物安全柜(Scientific Visions Inc)

(7)超净工作台X90-3(北京伟达净化技术研究所)

(8)冰箱与超低温冰箱(海尔)

(9)电子分析天平(Sartorius)

7、生物信息学分析软件

(1)UCSC数据库(http://genome.ucsc.edu/)

(2)Ensembl数据库(http://grch37.ensembl.org/)

(3)Coding Potential Calculator(http://cpc.cbi.pku.edu.cn/programs/run_cpc.jsp)

(4)sfold(http://sfold.wadsworth.org/)

8、统计学分析

所有的数据统计后用GraphPad Prism5(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)软件作图分析，数据统计表示为平均值±标准差，两组之间的差异性分析采用t检验，单因素多水平实验统计采用单因素方差分析(ANOVA)，动物存活率采用Kaplan-Meier survivalanalysis。所有的实验均重复三次，显著性差异表示为*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

实施例1、流感长链非编码RNA-lnc330的发现及性质确定

一、实验方法

1、BJ501病毒按照MOI＝0.1感染A549细胞，感染后24小时收取样品，提取RNA，同样收取对照组未感染病毒的A549细胞，送华大基因进行转录组测序(10G数据/样品)。经转录组数据表达分析，发现有2条源于流感NA基因的长链非编码RNA，长度330nt。

2、病毒RNA提取及反转录PCR实验

(1)根据说明书于收获的样本(BJ501病毒)中加入TRIzol并混匀，于室温作用10分钟；

(2)每1ml TRIzol液中加入200μl氯仿，涡旋混匀，室温静置3-5分钟，13000g，4℃离心，15分钟；

(3)将上清转移至新的EP管中，加入500μl异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，室温静置10分钟，12000g，4℃离心，10分钟；

(4)弃去上清，用75％乙醇重悬沉淀，7500g，4℃离心，5分钟；

(5)弃去上清，将沉淀静置于通风橱中风干；

(6)用一定量RNase Free dH₂O溶解RNA沉淀，按说明书用RNase-Free DNase I(Promega)消化基因组后利用NANO DROP定量RNA；

(7)按反转录试剂盒(TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix，全式金，货号AT301-03)说明书和试剂，将RNA反转录为cDNA；

(8)根据下列相应反应体系RT-PCR或PCR扩增目的基因；

表1 RT-PCR反应体系

表2 PCR反应体系

表1中的引物是试剂盒自带的引物。表2中的引物：

Lnc330上游引物：5’-TTACTTGTCAATGGTAAATGGC-3’；

Lnc330下游引物：5’-ATGAATCCAAACCAAAAGATAAT-3’。

3、5’和3’RACE(Rapid amplification of cDNA ends)实验

(1)细胞样品收集和RNA提取同第一部分(BJ501流感株流感病毒感染的A549细胞)，75％酒精洗两次，80％酒精洗一次，7500g离心5min，弃去酒精，晾干EP管内残余酒精后，每个样品加入20μl RNase-free H₂O。

RACE试验为Clontech Laboratories公司的SMARTer@RACE5’/3’试剂盒clontech：634858。

(2)去除RNA样品中DNA：

a)每个样品加入0.1体积10×TURBO DNase Buffer和1μl TURBO DNase至RNA中，轻轻混匀，37℃孵育20-30min；

b)加入0.1体积的Resuspended DNase Inactivation Regent(至少2μl)，轻轻混匀，室温(若低于22-26℃，移至金属浴中维持温度)，孵育5min，孵育过程中间或混匀；

c)10000g离心2min，将上清(RNA)转移至新的EP管内；

(3)RNA样品反转录：

a)按照以下反应体系进行RNA样品反转录：

将上述体系混匀，离心液体至管底，72℃ 3min，42℃ 2min，孵育后14000g离心液体至管底；

b)对于5’RACE体系，每个体系内再加入1μl SMARTER ⅡA oligonucleotide；

c)配制剩余反应体系：

5×First-Strand buffer	4μl
		DTT(100nM)	0.5μl
dNTP(20nM)	1μl
		Rnase Inhibitor(40U/μl)	0.5μl
Smart scribe Recerse Transcriptase	2μl
		Total	8μl

