JP5442203B2 - 治療におけるレトロトランスポゾン阻害 - Google Patents
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Description
5’−AGAAATGAGCAAAGCCTCCA−3’(配列番号20);
5’−GCCTGGTGGTGACAAAATCT−3’(配列番号21);および
5’−TAAGGGCAGCCAGAGAGAAA−3’(配列番号24)。
5’−TCCAGCAGCACATCAAAAAG−3’(配列番号22);
5’−CCAGTTTTTGCCCATTCAGT−3’(配列番号23);および
5’−TGACAAACCCACAGCCAATA−3’(配列番号25)。
5’−AGAAAUGAGCAAAGCCUCCA−3’(配列番号39);
5’−GCCUGGUGGUGACAAAAUCU−3’(配列番号40);および
5’−UAAGGGCAGCCAGAGAGAAA−3’(配列番号41)であり、
5’−UCCAGCAGCACAUCAAAAAG−3’(配列番号42);
5’−CCAGUUUUUGCCCAUUCAGU−3’(配列番号43);および
5’−UGACAAACCCACAGCCAAUA−3’(配列番号44)である。
方法
細胞培養物
ヒトA−375黒色腫(ATCC−CRL−1619)、TVM−A12一次黒色腫由来(20)、HT29腺癌(ATCC HTB−38)、H69小細胞肺癌(SCLC)(ATCC HTB119)およびPC3前立腺癌(ATCC CRL−1435)細胞系を、104〜5×104細胞/ウェルの密度にて6ウェルプレートに播種し、10%ウシ胎仔血清を含むDMEMまたはRPMI1640内で培養した。ネビラピン(Nevirapine)およびエファビレンツ(Efavirenz)を、上述のような市販のビラミューン(Viramune)(Boehringer-Ingelheim)およびサスティバ(Sustiva)(Bristol-Myers Squibb)から精製した(18)。薬剤をジメチルスルホキシド(DMSO)(Sigma-Aldrich)中でそれぞれ350μMおよび15μMとし、播種から5時間後に細胞に添加した。対照には、同じDMSO容積(最終濃度0.2%)を添加した。48時間ごとに新鮮なRT阻害剤含有培地に交換した。細胞を96時間ごとに回収し、Burkerチャンバ内でカウントし(2回のカウント/試料)、同じ密度にて再プレーティングした。
回収直前の30分間に、BrdU(20μM)を培養物に添加した。次いで、回収した細胞を抗BrdU抗体およびヨウ化プロピディウム(PI)で処理し、FACStar Plusフローサイトメーター(Beckton-Dickinson)においてDNA含量とBrdU取り込みとの二重パラメータ(biparametric)分析に供した。DAPI(核形態学)、PI(細胞浸透性)および3,3ジヘキシルオキサカルボシアニン[DiOC6(3)]、ミトコンドリア膜電位用蛍光プローブによる複合染色後、顕微鏡で細胞死を評価した。
A−375およびTVM−A12細胞を4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、PBS中の0.2%Triton−X100において5分間浸透化した。マウスモノクローナル抗ウシα−チューブリン(Molecular Probes, A-11126)をAlexa Fluor 488−結合二次抗体(Molecular Probes, cat. A-11001)によって顕在化し、0.1mg/mlのリボヌクレアーゼAの存在下、2μg/mlのPIで核を染色した。アルゴン/クリプトンレーザー(励起波長および発光波長:Alexa488の場合488nmおよび510nm、PIの場合568nmおよび590nm)を備えた共焦点Leica TCS 4D顕微鏡下で撮像した。共焦点区域は、0.5〜1μm間隔で設けた。
A−375およびTVM−A12細胞を、0.1M Millonig’sリン酸塩緩衝液中の2.5%グルタルアルデヒドで固定した。洗浄後、細胞をMPB中の1%OsO4(1時間、4℃)でポスト固定し、高アセトン濃度で脱水した。液体CO2を用いて試料を臨界点乾燥させ、金でスパッタコーティングし、Stereoscan240走査電子顕微鏡(Cambridge Instr.(英国、ケンブリッジ(Cambidge, UK)))上で検査した。
RNA抽出およびRNaseを含まないDNase Iによる処理は(18)に記載される通りに行った。300ngのRNA、オリゴ(dT)およびThermoscriptシステム(Invitrogen)を用いてcDNAを合成した。最初の工程は94℃で2分間、続いて94℃で30秒、58℃〜62℃で30秒、72℃で1分間のサイクルにて、Platinum Taq DNA Polymeraseキット(Invitrogen)および30pmolのオリゴヌクレオチド(MWG-Biotech、ドイツ、エーベルスベルグ(Ebersberg, Germany))を用いて反応混合物の1/25を増幅した。
C−myc PCR産物のサイズ:633bp;
F,5’−gtcacacccttctcccttcg−3’(配列番号1);
