CN101151371B - 治疗中的逆转录转座子抑制 - Google Patents

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Abstract

RNA干扰用于癌损伤治疗中,其中RNA识别至少一个LINE-I重复元件的一部分。

Description

治疗中的逆转录转座子抑制
技术领域
本申请涉及逆转录酶表达抑制剂在治疗中的用途。
背景技术
Spadafora在其论文(Cytogenet Genome Res 105:346~350(2004))中讨论内源的、非端粒逆转录酶及其在胚胎发生和转化中的意义。
更特别地,逆转录酶(RT)由两类重复基因组元件编码,即逆转录转座子和内源逆转录病毒。它们都需要RT作为其系统的基本组成。
可逆转录转座子元件(retrotransposable elements),如长散布元件(LINEs),长期以来认为是“垃圾DNA”,除了作为不再需要的剩余DNA以外只有很少的用途,并没有将其基因组中删除。早在1971年(Temin,J Natl Cancer Inst46:56~60),这一部分已经受到挑战,但是,本领域继续简单地将这种序列认为是“垃圾DNA”。
Spadafora在其论文(同上)中回顾了该技术,并证明了RT编码基因的表达通常在非病理、末期分化的细胞中被抑制,但是,在非常早期的胚胎、生殖细胞、胚胎和肿瘤组织中是活性的,所有这些都具有高的增殖潜能。在鼠科胚胎中阻断RT停滞了其发育,并且去除阻断影响都没有重新启动胚胎发生。在癌细胞中,增殖得到显著减少,在48和72小时之间观察到区别。
Kuo等人(Biochem and Biophys Res Com 253:566~570(1998))从人类小细胞肺癌的cDNA文库中确定出一个1.7kb的LINE-I(L1)转录本。他们发现,这种重复元件在人类组织中无处不在地表达,包括正常的(纤维原细胞和肝脏)和转化的。此外,他们表明衍生自此转录本的正义寡核苷酸,与人类肝细胞瘤细胞孵育,降低了细胞增殖的速率。该元件在正常和癌组织中的存在显示出这种重复元件与细胞增殖的常规功能有关。作者将细胞增殖的降低解释为由于突变而对参与控制细胞生长的基因的沉默或功能性变更。作者并不认为这种转化是可逆事件。
相反,我们现在确定,逆转录转座子的LINE-1族的抑制对于抑制或阻碍癌组织的增殖及刺激其分化是有效的。
发明内容
因此,本发明第一方面是提供RNA干扰抑制癌组织非特异性增殖的用途,其中RNA识别至少一个LINE-1重复元件的一部分。
另一方面,本发明提供RNA干扰(RNAi)在治疗癌损伤中的用途,其中RNA识别至少一个LINE-1重复元件的一部分。
使用本发明RNAi的RT表达减少导致癌组织增殖的降低,常常大于50%,且至少在受治疗的细胞中随后的增殖主要为分化生长。因此,本发明的RNAi起到减少癌组织增殖,同时激励分化的作用。
应当理解,本发明的RNAi特别指LINE-1,其用途避免使用一般的非核苷酸RT抑制剂(NNRTI),其封闭所有的RTs。事实上,令人惊讶的是,本发明的RNAi,直接抗(against)LINE-1,起封闭或抑制癌组织增殖的作用,假定LINE-1只是RT编码元件下的亚群。
目前,LINE-1家族中只有少数成员(大约6~8个)被识别为具有特别高的活性,本发明给出抗这些中任一个的RNAi。使用RNAi的联合治疗,其中设计每个RNA对于单个LINE-1逆转录转座子(retrotransposon)来说都是特定的,但是优选使用抗共有序列的RNA。这种共有序列可以用于两个或多个LINE-1家族成员,但是优选用于活性成员,如果多个都是同一的(identified),则可以用于多个。
优选地,RNAi为短干扰RNA(siRNA)或双链RNA(dsRNA)。
还优选,RNA为短发夹RNA,优选适于且优选通过siRNA表达载体方法来给药。合适的载体包括本领域公知并在此仍要讨论的逆转录酶病毒质粒。
通常优选,本发明中使用的RNA具有10或更大的片段,如15、20、30、40或更多核苷酸,其相当于转录LINE-1DNA区域的正链意义(direct sense)。然而,特别优选为21个核苷酸。转录的LINE-1DNA优选选自共有区域。然而,并不必须要求核苷酸的片段与转录LINE-1DNA的所选区域完全一致,只要本发明的干扰RNA起到结合来自LINE-1DNA的转录RNA即可。
然而,特别优选的是,来自RNAi的RNA核苷酸片段与相应来自LINE-1序列的转录DNA片段一致。RNAi优选包括与相应来自LINE-1序列的转录DNA片段一致的21个核苷酸序列,更优选由相应来自LINE-1序列的转录DNA片段一致的21个核苷酸序列组成。
本发明的RNAi可以形成环形结构,其中,环可以位于上述核苷酸片段范围内,在这种情况下,片段可以被环中断。该环可以采取dsRNA形式作为其结构的一部分,可以在RNA片段中提供1、2或3个核苷酸缺口。通常优选,没有导致RNA片段省略的环,使得目标mRNA沿着选定序列结合。
本发明的RNAi可以简单地为能够连接来自LINE-1元件的对应转录序列的短序列,或可以另外包括一个或两个末端序列和/或内部环序列。
应当理解,选自LINE-1内的序列应当是开放阅读框架,例如可以选自RT的ORF1和ORF2。因此,优选开放阅读框架编码逆转录酶。这包括具有逆转录活性的任何蛋白质。
RNAi治疗可以以任何方便的方式给药。通常,重要的是必须确保RNAi到达目标细胞。
虽然本发明的RNAi可以以任何合适的载体直接注射到目标位置,但是其还可以绑定至例如组织工程细胞支架(scaffolds)或纳米颗粒(nanoparticles)而给药。
更优选地,RNAi可以例如作为质粒或通过逆转录酶病毒来给药。腺病毒和腺相关病毒的载体可以得到使用以来分配RNAi的编码序列,优选以质粒形式。其他类似的病毒和逆转录酶病毒以及其他这种载体也可以使用。特别地,已经确定,将编码序列如质粒传递至目标位置的功效可以在循环中增加,如果使用渗透因子,如血管内皮生长因子(VEGF)。
传递的其他合适方法为pSUPER RNAi系统kit(www.oligogengine.com)。
附图说明
图1:通过抗RT药物的增殖抑制作用。
(A)用DMSO(对照)、奈韦拉平(nevirapine)(NEV)和依法韦仑(efavirenz)(EFV)处理培养基中生长的细胞。每96小时对细胞计数并重新装盘,进行5个周期。然后,在没有抑制剂的培养基中培养细胞(2个周期)。然后,再将RT抑制剂加入进行2个周期。细胞计数用对照数的%来表示,其确定为100%。数值代表了三个实验的合并数据。
(B)RT抑制剂存在的4个96小时周期和去除药物后的细胞周期图。
图2:RT抑制剂导致黑素瘤细胞的形态分化。
(A)在DMSO-(a、b、c)、奈韦拉平-(d、e、f)或依法韦仑-(g、h、i)处理培养的A-375细胞系。在姬姆萨(Wright Giemsa)染色后(左栏)、SEM(中栏)和α微管蛋白(绿色)与细胞核PI着色(红色)之后的共焦显微镜(右栏)后的相差显微镜观察的培养物。
(B)黑素瘤衍生的TVM-A12原代细胞。DMSO-(a、b、c)和奈韦拉平处理(d、e、f)的细胞在相差显微镜(左栏)、SEM(中栏)和共焦显微镜(右栏)下的情况,标尺,20μm。
图3:RT抑制剂调节A-375(板A)和PC3(板B)细胞系中的基因表达。
从用DMSO(ctr)、奈韦拉平(nev)或依法韦仑(efv)处理和去除奈韦拉平(nev/r)或依法韦仑(efv/r)之后的细胞中提取的RNA,通过RT-PCR扩增,用内部寡核苷酸来印迹和杂交。GAPDH用作内部标准。
图4:RNAi对LINE-1诱导A-375细胞的形态分化,减少A-375细胞的增殖并调节A-375细胞的中的基因表达。
(A)完全长度LINE-1元件的结构。给出了siRNA寡核苷酸的位置。箭头表明用于RT-PCR分析的引物对的位置。
(B)用对照(CTR)和LINE-1siRNA寡核苷酸(L1-i)转染A-375培养物的相差显微镜分析。
(C)用CTR和L1-i寡核苷酸转染后的细胞生长。
(D)来自用CTR或L1-i寡核苷酸转染的A-375细胞的RNA在半定量RT-PCR之后的示例性基因表达模式。定量变化(表示为L1-i转染的培养物的%信号比上CTR转染的培养物的信号)代表三个独立实验的平均值;扩增的产品由条带的光密度计量和对相同实验中GAPDH信号的标准化来测定。
图5:依法韦仑减少了裸鼠中人类瘤的生长。
监控由指定细胞系所形成的瘤在未受处理动物(红色)和接种后用依法韦仑处理1天(紫色)或处理1周(黄色)的动物中的生长。PC3和HT29中从上往下第二条开始的两条曲线显示了接种后开始1天处理但在14天后进行不连续处理的动物中PC3-和HT69-衍生瘤的生长。曲线显示出一组五个动物的瘤尺寸的平均值。
图6:用依法韦仑预处理的PC3细胞的降低的致肿瘤性。
(A)未处理或依法韦仑预处理细胞形成的瘤的生长,这些细胞注射到没有进行处理或在活体内依法韦仑后处理的老鼠体内。
(B)指定的处理30天之后PC3衍生的异种移植物的结果(n=20个动物/组)。
图7:用pS-L1感染的细胞表现出增殖的显著减少。
pS-L1感染的细胞显示为A-375pS-11。增殖保持恒定至少39天。未感染细胞(A-375,图7A)保持高增殖速率,pS感染的细胞(A-375pS,图7B)显示出增殖在感染后的最初几天中缓和降低,但随后快速恢复到与未感染细胞相当的高增殖速率。
图8:与对照相比,瘤生长在接种LINE-1干扰(LINE1-interfered)细胞的老鼠中得到显著降低。
板A示出了接种A375pS和A375pS-L1i细胞的老鼠体内瘤生长的进程。板B的例子中示出了与那些接种对照细胞的老鼠相比,在接种LINE-1干扰细胞的老鼠体内瘤生长得到显著降低。
具体实施方式
本发明RNAi靶向的LINE-1元件(L1s)优选根据Brouha等(2003)的教导来选择,其全文作为参考合并于此。
优选为活性L1s,因为如果它们是活性的,则他们易于能够表达RT。因此,本发明的RNAi优选识别或靶向至少一个活性L1的一部分。优选,RT的表达受RNAi的抑制。
应当理解,所使用RNAi序列将识别,并能够结合通过从目标L1内包括的特殊ORF转录可获得的RNA,L1元件的特征在于其也包括在此讨论的优选序列。
因此,L1序列由本发明优选序列来确定,例如SEQ ID No.27,其对应的DNA序列或其同源,这将在其它地方说明,但是L1序列也优选能够表达蛋白质,优选为RT,其表达受RNAi抑制。
优选在严格的条件下将RNAi序列结合LINE-1RNA,如在含有50%甲酰胺和6×SSC的缓冲剂中。
优选用于表征L1元件特征的序列其本身为ORF、ORF的一部分或包括ORF的至少一部分。优选用于由RNAi靶向的L1序列包括在所述L1元件的ORF范围内。
因此,那些制造特定DNA序列的参考可以优选,应当理解,用于具有确定的序列,其可能包含在L1元件的较大序列中。这样,确定L1元件的序列不必含有ORF,假设L1元件本身含有可表达ORF,从ORF转录的RNA能够由靶向特定L1元件的RNAi来结合。
这样,RNAi优选靶向包括该优选DNA序列或其对应序列或其同源序列的L1元件。
优选L1元件内的ORFs例子为对应于引物序列SEQ ID Nos.20~25的序列。因此,RNAi优选识别这些SEQ ID NOS或其对应的序列。
更特别地,对于ORF1为:
5’-AGAAATGAGCAAAGCCTCCA-3’(SEQ ID No.20)
5’-GCCTGGTGGTGACAAAATCT-3’(SEQ ID No.21)
5’-TAAGGGCAGCCAGAGAGAAA-3’(SEQ ID No.24)
对于ORF2为:
5’-TCCAGCAGCACATCAAAAAG-3’(SEQ ID No.22)
5’-CCAGTTTTTGCCCATTCAGT-3’(SEQ ID No.23)
5’-TGACAAACCCACAGCCAATA-3’(SEQ ID No.25)
因此,这些序列的RNA等同物为,对于ORF1为:
5’-AGAAAUGAGCAAAGCCUCCA-3’(SEQ ID No.39)
5’-GCCUGGUGGUGACAAAAUCU-3’(SEO ID No.40)
5’-UAAGGGCAGCCAGAGAGAAA-3’(SEQ ID No.41)
对于ORF2为:
5’-UCCAGCAGCACAUCAAAAAG-3’(SEQ ID No.42)
5’-CCAGUUUUUGCCCAUUCAGU-3’(SEQ ID No.43)
5’-UGACAAACCCACAGCCAAUA-3’(SEQ ID No.44)。
因此,特别优选RNAi包括至少一个片段,优选来自SEQ IDNos.39~44中任何一个的至少10个连续核苷酸,更优选15个连续核苷酸,最优选20个连续核苷酸。如上所述,也优选使用所述序列较短的片段,由如发夹环这样的特征散开。
对于L1RP,对于ORF1的CDS存在于SEQ ID No.27的907~1923位置上,编码在SEQ ID No.45中给出的蛋白质序列。存在于SEQ ID No.27的1987~5814的位置上的CDS,编码ORF2,蛋白质序列在SEQ ID No.46中给出。ORF2编码的蛋白质被认为具有RT活性。因此,优选RNAi靶向包括在SEQ ID No.27中907~1923位置上和/或SEQ ID No.27中1987~5814位置上的DNA,优选能抑制根据SEQ ID No.45的蛋白质的表达,最优选SEQ ID No.46。类似地,CDSs存在于SEQ ID No.32中17717~18697和115033~116161的位置上,但是这些描述为假基因,因此不优选。
因此,优选RNAi包括对应于编码根据SEQ ID No.45的蛋白质的RNA序列的RNA片段,最优选为SEQ ID No.46。该片段可以包括发夹或别处讨论的其他特征。优选地,RNAi由对应于编码根据SEQ ID No.45的蛋白质的RNA序列的20或21bp的RNA片段组成,最优选SEQ IDNo.46。优选地,RNAi具有SEQ ID No.19的序列,或其RNA等同物,靶向热L1s中共有序列的SEQ ID No.47。
另一方面,本发明提供了这种RNAi。
如Brouha等人(2003)描述那样,活性L1s优选多形态,并优选“年轻”或最近形成,由于L1元件或序列的年龄确定其可能的转换。如Brouha等人(2003)描述那样,具有很少序列转换的L1s通常在种群上具有多形态性,在培养的细胞种具有活性。相反,高度转换的L1序列是最通常的固定和无活性。
活性L1通常长度为6kbp,表明没有5’截断。因此,LINE-1元件优选长度至少为6kbp。
优选在Brouha等人(2003)预测的在平均人类中为活性的80~100个有逆转录能力(retrotransposition-competent)的L1s。这些有逆转录能力的L1s中的6个被发现是高度活性L1s(热L1s(hot L1s))。热L1s优选显示至少1/3的L1RP活性。因此,特别优选L1序列为“热L1s”,其具有在人体中的高生物活性,并优选显示至少1/3的L1RP活性。
L1RP为热L1,在Brouha等人(2003)和Hum.Mol.Genet.8(8),1557~1560(1990)中得到说明,上述可以从http://hmg.oxfordjoumals.org/cgi/reprint/8/8/1557获得,NCBI登陆号为AF148856,SEQ ID No.27。正如优选靶向ORF’s那样,SEQ ID No.27的907~1923(ORF1)和1987~5814(ORF2)核苷酸位置为RNAi特别优选的靶标。
相对于L1RP的活性可以通过合适的化验来测量,例如通过将LINE-1元件连接用于表达的易于由熟练技术人员选择的可探测标记。优选地,这可以包括用于Brouha等人(2003)中所使用的方法和EGFP检测。EGFP表达盒的构建和如何使用其来评价活性进一步在参考号为23的Brouha等人(2003)、Haig H.Kazazian Jr等人在Nucleic Acids Research,2000,Vol.28,No.6,1418~1423中进一步说明。包括EGFP的L1的合适实施例在SEQ ID No.26中给出,将在下面讨论。
无需理论上的界定,认为,转录从位于其5引物UTR的内部启动区起始,RNA转运到细胞质。L1编码的蛋白质、ORF1p和ORF2p然后作用于编码它们的mRNA,这种现象公知为顺式优选(cis preference)。
然后,得到的核蛋白微粒再次进入被认为通过靶向处理(target-primed)逆转录产生的L1整合的细胞核中。在这个过程中,L1核酸内切酶在基因组DNA中松散的共有序列5’-TTTTT/A-3’处产生单链缺口(nick),暴露一个3’OH,其作为用于通过L1RT(逆转录)来逆转录L1RNA的引物。
优选地,LINE-1序列包括21个碱基对共有序列,SEQ ID No.19,其对应的(反义)DNA序列或其RNA等同物。因此,也优选本发明的RNAi包括该21个碱基对序列的RNA等同物,或对应于SEQ ID No.19的DNA的RNA等同物,或能够在严谨条件下如6×SSC下杂交的序列。
也优选,RNAi靶向的序列为SEQ ID Nos.35-38中的任一个,更优选为SEQ ID No.37,最优选为SEQ ID No.35。包括其中的是对应的DNA序列或其RNA等同物。SEQ ID No.35为实施例2中靶向的60bp序列,同时,SEQ ID Nos.36-38为较长的共有序列,将在下面讨论。
被用于靶向的L1序列也可以与在此描述的任何一种序列享有一定程度的同源性,优选至少70%,更优选至少85%,更优选至少95%,更优选至少99%,更优选至少99.5%,更优选至少99.9%,更优选至少99.95%,最优选至少99.99%的同源性。因此,RNAi优选靶向包括这些优选序列或其对应序列或其同源序列的L1元件。
