KR101999410B1 - 염색체 랜딩 패드 및 관련된 용도 - Google Patents

염색체 랜딩 패드 및 관련된 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101999410B1
KR101999410B1 KR1020137028897A KR20137028897A KR101999410B1 KR 101999410 B1 KR101999410 B1 KR 101999410B1 KR 1020137028897 A KR1020137028897 A KR 1020137028897A KR 20137028897 A KR20137028897 A KR 20137028897A KR 101999410 B1 KR101999410 B1 KR 101999410B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
site
cell
sequence
gene
polynucleotide
Prior art date
Application number
KR1020137028897A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140019430A (ko
Inventor
빈센트 피. 마우로
웨이 조우
브루스 커닝햄
제랄드 엠. 에델만
Original Assignee
더 스크립스 리서치 인스티튜트
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 스크립스 리서치 인스티튜트 filed Critical 더 스크립스 리서치 인스티튜트
Publication of KR20140019430A publication Critical patent/KR20140019430A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101999410B1 publication Critical patent/KR101999410B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/68—Stabilisation of the vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본원에서는 숙주 세포에서 하나 이상의 재조합 폴리뉴클레오티드를 안정하게 통합 및/또는 발현시키는 방법을 제공한다. 재조합 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 일부 천연 염색체 통합 부위에서 숙주 게놈 내로 통합된다. 통합은 특이적 염색체 위치를 표적화하는 하이브리드 리콤비나제를 사용함으로써, 또는 상동성 재조합에 의해 매개될 수 있다. 외래 유전자의 안정한 통합 및 강력한 전사 활성을 지지하는 숙주 세포 내의 천연 염색체 통합 부위는 CHO 게놈 중의 특이적 유전자인, 안키린 2 유전자 (Ank2), 절단 및 폴리아데닐화 특이적 인자 4 유전자 (Cpsf4), C-Mos 유전자 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자 내에 또는 그에 인접하게 존재한다. 부위-특이적 재조합 서열 (염색체 랜딩 패드)을 상기 특이적 염색체 위치 내로 삽입하기 위한 방법 및 핵산 분자 또한 제공한다. 천연 염색체 통합 부위 내로 통합된 염색체 랜딩 패드 또는 트랜스진을 함유하는 조작된 숙주 세포를 추가로 제공한다. 삽입된 염색체 랜딩 패드를 보유하는 숙주 세포에서 이종성 폴리뉴클레오티드를 통합시키고 발현시키기 위한 방법 및 조성물 (예컨대, 키트)을 추가로 제공한다.

Description

염색체 랜딩 패드 및 관련된 용도 {CHROMOSOMAL LANDING PADS AND RELATED USES}
우선권 서류에 대한 참조
본 출원은 35 U.S.C. §119(e)하에 2011년 4월 5일 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 61/516,612를 우선권 주장한다. 상기 언급된 출원일의 우선권은 본원에서 주장하는 바와 같고, 이 가특허 출원의 개시내용은 그 전문이 본원에서 참고로 포함된다.
서열 목록 포함
본 출원은 EFS 웹을 통해 본 명세서와 함께 전자 제출된 서열 목록의 전자 등가 서류 사본 및 EFS 웹을 통해 본 명세서와 함께 전자 제출된 컴퓨터 판독 가능한 형태의 서열 목록을 포함하고, 2012년 4월 5일 작성된 213476 바이트 크기의 파일명이 "37651505001 WOSEQUENCELISTING.txt"인 파일을 포함하며, 이는 그의 전문이 본원에서 참고로 포함된다.
이종성 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포의 게놈 내로 통합하는 것은 치료학적 목적을 위해 (예컨대, 유전자 요법), 및 시험관내에서 유용한 단백질 또는 폴리펩티드를 제조하는 데 통상 실시된다. 비상동성 재조합에 의해 게놈 중의 무작위 위치에 삽입하기 위해서는 선별 및 클론 확장을 수회에 걸쳐 수행함으로써 허용되는 발현 시스템을 제조하여야 한다. 상기 접근법은 또한 새 유전자에 대한 발현 시스템이 요구될 때마다 매번 반복되어야 한다. 무작위적인 통합 이벤트의 성질에 기인하여, 재조합 유전자가 삽입되는 위치 중 일부는 전사 이벤트를 전혀 지지하지 못한다. 이는 발현 수준이 유전자좌의 국소 유전적 환경의 효과 (위치 효과)에 의해 크게 영향을 받기 때문이다. 추가로, 많은 염색체 부위로부터의 발현은 시간이 경과함에 따라 감소한다. 일부 경우에서, 이러한 불안정성은 트랜스진의 DNA 메틸화에 기인한다. 그 결과, 통합된 유전자의 발현 수준은 통합 부위에 따라 큰 폭의 차이를 보인다. 추가로, 일부 경우에서 외인성 DNA의 게놈 내로의 무작위적인 통합은 중요한 세포 유전자를 파괴시킬 수 있고, 이로써, 표현형은 변경될 수 있다.
무작위 삽입 이외에도, 게놈 중의 정의된 부위에 트랜스진을 통합하기 위한 것으로 리콤비나제-매개 통합이 기술된 바 있다. 그러나, 통합된 트랜스진을 안정하게 고효율로 발현시키는 것은 여전히 번거로우며, 원하는 통합된 세포를 선별하기 위해서는 스크리닝된 클론들 다수가 필요하다.
당업계에서는 포유동물 세포에서 이종성 폴리뉴클레오티드를 안정하게 통합시키고/거나, 고수준으로 유전자를 발현시키기 위한 수단이 요구되고 있다. 본 개시내용은 이러한 요구 등을 다룬다.
개요
한 측면에서, 숙주 세포에서 이종성 폴리뉴클레오티드를 안정하게 통합시키고 발현시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 안키린 2 유전자 (Ank2), 절단 및 폴리아데닐화 특이적 인자 4 유전자 (Cpsf4), C-Mos 유전자 및 네프로시스틴(Nephrocystin)-1/Mal 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 내에 또는 그에 인접하게 위치하는 천연 염색체 부위에서 숙주 세포의 게놈 내로 이종성 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 것을 포함한다. 일부 방법에서, 이종성 폴리뉴클레오티드를 숙주 게놈 내로 삽입하는 것은 상동성 재조합에 의해 또는 하이브리드 리콤비나제(hybrid recombinase)에 의해 매개된다. 일부 방법에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 상기 방법 중 일부에서, 천연 염색체 삽입 부위는 Ank2 유전자의 경우 서열 번호 1의 130-131번 위치, Cpsf4 유전자의 경우 서열 번호 2의 629-630번 위치, C-Mos 유전자의 경우 서열 번호 3의 272-273번 위치, 또는 네프로시스틴-1/Mal 유전자의 경우 서열 번호 4의 239-240번 위치에 또는 그에 가깝게 존재한다. 일부 방법에서, 숙주 게놈 내로 통합시키고자 하는 이종성 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드, 예컨대 치료용 단백질 또는 산업용 단백질을 코딩할 수 있다.
관련된 측면에서, 이종성 폴리뉴클레오티드 서열을 포유동물 세포의 게놈 내로 안정하게 통합시키기 위한 재조합 또는 조작된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 재조합 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 제1 상동성 아암(arm), 이종성 폴리뉴클레오티드 서열, 및 제2 상동성 아암을 함유한다. 제1 및 제2 상동성 아암은 각각, 안키린 2 유전자 (Ank2), 절단 및 폴리아데닐화 특이적 인자 4 유전자 (Cpsf4), C-Mos 유전자 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 내에 또는 그에 인접하게 위치하는 천연 염색체 삽입 부위의 측면에 위치하는 5'- 및 3'-서열과 실질적으로 동일하다. 전형적으로, 천연 염색체 삽입 부위는 외래 유전자의 안정한 통합을 지지할 수 있다. 일부 방법에서, 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드, 예컨대 치료용 단백질 또는 산업용 단백질을 코딩한다. 일부 다른 방법에서, 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 부위-특이적 재조합 서열 (염색체 랜딩 패드(chromosomal landing pad))을 포함한다. 예를 들어, 부위-특이적 재조합 서열은 파지 인테그라제(phage integrase)에 의해 인식되는 인식 서열, 예컨대 phiC-31 파지 인테그라제에 의해 인식되는 attP 부위 또는 attB 부위일 수 있다. 일부 방법에서, 숙주 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 상기 방법에서, 천연 염색체 삽입 부위는 Ank2 유전자의 경우 서열 번호 1의 130-131번 위치, Cpsf4 유전자의 경우 서열 번호 2의 629-630번 위치, C-Mos 유전자의 경우 서열 번호 3의 272-273번 위치, 또는 네프로시스틴-1/Mal 유전자의 경우 서열 번호 4의 239-240번 위치에 또는 그에 가깝게 위치할 수 있다. 관련된 실시양태에서, 재조합 또는 조작된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터 또한 본 발명에서 제공한다.
또 다른 측면에서, 조작된 포유동물 세포를 제공한다. 세포는 안키린 2 유전자 (Ank2), 절단 및 폴리아데닐화 특이적 인자 4 유전자 (Cpsf4), C-Mos 유전자 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 내에 또는 그에 인접하게 위치하는 하나 이상의 천연 염색체 삽입 부위에서 그의 게놈 내로 안정하게 통합되어 있는 이종성 폴리뉴클레오티드를 보유한다. 전형적으로, 선택된 천연 염색체 삽입 부위는 외래 유전자의 안정한 통합을 지지한다. 상기 방법 중 일부에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드, 예컨대 치료용 단백질 또는 산업용 단백질을 코딩한다. 일부 다른 방법에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 부위-특이적 재조합 서열 (염색체 랜딩 패드)을 함유한다. 예를 들어, 부위-특이적 재조합 서열은 파지 인테그라제에 의해 인식되는 인식 서열, 예컨대 phiC-31 파지 인테그라제에 의해 인식되는 attP 부위 또는 attB 부위일 수 있다. 일부 바람직한 실시양태는 재조합 또는 조작된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에 관한 것이다. 상기 실시양태에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 Ank2 유전자의 경우 서열 번호 1의 130-131번 위치, Cpsf4 유전자의 경우 서열 번호 2의 629-630번 위치, C-Mos 유전자의 경우 서열 번호 3의 272-273번 위치, 또는 네프로시스틴-1/Mal 유전자의 경우 서열 번호 4의 239-240번 위치에서 또는 그에 가깝게 통합될 수 있다.
추가의 또 다른 관련된 측면에서, 이종성 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포의 게놈 내로 안정하게 통합시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 부위-특이적 재조합 서열을 세포의 게놈 내로 삽입시키는 단계로서, 여기서 삽입은 안키린 2 유전자 (Ank2), 절단 및 폴리아데닐화 특이적 인자 4 유전자 (Cpsf4), C-Mos 유전자 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 내에 또는 그에 인접하게 위치하는 천연 염색체 삽입 부위에서 이루어지는 것인 단계; 및 (b) 이종성 폴리뉴클레오티드를 삽입된 부위-특이적 재조합 서열에서 세포의 게놈 내로 상동성 재조합에 의해 통합시키는 단계를 수반한다. 본 방법을 위해 선택된 천연 염색체 삽입 부위는 전형적으로 외래 유전자의 안정한 통합을 지지한다. 일부 방법에서, 부위-특이적 재조합 서열은 파지 인테그라제에 의해 인식되는 제1 인식 서열, 예컨대 phiC-31 파지 인테그라제의 attP 부위 또는 attB 부위이다. 상기 방법에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 예컨대, 파지 인테그라제에 의해 인식되는 attB 부위 또는 attP 부위와 같이, 제1 인식 서열과 동족인 파지 인테그라제의 제2 인식 서열에 부착된다. 일부 방법에서, 사용되는 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 상기 방법에서, 부위-특이적 재조합 서열은 바람직하게 Ank2 유전자의 경우 서열 번호 1의 130-131번 위치, Cpsf4 유전자의 경우 서열 번호 2의 629-630번 위치, C-Mos 유전자의 경우 서열 번호 3의 272-273번 위치, 또는 네프로시스틴-1/Mal 유전자의 경우 서열 번호 4의 239-240번 위치에서 또는 그에 가깝게 게놈 내로 삽입될 수 있다. 일부 방법에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 표적 폴리펩티드-코딩 서열을 함유한다. 전형적으로, 이종성 폴리뉴클레오티드의 숙주 게놈 내로의 통합은 파지 인테그라제의 존재하에서 이루어진다. 상기 방법 중 일부에서, 파지 인테그라제는 세포 내로 도입된 벡터로부터 발현될 수 있다.
명세서의 나머지 부분과 특허청구범위를 참고함으로써 본 발명의 성질 및 장점에 관해 추가로 이해할 수 있다.
도 1은 강력한 전사 활성을 지지하는 천연 염색체 삽입 부위를 확인하기 위해 CHO 게놈 내로 무작위적으로 통합하는 데 사용되는 플라스미드의 구조를 보여주는 다이어그램이다. 플라스미드는 sv40 프로모터 구동 EGFP 발현 카세트를 함유한다. BamHI 부위는 (안정한 통합 이전에 선형화를 위해) EGFP와 히그로마이신 저항성 유전자 사이에 위치한다.
도 2는 CHO 게놈 중 확인된 천연 염색체 삽입 부위 내로 attP 부위를 도입하는 데 사용되는 플라스미드를 도시한 것이다. attP 부위는 Neo 유전자의 5'에 위치한다. 좌측-상동성 아암은 attP 및 Neo 유전자의 5'에서 클로닝되고; 우측-상동성 아암은 Neo 유전자의 3'에서 클로닝된다. HSV-TK 유전자는 음성 선별을 위해 사용된다. 제시된 서열은 phi-C31 파지 인테그라제에 의해 인식되는 attP 및 attB 부위의 이중 가닥 서열이다: attP (서열 번호 5 및 서열 번호 6), attB (서열 번호 7 및 서열 번호 8).
도 3은 CHO 세포 게놈의 안키린 2 (Ank2) 유전자 중 천연 염색체 삽입 부위 및 측면에 위치하는 서열 (서열 번호 1)을 보여주는 것이다
도 4는 CHO 세포 게놈의 절단 및 폴리아데닐화 특이적 인자 4 (Cpsf4) 유전자 중 천연 염색체 삽입 부위 및 측면에 위치하는 서열 (서열 번호 2)을 보여주는 것이다.
도 5는 CHO 세포 게놈의 C-Mos 유전자 중 천연 염색체 삽입 부위 및 측면에 위치하는 서열 (서열 번호 3)을 보여주는 것이다.
도 6은 CHO 세포 게놈의 네프로시스틴-1/Mal 유전자 중 천연 염색체 삽입 부위 및 측면에 위치하는 서열 (서열 번호 4)을 보여주는 것이다.
상세한 설명
I. 개관
본원에서는 재조합 유전자의 강력한 전사 활성을 수행할 수 있는 포유동물 세포 중의 천연 염색체 부위, 및 재조합 구축물의 부위-특이적 통합을 위한 "랜딩 패드"로서의 그의 용도를 개시한다. 구체적으로, 통합된 외래 유전자의 강력한 발현을 촉진시키는 포유동물 게놈 (예컨대, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 게놈) 중 여러 유전자 중의 염색체 위치를 확인하였다. 하기 기술하는 바와 같이, 이러한 천연 염색체 삽입 부위를 확인하는 것은 선별용 유전자 (예컨대, 히그로마이신-저항성 유전자 및 증강된 녹색 형광 단백질, EGFP을 코딩하는 유전자)를 함유하는 플라스미드의 게놈 내로 무작위적으로 통합시키는 것을 포함하였다. 무작위 통합시, 세포를 히그로마이신-저항에 대해 선별하고, 초기 형질감염 후 3주째에 형광 활성 세포 분류법 (FACS)을 사용하여 EGFP 발현에 대해 분류하였다. 선별된 세포를 회수하고, 선별 없이 수주 더 성장시켰다. 이어서, 세포를 다시 FACS 분류하였다. EGFP 수준이 가장 높은 세포를 96-웰 플레이트 중 개별 웰로 분류하였다. 클론을 단일 세포로부터 성장시키고, 수주 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 EGFP 발현에 대해 다시 시험하였다. 성장 속도가 모체 세포주의 성장 속도와 유사하거나, 그보다 더 높은 것을 확인하기 위해 세포를 추가로 스크리닝하였다. 이어서, 상기 유전자 중의 삽입 부위의 서열을 분석하였다. 상기 연구를 통해, 재조합 유전자로부터 안정적이고 강력한 전사 활성을 수행할 수 있는 천연 염색체 부위를 보유하는 수개의 유전자, 안키린 2 유전자 (Ank2), 절단 및 폴리아데닐화 특이적 인자 4 유전자 (Cpsf4), C-Mos 유전자 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자를 확인할 수 있었다.
본원에서는 또한 원하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 균일하게 통합하기 위한 염색체 랜딩 패드로서의 천연 염색체 부위를 확인하는 것도 기술한다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 파지 인테그라제에 의해 인식되는 파지 부착 부위 attP를 상동성 재조합을 통해 천연 염색체 부위 내로 도입한다. 부위-특이적 재조합 서열 (즉, attP 부위)이 게놈 내로 삽입되어 있다면, 이때, 재조합 유전자는 파지 인테그라제의 존재하에서 파지 인테그라제 (예컨대, phiC-31 파지 인테그라제)에 의해 인식되는 동족 재조합 서열 (즉, attB 부착 부위)을 함유하는 벡터 사용으로 세포 내로 쉽게 도입될 수 있다. 파지 인테그라제를 통해 두 동족 재조합 서열 (즉, attB 및 attP 부위)은 재조합될 수 있고, 이로써 전체 attB-함유 벡터는 염색체 중 단일 attP 부위 내로 통합될 수 있다.
본원에서는 숙주 세포에서 이종성 폴리뉴클레오티드를 안정하게 통합시키고/거나, 그를 발현시키는 방법을 제공한다. 확인된 유전자 (즉, Cpsf4, Ank2, C-Mos, 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자) 중 하나 이상에, 또는 그의 가깝게 안정하게 통합되어 있는 이종성 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포 또한 제공한다. 이종성 폴리뉴클레오티드, 예컨대 부위-특이적 재조합 서열 (염색체 랜딩 패드)을 포유동물 세포의 게놈 내로, 특히, 본원에 개시된 하나 이상의 천연 염색체 삽입 부위 내로 삽입하는 데 유용한 폴리뉴클레오티드 및 관련 벡터를 추가로 제공한다. 본원에 개시된 하나 이상의 천연 염색체 삽입 부위에서 그의 게놈 내로 안정하게 통합되어 있는 이종성 부위-특이적 재조합 서열을 가지는 조작된 포유동물 세포를 추가로 제공한다. 또한, 관심 표적 폴리펩티드를 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포에서 하나 이상의 삽입된 염색체 랜딩 패드에 안정하게 통합시키고, 발현시키는 방법을 제공한다. 그렇게 생성된, 이종성 폴리뉴클레오티드를 발현하는 세포 또한 본원에서 제공한다.
본원에 기술된 특정의 방법, 프로토콜, 및 시약은 달라질 수 있다. 달리 명시하지 않는 한, 당업계의 기술 범위 내에 포함되어 있는 분자 생물학 (재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 종래 기법이 사용될 수 있다. 그러한 기법은 문헌에 상세하게 설명되어 있다. 예를 들어, 예시적인 방법은 하기 참고 문헌에 기술되어 있다:
Figure 112013099073815-pct00001
II . 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용과 관련된 당업계의 숙련가가 통상 이해하고 있는 것과 같은 의미를 가진다. 하기 참고 문헌은 당업자에게 본 개시내용에서 사용되는 많은 용어들에 대한 일반적인 정의를 제공한다:
Figure 112013099073815-pct00002
이들 용어 중 일부는 그가 본 개시내용에 구체적으로 적용됨에 따라 본원에서 추가로 명확해진다.
본원에서 사용되는 바, 단수 형태인 "하나("a", "an") 및 "그"라는 것은 문맥상 달리 명확하게 언급되지 않는 한, 복수 개의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "한 세포"라고 언급하는 것은 복수 개의 상기 세포를 포함하고, "한 단백질"이라고 언급하는 것은 하나 이상의 단백질 및 당업자에게 공지된 그의 등가물 등을 포함한다.
"작용제"라는 용어는 임의의 물질, 분자, 요소, 화합물, 엔티티, 또는 그의 조합을 포함한다. 예컨대, 단백질, 폴리펩티드, 소형 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오티드 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 천연 생성물, 합성 화합물, 또는 화학 화합물, 또는 2가지 이상의 물질의 조합일 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, "작용제," "물질," 및 "화합물"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
"염색체 랜딩 패드" (또는 간단하게 "랜딩 패드")라는 용어는 숙주 세포 (예컨대, 포유동물 세포, 예컨대 CHO 세포)의 게놈 내로 안정하게 통합되어 있는 부위-특이적 인식 서열 또는 부위-특이적 재조합 부위 (예컨대, attP 부위)를 의미한다. 특히, 부위-특이적 인식 서열 또는 재조합 부위는 본원에 개시된 수개의 특이적 유전자, 즉, 안키린 2 유전자 (Ank2), 절단 및 폴리아데닐화 특이적 인자 4 유전자 (Cpsf4), C-Mos 유전자 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자에 존재하는 하나 이상의 천연 염색체 삽입 부위에서 숙주 게놈 내로 삽입된다. 이종성 부위-특이적 재조합 서열이 숙주 게놈 내에 존재함에 따라 리콤비나제 (예컨대, phiC-31 인테그라제)는 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 트랜스진의 숙주 게놈 내로의 부위-특이적 삽입을 매개할 수 있다. 전형적으로, 랜딩 패드 내로 통합시키기 위해, 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 트랜스진을, 이 또한 리콤비나제에 의해 인식되는 동족 인식 서열 또는 재조합 부위 (예컨대, 삽입된 부위-특이적 재조합 부위가 attP 부위일 경우, attB 부위)에 부착시킨다.
"관심 폴리뉴클레오티드" (또는 "관심 유전자" 또는 "표적 유전자")라는 어구는 폴리펩티드 또는 단백질 생성물 ("관심 폴리펩티드" 또는 "표적 폴리펩티드")을 코딩하는 시스트론, 오픈 리딩 프레임 (ORF), 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 한다. 본원에 기술된 염색체 랜딩 패드를 보유하는 조작된 숙주 세포에서의 안정한 통합 및 발현을 위해, 관심 폴리뉴클레오티드는 코딩 서열, 및 또한 동족 부위-특이적 재조합 서열 (예컨대, attB 또는 attP 부위)에 작동가능하게 연결된 적절한 전사 조절 요소 (예컨대, 프로모터 서열)를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 치료용 단백질, 영양 단백질 및 산업상 유용한 단백질과 같이 각종 표적 폴리펩티드는 관심 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 그로부터 발현될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "내인성"이라는 용어는 보통 야생형 숙주에서 발견되는 핵산 또는 폴리펩티드를 의미하는 반면, "외인성"이라는 용어는 보통 야생형 숙주에서 발견되지 않는 핵산 또는 폴리펩티드를 의미한다.
"숙주 세포"는 이종성 폴리뉴클레오티드 서열을 그 안으로 도입시키고자 하는 것이거나, 상기 서열이 도입되어 있는 살아있는 세포를 의미한다. 살아있는 세포는 둘 모두를 포함한다. 이종성 폴리뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입시키는 수단은 주시되어 있으며, 그 예로는 예컨대, 형질감염, 전기천공, 인산칼슘 침전법, 미세주입법, 형질전환, 바이러스 감염 등이 있다. 세포 내로 도입시키고자 하는 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 대개 복제가능한 발현 벡터 또는 클로닝 벡터이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포를 조작하여 원하는 유전자를 그의 염색체 상에 또는 그의 게놈 중에 도입할 수 있다. 숙주로서의 역할을 할 수 있는 많은 숙주 세포 (예컨대, CHO 세포)가 당업계에 알려져 있다. 예컨대, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (3rd ed., 2001)]; 및 [Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003)]을 참조할 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다.
"뉴클레오티드 서열," "핵산 서열," "핵산," 또는 "폴리뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 단일 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 의미하며, 달리 제한하지 않는 한, 천연적으로 발생된 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 핵산에 하이브리드화하는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포함한다. 핵산 서열은 예컨대, 원핵 생물 서열, 진핵 생물 mRNA 서열, 진핵 생물 mRNA로부터의 cDNA 서열, 진핵 생물 DNA (예컨대, 포유동물 DNA)로부터의 게놈 DNA 서열, 및 합성 DNA 또는 RNA 서열일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
"작동가능하게 연결된" 또는 "작동가능하게 회합된"이라는 용어는 유전 요소가 그의 정상적인 기능을 수행할 수 있도록 하는 방식으로 연결된 유전 요소 사이의 기능적 결합을 의미한다. 예를 들어, 유전자의 전사가 프로모터의 제어하에 있고, 제조된 전사체가 정상적으로 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질로 정확하게 번역되었을 때, 유전자는 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 것이다. 유사하게, 인핸서 요소는 그를 통해 유전자의 전사가 상향 조절되었다면, 이는 관심 유전자와 작동가능하게 회합되어 있는 것이다.
"실질적으로 동일한" 핵산 또는 아미노산 서열이란 표준 파라미터를 사용하여 본원에 기술된 주지의 프로그램 (예컨대, BLAST) 중 하나에 의해 측정된 바, 참조 서열과 75%, 80% 또는 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하는 핵산 또는 아미노산 서열을 의미하는 것이다. 서열 동일성은 바람직하게 95% 이상, 더욱 바람직하게 98% 이상, 및 가장 바람직하게 99% 이상이다. 일부 실시양태에서, 대상 서열은 참조 서열과 비교하였을 때, 그 길이가 대략적으로 동일한 것, 즉, 대략적으로 동일한 개수의 연속된 아미노산 잔기 (폴리펩티드 서열인 경우) 또는 뉴클레오티드 잔기 (폴리뉴클레오티드 서열인 경우)로 구성된 것이다.
서열 동일성은 당업계에 공지된 각종 방법으로 쉽게 측정될 수 있다. 예를 들어, BLASTN 프로그램은 (뉴클레오티드 서열의 경우) 디폴트로서 워드길이 (W)=11, 기대치 (E)=10, M=5, N=-4, 및 양 가닥 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드길이 (W)=3, 기대치 (E)=10, 및 BLOSUM62 점수화 매트릭스를 사용하였다 (문헌 [Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)] 참조). 서열 동일성(%)은 비교창에 걸쳐 최적으로 정렬된 두 서열을 비교함으로써 측정되는데, 여기서, 비교창에서 폴리뉴클레오티드 서열 중의 일부는 두 서열이 최적으로 정렬될 수 있도록 하기 위해 (부가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하여 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 상기 비율은 두 서열 모두에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 존재하는 위치의 개수를 측정하여 매칭되는 위치의 개수를 얻고, 매칭되는 위치의 개수를 비교창에 있는 위치의 총 개수로 나누고, 그 결과에 100을 곱함으로써 서열 동일성(%)을 얻음으로써 계산된다.
본원에서 사용도는 바, 단방향 부위-특이적 리콤비나제 (또는 간단하게 부위-특이적 리콤비나제)란 박테리아 또는 단세포 효모로부터 유래된 리콤비나제 군을 의미한다. 이는 티로신 리콤비나제 및 레솔바제/인버타제 또는 세린 리콤비나제 패밀리 (예컨대, 파지 인테그라제, 예컨대 파지 phiC31, R4, 및 TP-901로부터의 인테그라제), 둘 모두를 포함한다. 티로신 리콤비나제는 티로신 인테그라제 (예컨대, λ, HK022, P22, HP1 및 L5로부터의 인테그라제) 및 다른 티로신 리콤비나제 (예컨대, Cre 및 Flp)를 포함한다. 세린 리콤비나제의 예로는 세린 인테그라제 (예컨대, phiC-31, R4, TP901로부터의 인테그라제) 및 다른 세린 리콤비나제 (예컨대, γδ, Tn3, 파지 Mu 리콤비나제)를 포함한다.
바람직하게, 부위-특이적 리콤비나제는 상이한 두 DNA 인식 서열인 파지 부착 부위인 attP, 및 박테리아 부착 부위인 attB 사이의 단방향 부위-특이적 재조합을 매개하는 인테그라제 (특히, 파지 인테그라제)를 포함할 수 있다. 티로신 패밀리의 인테그라제, 예컨대 람다 인테그라제는 촉매성 티로신을 이용하여 가닥 절단을 매개하고, 보다 긴 attP 서열을 인식하는 경향이 있으며, 파지 또는 숙주 박테리아에 의해 코딩되는 다른 단백질을 필요로 한다. 세린 패밀리로부터의 파지 인테그라제 (예컨대, phiC-31 파지 인테그라제)는 크기가 더 크며, 가닥 절단을 위해 촉매성 세린을 사용하여 보다 짧은 attP 서열을 인식하고, 숙주 보조인자는 필요로 하지 않는다. attB 및 attP 부위는 상이한 서열이기 때문에, 재조합을 통해 attB 서열도 attP 서열도 아니며, 관련 인테그라제 효소에 대한 재조합 부위로서 기능적으로 인식되지 못하는 핵산 스트레치 (좌측인 경우, attL, 또는 우측인 경우, attR로 불린다)가 생성될 것이며, 효소가, 제1 재조합을 역전시킬 수 있는 제2 재조합을 촉매화시킬 수 있는 가능성을 제거한다. 이로써 단방향 부위-특이적 통합 이벤트가 이루어질 것이다.
Phi-C31 인테그라제란 포유동물 세포에서 게놈 재조합을 고효율로 긴밀한 서열 특이성으로 촉매화시킬 수 있는 파지 인테그라제를 의미한다. 상기 효소의 기능에 관한 특징 규명은 예컨대, 문헌 [Kuhstoss and Rao, J. Mol. Biol. 222, 897-908, 1991]; [Rausch and Lehmann, Nucleic Acids Research 19, 5187- 5189, 1991]; 및 [Groth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 5995-6000, 2000]과 같이 당업계에 기술되어 있다.
파지 인테그라제 (예컨대, 파지 phi-C31 인테그라제)의 천연 attB 및 attP 인식 부위의 길이는 일반적으로 약 34 내지 40개의 뉴클레오티드 길이이다. 예컨대, 본원의 도 2 및 또한 문헌 [Groth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5995-6000, 2000]을 참조할 수 있다. 상기 부위는 전형적으로 하기와 같이 배열되어 있다: attB는 제1 DNA 서열 attB5', 코어 영역, 및 제2 DNA 서열 attB3'을 포함하며, 5'→3'으로의 상대적인 순서는 attB5'-코어 영역-attB3'이다. attP는 제1 DNA 서열 attP5', 코어 영역, 및 제2 DNA 서열 attP3'을 포함하며, 5'→3'으로의 상대적인 순서는 attP5'-코어 영역-attP3'이다. Phi-C31의 attP 및 attB의 코어 영역은 서열 5'-TTG-3'을 가진다.
