JP2024515654A - H-1 PV発現RNAiエフェクター - Google Patents
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Abstract
本発明は、RNAiエフェクター、好ましくは改良された抗がん活性を示すPD-L1遺伝子に対するshRNAを発現する、革新的なプロトパルボウイルス(PV)に関する。これらの新しいウイルスは、NS領域内のインフレーム欠失(ΔH-1PV)を特色とし、shRNAの発現がH-1ポリメラーゼIIIプロモーターによって制御されるshRNA発現カセットを宿す、プロトパルボウイルスH-1PVからなるΔH-1PVサイレンタープラットフォームに基づく。本発明において、本発明者らは、ΔH-1PVサイレンサーを使用してPD-L1遺伝子をサイレンシングすることを狙いとした。PD1/PD-L1はT細胞媒介性免疫応答の負の制御をし、腫瘍が抗原特異的T細胞免疫応答を避けるメカニズムとして働く。本発明はまた、該パルボウイルスを含む細胞又は生物を提供する。
Description
本発明は、RNAiエフェクター、好ましくはshRNAを発現する、革新的なプロトパルボウイルス(protoparvovirus)(PV)に関する。これらの新しいウイルスは、NS領域内のインフレーム欠失(ΔH-1PV)を特色とし、RNA発現カセット、好ましくはRNAの発現がPol III H-1プロモーターによって制御されるshRNAカセットを宿す、プロトパルボウイルスH-1PVからなるΔH-1PVサイレンタープラットフォームに基づく。本発明はまた、該パルボウイルスを含む細胞又は生物を提供する。
RNA干渉、RNAiエフェクター及び送達
RNA干渉(RNAi)は、Andrew Fire及びCraig Melloによってカエノラブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)で最初に認められ、彼らは後にその発見について1998年にノーベル賞を受賞した。RNAiのメカニズムは、標的配列に相補的な二本鎖RNAによる、宿主mRNAの配列特異的分解に基づく。RNAiは、遺伝子発現を制御する、自然に存在する細胞プロセスであり、それゆえに発生を含む多くの細胞プロセスにおいて中心的役割を果たす[1]。これはまた、細胞をウイルス及びトランスポゾンのような病原体から守る免疫応答の、極めて重要な成分でもある[2]。その発見のすぐ後に、その高い特異性及び既知の遺伝子配列の強力なノックダウンを達成する能力のおかげで、生物学的な疑問、及び疾患の処置選択に取り組むためにRNAi技術が利用された[3]。治療的に、RNAiは、マイクロRNA(miRNA)模倣物、低分子干渉RNA(siRNA)、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)及びダイサー基質低分子干渉RNA(dsiRNA)を含む低分子RNA二本鎖の送達を介して働く[4]。4つ全ての種類のRNAiエフェクターが、現在、複数のタイプのがんを含む種々の疾患に対する多数の第I相~第III相臨床試験で試験されている[5]。特に、RNA干渉(RNAi)は、RNAが遺伝子発現をサイレンシングするプロセスである。これは、二本鎖RNAをより小さい断片に切断する、ダイサー酵素によって開始される。パッセンジャー鎖は更に断片化され、ガイド鎖はRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に積み込まれる。ガイド鎖は標的mRNA、及びRISCの触媒活性成分として働くタンパク質であるArgonature-2と対を形成し、mRNAを切断する。典型的には、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)はプラスミドを通して加えられる。shRNAは核でのプロセシングを受けて、細胞質に輸送され、そこでshRNAは、ダイサー基質低分子RNA(dsiRNA)と共に低分子干渉RNA(siRNA)にプロセシングされる。shRNAはRISCを介してmRNA中の特異的配列に結合する。これにより、mRNAの分解がもたらされる。
RNA干渉(RNAi)は、Andrew Fire及びCraig Melloによってカエノラブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)で最初に認められ、彼らは後にその発見について1998年にノーベル賞を受賞した。RNAiのメカニズムは、標的配列に相補的な二本鎖RNAによる、宿主mRNAの配列特異的分解に基づく。RNAiは、遺伝子発現を制御する、自然に存在する細胞プロセスであり、それゆえに発生を含む多くの細胞プロセスにおいて中心的役割を果たす[1]。これはまた、細胞をウイルス及びトランスポゾンのような病原体から守る免疫応答の、極めて重要な成分でもある[2]。その発見のすぐ後に、その高い特異性及び既知の遺伝子配列の強力なノックダウンを達成する能力のおかげで、生物学的な疑問、及び疾患の処置選択に取り組むためにRNAi技術が利用された[3]。治療的に、RNAiは、マイクロRNA(miRNA)模倣物、低分子干渉RNA(siRNA)、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)及びダイサー基質低分子干渉RNA(dsiRNA)を含む低分子RNA二本鎖の送達を介して働く[4]。4つ全ての種類のRNAiエフェクターが、現在、複数のタイプのがんを含む種々の疾患に対する多数の第I相~第III相臨床試験で試験されている[5]。特に、RNA干渉(RNAi)は、RNAが遺伝子発現をサイレンシングするプロセスである。これは、二本鎖RNAをより小さい断片に切断する、ダイサー酵素によって開始される。パッセンジャー鎖は更に断片化され、ガイド鎖はRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に積み込まれる。ガイド鎖は標的mRNA、及びRISCの触媒活性成分として働くタンパク質であるArgonature-2と対を形成し、mRNAを切断する。典型的には、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)はプラスミドを通して加えられる。shRNAは核でのプロセシングを受けて、細胞質に輸送され、そこでshRNAは、ダイサー基質低分子RNA(dsiRNA)と共に低分子干渉RNA(siRNA)にプロセシングされる。shRNAはRISCを介してmRNA中の特異的配列に結合する。これにより、mRNAの分解がもたらされる。
RNAiが遭遇する最も一般的な問題は、細胞へのshRNAの効率的な送達である。shRNAの効果的な送達のためのいくつかの市販のトランスフェクション試薬があるが、ある特定のタイプの細胞は、依然として効率的にトランスフェクトするのが難しい。がん遺伝子療法におけるshRNAの送達及び発現に採用されるウイルスの例は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス及びレトロウイルスである。しかしながら、これらのウイルスのほとんどは複製が不完全であり、そのためサイレンシング効果は一次感染細胞に限られる。安全性への懸念により、レンチウイルスベクターの使用はインビトロに限定されており、インビボ設定に更に用いることができない。
RNAi媒介性の抗がん療法によって標的とされる遺伝子の例は、KRAS、ポロ様キナーゼ1、フューリン、エフリンA型受容体及びc-mycである。臨床研究のほとんどは、剥き出しのsiRNAと比較して優れた安定性を有する、ナノ粒子(例えば、脂質ナノ粒子)にコンジュゲートしたsiRNAを伴う。しかしながら、大幅な改善にもかかわらず、注射後の最初の72時間以内にsiRNAの急速な下落が観察され、siRNAのほとんどは肝細胞に取り込まれる(注射から30分後には既に注射量のおよそ50%が肝臓に見られる)。よって、siRNAの効率的な送達は、この分野の大きな障害のままである[5]。ほとんどの送達系は一時的であり、siRNAの細胞内濃度は細胞分割の間に希釈されるので、siRNAの反復投与がしばしば必要である。