在对特定序列作出的参考中,应当理解,当该序列为DNA序列、其包括对应的DNA序列(如杂交成前述序列的序列,特别是在高度严谨条件下,如6×SSC)或其RNA等同物,即通过转录所述DNA序列获得的RNA序列。
LINE-1元件(L1s)可以选自可逆转录元件的大的群组中,假设该元件编码RT。优选L1s从L1元件的“转录的组A”(Ta)子集或pre-Ta子集衍生得到。然而,特别优选为Ta子集,特别是Ta-1d家族。
然而,特别优选L1s选自LRE3、L1RP(NCBI登陆号为AF148856)和登陆号分别为ac004200、ac002980、a1356438、a1512428、ac021017和a1137845,SEQ ID Nos.26~33。这些序列和其相关的特征数据可以从NCBI网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi获得。
关于SEQ ID No.26,给出的完整序列为LRE3-EGFP的合成构建,即用EGFP(增强型绿色荧光蛋白)和中断的D1gh2基因(部分序列)标记LRE3。然而,本领域技术人员容易理解,不必包括位于1~155位置处的EGFP编码区域或处于510~910位置处的D1gh2基因部分,这些可以用ORF1和ORF2代替,正如存在于提供的其他L1s中的那样。其和进一步信息可以从NCBI网站上获得,SEQ ID No.26的登陆号为AY995186。
本领域技术人员能够基因工程化L1,使其包括可探测标记如EGFP,可以使用SEQ ID No.26作为起始点或模板。
对于L1元件群体的共有序列提供在SEQ ID Nos.36~38中。SEQ IDNo.36为Ta-1d共有序列,SEQ ID No.37为热元件共有序列,SEQ IDNo.38为对于90活性L1s更大的共有序列。这些可以从Brouha等人(2003)的在线论文的“辅助信息(supporting information)”中获得,该论文可以在www.pnas.org获得。
因此,优选L1序列选自SEQ ID Nos.36、37和38或其对应序列或同源序列中的任一。同源序列优选与所述SEQ ID No.或其对应序列具有至少70%的同源性,更优选至少85%,更优选至少95%,更优选至少99%,更优选至少99.5%,更优选至少99.95%,最优选至少99.99%。
由于其提高的活性,特别优选为热L1共有序列SEQ ID No.37或其对应序列或同源序列。与热11共有序列的同源或相似性程度是对逆转录活性良好的预测因子。Brouha等人(2003)分析了L1活性和核苷酸序列之间的关系,构造了具有8个热L1s的共有序列(LRE3、L1RP、ac004200、ac002980、a1356438、a1512428、ac021027和a1137845)SEQ ID No.37。该序列除了在1033位置上的沉默ORF1改变外,与Ta-1d共有序列(SEQID No.36)相同,除了12个多形态位置外与90个完整的L1s的共有序列(SEQ ID No.38)相同。
Brouha等人(2003)比较了L1s,首先作为活性和非活性群组,然后与热元件的共有序列配对。他们分析了整个中的L1s,然后按区域分析,最后按是否导致氨基酸改变的不同。结果发现,没有单独与活性或非活性L1s有关的核苷酸改变。正如预期的那样,有一些例外,L1越接近热L1共有序列,其越容易变成活性。考虑上述结果,他们的数据表明逆转录活性的降低作为时间函数产生的。L1与“热”共有序列越远,其越不容易变成活性。
特别优选LINE-1元件包括与上述给出序列特别是热L1s具有非常高程度序列同源性。其原因是,如Brouha等人讨论的那样,L1序列越接近热L1序列,其越容易变得活性,尽管有一些例外。如上所述,优选LINE-1元件或序列为热L1,优选具有L1RP活性的至少1/3,优选至少2/3,更优选100%,最优选大于100%,优选为150%或更大。
在特别优选的热L1s中,所有的都是多形态的,且3个(ac002980、ac004200和a1356438)来自最年轻的Ta-1d群组。此外,一个在Ta-1nd群组(a1512428),另一个是较年轻的Ta-0亚群(a1137845)的成员。这5个规范的热L1s的序列与其各自的群组或亚群的共有序列非常相似,显示出在人类中的进化中,他们相对较近的逆转录。最后,一个热L1(ac021017)为非规范的。
21个核苷酸的序列,SEQ ID No.19,与90个左右(约80至100)活性L1逆转录因子内存在的对应序列是互补的,这些活性L1逆转录因子是本发明的优选目标。因此,RNAi优选靶向包括此序列或对应序列或其同源序列的L1元件。
同时,LINE-1和逆转录酶(RT)之间的链已经公知约30年,当在清楚RT是由LINE-1编码的基因之一时,LINE-1逆转录因子已经传统上地归类为没有用处的DNA,通常被称为“垃圾DNA”。同样,这种垃圾DNA被普遍认为没有生物功能。尽管如此,本发明人还是惊奇地发现,RT抑制可以拮抗瘤生长。本发明人是首先认识到特定靶向LINE-1序列的RNAi抑制了培养中的细胞增殖和动物模型中瘤的生长。
Mangiacasale等人的Oncogene2003,Vol.22,,PP2750~2761,关注于药理学上的RT抑制剂,根本没有注意到RNAi。本发明人之一的C.Spadafora的Cytogenet.Genome Res.2004,Vol.105,PP346~360,是将现有技术中的各种线索(strands)结合在一起的综述性论文,但是并没有披露有关RNAi的内容。
RNAi优选为双链。优选地,双链核寡核苷酸并不以自由形式用于细胞转染,但是优选由编码该特定siRNA的DNA结构来携带。优选地,转录的RNA形成双链回文(palindromic)结构,其由细胞“dicer”系统进一步自发地进行,由此形成siRNA分子,例如在Brummelkamp等人2002教导的那样(注意DMI,将这篇参考文献插入参考列表的末尾处)。
另一方面,优选用于传送RNAi的标准细胞转染程序由适当的逆转录病毒或腺病毒起源的适当传送系统来替代。这种病毒系统是本领域公知的。优选地,表达L1靶向的RNAi的病毒载体或衣壳,优选siRNA,能够特定地靶向瘤细胞,且通过转染瘤细胞导致RNAi表达,例如通过转录以提供siRNA,借此导致拮抗瘤生长及刺激瘤细胞的分化。
尽管设想了任何瘤细胞的靶向或处理,但瘤细胞优选地选自由乳腺癌肿瘤、肺癌肿瘤、黑素瘤和前列腺癌。事实上,特别优选为黑素瘤和前列腺癌。
因此,特别优选RNAi直接传送至癌组织,例如通过在合适位置上注射或由植入物释放。如上所述,特别优选使用病毒载体或衣壳,优选包括编码特定siRNA的DNA结构。在本例中,优选能够在目标组织即癌或瘤组织中表达DNA结构的病毒载体或衣壳。这可以借助包括在DNA结构中的适当的组织特定启动子和/或借助于特定用于特定组织的病毒衣壳或载体。
上述还应用于包括编码特定siRNA的多核苷酸优选为DNA的质粒。特别地,优选这种质粒包括合适的组织特定启动子或其他用于siRNA组织特定表达的方式。
在质粒和载体或衣壳的两个例子中,优选质粒、载体或衣壳仅靶向癌组织,优选以组织特定的方式。
进一步,本发明还提供了治疗患有癌症或肿瘤的患者的方法,该方法优选包括上述RNA干扰法。优选该方法包括:选择具有癌组织的个体,如上所述使用RNA干扰法对抗至少一个L1元件。优选,该方法包括对逆转录酶(RT)在治疗学上有效的抑制作用,足以导致对癌组织增殖的抑制或阻碍,及优选刺激所述组织的分化。
同时设想了仅靶向一个L1元件,也优选靶向多个L1元件,或者在相同时间或者先后,作为计划的疗法的一部分。
另一方面,本发明还提供了多核苷酸序列的用途,优选为DNA序列,该多核苷酸序列编码能够靶向或识别至少一个LINE-1元件中一部分的siRNA,用于制造治疗癌症的药物。优选,这种药物包括病毒衣壳或载体,其依次包括多核苷酸。
本发明将通过下面非限制性的实施例得到进一步阐述。
实施例1
方法
细胞培养
人类A-375黑素瘤细胞系(ATCC-CRL-1619),TVM-A12原发性黑素瘤衍生的细胞系(TVM-A12primary melanoma-derived)(20),HT29腺癌细胞系(ATCC HTB-38),H69小细胞肺癌细胞系(SCLC)(ATCC HTB119)和PC3前列腺癌(ATCC CRL-1435)细胞系接种在六孔板中,密度为104~5×104细胞/孔,在具有10%的胎牛血清的DMEM或RPMI1640培养基中培养。从商业上可获得的Viramune(Boehringer-Ingelheim)和的Sustiva(Bristol-Myers Squibb),如(18)描述的,纯化奈韦拉平和依法韦仑。药物分别在二甲亚砜(dimethylsulfoxide)(DMSO,Sigma-Aldrich)中制备350和15μM,在接种5小时之后加入细胞;向对照中加入相同体积的DMSO(最终浓度的0.2%)。每48小时更换新鲜的含有RT抑制剂的培养基。每96小时收集细胞,在Burker室(两个计数/样品)中计数并以相同密度再铺盘。
细胞周期和细胞死亡分析
在收集前的最后30分钟期间,向培养物中加入BrdU(20μM)。然后,对收集的细胞进行抗BrdU抗体和碘化丙啶(PI)处理,在FACStarPlus流式细胞测定器(Beckton-Dickinson)上进行DNA含量和BrdU的双参数分析。在用DAPI(细胞核形态学);PI(细胞渗透性)和3,3己二基-氧杂羰花青(oxacarbocyanine)[DiOC6(3)],线粒体跨膜电位的荧光探针,联合染色后,通过使用显微镜检测细胞的死亡。
间接荧光免疫检验法和激光共聚焦扫描显微镜
用4%的对-多聚甲醛固定A-375和TVM-A1210分钟,用以PBS为溶剂的0.2%Triton-X渗透5分钟。小鼠单克隆抗牛α-微管蛋白抗体(Molecular Probes,A-11126)由Alexa Fluor488耦联的第二抗体(Molecular Probes,目录号为A-11001)来显示;细胞核在0.1mg/ml核糖核酸酶A存在的情况下用2μg/ml的PI染色。在Leica TCS4D的激光共聚焦扫描显微镜下对样品成像,该显微镜装配有氩/氪激光(激发波长和发射波长为:对于Alexa488为488nm和510nm,对于PI为568nm和590nm)。以0.5~1μm的间隔截取激光共聚焦扫描的部分。
扫描电子显微镜(SEM)
在以0.1M Millonig的磷酸缓冲液为溶剂的2.5%的戊二醛溶液固定A-375和TVM-A12细胞。清洗之后,用以MPB为溶剂的1%的OsO4(1h,4℃)将细胞再次固定,使用增加的丙酮浓度进行脱水。使用液态CO2对样品进行临界点干燥,并在Stereoscan 240扫描电子显微镜(Cambridge Instr.,Cambridge,UK)检测之前用金喷涂样品。
半定量RT-PCR
如(18)中所描述的,提取RNA并用无RNase的DNase I进行处理。使用300ngRNA、oligo(dT)和Thermoscript系统(Invitrogen)合成cDNAs。使用Platinum Taq DNA聚合酶试剂盒(Invitrogen)和30pmol寡核苷酸(MWG-Biotech,Ebersberg,Germany)对1/25的反应混合物进行扩增。使用的条件是:在94℃2分钟的起始步骤,接着以94℃30秒、58~62℃30秒及在72℃1分钟,循环30次。
在具有增加的循环数(25~40)的连续的扩增系列中,使用每个oligo对。PCR产品进行电泳,转膜,并在42℃用[32p]γ-ATP末端标记的内部寡核苷酸杂交16小时。扩增信号的强度由光密度法在对每个基因的至少三个独立实验中进行测量。
用于半定量PCR分析的寡核苷酸(正向,F;反向,R)和用于杂交的内部探针(INT)。
C-myc PCR产品大小,633bp;
F,5’-gtcacacccttctcccttcg-3’(SEQ ID NO.1)
R,5’-tgtgctgatgtgtggagacg-3’(SEQ ID NO.2)
INT,5’-agagaagctggcctcctacc-3’(SEQ ID NO.3)
Bc12PCR产品大小,459bp:
F,5’-ggtgccacctgtggtccacctg-3’(SEQ ID NO.4)
R,5’-cttcacttgtggcccagatagg-3’(SEQ ID NO.5)
INT,5’-ctgaagagctcctccaccac-3’(SEQ ID NO.6)
E-cadherin PCR产品大小,732bp:
F,5’-ctcctctcctggcctcagaa-3’(SEQ ID NO.7)
R,5’-tactgctgcttggcctcaaa-3’(SEQ ID NO.8)
INT,5’-gaacgcattgccacatacac-3’(SEQ ID NO.9)
PSA PCR产品大小,584bp:
F,5’-ttgtcttcctcaccctgtcc-3’(SEQ ID NO.10)
R,5’-agcacacagcatgaacttgg-3’(SEQ ID NO.11)
INT,5’-ccacacccgctctacgatat-3’(SEQ ID NO.12)
Ccndl PCR产品大小,690bp:
F,5’-ccctcggtgtcctacttcaa-3’(SEQ ID NO.13)
R,5’-tcctcctcttcctcctcctc-3’(SEQ ID NO.14)
INT,5’-cgcacgatttcattgaacac-3’(SEQ ID NO.15)
Gapdh PCR产品大小,590bp:
F,5’-aggggtctacatggcaactg-3’(SEQ ID NO.16)
R,5’-acccagaagactgtggatgg-3’(SEQ ID NO.17)
INT,5’-gtcagtggtggacctgacct-3’(SEQ ID NO.18)
对LINE-1的RNA干扰
一个21-nt的双链siRNA寡核苷酸(L1-I)
设计(5’-AAGAGCAACTCCAAGACACAT-3’,SEQ ID NO.19)来靶向Bruha等人(21)描述的高活性LINE-1元件的共有序列。具体地,靶向以下的序列:
i)八个热L1s(LRE3(SEQ ID NO.26)、L1RP(SEQ ID NO.27)、ac004200(SEQ ID NO.28)、ac002980(SEQ ID NO.29)、a1356438(SEQ ID NO.30)、a1512428(SEQ ID NO.31)、ac021017(SEQ IDNO.32)、a11378459(SEQ ID NO.33));
ii)Ta-1d家族;
iii)90个全长L1元件。对于对照,细胞用非特异性siRNA(SEQ IDNO.34)转染,其是3’-荧光素修饰以监测转染效率。
siRNA寡核苷酸用QIAGEN USA合成。转染是在A-375细胞中使用RNAiFect转染试剂(QIAGEN目录号为301605)在24孔(well)的板中加入每孔1.5μg的siRNA来实施。转染后48小时和72小时计数细胞,在装配有Olympus CAM/EDIA数码相机的Olympus CK30倒置显微镜下记录细胞形态。约80%的细胞在24小时后被转染,正如由荧光素显微镜确定的那样。
在使用了用于LINE-1ORF-1和ORF-2的特定引物对进行转染之后48小时,用RT-PCR来分析LINE-1表达。
ORF-1:
F,5’-AGAAATGAGCAAAGCCTCCA-3’(SEQ ID NO.20)
R,5’-GCCTGGTGGTGACAAAATCT-3’(SEQ ID NO.21)
ORF-2:
F,5’-TCCAGCAGCACATCAAAAAG-3’(SEQ ID NO.22)
R,5’-CCAGTTTTTGCCCATTCAGT-3’(SEQ ID NO.23)
RNA提取物和RT-PCR条件如在此说明的那样,除了退火温度为54℃以及经过23个循环执行扩增以外。用于Southern分析的内部寡核苷酸为:5’-TAAGGGCAGCCAGAGAGAAA-3’(ORF-1,SEQ ID NO.24)和5’-TGACAAACCCACAGCCAATA-3’(ORF-2,SEQ ID NO.25)。
瘤异种移植物和动物的治疗
五周大的无胸腺裸鼠(Harlan,Italy),根据欧洲联盟指南进行保存,用在100μlPBS中含有A-375黑素瘤细胞(4×106)、H69细胞(107)、PC3细胞(2×106)和HT-29(106)细胞进行皮下接种。小鼠每周五天地每天接受依法韦仑(20mg/kg)皮下注射,依法韦仑使用以DMSO为溶剂的4mg/ml的储存液(stock),用生理溶液以1:1稀释,而新鲜配置。对照用50%的DMSO注射。在瘤植入后一天或一周开始治疗,在一些实验中,在14天后停止。每隔一天用测径器测量装置监测瘤生长;使用以下公式计算体积:
长度×宽度×高度×0.52                  (22)
结果
针对RT-编码LINE-1家族靶向的RNA干扰(RNAi)降低了黑素瘤细胞的增殖,并促进黑素瘤细胞的分化
我们希望毫不含糊地确定,如下讨论的、对药用RT抑制剂响应所观察到的生长速率降低和对分化的诱导是否在事实上可归于细胞RTs的特定抑制作用。为了证实这一点,设计RNAi实验来特异性地靶向LINE-1元件亚家族(subfamilies),其公知在人体细胞中最大丰富度的表达(21,上述在方法的对应部分中描述了靶向的序列)。
与LINE-1ORF1(图4,板A)同源的双链RNA寡核苷酸在A-375细胞中得到转染。转染48~72小时后诱导了典型的分化形态(板B)。伴随地,与用非特异性寡核苷酸转染的细胞相比,降低了约70%(板C)的增殖。这些结果与那些用药用RT抑制作用获得结果相当。通过半量RT-PCR分析,ORF1和ORF2的表达与用非特异性寡核苷酸转染的细胞相比都降低了几乎80%(板D)。此外,对LINE-1元件的RNAi诱导了c-myc和cyclin-D1基因的表达下调,但是并不诱导GAPDH基因的表达下调,如对RT抑制剂药物响应中所见。