트랜스제닉 동물 또는 식물이란 동물 또는 식물의 하나 이상의 세포의 게놈 중에 트랜스진 또는 트랜스제닉 요소가 통합되어 있는 비인간 비인간 동물 또는 식물을 의미한다. 상기 용어는 유전자 변형을 포함하는 모든 세포 또는 거의 모든 세포를 가지는 동물 또는 식물 (예컨대, 완전한 트랜스제닉 동물, 특히 유전 트랜스진을 가지는 트랜스제닉 동물) 뿐만 아니라, 동물 또는 식물의 세포의 서브세트가 게놈상 통합된 트랜스진을 포함하도록 변형된 키메라 트랜스제닉 동물 또는 식물을 포함한다. 트랜스제닉 식물 또는 동물은 모든 발생 단계의 개별 동물 또는 식물을 포함한다. 트랜스제닉 동물인 경우, 본원에서는 가축 (예컨대, 닭, 돼지, 염소, 양, 소, 말, 토끼 등), 설치류 (예컨대, 마우스), 비인간 영장류 (예컨대, 레서스 원숭이) 및 애완동물 (예컨대, 고양이 및 개)가 고려된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 동물은 마우스 또는 래트이다.
"치료 유전자"란 단백질 (예컨대, 분비된 단백질, 막 결합 단백질 (예컨대, 수용체), 구조 단백질, 세포질 단백질 등)을 비롯한, 숙주에게 어느 정도 치료학상 이익이 되는 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 기능성 RNA (안티센스, 해머헤드 리보자임) 등을 의미한다. 분비된 단백질로는 대상체의 체액 중에서 (예컨대, 혈액, 림프, 타액, 위장관 분비액 등 중에서) 발견될 수 있는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 대상체는 인간 대상체이고, 도입된 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 단백질 또는 다른 인간 유전자 생성물을 코딩한다.
"벡터" 또는 "구축물"이라는 용어는 폴리뉴클레오티드 서열 요소에 작동가능하게 연결된 유전자/유전자 생성물의 발현이 예측가능하게 제어될 수 있도록 하는 일정한 조직화 패턴으로 배열된 폴리뉴클레오티드 서열 요소를 의미한다. 전형적으로, 이는 외래 DNA를 숙주 세포 내로 도입하여 그의 복제 및/또는 전사를 촉진시키기 위해 외래 폴리뉴클레오티드 서열 세그먼트가 그로 스플라이싱될 수 있는 전달성 폴리뉴클레오티드 서열 (예컨대, 플라스미드 또는 바이러스)이다.
클로닝 벡터는 숙주 세포에서 자율적으로 복제가능하고, 하나 또는 소수의 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열 (전형적으로 플라스미드 또는 파지)이다. 외래 폴리뉴클레오티드 서열 단편은 단편이 복제 및 클로닝될 수 있도록 하기 위해 상기 부위에서 벡터로 스플라이싱될 수 있다. 벡터는 형질전환된 세포를 확인하는 데 사용하기 적합한 하나 이상의 마커를 포함할 수 있다. 예를 들어, 마커는 테트라시클린 또는 암피실린 저항성을 제공할 수 있다.
발현 벡터는 클로닝 벡터와 유사하지만, 숙주로의 형질전환 이후, 그로 클로닝된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 유도할 수 있다. 클로닝된 폴리뉴클레오티드 서열은 보통 특정의 조절 서열, 예컨대 프로모터 또는 인핸서의 제어하에 배치되어 있다 (즉, 그에 작동가능하게 연결되어 있다). 프로모터 서열은 구성적, 유도성, 또는 억제성일 수 있다.
III . 천연 염색체 통합 부위에의 이종성 폴리뉴클레오티드 삽입
본원에서는 삽입된 이종성 폴리뉴클레오티드 (외인성 유전자 또는 트랜스진)의 안정적이고 효율적인 발현을 지지하는 천연 염색체 통합 부위를 포함하는 수개의 특이적 유전자를 기술한다. 이러한 천연 염색체 통합 부위는 숙주 세포에서 이종성 폴리뉴클레오티드의 안정한 통합 및/또는 발현에 적합하다. 예를 들어, 유용한 폴리펩티드 (예컨대, 치료용 또는 산업용 단백질)를 코딩하는 트랜스진 또는 재조합 유전자는 숙주 세포에 그렇게 통합되어 발현될 수 있다. 추가로, 상기 부위는 부위-특이적 재조합 서열 (염색체 랜딩 패드)을 숙주 게놈 내로 삽입하는 데 사용될 수 있다. 상기 삽입된 염색체 랜딩 패드를 보유하는 숙주 세포는 결국 이종성 폴리뉴클레오티드의 삽입 및 발현에 사용될 수 있다.
천연 염색체 삽입 또는 통합 부위란 이종성 폴리뉴클레오티드가 예컨대, 무작위 통합을 통해 그 안으로 통합될 수 있으며, 세포의 게놈 중에 천연적으로 존재할 수 있는 것인 염색체 위치 또는 부위를 의미한다. 다시 말해, 부위는 예를 들어, 재조합 수단에 의해 게놈 내로 도입되지 않는다. 본원에서 사용되는 바, 상기 용어는 달리 언급하지 않는 한, 구체적으로는 외래 유전자의 안정한 통합과, 그의 효율적인 전사를 지지하며, 안키린 2 유전자 (Ank2), 절단 및 폴리아데닐화 특이적 인자 4 유전자 (Cpsf4), C-Mos 유전자, 및 본원에서는 또한 네프로시스틴-1/Mal 유전자로서도 기술되어 있는 Mal 유전자를 비롯한 CHO 게놈 중의 수개의 유전자 중 하나 내에 또는 그에 인접하게 위치하는 게놈 중의 위치를 의미한다. 이는 또한 기능 또는 활성이 유사한, 다른 포유동물 종 (예컨대, 마우스, 래트, 및 인간)에서 상기 유전자 또는 (서열 정렬에 의해 측정된 바) 상동성인 영역의 오르토로그에서의 염색체 위치를 포함한다.
본원에서 상세하게 설명되는 바와 같이, 본원에서 CHO 게놈 중에서 확인된 4개의 유전자 각각에 대하여 하나의 특이적인 천연 염색체 삽입 부위가 기술된다 ( "예시된 위치"; 도 3-6 참조). 그러나, 본원에서 고려되는 천연 염색체 삽입 부위가 이러한 특정 위치로 제한되는 것은 아니다. 통합된 이종성 폴리뉴클레오티드의 안정한 통합 및/또는 효율적인 전사가 지지되는 한, 예시된 위치와 관련하여 천연 염색체 삽입 부위의 정확한 위치가 중요하지는 않다. 오히려 천연 염색체 부위는 4개의 유전자 중 하나 내에 또는 그에 인접하게 있는 임의의 위치에 위치할 수 있다. 관심 4개의 유전자 중 하나 내에 또는 그에 인접하게 있는 특이적 염색체 위치가 통합된 외래 유전자의 안정한 통합 및 효율적인 전사를 지지하는지 여부는 당업계에 주지되어 있는 표준 방법, 또는 본원에서 예시된 방법에 따라 측정될 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, CHO 게놈에 대하여 본원에서 예시된 특이적 위치, 또는 다른 포유동물 게놈 (예컨대, 마우스, 래트, 및 인간 게놈)에서 (서열 정렬에 의해 측정된 바) 상응하는 위치가 천연 염색체 삽입 부위로서 사용된다. 일부 다른 실시양태에서, 본원에서 고려되는 천연 염색체 부위는 바람직하게 예시된 위치 중 하나에 근접하게, 예컨대 예시된 위치 중 하나로부터 약 1 kb, 500 bp, 250 bp, 100 bp, 50 bp, 25 bp, 10 bp 미만 이내에, 또는 약 5 bp 미만 이내에 위치한다. 추가의 일부 다른 실시양태에서, 사용되는 천연 염색체 부위는 예시된 위치 중 하나로부터 약 1,000, 2,500, 5,000개 이상의 염기쌍 만큼 이격된 곳에 위치한다.
이종성 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 재조합 유전자 또는 염색체 랜딩 패드)는 안정한 통합 및/또는 발현을 위해 본원에 기술된 천연 염색체 통합 부위 내로 쉽게 삽입될 수 있다. 이종성 폴리뉴클레오티드는 다양한 수단에 의해, 예컨대 상동성 재조합에 의해, 또는 통합 부위에서 표적 서열을 특이적으로 표적화하는 하이브리드 리콤비나제를 사용함으로써 숙주 게놈의 천연 염색체 통합 부위 내로 삽입될 수 있다. 상동성 재조합인 경우, 상동성 폴리뉴클레오티드 분자는 정렬되고, 그의 서열 스트레치를 교환한다. 트랜스진이 상동성 게놈 서열 측면에 위치할 경우, 상기 교환 동안 트랜스진이 도입될 수 있다. 예를 들어, 하기 기술하는 바와 같이, 염색체 랜딩 패드 (attP 부위-함유 서열)은 천연 염색체 통합 부위에서 숙주 게놈 내로 상기와 같이 삽입될 수 있다.
포유동물 세포에서 상동성 재조합의 효율은 상동성인 염색체 영역에 파손을 도입함으로써 개선될 수 있다. 이는 상기 영역에 뉴클레아제를 표적화시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 천연 염색체 위치의 서열을 인식하는 DNA 결합 단백질을 사용함으로써 달성될 수 있다. 상기와 같은 표적화를 달성하는 한가지 방법은 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하는 것이다. 상기 단백질은 모듈식 조성을 가지며, 개별 아연 핑거 도메인을 함유하는데, 이들은 각각 표적 서열 중의 3-뉴클레오티드 서열 (예컨대, 상기 기술된 천연 염색체 통합 부위)을 인식할 수 있다. 일부 실시양태는 다수의 염색체 위치를 표적화하는 개별 아연 핑거 도메인과 함께 조합하여 아연 핑거 뉴클레아제를 사용할 수 있다. 예를 들어, Cpsf4, Ank2, C-Mos, 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자 중 예시된 통합 부위 주변의 개시된 염색체 서열은 각각 조작된 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 표적화될 수 있는 8, 6, 7, 및 8개의 후보 부위를 함유한다.
상동성 재조합 이외에, Cpsf4, Ank2, c-Mos, 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자에서 또는 그에 근접한 위치에서의 천연 염색체 통합 부위로의 이종성 폴리뉴클레오티드의 삽입은 또한 하이브리드 리콤비나제의 사용을 통해 달성될 수 있다. 재조합 리콤비나제는 리콤비나제 도메인 (예컨대, phiC31 인테그라제로부터의 것)이 DNA 표적화 도메인 (예컨대, 아연 핑거 도메인)에 연결되어 있는 것인 조작된 단백질이다. 그러한 분자는 Cpsf4, Ank2, c-Mos, 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자에 또는 그에 근접한 위치에 포함되어 있는 부위에 표적화될 수 있다. 상기와 같은 재조합 단백질을 통해 재조합 구축물은 상기 염색체 위치로 통합될 수 있을 것이다. 이러한 접근법의 장점으로는 (하기 기술되는 바와 같이) 랜딩 패드를 사전에 도입할 필요없이 세포주로 표적화할 수 있는 점, 및 상동성 재조합보다 효율이 더 높다는 점을 포함한다.
비록 아연 핑거 단백질이 DNA에 결합할 수 있는 그의 능력에 대해 잘 연구되어 있고, 상기 적용에 적합하기는 하지만, 다른 접근법을 사용함으로써, 예를 들어, 또 다른 유형의 DNA 결합 도메인의 돌연변이화에 의해 Cpsf4, Ank2, c-Mos, 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자를 특이적으로 표적화할 수 있다. 다른 DNA 결합 도메인으로는 류신-지퍼 및 나선 대 나선 연결 구조를 포함한다. 또한 이러한 유전자에서 서열에 염기쌍을 형성하는 핵산 모이어티를 사용함으로써 Cpsf4, Ank2, c-Mos, 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자를 특이적으로 표적화할 수 있다.
일부 실시양태는 상동성 재조합에 의해 또는 하이브리드 리콤비나제를 이용함으로써 천연 염색체 통합 부위 내로 트랜스진을 직접적으로 통합시키는 것을 포함한다. 트랜스진은 하기 기술하는 바와 같이, 치료용 또는 산업용 단백질, 예컨대 호르몬 또는 효소를 코딩하는 임의의 재조합 유전자일 수 있다. 일부 다른 실시양태는 본원에 개시된 천연 염색체 통합 부위 내로 하나 이상의 리콤비나제에 의해 인식되는 부위 특이적 재조합 서열 (염색체 랜딩 패드)을 삽입하는 것에 관한 것이다. 본원에서 상세하게 설명되는 바와 같이, 숙주 게놈 내로 안정하게 삽입된 염색체 랜딩 패드는 결국 숙주 세포 (예컨대, CHO 세포 또는 다른 포유동물 세포)에서 트랜스진을 통합 및 발현시키는 데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 천연 염색체 통합 부위에 하나 이상의 염색체 랜딩 패드를 보유하는 조작된 숙주 세포는 임의의 원하는 표적 유전자를 부위-특이적으로 통합하고 안정하게 발현시키는 데 유용하다.
IV . 상동성 재조합을 통한 이종성 폴리뉴클레오티드의 통합
한 측면에서, 상동성 재조합을 통해 이종성 폴리뉴클레오티드를 천연 염색체 통합 부위 내로 안정하게 통합시키기 위한 방법 및 조성물을 개시한다. 본원에서는 본원에 기술된 천연 염색체 통합 부위 또는 특이적 염색체 위치에서 숙주 게놈 내로 이종성 폴리뉴클레오티드 (트랜스진 또는 부위-특이적 재조합 서열)를 삽입하기 위한 폴리뉴클레오티드 분자 및 벡터 ("삽입 벡터")를 제공한다. 폴리뉴클레오티드 및/또는 삽입 벡터는 전형적으로 이종성 폴리뉴클레오티드 서열 (예컨대, 재조합 유전자 또는 염색체 랜딩 패드), 제1 상동성 아암, 및 제2 상동성 아암을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 추가로는 또한 양성 및/또는 음성 선별을 위한 마커 유전자 또는 서열을 포함할 수 있다.
숙주 게놈 내로 통합시키고자 하는 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에 기술된 바와 같이 치료학상 또는 산업상 유용한 임의의 단백질을 코딩할 수 있다. 하기에서 상세하게 설명되는 바와 같이, 이는 또한 이어서 트랜스진의 삽입 및 발현에 사용되는 리콤비나제에 의해 인식되는 통합 부위 (염색체 랜딩 패드)일 수 있다. 제1 및 제2 상동성 아암은 상동성 재조합을 위해 이종성 폴리뉴클레오티드 서열을 특이적인 염색체 위치 (예컨대, 본원에 개시된 천연 염색체 삽입 부위)로 표적화하는 것으로 한다. 따라서, 이는 각각 천연 염색체 통합 부위의 5'- 및 3'-측면에 위치하는 서열과 실질적으로 동일한 서열이다. 상기에서 설명된 바와 같이, 천연 염색체 통합 부위는 4개의 특이적 유전자인, Ank2 유전자, Cpsf4 유전자, C-Mos 유전자, 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자 중 하나의 코딩 또는 비-코딩 영역 내에 또는 그에 인접하게 존재한다. 네프로시스틴-1 유전자는 Mal 유전자에 대해 5' 방향에서 발견된다. 삽입 부위는 네프로시스틴-1과 Mal 유전자 사이의 Mal 유전자에 대해 5' 방향일 수 있다. 상기 게놈 영역을 본원에서는 "네프로시스틴-1/Mal"로 기술한다. 상기 유전자 중 하나의 또는 그 주변의 주어진 위치에서의 이종성 폴리뉴클레오티드의 삽입을 통해 안정한 통합 및/또는 발현이 이루어지는지 여부를 쉽게 측정할 수 있는 바, 게놈 중 각 유전자와 관련하여 천연 염색체 통합 부위의 정확한 위치가 중요하지는 않다. 그럼에도 불구하고, 본원에서는 일부 바람직한 천연 염색체 통합 부위가 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에 대하여 기술되어 있다. 하기 실시예에서 예시하는 바와 같이, CHO 세포에 대한 천연 염색체 통합 부위는 바람직하게 Ank2 유전자의 경우 서열 번호 1의 130-131번 위치 사이에, Cpsf4 유전자의 경우 서열 번호 2의 629-630번 위치 사이에, C-Mos 유전자의 경우 서열 번호 3의 272-273 사이에, 또는 네프로시스틴-1/Mal 유전자의 경우 서열 번호 4의 239-240번 위치 사이에 존재할 수 있다. CHO 세포에 대한 천연 염색체 통합 부위는 또한 안키린 2 유전자의 경우, NCBI 번호 NW_003615916.1의 26,123-175,773번 위치 사이에 (서열 번호 9의 23 내지 152,773번 위치 사이에) 또는 안키린 2 유전자 (서열 번호 10)의 경우, NCBI 번호 NW_003635654.1의 뉴클레오티드 844-845 사이에, Cpsf4 유전자의 경우, NCBI NW_003614125.1의 858,966-859,967번 위치 사이에 (서열 번호 11의 966-967번 위치 사이에) 또는 Cpsf4 유전자의 경우, NCBI NW_003614125.1의 858,533-859,237번 위치 사이에 (서열 번호 11의 533-1237번 위치 사이에), C-Mos 유전자의 경우, NCBI NW_003614707.1의 400,355-400,356번 위치 사이에 (서열 번호 12의 355-356번 위치 사이에), 또는 C-Mos 유전자의 경우, NCBI NW_003614707.1의 398,595-399,212번 위치 사이에 (서열 번호 12), 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자의 경우, NCBI NW_003613665.1의 1,578,738-1,578,739번 위치 사이에 (서열 번호 13의 738-739번 위치 사이에) 또는 네프로시스틴-1/Mal 유전자의 경우, NCBI NW_003613665.1의 1,574,453-1,625,306번 위치 사이에 (서열 번호 13) 존재할 수 있다. 서열 및 NCBI 참조 번호는 그 전문이 본원에서 참고로 포함된다.
천연 염색체 통합 부위는 또한 세포주 유형별로 달라질 수 있음을 이해하여야 한다. 예를 들어, 두 세포주 유형의 천연 염색체 통합 부위의 정확한 위치에 기인하여 CHO DG44 세포주의 Ank2 유전자의 뉴클레오티드 서열은 CHO-1 세포의 Ank2 유전자의 뉴클레오티드 서열과 다를 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이종성 뉴클레오티드 서열 (트랜스진 또는 염색체 랜딩 패드)을 삽입시키기 위해 선택되는 천연 염색체 통합 부위는 CHO 게놈 중 각각의 상기 특이적 위치에 또는 그에 가깝게 위치할 수 있다. 세포주 유형간의 또는 다른 포유동물 세포 (예컨대, 마우스 세포, 래트 세포 및 인간 세포)에 대해 바람직한 천연 염색체 통합 부위는 상이한 포유동물 종에서 같은 유전자 중의 서열 상동성에 기초하여 결정될 수 있다.
일단 이종성 폴리뉴클레오티드 서열을 삽입하기 위한 정확한 천연 염색체 통합 부위가 결정되고 나면, 측면에 위치하는 서열과 실질적으로 동일한 상동성 아암을 쉽게 디자인하고, 합성할 수 있다. 원하는 부위에서 상동성 재조합을 지시할 수 있는 한, 상동성 아암의 길이는 중요하지는 않다. 따라서, 상동성 아암은 원하는 천연 염색체 삽입 부위의 측면에 위치하는 서열의 적어도 10 bp, 25 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 500 bp, 1 kb, 2, kb, 5 kb, 10 kb 이상 연속된 뉴클레오티드 쌍을 포함하는 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상동성 아암은 CHO 게놈에서 예시된 염색체 삽입 부위 중 하나 (도 3-6) 또는 다른 포유동물 게놈에서 (서열 정렬에 의해 측정된 바) 상응하는 위치 측면에 위치하는 서열과 동일한 서열을 포함한다. 일부 다른 실시양태에서, 천연 통합 부위의 측면에 위치하는 서열과 실질적으로 동일한 (예컨대, 75%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상 동일한) 서열이 본원에서 기술된 폴리뉴클레오티드 분자 및 벡터에서 상동성 아암으로서 사용된다. 예를 들어, 상동성 아암은 도 3-6에 제시된 CHO 세포에서의 각각의 상기 유전자 중의 예시된 천연 통합 부위의 측면에 위치하는 서열 중 일부 또는 그 모두를 포함할 수 있다.
다양한 종으로부터의 세포 (예컨대, CHO 세포) 중의 유전자 (Ank2, Cpsf4, C-Mos 유전자, 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자) 또한 당업계에 기술되어 있다. 예를 들어, 인간 Ank2 유전자 (수탁 번호 NG_009006; NW_003615916.1; NW_003635654.1), Cpsf4 유전자 (수탁 번호 EF191081; NW_003614125.1), C-Mos 유전자 (문헌 [Neel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 7842-6, 1982]; 및 [Morris et al., Hum. Genetics 81:339-342]); 수탁 번호 NW_003614707.1), 네프로시스틴-1/Mal 유전자 (문헌 [Alonso et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1997-2001, 1987]; 및 [Rancano et al., J. Biol. Chem. 269:8159-8164, 1994]; 수탁 번호 NW_003613665.1)는 모두 당업계에서 특징 규명이 되어 있다. 당업자는 다양한 적용을 위한 적절한 상동성 아암 서열을 쉽게 디자인하고 합성할 수 있다. 실시예에서 예시되는 바와 같이, 확인된 통합 부위 중 하나의 측면에 위치하며, 길이가 약 1 kb 내지 5 kb인 서열이 이종성 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 랜딩 패드)의 숙주 게놈 내로의 상동성 통합을 위한 삽입 벡터의 상동성 아암으로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전체 유전자좌가 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 전체 유전자좌 + 5' 및 3' 말단 중 1 이상의 말단 상의 1, 2 kb 이상이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예컨대 Cpsf4 유전자 및 C-Mos 유전자의 경우, 전체 유전자좌 + 각각의 5' 및 3' 말단 상의 2 kb가 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 예컨대 네프로시스틴-1/Mal 유전자 및 안키린-2 유전자의 경우, 전체 유전자좌가 사용될 수 있다.
일부 구체적인 실시양태에서, 숙주 게놈 내로 통합시키고자 하는 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 부위-특이적 리콤비나제, 예컨대 파지 인테그라제, 예컨대 phiC-31 파지 인테그라제에 의해 인식되는 부위-특이적 재조합 서열이다. 천연 염색체 통합 부위 내로 삽입시키고자 하는 부위-특이적 재조합 서열은 부위-특이적 재조합을 지지하고, 단방향 부위-특이적 리콤비나제에 의해 인식되는 임의 서열일 수 있다. 바람직하게, 부위-특이적 재조합 서열은 인테그라제 (예컨대, 티로신 인테그라제 또는 세린 인테그라제)에 의해 인식되는 파지 부착 부위 (예컨대, attP 부위) 또는 박테리아 부착 부위 (예컨대, attB 부위)를 포함한다. 상기 서열의 예로는 수개의 파지 인테그라제, 예컨대 phiC-31 인테그라제 또는 λ 인테그라제에 의해 인식되는 attB 및 attP 서열 (뿐만 아니라, 의사(pseudo) att 부위)을 포함한다. 또한 적합한 재조합 부위로는 돌연변이체 인테그라제에 의해 인식되는 서열을 포함한다. 파지 게놈을 그의 숙주 (예컨대, E. 콜라이(E. coli) 세포)의 게놈 내로 통합시키는 동안, 효소는 파지 게놈의 attP 부위와 박테리아 게놈의 attB 부위 사이의 DNA교환을 촉매화시켜 attL 및 attR 부위를 형성한다. 파지 인테그라제 (예컨대, phiC-31 인테그라제)에 의해 인식되는 부위-특이적 재조합 부위 (예컨대, attP 부위)를 (예컨대, 본원에 개시된 천연 염색체 통합 부위에서) 숙주 게놈 내로 삽입시킴으로써 동족 인식 부위 (예컨대, attB 부위)에 부착된 이종성 폴리뉴클레오티드를 파지 인테그라제에 의해 촉매화되는 부위-특이적 재조합을 통해 숙주 게놈 내로 쉽게 삽입시킬 수 있다.
임의의 부위-특이적 리콤비나제 (예컨대, 세린 또는 티로신 파지 인테그라제)에 의해 인식되는 파지 부착 부위 (attP) 및 박테리아 부착 부위 (attB 부위)는 본원에 기술된 부위-특이적 재조합 서열로서 사용될 수 있다. 주어진 파지 인테그라제에 의해 인식되는 야생형 (천연) attB 및 attP 부위 뿐만 아니라, 의사 부위, 둘 모두를 포함한다. 각종 파지 및 다른 종에 대한 부위-특이적 리콤비나제 및 그 각자의 인식 서열 (attP 및 attB 부위)은 당업계에 공지되어 있고, 특징 규명되어 있다. 그 예로는 λ 파지 인테그라제 (문헌 [Enquist et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43:1115-1120, 1979]), HK022 파지 인테그라제 (문헌 [Yagil et al., J. Mol. Biol. 207:695-717, 1989]), P22 파지 인테그라제 (문헌 [Leong et al., J. Biol. Chem. 260:4468-4477, 1985]), HP1 파지 인테그라제 (문헌 [Waldman et al., J. Bacteriol. 165:297-300, 1986]), L5 파지 인테그라제 (문헌 [Lee et al., J. Bacteriol. 175:6836-6841, 1993]), phiC-31 파지 인테그라제 (문헌 [Kuhstoss and Rao, J. Mol. Biol. 222:897-908, 1991]), R4 파지 (문헌 [Groth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5995-6000, 2000]), TP901 파지 인테그라제 (문헌 [Christiansen et al., J. Bacteriol. 178:5164-5173, 1996]), γδ 트랜스포존 레솔바제 (문헌 [Reed et al., Nature 300:381-383, 1982]), Tn3 트랜스포존 레솔바제 (문헌 [Krasnow et al., Cell 32:1313-1324, 1983) 및 Mu 파지 인버타제 Gin (문헌 [Kahmann et al., Cell 41:771-780, 1985])을 포함한다.
부위-특이적 리콤비나제에 의해 인식되는 야생형 재조합 부위 이외에도, 폴리뉴클레오티드 분자 또는 벡터 중에 존재하는 랜딩 패드 삽입을 위한 부위-특이적 재조합 서열은 또한 1 이상의 염기쌍 변경 (치환, 결실 또는 삽입)에 의해 야생형 인식 부위 (예컨대, 야생형 attP 부위)와 차이를 보이는 서열을 포함할 수 있다. 서열 변경은 부위-특이적 재조합 서열 내의 임의 위치에서 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 부위-특이적 재조합 서열은 야생형 인식 부위와 비교하여 다중의 서열 변경을 가진다. 상기와 같은 변형된 부위-특이적 재조합 서열 (예컨대, 변형된 attP 부위)은 본원에 기술된 바와 같이 조작된 숙주 세포의 게놈 내로 통합되고, 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 트랜스진을 재조합 부위 내로 도입시키기 위해서는 상응하는 인테그라제 (예컨대, 돌연변이체 phi-C31 인테그라제)의 야생형 또는 돌연변이체 버전이 필요할 수 있다. 다양한 돌연변이체 인테그라제 (예컨대, 돌연변이체 phiC-31 인테그라제) 또한 당업계에 알려져 있다. 예컨대, 문헌 [Smith et al., Nuc. Acids Res. 32, 2607-2617, 2004]; 및 [Kevarala et al., Mol. Ther. 17, 112-120, 2008]을 참조할 수 있다.
이종성 폴리뉴클레오티드 서열 (트랜스진 또는 염색체 랜딩 패드)을 숙주 세포의 게놈 내로 삽입하는 경우, 상기 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 벡터 ("삽입 벡터") 내에 존재한다. 이러한 벡터는 전형적으로 환형이고, 상동성 재조합을 위해 사용되기 이전에 선형화된다. 상동성 아암 및 이종성 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 랜딩 패드) 이외에도, 벡터는 또한 선별 또는 스크리닝에 적합한 마커, 복제 기점, 및 다른 요소를 함유할 수 있다. 본원 실시예에 예시되어 있는 바와 같이, 벡터는 양성 선별 마커 및 음성 선별 마커, 둘 모두를 포함할 수 있다. 벡터가 통합되어 있는 숙주 세포를 확인하는 데 양성 선별 마커, 예컨대 항생제 저항성 유전자가 사용된다. 상기와 같은 마커의 예로는 네오마이신 , 블라스티시딘, 히그로마이신 및 제오신에 대한 항생제 저항성 유전자를 포함한다. 음성 선별 마커, 예컨대 자살 유전자는 원하는 위치에서 상동성 재조합이 이루어진 세포는 유지시키면서, 벡터 서열이 무작위로 통합되어 있는 세포는 제거하는 역할을 한다. 상기와 같은 음성 선별 마커의 예로는 본원 실시예에서 예시된 바와 같은 HCV-TK 유전자가 있다. 양성 스크리닝 마커 (예컨대, 증강된 녹색 형광 단백질)는 (예컨대, 형광 활성 세포 분류, FACS에 의해) 벡터가 안정하게 통합되어 있는 숙주 세포를 확인하는 데 사용된다. 음성 스크리닝 마커, 예컨대 시안 형광 단백질은 벡터 서열이 무작위로 통합되어 있는 세포를 (예컨대, FACS에 의해) 확인하는 데 사용된다. 양성 스크리닝 마커는 함유하지만, 음성 스크리닝 마커는 함유하지 않는 세포에 대한 FACS를 통해 원하는 위치에서 상동성 재조합이 이루어진 세포를 확인할 수 있을 것이다.
삽입 벡터 (뿐만 아니라, 하기 기술되는 표적화 벡터)의 성분 중 한가지 더 말하자면 복제 기점이 있다. 복제 기점은 다합체 기점-결합 단백질에 의해 인식되고, 기점 부위에서 DNA 복제 효소를 조립하는 데 중요한 역할을 하는 다중의 짧은 반복 서열을 포함하는 독특한 DNA 세그먼트이다. 벡터에서 사용하는 데 적합한 복제 기점으로는 예컨대, EBV oriP, SV40, E. 콜라이 oriC, colE1 플라스미드 기점, ARS 등을 포함한다. 발현 벡터에서 또 다른 유용한 요소는 다중 클로닝 부위 또는 폴리링커이다. 일련의 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 코딩하는 합성 DNA는 플라스미드 벡터 내로 예를 들어, 프로모터 요소의 하류로 삽입된다. 편리하게 특이적 위치의 벡터로 DNA를 클로닝할 수 있도록 상기 부위는 조작된다.
이종성 폴리뉴클레오티드를 숙주 게놈 내로 삽입하기 위한 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 분자 생물학 분야에 공지되어 있는 표준 방법 (예컨대, [Sambrook et al., 상기 문헌 동일]; 및 [Brent et al., 상기 문헌 동일]) 및 본원의 개시내용에 따라 쉽게 구축될 수 있다. 벡터를 제조하기 위해, 상동성 아암 및 이종성 폴리뉴클레오티드 서열 (예컨대, 트랜스진 또는 염색체 랜딩 패드)을 포함하는 상기 기술된 폴리뉴클레오티드는 포유동물 숙주 세포를 형질감염시키기 위한 다양한 공지의 플라스미드 내로 삽입될 수 있다. 상기와 같은 공지의 플라스미드로는 예컨대, BPV, EBV, 백시니아 바이러스 기반 벡터, SV40, 2-㎛ 서클, pcDNA3.1, pcDNA3.1/GS, pYES2/GS, pMT, p IND, pIND(Sp1), pVgRXR (인비트로겐(Invitrogen)) 등, 또는 그의 유도체를 포함한다. 이러한 플라스미드는 모두 당업계에 기술되어 있고, 주지되어 있다 (문헌 [Botstein et al., Miami Wntr. SyTnp. 19:265-274, 1982]; [Broach, In: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces : Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., p. 445-470, 1981]; [Broach, Cell 28:203-204, 1982]; [Dilon et at., J. Clin. Hematol. Oncol. 10:39-48, 1980]; 및 [Maniatis, In: Cell Biology : A Comprehensive Treatise, Vol. 3, Gene Sequence Expression, Academic Press, NY, pp. 563-608, 1980]).