短鎖ヘアピン型RNA(shRNA)は、別のクラスのRNAiエフェクターである[6]。shRNAは、典型的には、4~11不対ヌクレオチドの低分子ループで隔てられた2つの相補的な(センス及びアンチセンス)19~29塩基対配列からなる。典型的には、発現は、RNAポリメラーゼ(Pol)IIIプロモーター(例えばU6、H1)又は修飾pol IIプロモーターによって制御される。shRNAの転写の後に、ループによって連結されたセンス及びアンチセンス鎖は、対になって、特徴的なヘアピン構造を形成する。この構造は、細胞によって自然に使用されて遺伝子発現を調節するpre-miRNAに似ており、核でのプロセシングを必要とする[3]。shRNAのプロモーター駆動性発現の発見の後、ウイルスRNAiベクターの設計が可能になった[7]。がん遺伝子療法におけるshRNAの送達及び発現のために採用されるウイルスの例は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス及びレトロウイルスである。しかしながら、これらのウイルスのほとんどは複製が不完全であり、そのためサイレンシング効果は一次感染細胞に限られる。
腫瘍溶解性ウイルス及びRNAi
腫瘍溶解性ウイルス(OV)は、がん細胞において選択的に複製し、がん細胞を殺すウイルスであり、正常な組織を温存しながら腫瘍全体に広がる能力を有する。それらの抗がんポテンシャルは、広範な種々の腫瘍モデルに対して前臨床レベルで証明されており、多数のOVが、現在第I~第III相臨床評価されている。特に、免疫賦活性サイトカイン顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を発現する、修飾された単純ヘルペスウイルス(HSV)である、タリモジーン・ラハーパレプベック(T-Vec; Amgen社)は、切除不能な転移性黒色腫の処置のために、FDA及びEMAによって最近承認された。しかしながら、前臨床レベルでOVで得られた見込みのある結果は、臨床で常に再現されてはいない。腫瘍はしばしば本質的に高度に不均質であり、おそらくある特定の腫瘍はウイルス誘導性腫瘍崩壊に中程度に感受性がある。ある特定の腫瘍内で細胞の画分がウイルス処置を生き残り、腫瘍再成長につながることも可能である。したがって、OVベースの療法に関連したRNAi技術の適用は、ウイルスに、その感染に対する感受性が低いがん細胞を殺すためのさらなる作用様式を提供することによって、OVの有効性を補強する手段を代表し得るので、非常に魅力的である。また、RNAiエフェクターのOV媒介性送達は、特に静脈内投与の後に、特にがん細胞におけるこれらの分子の高レベルの発現をどのようにして達成するかという、RNAi技術の一般的なハードルを克服し得る。更に、OVは腫瘍を通して複製及び拡散し得、それによってshRNA生成及び送達を増幅するポテンシャルを有する。OVにRNAiエフェクターを装備させることは、腫瘍溶解性アデノウイルス(Ad)、例えば、その親ウイルスよりも優れた抗がん活性を有する、VEGF、MYCN、SATB1、C-Met、Ki67、IL-8、hTERT及びFAKを含む多数の腫瘍関連遺伝子を標的とするshRNAを発現するAdの場合に、確かなアプローチであることが証明されている[8~15]。腫瘍溶解性HSVを操作してRNAiエフェクター(shRNA及び人工miRNA)を効率的に発現させ得ることもまた、示された[16]。
腫瘍溶解性ウイルス(OV)は、がん細胞において選択的に複製し、がん細胞を殺すウイルスであり、正常な組織を温存しながら腫瘍全体に広がる能力を有する。それらの抗がんポテンシャルは、広範な種々の腫瘍モデルに対して前臨床レベルで証明されており、多数のOVが、現在第I~第III相臨床評価されている。特に、免疫賦活性サイトカイン顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を発現する、修飾された単純ヘルペスウイルス(HSV)である、タリモジーン・ラハーパレプベック(T-Vec; Amgen社)は、切除不能な転移性黒色腫の処置のために、FDA及びEMAによって最近承認された。しかしながら、前臨床レベルでOVで得られた見込みのある結果は、臨床で常に再現されてはいない。腫瘍はしばしば本質的に高度に不均質であり、おそらくある特定の腫瘍はウイルス誘導性腫瘍崩壊に中程度に感受性がある。ある特定の腫瘍内で細胞の画分がウイルス処置を生き残り、腫瘍再成長につながることも可能である。したがって、OVベースの療法に関連したRNAi技術の適用は、ウイルスに、その感染に対する感受性が低いがん細胞を殺すためのさらなる作用様式を提供することによって、OVの有効性を補強する手段を代表し得るので、非常に魅力的である。また、RNAiエフェクターのOV媒介性送達は、特に静脈内投与の後に、特にがん細胞におけるこれらの分子の高レベルの発現をどのようにして達成するかという、RNAi技術の一般的なハードルを克服し得る。更に、OVは腫瘍を通して複製及び拡散し得、それによってshRNA生成及び送達を増幅するポテンシャルを有する。OVにRNAiエフェクターを装備させることは、腫瘍溶解性アデノウイルス(Ad)、例えば、その親ウイルスよりも優れた抗がん活性を有する、VEGF、MYCN、SATB1、C-Met、Ki67、IL-8、hTERT及びFAKを含む多数の腫瘍関連遺伝子を標的とするshRNAを発現するAdの場合に、確かなアプローチであることが証明されている[8~15]。腫瘍溶解性HSVを操作してRNAiエフェクター(shRNA及び人工miRNA)を効率的に発現させ得ることもまた、示された[16]。
既に、ヌクレオチド(nt)2022~2135を包含するインフレーム欠失を特色とするΔH-1PVウイルスゲノムからなる第一世代のΔH-1PVサイレンサープラットフォームが存在する(WO2013/110464A1)。左(LP)及び右の回文配列(RP)は、セルフプライミングの複製開始点として働き;P4プロモーターは、非構造タンパク質NS1及びNS2をコードするNS遺伝子の発現を調節し、P38プロモーターは、VP1及びVP2ウイルスタンパク質をコードするVP遺伝子の発現を調節する。非コード領域(NCR)はVP領域の下流であり、標的特異的核酸カセットが、野生型H-1PVゲノムのヌクレオチド4687で非コード領域に挿入される。しかしながら、HpaI部位で挿入された標的特異的核酸カセット(4686~4691位)は安定して維持されず、ウイルスの適合性を損なうことが見出されている。
また、4570位でウイルスゲノムの3'末端非翻訳領域内にshRNA CDK9発現カセットを含む組換えパルボウイルスは、EP3327124A1(WO2018/096148A1)に記載されている。ウイルスは遺伝子サイレンシングが優れており、複製する能力を維持しているが、shRNA発現カセットは、NB324K生成細胞系におけるウイルスの増殖の間に次第に失われる。
Finglら、The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman編 Macmillan Publishing Co., New York, pp. 1-46 (1975)
上述のように、shRNAがアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス及びレトロウイルスによって送達される場合、ウイルスはしばしば複製が不完全であり、そのためサイレンシング効果は一次感染細胞に限定される。
したがって、本発明の目的は、より安定して、細胞又は生物においてがん関連遺伝子の発現を効率的に下方制御する手段を提供することである。
本発明によれば、これは、特許請求の範囲で定義される主題を提供することによって達成される。好ましい実施形態は、添付の特許請求の範囲で言及される。
本発明は、がん関連遺伝子又は発がん遺伝子、例えばPD-L1を標的とする、RNAiエフェクター、好ましくはshRNAを発現する、自律的なパルボウイルスH-1の欠失バリアントに関する。