R,5’−tgtgctgatgtgtggagacg−3’(配列番号2);
INT,5’−agagaagctggcctcctacc−3’(配列番号3);
F,5’−ggtgccacctgtggtccacctg−3’(配列番号4);
R,5’−cttcacttgtggcccagatagg−3’(配列番号5);
INT,5’−ctgaagagctcctccaccac−3’(配列番号6);
F,5’−ctcctctcctggcctcagaa−3’(配列番号7);
R,5’−tactgctgcttggcctcaaa−3’(配列番号8);
INT,5’−gaacgcattgccacatacac−3’(配列番号9);
F,5’−ttgtcttcctcaccctgtcc−3’(配列番号10);
R,5’−agcacacagcatgaacttgg−3’(配列番号11);
INT,5’−ccacacccgctctacgatat−3’(配列番号12);
F,5’−ccctcggtgtcctacttcaa−3’(配列番号13);
R,5’−tcctcctcttcctcctcctc−3’(配列番号14);
INT,5’−cgcacgatttcattgaacac−3’(配列番号15);
F,5’−aggggtctacatggcaactg−3’(配列番号16);
R,5’−acccagaagactgtggatgg−3’(配列番号17);
INT,5’−gtcagtggtggacctgacct−3’(配列番号18)。
Bruhaらの文献(21)に記載される高度に活性なLINE−1因子のコンセンサス配列を標的とするべく、A21−nt二本鎖siRNAオリゴヌクレオチド(L1−I)(5’−AAGAGCAACTCCAAGACACAT−3’(配列番号19))を設計した。具体的に、以下の配列を標的とした:
F,5’−AGAAATGAGCAAAGCCTCCA−3’(配列番号20);
R,5’−GCCTGGTGGTGACAAAATCT−3’(配列番号21)
F,5’−TCCAGCAGCACATCAAAAAG−3’(配列番号22);
R,5’−CCAGTTTTTGCCCATTCAGT−3’(配列番号23)。
欧州連合ガイドラインに従って保有された5週齢の無胸腺ヌードマウス(イタリア、ハーラン(Harlan, Italy))に、100μlのPBS中のA−375黒色腫(4x106)、H−69(107)、PC3(2x106)およびHT−29(106)細胞を皮下接種した。生理溶液で1:1に新たに希釈したDMSO中の4mg/mlのストックを用いて、エファビレンツ(20mg/kg)を週に5日、毎日マウスに皮下注射した。対照には50%DMSOを注射した。治療は、腫瘍の移植から1日後または1週間後に開始し、幾つかの実験においては14日後に中断した。キャリパー測定により腫瘍の増殖を一日おきにモニタリングし、以下の式を用いて体積を計算した:
長さ×幅×高さ×0.52 (22)。
RTコードLINE−1ファミリーを標的としたRNA干渉(RNAi)は、黒色腫細胞において増殖を低下させ、分化を促進する
以下に論じるように、医薬RT阻害剤に反応して観察された増殖率の低下および分化の誘発が、実際に、細胞RTの特異的な阻害に起因するかどうかを究明しようとした。これに対処すべく、ヒト細胞において最も豊富に発現することが知られているLINE−1因子のサブファミリー(21個、および上述の「方法」の対応する部分に記載される標的配列)を特異的標的とするようにRNAi実験を設計した。
また、広く使用されている2つのRT阻害剤、すなわちネビラピンおよびエファヴィレンツに長期間曝露したヒト形質転換細胞系の反応を調査した。A−375黒色腫、PC3前立腺癌およびTVM−A12一次黒色腫由来細胞系からの培養物を継代培養し、カウントし、少なくとも20日間(96時間周期を5回)連続的に薬剤を再添加しつつ96時間ごとに再プレーティングした。図1Aに示すように、これらの阻害剤はいずれも、全ての細胞系において細胞の増殖を効果的に低下させ、長期間の曝露中に安定な阻害効果を呈する。増殖の阻害は可逆的であった。RT阻害剤を除去すると、全ての細胞系は1回または2回の96時間周期中、対照と同程度の比率で増殖を再開した。薬剤の再添加により、全ての細胞系において再び増殖が阻害された。故に、RT阻害に関連する細胞増殖の低下は、細胞分裂を通じての永続的変化として継承したものではない。
黒色腫は、治療に対して最も耐性が高いので、RT阻害剤が細胞増殖の低下に付随する分化を誘発するかどうかを解明するのに適切であった。まず、幾つかの分化誘導因子に反応して、典型的な樹状表現型を取得することができるA−375黒色腫細胞を試験した(23)。図2Aに示すように、細胞の形状によって示された形態的分化(樹状伸長および接着性の増加)は、DMSOで処理した対照(a)と比べて、ネビラピン(d)またはエファビレンツ(g)への曝露から4〜5日の間に明らかとなった。走査電子顕微鏡(SEM)により、ネビラピン(e)およびエファビレンツ(h)を用いて培養したA−375細胞は、処理していない対照(b)と比べて平坦化しており、基質に密着する伸長した樹状伸長を呈していた。α−チューブリン免疫染色後の共焦点顕微鏡検査により、更に、対照(c)とは異なり、RT阻害細胞(f−i)における成長した樹状突起の長さ全体にわたって微小管アレイが再編成され、ここでは短い微小管が核形成中心の周りに集中していることが判明した。