RT抑制剂可逆地(reversibly)降低细胞增殖
我们已经调查了人类转化细胞系对于向两个广泛使用的RT抑制剂即奈韦拉平和依法韦仑延长暴露(prolonged exposure)的反应。来自A-375黑素瘤细胞、PC3前列腺癌细胞和TVM-A12原发性黑素瘤衍生的细胞系培养物每96小时进行传代、计数和再铺盘,同时连续添加药物至少20天(五个96小时的循环)。如图1所示,两种抑制剂都有效地降低了所有细胞系中的细胞生长,并在延长的暴露时期具有稳定的抑制效果。生长抑制作用是可逆的:当去除RT抑制剂,所有细胞系在一个或两个96小时循环内以与对照相当的速率恢复增殖。药物的再次添加再次抑制了所有细胞系中的增殖。因此,与RT抑制作用有关的细胞生长的减少并没有作为整个细胞分裂中固定改变得到遗传。
为了说明降低增殖的基础,我们调查了是否任一RT抑制剂都诱导了A-375或PC3细胞系中的细胞死亡。用PI的联合染色显示出可渗透的坏死细胞,用DAPI可视化凋亡(apoptotic)细胞核,用DiOC6(3)监测线粒体跨膜电位的损失,说明通过任一RT抑制剂都没有显著诱导细胞死亡;所记录的低速率(暴露给任一药物后72小时最大为15%)很大程度上由凋亡来说明(未显示数据)。因此,没有药物有显著的非特异性毒性,显示降低的细胞生长,更确切为反映了细胞周期延迟的诱发。
为了证实这一点,我们使用了双参数的FACS分析来测量暴露给RT抑制剂4个96小时循环之后的DNA含量(通过PI显示)和DNA复制(通过BrdU渗入显示)。细胞周期方式(profile)在抗RT治疗的培养物中有了显著改变,显示了具有G0/G1含量的BrdU阴性细胞的比例的增加,其在A-375细胞培养物中特别显著(图1B)。药物的去除再次建立了初始的细胞周期方式并停止了G1延迟。
在转化的细胞系中奈韦拉平诱导细胞形态上的分化、分化和增殖基因的表达
因为黑素瘤耐大多数治疗,因此,这与确定是否RT抑制剂诱导伴随着细胞生长降低的分化有关。我们首先检查了A-37黑素瘤细胞,其能获得对特定分化诱导剂(23)响应的典型的树突表现型。如图2A所示,由细胞形状显示的形态学上的分化的呈树突延伸,并具有增加的附着,与DMSO处理的对照(a)相比,在暴露给奈韦拉平(d)或依法韦仑(g)的4~5天中变得很明显。通过扫描电子显微镜(SEM),使用奈韦拉平(e)和依法韦仑(h)的A-375细胞培养物与未处理的对照(b)相比变平(flattened),并显示出伸长的树突延伸,其紧密地依附于基底。在α-微管蛋白免疫染色后的激光共聚焦显微镜进一步显示出微管列(array)在受RT抑制的细胞(f-i)的向外生长树突(dendrites)中的整个长度上重新排列,其与对照(c)不同,其中短的微管集中在成核中心的周围。
在由奈韦拉平处理后的黑素瘤衍生的原发性TVM-A12细胞中观察到类似的反应(图2B):通过相差(phase contrast)(a)和SEM(b),未经处理的细胞具有纺锤状的形态;与未经处理的细胞(c)相比,奈韦拉平处理的TVM-A12细胞形成了替代的典型分支树突(d-e),并显示了良好的组织、伸长的微管列(f)。
形态上分化的诱导表明:关键性调控基因在对RT抑制处理做出响应时被调节。这在仅用DMSO处理、或奈韦拉平或依法韦仑处理4个循环的培养物的半量RT-PCR分析中研究过。在A-375黑素瘤细胞中,我们关注一套4个基因:E-cadherin基因,涉及细胞-细胞附着和在分化但非瘤细胞中的表达(24);c-myc,bcl-2(25)和cyclin D1(26)基因,它们直接涉及黑素瘤细胞增殖和瘤生长。
如图3A所示,我们发现,E-cadherin基因与对照相比在受RT抑制的A-375培养物中得到显著上调;相反,c-myc,bcl-2和cyclin D1基因下调。记录的一个例外是在依法韦仑中,其没有使得cyclin D1表达下调。我们也分析了PC3前列腺癌细胞,并从分化的前列腺癌上皮细胞中选取两个标记基因,即前列腺特定抗原PSA(27)和雄激素受体(AR)(28)基因。这些基因没有一个表达在未经处理的培养物中,但都在对RT抑制剂的响应中被诱导(图3B)。当抑制剂去除时,所有基因的表达再次返回初始水平。因此,RT抑制药物导致转化细胞中关键性基因表达的重新编排,与分化诱导相一致,然而这种重新编排是可逆的,当RT抑制作用消除就停止了。
RT抑制剂降低了无胸腺裸鼠中人类瘤异种移植体的生长
因为转化细胞的关键性特征,包括增殖和分化,通过RT抑制作用得到调节,我们在活体中测试了RT抑制剂拮抗瘤生长的能力。
选择用于这些实验的致瘤细胞系包括A-375细胞系和PC3细胞系、以及HT29结肠细胞系和H69小细胞肺癌细胞系,它们都显示出响应RT抑制剂降低的细胞生长(19,数据未示出)。细胞皮下接种到无胸腺裸鼠的肢中。然后,对这些动物进行依法韦仑处理,因为在初级实验中与奈韦拉平相比,该药物在活体中具有较高效率。最佳剂量(20mg/体重kg)在测试药物4~40mg/kg的剂量响应实验中确定。
依法韦仑处理证实在所有动物界中是安全的,没有动物死亡或任一群中有明显的中毒现象,尽管用40mg/kg处理的群中显示出在超过60%的动物中体重显著降低。图5显示了在接种瘤后未经依法韦仑处理(红色)或经过依法韦仑处理开始1天(紫色)或1周(黄色)的小鼠体内瘤生长的记录曲线。
对所有异种移植体类型而言,与未经处理的动物相比,瘤生长在得到处理的动物体内得到显著降低,不管处理开始的时间如何,不管初始瘤大小的差异,进行性肿瘤得到相当有效的拮抗。接种1天开始处理但在15天后停止处理的动物体内PC3和HT29衍生的瘤生长曲线(绿色)说明活体中瘤生长的RT依赖的(RT-dependent)抑制作用是可逆的。
依法韦仑处理的PC3细胞显示活体中致肿瘤性的降低
我们已经研究了是否用依法韦仑预先处理转化细胞将缓和衍生异种移植体的致肿瘤性潜能。PC3前列腺癌细胞用20μM的依法韦仑培养2个96小时循环,其时间足够PSA和AR基因的响应(图3B),随后在裸鼠中接种。
未处理的细胞在动物的平行对照(parallel batches)中接种。依法韦仑预处理或未处理的PC3细胞异种移植体然后或者连续用依法韦仑在活体中连续处理,或者留下来并不处理。如图6A所示,未处理的PC3细胞在所有动物中生成急性发展(aggressive)瘤。相反,依法韦仑预处理的PC3细胞显示了活体中形成瘤能力的降低,异种移植体生长更为缓慢。如图6B总结的那样,依法韦仑预处理的PC3细胞在65%的接种动物中发展了生长缓慢的异种移植体,而未处理细胞中的异种移植体为100%。此外,活体接种了预处理细胞并用依法韦仑进一步处理的动物仅有40%完全发展了瘤,在这种情况下,生长曲线是平的。因此,依法韦仑削弱了转化细胞的致肿瘤性潜能。
讨论
这项工作突出显示了人类基因组涉及癌的三个特征:第一,LINE-1元件被鉴定为涉及细胞分化和增殖控制的机制中的活性成分;第二,LINE-1元件的RNAi依赖失活,或其编码的内源RT活性的药理学抑制作用能够恢复这些特性在转化的细胞中的控制;第三,RT的抑制剂降低了活体动物模型中的瘤生长。
用于这项工作的RT抑制剂药物,奈韦拉平和依法韦仑,通过结合在RT酶的p66亚基中的疏水孔袋(hydrophobic pocket)而具有相同的活性机制(29,30)。尽管被设计成靶向HIV编码的RT,两者都在体外抑制了未传染细胞中的内源RT的酶活性(19)。我们已经显示出,两种药物都降低了转化细胞的增殖,很大程度上独立于细胞死亡,但是与G1延迟或停止有关。与此相随,RT抑制剂诱导了转化细胞的形态分化。分化诱导是快速的,这与由与端粒末端转移酶相关RT抑制剂(TERT)引起的表型改变不同,其需要长的处理时间(120天)(31)。此外,我们没有观察衰老细胞典型的肌动蛋白应力纤维(stress fiber)或focal adhesion sites的重新组织。这种缺少衰老特定修饰、和分化的快速诱导表明用于此的RT抑制剂并没有靶向TERT,并诱导表型的低增殖分化而不是衰老。
特别令人惊奇的是,RT抑制作用的特异性在RNAi实验中得到证明,该实验中RT抑制作用靶向针对在人类细胞中高度表达的六个LINE-1逆转录转座子的亚群,其占整个逆转录转座子能力的84%(21)。显著地,我们发现,RNAi降低了LINE-1衍生的ORF1和ORF2在A-375细胞中约80%的表达,表明LINE-1亚群生物活性得到有效地下调。由RNAi向RT编码LINE-1元件的诱导的改变与由药理学RT抑制剂导致的无明显差别,表明LINE-1在对照细胞中增殖和分化。使用独立途径观察到的表型相似性指出,LINE-1表达的抑制、或RT活性的抑制足够延迟增殖并促进分化。这些观察结果指出,药物的任何未知副作用并不归于以非特定方式观察到的表型。
与降低生长和分化形态的诱导相一致,我们发现,所选基因小组(panel)在RT抑制作用的表达响应中进行重排。这显示,RT活性能有效调控基因表达,这些基因促使从高增殖、转化的表型向低增殖、分化的表型转化,表明基因组功能是药物或RT依赖的RT活性的抑制作用的最终靶标。然而,基因表达中的改变并不通过细胞分裂来遗传,而是当RT抑制作用削除后可逆。检测特征的可逆性及其对抑制药物存在的依附性与以下概念一致,即LINE-1编码的RT是调控基因表达的表观遗传学机制(epigenetic mechanism)的一部分,并对主要的细胞增殖和分化的分子机制起作用。
该研究的一方面是,RT抑制药物降低接种有四个人类异种移植物模型的活体裸鼠体内瘤生长的能力。瘤生长得到抑制,只要向动物供给RT抑制剂,然而,一旦停止治疗就会恢复,正如在细胞系中观察的那样。虽然这些数据说明了RT抑制剂在治疗癌症中有前途的细胞生长抑制的能力,其证实了内源RT在瘤生长中的表观遗传学作用。此外,依法韦仑对PC3前列腺细胞的体外预处理削弱了其活体内致肿瘤性。因此,分化标记的活性和与RT抑制作用有关的降低增殖都是能削弱活体内转化细胞恶性表型的大范围程序重排(reprogramming)的一部分。
生长数据指出,表观遗传学改变能够程序重排瘤细胞,将转化表型转化成“正常”非病态状态(32,33)。表观遗传学程序重排能绕过在多种瘤中最初导致恶性转化的基因变更(32)。因此,表观遗传学调节因素认为是瘤治疗中有价值的、值得挑战的目标(34)。然而,许多受试化合物通常被证明是毒性和/或化学性不稳定。奈韦拉平和依法韦仑用于AIDS治疗已经多年;在癌症治疗中使用这些RT抑制剂的前景将具有明显的优势,对于连续给药通常具有好的耐药性(tolerance)的流行病学记录。此外,流行病学证据表明卡波济(氏)肉瘤(35)和其他AIDS有关的癌(36)在用高活性抗逆转录酶病毒治疗(HAART)处理的患者中具有降低的发生频率:虽然通常认为是在受处理患者体内提高了免疫反应的一种反映,它也能表明对于瘤细胞中内源RT活性的HAART的直接抑制效果。
在这一阶段,通过RT活性能指导细胞命运的机制仍然不清楚。逆转录能在裂殖酵母中有助于异染色质形成(37)。尽管这种机制没有在较高级的真核细胞中得到验证,我们实验室的工作表明,LINE-1编码的RT涉及DNA甲基化作用(methylation)的重新分配中,和基因表达的染色质再塑依赖(remodeling-dependent)的调节。
总的来说,内源RT的形成作为高增殖和损失分化有关的细胞机制的“功能性”标记,能被认为是癌治疗中的新型潜在靶标。数据能特别地支持前列腺癌,其中AR表达的损失是激素治疗失败的主要原因。因为RT抑制剂对AR和PSA进行上调,这些分化诱导化合物可能对于恢复前列腺癌细胞中雄性激素灵敏性有帮助。
实施例2
A)LINE-1靶向的siRNA表达DNA结构的克隆
siRNA靶向序列是由已知在人类细胞中高度活性的LINE-1元件衍生得到的(Brouha等,2003,supplementary material)。该靶向序列为60bp长(从1492~1552),在SEQ ID NO.35中列出,作为双链DNA而人工合成。然后,将DNA寡核苷酸克隆入商业可获得的载体pSuper.retro.neo+GFP中(OligoEngine,USA,目录号VEC-PRT-0006)。
B)逆转录酶病毒载体的装配
然后,该结构转染入产生逆转录病毒的Phi-NX细胞(由ATCC获得)中被,包装在新近合成的逆转录病毒颗粒中,再自发地从细胞释放到培养基中。转染48小时后,利用离心法收集逆转录病毒颗粒(称为pS-L1i),通过0.45微米的微孔过滤器过滤,再用于细胞转染。该方法根据制造商的说明来执行(OligoEngine)。
C)人类瘤基因细胞系的转染
通过将被转染细胞的上清液与细胞培养物简单混合并培育24小时,而用PS-L1i转染A375(黑素瘤)和PC3(前列腺癌)的人类细胞系。然后,在新霉素存在的情况下选取被转染的细胞7天。所有抗新霉素的细胞都是GFP报告基因表达为阳性。作为对照,来自相同细胞系的平行培养物用包含空DNA载体(pS)(没有siRNA编码序列)的逆转录病菌颗粒转染。
如图7所示,受pS-L1感染的细胞显示了增殖的急剧降低,其保持恒定至少39天。未感染细胞维持高的增殖速率,受pS感染的细胞显示出在转染后最初几天里增殖的温和降低,但随后快速恢复到与未转染细胞相当的高增殖。
与这些数据良好相关的是,LINE-1(ORF1和ORF2)表达在感染pS-L1的细胞中强烈下调,但在pS转染的细胞中没有下调,在RNA和蛋白质水平上都下调,正如使用特定抗体的western blot分析(数据未示出)所显示的那样。
D)受pS-L1感染的A375细胞具有降低的致肿瘤性,正如通过在裸鼠中接种作出的活体内检测所确定的那样。
为了评价pS-L1i细胞的致瘤潜能是否受到影响,用pS载体或用LINE-1敲除的pS-L1i结构转染的5×106A375细胞,在两组无胸腺裸鼠中皮内接种(感染后15天)。然后,监测两组小鼠体内的瘤进程:图8中板A示出了接种A375pS和A375pS-L1i细胞的小鼠体内瘤生长的进程。板B中实施例显示与接种对照细胞的小鼠相比,接种LINE1干扰的细胞的小鼠体内瘤生长有显著降低。
这些结果一起支持以下结论:LINE1基因活性有助于转化细胞的增殖,并能认为是基因癌治疗中的新型潜在靶标。
因此,为了通过基因治疗提高本发明的利用,将以下两个改进引入到所说明的方法中:
i)双链ribo寡核苷酸并不以自由形式用于细胞转染,而是由编码特定siRNA的DNA结构携带。转录的RNA形成双链回文结构,其通过细胞“dicer”系统进一步自发进行,由此形成siRNA分子(Brummelkamp等,2002,参考文献38)
ii)标准细胞转染程序必须通过逆转录病毒或腺病毒来源的适当传输系统来替代。
换句话说,本方法的改进在于:表达LINE-1靶向的siRNA的病毒载体的发展,siRNA将用于感染瘤。LINE-1靶向的siRNA表达结构通过病毒载体在致瘤细胞中传递,由此,抑制内源LINE-1表达。基于我们之前的实验,用这种方式获得的组成性功能敲除的LINE-1将强烈拮抗瘤进程。
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LIRP上的附加信息:
NCBI接收号为:AF148856,可以从以下网站获得,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=5070620,且在下述内容中描述:
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JOURNAL提交(06-MAY-1999)Genetics,School of Medicine,University of Pennsylvania,515CRB,415Curie Blvd.,Philadelphia,PA19104,USA
重要序列
SEQ ID NO.47:5’-AAGAGCAACUCCAAGACACAU-3’
SEQ ID NO.45:
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KTKHRRIFSLIGGN 1275
SEQ ID NO 36
(a)Ta-1d共有
6,021 核苷酸
5’-GGGGGAGGAGCCAAGATGGCCGAATAGGAACAGCTCCGGTCTACAGCTCCC
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GGGAAAGGATTCCCTATTTAATAAATGGTGCTGGGAAAACTGGCTAGCCATA
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CAGGCAACCTACAACATGGGAGAAAATTTTTGCAACCTACTCATCTGACAAA
GGGCTAATATCCAGAATCTACAATGAACTCAAACAAATTTACAAGAAAAAAA
CAAACAACCCCATCAAAAAGTGGGCGAAGGACATGAACAGACACTTCTCAA
AAGAAGACATTTATGCAGCCAAAAAACACATGAAGAAATGCTCATCATCACT
GGCCATCAGAGAAATGCAAATCAAAACCACTATGAGATATCATCTCACACCA
GTTAGAATGGCAATCATTAAAAAGTCAGGAAACAACAGGTGCTGGAGAGGA
TGCGGAGAAATAGGAACACTTTTACACTGTTGGTGGGACTGTAAACTAGTTC
AACCATTGTGGAAGTCAGTGTGGCGATTCCTCAGGGATCTAGAACTAGAAAT
ACCATTTGACCCAGCCATCCCATTACTGGGTATATACCCAAATGAGTATAAAT
CATGCTGCTATAAAGACACATGCACACGTATGTTTATTGCGGCACTATTCACA
ATAGCAAAGACTTGGAACCAACCCAAATGTCCAACAATGATAGACTGGATTA
AGAAAATGTGGCACATATACACCATGGAATACTATGCAGCCATAAAAAATGA