d)将8μl配制的剩余体系加入至步骤b)中的体系内，总体积为20μl，吹打混匀，离心液体至底部；

e)42℃ 90min，70℃ 10min在PCR仪中进行反转录；

f)使用Tricine-EDTA Buffer稀释反转录得到的cDNA，每管加入10μl Tricine-EDTA Buffer。样品置于-20℃备用；

(4)RACE PCR

3’RACE GSP1：5’-CAAATTACTTGTCAATGGTAAATGGC-3’；

5’RACE GSP 1：5’-ACCATTGGTTCGGTCTGTATG-3’；

5’RACE GSP 2：5’-GCGCCAGTTCTTCCTAAAAGGAAAG-3’；

3’RACE GSP 2：5’-GC AAAATGAATCCAAACCAAAAGATAAT-3’。

反应条件：

5cycles：

94℃ 30sec

72℃ 1min

20cycles：

94℃ 30sec

68℃ 30sec

72℃ 1min

二、实验结果

将BJ501感染A549细胞进行深度测序，排除宿主(A549)细胞表达基因，获得2条源于流感病毒NA基因的长链非编码RNA对应的DNA序列，长度为330bp(Lnc RNA序列分别为SEQID No.3及SEQ ID No.4，对应的DNA序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)。通过NCBI序列比对结果表明，SEQ ID No.1覆盖NA基因1-134位，1192-1286位，1310-1410位，SEQ IDNo.2覆盖NA基因1-134位，1192-1285位，1309-1410位。SEQ ID No.2与SEQ ID No.1在102位发生突变，SEQ ID No.2的102位是A，SEQ ID No.1的102位是C。将SEQ ID No.3及SEQ IDNo.4所示lnc RNA命名为Lnc330。

为了明确这些RNA的基本性质，通过Coding Potential Calculator预测Lnc330对应的DNA序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，均无潜在的编码能力(图1中A和B)通过sfold网站预测SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的二级结构(图2中A和B)。

利用Trizol提取流感病毒的RNA，并利用如下引物(Lnc330上游引物：TTACTTGTCAATGGTAAATGGC；Lnc330下游引物：ATGAATCCAAACCAAAAGATAAT)进行PCR扩增获得目的片段(SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)，并且连T挑选单克隆(图3)，测序验证目的序列。

为了进一步确认Lnc330的转录起始和终止位点，我们收集了流感株流感病毒感染的A549细胞，利用5’和3’RACE的方法对Lnc330进行克隆、测序检测，确定了Lnc330的全长序列为330nt(即SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)，且具有3’poly A尾(图4)

实施例2、流感长链非编码RNA-lnc330的抗流感作用研究

一、细胞水平实验

1、pcDNA3.1(+)-lnc330表达载体构建

a)通过PCR获得Lnc330序列(SEQ ID No.1)，通过测序确认全长正确无突变。

b)所用PCR引物中已加入酶切位点，上游酶切位点为BamHI，下游酶切位点为EcoRI，使用这两种限制性内切酶将Lnc330和pcDNA3.1(+)载体进行双酶切，胶回收后使用T4连接酶进行连接，使用DH5α感受态细胞进行转化，在Amp⁺(氨苄青霉素)固体LB培养平板上挑取单克隆菌落进行扩增，通过菌液PCR选取阳性菌落进行测序。

c)选取测序完全正确的菌液进行扩增，使用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒后保存至-20℃保存备用。

pcDNA3.1(+)-lnc330表达载体的结构描述如下：在pcDNA3.1(+)载体的酶切位点BamHI和EcoRI之间插入SEQ ID No.1所示DNA片段后得到的重组质粒。

2、细胞转染、病毒感染及鉴定

(1)病毒感染按照不同的MOI(0.1,1,3,5,10)分别感染MDCK、CNE-2Z与A549细胞。具体步骤如下：

(a)将MDCK、CNE-2Z与A549细胞按照每孔5×10⁴个铺到24孔板中；

(b)待12小时后，按照不同的MOI(0.1,1,3,5,10)配制感染溶液，溶剂为无血清的DMEM(公司Gibco，货号:11965-092)，加入(a)铺好的细胞中，孵育1小时；