H-1PVは、ヒトに対して非病原性であり、腫瘍溶解性及び腫瘍抑制性(oncosuppressive)の特性を有するので、その抗がんポテンシャルのために、高い関心を集めてきた。ヒトは通常齧歯類パルボウイルス感染に曝されないため、既存の抗ウイルス免疫は、通常これらのウイルスには問題がない。パルボウイルスゲノムは、それぞれ非構造(NS1及びNS2)及びキャプシド(VP1及びVP2)タンパク質の発現を調節する2つのプロモーターP4及びP38を含む、およそ5100塩基の一本鎖DNAからなる。P4プロモーターの活性化は、PV生活環における重要なステップである。P4プロモーターの活性は、後にそれ自身の遺伝子産物であるNS1によって調節されるが、その初期の活性化は、細胞周期のS期に主に発現される宿主細胞因子に完全に依存する。この依存性は、該ウイルスが静止期細胞を刺激して増殖させることができないことと共に、増殖性、形質転換又は悪性細胞中で優先的に複製するウイルスの腫瘍親和性(oncotropism)に寄与する。また、パルボウイルス細胞毒性はまた、腫瘍性形質転換と関連した細胞変化によって刺激される。NS1は、主要なウイルス毒性タンパク質である。H-1PVは、がん細胞におけるいくつかの死の経路を活性化することが示されている。PVの抗がんポテンシャルは多くの前臨床研究によって支持されているが、有効性は、臨床適用における限定要因となることが予想できる。一部のがん細胞はウイルス処置に耐性があり、腫瘍再発を引き起こす可能性がある。
本発明をもたらした実験の間に、パルボウイルスゲノムの特定の部位でのshRNA発現カセットの挿入はパルボウイルスパッケージング容量と適合し、ウイルス複製に干渉せず、ウイルスの固有の細胞毒性を促進することを示すことができた。該ウイルスは高レベルのshRNAを発現し、遺伝子サイレンシングが非常に優れている。複製が不十分なベクターと比較した、H-1PVサイレンサーの大きな利点は、増殖性細胞、例えばがん細胞において、複製及び増殖する能力にある。全ての感染/形質導入細胞は、理論的には、新しいウイルス粒子を生成するようになり得た。2ラウンド目の感染を通した子孫ビリオンは、腫瘍及び効率的な送達を通して伝播し、治療用shRNAを発現し得た。この設定において、サイレンシングシグナルは、初回の接種材料を超えて増幅され得た。まとめると、パルボウイルスベースのベクター及びshRNA技術は互いの制限を補い合う:パルボウイルスの天然の腫瘍親和性は、増殖性細胞、例えばがん細胞において、特異的且つ効果的にshRNAを送達して、shRNAの形質導入を媒介するはずである。
よって、本発明は、細胞中で標的遺伝子の発現を下方制御するための、パルボウイルスH-1欠失バリアントに基づくパルボウイルスにおいて、パルボウイルスH-1欠失バリアントがヌクレオチド2022~2135を包含する欠失を含み、標的特異的核酸がH-1パルボウイルスVP遺伝子の下流の非翻訳領域で挿入され、細胞中のRNAポリメラーゼによって認識可能なプロモーター又はプロモーター領域の制御下で発現可能であり、該標的特異的核酸はRNAiで転写可能であり、該パルボウイルスは細胞中で複製及び増殖可能であることを特徴とする、パルボウイルスを提供する。
パルボウイルスH-1欠失バリアント(ΔH-1PV)は、野生型パルボウイルスH-1のヌクレオチド(nt)2022~2135を包含するインフレーム欠失を特色とする(図1)。左(LP)及び右の回文配列(RP)は、セルフプライミングの複製開始点として働き;P4プロモーターは、非構造タンパク質NS1及びNS2をコードするNS遺伝子の発現を調節し、P38プロモーターは、VP1及びVP2ウイルスタンパク質をコードするVP遺伝子の発現を調節する。非コード領域(NCR)はVP領域の下流であり、ウイルスゲノム複製及びキャプシド形成の調節に関与していると考えられる。
標的特異的核酸は、ウイルス複製及び細胞毒性に影響を及ぼさないように、すなわちパルボウイルスのキャプシドタンパク質をコードするパルボウイルスVP遺伝子の下流で、ウイルスゲノムに挿入される。好ましくは、標的特異的核酸カセットは、ΔH-1PVゲノムのヌクレオチド4480で挿入される。本発明者らは、いくつかの試験を行って、最も適した挿入部位を決定した。shRNA発現カセットが4815位又は4465位で挿入された場合、shRNAカセットは継代1又は2で失われた。shRNA発現カセットを4598位又は4469位で挿入することによって、カセット維持の安定性が向上し、すなわち、継代3でもウイルスゲノムに安定して組み込まれたままである。これは、第一世代ΔH-1PVサイレンサープラットフォームで使用されるHpaI制限酵素部位への挿入よりも更に良い(WO2013/110464A1)。shRNA発現カセットが4480位で挿入された場合に、最良の結果が達成された。これは、より多くのウイルス生成及び感染性を伴って、継代4で安定してウイルスゲノムに組み込まれる。本発明者らは、4480位の新しいカセット挿入部位があらゆるshRNAで普遍的であるという概念の証明を呈示することができた。
好ましい実施形態では、標的遺伝子はPD-L1である。PD-1(プログラム細胞死1)及びPD-L1(プログラム細胞死リガンド1)は、T細胞媒介性免疫応答の負の調節において重要な役割を果たし、腫瘍が抗原特異的T細胞免疫応答を避けるメカニズムとして働く。よって、PD-1又はPD-L1の遮断は、腫瘍処置に適した方法である。複数のさらなる免疫チェックポイント受容体及びリガンドは、一部は種々のタイプの腫瘍細胞において選択的に上方制御されるが、特にワクチン等の抗腫瘍免疫応答の活性化を促進するアプローチと組み合わせた、遮断の主要な標的である。現在、遮断は、抗PD-1又は抗PD-L1抗体の投与を通して達成される。抗PD-L1抗体及びそれを生成する方法は、当該分野で公知である。かかるPD-L1に対する抗体は、ポリクローナル若しくはモノクローナル、及び/又は組換え、及び/又はヒト化であり得る。PD-L1に対する抗体の例は、米国特許第8,217,149号、米国特許出願第13/511,538号、米国特許出願第13/478,511号に開示されている。現在、PD-L1に対する3つの抗体、すなわちアテゾリズマブ、アベルマブ及びデュルバルマブがFDAによって承認されている。しかしながら、現在公知のチェックポイント阻害剤の投与に関連する、未だ解決していない問題がある:
(1)有害な免疫効果:免疫のブレーキを解放することの欠点は、免疫チェックポイント阻害剤(ICI)で処置された患者の健康な組織における毒性の誘導である。該患者は、自己免疫応答に似たICIの特有の範囲の副作用である、免疫関連有害事象(irAE)を発症する。irAEは、体のほとんど全ての臓器に影響を及ぼし、皮膚、消化管、肺、並びに内分泌系、筋骨格系及び他の系で最も一般的に見られる。ICIは、有意な臨床的抗がん有効性を有するが、しばしば重大な全身毒性を有する。よって、50%までのirAEの発生率によって、それらの広範且つ普遍的な使用は妨げられてきた。
(2)標的タンパク質PD-L1の変異は、処置耐性をもたらす。
(3)例えば、膵管腺がん(PDAC)は、単剤免疫チェックポイント遮断の試験において期待外れの結果を示している。この失敗の、可能性のある理由は、PDACにおける、免疫逃避メカニズムと低い変異量の組合せにより得る。
(1)有害な免疫効果:免疫のブレーキを解放することの欠点は、免疫チェックポイント阻害剤(ICI)で処置された患者の健康な組織における毒性の誘導である。該患者は、自己免疫応答に似たICIの特有の範囲の副作用である、免疫関連有害事象(irAE)を発症する。irAEは、体のほとんど全ての臓器に影響を及ぼし、皮膚、消化管、肺、並びに内分泌系、筋骨格系及び他の系で最も一般的に見られる。ICIは、有意な臨床的抗がん有効性を有するが、しばしば重大な全身毒性を有する。よって、50%までのirAEの発生率によって、それらの広範且つ普遍的な使用は妨げられてきた。
(2)標的タンパク質PD-L1の変異は、処置耐性をもたらす。
(3)例えば、膵管腺がん(PDAC)は、単剤免疫チェックポイント遮断の試験において期待外れの結果を示している。この失敗の、可能性のある理由は、PDACにおける、免疫逃避メカニズムと低い変異量の組合せにより得る。
したがって、PD1/PD-L1はT細胞媒介性免疫応答の負の制御をし、腫瘍が抗原特異的T細胞免疫応答を避けるメカニズムとして働くので、抗がん治療標的遺伝子としての、PD-L1遮断のための新しい戦略が必要である。また、これは、がん細胞増殖を高め、腫瘍発生を促進する。