TGAGTTCATATCCTTTGTAGGGACATGGATGAAATTGGAAACCATCATTCTCA
GTAAACTATCGCAAGAACAAAAAACCAAACACCGCATATTCTCACTCATAGG
TGGGAATTGAACAATGAGATCACATGGACACAGGAAGGGGAATATCACACT
CTGGGGACTGTGGTGGGGTCGGGGGAGGGGGGAGGGATAGCATTGGGAGAT
ATACCTAATGCTAGATGACACATTAGTGGGTGCAGCGCACCAGCATGGCACA
TGTATACATATGTAACTAACCTGCACAATGTGCACATGTACCCTAAAACTTAG
AGTATAATAAA-3’
SEQ ID NO 37
(b)热序列共有
6,021核苷酸
5’-GGGGGAGGAGCCAAGATGGCCGAATAGGAACAGCTCCGGTCTACAGCTCCC
AGCGTGAGCGACGCAGAAGACGGTGATTTCTGCATTTCCATCTGAGGTACCG
GGTTCATCTCACTAGGGAGTGCCAGACAGTGGGCGCAGGCCAGTGTGTGTGC
GCACCGTGCGCGAGCCGAAGCAGGGCGAGGCATTGCCTCACCTGGGAAGCG
CAAGGGGTCAGGGAGTTCCCTTTCCGAGTCAAAGAAAGGGGTGACGGACGC
ACCTGGAAAATCGGGTCACTCCCACCCGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTT
AAGAAACGGCGCACCACGAGACTATATCCCACACCTGGCTCGGAGGGTCCTA
CGCCCACGGAATCTCGCTGATTGCTAGCACAGCAGTCTGAGATCAAACTGCA
AGGCGGCAACGAGGCTGGGGGAGGGGCGCCCGCCATTGCCCAGGCTTGCTTA
GGTAAACAAAGCAGCCGGGAAGCTCGAACTGGGTGGAGCCCACCACAGCTC
AAGGAGGCCTGCCTGCCTCTGTAGGCTCCACCTCTGGGGGCAGGGCACAGAC
AAACAAAAAGACAGCAGTAACCTCTGCAGACTTAAGTGTCCCTGTCTGACAG
CTTTGAAGAGAGCAGTGGTTCTCCCAGCACGCAGCTGGAGATCTGAGAACGG
GCAGACTGCCTCCTCAAGTGGGTCCCTGACTCCTGACCCCCGAGCAGCCTAA
CTGGGAGGCACCCCCCAGCAGGGGCACACTGACACCTCACACGGCAGGGTAT
TCCAACAGACCTGCAGCTGAGGGTCCTGTCTGTTAGAAGGAAAACTAACAAC
CAGAAAGGACATCTACACCGAAAACCCATCTGTACATCACCATCATCAAAGA
CCAAAAGTAGATAAAACCACAAAGATGGGGAAAAAACAGAACAGAAAAACT
GGAAACTCTAAAACGCAGAGCGCCTCTCCTCCTCCAAAGGAACGCAGTTCCT
CACCAGCAACAGAACAAAGCTGGATGGAGAATGATTTTGATGAGCTGAGAG
AAGAAGGCTTCAGACGATCAAATTACTCTGAGCTACGGGAGGACATTCAAAC
CAAAGGCAAAGAAGTTGAAAACTTTGAAAAAAATTTAGAAGAATGTATAACT
AGAATAACCAATACAGAGAAGTGCTTAAAGGAGCTGATGGAGCTGAAAACC
AAGGCTCGAGAACTACGTGAAGAATGCAGAAGCCTCAGGAGCCGATGCGAT
CAACTGGAAGAAAGGGTATCAGCAATGGAAGATGAAATGAATGAAATGAAG
CGAGAAGGGAAGTTTAGAGAAAAAAGAATAAAAAGAAATGAGCAAAGCCTC
CAAGAAATATGGGACTATGTGAAAAGACCAAATCTACGTCTGATTGGTGTAC
CTGAAAGTGATGTGGAGAATGGAACCAAGTTGGAAAACACTCTGCAGGATAT
TATCCAGGAGAACTTCCCCAATCTAGCAAGGCAGGCCAACGTTCAGATTCAG
GAAATACAGAGAACGCCACAAAGATACTCCTCGAGAAGAGCAACTCCAAGA
CACATAATTGTCAGATTCACCAAAGTTGAAATGAAGGAAAAAATGTTAAGGG
CAGCCAGAGAGAAAGGTCGGGTTACCCTCAAAGGAAAGCCCATCAGACTAA
CAGCGGATCTCTCGGCAGAAACCCTACAAGCCAGAAGAGAGTGGGGGCCAA
TATTCAACATTCTTAAAGAAAAGAATTTTCAACCCAGAATTTCATATCCAGCC
AAACTAAGCTTCATAAGTGAAGGAGAAATAAAATACTTTATAGACAAGCAAA
TGTTGAGAGATTTTGTCACCACCAGGCCTGCCCTAAAAGAGCTCCTGAAGGA
AGCGCTAAACATGGAAAGGAACAACCGGTACCAGCCGCTGCAAAATCATGC
CAAAATGTAAAGACCATCGAGACTAGGAAGAAACTGCATCAACTAATGAGC
AAAATCACCAGCTAACATCATAATGACAGGATCAAATTCACACATAACAATA
TTAACTTTAAATATAAATGGACTAAATTCTGCAATTAAAAGACACAGACTGG
CAAGTTGGATAAAGAGTCAAGACCCATCAGTGTGCTGTATTCAGGAAACCCA
TCTCACGTGCAGAGACACACATAGGCTCAAAATAAAAGGATGGAGGAAGAT
CTACCAAGCCAATGGAAAACAAAAAAAGGCAGGGGTTGCAATCCTAGTCTCT
GATAAAACAGACTTTAAAACCAACAAAGATCAAAAGAGACAAAGAAGGCCAT
TACATAATGGTAAAGGGATCAATTCAACAAGAGGAGCTAACTATCCTAAATA
TTTATGCACCCAATACAGGAGCACCCAGATTCATAAAGCAAGTCCTCAGTGA
CCTACAAAGAGACTTAGACTCCCACACATTAATAATGGGAGACTTTAACACC
CCACTGTCAACATTAGACAGATCAACGAGACAGAAAGTCAACAAGGATACC
CAGGAATTGAACTCAGCTCTGCACCAAGCAGACCTAATAGACATCTACAGAA
CTCTCCACCCCAAATCAACAGAATATACATTTTTTTCAGCACCACACCACACC
TATTCCAAAATTGACCACATAGTTGGAAGTAAAGCTCTCCTCAGCAAATGTA
AAAGAACAGAAATTATAACAAACTATCTCTCAGACCACAGTGCAATCAAACT
AGAACTCAGGATTAAGAATCTCACTCAAAGCCGCTCAACTACATGGAAACTG
AACAACCTGCTCCTGAATGACTACTGGGTACATAACGAAATGAAGGCAGAAA
TAAAGATGTTCTTTGAAACCAACGAGAACAAAGACACCACATACCAGAATCT
CTGGGACGCATTCAAAGCAGTGTGTAGAGGGAAATTTATAGCACTAAATGCC
TACAAGAGAAAGCAGGAAAGATCCAAAATTGACACCCTAACATCACAATTA
AAAGAACTAGAAAAGCAAGAGCAAACACATTCAAAAGCTAGCAGAAGGCAA
GAAATAACTAAAATCAGAGCAGAACTGAAGGAAATAGAGACACAAAAAACC
CTTCAAAAAATCAATGAATCCAGGAGCTGGTTTTTTGAAAGGATCAACAAAA
TTGATAGACCGCTAGCAAGACTAATAAAGAAAAAAAGAGAGAAGAATCAAA
TAGACACAATAAAAAATGATAAAGGGGATATCACCACCGATCCCACAGAAA
TACAAACTACCATCAGAGAATACTACAAACACCTCTACGCAAATAAACTAGA
AAATCTAGAAGAAATGGATACATTCCTCGACACATACACTCTCCCAAGACTA
AACCAGGAAGAAGTTGAATCTCTGAATCGACCAATAACAGGCTCTGAAATTG
TGGCAATAATCAATAGTTTACCAACCAAAAAGAGTCCAGGACCAGATGGATT
CACAGCCGAATTCTACCAGAGGTACAAGGAGGAACTGGTACCATTCCTTCTG
AAACTATTCCAATCAATAGAAAAAGAGGGAATCCTCCCTAACTCATTTTATG
AGGCCAGCATCATTCTGATACCAAAGCCGGGCAGAGACACAACCAAAAAAG
AGAATTTTAGACCAATATCCTTGATGAACATTGATGCAAAAATCCTCAATAA
AATACTGGCAAACCGAATCCAGCAGCACATCAAAAAGCTTATCCACCATGAT
CAAGTGGGCTTCATCCCTGGGATGCAAGGCTGGTTCAATATACGCAAATCAA
TAAATGTAATCCAGCATATAAACAGAGCCAAAGACAAAAACCACATGATTAT
CTCAATAGATGCAGAAAAAGCCTTTGACAAAATTCAACAACCCTTCATGCTA
AAAACTCTCAATAAATTAGGTATTGATGGGACGTATTTCAAAATAATAAGAG
CTATCTATGACAAACCCACAGCCAATATCATACTGAATGGGCAAAAACTGGA
AGCATTCCCTTTGAAAACCGGCACAAGACAGGGATGCCCTCTCTCACCGCTC
CTATTCAACATAGTGTTGGAAGTTCTGGCCAGGGCAATCAGGCAGGAGAAGG
AAATAAAGGGTATTCAATTAGGAAAAGAGGAAGTCAAATTGTCCCTGTTTGC
AGACGACATGATTGTTTATCTAGAAAACCCCATCGTCTCAGCCCAAAATCTCC
TTAAGCTGATAAGCAACTTCAGCAAAGTCTCAGGATACAAAATCAATGTACA
AAAATCACAAGCATTCTTATACACCAACAACAGACAAACAGAGAGCCAAAT
CATGGGTGAACTCCCATTCACAATTGCTTCAAAGAGAATAAAATACCTAGGA
ATCCAACTTACAAGGGATGTGAAGGACCTCTTCAAGGAGAACTACAAACCAC
TGCTCAAGGAAATAAAAGAGGAGACAAACAAATGGAAGAACATTCCATGCT
CATGGGTAGGAAGAATCAATATCGTGAAAATGGCCATACTGCCCAAGGTAAT
TTACAGATTCAATGCCATCCCCATCAAGCTACCAATGACTTTCTTCACAGAAT
TGGAAAAAACTACTTTAAAGTTCATATGGAACCAAAAAAGAGCCCGCATTGC
CAAGTCAATCCTAAGCCAAAAGAACAAAGCTGGAGGCATCACACTACCTGAC
TTCAAACTATACTACAAGGCTACAGTAACCAAAACAGCATGGTACTGGTACC
AAAACAGAGATATAGATCAATGGAACAGAACAGAGCCCTCAGAAATAATGC
CGCATATCTACAACTATCTGATCTTTGACAAACCTGAGAAAAACAAGCAATG
GGGAAAGGATTCCCTATTTAATAAATGGTGCTGGGAAAACTGGCTAGCCATA
TGTAGAAAGCTGAAACTGGATCCCTTCCTTACACCTTATACAAAAATCAATTC
AAGATGGATTAAAGATTTAAACGTTAAACCTAAAACCATAAAAACCCTAGAA
GAAAACCTAGGCATTACCATTCAGGACATAGGCGTGGGCAAGGACTTCATGT
CCAAAACACCAAAAGCAATGGCAACAAAAGACAAAATTGACAAATGGGATC
TAATTAAACTAAAGAGCTTCTGCACAGCAAAAGAAACTACCATCAGAGTGAA
CAGGCAACCTACAACATGGGAGAAAATTTTTGCAACCTACTCATCTGACAAA
GGGCTAATATCCAGAATCTACAATGAACTCAAACAAATTTACAAGAAAAAAA
CAAACAACCCCATCAAAAAGTGGGCGAAGGACATGAACAGACACTTCTCAA
AAGAAGACATTTATGCAGCCAAAAAACACATGAAGAAATGCTCATCATCACT
GGCCATCAGAGAAATGCAAATCAAAACCACTATGAGATATCATCTCACACCA
GTTAGAATGGCAATCATTAAAAAGTCAGGAAACAACAGGTGCTGGAGAGGA
TGCGGAGAAATAGGAACACTTTTACACTGTTGGTGGGACTGTAAACTAGTTC
AACCATTGTGGAAGTCAGTGTGGCGATTCCTCAGGGATCTAGAACTAGAAAT
ACCATTTGACCCAGCCATCCCATTACTGGGTATATACCCAAATGAGTATAAAT
CATGCTGCTATAAAGACACATGCACACGTATGTTTATTGCGGCACTATTCACA
ATAGCAAAGACTTGGAACCAACCCAAATGTCCAACAATGATAGACTGGATTA
AGAAAATGTGGCACATATACACCATGGAATACTATGCAGCCATAAAAAATGA
TGAGTTCATATCCTTTGTAGGGACATGGATGAAATTGGAAACCATCATTCTCA
GTAAACTATCGCAAGAACAAAAAACCAAACACCGCATATTCTCACTCATAGG
TGGGAATTGAACAATGAGATCACATGGACACAGGAAGGGGAATATCACACT
CTGGGGACTGTGGTGGGGTCGGGGGAGGGGGGAGGGATAGCATTGGGAGAT
ATACCTAATGCTAGATGACACATTAGTGGGTGCAGCGCACCAGCATGGCACA
TGTATACATATGTAACTAACCTGCACAATGTGCACATGTACCCTAAAACTTAG
AGTATAATAAA-3’
SEQ ID NO 38
(c)90-序列共有
6.022核苷酸
5’-GGGGGAGGAGCCAAGATGGCCGAATAGGAACAGCTCCGGTCTACAGCTCCC
AGCGTGAGCGACGCAGAAGACGGGTGATTTCTGCATTTCCATCTGAGGTACC
GGGTTCATCTCACTAGGGAGTGCCAGACAGTGGGCGCAGGCCAGTGTGTGTG
CGCACCGTGCGCGAGCCGAAGCAGGGCGAGGCATTGCCTCACCTGGGAAGC
GCAAGGGGTCAGGGAGTTCCCTTTCCGAGTCAAAGAAAGGGGTGACGGACG
CACCTGGAAAATCGGGTCACTCCCACCCGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCT
TAAGAAACGGCGCACCACGAGACTATATCCCACACCTGGCTCAGAGGGTCCT
ACGCCCACGGAATCTCGCTGATTGCTAGCACAGCAGTCTGAGATCAAACTGC
AAGGCGGCAACGAGGCTGGGGGAGGGGCGCCCGCCATTGCCCAGGCTTGCTT
AGGTAAACAAAGCAGCCGGGAAGCTCGAACTGGGTGGAGCCCACCACAGCT
CAAGGAGGCCTGCCTGCCTCTGTAGGCTCCACCTCTGGGGGCAGGGCACAGA
CAAACAAAAAGACAGCAGTAACCTCTGCAGACTTAAGTGTCCCTGTCTGACA
GCTTTGAAGAGAGCAGTGGTTCTCCCAGCACGCAGCTGGAGATCTGAGAACG
GGCAGACTGCCTCCTCAAGTGGGTCCCTGACCCCTGACCCCCGAGCAGCCTA
ACTGGGAGGCACCCCCCAGCAGGGGCACACTGACACCTCACACGGCAGGGT
ATTCCAACAGACCTGCAGCTGAGGGTCCTGTCTGTTAGAAGGAAAACTAACA
ACCAGAAAGGACATCTACACCGAAAACCCATCTGTACATCACCATCATCAAA
GACCAAAAGTAGATAAAACCACAAAGATGGGGAAAAAACAGAACAGAAAA
ACTGGAAACTCTAAAACGCAGAGCGCCTCTCCTCCTCCAAAGGAACGCAGTT
CCTCACCAGCAACAGAACAAAGCTGGATGGAGAATGATTTTGACGAGCTGAG
AGAAGAAGGCTTCAGACGATCAAATTACTCTGAGCTACGGGAGGACATTCAA
