CN112969367A - 作为c3肾小球病模型的补体因子h基因敲除大鼠 - Google Patents

作为c3肾小球病模型的补体因子h基因敲除大鼠 Download PDF

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Abstract

提供了包含失活的Cfh基因座的大鼠细胞和大鼠，以及制备和使用这种大鼠细胞和大鼠的方法。包含失活的Cfh基因座的大鼠为C3肾小球病(C3G)的模型。提供了使用包含失活的Cfh基因座的大鼠来评估推定的C3G治疗剂的体内功效的方法。

Description

作为C3肾小球病模型的补体因子H基因敲除大鼠
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年9月13日提交的美国申请号62/730,690的权益，出于所有目的将其通过引用整体并入本文。
对通过EFS Web提交为文本文件的序列表的引用
写在文件536658SEQLIST.txt中的序列表为294KB，创建于2019年9月6日，通过引用并入。
背景技术
C3肾小球病(C3G)的特征在于作为C3肾病因子和/或补体基因突变的结果的替代途径(AP)补体激活的过度激活。大约50％的患者在诊断后10年内会发展为终末期肾病(ESRD)。肾脏移植后的复发率约为80-90％。当前没有FDA批准的C3G治疗方法，也没有攻击C3G病因的疗法。
补体因子H缺乏的(Cfh-/-)小鼠已被用于实验研究，以了解C3G的潜在机制。但是，ESRD在Cfh-/-小鼠中可能需要几个月的时间才能显现，因此需要长期的临床前研究以评估新的治疗方法。需要更好的C3G模型。
发明内容
提供了包含失活的Cfh基因座的大鼠、大鼠细胞和大鼠基因组，以及制备和使用这种大鼠、大鼠细胞和大鼠基因组的方法。还提供了包含使大鼠Cfh基因失活的靶向基因修饰的大鼠Cfh基因、用于使大鼠Cfh基因失活的核酸酶试剂，其中所述核酸酶试剂靶向并切割所述Cfh基因中的核酸酶靶位点，及其制备这种大鼠Cfh基因的方法。
在一方面，提供了包含失活的内源Cfh基因座的大鼠。可选地，内源Cfh基因座的起始密码子在失活的内源Cfh基因座中被突变或缺失。可选地，在失活的内源Cfh基因座中缺失内源Cfh基因座的起始密码子。可选地，在失活的内源Cfh基因座中缺失内源Cfh基因座的第一外显子中的编码序列。可选地，在失活的内源Cfh基因座中缺失在内源Cfh基因座中的第一内含子中的剪接供体位点。
在一些这样的大鼠中，该大鼠为雄性的。在其它这样的大鼠中，该大鼠为雌性。在一些这样的大鼠中，该大鼠对于失活的内源Cfh基因座是纯合的。在其它这样的大鼠中，该大鼠对于失活的内源Cfh基因座是杂合的。
一些这样的大鼠具有一种或多种C3肾小球病(C3G)的症状。与野生型大鼠相比，一些这样的大鼠具有降低的循环C3水平。可选地，循环C3水平小于约200μg/mL。可选地，循环C3水平小于约100μg/mL。可选地，与野生型大鼠相比，年龄在约7周至约17周之间的基因修饰的大鼠具有降低的循环C3水平。
与野生型大鼠相比，一些这样的大鼠具有升高的血尿素氮水平。与野生型大鼠相比，一些这样的大鼠具有升高的血尿素氮水平、升高的血清胱抑素C水平，或升高的尿白蛋白水平。与野生型大鼠相比，一些这样的大鼠具有升高的血尿素氮水平、升高的血清胱抑素C水平，和升高的尿白蛋白水平。可选地，血尿素氮水平大于约10、大于约20、大于约30、大于约40、大于约50、大于约60、大于约70、大于约80、大于约90，或大于约100mg/dL。可选地，血清胱抑素C水平大于约1000、大于约1100、大于约1200、大于约1300、大于约1400、大于约1500、大于约1600、大于约1700、大于约1800、大于约1900，或大于约2000ng/mL。可选地，每天的尿白蛋白大于约1000、大于约2000、大于约3000、大于约4000、大于约5000、大于约6000、大于约7000、大于约8000、大于约9000，或大于约10000μg/天。可选地，尿白蛋白与尿肌酐之比大于约100、大于约200、大于约300、大于约400、大于约500、大于约600、大于约700、大于约800、大于约900、大于约1000、大于约1100、大于约1200、大于约1300、大于约1400、大于约1500、大于约1600、大于约1700、大于约1800、大于约1900，或大于约2000μg：mg。可选地，与野生型大鼠相比，年龄在约7周至约17周之间的基因修饰的大鼠具有增加的血尿素氮水平。可选地，与野生型大鼠相比，年龄在约7周至约17周之间的基因修饰的大鼠具有升高的血尿素氮水平、升高的血清胱抑素C水平，或升高的尿白蛋白水平。
与野生型大鼠相比，一些这样的大鼠在肾脏中具有增加的C3沉积。可选地，与野生型大鼠相比，年龄在约7周至约17周之间的基因修饰的大鼠在肾脏中具有增加的C3沉积。与野生型大鼠相比，一些这样的大鼠在肾脏中具有增加的C5b-9沉积。可选地，与野生型大鼠相比，年龄在约7周至约17周之间的一些这样的大鼠在肾脏中具有增加的C5b-9沉积。
与野生型大鼠相比，一些此类大鼠具有增加的肾小球病变。可选地，与野生型大鼠相比，增加的肾小球病变包括增加的肾小球基底膜厚度、增加的足细胞足突宽度，或减少的足细胞足突数量。可选地，与野生型大鼠相比，增加的肾小球病变包括增加的肾小球基底膜厚度、增加的足细胞足突宽度，和减少的足细胞足突数量。可选地，与野生型大鼠相比，肾小球基底膜厚度的增加为至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、或至少约10倍，和/或基因修饰的大鼠中肾小球的平均肾小球基底膜厚度为至少约0.2、至少约0.3、至少约0.4、至少约0.5、至少约0.6、至少约0.7、至少约0.8、至少约0.9、至少约1.0、至少约1.1、至少约1.2、至少约1.3、至少约1.4、至少约1.5、至少约1.6、至少约1.7，或至少约1.8微米。可选地，与野生型大鼠相比，足细胞足突宽度的增加为至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍，或至少约7倍，和/或基因修饰的大鼠中肾小球中足突的平均宽度为至少约0.4、至少约0.5、至少约0.6、至少约0.7、至少约0.8、至少约0.9、至少约1.0、至少约1.5、至少约2.0，或至少约2.5微米。可选地，与野生型大鼠相比，足细胞足突数量的减少为至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍，或至少约3.8倍，和/或基因修饰的大鼠中每微米长度的平均足细胞足突数量小于约2.5、小于约2、小于约1.5、小于约1、小于约0.9，或小于约0.8。可选地，与野生型大鼠相比，年龄在约7周至约17周之间的基因修饰的大鼠具有增加的肾小球病变。
与野生型大鼠相比，一些这样的大鼠具有降低的寿命。可选地，基因修饰的大鼠的寿命中位数小于约150天。
在另一方面，提供了评估用于治疗C3肾小球病(C3G)的药剂的体内治疗功效的方法。一些这样的方法包括：(a)向任何上述基因修饰的大鼠施用药剂；(b)与未施用所述药剂的对照基因修饰的大鼠相比，评估已施用所述药剂的所述基因修饰的大鼠中C3G的一种或多种症状。可选地，步骤(b)包括评估以下一项或多项或全部：(i)循环C3水平；(ii)血尿素氮水平；(iii)C3在肾脏中的沉积；(iv)C5b-9在肾脏中的沉积；和(v)寿命。可选地，步骤(b)包括评估：(i)循环C3水平；(ii)血尿素氮水平；(iii)C3在肾脏中的沉积；(iv)C5b-9在肾脏中的沉积；(v)寿命；或(vi)其组合。可选地，步骤(b)包括评估：(i)循环C3水平；(ii)血尿素氮水平；(iii)血清胱抑素C水平；(iv)尿白蛋白水平；(v)C3在肾脏中的沉积；(vi)C5b-9在肾脏中的沉积；(vii)肾小球基底膜厚度；(viii)足细胞足突宽度；(ix)足细胞足突数量；(x)寿命；或(xi)其组合。可选地，所述基因修饰的大鼠的年龄在约7周至约17周之间。
在一些这样的方法中，步骤(b)包括评估循环C3水平，其中相对于对照基因修饰的大鼠，已施用所述药剂的基因修饰的大鼠中循环C3水平的增加表明了推定的C3G治疗剂的治疗效果。在一些这样的方法中，步骤(b)包括评估血尿素氮水平，其中相对于对照基因修饰的大鼠，已施用所述药剂的基因修饰的大鼠中血尿素氮水平的降低表明了推定的C3G治疗剂的治疗效果。在一些这样的方法中，步骤(b)包括评估血清胱抑素C水平，其中相对于对照基因修饰的大鼠，已施用所述药剂的基因修饰的大鼠中血清胱抑素C水平的降低表明了推定的C3G治疗剂的治疗效果。在一些这样的方法中，步骤(b)包括评估尿白蛋白水平，其中相对于对照基因修饰的大鼠，已施用所述药剂的基因修饰的大鼠中尿白蛋白水平的降低表明了推定的C3G治疗剂的治疗效果。在一些这样的方法中，步骤(b)包括评估C3在肾脏中的沉积，其中相对于对照基因修饰的大鼠，已施用所述药剂的基因修饰的大鼠中的C3在肾脏中的沉积水平的降低表明了推定的C3G治疗剂的治疗效果。在一些这样的方法中，步骤(b)包括评估C5b-9在肾脏中的沉积，其中相对于对照基因修饰的大鼠，已施用所述药剂的基因修饰的大鼠中的C5b-9在肾脏中的沉积水平的降低表明了推定的C3G治疗剂的治疗效果。在一些这样的方法中，步骤(b)包括评估肾小球基底膜厚度，其中相对于对照基因修饰的大鼠，已施用所述药剂的基因修饰的大鼠中肾小球基底膜厚度的减少表明了推定的C3G治疗剂的治疗效果。在一些这样的方法中，步骤(b)包括评估足细胞足突宽度，其中相对于对照基因修饰的大鼠，已施用所述药剂的基因修饰的大鼠中足细胞足突宽度的减少表明了推定的C3G治疗剂的治疗效果。在一些这样的方法中，步骤(b)包括评估足细胞足突数量，其中相对于对照基因修饰的大鼠，已施用所述药剂的基因修饰的大鼠中足细胞足突数量的增加表明了推定的C3G治疗剂的治疗效果。在一些这样的方法中，步骤(b)包括评估寿命，其中相对于对照基因修饰的大鼠，已施用所述药剂的基因修饰的大鼠的寿命的延长表明了推定的C3G治疗剂的治疗效果。
在另一方面，提供了制备任何上述基因修饰的大鼠的方法。一些这样的方法包括：(a)将第一核酸酶试剂引入大鼠胚胎干(ES)细胞，所述第一核酸酶试剂靶向邻近内源Cfh基因组基因座的起始密码子的第一靶序列，其中所述核酸酶试剂切割所述第一靶序列，以产生包含失活的内源Cfh基因座的基因修饰的大鼠ES细胞；(b)将基因修饰的大鼠(ES)细胞引入大鼠宿主胚胎中；以及(c)在代孕母体中孕育大鼠宿主胚胎，其中所述代孕母体产生包含所述失活的内源Cfh基因座的F0后代基因修饰的大鼠。一些这样的方法包括：(a)将第一核酸酶试剂引入大鼠单细胞期胚胎，所述第一核酸酶试剂靶向邻近内源Cfh基因组基因座的起始密码子的第一靶序列，其中所述核酸酶试剂切割所述第一靶序列，以产生包含失活的内源Cfh基因座的基因修饰的大鼠单细胞期胚胎；以及(b)在代孕母体中孕育所述基因修饰的大鼠单细胞期胚胎，其中所述代孕母体产生包含所述失活的内源Cfh基因座的F0后代基因修饰的大鼠。
在一些这样的方法中，所述第一核酸酶试剂的第一靶序列在所述内源Cfh基因座的第一外显子、第一内含子或5'UTR中。可选地，所述第一核酸酶试剂是Cas9蛋白和指导RNA。可选地，所述第一靶序列包含SEQ ID NO：12或13。
在一些这样的方法中，步骤(a)还包括将第二核酸酶试剂引入所述大鼠ES细胞中，所述第二核酸酶试剂靶向邻近内源Cfh基因座的终止密码子的第二靶序列。在一些这样的方法中，步骤(a)还包括将第二核酸酶试剂引入大鼠ES细胞或大鼠单细胞期胚胎中，所述第二核酸酶试剂靶向邻近内源Cfh基因座的终止密码子的第二靶序列。可选地，所述第二靶序列位于所述内源Cfh基因座的倒数第二个内含子、倒数第二个外显子、最后一个内含子、最后一个外显子或3'UTR中。可选地，所述第二靶序列包含SEQ ID NO：14或15。
在一些这样的方法中，步骤(a)还包括将第二核酸酶试剂引入所述大鼠ES细胞中，所述第二核酸酶试剂靶向邻近内源Cfh基因座的起始密码子的第二靶序列，所述第二靶序列不同于所述第一靶序列。在一些这样的方法中，步骤(a)还包括将第二核酸酶试剂引入所述大鼠ES细胞或大鼠单细胞期胚胎中，所述第二核酸酶试剂靶向邻近内源Cfh基因座的起始密码子的第二靶序列，所述第二靶序列不同于所述第一靶序列。可选地，所述第一靶序列和第二靶序列侧接内源Cfh基因座的起始密码子。可选地，所述第一靶序列在所述内源Cfh基因座的第一外显子或5'UTR中，且所述第二靶序列在所述内源Cfh基因座的第一外显子或第一内含子中。可选地，所述第一靶序列包含SEQ ID NO：12，并且所述第二靶序列包含SEQID NO：13。任选地，步骤(a)还包括将第三核酸酶试剂和/或第四核酸酶试剂引入所述大鼠ES细胞，其中第三和第四核酸酶试剂分别靶向邻近内源Cfh基因座的终止密码子的第三和第四靶序列，且其中第三和第四靶序列是不同的。可选地，步骤(a)还包括将第三核酸酶试剂和/或第四核酸酶试剂引入大鼠ES细胞或大鼠单细胞期胚胎，其中第三和第四核酸酶试剂分别靶向邻近内源Cfh基因座的终止密码子的第三和第四靶序列，且其中第三和第四靶序列是不同的。可选地，所述第三和第四靶序列位于所述内源Cfh基因座的倒数第二个内含子、倒数第二个外显子、最后一个内含子、最后一个外显子或3'UTR中。可选地，所述第三和第四靶序列分别包含SEQ ID NO：14或15。
在一些这样的方法中，步骤(a)还包括将外源供体核酸引入所述大鼠ES细胞，所述外源供体核酸包含与内源Cfh基因座处的5'靶序列杂交的5'同源臂和与内源Cfh基因座处的3'靶序列杂交的3'同源臂，其中所述外源供体核酸被设计成突变或删除内源Cfh基因座的起始密码子。在一些这样的方法中，步骤(a)还包括将外源供体核酸引入所述大鼠ES细胞或所述大鼠单细胞期胚胎，所述外源供体核酸包含与内源Cfh基因座处的5'靶序列杂交的5'同源臂和与内源Cfh基因座处的3'靶序列杂交的3'同源臂，其中所述外源供体核酸被设计成突变或删除内源Cfh基因座的起始密码子。可选地，5'靶序列和3'靶序列侧接所述内源Cfh基因座的起始密码子。可选地，5'靶序列和3'靶序列侧接内源Cfh基因座的编码序列。
在另一方面，提供了包含失活的内源Cfh基因座的基因修饰的大鼠细胞。在另一方面，提供了包含失活的内源Cfh基因座的基因修饰的大鼠基因组。在另一方面，提供了大鼠Cfh基因，其包含使大鼠Cfh基因失活的靶向基因修饰。在另一方面，提供了用于使大鼠Cfh基因失活的核酸酶试剂，其中所述核酸酶试剂靶向并切割Cfh基因中的核酸酶靶位点。在另一方面，提供了制备包含失活的内源Cfh基因座的基因修饰的大鼠细胞的方法，包括将核酸酶试剂引入大鼠细胞中，所述核酸酶试剂靶向邻近内源Cfh基因组基因座的起始密码子的靶序列，其中所述核酸酶试剂切割所述靶序列，以产生包含失活的内源Cfh基因座的基因修饰的大鼠细胞。在另一方面，提供了制备包含失活的内源Cfh基因座的基因修饰的大鼠基因组的方法，包括使大鼠基因组与核酸酶试剂接触，所述核酸酶试剂靶向邻近内源Cfh基因组基因座的起始密码子的靶序列，其中所述核酸酶试剂切割所述靶序列，以产生包含失活的内源Cfh基因座的基因修饰的大鼠基因组。在另一方面，提供了制备失活的大鼠Cfh基因的方法，所述方法包括使大鼠Cfh基因与核酸酶试剂接触，所述核酸酶试剂靶向邻近内源Cfh基因组基因座的起始密码子的靶序列，其中所述核酸酶试剂切割所述靶序列，以产生失活的大鼠Cfh基因。
附图说明
图1A(未按比例)示出了用于靶向大鼠Cfh基因座的靶向方案的示意图。示出了指导RNA GU1、GU2、GD2和GD3的指导RNA靶序列的位置，以及外显子1、21和22的位置，以及ATG起始密码子和TAA终止密码子。还示出了对在大鼠ES细胞克隆AB5、AE1、AA8、BB7、BE6和HG6中删除的区域的描述。
图1B(未按比例)示出了用于筛选靶定的大鼠Cfh基因座的等位基因丢失(LOA)测定和下一代测序(NGS)测定的示意图。用于LOA测定的引物和探针包括rTUF、rTUP、rTUR、rTU2F、rTU2P和rTU2R，而NGS引物包括AmpF1、AmpF2、AmpR1和AmpR2。
图2示出了雄性和雌性Cfh基因敲除大鼠随时间的存活百分比。
图3示出了7周龄的雄性和雌性野生型和Cfh敲除大鼠中的循环C3水平。
图4示出了来自雌性野生型和Cfh基因敲除大鼠的冷冻肾脏切片中的C3和C5b-9的染色。组A-C分别是来自18周龄、17周龄和17周龄的雌性野生型大鼠的样品。组D-F分别是来自12周龄、17周龄和9周龄的雌性Cfh敲除大鼠的样品。
图5示出了来自15周龄的雌性野生型大鼠和三只分别为12周龄、13周龄和15周龄的雌性Cfh敲除大鼠(CFH KO大鼠1、CFH KO大鼠2和CFH KO大鼠3)的肾脏样品中的髓质和皮质组织的髓质和皮质组织的高碘酸-希夫(PAS)染色。
图6A和6B示出了雄性野生型和Cfh敲除大鼠的血尿素氮(BUN)水平(图6A)以及雌性野生型和Cfh敲除大鼠的血尿素氮(BUN)水平(图6B)，从7周龄开始至每只Cfh敲除大鼠死亡。在基线处，有10只雄性野生型大鼠、8只雄性Cfh敲除大鼠、9只雌性野生型大鼠和7只雌性Cfh敲除大鼠。
图7示出了补体途径的示意图，包括经典及凝集素途径以及替代途径。
图8A和8B示出了在雄性野生型和Cfh基因敲除大鼠(图8A)以及在雌性野生型和Cfh基因敲除大鼠(图8B)中的血清胱抑素C(sCysC)，从7周龄开始至每只Cfh基因敲除大鼠死亡。
图9A-9D示出了雄性和雌性野生型和Cfh敲除大鼠中的尿白蛋白测量值。图9A示出了雄性野生型和Cfh基因敲除大鼠中每天的尿白蛋白，图9B示出了雄性野生型和Cfh基因敲除大鼠中的尿白蛋白相对于尿肌酐的标准化(normalization)，图9C示出了雌性野生型和Cfh基因敲除大鼠中每天的尿白蛋白，图9D示出了雌性野生型和Cfh基因敲除大鼠中的尿白蛋白相对于尿肌酐的标准化。
图10A和10B示出了来自野生型大鼠的肾小球的肾小球毛细血管环(图10A)和系膜(图10B)的电子显微照片(12,000X)。
图11A和11B示出了来自Cfh基因敲除大鼠的肾小球的肾小球毛细血管环的电子显微照片。图11A的放大倍数为12,000X，图11B的放大倍数高于图11A。
图12A和12B示出了来自Cfh基因敲除大鼠的肾小球系膜的电子显微照片。图12A的放大倍数为12,000X，图12B的放大倍数高于图12A。
具体实施方式
定义
本文可互换使用的术语“蛋白质”、“多肽”，和“肽”包括任何长度的氨基酸的聚合形式，包括编码和非编码氨基酸以及化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸。该术语还包括已被修饰的聚合物，例如具有修饰的肽主链的多肽。术语“结构域”是指具有特定功能或结构的蛋白质或多肽的任何部分。
蛋白质被称为具有“N末端”和“C末端”。术语“N末端”是指蛋白质或多肽的起始，末端为具有游离胺基(-NH2)的氨基酸。术语“C末端”是指氨基酸链(蛋白质或多肽)的末端，其末端为是游离羧基(-COOH)。
本文可互换使用的术语“核酸”和“多核苷酸”包括任何长度的核苷酸的聚合形式，包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其类似物或修饰形式。它们包括单链、双链，和多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交，以及包含嘌呤碱基、嘧啶碱基，或其它天然的、化学修饰的、生物化学修饰的、非天然的，或衍生的核苷酸碱基。
核酸被称为具有“5'末端”和“3'末端”，因为单核苷酸通过使一个单核苷酸戊糖环的5'磷酸通过磷酸二酯键在一个方向上与其邻居的3'氧连接的方式反应生成寡核苷酸。如果寡核苷酸的5'磷酸未与单核苷酸戊糖环的3'氧连接，则将其称为“5'末端”。如果寡核苷酸的3'氧未与另一个单核苷酸戊糖环的5'磷酸连接，则将其末端称为“3'末端”。即使是较大的寡核苷酸内部的核酸序列也可被称为具有5'和3'末端。在线性或环状DNA分子中，离散元素被称为“下游”或3'元素的“上游”或5'。
术语“基因组整合”是指已被引入细胞以使核苷酸序列整合到细胞基因组中的核酸。可以使用任何方案将核酸稳定地掺入细胞的基因组中。
术语“靶向载体”是指可以通过同源重组、非同源末端连接介导的连接，或以任何其它重组方式引入细胞基因组中的靶向位置的重组核酸。
术语“病毒载体”是指重组核酸，其包含至少一种病毒来源的元件，并且包括足以或允许包装到病毒载体颗粒中的元件。可以将载体和/或颗粒用于将DNA、RNA，或其它核酸离体或体内转移到细胞中的目的。多种形式的病毒载体是已知的。
术语“野生型”包括具有在正常(相对于突变、患病，改变等)的状态或情景中发现的结构和/或活性的实体。野生型基因和多肽通常以多种不同形式(例如等位基因)存在。
术语“内源序列”是指天然存在于大鼠细胞或大鼠体内的核酸序列。例如，大鼠的内源Cfh序列是指天然存在于大鼠中Cfh基因座处的天然Cfh序列。
“外源”分子或序列包括通常不以该形式存在于细胞中的分子或序列。通常的存在包括在细胞的特定发育阶段和环境条件的存在。例如，外源分子或序列可以包括细胞内相应内源序列的突变形式，例如内源序列的人源化版本，或者可以包括与细胞内的内源序列相对应但形式不同(即不在染色体内)的序列。与此相对，内源分子或序列包括在特定环境条件下，在特定发育阶段的特定细胞中通常以该形式存在的分子或序列。
当在核酸或蛋白质的上下文中使用时，术语“异源的”表示该核酸或蛋白质包含在同一分子中并非天然同时出现的至少两个片段。例如，当涉及核酸的片段或蛋白质的片段使用时，术语“异源的”表示该核酸或蛋白质包含两个或更多个在自然界中彼此之间没有相同关系(例如结合在一起)的子序列。作为一个实例，核酸载体的“异源”区域是在另一核酸分子内或附着于另一核酸分子的核酸片段，其在自然界中不与另一分子相关联。例如，核酸载体的异源区域可以包括编码序列，该编码序列侧接在自然界中与该编码序列不相关联的序列。同样地，蛋白质的“异源”区域是在另一肽分子内或附着于另一肽分子的氨基酸片段，其在自然界中不与另一肽分子相关联(例如融合蛋白或带有标签的蛋白)。类似地，核酸或蛋白质可包含异源标记或异源分泌或定位序列。
术语“基因座”是指基因(或重要序列)、DNA序列、多肽编码序列的特定位置，或生物体基因组的染色体上的位置。例如，“Cfh基因座”可以指Cfh基因、Cfh DNA序列、CFH编码序列，或Cfh在生物体基因组染色体上的位置，已识别出这类序列存在于该生物体基因组染色体的何处。“Cfh基因座”可包含Cfh基因的调节元件，包括例如增强子、启动子、5'和/或3'非翻译区(UTR)或其组合。
术语“基因”是指染色体中编码产物(例如RNA产物和/或多肽产物)的DNA序列，并包括被非编码内含子打断的编码区和与5'和3'末端上的与该编码区相邻的序列，使得该基因对应于全长mRNA(包括5'和3'非翻译序列)。术语“基因”还包括其它非编码序列，包括调节序列(例如启动子、增强子，和转录因子结合位点)、多腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点、沉默子、隔绝序列(insulating sequence)，和基质附着区。这些序列可以靠近基因的编码区(例如在10kb之内)或在远处位点，并且它们影响基因转录和翻译的水平或速率。
术语“等位基因”是指基因的变体形式。一些基因具有多种不同形式，它们位于染色体上的相同位置或遗传位点上。二倍体生物在每个遗传位点具有两个等位基因。每对等位基因代表特定遗传基因座的基因型。如果在特定位点有两个相同的等位基因，则基因型被描述为纯合子，如果两个等位基因不同，则基因型被描述为杂合子。
“启动子”是DNA的调节区，其通常包含能够引导RNA聚合酶II在特定多核苷酸序列的适当转录起始位点起始RNA合成的TATA盒。启动子可以另外包含影响转录起始速率的其它区域。本文公开的启动子序列调节可操作连接(operably linked)的多核苷酸的转录。启动子可以在本文公开的一种或多种细胞类型(例如大鼠细胞、多能细胞、单细胞期胚胎、分化的细胞，或其组合)中具有活性。启动子可以是例如组成型活性启动子、条件启动子(conditional promoter)、诱导型启动子、时间受限的启动子(temporally restrictedpromoter)(例如发育调控的启动子(developmentally regulated promoter))，或空间受限的启动子(spatially restricted promoter)(例如细胞特异性或组织特异性启动子)。启动子的例子可以在例如WO 2013/176772中找到，其全部内容通过引用并入本文。
“可操作的连接”或“可操作地连接”是指两个或更多个成分(例如启动子和另一个序列元件)的并置，使得两个成分均正常起作用，并允许至少一个成分可以介导施加在至少一个其它组件上的功能。例如，如果启动子响应一种或多种转录调节因子的存在或不存在而控制编码序列的转录水平，则该启动子可以可操作地连接至编码序列。可操作的连接可以包括这样的序列，所述序列彼此连续或反式作用(例如，调节序列可以在一定距离处起作用以控制编码序列的转录)。
术语“变体”是指不同于群体中最普遍的序列的核苷酸序列(例如一个核苷酸不同)或不同于群体中最普遍的序列的蛋白序列(例如一个氨基酸不同)。
当涉及蛋白质时，术语“片段”是指比全长蛋白质短或具有更少氨基酸的蛋白质。当涉及核酸时，术语“片段”是指比全长核酸短或具有更少核苷酸的核酸。片段可以是，例如，N末端片段(即去除蛋白质的C末端的一部分)、C末端片段(即去除蛋白质的N末端的一部分)，或内部片段。
在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中，“序列同一性”或“同一性”是指两个序列中的残基，当在指定的比较窗口上比对以获得最大对应性时它们是相同的。当使用序列同一性百分比来表示蛋白质时，不相同的残基位置的不同之处通常为保守的氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基取代，并因此不改变分子的功能特性。当序列的不同之处为保守取代时，可以向上调整序列同一性百分比以对取代的保守性质进行校正。因这种保守取代而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调整的方法是众所周知的。通常，这涉及将保守取代计为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，在相同氨基酸的评分为1，非保守取代的评分为0的情况下，保守取代的评分为0与1之间的值。保守取代的得分的计算通过例如PC/GENE程序实现(加利福尼亚州，山景城，Intelligenetics)。
“序列同一性百分比”包括通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列(完美匹配残基的最大数目)而确定的值，其中为了两个序列的最佳比对，比较窗口中的多核苷酸序列的部分可以包括与参考序列(其不含添加或删除)相比的添加或删除(即空隙)。通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数，以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，然后将结果乘以100，以得到序列同一性百分比。除非另有说明(例如较短的序列包括连接的异源序列)，否则比较窗口是被比较的两个序列中较短的序列的全长。
除非另有说明，否则序列同一性/相似性值包括使用GAP版本10，利用以下参数获得的值：使用GAP权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵获得核苷酸序列的同一性％和相似性％；使用GAP权重8和长度权重2，以及BLOSUM62评分矩阵获得氨基酸序列同一性％和相似性％；或其任何等效程序。“等效程序”包括任何序列比较程序，当与由GAP版本10生成的相应比对进行比较时，对于所讨论的任何两个序列，所述序列比较程序针对所讨论的任何两个序列生成具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同百分比的序列同一性的比对。
术语“保守氨基酸取代”是指序列中通常存在的氨基酸被具有相似大小，电荷或极性的不同氨基酸取代。保守取代的实例包括用非极性(疏水)残基如异亮氨酸、缬氨酸，或亮氨酸取代另一个非极性残基。同样地，保守取代的例子包括一个极性(亲水)残基被另一个所取代，例如精氨酸和赖氨酸之间的取代、谷氨酰胺和天冬酰胺之间的取代，或甘氨酸和丝氨酸之间的取代。另外，保守取代的其它实例是用碱性残基例如赖氨酸、精氨酸，或组氨酸取代另一种碱性残基，或用一个酸性残基例如天冬氨酸或谷氨酸替代另一种酸性残基。非保守取代的实例包括将非极性(疏水)氨基酸残基，例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸，或蛋氨酸取代为极性(亲水)残基，如半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸和/或将极性残基取代为非极性残基。下文总结了典型的氨基酸分类。
表1：氨基酸分类
Figure BDA0003041521230000151
“同源”序列(例如核酸序列)是指与已知参考序列相同或基本相似的序列，使得其例如与已知参考序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％相同。同源序列可以包括，例如，种间同源序列和种内同源序列。同源基因例如通常通过物种形成事件(speciation event)(种间同源基因)或遗传复制事件(genetic duplicationevent)(种内同源基因)源自共同的祖先DNA序列。“种间同源”基因包括通过物种形成从共同祖先基因进化而来的不同物种中的基因。种间同源物(orthologs)通常在进化过程中保持相同的功能。“种内同源”基因包括通过基因组内的复制而相关的基因。种内同源物(paralogs)可以在进化过程中进化出新功能。
术语“体外”包括人工环境以及在人工环境(例如试管)内发生的过程或反应。术语“体内”包括自然环境(例如细胞或生物体或身体)以及在自然环境中发生的过程或反应。术语“离体”包括已经从个体体内移出的细胞以及在这种细胞内发生的过程或反应。
术语“报告基因”是指具有编码基因产物(通常是酶)的序列的核酸，当包含与异源启动子和/或增强子元件可操作地连接的报告基因序列的构建体被引入含有(或可以使其含有)该启动子和/或增强子元件的激活所必需的因子的细胞中时，该序列可被容易地和定量地测定。报告基因的例子包括但不限于编码β-半乳糖苷酶(lacZ)的基因、细菌氯霉素乙酰基转移酶(cat)基因、萤火虫荧光素酶基因、编码β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的基因，和编码荧光蛋白的基因。“报道蛋白”是指由报道基因编码的蛋白。
本文所使用的术语“荧光报道蛋白”是指基于荧光可检测的报道蛋白，其中荧光可以直接来自报道蛋白、报道蛋白在荧光底物上的活性，或具有结合荧光标记的化合物的亲和力的蛋白。荧光蛋白的例子包括绿色荧光蛋白(例如GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、eGFP、Emerald、Azami Green、单体Azami Green、CopGFP、AceGFP，和ZsGreenl)、黄色荧光蛋白(例如YFP、eYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP，和ZsYellowl)、蓝色荧光蛋白(例如BFP、eBFP、eBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv，Sapphire,和T-sapphire)、青色荧光蛋白(例如CFP、eCFP、Cerulean、CyPet、AmCyanl，和Midoriishi-Cyan)、红色荧光蛋白(例如RFP、mKate、mKate2、mPlum、DsRed单体、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-Monomer、HcRed-Tandem、HcRedl、AsRed2、eqFP611、mRaspberry、mStrawberry，和Jred)、橙色荧光蛋白(例如mOrange、mKO、Kusabira-Orange、Monomeric Kusabira-Orange、mTangerine，和tdTomato)，以及可以通过流式细胞方法检测到其在细胞中的存在的任何其它合适的荧光蛋白。
响应双链断裂(DSB)的修复主要通过两个保守的DNA修复途径发生：同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)。参见Kasparek&Humphrey(2011)Seminars in Cell&Dev.Biol.22:886-897，出于所有目的通过引用整体并入本文。同样，由外源供体核酸介导的靶核酸的修复可以包括两个多核苷酸之间交换遗传信息的任何过程。
术语“重组”包括两个多核苷酸之间的遗传信息交换的任何过程，并且可以通过任何机制发生。重组可通过同源定向修复(HDR)或同源重组(HR)发生。HDR或HR包括一种可能需要核苷酸序列同源性的核酸修复形式，其使用“供体”分子作为模板来修复“靶标”分子(即经历双链断裂的分子)，并导致遗传信息从供体转移到靶标。不希望受到任何特定理论的束缚，这种转移可能涉及在断裂的靶标和供体之间形成的异源双链DNA的错配校正，和/或合成依赖性链退火，其中供体用于重新合成遗传信息，该遗传信息将成为靶标的一部分，和/或相关过程。在一些情况下，供体多核苷酸、供体多核苷酸的一部分、供体多核苷酸的拷贝，或供体多核苷酸的拷贝的一部分整合到靶DNA中。参见Wang et al.(2013)Cell 153:910-918；Mandalos et al.(2012)PLoS ONE 7:e45768:1-9；和Wang et al.(2013)Nat.Biotechnol.31:530-532，出于所有目的将其每一篇均通过引用整体并入本文。
NHEJ包括通过将断裂末端彼此直接连接或与外源序列直接连接而不需要同源模板来修复核酸中的双链断裂。通过NHEJ对非连续序列进行连接通常会导致双链断裂位点附近的删除、插入，或易位。例如，NHEJ还可以通过将断裂末端与外源供体核酸的末端直接连接(即基于NHEJ的捕获)来导致外源供体核酸的靶定整合。当同源定向修复(HDR)途径不能立即使用时(例如，在非分裂细胞、初级细胞，以及较差地进行基于同源性的DNA修复的细胞中)，此类NHEJ介导的靶定整合可优选用于插入外源供体核酸。另外，与同源定向修复相反，不需要关于切割位点侧面的大范围的序列同一性的知识，这在尝试靶定插入到具有对基因组序列的认识有限的基因组的生物中时可能是有益的。整合可以通过在外源供体核酸与切割的基因组序列之间平端的连接或通过使用侧面为单链突出端的外源供体核酸连接黏性末端(即具有5'或3'单链突出端)来进行，所述单链突出端与在切割的基因组序列中由核酸酶试剂产生的那些相容。参见，例如，US 2011/020722、WO 2014/033644、WO 2014/089290和Maresca et al.(2013)GenomeRes.23(3):539-546，出于所有目的将每一篇均通过引用整体并入本文。如果连接平端，可能需要进行靶标和/或供体切除，以产生片段连接所需的微同源性区域(regions of microhomology)，这可能会在靶序列中产生不想要的改变。
“包含”或“包括”一个或多个所列举的要素的组合物或方法可以包括未具体列举的其它要素。例如，“包含”或“包括”蛋白质的组合物可以单独包含蛋白质或包含蛋白质以及其它成分。过渡用语“基本上由……组成”是指权利要求的范围应解释为涵盖权利要求中所述的特定要素以及不实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的要素。因此，当在本发明的权利要求书中使用时，术语“基本上由……组成”并不意图被解释为等同于“包括”。
“可选的”或“可选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不会发生，并且说明书包括事件或情况发生的情况以及事件或情况没有发生的情况。
值范围的指定包括该范围内或定义该范围的所有整数，以及该范围内的整数定义的所有子范围。
除非从上下文中另外显而易见，否则术语“约”涵盖所述值的标准测量误差范围(例如SEM)内的值。
术语“和/或”是指并涵盖一个或多个相关列出的项目的任何和所有可能的组合，以及当以备选方式(“或”)解释时组合的不存在。
术语“或”是指特定列表的任何一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合。
除非上下文另外明确指出，否则冠词“一”，“一个”和“所述”的单数形式包括复数形式。例如，术语“一种蛋白质”或“至少一种蛋白质”可包括多种蛋白质，包括其混合物。
具有统计学意义的均值意指p≤0.05。
详细说明
I.概述
本文公开了包含失活的Cfh基因座的大鼠基因组、大鼠细胞和大鼠，以及使用这种大鼠细胞和大鼠的方法。本文还公开了大鼠Cfh基因，其包含使大鼠Cfh基因失活的靶向基因修饰和用于使大鼠Cfh基因失活的核酸酶试剂，其中核酸酶试剂靶向并切割Cfh基因中的核酸酶靶位点。本文公开的大鼠易于发生高自然死亡率，并且表现出与C3肾小球病(C3G)极为相似的生理学、形态学和组织学症状。由此，本文公开的大鼠可用于评估C3G治疗的候选化合物或药剂的治疗效果。
C3G是涵盖C3肾小球肾炎和致密性沉积物疾病的一系列疾病。C3G病理的根本原因是获得性或遗传缺陷导致的未调控替代途径(AP)补体激活。获得性缺陷包括C3肾病因子的发展和稳定替代途径C3转化酶的自身抗体。遗传缺陷包括C3转化酶组分、补体组分C3和补体因子B中的突变，或调节蛋白，例如补体因子H(CFH)、与CFH相关的1，2，3和5、补体因子I、CD46等中的突变。诊断后的10年内，约有50％的C3G患者发展为终末期肾病(ESRD)，几乎没有治疗选择。
在组织学上，在没有免疫球蛋白的情况下，C3G患者的肾脏显示占主导地位的肾小球C3沉积，且具有一系列病理特征，包括系膜基质扩张，以及膜和毛细血管内增生(少数情况下具有新月状形成)。也有组织学证据表明膜攻击复合物(MAC)C5b-9在肾脏中的沉积，表明末端补体成分C5激活。但是，在摄入依库丽单抗(eculizumab)(一种C5阻断性单克隆抗体)的C3G患者中未观察到完全的临床缓解，这表明需要新的治疗策略。
CFH是替代途径的关键负调节剂。它通过减少替代途径C3转化酶2的形成并增加其解离来控制补体激活。在C3G患者中导致其功能丧失或不足的CFH突变曾得到报道。由于补体激活不受控制，这些患者中的C3水平大量降低。在猪中还发现了CFH的自发突变，导致其缺乏和致命的C3G样表型。
补体因子H缺乏的(Cfh-/-)小鼠已经成为了解C3G潜在机制的工具。与人类患者相似，Cfh-/-小鼠表现出与最少量的免疫球蛋白时的C3和MAC沉积相一致的不受调节的替代途径补体激活和肾小球病变，以及细胞过多(hypercellularity)，系膜基质扩张和电子致密沉积物。但是，Cfh-/-小鼠不显现出早期死亡，且ESRD的发展可能需要几个月的时间才能显现出来，故需要长期的临床前研究来评估新的治疗方法。因此，需要替代的C3G模型。
本文公开了使用
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技术研发的Cfh-/-鼠。总体而言，我们的数据表明Cfh-/-大鼠表现出C3G的分子和病理学特征，包括降低的循环C3水平降低(表明由于替代途径使补体过度活化而导致C3的消耗)、升高的血尿素氮和血清胱抑素C(表明肾衰竭)、升高的尿白蛋白(白蛋白尿)、肾小球中C3和C5b-9的沉积、肾小球硬化、肾小管萎缩和肾小管中的蛋白性管型(proteinaceous cast)。此外，我们的数据表明，Cfh-/-大鼠表现出明显的肾小球病理，包括足细胞变薄(effacement)和扭曲(通过足突宽度增加和足突减少而测量上皮变薄)、伴有细胞介入(cellular interposition)和电子致密沉积物的肾小球基底膜(GBM)增厚、系膜扩张，和伴有开孔(fenestrae)缺失的内皮肿胀。但是，与Cfh-/-小鼠不同，大多数Cfh-/-大鼠死于ESRD，且雄性中位年龄为52天，雌性中位年龄为103天，从而能够进行较短的临床前研究以评估新疗法。
II.包含失活的Cfh基因座的大鼠
本文公开的大鼠细胞和大鼠包含失活的Cfh基因座。此类大鼠重现了C3肾小球病(C3G)的表型，并且优于现有的C3G模型。
A.补体因子H(CFH)、替代补体(AC)途径和C3肾小球病(C3G)