特に、本発明者らは、shRNA発現カセットをウイルスゲノムの非コード領域内に挿入することによって、pΔH-1PVshPD-L1及びpΔH-1PVshEGFP感染性分子クローンを生成した(図1)。PD-L1又はEGFPのいずれかに対するshRNA配列は、効率的な遺伝子特異的サイレンシング効果で証明された。shRNAカセットを安定して発現する新しいH-1PVを開発するために、本発明者らは、いくつかの試験を行って、図2Aに示される許容NB324K細胞(permissive NB324K cell)における連続した感染ラウンドを使用したウイルスゲノムへのshRNA発現カセットの安定性を調べることによって、最も適した挿入部位を評価した。shRNA発現カセットが4815位又は4465位で挿入された場合、shRNAカセットは継代1又は2で失われた。shRNA発現カセットを4598位又は4469位で挿入することによって、カセット維持の安定性が向上し、すなわち、継代3でもウイルスゲノムに安定して組み込まれたままである。これは、第一世代ΔH-1PVshEGFPで使用されるHpaI制限酵素部位への挿入よりも更に良い(WO2013/110464A1)。shRNA発現カセットが4480位で挿入された場合に、最良の結果が達成された(図2B)。これは、より多くのウイルス生成及び感染性を伴って、継代4で安定してウイルスゲノムに組み込まれる(図2B及び図2C)。これにより、パルボウイルスの適応性のある中間物にはshRNA発現カセットの最適な挿入部位が必要であることの証拠が初めて提供され、ウイルスが良好なウイルス適合性でPD-L1遺伝子に対するshRNAを発現するPVを生成する最も好ましい能力を有することが示唆される。ウイルス生成及び感染性は、種々の構築物において同等であり、shRNA配列の変化、すなわちPD-L1又はEGFPのいずれに対しても依存せず、4480位での新しいカセット挿入部位があらゆるshRNA配列に普遍的であることを示す(図2C)。
PD-L1を標的とする最も効率的なshRNA配列を選択するために、本発明者らは、膵管腺がん(PDAC)AsPC-1又は多形性膠芽腫(GBM)U251細胞のいずれかにおいてFlagタグPD-L1を過剰発現する安定した細胞系を開発して、PD-L1遺伝子に対する種々のshRNA配列を有するΔH-1PVshPD-L1での感染の際のサイレンシング効率を評価した。結果として、本発明者らは、さらなる解析のために、ノックダウン有効性の評価に従って、よりPD-L1遺伝子サイレンシングの能力のあるΔH-1PVshPD-L1_1を選択した。他に述べられない限りは、用語「ΔH-1PVshPD-L1_1」は、以下、ΔH-1PVshPD-L1をいう。FlagタグPD-L1を過剰発現するAsPC-1又はU251細胞を、増大する量のΔH-1PVshPD-L1又はΔH-1PVshEGFPのいずれかに感染させた(図3及び図4)。感染の72時間後に、全細胞溶解物のウエスタンブロット解析のために細胞を採集した。結果から、ΔH-1PVshEGFPの対照ウイルスではなく、AsPc-1又はU251細胞のいずれかにおけるH-1PVshPD-L1による感染の際にウイルス力価依存的にPD-L1遺伝子サイレンシング効果があったことが示された。これらの結果と一致して、ΔH-1PVshPD-L1感染細胞においてPD-L1 mRNAレベルの強い減少が見られ、ΔH-1PVshPD-L1がPD-L1遺伝子をサイレンシングする能力を有することが確認された。
活性化T細胞上で発現される受容体であるプログラム細胞死タンパク質1(PD-1)の、そのリガンドである、ほとんどのがんのPD-L1への結合は、免疫応答の負の制御をする。PD-1/PD-L1相互作用によって、T細胞活性が阻害され、がん細胞が免疫監視機構を免れられるようになる[35]。PD-L1遺伝子をサイレンシングすることによってPD-1/PD-L1相互作用の阻害が達成され得る可能性を調査するために、本発明者らは、ΔH-1PVshPD-L1が生物発光細胞ベースのアッセイにおいてPD-1/PD-L1相互作用を崩壊させ得るか否かを試験した。図5に図示されるように、PD-L1及びTCR活性化因子を過剰発現するAsPC-1又はU251細胞のいずれかを抗PD-L1中和抗体及び対照抗体で処理するか、又は12(AsPC-1)及び2(U251)のMOI(pfu/細胞)でΔH-1PVshPD-L1又はΔH-1PVshEGFPのいずれかに感染させた。PD-1/NFATレポーターJurkat T細胞と共培養された後の活性化T細胞核内因子(NFAT)活性に対応する発光を測定した。予想された通り、抗PD-L1中和抗体で処理されたものの発光は対照抗体よりも1.7(U251)又は3.8(AsPC-1)倍高かった。興味深いことに、ΔH-1PVshPD-L1に感染したものの発光は対照ウイルスΔH-1PVshEGFPよりも1.6(U251)又は2.8(AsPC-1)倍高く、ΔH-1PVshPD-L1がPD-1/PD-L1相互作用を遮断及び除去し得ることが示唆された。並行してウエスタンブロットによってPD-L1遺伝子のノックダウンを調べた。これらの結果から、ΔH-1PVshPD-L1はPD-L1遺伝子のサイレンシングを介してT細胞活性化の促進において役割を果たし得ることが示された。
この革新的なウイルスは、本来のH-1PVの特徴を有するだけでなく、他の産物が示すことのない遺伝子サイレンシングの重要な機能により競争上の優位性も有する、パルボウイルスの次世代を表す。以下の結果は、PD-L1遺伝子に対するshRNAを発現するΔH-1PV pサイレンサーが特有の優れた抗がんプロファイルを有するという前臨床概念証明である:
(1)H-1PVの、がん細胞の免疫抑制腫瘍微小環境(TME)を「冷たい(cold)」状態から「炎症性(hot)」状態にスイッチする強力な抗がん免疫応答を誘発することと結び付けて腫瘍細胞毒性を誘導する固有の能力。
(2)PD-L1遺伝子のサイレンシングは、細胞毒性Tリンパ球の消耗の逆転をもたらし、そのためT細胞集団の「天然の」機能の再誘導を介した腫瘍細胞の排除につながった。
(1)H-1PVの、がん細胞の免疫抑制腫瘍微小環境(TME)を「冷たい(cold)」状態から「炎症性(hot)」状態にスイッチする強力な抗がん免疫応答を誘発することと結び付けて腫瘍細胞毒性を誘導する固有の能力。
(2)PD-L1遺伝子のサイレンシングは、細胞毒性Tリンパ球の消耗の逆転をもたらし、そのためT細胞集団の「天然の」機能の再誘導を介した腫瘍細胞の排除につながった。
予後「PD-L1特異的核酸」は、本明細書で使用される場合、PD-L1標的遺伝子の転写されたヌクレオチド配列の相補物と少なくとも約75%、具体的には少なくとも約80%、より具体的には少なくとも約85%、非常に具体的には約90%、特に約95%の配列同一性を有する、少なくとも15、20、25、50、100又は200個の連続したntを含む核酸をいう。PD-L1配列は公知であり、例えば、Bretonら[32]、Wangら[36]及びJeffreyら[33]のような刊行物に記載されている。好ましくは、以下の配列を下方制御に使用した:5'GATATTTGCTGTCTTTATA-3'(配列番号1)。この配列と整合するRNAを用いて、PD-L1の全ての既知のアイソフォームを標的化することが可能であった(GenBank受託番号NM_014143)。
本発明において、PD-L1遺伝子は、インビボ細胞又はインビトロ細胞(エクスビボ)において下方制御され得る。細胞は初代細胞、若しくはある期間培養された細胞であってもよく、又は細胞は培養された細胞系で構成されもよい。細胞は、がん細胞若しくは腫瘍等の疾患細胞又はウイルスに感染した細胞であってもよい。細胞は、前駆細胞系譜の全ての前駆細胞、より成熟した細胞及び完全に成熟した細胞を生じる幹細胞、造血細胞系譜の全ての成熟細胞を生じる前駆細胞、特定の造血系譜を生じる抗原感作前駆細胞、Tリンパ球前駆細胞、未成熟Tリンパ球、成熟Tリンパ球、骨髄系前駆細胞、又は単球/マクロファージ細胞であってもよい。細胞は、全能性(omnipotent)又は全能性(totipotent)の幹細胞又は胚性幹細胞であってもよい。細胞は、神経細胞、神経系細胞、上皮細胞、筋細胞、心細胞、肝細胞、腎細胞、幹細胞、胚性若しくは胎児幹細胞又は受精卵細胞であってもよい。
