具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合说明书附图和本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例中未注明具体技术或条件者,均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1
急性肺损伤大鼠模型的建立和取样:7日龄新生SD大鼠,体质量10-14g;随机分成两组,假手术组(正常对照组)和急性肺损伤组,每组8只;假手术组不再做任何处理;急性肺损伤组气管滴注LPS(5mg/kg);ASIC1a组是在急性肺损伤组基础上,提前24h尾静脉注射PcTx-1(25μg/kg)。将各组大鼠用4%水合氯醛麻醉下,打开胸腔,取肺组织立即放入液氮冷冻保存。
实施例2
高通量测序及数据分析:
2.1组织总RNA提取及质检
(1)取适量组织(50-100mg)于匀浆器壶部,加入1ml Trizol裂解液,并用剪刀剪碎组织,然后在冰上用匀浆器匀浆至肉红色,冰上裂解10min;
(2)将组织悬液转移至1.5mlEP管中,颠倒混匀10下,室温静置5min;
(3)加入细胞悬液五分之一体积的预冷的氯仿,剧烈震荡1min后于冰上静置10min,于4℃下以12000rpm的转速离心30min;
(4)转移上层水相到新EP管中新的去RNA酶的EP管中(注意避免触及中间层),加入等体积预冷的异丙醇,颠倒混匀,-20℃助沉1h,于4℃下以12000rpm的转速离心30min;
(5)弃上清,加入预冷的无水乙醇1ml,涡旋振荡,洗涤RNA沉淀;
(6)于4℃下以7500rpm的转速离心10min,弃上清,打开超净台风机干燥5min,晾干后,加入适量DEPC水充分吹打溶解沉淀。
RNA质量检测标准,使用Thermo Nanodrop 2000分光光度计测量RNA浓度和OD260/OD280的值,OD260/OD280值小于1.8提示存在蛋白等污染,介于1.8与2.1之间,蛋白纯度较好,大于2.1,提示RNA降解过多,最终结果表明RNA纯度较高,无蛋白质或DNA等污染。
2.2circRNA测序检测
(1)全转录组测序建链特异性文库流程,包括Ribo-Zero Deplete and FragmentRNA、Synthesize First Strand cDNA、Synthesize Second Strand cDNA、纯化、Adenylate3'Ends、Ligate Adapters、纯化、Enrich DNA Fragments、纯化、文库质检;
(2)原始测序数据及质量控制
原始测序数据及评估,高通量测序得到的原始图像数据文件经碱基识别(BaseCalling)分析转化为原始测序序列,被称为Raw Data或Raw Reads,结果以FASTQ文件格式存储,其中包含测序序列(reads)的序列信息以及其对应的测序质量信息。测序得到大量的样本数据。鉴于数据错误率对结果的影响,对原始数据进行质量预处理,并对整个质控过程中的reads数进行统计汇总。
测序序列质量评估,包括碱基质量分布和GC含量分布。
circRNA测序序列评估,包括测序饱和度分析、测序随机性评估、Reads在不同元件的富集分析、基因覆盖度分析、Reads在参考基因组上的分布。
(3)circRNA鉴定、注释、定量
测序序列使用CIRI软件进行circRNA预测,将预测结果与现有circRNA数据库比对,得到己知cricRNA和预测的cricRNA;在circRNA预测方面,主要基于数据库中释放的蛋白编码基因及转录本的注释信息,通过位置信息比对,获取与circRNA在位置上有着最大重叠的转录本,基于该转录本信息,对circRNA的序列进行预测。
CircRNA的注释主要是与已知数据比较、circRNA来源基因注释、circRNA基因结构分析。
circRNA的定量:用RPM对circRNA进行定量,对各样本circRNA表达量及丰度(RPM)进行统计。
2.3差异表达circRNA分析
利用CircSeq数据比较分析两个样品中同一个circRNA是否存在差异表达的时候,可以选取两个标准:其一,foldChange,即两组样品中同一个circRNA表达水平的变化倍数;其二,pvalue或FDR,FDR值的计算方法先要对每个circRNA进行pvalue的计算,再用FDR错误控制法对pvalue作多重假设检验校正。其中,定位于染色体18(染色体上的位置:65825830|65841509)的一circRNA上调差异表达明显,具体序列如下:
SEQ ID NO.1:
CCAAGTGGTAAGAAGTTCAGAAGTAAACCGCAGCTGGCGAGATACCTGGGAAATGCTGTTGACCTTAGCAGTTTTGACTTCAGAACCGGCAAGATGATGCCTAGTAAATTACAGAAGAACAAACAGAGGCTGCGGAACGATCCCCTCAATCAGAACAAGGTTGGTAAATGTACTTGTAATGTGGACATGCACTTCCTAGGCTCTCCACCAGTGTTTCATGTTGTGTTTGGGTTGTGATCTTGGTTGGCTGAAAATGTCTCTCCCTACTACAGAGCCTTTTAAAACTTACAAGTGAGACTTATGTTTCTATATTTGGAAGTGCTTGGAAAAATGTGTTAAGTAATTGTGCATAGTAGAAAACAATATTTCAGTATGTCATTAGGCCAACATGGGCACCAACCACACTTTGTGACTTTCTCTTTTTTCTTTCATTCATTCATTCATTCATTCATTCATTCATTCATTCATTCATTTTTCAAGATACGGTTTCTCTGTGTAGCCCTTGTTATCCTGAAACTCATTCTGTAGACCAAGCTAGCCTGTAACTCAAAGATATCCCTGCTTTTTCCTCCCAAGTGCTTGTATTAAAGGCGTTCATCATCACCATTTATCTGGCTTGTTTTTTTCTTAATTTTTTTTTCTATTTCCTAAAAAGAGGCAACATTCCCACATAGTGTATTGTGTCTAATTTTATAGTTAGTTCAGAAGTTGTGCCTTTGACGGTGATGACACCTACCCGTAGACATCACTGTTCTCGTCAGGTTTCACGAGCTCTAAATTTTCTTGAACTTGTTGCTTGACTATTCTGTAGCAATATAAATAAGTTACATTTGAATATGTTAATTTAATTTGAGGCTTTAGAATCTTTTTTTTTTTTTAAAAGCTTCTGTTCTTCCAAGGACAACTGGCCATGTATGACCCACAGATGACGCATTGCCTTGCATGGTTCCTCTAAGTATGTTCTCACCTCAGCACTGAGACAGGAGCTGAGGTGAAGTCACTGCAGGTTCCTCAGGGATTTCAGGGACTTTGTTATCAGTTGTGAAAGGGCTTCATTTCTGTACATTTAGGAGTCTGTCTGTGTGTTACCATCAACACACTTTCTCCCTCAGGCTTGTGAAGTTCAGGGTGAAAAGCAGAGGCATTTCTTAGGCTCTGACTGCTGTGGCCGGCCAGAGCCTCAGTGTGCAGTCCTGAGGAAGCAGGCTGTGGGCTCAGGCGGGCGGGCTATGCTGGGTTTCAGCAGCTACACTCACTCACACACAACATTCTTACTCTGAAGGCCCGAGGCCTTTTGTAGAATTGGGCAAGAAAACTCCTATAGCTTTATCATGAGAAAATACAGTGGGAATTTACATAAAAACATTTAACAAAGTATTGACCCATGCTATTTTCCTTTTTTTCAAACTGCCCTTTCCTTCCTTAAGGGGCAGCCACCTTCTGAGCACCGAGCCATCCTGCTTAACATGGCGTCCGGTGTAGGAAGCTTTCTGGTTCAAGCTCTTTATCTCATTTTTTTGTTTTTGTTTGTTTTTGTTTGGAATACACAAACTCACACACACATCATGTGCGTGTGTGTAATATATTGATGGATATAGCGACTACATTTTTCTAGAACTGCTGCTGTAAACTCTAGTTATAGCACTGCCTGCATGCCTTAGAAGGACTTACATATTTATGAAATGAAGAGAATGTGTTTAGATTACCCTGCTGTGCCCAGAATCACAGTTTAGCCTCCTTTAATGTAATTTGAAGCTTTACGTCCTGACAGTTATGGTTCGTTAAACCCCAACACTAATTGGTCTCTAGTTTGTGTGCACCCTTCTGCTCTAGCCGCTCTGGACCGCTCTTCACCCCGCAGCATGGCATGCGCTTTCGGGATCTGCTTGCTTCTGTGCTGTTTCCTCTGCTTGGAATGTGCTCCCCTCCCCCTCACCCGGTGACCTCCTCAGCTGAGGCTCAGCTCCATTGCCTGCATACCGGGGAATCCTGTCCCTCCCTCCGAGATGACCATGTGCTTCAGCTAGACTGTGAGCTCCACGAGAGCAGGACTCTTTGCTTTGTTGTTTTGTGTAGTTGCCCCAAACCTTGCACGTAGTAGCCTATTAAATAAATACTGCTTTACTCTCCATTTGATTCTAGAAGGGTGTAGTGATAATAAATGCTTATTCAATAAATGTGTACAACACGCGTGTGGAGGTGCCGGTTGTTTTCATTGTTTTCCACTGTGTGAAGGTTGTGCTGCCTGGTCTACCTTGACCTGAGTTTTGTTTTAGGGAAGTAGCCACAGTTTTACAAGCAGACTTGCTTTGGGAGTGACACTATCATTCCAAGCAGGAAAATGTGGTAAAATGAAGTTGTTTTTCATGACGCGCTGAGTAAAGAAAACTGGGAATGACAAGTGGCAGACAGAAATCTCAGTATGCAGCAAGCTTGGTCAGGGGTAATTACTCATTGGGTACTTTCCTTTTTTTAAGTTTTTACAAGAGGTTTTCTTCTTAGAACTGGGGATATAGTCAACAAGGAAGGAAGGTTTTAAACAGGATTAACCGACTGTAAGTTGATCTTAACGTCTGTCTTCTGTATTATTGCTAATGAATGGTTATTTTCAAGTATCATTAGAAGGACCCCTCTGAAGATCTTCACCAGCGCCCTTCAGTCATCCTCCGGTGGGCGGGAAGGGAGCTGGGCATTGCCCTTGGATTAACACACTGCAGGTTTTGTACCTGTTTTGCTTTTCTCAAATTTAGTCTTAATCTAGCCCTCAAAGTTGATTGCATTCTTGATTTGATTACACTTTATTGATTTTTCTTGCTACTGCTATAATTATTTGCAGACAACCTATCTCTCAAGCTGATAAAATCCATCTGAGATACCAAGTTACTGAGGCTCTCACTAGGGTTAATGGGAGCGGCTGACTCAGAATAATAGGAAGTGGCCAACTTGAGTGTGGTGAAGTCATAGCAGTTTGACCCCAGTGGAGCATTCTGGGATGGAATTGTGGTAGCTTTAGCCACACATGTGACCAATACGCAGTTACATATGCGTGGACTCCTTGGATTTCTAGAATGAGAAGGCAAAGCTTCAAATACTCACACAGACACACACACACACACACACACACACACACACACGCACACACACATTTAGACTTTTAAGACATATTTCAAATTTCAGAGATAGGATTTGACATTTTAAGGAGGCAGTGGAGACAAGATGGTAATTTCGGGTGACTGAGATGGCTGAGCAGTTGAAGGCCCTTGCTGCCAAATCTGATGACATGAGTTTCATTCCCATGACCCATGTAAAGATGGAGAGAGAGAGAGATCACACACACGCACACACATATACACATGTACGTACACATGCATGCACACACATGCACACACATGTACACAGATGCACACACATACACATGTATACACACATACACATGTACACACACATACACATGTACACACATGCATGCATACAGAGTGGGGGAGGGAGACTGGGAGGAGAGAGAAAATATAAACAATATAAAACTAAGATAATGTCTAAAGCTGACGTGGAGATATTCTAGGATGAGCCGCATTAGGTTGTTTGTACAAAGCAGGCTTAGGGAACTTTGGAAACTTGGTTCTGTTAGAAATTCTACATTAAGCTGAATTCCTTATGTTTCTGTCTTTTAATACTACAGTATTAATGGAATATCATAACGAAGCTGCAGAACTTAAATGCACATGTCCTGACCTTGATGTGGTCTGCGATAGATTTTGCAGGTTGCTTACAATAGACATGTGGACCCAGTCTTCCTGAGTGAACTTGAGAGCACTGCTGTAGCCTTAGAAGGTGCCACTCTGTGCCTGGCCTGTTCCTCTGGGTGAGGTCAGGTCTGTGTCAGATCTGCCACTCTTCATTTCTCATGGGCCATCTCCTGTAGTGTGCATAGTCAGTATGTCATTGTGCATACAGGCACAGACTTAGATTATGTATGACCGACTGTATCCTAGATTTTTAGACACACGGAGAGGATACATGTTTCAATTATCCTCATGAAATAATAAAAATTGCACTTAAGCTCAGTAGTGTAATTTGGAGGCAGTTACTGTGTAGCTAGTGGATAGCTAGCCTTTGGGTTAGGCAGCATGCACTGTGGAGAAGCATGCAGCGTGCAGCATTGCAAGCGGGCGAAGCTGGAAAGGCACAGTGCTAGCTGGGCTCTTTGAGTCCAGAAAGCAGCAGCCCTGAATTAGTGCTGTGGCAGGAGGCCTGGGAAGGGGGAATCGAGAAGTGAGTAGATTTAAGTGCCTGCTGGTTACAGCGAAAGGGAATTGATGCTTCCTAAAATTGTGGCTTTGGTCACTGCTGCAGTTTGGGTATACTTTGTCTCCTAAAAGTTCTTGTCTGGAGACGTGGCCCTCAGTACTGTGATTTTGAAGCGGATGGGGTGGCCCAGTGGAAAGTGACCAAGTCATAGGGTTCCATTTTTATAATGGATTAACGCCACCCTTGGAGGGAGCATTGTGGCTTTCACAGGCATTCCTCTAACGGAGAGCTGTAATAAAAAGATCAAGCCCAGCCTTTTCCTTCTCTCGCTTCTCTGTTTGCATACCTGTCCCCTTGCTGGCACCATGCTGTCTAGCCAAATAAAGCCCTAAGTTGCCTGAGCCCTAGGTATTTTGCTTAGCAACAGCCAGTTGAGTCTTTCAAGAAATAGAATGGCTGCTGCTGAAGGGTTGACCAAAGAAGACAAAACTTTATTGAGTTTGACATTTTAATTACCCTTCTTTTGAGACAGGGTGTTTCTACATAACTTTCACTGTCCTGGAACTCATTATGCAGACCCAGGCCAGCCTTGAACACAGATCCATTTGCCTCTGATTACTGGGAACTGAGATTAAAGGTAGCAAATATCAGCATAGGAAGCTTTAATTAGCTCTGAGCACTAGGTTTTGTGGGGACAGAAGCCAGGTTGGATTGTAATGTGAAATTGGACAGCAAGGACAGCTATTCAGTAA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2.4差异表达circRNA作为miRNA海绵的功能分析
circRNA的一个重要作用机制是发挥miRNA海绵功能,结合miRNA反应元件(miRNAresponse element,MRE),调控基因表达,影响疾病的发生、反应发展。
利用预测软件对上述circRNA与miRNA的结合位点进行分析,结果显示本申请保护的circRNA有19个MRE:
rno-miR-132-3p、rno-miR-219a-2-3p、rno-miR-466b-4-3p、rno-miR-466b-3p、rno-miR-466b-5p、rno-miR-146b-5p、rno-miR-466c-3p、rno-miR-6216、rno-miR-206-3p、rno-miR-3473、rno-miR-466b-2-3p、rno-miR-293-5p、17_41438、17_41409、17_41456、17_41426、17_41422、rno-miR-212-5p、rno-miR-127-5p。
采用Cytoscape绘制circRNA/miRNA关系图,结果如图1所示。
实施例3
3RT-PCR验证对照组和模型组中circRNA相对表达量。
1.模型建立
具体方法同实施例1,其中,假手术组(正常对照组)和急性肺损伤组每组8只。
2.实验方法
2.1组织总RNA提取
参考实施例2。
2.2引物设计
针对circRNA的环状闭合结构,设计背靠背引物(divergent primer),GAPDH作为内参,送往引物合成公司合成;
circRNA引物:
上游引物:5’-TGGTCCCCAAGAGATTCAACAG-3’(SEQ ID NO.2)
下游引物:5’-CATCATCTTGCCGGTTCTGAAG-3’(SEQ ID NO.3)
目标基因扩增长度:128bp。
2.3反转录