V. 이종성 폴리뉴클레오티드가 통합되어 있는 조작된 세포
본원에서는 본원에 개시된 천연 염색체 통합 부위 중 하나 이상의 부위에서 게놈 내로 안정하게 통합되어 있는 이종성 폴리뉴클레오티드 (재조합 유전자 또는 염색체 랜딩 패드)를 포함하는 재조합 또는 조작된 숙주 세포를 제공한다. 재조합 유전자가 개시된 부위에 통합되어 있는 세포를 통해 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 안정하고 강력하게 발현될 수 있다. 염색체 랜딩 패드가 통합되어 있는 세포를 통해 관심 표적 폴리뉴클레오티드 또는 유전자는 효율적으로 부위-특이적 통합 및/또는 발현될 수 있다. 하기 설명되는 바와 같이, 조작된 숙주 세포는 또한 상기와 같이 삽입된 염색체 랜딩 패드를 보유하고, 이어서, 하나 이상의 트랜스진이 랜딩 패드 내로 통합되어 있는 세포 또한 포함할 수 있다. 상기 기술된 폴리뉴클레오티드 분자 또는 삽입 벡터를 사용하여, 본원에 기술된 특이적 염색체 위치 중 하나 이상의 위치에 재조합 유전자 또는 염색체 랜딩 패드를 삽입함으로써 각종 세포를 변형시킬 수 있다.
상기 기술된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 삽입 벡터 (또는 하기 기술되는 표적화 벡터)는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 적절한 숙주 세포 (예컨대, 포유동물 세포 예컨대, CHO 세포) 내로 도입시킬 수 있다. 전형적으로, 적절한 제한 효소 분해를 통해 숙주 염색체에 상동성인 유리 말단을 생성한 후, 이어서, 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포로 형질감염시킬 수 있다. 당업계에서 통상적으로 실시되는 표준 프로토콜에 의해 선형화된 삽입 벡터를 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 예를 들어, 인산칼슘 공침전법에 의해, 종래 기계적인 방법, 예컨대 미세주입법 또는 전기천공에 의해, 리포좀에 내장된 플라스미드 삽입에 의해, 및 바이러스 벡터에 의해 벡터를 숙주 세포로 형질감염시킬 수 있다. 상기 기법은 모두 당업계에 주지되어 있고, 통상적으로 실시되는 것이다 (예컨대, 문헌 [Freshney, 상기 문헌 동일]; [Sambrook et al., 상기 문헌 동일]; 및 [Brent et al., 상기 문헌 동일]). 형질감염된 재조합 삽입 벡터를 보유하는 숙주 세포는 벡터 상에 존재하는 선별 마커를 사용하여 확인하고 단리시킬 수 있다. 이어서, 벡터 함유 세포를 선별할 수 있는 배지 중에서 다수의 수혜자 세포를 성장시킬 수 있다.
부위-특이적 재조합 서열 (즉, attP 서열)을 천연 염색체 삽입 부위로 삽입시키기 위한 특이적 벡터는 본원에 예시되어 있다 (도 2). attP 서열 이외에도, 벡터 는 언급된 천연 염색체 삽입 부위에서의 상동성 재조합을 지지하는 상동성 아암, 및 또한 선별 마커를 보유한다. 원하는 천연 삽입 부위에서 CHO 게놈 내로 통합시키기 위해, 벡터를 먼저 제한 분해를 통해 선형화시켰다. 선형화된 서열을 숙주 세포 (예컨대, CHO 세포) 내로 형질감염시킨 후, 이어서, 세포를 양성 및 음성 선별하여 상동성 재조합을 통해 부위-특이적 재조합 부위 (attP 부위)가 통합되어 있는 세포를 확인한다. 이어서, 상기와 같이 확인된 세포를 추가로 조사하고 선택된 천연 염색체 삽입 부위에서의 이종성 폴리뉴클레오티드의 통합에 관해 확인할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 유전자에 의해 코딩되는 치료용 또는 산업용 단백질을 제조하는 데 재조합 유전자가 통합되어 있는 세포를 직접 사용할 수 있다. 별법으로, 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 염색체 랜딩 패드 내로 통합시킴으로써 표적 폴리펩티드를 제조하는 데 염색체 랜딩 패드가 삽입되어 있는 세포가 사용될 수 있다.
바람직하게, 천연 염색체 삽입 부위에 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위한 숙주 세포는 진핵 생물 세포이다. 진핵 생물 벡터/숙주 시스템, 및 포유동물 발현 시스템을 통해 특히 발현된 포유동물 단백질의 번역 후 변형이 적절하게 이루어질 수 있고, 예컨대 1차 전사체의 적절한 프로세싱, 발현된 생성물의 당화, 인산화 및 이롭게는 분비가 이루어질 수 있다. 그러므로, 진핵 생물 세포, 예컨대 포유동물 세포는 본원에 기술된 천연 염색체 위치에 이종성 폴리뉴클레오티드 (재조합 유전자 또는 염색체 랜딩 패드)를 삽입하는 데 바람직한 숙주 세포이다. 적합한 세포로는 동물 세포 (예컨대, 곤충, 설치류, 소, 염소, 토끼, 양, 비인간 영장류, 인간 등으로부터의 세포) 및 식물 세포 (예컨대, 벼, 옥수수, 목화, 담배, 토마토, 감자 등), 둘 모두를 포함한다. 상기와 같은 숙주 세포주의 구체적인 예로는 CHO, BHK, HEK293, VERO, HeLa, COS, MDCK, PER.C6, 및 W138을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 천연 염색체 위치에 사전 삽입되어 있는 랜딩 패드 내로 관심 폴리뉴클레오티드 또는 트랜스진이 이미 안정하게 통합되어 있는 재조합 세포를 제공한다. 숙주 게놈 내로 이미 삽입되어 있는 염색체 랜딩 패드 내로 표적 폴리뉴클레오티드를 통합시키기 위한 표적화 벡터는 하기에서 더욱 상세하게 기술한다. 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 랜딩 패드는 부위-특이적 리콤비나제 (예컨대, 파지 인테그라제 예컨대, phi-C31 인테그라제)에 의해 인식되는 인식 서열 (예컨대, attP 부위)을 포함한다. 리콤비나제에 의해 인식되는 동족 인식 서열 (예컨대, attB 부위)에 부착시킴으로써, 적절한 전사 조절 요소와 함께 관심 폴리뉴클레오티드를 리콤비나제에 의해 매개되는 부위-특이적 재조합을 통해 랜딩 패드 내로 통합시킨다. 재조합 세포 중의 통합된 관심 폴리뉴클레오티드는 산업 또는 치료를 위한 적용에 유용한 임의의 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 상기와 같은 폴리펩티드 및 단백질의 구체적인 예는 상기 기술되어 있다. 이는 예컨대, 효소 (예컨대, 프로테아제, 포스포리파제 등), 프로테아제 억제제, 호르몬 (예컨대, 뇌하수체 호르몬), 성장 인자, 시토카인, 케모카인, 케모탁신, 고나도트로핀, 지질-결합 단백질, 소마토메딘, 고나도트로핀, 및 면역글로불린을 포함한다. 관심 다른 단백질로는 항미생물성 폴리펩티드 (예컨대, 항박테리아성, 항진균성, 항바이러스성, 및/또는 항기생충성 폴리펩티드), 및 항체 또는 그의 항원-결합 항체 단편 (예컨대, FAb) (예컨대, 오르토클론 OKT-e (항-CD3), GPIIb/IIa 단일클론 항체)을 포함한다.
포유동물 세포 이외에도, 본원에 기술된 이종성 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위한 숙주 세포는 또한 효모 세포 또는 식물 세포일 수 있다. 그렇게 조작된 효모 또는 식물 세포는 효모 또는 식물 발현 벡터를 통해 숙주 내로 도입되는 트랜스진을 안정하게 통합 및 발현시키는 데 적합하다. 적합한 곤충 세포의 예로는 초파리 애벌레로부터의 세포를 포함한다. 곤충 세포가 사용될 때, 이종성 폴리뉴클레오티드는 적절한 삽입 벡터를 통해 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 당업계에 기술되어 있는 바와 같이 바큘로바이러스 벡터가 사용될 수 있다 (문헌 [Jasny, Science 238: 1653, 1987]; 및 [Miller et al., In: Genetic Engineering (1986), Setlow, J. K., et al., eds., Plenum, Vol. 8, pp. 277-297]). 곤충 세포가 숙주로서 사용될 때, 이종성 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위한 삽입 벡터에서 초파리-알콜 데히드로게나제 프로모터가 임의적으로 사용될 수 있다 (문헌 [Rubin, Science 240:1453-1459, 1988]).
VI . 표적 폴리뉴클레오티드의 염색체 랜딩 패드 내로의 통합
상기 기술된 바와 같이, 폴리펩티드를 코딩하는 표적 폴리뉴클레오티드 또는 트랜스진 (즉, "관심 폴리뉴클레오티드" 또는 "관심 유전자")은 본원에 개시된 천연 염색체 통합 부위 내로 직접적으로 통합될 수 있다. 하기 기술된 치료용 또는 산업용 단백질 중 임의의 것의 안정적이고 효율적인 발현 및 제조는 이러한 방식으로 달성될 수 있다. 별법으로, 표적 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 천연 염색체 통합 부위에 이미 삽입되어 있는 염색체 랜딩 패드를 통해 숙주 게놈 내로 통합될 수 있다. 본원에 기술된 삽입된 염색체 랜딩 패드를 보유하는 조작된 숙주 세포를 사용함으로써, 세포에서 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 트랜스진을 통합하고 발현시키는 벡터 ("표적화 벡터") 및 방법 또한 제공한다. 다양한 유용한 표적 폴리펩티드를 코딩하는 관심 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 조작된 숙주 세포의 게놈 내로 안정하게 통합될 수 있다. 관심 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 대해 내인성 또는 외인성일 수 있다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 천연적으로 존재하지 않는 서열을 가지는 핵산 분자인 반면, 내인성 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 이미 존재하고 있는 서열을 가지는 핵산 분자이다. 발현될 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 다수의 구체적인 예는 하기에 기술되어 있다.
사용하고자 하는 조작된 숙주에 따라, 다양한 표적화 벡터가 적합하게 사용된다. 삽입된 염색체 랜딩 패드를 보유하는 바람직한 숙주 세포는 포유동물 세포 (예컨대, CHO 세포)이기 때문에, 표적화 벡터는 진핵 생물 발현용 벡터가 바람직하다. 일반적으로, 표적화 벡터는 동족 재조합 부위 또는 인식 서열에 부착되어 있는 관심 유전자를 가질 것이다. 벡터 상의 동족 재조합 부위는 또한 삽입된 염색체 랜딩 패드를 인식하는 부위-특이적 리콤비나제 (예컨대, phiC-31 인테그라제)에 의해 인식된다. 따라서, 벡터 상의 동족 재조합 부위는 리콤비나제에 의해 매개되는 표적 폴리뉴클레오티드의 랜딩 패드 내로의 통합을 지지할 것이다. 예를 들어, 특이적 파지 인테그라제의 삽입된 파지 부착 부위 (attP)를 보유하는 조작된 숙주 세포에서의 통합 및 발현을 위해, 벡터는 동일한 인테그라제에 의해서도 또한 인식되는 동족 박테리아 부착 부위 (attB 부위)에 부착된 표적 폴리뉴클레오티드를 가질 것이다. 유사하게, 삽입된 랜딩 패드가 파지 인테그라제의 attB 부위를 포함할 경우, 표적화 벡터는 인테그라제에 의해 인식되는 동족 attP 부위를 포함할 것이다. 일부 파지 인테그라제, 예컨대 phi-C31 및 R4는 박테리아 부착 부위보다는 파지 부착 부위 (attP 부위)로의 통합을 선호한다. 이러한 효소의 경우, 표적화 벡터는 attB 부위를 보유하여야 하는 반면, 랜딩 패드는 attP 부위를 포함하여야 한다. 다른 파지 인테그라제는 파지 부착 부위보다는 우선적으로 박테리아 부착 부위 (예컨대, 의사 attB)로 통합된다. 이러한 선호도를 가지는 효소의 예로는 phiBT1 인테그라제 및 A118 인테그라제를 포함한다. 이러한 인테그라제가 사용될 때, 표적 벡터는 attB 부위 대신 attP 부위를 보유하여야 하는 반면, 숙주 세포는 삽입된 랜딩 패드 중 attB 부위를 함유하여야 한다.
랜딩 패드에의 통합시 표적 폴리뉴클레오티드 발현을 지지하기 위해, 표적화 벡터는 또한 표적 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열 및 다른 전사 조절 요소 (예컨대, 인핸서 서열)를 함유할 수 있다. 일반적으로, 프로모터는 그가 도입되는 세포 유형에서 기능성인 것으로 선택될 수 있다. 포유동물 숙주 세포에서의 발현을 위해 당업계에 공지된 다수의 프로모터가 사용될 수 있다. 그 예로는 마우스 메탈로티오네인 I 유전자 서열의 프로모터 (문헌 [Hamer et al., J Mol. Appl . Gen. 1:273-288, 1982]); 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터 (문헌 [McKnight, Cell 31:355-365, 1982]); SV40 조기 프로모터 (문헌 [Benoist et al., Nature ( London ) 290:304-310, 1981]); 효모 gal1 유전자 서열 프로모터 (문헌 [Johnston et al., Proc . Natl . Acad . Sci . ( USA ) 79:6971-6975, 1982]; [Silver et al., Proc . Natl . Acad . Sci . ( USA ) 81 :5951-59SS, 1984]), CMV 프로모터, EF-1 프로모터, 액틴 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 프로모터, 유비퀴틴 프로모터 및 티미딘 키나제 프로모터, 엑디손-반응성 프로모터(들), 테트라시클린-반응성 프로모터 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
추가로, 표적화 벡터는 선별 또는 스크리닝 마커 서열, 복제 기점 등을 가질 수 있다. 상기 기술된 삽입 벡터에서 사용되는 마커와 같이, 표적화 벡터 중의 선별 또는 스크리닝 마커 또한 오직 벡터를 함유하는 세포의 성장만을 선별 또는 스크리닝하는 수단을 제공한다. 그러한 선별 마커에는 전형적으로 2가지 유형이 있다: 약물 저항성 및 영양요구성. 약물 저항성 마커를 통해 세포는 해독되지 않으면, 세포를 사멸시킬 수도 있는 외인성으로 첨가된 약물을 해독시킬 수 있다. 영양요구성 마커를 통해 세포는 필수 성분 (보통 아미노산)이 부족한 배지 중에서 성장하는 동안 상기 필수 성분을 합성할 수 있다. 통상의 선별가능한 마커 유전자로는 항생제, 예컨대 암피실린, 테트라시클린, 카나마이신, 블레오마이신, 스트렙토마이신, 히그로마이신, 네오마이신, 제오신™, G418 등에 대해 저항성인 것을 포함한다. 선별가능한 영양요구성 유전자로는 히스티디놀의 존재하에 히스티딘 무함유 배지 중에서 성장할 수 있도록 하는 예를 들어, hisD를 포함한다.
선별 마커 서열 및 전사 조절 요소는, 일단 랜딩 패드에서 부위-특이적 재조합이 이루어지고 나면, 숙주 게놈 내로 표적 폴리뉴클레오티드와 함께 공동으로 통합될 수 있도록 하는 방식으로 벡터 중에 표적 폴리뉴클레오티드 및 동족 리콤비나제 인식 서열에 연결되어야 한다. 본원에 기술된 표적화 벡터는 본 명세서의 교시를 고려하여, 분자 생물학 분야에 공지되어 있는 방법을 사용함으로써 구축될 수 있다. 예컨대, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (3rd ed., 2001)]; [Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003)]; 및 [Freshney, Culture of Animal Cells : A Manual of Basic Technique , Wiley-Liss, Inc. (4th ed., 2000)]을 참조할 수 있다. 전형적으로, 랜딩 패드에 동족인 재조합 부위, 관심 폴리뉴클레오티드, 선별 마커를 코딩하는 서열, 및 본원에 기술된 다른 임의적인 요소를 적합한 벡터 골격 내로 삽입함으로써 표적화 벡터가 조립된다.
삽입된 염색체 랜딩 패드 및 표적화 벡터를 보유하는 조작된 숙주 세포 이외에도, 랜딩 패드 (예컨대, attP 부위)에서의 표적 폴리뉴클레오티드의 부위 특이적 통합을 위해서는 상응하는 리콤비나제 (예컨대, 파지 인테그라제, 예컨대 phiC-31 인테그라제)의 촉매 활성 또한 필요할 것이다. 리콤비나제 (예컨대, phiC-31 인테그라제)는 표적화 벡터의 도입 이전, 그와 동시에, 또는 그 이후에 표적 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 설명한 바와 같이, 다양한 파지 인테그라제가 고려된다. 표적 폴리뉴클레오티드를 조작된 숙주 세포 내로 통합시키는 데 사용되는 특이적 인테그라제는 표적화 벡터 중의 동족 인식 서열 및 숙주 게놈의 랜딩 패드 중의 부위-특이적 재조합 서열에 상응하고, 그를 인식하여야 한다. 일부 실시양태에서, 단방향 부위-특이적 리콤비나제는 세린 인테그라제이다. 시험관내 및 생체내 재조합에 유용할 수 있는 세린 인테그라제로는 파지 phi-C31, R4, TP901-1, phiBT1, Bxb1, RV-1, A118, U153, 및 phiFC1로부터의 인테그라제 뿐만 아니라, 긴 세린 인테그라제 패밀리 중의 다른 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예컨대, 문헌 [Gregory et al., J. Bacteriol , 185:5320-5323, 2003]; [Groth and Calos, J. Mol. Biol. 335:667-678, 2004]; [Groth et al., Proc . Natl . Aacd . Sci . 97:5995-6000, 2000]; [Olivares et al., Gene 278:167-176, 2001]; [Smith and Thorpe, Molec. Microbiol , 4: 122-129, 2002]; 및 [Stoll et al., J Bacteriol , 184:3657-3663, 2002]를 참조할 수 있다. 이러한 야생형 인테그라제 이외에도, 돌연변이를 보유하는 변경된 인테그라제 또한 당업계에 공지되어 있다 (예컨대, 문헌 [Sclimenti et al., Nuc . Acid Res . 29:5044-5051, 2001] 참조). 야생형과 비교하여 활성 또는 특이성이 변경된 상기와 같은 인테그라제 또한 재조합 반응, 및 표적 폴리뉴클레오티드의 조작된 숙주 게놈 내로의 통합에 유용하다.
일부 실시양태에서, 정제된 효소 폴리펩티드를 숙주 세포 내로 도입하여 표적화 벡터의 통합을 매개한다. 기능성 단백질을 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 파지 인테그라제 폴리펩티드, 예컨대 phiC-31 인테그라제를 리포솜, 코팅된 입자, 위스커, 미세주입법, 전기천공, 및 펩티드 수송체를 비롯한, 많은 수단에 의해 세포 내로 직접적으로 도입할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Siprashvili et al., Mol . Ther ., 9:721-728, 2004] 참조). 일부 다른 실시양태에서, 적합한 발현 벡터를 사용하여 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입할 수 있다. 인테그라제는 관심 유전자를 발현하는 동일한 표적화 벡터로부터 발현될 수 있다. 별법으로, 제2 벡터를 통해 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인테그라제를 코딩하는 DNA 서열을 발현 벡터 상에 숙주 세포 내로 도입한다. 이는 예컨대, 문헌 [Olivares et al., Gene , 278:167-176, 2001]; 및 Thyagarajan et al., Mol Cell Biol 21:3926-3934, 2001]과 같이 당업계에 기술되어 있는 바와 같이 수행될 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, 부위 특이적 통합은 리콤비나제 폴리펩티드를 코딩하는 RNA 분자의 일시적인 존재에 의존한다. 예를 들어, 파지 인테그라제를 코딩하는 mRNA 분자를 예컨대, 문헌 [Groth et al., J. Mol . Biol . 335:667-678, 2004]; 및 [Hollis et al., Repr . Biol . Endocrin . 1:79, 2003]에 기술되어 있는 바와 같이, 숙주 세포 내로 도입할 수 있고, 상기 세포에서 발현시킬 수 있다. 일반적으로는 표적화 벡터의 조작된 숙주 세포의 게놈 내로의 삽입을 위해 필요한 시간에만 오직 인테그라제가 존재하는 것이 바람직하다. 인테그라제-코딩 RNA (예컨대, mRNA)를 도입하면, 확실하게 일시적으로 발현될 수 있으며, 인테그라제-코딩 핵산이 표적 게놈 내로 영구적으로 혼입될 가능성은 제거된다. 부위-특이적 리콤비나제의 일시적인 발현은 또한 다른 수단을 통해서도 달성될 수 있다. 예를 들어, 효소를 발현하는 폴리뉴클레오티드를 조절가능한 프로모터 (즉, 발현이 선택적으로 유도될 수 있거나, 억제될 수 있는 프로모터)의 제어하에 배치할 수 있다.
표적 세포의 위치에 따라, 시험관내에서 또는 생체내에서 표적화 벡터 및/또는 파지 인테그라제를 발현하는 제2 벡터를 표적 세포 내로 도입하는 데 임의의 편리한 프로토콜이 사용될 수 있다. 예를 들어, 조작된 숙주 세포가 단리된 세포일 경우, 표적 세포의 생존가능성을 허용하는 세포 배양 조건하에서 예컨대, 표준 형질전환 기법을 사용함으로써 표적화 벡터를 직접 세포 내로 도입시킬 수 있다. 상기 기법으로는 바이러스 감염, 형질감염, 컨쥬게이션, 원형질 융합, 전기천공, 입자 총 기술, 인산칼슘 침전법, 직접 미세주입법, 바이러스 벡터 전달 등을 포함하나, 반드시 이에 한정될 필요는 없다. 방법 선택은 일반적으로 형질전환되는 세포 유형, 및 형질전환이 이루어지는 환경 (즉, 시험관내, 생체외, 또는 생체내)에 따라 달라진다. 이러한 방법에 대한 일반적인 논의는 예컨대, 문헌 [Brent et al., 상기 문헌 동일]에서 살펴볼 수 있다.
별법으로, 조작된 숙주 세포 또는 세포들이 다세포 유기체의 일부분일 경우, 표적화 벡터는 표적화 벡터가 숙주 세포(들) 내로 진입할 수 있는 방식으로, 예컨대 생체내 또는 생체외 프로토콜을 통해 유기체 또는 숙주에 투여될 수 있다. "생체내"란, 표적 구축물이 살아있는 동물의 체내로 투여된다는 것을 의미하는 것이다. "생체외"란, 세포 또는 기관이 신체 외부에서 변형되는 것을 의미하는 것이다. 전형적으로 상기 세포 또는 기관은 살아있는 신체로 다시 복귀하게 된다. 핵산 구축물을 투여하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터를 사용하여 (문헌 [Monahan et al., Gene Therapy 4:40-49, 1997]; [Onodera et al., Blood 91 :30-36, 1998]), "네이키드 DNA" 흡수 등에 의해 핵산 구축물을 양이온 지질과 함께 전달할 수 있다 (문헌 [Goddard, et al., Gene Therapy, 4:1231-1236, 1997]; [Gorman et al., Gene Therapy 4:983-992, 1997]; [Chadwick et al., Gene Therapy 4:937-942, 1997]; [Gokhale et al., Gene Therapy 4: 1289-1299, 1997]; [Gao and Huang, Gene Therapy 2:710-722, 1995]). 핵산 구축물의 생체외 투여를 위해 당업계에 주지된 세포 형질감염 기법 (상기 논의 참조)이 사용될 수 있다. 정확한 제제화, 투여 경로, 및 투여량은 실험적으로 선택될 수 있다. 예컨대, 문헌 [Fingl et al., 1975, in The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1 p 1]을 참조할 수 있다.
VII . 조작된 숙주 세포를 이용하여 발현시키고자 하는 표적 폴리펩티드 또는 단백질
상기 기술된 조작된 숙주 세포는 관심 임의의 폴리뉴클레오티드를 안정하게 발현시키는 데 유용하다. 관심 폴리뉴클레오티드는 의료용 또는 산업용으로 적용되는 다양한 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 숙주 세포에서 랜딩 패드 내로 통합시키고자 하는 관심 표적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 치료용 단백질을 코딩하는 것일 수 있다. 치료용 단백질의 예로는 인자 VIII, 인자 IX, β-글로빈, 저밀도 지질단백질 수용체, 아데노신 데아미나제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 스핑고마이엘리나제, 글루코세레브로시다제, 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절인자, α-안티트립신, CD-18, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기노숙시네이트 신테타제, 페닐알라닌 히드록실라제, 분지쇄 α-케토산 데히드로게나제, 푸마릴아세토아세테이트 히드롤라제, 글루코스 6-포스파타제, α-L-푸코시다제, β- 글루쿠로니다제, α-L-이듀로니다제, 갈락토스 1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제, 인터류킨, 시토카인, 소형 펩티드 등을 포함한다. 조작된 숙주 세포에서 통합된 표적 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있다는 다른 치료용 단백질로는 예컨대, 헤르셉틴(Herceptin)®, 각종 병원체, 예컨대 질환 유발 박테리아 또는 바이러스 (예컨대, E. 콜라이, P. 아에루기노사(P. aeruginosa), S. 아우레우스(S. aureus), 말라리아, HIV, 광견병 바이러스, HBV, 및 시토메갈로바이러스)로부터의 폴리펩티드 항원, 및 다른 단백질, 예컨대 락토페린, 티오레독신 및 베타-카제인백신을 포함할 수 있다.
관심 단백질에 대한 추가의 예로는 에리트로포이에틴, 조직 플라스미노겐 활성 인자 (tPA), 우로키나제, 스트렙토키나제, 뉴트로포에시스 자극 단백질 (이는 또한 필가스팀 또는 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)로도 공지되어 있다), 트롬보포이에틴 (TPO), 성장 호르몬, 헤모글로빈, 인슐리노트로핀, 이미글루세라제, 사르그라모스팀, 엔도텔린, 가용성 CD4, 및 항체 및/또는 그의 항원-결합 단편 (예컨대, FAb) (예컨대, 오르토클론 OKT-e (항-CD3), GPIIb/IIa 단일클론 항체), 섬모 신경 돌기 형질전환 인자 (CNTF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 뇌 유래 신경 돌기 인자 (BDNF), 부갑상샘 호르몬 (PTH)-유사 호르몬, 인슐린자극성 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 표피 성장 인자 (EGF), 산성 섬유아세포 성장 인자, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 형질전환 성장 인자 β, 신경 돌기 성장 인자 (NGF), 인터페론 (IFN) (예컨대, IFN-α2b, IFN-α2a, IFN-αN1, IFN-β1b, IFN-γ), 인터류킨 (예컨대, IL-1, IL-2, IL-8), 종양 괴사 인자 (TNF) (예컨대, TNF-α, TNF-β), 형질전환 성장 인자-α 및 -β, 카탈라제, 칼시토닌, 아르기나제, 페닐알라닌 암모니아 리아제, L-아스파라기나제, 펩신, 유리카제, 트립신, 키모트립신, 엘라스타제, 카르복시펩티다제, 락타제, 수크라제, 내인성 인자, 혈관활성 장 펩티드 (VIP), 칼시토닌, Ob 유전자 생성물, 콜레시스토키닌 (CCK), 세로토닌, 및 글루카곤을 포함하나, 반드시 이에 한정될 필요는 없다.
통합된 표적 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는, 관심 적합한 폴리펩티드로는 또한 특이적 막 단백질 또는 다른 세포내 단백질을 포함한다. 막 단백질의 예로는 아드레날린성 수용체, 세로토닌 수용체, 저밀도 지질단백질 수용체, CD-18, 사르코글리칸 (근이영양증인 경우, 결핍되어 있는 것) 등을 포함하나, 반드시 이에 한정될 필요는 없다. 유용한 세포내 단백질로는 주로 세포내 구획 내에 위치하는 단백질, 또는 세포 내에서 원하는 생물학적 활성을 보이는 단백질을 포함한다. 그러한 세포내 단백질로는 유전성 티로신혈증 1형을 앓는 대상체에서 결핍되어 있는 푸마릴아세토아세테이트 히드롤라제 (FAH)를 포함한다. 세포내 단백질의 다른 구체적인 예로는 항바이러스 단백질 (예컨대, 바이러스 복제 또는 감염된 세포의 선택적 사멸을 억제시킬 수 있는 단백질), 구조 단백질, 예컨대 콜라겐, 즉, VII형 콜라겐 COL7A1 유전자 (열성 이영양성 수포성 표피박리증 (RDEB)에서 결핍되어 있는 것), 및 디스트로핀 (근이영양증에서 결핍되어 있는 것)을 포함한다.
VIII . 키트 , 및 트랜스진이 통합되어 있는 트랜스제닉 동물
본원에서는 상기 기술된 조작된 숙주 세포를 사용하기 위한 키트를 제공한다. 키트를 통해 당업자는 본원에 개시된 하나 이상의 천연 염색체 통합 부위에 표적 트랜스진 또는 삽입된 염색체 랜딩 패드를 보유하는 조작된 숙주 세포에서 이종성 폴리뉴클레오티드를 부위-특이적으로 통합시키고/거나, 발현시킬 수 있다. 본원에 기술된 일부 키트는 표적 폴리뉴클레오티드가 게놈 중 천연 염색체 통합 부위에 직접 삽입되어 있는 조작된 숙주 세포 (예컨대, CHO 세포)를 포함한다. 일부 다른 키트는 게놈 중 천연 염색체 통합 부위 내로 사전 통합되어 있는 하나 이상의 염색체 랜딩 패드에 표적 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 있는 조작된 숙주 세포를 포함한다. 본원에 기술된 추가의 일부 다른 키트는 하나 이상의 천연 염색체 통합 부위에 염색체 랜딩 패드가 삽입되어 있는 재조합 세포 및 염색체 랜딩 패드 내로 표적 폴리뉴클레오티드를 삽입시키기 위한 다른 시약을 포함한다.
예시하는 바와 같이, 본원에 기술된 일부 키트는 하기 성분들, 본원에 기술된 천연 염색체 위치 중 하나 이상의 위치에 삽입된 랜딩 패드 (예컨대, attP 부위)를 보유하는 조작된 숙주 세포 (예컨대, CHO 세포주), 이종성 폴리뉴클레오티드를 클로닝 및 통합시키기 위한 표적화 벡터, 및 인테그라제 성분 (예컨대, phiC-31) 중 적어도 하나 이상을 포함한다. 키트는 임의적으로는 또한 표적화 벡터로 클로닝 및 숙주 세포에서 발현시키고자 하는 표적 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 전형적으로, 표적화 벡터로의 클로닝시, 이종성 표적 폴리뉴클레오티드는 삽입된 랜딩 패드에서의 통합을 위해 인테그라제에 의해서도 인식되는 동족 서열 (예컨대, attB 부위)에 부착된다. 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 인테그라제 성분은 임의의 적합한 형태로 (예컨대, 표적 세포 내로의 도입을 위해 제제화된 단백질로서, 또는 조작된 숙주 세포 내로의 도입 후, 원하는 인테그라제로 발현시키는 인테그라제 벡터로) 제공될 수 있다. 따라서, 일부 키트는 실질적으로 정제된 리콤비나제 폴리펩티드 (예컨대, phiC-31)를 포함할 수 있다. 일부 다른 키트는 숙주 세포에서 효소를 발현시킬 수 있는 제2 벡터를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 키트는 임의적으로 다른 성분, 예컨대 표적화 폴리뉴클레오티드를 클로닝시키기 위한 제한 효소, 제어 플라스미드, 완충제 등을 포함할 수 있다. 키트의 다양한 성분이 별개의 용기에 존재할 수 있거나, 또는 원하는 대로, 특정의 화합성 성분은 단일 용기 내로 사전 조합될 수 있다.