好ましくは、該パルボウイルスバリアントは、医薬組成物として製剤化され、ここでパルボウイルスは有効量で存在し、薬学的に許容され得る担体と組み合わせられる。
「薬学的に許容され得る」は、有効成分の生物活性の有効性に干渉せず、投与された患者に対して毒性でない、あらゆる担体を包含するよう意味される。適切な薬学的担体の例は当該分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油/水乳剤等の乳剤、種々のタイプの湿潤剤、無菌溶液等を含む。さらなる薬学的に適合性の担体としては、ゲル、生体吸着性マトリックス材料、パルボウイルス(治療剤)を含む埋め込み要素(implantation element)、又はあらゆる他の適切なビヒクル、送達若しくは分散手段若しくは材料を挙げることができる。かかる担体は、従来の方法によって製剤化し得、有効量で対象に投与し得る。
「有効量」は、処置をもたらすのに十分な有効成分の量をいう。「有効量」は、当業者に公知の方法を使用して決定し得る(例えば、Finglら、The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman編 Macmillan Publishing Co., New York, pp. 1-46 (1975)を参照のこと)。
パルボウイルスの投与は、種々の方法によって、例えば静脈内、腫瘍内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所又は皮内投与によって、もたらされ得る。投与経路は、勿論、療法の種類に依存する。好ましい投与経路は、静脈内(i.v.)、腫瘍内又は気管支内投与である。血液脳関門に浸透する能力を有する感染性ウイルス粒子が使用される場合、処置は、例えばH-1PVウイルスの静脈内注射によって、行われるか、又は少なくとも開始される。
パルボウイルスの投与計画は、例えば患者のサイズ、体表面積、年齢、性別、投与される特定の修飾されたパルボウイルス等、投与の時間及び経路、間葉腫のタイプ、患者の健康全般、並びに患者が供されている他の薬物療法を含む、患者データ、観察及び他の臨床的要因に基づいて、主治医によって、当該分野の技術の範囲内で容易に決定可能である。
別の特定の投与技術として、パルボウイルスは、患者に埋め込まれた供給源から患者に投与され得る。例えば、例えばシリコーン又は他の生体適合性材料のカテーテルが、例えば、さらなる外科的処置なしに局所的に種々の時点でパルボウイルスを注入できるように、腫瘍除去の間に、又は別の手順によって、患者に取り付けられた小さい皮下埋め込み型リザーバー(Rickhamリザーバー)に連結され得る。パルボウイルスはまた、定位的な外科的手法によって、又はニューロナビゲーション標的化技術によって、腫瘍に注入され得る。
パルボウイルスの投与はまた、低流速で適切なポンプシステム、例えば蠕動式輸液ポンプ又は対流強化薬剤送達(CED)ポンプを使用して、埋め込まれたカテーテルを通したウイルス粒子又はウイルス粒子を含む流体の持続注入によって行われ得る。
更に別の、パルボウイルスの投与の方法は、パルボウイルスを所望の組織に分配するよう構築及び配置された埋め込み式デバイスからのものである。例えば、パルボウイルス、例えばパルボウイルスH1をしみ込ませたウェーハを採用してもよく、ここで該ウェーハは外科的腫瘍除去の結果の切除腔の縁に取り付けられる。かかる治療介入において、複数のウェーハが採用され得る。パルボウイルスH1バリアントを活発に生成する細胞を腫瘍に注射してもよく、又は腫瘍除去後の腫瘍切除腔(tumor cavity)に注射してもよい。
本発明の特に好ましい実施形態では、標的特異的核酸は、H-1PVゲノムの4480位で挿入される。基礎となるベクターは、EP2397542A1に記載されているpdB del H-1PVである。
本発明の更に特に好ましい実施形態では、RNAポリメラーゼによって認識可能なプロモーター又はプロモーター領域は、例えばCMV、P38及びヒトユビキチンC等のRNAポリメラーゼII(Pol II)プロモーター又はU6、H1、7SK及びtRNA等のRNAポリメラーゼIII(Pol III)プロモーターである。特に好ましいRNAポリメラーゼIII(Pol III)プロモーターの例は、RNAポリメラーゼIII H1プロモーターである。
本発明の好ましい実施形態では、PD-L1特異的核酸はshRNAである。shRNAは、RNA干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするのに使用され得る急なヘアピンカーブを作るRNAの配列である、低分子ヘアピン型RNA又は短鎖ヘアピン型RNAである。shRNAヘアピン構造は、細胞機械によってsiRNAに切断され、これは次いでRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に結合する。この複合体は、結合するsiRNAに整合するmRNAに結合してこれを切断する。しかしながら、マイクロRNA及び/又はアンチセンスオリゴヌクレオチド等の他のRNAiトリガー分子の挿入もまた、可能である。
本発明の更に特に好ましい実施形態では、PD-L1特異的核酸、例えばshRNAは、少なくとも15ヌクレオチドの長さを有する。特に好ましい実施形態では、PD-L1配列は、以前に記載されているように、PD-L1配列の配列5'GATATTTGCTGTCTTTATA-3'(配列番号1)に整合する[32]。PD-L1遺伝子は、代替的にスプライシングされ、複数の転写産物バリアントをもたらす。既知の4つのバリアントのうち、1つは非コードであり、PD-L1タンパク質の異なるアイソフォームをコードする3つが存在する。
本発明はまた、がんの処置で使用するための、上記で特徴づけられたような齧歯類パルボウイルスに関する。
好ましい実施形態では、該パルボウイルスは、腫瘍、特に(排他的ではないが)前立腺がん、膵がん、脳がん(好ましくは神経膠腫)、子宮頸がん、肺がん、頭頚部がん、乳がん又は結腸がんを処置するために使用され得る。
更に好ましい実施形態では、該パルボウイルスは、該腫瘍の細胞が、化学療法及び/又は放射線療法に耐性であることを特徴とする腫瘍の処置のために使用され得る。
本発明のパルボウイルスで処置可能な患者としては、ヒト及び非ヒト動物が挙げられる。後者の例としては、限定されないが、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、及びネコ等の動物が挙げられる。
本発明はまた、本明細書で前述されるようなパルボウイルスを含む、動物、真菌又は原生生物の細胞を提供する。一実施形態では、細胞はインビトロである。細胞は、好ましくは、動物細胞、単離されたヒト細胞、インビトロヒト細胞、非ヒト脊椎動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、魚類細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、ブタ細胞、ヒツジ細胞、齧歯類細胞、ハムスター細胞、マウス細胞、ラット細胞、モルモット細胞、ウサギ細胞、非ヒト霊長類細胞、線虫細胞、貝類細胞、クルマエビ細胞、カニ細胞、ロブスター細胞、昆虫細胞、ミバエ細胞、鞘翅目(Coleopteran)昆虫細胞、双翅目(Dipteran)昆虫細胞、鱗翅目(Lepidopteran)昆虫細胞又は同翅目(Homopteran)昆虫細胞である。
最後に、本発明はまた、本明細書で前述されたようなパルボウイルスを含む、トランスジェニック非ヒト動物、真菌又は原生生物を提供する。トランスジェニック動物は、細胞、好ましくは未分化細胞を、発生中の胚へ移植してキメラ胚を生じること、組換え細胞由来の核を除核胚若しくは活性化卵母細胞等に移植することによる、受精卵母細胞の前核へのパルボウイルスの注射によって作成し得る。トランスジェニック動物を生じるための方法は、当該分野で十分確立されており、例えば、米国特許第4,873,191号に記載されている。