(c)弃掉孵育的感染溶液，利用PBS(公司：Macgene货号：CC008)洗两遍，弃掉PBS洗液；

(d)配制含2％的胎牛血清(公司：Gibco,货号：15140071)的DMEM，按照每孔500微升加入(c)步骤的24孔板中。

(e)感染24小时后，加入500微升TriZol，室温放置10分钟；

(f)加入100μl氯仿，涡旋混匀，室温静置3-5分钟，13000g，4℃离心，15分钟；

(g)将上清转移至新的EP管中，加入500μl异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，室温静置10分钟，12000g，4℃离心，10分钟；

(h)弃去上清，用75％乙醇重悬沉淀，7500g，4℃离心，5分钟；

(i)弃去上清，将沉淀静置于通风橱中风干；

(j)用一定量RNase Free dH₂O溶解RNA沉淀，按说明书用RNase-Free DNase I(Promega)消化基因组后利用NANO DROP定量RNA；

(k)按反转录试剂盒(TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix，全式金，货号AT301-03)说明书和试剂，将RNA反转录为cDNA；

表3 RT-PCR反应体系

(k)按反转录试剂盒(TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix，全式金，货号AT301-03)说明书和试剂，将RNA反转录为cDNA；

利用TB Green Premix Ex Taq(公司TaKaRa，货号RR820Q)，实时定量PCR目的片段，采用2^-ΔΔt方法分析数据。实时定量PCR反应体系如下

表4 PCR反应体系

实时定量PCR所用的引物为：

GAPDH

上游引物：5'-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3'

下游引物：5'-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3'

Influenza M

上游引物：5'-AAGACCAATCCTGTCACCTCTG-3'

下游引物：5'-CAAAACGTCTACGCTGCAGTCC-3'

结果如图5所示，在不同的细胞中，流感感染24小时后，流感的复制是具有感染剂量依赖性的，感染浓度越高，复制量越高。

(2)用步骤1构建的Lnc330过表达质粒pcDNA3.1(+)-lnc330与载体质粒pcDNA3.1(+)，利用jetPRIME Transfection Reagent(公司：polyplus transfection，货号CatNo114-07)分别转染A549细胞、MDCK细胞、CNE-2Z细胞。转染24小时后，流感病毒BJ501按照MOI＝1感染转染的细胞。如图6分组：pcDNA3.1 Medium组为转染载体质粒pcDNA3.1(+)未感染病毒组；pcDNA3.1-lnc330 Medium组为转染过表达质粒pcDNA3.1-lnc330未感染病毒组；pcDNA3.1 BJ501组为转染载体质粒pcDNA3.1(+)感染病毒组；pcDNA3.1-lnc330 Medium组为转染过表达质粒pcDNA3.1-lnc330 BJ501感染病毒组。按照上述分组，感染24小时后，提取RNA，具体步骤如下：

(a)依据说明书于样品中加入TRIzol并混匀，于室温作用10分钟；

(b)每1ml TRIzol液中加入200μl氯仿，涡旋混匀，室温静置3-5分钟，13000g，4℃离心，15分钟；

(c)将上清转移至新的EP管中，加入500μl异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，室温静置10分钟，12000g，4℃离心，10分钟；

(d)弃去上清，用75％乙醇重悬沉淀，7500g，4℃离心，5分钟；

(e)弃去上清，将沉淀静置于通风橱中风干；

(f)用一定量RNase Free dH₂O溶解RNA沉淀，按说明书用RNase-Free DNase I(Promega)消化基因组后利用NANO DROP定量RNA；

(g)按反转录试剂盒(TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix，全式金，货号AT301-03)说明书和试剂，将RNA反转录为cDNA；

(h)根据下列相应反应体系RT-PCR或PCR扩增目的基因；

表5 RT-PCR反应体系

利用TB Green Premix Ex Taq(公司TaKaRa，货号RR820Q)，实时定量PCR目的片段，采用2^-ΔΔt方法分析数据。实时定量PCR反应体系如下

表6 PCR反应体系

内参GAPDH

上游引物：5'-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3'

下游引物：5'-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3'

Influenza M

上游引物：5'-AAGACCAATCCTGTCACCTCTG-3'

下游引物：5'-CAAAACGTCTACGCTGCAGTCC-3'