ACCAAAGGCAAAGAAGTTGAAAACTTTGAAAAAAATTTAGAAGAATGTATA
ACTAGAATAACCAATACAGAGAAGTGCTTAAAGGAGCTGATGGAGCTGAAA
ACCAAGGCTCGAGAACTACGTGAAGAATGCAGAAGCCTCAGGAGCCGATGC
GATCAACTGGAAGAAAGGGTATCAGCAATGGAAGATGAAATGAATGAAATG
AAGCGAGAAGGGAAGTTTAGAGAAAAAAGAATAAAAAGAAATGAGCAAAG
CCTCCAAGAAATATGGGACTATGTGAAAAGACCAAATCTACGTCTGATTGGT
GTACCTGAAAGTGATGTGGAGAATGGAACCAAGTTGGAAAACACTCTGCAGG
ATATTATCCAGGAGAACTTCCCCAATCTAGCAAGGCAGGCCAACGTTCAGAT
TCAGGAAATACAGAGAACGCCACAAAGATACTCCTCGAGAAGAGCAACTCC
AAGACACATAATTGTCAGATTCACCAAAGTTGAAATGAAGGAAAAAATGTTA
AGGGCAGCCAGAGAGAAAGGTCGGGTTACCCTCAAAGGAAAGCCCATCAGA
CTAACAGCGGATCTCTCGGCAGAAACCCTACAAGCCAGAAGAGAGTGGGGG
CCAATATTCAACATTCTTAAAGAAAAGAATTTTCAACCCAGAATTTCATATCC
AGCCAAACTAAGCTTCATAAGTGAAGGAGAAATAAAATACTTTATAGACAAG
CAAATGCTGAGAGATTTTGTCACCACCAGGCCTGCCCTAAAAGAGCTCCTGA
AGGAAGCGCTAAACATGGAAAGGAACAACCGGTACCAGCCGCTGCAAAATC
ATGCCAAAATGTAAAGACCATCGAGACTAGGAAGAAACTGCATCAACTAATG
AGCAAAATCACCAGCTAACATCATAATGACAGGATCAAATTCACACATAACA
ATATTAACTTTAAATATAAATGGACTAAATTCTGCAATTAAAAGACACAGAC
TGGCAAGTTGGATAAAGAGTCAAGACCCATCAGTGTGCTGTATTCAGGAAAC
CCATCTCACGTGCAGAGACACACATAGGCTCAAAATAAAAGGATGGAGGAA
GATCTACCAAGCCAATGGAAAACAAAAAAAGGCAGGGGTTGCAATCCTAGT
CTCTGATAAAACAGACTTTAAACCAACAAAGATCAAAAGAGACAAAGAAGG
CCATTACATAATGGTAAAGGGATCAATTCAACAAGAGGAGCTAACTATCCTA
AATATTTATGCACCCAATACAGGAGCACCCAGATTCATAAAGCAAGTCCTCA
GTGACCTACAAAGAGACTTAGACTCCCACACATTAATAATGGGAGACTTTAA
CACCCCACTGTCAACATTAGACAGATCAACGAGACAGAAAGTCAACAAGGA
TACCCAGGAATTGAACTCAGCTCTGCACCAAGCAGACCTAATAGACATCTAC
AGAACTCTCCACCCCAAATCAACAGAATATACATTTTTTTCAGCACCACACCA
CACCTATTCCAAAATTGACCACATAGTTGGAAGTAAAGCTCTCCTCAGCAAA
TGTAAAAGAACAGAAATTATAACAAACTATCTCTCAGACCACAGTGCAATCA
AACTAGAACTCAGGATTAAGAATCTCACTCAAAGCCGCTCAACTACATGGAA
ACTGAACAACCTGCTCCTGAATGACTACTGGGTACATAACGAAATGAAGGCA
GAAATAAAGATGTTCTTTGAAACCAACGAGAACAAAGACACCACATACCAG
AATCTCTGGGACGCATTCAAAGCAGTGTGTAGAGGGAAATTTATAGCACTAA
ATGCCTACAAGAGAAAGCAGGAAAGATCCAAAATTGACACCCTAACATCAC
AATTAAAAGAACTAGAAAAGCAAGAGCAAACACATTCAAAAGCTAGCAGAA
GGCAAGAAATAACTAAAATCAGAGCAGAACTGAAGGAAATAGAGACACAAA
AAACCCTTCAAAAAATCAATGAATCCAGGAGCTGGTTTTTTGAAAGGATCAA
CAAAATTGATAGACCGCTAGCAAGACTAATAAAGAAAAAAAGAGAGAAGAA
TCAAATAGACACAATAAAAAATGATAAAGGGGATATCACCACCGATCCCACA
GAAATACAAACTACCATCAGAGAATACTACAAACACCTCTACGCAAATAAAC
TAGAAAATCTAGAAGAAATGGATACATTCCTCGACACATACACTCTCCCAAG
ACTAAACCAGGAAGAAGTTGAATCTCTGAATAGACCAATAACAGGCTCTGAA
ATTGTGGCAATAATCAATAGTTTACCAACCAAAAAAGAGTCCAGGACCAGATG
GATTCACAGCCGAATTCTACCAGAGGTACAAGGAGGAACTGGTACCATTCCT
TCTGAAACTATTCCAATCAATAGAAAAAGAGGGAATCCTCCCTAACTCATTTT
ATGAGGCCAGCATCATTCTGATACCAAAGCCGGGCAGAGACACAACCAAAA
AAGAGAATTTTAGACCAATATCCTTGATGAACATTGATGCAAAAATCCTCAA
TAAAATACTGGCAAACCGAATCCAGCAGCACATCAAAAAGCTTATCCACCAT
GATCAAGTGGGCTTCATCCCTGGGATGCAAGGCTGGTTCAATATACGCAAAT
CAATAAATGTAATCCAGCATATAAACAGAGCCAAAGACAAAAACCACATGA
TTATCTCAATAGATGCAGAAAAAGCCTTTGACAAAATTCAACAACCCTTCAT
GCTAAAAACTCTCAATAAATTAGGTATTGATGGGACGTATTTCAAAATAATA
AGAGCTATCTATGACAAACCCACAGCCAATATCATACTGAATGGGCAAAAAC
TGGAAGCATTCCCTTTGAAAACTGGCACAAGACAGGGATGCCCTCTCTCACC
GCTCCTATTCAACATAGTGTTGGAAGTTCTGGCCAGGGCAATCAGGCAGGAG
AAGGAAATAAAGGGTATTCAATTAGGAAAAGAGGAAGTCAAATTGTCCCTGT
TTGCAGACGACATGATTGTTTATCTAGAAAACCCCATCGTCTCAGCCCAAAAT
CTCCTTAAGCTGATAAGCAACTTCAGCAAAGTCTCAGGATACAAAATCAATG
TACAAAAATCACAAGCATTCTTATACACCAACAACAGACAAACAGAGAGCC
AAATCATGGGTGAACTCCCATTCACAATTGCTTCAAAGAGAATAAAATACCT
AGGAATCCAACTTACAAGGGATGTGAAGGACCTCTTCAAGGAGAACTACAAA
CCACTGCTCAAGGAAATAAAAGAGGACACAAACAAATGGAAGAACATTCCA
TGCTCATGGGTAGGAAGAATCAATATCGTGAAAATGGCCATACTGCCCAAGG
TAATTTACAGATTCAATGCCATCCCCATCAAGCTACCAATGACTTTCTTCACA
GAATTGGAAAAAACTACTTTAAAGTTCATATGGAACCAAAAAAGAGCCCGCA
TTGCCAAGTCAATCCTAAGCCAAAAGAACAAAGCTGGAGGCATCACACTACC
TGACTTCAAACTATACTACAAGGCTACAGTAACCAAAACAGCATGGTACTGG
TACCAAAACAGAGATATAGATCAATGGAACAGAACAGAGCCCTCAGAAATA
ATGCCGCATATCTACAACTATCTGATCTTTGACAAACCTGAGAAAAACAAGC
AATGGGGAAAGGATTCCCTATTTAATAAATGGTGCTGGGAAAACTGGCTAGC
CATATGTAGAAAGCTGAAACTGGATCCCTTCCTTACACCTTATACAAAAATCA
ATTCAAGATGGATTAAAGATTTAAACGTTAGACCTAAAACCATAAAAACCCT
AGAAGAAAACCTAGGCATTACCATTCAGGACATAGGCGTGGGCAAGGACTTC
ATGTCCAAAACACCAAAAGCAATGGCAACAAAAGCCAAAATTGACAAATGG
GATCTAATTAAACTAAAGAGCTTCTGCACAGCAAAAGAAACTACCATCAGAG
TGAACAGGCAACCTACAACATGGGAGAAAATTTTCGCAACCTACTCATCTGA
CAAAGGGCTAATATCCAGAATCTACAATGAACTCAAACAAATTTACAAGAAA
AAAACAAACAACCCCATCAAAAAGTGGGCGAAGGACATGAACAGACACTTC
TCAAAAGAAGACATTTATGCAGCCAAAAAACACATGAAGAAATGCTCATCAT
CACTGGCCATCAGAGAAATGCAAATCAAAACCACTATGAGATATCATCTCAC
ACCAGTTAGAATGGCAATCATTAAAAAGTCAGGAAACAACAGGTGCTGGAG
AGGATGTGGAGAAATAGGAACACTTTTACACTGTTGGTGGGACTGTAAACTA
GTTCAACCATTGTGGAAGTCAGTGTGGCGATTCCTCAGGGATCTAGAACTAG
AAATACCATTTGACCCAGCCATCCCATTACTGGGTATATACCCAAAGGACTAT
AAATCATGCTGCTATAAAGACACATGCACACGTATGTTTATTGCGGCACTATT
CACAATAGCAAAGACTTGGAACCAACCCAAATGTCCAACAATGATAGACTGG
ATTAAGAAAATGTGGCACATATACACCATGGAATACTATGCAGCCATAAAAA
ATGATGAGTTCATATCCTTTGTAGGGACATGGATGAAATTGGAAACCATCATT
CTCAGTAAACTATCGCAAGAACAAAAAACCAAACACCGCATATTCTCACTCA
TAGGTGGGAATTGAACAATGAGATCACATGGACACAGGAAGGGGAATATCA
CACTCTGGGGACTGTGGTGGGGTCGGGGGAGGGGGGAGGGATAGCATTGGG
AGATATACCTAATGCTAGATGACACATTAGTGGGTGCAGCGCACCAGCATGG
CACATGTATACATATGTAACTAACCTGCACAATGTGCACATGTACCCTAAAA
CTTAGAGTATAATAAA
SEQ ID NO.34
5’-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3’
SEQ ID NO.35
5′-AGCTTAAAAAGAGAACGCCACAAAGATACTCTCTTGA
AGTATCTTTGTGGCGTTCTCGGG-3′
SEQ ID NO.26
5′-cctattggcg ttactatggg aacatacgtc attattgacg tcaatgggcg
ggggtcgttgggcggtcagc caggcgggcc atttaccgta agttatgtaa cgcggaactc
catatatgggctatgaacta atgagcccgt aattgattac tattagcccg ggcaatgtgc
acatgtaccctaaaacttaa agtataataa agacgtcagg gttcgaaatc gataagcttg
gatcccccgacctcgagggg ggaggccggc aaggccggat ccagacatga taagatacat
tgatgagtttggacaaacca caactagaat gcagtgaaga aaatgcttta tttgtgaaat
ttgtgatgctattgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa
caaaaaaaaaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa aaaaaaaata acttgaagca aataaacaag acgaccaatt
caatgtgctggaacaccgta agtttgcagt ttctgacata taaaatgtgg aggggaccta
tgttaccctaaacctttcca cccactgctt cagctaaagg gtcaatgaag aacaagcttc
ctatgtatcacgtgacagtt ttgggattca ggcactggta aaggcaacag cccttaagtg
atccaagatattttctcttt ttcacattgc aattctatct tggtttatca tggggttctt
gtattttatcaacatcccta ctctgacaga acagacaaaa tgctatagcg atggcatcct
tgtagtgggaagaacagacc acagaccctg agagctatcc tgggtcatcc tcaggaatgt
gtgaaaggtagaaaggatct-3′
SEQ ID NO.27
5′-ggggggagga gccaagatgg ccgaatagga acagctccgg tctacagctc
ccagcgtgagcgacgcagaa gacggtgatt tctgcatttc catctgaggt accgggttca
tctcactagggagtgccaga cagtgggcgc aggccagtgt gtgtgcgcac cgtgcgcgag
ccgaagcagggcgaggcatt gcctcacctg ggaagcgcaa ggggtcaggg agttcccttt
ccgagtcaaagaaaggggtg acggacgcac ctggaaaatc gggtcactcc cacccgaata
ttgcgcttttcagaccggct taagaaacgg cgcaccacga gactatatcc cacacctggc
tcggagggtcctacgcccac ggaatctcgc tgattgctag cacagcagtc tgagatcaaa
ctgcaaggcggcaacgaggc tgggggaggg gcgcccgcca ttgcccaggc ttgcttaggt
aaacaaagcagcagggaagc tcgaactggg tggagcccac cacagctcaa ggaggcctgc
ctgcctctgtaggctccacc tctgggggca gggcacagac aaacaaaaag acagcagtaa
cctctgcagacttaagtgtc cctgtctgac agctttgaag agagcagtgg ttctcccagc
acgcagctggagatctgaga acgggcagac tgcctcctca agtgggtccc tgacccctga
cccccgagcagcctaactgg gaggcacccc ccagcagggg cacactgaca cctcacacgg
cagggtattccaacagacct gcagctgagg gtcctgtctg ttagaaggaa aactaacaac
cagaaaggacatctacaccg aaaacccatc tgtacatcac catcatcaaa gaccaaaagt
agataaaaccacaaagatgg ggaaaaaaca gaacagaaaa actggaaact ctaaaacgca
gagcgcctctcctcctccaa aggaacgcag ttcctcacca gcaacagaac aaagctggat
ggagaatgattttgatgagc tgagagaaga aggcttcaga cgatcaaatt actctgagct
acgggaggacattcaaacca aaggcaaaga agttgaaaac tttgaaaaaa atttagaaga
atgtataactagaataacca atacagagaa gtgcttaaag gagctgatgg agctgaaaac
caaggctcgagaactacgtg aagaatgcag aagcctcagg agccgatgcg atcaactgga
agaaagggtatcagcaatgg aagatgaaat gaatgaaatg aagcgagaag ggaagtttag
agaaaaaagaataaaaagaa atgagcaaag cctccaagaa atatgggact atgtgaaaag
accaaatctacgtctgattg gtgtacctga aagtgatgtg gagaatggaa ccaagttgga