要約すると、新しいウイルスは、NS領域内のインフレーム欠失(ΔH-1PV)を特色とし、RNA発現カセット、好ましくはshRNAの発現がPol III H-1プロモーターによって制御されるshRNA発現カセットを宿す、プロトパルボウイルスH-1PVからなるΔH-1PVサイレンタープラットフォームに基づく。ΔH-1PVサイレンサーは、その複製する能力を維持しながら、遺伝子サイレンシングに有効であり、完全感染性である。本発明において、ΔH-1PVサイレンサーを使用して、免疫系の機能障害を引き起こす活性が公知であるPD-L1遺伝子をサイレンシングした。PD1/PD-L1はT細胞媒介性免疫応答の負の制御をし、腫瘍が抗原特異的T細胞免疫応答を避けるメカニズムとして働く。HEK293T細胞におけるプラスミドのトランスフェクションによって、典型的なパルボウイルス生成プロトコルに従って、NB324K細胞における感染を介して更に増幅され得る完全感染性ウイルス粒子を生じた。
下記の実施例は、本発明をより詳細に説明する。
プラスミド構築及びウイルス生成
pΔH-1PVRNAiは、NSコード領域内の、NCBI gene bank(参照配列X01457.1;図7)によるヌクレオチド2022~2135の114ヌクレオチドのインフレーム欠失を特色とするΔH-1PVウイルスゲノムを含む[18]。下記のTable 1(表1)に示されるプライマーで生じたNsiI-HpaI融合PCR DNA断片をクローニングすることによって、ヌクレオチド4480位でshRNA発現カセットをpΔH-1PVに導入した。5'-GATATTTGCTGTCTTTATA-3'(配列番号1)の配列を含む、本研究における特に好ましいshPD-L1は、全ての公知のPD-L1のアイソフォームを標的とすることができた(GenBank受託番号NM_014143)。配列決定によって、shRNA発現カセットを有する全てのプラスミド構築物を更に確認した(LGC Genomics社、ベルリン、ドイツ)。以前に記載されているように、ウイルスを生成し、精製し、プラークアッセイによってタイトレーションし、リアルタイムPCRによって定量化した[26]。
pΔH-1PVRNAiは、NSコード領域内の、NCBI gene bank(参照配列X01457.1;図7)によるヌクレオチド2022~2135の114ヌクレオチドのインフレーム欠失を特色とするΔH-1PVウイルスゲノムを含む[18]。下記のTable 1(表1)に示されるプライマーで生じたNsiI-HpaI融合PCR DNA断片をクローニングすることによって、ヌクレオチド4480位でshRNA発現カセットをpΔH-1PVに導入した。5'-GATATTTGCTGTCTTTATA-3'(配列番号1)の配列を含む、本研究における特に好ましいshPD-L1は、全ての公知のPD-L1のアイソフォームを標的とすることができた(GenBank受託番号NM_014143)。配列決定によって、shRNA発現カセットを有する全てのプラスミド構築物を更に確認した(LGC Genomics社、ベルリン、ドイツ)。以前に記載されているように、ウイルスを生成し、精製し、プラークアッセイによってタイトレーションし、リアルタイムPCRによって定量化した[26]。
細胞培養
10%ウシ胎仔血清(FBS、Gibco、Life Technologies社、ダルムシュタット、ドイツ)を補足したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Sigma-Aldrich社、ミュンヘン、ドイツ)中でAsPC-1、U251及びHEK293T細胞系を増殖させた。PD-1/NFATレポーターJurkat細胞(BPS Bioscience社、CA、USA)を、10%FBSを補足したロズウェルパーク記念研究所培地1640(RPMI、Invitrogen社)中で培養した。5%FBSを補足した最小必須培地(MEM、Sigma-Aldrich社、ミュンヘン、ドイツ)中で、NB324K細胞を増殖させた。全ての培地は2mM 1-グルタミン酸(Gibco)、100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシン(Gibco)を含んでいた。全ての細胞は、37℃、5%CO2雰囲気、95%湿度で増殖させ、製造業者の使用説明書に従ってマイコプラズマ検出キットを使用して、マイコプラズマ混入について常法でチェックした(Venor GeM、Minerva Biolabs社、ベルリン、ドイツ)。
10%ウシ胎仔血清(FBS、Gibco、Life Technologies社、ダルムシュタット、ドイツ)を補足したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Sigma-Aldrich社、ミュンヘン、ドイツ)中でAsPC-1、U251及びHEK293T細胞系を増殖させた。PD-1/NFATレポーターJurkat細胞(BPS Bioscience社、CA、USA)を、10%FBSを補足したロズウェルパーク記念研究所培地1640(RPMI、Invitrogen社)中で培養した。5%FBSを補足した最小必須培地(MEM、Sigma-Aldrich社、ミュンヘン、ドイツ)中で、NB324K細胞を増殖させた。全ての培地は2mM 1-グルタミン酸(Gibco)、100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシン(Gibco)を含んでいた。全ての細胞は、37℃、5%CO2雰囲気、95%湿度で増殖させ、製造業者の使用説明書に従ってマイコプラズマ検出キットを使用して、マイコプラズマ混入について常法でチェックした(Venor GeM、Minerva Biolabs社、ベルリン、ドイツ)。
安定細胞系の樹立
以前に記載されている方法に従ってFlagタグPD-L1を発現するpS/MARt DNAベクターを使用することによって、AsPC-1及びU251安定細胞系の生成を行った[37]。製造業者のプロトコル(Invitrogen社、C10459)に従って、1μg/mlのピューロマイシンを含む培地で陽性クローンの選択を行った。選択されたクローンのプールをこの研究で使用した。
以前に記載されている方法に従ってFlagタグPD-L1を発現するpS/MARt DNAベクターを使用することによって、AsPC-1及びU251安定細胞系の生成を行った[37]。製造業者のプロトコル(Invitrogen社、C10459)に従って、1μg/mlのピューロマイシンを含む培地で陽性クローンの選択を行った。選択されたクローンのプールをこの研究で使用した。
shRNA発現カセットの安定性の評価
shRNA発現カセットを有するウイルスゲノムを有するプラスミドをHEK293T細胞に一過性導入した。3日後に細胞を採集し、3回の凍結解凍サイクルを通してウイルス粒子を放出させた。粗細胞抽出物をBenzonaseヌクレアーゼ(Merck社、ドイツ)で消化し、リアルタイムPCRによってウイルス力価を定量化し、以前に記載されている方法に従って、1mlあたりのキャプシド形成ウイルスゲノムとして表した(Vg/ml)[26]。この期間を継代0ステージ(P0)と定義する。HEK293T細胞で生成されたウイルスの画分を接種材料として使用して、NB324Kプロデューサー細胞中でウイルスストックのさらなる増幅を行った。感染の3~5日後に細胞を採集し、上述のように処置したが、この期間を、すなわち継代1(P1)とする。図2Aに図示されるように、全ての継代からウイルスを採集した。製造業者のプロトコルに従って(Qiagen社、ヒルデン、ドイツ)、ウイルスDNAをQiagen社ウイルスDNA抽出キットで抽出した。カセットに隣接するプライマーを使用したPCRによって、shRNAカセットを含むゲノム断片を増幅した。ΔH-1PVのPCR産物を対照としてロードした。