通过qPCR检测流感M基因与内参GAPDH的表达，检测流感的复制情况。

结果如图6所示，在不同的细胞中，过表达Lnc330，流感的相关基因M的复制量降低。

(3)利用TCID50的方法检测，过表达Lnc330细胞(A549细胞、MDCK细胞、CNE-2Z细胞)流感病毒的滴度，进而寻找Lnc330是否抑制病毒复制。具体步骤如下：

(a)将MDCK、CNE-2Z与A549细胞按照每孔3×10⁴个铺到24孔板中；

(b)12小时后待细胞贴壁，将Lnc330过表达质粒pcDNA3.1(+)-lnc330与载体质粒pcDNA3.1(+)，利用jetPRIME Transfection Reagent(公司：polyplus transfection，货号Cat No114-07)分别转染A549细胞、MDCK细胞、CNE-2Z细胞。

(c)转染24小时后，按照MOI＝1,配制感染病毒BJ50，溶剂为无血清的DMEM(公司Gibco，货号:11965-092)，加入(b)感染中，孵育1小时；

(d)弃掉孵育的感染溶液，利用PBS(公司：Macgene货号：CC008)洗两遍，弃掉PBS洗液；

(e)配制含2％的胎牛血清(公司：Gibco,货号：15140071)的DMEM，按照每孔500微升加入(c)步骤的24孔板中。

(f)待24小时后，将24孔板反复冻融，3000rpm，离心5分钟，取上清，弃细胞碎片。

(g)上清利用TCID50的方法测定病毒滴度。

结果如图7所示，按照MOI＝1感染过表达Lnc330的A549与正常(野生)型的A549，过表达组的流感滴度平均数为10^2.6，即为398.11，正常感染组为10^3.23，即为1698.24。因此过表达组的流感滴度是正常组对照的1/5。此外，我们也在MDCK与CNE-2Z细胞也做了尝试，与A549的结果相似，过表达组的流感滴度显著低于正常对照组。

(4)不同型别的流感转染A549细胞感染24小时，通过qPCR检测相关基因的表达，检测流感的复制情况。

具体步骤如下：

(a)用步骤1构建的Lnc330过表达质粒pcDNA3.1(+)-lnc330与载体质粒pcDNA3.1(+)，利用jetPRIME Transfection Reagent(公司：polyplus transfection，货号CatNo114-07)转染A549细胞。转染24小时后，按照MOI＝1，不同的病毒株(H1N1、H3N2、H7N9、H5N1)感染转染的细胞。如图8分组：pcDNA3.1 infection组为转染载体质粒pcDNA3.1(+)感染病毒组；pcDNA3.1-lnc330 infection组为转染过表达质粒pcDNA3.1-lnc330感染病毒组。按照上述分组，感染24小时后，提取RNA，具体步骤如下：

(a)依据说明书于样品中加入TRIzol并混匀，于室温作用10分钟；

(b)每1ml TRIzol液中加入200μl氯仿，涡旋混匀，室温静置3-5分钟，13000g，4℃离心，15分钟；

(c)将上清转移至新的EP管中，加入500μl异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，室温静置10分钟，12000g，4℃离心，10分钟；

(d)弃去上清，用75％乙醇重悬沉淀，7500g，4℃离心，5分钟；

(e)弃去上清，将沉淀静置于通风橱中风干；

(f)用一定量RNase Free dH₂O溶解RNA沉淀，按说明书用RNase-Free DNase I(Promega)消化基因组后利用NANO DROP定量RNA；

(g)按反转录试剂盒(TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix，全式金，货号AT301-03)说明书和试剂，将RNA反转录为cDNA；

(h)根据下列相应反应体系RT-PCR或PCR扩增目的基因；

表7 RT-PCR反应体系

利用TB Green Premix Ex Taq(公司TaKaRa，货号RR820Q)，实时定量PCR目的片段，采用2^-ΔΔt方法分析数据。实时定量PCR反应体系如下

表8 PCR反应体系

内参GAPDH

上游引物：5'-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3'

下游引物：5'-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3'

Influenza M

上游引物：5'-AAGACCAATCCTGTCACCTCTG-3'