按照PimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time)RR037A(Takara)说明书配置反转录反应体系,首先将各试剂进行瞬离,使用移液器依次添加至去RNA酶的EP管中,充分混匀,将反应体系置于T100 Thermal Cycler梯度PCR仪内使RNA逆转录为cDNA,逆转录条件为:37℃15min,85℃5sec循环,最后4℃保存。
2.4RT-PCR验证样本中circRNA的表达情况
按照SYBR.Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)RR420A(Takara)说明书配置RTPCR反应体系,具体见下表;首先将各试剂瞬离,使用移液器依次添加至去RNA酶的EP管中,混合均匀,置于ABI 7500PCR仪进行qRT-PCR反应。
表2为RT-PCR反应体系
组分 |
体积 |
2x S6 Universal SYBR qPCR mix |
5μl |
上游引物 |
0.3μl |
下游引物 |
0.3μl |
cDNA模板 |
2μl |
ddH2O |
补足至10μl |
反应条件:预变性(95℃,30sec);变性(95℃,3-10sec);退火&延伸(60℃,10-30秒),循环数为40;融解曲线使用仪器默认程序即可。
2.5统计学分析
利用Graphpad Prism 7.00软件对实验数据进行统计分析;数据用均值士标准差表示;P小于0.05代表差异具有统计学意义,所有实验重复三次。
实时定量PCR扩增曲线整体平行性好,表明各反应管的扩增效率相近,扩增曲线拐点清楚,极限平而无上扬现在,曲线指数期斜率较大,说明扩增效率较高;样本扩增产物溶解曲线为单峰,表明扩增产物唯一,是特异性扩增;RT-PCR的相对定量公式:2-ΔCt×100%。结果显示:circRNA在急性肺损伤模型组中表达量明显高于正常组,差异具有统计学意义(P<0.001),是正常组的约1.8倍(具体结果见图2),在急性肺损伤的20例肺组织中70%表达趋势符合预期。RT-PCR验证实验结果与数据分析结果基本一致,显示circRNA是很好的辅助诊断分子标志物,可能具有很好的临床应用价值。
实施例4
1.研究对象
选取2021年3月-2022年3月10例ALI患者为观察组,同期10例呼吸内科诊断肺炎患者为对照组,两组年龄18-75岁。
2.纳入、排除标准(1)纳入标准:年龄≥18岁;观察组符合ALI诊断标准;接受支气管肺泡灌洗术患者;无肺结核。(2)排除标准:长期应用免疫调节剂者;长期使用激素者;白血病者;伴有恶性肿瘤者;妊娠期、哺乳期女性;未做支气管肺泡灌洗术者;急性心脑血管疾病者;肝肾功能严重不全者;药物或酒精依赖症者。
3.检测方法:两组均行支气管肺泡灌洗术,通常于局部麻醉后将纤维支气管镜插入右肺中叶或左肺舌段的支气管,将其项端契入支气管分支开口,经气管活检孔缓缓注入37℃灭菌生理盐水,每次30-50mL,总量100-250mL,不应超过300mL。每次注液后以-19.95~-13.30kPa负压吸出,要防止负压过大,过猛。分别收集于用硅油处理过的容器中,容器周围用冰块包围,并及时送检。记录回收液量,至少应回收30-40%以上。
合适的BALF应要求:(1)达到规定的回收比例;(2)不混有血液,红细胞数小于10%;(3)混有的上皮细胞小于3%。采用酶联免疫吸附法检测sTREM-1表达,采用实时定量PCR检测miR-127-5p、miR-3473、17-41409、17-41422表达。
4.统计学分析
利用Graphpad Prism 7.00软件对实验数据进行统计分析;数据用均值士标准差表示;P小于0.05代表差异具有统计学意义,所有实验重复三次。
实时定量PCR扩增曲线整体平行性好,表明各反应管的扩增效率相近,扩增曲线拐点清楚,极限平而无上扬现在,曲线指数期斜率较大,说明扩增效率较高;样本扩增产物溶解曲线为单峰,表明扩增产物唯一,是特异性扩增;RT-PCR的相对定量公式:2-ΔCt×100%。结果显示,人体急性肺损伤中miRNA表达趋势与大鼠急性肺损伤中miRNA表达趋势相同。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
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安徽医科大学
一种新 circRNA、试剂盒及用途
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人工序列(Artificial Sequence)
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