다양한 시약 이외에도, 본원에 기술된 키트는 전형적으로는 관심 폴리뉴클레오티드를 통합 및 발현시키는 데 있어서 키트의 성분을 사용하는 방법에 관한 설명서를 추가로 포함한다. 대상 방법 실시에 관한 설명서는 일반적으로 적합한 기록 매체 상에 기록되어 있다. 예를 들어, 설명서는 기판, 예컨대 종이 또는 플라스틱 등에 인쇄되어 있을 수 있다. 따라서, 설명서는 키트에 패키지 삽입물로서, 키트 또는 그의 성분의 용기의 라벨링 (즉, 패키징 또는 서브패키징과 결합되어 있는 것)으로 존재할 수 있다. 다른 실시양태에서, 설명서는 적합한 컴퓨터 판독가능한 저장 매체, 예컨대 CD-ROM, 디스켓 등에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로서 존재한다. 추가의 일부 다른 실시양태에서, 실제 설명서는 키트내 존재하지 않지만, 예컨대 인터넷을 통해 원격 소스로부터 설명서를 얻기 위한 수단으로 제공된다. 상기 실시양태의 일례는 설명서를 살펴볼 수 있고/거나, 그로부터 설명서를 다운로드 받을 수 있는 웹 어드레스를 포함하는 키트이다. 설명서와 마찬가지로, 설명서를 얻기 위한 수단도 적합한 기판 상에 기록되어 있다.
본원에 개시된 하나 이상의 천연 염색체 통합 부위에 이종성 폴리뉴클레오티드 (트랜스진 또는 염색체 랜딩 패드)를 삽입함으로써 그의 게놈이 변형되어 있는 것인 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물을 추가로 제공한다. 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물은 또한 염색체 랜딩 패드가 삽입되어 있고, 삽입된 랜딩 패드에 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드를 통합함으로써 추가로 변형되어 있는 게놈을 가질 수 있다. 본원에 기술된 방법으로 제조될 수 있는 트랜스제닉 동물의 예로는 마우스, 래트, 닭, 고양이, 개, 토끼, 돼지, 염소, 양, 소, 말 뿐만 아니라, 비인간 영장류, 예컨대 레서스 원숭이를 포함한다. 본원에 기술된 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물은 천연 염색체 통합 부위 중 하나 이상의 부위에서 게놈 내로 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 트랜스진을 통합함으로써 제조될 수 있다. 다른 트랜스제닉 동물 또는 식물은 본원에 기술된 바와 같이 게놈 내로 이미 삽입되어 있는 염색체 랜딩 패드로 표적 폴리뉴클레오티드를 통합시킴으로써 제조된다. 표적 세포는 본원에 기술된 시스템 및 방법을 사용하여 쉽게 유전자 변형될 수 있고, 본원에 기술된 트랜스제닉 동물을 제조하는 데 적합한 임의의 세포일 수 있다. 표적 세포는 예컨대, 배양물 중에서, 또는 다세포 유기체 (예컨대, 포배에서, 태아에서, 또는 출생후 동물 등에서)에서 단리될 수 있다. 예시적인 표적 세포로는 1차 세포, 2차 세포, 형질전환된 세포, 난세포, 수정란 세포, 단세포 배아, 체세포 (예컨대, 근육, 뼈, 연골, 인대, 힘줄, 피부 (진피, 표피 등)), 내장 세포 (예컨대, 폐, 간, 췌장, 위장관 (입, 위, 장) 등), 줄기 세포 (예컨대, 배아 줄기 세포 (예컨대, 배아 줄기 세포 표현형을 가지는 세포), 성체 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 등), 및 생식 세포 (예컨대, 원시 생식 세포, 배아 생식 세포 등)를 포함하나, 반드시 이에 한정될 필요는 없다.
트랜스제닉 동물 또는 식물은 당업자에 의해 통상 실시되는 방법을 사용함으로써 제조될 수 있다. 예컨대, 하기 문헌을 참조할 수 있다:
Figure 112013099073815-pct00003
및 미국 특허 번호 제5,175,384호, 및 미국 특허 번호 제4945050호, 제5175384호, 및 제5175385호.
실시예
하기 실시예는 본원에 기술된 범주를 제한하고자 하는 것이 아니라, 추가로 설명하기 위해 제공한다. 다른 변이형도 당업계의 숙련가에게는 쉽게 자명해질 것이며, 첨부된 특허청구범위에 포함된다.
실시예 1 강력한 전사 활성을 가진 천연 염색체 부위 확인
CHO 게놈 내로의 무작위 통합을 위한 플라스미드: 문헌 [Thyagarajan et al., (2001, Mol Cell Biol . 21(12):3926-34)]에 기술되어 있는 원래의 attP 함유 플라스미드에 기초하여 플라스미드를 변형시켰다. 구체적으로, 제오신 마커를 네오마이신 마커로 대체하여 원래의 플라스미드를 변형시켰다. 추가로, 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 SV40 프로모터에 의해 제어되는 EGFP 유전자로 대체하였다 (도 1).
안정한 형질감염: 변형된 플라스미드를 퀴아젠 미디프렙(Qiagen midiprep) 칼럼을 사용하여 정제하였다. 25 ㎍의 DNA를 밤새도록 제한 효소 BamHI로 분해하여 플라스미드를 선형화시켰다. 이어서, 생성된 선형 DNA로 CHO 세포를 형질감염시켜 안정하게 통합시켰다. 형질감염 후 2일이 경과하였을 때, 세포를 새 플레이트로 나누어 놓고, 안정한 통합 이벤트 선별을 위해 히그로마이신을 성장 배지에 첨가하였다. FACS 분석을 위해 수거하기 전 3일 동안 세포를 배양물 중에서 성장시켰다.
FACS: 히그로마이신 선별하에 배양물 중에서 3주 동안 성장시킨 후, 스크립스 FACS 코어 퍼실리티(Scripps FACS Core Facility)에서 대량 분류하기 위해 안정한 세포를 함께 풀링하고; EGFP 발현 세포 중 상위 1%를 수집하고, 배양 배지로 복귀시켜, 회복시키고 수주 동안 성장시켰다. 세포 배양 플레이트가 컨플루언트되었을 때, 세포를 수집하고, FACS에 의해 다시 분류하였다. 이 시점에서, EGFP 발현 세포 중 상위 1%를 개별 세포로 96웰 플레이트의 웰로 분류해내었다.
단일 세포 집단: 96웰 플레이트로 분류된 세포를 2 내지 3주 동안 상기 플레이트에서 성장시킨 후, 24웰 플레이트로 옮겨 놓았다. 1주후, 확장 배양을 위해 세포를 6웰 플레이트로 옮겨 놓았다. 이 단계에서, 단일 세포 집단이 안정하게 통합된 attP 함유 플라스미드 구축물을 함유하고, EGFP 발현을 유지하는지 확인하기 위해 EGFP 발현을 체크하였다.
성장 속도 체크: EGFP 발현을 확인한 후, 모체 CHO 세포주와 함께 단일 세포 집단을 성장 속도에 대해 체크하였다. 세포를 웰당 10,000개의 세포로 6웰 플레이트에 시딩하였다. 3개의 시점: 플레이팅 후 24시간째, 48시간째 및 72시간째에 세포 개수를 계수하였다. 안정성 연구를 위해 모체 CHO 세포주와 등가이거나, 그보다 빠른 속도로 성장하는 세포만을 추가로 배양하였다.
안정성 연구: 발현 안정성을 측정하기 위해 단일 세포 집단을 최대 4개월까지 추가로 배양하였다. 매달 1회씩 EGFP 발현에 대해 세포를 체크하였다. 배양 기간 종결시, 성장 속도 및 EGFP 발현, 둘 모두를 체크하여 단일 세포 집단이 EGFP 발현을 고수준으로 유지하였는지, 및 모체 CHO 세포만큼 빠른 속도로 또는 심지어 그보다 더 빠른 속도로 성장하였는지를 확인하였다. 이 단계 후, 염색체 통합 부위 확인을 위한 우수한 후보 물질로서 20개의 단일 세포 집단을 선택하였다.
통합 부위 확인: 상위 20개의 단일 세포 집단으로부터 게놈 DNA를 정제하였다. 개별 DNA 샘플의 농도를 체크하고, 4개의 평활 말단 생성 제한 효소: EcoRV, PvuI, StuI 및 HincII를 사용하는 효소 분해를 위해 10 ㎍의 전체 DNA를 사용하였다. 이어서, 페놀 및 클로로포름을 이용하여 완전하게 분해된 DNA 샘플을 정제하였다. 이어서, 에탄올을 사용하여 상기 DNA 샘플을 침전시키고, 이중 가닥 DNA 링커 분자 (게놈 워커 어댑터스(Genome Walker Adaptors))에 결찰시켰다.
히그로마이신 저항성 유전자에 기초하여 3개의 유전자 특이적 프라이머 (GSP)를 디자인하였다. GSP1 및 AP1 (어댑터 프라이머 1)을 1차 PCR 반응에서 사용하였고; GSP2 (네스티드유전자 특이적 프라이머) 및 AP2 (어댑터 프라이머 2)를 2차 PCR 반응에서 사용하였다. 필요한 경우, GSP3 및 AP2를 3차 PCR 반응에서 사용하여 특이적 생성물을 수득하였다.
그 결과, 안정한 통합 및 강력한 전사 활성을 지지하는 CHO 게놈 중의 천연 염색체 통합 부위는 안키린 2 유전자 (Ank2), 절단 및 폴리아데닐화 특이적 인자 4 유전자 (Cpsf4), C-Mos 유전자, 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자에 존재하는 것으로 나타났다. 이종성 서열의 통합을 위한 유전자의 정확한 위치는 각각 도 3-6에 명시되어 있다 (서열 번호 1-4).
실시예 2 확인된 천연 염색체 통합 부위에의 랜딩 패드 삽입
상동성 재조합: 통합 부위의 측면에 위치하는 게놈 DNA를 확인하고, 양성 및 음성 선별 마커, 둘 모두를 함유하는 플라스미드로 클로닝하였다 (도 2). 각 부위에 대해 보다 긴 상동성 아암 (길이가 3 내지 4 kb)을 네오마이신 저항성 유전자의 5'에 클로닝하였다. 보다 짧은 상동성 아암 (길이가 1.5 내지 2 kb)은 네오마이신 저항성 유전자의 3'에 클로닝하였다. 하나의 단일 파지 부착 부위 attP는 긴 상동성 아암의 말단에 위치하였다.
상동성 재조합 플라스미드를 NotI 효소로 분해하여 플라스미드를 선형화시켰다; 긴 상동성 아암은 상기 선형 DNA의 한쪽 말단에 위치하였다. CHO 세포로의 형질감염시, 네오마이신을 배양 배지에 첨가하여 상기 선형 DNA가 세포 염색체 내로 통합되어 있는 세포를 선별하였다. 4 내지 6주 경과 후 저항성 클론 풀을 수득하였다. 이어서, 플라스미드가 무작위로 통합되어 있는 세포를 사멸시키는 간시클로비르를 배양 배지에 첨가하여 세포를 음성 선별하였다. 표적 부위에서 상동성 재조합이 이루어진 세포만이 양성 및 음성 선별에서 살아남게 되었다. 상기 두 선별 회차 모두를 마친 후에, 살아남은 세포를 선별하고, 24웰 배양 플레이트 중에서 성장시키고, 6웰 플레이트로 확장시켰다. 이어서, 게놈 DNA를 상기 세포 클론으로부터 단리시키고, 표적화된 위치로의 attP 부위 통합에 대해 체크하였다.
랜딩 패드 통합: attP 부위가 원하는 위치 내로 삽입되었는지를 확인한 후, 파지 Phi-C31 인테그라제 시스템을 사용하여 재조합 유전자를 attP 부위 내로 통합시키는 데 상기 세포주를 사용할 수 있었다. 단일 attB 부위를 함유하는 플라스미드로 재조합 유전자를 클로닝하였다. 재조합 유전자 및 Phi-C31 인테그라제 유전자를 함유하는 플라스미드로 공형질감염시킬 때, 세포를 특이적 통합 이벤트에 대해 선별할 수 있었다.
비록 상기 발명은 명확한 이해를 목적으로 예시 및 일례에 의해 좀 더 상세하게 기술되기는 하였지만, 첨부된 특허청구범위의 정신 또는 범주로부터 벗어남 없이 본 발명에 대한 특정의 변형 및 수정이 이루어질 수 있다는 것이 본 발명의 교시를 고려하여 당업계의 숙련가에게는 쉽게 자명해질 것이다.
본 명세서에서 인용된 모든 공개 문헌, 데이터베이스, 진뱅크 서열, 특허, 및 특허 출원은 마치 이들이 각각 참고로 포함된다고 구체적으로 및 개별적으로 명시된 것과 같이 본원에서 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> The Scripps Research Institute Mauro, Vincent P. Zhou, Wei Cunningham, Bruce Edelman, Gerald M. <120> CHROMOSOMAL LANDING PADS AND RELATED USES <130> 37651-505001 / 1413.1 / PRM0035P <140> UNKNOWN <141> 2012-04-05 <150> US 61/516,612 <151> 2011-04-05 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 254 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <223> Ankyrin 2 <400> 1 aaaatttctt gctttcttct aaaagcatta tctataaata tttgttgtct aaaactcatt 60 tttcccatgt ttagtgtgtg tgtttatgcg tgagtgcata ttgtcttggc taccatgaag 120 agaaatatta tttttccttc cagtgttctt gagtggcaaa ttacttttct gttgcagtgt 180 gacaacacca ggggcagaag gggcagagac tcaaaaagcc acagaagttc ctgactctct 240 ctgtaagact cctg 254 <210> 2 <211> 1148 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <223> cleavage and polyadenylation specific factor 4 (Cpsf4) <400> 2 ataaaatcaa aataatgcat cttttgaaga aagcataaaa accaatatac agaattgtga 60 tatgacccgg catccctttt gggacggcag tgactgcagg cgagaaggag gggatggcag 120 agagcagtgt gaagtgggga gggcagctaa gagacctgag ggggagccag gtcctaggcc 180 tctgccgccg ctgccatgca taaaatcatc gccagcgtgg accctatcaa gttcgacttg 240 gagatcgcca tggagcaaca gctccaggcc cttcccagga taagtcgggg gctgctgtct 300 gagaattcat tttgaaagct gcctgtggca aatgtggcat gtgtccattc cgccacatta 360 gtggtgagaa gacagttgtg tgcaaacact ggctaagagc actctgcaag aaaggggacc 420 agtgtgagtt cttacatgag tacgacatga ccaagatgcc cgagtactac ttttacccca 480 agttcgggaa atgcaacaac aaggagtgcc ccttcctgta catcgaccct gagtctaaga 540 ttaaggactg cccttggtat gaccacggct tctgtaagca tggccccctg tgcaggcatc 600 ggcacactcg gagagtcatt tgtgtgaatt acctggtagg attctgccct gaggaaccct 660 agggtagatt catgcaccct ccatttgaac tgcccatggg aaccactgag caacctccac 720 taccacaaca gatacagcct ccaacaaaga tcattgggtt catgcagagt caaaatagca 780 gtgcagggaa cctgggaccc tggacattgg agcaagtcac ttactataag tgtggtaaaa 840 aaggacacta tgccaacaga tgcaccaaag ggccaattgg catttctcag tggacagtga 900 caatagctgg gctctgtgga gcagcctaag agacctgctg ttggtaacaa gcacttagct 960 gctcaatgta gtgctggcag gactggctag agcctcaggc acacttgcca gggctcattt 1020 tgaggggcca tgtctgtcct atcattttgc tgtaatcttt tttctttaaa gaaggaacat 1080 gtgcttcagt tgggtccctt gagccagctt gcttggacat cagtgcctca ttttttggac 1140 tatgtgct 1148 <210> 3 <211> 743 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <223> C-Mos <400> 3 cagacatttg ttgaactact tgccagggtt attagatgca acctttgtaa gaattaacat 60 ctgtaacttt aatgtctttg atccaaatac aatcacttat agaagtcaga tcacatacct 120 tttacgttca tcagaaggga gcattctgac actgtatttg atttaaacag caagttaaga 180 ctctgtaaca taacaacaca gtgacctccc aatatccctt tccaaggcaa gttaagccac 240 cccatgagtg tgagtttgct tcaagacaga ttctagactt cacagaaagc aagttcctgg 300 aatttaatgc agagttggag gaaggaagaa aggaacaaag gtgattgtga tgaccacggc 360 tgtaaatatc agcaagcgtg ggaaaacaga ggaaaagtca ggagaaatag acatggctca 420 gaatcactgg tacccatcta taatatggaa aagcagatgc tgaacacaaa ttcagggtct 480 ggccatcaaa ccacacattc ctcctttttt gttttataaa aatgcgctca gttttatgct 540 atatctctgg gagaatgggg aagagccttg ctctgtttat tcaaaaacgt ttctcaaagt 600 ggctaggagt tactcctctt agctgcttgg taaggtgttt tatgcataca ggtgataagt 660 gatcactttt catgtgacag ctgtgtccct ttgacttcag aatcacaggt tttgagaaga 720 caataaagga gagacatata aac 743 <210> 4 <211> 618 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <223> Nephrocystin-1/Mal <400> 4 cctccagaaa gccttgcggg tcaactaaga attcggtcta acgactcacc aaccctcaac 60 actcctcatc cctcaggccc ttgtctaaac tagccagacc cacccagccc agcgcccctc 120 tcctttgaaa ttcatcactt tctcaaagtg taacaggtgt caacgtatag tcttaataaa 180 ctaaccaagg acagattagt aatttcagaa aagttaattt caaagatgat caaacacaaa 240 agatcgtagc gattttaagt cataaccctc agtgctgagg aagactcgat gaaacaggcg 300 atgccctggt atatagtcta catttctgga cagcagtttg acaacatata gcgagcattg 360 atcctcctag gctggttgat tacattctca gcaatctccc acttacaata acttaaaagt 420 gtgacagaga tggatattta aatgtgttca ccacattttt tgcttataat agaaaagctg 480 aatatgaata aatgataggt attagtggga tggataaact aatccataga tggattaatg 540 ttatacaggg cttctcagtt cttcttttga gggaaaggat ttagtggcag gacacaaagc 600 ttaaacagaa gtttatat 618 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Bacteriophage phi-C31 <223> phi-C31 phage integrase attP site strand 1 <400> 5 ccccaactgg ggtaaccttt gagttctctc agttggggg 39 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Bacteriophage phi-C31 <223> phi-C31 phage integrase attP site strand 2 <400> 6 ggggttgacc ccattggaaa ctcaagagag tcaaccccc 39 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Bacteriophage phi-C31 <223> phi-C31 phage integrase attB site strand 1 <400> 7 gtgccagggc gtgcccttgg gctccccggg cgcg 34 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Bacteriophage phi-C31 <223> phi-C31 phage integrase attB site strand 2 <400> 8 cacggtcccg cacgggaacc cgaggggccc gcgc 34 <210> 9 <211> 152760 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <220> <221> misc_feature <222> (50692)..(51086) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (84882)..(84898) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (114932)..(116327) <223> n is a, c, g, or t <223> Ankyrin 2 gene <308> GenBank NCBI No. NW_003615916.1 <309> 2011-10-27 <400> 9 ataattaacc aggaggagag acactatttc tcttgctgtt taatgttctc caccaaacac 60 caggcaaata cagcagtgaa gcaaagcagg aagcacagca caataagcaa atgacaggga 120 cacagttact gctacttgga aaaagagaga gaaaagcaaa cttcactatt ctgttttctt 180 tgggaaagcc tgttatgtta attccagaag atcttgttaa tgaaccagaa acaacacaga 240 tctagagatc tagttggccc tttaatggtg tagtaaggtt caaacctgct cagttttaag 300 catttgtttt cactgtacac acacacacac acacacacac acacacacac agagagagag 360 agagagagag agagcgagag agagagagag atgaagcagt ttttttctta tgtttttgaa 420 accgcagcac tccaaaggat ttcagtttgg catattcttg tcttgtcttc acatgaatat 480 attcaattaa tttcctgttc tctggttgaa acaaaaagaa aagaaagaat gaaaacccgg 540 agctaactgc tcttcccaaa gtctctctct catgctgcta ccacttaaca aaaatgaacc 600 aaatcctttt ggccttgccg tcggtgttgt tgactagatt actcagttct cctgttcccc 660 aagtcctcag aagctcctac ttttcattta ctagatatct gcaaattaaa catatatcct 720 tgtttccccc aggtgaggga tggtaagaat tttccttgga gctctgaggc actaatccag 780 agcatgccac cgtccggggg gacagtagat tccttactaa ataaaagcac taaggagata 840 ggccattgat gagtttctgt tggcttcata tctacttcat tgaacagctt ctgactctcc 900 aaaactcata gactgatgac aaagaaggac aaagcactgc tgccacattt aacacttgta 960 cattttattt agttaaatca gccattgtac aacattgcag ctatgtattg ttagtgttgt 1020 attgttttcc attaactaat acatgccctc atagatatat tcaattagtg ttatcaccat 1080 gggaacaaga tgctgattca tcaactgaaa attctgaaaa ttcacttctt ctcacagtat 1140 tcaagttttt tttgataaca cagcaaaaaa aaaaaaatca aaattgaaag aaggtgaatg 1200 accattatat tgctacacag acatcatctg cactgcaaat aacacaacag aaaggctttt 1260 catgagctcc ggtgaagttc tgacaagatg gccatggcat atctcaaaaa gggctgccac 1320 atgcctctct tgttctggat gccaaagaat actttgtttc tactcaaccc cccacagaaa 1380 gtgctagcgt taggggctca ggagatttgg gagatgggaa acctctctcc caagaaaatt 1440 cctctcttgg taatgttact ttaaaagatg aagtgccatt gtttgtcctg tttgtgtttg 1500 acattccaag caatgagtca gttctgcaca caggaaaagg ccagatagga ttggacaaag 1560 ttcagtctca ggagagtaca ctgttttctt tctttctttc ttttttttta aatctcatct 1620 tcattgaata tacttttctt taacaaataa ctgattcaaa acgtatactg tttatatgaa 1680 tatatttgtg actatatata tatatgttaa aatgctacac agcttcaacc actagaggga 1740 ttagacacag ggcatgggga tcactcagtc atcgtccctt ctctgaaaca aacagaaagt 1800 tgcacaaatg cacttcagtt tccaagggtg tctgggtttc aaataaataa atcaaaaaaa 1860 ttaatcaaaa ccaaattttc caaggatttc tcaatctcgt ctgcaagccg aaaagcagac 1920 atagctagaa aatgaaagcc catggttaaa accattagta tgacaaaaag ggtttgtgtg 1980 tgtgcgtgtg tgtgtgtgtg gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 2040 gtgtgtaatg ccacatgcag gtattagaga agagatacac ctggaggtgg gggtaaaaaa 2100 aaaagcaaaa gaaaccactc caacatggtg acatcattta acattttgtg tggtgcataa 2160 atcttgtttc caatgaatta tctacagtgc agtggccaga agaaagtacc accagtaaga 2220 cagcgtggtt tgctaaagca gcgatgaaca ctggaaaact acagtagtta tagctttttt 2280 aaaataccct gccaacgtgt ccaaaatcaa aaacacctga aagtgctaga acaccaccca 2340 tgcagcttct agcaccagaa tacctcattg tttccatccg cttgtctgtg ctcccttctt 2400 cccctccctc agggtggcag ctggagagcc atcatcgatg gctgaccagt actagattct 2460 gctccttggg atcattcttc aagattatga tcctgtattt aggagcaatg gctactctgg 2520 aagtactaag gacatgtcaa ggtctgaagt gttcctttca tagaactgtg ttacccttaa 2580 ctgtgttaac aatatcttaa ttaaccattg ttcagcaatt tcaagaggct tttattccat 2640 gatgcccagt gaaattatga caggcagtgg tttaaatttt actctgttgt tcgtctgaga 2700 atgtcagcta tatacattat acatggatat cctcggaaac attcccctct gtcacttgaa 2760 gaagtctgca ggtgaagttc ttctgatttt catggagcct gagcagaagc aaagaacaat 2820 ggaggcgcca gttcccaggt tagcacagat gctcagaata gtggatacag catccagaat 2880 gaaggatgct atctttggtc acaaattagc ttatagttag agagggtggg ggagaaggaa 2940 gcaaaagaaa atgccttgta tttgccaaga gtggaaatgt cacaggatcc cagtaattag 3000 gccacttggg tcactcctga caggaaatgg gaagttgcat attgagtggg tatgtggttt 3060 ctggtaagaa ctgggcagct cctcattggg cctcttgctt tgtgttctcc ttgcagaaat 3120 gccgaaggag ttggtggaga tctctctgga ggtcgtcttg gtctagtgct ccaggaacat 3180 cctccaggtg ctccaagttg atgcgttttc cctgctggtc cttcaccaca gccctcttct 3240 gtgtactggc tttactcatt gttgtcctac agggagcaga tcagataatg agaccctttc 3300 cctgacaccc atggacttcc tgtcatacca tgtatttatt cctattagtt taatgatgac 3360 aggtggacag ttatgtttct cacatctctc ataaatgagg ctctcccaaa gcttaaaaag 3420 tgtattttag aacaagaaac attgattttt tatatcttta aaaatagttc aaataaagaa 3480 cactatgcct ccattacatt ttcacaaaga gaagccaggc catggctcag attttggtta 3540 agttgcattg atccaaaagg ttctcgctta ctctgaaata atgataccaa aagcatcatt 3600 gacaaaatca gaaaatcata taaaattcac tcacttccca ttctgaacct tgcccaaatt 3660 ttgttttact atgagatttg atttccatga gattgaaatc tttaaaaact ggagtattct 3720 accaaaatat gagaagggga ctctgaagct cccttgagag taagcaaggg agggaaagga 3780 gatggagatg actcccaagg gcaaacactt tctgtgtatc cttgggacct ccacgtgctt 3840 aaccagttct gcatgttcca ccatgtcagt cagcaggcat cttccttccc ctggtgctcc 3900 ttgagaaaag atgccctagc ttgctatttt atttcaaact attattttct tagagtctcc 3960 acttgaaaat gatattgtaa tgtgttcttt ttctattctt ctcaccatct atttatgaga 4020 ataatgcttc attctgcaaa taggtgttga atgtatttta tgtactgtct atagttataa 4080 caaataagaa aactgacctt agaaggttta aattacatcc ccacactttt tcttttttaa 4140 acattagcta agggtccaag attcctgagt ctgggtccat aagcaggaat ccatggatct 4200 tcaaatccaa caacaaagaa tgaccaggta ttttccttat gactttgcag tgttttgaaa 4260 ctagaagttt taacaatggt cattctaacc tgatgctagt ttctaaaaat ttacttctgc 4320 ccaattccag ctctcctttg gccatccttg cttccgacct ccttctccaa gtctctctta 4380 gatattacat acattgcatt ttcatttgat gccatatcta aatttgttcc tcttgatgaa 4440 atgttcatag ttgatcactg tggctgcagt cagtttgtgt gtttctggct gttccctatc 4500 atttctggtt tgtttacttc acaaaagaca aatatctgtc tctttctgcc agggattagg 4560 agaaggttcc acagttctgg tgtcaggggg caggcctaca gcgtgggact tttttttttt 4620 ttaattttct gcagatgtgt gcagatgttt atacatacac atgtatatga taaaatgact 4680 tcagtaatgt agaaactcaa gtgctgttca ccagagtccc acactgacta gcagtgtgca 4740 tgcaagttgt ttgttactgt cttcagctaa gtgtccacca cttcaaggac acagggaggc 4800 aactgctctc cgaatctatt ccagttcaaa gatcatggga tgccaaggtt tgcaaaggct 4860 atatagtttc aaccaaacaa tcagacaaaa gggttcaaca ttcaaagcag aagcatttta 4920 tccgtaattt atacggcatt taaaagctct aggcaaccaa ttatgttctt ctaaattcat 4980 agctgctact gtttctcaca tttgagctga aggcgggact gtgacagaac cttaattttg 5040 cttgtaatta ttatgttcca gaaacctaaa atagccttgt ggagtactat aaatgacaat 5100 ctttctccct ttttcaatga gattggaagc acagcaataa cttgggctcc cattgtatct 5160 ttcactgaga agctaagagg tttgtgagag tagtgatgct tacaatggcg ctagaggacc 5220 aaagtggtga agagaggctc cagaagcaat gctcagttct gacatcagaa ttgcaatgga 5280 gcctcacagc gagcacacga gggaaaggct gcttaccatt cacacatgct cttactcatg 5340 ctgcttgcgg caacattctg tacatccagg acctcagaca tcaaacatgt gctcttgttt 5400 cttgtcactc ccatgcatca ccatggaagt tgttaacagt aaaaagccat gatagaggaa 5460 gactgagctt gatatagtta gttgccaagt taatcagtgt gcaatcgatt agatttctct 5520 tcatatggtc tccaaatcta tcaacacagt ggtattcccc accggcttag ctccaactgt 5580 attgacaatt tgcttgaacc cagaaagcca aattgtataa acaaatgtct caccatcact 5640 gtgtctcagt attaatttga aagcatcagt ggacatgcta ggggcaacac acacacacac 5700 ccatgcctga cccaggcctt ctcacacagg gcagtcagag gctcagaagg gctctaccct 5760 tcctttctag cattagaaac tttgtatcat gttagtggtc aaaacatcac cccatgctaa 5820 cccaaacctc ttaattattg atccatcctc cttcaggatt tcattttcta ctaaactggg 5880 gaagtgaact ttcatgtggc tacctgtgta acccaaagcc tgagataaga aaaagagaaa 5940 acaagacttg actcatagat caccgacttt cattgaagca gtctactgtt ttactagtta 6000 gtcttctgct ttactaatta gtctaatgct ttactaatta gtctattgct tcactagtta 6060 gtttagtgtc ttactaatta gtctactcct ttactagtta gtctactgct ttactaactc 6120 tggtggtaca aaagaggtat tcgatggggt aacatatgag ctcatatgtg ggtatcgagt 6180 tttatttaac acgtccttta aaattccatt tatgtcacag ataatactct ttgttaaaag 6240 cttgaaactg acatctagac tgactgactt taaattttcc ccttatttgc catcctcctt 6300 ctgattgtgg agatttgaat aatatatatg agctcatatg tgggtatcga gttttattta 6360 acacgtcctt aaaattccat ttatgtcaca gataatactc tgttaaaagc ttgaaactga 6420 catctagact gactgacttt aacttttccc cttatttgcc atcctccttc tgattgtgga 6480 gatttgaata ataaatgaga tcatttatca aagacaaaac cagatacagg gtccaatgta 6540 caacttagac aattcacttt ttgaacaccc aagaggtcaa atgtgcagaa ttaaaagtat 6600 ttaaagaaag tttgctttaa atacaaaaat atgttaatag actacttata tataattgtt 6660 gatactatta ttgttgttgt gatattgttg ttctagtatc tggtgatcaa acccagtgct 6720 ttgtgggggg ccacataggc atcctaaaat acagctggat ccccaggcct aatgtgagta 6780 agtacataag ggcactgatt atagcattta actttaagca tttaagatat aacttatcta 6840 tttttttagg caggctgcca taaagaagtc caggctagcc tgagctcact ctgtagcata 6900 agctagcttt gatcttgtgg catcatgctt tagccaccgc agtgccagta ttacaaacct 6960 aggccaccac acttggcttt gtaattttaa cagacatagg aaatcatgcc ccaactctgg 7020 aaacttggat tctgccctgg caggaatgaa tctcagcaac ctgcattttt aagagccctc 7080 tgggtgacat gaatgaaaac cagggggctg cagaaataca acttcaccac ataaattgtt 7140 taagacggaa atctggtctt ttcagttata caaacacctt ccatgaatct gtgtatgaaa 7200 tgacaaatgc ttttctttgc taacacaaag caaccataaa acgcacatca aaggaaaaca 7260 gacacaaaat aaaacaatgc tctgtacctc ttcaaagtca tctttggctg aaggaaggtc 7320 agtggctaag ctagagtccc ccaggctttt ctccatcctt tctccatgta ccactgttgt 7380 tttaacaact ttgctgactc tacggccttc tactggttca gcctgaaact gtgaggtact 7440 ggacaaaatg ctgggttcag acaaggtcac ctaatgaatg aaggacacat aacagacaat 7500 tcccaatggc caaaatggaa caaataatga tatttctgtg aaataaaatg gttgtaatac 7560 tggcttccta aaaaaaaaaa aaaacagtaa ttaggaacaa atctcatcaa ttggtctatt 7620 tgagggtata ctgccagaac acgaacagtt aatgggctat ttgaataaaa tctcaccagt 7680 cacatttcct aagggctgac aggcacaatg tagattggca acctaggctt gatctctttc 7740 ccacaattaa gtttatttcc tttgcaacat gaagataaag tcaacccctg aagggagagc 7800 ttgaaaagct atgagaaatc aaagtggata actagacagc ttcgtgtcta taatcatatg 7860 attctgaaga tataaataaa cacagaacag taagaatttc aaattgtgtg tgtggtggtc 7920 tcaagtcttc aaacagtgag gtaaaataga aagtaataaa tggcctaaat caaagcattt 7980 cagatcataa tttaattaac cctgaaactc agaagtttga ttgtcaagca tatatcgaaa 8040 gtgactcttg gaaggctggt gtgccaacaa ggcccaatca ctgcagtaca tttgggtacc 8100 gtactcttca tagcacatac cttgccagaa aatagattta aaatttggct tttgattgct 8160 actgtaatca actaagaatg aaatgcaaca tagaaatgaa gaaaaacaaa gacaatgagt 8220 acaaggacca catagaatgg aaatacagtg ggaactgaca tgttttttcc tgttttgtct 8280 ttctctgcac aatgaactct gcagagctgg gtggcctcac ctctgattgc tgggtgtcac 8340 tcttcaatac cacacgcttt atcactttgg aataactgtc cccatcctca atgttgactg 8400 gctcctgtgg cgttccctgc attgtaatct cctccttctc catgccatca gaggatacgt 8460 accgcctaat gattttccgg gtgacctgaa acacatttca tgttgctgcc ttattttttg 8520 tgtttcggca