本文所述的大鼠细胞和大鼠包含失活的Cfh基因座。补体因子H(CFH；也称为因子H、补体组分因子H、血小板补体因子H、补体抑制因子H和肾上腺髓质素结合蛋白-1)由Cfh基因(也称为Fh、Ambp-1和Ambp1)编码。补体因子H在因子I使C3b失活的过程中起辅助因子的作用，并且在替代补体途径中还增加了C3bBb复合物(C3转化酶)和(C3b)NBB复合物(C5转化酶)的解离速率。因子H是补体激活家族调节因子的成员，并且是补体控制蛋白。其为在血浆中循环的大的可溶性糖蛋白，且其主要功能是调节补体系统的替代途径，确保补体系统针对病原体或其它危险物质，并且不会损坏宿主组织。因子H通过同时具有对于因子I介导的C3b裂解的辅因子活性和针对替代途径C3转化酶C3bBb的衰减加速活性来调节自身细胞和表面的补体激活。因子H在自身细胞和自身表面上发挥保护作用，但不在细菌或病毒的表面上发挥保护作用。这可能是因子H具有采用较低或较高活性的不同构象的能力的结果。较低活性的构象是溶液中的主要形式，足以控制液相的扩增。当因子H与通常存在于宿主细胞上但通常不存在于病原体表面上的糖胺聚糖和/或唾液酸结合时，被认为诱导了更高活性的构象，从而确保了自身表面受到保护，而补体在外源表面上的生长不减。
大鼠Cfh映射到13号染色体上的大鼠13q13(NCBI RefSeq基因ID 155012；装配体Rnor_6.0(GCF_000001895.5)；位置NC_005112.4(56979155..57080540，补体))。据报道，该基因有22个外显子。示例性的大鼠Cfh基因组基因座序列在SEQ ID NO：1中列出。所提及的大鼠Cfh基因组基因座包括野生型形式(SEQ ID NO：1)以及所有等位基因形式和异形体。大鼠Cfh基因组基因座的任何其它形式都具有与野生型形式最大比对的编号核苷酸，比对的核苷酸指定为相同编号。其它大鼠Cfh基因组基因座序列可以是与SEQ ID NO：1具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％，或至少约99％的同一性的同系物或等位基因形式或异形体。野生型大鼠CFH蛋白的UniProt登录号为Q5XJW6、G3V9R2、F1M983和Q91YB6，且NCBI登录号为NP_569093.2(在SEQ ID NO：3中列出)。对大鼠CFH蛋白的提及包括野生型形式(NP_569093.2；SEQ ID NO：3)以及所有等位基因形式和异形体。大鼠CFH的任何其它形式都具有与野生型形式最大比对的编号氨基酸，比对的氨基酸指定为相同的编号。其它大鼠CFH蛋白序列可以是与SEQ ID NO：3具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％，或至少约99％的同一性的同系物或等位基因形式或异形体。编码NP_569093.2的mRNA(cDNA)的NCBI登录号为NM_130409.2(在SEQID NO：16中列出)。其它大鼠Cfh mRNA(cDNA)序列可以是与SEQ ID NO：16具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％，或至少约99％的同一性的同系物或等位基因形式或异形体。大鼠CFH蛋白的示例性编码序列在SEQ ID NO：2中列出。其它大鼠Cfh编码序列可以是与SEQ ID NO：2具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％，或至少约99％的同一性的同系物或等位基因形式或异形体。对大鼠Cfh mRNA(cDNA)和编码序列的提及包括野生型形式(分别为SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：2)以及所有等位基因形式和异形体。大鼠Cfh mRNA(cDNA)的任何其它形式和编码序列均具与野生型形式最大比对的编号核苷酸，比对的核苷酸指定为相同的编号。
补体系统是先天免疫的关键组成部分，其通过多种机制(包括调理作用、细胞裂解和炎症细胞募集)帮助宿主防御入侵的病原体(主要通过过敏毒素C5a介导)。补体激活是由一组复杂的膜结合蛋白和液相蛋白调节的。补体系统包括三个相互关联的途径：经典途径，凝集素途径和替代途径。参见图7。但是，后者的失调是C3肾小球病(C3G)的特征。
补体的替代途径(AP)是独特的。首先，与其它途径不同，它不需要特定的触发蛋白，并且在称为“慢速运转(tickover)”的过程中保持连续的活性。最初的替代途径蛋白C3通过水解形成C3(H2O)而自发激活。慢速运转负责替代途径的持续、低水平的激活。正是这一特征强调了控制和保护自身组织免受永久补体活性影响的蛋白质的重要性。
活化的C3募集补体因子B(FB)，然后募集D因子(FD)。FD将结合C3(H2O)的FB切割为Bb，释放Ba并形成替代途径C3转化酶[C3(H2O)Bb]，一种有效的丝氨酸蛋白酶。这种蛋白酶促进了被称为扩增的过程，这是替代途径的另一个独特特征。作为扩增的结果，转化酶将另外的C3指数切割为C3b和C3a，从而产生更多的C3转化酶(C3bBb)。替代途径充当经典途径和凝集素途径两者的效应臂(effector arm)。从这些途径中的任何一个途径引发的活性都通过替代途径被放大。
额外的C3b分子与C3转化酶复合物的结合产生了末端途径酶：C5转化酶(C3bBbC3b)。C5转化酶将C5切割成C5b和C5a，C5b是末端补体复合物的第一组分。C5b与C6和C7结合，随后与C8的相互作用诱导几个C9单元的结合以形成裂解复合物C5b-C9(C5b-9)，也称为膜攻击复合物。该裂解复合物形成补体介导的靶细菌杀害的基础。最后，除了末端补体复合物的产生外，补体激活过程中C3a和C5a过敏毒素的产生还增强了替代途径的免疫角色。两种过敏毒素在补体介导的炎症中都起着核心作用。
已经识别了许多补体对照蛋白。那些作用以控制替代途径(和间接控制末端补偿途径)活性的包括补体因子H(FH)、膜辅因子蛋白(MCP)、衰变加速因子(DAF)、补体受体1(CR1)和补体因子I(FI)。对于限制持续活跃的补体系统或先天性免疫触发所触发的替代途径对宿主细胞造成的不利损害而言，补体控制是必须的。因子H是一种大量存在的血清补体调节蛋白，其抑制补体激活的替代途径。它通过几种机制实现了这一目标，其中包括对替代途径C3转化酶复合物(C3bBb)的抑制，以及作为因子I介导的活化C3(称为C3b)的蛋白水解降解的辅助因子。在因子H缺陷型个体中报道的补体谱(complement profile)说明了因子H作为体内C3激活调节剂的至关重要性；在因子H缺陷型个体中，替代途径激活不受阻碍地进行，从而导致C3水平显著降低。
C3肾小球病(C3G)描述了由共有的肾脏活检病理定义的一系列肾小球疾病：在电子显微镜下和在免疫荧光下显现占主导的C3沉积，从而允许疾病的分类。C3G当前分为两种主要的电子显微镜亚型：致密物沉积病(DDD)和C3肾小球肾炎(C3GN)。2013年之前，部分C3G患者被诊断为膜增生性肾小球肾炎(MPGN)或系膜增生性肾小球肾炎。根据肾小球的微观外观，这些患者现在被称为C3G患者。补体失调是观察到的病理的基础，这一关系得到了遗传和后天疾病驱动因素研究的支持。补体系统是血液中蛋白质的集合，这些蛋白质正常运行时可帮助(补充)免疫系统抵抗细菌和病毒等入侵者。但是，当补体系统异常激活时(例如在C3G中)，正常的补体蛋白(例如C3)会被分解。C3的分解产物停留在肾脏中，引起损害肾小球的反应。受损的肾小球不能很好地过滤血液，尿液生成减少。如果这种情况持续下去，毒素会在血液中积聚，更多的肾脏组织可能会受到损害，肾脏执行其它重要功能的能力可能会下降。C3G的一些常见症状包括尿液中的血液(血尿)、尿液中的蛋白质过多(蛋白尿)、肾小球滤过率降低(GFR；肾脏过滤血液和制造尿液的能力降低)、肌酐升高、疲劳，以及手、脚和脚踝肿胀(浮肿)。其它症状包括循环C3水平降低、血尿素氮水平升高、肾脏中的C3沉积增加、肾脏中的C5b-9膜攻击复合物沉积增加以及寿命降低(自发死亡)。
通过CFH的靶向破坏，建立了在肾活检中具有占主导DC3优势并且在肾组织学上具有C3GN样图案的小鼠模型。该模型仍然是当今研究C3G的主要模型。但是，终末期肾病(ESRD)在Cfh-/-小鼠中可能需要几个月的时间才能显现，因此需要长期的临床前研究来评估新的治疗方法。需要更好的C3G模型，以更快，更一致地患上C3G和ESRD。
B.失活Cfh基因座
失活的内源Cfh基因座或失活的Cfh基因是不产生补体因子H(CFH)蛋白或不产生功能性CFH蛋白的Cfh基因座或Cfh基因。CFH的功能包括抑制替代途径C3转化酶复合物(C3bBb)，并作为因子I介导的活化C3(C3b)的蛋白水解降解的辅助因子。不起作用的CFH蛋白不能抑制替代途径C3转化酶复合物(C3bBb)，也不能作为因子I介导的活化C3(C3b)的蛋白水解降解的辅助因子。
作为一个例子，失活的内源Cfh基因座或失活的Cfh基因可以是其中内源Cfh基因座或Cfh基因的起始密码子已被删除或已被破坏或突变，使得起始密码子不再起作用的基因座或基因。例如，起始密码子可被起始密码子内的缺失或插入破坏。或者，起始密码子可通过例如一个或多个核苷酸的取代而突变。
作为另一个例子，可以删除内源Cfh基因座或Cfh基因的起始密码子，或可以删除内源Cfh基因座或Cfh基因的第一外显子中的编码序列。作为一个具体例子，可以删除第一外显子中的起始密码子和编码序列，并且可以删除第一内含子中的剪接供体位点。
作为另一个例子，可以删除内源Cfh基因座或Cfh基因中的一些、大多数或全部编码序列。例如，可以删除外显子1、外显子1-2、外显子1-3、外显子1-4、外显子1-5、外显子1-6、外显子1-7、外显子1-8、外显子1-9、外显子1-10、外显子1-11、外显子1-12、外显子1-13、外显子1-14、外显子1-15、外显子1-16、外显子1-17、外显子1-18、外显子1-19、外显子1-20中的编码序列。在一个具体的例子中，可以删除外显子1-21或外显子1-22中的编码序列。或者，可以删除至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85、至少约90％或至少约95％的内源Cfh基因座或Cfh基因中的编码序列(包括起始密码子)。在另一个实施例中，内源Cfh基因座或Cfh基因中的所有编码序列均被删除。
从内源Cfh基因座或Cfh基因删除，以使其失活的序列的具体例子是SEQ ID NO：5所示的序列或当与SEQ ID NO：1所示的大鼠Cfh基因组基因座序列最佳比对时对应于SEQID NO：1的核苷酸97-242的序列(即SEQ ID NO：5)(例如与SEQ ID NO：5具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％，或至少约99％的同一性的内源序列)。失活的内源Cfh基因座或Cfh基因的具体例子是SEQ ID NO：4所示的序列或具有缺失的序列，该缺失与当SEQ ID NO:4与SEQ ID NO：1最佳比对时，SEQ ID NO:4相对于SEQ ID NO：1的缺失相对应(例如与SEQ ID NO：4具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的同一性的内源序列)。
C.大鼠基因组、大鼠细胞和包含失活的Cfh基因座的大鼠
提供了如本文其他地方所述的大鼠基因组、大鼠细胞和包含失活的Cfh基因座或失活的Cfh基因的大鼠。基因组、细胞或大鼠可以是雄性或雌性。对于失活的Cfh基因座，大鼠基因组、大鼠细胞或大鼠可以是杂合的或纯合的。优选地，基因组、细胞或大鼠(例如用于本文公开的方法中的基因组、细胞或大鼠)对于失活的Cfh基因座是纯合的。二倍体生物在每个遗传基因座具有两个等位基因。每对等位基因代表特定遗传基因座的基因型。如果在特定基因座有两个相同的等位基因，则将基因型描述为纯合；如果两个等位基因不同，则将基因型描述为杂合。
本文提供的大鼠基因组、大鼠细胞和大鼠可以是例如任何包含Cfh基因座的大鼠基因组、大鼠细胞或大鼠。大鼠细胞也可以处于任何类型的未分化或分化状态。例如，大鼠细胞可以是全能细胞、多能细胞(例如大鼠多能细胞，例如大鼠胚胎干(ES)细胞)或非多能细胞。全能细胞包括可产生任何细胞类型的未分化细胞，多能细胞包括具有发展为一种以上分化细胞类型的能力的未分化细胞。这样的多能和/或全能细胞可以是，例如，ES细胞或ES类细胞，例如诱导性多能干(iPS)细胞。ES细胞包括源自胚胎的全能或多能细胞，当引入胚胎时，它们能够对发育中的胚胎的任何组织作出贡献。ES细胞可以源自胚泡的内部细胞团，并且能够分化为三个脊椎动物胚层(内胚层、外胚层和中胚层)中的任何一个的细胞。
本文提供的细胞也可以是生殖细胞(例如精子或卵细胞)。所述细胞可以是有丝分裂感受态细胞(mitotically competent cells)或有丝分裂失活细胞(mitotically-inactive cells)、减数分裂感受态细胞或减数分裂失活细胞。类似地，细胞也可以是原代体细胞或并非原代体细胞的细胞。体细胞包括不是配子、生殖细胞、配子母细胞或未分化的干细胞的任何细胞。例如，细胞可以是肾细胞。
本文提供的合适的细胞还包括初级细胞。初级细胞包括直接从生物体、器官，或组织分离的细胞或细胞培养物。初级细胞包括既未转化也非永生的细胞。这样的细胞可以通过常规技术分离，并且包括，例如，肾细胞。
本文提供的其它合适的细胞包括永生细胞。永生细胞包括来自多细胞生物的细胞，这些细胞通常不会无限期增殖，但是由于突变或改变而逃避了正常的细胞衰老，可以继续分裂。这样的突变或改变可以自然发生或有意诱导。永生细胞或原代细胞包括通常用于培养或表达重组基因或蛋白质的细胞。
本文提供的细胞还包括单细胞期胚胎(即受精卵细胞或受精卵)。这样的单细胞期胚胎可以来自任何遗传背景，可以是新鲜的或冷冻的，并且可以源自自然育种或体外受精。本文提供的细胞可以是正常，健康的细胞，或者可以是患病或携带突变的细胞。
包含本文所描述的失活的Cfh基因座的大鼠可以通过本文其他地方描述的方法制备。大鼠可来自于任何大鼠种系，包括例如ACI大鼠种系、Dark Agouti(DA)大鼠种系、Wistar大鼠种系、LEA大鼠种系、Sprague Dawley(SD)大鼠种系，或Fischer大鼠种系(例如Fisher F344或Fisher F6)。大鼠还可获自衍生自上述两种或多种种系的混合的种系。例如，合适的大鼠可获自DA种系或ACI种系。ACI大鼠种系被表征为具有黑色刺豚鼠，其具有白色腹部和足部以及RT1av1单体型。这些种系可获自包括Harlan实验室在内的多种不同的来源。Dark Agouti(DA)大鼠种系被表征为具有刺鼠皮(agouti coat)和RT1av1单体型。这些大鼠获自包括Charles River和Harlan实验室在内的多种不同的来源。一些合适的大鼠可来自同系交配大鼠种系。参见，例如，US2014/0235933，其全部内容出于所有目的通过引用并入本文。
在一个具体的例子中，在。Dark Agouti种系的胚胎干细胞中使Cfh基因失活。在一个具体的例子中，那些ES细胞随后被引入Sprague Dawley大鼠宿主胚胎中以产生嵌合体。然后可将嵌合体与Sprague Dawley大鼠交配以产生F1动物，然后将其杂交(interbreed)以建立具有失活的Cfh基因座的大鼠种系。例如，最终的大鼠Cfh敲除系可以是50％的DarkAgouti和50％的Sprague Dawley。
包含失活的内源Cfh基因座的大鼠具有如本文其它地方所公开的C3肾小球病(C3G)的一种或多种症状。术语“症状”是指医师观察到的疾病的客观证据。
作为一个例子，与野生型大鼠相比，包含失活的内源Cfh基因座的大鼠可具有降低的循环补体成分3(C3)蛋白水平(例如在约7周至约17周龄时)。例如，循环C3水平可为小于约200μg/mL或小于约100μg/mL。例如，在大约7周龄、大约8周龄、大约9周龄、大约10周龄、大约11周龄、大约12周龄、大约13周龄、大约14周龄、大约15周龄、大约16周龄或大约17周龄时，循环C3水平可以小于约200μg/mL或小于约100μg/mL。例如，循环C3水平可以在约25至约200之间、在约25至约175之间、在约25至约150之间、在约25至约125之间、在约25至约100之间，或在约25至约75μg/mL之间(例如在约7周龄、约8周龄、约9周龄、约10周龄、约11周龄、约12周龄、约13周龄、约14周龄、约15周龄、约16周龄，或约17周龄时)。
作为另一个例子，与野生型大鼠相比，包含失活的内源Cfh基因座的大鼠在肾脏中(例如在肾小球中)可具有增加的C3沉积(例如在约7周至约17周龄时)。作为另一个例子，与野生型大鼠相比，包含失活的内源Cfh基因座的大鼠在肾脏中(例如在肾脏的肾小球中)可具有增加的C5b-9膜攻击复合物(MAC；或末端补体复合物C5b-9)沉积(例如在约7周至约17周龄时)。
作为另一个例子，与野生型大鼠相比，包含失活的内源Cfh基因座的大鼠可具有增加的血尿素氮(BUN)水平(例如在约7周至约17周龄时)。例如，所述增加的BUN水平可以是至少约或大于约10、至少约或大于约20、至少约或大于约30、至少约或大于约40、至少约或大于约50、至少约或大于约60、至少约或大于约70、至少约或大于约80、至少约或大于约90，或至少约或大于约100mg/dL(例如在约7周龄、约8周龄、约9周龄、约10周龄、约11周龄、约12周龄、约13周龄、约14周龄、约15周龄、约16周龄，或约17周龄时)。例如，BUN水平可以在约10至约400之间、在约10至约350之间、在约10至约300之间、在约10至约250之间、在约10至约200之间、在约20至约400之间、在约20至约350之间、在约20至约300之间、在约20至约250之间、在约20至约200之间、在约30至约400之间、在约30至约350之间、在约30至约300之间、在约30至约250之间、在约30至约200之间、在约40至约400之间、在约40至约350之间、在约40至约300之间、在约40至约250之间、在约40至约200之间、在约50和约400之间、在约50和约350之间、在约50和约300之间、在约50和约250之间，或在约50和约200mg/dL之间(例如在约7周龄、约8周龄、约9周龄、约10周龄、约11周龄、约12周龄、约13周龄、约14周龄、约15周龄、约16周龄，或约17周龄时)。
作为另一个例子，与野生型大鼠相比，包含失活的内源Cfh基因座的大鼠可具有降低的寿命。作例如，包含失活的内源Cfh基因座的大鼠或大鼠群的寿命或寿命中位数可为小于约300天、小于约250天、小于约200天、小于约150天、小于约140天、小于约130天、小于约120天、小于约110天、小于约100天、小于约90天、小于约80天、小于约70天、小于约60天，或少于约50天。在特定例子中，寿命中位数小于约150天或小于约110天。在特定例子中，寿命小于约250天、小于约150天或小于约130天。例如，包含失活的内源Cfh基因座的大鼠或大鼠群的寿命或寿命中位数可为在约25至约75之间，在约30至约70之间，在约35至约65之间，在约40至约60之间，在约45至大约55之间，在约50至约55之间，在约75至约125之间，在约80至约120之间，在约85至约115之间，在约90至约110之间，在约95至约105之间，在约100至约105之间，在约25至约125之间，在约30至约120之间，在约35至约115之间，在约40至约110之间，在约45至约105之间，或在约50至约105天之间。
作为另一个例子，与野生型大鼠相比，包含失活的内源Cfh基因座的大鼠可具有增加的血清胱抑素C水平(例如在约7周至约17周龄时)。例如，血清胱抑素C水平可以为至少约或大于约1000、至少约或大于约1100、至少约或大于约1200、至少约或大于约1300、至少约或大于约1400、至少约或大于约1500、至少约或大于约1600、至少约或大于约1700、至少约或大于约1800、至少约或大于约1900或至少约或大于约2000ng/mL(例如在约7周龄、约8周龄、约9周龄、约10周龄、约11周龄、约12周龄、约13周龄、约14周龄、约15周龄、约16周龄，或约17周龄时)。例如，血清胱抑素C水平可以在约1000至约5000之间、在约1000至约4500之间、在约1000至约4000之间、在约1000至约3500之间、在约1000至约3000之间、在约1100至约5000之间、在约1100至约4500之间、在约1100至约4000之间、在约1100至约3500之间、在约1100至约3000之间、在约1200至约5000之间、在约1200至约4500之间、在约1200至约4000之间、在约1200至约3500之间、在约1200至约3000之间、在约1300至约5000之间、在约1300至约4500之间、在约1300至约4000之间、在约1300至约3500之间、在约1300至约3000之间、在约1400至约5000之间、在约1400至约4500之间、在约1400至约4000之间、在约1400至约3500之间、在约1400至约3000之间、在约1500至约5000之间、在约1500至约4500之间、在约1500至约4000之间、在约1500至约3500之间，或在约1500至约3000ng/mL之间(例如在约7周龄、约8周龄、约9周龄、约10周龄、约11周龄、约12周龄、约13周龄、约14周龄、约15周龄、约16周龄，或约17周龄时)。
作为另一个例子，与野生型大鼠相比，包含失活的内源Cfh基因座的大鼠可具有增加的尿白蛋白水平(白蛋白尿)(例如在约7周至约17周龄时)。例如，增加的尿白蛋白可以通过每天的尿白蛋白测量，或标准化为肌酐。例如，尿白蛋白/天可以是，例如，至少约或大于约1000、至少约或大于约2000、至少约或大于约3000、至少约或大于约4000、至少约或大于约5000、至少约或大于约6000、至少约或大于约7000、至少约或大于约8000、至少约或大于约9000，或至少约或大于约10000μg/天(例如在约7周龄、约8周龄、约9周龄、约10周龄、约11周龄、约12周龄、约13周龄、约14周龄、约15周龄、约16周龄，或约17周龄时)。例如，尿白蛋白/天可以例如在约1000与约40000之间、在约2000与约40000之间、在约3000与约40000之间、在约4000与约40000之间，或在约5000与约40000μg/天之间(例如在约7周龄、约8周龄、约9周龄、约10周龄、约11周龄、约12周龄、约13周龄、约14周龄、约15周龄、约16周龄，或约17周龄时)。例如，标准化为尿肌酐的尿白蛋白(即尿白蛋白与尿肌酐之比)可以为，例如，至少约或大于约100、至少约或大于约200、至少约或大于约300、至少约或大于约400、至少约或大于约500、至少约或大于约600、至少约或大于约700、至少约或大于约800、至少约或大于约900、至少约或大于约1000、至少约或大于约1100、至少约或大于约1200、至少约或大于约1300、至少约或大于约1400、至少约或大于约1500、至少约或大于约1600、至少约或大于约1700、至少约或大于约1800、至少约或大于约1900，或至少约或大于约2000μg：mg(例如在约7周龄、约8周龄、约9周龄、约10周龄、约11周龄、约12周龄、约13周龄、约14周龄、约15周龄、约16周龄，或约17周龄时)。例如，标准化为尿肌酐的尿白蛋白(即尿白蛋白与尿肌酐的之比)可以为例如约100至约6000之间、约200至约6000之间、约300至约6000之间、约400至约6000之间、约500至约6000之间、约1000至约6000之间、约100至约5000之间、约200至约5000之间、约300至约5000之间、约400至约5000之间、约500至约5000之间，或约1000至约5000μg：mg之间(例如在约7周龄、约8周龄、约9周龄、约10周龄、约11周龄、约12周龄、约13周龄、约14周龄、约15周龄、约16周龄，或约17周龄时)。
作为另一个例子，包含失活的内源Cfh基因座的大鼠可表现出明显的肾小球病理，包括足细胞的变薄和扭曲(通过足突宽度增加和足突减少而测量上皮变薄)、肾小球基底膜(GBM)增厚(例如伴有细胞介入和电子致密沉积物)、系膜扩张，和/或伴有开孔(fenestrae)缺失的内皮肿胀(例如在约7周至约17周龄时)。
作为一个例子，GBM厚度的增加可以为与野生型大鼠相比的至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍，或至少约10倍(例如在约7周龄、约8周龄、约9周龄、约10周龄、约11周龄、约12周龄、约13周龄、约14周龄、约15周龄、约16周龄，或约17周龄时)。例如，肾小球中的平均GBM厚度可以为至少约0.2、至少约0.3、至少约0.4、至少约0.5、至少约0.6、至少约0.7、至少约0.8、至少约0.9、至少约1.0、至少约1.1、至少约1.2、至少约1.3、至少约1.4、至少约1.5、至少约1.6、至少约1.7，或至少约1.8微米长(例如在约7周龄、约8周龄、约9周龄、约10周龄、约11周龄、约12周龄、约13周龄、约14周龄、约15周龄、约16周龄，或约17周龄时)。例如，肾小球中的平均GBM厚度可以为约0.2至约2.5之间、约0.5至约2.5之间、约1.0至约2.5之间、约1.1至约2.5之间、约1.2至约2.4之间、约1.3至约2.3之间、约1.4至约2.2之间、约1.5至约2.1之间、约1.6至约2.0之间，或约1.7至约1.9微米之间的长度(例如在约7周龄、约8周龄、约9周龄、约10周龄、约11周龄、约12周龄、约13周龄、约14周龄、约15周龄、约16周龄，或约17周龄时)。例如，肾小球中GBM的平均厚度可以为约1.8微米的长度(例如在约7周龄、约8周龄、约9周龄、约10周龄、约11周龄、约12周龄、约13周龄、约14周龄、约15周龄、约16周龄，或约17周龄时)。
作为另一个例子，足细胞足突宽度的增加可以是与野生型大鼠相比的至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍，或至少约7倍(例如在约7周龄、约8周龄、约9周龄、约10周龄、约11周龄、约12周龄、约13周龄、约14周龄、约15周龄、约16周龄，或约17周龄时)。例如，肾小球的足突的平均宽度可以为至少约0.4、至少约0.5、至少约0.6、至少约0.7、至少约0.8、至少约0.9、至少约1.0、至少约1.1、至少约1.2、至少约1.3、至少约1.4、至少约1.5、至少约1.6、至少约1.7、至少约1.8、至少约1.9、至少约2.0、至少约2.1、至少约2.2、至少约2.3、至少约2.4，或至少约2.5微米(例如在约7周龄、约8周龄、约9周龄、约10周龄、约11周龄、约12周龄、约13周龄、约14周龄、约15周龄、约16周龄，或约17周龄时)。例如，肾小球的足突的平均宽度可以在约0.5至约5.5之间、在约1.0至约5.5之间、在约1.5至约5.5之间、在约0.5至约3.5之间、在约1.0至约3.5之间、在约1.5至约3.5之间、在约2.0至约3.5之间、在约2.0至约3.0之间、在约2.1至约2.9之间、在约2.2至约2.8之间、在约2.3至约2.7之间，或在约2.4至约2.6微米之间(例如在约7周龄、约8周龄、约9周龄、约10周龄、约11周龄、约12周龄、约13周龄、约14周龄、约15周龄、约16周龄，或约17周龄时)。例如，肾小球的足突的平均宽度可以为约2.5微米(例如在约7周龄、约8周龄、约9周龄、约10周龄、约11周龄、约12周龄、约13周龄、约14周龄、约15周龄、约16周龄，或约17周龄时)。
作为另一个例子，足细胞足突数的减少可以是相对于野生型大鼠的至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约3.8倍、至少约4倍(例如在约7周龄、约8周龄、约9周龄、约10周龄、约11周龄、约12周龄、约13周龄、约14周龄、约15周龄、约16周龄，或约17周龄时)。例如，每微米长度的平均足细胞足突数(例如，覆盖肾小球毛细血管环的足突的平均数)可为小于约2.5、小于约2、小于约1.5、小于约1.4、小于约1.3、小于约1.2、小于约1.1、小于约1、小于约0.9，或小于约0.8(例如在约7周龄、约8周龄、约9周龄、约10周龄、约11周龄、约12周龄、约13周龄、约14周龄、约15周龄、约16周龄，或约17周龄时)。例如，每微米长度的平均足细胞足突数可以在约0.4至约2.5之间、约0.4至约2.0之间、约0.4至约1.5之间、约0.4至约1.4之间、约0.4至约1.3之间、约0.4至约1.2之间、约0.4至约1.1之间、约0.4至约1.0之间、约0.4至约0.9之间、约0.4至约0.8之间、约0.5至约2.5之间、约0.5至约2.0之间、约0.5至约1.5之间、约0.5至约1.4之间、约0.5至约1.3之间、约0.5至约1.2之间、约0.5至约1.1之间、约0.5至约1.0之间、约0.5至约0.9之间、约0.5至约0.8之间、约0.6至约2.5之间、约0.6至约2.0之间、约0.6至约1.5之间、约0.6至约1.4之间、约0.6至约1.3之间、约0.6至约1.2之间、约0.6至约1.1之间、约0.6至约1.0之间、约0.6至约0.9之间，或约0.6至约0.8之间(例如在约7周龄、约8周龄、约9周龄、约10周龄、约11周龄、约12周龄、约13周龄、约14周龄、约15周龄、约16周龄，或约17周龄时)。例如，每微米长度的平均足细胞足突数可为约0.7(例如在约7周龄、约8周龄、约9周龄、约10周龄、约11周龄、约12周龄、约13周龄、约14周龄、约15周龄、约16周龄，或约17周龄时)。
III.使用包含失活的Cfh基因座的大鼠评估C3G治疗药物在体内或体外的功效的方法
提供了多种使用如本文其它地方所述的包含失活的Cfh基因座的大鼠，以评估推定的C3肾小球病(C3G)治疗剂在体内或体外的功效的方法。这样的方法可以是用于识别候选试剂(即化合物或治疗分子)或评估用于治疗C3G的候选试剂的体内治疗功效的方法。该方法利用了本文公开的包含失活的Cfh基因座的任何大鼠。在这样的方法中，可以将候选化合物直接施用于表现出C3G症状的大鼠，以确定该药剂或化合物是否可以减轻C3G的一种或多种症状。
A.测试推定C3G治疗药物在体内或体外的功效的方法
提供了多种方法来评估的药剂或化合物(例如推定的C3G治疗剂)在体内或体外的C3肾小球病(C3G)治疗活性。这样的方法可以包括向包含失活的Cfh基因座的大鼠施用所述药剂或化合物，并评估所述药剂化合物在大鼠中的C3G治疗活性，或者其可以包括向包含失活的Cfh基因座的大鼠施用推定的C3治疗剂，以及评估推定的C3治疗剂在大鼠中的活性。例如，这样的方法可以用于评估用于治疗C3肾小球病(C3G)的药剂或化合物的体内治疗功效。这样的方法可以包括，例如，向包含失活的Cfh基因座的大鼠施用所述药剂或化合物，以及与尚未施用该药剂或化合物对照的基因修饰的大鼠相比，评估已经施用了所述试剂或化合物的基因修饰的大鼠中的C3G的一种或多种症状。
所述试剂或化合物可以是任何生物或化学试剂。推定的C3G治疗剂或化合物的例子在本文其它地方公开。
这样的化合物或药剂可以通过如本文其它地方更详细公开的任何递送方法(例如注射、AAV、LNP或HDD)和通过任何给药途径来施用。递送治疗性分子的方式和给药途径在本文其它地方更详细地公开。
用于评估推定的C3G治疗剂的活性或用于评估药剂或化合物的C3G治疗活性的方法是众所周知的，并在本文其它地方提供。这样的评估可以包括评估替代补体(AC)途径的活性的读数或评估肾功能。例如，此类方法可包括评估任何C3G症状，例如以下一种或多种或所有症状：(i)循环C3蛋白水平(C3G中降低)；(ii)血尿素氮水平(C3G中增加)；(iii)肾脏(例如肾脏的肾小球)中C3的沉积水平(C3G中升高)；(iv)肾脏(例如肾脏的肾小球)中C5b-9沉积水平(C3G中升高)；以及(v)大鼠的寿命(在C3G中降低)。作为另一个例子，这样的方法可以包括评估以下一个或多个或全部：(i)循环C3蛋白水平(C3G中降低)；(ii)血尿素氮水平(C3G中增加)；(iii)肾脏(例如肾脏的肾小球)中C3的沉积水平(C3G中升高)；(iv)肾脏(例如肾脏的肾小球)中C5b-9沉积水平(C3G中升高)；(v)血清胱抑素C水平(在肾小球疾病如C3G中升高)；(vi)尿白蛋白(白蛋白尿)(在肾小球疾病如C3G中增加)；(vii)肾小球基底膜(GBM)的厚度(在肾小球疾病如C3G中增加)；(viii)足细胞足突宽度(在肾小球疾病如C3G中增加)；(ix)足细胞足突数(在肾小球疾病如C3G中降低)；和(x)大鼠的寿命(在C3G中降低)。也可以使用本文描述的与肾小球疾病有关的任何其它症状。与尚未施用候选药剂或化合物的对照大鼠相比，该药剂或化合物可以改善或治疗C3G的一种或多种症状。术语“改善”或“治疗”是指消除与C3G相关的一种或多种症状、延迟与C3G相关的一种或多种症状的发作，或减少与C3G相关的一种或多种症状的流行、频率或严重性。
所评估的一种或多种症状可包括降低的C3循环水平。这样的方法可以包括评估在施用所述药剂或化合物的基因修饰的大鼠中的循环C3蛋白水平。可以例如在约2周至约17周、约2周至约12周、约3周至约11周、约4周至约10周、约5周至约9周，或约6周至约8周龄的大鼠中评估循环C3水平。在一个具体的例子中，可以在大约7周龄时评估循环C3水平。或者，可以在约7周至约17周、约7周至约16周、约7周至约15周、约7周至约14周、约7周至约13周、约7周至约12周、约7周至约11周、约7周至约10周、约7周至约9周，或约7周至约8周龄时评估循环C3水平。例如，可以相对于尚未施用所述药剂或化合物的对照基因修饰大鼠中的循环C3蛋白水平来评估施用所述药剂或化合物的基因修饰的大鼠中的循环C3蛋白水平，其中相对对照基因修饰大鼠中而言的增加的循环C3蛋白水平表明该药剂或化合物具有治疗作用。例如，在如本文所述的包含失活的Cfh基因座的任何大鼠中，候选药剂或化合物导致的改善的循环C3水平的降低可以是统计学上显著的。例如，与未用候选化合物或药剂处理的对照大鼠相比，候选药剂或化合物可将任何包含本文所述的失活的Cfh基因座的大鼠中的降低的循环C3水平改善(即增加循环C3水平)1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％中的任一。可以使用许多众所周知的方法来评估循环C3水平。
所评估的一种或多种症状还可以包括在肾脏中(特别是在肾单位中例如肾小球中)的C3沉积。这样的方法可以包括评估在施用药剂或化合物的基因修饰的大鼠的肾脏(例如肾脏的肾小球)中C3沉积的水平。可以例如在约7周至约17周、约8周至约17周，或约9周至约17周龄的大鼠中评估C3沉积。或者，可以在约7周至约17周、约7周至约16周、约7周至约15周、约7周至约14周、约7周至约13周、约7周至约12周、约7周至约11周、约7周至约10周、约7周至约9周，或约7周至约8周龄时评估肾中C3沉积的水平。例如，可以相对于尚未施用所述药剂或化合物的对照基因修饰大鼠中的C3沉积水平来评估施用了所述药剂或化合物的基因修饰的大鼠中的C3沉积水平，其中相对于对照基因修饰大鼠而言，降低的C3沉积水平表明该药剂或化合物具有治疗作用。例如，在如本文所述的包含失活的Cfh基因座的任何大鼠中，候选药剂或化合物导致的改善的肾C3沉积可以是统计学上显著的。例如，与未用候选化合物或药剂处理的对照大鼠相比，候选药剂或化合物可将任何包含本文所述的失活的Cfh基因座的大鼠中的肾C3沉积改善(即降低的肾C3沉积)1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％中的任一。肾C3蛋白沉积的确定可以通过许多已知方法来分析，包括但不限于免疫组织化学、免疫荧光和电子显微镜(包括免疫电子显微镜)。
所评估的一种或多种症状还可以包括在肾脏中(例如肾小球中)的C5b-9膜攻击复合物沉积。这样的方法可以包括评估在施用药剂或化合物的基因修饰的大鼠的肾脏(例如肾脏的肾小球)中C5b-9膜攻击复合物沉积的水平。可以例如在约7周至约17周、约8周至约17周，或约9周至约17周龄的大鼠中评估C5b-9沉积。或者，可以在约7周至约17周、约7周至约16周、约7周至约15周、约7周至约14周、约7周至约13周、约7周至约12周、约7周至约11周、约7周至约10周、约7周至约9周，或约7周至约8周龄时评估肾中C5b-9沉积的水平。例如，可以相对于尚未施用所述药剂或化合物的对照基因修饰大鼠中的C5b-9沉积水平来评估施用了所述药剂或化合物的基因修饰的大鼠中的C5b-9沉积水平，其中相对于对照基因修饰大鼠而言，降低的C5b-9沉积水平表明该药剂或化合物具有治疗作用。例如，在如本文所述的包含失活的Cfh基因座的任何大鼠中，候选药剂或化合物而导致的C5b-9膜攻击复合物的形成和沉积的改善可以是统计学上显著的量。例如，与未用候选化合物或药剂处理的对照大鼠相比，候选药剂或化合物可将任何包含本文所述的失活的Cfh基因座的大鼠中的C5b-9膜攻击复合物的形成和沉积改善(即降低的C5b-9沉积)1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％中的任一。肾中的C5b-9膜攻击复合物的形成和沉积的的确定可以通过许多已知方法来分析，包括但不限于免疫组织化学、免疫荧光(例如免疫荧光标记的抗C9抗体)和电子显微镜(包括免疫电子显微镜)。
所评估的一种或多种症状还可以包括血清中的血尿素氮(BUN)水平。这样的方法可以包括评估在施用药剂或化合物的基因修饰的大鼠中的血尿素氮水平。可以例如在约7周至约17周、约8周至约17周，或约9周至约17周龄的大鼠中评估血尿素氮水平。或者，可以在约7周至约17周、约7周至约16周、约7周至约15周、约7周至约14周、约7周至约13周、约7周至约12周、约7周至约11周、约7周至约10周、约7周至约9周，或约7周至约8周龄时评估血尿素氮水平。例如，可以相对于尚未施用所述药剂或化合物的对照基因修饰大鼠中的血尿素氮水平来评估施用了所述药剂或化合物的基因修饰的大鼠中的血尿素氮水平，其中相对于对照基因修饰大鼠而言，降低的血尿素氮水平表明该药剂或化合物具有治疗作用。例如，在如本文所述的包含失活的Cfh基因座的任何大鼠中，候选药剂或化合物而导致的血浆或血清尿素氮水平升高的改善可以是统计学上显著的。例如，与未用候选化合物或药剂处理的对照大鼠相比，候选药剂或化合物可将任何包含本文所述的失活的Cfh基因座的大鼠中的升高的血浆或血清血尿素氮水平改善(即降低的血浆或血清血尿素氮水平)1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％中的任一。可以使用许多众所周知的方法来评估血清和/或血浆的BUN水平。
所评估的一种或多种症状还可以包括血清中的血清胱抑素C水平。这样的方法可以包括评估在施用药剂或化合物的基因修饰的大鼠中的血清胱抑素C水平。可以例如在约7周至约17周、约8周至约17周，或约9周至约17周龄的大鼠中评估血清胱抑素C水平。或者，可以在约7周至约17周、约7周至约16周、约7周至约15周、约7周至约14周、约7周至约13周、约7周至约12周、约7周至约11周、约7周至约10周、约7周至约9周，或约7周至约8周龄时评估血清胱抑素C水平。例如，可以相对于尚未施用所述药剂或化合物的对照基因修饰大鼠中的血清胱抑素C水平来评估施用了所述药剂或化合物的基因修饰的大鼠中的血清胱抑素C水平，其中相对于对照基因修饰大鼠而言，降低的血清胱抑素C水平表明该药剂或化合物具有治疗作用。例如，在如本文所述的包含失活的Cfh基因座的任何大鼠中，候选药剂或化合物而导致的血浆或血清胱抑素C水平升高的改善可以是统计学上显著的。例如，与未用候选化合物或药剂处理的对照大鼠相比，候选药剂或化合物可将任何包含本文所述的失活的Cfh基因座的大鼠中的升高的血浆或血清胱抑素C水平改善(即降低的血浆或血清胱抑素C水平)1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％中的任一。可以使用许多众所周知的方法来评估血清和/或血浆的胱抑素C水平。
所评估的一种或多种症状还可以包括尿白蛋白水平(白蛋白尿)。这样的方法可以包括评估在施用药剂或化合物的基因修饰的大鼠中的尿白蛋白水平。可以例如在约7周至约17周、约8周至约17周，或约9周至约17周龄的大鼠中评估尿白蛋白水平。或者，可以在约7周至约17周、约7周至约16周、约7周至约15周、约7周至约14周、约7周至约13周、约7周至约12周、约7周至约11周、约7周至约10周、约7周至约9周，或约7周至约8周龄时评估尿白蛋白水平。例如，可以相对于尚未施用所述药剂或化合物的对照基因修饰大鼠中的尿白蛋白水平来评估施用了所述药剂或化合物的基因修饰的大鼠中的尿白蛋白水平，其中相对于对照基因修饰大鼠而言，降低的尿白蛋白水平表明该药剂或化合物具有治疗作用。例如，在如本文所述的包含失活的Cfh基因座的任何大鼠中，候选药剂或化合物而导致的尿白蛋白水平升高的改善可以是统计学上显著的。例如，与未用候选化合物或药剂处理的对照大鼠相比，候选药剂或化合物可将任何包含本文所述的失活的Cfh基因座的大鼠中的升高的尿白蛋白水平改善(即降低的尿白蛋白水平)1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％中的任一。可以使用许多众所周知的方法来评估尿白蛋白水平，而且可以定量，例如每天或相对于尿肌酐标准化。