増殖および分化を含む形質転換細胞の重要な特徴がRT阻害によって調節されるので、RT阻害剤が腫瘍増殖に拮抗する能力をin vivoでテストした。
また、形質転換細胞をエファビレンツで事前処理したときに、生成された異種移植片の腫瘍形成能が調節されるかどうかを調査した。PC3前立腺癌細胞を、2回の96時間周期(PSAおよびAR遺伝子を誘導するに十分な時間)の間、20μMのエファビレンツを用いて培養し(図3B)、次いでヌードマウスに接種した。
この研究は、癌に関与するヒトゲノムの3つの特徴を強調している。第一に、LINE−1因子は、細胞分化および増殖の制御に関与する機構の活性成分として同定される。第二に、LINE−1因子のRNAi依存型の不活性化、またはそれらがコードする内因性RT活性の薬理学的阻害は、形質転換細胞におけるこれらの特色の制御を回復させることができる。第三に、RT阻害剤は、動物モデルにおける腫瘍の増殖をin vivoで低下させる。
A)LINE−1標的siRNAを発現するDNA構築物のクローニング
siRNA標的配列は、ヒト細胞において高度に活性であることが知られているLINE−1因子に由来していた(Brouha et al., 2003, supplementary material)。標的配列は60bp長(1492〜1552)であって、配列番号35で表され、二本鎖DNAとして人工的に合成された。次いで、市販のベクターpSuper.retro.neo+GFPにおいて、DNAオリゴヌクレオチドをクローニングした(OligoEngine, USA, cat.#VEC-PRT-0006)。
次に、レトロウイルス産生Phi−NX細胞(ATCCから入手)内で構築物をトランスフェクトし、新たに合成したレトロウイルス粒子内にパッケージし、細胞から培地内へ自然発生的に放出させた。トランスフェクションから48時間後、レトロウイルス粒子(pS−L1iと呼ぶ)を遠心分離によって収集し、0.45マイクロメートルのMilliporeフィルタを用いて濾過し、細胞感染に使用した。このプロトコルは、製造業者の推奨(OligoEngine)に従って行った。
トランスフェクト細胞の上澄みと、細胞培養物とを単純に混合し、24時間インキュベーションすることによって、A375(黒色腫)およびPC3(前立腺癌)ヒト細胞系をpS−Lliに感染させた。次いで、ネオマイシンの存在下、7日間トランスフェクト細胞を選択した。全てのネオ耐性細胞がGFPレポーター遺伝子の発現に対して陽性であることが判明した。対照として、同じ細胞系からの平行培養物を、siRNAコード配列を持たない空のDNAベクター(pS)を含有するレトロウイルス粒子に感染させた。
pS−Lli細胞の腫瘍形成能が影響を受けたかどうかを評価するために、pSベクターまたはLINE−1ノックアウトpS−L1i構築物に感染させた5×106 A375細胞を、2群の無胸腺ヌードマウスに皮内接種した(感染から15日後)。次いで、両マウス群において腫瘍の進行をモニタリングした。図8のパネルAは、A375 pSおよびA375 pS−L1i細胞を接種されたマウスにおける腫瘍増殖の進行を示している。パネルBにおける例は、対照細胞を接種されたマウスと比べて、LINE−1感染細胞を接種されたマウスでは腫瘍の増殖が著しく低下したことを示している。
NCBIアクセッション番号AF148856、http://www.ncbi.nig.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=5070620で入手可能および以下に記載:
Claims (6)
- 少なくとも1つのLINE−1(L1)反復因子のORF1の転写領域の15ヌクレオチド以上の伸張部を含むRNA分子を含んでなる、癌を治療するための医薬組成物であって、該RNA分子が、
(a)配列番号47で表される配列からなる短鎖干渉RNA(siRNA)、および
(b)siRNA発現ベクターによる投与に適合する、配列番号35で表される配列からなる短鎖ヘアピンRNA
から選択されるものである、医薬組成物。 - 前記RNA分子が配列番号47で表される配列を有する、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記RNA分子が配列番号35で表される配列からなる、請求項1に記載の医薬組成物。
- 発現ベクターが、前記siRNAをコードするDNA構築物を含んでなるレトロウイルスまたはアデノウイルス起源のものである、請求項1に記載の医薬組成物。
- 発現ベクターが、前記siRNAをコードするDNA構築物を含んでなるプラスミドである、請求項1に記載の医薬組成物。
- 少なくとも1つのLINE−1(L1)反復因子のORF1の転写領域の15ヌクレオチド以上の伸張部を含むRNA分子をコードするポリヌクレオチドを含んでなる、癌性病変を治療するための医薬組成物であって、前記RNA分子が、siRNA発現ベクターによる投与に適合する、配列番号35で表される配列からなる短鎖ヘアピンRNAである、医薬組成物。
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