cccacactag tgacagcatt taaacaggaa gcgtgaaaac agccctgtac 8580 agagagccac tggcaggtac cttcttcacc acggtgtgtc cattctcatc gacatattcc 8640 tcttctgaga cagtttctgg gggtatgtca ggcatatcat ctccctaaac agtgggggaa 8700 aagcattacc taagtgtgtg gcactgtcct gaggaactac gtccaagtgc ttctgatatg 8760 aggaatgtta gaaaaccaga ggtcatgttg ccaagtattg ccgagatgca aaatcctgtc 8820 agtttgatta attttaaaaa atgaagcagg tatattagca agaaaaaaca aaacatgctt 8880 aggagaatct caccaaagtt agggaaaatt taatcaaaca acaaaaacaa ataagcaaga 8940 agggaggcag gtgcaaccct agaagccaag ccttctgcgt gctggctcat ggaggagggc 9000 tgcaaacatc cttggctctc tgcatcccct aacaaatgag agaggaagag gggagctgct 9060 ttccatgcat gcactaccta tggatcatgc tcagcctctg ttgttccaga tctctcttag 9120 tgaaggacac aactgtcccg acgtgcagta acttaacagc gggtacctgg ataatcactc 9180 tccggcggac aaccctggta gttaccatgg cctcctcatc agagctggcc tccagctctc 9240 ctaattcctc tgttagctcc tggtggaagc atgcatgaat cgttgttttt aatcttattt 9300 taaattttaa aatgtaatca aaaattgtat ttggtttcca agacagggtt tctctgtgta 9360 tcagccctgg cattatcctg gagctcactt tataggccaa gctggcgtca aactcccaga 9420 gatctgcctg cctctgcctg gcaagtgctg gggttaaaga cgtgtgccac cacctccgag 9480 cttcaagaaa aacttgtttg agatgggata ttacttggtg gaccaccctg gcttgaactt 9540 ataatcattc tgtgccagac tcacgagtgc caggtttaca gatgtgtgtc accacacttg 9600 gctgcatcat tttgtttaat ttgctattga ataactgtac tattggtttc tttatttgtc 9660 tgtatcatat tctgaaattt tatgcaggga gatattgata gaaaatcatc agggaaaaag 9720 taaatgtgtg gttatctcaa gcctcaacaa gcatggagtc ttattgttcc caaaatcata 9780 aagaaatccc gcaatctgag agtggttgga aaagccactg tcaaaactgg tcccaagaga 9840 tgtcttttcc cacatgaatt ctgtacttaa gtttaataaa atctgggtga aagtacagga 9900 cctaagtagc acactaaata cctgtgacac atgggccagt cttgactagg caaggaattc 9960 taatcccaca cacagaacag ctcatatttg tagcagagct ttctccagta agttaaattt 10020 cctgtagcta ttagtaaata gtacattttc ctgccatcaa aaattgtagg ctttaaataa 10080 cattgaactc ttttttttta gagaagctaa gagaatactt tcatttatgg gtttgaccaa 10140 aagccaaaga tgaggctagg aacataattt tagattgaaa atgccttaag agtcataaac 10200 agagacaggc tttcttcaca gaacatgatt tccttcctcc tctctcctcc cctcctctta 10260 cttcccctcc tgtctccccc tcccttcttc ccttccaggt tttttgacaa aaatcaagct 10320 atgttgtatc tcacaggttt taaacttttg atccttctgc atcagccttc agagtacttg 10380 gatgaccggt ataaataagc aagaagggag gcaggtgcaa ccctagaagc caagccttct 10440 gcgtgctggc tcacggagga gggctgcaaa catccttggc tctctgcatc ccctaacaaa 10500 tgagagagga agaggggagc tgctttccat gcatgcacta cctatggatc atgctcagcc 10560 tctgttgttc cagatctctc ttagtgaagg acacaactgt cccgacgtgc agtaacttaa 10620 cagcgggtac ctggataatc actctccggc ggacaacccg actttttttt aagggaaaga 10680 gtacactcaa aaaacttact gtctcaaaac acccaaagac aatcaggaac ctactgctag 10740 caatatggtc agcaacaaaa ataactacaa tgacatgttg gggttactgt tgtaagaagt 10800 taggagttca caagtgaagc atatgaggga cgactagaaa tgcattgagc taagaagagg 10860 ccgtaaaaac cctaggatgc taggccaagc tggcgtcaaa ctcccagaga tctgcctgcc 10920 tctgcctggc aagtgctggg gttaaagacg tgtgccacca cctccgagct tcaagaaaaa 10980 cttgtttgag atgggatatt acttggtgga ccaccctggc ttgaacttat aatcattctg 11040 tgccagactc acgagtgcca ggtttacaga tgtgtgtcac cacacttggc tgcatcattt 11100 tgtttaattt gctattgaat aactgtacta ttggtttctt tatttgtctg tatcatattc 11160 tgaaatttta tgcagggaga tattgataga aaatcatcag ggaaaaagta aatgtgtggt 11220 tatctcaagc ctcaacaagc atggagtctt attgttccca aaatcataaa gaaatcccgc 11280 aatctgagag tggttggaaa agccactgtc aaaactggtc ccaagagatg tcttttccca 11340 catgaattct gtacttaagt ttaataaaat ctgggtgaaa gtacaggacc taagtagcac 11400 actaaatacc tgtgacacat gggccagtct tgactaggca aggaattcta atcccacaca 11460 cagaacagct catatttgta gcagagcttt ctccagtaag ttaaatttcc tgtagctatt 11520 agtaaatagt acattttcct gccatcaaaa attgtaggct ttaaataaca ttgaactctt 11580 tttttttaga gaagctaaga gaatactttc atttatgggt ttgaccaaaa gccaaagatg 11640 aggctaggaa cataatttta gattgaaaat gccttaagag tcataaacag agacaggctt 11700 tcttcacaga acatgatttc cttcctcctc tcccctctcc tcccctcctc ttacttcccc 11760 tcctgtctcc ccctcccttc ttcccttcca ggttttttga caaaaatcaa gctatgttgt 11820 atgtcctccc ttgggcccta tgggcatcta aaggaggaaa gtgcctaaga ggaagaaatc 11880 atttcatgtc tctttcttct catgttccag tgacaagaga gcaaaactca gtgtcaacag 11940 agtactgtgc tgtgagctct tgacacacta aggttgcttc tcctgagcca ctttcctttt 12000 caggatggcc agtgtcactc aggcaacttt ctcctttacc tgctaaagtt ctgagctaaa 12060 tgattttcta gggtttcttt ccagcagaca atgcctcctt atccttactc taactctgct 12120 ttatctcaaa ctaatggtgt tgtgtcctgt ttgcatgatt tataccatat tgatgttttg 12180 tttgtttttt tgtgtgtttg ttttgttttt tcaagacagg gtttctctgt atagctttgg 12240 agactatcct ggcactggct ctggagacca ggctggcctc gaactcacag agatccgcct 12300 gcctctgcct ccctatgcct cccgagtgct gggattaaag gcgtgtgcca ccaaccccag 12360 gtcatactga tgtttttata cttagatgct acatagcttt gctgaagtac taatgggctg 12420 ccattcctac accatcactg ctcaaacccc aaggcagcca tggcactaag tgggcacatt 12480 ccaatgagat acaacaatcc tacaagtagt gactgtggtt tgcaaggagt acacccaaag 12540 gtgattcaca ggcttatcag tggcccttga ccctggtaac tgataactag atttggaaat 12600 ggagacttgg agaactttgg gattgttcaa ggttacagaa ttggaagtcg gctcaggtag 12660 gacagtacca cacaacatga tcacaattat gtatcttgac tgtttcagct cttctacagc 12720 ctctgcccct tctgcccctg gtgttgttat actggaacag aaaagtcaat ttgccactca 12780 agaacacttc ctgccacaga agtttttctt tggagttgta tttaatatac tttcttctga 12840 aactcactag tattcctgct ggtcttgcat tttccctgag aaatcctgtt gagctggctc 12900 cgggtgcatt tggggagaaa gtgttgcggc tgggctgtct ccctcagttt tggggataca 12960 atcttgaaat gtggaataac caacagaaat gtcttcttca gagaccatgg gtgggtgatc 13020 gctggactcg ctttctttgg aagctgcttg ctcctctttc tgcttatgcc gggcaacaca 13080 gagctcctct tgaagtactg aaaatcctgc agggaagagt aattgaaagt attgtggaat 13140 ctcacttaca ctaggtgttg taatttaaaa aaaaggcagc tcaagagaaa gcgatgccct 13200 gagacagagc tcatgtggag ggtttttttt aattagggga aaggaaatgg gaccagcctc 13260 tggggacaga caggagcatc agaagagaat ggggggcaga gacaggcaga gaagcagaga 13320 gagaagatat atcagaagga aaaaggaact ggaggagcca cccatggtag gaaagattga 13380 acagaggggg taccaaatgg aatctgaggt gttgatgggg aatgtgcttc tgtgtatatg 13440 tttctcttat tggttgatga atagggaagc aagataggtg ggactaggag tggaggagga 13500 ttctgggaaa tatagtaaag agacgaccat gtgatccagg caggaagtga tgtagcaggc 13560 agaatcagaa tataagcagg gacaagcagg aaattgctct ctctcttctc ttctctgtgg 13620 agacactgag cagatatgat gcagacccca acagagtaag aggcccagac cttatctccg 13680 gtaagacaag gccacaagga aatacacaga ttagtaatta tgggttaaga ataagaaacc 13740 caagttgcca gccaacagct tataactaat atagcatctg tgtgtttcct ttggggcaaa 13800 gaagggcagt gggacctagc cagccaagag aaaacttcac attacaaggt ggcatggaag 13860 taaatacatc atcaccaaaa gctatggtct gttgtaaaaa aaaaaaaaaa tggaggcagt 13920 aggtccatct cctgaattat cccctactcc taagagacac cactttacct tcactgttgt 13980 ccagtacaat ggtctgctcc atttccgcat agctgtggcc catgcgctcc tgcaggggtt 14040 ctgtgttggt ctccaggaga tgtacaatat ccatcctgtt aatcttggtg aggcattcaa 14100 tgaggatggt atctgagaca ttagagaaaa ggcattcttt gcatatgagg ggtactcttt 14160 ttaggaactc tttcattcag ttgccttact aagttcttgg tatttacagc agagcctagc 14220 aaactccaac taggtccttt gtaaatagag gcaaatagca gagaatagac cccacatact 14280 acaaaccctg aaggcagagt tgctagataa gacacagggc acagccccat ctggattcta 14340 ggtaaaaaca aagactttaa ctgtatctca aacactgtat atttatatta tatttatatt 14400 aaatatattt tttaaatatt tatattaaaa gatatttgat tgtttttaag ttaaattgaa 14460 tacccttctg tttttattgg ctaaacctgc caatgctgct aaaaaggatg tggggaaaaa 14520 agaaacagca ggagatatta aggcagatct tcacagagac atgaaaggat gggctgaagc 14580 tgggtggcag ccaagttcta tctcatttcc catttaattc cacagggtca taatcatatc 14640 agtcatcaca tacagtatct acttgattct cctcccccat atatctaaat ttctagagag 14700 gaatggaaac atgaactgca ggcagtacac tccccataaa taattgtaac cgtacaactg 14760 tgcccgttaa ctaatactta gaaactgtta ggtctcagtg aaccttccac agtggctggt 14820 gctcatatca ttgccactgt tcacaaacat atcatgcaag atttctcatg gaacaagatt 14880 ctaaaaaaaa tttagaaaga taataacagc ttgttctcct tcactgacag tggttgttaa 14940 aattgatgac ttttgacaat ttatcttact gattctgtaa gaacgggatc gttgggggat 15000 ccacttccac ctttgtctaa aacctccacc ttagcatttt cccaattacc tgtggcatgc 15060 ttcccatccc tctccaacca gtacttcagc agtgcatggc tctggtcttg aagggagttg 15120 gggttctcaa ttcgaatttg gtgaatttgc tcctcagtga aatccagttc tcttgctaat 15180 tctaaaataa taacaacaaa atgctacgtt gtcaatacat tgacttcatg tttgagtctc 15240 tacaccttgt tccatgatgt gtaagtgata tggtcttgtg ctgctttgag catttaggtt 15300 agaagtgact cacacacacc tttgacatat taaaactaac aacctctccc tattaaaatt 15360 ggatatagaa ttaattactg ccattgtaga aatagtgaag gtgaaggagt gatggtgaaa 15420 tgtaaatgga gatcagacca ttattacttg tttatatttt taatcaggaa aatgaaaaat 15480 aagtgactga acaggagaag tgaagcattt ctcactttta taggttttta actttaacaa 15540 atcctgtttc tggaaatgtg tacaaacatt tgttgtagct aatttacagt gatcgggtat 15600 gctcctttct ttgatgtata tgaaggaaag gtctgtggaa actggtgtag agtagaagtc 15660 aaaaagattt ctttaaaaga tgggaatagt ggtacatacc ttgaatccca ggactgagga 15720 ggcagaggca ggtggatctc tgtaagtttg aggcaagtct ggtctacata ctgagttcca 15780 ggatagctag agctacatag agaaatcctc tctcaaatgt acctcctata aaaagtttgt 15840 ttattttact ataaacattc tatatgaata cttgatgctt gtgcatacta taggtataca 15900 tttgtgtgca aaagcaatga cttctaatgt ctacctggta tctttcaata ttaaaaataa 15960 cccttgatcc agtaattcta ttttagaaat gtatttcctt ttcctttatt ttcattctgt 16020 tatgttataa ggtttaaaat tttgccacct ttatacttaa cacacttagt atgtgtggat 16080 tctacatatt caaggaaaaa atacatatct aaaatgccaa ccagagatat tttggtatca 16140 ttctcttctc tgaatcctta tatcaggtat ttcaacatta ttctaaaatt accaaaagtg 16200 agaaaatggc tattcctaca gcttctagtc atttattcaa aattatgaat catctttgag 16260 gataggctct tatttccttc taaattttca agaaactgat agaaaagtag taactttgca 16320 attttttttt ctcagcaaag cacatccaag tgatacttaa gaaaccaaat cagagtcaaa 16380 aataatgaaa acgaaagtaa gctaggctat aatattgcct aatattaagt cacaggtaga 16440 tgaaaattta ttttaaattt ataaaccatg atttgtaaat agcagtatgg atattagaat 16500 tcacttcctc ttaataaatt accaagcgtc cctacctcaa aaaaatggtg caacatatgt 16560 gttttaacat tcacccagag cacatgttaa tactatttac tatgaagaca cctaacatca 16620 aacatcaaaa acaagcagca ctgataaaaa tctcaaatgt tatgaaaaat tgccaggcat 16680 agtaactcac acctgtattt acagcactgg agcaggtgga ataccatgac tttaggacag 16740 cttaaggtat attgtgaatt ccaaatggac ccctgggcta tagattaaga acctgtctaa 16800 gaaaaacaaa aacaaagatt ataaaaattg aatctaaaat tgtgtgaaac ctgggtattt 16860 tcccatagct tagctaacta taactagtag aagaggatgg gtaaatgggt ttattctcaa 16920 agtcttcaac tccaaagttc taaattccaa aactgttaag aaccttatac tcaggccaca 16980 caattagcta ctgtggttgg atttttcaac ttgtagattt ttcctcacac tattctttat 17040 agtcttccac aagaaaaatt aagagaaaca atctttaaca gactgtttct gtagagaaac 17100 tggatcacac caattacctg tccaactgaa gccaagatga tcagcaatgt aagccagcct 17160 ttcttcaatc cgttcctgtt catcttgggg atctacagaa ggtcaaaaac agaatggaca 17220 aagagtatct gggacaacaa gggagccaca gtactaatca tccaagaaag gaagtcactt 17280 gaccaagtct ctgatagctc tcatggttca ggttgtatgg aaaggtgtgt tttctgattt 17340 ctggggtaga atggggaatg aatcccatgt ggtgacttgt ggaaaccgtc tccttcctta 17400 tctctttaat gaggactaat aactgaacag aacgtccagt tatttcaggg cttccctttt 17460 acacttttga aaacacggcc caccagagca tactcatttt gcaaatgaaa caccagaaaa 17520 atggccaatg gattatagaa gcggagtaag tggttgggct ctaccactaa tgcctgagga 17580 ggtgtcaatc accatcaggt cctggatgaa agaaagcact aagaattatc ttagtcatgg 17640 ttagactgac cagcctggcc aggaacaaca ctgtcctaat gaccttggta gaagacaaga 17700 taaaggcatt tgaactttgt atgttctgct gctatgatat ttgcttctga ggcaaagttt 17760 ctggctgtct cttcctatgt aaagttttca ctaccacaaa ctagaattca tcctcttccc 17820 ttttaatgac catggattaa tgggcagcag caggaaattc tgtcacccac atttaggagt 17880 tagtcttcat ttggagatag tggaagcctg caggttacct ctcaaagcca cccatggttt 17940 cctttttttt tttttttttt ttttttcaat tccaagagcc atcattccct cacatcatgc 18000 aatgtttgag attttgttgt ctgctgaatc tcatctgaac acattcacaa tccatctgct 18060 tcacaactca aaagtggatt tttacctcac gtttgtttgc ttaatttggt tatcatggta 18120 tctgaaagcc aacctctctg aattggaaaa cagacccata gtaatttcag gatgtgagca 18180 atcattttga gtaaagggct ttttaatcct gacaaaattg aatgcaccaa ttatttaatg 18240 aacacaaaga aaagagttga gagcactgag tccttgtgct aagaaactca catgctcatg 18300 tgcaaaacca aaagttttta acttgaggct aagcctggga cttcagaaca acaaaaccca 18360 aagcttgtat ggctttacgt gcagcaacta aagaaaagca aggtcccccg ttgcttggtt 18420 atgtttatgt ttttgataag cattctcatt actcaatctt gagattgttt catagacaag 18480 agtatacaga aaaagcacaa aacacaaagg gcttacacaa acacattaac cactacagaa 18540 agcttaaagg aaatgagaca caaatcacaa aataaaagaa acattaccaa aaaaaatctc 18600 tatcaaattt atgacatgcg tagcacaggg aatcccagtg gctggcaaat accttcagct 18660 cggtcatggc cattttcatc agggatgcgt tcaatcatag tctcaatgga ctcatcccaa 18720 atgggccttg tgtcaaagat gtcctcagga actgaattct cagtctcaac aggtggcaga 18780 ttctcaatga ctgacacttc cagggcacta ctactttcat catctgaagg tggctcctgc 18840 tccctttctg actgtgtgag cctgtccact aatttggacg cctcatcact aatttcctca 18900 aagaattcta tggaatttct ataaaggtca aagaagtgct ccctactctc ttttgtgggg 18960 ctcatgcctg tcctgctgga agatggagtg cttctgctct taactggtaa tcgggatgca 19020 aatagctttg gttttgtggc cccttcttct gattctgact caaacccttc tgctctctcc 19080 ctgctctctg tttctgtctc aatgtaactt ctggctttta ctgggcattt ggtcttagca 19140 tccaaaggat tagcatctga ttcagatttg cttctaccat ctggtgctct gcttagcatg 19200 tcctgtccct ggggaacagc tgtcttctgg agagatgtgt ctggatagga gagctgccac 19260 tcagttcttt gggtgggtgc tttgatgggg attttggact ttggttttgc ttcatcctcc 19320 ttactttcct catccatgcc agatgggaaa tcatcagaaa atgcactctc atcctctgta 19380 gatgaaggga ctgggactga agtggagagt gtccttagag aaatttgagg tttgctttca 19440 gcagaaggca cattttccat gggtgcagta gggatctcaa tcacagattt ctgttcctct 19500 ggggaagaat ctggggactc gtcatcccta tctgaatgaa cagacctagt gactgtggaa 19560 aagtccaatt gaacaatagg ttgggggaag gcagggcaag gtgtctgctt cacagtgctc 19620 agagaagatg tatcactcag ttgcatggtg gggaggtcct gagcttctgt ggatacagcc 19680 tcttttgtgg gcatttcagt ggaagctgaa atcatcactt gggagtcaag gttagtatct 19740 gaggcaggta attcctcagt ttcctcactc acatcatcag gaagtaattc tccctcatcg 19800 tctacttctt ctttggattc tgaaagttcc agtgactcac ttgtgttttc cggctgtgtc 19860 ggctcagccc ccatggtccc ttccttcaag tcttcaggga tagtctcttc attggattct 19920 tgaccaattt ggaaaaagtg caaattttca tctgtatagg accttttggt catatcaata 19980 gcaccacttc tggtcatctc aaacaatttt ccttcctgga agaggaatgg attttgttca 20040 cttgttgggg ttccctcttc agttggggtc ctagcaggag tagtatcggg agtagtaccc 20100 tgtgattgtc tgtctaccat caaaccaaat attttctgtt cttcctcttt cactctagct 20160 tcaaaggctt catcatcttc acgaatttca ctccaggagt cagaatccac atcggttttc 20220 gtgatgatga ctttgctcac ttgctcacca atgactgctg gtgcatttgg tgtagcagat 20280 gctacagatg tggaaggcac atctgactgc attccccaca agctggtttt ttcctcggat 20340 tcagttttta gaccctgggt ttcaaatttt gattcttggc ttgagacagc tctaccagag 20400 gagtttgtct ttacaacatc ctcagaagag gatctgatga caacagagaa cacttcaggt 20460 ggacaaacaa ctgtggtgtg acatgtgtct gtttggattc tgctgtcctc accagagaaa 20520 aatgatgagg aaggaacatt ttcataaggg ctggttattt gaggatcaga attttcatca 20580 gtctcagcta aatcagacac cagagtgtct gtatcaaccc tatctgtttg agttgtagaa 20640 gatgagtctt gagtgggaca gtccttcggc atgcttccca gagtctgatc agttactgtg 20700 acgtctactt tttcagtgga agatggggag ggtacttctt tcactgattc ctttctttca 20760 gatactgcac aatgagatga agaagacagg gaagagcttc caccggggaa atctgcctgt 20820 gtagattcca ctccagaagg atcaagctct ctcccttttt cccaagtatc ctggagagcc 20880 agtgactctt tatcaatggc aagctgttca tcaacatcaa tacatgctgg actctgaact 20940 cctagggaga caagggtggc tgacttgcta ggactcacaa cttcacaacc atggccatca 21000 caggtttccg accgatgagt ctctctgttc agatcatcat aagacctatc aacaccatca 21060 gcagaaggag tccgacagcc ttcagctaaa ggagattggc aatctttgtc ttcttctgac 21120 ttacccggct cctcttgaat atcttcgttc atcttgaaag tgtattgttt ggaaactata 21180 ggctggaact gtgattcttc agggctggaa ttagagtcta tgctggatgg gaggggagat 21240 ggaggttgaa ctcgaataac tggttccatc agaagccctg agtcggcacc tttactcagc 21300 tgtgtcagct caggctcact ttcagaggag gaagaagctt ttctgctctc cgaagtcacc 21360 aagactggga cctcagtctc cccttccatg gtctccactg gcttttgttc atccacttct 21420 accgaacagt cagcatcggg gtctgaggct gaagaggagc catcttgtct gggttctttt 21480 ctgtagtctc ttttctgctt tgcttcttgc tcgagttcat caaatgtttt aattttggtt 21540 accatcttga acatttcctc ttctggggtg aacctctttt tctccccatt ttcagagtcc 21600 tcctcctctg cacactcatg aatcacagct ggcttgggta aacttgaatc tgaagccttg 21660 ggtgtgacct catagctaac ttcttctgaa ctgggagtgt caggggagag ggggcttttc 21720 cctgagctct ccatgagtga agtctgttca agactgtcgt cctcggcact gccatcaggg 21780 tctcggagca gccgagaacg catggaagcc acttcagcaa caagatctgt tttggcaata 21840 gctgcaggga gaggaaagtg acttgggaga attcctgcct tcattttggg ctcaactggg 21900 ctgctttcaa gggagtccct gcaaggggat tctttcagag gacttggttc cagagaatcg 21960 ggagttttgt gtgaggagtt atcttccaac acagggctag cttctagaga gtctttgtgg 22020 cttactgcta atgattcatc ggccactggg ctgagggtct cactatcccg gctagggagt 22080 ggaagttcta acccttgggg gcttctaata gctccctggg gctttggttc tgttccctca 22140 cctgccttcc cagaagcatc agatgatgag aaggcctttc ccacctcgga gggagtggtg 22200 gattcctgag tttcactttt tgcttgtgtt ttacaagctg aacctacaat tgggagctga 22260 ctttcgtcac aggacccttt ctcagtaaag acttggcatg tttcatctgc caacgataca 22320 ctgtgcctgc tagggcaacc atctagtttg gaggatacat cttgggaagg gtcttgggtg 22380 acctccttct gacaatgctc agtagaggtc tctgaacccc cagtgaccac agcaccttgt 22440 gttccagaac tatcagtaat gtctttagtt aaaggaagct ctttttctga atgaatttct 22500 gtgggcattt ctaccttagt ttccttgatc tctccaattt gttcctcact tttcttcggt 22560 gagaaagaaa gactctctgg acttgtctcg ggagtttctg ctaggccctc atgcttatag 22620 ctctcttctg aactgacctg aggagtacct tccatcaggc tgccacaagg cgagcctgct 22680 atcacttcct gtttcaggct ttccaaactg ccagccaaag caccactctg taaagacaga 22740 gctggaagaa actcgtcttt catgtaatct agagggaacg ttgtgttgaa aggacttgtg 22800 attacttggt ctaagtgtat ctgagccttt tctgtttcct cagtgaggcg gaactgctga 22860 tatttatcat tgtcttctaa ctcttgcttg atgacatcag agaagtcagt ggaggtcttc 22920 ctgtctgggc tgatctgaag atccatgtct ccttgctcat ccatcatctt gtcttgaagg 22980 atctcactgc cccgagggct ttcttctgcc accactgatg gaactggctc aggtgtttta 23040 ataatgggag ctctctcaaa cttttctcta actggatctt ctgtcctgag cccaacagtg 23100 atggtagtag aacggaacct tctggattct gtaggtgccg tcactggaaa tctctggcca 23160 cgcttgattg tctggctttc tgttctctga gactctctct gggttactgt gtgccccttt 23220 tctttttctg ctcgggtttt acttttgtct tgtgattgct tttgctttgt tgatttgtgc 23280 tcaaagagtc ctgttttgtg tttagacggg tcctgacctg actggaatgc tttcatcaac 23340 tcccggacag acattgtctc ctcaattcgt tctgttttgg aggtgggaga tacaggtggc 23400 tgcttttctg tcttcccagg tgacacagga aggtgcttat catttttccc agactgcttc 23460 tctgaggttc ttgcagaagg tgaaactggc aagcgttttt ctgttctccc aggtgacact 23520 ggagggtgtt tctctgttct tccagatgat ggtactggag gacgtttgtc tgtttttcct 23580 gaaggtgaca caggtgtatg tcgttctgtt tttacagatg acacagggga atgtctttca 23640 ttttttgttg agggggatcc aggtgaatgt ttctcaggtt tacttgacga tactggtgag 23700 tgtcgttcat tttttggcga gggtgacaca ggtgagtgtt tctctgtttt gcttgatggt 23760 gacactggcg tgtgtctttc agtttttgca gaggaagaaa aagaagagtg cttttctgtt 23820 ttagaagaag gagatgactt tgaagagggt gacacagctg ggtgtgtcct gggcgtggtc 23880 tttttgggca catcctcttt gcctttgact ctgaccggca gcttgcttcg acctttctgc 23940 tcatcttcta cttttttctg aagagccttt actttgtcct ttatggaacc aataggagtt 24000 tcttctatca gaggagaggt ggccttggca gtgggaaggg gctcgggtgc caggcctcgg 24060 tcttcatcta ccgactcctc tgaactacct ttcctaagtt cggttgtttc ttcactgcct 24120 tgggaacctt cctctttttg tttctgcttt tcttttagtt tcctcctcac tggcttcttt 24180 atcaccaggc ttggttttgg ctgcttctgg gcactttgtt tctcctctgc tggcacagtc 24240 ttccctttat tattctcaga ggtcttggca acacctgaag cctgacttgt ctcccctgtc 24300 ttttcctgag ctgtctgtgg cttcttttca tgagaagaag tatatgaatt taggtcttct 24360 gttaggtagg tcactaaccc agtggagtcc ttctctgatt tgaccttgga ccctctgtct 24420 actctgactt ctatgcatgg ctgttcagtg atttctgcag gcgcatgttg cttggcctct 24480 tggatttcct catcactgac aatgacccat tcctcttcta gctcccgctc agactgagaa 24540 gtctgtactc tgccttcttc tctaacacag gccccacttc tcaggattgc gtccactttc 24600 tctaagtcct ccttaaccct ttcaacaatt tcgaatggtt cgcctggctc ttcttcagca 24660 gcctttgcca gctccttcac cttgatagaa cctgccttat cggacacatc tgtggtcaag 24720 atggccgtca ttttgatcaa atcttgtttc atctcagaaa cttcagagag caagtccgga 24780 cttgctaaga caggaacttc attaaccagg tggcttttca ggacagatgt ttctgttgac 24840 tctgtctcat catctttgat gtgaatgaaa aacattgaaa gtaaaatgga aatcaaaaaa 24900 gatatcggca aatgtaatca ggaccaaaac aacacagcgt cttttcctgg tggtggaagg 24960 ggcaacagaa tgggctggga atggtgaatc cacaaggtct caaggaacaa gagcaaagca 25020 aggctaacag aaaaaaataa ctgaaaagga aaatgagcag gaaataactt gcttaatttt 25080 ctcaattgta gcacattcat acatacaaca aagctatcac aaatactcaa gacatacata 25140 aaaaagtcac aaatcaaaaa gaagagagca gtgaaattac acagaggtat ctcaagattg 25200 tccagatatt acagatcaat gtcagaaaat aaaacaaaac aagaaaccat ggggaaaaaa 25260 taaaaaaagc attagaaatt gcagaaactt gatttcctcc ctgagaaagc cagtaggagc 25320 aaattcagaa ttgcacccaa ctatgtccat acattgtaaa tcccacaggt ctggaatttg 25380 atcagcatag tcctgccacc atacagcaat ggcagaatac acatctgaat cagcagcaga 25440 ctggcatttc atcaaagaga aatccacacc taacgatgac acacatctcg tgctgagagg 25500 catggccctt tccttggagg aacctccttg tttagagatg taacagacag aacaaggagg 25560 aggataaagg aaaggaacaa atgacagaaa caacagttgt gactgaacat atatgtgagt 25620 tcagagttaa aatgtgatgc gtggcaaccc aaattagaga cagtcacaca ggacacacac 25680 acagttgatg taagccaagt tatttccatg caaagcaaag gtggaataaa actgctgggc 25740 aggggacagc cttgcaggaa agtgcaggca ggagggtggt gagaaattag aacaaaaatg 25800 taaaacgtta ctgtggtgaa gcatatttag ctccctaacg atccatgcat aaggtggcct 25860 gtgcaggttc ttttaattaa tacaaatgca agaaaccctc