所评估的一种或多种症状还可以包括肾小球病理，例如肾小球基底膜(GBM)的厚度、足细胞足突的宽度和足细胞足突的数量。这样的方法可以包括评估在施用药剂或化合物的基因修饰的大鼠中的肾小球病理。可以例如在约7周至约17周、约8周至约17周，或约9周至约17周龄的大鼠中评估肾小球病理。或者，可以在约7周至约17周、约7周至约16周、约7周至约15周、约7周至约14周、约7周至约13周、约7周至约12周、约7周至约11周、约7周至约10周、约7周至约9周，或约7周至约8周龄时评估肾小球病理。例如，可以相对于尚未施用所述药剂或化合物的对照基因修饰大鼠中的肾小球病理来评估施用了所述药剂或化合物的基因修饰的大鼠中的肾小球病理，其中相对于对照基因修饰大鼠而言，减小的GBM厚度、减小的足细胞足突宽度，或增加的足细胞足突数量(例如：增加的足细胞足突数量/微米长度)表明该药剂或化合物具有治疗作用。例如，在如本文所述的包含失活的Cfh基因座的任何大鼠中，增加的GBM厚度、增加的足细胞足突宽度，或减少的足细胞足突数量的改善可以是统计学上显著的。例如，与未用候选化合物或药剂处理的对照大鼠相比，候选药剂或化合物可将任何包含本文所述的失活的Cfh基因座的大鼠中的增加的GBM厚度、增加的足细胞足突宽度，或减少的足细胞足突数量改善(即减小的GBM厚度、减小的足细胞足突宽度，或增加的足细胞足突数量)1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％中的任一。可以使用许多众所周知的方法，包括本文所描述的方法来评估肾小球病理。
所评估的一种或多种症状还可以包括自发死亡(即寿命)。这样的方法可以包括评估在施用药剂或化合物的基因修饰的大鼠的寿命。例如，可以相对于尚未施用所述药剂或化合物的对照基因修饰大鼠的寿命来评估施用了所述药剂或化合物的基因修饰的大鼠的寿命，其中相对于对照基因修饰大鼠而言，寿命的增加表明该药剂或化合物具有治疗作用。例如，在如本文所述的包含失活的Cfh基因座的任何大鼠中，候选药剂或化合物而导致的自发死亡的发生的改善可以是统计学上显著的。例如，与未用候选化合物或药剂处理的对照大鼠相比，候选药剂或化合物可将任何包含本文所述的失活的Cfh基因座的大鼠的自发死亡的发生改善(即寿命增加)1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％中的任一。
上文实施例中的对照基因修饰大鼠除了未经该药剂或化合物处理之外，其它方面可与已经该试剂或化合物处理的大鼠相同。例如，对照大鼠可以具有相同的失活的Cfh基因座、可与已经过处理的大鼠的种系相同、可与已经过处理的大鼠的性别相同，和/或可与已经过处理的大鼠的年龄相同。对照大鼠可以是，例如，未经处理的，或用没有治疗作用的对照物质(例如安慰剂)处理的。
上文提供的用于评估体内活性的各种方法也可以用于评估推定的C3G治疗剂的活性或评估化合物离体的C3G治疗活性，如本文其它地方所述。
B.候选C3G治疗药物
可以在本文公开的大鼠细胞和大鼠中测试任何候选的C3肾小球病(C3G)治疗剂或化合物。这种推定的治疗剂可以是设计或定制为预防或减轻如本文其它地方所述的、与C3G相关的一种或多种症状的任何药剂。这种推定的治疗剂可以是小分子或可以是生物剂(biologics)，例如抗体、抗原结合蛋白，或核酸或蛋白。候选治疗剂或化合物可以是，例如，小分子化合物、抗体、蛋白质、抑制性核酸或其任何组合。
作为一个例子，可以将推定的C3G治疗剂设计为补体抑制剂。补体抑制剂的例子包括依库丽单抗(一种批准用于其它的补体介导的肾脏疾病(非典型溶血性尿毒症综合征，aHUS)的人源化抗补体C5单克隆抗体；阻断C5的裂解从而阻止C5b-9的形成和过敏毒素C5A的产生)、可溶性补体受体1(CR1)、C3抑制剂，如Cp40(肽类C3抑制剂)、C5抑制剂(例如针对C5的siRNA剂、FB和FD抑制剂，和C5a受体阻滞剂)。参见，例如，Nester和Smith(2016)Seminars in Immunology 28:241-249，出于所有目的通过引用将其全部内容合并于此。
作为另一个例子，推定的C3G治疗剂可以是被设计为减缓C3G引起的肾脏损害过程的药剂。这样的药剂可以包括，例如，皮质类固醇(例如用于使补体系统所属的受试者的免疫系统平静，并阻止其攻击肾小球)、免疫抑制药(例如用于抑制受试者的免疫系统的功能，该系统会导致C3G引起的肾脏损害)、ACEI抑制剂和ARB(用于，例如，减少蛋白质损失和控制血压的血压药物)、饮食变化(例如减少盐(钠)和蛋白质以减轻肾脏的废物负荷)和补体抑制剂。
还可以使用本文公开的大鼠评估任何其他已知或推定的C3G治疗剂的活性。类似地，可以使用本文公开的大鼠，筛选任何其它分子的C3G治疗活性。
C.将推定的C3G治疗剂引入大鼠或大鼠细胞
本文公开的方法可以包括将多种药剂或化合物(例如推定的C3G治疗剂(如抗体或小分子))引入大鼠或大鼠细胞；所述的多种药剂或化合物包括核酸、蛋白质、核酸-蛋白质复合物、肽模拟物、抗原结合蛋白或小分子。“引入”包括以这样的方式向大鼠或大鼠细胞呈现分子(例如核酸或蛋白质或小分子)，使得该分子能够进入大鼠细胞内部或大鼠内的细胞内部。引入可以通过任何方式完成。如果引入多个组份，这些组份可以同时或以任何组合顺序被引入。另外，可以通过相同的递送方法或不同的递送方法将两个或更多组分引入大鼠细胞或大鼠中。类似地，可以通过相同的给药途径或不同的给药途径将两个或更多组分引入大鼠。
引入大鼠或大鼠细胞的药剂或化合物可以在包含载体的组合物中提供，所述载体增加了被引入的分子的稳定性(例如，在给定的储存条件下(例如-20℃、4℃，或环境温度)延长降解产物的含量低于阈值(例如低于起始核酸或蛋白质的重量的0.5％)的时间；或增加体内稳定性)。此类载体的非限制性实例包括聚(乳酸)(PLA)微球、聚(D,L-乳酸-甘醇酸)(poly(D,L-lactic-coglycolic-acid)，PLGA)微球、脂质体、胶束、反胶束、脂质卷，和脂质微管。
本文提供了各种方法和组合物，以允许将推定的C3G治疗剂或化合物引入大鼠细胞或大鼠中。将药剂引入各种细胞类型的方法是本领域已知的，包括例如稳定的转染方法、瞬时转染方法和病毒介导的方法。
转染方案以及用于将药剂引入细胞的方案是多样的。非限制性转染方法包括基于化学品的转染方法，其使用脂质体；纳米粒子；磷酸钙(Graham et al.(1973)Virology 52(2):456–67，Bacchetti et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74(4):1590–4，和Kriegler,M(1991).Transfer and Expression:A Laboratory Manual.New York:W.H.Freeman and Company.pp.96–97)；树状聚合物；或阳离子聚合物(例如DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺)。非化学方法包括电穿孔、声纳穿孔，和光学转染。基于粒子的转染包括使用基因枪或磁辅助转染(Bertram(2006)Current Pharmaceutical Biotechnology 7,277–28)。病毒方法也可以用于转染。
还可以通过电穿孔、通过卵细胞质内注射(intracytoplasmic injection)、通过病毒感染、通过腺病毒、通过腺相关病毒、通过慢病毒、通过逆转录病毒、通过转染、通过脂质介导的转染，或通过核转染将推定的C3G治疗剂或化合物引入细胞。核转染是一种改进的电穿孔技术，其使核酸底物不仅可以传递到细胞质，还可以通过核膜递送到细胞核。另外，在本文公开的方法中使用核转染通常比常规电穿孔需要更少的细胞(例如仅需约200万，而常规电穿孔则需700万)。在一实施例中，使用
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NUCLEOFECTORTM系统进行核转染。
也可以通过显微注射来将推定的C3G治疗剂或化合物引入细胞(例如合子)。在合子(即单细胞期胚胎)中，显微注射可以注入母系和/或父系原核或注入细胞质中。进行显微注射的方法是众所周知的。参见，例如，Nagy et al.(Nagy A,Gertsenstein M,VinterstenK,Behringer R.,2003,Manipulating the Mouse Embryo.Cold Spring Harbor,NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press)；还参见Meyer et al.(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107:15022-15026和Meyer et al.(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA109:9354-9359。
将推定的C3G治疗剂或化合物引入大鼠细胞或大鼠的其它方法可包括，例如，载体递送、颗粒介导的递送、外体介导的递送、脂质纳米颗粒介导的递送、细胞穿膜肽介导的递送，或可移植入装置介导的递送。作为具体实例，可以将核酸或蛋白质在诸如聚(乳酸)(PLA)微球、聚(D,L-乳酸-甘醇酸)(PLGA)微球、脂质体、胶束、反胶束、脂质卷，或脂质微管的载体中引入大鼠细胞或大鼠。递送至大鼠的一些具体实例包括流体动力递送、病毒介导的递送(例如，腺相关病毒(AAV)介导的递送)，和脂质纳米颗粒介导的递送。
可以通过流体动力递送(HDD)将推定的C3G治疗剂或化合物引入大鼠细胞或大鼠。流体动力递送已经作为体内的细胞内DNA递送的方法出现。为了将基因递送至实质细胞，仅需要通过选定的血管注射必需的DNA序列，从而消除了与当前的病毒载体和合成载体有关的安全隐患。当注射入血液时，DNA能够到达血液可及的不同组织中的细胞。流体动力递送利用通过将大量溶液快速注射到循环中的不可压缩的血液中所产生的力来克服内皮和细胞膜的物理屏障，该物理屏障阻止了大的和膜不可渗透的化合物进入实质细胞。除了DNA的递送外，此方法还可用于体内的RNA、蛋白质，和其它小化合物的有效细胞内递送。参见，例如，Bonamassa et al.(2011)Pharm.Res.28(4):694-701，出于所有目的通过引用整体并入本文。
还可以通过病毒介导的递送(例如AAV介导的递送或慢病毒介导的递送)来实现推定的C3G治疗剂或化合物的引入。其它示例性病毒/病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、痘病毒，和单纯疱疹病毒。病毒可以感染分裂细胞、非分裂细胞，或分裂和非分裂细胞两者。病毒可以整合到宿主基因组中，也可以不整合到宿主基因组中。还可以对此类病毒进行工程化，使其免疫力降低。病毒可以是可复制型的，也可以是复制缺陷型的(例如，在另一轮病毒体复制和/或包装中必需的一个或多个基因中有缺陷)。病毒可引起瞬时表达、长期表达(例如至少1周、2周、1个月、2个月，或3个月)，或永久表达。示例性病毒滴度(例如AAV滴度)包括1012、1013、1014、1015，和1016载体基因组/mL。
推定的C3G治疗剂或化合物的引入也可以通过脂质纳米颗粒(LNP)介导的递送来实现。脂质制剂可以保护生物分子免于降解，同时改善其细胞摄取。脂质纳米颗粒是包含通过分子间力彼此物理结合的多个脂质分子的颗粒。其包括微球(包括单层和多层囊泡，例如脂质体)、乳液中的分散相、胶束或悬浮液中的内相。
体内给药可以通过任何合适的途径进行，包括，例如，肠胃外、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、鞘内、腹膜内、局部、鼻内，或肌肉内。全身性给药方式包括，例如，口服和肠外途径。肠外途径的实例包括静脉内、动脉内、骨内(intraosseous)，肌肉内、皮内、皮下、鼻内，和腹膜内途径。一个具体的例子是静脉输液。局部给药方式包括，例如，鞘内、脑室内、实质内(例如局部实质内递送至纹状体(例如进入尾状核(caudate)或壳核)、大脑皮层、中央前回、海马(例如进入齿状回或CA3区)、颞叶皮层(temporal cortex)、杏仁核、额叶皮层(frontal cortex)、丘脑、小脑、延髓、下丘脑、顶盖、被盖，或黑质)、眼内、眶内、结膜下、玻璃体内、视网膜下，和巩膜途径。与全身给药(例如静脉内)相比，当局部给药(例如实质内或玻璃体内)时，显著更少量的组分(与全身途径相比)即可以发挥作用。局部给药方式还可以减少或消除全身给药治疗有效量的组分时可能发生的潜在毒性副作用的发生。在一个特定的例子中，给药途径是皮下或静脉内。
可以使用一种或多种生理和药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂，或助剂配制包含推定的C3G治疗剂或化合物的组合物。该制剂可以取决于选择的给药途径。术语“药学上可接受的”是指载体、稀释剂、赋形剂，或助剂与制剂的其它成分相容并且对其接受者基本上无害。
给药频率和剂量数目可以取决于推定的C3G治疗剂或化合物的半衰期和给药途径以及其它因素。可以在一段时间内进行一次或多次的将推定的C3G治疗剂或化合物引入大鼠细胞或大鼠中。例如，引入可以在一段时间内至少执行两次、在一段时间内至少执行三次、在一段时间内至少执行四次、在一段时间内至少执行五次、在一段时间内至少执行六次、在一段时间内至少执行七次、在一段时间内至少执行八次、在一段时间内至少执行九次、在一段时间内至少执行十次、至少执行十一次、在一段时间内至少执行十二次、在一段时间内至少执行十三次、在一段时间内至少执行十四次、在一段时间内至少执行十五次、在一段时间内至少执行十六次、在一段时间内至少执行十七次、在一段时间内至少执行十八次、在一段时间内至少执行十九次，或在一段时间内至少执行二十次。
IV.制作包含失活的Cfh基因座的大鼠的方法
提供了各种方法来制备如本文其它地方所述的包含失活的Cfh基因座的大鼠。同样，提供了各种方法来制备如本文其它地方所述的失活的大鼠Cfh基因或基因座或包含失活的Cfh基因座的大鼠基因座或大鼠细胞。用于生产基因修饰大鼠的任何方便的方法或方案都适用于生产这种基因修饰的大鼠。参见，例如，Cho et al.(2009)Current Protocolsin Cell Biology42:19.11:19.11.1–19.11.22和Gama Sosa et al.(2010)BrainStruct.Funct.214(2-3):91-109，出于所有目的，将每一篇均通过引用整体并入本文。这样的基因修饰的大鼠可以例如通过在靶Cfh基因座处的基因敲除产生。
例如，产生包含失活的Cfh基因座的大鼠的方法可包括：(1)修饰多能细胞的基因组以包含失活的Cfh基因座；(2)识别或选择包含失活的Cfh基因座的基因修饰的多能细胞；(3)将该基因修饰的多能细胞导入大鼠宿主胚胎中；以及(4)将宿主胚胎移植入代孕母体中并在代孕母体中孕育宿主胚胎。替代地，产生包含失活的Cfh基因座的大鼠的方法可包括：(1)修饰多能细胞的基因组以包含失活的Cfh基因座；(2)识别或选择包含失活的Cfh基因座的基因修饰的多能细胞；(3)将基因修饰的多能细胞导入大鼠宿主胚胎中；以及(4)在代孕母体中孕育宿主胚胎。可选地，可以将包含修饰的多能细胞(例如大鼠ES细胞)的宿主胚胎培育至胚泡阶段，然后将其移植入代孕母体并在代孕母体中孕育，以产生F0大鼠。代孕母体然后可以产生包含失活的Cfh基因座的F0代大鼠。
所述方法可以进一步包括识别具有修饰的靶基因组基因座的细胞或动物。可以使用多种方法来识别具有靶向基因修饰的细胞和动物。
筛选步骤可以包括例如用于评估亲代染色体的等位基因修饰(MOA)的定量测定。例如，可以通过定量PCR，例如实时PCR(qPCR)，来进行定量测定。实时PCR可以利用识别靶基因座的第一引物组和识别非靶定参考基因座的第二引物组。引物组可以包含识别扩增的序列的荧光探针。等位基因丢失(LOA)测定颠倒了传统的筛选逻辑，并量化了突变所针对的天然基因座的拷贝数。在正确靶向的杂合细胞克隆中，LOA测定检测到两个天然等位基因之一(对于不在X或Y染色体上的基因)，另一个等位基因被靶向修饰破坏。例如，可以将
Figure BDA0003041521230000481
用于量化基因组DNA样品中DNA模板的拷贝数，特别是通过与参考基因进行比较来量化(参见，例如，US 6,596,541，出于所有目的通过引用整体并入本文)。参考基因在与靶基因或基因座相同的基因组DNA中进行定量。因此，进行了两次
Figure BDA0003041521230000482
扩增(每个都有其各自的探针)。一个
Figure BDA0003041521230000483
探针确定参考基因的“Ct”(阈值周期)，而另一探针确定被成功靶向所替代的靶基因或基因座区域的Ct(即LOA测定)。Ct是反映每个
Figure BDA0003041521230000484
探针的起始DNA量的量，即，量较少的序列需要更多次的PCR循环才能达到阈值循环。将
Figure BDA0003041521230000485
反应的模板序列的拷贝数减少一半，将导致增加约1个Ct单位。在靶基因或基因座的一个等位基因已被同源重组替代的细胞中，
Figure BDA0003041521230000487
反应将导致靶
Figure BDA0003041521230000486
反应的Ct增加，而参考基因的Ct不增加(与来自非靶向细胞的DNA相比)。
合适的定量测定的其它实例包括荧光介导原位杂交(FISH)、比较基因组杂交、等温DNA扩增、定量杂交至固定探针、
Figure BDA0003041521230000488
探针、
Figure BDA0003041521230000489
分子信标探针，或ECLIPSETM探针技术(参见例如US2005/0144655，其出于所有目的以全文引用方式并入本文)。下一代测序(NGS)也可以用于筛选。下一代测序也可以称为“NGS”或“大规模并行测序”或“高通量测序”。在本文公开的方法中，没有必要使用选择标记来筛选靶细胞。例如，可以在不使用选择盒的情况下依靠本文所述的MOA(例如LOA)和NGS测定。
合适的多能细胞的例子是胚胎干(ES)细胞。修饰的多能细胞可通过例如以下重组产生：通过(a)将一个或多个靶向载体或外源供体核酸引入细胞中，该靶向载体或外源供体核酸包含与内源Cfh基因座上的5'和3'靶序列相对应的5'和3'同源臂，其中所述外源供体核酸或靶向载体被设计为突变或缺失内源Cfh基因座的起始密码子或删除内源Cfh基因座中的全部或部分编码序列(可选地包括起始密码子)。同样地，修饰的大鼠单细胞期胚胎可以例如通过重组来产生：通过(a)将一个或多个靶向载体或外源供体核酸引入单细胞期胚胎，所述外源供体核酸包含与内源Cfh基因座上的5'和3'靶序列相对应的5'和3'同源臂，其中所述外源供体核酸或靶向载体被设计为突变或缺失内源Cfh基因座的起始密码子或删除内源Cfh基因座中的全部或部分编码序列(可选地包括起始密码子)。同样地，修饰的大鼠基因组或失活的大鼠Cfh基因或基因座可以例如通过重组来产生：通过(a)使大鼠基因组或大鼠Cfh基因或基因座与更多的靶向载体或外源供体核酸接触，所述外源供体核酸包含与内源Cfh基因座上的5'和3'靶序列相对应的5'和3'同源臂，其中所述外源供体核酸或靶向载体被设计为突变或缺失内源Cfh基因座的起始密码子或删除内源Cfh基因座中的全部或部分编码序列(可选地包括起始密码子)。可选地，5'和3'同源臂可以侧接插入核酸，该插入核酸包含例如报道基因或选择标记，并且所述识别可以包括识别至少一个在其基因组中包含整合在靶基因组基因座上的插入核酸的细胞。替代地，修饰的多能细胞可以例如通过以下产生：通过(a)向细胞中引入：(i)一个或多个核酸酶试剂，其中所述核酸酶试剂在靶基因组基因座内的靶序列处诱导切口或双链断裂；以及(b)识别至少一个在靶基因组基因座处包含修饰(例如靶核酸的删除)的细胞。类似地，修饰的大鼠单细胞期胚胎可通过以下产生：通过(a)向大鼠单细胞期胚胎中引入：(i)一个或多个核酸酶试剂，其中所述核酸酶试剂在靶基因组基因座内的靶序列处诱导切口或双链断裂；以及(b)识别至少一个在靶基因组基因座处包含修饰(例如靶核酸的删除)的细胞。类似地，修饰的大鼠基因组或失活的大鼠Cfh基因或基因座可以例如通过使大鼠基因组或大鼠Cfh基因或基因座与一个或多个核酸酶试剂接触而产生，其中核酸酶试剂在大鼠Cfh基因或基因座中的靶基因组基因座内的靶序列处诱导切口或双链断裂。替代地，修饰的多能细胞可通过以下产生：通过(a)向细胞中引入：(i)一个或多个核酸酶试剂，其中所述核酸酶试剂在靶基因组基因座内的靶序列处诱导切口或双链断裂；以及(ii)一个或多个靶向载体或外源供体核酸，其包含对应于5'和3'靶序列的5'和3'同源臂，所述5'和3'靶序列位于与核酸酶靶序列足够接近之处；以及(c)识别在靶基因组基因座处包含所需的修饰的至少一个细胞。类似地，修饰的大鼠单细胞期胚胎可通过以下产生：通过(a)向大鼠单细胞期胚胎中引入：(i)一个或多个核酸酶试剂，其中所述核酸酶试剂在靶基因组基因座内的靶序列处诱导切口或双链断裂；以及(ii)一个或多个靶向载体或外源供体核酸，其包含对应于5'和3'靶序列的5'和3'同源臂，所述5'和3'靶序列位于与核酸酶靶序列足够接近之处；以及(c)识别在靶基因组基因座处包含所需的修饰的至少一个细胞。类似地，修饰的大鼠基因组或失活的大鼠Cfh基因或基因座可以例如通过使大鼠基因组或大鼠Cfh基因或基因座与以下接触而产生：(i)一个或多个核酸酶试剂，其中核酸酶试剂在大鼠Cfh基因或基因座中的靶基因组基因座内的靶序列处诱导切口或双链断裂；以及(ii)一个或多个靶向载体或外源供体核酸，其包含对应于5'和3'靶序列的5'和3'同源臂，所述5'和3'靶序列位于与核酸酶靶序列足够接近之处。可以使用诱导切口或双链断裂进入所需的靶序列的任何核酸酶试剂。合适的核酸酶的实例包括类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、兆核酸酶，和成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)系统(例如CRISPR/Cas9系统)或此类系统的组分(例如CRISPR/Cas9)。参见，例如，US 2013/0309670和US 2015/0159175，出于所有目的将每一篇的全部内容通过引用整体并入本文。
在一个具体实施例中，制备包含失活的内源Cfh基因座的大鼠的方法包括：(a)将第一核酸酶试剂引入大鼠胚胎干(ES)细胞，所述第一核酸酶试剂靶向邻近内源Cfh基因组基因座的起始密码子的第一靶序列，其中所述核酸酶试剂切割所述第一靶序列，以产生包含失活的内源Cfh基因座的基因修饰的大鼠ES细胞；(b)将基因修饰的大鼠(ES)细胞引入大鼠宿主胚胎中；以及(c)在代孕母体中孕育大鼠宿主胚胎，其中所述代孕母体产生包含所述失活的内源Cfh基因座的F0后代基因修饰的大鼠。在另一个具体实施例中，制备包含失活的内源Cfh基因座的大鼠的方法可包括：(a)将第一核酸酶试剂引入大鼠单细胞期胚胎，所述第一核酸酶试剂靶向邻近内源Cfh基因组基因座的起始密码子的第一靶序列，其中所述核酸酶试剂切割所述第一靶序列，以产生包含失活的内源Cfh基因座的基因修饰的大鼠单细胞期胚胎；以及(b)在代孕母体中孕育所述基因修饰的大鼠单细胞期胚胎，其中所述代孕母体产生包含所述失活的内源Cfh基因座的F0后代基因修饰的大鼠。所述第一核酸酶试剂的第一靶序列可以为，例如，在所述内源Cfh基因座的第一外显子中、第一外显子的上游((例如在5'非翻译区域(UTR 5'))处，或所述第一外显子的下游处。例如，靶序列可以在起始密码子的约10、约20、约30、约40、约50、约100、约200、约300、约400、约500或约1000个核苷酸内。作为一个具体实施例，靶序列可以在起始密码子的约100个核苷酸内。可选地，第一核酸酶试剂是Cas9蛋白和指导RNA。Cas9蛋白可以以蛋白质、mRNA，或DNA的形式递送，而指导RNA可以以RNA或DNA的形式递送。例如，Cas9蛋白和指导RNA都可以以DNA的形式递送。例如，编码Cas9蛋白的DNA可以包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：SEQ ID NO：6。Cas9蛋白序列可以包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：SEQ ID NO：7。可选地，第一靶序列包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：SEQ ID NO：12或13。可选地，指导RNA序列包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：SEQ ID NO：8或9。核酸酶试剂可以切割第一靶序列，第一靶序列可以通过非同源末端连接(NHEJ)修复，从而导致在靶基因组基因座处的破坏起始密码子的其它缺失和/或插入(indels)。
这种方法中的步骤(a)还课包括将第二核酸酶试剂引入所述大鼠ES细胞中，所述第二核酸酶试剂靶向邻近内源Cfh基因座的终止密码子的第二靶序列。同样地，这种方法中的步骤(a)还包括将第二核酸酶试剂引入大鼠单细胞期胚胎，所述第二核酸酶试剂靶向邻近内源Cfh基因座的终止密码子的第二靶序列。第二核酸酶试剂的第二靶序列可位于所述内源Cfh基因座的倒数第二个内含子、倒数第二个外显子、最后一个外显子、最后一个外显子的上游(例如最后一个内含子)，或最后一个外显子的下游(例如3'非翻译区域(UTR 3'))中。例如，靶序列可以在终止密码子的约10、约20、约30、约40、约50、约100、约200、约300、约400、约500、约1000、约2000、约3000、约4000，或约5000个核苷酸内。在一个具体实施例中，靶序列可以在终止密码子的约200个核苷酸内或在终止密码子的约3000个核苷酸内。可选地，第二核酸酶试剂是Cas9蛋白和指导RNA。Cas9蛋白可以以蛋白质、mRNA，或DNA的形式递送，而指导RNA可以以RNA或DNA的形式递送。可选地，第二靶序列包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：SEQ ID NO：14或15。可选地，指导RNA序列包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：SEQ ID NO：10或11。第一核酸酶试剂和第二核酸酶试剂可以分别切割第一靶序列和第二靶序列，第一靶序列和第二靶序列可以通过非同源末端连接(NHEJ)修复，以删除第一和第二靶序列之间的序列，从而删除内源Cfh基因座的一些或全部编码序列。
替代地，这样的方法中的步骤(a)还包括将第二核酸酶试剂引入所述大鼠ES细胞中，所述第二核酸酶试剂靶向邻近内源Cfh基因座的起始密码子的第二靶序列，所述第二靶序列不同于所述第一靶序列。类似地，这样的方法中的步骤(a)还可包括将第二核酸酶试剂引入大鼠单细胞期胚胎中，所述第二核酸酶试剂靶向邻近内源Cfh基因座的起始密码子的第二靶序列，所述第二靶序列不同于所述第一靶序列。第一核酸酶试剂的第一靶序列可例如在所述内源Cfh基因座的第一外显子中或第一外显子上游(例如5'UTR)中，且第二核酸酶试剂的第二靶序列可例如在所述内源Cfh基因座的第一外显子中或第一外显子的下游(例如第一内含子)中。例如，靶序列可以在起始密码子的约10、约20、约30、约40、约50、约100、约200、约300、约400、约500，或约1000个核苷酸内。在一个具体实施例中，靶序列可以在起始密码子的约100个核苷酸内。可选地，第二核酸酶试剂是Cas9蛋白和指导RNA。Cas9蛋白可以以蛋白质、mRNA，或DNA的形式递送，而指导RNA可以以RNA或DNA的形式递送。可选地，第一和第二靶序列侧接起始密码子。可选地，第一靶序列包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：SEQ ID NO：12；且第二靶序列包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：SEQ IDNO：13。可选地，第一指导RNA包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：SEQ ID NO：8；且第二指导RNA包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：SEQ ID NO：9。第一核酸酶试剂和第二核酸酶试剂可以分别切割第一靶序列和第二靶序列，第一靶序列和第二靶序列可以通过非同源末端连接(NHEJ)修复，以删除第一和第二靶序列之间的序列，从而删除起始密码子。
这样的方法中的步骤(a)还包括将第三核酸酶试剂和/或第四核酸酶试剂引入所述大鼠ES细胞，其中第三和第四核酸酶试剂分别靶向内源Cfh基因座的终止密码子附近的第三和第四靶序列，其中第三和第四靶序列是不同的。类似地，这样的方法中的步骤(a)还包括将第三核酸酶试剂和/或第四核酸酶试剂引入大鼠单细胞期胚胎，其中第三和第四核酸酶试剂分别靶向内源Cfh基因座的终止密码子附近的第三和第四靶序列，其中第三和第四靶序列是不同的。所述第三和第四靶序列可为，例如，位于所述内源Cfh基因座的倒数第二个内含子、倒数第二个外显子(例如外显子21)、最后一个外显子(例如外显子22)、最后一个外显子上游(例如最后一个内含子)，或最后一个外显子下游(例如3'UTR)中。例如，靶序列可以在终止密码子的约10、约20、约30、约40、约50、约100、约200、约300、约400、约500、约1000、约2000、约3000、约4000，或约5000个核苷酸内。在一个具体实施例中，靶序列可以在终止密码子的约200个核苷酸内或终止密码子的约3000个核苷酸内。可选地，第三和/或第四核酸酶试剂是Cas9蛋白和指导RNA。Cas9蛋白可以以蛋白质、mRNA，或DNA的形式递送，而指导RNA可以以RNA或DNA的形式递送。可选地，第三和/或第四靶序列包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：分别为SEQ ID NO：14和/或15。可选地，第三指导RNA和/或第四指导RNA包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：分别为SEQ ID NO：10和/或11。第一核酸酶试剂和/或第二核酸酶试剂可以分别切割第一靶序列和/或第二靶序列，且第三核酸酶试剂和/或第四核酸酶试剂可以分别切割第三靶序列和/或第四靶序列；其可以通过非同源末端连接(NHEJ)修复，以删除第一和第二靶序列之间的序列、第一和第三靶序列之间的序列、第一和第四靶序列之间的序列、第二和第三靶序列之间的序列，或第二和第四靶序列之间的序列，从而删除内源Cfh基因座的大部分或全部编码序列。
这样的方法中的步骤(a)还可进一步包括将外源供体核酸或靶向载体引入所述大鼠ES细胞，所述外源供体核酸或靶向载体包含与内源Cfh基因座处的5'靶序列杂交的5'同源臂和在与内源Cfh基因座处的3'靶序列杂交的3'同源臂，其中所述外源供体核酸或靶向载体被设计成突变或删除内源Cfh基因座的起始密码子或被设计成删除内源Cfh基因座的一些或所有编码序列(可选地包括起始密码子)。类似地，在一些这样的方法中的步骤(a)还包括将外源供体核酸或靶向载体引入大鼠单细胞期胚胎，所述外源供体核酸或靶向载体包含与内源Cfh基因座处的5'靶序列杂交的5'同源臂和与内源Cfh基因座处的3'靶序列杂交的3'同源臂，其中所述外源供体核酸或靶向载体被设计成突变或删除内源Cfh基因座的起始密码子或被设计成删除内源Cfh基因座的一些或所有编码序列(可选地包括起始密码子)。替代地或另外地，外源供体核酸或靶向载体可以被设计为通过将插入序列(被5'和3'同源臂侧接)插入起始密码子或内源Cfh基因座中来破坏起始密码子。在这样的方法中，外源供体核酸或靶向载体可以通过同源介导的修复(homology directed repair)与靶基因座重组，或者可以通过NHEJ介导的插入被插入以产生失活的Cfh基因座。例如，外源供体序列或靶向载体可删除5'和3'靶序列之间的基因组序列，以产生失活的Cfh基因座。在一个例子中，5'和3'靶序列可以侧接内源Cfh基因座的起始密码子。在另一个例子中，5'和3'靶序列可以侧接内源Cfh基因座的第一外显子。在又一个例子中，5'和3'靶序列可以侧接内源Cfh基因座的一些或全部编码序列。
可以在任何阶段将供体细胞引入宿主胚胎，例如胚泡阶段或前桑葚胚阶段(pre-morula stage)(即4细胞阶段或8细胞阶段)。产生了能够通过种系传递基因修饰的后代。参见，例如，美国专利号7,294,754，出于所有目的通过引用整体并入本文。
可选地，产生本文其它地方所描述的大鼠的方法可包括：(1)使用上述修饰多能细胞的方法修饰单细胞期胚胎的基因组，以包含失活的Cfh基因座；(2)选择基因修饰的胚胎；以及(3)将该基因修饰的胚胎移植入代孕母体中并在代孕母体中孕育。替代地，产生本文其它地方所描述的大鼠的方法可包括：(1)使用上述修饰多能细胞的方法修饰单细胞期胚胎的基因组，以包含失活的Cfh基因座；(2)选择基因修饰的胚胎；以及(3)将该基因修饰的胚胎在代孕母体中孕育。产生了能够通过种系传递基因修饰的后代。
核转移技术也可以用于产生小鼠。简而言之，核转移的方法可以包括以下步骤：(1)将卵细胞去核或提供去核卵细胞；(2)分离或提供将与该去核卵细胞结合的供体细胞或细胞核；(3)将细胞或细胞核插入去核卵细胞中以形成重构细胞；(4)将重构细胞移植入动物子宫内形成胚胎；以及(5)允许该胚胎发育。在这种方法中，卵细胞通常是从死去的动物身上获得的，尽管它们也可以从活体动物的输卵管和/或卵巢中分离。去核之前，卵细胞可在多种众所周知的培养基中成熟。卵细胞的去核可以多种公知的方式进行。可以通过融合前在透明带下显微注射供体细胞，将供体细胞或细胞核插入去核卵细胞以形成重构细胞。可以通过在接触/融合平面上施加直流电脉冲(电融合)，通过将细胞暴露于融合促进化学物质(例如聚乙二醇)，或通过失活病毒(例如仙台病毒)来诱导融合。重构的细胞可以在核供体和受体卵细胞融合之前、之中，和/或之后通过电和/或非电方式激活。激活方法包括电脉冲、化学诱导的电击、精子穿透、卵细胞中二价阳离子水平的增加，以及卵细胞中细胞蛋白的磷酸化的降低(通过激酶抑制剂的方式)。活化的重构细胞或胚胎可以在众所周知的培养基中培养，然后转移到动物的子宫中。参见，例如，US 2008/0092249、WO 1999/005266、US2004/0177390、WO 2008/017234，和美国专利号7,612,250，出于所有目的将其每一篇的全部内容通过引用整体并入本文。
本文提供的各种方法允许产生基因修饰的F0大鼠，其中基因修饰的F0大鼠的细胞包含失活的Cfh基因座。基因修饰的F0大鼠的细胞对于失活的Cfh基因座可以是杂合的，或者对于失活的Cfh基因座可以是纯合的。
出于所有目的，上文或下文所引用的所有专利文件、网站、其它出版物、登录号等均以引用的方式整体并入本文，其程度与将每个单独的项目具体并单独地指示为通过引用并入本文的程度相同。如果序列的不同版本在不同时间与登录号相关联，则意指在本申请的有效申请日与登录号相关联的版本。有效申请日是指实际的申请日或提及登录号的优先权申请(如有的话)的申请日中较早的日期。同样，如果在不同时间发布了出版物，网站等的不同版本，则除非另有说明，是指在本申请的有效申请日最近发布的版本。除非另外明确指出，否则本发明的任何特征、步骤、元素、实施例，或方面可以与任何其它相结合使用。尽管出于清楚和理解的目的已经通过图示和示例的方式对本发明进行了详细描述，但是显而易见的是，可以在所附权利要求的范围内进行某些改变和修改。
序列简述
使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码示出所附序列表中列出的核苷酸和氨基酸序列。核苷酸序列遵循从序列5'末端开始并向前(即每行从左到右)到3'末端的标准约定。每个核苷酸序列仅显示一条链，但任何对所示出的链的提及均应理解为包括互补链。当提供编码氨基酸序列的核苷酸序列时，应当理解还提供了其编码相同氨基酸序列的密码子简并变体。氨基酸序列遵循从序列的氨基末端开始并向前(即在每行中从左至右)到达羧基末端的标准约定。
表2：序列描述。
SEQ ID NO 类型 描述
1 DNA 大鼠Cfh基因组序列
2 DNA 大鼠Cfh编码序列
3 蛋白质 大鼠CFH蛋白质序列(NP_569093.2)
4 DNA 克隆AA8中的大鼠Cfh修饰基因组位点
5 DNA 克隆AA8中删除的大鼠基因组Cfh序列
6 DNA Cas9 DNA序列
7 蛋白质 Cas9蛋白质序列
8 RNA rGU1 sgRNA
9 RNA rGU2 sgRNA
10 RNA rGD2 sgRNA
11 RNA rGD3 sgRNA
12 DNA rGU1靶序列
13 DNA rGU2靶序列
14 DNA rGD2靶序列
15 DNA rGD3靶序列
16 DNA 大鼠CFH mRNA(cDNA)分配的登录号NM_130409.2
17 DNA rTUF
18 DNA rTUP
19 DNA rTUR
20 DNA rTU2F
21 DNA rTU2P
22 DNA rTU2R
23 DNA AmpF1
24 DNA AmpR1
25 DNA AmpF2
26 DNA AmpR2
实施例
实施例1：包含失活的Cfh基因座的小鼠的产生
为了产生敲除的大鼠Cfh等位基因，将指导RNA设计成在Cfh基因的末端切割以折叠(删除)编码序列，或设计成在起始密码子侧翼的位点切割以删除起始密码子。没有使用靶向载体。内源大鼠Cfh基因座(外显子1至外显子22)示于SEQ ID NO：1。大鼠Cfh编码序列示于SEQ ID NO：2。大鼠CFH蛋白序列示于SEQ ID NO：。
将包括四个指导RNA(在SEQ ID NO：12-15中列出的指导RNA靶序列分别对应rGU1、rGU2、rGD2和rGD3)的CRISPR/Cas9组分引入Dark Agouti大鼠胚胎干细胞中。具体地，将2×106个大鼠ES细胞(Dark Agouti品系DA2B)用以下物质电穿孔：5μg的Cas9表达质粒(SEQ IDNO：6所示的Cas9编码序列)；以及各5μg的编码以下gRNA的DNA：rGU1、rGU2、rGD2和rGD3(分别为SEQ ID NO：8-11中列出的指导RNA序列，其分别靶向SEQ ID NO：12-15中列出的大鼠Cfh序列)。rGD2靶序列与在SEQ ID NO：1中列出的大鼠Cfh基因组序列中标注的靶序列具有一个核苷酸差异(在残基17处为“C”而非“A”)。该差异的原因是指导RNA对Dark Agouti品系序列(所使用的大鼠ES品系)具有特异性，而基因组序列来自Brown Norway品系(用于对大鼠基因组进行测序的品系)。A/C变体是Dark Agouti和Brown Brown之间的SNP。电穿孔条件为：400V电压；100mF电容；和0W电阻。通过
Figure BDA0003041521230000581
等位基因丢失测定挑选、扩增，和筛选集落(colonies)，以检测内源大鼠等位基因的丢失。参见图1B。表3列出了用于等位基因丢失测定的引物和探针。
表3：筛选测定
用于 引物/探针 序列 SEQ ID NO
TU LOA rTUF CATAGCAGAGAGGAACTGGATGGT 17
TU LOA rTUP GCACATACTTCTCTT 18
TU LOA rTUR GTCAACTGCTCCCAGATAGATCCAAG 19
TU2 LOA rTU2F ACCACCACCTTTCTCCCTTCTGACTG 20
TU2 LOA rTU2P GCCGCATTATAAAACA 21
TU2 LOA rTU2R TTGCTGATAATATTTCTCATAGCAA 22
NGS对1(NGS pair 1) AmpF1 ATTTCCTAAACTAACTTTCAAC 23
NGS对1 AmpR1 GTGGTAAGTTTAAAAACCGTGAA 24
NGS对2(NGS pair 2) AmpF2 CGCCTATGCTGCTGGACTTGTGGT 25
NGS对2 AmpR2 CTTTCACTTGACTATTGTAATTGAT 26
在例如US 2014/0178879；US 2016/0145646；WO 2016/081923；和Frendewey etal.(2010)Methods Enzymol.476:295-307中描述了包括等位基因丢失(LOA)和等位基因获得(GOA)测定的等位基因修饰(MOA)测定，出于所有目的，通过引用将其每一篇的全部内容合并于此。等位基因丢失(LOA)测定颠倒了传统的筛选逻辑，并量化了突变所针对的天然基因座的基因组DNA样本中的拷贝数。在正确靶向的杂合细胞克隆中，LOA测定检测到两个天然等位基因之一(对于不在X或Y染色体上的基因)，另一个等位基因被靶向修饰破坏。
筛选了六个克隆，并示于图1A和下表4中。识别出Cfh的一个等位基因被折叠的集落。还识别出其中仅外显子1(含有ATG起始密码子)被删除的集落。使用克隆AA8建立Cfh基因敲除大鼠品系，其在外显子1中具有杂合的146bp缺失，其删除内含子1中的ATG起始密码子、外显子1编码序列和剪接供体位点。所删除的序列示于SEQ ID NO：5，克隆AA8中的修饰的Cfh基因组基因座示于SEQ ID NO：4。将阳性克隆AA8解冻、扩增并通过
Figure BDA0003041521230000595
再次确认。还通过下一代测序(NGS)证实AA8。
表4：大鼠Cfh敲除克隆
克隆 突变 显微注射日期 嵌合体 生殖系传递
BE6 ΔCDS(97kb) 5/6/16；5/20/16 0 N/A
HG6 ΔCDS(97kb) 5/6/16；5/20/16 0 N/A
BB7 ΔCDS(97kb) 5/20/16 1M 否
AE1 Δ外显子1(183bp) 9/30/16 3F；3MPE 否
AA8 Δ外显子1(146bp) 9/30/16 1M 是
AB5 Δ外显子1(～900bp) 9/30/16 2M 否