下游引物：5'-CAAAACGTCTACGCTGCAGTCC-3'

通过qPCR检测流感M基因与内参GAPDH的表达，检测流感的复制情况。

结果如图8所示，不同型别流感的过表达Lnc330组的病毒复制量均显著低于正常组。

(5)利用TCID50的方法检测，检测不同的毒株(H1N1、H3N2、H7N9、H5N1)感染过表达Lnc330细胞(A549细胞)流感病毒的滴度，进而寻找Lnc330是否抑制不同毒株病毒复制。如图9分组：pcDNA3.1 infection组为转染载体质粒pcDNA3.1(+)感染病毒组；pcDNA3.1-lnc330 infection组为转染过表达质粒pcDNA3.1-lnc330感染病毒组。具体步骤如下：

(a)将A549细胞按照每孔3×10⁴个铺到24孔板中；

(b)12小时后待细胞贴壁，将Lnc330过表达质粒pcDNA3.1(+)-lnc330与载体质粒pcDNA3.1(+)，利用jetPRIME Transfection Reagent(公司：polyplus transfection，货号Cat No114-07)分别转染A549细胞。

(c)转染24小时后，按照MOI＝1,配制感染溶液(H1N1、H3N2、H7N9、H5N1)，溶剂为无血清的DMEM(公司Gibco，货号:11965-092)，加入(b)感染中，孵育1小时；

(d)弃掉孵育的感染溶液，利用PBS(公司：Macgene货号：CC008)洗两遍，弃掉PBS洗液；

(e)配制含2％的胎牛血清(公司：Gibco,货号：15140071)的DMEM，按照每孔500微升加入(c)步骤的24孔板中。

(f)待24小时后，将24孔板反复冻融，3000rpm,离心5分钟，取上清，弃细胞碎片。

(g)上清利用TCID50的方法测定病毒滴度。

结果如图9所示，利用TCID50的方法检测，进行验证，发现Lnc330在不同程度上抑制不同型别流感的复制。

二、动物水平实验

为了研究Lnc330是否能够成为一个药物，在体内也有效果。我们进行了一系列体内的动物实验。载体介导的体内给药是现在新兴的给药方式，在众多病毒载体中，腺相关病毒具有很好的稳定性和可操作性，且其具有很好的靶向性。报道称腺相关病毒AAV2/9型能够靶向到小鼠的肺脏，为此，我们将Lnc330构建到AAV2/9型腺相关病毒载体上，通过滴鼻的方式，将AAV2/9-AVAN过表达至小鼠体内。三周后给予BJ501株流感病毒感染小鼠，连续观察感染后小鼠体重变化(n＝10)和死亡率(n＝10)14天。

1、Lnc330腺相关病毒载体构建

委托和元生物技术股份有限公司将Lnc330(SEQ ID No.1)构建到腺相关病毒载体(血清型为AAV2/9)上，载体名称为pAAV-EF1A-EGFP-CMV-Lnc330，克隆号为H5192。

2、小鼠感染实验

1)将Lnc330全长构建到腺相关病毒载体(pAAV-EF1A-EGFP-CMV-Lnc330 AAV2/9)上，通过滴鼻感染途径，按照每只4周龄C57BL/6小鼠(12g左右)给予1×10¹¹V.G/20μlLnc330腺相关病毒或对照载体病毒(未载有Lnc330的腺病毒，由和元生物技术股份有限公司提供)。

2)三周后，通过滴鼻感染途径，实验组小鼠给予剂量为10^5.125TCID₅₀的BJ501株流感病毒，终体积为20μl；对照组小鼠给予鸡胚尿囊液(AF，20μl)。

3、抗病毒效果检测

(1)定时检测小鼠表现以及体重变化，并统计死亡率。

结果显示，Lnc330过表达的小鼠在感染BJ501株流感病毒后体重降低较对照组明显减轻(图10)；从死亡率看，Lnc330过表达的小鼠在感染BJ501株流感病毒后存活率较对照组明显上升(图11)。整个观察期内，我们能够观察到感染BJ501株流感病毒后，Lnc330过表达的小鼠较对照组小鼠活跃，且立毛等感染症状都较对照组轻。由此可见，Lnc330能够有效缓解BJ501株流感病毒感染引起的小鼠体重降低程度并降低小鼠死亡率。