agggttggct tatataaaga 25920 cttgagtaaa gagagagtcc ttctttggag gttattttgt cactatatga aaatcatgta 25980 agggttatct ttaaacagaa acaaacataa atctgcattt aaaatctggg agacatttaa 26040 agtttctagg tgtcattcaa gagaatcatg gcattatagc aacatgggaa ctttactgcc 26100 tttttaactg gcctagacca ataatttcaa ttcctaatag tttatatata ggagtaaagg 26160 aaggaaccat ttaagtcaat acaataatcc taaagaagaa agagaaagag gaaataaaaa 26220 cacttaaaaa tcagtgaagg tagcactaat atgtgtcata aacaaaggtg ccttctctgg 26280 agagaatttg tatttgttca gaggcaagca catgtgaata tataaaatat attaagatca 26340 atttatggta atgttgattt tttagttata taaactattg aagacatcag aatctcagat 26400 agtttcatcc tgaatgaaga agaacatgac gataaacctc agttaaagcc atttcaatag 26460 gacaatagta aattatagtg agctaagact tcagacaaac aggccctagt tggtggctgt 26520 tttgtgaggc ttaggcggta tggccttgct ggagtgtcac cagggttggg caggctttgg 26580 ggcttctgga gtattcattc tgcctgttgt ggtttccaga ttccaacagc ctgccaccta 26640 ctacctctgc tctgccatca aggaatctaa cccttaggga ctgtaagccc aaaataaaac 26700 tctttcttca gtgagttgct ttggtcatgg tgtttatatc acagacacag aaaagtaaca 26760 aatacaatta gctagggcta aatgaccttg acatgtgcct ctgtgttctt tccgaattgt 26820 tacgctggga tatggtgaat caaaacaaat cttaatactt aataaaatta aaaattagaa 26880 tattttctca ggtggtttaa tgcttaaggt agagaaaaag ctataaaatt caacttgggt 26940 tcctatacaa gatgagacag ttacaagaga ctagactaac gagatgaaat gttaatagac 27000 tatcacaaac ctcaggtgaa tttagggctg gttactgcac tagattttgt tgggattttg 27060 agttgttatt taaacatagc cacacaagga cacattgtga acggtaattg gatccagtat 27120 actttaattt ttccattctt ttcttttttc ttcttttctt tccttggaaa tgttcacaaa 27180 attctgttag atctcaccta aagatttagg tacacttcac cacagtaaga gtgcaaggat 27240 ggtagagtat ggggggaggg gtgcatgagc ttcagctaag aactatgaga cagtatcgct 27300 tttgtaggca tccttccaaa ggcaaggctc actacagagg tcactgtagc tttatgtaaa 27360 aagtaatact gtcatgtcag tgcttaaaaa gaaaagaatg aggtaacaat gttatgctaa 27420 caaatggaca aaacgataga gtagctttgt aaacaagctt tacagcaatg ccaggggtta 27480 cagggatgtc aaaagaaagt gaatgcttag atgaataatc attgcattta ttgctaatta 27540 gctcacaaat taggtatatt tatgatttaa ctggccaagc tgcttttata agtatatatt 27600 aatgattaat aagaattaca taaaattaca attattatgg tagttagtaa tagcaactag 27660 cttgcatctt aattcatgct tcttttcatt atagccatct ttcaaacaaa ctcaatttta 27720 tttaaaaatc ttactttttt ctgatgtcat accgatctga aagaaaacat acacaaatac 27780 aatggttaca cacagctctt ggctcaaagt cctttatgtc ctttatccta tttgtaatat 27840 gaacatagga gtataataag ctagaggaaa gtcagaggca ttagctacag ttcctgtatg 27900 tagaagcaaa catatattca cacatcattg ctagatactg caggaagaat atgttaatct 27960 tgggaagaca tgaccccact gtgtttgatg taagaattgc gtattaggga aaaggtcatg 28020 aaaaagttga agtcagtctt cagcagtagt ttcccattta atgaggggaa aaaaatggca 28080 aagttttgct gggtgataaa ttctaccaaa gtcatttcgt gacaacagtg agccactgtt 28140 ccaaagcttt tctcatattc cttttaggaa gaacagaaac ttcctgaggg tatttcacag 28200 gaaacactgt ttatctaatg gaaatggttc agctgtgaac acagcaaagt tggtttcatc 28260 acttgtatgc tcttttgggg tgtaggtgcc acattttgag aggcagggtg atagaatcac 28320 tgagcacaga agtgtgtgac agtgacacac acagggagaa gaccagtcac acatctgctg 28380 gtgtgtgtga ctgccattcc acatctgttg tgtagcttcc catggcataa gcaatcccct 28440 aaactaaggc catgcattgt aagttggtaa gtaccgaaca tttattgtgt ttttctttgt 28500 atttttacat ttcagatgca ttggcataac ttttaaaaat ggtatattaa aaacatgcac 28560 tgatgataat tagtttggaa acagttgagc acaagaagga aacaggagtt gctatattaa 28620 tgagtaaatg taaggaattt tccaatgatt tctttcattt ctgtttcagt gcctagtttc 28680 agacctttag aaagaagaca atttacttta aaaattgaag tgtgtatcac tcagatatct 28740 atttttttaa ggtaccctct ttagaactta ttttctatat ttgtatgtaa cttgacacag 28800 aagtcaggtg agataaaccc atgctgatga ggtatgtgga acactgagtt ttgcaaatat 28860 actttatgag gaaatgtttg ctattagtat atgtttatat tataatcttg gagtctagtg 28920 aatgtactat gtgtttctga acattagtta gtcttagtaa ttctcagact tggtgttagg 28980 accacagtat acatctaaag ttactttcat taataagcta cacataaaca aatctgcata 29040 ctgcagttaa gagctgagaa gattcaagaa caccacaatt acactaacac actacctagt 29100 aattgccaga gtgctgaagt catcacagtc ccacctcaga aagccttgct gctagtgagg 29160 ctatgagacc taaaaagtaa actgctgtat ctgatcactg ttaccttcag acaacttcag 29220 tctagccttt gagtgtcatt gagacatggc ctggccttta ggagttggta gagaaatata 29280 tactattaca tagagggcta cagtaaataa agaaactttg cagttttctg aatgtcattc 29340 acaagatgga gaaaaatgta agagaggggg gattgactaa aattctgttc atcaaattgc 29400 taaggacagt tgcctacttt ctaagaatca gaggccaacc atatgctctt attggtggct 29460 ccaacaatga tatagccagg aacaagtgac tctgttgtaa aattacctct tcctcctgct 29520 cttgatctga ctctgattcc ttgatgcccc aagatgccat tcgagatgga aaaaagggaa 29580 aaggaagaaa acttttagaa ggaaggaata aatacatcgc acctacaagc atcaaggcag 29640 gtacacagta cactcagact cttttcttaa acagtttcta taagacaaac agttaaagaa 29700 gattgatcaa agtttataca ttcaaagaga caaaaggaac aaatgataaa tatactaatt 29760 ccagacccta ggttaaaagc agtctcaaat cttgatattt aatgtgtctg gtacaattga 29820 tttacagaaa tggtggtgac actatcccac ttactatgga tactgactga aaatgtcaaa 29880 tgacattagt aagtttatgt tgaaaacatt ttcaatacat gggcactaca caagtttcat 29940 cataataaaa agctacggaa ttctcagtat atcataaatg tgcaatgttt ggcattttat 30000 tcttttcatc ttgaattact aaatagaaac cacccctgac caccatagca ttaataactc 30060 tgtgagctat gtctggcctc aaagaatgta aaagaaagta aatgcgttct ttcacagcat 30120 ttggagagct cagagaccag tgaaagcaca ttggcactaa tatctctggg tagcttttgc 30180 atctctcctc agtaactcta tcaccagaga ctaaacatta aagtgcattt gtgtcatggg 30240 atcacatttt cttggttgat ctatctattg ctacattcca attgcattga aacatcatgc 30300 atattatatg tggaaataga tattaaattt atttttaatt tctaagaaga actaataaca 30360 tcaaatatat gctaggagtc ttcttctata caactgacct ctatttccaa gaaggaggat 30420 ttaaaccaat acatactgca gcaactatga tggaggcaaa gctaatagag aatccttggt 30480 tctgcagact caggatagaa agttttaagt atttccctac ttcccctcca gcatccacta 30540 ctcatccctt ttccaagtgc agaacaaact gaacacttgt agctgttatg cacagactat 30600 tatctgcagc tgtctatttt taaaaattag cttaaaggtg gggggaagct ttcagaataa 30660 gatttcccac atcacttaac tgatttagtc gccttctttg atacattcag aatagtcaaa 30720 agtattatgt catagagaaa gagttagata caattaacat tagataaatt tgcatcagga 30780 attaacaaac ctcctcctag tgctgcaaca attgtgatct tctcaagaat atgtttttag 30840 acagatcatg ctaagttaat tgaaaagcta gtttaaaatt cttcaaccat taaaacagga 30900 cagactataa tataaacagg tgattggttc aggaaaaggt aaaattctag tagtatgctc 30960 tgaaacttca agctgaccca gctctgagtg aacagtgaat ataagctaac actctaccat 31020 ccaggtggga ggtaatgcac caagtagcct caggaatgca cacagaaaca agaacaggga 31080 ttgacaacac cagttatttt ttctttacaa cttagctcaa aaagcattaa gattaaaact 31140 catcttttct ctgtcatatc taatatataa aaattaaagt gcattaaatg tcaaagaagg 31200 tgggaattgc tttttctcta ctgaattgaa aaaaaaatca ctgaattggg tagaataaca 31260 aaaatgattt gtacacgttc ttgtgttcaa tgtcttttat aaagaatctg aatcttaatg 31320 tctatgctgc ctgggaacac tacagtattc acaatacctt tgcataaatt ggcagggtga 31380 tgttcaggtt gcaaatggct tgatgcacca atcctcttgt ggatttcggt tccttcataa 31440 atgatagtcg cccgcaaggt tcctgagttg tatcacgtac cttgagtgag aaagacatat 31500 gtgcttgacc tacgtttgac agcagatgag gtttaaagga gaggggggaa taatttcaat 31560 ccagtaacac ttaaaggata gacataagat ccacagacgt aaagcttctc cttttctact 31620 ttggtgtcat cattgtcaat aacactttga aaatgtcttt caggcatttg ttgctttata 31680 atgtacaatt gaaaaaaaat tgtaccagga tggtttgcta tgcacatgat gtgaaatgaa 31740 gctgaccatc atgctaactc acaggccttg cctcaaatga aacctgccat ttgtttgagg 31800 agaggatgct tcatcccttc agatctccca gcaaacttca aatataaaat aattataaac 31860 tatggctaca tttctgaaca ttaggtttcc gaaactaatt tacctttttt ttttttaaaa 31920 aactatggta aaatacacct gccataaata aaactgtaca tttctactgt tttctaagtg 31980 ctgtgaagta agctcatgaa gttgtgcaat caccactact ccccagtgct ttctattcac 32040 ccaggcactg tgcccagtac aattttactt tccattccct gtccctggca acccccactc 32100 cactttgtgt ctccatggac ttgcctgctt tgtaaagtgg actcacatag tattttcctt 32160 gtgttttact gacttagcat aatattttta agttcattgc aacatcaaaa tttcattcaa 32220 tcattcactt ttagctgtgg atttgtaaca ggaaacatca tttcagatgt accattcagt 32280 ggtcgaagta cgtgcatttc attgtatagc tatcagcact atccagaggt gtgccgaggt 32340 tacttcccaa actgcaagtc tctgcgtgga aagcaaaaat tcctccccac catattcctt 32400 tccctaatag ccaccctttt actttctgtc ttcatgactt ttacttccct gggtatccct 32460 taataaatgg ggctattcac tatcaaactt tctattacgt tgaattgatg aaagtgtatc 32520 aagtctatag ctttaagtag aatattttct tatcggacta tgagattctg ggtcttttga 32580 gaagttatta caaaaagttt ttggtgctct tttggtctag tgacattcac atacttttta 32640 aactctaagt atgaatatat aaaagtcaca gcagtgaaga aacagaaggg ttgggagttt 32700 aagtcactag tagagttact ccctttcaat aactaggcat gaggccctaa gtttaattca 32760 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca agcacgaaga gggagagaaa 32820 gaagagaggg agagggaggg agggagaaag agagaaatag agagagagag agagagagag 32880 agagagagag agatacttat atagctggtc ttgacagcta gttattaagt gggatcaaat 32940 ctgggaaaca gtatttaatc ttatactctt aatacttagt aacttggtca tagtttctcc 33000 tcattgccct catattgtgg tctctcatta aaatatatgg ttgactttgg acttcaaaaa 33060 ttttaaaaat gtatgttttt gtaaacattt gtaaaaatat atttaaaaac tactggaaat 33120 gtttgagaag cacatattct cactatgaaa gtaactgaaa acagcccttg tacatgagca 33180 aatgtttaac tgatttttat ttttgtatat aaattacctt gacaaagaga ggaagtctgt 33240 tttctttgaa ggcaaaaaaa ctgaatatat gatgttggcc actcttggtt agtggtacca 33300 gattgccaaa acaatcaaca taaataggtt ttccttctaa tacctaaggt aagacagaaa 33360 accaacacag attaagacat ctacaatcat ttttatgaca tttattctaa caagtagtag 33420 gtgtacttgg aatcttcggt tcttagaata ttcataggac gatgttcaca ctgctgattg 33480 acatctgtca tatacatgct ttgccataca tagtaccagc attctttctt gctactaaga 33540 atcttcaatt gtatggcaac attcaatttc tcatttttat tgttgtataa agatacccat 33600 aaagaccaat atatgtctaa tacctaaata taaactttgt attgggtaac tttgacatca 33660 tgataggaat cccggaggac ttcagtatct aaacatctac aatgatggaa agttctttac 33720 aaaaaaaggg aaaaatcaat gtagacaagt atttagctga ccaaatactt aaacaaaaag 33780 aagtacttta aaagaaaatc caggaagctg aaatcacaga aactactata gttattataa 33840 actcatagtt acctatagac tcaaagttta tcaataactt atagtttttc ttcagataaa 33900 ttttacagaa atccttctac atacagagag accatccatt tatggtccaa attgtcagaa 33960 aaatctctga tttgggacct tgacctttaa gtgatagaca cacaggctga cctttctttt 34020 gttaagcaaa tctccctata tctgttttgc aagtgacttg atagtgaaaa ttcaggatgc 34080 agcatgtcta tattcttacc tccacatccc tgctcctggc cacctcagag aagttttctt 34140 gttgctcaag ggtcttatct actttatcat ctgtcataca gaaacaccgc aaccgggctt 34200 caatggggtc atgtgatttg gcaaagacta caaatttggc catatatggt acacagataa 34260 tttctctata cacttgcgat gcaaaggaaa cagattcctg aatctgccga caatctatca 34320 gccagaacct acaaaaaaaa agaaagaaag aaagaaagaa agaaagaaag aaaaccagtt 34380 acctaagtat aattatgcca tttgacaaaa aatagaaaga aagaaagaaa gaaagaacga 34440 aaggaagaaa gaaaaccagt tacctaagta taattatgcc atttgacaaa aaataaattc 34500 ttttaatatg gccaatatag tcatcaaatg attcttgaaa aagaaagaag tgagagagat 34560 agagatgata agaggaccta gataaaaggg aaataaaaaa ggaaatggca aggaagtcta 34620 gaggtatcaa gaaggagaga tatatcagat ttttaggatt gactatgatg aagagagaat 34680 atgttcaatg tacaatatac acttagaagt aaaagtcatt atgtaacata ttaccatgca 34740 taatgaataa atccaataga atacacctcc caaggcaaag taaaacaaaa agattgactt 34800 aaatgttcta gttgtgtttc tcttcttgaa aactcttatt tataaccaat cttttgactt 34860 acaaatcgat tgcttttgga atctttggta ataaaagctc tgtatcagac tatgatatag 34920 atttctttga gtgagttatt cttttccttt attcctctcc taatcgttta atcttctgaa 34980 tctttcaaca tcttttcctc actgcatcat cttccaagag actcaccagc cactgagact 35040 caatcagacc aaccagaaat ttgacgatgt ttacttttcc attaaagata tacaaatgag 35100 aactaatatt agaattcaat tactgtatgt aaaagaaata atagaagata tcttcagcct 35160 cttaaagatt tgtaatatgc aagtgtgtta ggtatataac acattgtaac tacttaacca 35220 cttaggaagc tatactgaac tgtgtgtgtc ttggtattct attgaaaaaa acaactcccc 35280 atgtgttgga taacaggaaa cttctcattc cttggggact gtaatcatca gaagtggctg 35340 ccaaagctat caccaagatc atacagccaa agcagacaga cccatttttt ccatagatcc 35400 taatctgaat gtcagggagg atttggttat tgtgttgtta tcattcatgt caaaaaatgt 35460 aagccttatt tcatattcga caacaataat caaaatcccc ttgaaagaat taagaaaaaa 35520 catcaaatga caaagagaaa acaatcagtt tggggaggaa caaagtaata tagcaaatag 35580 gcttttctgt gttgcacata catacctggc agacacgttg gttgtaaagg aaacacattc 35640 attgacgaat gttagtggtg tagttcctgt gatgtcttcc cattgtgcag gcgtggttcc 35700 acctgaaata gcatgattgt ggaagacaat tgggcaaaat tccagacatt ggcctttcaa 35760 aaatgtcttt gtgattctga ctgtttacct gtgtgatccc tccatgccac aaaagggcac 35820 aatgggaata acatggactg agatacaggt tagtgataga acatttgcct agtgtgtgca 35880 cagtcccctg ttcaaccctc tctgccaaat agaaaaagaa aaaagaaaga aaagcaaaac 35940 aactttcagg gctaaggatg tgtagctcag gagtaaagtg cttgcctttt ctagcaaata 36000 acatgctccc agttcaatca ccagcatcag aaggaaaaat aaaaagtaaa tttaattaaa 36060 tcaaaatgaa agagtacaaa ctgtcaaaac tatgtaccaa aaagtacccc ccctcaaaaa 36120 agcgaacacc accttaagat aaactaaatt taagggaagt tatatgaata tctgtttatt 36180 agacattctg tacttgacct gctaaaaaag ggaaatgatt ttcccagtgc tggatcctga 36240 atgtcacaag attgatgtgc taggcaagag tcccccactg gtgcaatggt ggcaagactg 36300 tttatggaga accaactgct cttttggttg gctttgagtc tgatccactg gaggaaatgc 36360 atatatagta ccctaagcat ggtcacagag aagccataag ccctagagga aaactattgt 36420 tgtttttgct aaatgatcat attgtcaaac agccttctaa atatttatgt ttatatccat 36480 atatgtaaac tttggtcaga gaagctcctt actgatattg gtaatggttt gcagagattc 36540 ctaactgctc aaagtgctga gaataagaaa ttgtgagtgc tcaataggag gtgggacagc 36600 tatagcatcc tgtcagggaa catgagcaag aggagtgggg tgggggagtg agaagaaaga 36660 aatagagaaa ggaaaagaaa ggaaggaagg aaggaaggaa ggaggaagaa agaaagaaag 36720 aaagaaagaa agaaagaaag aaagaaagaa agaaagaaag agaaagggga gaaaagaaaa 36780 gaaaaagtaa gagccagaaa atgggaggag tgctgaaatg ctgtctactg ggcatgggct 36840 gttagacctg ggttacctgt acagatcagc ccaggaaaat tgctgcatag ataggaagga 36900 actgtcaggg caccacccat aaatgaggtg atattggcag ttgctgtctt ctgggggaaa 36960 gaaaggttca cttttctttg aggggtagtc actggaagat cagattgcag ctggtggatg 37020 gcccaacact gtgcacatat gggcagcact aataactcag tgggtgaaaa aataaaatta 37080 aaaatattta tttttaaaat gactgcatat aaagtatata atagtttgat ttgtaaacat 37140 tgttgagtat gcaactcatt cttttattca cctagttaat taaaaaatgc ttcgcctgaa 37200 ttaatgtatc taaccccaca gcttttttga tgcagggctt gaactcagcc tttcaaatac 37260 tggcctatat tctcagcttt cagggctact taggacaaaa gccactgaat ttttcactac 37320 gctctaaatg ccttctagaa ttttctctgc taaagtcaca tatgactcac ctgttatgct 37380 gcatagtaat cttaaggttg gtgcgtctcc cccaaaacca ttcagcatga catcacttga 37440 agctttgggg acgggaatcg tcatggtaat aggcttgtga aattttcttc tcctgggttc 37500 caaagtgact atagggctga aggttgcttt gttgcctagg atcttcttca ccaactcact 37560 gtgcataggt tgagcctttc aaggtaagaa agaacattaa actatatagt accacactta 37620 attccaacta tcacatccag acattgtttt tcatttcaca aatgagttta atggatttca 37680 aacatggcag ctataagttt agtactatta aagattcaca attaaaaaat tattacattt 37740 tatttttaat ttattttttg tgtgttagaa gtatgtgtgg ctgagtgaat gctacagcat 37800 acatgtgcag gtcagaagac agatgaatct gaggacgtcg tttctcatct ttcatcaggt 37860 gagtttccag acttgaactc aggcttagca gcaagcccct tcaccagtcc agtcatctca 37920 cctgccccac cctcaaaatt ttgtgaatct ttagtctctt gtgttagcct ttgctcactc 37980 aggaaaactt tatttaggtg atatttcaac tctcgtttga aaacctaatt gtaaccctgg 38040 taataaaaat accacagtac catatgcatc ctgcatgggc atacctgcag gcctacacgg 38100 atgcgctttg tgagtgcacc ctctggaaag acagcctgca cctgtgacac cacggtactg 38160 ctcagcactc cgccctctgg gccaatcagg ttgctgtcct gtttgatccg agacaccacc 38220 gcaaagtact gtgggaagtc acgagtgatg atacggcaga ttcgtttctt ttccaggtcc 38280 tcgggactgt ccagcactga gacaagaaat gatccatttt cataaagcta gtgactcccg 38340 agaacattct agtagactca tgggcacggt taatagtagt caggaggagc agccaagctt 38400 ccctttagtt aaagctagaa cacaaggtca tcctgacacc aaataaatac tgggatcttt 38460 caccagctgt cagcaggttg ctggtacact tggggaaaac cctgctttcc agggcagtgg 38520 aaaagaagtg catctcgggc ccgatgtgcc tgtgcagtgc tgtgtcttcg agggctatcc 38580 tgtagtggaa attaacatgt gctattcttg gttcatgtga tggagaggag gctgcacagg 38640 tacctccttt cctttgccaa tttcaaagtt agctcaaaga ctagttattg ttatcttcag 38700 aaatcatatg gtccattagg tttcggggga ccagtccggt aataaattct gtagtgaatg 38760 gttaagattt ctgcttatag actctgtctt gtggcattgt ttgtgtctga attgacattg 38820 gtgatgacat cagggtttca atattcctct gatgacaatg acttagcaaa cacatgacct 38880 aacagcagag agtgggatca tggactctac aagttgctcc agtgtaggta tttagagaaa 38940 taaaggcagt tagactaagt gtccatatga atgactgaat gaacttattc ctgtctcttt 39000 aataatagaa catttaaaag ttttgtgctg agttattcat tatgaaatga catctctact 39060 gttagtttta gattccacaa aaggttgcat taaaggatag aatcctgctg actatacttg 39120 ttaaaggaat acatttatta tcttaaaaga ctttattttc ctgagtttaa cataaacaca 39180 gttaagaaaa cggatggatc aggcactaaa acttgctaca atcagaaccc agcagataat 39240 gctctggagt gaaatacctc aagaggcaca catttgcaca caagtgctca gagaactgaa 39300 atatctaaaa gcaaagcaca attatcatat ctccacctga gagtccttta gaccccttaa 39360 ccgaaggtac cttcatccat gccattaagg atctcgttca gttcgtcttc agtgtagtca 39420 cagaaatgct ctttccagct gtccccgttt tcacttcgca gaaccaccag ctccctctcc 39480 tttcctcgaa gggcagcaaa gtgaggaatc tccacgatca ccggcctgac acagcaatac 39540 agaacactca gtgtagacag gacaaccaat cctgagacaa gtacctcaac actgtctgtt 39600 gcaaagtgac ctggaattct gttcattctg gggacaggga cacagtgggc cttcctccag 39660 agcccaatga ctaatagatg gtgacacagt ggcactccac ctcaggggca ctggtcctca 39720 agtacatgct gctaccttaa ggcaaatgat atttctctgt gagtgcatgt ggcattctgg 39780 aacttctcct ttgataaatg taggtatagc aatttaacca aaagaaatgt acatgcatgg 39840 ctatgacgta tgccaatctc ctaaaacatg tcctacaggt gcaaaatgac aacatgagtt 39900 aagaaagaat atggctcata cattgcataa ttcaatgtgt tataaatgag atgtcagaaa 39960 ggtagactac ttgtgctaat gagccatgca cttatggcta ttctcatact gtcttcattc 40020 aagaaaacaa taggcatgtg tacacaatgt ggccctaatg agccactcag ctgacagtcc 40080 aatggtgtcc aatgcctatt atggtcagga tccagaacat gcactgtcct atggctttta 40140 ggtcacattc atcctcaaca tagacagagg cttttcattt ttgagtccag gttgctttga 40200 tacagactcc aaactcatca aaaccacatc atgactagca cagagtacaa ctaggcaagt 40260 ctcatgcttg aacgaaaatg aaggtcacag cactttaaag gagaagatat aaaacgtcac 40320 tcaaaaacaa aagtcacata ccacaagggt cagaaatggt ccactaaaga taggttatac 40380 agagtttaaa tcatagagag ggacatgtca tgggcacaat gacgaaaaga gaaatcatat 40440 cgcagaagaa ggagaagaat gggggccagc agccatcaat ttgttttaag tcgctcctac 40500 ccaaggaatt tggttccagg aggccccagc tgaaggatgc ggctgaccaa actttctccc 40560 tcattaagtg ggggaggagc cgttggcagg tgaagtttac tgagtacatc caaagcagca 40620 gtgaaagaaa gaacagaagt aagcttcagg taccgtgtcc acagaacccc agcatcacag 40680 ggtgaagttt ggtttcacac tgcgttcggt tctgccccct ccattggtca caaagagcaa 40740 ggaactagga actgagaccc agagtgtaca atggaggtgc ctctgtgcca ggccagcacc 40800 tggctgtcaa gtctgttcct atttaggttc actgccaggg cactagccaa aaatgaaaaa 40860 aaatggaggg gaaaaattgc tctttgggaa agacaaaact gttgggaata tagtaaaaac 40920 tctggacagc agccagacgt ttccatagat attcctcaac agatttgaag gttattaaaa 40980 aagcctacaa caatgtaagc aggagggagt taggctctga aatgaacatc aagaacatca 41040 aaataatcca gccatagtgt cattttatga tgcaacccag aactccatag gctctttcca 41100 aacctctgcc tgataagacg tgtaagaggt ggtttctaca actgggaact agcaacacat 41160 cccttttgaa tttggagcaa cctgttaaca atttgcccca aattacagac tttagaacat 41220 tttcagagtt ctaaagcaag aaatcttctc cccagtatga catgaacaac aatgtaaagg 41280 aatcctgatt agtaagagtt ttctctgttt taagacccaa gacttaaata caattgattt 41340 gtttcaaaat gatttgaaac ttgttccctg ctccaaagct tcatcccttt gtcaccattc 41400 agtcacgact tttcacctct tgacagattg aggtgccatt tagtatgaca gtagccatac 41460 agacaaacag aagaaagaag aaatgctatt ttctgctcaa aatggccaaa atgacaaatg 41520 gcagaggtta atctcagtat tttcatctta cactgtggct tagaagctga aggtaacaat 41580 tttgataata gaaaaacaca caaatcattt agactgaatt ttagatattc aatgaaggca 41640 gcactctggt ctgaagagaa ggtaactgtc actggattca taacgacaca aggcattaaa 41700 tttatgtttc aaacagaaca cattttttct ttatattttg ccttttagtc tcagatgaga 41760 aacagaaata cttaccaatg gctaaaaaac atggttatac tattgggaat ctagcagcta 41820 ctcccacatc caagaagaaa aaacactaaa acactagcaa cctgcatgtt taactcactg 41880 acgccttatc atgggagtgt ggaagtaaag gcaggcatca aggcactatt tccaattaaa 41940 aaaaaaaaag tcacaggaac ctatcctttt tcaaaatggc tttgacatac ctttggtgtt 42000 ccatcccatt gatctcgggt agagggcaca agcccaccgg agagtaagta gacgacttat 42060 gggaaaccct tacccaagga actgagctcc agaaggtccc acttcaatga ggcggctggc 42120 caggccttct ccttccacca ttggcggcat cgttgccagt ctatggcgtt tcaccaggcg 42180 gcaggtgact cgagttggtg ctgtgcattt ccgaggtggg ataatgatcc ggagtccatt 42240 gtgtctgcat ccgcgcatgg cgccaccacg ggcatccacc atgaaactga ccaggaaact 42300 gaaaagtgaa agagaagatt aggcacgctt caaagcaacg cagcaggtaa tcacaaactg 42360 tgaggtcaat tgttttctgg actgtctatt tctcctcaat acaatgcttt taaatgtaag 42420 tgccttgcgg aaaaatattt ttgaagttta tactaatatc tatatttgta ttacttattt 42480 taatttctgt ataattttca tatgcttctg aagaataatt ccaagttttg ctagtaactg 42540 gaatgaaatt gcacagaaga tgggcaagcc ttctgtctcc ttatatgtcc tgtgcaatcc 42600 aagtgttcaa ataatataag gctgcagtac acaggaaaga caaagtgtca tatgtttcaa 42660 cttagctttc caagatcaca tctgtctagc ttgtttttaa gataatctca tcatgactga 42720 aaaacaacct caaggacctt ttcttatgat caaatctatg ccaatgtgtc ctgcccacaa 42780 atcattgttc ccagggtgca gatttgtcac cagtcaaaag acgggaaaac ggttggaata 42840 gactttctgg ctaaagtgat gactgcactt ttaacccgtc cctgcactca gccattgtaa 42900 ctgaaacaga gggtgaatga tgggaacaaa tggggttccc cctgctctgt ttctgtgggg 42960 cagggccagc atgggaagcc agggctcatg ctgatagagg tactttgaca gcatgatttc 43020 ccccaaattg caataaactg gaggtggaaa agaaattaca gtttaaatat gcaaaagcat 43080 ctctgtgagt tttgtttctt tattgttcac tgaccacgac aaaaagaatg gtaatctcaa 43140 gagtctgtgg ctgttgaatg tgccaagaga aagtgtctga actctgaagt ttctttgggg 43200 tcgtcacaaa tcctggagca gcttagctag aatgcttgtt