使用US 2014/0235933、US 2014/0310828、WO 2014/130706，和WO 2014/172489中描述的方法产生F0和F1大鼠，出于所有目的将其每一篇全部内容通过引用并入本文。将已确认的靶向大鼠ES细胞克隆AA8(Dark Agouti)显微注射到Sprague Dawley(SD)胚泡中，然后将其转移到假孕(pseudopregnant)受体雌性(SD受体雌性)中，以使用标准技术进行妊娠。通过包被颜色识别嵌合体，并将雄性F0嵌合体与相同种系的雌性野生型大鼠(SD雌性)。然后对生殖系(例如刺鼠(agouti))F1幼仔进行基因型分型，确定纯合修饰的等位基因的存在。纯合的F1 Cfh基因敲除大鼠为50％的Dark Agouti和50％的Sprague Dawley。
实施例2.包含失活的Cfh基因座的大鼠的表征
为了评估Cfh敲除大鼠是否重现了C3肾小球病(C3G)的表型，评估了与替代补体途径激活、肾脏病理学和死亡率有关的各种读数。C3肾小球病(C3G)的特征在于作为C3肾病因子和/或补体基因突变的结果的替代途径(AP)补体激活的过度激活。由于大约50％的患者在诊断后10年内会发展为终末期肾病(ESRD)，因此评估了雌性和雌性Cfh基因敲除大鼠(20只雄性大鼠，18只雌性大鼠)的存活率。如图2所示，雄性Cfh基因敲除大鼠死亡的中位年龄为52天
Figure BDA0003041521230000591
雌性Cfh基因敲除大鼠死亡的中位年龄为103天
Figure BDA0003041521230000592
最后一只雄性Cfh基因敲除大鼠在122天
Figure BDA0003041521230000593
死亡，而最后一只雌性Cfh基因敲除大鼠在247天
Figure BDA0003041521230000594
Figure BDA0003041521230000601
死亡。观察到雌性与雄性之间存在差异。雌性小鼠中的补体活性低于雄性小鼠，并且大鼠中可能存在相似的性别差异。这种自发死亡发生在Cfh基因敲除大鼠的生命早期，远低于野生型实验室大鼠的平均三年寿命。此外，在Cfh敲除大鼠中观察到的自发性死亡是比在Cfh敲除小鼠中所观察到的更突然和更快的表型；据报道，在8个月后，Cfh敲除小鼠的死亡率仅为23％。参见Pickering et al.(2002)Nat.Genet.31(4):424-428，出于所有目的通过引用整体并入本文。
与野生型对应相比，在雄性和雌性Cfh敲除大鼠中还观察到较低的循环C3水平。使用来自ABCAM的夹心ELISA在7周龄的雄性和雌性野生型(WT)和Cfh敲除大鼠中测量循环C3水平。稀释样品和标准品，并加入具有结合的C3抗体的平板中。温育后洗涤平板，并加入另一C3抗体。再次温育后，使用抗检测抗体的二抗，然后将其暴露于TMB溶液中以产生可测量的颜色。用酸终止反应，并在450nm下测量信号。补体C3不断水解，可形成液相C3转化酶，随后裂解更多的C3分子。CFH是替代途径的内源负调节剂，是抑制C3激活/裂解所必需的。没有CFH，C3被连续消耗，导致较低的循环水平，如图3所示。
与野生型对应相比，在Cfh敲除大鼠的肾脏中还观察到增加的C3和C5b-9沉积，这与人C3G患者中观察到的一致。参见，例如，Barbour et al.(2013)Semin.Nephrol.33(6):493-507和Vivarelli et al.(2012)N.Engl.J.Med.366(12):1163-1165，出于所有目的，通过引用将其全部内容整体并入本文。分别在来自三只年龄分别为18周、17周和17周的雌性野生型大鼠和三只年龄分别为12周、17周和9周的雌性Cfh敲除大鼠的肾脏样本中测量了C3和C5b-9沉积。使用1:50稀释的荧光素缀合的山羊抗C3(MP Biomedicals#55191)和1：100稀释的兔抗C5b-9(Abcam ab55811)以及1：333.3稀释的Cy5偶联的驴抗兔(JacksonImmunoresearch 711-605-152)对大鼠肾脏的冷冻切片进行免疫组织化学分析。结果示于图4中。Cfh敲除大鼠显示出C3和C5b-9膜攻击复合物(MAC)蛋白的自发沉积，其量远超过在野生型大鼠中所观察到的。
与野生型对应相比，在Cfh敲除大鼠中还观察到严重的肾小球硬化、肾小管萎缩和蛋白性管型。当存在蛋白尿时(当蛋白渗漏入尿液时)会形成管型。管型是肾小管腔内蛋白质固化的结果。从一只15周龄的野生型雌性大鼠和三只年龄分别为12周、13周和15周的雌性Cfh敲除大鼠(CFH KO大鼠1、CFH KO大鼠2和CFH KO大鼠3)采集肾脏样品。用高碘酸-希夫染色肾脏样品。简而言之，将玻片在1％高碘酸中氧化后用希夫试剂染色，然后用苏木精对比染色。如图5所示，Cfh敲除大鼠显示出系膜细胞基质和肾小球袢大小的显著扩张，以及肾小管的明显扩张。这种病理情况比在Cfh基因敲除小鼠中观察到的病理情况更为严重。在Cfh基因敲除小鼠的公开数据中似乎没有显示肾小管病变，而Cfh基因敲除大鼠则很明显地具有肾小管病变。与Cfh基因敲除小鼠的公开数据相比，Cfh基因敲除大鼠似乎还具有更多的肾小球硬化症。参见，例如，Pickering et al.(2002)Nat.Genet.31(4):424-428，出于所有目的通过引用整体并入本文。这些发现与肾功能丧失和死亡率的增加相一致。
与野生型对应相比，Cfh敲除大鼠中的肾小球滤过标记物血尿素氮(BUN)也升高，表明肾小球滤过率降低。从7周龄开始，每周测量雄性野生型和Cfh基因敲除大鼠(图6A)以及雌性野生型和Cfh基因敲除大鼠(图6B)的血尿素氮水平，直到所有Cfh基因敲除大鼠死亡。血尿素氮(BUN)水平的测定试剂盒来自BioAssay Systems。该测定使用Jung方法，该方法利用与尿素形成有色络合物的显色试剂。为此，将血清稀释5倍并以5μL的体积铺板。添加了一个标准。以1：1的比例将200μL试剂A和B添加到板上。20分钟后，在430nm处读取信号。血尿素氮(BUN)是肾功能的标志。当肾脏开始衰竭时，BUN会积聚在血液中。正如在雌性和雄性Cfh基因敲除大鼠中所观察到的那样，循环中BUN的增加意味着肾脏功能下降。参见图6A和6B。这种表型比Cfh基因敲除小鼠更具戏剧性。尽管未在Cfh敲除小鼠中测量BUN水平，但已测量了另一项肾功能标志物：血清肌酐水平，其在Cfh敲除小鼠和野生型小鼠之间没有差异。参见，例如，Pickering et al.(2002)Nat.Genet.31(4):424-428，出于所有目的通过引用整体并入本文。
还在Cfh敲除大鼠和野生型对应中测量了血清胱抑素C(sCysC)，一种肾小球滤过标记。从7周龄开始，使用试剂盒(Biovendor#RD391009200R)，根据制造商的说明书，每周测量雄性野生型和Cfh基因敲除大鼠(图8A)以及雌性野生型和Cfh基因敲除大鼠(图8B)的血清胱抑素C水平，直到所有Cfh基因敲除大鼠死亡为止。与野生型相比，Cfh敲除大鼠的血清胱抑素C也升高，表明肾小球滤过率降低。参见图8A和8B。
接下来，使用利尿笼(Tecniplast Inc.)从野生型或Cfh敲除大鼠处收集尿液16-18小时。使用来自Exocell的试剂盒(产品编号NR002和1012)，根据制造商的说明书测量尿中的白蛋白和尿中的肌酸。每天对尿白蛋白进行定量或将其标准化为尿肌酐，并在雄性和雌性大鼠中进行测量。如图9A-9D所示，与野生型对应相比，雄性(图9A和9B)和雌性(图9C和9D)的Cfh敲除大鼠的每日尿白蛋白或标准化为尿肌酐均升高。蛋白尿是肾损伤的标志，提示肾小球渗漏。
我们接下来通过Cfh敲除大鼠的电子显微镜分析评估肾小球损伤。研究的大鼠包括5只野生型对照(7周龄)和7只Cfh敲除大鼠(7周龄)。将皮质肾样品固定在戊二醛中。对固定的组织进行电子显微镜切片和染色处理，并通过电子显微镜评估从单个时间点获得的组织中的肾小球。组织学评估包括：足细胞足突消失的测量；肾小球基底膜(GBM)厚度；其它GBM病理改变(如果明显)；定性评估肾小球内皮细胞异常；以及任何肾小球电子致密沉积物的存在和位置。
通过以下标准评估肾小球疾病：(1)足细胞足突消失的测量；(2)肾小球基底膜厚度的测量；和(3)定性评估肾小球内皮细胞异常、沉积物的存在和位置，或其他超微结构异常。为了测量足细胞的足突消失，可通过直接测量每微米的毛细血管长度中足突轮廓(process profiles)的数量来评估肾小球的足突消失。还使用Image-Pro Plus成像软件的线性测量工具计算平均足突宽度。在分析时按组对数据进行组织。对于肾小球基底膜厚度的测量，通过图像分析来测量肾小球基底膜厚度。使用Image-Pro Plus软件的校准测量工具，在每个图像中垂直于沿基底膜长度方向的线性轴进行五个单独的测量。在分析时按组对数据进行组织。
来自野生型大鼠的肾小球显示出正常的超微结构，其中足细胞具有均匀且规则的镶嵌连接(interdigitation)和足突宽度、一致的GBM厚度以及典型的毛细血管环内皮层。Cfh基因敲除大鼠表现出大量的超微结构病理，包括肾小球基底膜(GBM)厚度、细胞介入和整个结构中电子致密沉积物的明显增加。足细胞显示出轮廓不规则的消失(足突增宽)。系膜膨胀并包含电子致密的沉积物。内皮经常为伴随开孔损失的肿胀、空泡状(vacuolated)(未定量)。结果显示在表5中。从这些数据得出的结论是，Cfh敲除大鼠具有明显的肾小球病理，包括足细胞的消失和扭曲、GBM增厚并伴有细胞介入和电子致密沉积物、肾小球系膜扩张和伴随开孔损失的内皮肿胀。
表5：样品的总体评估。
Figure BDA0003041521230000641
这些发现的代表性图像示于图10A、10B、11A、11B、12A和12B中。图10A和10B示出了来自野生型大鼠)的肾小球的肾小球毛细血管环(图10A)和系膜(图10B)的电子显微照片(12,000X)。毛细血管环显示正常的超微结构，其中足细胞在完整的肾小球基底膜的外侧具有规则的镶嵌连接的足突(图10A，插图中的放大倍数更高)。毛细血管内皮细胞显示正常放置的开孔。系膜(图10B)在外观上是正常的，其中细胞占据了稀疏的基质。
图11A示出了来自Cfh敲除大鼠的肾小球的肾小球毛细血管环的电子显微照片，其放大倍数与上述相同。图11B示出了图11A的更高的放大倍数。毛细血管环显示异常的超微结构，其中足细胞足突在明显增厚的肾小球基底膜上消失。GBM在整个结构的整个厚度中包含不同密度的沉积物，但在内皮下和上皮下位置的沉积最强。还观察到嵌入GBM中的细胞过程的介入(箭头)。内皮肿胀而伴随开孔的损失。如图11B中所示，毛细血管里的内皮显示出开孔的损失。
图12A示出了来自Cfh敲除大鼠肾小球的系膜的电子显微照片，其放大倍数与图10B相同。图12B示出了图12A的更高的放大倍数。系膜显示异常的超微结构，其中基质增加并嵌入了电子致密沉积物。
来自野生型(WT)-载体(A组)大鼠的肾小球显示出正常的超微结构，其中足细胞显示出均匀且规则的镶嵌连接(interdigitation)和足突宽度、一致的GBM厚度以及典型的毛细血管环内皮层。Cfh敲除大鼠(B组)的肾小球的GBM明显增厚，并且具有根据宽度的增加和足突的减少而测量的上皮的消失。参见表6。
表6.详细的超微结构分析。
Figure BDA0003041521230000651
A组vs B组，P<0.05
然后通过图像分析评估GBM厚度。测量出野生型大鼠肾小球中GBM的平均厚度为0.182微米(182nm)。在Cfh敲除大鼠的肾小球中，GBM的厚度增加了10倍，其中平均厚度由于基质、电子致密沉积物和细胞介入的增加而达到1.8微米。两组之间的差异具有统计学意义(P<0.0001)。参见表7。
表7：GBM厚度
Figure BDA0003041521230000661
然后通过图像分析评估足细胞足突宽度。在野生型大鼠的肾小球中，足突的平均宽度测量为0.369微米(369nm)。在Cfh敲除大鼠的肾小球中，足突的宽度增加了约7倍，平均宽度达到2.564微米。两组之间的差异具有统计学意义(P<0.0001)。参见表8。
表8：足细胞足突宽度
Figure BDA0003041521230000662
然后通过图像分析评估足细胞足突数/微米长度。在野生型大鼠的肾小球中，平均足突数测量为2.67/微米程度。覆盖Cfh基因敲除大鼠肾小球毛细血管环的足突数量减少了约3.8倍，测量出平均为0.708足突/微米长度。两组之间的差异具有统计学意义(P<0.0001)。参见表9。
表9：足细胞足突数/微米长度
Figure BDA0003041521230000663
总而言之，在Cfh敲除大鼠中观察到自发死亡，其发生于大鼠的寿命的早期。Cfh基因敲除大鼠中较低的C3水平表明通过不受控制的替代补体途径激活的消耗。Cfh基因敲除大鼠的肾脏组织病理与C3和C5b-9沉积以及肾小球硬化和肾小管病理学一致。血尿素氮和血清胱抑素C都是GFR的标志物，其皆在Cfh敲除大鼠中升高，提示肾功能衰竭。另外，Cfh敲除的大鼠中的尿白蛋白升高。综合而论，这些表型表明Cfh基因敲除的大鼠表现出C3肾小球病(C3G)样疾病，并显示出加速的病程，从而能够允许更高效和有效的临床前研究来评估新的潜在C3G治疗药物。
序列表
<110> 瑞泽恩制药公司
<120> 作为C3肾小球病模型的补体因子H基因敲除大鼠
<130> 57766-536658
<150> US 62/730,690
<151> 2018-09-13
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 97474
<212> DNA
<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）
<220>
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<223> 外显子1
<220>
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<223> rGD3靶序列
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<223> 外显子22
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<223> rGD2靶序列
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<221> misc_feature
<222> (96993)..(96995)
<223> 终止密码子
<400> 1
cctaaactaa ctttcaactt ccctttgggg caagtctgtc tctgctgtaa ccacagttca 60
tagcagagag gaactggatg gtacagcaca tacttctctt cgagtcaact gctcccagat 120
agatccaaga catgagactg tcagcaagaa ttatttggct tatattatgg actgtttgtg 180
tagcagaagg taagcttaaa accaccacct ttctcccttc tgactgagcc gcattataaa 240
acatttgctg ataatatttc tcatagcaat tattcaaatt aagtctagaa aatgtgggta 300
attactagtc tgtaactgaa tggcttttgg tggtaagttt aaaaaccgtg aacctttcac 360
ttgactattg taattgatag ttcagcttga tgtaaaactc aagacagtgc tttaaacatg 420
tttttgcaat ccataattag gcatagacat ttaacttgta gttatcagga aatacaggct 480
cctctttttc tcatgagtgt ccctgaagta ctatatgtaa aactagttag aaatatataa 540
atatccaaag tcaatgaaag cacttacttt tttctttaaa tgggtggatc gatttcaggc 600
ttatttctaa accttcctaa ctacatcact tagctgatat ttccatggtt ttaaaagttt 660
cgtatgtaag accttcaagt atgagataaa aagaaaataa aatttgacat gtaacctgca 720
ttggacggat ctgatttgtt tctggttttg ttttctgtga atacgtgtgg ggcatgtttg 780
tttctgaagc cattttgaag taggtaatgt gactgtcgga gttctttcat gacaataaca 840
gggtctgact ttattattca cttaaattct cccaagactg cttagtttat ccaatgaaag 900
agctttgctt tcccagttta ggaagggtac ctagttgtgg gataaacatt taatcaactc 960
ttctttgtgt tttgattgtt taagataggg tgtcactaca cccttgagct cactgtagtc 1020
ctcttgtcag cagcttccta tgggctgagg ttaccagtga gagtgactgc catgcctgac 1080
ttagcacttt ttatataaag tgaatgacat aactttaata acttccttaa atgtttctct 1140
tagccaatgc attgtaattt gaagctttgc tgtaaccact actcagtaaa gaatactaaa 1200
attatcctct gactggatgt ttaccaaccc acataagaag agtagatatg gtttctcagt 1260
tgtatctttt actaaaattc tgaaaaaaaa atttaagggt attttatact ttttgaaaga 1320
gtaaacattt tcaattatat tttttaatgt tattccttga attttagctt aagagtcttg 1380
tattcagatg ccttatagac taaggcagtc atttccttgt atatgaaaat ataagtattg 1440
ctgaaatgaa atgtgattat attggccagg aattctaaag caatgttgat attaccaagc 1500
ataactaaac tttttatttt gttaaaggca atgttttcat cgcttatttt agtgttctac 1560
ttgaataata atgtttacta agaggttttt aaagatatat aagattaaag aaagaactat 1620
tttatgttta gctaactttt aagtcttaat tgatataaat cgaattaagg tgtctacaca 1680
attacaaagc agaatttcaa tattaaaaag gaagtgccgc gatgtttgcg tgatacttta 1740
acgctaatga tttaaaaatc ctcatttatg ccatggatgt cagctgattt ttttgttatt 1800
gctggatttg aattttcatc agtatgtatt caaatgtggt gccagttctt gctgatgagg 1860
tgggcagtta cactgtgtcc gatactgttt cacagggatt ttcctttcat tcacagatga 1920
aaagagagtt tagtttctaa atcattatgt agggtaacct catggtctcc acaaaatgaa 1980
tgtaaacaga tgggagaagt ttcatggatt ttcagtggac acagtactcc cactttagtc 2040
ttagcttggc tggtgacccg tgtctatctc aaatgtaaac aatttaatca gtctatcaac 2100
ttaagaggaa tttcagcaga agagcttgga tcaattaaaa caattatgta tatgctgcaa 2160
tgtttgctcc tgtttctatt ctattagatg ctggctacta agctgattta aaaaaaaaaa 2220
gtttgtgaaa tgctctcata ttaggctttc tgaaacaggg aagaaaagat ttcataagta 2280
ttttctgccc tgataaagat caacattcat ctaaaaccaa tgttagctgg gccagcagga 2340
acggtaaaca caataatgat cttgcttggc aaagaacctg gctacttgag ttcaattcat 2400
gggccccacc tggtgaaagg gggaaaaaaa gcctctacag actgtcctcc agtttcctca 2460
tacaggcatg gcaactgtat gttacaccca ctcaaattaa aagaaaataa taaccataac 2520
aaaaaattta aactccacta ttaataatta aagaataata accaaaagaa gaactatgaa 2580
cccagcttgt ttgcctccct ccctccgtgc ccctctctct ctctctctct ctctctctct 2640
ctctctgccc cgcggggccg cccccacagc cccctatatc cacaccccca agaggggagg 2700
ggagaaggcc gggcgccacc acccccgccc caccaaacaa ccccccagac cggccctacc 2760
cacgcgcgga caaccacacc acgccggcga acacccaccc cccacagccg aaccaagcaa 2820
cacacaccac aacccgcgaa ggggacccgt aaccggccct ctctctctct ctctctctct 2880
ctgtcccccc cctctccttt tccccttttc tacttgccaa gggctttctc atatcttttt 2940
agtgcagtgc ttgactgtat tcacacttct agctgccaag aacagtcaat ggtgcttcct 3000
gcaaaaccac acgctgatca gaattgggtc agatttacag gacaacctgt aacataagag 3060
agttccttgg ttgagccgta taatttcagt tctggggaat ggattatacc caagctttcc 3120
aagcatttta ctctcacaat tgaatattgt atgaaattag gccgcagccc aggattgctg 3180
aaatgaacca attaaacctg tgctgaaaca aaaccaaata accactgcgt gctttctggg 3240
gagataagtg ttttctaatc ctggaggttt aaaggacaaa aaggtccttt caggcttaga 3300
gactttaatc atagaatgga gaattggttt aattctataa tgttttaagt atatgatttt 3360
ttcaaactta gtttaacatt gatgtggaaa aattgatgtt atatacatta attatgagtt 3420
aataatagtt gctttggggg aaatttagag aaaagttaat tattctttta tgtaaaatga 3480
tattatatta tgtcaaaaag tcaagtgatt caatgtaaga tatttatact tttccttaag 3540
aaaaagaatt aatatggagt gtgtcttact tttcccttca ctctgtgtcc aaagttgaaa 3600
gcagctgatt ctgcagcgtt caccacatct taactataaa ccatgtctac agcttttcct 3660
ttggccttag ccatattgaa tatgaaggtt tcacatgtcc caagtgactg aatgaagacg 3720
gatgcagcaa gttgcaatac agaagtgata tgtgcgtcac tgtgtatgta ttgtcacata 3780
cagtactgca tacacagagt tctgtcagta gtatcactgc tgtcctttgt cttcaattac 3840
tttagttctt cgagatagag tccccctgtt tggcccatgc tggtccttaa actcctagtc 3900
ttctggcctt agcctcccta gtactgaaat tcaatatcaa gaatatctta tgcagatttt 3960
ctgttgcttt cattcaacta aattgacagc aatagctgga ccttccttag aaaaatggaa 4020
aaatatttaa atatcaaaac cttctaaaga agcaacctat agttctcttt ttctagacag 4080
aaaataaaaa aaaatccaaa aagtaaaggt caactttaaa acatacatat aagtaatatt 4140
atatatactg atcatgttat atttagaaat atatatgtat atgcatatat gcatataatt 4200
atagttatga aaataagtag tcatggggtg aaagaaagta aaggagatag gtgggcagta 4260
ttggagagac aagaggaaag gggaaatgat gtaattagat tataatctaa aaaatataaa 4320
agaaataaga ataaaaaaga aatggaaatt ttggtggtaa actaaaaaat aacgtgtgga 4380
tttacaaaga gaaaatacat gtctgcatgt cttcaatgct ttcattgaca cagaaaacca 4440
atttcggtat cttgctttta tgctccttta tcacagcaaa aatttataaa catgtcacag 4500
gacaaaccgg gacttttaaa cctttcttgt atttcaaatt ataataaata tttggattta 4560
ttgctgcagt ctctactgtg agcataatgt ttactttctt tcttttttta aaatcataat 4620
gttttcaaag ccagaagaca tctgaaaact ctgaagttga ctatctttgg tatttctttg 4680
gctttcttgt ttgggacaaa actgaaggaa ttcacaatgt caaccaaacc acctattgcc 4740
attaatagta cctacttgca aagtcctaag tttccattaa ccaaacagca caaaccgaat 4800
ccattgcagt tgtttcgttt ctcccattga ggaaaaaaaa acaacatcct cgtagcctcc 4860
cttttctgaa ccttgaaatt ggaacagtaa tctttttcac acacaccatg gaggcagtgc 4920
atagatagat ccccacattt ctttaaggaa agtggttgga ttgaataatc aggtgtggga 4980
cagagatgtc aacattgaaa ttcttccttg agtttgaatt ttgagaagag tctaaaagag 5040
gtcaggttga aagaacttgc atcctgtttg ataaggttct tcacacagtc tagcatattt 5100
attaagcttc tcggttgtac tctcccaggc cccagaggtc agaggtccat gtatgccacc 5160
ttctatcaca cttgcttaaa tccaccctag tagatgcaca tgagtattag agatcattat 5220
gtaaactaga cactagggca ctactagttt attacctaaa ttaggcatta atgtcagtgg 5280
agcaagtaac ctctatccct acaacacatg ttttcaggat agaattatat ttccctaaat 5340
catgttactt ggcattgtgc cccaattgtc ttcagtgtct tctttcatgc aactcttaaa 5400
gtatttgaca tgtttatcgt accacaaact caaccaacct gttatttatg tgtaagggac 5460
cacatagtta aatttagtgc tattatgtgt aatttactgt gaaatttcac tgatagagga 5520
tagaactgga aaatggtaag ggacaaaata gaccaaagac attctgagac aggaagcttc 5580
ctaggatgaa atgctgtaac aggtgacaaa gggtggagaa gttgctcgca ggcagggtga 5640
aggtggtcag tgaaaacaag ccttgcttat catcagcaca gtcatgttct aggaatgtgc 5700
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ttctaaggta ggaactgcca cagagtaaat agtctgcctc tttgtcctta gattgctcaa 5820
ttttgaactc tctctcccct tccaaattaa tccatgttta tttcctgact ctgattgtta 5880
gtctttactt cctccttctc tctctccttc cctcactctc tccctcagcc ctccctcctt 5940
cctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctcca cacacacaca cacacacaca 6000
cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacactac ctctacctct cgacatttag 6060
gcagatgctg tccaccaaat cctcaaacgc tcagttgact gatgttaact ttagcttttc 6120
tcagagcaca aaacatgaaa aacagataaa gtaattggga aaaaaaatgt tacttttttt 6180
ttttggttta aaattagaag aaaaaaaaag tctggttcag ataaagtcaa gcaactaaac 6240
agaaaaaaat tccaaccgtg aaataataaa aagaacacac ggatttgaca gaacactttt 6300
gttttgacat tttcacttag aaagtctagt ttctcacaga gtgttaactg gaaatgggat 6360
agatagagga cgattataga aacacccctt caaaggttcc gagggaactt ttatacttcg 6420
agctaaattc aagtgactct agacttcaaa aaccgcaaca tagacagatg tgcaaactct 6480
gtagagaact ttcagtgcat gcaacaggca ttcaactcca ccagacagtg gtgctcttgc 6540
cactgcctcc tcctcctttt cctcctcttt tttttccctc aagttgtctc tttcttttcc 6600
tttttccaag tcttgtcttt taagtttccc atttgccact ctcagctgtt ggtggcccta 6660
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tagctcatct tataaactat tatgactcag attttaaaaa gttcctaaag cagaaaactg 6900
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aaatttatag gaaaaattga tgaattcaga ctcacaggga gacaaactct gcatgctctc 7020
cttcacattt tgattctagt ttttaataca tatactttat atatactgca tatatctttg 7080
tttaatatga cgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgacttatgg 7140
atagaagaca tggaactaga agtggaaaaa gaaccgtgga ggaagggaac catgaaaaac 7200
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tgagggaaga aaatacaggg cagttctcta agttcaaggc cagcttaatc tacaaagtga 7380
attcgaggac agtcaggcct acacgaaaaa ctatgtcttg gaagaaaaaa atgcctcact 7440
ataatataat ataaaatata atataatact tcatatatta acttaaaaaa taacatgaaa 7500
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atacagatgt tctgctgact tagttctatg ttgtttctct gagaaaagtc agacaaagct 7620
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ctacaactta acttggctta agtttcacaa ggattagtgg gaggttagga aagaaaaagt 7860
tttccctttt atttattttt gttttgtttt gtttttgatt tttttaattt atatttcaaa 7920
tattatcccc tttcctggtt tccctttcat aaacccccta ctttatcatt ttatccccct 7980
gccccttctt ctatgagggt gttcagccac ccaaccacac acaccttccc gcctcccctc 8040
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gagtctctca tgagacagct atattaggct cctgtcagca tgcacttctt gacctcagca 8400
atattgtcga gtttggtgtc tgtatgtata tgggctggat ccccagttgg gacaggttct 8460
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tttttgttcc ccctttcaag aagaactgaa gcatccgcat tttggtcgtc tttcttgagt 8580
ttcatggtgg tctatggatt gtattttggg taagctgggc ttttgggtta atattcactt 8640
ttcagtgagt gcataccagg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 8700
tgtgtgtatg tgtgtgtgtg gttgggttac ctcactcagg atgatatttt ctagttccat 8760
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catcccactg atacctctca tccactccag tactggagct gctaaaacat tcagccttag 8880
ttactccatc ttgtggctaa actgctttgt gaggcagccg ttcaagccta atgaaaccgt 8940
tcaatgtatg ctaacagttt attttaaaaa gacaatattg aacctggacc cttcttggtg 9000
ttaggagact cttgtgtaaa tgctgccttt ttcagaaatt gacttcaagc tgactcctca 9060
ggaggcaaaa attccaacta ctctggtcga tttcactcag gtttagccat atacctgcct 9120
attatgatct aggtgcttct cgagggtatt agttttataa agaaaattta taattatttc 9180
tgtatgtttt agaaatagaa atttattttc caatgttcat taaatataac caaaacttaa 9240
atttttgtag tttgtttttt aaagtacttt attgcaattt atatttactt tgttcaaaaa 9300
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aatactcttt ggatcatata catgcataaa cttaatactc atttatatca ataagaaagc 9420
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cattcttttt ccaaaatcct tgtagaagct ataggaagag aaaaaaagat gacctctcca 9600
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agacttactt cattgcagca agaacatttc aaagaacaat tctgagacat attggcattc 9720
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gtttctggaa aacattcaag agtggcattt gcatctaagt aaataggaaa ttaacaaaga 9960
aaattcttaa aaagcaaaat caactattta attaggattg gaccaggttt catttgttgg 10020
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tataaaacat agcagtcctt ttatttcaca tgctgtgtac catcttgtag atggaagttc 10740
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ttttagaaat aaaatgaata atgagcctag aacctgccat ctaagaagca ccatgctggg 10920
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ttcaaataca ttttgaattt tctgtaaaaa aaaatgttaa gcgaaattct tctctgataa 11280
aacttaagaa cacagctcag gatctccaat ttacttccta tgcccaaact taagtactag 11340
ttgaaaaacg cgagccccaa acttaagtcc agttcaaaaa cacgagccct gttgtctgca 11400
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ttccatgtct ttacataaca aaaagaagac aatgaaaata aataaagaaa tacaatcaag 11520
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tcatacatat ctacaattgc actcatctcc tcttctcaca tttgccccct tacctgtgag 11640
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agggaagtga agggaaaagg gaaaggacta gccaaggcaa gtattcactg aatcacggtc 11820