(2)小鼠肺部组织湿干比检测和小鼠器官病理检测及肺组织中浸润的炎性细胞计数

A.小鼠肺组织湿干比

1)感染后第5天，将小鼠的肺脏完整取出，迅速用PBS将肺脏表面的血渍清洗干净；

2)用滤纸将肺脏表面PBS及水迹吸干，称取小鼠肺脏湿重；

3)将肺脏置于68℃烘箱中烘烤48小时后称取干重；

4)计算湿重和干重比值，得出肺组织湿干比，以此评价肺组织水肿程度。

B.小鼠器官病理检测及肺组织中浸润的炎性细胞计数

1)感染后第5天，将小鼠的肺组织取出，迅速用PBS将肺组织表面的血渍清洗干净后，放入10％福尔马林中固定；

2)经48小时充分固定后，送至病理室进行病理组织切片并进行H&E染色；

3)将小鼠肺组织病理切片置于显微镜下观察，选取放大200倍视野，计数视野内肺组织中浸润的多核细胞及巨噬细胞。每个实验组分别随机选择100个视野进行计数后，统计各组观察到的细胞数目，计算其平均值和标准差，进行统计分析。

结果显示：在小鼠体内利用腺相关病毒过表达Lnc330三周后，给予BJ501株流感病毒感染，于感染后第5天观察小鼠(n＝3)肺组织病理及炎性细胞浸润情况。结果显示，Lnc330过表达后，小鼠在感染BJ501株流感病毒后肺部的炎症程度显著低于对照小鼠，主要表现在Lnc330过表达小鼠的肺部结构较对照组小鼠完整，出血较少，且炎性细胞浸润显著低于对照组(图12和图13)。进一步检测了Lnc330过表达小鼠和对照小鼠感染BJ501株流感病毒后第5天肺部水肿程度(n＝6)。结果显示Lnc330过表达后，小鼠肺部湿干比显著低于野生型小鼠，这表明Lnc330过表达后小鼠的肺部水肿程度较低(图14)。

上述结果说明Lnc330能够缓解病毒介导的小鼠急性肺损伤，改善其肺部情况。

(3)小鼠肺脏病毒滴度检测

1)感染后第5天，于无菌条件下将小鼠的肺脏完整取出置于研磨管中，按比例加入含有100U/ml青-链霉素双抗的DMEM培养基(不含血清)，冰水浴中将组织研磨成混悬液；

2)4℃离心，3000转/分钟，20分钟；

3)将上清小心吸出置于2.0ml冻存管中，保存于-80℃待检；

4)组织液中的病毒滴度(TCID₅₀)利用MDCK细胞标定，计算方法为Reed-Muench法(参考Erich Hoffmann，A DNA transfection system for generation of influenza Avirus from eight plasmids.(2000),vol.97,6108-6113.)；

5)实验过程皆保持无菌。

结果显示：过表达Lnc330三周后，给予BJ501株流感病毒感染，于第5天取小鼠(n＝6)的肺脏进行研磨，取研磨液进行病毒滴度(TCID₅₀)测定，发现Lnc330处理组的病毒滴度明显小于对照组(图15)。这表明Lnc330能够帮助宿主清除流感病毒，抑制流感病毒在小鼠体内复制。