actacattaa caatgacact 43260 caccaaggtc ccttggtcac gcacctccta cagaagcaaa agttaaataa caacagtgta 43320 gttgtcctgt acatatacac aaggacatgt gtaaacagaa tgtaggctct tccacaatca 43380 ctccaatgtt ctcccacttt cactgcactt gcaaagtttt tacaacaaca aaatggaagc 43440 aacgtatagg tgtttcatag atctactgat aaccacacca gccagatcaa cacacctaga 43500 tattgcctcc atgacaacac tgaaaacatt tgaaagggat tccatcaaag taagttgtgg 43560 gatagaaaca tggtacactg gtgttatttt ttgttttagg taagtgtaat atcatagcat 43620 cctctttgcg gcagaacaca gaatgcatta gacatgccat taaacagaaa acctgttgct 43680 agtaagagaa atgggtgcgg aggagcccag agtaccctct gaagcatatc atgcagcatg 43740 agaccacagg agccacagtc ctccacatgc agtagccagg ctagcctacc attctcccct 43800 cgctgttgag ttttcaggtc gggcaatagc tgctatgtac aagcaacagt tcatactgtg 43860 ttaactgttg atgttctggg tgttagcaaa acacaatgag aaaagggcta cagcttttca 43920 tactcagtct ttagtatgaa ttctgaaatg ttttgtttct gacttttaaa tatacacgtt 43980 cactcaaagg aagaactggg aatacttcca gatgaacaag catattttct tttattattt 44040 ttgagtacat ttatattgat gtccatttaa aagtaggaaa attgctgctg ctgtttcaac 44100 tagcagtgtt tccagattca ctgtaatatt tccaacttgt ttatagttaa atttgatacc 44160 tcctttgatt ttcctccctc ataacttttt aagataggat ctcaagtagt acagcctagc 44220 cttaaacttt ctacatttat gcaattaact ttgtactttg cctttacctc taaagttctg 44280 tggttataaa tgtataacaa cacctaggga atttttcaag tctctggtac tgtgagaaaa 44340 ggaaataggt gctaaaacta gaagggatta ttattacatg tttgcttaat gtaatgaacc 44400 ctcatagtat ctatgtcttt tgaagaaagt aacaaagttt ctgcactcac atcccaagcc 44460 cttatatttc catggtatta ttccagtgat ggcctttagc ttgtaggata ttaattctct 44520 acccccccca aaaaaaaaac acatagaata ttcttgtggt ctaccctcaa agcagagaat 44580 cggctgctat gtccttgaca gagtctatta ttttcccact gaagccctct tttttgtgtt 44640 aacttcctct gatttctgct tccatggtcc ttttgtgtga tctgttgccc taccacaaat 44700 gtcaggagct gtgccaagat gtcactttat gctttcttcc ttgcttggac ctgctaactt 44760 ctttagtcaa tgagatatca tctgtcatct catcaaggtg tcacctaagg gctctaacaa 44820 tagtgaatgc aatctcagtc ccctagtact cagtaaagta tggatgcagc gcactgtaca 44880 gagtcaaaat attttttgag taaatgaatg aatctaagaa tgaaaagcag gctatgacaa 44940 gttatgtgta cttacaagga tcagagagag agcaaggcat gagataagtg aattctttga 45000 tgcctggcca gttattacaa tcaaacctca ctcaaatccc tatgttctga tgtggcaaag 45060 caggaaaata gtatgtctaa ttttaaagag tctactccac acatttacgc tcagctggga 45120 gatccgatca gatctggtat acttgtttcc ctgggtagag gtttagtgga aatggaagac 45180 tctgaaaact aagagcttga atgtaacaaa atgatatttt taaaagtgat aacaagatta 45240 tatgaagaaa gactgaagaa ggaggaatca aagtagcaga atttaaagac tgaagcagca 45300 tatagataca cttcccagca atcattcctg tgtcgtgggt gattcagaaa acagtaaact 45360 ggtagaatta agcgcctaat atgcataatc cagggggaaa tggcaaactt caggagaggg 45420 taaacctcca taattaccgt aactgaagaa atgacatagg ctacatgaaa atcacaaata 45480 agagagagag agaaagagag agagagagag agagagagag agagagtaaa ataaaaagat 45540 gccaagaaac agaaagggct ggaagacacg aaacaactgt cattattcag aaggaacaaa 45600 tgccaagaaa aagaaagggc tggaagacac gaaacaactg tcattattca gaaggaacaa 45660 agagtattat tgtaaggtta acctagaagt taaacattct aggcaaattt gcctcataat 45720 gtaattgtca aatgaccaat taagactgaa cttcactgtg tactcccaga acctctcctc 45780 tacatagaaa gagtaagaga aacattgcct ggatttcata tctaggtcta cttgtaaagc 45840 cagcaagcta accagtcaat cccaatggtt tctagcacaa aactgggtaa gcatttggag 45900 atttttacta aaaatggaag aatacagaaa gatgcactac ctggatggct aagggaagcc 45960 agttcatctc tgctatgtat aaagcaactg ccaactctgc aagagccttt tctttgtaag 46020 gactgtgagg aaaggagaga gcatgggaga agtaactcat gcaatgctgg aatgtgtcag 46080 ctagcctgct ggaatgaact gagtgaatat aattctctca cctctgaggg acactggaag 46140 tgagacaatg cggtccctgc aaacatttac agatgaaggg aactgaagga aaccgaagaa 46200 gacagctaca tacaaaggag atgggatgca aactgaagct cagctctgca gtctggcgtg 46260 tgacatggaa gcttccttgt ccctgggtgc tgatcctgtc accacttaca gtaataggga 46320 gaaataaatg atgtgtgggt aaaaaaaata cagattcaat aaatggctgc tcccattatc 46380 ttctttttct gccttttatc tttttaatgt catgttcatt aaaatgtaca tcatacatca 46440 cctaaaaaac ggtaaaaaaa atactcattg agagccttca atgtacccac atttgtgcta 46500 aggggtttta atataatcag tagagttatg attgcctcat gaaattgatt ctttaagcag 46560 gatgtgagga ttttcttact acagaacagg gtgctgtgct gccatgttct ttccatgtct 46620 gttttgaatt atttctgtaa ccacagtcaa gaaacatgac aagttcatta gcttttgttt 46680 tcatatgcat gaattcaaag atttaggtga ataaactctg aactcactgc ctaatattac 46740 aaatttgatg cagttatggc taactagatc agacaaccta cctgaatatt tgattttaga 46800 ttttctggag gaattcctaa ttggaaagca aactgttact gcttcaataa atgtagtttt 46860 taacccatgg ttaaatagat gctttcttga aaatgtgtag gcatactgcg ttagacattg 46920 acttaaaact acaagggagg gtggagagat aaccagggga cattggctct gatgcatctg 46980 actcttcaaa tgacagcagt catgcaaagt agaaattctg aagttttcta aattgtgaga 47040 tactatgttt tcacaattta aaaaggaata aaagcaaaca caattcactt ttattaggca 47100 gaggacttgc tgataaatat gcaatttgat tagctaaaca ggtacatgct tcagaggaga 47160 cagcataaaa caaggattct gacttttcaa acaactgtac tgtccatccc caaagttact 47220 gatacttaaa atttccattt aattcatcta ggaccatgag ctgggaacag ggaggagact 47280 gcagcattcg gagttagtca ctgggtgaaa gacagaagaa aagattcatc agggtgcttc 47340 agtgatgcca tgtacacagc agaggtcctg acttccactc ggactcgtgg tgctgttgga 47400 aaccacacca ggagcttcct tctccatcat tcccctgtcc tttactagtt ctccaaatcc 47460 cacaaaccaa aacattgatt aaaaaaatga cactgaaaag ggtggttcaa atttgttcaa 47520 atcactcagt aattaattac caatcactgt agtcatgaat agaaatacaa tatttagggt 47580 gtgcctgaga agacataaaa ggatgcttag acccttaaaa gaatgaaaac atagaattgt 47640 cttattttta gaggaataac ccatattatc atcatggatg accaaagaat aaaaatacta 47700 taatcagtag cccaaaggaa ctttaaaaat aacttcatct aaataataca gaatgattgc 47760 tatatttaga atgcagataa ctcattccgt agcacaattg caaaatatca aaaggttgaa 47820 cttaaaactg agttagcaaa gatatgtact attaataagc ccttagcctt tggctcacct 47880 agaatattgc aagataaaaa gcaaaacaaa gaagaaaaag gcctgagtgc taccaaaaat 47940 cacaaccttt aataaaactt caaaatagca ctgccaattt gcataattat gggaacataa 48000 tatttcagtt ggatgtagca cttttcctcc caaaagaagc tgagatgtta aggccatgat 48060 caagacagga gtctgtttta attttgatcc agctaacatg gtacctactg gtactaaata 48120 gacccacttt cccttcatag ggaaagtgag caattgtctt gatttggaga acataagcct 48180 ctgtatatgt ttcactagac atcatcaaca ctaaagcatc ctgaggtaga gcatatgcag 48240 aaggagatgg cgaaggagag gagaacaagg gacatggtca gagaaggaat tacgcagagg 48300 ttcacctgct gttgtcacga tcaagacatg gagaggcgcg gctgcaacag aatagataat 48360 ttagcatgga gaaagagtgg ataagtgaaa tataaagaat gaaatcagat gtgactttga 48420 ttaaaatatt taattcatat actaacacag tgttcactga aaaaaagaga tggaaataca 48480 agtaagatat cactctatgc aaatacaact aaaatgtcac tctgtatgcg ctgagagaag 48540 aacaagcttt ggggccttcg tagttcctcc cagtttagga acctggggaa gttacttaat 48600 tactggatat gaaagtgaag cattaattag cattggcttg tgggaacact tagcaaatac 48660 taagtgtcag agaagctagg aaacaccaag tgatattata atggcaaata caaagtctta 48720 gatactgtag atgtagtttt gattcaactg ctgtccattt gtaattcttc caatactttt 48780 taaataagat aattccccgt tgggatatag cagaagaaac acaaactgga aaggaatagc 48840 ttaaatgata gcttctgtgg cagagatagc atacagtcta caacaaagta ggtaacattc 48900 tttggataat agtggataat aaagatcttg gcaaacatga tcttagtgct tctccccaag 48960 acaccatggc ctactttgag cattgtggtc tttctcctca tccctaatgt ctagtcccac 49020 tttatagtcc tactcgtcac tgctcttttc cccatggagt ctgtgattca ttaaccccat 49080 gcctgcagga tttaataagg ttccaatgtt tgctaacatg tggaagtata ttttattcaa 49140 tgaatcagaa atccatcctt ccagatcagt tgatttgcta ctttagaaaa caatcttctt 49200 catctgaaag aaccagcctt tgtggatcta aaagaactcc caagatattt taagaaacat 49260 gaacagctaa attaaacact ggaagtgctt ccataagcgt ttacgttatg ctatcccatg 49320 caaaatacac ttggctgcct tatgcctcaa acagtctgtg atttgagcaa acagttttga 49380 atacatcttt catgactttt ttgaagtata gtgcaaggtt cacaacaaaa ttgtcttcag 49440 catgctttaa acgatcaatt tcataggcct ttattgtact gtatcatatt ctaacacctc 49500 atgagttggt atttaattaa taacatctgg ctgtcattaa aacactacaa agactttcaa 49560 agtggcaata tataaagttg agttgtaaaa ctagctattg gtagggaaac tgccttacat 49620 cagccaattc attatgcata taggcaatta caaagaattg taaagttcac atttttgtgc 49680 aacaataaag ttgcacaaac tttactatta tgacattaga tgggagcctc taataataac 49740 tgtttcttgg attcatgagg agtcagttgg gcaactcaaa taataacaaa aagtcaagcc 49800 tctcatttgt ccaaataact gaatgtatca atctgtgcag gaagcagagt gtaatcattg 49860 gcccagttct tcttagccaa ggacatctct taaaaatgaa atagagggaa agtaaataac 49920 tagcactgat tagtggtaga aaatgcagct cgaagttaag acaactactg aatttaatgc 49980 agcattgtcc tcatgtatac gttagatata atcacaagct ttcttcacta ttctttaccc 50040 aaaagtcagt cgcctttccc ttacatttta agtgggttaa aactcagatc cctgaaaaat 50100 atctaacagc tattacttat gaacctgatc catgatgagt ggattaataa ggaatcagtg 50160 ttataagaca tgatgaatgc tactcatata tattaatatg aatgtcactt tcaaacagca 50220 cagctcttgg aatccttaac tttctaaggg taatcttgct tctccctaaa gtcctctgtg 50280 gccccatgtt tgctcaacca ctacaatagt gacacccata gatgatagaa acaagtccat 50340 attgggattg tgggctgaat gtgtttgtat tgtcattcag aagacttggg gcgcactttg 50400 tttaacttat ttggagtttt gagaaatgtg aaatgtgtat aaggaggatg cagaaataat 50460 aaaagctata ttctattaag tacttgtttc taggtaaagt ctaatgattt taaaagcttt 50520 aactttaaag gagtgacaag caggttgtat ccactctgtg aaaggcattg aaaagacagc 50580 tgagaaaatg actacatgga tgtgaaatct ttttattcat atccctactt gagtttgagt 50640 ttatggatca gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gnnnnnnnnn 50700 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 50760 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 50820 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 50880 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 50940 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 51000 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 51060 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnntcct tttctatatc taaaacctac acacaaagag 51120 catcagattt aatggaaaac acagcttcaa aattcaacta aaatacagtg agttctgaaa 51180 gagcacaaaa caagaggtgc tatgacagaa atttttgtct aaaaacacga tgaaattatc 51240 tcttctaatg cattccctcc tgaattatat tatgacagca aagtactttg aagagagccc 51300 ctgttcatcc atttccctat atcaaatcca tacatcagat ttaatggaaa acaagcttca 51360 aaactcaact aaaatacagt gagttctgaa agagcacaaa aacaagaggt gctatgacag 51420 aaatttttgt ctaaaaacac catgaaatta tctcttctat aattccctcc tgaattatat 51480 tatgacagca gagtactttg aagagagccc ctgttcatcc atttccctat atcaaatcca 51540 tcacgagcaa taaaattata cctaaaatta aaggttccaa agtaaactta aagccttttc 51600 tcatagctac tttaaatatt gcaacaaaat gtactttgca aggtaccatt catcatgtaa 51660 atatgcctgg gtcattttta tctcataatg gagatattag ttacacaaca caaatctttg 51720 tagaaaatct ccatagagga actatggctg aagaaagtat ggccaaaaaa agaaacagta 51780 tattatttag agggtagggg gcaatgctca gtgaaaaatc tagtgaacat ttgtcatatt 51840 gtagggcacc gtcaaatctc tcaccctaaa tttttttttt gttgttaaga ataaatttag 51900 gtttctgtca ttctctattt ctttctccct ctggactccc acccccacca ggtttcctcg 51960 ggatatttgt ggtatgagga catttgaaaa agttatccag aaagcagtca tgaaggcaga 52020 aagtcacata cctggtggcc aggaatcaca accgtgtcat caatcatggc actgtccctc 52080 aggtacgaag catggctcag agtgtgagac ctgtcagaac tgaaggaccg gaggctggta 52140 ggttggcagg aggtcatgat cataaaccaa cagcggtgga ggattgggaa gatgaaatga 52200 gccgagcagg agagtgaaaa aagcgtgcta ttagctaaca gtgcaacttc caggggacac 52260 aggtctcaga gtggccctac gcctccaccc aacagctaaa aacgcatcct cagactggct 52320 gaacagtgaa aggcaagggc acaagggaac ccacaaggta aatttgatac tcttaatctg 52380 atttgttgcc tttccagaaa tgtttgaaac cagcaactgt cttttatttg ccagcagaag 52440 aaatttatac aggtaataat tctgaaatcc ttgctaaata acctccctgc agccgtggga 52500 aaaaatatct gatggaagga agacagcggc cggagagcaa aagtagaacg aaaaggcagg 52560 tttcagtttt tgccctttat tttctattct cttcccatgc cccttcctct tcctttccac 52620 acggggaatg gctgaatgtc agtgtcctcc cctggaaggt acagagtgaa atgaactgga 52680 gccagatgtg tggttcctgt ggaagtggag ttcctcttgt ttatctctgg agagtccaac 52740 aatgctgtta tttcagagga gggcagtgtc ccttttgtat gccctgtgtg tagtgcagga 52800 agctctaaag agtgttggtt gccatgggga tgagaggcaa gagcagagga actcagcacc 52860 agcccaaaac agatacacac taacacaaag acaaactgcc aacagacacc aaaagtaaca 52920 ccttatattt ttgataaatc tgaattttgt tattcctaat tgcagattca aatgcaatgg 52980 gcaaaaattg cactcattct attcaatatg tacaatcaaa ggacattatt ttggtgttat 53040 cccttttatt ttcctgagac agggtctttc tgtgtcatcc aggctagtct ggaactcact 53100 atgtagccca gaatgtcctt gaacacttgc ctcagtttcc tgagggctga agttacaggt 53160 ctgagctacc acgattagct tacagattga tatttgaaat aatgtgtcat atgaagattt 53220 ttatgcatag cccaggaatt aacagtttgc attcaaactg ccagccaaaa accacaaatg 53280 ggtaacacaa aggataagca agcctagtag atattgatca atgaagcact gtagaattat 53340 ggactgaatg aaatactaac attaagttta ttaaatagaa aattagcatg tagattagta 53400 gaaacacctt agtcttgaaa atgcatcaaa ttttgttact cacgctctct gataaacatg 53460 aggtgtcaat gaaaaccagc tatttgaaaa cattattaca tgaaggattc tttatggtga 53520 cattttccca tgttttgtca gtagtaggtt ttcagaacct cacatttaga cagtaagtga 53580 tacgacaaaa agaaattgat tattggctgt ataagctctt ccctacataa atctatatgt 53640 ttataatgaa ataaaatcaa aatataattt gaactcagct atctacagtt ttacaggctt 53700 ttggggtaga ttgagagtct taacacaggg cacaggtagc ctggatgcct tgcaattaat 53760 cagcagaagt ttgagcccta gcaagaggca gcaactgata ctacagctgg ctttgtggct 53820 gtggagttgg cttttgatgg ggtcttaatg agatcttgaa tttaggctga gacagaaatt 53880 caataataag gatgataatc ttttaatgta acaaaagtgt actcccacta gtggaataaa 53940 atgttgctat tccttgctgt aacccagagg aagcagagat acatttgagt gtgttttgta 54000 cccagcagca gtccaccagt agtacttaaa ttctattctt tattttgttt tgactttggc 54060 caaaggcaga gggccaacct cacgaaacaa cagtgtctac tccatcacct ttcccatcga 54120 gcgtcttcag ctgggcccag atttattagg tatataatgt ctagccatgg ttgtataatc 54180 taaatgttta gactataact tttcataata aagatgctag ctgtatgtga attcatactg 54240 caaaagatgt gaaccaggta agaagaacac ttgattcaaa aggccagctc ttttgctagg 54300 aaaaattaac cttttaatgc accctaagta gagaagaaat tctggtttaa aatgaaaatg 54360 tatactgatg ggaataaaca gtggtaataa aggtattcca cataaaacct gtgacaaagc 54420 tgtcagaatt gtattatacc taaactttga cagaaggcac tgggtctcag tgaccactgg 54480 agtgacaatg actaattggc aggtctgcct gaagagcatg atatgaaaaa gcttatgggc 54540 cctaagtgtc atatcccatc ccacagttag caccagtgat gaaggtgagt ttgtgattgc 54600 catcttcctg aatactgggt ctgtctctcg actgaattga tatagagaag gtagagagag 54660 aatctggtgg tttttattca ttttcatctt gcttaaacag ctaacaagga aaaaagacaa 54720 cttagccaca aaaggtgatt gcaaaagaga caatgggcaa gaccactatc tgagtgttca 54780 tttctttgag gatcctatgg tgctttctct gctgactgta gggaaatgct aactggatag 54840 tgaatcaaac tttatgtttc ctaactgttc ttttcaccct gagaaaatat tgctgagata 54900 ttctaacagc agagacataa ttctctctgg taaaataata acaagaaaaa acttttggaa 54960 taatttgagt ttctgagtca tgaactgtcc acatttggtg gaaaacatta cgaaaaagtt 55020 ctaatgtttt atagcagagt taccattaaa aaattatgtt ggggagcagg gactcctgtt 55080 cacttaatac acagagaata atatatccag agaaattaaa ttttacttgt tcagttgagg 55140 gattagcagc tatagataca aggaaagact caattcacac tttcctcctt tcatataatt 55200 tatgggtttg aataaatgta ataattaata tcttactaaa ctataaaatt tattagacat 55260 tcaacttata gagtttgaag ccctgttgaa caagtaaatg cacaaaatgt tcagtgtgct 55320 gaagaagctt ctgtgatttt ttggttactt ggggttttat atttgaattt ggacagtatt 55380 tttaacctgt aagcaataat aataataaat gaactaaaag ctagctgatt gtaatttgac 55440 tgtgtttttg ttcagtatgc attaatttgt acatgcttgt ttcaggcaac agaatatttt 55500 ctctagcttc tccaagtgca tatatacgta ggttgtttag tttgtatggg agaaaccatg 55560 cctctgtgtc ttcagccaca aggtggcact gtaacagtca gagttaagcc tggatctcct 55620 ggcactgtgg ttccagtaac agactaactc cagcagttac tgaatttaga tcaaagggga 55680 aaaaaatcca taattccaag atgtaagcaa ttctggccaa cacacacaca cacacatacg 55740 cacacatgga tgcacgtgca tacatacgca gtgagcagtg aagcagggaa atgcgtgtgt 55800 gtacaggaag gccatggttt catgccatgt aatacctacc tggggatggt actactgaca 55860 gcataccaaa taaagaaata atgaaaagga gaatggttac caaaaaaagt ggtgtgccaa 55920 attgctcaag caaaagtgaa atagtaatta ataaacatga aaatgagatg ctgtccatac 55980 tctgttttgg gctagtgtgt acatgtggtg gccaagagat gcaggtggaa ccctaaaaac 56040 atagcatgta atgtttgctt ctagcctcca tctttatatg ctggtaaatt tcaaaccatc 56100 cacctcctta ttctataaaa agtacactac cattctccaa tcttagtttg aaaaaaagga 56160 aatgtgactg aatcaggtat ttttttaata attagaaact gatgaaaatg aattgttcct 56220 tggttgaaca taatcaagtg cacactatcg tgaattcaca caaagctaca gagaagtttt 56280 tttattgtta aaacatagtc ttttaagaat ctcagattat aaatcgaaat ctgtcagtgg 56340 acaagaattt gatgtgtgga acacaggctc agtcaccttt ccccccaaac cccccacagg 56400 ctcctccttt cttacgctga ccctaagggt cacctactat ctaagccacc aatagcaggg 56460 agtcacctcc cttcgttttc aaatgctcca taaaactaac caacaaatct cactgcccgt 56520 ttcaaaattg tcactgctgg attctttcca cgactagccc agggttagag tttcatagtt 56580 gcataatcac ccagcaaaca gcactaagca gctgggtggt ctagtccagt gggcactaga 56640 atggtcctct gtagagggat tcttataaaa tccaggtaca gctccctccc ttcacactcc 56700 cactccagcc caaggcacca gtgtgccacc gataatgtaa gctttgctgc ccccacagtt 56760 aagtatccct gtcttcccta gcatcactgc tatgcattct tcctgtgttt gagcttctat 56820 ctgtcaggaa gatcaagcct cagccctgca gaggcgctct gtgctcttcc atcctggcct 56880 ttcagggtct ctcttaggcg gtgaattcag tgaacatatt ttaatcaggt tggtacctct 56940 gggacttacc agaatgcaca gctcaagaat taacttacca cagtaaaaaa aaaaaaaaga 57000 aagaaaaaag tgaagaaaaa ggcaagaggg gggaaaaaag agagaaggaa ttctggtgct 57060 taagggaaaa gcctccaagt agcttgcttt tgtatattat caatgtagaa ttgataattc 57120 cttaagctgt aaacatggga aattcataac atagccaaca aaagagtgag ctttgtccta 57180 tgagcatgtg actgttgatg ggaaagacat tacagcaaca tggacaggca tatatgtgac 57240 ccaggctggc agccatactt ctgaagaaat acccagaata ttcttattca tcttgctgtt 57300 gagagtacca agcaccaggt gtattagcta gtaatagcca agagtacctt gaatctcaca 57360 gtgcagaata tgagaaaggc tcttcacatt tgtctataaa tagtcaggtc cttatgggca 57420 cagatcacct cataagatcc tatcttcttt ttttaaatga aaacattaac tccagagcag 57480 tttccctctg cacttgtttt tctattattc ttcataattt tgttcacaca gaaataacag 57540 caccaatagt taagttagac ttaagggtat ctggagatgt taaacatatc ggccaggcaa 57600 aactgtgcgt agaatttccc tagagaacaa tgtggcagct gataaataca tcacttggga 57660 aggcagtgac tcctgtttgt ctttgtccag tttcgtagca gttggatgat tgtactatat 57720 tgtttggtgt ctctgaacta gtttccagtc cttcaaaatg ggcactactt aaaatatcag 57780 agaaatgaag gcgataacat gttaactggc aaatgtggta aactacccat aagtgttcta 57840 taaccatgtc tacatttttt aatctccata aaaaaggaag tggtcagcca ggcatagtgg 57900 tacatagtgt acctgcctat aatgcatgcc caacactcag gaagctagga ataggagggt 57960 caggagtttg agactcatct gagaaagcca ttctgggcta cacagtgaga ccttatctct 58020 aaaaaccaaa agaaaaagag aaaagaggga aacatttttt taaatgtgtt gtgagcactt 58080 gtgtctgaca ttcaatggaa ggttggtgaa tacctgtcag atctccctcc ctccaggctg 58140 taccgaaggt agttcatgcc atccaggaac tgactgctgg gtagtgagtc atcaccgagt 58200 tctttgagat cttcaggcct aaggtattcc cccccatcgc ctgtcattgt gtcatcacct 58260 taaggcaatc agaggagagt gaaggaagtt acttgttgaa tttcatacca gcaacaaaat 58320 atgcccataa ttatgaaggg cattcataca gcatcttgga taacagcaaa acactgcaca 58380 gcaggaagaa acagggttca tgcatatgtc tacaaagggc taaagctaat agagatagta 58440 tttgattcat tgccctacaa tgcaccaaga agaaacaatt ctctgaattg taattgtttg 58500 gctaccttga aagggttttc tttattatgt ctgtcatatg atgactagtt cagcttaaag 58560 attagccaaa tgtgtagact attagaattc tctcagtacc ttcaataatt ctgcacaaaa 58620 tccagtacta atagtctctt tgtgccattg acagtaggct aagaaacgta tatttttcta 58680 taataaatga gaggttttaa ttttatttat atattgtgta tgtgtgtgtt agtgtgtttg 58740 tgtgtatgta tctgtgtgtt tgtgtgcctc tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tacacatgaa 58800 aaggatatca gaggaacatg gtctctgctt ccattgtgtg agagctagga tttagttcag 58860 tttgtcaggc ttagcagaaa gcaatttacc tgctaaatca tgttgctggt cacaaatacg 58920 ataataatat tttataagat taaatatata caatagcaaa agagcacaaa agtaaaaata 58980 aattctaaga acaggactac taaaatcttg gcatgctctg gcttgggcat gagcctaatc 59040 tgttttagag agttttatta acatctggga agacagtctg tgacccattt tcatgtgtga 59100 aaagggtgat gggaatgtca aatgcaagat ctattacata acaagagctg catcttatgt 59160 atcactggag caagaagcca aacatcacct aacactcaaa agttggcttg catgcttcct 59220 ctttcccctc ttccctgacc ccactcagaa gttccaatac aagcgaactt ggcttaagtc 59280 cctactacta cccaaattgg ggcaccctgc atccacctgc tgggtcagtt agttttcaaa 59340 tgctaacctg tttctcctgt ttccagttct gatcccaagg tggtcacagg gaacaaagtt 59400 agactcaaaa taagtatcta ttacttatgc cttcaaattt ctcaatgctt cataataaaa 59460 cagggcccac attttagatt ttcttactca acctctttct tgttttgtct tggtgggaag 59520 cagaaggttc ataaaagtgg aaggaaaaga tagaggaggg aaggcagagt ctagctggaa 59580 aattccaccc tgacagacca gggcagtaag taaactacag atgatctggc agaacctggg 59640 aatgaacaca tttctaacct tcctctcttc tggtgatgga attgtgttac aaatagagaa 59700 caagctgtct ggacagtata tttaaaataa aatatatcct tttaaaaact ctagtgacag 59760 gccaaggcac tatttgaaac cctctgatca ctttaagctc atgaaatagt gtctgtcctt 59820 aatattctcc ccaattctct gccttctgat tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 59880 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgatacccct gccactgttc tgttgtgata tgcctccagc 59940 agttgctatg ctcggttaat taaaagtgag gcttcagagt tttggataca cccatagtga 60000 gccttaggaa tagattgtga ctgtgaccca aagtccctag tgatagtcac actatctaga 60060 atctcatctg atactgttaa taggaggggt acttgtctct ggccaaatct tgatattata 60120 tgcaatttct ctccaaatat ttgcaccaaa aatactattg ttcagtatta cctatcaaca 60180 ctgagtggtg gaaagcgtgt atcaggagaa gtagagggag ttcatgcttg tttatctcca 60240 tttctagaac cctatgcccc ccatcttctt gtcagcctgg tctagaccct catctataat 60300 cttcctctgc caccaatctc atgaaggact ctccctccct ctagtaaaca ctaagcccta 60360 ttctacatca tacttggtct cctcttccct ttgtaatcaa actaattaaa gagacccttg 60420 ctattattaa ttgattttag taattaaaca gtgaccaaga gttgacttct ttgaaaaagc 60480 aatcttccat gatatctctg acagaaatct ctttgggccc ttttcctatt actttgagtg 60540 