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caagcacatg tccctgcctg tactgcagtg ctgtgggcca gtgaaggaca gggccagttc 12000
tctcagaccc atggacatag atagcgtggc ttcaggcaac agcagacatc aacgtggtcc 12060
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gctacatatg atccaagatg ataagttatg ccaactctac tgggcaatga cagcatgttg 12480
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ccatgtgtgc ctagttcact tatgtgttca taatagtagt gctgggtggc tttaggtcga 12600
ctcacagcta ccatgtctca accggtactt gcttcccatt atgtacataa catataaata 12660
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ccccactgtg taaacagacc atatttttgt tatccattct tcagctgata gacatcctgg 14100
ctgtttctac ttcctggata ttgttggtag agcaacaacg atcatgggtg aacagatatc 14160
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tatctcttgt cattaattta tttaatctta ttcaggctgg gagaagatga aatcacagag 14400
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aagactttat ctatctagaa tgccacacct ttaatccctc tgggtggaaa tagagatatg 17040
cccttagtac acacctttaa tcccaaacca tgaaagtaaa gctagttgtt aaaaaaaaaa 17100
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gaggaggagg agaaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga gaggagagac 17400
gagacgagac gaggagagga gaggagagga gaggagagga gaggagagaa gagaagagaa 17460
gagaagagaa gagaagagaa gagaagagaa gagaagagaa gagaagagag gagaggagag 17520
gagaggagag gacaagagaa gagaagagga gaagtcctgg agcagagaca ggttgtaggt 17580
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tattttatcc atagttttgt ttgtttgatt tttttgtttg ttctttacaa cttagaagat 18000
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gctttgtact aaatccttta cattgtagca atataaatta tattactact gtaactaaag 18420
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ccttttattt cctaacttga gacagtgaac tataacggtt tattctattc aagttttaga 19440
attagctcca aaatatccct atgctcaaat gctcaatgtt tgtaacatct tactccgatc 19500
ccctctctta cagaagcaga aaagtgctta tgagcatcat aggattagca ggagaaataa 19560
atatgaccca cccttgcagc acttcaaaat gatcccagat gaccacaaat acccactaga 19620
tgctcatttt tttatttaac ttctccttgt ttcacaacgt gaaggagact tttcaaacta 19680
caattttcaa ggtcactgct gaccttatta tttaaagcca acaaagattt ctttggcctg 19740
gatttttcag gttgttccat tcttcacctt tgaattagct catcctaggc cgtagaaact 19800
ctctcatttc tagtcctata ggaaacacca aatacgactc agcagttgtg acttcagtag 19860
gcaagcagac agcacacaca aattggaagc tacagactag tccttttggc aggtcaacac 19920
cagacccaaa ccagcagctg tccaaagctg aaggaaccat tgggcttacc aaccatcctg 19980
acgtaatact gtggaatctg caaattgcca gaggaacttc aggagaattt cttagagaag 20040
cttctcagtg gcagcatagt gaagaatagt gagacagagt aaacaaaatc aatgctcagt 20100
actcgtctcc cactatctgt gtgatcataa ttatactctg tcgtctagag tcctttcatg 20160
tgtgtgcccc agcaaaacat catttgacat aacttacttt ccaaaccgac tagaagtttc 20220
cacttcactt atttacctct gattctggct ctcttcaagt cactgttgcc accttgtatt 20280
tatcaagtgt aaacactgat agaacccatc taggtcaata gctgtgtata ttgattctga 20340
atcaccaata tcaaatcaat caaattactg acaattatcg cgtaaagtcc tcataccacg 20400
taggataaaa ataggtaaaa agcagttcat attcattcaa atttctgttg atgaatgttc 20460
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gcttatttca accctatttt ttttactcat cctttttagt cctgtgcttt tggctaaatt 20580
ttctctgcta aaaataaaca aatataaata aatataaata tagggtttta tgtactttgt 20640
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attctcatca atataactta aaactatcta aaacataata gatataaata gagattgata 22140
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tgtgaaggtt ttatccatag tcttaatttt agaaaaaaaa gggggggagg gaagcaagaa 22440
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cttgctatca cgaagatgta aactgtcact ctaagtaata gttttctttt cccattccca 23160
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnngtggc 27720
aggggtcctg ccgctcctgg gccctccccc acgggagccc agaggcctta tacagtttcc 27780
tcttgggcca gggatgtggg caggggtgag cagtgttggt ggtctcttcc gctctgcagc 27840
ctcaggagtg cccacctgac caggcggttg ggtctctttc tcaccgggtc tgggagcaga 27900
gagctgctgc gggccgggat ctgctgcaag ttttaatttt tttttttttt gattcttttt 27960
tttcggagct ggggaccgaa cccagggcct tgcgcttcct aggtaagcgc tctaccactg 28020
agctaaatcc ccagccccgc aagttttaat ttttaagaca ttctaatttt tattaatatt 28080
gttaggataa aatatataca tatacatata tcatacaaca cacacagaca tacacacata 28140
tgtattgcat gtttacaatc agttttaggt atcttaattg aatccactaa gcctttgaat 28200
tttgacaaac tgatataata tattgttact taatatttct tttctttcct cctcctcctc 28260
ctcctcttcc tcttcttcat cttcttcatc ttcttcttct tccccttctt cttcttcttc 28320
ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc 28380
ttcttctaga cagcctttca taatgtaatc atggccggcc tgaacctgat atgtagtcca 28440
tatagcttct accttgcagc aggctcctta gagttccgac aagagttttg aaattgcctg 28500
catgtggcac tggtcttata ctatatttat ttttcaatat tatctaacac ctccattatt 28560
ttcaccattc cttagtattg tccaccttag actaaagaag acagtgtttt cttcttttca 28620
aatttagttt gcttttgaga ttataactac atcatttctt tcctcaagga ttgactagtt 28680
gctgctaaca actctaacag cactgattca tcatgagaat aatgatatac caatatgtat 28740
agtcaatgtg gcatatattt gacatattga agtttaatgg ctgatatctt ttggacttta 28800
actaattgtc tattgctaat gaaacctagg aaattctgat ccttgagatt atttttaaag 28860
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catgtggaga aagataaaaa aaaaaaaaaa ccagcaaagt atctacagca agatgtgggc 28980
ctgagggtct tctgtgcagc tcagttcaac caaaagtata tcacagcagt tactactgtt 29040
tatgtatgca ttcggaagac gggagggacc tagtcaatat ggtcaatttc aaggacttcc 29100
tgaagctttt gaattgttta cttcctgagc ttccttagag gatgggattt tttagttccc 29160
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ttatgaaata gcaacaaaaa taattttatg gttatgggat cgccacacaa gaggaatggt 29340
attaaaggac caaagcatta gggaggttga aaaccattgc tttatctcat cctattttta 29400
tgggtgcttc tctctgagac ggagtctttt atcttaaaga aaattgctat tcaacaattg 29460
aagagaggta ttaggtcagt aagagtatgg tatggtcata ggccagcaca attcctgcat 29520
atgcttgtca taaataactc acctcttctt cagattgact gggaaaagac aaaacatttc 29580
aaagtgatct tttaaaagtt tccttcgtta taaagaagga aaaatggatt aaaaggatgg 29640
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taaggctgct gtgaacatag gggaacacgt gtctttttta tatgttgggg catcttttgg 75900
atatatgccc aagagacgta tagctgggtc ctcaggtagt tcaatgtcca attttctgag 75960
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gaataatttg tttagctctg aaccccattt tttagtaggg ttatttgtct ccctgtggtc 76260
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agaactgcag gacctgttca ggaccttgtg caggcagaaa ctggtagtgg actgtccaag 89700
aagacttctg tctttgtgtg tcctgaggcc accaggtgtc cacttggagc agaagagttg 89760
gtcttacctc tgctctctgg tgtgtcatca ctcctgatga ctggctttca gttttgggtg 89820
caggcagaaa caggaagaga cctgcccctg actgctctaa tttcttgtgc ccagagagca 89880
gaggaggcac tagacaggtt cctgttgggc caagaatgtg agcagaagtc ggggtctccc 89940
ctgagctctc aggattatct gcacttctga gggtccagct gtctccccga taggatttgg 90000
gtacagagaa ctgcaggacc agttcaggtc cttgtgcagg cagaaactgg aagtgtactg 90060
tcccagactg ctcctgcctt tgtgtgtcct gaggccacca ggcagatttc ttggagcaga 90120
agagttggcc ctccctctgc tcttagatgt gcaggcgctc ctggaaaccg actttcagct 90180
ctggatacag gcaaaaacca taagtttcct ccgctgaatg ctcccaggtt actgtgctta 90240
gaggtcacag agggcactag gaaggttcct gttgggccag gaatgtgagc agaggtgggg 90300
gtctctcctg agctctcggg attgtctgca cttctgagag tccaattctc tctcccacga 90360
tatttgggta cagaaatgtg ggaccaggtc agccctgggt gcaggtgcct atttctatta 90420
ttcttagatt tgatattttc attgtacctg gatttcctgg atgcttcatg ttgcaagatt 90480
tttatgtctt gacttttctt tgacagtgtg tcaatatctt ctaaaatatc ttctacatct 90540
gaaaattcta tataatatct cttatattct gttgttgatg ctttcatcca taattcctga 90600
cctcttttct aggttttcca attcaagcac tgcctctctt tgtgttttct ttatagtttc 90660
tacttccact tttagctctt ggaccacatt cttcaattgc ttcacctgat ttctttcttt 90720
cttttccccc ctgtatttct ttaaggaatt tatttgtttc ccctttaaag gcttctaccc 90780
gtttacctat gttttcctgt ttgtctttcc atgacttact tctatcctct ttaaaggatg 90840
ctattatctt catggatagt atattaggtc agcttcctgt ttttcaagtt tgttgttgca 90900
cacaaggctt gctgaagtga gagaattggt ttctgatgac gccaaagtat attgacttct 90960
gtttcttatg gtcttgggct tgcctctagc aaactggtca tctctggtgt tagctgttct 91020
gggtgtctct gtcttcatcc tacttcctat gtccctgggt tgctagagtt ctctgggtag 91080
gcttgtgttt ctggctgtag ctgaccactg gtgaagactt cagaatgtga ggtcttaata 91140
ggggcatgta cactagtgac ctgctgccct ggctacagag acaatctgct gatctgttgc 91200
cctgtgtgca gcagatctct ttggaggcct tcagactgtg gggtctgttg ctcagtgtgt 91260
agcagaattc gcggaggact tcacactggt cagttatcct gcatgtacca gaactcgtga 91320
gaggccttca gactgtagta tctttagagg agcagacaag ctgatgatct gccattgcag 91380
aaggtgcagg atggaaagca ttcttgtttg ggagggtccc ttacttattg ccctgtgtgc 91440
tgcagaactc ctgagaggcc atcaggctgt gataccttca gaagagcagc caagctggta 91500
ggggtcttat ttctcttttt atttcttgtt ttggaggagt ggttctcaag aatttaacag 91560
tggcatgcat ttttattact tttgaacaca tagtctgagt atgctatctc taatagtttc 91620
ctaaccatct gttactcaag tcaaccaggc tgatatttta tataagtaga aactgaactt 91680
atcttcaaaa tccaattaca ttttccattt tttgtgtttt ccttaaaaat tccttcggag 91740
ttttctctta catatattaa atgccaccct tttttatttt tatttttttc agagtccatg 91800
atttatttgt ttactctcct tcctgggatt gccctttcaa taaatcccct ttctttgctt 91860
ttcattgtta ttcatcaatt ttttcttctt attattttat ttacttacat tccaaacatt 91920
ggcccccttc ccagtaccat atcctcaagt tattcattgt ccccctttcc tttgcttctg 91980
agagtgtgct ccctgacaca cccacctacc tacacctcac ccctaccagc atcccttctc 92040
ccctcttttc agatttctac aggatttggc tgttcctctc ctactgaggt cagataaggc 92100
agccctctgc cacatatgta ccaggagcta tggatcagtc catgaatact cttttgttgg 92160
tggcttagac tctgggatct ctgaggtgtt ctggttattt gatactgttg ttctttctgt 92220
gataccacaa tccccttcag caccatcaat cctttgctta actcatccat agacatccca 92280
gacctcattc actgttggct gtaaatattt ccatctgttt cagtcagctg ctaaatagag 92340
cctctcatgg gacagccatg ctgggcttct ctctgcaagt acaacatggt gtcaaagttt 92400
ggtgcctata catgggatgc atctcaagtt gagagggtca ctggatgggc tttccttcag 92460
gctctccaca atttttctcc ctgtgtttcc tttagacagg aacaattctt ggtcgaacat 92520
ttataaggtg actgggtgac cccattcctc aactgggtgc catgtctacc tactgttggt 92580
ctctttaggt tccaactcct cacttttgga cattctgatt aagcttatcc ccattggatc 92640
ctaagagccc cctctcatat ctttgatgtc tgagtctttc tagggattct ccagttcccc 92700
caaccattca ctggtgcata tttctgttca ttcttctggc cctctagaat tctgtcctgt 92760
gtccccccat attttatcca gaccttcctc ttctccctcc tcatcccctc tgccattcat 92820
gtccctccct ccctctgcct cctatgatta tttttaacac tcttcttata tgcaagtttt 92880
cacttgaaac acaaatctaa ttttatgaaa acaaagatca cctactatat agccctaatc 92940
ttacagttaa atttgtccta ctcttaattt ttatttttca cttatataat gaattctggt 93000
agttattctt tagggaggac tctctgatgg agataaatcc cctttatctc ttttatctga 93060
taatgtctca tcaatgtctt tattcaaaag gcaaacaaca caggatatag aacttaaggc 93120
ttacactcat tttcttttcc ttactatggt ctgcatggtg agaggatagg agtcactttc 93180
tttgggatct gggtccagtg tggttgatga tgacttccta ctgatttttg tccaagatgt 93240
tttctttaag cagtttcagt agagagatct ccaggagttt catgggactt gtcctatttg 93300
actttactca gttcttgaat atgtacagtc atctattatg gagaattgtt ttcattttcc 93360
ttcatagtaa aacattaatt ttgcttgaat attgaatatt ttgtttttac ctaaaaatat 93420
ttgaattttt ttcagtttca tgatgttcct cttgaggtca tactgaacat aatcagtact 93480
tttgatttca tatttttcct gtgtcctcac aagaacaatc agtagtctaa aagaaaaaca 93540
tataacacaa cagtgtgaca ttagatgagt ttggaatttc tttgctagaa ttttcaatgt 93600
ctcatctctt catataatgt ttactaaaaa ttctatgtcc aagcttttca gatataccta 93660
gttaaagtat atcatagatg tctatgctta ttttaaccat atcagaaacc cagaaaacct 93720
cattagcctt ctgttacatt ataggctttc aagtcttgtt ttaaatgtac ttatacaaaa 93780
tgataaagag tgggaatata tacagtcata tactattgag tttcttcaaa aaaaaatgcc 93840
tatctacatt ggccatagca cctaatcctt ctcaggttca gaagctgtta agagatttac 93900
tactacttga agttttcagg cagacatgtt tgctgtagtt aagaaatgtt tcaggtgaga 93960
aaaaaagaag aacttgtaac tctcagttta tatgattaat ctttcttcaa ataatcattt 94020
atacagccag aaatcactaa agacttaata cttaatgttt ttggttctgc ttgagcctgt 94080
agttttactt gatattcaaa cattcaaatg ttgtctcctt agattcaaca gggaaatgtg 94140
ggcctcctcc acctattgac aatggagaca tcacctcctt gtcattacca gtatatgcac 94200
cattatcatc agttgaatat caatgccaga actattatct acttaaggga aataagatag 94260
taacatgtag aaatggaaag tggtctcagc caccaacctg cttacgtaag taccttattc 94320
acatagatta taagaaattc tgttttatat tgtgggtatt tttctgttta taatataaca 94380
ttcacaaaat aaaagtactg ttttgtttgt gtttcagtat caaacatcag catgtgataa 94440
aacaagatta ttagattctt tttataaaaa atacctgtta aataaaattg tatatattat 94500
tcttaataat tgtttttttc taatatgtat taacatctac aaaactgggt gccagcataa 94560
cattatataa ctgttgtctc agtcagtgtt ctattgtttt aaagaggaac tatgaccatg 94620
gcaactcttt taaaagaaac catttgttgg gggttgctta caattttgga aatttattct 94680
actctcaaca tgtttgggag catggtggca cagaggtaaa catgatggtg aagaagtagc 94740
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ctatgcaaac tcccacaagg ccgtagccat aatacttcac aagtaccacc attctccaat 94860
gaaaaatctg tatgtgtatc tatggaggtc attccttttc aaataagcac atctgtatac 94920
atcttgcagt tattaaatcc atacaacatc tcctttcctt agataaggca actgacatct 94980
attaatcact gttatgcatt ctaaagtaat tctctctgtg agaaagagca caaagtagtt 95040
gtctttctgt gttggttata tttgacttaa tgtccttcaa tgcccttttc taagtaaaat 95100
aataaaatat atctttaatg acttaatatt ttacatttaa atataccatg atgtcattat 95160
aaattcacca attagtatta gttcagcttt cttcacctta ccaacttcca tgtagcagtt 95220
tagaataaac atatagatcc aggttgagta ctttgatttt atttcctttg cgtacattcc 95280
agaagaaaca ataggaacaa tacataaata tctattttta aatttgtaag aaatctcaat 95340
ttttatccat agtaacttca caaaatcata ttcctgtcaa tggtttgtga agtgttcacc 95400
acacactaat gagcagttgt aatttttagg gctccttcct ctggtgctac tttaactgag 95460
ttaaaagata tcttactatg gcttttcaat ggaatgacag caatgatatt tatgtgtttt 95520
tcttagaagt atctattcat ttatccagat ttgatcagct tatttttcct ttaaaatgtg 95580
ctttaccaca gactaatata gttcagcgaa aggttatcag cagactggaa tatttttcaa 95640
ttatttaagt ataatttatg acagatatag tgcaaagcct tttcacaatc aatttactaa 95700
aaaaggtgtt ctaacttcta acagaccagc aaggcccaaa gcaatgaaat caaattatat 95760
aaaaacaaaa caaaagcaaa taaatatatt tatgcacttt gtacgaaatg gaggtcacat 95820
ctttatgctt tcttgaccca ggacaccccc ctaaaagata tgtaaatacc taaaaataaa 95880
gaatagacaa ccatatactt caattaaact tgctgccaat ttcttaggtg tattgactat 95940
gctctgtgat atgcaccagt accacaatgg gatcaaatcc acaggtcaaa gtttgctttt 96000
tgccttgtga tttggagtcc cagccaaaca cacagtgtca aaaccatgaa atgtttccct 96060
gttgtgcttc ctgatacttt cagtggtttg ttcttatatc aatgtctttg accaaatttc 96120
agttgaattt gcccataatg acaaacagat ataaaatttc aatcatcgcc atatggatat 96180
caattatcat tttatcattt attaaatatg atatcagttc attaacataa gttttgggaa 96240
agtttattaa gatcagtaac ctgtagatgc atagatcaat tttcaaatca cttttctcat 96300
tcattggagt cttccgagtg ttctggttac tgtggggttc ctggtgtata ttgaaataaa 96360
gtattatggt atctcctgat ttttcctttc tgttctagtt acagttgtct attcattcta 96420
ttgtagttcc atacaagttt tagattttta tccctattag tatgaaaaat gttattgata 96480
tttcagtgtc agctcacaga gtctgctatt agccatagga tatgtggaca tgtctatacc 96540
tatattaatt cttacaaccc attaatatac aagctttctc tatttctgtc ttttcagatt 96600
attttaccag ttaactaata tttttgattg aagttttcac ttctgtttat aaattcatag 96660
ctgaattaat tttgaagata ctgaaaatga cattgcattt atagttaatt ctcagaaaaa 96720
tggaattttt ctatagaaag ggggtgattt ctgtaggttt atatattaat tgttgaactt 96780
tggtaattta tctttcagat gcatgtgtga taccagaaga tattatggaa aaacataata 96840
tagttctcag atggagggaa aatgcaaaga tttattccca atcaggggag aatattgaat 96900
tcatgtgtaa acctggatat agaaaattca gaggatcacc tccgtttcgt acaaagtgca 96960
ttgagggtca catcaattat cccacttgtg tataaaatcg ctatacaatt attagtaaac 97020
cttatggatg aacctttgtt tagaaatgca catgtatatt actaatacag tttgaattta 97080
catttgaaat attgtttagc tcatttcttc taataagtat ataaactttt tttatatggt 97140
ggttaatcag taactttaca gactgttgcc acaaagcaag aacattgcat tcaaaactcc 97200
taatccaaaa tatgatatgt ccaaggacaa actatgtcta agcaagaaaa taaatgttag 97260
ttcttcaatg tctgttttta ttcaggactt ttcagatttt cttggatacc ttttgttgtt 97320
aggttctgat tcacagtgag tggaagacac actgactctg acttcaaatt agtattactt 97380
gccaatacat aacaaccaaa ctatcataat atcacaaatg tatacagcta attactgtgt 97440
cctacctttg tatcaataaa gaaatctaag aaag 97474
<210> 2
<211> 4236
<212> DNA
<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）
<400> 2
acagcacata cttctcttcg agtcaactgc tcccagatag atccaagaca tgagactgtc 60
agcaagaatt atttggctta tattatggac tgtttgtgta gcagaagatt gtaaaggtcc 120
tcctccaaga gaaaattcag aaattctctc aggttcgtgg tctgaacaac tatattcaga 180
aggcactcag gcaacctaca aatgccgccc tggataccga acacttggta ctattgtaaa 240
agtatgcaag aatggagaat gggtaccttc taacccatca aggatatgtc ggaaaaggcc 300
atgtgggcat cccggagaca caccctttgg gtcctttagg ctggcagttg gatctgaatt 360
tgaatttggt gcaaaggttg tttatacatg tgatgaaggg taccaactct taggtgaaat 420
tgattaccgt gaatgtgatg cagatgggtg gaccaatgat attccaatat gtgaagttgt 480
gaagtgcttg ccagtgacag aactggagaa tggaagaatt gtgagtggtg cagccgaacc 540
agaccaggaa tattattttg gacaggtggt acgctttgaa tgcaactccg gcttcaagat 600
tgaaggacag aaagaaatgc actgctcaga aaatggcctc tggagcaatg aaaagccaca 660
gtgtgtggaa atttcttgcc tgccaccacg agttgaaaat ggagatggta tatatctgaa 720
accagtttac aaggagaatg aaagattcca atataaatgt aagcaaggtt ttgtgtacaa 780
agaaagaggg gatgctgtct gcacgggttc tggatggaat cctcagcctt cctgtgaaga 840
aatgacatgt ttgactccat atattccaaa tggtatctac acacctcaca ggattaaaca 900
cagaattgat gatgaaatca gatatgaatg taaaaatggc ttctatcctg caacccgatc 960
acctgtttca aagtgtacaa ttactggctg gatccctgct ccaagatgta gcttgaaacc 1020
ttgtgatttt ccacaattca aacatggacg tctgtattat gaagaaagcc ggagacccta 1080
cttcccagta cctataggaa aggagtacag ctattactgt gacaacgggt ttacaacgcc 1140
ttcacagtca tactgggact accttcgttg cacagtaaat gggtgggagc ctgaagttcc 1200
atgcctcagg caatgtattt tccattatgt ggaatatgga gaatctttat actggcaaag 1260
aagatatata gagggtcagt ctgcaaaagt ccagtgtcac agtggctata gtcttccaaa 1320
tggtcaagat acaatattat gtacagaaaa tggctggtcc cctcctccca aatgcgtccg 1380
tatcaagact tgttcagtat cagatataga aattgaaaat gggttttttt ctgaatctga 1440
ttatacatat gctctaaata gaaaaacacg gtatagatgt aaacagggat atgtaacaaa 1500
taccggagaa atatcaggaa taattacttg tcttcaagat ggatggtcac ctcgaccctc 1560
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taaacatacc aaaggctcta taacatgtac ttatgatgga tggtctagta caccctcctg 1740
ttatgaaaga gaatgcagca ttcccctgtt acaccaagac ttagttgttt ttcccagaga 1800
agtaaaatac aaagttggag attcgttgag tttctcttgc cgttcaggac acagagttgg 1860
agcagattta gtgcaatgct accactttgg atggtcccct aatttcccaa cgtgtgaagg 1920