aaacactctgcaggatatta tccaggagaa cttccccaat ctagcaaggc aggccaacgt
tcagattcaggaaatacaga gaacgccaca aagatactcc tcgagaagag caactccaag
acacataattgtcagattca ccaaagttga aatgaaggaa aaaatgttaa gggcagccag
agagaaaggtcgggttaccc tcaaaggaaa gcccatcaga ctaacagcgg atctctcggc
agaaaccctacaagccagaa gagagtgggg gccaatattc aacattctta aagaaaagaa
ttttcaacccagaatttcat atccagccaa actaagcttc ataagtgaag gagaaataaa
atactttatagacaagcaaa tgttgagaga ttttgtcacc accaggcctg ccctaaaaga
gctcctgaaggaagcgctaa acatggaaag gaacaaccgg taccagccgc tgcaaaatca
tgccaaaatgtaaagaccat caagactagg aagaaactgc atcaactaat gagcaaaatc
accagctaacatcataatga caggatcaac ttcacacata acaatattaa ctttaaatat
aaatggactaaattctgcaa ttaaaagaca cagactggca agttggataa agagtcaaga
cccatcagtgtgctgtattc aggaaaccca tctcacgtgc agagacacac ataggctcaa
aataaaaggatggaggaaga tctaccaagc caatggaaaa caaaaaaagg caggggttgc
aatcctagtctctgataaaa cagactttaa accaacaaag atcaaaagag acaaagaagg
ccattacataatggtaaagg gatcaattca acaagaggag ctaactatcc taaatattta
tgcacccaatacaggagcac ccagattcat aaagcaagtc ctcagtgacc tacaaagaga
cttagactcccacacattaa taatgggaga ctttaacacc ccactgtcaa cattagacag
atcaacgagacagaaagtca acaaggatac ccaggaattg aactcagctc tgcaccaagc
agacctaatagacatctaca gaactctcca ccccaaatca acagaatata catttttttc
agcaccacaccacacctatt ccaaaattga ccacatagtt ggaagtaaag ctctcctcag
caaatgtaaaagaacagaaa ttataacaaa ctatctctca gaccacagtg caatcaaact
agaactcaggattaagaatc tcactcaaag ccgctcaact acatggaaac tgaacaacct
gctcctgaatgactactggg tacataacga aatgaaggca gaaataaaga tgttctttga
aaccaacgagaacaaagaca ccacatacca gaatctctgg gacgcattca aagcagtgtg
tagagggaaatttatagcac taaatgccta caagagaaag caggaaagat ccaaaattga
caccctaacatcacaattaa aagaactaga aaagcaagag caaacacatt caaaagctag
cagaaggcaagaaataacta aaatcagagc agaactgaag gaaatagaga cacaaaaaac
ccttcaaaaaatcaatgaat ccaggagctg gttttttgaa aggatcaaca aaattgatag
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tgataaaggggatatcacca ccgatcccac agaaatacaa actaccatca gagaatacta
caaacacctctacgcaaata aactagaaaa tctagaagaa atggatacat tcctcgacac
atacactctcccaagactaa accaggaaga agttgaatct ctgaatcgac caataacagg
ctctgaaattgtggcaataa tcaatagttt accaaccaaa aagagtccag gaccagatgg
attcacagccgaattctacc agaggtacaa ggaggaactg gtaccattcc ttctgaaact
attccaatcaatagaaaaag agggaatcct ccctaactca ttttatgagg ccagcatcat
tctgataccaaagccgggca gagacacaac caaaaaagag aattttagac caatatcctt
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caaaaagcttatccaccatg atcaagtggg cttcatccct gggatgcaag gctggttcaa
tatacgcaaatcaataaatg taatccagca tataaacaga gccaaagaca aaaaccacat
gattatctcaatagatgcag aaaaagcctt tgacaaaatt caacaaccct tcatgctaaa
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caaacccacagccaatatca tactgaatgg gcaaaaactg gaagcattcc ctttgaaaac
cggcacaagacagggatgcc ctctctcacc gctcctattc aacatagtgt tggaagttct
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ccaaaatctccttaagctga taagcaactt cagcaaagtc tcaggataca aaatcaatgt
acaaaaatcacaagcattct tatacaccaa caacagacaa acagagagcc aaatcatggg
tgaactcccattcacaattg cttcaaagag aataaaatac ctaggaatcc aacttacaag
ggatgtgaaggacctcttca aggagaacta caaaccactg ctcaaggaaa taaaagagga
gacaaacaaatggaagaaca ttccatgctc atgggtagga agaatcaata tcgtgaaaat
ggccatactgcccaaggtaa tttacagatt caatgccatc cccatcaagc taccaatgac
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cattgccaagtcaatcctaa gccaaaagaa caaagctgga ggcatcacac tacctgactt
caaactatactacaaggcta cagtaaccaa aacagcatgg tactggtacc aaaacagaga
tatagatcaatggaacagaa cagagccctc agaaataatg ccgcatatct acaactatct
gatctttgacaaacctgaga aaaacaagca atggggaaag gattccctat ttaataaatg
gtgctgggaaaactggctag ccatatgtag aaagctgaaa ctggatccct tccttacacc
ttatacaaaaatcaattcaa gatggattaa agatttaaac gttaaaccta aaaccataaa
aaccctagaagaaaacctag gcattaccat tcaggacata ggcgtgggca aggacttcat
gtccaaaacaccaaaagcaa tggcaacaaa agacaaaatt gacaaatggg atctaattaa
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tgaactcaaacaaatttaca agaaaaaaac aaacaacccc atcaaaaagt gggcgaagga
catgaacagacacttctcaa aagaagacat ttatgcagcc aaaaaacaca tgaagaaatg
ctcatcatcactggccatca gagaaatgca aatcaaaacc actatgagat atcatctcac
accagttagaatggcaatca ttaaaaagtc aggaaacaac aggtgctgga gaggatgcgg
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attactgggtatatacccaa atgagtataa atcatgctgc tataaagaca catgcacacg
tatgtttattgcggcactat tcacaatagc aaagacttgg aaccaaccca aatgtccaac
aatgatagactggattaaga aaatgtggca catatacacc atggaatact atgcagccat
aaaaaatgatgagttcatat cctttgtagg gacatggatg aaattggaaa ccatcattct
cagtaaactatcgcaagaac aaaaaaccaa acaccgcata ttctcactca taggtgggaa
ttgaacaatgagatcacatg gacacaggaa ggggaatatc acactctggg gactgtggtg
gggtcgggggaggggggagg gatagcattg ggagatatac ctaatgctag atgacacatt
agtgggtgcagcgcaccagc atggcacatg tatacatatg taactaacct gcacaatgtg
cacatgtaccctaaaactta gagtataat- 3′(6019)
序列表
<110>高等健康研究院
     E·加拉奇
     P·西尼巴尔迪
<120>治疗中的逆转录转座子抑制
<130>351519D25632CBE
<150>UK 0428522.7
<151>2004-12-30
<150>UK 0428522.7
<151>2004-12-30
<160>47
<170>PatentIn version 3.3
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<212>DNA
<213>人类
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ggcggtcagc caggcgggcc atttaccgta agttatgtaa cgcggaactc catatatggg    120
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cctcgagggg ggaggccggc aaggccggat ccagacatga taagatacat tgatgagttt    300
ggacaaacca caactagaat gcagtgaaga aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct    360
attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caaaaaaaaa    420
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    480
aaaaaaaaaa aaaaaaaata acttgaagca aataaacaag acgaccaatt caatgtgctg    540
gaacaccgta agtttgcagt ttctgacata taaaatgtgg aggggaccta tgttacccta    600
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<211>6019
<212>DNA
<213>人类
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ggggggagga gccaagatgg ccgaatagga acagctccgg tctacagctc ccagcgtgag     60
cgacgcagaa gacggtgatt tctgcatttc catctgaggt accgggttca tctcactagg    120
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cctcctccaa aggaacgcag ttcctcacca gcaacagaac aaagctggat ggagaatgat    1020
tttgatgagc tgagagaaga aggcttcaga cgatcaaatt actctgagct acgggaggac    1080
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agaataacca atacagagaa gtgcttaaag gagctgatgg agctgaaaac caaggctcga    1200
gaactacgtg aagaatgcag aagcctcagg agccgatgcg atcaactgga agaaagggta    1260
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gtcagattca ccaaagttga aatgaaggaa aaaatgttaa gggcagccag agagaaaggt    1620
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caagccagaa gagagtgggg gccaatattc aacattctta aagaaaagaa ttttcaaccc    1740
agaatttcat atccagccaa actaagcttc ataagtgaag gagaaataaa atactttata    1800
gacaagcaaa tgttgagaga ttttgtcacc accaggcctg ccctaaaaga gctcctgaag    1860
gaagcgctaa acatggaaag gaacaaccgg taccagccgc tgcaaaatca tgccaaaatg    1920
taaagaccat caagactagg aagaaactgc atcaactaat gagcaaaatc accagctaac    1980
atcataatga caggatcaac ttcacacata acaatattaa ctttaaatat aaatggacta    2040
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<210>28
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<213>人类
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ggcgctgcct tcctggggtg acggagcagc tggaagcgtt ttcggatcct ggaatcagtg     120
ggcggcctgc gggaggggct gaggcgcctt tccctactca cccggctccg aatccaccgc     180
ggtgctgttt caagcgagtc agattccaga tcgcgctcca gcccggactc ggaattcctg     240
ccccgcgggt ctgcattttc acagcggcag gtgtgagtgc cccgcagctg gagcccagaa     300
acctgaaggc agctcggccc tccccagccc acagcgccgt tattccgttt ctatatcagt     360
aaacacttgt cattttccgt agaccagggc gggatgatgg gtgatcccag tcctcgcagt     420
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cagtctgcga ggagaaaatc acctttgtgc tggtaagtcc aggaatctaa ggcgagtgct     600
gagggagaaa acgtagttga tggctcagag cagaaggggc tggaggtagg gtagaggggg     660