小结：

在本发明的研究中，我们在发现来自流感本身的Lnc330并且可以显著抑制流感病毒复制，其研究小结如下：

1、通过对流感感染A549细胞样品进行测序，获得病毒本源的Lnc330的序列特征及结构；

2、在不同的细胞系中，过表达Lnc330，发现均能抑制甲型H1N1的流感病毒复制；

3、小鼠体内实验中，Lnc330对流感病毒介导的急性肺损伤就有缓解作用，Lnc330有效控制流感病毒在肺部的载量。

本发明针对流感自身基因NA设计的长链非编码RNA——Lnc330可以作为一种潜在的抗流感病毒药物。

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 流感长链非编码RNA-lnc330及其应用

<130> GNCLN191673

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 330

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

ttacttgtca atggtaaatg gcaactcagc accgtctggc caagaccaac ccacagtgtc 60

actgtttaca ccacaaaagg atatgctgct cccgctagtc ccctctgatt agttcaaccc 120

agaagcaagg tcttatacaa tccagccctg ttagttctgg atgctgaaca aaactcccgc 180

tatatcctga ccactctgat tttgattccc aagttgaatt gagtggctaa tccatattga 240

gattatgttt ccaatttgta atattaagtt agccattcca attgtcatac agaccgaacc 300

aatggttatt atcttttggt ttggattcat 330

<210> 2

<211> 330

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

ttacttgtca atggtaaatg gcaactcagc accgtctggc caagaccaac ccacagtgtc 60

actgtttaca ccacaaaagg atatgctgct cccgctagtc cactctgatt agttcaaccc 120

agaagcaagg tcttatacaa tccagccctg ttagttctgg atgctgaaca aaactcccgc 180

tatatcctga ccactctgat tttgattccc aagttgaatt gagtggctaa tccatattga 240

gattatgttt ccaatttgta atattaagtt agccattcca attgtcatac agaccgaacc 300

aatggttatt atcttttggt ttggattcat 330

<210> 3

<211> 330

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

uuacuuguca augguaaaug gcaacucagc accgucuggc caagaccaac ccacaguguc 60

acuguuuaca ccacaaaagg auaugcugcu cccgcuaguc cccucugauu aguucaaccc 120

agaagcaagg ucuuauacaa uccagcccug uuaguucugg augcugaaca aaacucccgc 180

uauauccuga ccacucugau uuugauuccc aaguugaauu gaguggcuaa uccauauuga 240

gauuauguuu ccaauuugua auauuaaguu agccauucca auugucauac agaccgaacc 300

aaugguuauu aucuuuuggu uuggauucau 330

<210> 4

<211> 330

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

uuacuuguca augguaaaug gcaacucagc accgucuggc caagaccaac ccacaguguc 60

acuguuuaca ccacaaaagg auaugcugcu cccgcuaguc cacucugauu aguucaaccc 120

agaagcaagg ucuuauacaa uccagcccug uuaguucugg augcugaaca aaacucccgc 180

uauauccuga ccacucugau uuugauuccc aaguugaauu gaguggcuaa uccauauuga 240

gauuauguuu ccaauuugua auauuaaguu agccauucca auugucauac agaccgaacc 300

aaugguuauu aucuuuuggu uuggauucau 330

Claims (9)

1.长链非编码RNA，为如下任一：

（a1）SEQ ID No.3所示的RNA；

（a2）SEQ ID No.4所示的RNA。

2.能够转录成权利要求1所述长链非编码RNA的DNA；

所述DNA为如下中任一：

（b1）SEQ ID No.1所示的DNA；

（b2）SEQ ID No.2所示的DNA。

3.含有权利要求2所述DNA的表达盒、重组载体或重组菌。

4.权利要求1所述的长链非编码RNA或权利要求2所述的DNA或权利要求3所述表达盒、重组载体或重组菌在制备抗流感病毒产品中的应用。

5.权利要求1所述的长链非编码RNA或权利要求2所述的DNA或权利要求3所述表达盒、重组载体或重组菌在如下任一中的应用：

（C1）制备能够抑制流感病毒复制的产品；

（C2）制备能够减轻流感病毒介导的急性肺损伤的产品。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述流感病毒为H1N1亚型流感病毒、H3N2亚型流感病毒、H7N9亚型流感病毒或H5N1亚型流感病毒。

7.一种产品，其有效成分为权利要求1所述的长链非编码RNA；所述产品具有如下功能中的至少一种：

（D1）抗流感病毒；

（D2）抑制流感病毒复制；

（D3）减轻流感病毒介导的急性肺损伤。

8.一种产品，含有权利要求2所述的DNA或权利要求3所述表达盒、重组载体或重组菌；所述产品具有如下功能中的至少一种：

（D1）抗流感病毒；

（D2）抑制流感病毒复制；

（D3）减轻流感病毒介导的急性肺损伤。

9.根据权利要求7或8所述的产品，其特征在于：所述流感病毒为H1N1亚型流感病毒、H3N2亚型流感病毒、H7N9亚型流感病毒或H5N1亚型流感病毒。

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