shRNA発現カセットを有するウイルスゲノムを有するプラスミドをHEK293T細胞に一過性導入した。3日後に細胞を採集し、3回の凍結解凍サイクルを通してウイルス粒子を放出させた。粗細胞抽出物をBenzonaseヌクレアーゼ(Merck社、ドイツ)で消化し、リアルタイムPCRによってウイルス力価を定量化し、以前に記載されている方法に従って、1mlあたりのキャプシド形成ウイルスゲノムとして表した(Vg/ml)[26]。この期間を継代0ステージ(P0)と定義する。HEK293T細胞で生成されたウイルスの画分を接種材料として使用して、NB324Kプロデューサー細胞中でウイルスストックのさらなる増幅を行った。感染の3~5日後に細胞を採集し、上述のように処置したが、この期間を、すなわち継代1(P1)とする。図2Aに図示されるように、全ての継代からウイルスを採集した。製造業者のプロトコルに従って(Qiagen社、ヒルデン、ドイツ)、ウイルスDNAをQiagen社ウイルスDNA抽出キットで抽出した。カセットに隣接するプライマーを使用したPCRによって、shRNAカセットを含むゲノム断片を増幅した。ΔH-1PVのPCR産物を対照としてロードした。
タンパク質抽出及びウエスタンブロット解析
培養培地中で細胞をかき取り、採集し、PBSで洗浄した。細胞ペレットを、プロテアーゼ(Roche Diagnostics社、マンハイム、ドイツ)を及びホスファターゼ阻害剤(Sigma-Aldrich社)含む溶解バッファー(pH7.5の20mMトリス-HCl、1mM EDTA、150mM NaCl、0.1% SDS、1%Triton X-100、1%デオキシコール酸ナトリウム)中、氷上で30分間溶解させた。13,000rpmで15分間、4℃での遠心分離によって、細胞残屑を除去した。さらなる解析のために、上清を-80℃で維持した。全細胞抽出物(20μg)をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分解し、Hybond-Pメンブレン(GE Healthcare社)に転写した。解析に、以下の抗体を使用した:マウスモノクローナル抗ビンキュリン(sc-25336;Santa Cruz Biotechnology社、ハイデルベルク、ドイツ、1:10,000希釈で使用した)、ポリクローナル抗NS-1 SP8抗血清[31](1:3,000)、1:2,000希釈のマウスモノクローナル抗Flag(AHP1074;AbD Serotec社)、1:1,000希釈のウサギ抗PD-L1抗体(PA5-20343、Thermo Fisher社、USA)。1:5,000希釈の、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートさせた二次抗体(Santa Cruz Biotechnology社)とのインキュベーションの後、Vilber Lourmat社化学発光検出システム(ソフトウェア、Chemi-Capt 5000)ECL基質溶液でタンパク質を検出した。
培養培地中で細胞をかき取り、採集し、PBSで洗浄した。細胞ペレットを、プロテアーゼ(Roche Diagnostics社、マンハイム、ドイツ)を及びホスファターゼ阻害剤(Sigma-Aldrich社)含む溶解バッファー(pH7.5の20mMトリス-HCl、1mM EDTA、150mM NaCl、0.1% SDS、1%Triton X-100、1%デオキシコール酸ナトリウム)中、氷上で30分間溶解させた。13,000rpmで15分間、4℃での遠心分離によって、細胞残屑を除去した。さらなる解析のために、上清を-80℃で維持した。全細胞抽出物(20μg)をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分解し、Hybond-Pメンブレン(GE Healthcare社)に転写した。解析に、以下の抗体を使用した:マウスモノクローナル抗ビンキュリン(sc-25336;Santa Cruz Biotechnology社、ハイデルベルク、ドイツ、1:10,000希釈で使用した)、ポリクローナル抗NS-1 SP8抗血清[31](1:3,000)、1:2,000希釈のマウスモノクローナル抗Flag(AHP1074;AbD Serotec社)、1:1,000希釈のウサギ抗PD-L1抗体(PA5-20343、Thermo Fisher社、USA)。1:5,000希釈の、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートさせた二次抗体(Santa Cruz Biotechnology社)とのインキュベーションの後、Vilber Lourmat社化学発光検出システム(ソフトウェア、Chemi-Capt 5000)ECL基質溶液でタンパク質を検出した。
RNA単離及びリアルタイム定量的RT-PCR
製造業者の使用説明書に従って、TRIzol(登録商標)Reagent RNA抽出キット(Invitrogen社)を使用して、全RNAを単離した。1μgの全細胞RNAを1単位のDNアーゼI(Promega社)で、37℃で20分間消化して、ゲノムDNA混入物を除去し、その後逆転写(RT)のためにオリゴ(dT)プライマー及びモロニーマウス白血病ウイルスの逆転写酵素(Promega社)でプロセシングした。各cDNA試料について、cDNA試料の、残ったゲノムDNAの潜在的な混入を検出するために、逆転写酵素を加えていないRT混合物で対照を生成した。Table 1(表1)のプライマー対で、cDNAの画分を鋳型として使用した定量的PCRを行った。
製造業者の使用説明書に従って、TRIzol(登録商標)Reagent RNA抽出キット(Invitrogen社)を使用して、全RNAを単離した。1μgの全細胞RNAを1単位のDNアーゼI(Promega社)で、37℃で20分間消化して、ゲノムDNA混入物を除去し、その後逆転写(RT)のためにオリゴ(dT)プライマー及びモロニーマウス白血病ウイルスの逆転写酵素(Promega社)でプロセシングした。各cDNA試料について、cDNA試料の、残ったゲノムDNAの潜在的な混入を検出するために、逆転写酵素を加えていないRT混合物で対照を生成した。Table 1(表1)のプライマー対で、cDNAの画分を鋳型として使用した定量的PCRを行った。
以前に記載されているように[29]、rRNA 18Sを内部対称として選択した。各試料の蛍光の閾値サイクル(Ct)を、Mastercycler(登録商標)ep realplexシステム(Eppendorf社、ハンブルク、ドイツ)を使用したリアルタイムPCRによって決定した。2-ΔΔCt法を適用して[34]、群の間の遺伝子発現の相対的定量化を行った。結果を、非感染細胞(モック)の転写産物レベルと比較した折り畳み式で表す。
1.トランスフェクション及び感染
AsPC-1及びGBM U251細胞を、4×105及び2×105/mLの密度で12ウェルプレートに播種した。24時間後に、製造業者の使用説明書に従って3μlのmetafectene試薬の存在下で(Biontex Laboratories GmbH社、ミュンヘン、ドイツ)、培養物に1μgの、TCR活性化因子を発現するベクター(BPS Bioscience社、CA、USA)及びTCR活性化因子/PD-L1を発現するプラスミド(BPS Bioscience社、CA、USA)をトランスフェクトさせた。24時間後に、細胞をトリプシン処理し、AsPC-1は4.2×104、GBM U251細胞系は2×104の密度で96ウェルプレートに分割し、一方で、処置の際のPD-L1遺伝子発現の評価のために、トランスフェクトされた細胞系を、6cm皿に4×105の細胞の数で維持した。96ウェルプレート又は6cm皿のいずれかに播種された細胞を、分割の後に8時間インキュベートし、次いで12(AsPC-1)及び2(U251)のMOI(pfu/細胞)で、ΔH-1PVshPD-L1又はΔH-1PVshEGFPのいずれかで感染させた(又はさせなかった)。
AsPC-1及びGBM U251細胞を、4×105及び2×105/mLの密度で12ウェルプレートに播種した。24時間後に、製造業者の使用説明書に従って3μlのmetafectene試薬の存在下で(Biontex Laboratories GmbH社、ミュンヘン、ドイツ)、培養物に1μgの、TCR活性化因子を発現するベクター(BPS Bioscience社、CA、USA)及びTCR活性化因子/PD-L1を発現するプラスミド(BPS Bioscience社、CA、USA)をトランスフェクトさせた。24時間後に、細胞をトリプシン処理し、AsPC-1は4.2×104、GBM U251細胞系は2×104の密度で96ウェルプレートに分割し、一方で、処置の際のPD-L1遺伝子発現の評価のために、トランスフェクトされた細胞系を、6cm皿に4×105の細胞の数で維持した。96ウェルプレート又は6cm皿のいずれかに播種された細胞を、分割の後に8時間インキュベートし、次いで12(AsPC-1)及び2(U251)のMOI(pfu/細胞)で、ΔH-1PVshPD-L1又はΔH-1PVshEGFPのいずれかで感染させた(又はさせなかった)。