agggctttgg acagaaaaga cctgggagat ttggttgggg aggggcagcc aggcctagac     720
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gtggagggaa gagcttggga ccagcgtcag gagagctggg tccatctccc tctctgcccc    1020
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cgcagtccct ggagttgggg ccctcctttt ttcgggacca ggagctggtg cttcttattg    1920
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cttttaaggt tttaaaaatc attcatatgc tgagaaactt ttaatggtta tttccaaccc    16800
tcccctcttc cctcacagtg aaattgctct tcccacagcc tcccccatct caactggtga    16860
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acccgacatc caatccagca agaattcctg ttggctccac catcatatta catcaagatt    16980
tcagccactt ctcatacctc tgttcagagc cgccatcacc tctgtcctgg atttctaaaa    17040
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gccagagtta ttcttttaaa acataagtca tattgggtca tttatctgct caaaacactg    17160
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caattttatt attctttttc atgtgcaaat ccagctttcc ttgcacaatt tattgaagag    18840
actatttttt ctccatgggt tatctcagta cccatatcaa aattagctgt ccagaaacca    18900
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atccaccatg atcaagtggg cttcatccct gggatgcaag gctggttcaa tatacgcaaa    3720
tcaataaatg taatccagca tataaacaga gccaaagaca aaaaccacat gattatctca    3780
atagatgcag aaaaagcctt tgacaaaatt caacaaccct tcatgctaaa aactctcaat    3840
aaattaggta ttgatgggac gtatttcaaa ataataagag ctatctatga caaacccaca    3900
gccaatatca tactgaatgg gcaaaaactg gaagcattcc ctttgaaaac tggcacaaga    3960
cagggatgcc ctctctcacc gctcctattc aacatagtgt tggaagttct ggccagggca    4020
atcaggcagg agaaggaaat aaagggtatt caattaggaa aagaggaagt caaattgtcc    4080
ctgtttgcag acgacatgat tgtttatcta gaaaacccca tcgtctcagc ccaaaatctc    4140
cttaagctga taagcaactt cagcaaagtc tcaggataca aaatcaatgt acaaaaatca    4200
caagcattct tatacaccaa caacagacaa acagagagcc aaatcatggg tgaactccca    4260
ttcacaattg cttcaaagag aataaaatac ctaggaatcc aacttacaag ggatgtgaag    4320
gacctcttca aggagaacta caaaccactg ctcaaggaaa taaaagagga cacaaacaaa    4380
tggaagaaca ttccatgctc atgggtagga agaatcaata tcgtgaaaat ggccatactg    4440
cccaaggtaa tttacagatt caatgccatc cccatcaagc taccaatgac tttcttcaca    4500
gaattggaaa aaactacttt aaagttcata tggaaccaaa aaagagcccg cattgccaag    4560
tcaatcctaa gccaaaagaa caaagctgga ggcatcacac tacctgactt caaactatac    4620
tacaaggcta cagtaaccaa aacagcatgg tactggtacc aaaacagaga tatagatcaa    4680
tggaacagaa cagagccctc agaaataatg ccgcatatct acaactatct gatctttgac    4740
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ctaaaactta gagtataata aa                                             6022
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<212>RNA
<213>人工序列
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<212>PRT
<213>人类
<400>45
Met Gly Lys Lys Gln Asn Arg Lys Thr Gly Asn Ser Lys Thr Gln Ser
1               5                   10                  15
Ala Ser Pro Pro Pro Lys Glu Arg Ser Ser Ser Pro Ala Thr Glu Gln
            20                  25                  30
Ser Trp Met Glu Asn Asp Phe Asp Glu Leu Arg Glu Glu Gly Phe Arg
        35                  40                  45
Arg Ser Asn Tyr Ser Glu Leu Arg Glu Asp Ile Gln Thr Lys Gly Lys
    50                  55                  60
Glu Val Glu Asn Phe Glu Lys Asn Leu Glu Glu Cys Ile Thr Arg Ile
65                  70                  75                  80
Thr Asn Thr Glu Lys Cys Leu Lys Glu Leu Met Glu Leu Lys Thr Lys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Leu Arg Glu Glu Cys Arg Ser Leu Arg Ser Arg Cys Asp
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Gln Leu Glu Glu Arg Val Ser Ala Met Glu Asp Glu Met Asn Glu Met
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Lys Arg Glu Gly Lys Phe Arg Glu Lys Arg Ile Lys Arg Asn Glu Gln
    130                 135                 140
Ser Leu Gln Glu Ile Trp Asp Tyr Val Lys Arg Pro Asn Leu Arg Leu
145                 150                 155                 160
Ile Gly Val Pro Glu Ser Asp Val Glu Asn Gly Thr Lys Leu Glu Asn
                165                 170                 175
Thr Leu Gln Asp Ile Ile Gln Glu Asn Phe Pro Asn Leu Ala Arg Gln
            180                 185                 190
Ala Asn Val Gln Ile Gln Glu Ile Gln Arg Thr Pro Gln Arg Tyr Ser
        195                 200                 205
Ser Arg Arg Ala Thr Pro Arg His Ile Ile Val Arg Phe Thr Lys Val
    210                 215                 220
Glu Met Lys Glu Lys Met Leu Arg Ala Ala Arg Glu Lys Gly Arg Val
225                 230                 235                 240
Thr Leu Lys Gly Lys Pro Ile Arg Leu Thr Ala Asp Leu Ser Ala Glu
                245                 250                 255
Thr Leu Gln Ala Arg Arg Glu Trp Gly Pro Ile Phe Asn Ile Leu Lys
            260                 265                 270
Glu Lys Asn Phe Gln Pro Arg Ile Ser Tyr Pro Ala Lys Leu Ser Phe
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Ile Ser Glu Gly Glu Ile Lys Tyr Phe Ile Asp Lys Gln Met Leu Arg
    290                 295                 300
Asp Phe Val Thr Thr Arg Pro Ala Leu Lys Glu Leu Leu Lys Glu Ala
305                 310                 315                 320
Leu Asn Met Glu Arg Asn Asn Arg Tyr Gln Pro Leu Gln Asn His Ala
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Lys Met
<210>46
<211>1275
<212>PRT
<213>人类
<400>46
Met Thr Gly Ser Thr Ser His Ile Thr Ile Leu Thr Leu Asn Ile Asn
1               5                   10                  15
Gly Leu Asn Ser Ala Ile Lys Arg His Arg Leu Ala Ser Trp Ile Lys
            20                  25                  30
Ser Gln Asp Pro Ser Val Cys Cys Ile Gln Glu Thr His Leu Thr Cys
        35                  40                  45
Arg Asp Thr His Arg Leu Lys Ile Lys Gly Trp Arg Lys Ile Tyr Gln
    50                  55                  60
Ala Asn Gly Lys Gln Lys Lys Ala Gly Val Ala Ile Leu Val Ser Asp
65                  70                  75                  80
Lys Thr Asp Phe Lys Pro Thr Lys Ile Lys Arg Asp Lys Glu Gly His
                85                  90                  95
Tyr Ile Met Val Lys Gly Ser Ile Gln Gln Glu Glu Leu Thr Ile Leu
            100                 105                 110
Asn Ile Tyr Ala Pro Asn Thr Gly Ala Pro Arg Phe Ile Lys Gln Val
        115                 120                 125
Leu Ser Asp Leu Gln Arg Asp Leu Asp Ser His Thr Leu Ile Met Gly
    130                 135                 140
Asp Phe Asn Thr Pro Leu Ser Thr Leu Asp Arg Ser Thr Arg Gln Lys
145                 150                 155                 160
Val Asn Lys Asp Thr Gln Glu Leu Asn Ser Ala Leu His Gln Ala Asp
                165                 170                 175
Leu Ile Asp Ile Tyr Arg Thr Leu His Pro Lys Ser Thr Glu Tyr Thr
            180                 185                 190
Phe Phe Ser Ala Pro His His Thr Tyr Ser Lys Ile Asp His Ile Val
        195                 200                 205
Gly Ser Lys Ala Leu Leu Ser Lys Cys Lys Arg Thr Glu Ile Ile Thr
    210                 215                 220
Asn Tyr Leu Ser Asp His Ser Ala Ile Lys Leu Glu Leu Arg Ile Lys
225                 230                 235                 240
Asn Leu Thr Gln Ser Arg Ser Thr Thr Trp Lys Leu Asn Asn Leu Leu
                245                 250                 255
Leu Asn Asp Tyr Trp Val His Asn Glu Met Lys Ala Glu Ile Lys Met
            260                 265                 270
Phe Phe Glu Thr Asn Glu Asn Lys Asp Thr Thr Tyr Gln Asn Leu Trp
        275                 280                 285
Asp Ala Phe Lys Ala Val Cys Arg Gly Lys Phe Ile Ala Leu Asn Ala
    290                 295                 300
Tyr Lys Arg Lys Gln Glu Arg Ser Lys Ile Asp Thr Leu Thr Ser Gln
305                 310                 315                 320
Leu Lys Glu Leu Glu Lys Gln Glu Gln Thr His Ser Lys Ala Ser Arg