ccaagtaaaa tcatgtgacc aacctcttga aatcccgaat ggggaaataa agggaacaaa 1980
aaaagttgaa tacagccatg gtgacgtggt ggaatatgat tgcaaaccta gatttctact 2040
gaagggaccc aataaaatcc agtgtgttga cgggaagtgg acaaccttgc cgatatgcgt 2100
tgagtatgag agaacatgtg gagaccttcc tgcacttgag catggctctg tccagttatc 2160
tgtccctccc taccaccacg gagattcagt ggagttcact tgtgcagaaa ccttcacaat 2220
gattgggcat gcagtagttt tctgcattag tggaaggtgg accgagcttc ctcaatgtgt 2280
tgcaacagat caactggaga agtgtaaagc cccgaagtca actggcatag atgcaattca 2340
tccaaataag aatgaattta atcataactt tagtgtgagt tacagatgta gacaaaagca 2400
ggagtatgaa cattcaatct gcatcaatgg aagatgggat cctgaaccaa actgtacaag 2460
aaatgagaaa agattctgcc ctcctccccc acagattcca aatgcccaag tgattgaaac 2520
cacagtgaaa tacttggatg gagagaaagt atctgttctt tgccaagatg gttacctaac 2580
tcagggccca gaagaaatgg tgtgtaaaca tggaaggtgg cagtcgttac cacgctgcac 2640
ggaaaaaatt ccatgttccc agccccctaa aattgaacat ggatctatta agtcgcccag 2700
gtcctcagaa gagagagatt taattgagtc cagcagttat gaacacggaa ctacattcag 2760
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tcagccacca acctgcttac atgcatgtgt gataccagaa gatattatgg aaaaacataa 3600
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attcatgtgt aaacctggat atagaaaatt cagaggatca cctccgtttc gtacaaagtg 3720
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agttcttcaa tgtctgtttt tattcaggac ttttcagatt ttcttggata ccttttgttg 4080
ttaggttctg attcacagtg agtggaagac acactgactc tgacttcaaa ttagtattac 4140
ttgccaatac ataacaacca aactatcata atatcacaaa tgtatacagc taattactgt 4200
gtcctacctt tgtatcaata aagaaatcta agaaag 4236
<210> 3
<211> 1235
<212> PRT
<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）
<400> 3
Met Arg Leu Ser Ala Arg Ile Ile Trp Leu Ile Leu Trp Thr Val Cys
1 5 10 15
Val Ala Glu Asp Cys Lys Gly Pro Pro Pro Arg Glu Asn Ser Glu Ile
20 25 30
Leu Ser Gly Ser Trp Ser Glu Gln Leu Tyr Ser Glu Gly Thr Gln Ala
35 40 45
Thr Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Thr Leu Gly Thr Ile Val Lys
50 55 60
Val Cys Lys Asn Gly Glu Trp Val Pro Ser Asn Pro Ser Arg Ile Cys
65 70 75 80
Arg Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Ser Phe
85 90 95
Arg Leu Ala Val Gly Ser Glu Phe Glu Phe Gly Ala Lys Val Val Tyr
100 105 110
Thr Cys Asp Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asp Tyr Arg Glu
115 120 125
Cys Asp Ala Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val
130 135 140
Lys Cys Leu Pro Val Thr Glu Leu Glu Asn Gly Arg Ile Val Ser Gly
145 150 155 160
Ala Ala Glu Pro Asp Gln Glu Tyr Tyr Phe Gly Gln Val Val Arg Phe
165 170 175
Glu Cys Asn Ser Gly Phe Lys Ile Glu Gly Gln Lys Glu Met His Cys
180 185 190
Ser Glu Asn Gly Leu Trp Ser Asn Glu Lys Pro Gln Cys Val Glu Ile
195 200 205
Ser Cys Leu Pro Pro Arg Val Glu Asn Gly Asp Gly Ile Tyr Leu Lys
210 215 220
Pro Val Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Lys Gln Gly
225 230 235 240
Phe Val Tyr Lys Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Gly Ser Gly Trp
245 250 255
Asn Pro Gln Pro Ser Cys Glu Glu Met Thr Cys Leu Thr Pro Tyr Ile
260 265 270
Pro Asn Gly Ile Tyr Thr Pro His Arg Ile Lys His Arg Ile Asp Asp
275 280 285
Glu Ile Arg Tyr Glu Cys Lys Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Thr Arg Ser
290 295 300
Pro Val Ser Lys Cys Thr Ile Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg Cys
305 310 315 320
Ser Leu Lys Pro Cys Asp Phe Pro Gln Phe Lys His Gly Arg Leu Tyr
325 330 335
Tyr Glu Glu Ser Arg Arg Pro Tyr Phe Pro Val Pro Ile Gly Lys Glu
340 345 350
Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Asn Gly Phe Thr Thr Pro Ser Gln Ser Tyr
355 360 365
Trp Asp Tyr Leu Arg Cys Thr Val Asn Gly Trp Glu Pro Glu Val Pro
370 375 380
Cys Leu Arg Gln Cys Ile Phe His Tyr Val Glu Tyr Gly Glu Ser Leu
385 390 395 400
Tyr Trp Gln Arg Arg Tyr Ile Glu Gly Gln Ser Ala Lys Val Gln Cys
405 410 415
His Ser Gly Tyr Ser Leu Pro Asn Gly Gln Asp Thr Ile Leu Cys Thr
420 425 430
Glu Asn Gly Trp Ser Pro Pro Pro Lys Cys Val Arg Ile Lys Thr Cys
435 440 445
Ser Val Ser Asp Ile Glu Ile Glu Asn Gly Phe Phe Ser Glu Ser Asp
450 455 460
Tyr Thr Tyr Ala Leu Asn Arg Lys Thr Arg Tyr Arg Cys Lys Gln Gly
465 470 475 480
Tyr Val Thr Asn Thr Gly Glu Ile Ser Gly Ile Ile Thr Cys Leu Gln
485 490 495
Asp Gly Trp Ser Pro Arg Pro Ser Cys Ile Lys Ser Cys Asp Met Pro
500 505 510
Val Phe Glu Asn Ala Met Thr Lys Asn Asn Asn Thr Trp Phe Lys Leu
515 520 525
Asn Asp Lys Leu Asp Tyr Glu Cys His Ile Gly Tyr Glu Asn Glu Tyr
530 535 540
Lys His Thr Lys Gly Ser Ile Thr Cys Thr Tyr Asp Gly Trp Ser Ser
545 550 555 560
Thr Pro Ser Cys Tyr Glu Arg Glu Cys Ser Ile Pro Leu Leu His Gln
565 570 575
Asp Leu Val Val Phe Pro Arg Glu Val Lys Tyr Lys Val Gly Asp Ser
580 585 590
Leu Ser Phe Ser Cys Arg Ser Gly His Arg Val Gly Ala Asp Leu Val
595 600 605
Gln Cys Tyr His Phe Gly Trp Ser Pro Asn Phe Pro Thr Cys Glu Gly
610 615 620
Gln Val Lys Ser Cys Asp Gln Pro Leu Glu Ile Pro Asn Gly Glu Ile
625 630 635 640
Lys Gly Thr Lys Lys Val Glu Tyr Ser His Gly Asp Val Val Glu Tyr
645 650 655
Asp Cys Lys Pro Arg Phe Leu Leu Lys Gly Pro Asn Lys Ile Gln Cys
660 665 670
Val Asp Gly Lys Trp Thr Thr Leu Pro Ile Cys Val Glu Tyr Glu Arg
675 680 685
Thr Cys Gly Asp Leu Pro Ala Leu Glu His Gly Ser Val Gln Leu Ser
690 695 700
Val Pro Pro Tyr His His Gly Asp Ser Val Glu Phe Thr Cys Ala Glu
705 710 715 720
Thr Phe Thr Met Ile Gly His Ala Val Val Phe Cys Ile Ser Gly Arg
725 730 735
Trp Thr Glu Leu Pro Gln Cys Val Ala Thr Asp Gln Leu Glu Lys Cys
740 745 750
Lys Ala Pro Lys Ser Thr Gly Ile Asp Ala Ile His Pro Asn Lys Asn
755 760 765
Glu Phe Asn His Asn Phe Ser Val Ser Tyr Arg Cys Arg Gln Lys Gln
770 775 780
Glu Tyr Glu His Ser Ile Cys Ile Asn Gly Arg Trp Asp Pro Glu Pro
785 790 795 800
Asn Cys Thr Arg Asn Glu Lys Arg Phe Cys Pro Pro Pro Pro Gln Ile
805 810 815
Pro Asn Ala Gln Val Ile Glu Thr Thr Val Lys Tyr Leu Asp Gly Glu
820 825 830
Lys Val Ser Val Leu Cys Gln Asp Gly Tyr Leu Thr Gln Gly Pro Glu
835 840 845
Glu Met Val Cys Lys His Gly Arg Trp Gln Ser Leu Pro Arg Cys Thr
850 855 860
Glu Lys Ile Pro Cys Ser Gln Pro Pro Lys Ile Glu His Gly Ser Ile
865 870 875 880
Lys Ser Pro Arg Ser Ser Glu Glu Arg Asp Leu Ile Glu Ser Ser Ser
885 890 895
Tyr Glu His Gly Thr Thr Phe Ser Tyr Val Cys Asp Asp Gly Phe Arg
900 905 910
Ile Ser Glu Glu Asn Arg Val Thr Cys Asn Met Gly Lys Trp Ser Ser
915 920 925
Leu Pro Arg Cys Val Gly Ile Pro Cys Gly Pro Pro Pro Ser Ile Pro
930 935 940
Leu Gly Ile Val Ser His Glu Leu Glu Ser Tyr Gln Tyr Gly Glu Glu
945 950 955 960
Val Thr Tyr Asn Cys Ser Glu Gly Phe Gly Ile Asp Gly Pro Ala Phe
965 970 975
Ile Lys Cys Val Gly Gly Gln Trp Ser Glu Pro Pro Lys Cys Ile Lys
980 985 990
Thr Asp Cys Asp Asn Leu Pro Thr Phe Glu Ile Ala Lys Pro Thr Glu
995 1000 1005
Lys Lys Lys Lys Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Gln Val Thr Phe Arg
1010 1015 1020
Cys Pro Pro Pro Tyr Arg Met Asp Gly Ser Asp Ile Val Thr Cys
1025 1030 1035
Val Asn Thr Lys Trp Ile Gly Gln Pro Val Cys Lys Asp Asn Ser
1040 1045 1050
Cys Val Asn Pro Pro His Val Pro Asn Ala Thr Ile Leu Thr Arg
1055 1060 1065
His Lys Thr Lys Tyr Pro Ser Gly Asp Lys Val Arg Tyr Asp Cys
1070 1075 1080
Asn Lys Pro Phe Glu Leu Phe Gly Glu Val Glu Val Met Cys Gln
1085 1090 1095
Asn Gly Ile Trp Thr Glu Pro Pro Lys Cys Lys Asp Ser Thr Gly
1100 1105 1110
Lys Cys Gly Pro Pro Pro Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile Thr Ser
1115 1120 1125
Leu Ser Leu Pro Val Tyr Ala Pro Leu Ser Ser Val Glu Tyr Gln
1130 1135 1140
Cys Gln Asn Tyr Tyr Leu Leu Lys Gly Asn Lys Ile Val Thr Cys
1145 1150 1155
Arg Asn Gly Lys Trp Ser Gln Pro Pro Thr Cys Leu His Ala Cys
1160 1165 1170
Val Ile Pro Glu Asp Ile Met Glu Lys His Asn Ile Val Leu Arg
1175 1180 1185
Trp Arg Glu Asn Ala Lys Ile Tyr Ser Gln Ser Gly Glu Asn Ile
1190 1195 1200
Glu Phe Met Cys Lys Pro Gly Tyr Arg Lys Phe Arg Gly Ser Pro
1205 1210 1215
Pro Phe Arg Thr Lys Cys Ile Glu Gly His Ile Asn Tyr Pro Thr
1220 1225 1230
Cys Val
1235
<210> 4
<211> 97328
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(96)
<223> 外显子1
<220>
<221> misc_feature
<222> (18013)..(18198)
<223> 外显子2
<220>
<221> misc_feature
<222> (18494)..(18599)
<223> 外显子3
<220>
<221> misc_feature
<222> (21021)..(21097)
<223> 外显子4
<220>
<221> misc_feature
<222> (23223)..(23414)
<223> 外显子5
<220>
<221> misc_feature
<222> (23849)..(27569)
<223> N = A, T, C,或G
<220>
<221> misc_feature
<222> (30174)..(30344)
<223> 外显子6
<220>
<221> misc_feature
<222> (33877)..(34050)
<223> 外显子7
<220>
<221> misc_feature
<222> (47893)..(48087)
<223> 外显子8
<220>
<221> misc_feature
<222> (48451)..(48627)
<223> 外显子9
<220>
<221> misc_feature
<222> (60128)..(60310)
<223> 外显子10
<220>
<221> misc_feature
<222> (61423)..(61599)
<223> 外显子11
<220>
<221> misc_feature
<222> (66870)..(67043)
<223> 外显子12
<220>
<221> misc_feature
<222> (67758)..(67940)
<223> 外显子13
<220>
<221> misc_feature
<222> (68026)..(68205)
<223> 外显子14
<220>
<221> misc_feature
<222> (70445)..(70621)
<223> 外显子15
<220>
<221> misc_feature
<222> (73158)..(73340)
<223> 外显子16
<220>
<221> misc_feature
<222> (73511)..(73717)
<223> 外显子17
<220>
<221> misc_feature
<222> (74282)..(74455)
<223> 外显子18
<220>
<221> misc_feature
<222> (83447)..(83623)
<223> 外显子19
<220>
<221> misc_feature
<222> (85250)..(85426)
<223> 外显子20
<220>
<221> misc_feature
<222> (88077)..(88078)
<223> N = A, T, C,或G
<220>
<221> misc_feature
<222> (93999)..(94181)
<223> 外显子21
<220>
<221> misc_feature
<222> (96653)..(97328)
<223> 外显子22
<220>
<221> misc_feature
<222> (96847)..(96849)
<223> 终止密码子
<400> 4
cctaaactaa ctttcaactt ccctttgggg caagtctgtc tctgctgtaa ccacagttca 60
tagcagagag gaactggatg gtacagcaca tacttcattt gctgataata tttctcatag 120
caattattca aattaagtct agaaaatgtg ggtaattact agtctgtaac tgaatggctt 180
ttggtggtaa gtttaaaaac cgtgaacctt tcacttgact attgtaattg atagttcagc 240
ttgatgtaaa actcaagaca gtgctttaaa catgtttttg caatccataa ttaggcatag 300
acatttaact tgtagttatc aggaaataca ggctcctctt tttctcatga gtgtccctga 360
agtactatat gtaaaactag ttagaaatat ataaatatcc aaagtcaatg aaagcactta 420
cttttttctt taaatgggtg gatcgatttc aggcttattt ctaaaccttc ctaactacat 480
cacttagctg atatttccat ggttttaaaa gtttcgtatg taagaccttc aagtatgaga 540
taaaaagaaa ataaaatttg acatgtaacc tgcattggac ggatctgatt tgtttctggt 600
tttgttttct gtgaatacgt gtggggcatg tttgtttctg aagccatttt gaagtaggta 660
atgtgactgt cggagttctt tcatgacaat aacagggtct gactttatta ttcacttaaa 720
ttctcccaag actgcttagt ttatccaatg aaagagcttt gctttcccag tttaggaagg 780
gtacctagtt gtgggataaa catttaatca actcttcttt gtgttttgat tgtttaagat 840
agggtgtcac tacacccttg agctcactgt agtcctcttg tcagcagctt cctatgggct 900
gaggttacca gtgagagtga ctgccatgcc tgacttagca ctttttatat aaagtgaatg 960
acataacttt aataacttcc ttaaatgttt ctcttagcca atgcattgta atttgaagct 1020
ttgctgtaac cactactcag taaagaatac taaaattatc ctctgactgg atgtttacca 1080
acccacataa gaagagtaga tatggtttct cagttgtatc ttttactaaa attctgaaaa 1140
aaaaatttaa gggtatttta tactttttga aagagtaaac attttcaatt atatttttta 1200
atgttattcc ttgaatttta gcttaagagt cttgtattca gatgccttat agactaaggc 1260
agtcatttcc ttgtatatga aaatataagt attgctgaaa tgaaatgtga ttatattggc 1320
caggaattct aaagcaatgt tgatattacc aagcataact aaacttttta ttttgttaaa 1380
ggcaatgttt tcatcgctta ttttagtgtt ctacttgaat aataatgttt actaagaggt 1440
ttttaaagat atataagatt aaagaaagaa ctattttatg tttagctaac ttttaagtct 1500
taattgatat aaatcgaatt aaggtgtcta cacaattaca aagcagaatt tcaatattaa 1560
aaaggaagtg ccgcgatgtt tgcgtgatac tttaacgcta atgatttaaa aatcctcatt 1620
tatgccatgg atgtcagctg atttttttgt tattgctgga tttgaatttt catcagtatg 1680
tattcaaatg tggtgccagt tcttgctgat gaggtgggca gttacactgt gtccgatact 1740
gtttcacagg gattttcctt tcattcacag atgaaaagag agtttagttt ctaaatcatt 1800
atgtagggta acctcatggt ctccacaaaa tgaatgtaaa cagatgggag aagtttcatg 1860
gattttcagt ggacacagta ctcccacttt agtcttagct tggctggtga cccgtgtcta 1920
tctcaaatgt aaacaattta atcagtctat caacttaaga ggaatttcag cagaagagct 1980
tggatcaatt aaaacaatta tgtatatgct gcaatgtttg ctcctgtttc tattctatta 2040
gatgctggct actaagctga tttaaaaaaa aaaagtttgt gaaatgctct catattaggc 2100
tttctgaaac agggaagaaa agatttcata agtattttct gccctgataa agatcaacat 2160
tcatctaaaa ccaatgttag ctgggccagc aggaacggta aacacaataa tgatcttgct 2220
tggcaaagaa cctggctact tgagttcaat tcatgggccc cacctggtga aagggggaaa 2280
aaaagcctct acagactgtc ctccagtttc ctcatacagg catggcaact gtatgttaca 2340
cccactcaaa ttaaaagaaa ataataacca taacaaaaaa tttaaactcc actattaata 2400
attaaagaat aataaccaaa agaagaacta tgaacccagc ttgtttgcct ccctccctcc 2460
gtgcccctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct gccccgcggg gccgccccca 2520
cagcccccta tatccacacc cccaagaggg gaggggagaa ggccgggcgc caccaccccc 2580
gccccaccaa acaacccccc agaccggccc tacccacgcg cggacaacca caccacgccg 2640
gcgaacaccc accccccaca gccgaaccaa gcaacacaca ccacaacccg cgaaggggac 2700
ccgtaaccgg ccctctctct ctctctctct ctctctgtcc cccccctctc cttttcccct 2760
tttctacttg ccaagggctt tctcatatct ttttagtgca gtgcttgact gtattcacac 2820
ttctagctgc caagaacagt caatggtgct tcctgcaaaa ccacacgctg atcagaattg 2880
ggtcagattt acaggacaac ctgtaacata agagagttcc ttggttgagc cgtataattt 2940
cagttctggg gaatggatta tacccaagct ttccaagcat tttactctca caattgaata 3000
ttgtatgaaa ttaggccgca gcccaggatt gctgaaatga accaattaaa cctgtgctga 3060
aacaaaacca aataaccact gcgtgctttc tggggagata agtgttttct aatcctggag 3120
gtttaaagga caaaaaggtc ctttcaggct tagagacttt aatcatagaa tggagaattg 3180
gtttaattct ataatgtttt aagtatatga ttttttcaaa cttagtttaa cattgatgtg 3240
gaaaaattga tgttatatac attaattatg agttaataat agttgctttg ggggaaattt 3300
agagaaaagt taattattct tttatgtaaa atgatattat attatgtcaa aaagtcaagt 3360
gattcaatgt aagatattta tacttttcct taagaaaaag aattaatatg gagtgtgtct 3420
tacttttccc ttcactctgt gtccaaagtt gaaagcagct gattctgcag cgttcaccac 3480
atcttaacta taaaccatgt ctacagcttt tcctttggcc ttagccatat tgaatatgaa 3540
ggtttcacat gtcccaagtg actgaatgaa gacggatgca gcaagttgca atacagaagt 3600
gatatgtgcg tcactgtgta tgtattgtca catacagtac tgcatacaca gagttctgtc 3660
agtagtatca ctgctgtcct ttgtcttcaa ttactttagt tcttcgagat agagtccccc 3720
tgtttggccc atgctggtcc ttaaactcct agtcttctgg ccttagcctc cctagtactg 3780
aaattcaata tcaagaatat cttatgcaga ttttctgttg ctttcattca actaaattga 3840
cagcaatagc tggaccttcc ttagaaaaat ggaaaaatat ttaaatatca aaaccttcta 3900
aagaagcaac ctatagttct ctttttctag acagaaaata aaaaaaaatc caaaaagtaa 3960
aggtcaactt taaaacatac atataagtaa tattatatat actgatcatg ttatatttag 4020
aaatatatat gtatatgcat atatgcatat aattatagtt atgaaaataa gtagtcatgg 4080
ggtgaaagaa agtaaaggag ataggtgggc agtattggag agacaagagg aaaggggaaa 4140
tgatgtaatt agattataat ctaaaaaata taaaagaaat aagaataaaa aagaaatgga 4200
aattttggtg gtaaactaaa aaataacgtg tggatttaca aagagaaaat acatgtctgc 4260
atgtcttcaa tgctttcatt gacacagaaa accaatttcg gtatcttgct tttatgctcc 4320
tttatcacag caaaaattta taaacatgtc acaggacaaa ccgggacttt taaacctttc 4380
ttgtatttca aattataata aatatttgga tttattgctg cagtctctac tgtgagcata 4440
atgtttactt tctttctttt tttaaaatca taatgttttc aaagccagaa gacatctgaa 4500
aactctgaag ttgactatct ttggtatttc tttggctttc ttgtttggga caaaactgaa 4560
ggaattcaca atgtcaacca aaccacctat tgccattaat agtacctact tgcaaagtcc 4620
taagtttcca ttaaccaaac agcacaaacc gaatccattg cagttgtttc gtttctccca 4680
ttgaggaaaa aaaaacaaca tcctcgtagc ctcccttttc tgaaccttga aattggaaca 4740
gtaatctttt tcacacacac catggaggca gtgcatagat agatccccac atttctttaa 4800
ggaaagtggt tggattgaat aatcaggtgt gggacagaga tgtcaacatt gaaattcttc 4860
cttgagtttg aattttgaga agagtctaaa agaggtcagg ttgaaagaac ttgcatcctg 4920
tttgataagg ttcttcacac agtctagcat atttattaag cttctcggtt gtactctccc 4980
aggccccaga ggtcagaggt ccatgtatgc caccttctat cacacttgct taaatccacc 5040
ctagtagatg cacatgagta ttagagatca ttatgtaaac tagacactag ggcactacta 5100
gtttattacc taaattaggc attaatgtca gtggagcaag taacctctat ccctacaaca 5160
catgttttca ggatagaatt atatttccct aaatcatgtt acttggcatt gtgccccaat 5220
tgtcttcagt gtcttctttc atgcaactct taaagtattt gacatgttta tcgtaccaca 5280
aactcaacca acctgttatt tatgtgtaag ggaccacata gttaaattta gtgctattat 5340
gtgtaattta ctgtgaaatt tcactgatag aggatagaac tggaaaatgg taagggacaa 5400
aatagaccaa agacattctg agacaggaag cttcctagga tgaaatgctg taacaggtga 5460
caaagggtgg agaagttgct cgcaggcagg gtgaaggtgg tcagtgaaaa caagccttgc 5520
ttatcatcag cacagtcatg ttctaggaat gtgcatgccc tttgccagga tgctatttaa 5580
aactaaacca tttaagtagt gcaaagcgga atttttctaa ggtaggaact gccacagagt 5640
aaatagtctg cctctttgtc cttagattgc tcaattttga actctctctc cccttccaaa 5700
ttaatccatg tttatttcct gactctgatt gttagtcttt acttcctcct tctctctctc 5760
cttccctcac tctctccctc agccctccct ccttcctctc tctctctctc tctctctctc 5820
tctctctctc tccacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 5880
cacacacaca ctacctctac ctctcgacat ttaggcagat gctgtccacc aaatcctcaa 5940
acgctcagtt gactgatgtt aactttagct tttctcagag cacaaaacat gaaaaacaga 6000
taaagtaatt gggaaaaaaa atgttacttt ttttttttgg tttaaaatta gaagaaaaaa 6060
aaagtctggt tcagataaag tcaagcaact aaacagaaaa aaattccaac cgtgaaataa 6120
taaaaagaac acacggattt gacagaacac ttttgttttg acattttcac ttagaaagtc 6180
tagtttctca cagagtgtta actggaaatg ggatagatag aggacgatta tagaaacacc 6240
ccttcaaagg ttccgaggga acttttatac ttcgagctaa attcaagtga ctctagactt 6300
caaaaaccgc aacatagaca gatgtgcaaa ctctgtagag aactttcagt gcatgcaaca 6360
ggcattcaac tccaccagac agtggtgctc ttgccactgc ctcctcctcc ttttcctcct 6420
cttttttttc cctcaagttg tctctttctt ttcctttttc caagtcttgt cttttaagtt 6480
tcccatttgc cactctcagc tgttggtggc cctattgact atatgggtgt acactgtggg 6540
aaagttccta cagtcttttt tgcgttcgct ctctcctcta ttcacaatcc cttttgaata 6600
acttttaagt actgcgcaat ataatacttt ccaaaaggtt gtcatttagt ggagaggaaa 6660
agaatgaaca gtgtattgaa atattcacat acagtagctc atcttataaa ctattatgac 6720
tcagatttta aaaagttcct aaagcagaaa actgaagttg aaaagatgtg ctgtatacac 6780
aaaatgaatt tttgttcagc tacaaaaaat tatgaaattt ataggaaaaa ttgatgaatt 6840
cagactcaca gggagacaaa ctctgcatgc tctccttcac attttgattc tagtttttaa 6900
tacatatact ttatatatac tgcatatatc tttgtttaat atgacgtgtg tgtgtgtgtg 6960
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgactt atggatagaa gacatggaac tagaagtgga 7020
aaaagaaccg tggaggaagg gaaccatgaa aaacacaagt ggattgacca agacagagga 7080
gggagacagg gtagaaaggt gaagagaaga aaataaaact gtttttacaa gtcataaaaa 7140
aggctggata tggtggcaca ccatagtccc tgtatgaggg aagaaaatac agggcagttc 7200