2.PD-1/NFATレポーターJurkat細胞との共培養
PD-1/NFATレポーターJurkat細胞は、BPS Bioscience社(CA、USA)から購入した。簡潔に述べると、感染の68時間後の、96ウェルプレート中の感染細胞を、製造業者の使用説明書に従って、培地中50ng/mlの希釈で抗PD-L1中和(#71213、BPS Bioscience社、CA、USA)又は対照抗体(PA5-20343、Thermo Fisher社、USA)のいずれかと共にプレインキュベートし、37℃で30分間インキュベートし、その後1ウェルあたり6×104個のJurkat細胞と共に37℃インキュベーターで16時間共培養した。インキュベーションの後、処置されたウェル及び未処置対照に30分間ルシフェラーゼ試薬を加え、その後発光計測することによって、ワンステップルシフェラーゼアッセイ(BPS Bioscience社、CA、USA)を行った。種々の処置又は対照のいずれかで、バックグラウンドを差し引いた発光の平均として、NFATルシフェラーゼレポーター発現の導入を計算した。結果を、種々の処置及び対照の、TCR活性化因子/PD-L1発現試料の平均発光対TCR活性化因子単独発現試料平均発光の相対比として表す。
PD-1/NFATレポーターJurkat細胞は、BPS Bioscience社(CA、USA)から購入した。簡潔に述べると、感染の68時間後の、96ウェルプレート中の感染細胞を、製造業者の使用説明書に従って、培地中50ng/mlの希釈で抗PD-L1中和(#71213、BPS Bioscience社、CA、USA)又は対照抗体(PA5-20343、Thermo Fisher社、USA)のいずれかと共にプレインキュベートし、37℃で30分間インキュベートし、その後1ウェルあたり6×104個のJurkat細胞と共に37℃インキュベーターで16時間共培養した。インキュベーションの後、処置されたウェル及び未処置対照に30分間ルシフェラーゼ試薬を加え、その後発光計測することによって、ワンステップルシフェラーゼアッセイ(BPS Bioscience社、CA、USA)を行った。種々の処置又は対照のいずれかで、バックグラウンドを差し引いた発光の平均として、NFATルシフェラーゼレポーター発現の導入を計算した。結果を、種々の処置及び対照の、TCR活性化因子/PD-L1発現試料の平均発光対TCR活性化因子単独発現試料平均発光の相対比として表す。
スフェロイドの発生
3D細胞スフェロイドは、スフェロイドの外層の細胞は栄養物及び酸素を利用できるがスフェロイドのコアでは細胞の分解産物の蓄積によって低酸素領域が形成されるので、腫瘍モデルの不均質性を表す。スフェロイドは、以前に記載されているように[38]、30%メチルセルロースストック溶液の存在下で、懸滴法を使用して20000個のAsPC-1細胞から生成される。2~3日後の、形成されたスフェロイドを、低接着丸底96ウェルプレートにトランスフェクトした。ΔH-1PVshEGFP又はΔH-1PVshPD-L1あり又はなしで50μl/ウェルの完全培地を加えた。スフェロイドについての取得解析ツールを使用したIncucyte(登録商標)3Dシングルスフェロイドアッセイで、スフェロイドのサイズをリアルタイムで解析した。Incucyte(登録商標)S3 2018Aソフトウェアで解析を行った。
3D細胞スフェロイドは、スフェロイドの外層の細胞は栄養物及び酸素を利用できるがスフェロイドのコアでは細胞の分解産物の蓄積によって低酸素領域が形成されるので、腫瘍モデルの不均質性を表す。スフェロイドは、以前に記載されているように[38]、30%メチルセルロースストック溶液の存在下で、懸滴法を使用して20000個のAsPC-1細胞から生成される。2~3日後の、形成されたスフェロイドを、低接着丸底96ウェルプレートにトランスフェクトした。ΔH-1PVshEGFP又はΔH-1PVshPD-L1あり又はなしで50μl/ウェルの完全培地を加えた。スフェロイドについての取得解析ツールを使用したIncucyte(登録商標)3Dシングルスフェロイドアッセイで、スフェロイドのサイズをリアルタイムで解析した。Incucyte(登録商標)S3 2018Aソフトウェアで解析を行った。
PD-L1は、腫瘍増殖及び進行と関連することが公知である。ヒト膵がんAsPc-1細胞の増殖におけるPD-L1の役割を評価するために、3Dスフェロイドを使用することによって、インビトロの細胞増殖に対するPD-L1の下方制御を調べた。3Dスフェロイドは、がん細胞の不均質性に代表される腫瘍生物学へのより高い関連性を特色とする高翻訳関連性モデルの一部である。細胞あたり5PFUのMOIでのΔH-1PVshEGFP又はΔH-1PVshPD-L1での処置の際のスフェロイドのサイズを、スフェロイドについての取得解析ツールを使用したIncucyte(登録商標)3Dシングルスフェロイドアッセイで測定した。Incucyte(登録商標)3D製品ポートフォリオ(システム、ソフトウェア、試薬)は、Sartorious AG社、ゲッティンゲン、ドイツから入手可能である。このデバイスは、細胞増殖をリアルタイムでモニタリングすることができる。図6に示されるように、感染後9日目に、ΔH-1PVshPD-L1に感染した細胞の増殖速度は、対照ベクターとしてのΔH-1PVshEGFPのものよりも有意に低いことが見出され、装備されたΔH-1PV shPD-L1によるPD-L1遺伝子のサイレンシングが腫瘍増殖の阻害に対して効果を有することが示された。まとめると、これらの結果から、ΔH-1PVshPD-L1が、がん患者への新しいウイルスの臨床的変換を保証する優れた抗がん活性を有することの概念証明が提供される。
(参考文献)
(参考文献)
Claims (11)
- 細胞中で標的特異的核酸の発現を下方制御するためのパルボウイルスであって、ヌクレオチド2022~2135を包含する欠失を含むパルボウイルスH-1欠失バリアントであり、標的特異的核酸がH-1パルボウイルスVP遺伝子のヌクレオチド4480で挿入され、細胞中のRNAポリメラーゼによって認識可能なプロモーター又はプロモーター領域の制御下で発現可能であり、前記標的特異的核酸はRNAiで転写可能であり、前記パルボウイルスは細胞中で複製及び増殖可能であることを特徴とする、パルボウイルス。
- 標的特異的核酸がPD-L1核酸である、請求項1に記載のパルボウイルス。
- 細胞のRNAポリメラーゼによって認識可能なプロモーター又はプロモーター領域がRNAポリメラーゼIII(Pol III)プロモーターである、請求項1又は2に記載のパルボウイルス。
- RNAポリメラーゼIII(Pol III)プロモーターがRNAポリメラーゼIII H1プロモーターである、請求項3に記載のパルボウイルス。
- 標的特異的核酸がshRNAである、請求項1から4のいずれか一項に記載のパルボウイルス。
- 標的特異的核酸が少なくとも15ヌクレオチドの長さを有する、請求項1から5のいずれか一項に記載のパルボウイルス。
- 標的特異的核酸が、PD-L1配列の配列5'GATATTTGCTGTCTTTATA-3'(配列番号1)に相補的である、請求項5に記載のパルボウイルス。
- 腫瘍を処置する方法における使用のための、請求項1から7のいずれか一項に記載のパルボウイルス。
- 前記腫瘍の細胞が、化学療法及び/又は放射線療法に耐性であることを特徴とする、請求項8に規定の使用のためのパルボウイルス。
- 前記パルボウイルスが、静脈内(i.v.)、腫瘍内又は気管支内投与によって投与されることを特徴とする、請求項8又は9に規定の使用のためのパルボウイルス。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載のパルボウイルスを含む、単離された細胞。
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