                325                 330                 335
Arg Gln Glu Ile Thr Lys Ile Arg Ala Glu Leu Lys Glu Ile Glu Thr
            340                 345                 350
Gln Lys Thr Leu Gln Lys Ile Asn Glu Ser Arg Ser Trp Phe Phe Glu
        355                 360                 365
Arg Ile Asn Lys Ile Asp Arg Pro Leu Ala Arg Leu Ile Lys Lys Lys
    370                 375                 380
Arg Glu Lys Asn Gln Ile Asp Thr Ile Lys Asn Asp Lys Gly Asp Ile
385                 390                 395                 400
Thr Thr Asp Pro Thr Glu Ile Gln Thr Thr Ile Arg Glu Tyr Tyr Lys
                405                 410                 415
His Leu Tyr Ala Asn Lys Leu Glu Asn Leu Glu Glu Met Asp Thr Phe
            420                 425                 430
Leu Asp Thr Tyr Thr Leu Pro Arg Leu Asn Gln Glu Glu Val Glu Ser
        435                 440                 445
Leu Asn Arg Pro Ile Thr Gly Ser Glu Ile Val Ala Ile Ile Asn Ser
    450                 455                 460
Leu  Pro Thr Lys Lys Ser Pro Gly Pro Asp Gly Phe Thr Ala Glu Phe
465                 470                 475                 480
Tyr Gln Arg Tyr Lys Glu Glu Leu Val Pro Phe Leu Leu Lys Leu Phe
                485                 490                 495
Gln Ser Ile Glu Lys Glu Gly Ile Leu Pro Asn Ser Phe Tyr Glu Ala
            500                 505                 510
Ser Ile Ile Leu Ile Pro Lys Pro Gly Arg Asp Thr Thr Lys Lys Glu
        515                 520                 525
Asn Phe Arg Pro Ile Ser Leu Met Asn Ile Asp Ala Lys Ile Leu Asn
    530                 535                 540
Lys Ile Leu Ala Asn Arg Ile Gln Gln His Ile Lys Lys Leu Ile His
545                 550                 555                 560
His Asp Gln Val Gly Phe Ile Pro Gly Met Gln Gly Trp Phe Asn Ile
                565                 570                 575
Arg Lys Ser Ile Asn Val Ile Gln His Ile Asn Arg Ala Lys Asp Lys
            580                 585                 590
Asn His Met Ile Ile Ser Ile Asp Ala Glu Lys Ala Phe Asp Lys Ile
        595                 600                 605
Gln Gln Pro Phe Met Leu Lys Thr Leu Asn Lys Leu Gly Ile Asp Gly
    610                 615                 620
Thr Tyr Phe Lys Ile Ile Arg Ala Ile Tyr Asp Lys Pro Thr Ala Asn
625                 630                 635                 640
Ile Ile Leu Asn Gly Gln Lys Leu Glu Ala Phe Pro Leu Lys Thr Gly
                645                 650                 655
Thr Arg Gln Gly Cys Pro Leu Ser Pro Leu Leu Phe Asn Ile Val Leu
            660                 665                 670
Glu Val Leu Ala Arg Ala Ile Arg Gln Glu Lys Glu Ile Lys Gly Ile
        675                 680                 685
Gln Leu Gly Lys Glu Glu Val Lys Leu Ser Leu Phe Ala Asp Asp Met
    690                 695                 700
Ile Val Tyr Leu Glu Asn Pro Ile Val Ser Ala Gln Asn Leu Leu Lys
705                 710                 715                 720
Leu Ile Ser Asn Phe Ser Lys Val Ser Gly Tyr Lys Ile Asn Val Gln
                725                 730                 735
Lys Ser Gln Ala Phe Leu Tyr Thr Asn Asn Arg Gln Thr Glu Ser Gln
            740                 745                 750
Ile Met Gly Glu Leu Pro Phe Thr Ile Ala Ser Lys Arg Ile Lys Tyr
        755                 760                 765
Leu Gly Ile Gln Leu Thr Arg Asp Val Lys Asp Leu Phe Lys Glu Asn
    770                 775                 780
Tyr Lys Pro Leu Leu Lys Glu Ile Lys Glu Glu Thr Asn Lys Trp Lys
785                 790                 795                 800
Asn Ile Pro Cys Ser Trp Val Gly Arg Ile Asn Ile Val Lys Met Ala
                805                 810                 815
Ile Leu Pro Lys Val Ile Tyr Arg Phe Asn Ala Ile Pro Ile Lys Leu
            820                 825                 830
Pro Met Thr Phe Phe Thr Glu Leu Glu Lys Thr Thr Leu Lys Phe Ile
        835                 840                 845
Trp Asn Gln Lys Arg Ala Arg Ile Ala Lys Ser Ile Leu Ser Gln Lys
    850                 855                 860
Asn Lys Ala Gly Gly Ile Thr Leu Pro Asp Phe Lys Leu Tyr Tyr Lys
865                 870                 875                 880
Ala Thr Val Thr Lys Thr Ala Trp Tyr Trp Tyr Gln Asn Arg Asp Ile
                885                 890                 895
Asp Gln Trp Asn Arg Thr Glu  Pro Ser Glu Ile Met Pro His Ile Tyr
            900                 905                 910
Asn Tyr Leu Ile Phe Asp Lys Pro Glu Lys Asn Lys Gln Trp Gly Lys
        915                 920                 925
Asp Ser Leu Phe Asn Lys Trp Cys Trp Glu Asn Trp Leu Ala Ile Cys
    930                 935                 940
Arg Lys Leu Lys Leu Asp Pro Phe Leu Thr Pro Tyr Thr Lys Ile Asn
945                 950                 955                 960
Ser Arg Trp Ile Lys Asp Leu Asn Val Lys Pro Lys Thr Ile Lys Thr
                965                 970                 975
Leu Glu Glu Asn Leu Gly Ile Thr Ile Gln Asp Ile Gly Val Gly Lys
            980                 985                 990
Asp Phe Met Ser Lys Thr Pro Lys  Ala Met Ala Thr Lys  Asp Lys Ile
        995                 1000                1005
Asp Lys  Trp Asp Leu Ile Lys  Leu Lys Ser Phe Cys  Thr Ala Lys
    1010                 1015                 1020
Glu Thr  Thr Ile Arg Val Asn  Arg Gln Pro Thr Thr  Trp Glu Lys
    1025                 1030                 1035
Ile Phe  Ala Thr Tyr Ser Ser  Asp Lys Gly Leu Ile  Ser Arg Ile
    1040                 1045                 1050
Tyr Asn  Glu Leu Lys Gln Ile  Tyr Lys Lys Lys Thr  Asn Asn Pro
    1055                 1060                 1065
Ile Lys  Lys Trp Ala Lys Asp  Met Asn Arg His Phe  Ser Lys Glu
    1070                 1075                 1080
Asp Ile  Tyr Ala Ala Lys Lys  His Met Lys Lys Cys  Ser Ser Ser
    1085                 1090                 1095
Leu Ala  Ile Arg Glu Met Gln  Ile Lys Thr Thr Met  Arg Tyr His
    1100                 1105                 1110
Leu Thr  Pro Val Arg Met Ala  Ile Ile Lys Lys Ser  Gly Asn Asn
    1115                 1120                 1125
Arg Cys  Trp Arg Gly Cys Gly  Glu Ile Gly Thr Leu  Leu His Cys
    1130                 1135                 1140
Trp Trp  Asp Cys Lys Leu Val  Gln Pro Leu Trp Lys  Ser Val Trp
    1145                 1150                 1155
Arg Phe  Leu Arg Asp Leu Glu  Leu Glu Ile Pro Phe  Asp Pro Ala
    1160                 1165                 1170
Ile Pro  Leu Leu Gly Ile Tyr  Pro Asn Glu Tyr Lys  Ser Cys Cys
    1175                 1180                 1185
Tyr Lys  Asp Thr Cys Thr Arg  Met Phe Ile Ala Ala  Leu Phe Thr
    1190                 1195                 1200
Ile Ala  Lys Thr Trp Asn Gln  Pro Lys Cys Pro Thr  Met Ile Asp
    1205                 1210                 1215
Trp Ile  Lys Lys Met Trp His  Ile Tyr Thr Met Glu  Tyr Tyr Ala
    1220                 1225                 1230
Ala Ile  Lys Asn Asp Glu Phe  Ile Ser Phe Val Gly  Thr Trp Met
    1235                 1240                 1245
Lys Leu  Glu Thr Ile Ile Leu  Ser Lys Leu Ser Gln  Glu Gln Lys
    1250                 1255                 1260
Thr Lys  His Arg Ile Phe Ser  Leu Ile Gly Gly Asn
    1265                 1270                 1275
<210>47
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>RNAi
<400>47
aagagcaacu ccaagacaca u    21

Claims (6)

1.RNAi分子,所述的RNAi分子识别至少一个LINE-1重复元件的一部分,其中所述的RNAi分子选自:
a)由序列SEQ ID NO.19,或其RNA等同物SEQ ID NO.47组成的短干扰RNA,或
b)序列SEQ ID NO:35的短发夹RNA,适于通过短发夹表达载体方法来给药。
2.一种短发夹表达载体,其包括序列SEQ ID NO:35的短发夹RNA。
3.根据权利要求2的短发夹表达载体,其中该表达载体为包含编码序列SEQ ID NO:35的短发夹RNA的DNA构建体的逆转录病毒或腺病毒载体。
4.根据权利要求2的短发夹表达载体,其中该表达载体为包括编码序列SEQ ID NO:35的短发夹RNA的DNA构建体的质粒。
5.如权利要求1所述的RNAi分子或权利要求2至4任一项所述的短发夹表达载体在制备治疗表达LINE-1的癌症的药物中的用途。
6.多核苷酸序列的用途,该序列编码如权利要求1所述的RNAi分子,在制造用于治疗表达LINE-1的癌症的药物中应用。
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