tctaagttca aggccagctt aatctacaaa gtgaattcga ggacagtcag gcctacacga 7260
aaaactatgt cttggaagaa aaaaatgcct cactataata taatataaaa tataatataa 7320
tacttcatat attaacttaa aaaataacat gaaataataa ttggaatggg aaaatgggtc 7380
aggaacagga gagggtgagg gtgacggtaa ctggatacag atgttctgct gacttagttc 7440
tatgttgttt ctctgagaaa agtcagacaa agctctcaat tcacaatctt ctctctccag 7500
tatgctcaaa ggacaggcat ggagcctcaa gtagataggc tacggatgct gcataggagt 7560
tagtcagaaa gaccaaagag gatgttaaca gaaaaacatc agatatacag aaagaactat 7620
aggttctata aagctgtggg gctcatctcc acacctacaa cttaacttgg cttaagtttc 7680
acaaggatta gtgggaggtt aggaaagaaa aagttttccc ttttatttat ttttgttttg 7740
ttttgttttt gattttttta atttatattt caaatattat cccctttcct ggtttccctt 7800
tcataaaccc cctactttat cattttatcc ccctgcccct tcttctatga gggtgttcag 7860
ccacccaacc acacacacct tcccgcctcc cctctctgac attcccctac actagggggg 7920
tccagccttg gcaggaccca ggggttctcc tttcactggt ggccaacaag gccatcttct 7980
gccacatatg cagctggagc cataggtctg tctgtgcata ctctttggat ggtggtttag 8040
tccctgggag ctctggttgg ttggtattgt tgtttttatg gggttacaaa ccccttcagc 8100
tccttgaatc ctttctctaa ctcctccaat ggggacccca ttctcagttc aatggttggc 8160
tgctagcatc ctctgtattt gtcatgctct ggcagagtct ctcatgagac agctatatta 8220
ggctcctgtc agcatgcact tcttgacctc agcaatattg tcgagtttgg tgtctgtatg 8280
tatatgggct ggatccccag ttgggacagg ttctgaatgg ccatttcttc agactttgct 8340
ccaaattttg tctccctatc tcctcctatg aatgtttttg ttcccccttt caagaagaac 8400
tgaagcatcc gcattttggt cgtctttctt gagtttcatg gtggtctatg gattgtattt 8460
tgggtaagct gggcttttgg gttaatattc acttttcagt gagtgcatac caggtgtgtg 8520
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tatgtgtgtg tgtggttggg 8580
ttacctcact caggatgata ttttctagtt ccatccattt acctatgaat gtcatgaagt 8640
cattgttttc ccttgttcta atccttatcc tcggcatccc actgatacct ctcatccact 8700
ccagtactgg agctgctaaa acattcagcc ttagttactc catcttgtgg ctaaactgct 8760
ttgtgaggca gccgttcaag cctaatgaaa ccgttcaatg tatgctaaca gtttatttta 8820
aaaagacaat attgaacctg gacccttctt ggtgttagga gactcttgtg taaatgctgc 8880
ctttttcaga aattgacttc aagctgactc ctcaggaggc aaaaattcca actactctgg 8940
tcgatttcac tcaggtttag ccatatacct gcctattatg atctaggtgc ttctcgaggg 9000
tattagtttt ataaagaaaa tttataatta tttctgtatg ttttagaaat agaaatttat 9060
tttccaatgt tcattaaata taaccaaaac ttaaattttt gtagtttgtt ttttaaagta 9120
ctttattgca atttatattt actttgttca aaaaaattca acctaaatat tcttgcacta 9180
tttataaatt aatctaaata tttttagtaa acaaaatact ctttggatca tatacatgca 9240
taaacttaat actcatttat atcaataaga aagcagatga gaaatttaat gaaactaaca 9300
ttcttgctct tcccacttta ttcttttact tttttctgag taatgtgtat actccaccat 9360
ctgctaataa atatattttt aaaatgatgc ctctcattct ttttccaaaa tccttgtaga 9420
agctatagga agagaaaaaa agatgacctc tccatcttta gtctttcaaa agtgtgggta 9480
caactgatgt tttacaaaat ataaaaattc attaagactt acttcattgc agcaagaaca 9540
tttcaaagaa caattctgag acatattggc attcggaaaa ggaattgcac ttggtttgtc 9600
agtcctaatt ctttaaaatc tgtatatgaa aaactggtaa tcatgattat taaaacagca 9660
aatatttgct ttaaagttcc atcgattata gttatcttcc tcaagtttaa gtaaaactct 9720
tgttttcaga ttatcaaacc tacacagtca ttctgtttct ggaaaacatt caagagtggc 9780
atttgcatct aagtaaatag gaaattaaca aagaaaattc ttaaaaagca aaatcaacta 9840
tttaattagg attggaccag gtttcatttg ttggaatctg agtaaatatt taggtacaag 9900
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 23940
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnng tggcaggggt cctgccgctc ctgggccctc 27600
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tacttaatat ttcttttctt tcctcctcct cctcctcctc ttcctcttct tcatcttctt 28140
catcttcttc ttcttcccct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt 28200
cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc tagacagcct ttcataatgt 28260
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cttagagttc cgacaagagt tttgaaattg cctgcatgtg gcactggtct tatactatat 28380
ttatttttca atattatcta acacctccat tattttcacc attccttagt attgtccacc 28440
ttagactaaa gaagacagtg ttttcttctt ttcaaattta gtttgctttt gagattataa 28500
ctacatcatt tctttcctca aggattgact agttgctgct aacaactcta acagcactga 28560
ttcatcatga gaataatgat ataccaatat gtatagtcaa tgtggcatat atttgacata 28620
ttgaagttta atggctgata tcttttggac tttaactaat tgtctattgc taatgaaacc 28680
taggaaattc tgatccttga gattattttt aaagtgcaca taaggtatat tcaggtgaaa 28740
ataaagaaga caagcatagc agcccccaga aggccatgtg gagaaagata aaaaaaaaaa 28800
aaaaccagca aagtatctac agcaagatgt gggcctgagg gtcttctgtg cagctcagtt 28860
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gagcttcctt agaggatggg attttttagt tccctttaga gcaatggttc tcaacctgtg 29040
accccctctg aagtcaaaca aacctttcac atgggttgcc taaaaccatt gtaaaacaca 29100
gatattatta ttaataatag ttgcaaaatt acagttatga aatagcaaca aaaataattt 29160
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ttgaaaacca ttgctttatc tcatcctatt tttatgggtg cttctctctg agacggagtc 29280
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gtgtgtttgt gtgtatggag aaggcaccat gacttttcaa agataaaatg aaaagtgaat 29760
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attttgaaga ttattcaatg aaaatattaa tctacaacca cgtgtctatt tttattttca 29880
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attaatcata tacttttaat ttcttccaaa aatgaaaatt tgaaatgaca gatatatgat 30000
caagagggca gtcaggccaa aacaatgttt gtttggtcac tgattttgac tgattgacct 30060
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aaacactata caattactct tttgcattta gaaatttctt gcctgccacc acgagttgaa 30180
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cattgagtct aaccatctgt tttcatggtg tttatgtatc ctagtcagag aagtatctca 30480
gtagtccttt ggcattaaac ctctgcacaa gattaactcc aggtgtcctc ctaaatagac 30540
catttatcca ctaaaggatc aaactataac ccatgatgta gctattttgt attgtcttgt 30600
gcttaagagg aacttttcaa acaatcattc cagtttcagg tgaatccagt tttccatgga 30660
agcattagga ttcaatagaa tagtcatgcc acaccaaata acagagcaga gcagaatgcc 30720
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caatggactt cattttactg aagaaaactt tatactccta tatgaaaagt agtttcttat 31200
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cacaatcttc tgaacaattt attttgatgc atctgtttcc tgtacagagt agattttgta 31620
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tcagaaaagt tggtcttacc tgtggtcctg tgtctcaagt tgctcgtggg gggctgcttt 80580
tgagctctct gtgagggtgg caaccaggag ggtctgtgca gccttttcca tgagcccccg 80640
agtactgggg tcccagacgg cattaggtgt tttcctctgg agtctgaaat gtgggcagag 80700
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gtattaacat ctacaaaact gggtgccagc ataacattat ataactgttg tctcagtcag 94440
tgttctattg ttttaaagag gaactatgac catggcaact cttttaaaag aaaccatttg 94500
ttgggggttg cttacaattt tggaaattta ttctactctc aacatgtttg ggagcatggt 94560
ggcacagagg taaacatgat ggtgaagaag tagctaagta ttccatatct ggctctgcag 94620
ggagcagaaa gtgataggca tacttctaac aagtctatgc aaactcccac aaggccgtag 94680
ccataatact tcacaagtac caccattctc caatgaaaaa tctgtatgtg tatctatgga 94740
ggtcattcct tttcaaataa gcacatctgt atacatcttg cagttattaa atccatacaa 94800
catctccttt ccttagataa ggcaactgac atctattaat cactgttatg cattctaaag 94860
taattctctc tgtgagaaag agcacaaagt agttgtcttt ctgtgttggt tatatttgac 94920
ttaatgtcct tcaatgccct tttctaagta aaataataaa atatatcttt aatgacttaa 94980
tattttacat ttaaatatac catgatgtca ttataaattc accaattagt attagttcag 95040
ctttcttcac cttaccaact tccatgtagc agtttagaat aaacatatag atccaggttg 95100
agtactttga ttttatttcc tttgcgtaca ttccagaaga aacaatagga acaatacata 95160
aatatctatt tttaaatttg taagaaatct caatttttat ccatagtaac ttcacaaaat 95220
catattcctg tcaatggttt gtgaagtgtt caccacacac taatgagcag ttgtaatttt 95280
tagggctcct tcctctggtg ctactttaac tgagttaaaa gatatcttac tatggctttt 95340
caatggaatg acagcaatga tatttatgtg tttttcttag aagtatctat tcatttatcc 95400
agatttgatc agcttatttt tcctttaaaa tgtgctttac cacagactaa tatagttcag 95460
cgaaaggtta tcagcagact ggaatatttt tcaattattt aagtataatt tatgacagat 95520
atagtgcaaa gccttttcac aatcaattta ctaaaaaagg tgttctaact tctaacagac 95580
cagcaaggcc caaagcaatg aaatcaaatt atataaaaac aaaacaaaag caaataaata 95640
tatttatgca ctttgtacga aatggaggtc acatctttat gctttcttga cccaggacac 95700
ccccctaaaa gatatgtaaa tacctaaaaa taaagaatag acaaccatat acttcaatta 95760
aacttgctgc caatttctta ggtgtattga ctatgctctg tgatatgcac cagtaccaca 95820
atgggatcaa atccacaggt caaagtttgc tttttgcctt gtgatttgga gtcccagcca 95880
aacacacagt gtcaaaacca tgaaatgttt ccctgttgtg cttcctgata ctttcagtgg 95940
tttgttctta tatcaatgtc tttgaccaaa tttcagttga atttgcccat aatgacaaac 96000
agatataaaa tttcaatcat cgccatatgg atatcaatta tcattttatc atttattaaa 96060
tatgatatca gttcattaac ataagttttg ggaaagttta ttaagatcag taacctgtag 96120
atgcatagat caattttcaa atcacttttc tcattcattg gagtcttccg agtgttctgg 96180
ttactgtggg gttcctggtg tatattgaaa taaagtatta tggtatctcc tgatttttcc 96240
tttctgttct agttacagtt gtctattcat tctattgtag ttccatacaa gttttagatt 96300
tttatcccta ttagtatgaa aaatgttatt gatatttcag tgtcagctca cagagtctgc 96360
tattagccat aggatatgtg gacatgtcta tacctatatt aattcttaca acccattaat 96420
atacaagctt tctctatttc tgtcttttca gattatttta ccagttaact aatatttttg 96480
attgaagttt tcacttctgt ttataaattc atagctgaat taattttgaa gatactgaaa 96540
atgacattgc atttatagtt aattctcaga aaaatggaat ttttctatag aaagggggtg 96600
atttctgtag gtttatatat taattgttga actttggtaa tttatctttc agatgcatgt 96660
gtgataccag aagatattat ggaaaaacat aatatagttc tcagatggag ggaaaatgca 96720
aagatttatt cccaatcagg ggagaatatt gaattcatgt gtaaacctgg atatagaaaa 96780
ttcagaggat cacctccgtt tcgtacaaag tgcattgagg gtcacatcaa ttatcccact 96840
tgtgtataaa atcgctatac aattattagt aaaccttatg gatgaacctt tgtttagaaa 96900
tgcacatgta tattactaat acagtttgaa tttacatttg aaatattgtt tagctcattt 96960
cttctaataa gtatataaac tttttttata tggtggttaa tcagtaactt tacagactgt 97020
tgccacaaag caagaacatt gcattcaaaa ctcctaatcc aaaatatgat atgtccaagg 97080
acaaactatg tctaagcaag aaaataaatg ttagttcttc aatgtctgtt tttattcagg 97140
acttttcaga ttttcttgga taccttttgt tgttaggttc tgattcacag tgagtggaag 97200
acacactgac tctgacttca aattagtatt acttgccaat acataacaac caaactatca 97260
taatatcaca aatgtataca gctaattact gtgtcctacc tttgtatcaa taaagaaatc 97320
taagaaag 97328
<210> 5
<211> 146
<212> DNA
<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）
<400> 5
tcttcgagtc aactgctccc agatagatcc aagacatgag actgtcagca agaattattt 60
ggcttatatt atggactgtt tgtgtagcag aaggtaagct taaaaccacc acctttctcc 120
cttctgactg agccgcatta taaaac 146
<210> 6
<211> 4176
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 起始密码子
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(30)
<223> 5' NLS
<220>
<221> misc_feature
<222> (4126)..(4173)
<223> 3' NLS
<220>
<221> misc_feature
<222> (4174)..(4176)
<223> 终止密码子
<400> 6
atggacaagc ccaagaaaaa gcggaaagtg aagtacagca tcggcctgga catcggcacc 60
aactctgtgg gctgggccgt gatcaccgac gagtacaagg tgcccagcaa gaaattcaag 120
gtgctgggca acaccgacag gcacagcatc aagaagaacc tgatcggcgc cctgctgttc 180
gacagcggcg aaacagccga ggccaccaga ctgaagagaa ccgccagaag aagatacacc 240
aggcggaaga acaggatctg ctatctgcaa gagatcttca gcaacgagat ggccaaggtg 300
gacgacagct tcttccacag actggaagag tccttcctgg tggaagagga caagaagcac 360
gagagacacc ccatcttcgg caacatcgtg gacgaggtgg cctaccacga gaagtacccc 420
accatctacc acctgagaaa gaaactggtg gacagcaccg acaaggccga cctgagactg 480
atctacctgg ccctggccca catgatcaag ttcagaggcc acttcctgat cgagggcgac 540
ctgaaccccg acaacagcga cgtggacaag ctgttcatcc agctggtgca gacctacaac 600
cagctgttcg aggaaaaccc catcaacgcc agcggcgtgg acgccaaggc tatcctgtct 660
gccagactga gcaagagcag aaggctggaa aatctgatcg cccagctgcc cggcgagaag 720
aagaacggcc tgttcggcaa cctgattgcc ctgagcctgg gcctgacccc caacttcaag 780
agcaacttcg acctggccga ggatgccaaa ctgcagctga gcaaggacac ctacgacgac 840
gacctggaca acctgctggc ccagatcggc gaccagtacg ccgacctgtt cctggccgcc 900
aagaacctgt ctgacgccat cctgctgagc gacatcctga gagtgaacac cgagatcacc 960
aaggcccccc tgagcgcctc tatgatcaag agatacgacg agcaccacca ggacctgacc 1020
ctgctgaaag ctctcgtgcg gcagcagctg cctgagaagt acaaagaaat cttcttcgac 1080
cagagcaaga acggctacgc cggctacatc gatggcggcg ctagccagga agagttctac 1140
aagttcatca agcccatcct ggaaaagatg gacggcaccg aggaactgct cgtgaagctg 1200
aacagagagg acctgctgag aaagcagaga accttcgaca acggcagcat cccccaccag 1260
atccacctgg gagagctgca cgctatcctg agaaggcagg aagattttta cccattcctg 1320
aaggacaacc gggaaaagat cgagaagatc ctgaccttca ggatccccta ctacgtgggc 1380
cccctggcca gaggcaacag cagattcgcc tggatgacca gaaagagcga ggaaaccatc 1440
accccctgga acttcgagga agtggtggac aagggcgcca gcgcccagag cttcatcgag 1500
agaatgacaa acttcgataa gaacctgccc aacgagaagg tgctgcccaa gcacagcctg 1560
ctgtacgagt acttcaccgt gtacaacgag ctgaccaaag tgaaatacgt gaccgaggga 1620
atgagaaagc ccgccttcct gagcggcgag cagaaaaagg ccatcgtgga cctgctgttc 1680
aagaccaaca gaaaagtgac cgtgaagcag ctgaaagagg actacttcaa gaaaatcgag 1740
tgcttcgact ccgtggaaat ctccggcgtg gaagatagat tcaacgcctc cctgggcaca 1800
taccacgatc tgctgaaaat tatcaaggac aaggacttcc tggataacga agagaacgag 1860
gacattctgg aagatatcgt gctgaccctg acactgtttg aggaccgcga gatgatcgag 1920
gaaaggctga aaacctacgc tcacctgttc gacgacaaag tgatgaagca gctgaagaga 1980
aggcggtaca ccggctgggg caggctgagc agaaagctga tcaacggcat cagagacaag 2040
cagagcggca agacaatcct ggatttcctg aagtccgacg gcttcgccaa ccggaacttc 2100
atgcagctga tccacgacga cagcctgaca ttcaaagagg acatccagaa agcccaggtg 2160
tccggccagg gcgactctct gcacgagcat atcgctaacc tggccggcag ccccgctatc 2220
aagaagggca tcctgcagac agtgaaggtg gtggacgagc tcgtgaaagt gatgggcaga 2280
cacaagcccg agaacatcgt gatcgagatg gctagagaga accagaccac ccagaaggga 2340
cagaagaact cccgcgagag gatgaagaga atcgaagagg gcatcaaaga gctgggcagc 2400
cagatcctga aagaacaccc cgtggaaaac acccagctgc agaacgagaa gctgtacctg 2460
tactacctgc agaatggccg ggatatgtac gtggaccagg aactggacat caacagactg 2520
tccgactacg atgtggacca tatcgtgcct cagagctttc tgaaggacga ctccatcgat 2580
aacaaagtgc tgactcggag cgacaagaac agaggcaaga gcgacaacgt gccctccgaa 2640
gaggtcgtga agaagatgaa gaactactgg cgacagctgc tgaacgccaa gctgattacc 2700
cagaggaagt tcgataacct gaccaaggcc gagagaggcg gcctgagcga gctggataag 2760
gccggcttca tcaagaggca gctggtggaa accagacaga tcacaaagca cgtggcacag 2820
atcctggact cccggatgaa cactaagtac gacgaaaacg ataagctgat ccgggaagtg 2880
aaagtgatca ccctgaagtc caagctggtg tccgatttcc ggaaggattt ccagttttac 2940
aaagtgcgcg agatcaacaa ctaccaccac gcccacgacg cctacctgaa cgccgtcgtg 3000
ggaaccgccc tgatcaaaaa gtaccctaag ctggaaagcg agttcgtgta cggcgactac 3060
aaggtgtacg acgtgcggaa gatgatcgcc aagagcgagc aggaaatcgg caaggctacc 3120
gccaagtact tcttctacag caacatcatg aactttttca agaccgaaat caccctggcc 3180
aacggcgaga tcagaaagcg ccctctgatc gagacaaacg gcgaaaccgg ggagatcgtg 3240
tgggataagg gcagagactt cgccacagtg cgaaaggtgc tgagcatgcc ccaagtgaat 3300
atcgtgaaaa agaccgaggt gcagacaggc ggcttcagca aagagtctat cctgcccaag 3360
aggaacagcg acaagctgat cgccagaaag aaggactggg accccaagaa gtacggcggc 3420
ttcgacagcc ctaccgtggc ctactctgtg ctggtggtgg ctaaggtgga aaagggcaag 3480
tccaagaaac tgaagagtgt gaaagagctg ctggggatca ccatcatgga aagaagcagc 3540
tttgagaaga accctatcga ctttctggaa gccaagggct acaaagaagt gaaaaaggac 3600
ctgatcatca agctgcctaa gtactccctg ttcgagctgg aaaacggcag aaagagaatg 3660
ctggcctctg ccggcgaact gcagaaggga aacgagctgg ccctgcctag caaatatgtg 3720
aacttcctgt acctggcctc ccactatgag aagctgaagg gcagccctga ggacaacgaa 3780
cagaaacagc tgtttgtgga acagcataag cactacctgg acgagatcat cgagcagatc 3840
agcgagttct ccaagagagt gatcctggcc gacgccaatc tggacaaggt gctgtctgcc 3900
tacaacaagc acagggacaa gcctatcaga gagcaggccg agaatatcat ccacctgttc 3960
accctgacaa acctgggcgc tcctgccgcc ttcaagtact ttgacaccac catcgaccgg 4020
aagaggtaca ccagcaccaa agaggtgctg gacgccaccc tgatccacca gagcatcacc 4080
ggcctgtacg agacaagaat cgacctgtct cagctgggag gcgacaagag acctgccgcc 4140
actaagaagg ccggacaggc caaaaagaag aagtga 4176
<210> 7
<211> 1391
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(10)
<223> 5' NLS
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1376)..(1391)
<223> 3' NLS
<400> 7
Met Asp Lys Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Lys Tyr Ser Ile Gly Leu
1 5 10 15
Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr
20 25 30
Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His
35 40 45
Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu
50 55 60
Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr
65 70 75 80
Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu
85 90 95
Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe
100 105 110
Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn
115 120 125
Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His
130 135 140
Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu
145 150 155 160
Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu
165 170 175
Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe
180 185 190
Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile
195 200 205
Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser
210 215 220
Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys
225 230 235 240
Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr
245 250 255
Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln
260 265 270
Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln
275 280 285
Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser
290 295 300
Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr
305 310 315 320
Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His
325 330 335
Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu
340 345 350
Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly
355 360 365
Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys
370 375 380
Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu
385 390 395 400
Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser
405 410 415
Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg
420 425 430
Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu
435 440 445
Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg
450 455 460
Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile
465 470 475 480
Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln
485 490 495
Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu
500 505 510
Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr
515 520 525
Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro
530 535 540
Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe
545 550 555 560
Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe
565 570 575
Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp
580 585 590
Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile
595 600 605
Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu
610 615 620
Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu
625 630 635 640
Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys
645 650 655
Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys
660 665 670
Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp
675 680 685
Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile
690 695 700
His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val
705 710 715 720
Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly
725 730 735
Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp
740 745 750
Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile
755 760 765
Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser
770 775 780
Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser
785 790 795 800
Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu
805 810 815
Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp
820 825 830
Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile
835 840 845
Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu
850 855 860
Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu
865 870 875 880
Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala
885 890 895
Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg
900 905 910
Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu
915 920 925
Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser
930 935 940
Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val
945 950 955 960
Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp
965 970 975
Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His
980 985 990
Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr
995 1000 1005
Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr
1010 1015 1020
Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys
1025 1030 1035
Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe
1040 1045 1050
Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro
1055 1060 1065
Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys
1070 1075 1080
Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln
1085 1090 1095
Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser
1100 1105 1110
Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala
1115 1120 1125
Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser
1130 1135 1140
Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys
1145 1150 1155
Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile
1160 1165 1170
Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe
1175 1180 1185
Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile
1190 1195 1200
Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys
1205 1210 1215
Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu
1220 1225 1230
Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His
1235 1240 1245
Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln
1250 1255 1260
Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu
1265 1270 1275
Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn
1280 1285 1290
Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro
1295 1300 1305
Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr
1310 1315 1320
Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile
1325 1330 1335
Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr
1340 1345 1350
Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp
1355 1360 1365
Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys
1370 1375 1380
Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1385 1390
<210> 8
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 8
cauagcagag aggaacugga ugguuuuaga gcuagaaaua gcaaguuaaa auaaggcuag 60
uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga gucggugcu 99
<210> 9
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 9
auaaugcggc ucagucagaa ggguuuuaga gcuagaaaua gcaaguuaaa auaaggcuag 60
uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga gucggugcu 99
<210> 10
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 10
gcaaagauuu auuccccauc agguuuuaga gcuagaaaua gcaaguuaaa auaaggcuag 60
uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga gucggugcu 99
<210> 11
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 11
uuagauucaa cagggaaaug ugguuuuaga gcuagaaaua gcaaguuaaa auaaggcuag 60
uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga gucggugcu 99
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）
<400> 12
catagcagag aggaactgga 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）
<400> 13
ataatgcggc tcagtcagaa 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）
<400> 14
gcaaagattt attccccatc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）
<400> 15
ttagattcaa cagggaaatg 20
<210> 16
<211> 4250
<212> DNA
<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）
<400> 16
acagcacata cttctcttcg agtcaactgc tcccagatag atccaagaca tgagactgtc 60
agcaagaatt atttggctta tattatggac tgtttgtgta gcagaagatt gtaaaggtcc 120
tcctccaaga gaaaattcag aaattctctc aggttcgtgg tctgaacaac tatattcaga 180
aggcactcag gcaacctaca aatgccgccc tggataccga acacttggta ctattgtaaa 240
agtatgcaag aatggagaat gggtaccttc taacccatca aggatatgtc ggaaaaggcc 300
atgtgggcat cccggagaca caccctttgg gtcctttagg ctggcagttg gatctgaatt 360
tgaatttggt gcaaaggttg tttatacatg tgatgaaggg taccaactct taggtgaaat 420
tgattaccgt gaatgtgatg cagatgggtg gaccaatgat attccaatat gtgaagttgt 480
gaagtgcttg ccagtgacag aactggagaa tggaagaatt gtgagtggtg cagccgaacc 540
agaccaggaa tattattttg gacaggtggt acgctttgaa tgcaactccg gcttcaagat 600
tgaaggacag aaagaaatgc actgctcaga aaatggcctc tggagcaatg aaaagccaca 660
gtgtgtggaa atttcttgcc tgccaccacg agttgaaaat ggagatggta tatatctgaa 720
accagtttac aaggagaatg aaagattcca atataaatgt aagcaaggtt ttgtgtacaa 780
agaaagaggg gatgctgtct gcacgggttc tggatggaat cctcagcctt cctgtgaaga 840
aatgacatgt ttgactccat atattccaaa tggtatctac acacctcaca ggattaaaca 900
cagaattgat gatgaaatca gatatgaatg taaaaatggc ttctatcctg caacccgatc 960
acctgtttca aagtgtacaa ttactggctg gatccctgct ccaagatgta gcttgaaacc 1020
ttgtgatttt ccacaattca aacatggacg tctgtattat gaagaaagcc ggagacccta 1080
cttcccagta cctataggaa aggagtacag ctattactgt gacaacgggt ttacaacgcc 1140
ttcacagtca tactgggact accttcgttg cacagtaaat gggtgggagc ctgaagttcc 1200
atgcctcagg caatgtattt tccattatgt ggaatatgga gaatctttat actggcaaag 1260
aagatatata gagggtcagt ctgcaaaagt ccagtgtcac agtggctata gtcttccaaa 1320
tggtcaagat acaatattat gtacagaaaa tggctggtcc cctcctccca aatgcgtccg 1380
tatcaagact tgttcagtat cagatataga aattgaaaat gggttttttt ctgaatctga 1440
ttatacatat gctctaaata gaaaaacacg gtatagatgt aaacagggat atgtaacaaa 1500
taccggagaa atatcaggaa taattacttg tcttcaagat ggatggtcac ctcgaccctc 1560
atgcattaag tcttgtgata tgcctgtatt tgagaatgct atgactaaga ataataacac 1620
atggtttaaa ctcaatgaca aattagacta tgaatgtcac attggatatg aaaatgaata 1680
taaacatacc aaaggctcta taacatgtac ttatgatgga tggtctagta caccctcctg 1740
ttatgaaaga gaatgcagca ttcccctgtt acaccaagac ttagttgttt ttcccagaga 1800
agtaaaatac aaagttggag attcgttgag tttctcttgc cgttcaggac acagagttgg 1860
agcagattta gtgcaatgct accactttgg atggtcccct aatttcccaa cgtgtgaagg 1920
ccaagtaaaa tcatgtgacc aacctcttga aatcccgaat ggggaaataa agggaacaaa 1980
aaaagttgaa tacagccatg gtgacgtggt ggaatatgat tgcaaaccta gatttctact 2040
gaagggaccc aataaaatcc agtgtgttga cgggaagtgg acaaccttgc cgatatgcgt 2100
tgagtatgag agaacatgtg gagaccttcc tgcacttgag catggctctg tccagttatc 2160
tgtccctccc taccaccacg gagattcagt ggagttcact tgtgcagaaa ccttcacaat 2220
gattgggcat gcagtagttt tctgcattag tggaaggtgg accgagcttc ctcaatgtgt 2280
tgcaacagat caactggaga agtgtaaagc cccgaagtca actggcatag atgcaattca 2340
tccaaataag aatgaattta atcataactt tagtgtgagt tacagatgta gacaaaagca 2400
ggagtatgaa cattcaatct gcatcaatgg aagatgggat cctgaaccaa actgtacaag 2460
aaatgagaaa agattctgcc ctcctccccc acagattcca aatgcccaag tgattgaaac 2520
cacagtgaaa tacttggatg gagagaaagt atctgttctt tgccaagatg gttacctaac 2580
tcagggccca gaagaaatgg tgtgtaaaca tggaaggtgg cagtcgttac cacgctgcac 2640
ggaaaaaatt ccatgttccc agccccctaa aattgaacat ggatctatta agtcgcccag 2700
gtcctcagaa gagagagatt taattgagtc cagcagttat gaacacggaa ctacattcag 2760
ctatgtctgt gatgatggat tcaggatatc tgaagaaaat agggtaacct gcaacatggg 2820
aaaatggagc tctctgcctc gttgtgttgg aataccttgt ggacccccac cttcaattcc 2880
tcttggtatt gtttctcatg aactagaaag ttaccaatat ggagaggagg ttacatacaa 2940
ttgttctgaa ggctttggaa ttgatggacc agcatttatt aaatgtgtag gaggacagtg 3000
gtctgaacca cccaaatgca taaaaactga ttgtgacaac ttgcccacat ttgaaattgc 3060
caaaccgaca gaaaagaaaa aaaaatcata caggtcagga gaacaagtga cattcagatg 3120
tccacctccg tatcgaatgg atggctctga cattgtcaca tgtgttaata cgaagtggat 3180
tggacagccg gtatgcaaag ataattcctg tgtgaatcca ccacatgtgc caaatgctac 3240
tatactaaca aggcacaaga ctaaatatcc atctggtgac aaagtacgtt atgactgtaa 3300
taaacctttt gaattatttg gggaagtgga agtgatgtgc caaaacggga tttggacaga 3360
accaccgaaa tgcaaagatt caacagggaa atgtgggcct cctccaccta ttgacaatgg 3420
agacatcacc tccttgtcat taccagtata tgcaccatta tcatcagttg aatatcaatg 3480
ccagaactat tatctactta agggaaataa gatagtaaca tgtagaaatg gaaagtggtc 3540
tcagccacca acctgcttac atgcatgtgt gataccagaa gatattatgg aaaaacataa 3600
tatagttctc agatggaggg aaaatgcaaa gatttattcc caatcagggg agaatattga 3660
attcatgtgt aaacctggat atagaaaatt cagaggatca cctccgtttc gtacaaagtg 3720
cattgagggt cacatcaatt atcccacttg tgtataaaat cgctatacaa ttattagtaa 3780
accttatgga tgaacctttg tttagaaatg cacatgtata ttactaatac agtttgaatt 3840
tacatttgaa atattgttta gctcatttct tctaataagt atataaactt tttttatatg 3900
gtggttaatc agtaacttta cagactgttg ccacaaagca agaacattgc attcaaaact 3960
cctaatccaa aatatgatat gtccaaggac aaactatgtc taagcaagaa aataaatgtt 4020
agttcttcaa tgtctgtttt tattcaggac ttttcagatt ttcttggata ccttttgttg 4080
ttaggttctg attcacagtg agtggaagac acactgactc tgacttcaaa ttagtattac 4140
ttgccaatac ataacaacca aactatcata atatcacaaa tgtatacagc taattactgt 4200
gtcctacctt tgtatcaata aagaaatcta agaaagttct tgcttatgaa 4250
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）
<400> 17
catagcagag aggaactgga tggt 24
<210> 18
<211> 15
<212> DNA
<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）
<400> 18
gcacatactt ctctt 15
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）
<400> 19
gtcaactgct cccagataga tccaag 26
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）
<400> 20
accaccacct ttctcccttc tgactg 26
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）
<400> 21
gccgcattat aaaaca 16
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）
<400> 22
ttgctgataa tatttctcat agcaa 25
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）
<400> 23
atttcctaaa ctaactttca ac 22
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）
<400> 24
gtggtaagtt taaaaaccgt gaa 23
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）
<400> 25
cgcctatgct gctggacttg tggt 24
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）
<400> 26
ctttcacttg actattgtaa ttgat 25

Claims (70)

1.一种基因修饰的大鼠，其包含失活的内源Cfh基因座。
2.根据权利要求1所述的基因修饰的大鼠，其中所述内源Cfh基因座的起始密码子在所述失活的内源Cfh基因座中被突变或缺失。
3.根据权利要求2所述的基因修饰的大鼠，其中在所述失活的内源Cfh基因座中缺失所述内源Cfh基因座的起始密码子。
4.根据权利要求3所述的基因修饰的大鼠，其中在所述失活的内源Cfh基因座中缺失所述内源Cfh基因座的第一外显子中的编码序列。
5.根据权利要求4所述的基因修饰的大鼠，其中在所述失活的内源Cfh基因座中缺失在所述内源Cfh基因座中的第一内含子中的剪接供体位点。
6.根据前述权利要求中任意一项所述的基因修饰的大鼠，其中所述的大鼠为雄性。
7.根据权利要求1-5中任意一项所述的基因修饰的大鼠，其中所述的大鼠为雌性。
8.根据前述权利要求中任意一项所述的基因修饰的大鼠，其中所述大鼠对于所述失活的内源Cfh基因座是纯合的。
9.根据前述权利要求中任意一项所述的基因修饰的大鼠，其中所述大鼠具有一种或多种C3肾小球病(C3G)的症状。
10.根据前述权利要求中任意一项所述的基因修饰的大鼠，其中与野生型大鼠相比，所述基因修饰的大鼠具有降低的循环C3水平。
11.根据权利要求10所述的基因修饰的大鼠，其中所述循环C3水平小于约200μg/mL。
12.根据权利要求11所述的基因修饰的大鼠，其中所述循环C3水平小于约100μg/mL。
13.根据权利要求10-12中任意一项所述的基因修饰的大鼠，其中与所述野生型大鼠相比，年龄在约7周至约17周之间的所述基因修饰的大鼠具有降低的循环C3水平。
14.根据前述权利要求中任意一项所述的基因修饰的大鼠，其中与野生型大鼠相比，所述基因修饰的大鼠具有升高的血尿素氮水平、升高的血清胱抑素C水平，或升高的尿白蛋白水平。
15.根据权利要求14所述的基因修饰的大鼠，其中与野生型大鼠相比，所述基因修饰的大鼠具有升高的血尿素氮水平、升高的血清胱抑素C水平，和升高的尿白蛋白水平。
16.根据权利要求14或15所述的基因修饰的大鼠，其中所述血尿素氮水平大于约10、大于约20、大于约30、大于约40、大于约50、大于约60、大于约70、大于约80、大于约90，或大于约100mg/dL。
17.根据权利要求14-16中任意一项所述的基因修饰的大鼠，其中所述血清胱抑素C水平大于约1000、大于约1100、大于约1200、大于约1300、大于约1400、大于约1500、大于约1600、大于约1700、大于约1800、大于约1900，或大于约2000ng/mL。
18.根据权利要求14-17中任意一项所述的基因修饰的大鼠，其中：
(I)每天的所述尿白蛋白大于约1000、大于约2000、大于约3000、大于约4000、大于约5000、大于约6000、大于约7000、大于约8000、大于约9000，或大于约10000μg/天；和/或
(II)尿白蛋白与尿肌酐之比大于约100、大于约200、大于约300、大于约400、大于约500、大于约600、大于约700、大于约800、大于约900、大于约1000、大于约1100、大于约1200、大于约1300、大于约1400、大于约1500、大于约1600、大于约1700、大于约1800、大于约1900，或大于约2000μg:mg。
19.根据权利要求14-18中任意一项所述的基因修饰的大鼠，其中与所述野生型大鼠相比，年龄在约7周至约17周之间的所述基因修饰的大鼠具有升高的血尿素氮水平、升高的血清胱抑素C水平，或升高的尿白蛋白水平。
20.根据前述权利要求中任意一项所述的基因修饰的大鼠，其中与野生型大鼠相比，所述基因修饰的大鼠在肾脏中具有增加的C3沉积。
21.根据权利要求20所述的基因修饰的大鼠，其中与野生型大鼠相比，年龄在约7周至约17周之间的所述基因修饰的大鼠在肾脏中具有增加的C3沉积。
22.根据前述权利要求中任意一项所述的基因修饰的大鼠，其中与野生型大鼠相比，所述基因修饰的大鼠在肾脏中具有增加的C5b-9沉积。
23.根据权利要求22所述的基因修饰的大鼠，其中与野生型大鼠相比，年龄在约7周至约17周之间的所述基因修饰的大鼠在肾脏中具有增加的C5b-9沉积。
24.根据前述权利要求中任意一项所述的基因修饰的大鼠，其中与野生型大鼠相比，所述基因修饰的大鼠具有增加的肾小球病变。
25.根据权利要求24所述的基因修饰的大鼠，其中与所述野生型大鼠相比，所述增加的肾小球病变包括增加的肾小球基底膜厚度、增加的足细胞足突宽度，或减少的足细胞足突数量。
26.根据权利要求25所述的基因修饰的大鼠，其中与所述野生型大鼠相比，所述增加的肾小球病变包括增加的肾小球基底膜厚度、增加的足细胞足突宽度，和减少的足细胞足突数量。
27.根据权利要求25或26所述的基因修饰的大鼠，其中：
(I)与所述野生型大鼠相比，所述肾小球基底膜厚度的增加为至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、或至少约10倍；和/或
(II)所述基因修饰的大鼠中肾小球的平均肾小球基底膜厚度为至少约0.2、至少约0.3、至少约0.4、至少约0.5、至少约0.6、至少约0.7、至少约0.8、至少约0.9、至少约1.0、至少约1.1、至少约1.2、至少约1.3、至少约1.4、至少约1.5、至少约1.6、至少约1.7，或至少约1.8微米。
28.根据权利要求25-27中任意一项所述的基因修饰的大鼠，其中：
(I)与所述野生型大鼠相比，所述足细胞足突宽度的增加为至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍，或至少约7倍；和/或
(II)所述基因修饰的大鼠中肾小球中足突的平均宽度为至少约0.4、至少约0.5、至少约0.6、至少约0.7、至少约0.8、至少约0.9、至少约1.0、至少约1.5、至少约2.0，或至少约2.5微米。
29.根据权利要求25-28中任意一项所述的基因修饰的大鼠，其中：
(I)与所述野生型大鼠相比，所述足细胞足突数量的减少为至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍，或至少约3.8倍；和/或
(II)所述基因修饰的大鼠中每微米长度的平均足细胞足突数量小于约2.5、小于约2、小于约1.5、小于约1、小于约0.9，或小于约0.8。
30.根据权利要求24-29中任意一项所述的基因修饰的大鼠，其中与所述野生型大鼠相比，年龄在约7周至约17周之间的所述基因修饰的大鼠具有增加的肾小球病变。
31.根据前述权利要求中任意一项所述的基因修饰的大鼠，其中与野生型大鼠相比，所述基因修饰的大鼠具有降低的寿命。
32.根据权利要求31所述的基因修饰的大鼠，其中所述基因修饰的大鼠的寿命中位数小于约150天。
33.一种评估用于治疗C3肾小球病(C3G)的药剂的体内治疗功效的方法，包括：
(a)向权利要求1-32中任意一项所述的基因修饰的大鼠施用所述药剂；以及
(b)与未施用所述所述药剂的对照基因修饰的大鼠相比，评估已施用所述药剂的所述基因修饰的大鼠中C3G的一种或多种症状。
34.根据权利要求33所述的方法，其中步骤(b)包括评估：
(i)循环C3水平；
(ii)血尿素氮水平；
(iii)血清胱抑素C水平；
(iv)尿白蛋白水平；
(v)C3在肾脏中的沉积；
(vi)C5b-9在肾脏中的沉积；
(vii)肾小球基底膜厚度；
(viii)足细胞足突宽度；
(ix)足细胞足突数量；
(x)寿命；或
(xi)其组合。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述基因修饰的大鼠的年龄在约7周至约17周之间。
36.根据权利要求33-35中任意一项所述的方法，其中步骤(b)包括评估循环C3水平，其中相对于所述对照基因修饰的大鼠，已施用所述药剂的所述基因修饰的大鼠中循环C3水平的增加表明了推定的C3G治疗剂的治疗效果。
37.根据权利要求33-36中任意一项所述的方法，其中步骤(b)包括评估血尿素氮水平，其中相对于所述对照基因修饰的大鼠，已施用所述药剂的所述基因修饰的大鼠中血尿素氮水平的降低表明了推定的C3G治疗剂的治疗效果。
38.根据权利要求33-37中任意一项所述的方法，其中步骤(b)包括评估血清胱抑素C水平，其中相对于所述对照基因修饰的大鼠，已施用所述药剂的所述基因修饰的大鼠中血清胱抑素C水平的降低表明了推定的C3G治疗剂的治疗效果。
39.根据权利要求33-38中任意一项所述的方法，其中步骤(b)包括评估尿白蛋白水平，其中相对于所述对照基因修饰的大鼠，已施用所述药剂的所述基因修饰的大鼠中尿白蛋白水平的降低表明了推定的C3G治疗剂的治疗效果。
40.根据权利要求33-39中任意一项所述的方法，其中步骤(b)包括评估C3在肾脏中的沉积，其中相对于所述对照基因修饰的大鼠，已施用所述药剂的所述基因修饰的大鼠中的C3在肾脏中的沉积水平的降低表明了推定的C3G治疗剂的治疗效果。
41.根据权利要求33-40中任意一项所述的方法，其中步骤(b)包括评估C5b-9在肾脏中的沉积，其中相对于所述对照基因修饰的大鼠，已施用所述药剂的所述基因修饰的大鼠中的C5b-9在肾脏中的沉积水平的降低表明了推定的C3G治疗剂的治疗效果。
42.根据权利要求33-41中任意一项所述的方法，其中步骤(b)包括评估肾小球基底膜厚度，其中相对于所述对照基因修饰的大鼠，已施用所述药剂的所述基因修饰的大鼠中肾小球基底膜厚度的减少表明了推定的C3G治疗剂的治疗效果。
43.根据权利要求33-42中任意一项所述的方法，其中步骤(b)包括评估足细胞足突宽度，其中相对于所述对照基因修饰的大鼠，已施用所述药剂的所述基因修饰的大鼠中足细胞足突宽度的减少表明了推定的C3G治疗剂的治疗效果。
44.根据权利要求33-43中任意一项所述的方法，其中步骤(b)包括评估足细胞足突数量，其中相对于所述对照基因修饰的大鼠，已施用所述药剂的所述基因修饰的大鼠中足细胞足突数量的增加表明了推定的C3G治疗剂的治疗效果。
45.根据权利要求33-44中任意一项所述的方法，其中步骤(b)包括评估寿命，其中相对于所述对照基因修饰的大鼠，已施用所述药剂的所述基因修饰的大鼠的寿命的延长表明了推定的C3G治疗剂的治疗效果。
46.制备根据权利要求1-32中任意一项所述的基因修饰的大鼠的方法，包括：
(a)将第一核酸酶试剂引入大鼠胚胎干(ES)细胞，所述第一核酸酶试剂靶向邻近所述内源Cfh基因组基因座的起始密码子的第一靶序列，其中所述核酸酶试剂切割所述第一靶序列，以产生包含所述失活的内源Cfh基因座的基因修饰的大鼠ES细胞；
(b)将所述基因修饰的大鼠(ES)细胞引入大鼠宿主胚胎中；以及
(c)在代孕母体中孕育大鼠宿主胚胎，其中所述代孕母体产生包含所述失活的内源Cfh基因座的F0后代基因修饰的大鼠。
47.制备根据权利要求1-32中任意一项所述的基因修饰的大鼠的方法，包括：
(a)将第一核酸酶试剂引入大鼠单细胞期胚胎，所述第一核酸酶试剂靶向邻近所述内源Cfh基因组基因座的起始密码子的第一靶序列，其中所述核酸酶试剂切割所述第一靶序列，以产生包含所述失活的内源Cfh基因座的基因修饰的大鼠单细胞期胚胎；以及
(b)在代孕母体中孕育所述基因修饰的大鼠单细胞期胚胎，其中所述代孕母体产生包含所述失活的内源Cfh基因座的F0后代基因修饰的大鼠。
48.根据权利要求46或47所述的方法，其中所述第一核酸酶试剂的第一靶序列在所述内源Cfh基因座的第一外显子、第一内含子或5'UTR中。
49.根据权利要求46-48中任意一项所述的方法，其中所述第一核酸酶试剂是Cas9蛋白和指导RNA。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述第一靶序列包含SEQ ID NO：12或13。
51.根据权利要求46-50中任意一项所述的方法，其中步骤(a)还包括将第二核酸酶试剂引入所述大鼠ES细胞或所述大鼠单细胞期胚胎，所述第二核酸酶试剂靶向邻近所述内源Cfh基因座的终止密码子的第二靶序列。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述第二靶序列位于所述内源Cfh基因座的倒数第二个内含子、倒数第二个外显子、最后一个内含子、最后一个外显子或3'UTR中。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述第二靶序列包含SEQ ID NO：14或15。
54.根据权利要求46-50中任意一项所述的方法，其中步骤(a)还包括将第二核酸酶试剂引入所述大鼠ES细胞或所述大鼠单细胞期胚胎，所述第二核酸酶试剂靶向邻近所述内源Cfh基因座的起始密码子的第二靶序列，所述第二靶序列不同于所述第一靶序列。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述第一靶序列和第二靶序列侧接所述内源Cfh基因座的起始密码子。
56.根据权利要求54或55所述的方法，其中所述第一靶序列在所述内源Cfh基因座的第一外显子或5'UTR中，且所述第二靶序列在所述内源Cfh基因座的第一外显子或第一内含子中。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述第一靶序列包含SEQ ID NO：12，并且所述第二靶序列包含SEQ ID NO：13。
58.根据权利要求54-57中任意一项所述的方法，其中步骤(a)还包括将第三核酸酶试剂和/或第四核酸酶试剂引入所述大鼠ES细胞或所述大鼠单细胞期胚胎，其中所述第三核酸酶试剂和所述第四核酸酶试剂分别靶向邻近所述内源Cfh基因座的终止密码子的第三和第四靶序列，且其中所述第三和第四靶序列是不同的。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述第三和第四靶序列位于所述内源Cfh基因座的倒数第二个内含子、倒数第二个外显子、最后一个内含子、最后一个外显子或3'UTR中。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述第三和第四靶序列分别包含SEQ ID NO：14或15。
61.根据权利要求46-60中任意一项所述的方法，其中步骤(a)还包括将外源供体核酸引入所述大鼠ES细胞或所述大鼠单细胞期胚胎，所述外源供体核酸包含与所述内源Cfh基因座处的5'靶序列杂交的5'同源臂和与所述内源Cfh基因座处的3'靶序列杂交的3'同源臂，其中所述外源供体核酸被设计成突变或删除所述内源Cfh基因座的所述起始密码子。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述5'靶序列和所述3'靶序列侧接所述内源Cfh基因座的所述起始密码子。
63.根据权利要求61或62所述的方法，其中所述5'靶序列和所述3'靶序列侧接所述内源Cfh基因座的编码序列。
64.一种包含失活的内源Cfh基因座的基因修饰的大鼠细胞。
65.一种包含失活的内源Cfh基因座的基因修饰的大鼠基因组。
66.一种大鼠Cfh基因，其包含使所述大鼠Cfh基因失活的靶向基因修饰。
67.一种用于使大鼠Cfh基因失活的核酸酶试剂，其中所述核酸酶试剂靶向并切割所述Cfh基因中的核酸酶靶位点。
68.一种制备包含失活的内源Cfh基因座的基因修饰的大鼠细胞的方法，包含将核酸酶试剂引入大鼠细胞中，所述核酸酶试剂靶向邻近内源Cfh基因组基因座的起始密码子的靶序列，其中所述核酸酶试剂切割所述靶序列，以产生包含所述失活的内源Cfh基因座的基因修饰的大鼠细胞。
69.一种制备包含失活的内源Cfh基因座的基因修饰的大鼠基因组的方法，包括使大鼠基因组与核酸酶试剂接触，所述核酸酶试剂靶向邻近内源Cfh基因组基因座的起始密码子的靶序列，其中所述核酸酶试剂切割所述靶序列，以产生包含所述失活的内源Cfh基因座的基因修饰的大鼠基因组。
70.一种制备失活的大鼠Cfh基因的方法，包括使大鼠Cfh基因与核酸酶试剂接触，所述核酸酶试剂靶向邻近内源Cfh基因组基因座的起始密码子的靶序列，其中所述核酸酶试剂切割所述靶序列，以产生所述失活的大鼠Cfh基因。
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