tttcttctca cgctctcttg tctgaaatgc cattcctaca tgacccctgt tatgtcccat 60600 ttgccatata ttattaaaat tcaaagactt catatactat atataaggtg ttcacaactg 60660 ggtccatctc agatcctggt caaactgcac atccatattt caatcccctc taagaatcct 60720 gcgcctgagt tttccgtaag catctcttcc ttgtctactt caccccctat caacatgctt 60780 ctccacaaac tctctctatg gcgagtagtg cagctgtctc catgctttta gtgacggaga 60840 tgggagagat gagggtcttt cttatattta ctttatttat ttattctttg ggtgtgacta 60900 ttttgcctgt atccatgtgt gtgtacatat gtgcctgctg gatccggcca aagtaggttt 60960 agggatggtg gtgaaccacc atgtgggtac tgggaaccaa acccaggtct tctgtaagtg 61020 gttaagtgct gttaactgct gagccatttc tctagcccca gacagtctat tctgcataat 61080 ttagctatta cagaataatt gtacagtgac atactttcta ttattaacat atctgatgta 61140 gaagggtcaa acacaactag tttcctgcat catataacaa acttaatgtg agtttcctgt 61200 acttggaaca atgtcttcct aaattacaga tgtattcatt taataaaatg atgaatctca 61260 gattaatgag gtcacttttg ttgtattcta cagggttttt tttgtttgtt tttgtttttg 61320 ttttgttttt ttgagacagg gtttctctgt gtagctttgg agcctatcct ggcactcact 61380 ctggagacca ggctggcctc aaactcacag agatccacct gcctctgcct ctcgagtgct 61440 gggattaaag gcgtgtgcca ccaatgcccg gcatattcta cagtttttcc agacacattt 61500 tgggtagctc cttcccacta attgtcaggc atcagcatac tgtagttttg ttttttgttg 61560 ttgggttttt gttttggttt tgagatccgg tttctctgta taacaaccct gtcctggaac 61620 ttgctttgta aaccaggctg ctttcaaact catagagatc catctgcctc tacttcccaa 61680 gtgctggtat taaaggcatg tgccatcacc actgggctca tactgcagtg tttttttttt 61740 tttttttaca gtaagattga ttttagttac caacacagac attaaaaacc tggggataaa 61800 ttaaggctaa atggtgtgga ttaactatgg tgataacctc tgtaaagctc agataaagag 61860 actttctgaa atatcattga gcccttgccc tttctaccga aatatgggga gagctgcaat 61920 gagaaggagg ctaagtgctc acaaaagtga gcatgtaaga gatgaaactt gtttcccagt 61980 ttttcttctc aaccctctgc cattctgaag ttctcatgtt cgatagatca tgcagatcca 62040 gggcacttgt ggagatgcat acttgagctg ttcactaact gatggatgaa tctcaaagat 62100 aagccatttg cacttgccac cattctctgt gagtgctttc tctactctca gatacatgag 62160 ttcttccagt tcccaataaa acaccctctt tctgtggacc acaactggat taatattcaa 62220 aaaagcagat ttttttaatc attaactgaa acctttatga tattccaatt tctctagact 62280 cagctaaaaa ttcagaccct tcgaaactaa acccaaagtt gttatgcaac agaataactg 62340 aattattttt ccactcatta tcactctgct gcactttcct acattaagat ccctgtattg 62400 atctttctct acttcttaaa acctggtaca ccctctgatt aatctctcgc tttttggaaa 62460 atacataaga ttgtgtggat ggccccgatt ctagatatga acactgatgg tattgtacct 62520 tcactttcag ctcttcatgc attactttcc atgtatgaag gcagaccctg tgtttgcctt 62580 taattccccc ataatgtgaa ttatagaact cttcttatta tgacagcaca ttcaccagct 62640 gtgctttgga ttcaagggag gataacacca atggctttag cacatatcaa gttagttgga 62700 gcaggcatct aaacccatct tatgaatacc ctttggtatt tgtacatggt taccaccagt 62760 agattctata gagaatgggg atgggctaac accttctaaa catatgtgac tgcactatgt 62820 ccatgtggat gatagcaggt tccacgaaaa catttactga acaaaatgtt aaagagttag 62880 cacggtaggt caactaatgc tgtactgacc ctttgcataa aaagcttttt tcacaattca 62940 aatatatcat ttatataaaa atcactgtac ttgaattctc tgctggtaat agaaagttgt 63000 tatatttttg gctattagta aaactaaaac attattctta tcacaaagtg ctcttattca 63060 ataatcaata ttcctatcaa atcaagagtt cttttttaac cactggcaaa tgtcactgtt 63120 tagcaatttt gattttaaaa gttatatatc tacatctcat tttatatatt aggcagacat 63180 gagagtctta caaatgaagt ttctagaaat tctacagtaa acactttagt tgcattaggt 63240 aataagtcct ttaccaatta ttttaaaaat agtgatctgt tttgaaatca aatgcatcta 63300 atttataaac tgagttttca tgtaataagc ttgctatgaa gagataccac atcatctctg 63360 gaaactgcat atcacataga atgttttatg tcattcattc attgtcccct aaacaccaaa 63420 ttcacactga atgactttta aaaatatgta ttttgttttt atttgtgtgt gtgtaagtgt 63480 gtgcgtgtgt gtgagtgtgt gctctgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 63540 tgtaagtgtg tgtaagtgta tatagttgcc cacagagacc agaagacagc ataagatcca 63600 ctggagctgg agttataggt gtttgtgagc tgcctttcat gagtgccggg aacacttaaa 63660 cactggacaa tattctccca ccagccatcc cctcactaaa tgctatttaa agatcattct 63720 taatcataat aacttacctc tactcttgac tatcttttaa aaaatcaatc acattataac 63780 tcctaattat atatttgttt ttaagagagg gtttcaatgc attgctaagg ctgacttttt 63840 tttaaaagac agattctctc cacatagcat agccctagct gtcctggaac tcactactta 63900 gatcaggttc gccttgaact cacagagagc tacctgcctc tgccacctgt gtattgggac 63960 taaaggtatg tgccaccata cccagcccag gctcacttta atgtctcctc tcaagttaac 64020 atcctgcttc tgtctcctga gtaatcataa ctaaaggtac atgctaacat acctggcttc 64080 taagtgaata tatctttgcc tcatcttaga agggtaatgt gagcattcac ctcaagcagt 64140 cttgactgaa ggtatagact ggaactaata aattagtaac caatatgcca tgcttacttt 64200 aatgttaact tatcaaagaa ttacttttcc tcaaaatctc tatcctaaaa aacaaagata 64260 tttatctgga aaaatattct tataatgttg gtctccataa tagttgctaa attattacca 64320 gaataagcaa attgtggctt taaacttaca agttaataaa atgcacacat caaatgcaca 64380 catgcataat tctacctata ttacacaagc tgtttcaaaa gaaacattag tatcaagcac 64440 aaagatttaa ggattaatgg gttgcttcta tgtagttaag aaaaatgaaa agcaaagaaa 64500 agcaatcact ctgagtccct taaatggtac ctgaatcact aagcgtttcc ccatcaataa 64560 agtggtcacc aaactgctta agagctgcac aacatatgaa tgaaaatgaa aaataaaatc 64620 ccaccgaaat atggtgtgca tataagtatg ctcaaactca gctggcagaa cacagctcag 64680 acttataata attactcaga attacagcat ttggcaatac ttttaaaata actcatcatc 64740 atacattgat ccaacatttg ttcattcttg tcataattct tatgcagact gacagagctc 64800 agtgcctatt gccaataaca aaacaaactg gttccaaata agactgaaga atgtaaagct 64860 ttgtcttgag attgcatgcc aaaaaaccta aaaacatatt taatcatttc tatagagact 64920 attactatca ggcccagcag cacctttgtg gcaatgattt tgtaaagata tgactgaatt 64980 ttccttgtac atatatatgg caataaattt ttaaatctca catgctggtt ttgctattga 65040 agcttgtata ctgtgtgtgg cacttctgtg atcttagggt agtagttttt gttgttttgt 65100 tttgttttta ctcaggagaa acaatgcagg gaaattaaaa atatggaaca aagaaaagtc 65160 actggggagg ttaaaaaaaa aaaaaaagga aactttctgt ctcaagatgg cttcttacct 65220 ctacccctag gagagcctag cacatttttt tagaaattct ttttcaggac tttgcaatcc 65280 actgtttaaa tgagcagttc tcaacttttg ggttacaact cctttatcag tcacatatca 65340 gaaatactgc ttatcacata tttacactat aattcataac agtagcaaaa ttactgttgt 65400 aaagtagcaa taaattaatt ttagggttga ggatcaccac agcatgaaga actggactac 65460 agggtcatag cattaggaag gttgaggact accagactag ataatgttcc tcaactctaa 65520 aaccatcgtc aaagtgctga tctttcctgg cattaagaat gatttattgt gttaggactg 65580 tactattttg tgctgaggtt ctttaatgaa ttttccaaga cttttttttt ctgggtttga 65640 tatatatatg tattctgtac acttgaacta atcagacaac agagatttct taatatacct 65700 ctaatgaaga atgtttaaaa gcctttcaag gcatttgaat atgaaatgta ttggtatata 65760 attaatatat atatatatat atatatatat atatatatat atacatttct tagtcttact 65820 agttattaga gattaaagat aacaatgggg aaaactaggt agacctgact tgcctacttc 65880 ttcaatggca ggaataaata ctgtacacta caattggtga ctgagcttta aatattagga 65940 tgctgtcatc tatactacca cctttagccc taagaaaact ttggtttcct tgtggaagaa 66000 cttgacagct gtcacaaaga ctgcagaaac tattacttac cctcttcatc agaaacatca 66060 agcacctccg tcatcgtttc aggaacattt agcttgtgtt tttccgtgat agtctggaaa 66120 aacaaaaagc attcattgca aagttaaaaa taaaatcaaa caaaacatga atgaagttac 66180 agaggtgcca atctacctta gcagcaagtt atgggacctc aaccatccca tcttatccat 66240 gcggaagctt tagaaactta ctctttcgtg aaatcccctt tgttctttct gaagataaaa 66300 gaccaatgaa cattgtacaa gagaaaattc attacagtta gttcccattt gaaaaatgaa 66360 gtttctggta atggcatgag taattagtca tattgaaaaa gtaaactaat gtcttcaaga 66420 cgtctttaac atgaactaag tgatgtttcc agaaaaaaaa aaaaaaaaac tttacaatga 66480 agtaattctc tcgcaatgta ctaaaaacaa agccaataaa aagatgctgt aaataatata 66540 ggtcacataa attatatgtg atatgttttg tcatgggtta gaggaccaga agtagagagt 66600 tagtcatctt tataatattc acagtctaca gttatggttt actgcttatt ggccttctcc 66660 agtgctccca aggggcaaaa tccaatgatt tcattcctga tagagtaaaa aggatgagag 66720 accaggctca tctggctgct tggcttataa ttctagactc atcttagctg caaggcctca 66780 gcaagtcctt gaacctagct atgcttcagt ttccttgttg aaacaccaca aactaatgtt 66840 tcataaaatt gttagggata ttaatacgag agctctgaga acagtccttg gaataggata 66900 ggactcagta agtttcggct ggaataactg atggtcgtaa ttgaaaatta cgttcatctt 66960 aggaaggagg ggcctcagga cttttttgaa tcacttgtac agaatggaac agcatgataa 67020 ttatacccca aatacaccac ggtgattttc aaaatgaaaa aaagtcagac acagagagac 67080 aaatatcata cgatttcact aatctgtgaa attgtttaaa agtccaaatc atacaaacag 67140 acagcaaaag catggttact agtggctgag ccaggcgagg gggaaatggt ctggttctca 67200 atggatacaa aatgtcagtc aaagggggaa gaagtgcaat aaatacatgg caccgtgatg 67260 atcacacaat atggcaggag attgtgcact tgaaactttc ttttctctgt tgtttttaag 67320 acagtgtcat ggaccccagg ctcatctcaa actcaaactt gctgtgcgca tggacagccc 67380 tgtacttcag cccttctgtc atcacctccc aagtgcctgg attccagctg tgcaccacca 67440 tagcttgttt aagaggtact ggaggttgag cccagggccc tgtgcatgct aagaaaggtc 67500 tgtattaact gacctgcacc cctagcccca gtatatttga cattttctag caaaagttag 67560 gtattctcat cacatccact cacaaatgaa aagtgcatga cgtggcggtg aattaattag 67620 ttcacttagc tatgttcaca atgtgtatgc atctcaaatc accacgctgc ccaccataaa 67680 tatgtaccat tgtatcaatt taaaaaatga aacacatgta caaataaaga aacctcatag 67740 ctttaaacat tacctaaagc tgattgagtt tcaaatttat aactctaatt cctacattta 67800 aagtgtattt agtgttccag ttggcagttg tgggaacatt aaaagactaa acttttgaca 67860 taagaggtaa atcttcaact agaataccaa agcaccatga gtaggttgtc cagagtgctg 67920 cgctttgctt tacagataat aaagacttat ttcaatgagt gcaatgacta tcacagactc 67980 tttcacaaag cagaagagat tttccacagg ttgccatata ccaagtagct ataaatggat 68040 ataatagatt tgtgctaaga gcaactagac tgattcagtc agagcatgga aatgcacaag 68100 tctttaacca acacttcttt agtggacttg ctttgcttat tttcagaaca aaattaaata 68160 aagtggctca gaagacctat tgtgaggtag caaacatgga caggcctgaa ggccttattg 68220 tcaggtccct gctaacctca tgctgggtgg tttgtttcaa tgtcacatgg gccctgcctc 68280 ttatgctgtg gagattttct acatagtcct atctctatca aaaacttttc tttggactat 68340 cagatgtgct ttccacagag aaatacttcc tgatgttcca acaataaatt tatttattta 68400 actgttgcat atattgcata caactctgta tggatcatct atttctctac ctcccacaga 68460 ggggtggagg ctgctgttcc agaggtagag tgttaccaca gaacctgaag aagagtaggt 68520 gcctcccaca tatatgccca atttacacag ggcatcgtta aatgcataac aaacagatct 68580 tcctactcac aaaggatgta attagataaa atacacaatt ctcttttaaa atgaaagaac 68640 attaagatat taggttacta aaacattttt tgaacaacta catttgaaca atatgtggag 68700 aactaagcta taattcaaag tgcatgctct tctctttctg ctgtagaatc taagatgtca 68760 tggtcaagat cagaaactac tttaaaagtt aaaataagga atatgcacac gattaatggg 68820 atataattaa gtcagacaat gagttattca tcatgatatg ggaaagcata gaaaattaaa 68880 tataagcttt tatcatgatg ttttagaaag agtggataat atctggtttt ccctgtatgt 68940 gggggactgt gtgcttaact gaccccactt agtcacacac accccagcca attgctccct 69000 ttattcacac acttcccaag ccatcatagc acagccaaat gatcttggcc atcctatcac 69060 ctttcaacac cctcaccctt tggtcaccag ggcagttgca ggctactctt gttttgtgtt 69120 tgttttttaa tgtccatcat atttgtcaat ataactttca tgactagata aatctttaaa 69180 tgtgtaattg tttttttttc ctgtaaaaac aaaggtaagt acccggaagt ttcaacaaag 69240 atatgtcccc ctcacacaca acatatatgg ctacccaatt aagcgtgagt gagacaatta 69300 taaatgattt gaaaaactat atatcagaaa aatttaaggg ttctgtactc catatgtttc 69360 tttaagaaaa cacacagaat gcatcaatgt tatatgaaac ttctttaaaa gtttgtttac 69420 aatgtgttag gaatgtttgc tttcgtgtac atatttacac tccatgcatg cctggagcct 69480 atgtaggcaa aaagagggtt tcagatccac tagaactggg actataggta attatgaatt 69540 gccatgtggg tagcaagtac taaccactag gctatctctt cagccccagt aaggtttaac 69600 taggtgttat aaagcacatg cacacacagt gaatattgat ggtgcttgtt ccaagatgac 69660 aatttagcca tctgatcaca gaactatatt cacagaaaga aatgatggcc agacagtgtc 69720 aaatgaaatt atctgtattc attgcatttt catgttgatg attcctttaa cagacatggt 69780 atcaaatcaa atttaggact tagaatttac atttcccttt atgacttaaa aaaaaaacct 69840 tcctaatgag taaaggatag tatatctaaa atgatttgtg tatggtaatt ctgggtaatt 69900 tattaagtaa tttatgttct tcttagcaat gattatttgc tacataatac attacattat 69960 aattacacca ataataagaa attagctgat gacagcagat tgacaggtag aagaatgaat 70020 catttttcaa agtttgtcca atcttaggag agtagagcta taggctctta ctgttgggaa 70080 taagccccca gttctgtgat gtcgctctgg taagcacaga gacttcatct aagacaatgc 70140 tgaactgtct cgcctccctt gctgcatctc tcagtgtaaa attaggaaag ccaaggttaa 70200 ggaaacaagg catgatccca cagtgtgtgg gcaatctcag ctgcaccagc ctctctctcc 70260 cttactatct agatctgctc cttcacaatg ccttcattca cgctttgggg taaagaactt 70320 gggaaagaag tttcttttct tcaagagaac tcacgtggtt gcacaagtgg cacaccctgt 70380 aaatgcaatg atgggaaatg aatccctcac ttgtgtagct agaactcaaa gctgcgttta 70440 atggtaaact tcctcaggtg acatttattc cctttgcctc attataaaat gccttgctct 70500 gcttgctatc accatagcac tggcttttat ttgtttgttt tttgtttgtt tgttttggtt 70560 aatcagtaaa ctttagaaaa tgacattaaa taggacatac ccactgaaat caataaagta 70620 tactttcttg tgtggtattt tttgttgaaa cctaggcagg agtcattctt tcacaaaatt 70680 ctggttaagc tacttttcag caaagccaag attaattaca ttggtatggt taggaaagtg 70740 ggctttgcca tccagcagtt taaactgaat tccagatttg tcctccagag ccaacacttt 70800 actaagctta catatgaatt atttgagata tcacaaatag taccctatgg agaaaagaaa 70860 acatggggaa aaggaatgat tgaacatcac ttcccaaagg gaagcatact acatgaagac 70920 ttccatgctg aaagagaatg cagccatact ttttatcccc aaattccatg tctcaaaaca 70980 aactcacaac tctatgagga gccaattagg agaaccagaa aataaagata aagcagaatc 71040 aaaacatgta gccattgaga tagagaaatg gtccagtggt taagagcact ggctgctctt 71100 ccagagggtc tgggtccaat tcccagcacc cacgtaatgg acaactgtct gtaactccag 71160 ttccagggga tctgatgccc tttgtgagca cccagcatag acacatgcaa gcaaaatata 71220 aacaaaacaa caacaacccc tgacaccact atcactatcc ttgtggataa aggggattgt 71280 ggagggtggt ggtttattta ctgtgaatgt catactctag ctgaaatctg acattctatg 71340 tgttatttat ggcttatcag tttttcacct agaaatttga attctaaata tggtgattta 71400 tttttcaaat aatgttctgc tttaaaatga acataaataa caacatagca atgaataaat 71460 tataatgaaa tataaataat taaaaaaaca aagactcaca aaatgttctg aaacagttgt 71520 tctgtattag agctgtcagg gataagatct tccataccct acctgtatat ctggtttctg 71580 acaagtctct gcaatcttac ttaaagatgg caaataggat atttaaaaat ctctctctct 71640 ctctctctct ctctctctct ctgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 71700 ttcacctgtg tgaatgcaca acatacacag caagacatat gtgtgaaggt tggggaagag 71760 cctagggttg tcactctttc caccttgctt tgagatagca tcttattttt gctgctggga 71820 agtccatgct agctggccct ccagcttccg ggaattttcc tgctgccacc tccgatctta 71880 ccacaggatg accacaattg caaatgtgca gggttactgt cacgtggttc tgggggtcca 71940 aacttaggtt ctcacacttg ccttgcaaat atgttagccc ctaagccatt tccaagtcta 72000 gtaattagaa tgtttagaaa caaattaaga agtgctagtt gcctcggttt taaaatacag 72060 atctttgtgt ttaaaatcat ttgctctaat ccatatttat gcactggaag tcttagaaat 72120 gagatatgga agtttcacag tgctattgat gtacaaaaac agaatgagat ttcctgtggg 72180 ccgtaactct cttctcccgt accgatacgc ttatgcagaa gagctgtttg gaccagtgat 72240 gctctttggc atgtagcaca gaggcctcac acacctttcc ttcagtaaaa atgaacaaga 72300 ggaaagtagg gccaggagag gaaaggatcc acaagcatgc catctagtgg caattctata 72360 aaagtacaga tccatggttc ccagtgtgga aaaagtatta aagttaacaa aacccaagac 72420 agacaacaca caggctcaga gtcaatcttg tcactaaaac ctttgtttct ttgtgatgta 72480 catgctattc tgaggtggca tagctgtgta ggtcttcaca ctaaaacttt tcctgttaaa 72540 acaaaaatcc cactattttt tttaaagatt cagtcataca gaaagatttt caatattctg 72600 accacaggga aatgaaggtt tgaagggata gacacattta tcttcatttg agtaacatat 72660 aatggaaata tatgccatca aatctcaaga cattgcagac acatgggcac ttttcatgaa 72720 ttgattaaaa atatttaaat aaaatatagt tttacttttt cttttaaaaa aaggtcatga 72780 ccttatataa tgacctgtaa atagggtggt aaactttgac aagacctttt ctcatatata 72840 atttatcaaa tctatacttt atatctttaa atctactgtg tgtgctggct aaagaggatg 72900 gctctgctta gaaaaggagc tgtgcagctg gctcccatcg aaaagtgcag tcgatattgt 72960 gcagctcatt aattattcat actccactct atttaaaact gcatgtcaca tcaactgcac 73020 cccgtctacc tcaatggctg tcaacgggga ctttccacta gcccatgaaa caaaattcct 73080 ttcctttcga tcccctctat tgaaagaatc aagtgttccc aaatactgca tgtagcagtt 73140 ctagcttggg agaattcacc agaacctatc ttatttcgtg tactttattc gttggtttgt 73200 ggttttattg tttccataga acatctcagg ttttgttgtt tctctgcttt ataaagataa 73260 attttaaaag ccattgttcg gagaactcgt gcttaaatta aagtttaaag actcctccct 73320 ggagcctctg cagagattag aaagcctctg tcagagtttg ctcttgggac ctcctctggc 73380 aaagaccaat aactatcact ggtctctcct caagaataag caggcatttc aaagcagtag 73440 aaataaagga ctttaggcat acactgaaca cctgcgattt tctttttatt ctacaaaatc 73500 atcaaacata agaagggaaa gaaaatttta ggatgctctg ctgtctatag aagtgcattt 73560 gacttagcca ggggctcttt tgacaagctg cctggcctct aggccaagtt caggttggct 73620 gcagaatgtg gtacctttct gccagcagta ggtgtcacac acagctagag gacagaggca 73680 ggggagccag aaaagaaact cacaaggaaa aggtactttt ctatagctag aaggctgcat 73740 tcgtatattt tatttgggaa ttatactgag ttaaagacag aaaccctgtt tccattggta 73800 aacacattcg tagctgcata ttcctgagtc tgttctacaa tgcattcagc aaaagaagtt 73860 cacggaagct gcaaacactg agcgaaaagt atgtggcggg aaaaccaaga ggacaggagc 73920 aggtcagtca tcagtactca ccgtggtggt ggtggtgacc tcctccgtca caaccttcag 73980 ggtgtcaacc acagagatgt agcccagccg cttagcaatc gccaaggctg tgttaccatt 74040 ctgaagagag agaaagaagg aaagagtgag aaaggctagg gaggactgcc ttgcgagcca 74100 atgagctcac ccggggctcg gcatgagcca gcacttcctt ccaaaacaag gcacagctcg 74160 ggaaaatcac tagtttttac cattacatct aaatctgtct ttgtaacttc tttagactat 74220 agcccaggtc accatggtaa cacaacaagc ttgcatctgc ctgctctttt gaataagcac 74280 ttgatgcttt aaccctgagg ttgtcaagca gctccaaatg ctgccccagc cttctaaagc 74340 cacctctgga actgaggact ggtgtctgcc aaaactacta gggagaacct gctacattct 74400 ttgctcacca agggtcaggc catctgccgc aggtaaaatg ttaccatagg gacccagtga 74460 cagatttagc ttctgctctg caggagctcc agtactgcaa gaactacaca agccagcaat 74520 tccagccgcc tccagcccag gccactgggg accccgtttg tttaattaca ccgcttagtt 74580 tacatttcaa tggctccatg tcccaatgag gcagttctaa gccaacactc agaaaccggc 74640 tcccttaaga agacagggag ggaagggtga atatgcgctc acatctgaga gccagctgta 74700 agcaaagccc ttccagcagc ccaagtggag ggccccactc cccagagacc caactgactt 74760 ccttcccggc aagcactccc cagaaatcac agacttctag aaaggttttt ccagaaatct 74820 ggggctttcc actgtctggg agtttgttta aggaggatgt atcacacttc atctctgaca 74880 acaaacagga cagcagggca agtacaggga agggccacag gcctccttac cgcagtggtg 74940 gcatttggct tggccccgtg ctggagcagg acattaatga tgtgtgtgtg gccctgttgg 75000 gcagcttggt gcaaaggtgt gtagccattc tgtggatcat gatagcaccg atttgcagag 75060 ggaggagaaa attaggttag ccttcaactt tagttcactt gtcttagtta cagcaaaccc 75120 atcaagcacc tcattgttta tttggagcac aattttccca gcaacccatt tctcagcaac 75180 aaacactccc tcacacctta tggcggacta aacaaggaga gactagatta tgaaacaata 75240 aaataaacag actcaattta taactgttat tatattttaa ccaattgaca tttaaaatgt 75300 ttaaacggag agaagattaa aaatggaaaa gagacagagc tgtgatccat ttccttagga 75360 aagatgaagg gtaagttggt gtttaactga aggctgccga gggtcacagg ccactattag 75420 tcatgaccat cttaacaacc cttgaagcta gctttagatg atctataaag atgaaagaga 75480 atctcatcta tatttaatct catgcttaac tcaggagatg gctttggttc tagaaggctg 75540 tatgtgtaaa ctttagaata gcaaactaaa ttggaagttc aatgccctgc cccaagaaaa 75600 tgtgtcttta aaaactagaa ttttgacagt gtgatcaaaa ctttcatgga gaagaatgcc 75660 cctgacttgg gaggaattgc tgttaggatt agtttgaggc cagtcttgtg cagaactgta 75720 gtcaacaggg gtggcactaa ttagttacgt attcatatta actcaaaact tctactggaa 75780 cccttgacgg tggaacggga gtcattccct aagcattcat tctgtactgg atgctggacc 75840 ttagagtgtt gtctctttca attttcattg tcactcagaa atggcttaca gtgcctagtc 75900 taaaaagggt attttgtaaa taatacttga ctaaatgaat agtaaacaaa tgattcataa 75960 atgactattt ttctccccat ttcagaaatg atgccactga aaataacagg gttaacctat 76020 ttctccacaa tcactctagg tttagtttct atgcagaaga tcatggaaac cagtggctac 76080 ttcacaactg tctgcaaaaa aaaatattta tctctatcag agcccactgc atctagctgt 76140 aacttctggg tagtatatat gtatatatat catgattaaa agaatatgca tattattaaa 76200 gtgtgtacat ttcatgcagt gtcagagtag atgcatgacc aacaagcata tttggtcatt 76260 ttgactacaa aattgtctga ttatattcgt gagtgtcata agaccccttc tagacagtca 76320 caacggcctt tctgtgtatg ggaatgacat catgtatgga tatctttctg tccaggtgtt 76380 cctgactctg tcatgttagg agtctgacag ctgctataga ttctctacaa taaaataaat 76440 ctgatgccct gaaaatgcag tcgatttaaa aagactctta gaaacctata gttattataa 76500 gaccctgcct gctctcaaat caggcaatcc atagacattt aagaaggata aactaaatga 76560 tatttatttt cctaaaaatt cttcctttcc attttattta taataaaatt taccttactt 76620 ctttattatc actcaagcat tcactaacta tgctatgtgc taaatacttt agtatataaa 76680 taacattctg tacactaaac taatatatat taatatagtt taaaagataa attacctaca 76740 aaaatcatgc caaatataat tagtcatagt taattaaaag tctgacccca ctgtagacca 76800 tattaaatcg agctctcatg gactgacccc ctatggtctg gaaaatgacc ccaggtatga 76860 tttaatctaa catttacctg aagttgtgat gagtgagaat agtcaacaga agattgagca 76920 gggctataac tttacattga cattggcttg aggtttctgt gactttccag ctggctggca 76980 caccagcctc aatctacccc ttctactatg gatgagcaag gctccaaatc cctcacattt 77040 ccatttctct cattgtaaaa cagagatggc tgaaggtgta tgcttcaaga aggaccaaat 77100 acgttttcca tgaagatatg tatagttcat gtgtagctca tgttaattat gtgaaaatac 77160 tagcaagatg ccatttcatc gtagacaatc tgcacctttc attgtgtcta atcaaagaaa 77220 tttctatttt gtatagagtt taaatccttt tcacaagtcg attccctgta ggtccagttt 77280 gtttcaatct aatacgacag ggtttcacta taattctaaa caaaaaaaaa tgatttcatt 77340 ttttaaagtt tacatttctt aatttttatg tcaagtttta tgagtagcta aggagtagag 77400 gcgggacaca tgtttgcatt ctaaaagcag ttaaacaatt ctttagtaac catggttaca 77460 cataaaacat caggaagtaa ataataattc cttctgcaaa ggaaaaactc tgaagaactt 77520 actaacagat tgcctattaa gacatgcatc tgccttctgc cctgaaatat atggtcccaa 77580 aggtcacatt aaaattatat agttcaccta aaagaaatcc ctaaaatgtg gaaatgagat 77640 tctgtttttc ttgtaacaaa atgtacagat ctaattccac agaagcacaa acaacacaat 77700 acagtgttgg gcatctaagt gttaagacca tctcagtggg caaacactca ctgataccac 77760 gtaaaccttt gcttgtactg ccagtgtctc attgcatggt gcatttgtac atctcagttg 77820 gtcgtgacta tgtgtatgag ctggctcaac caaaagagtg ctaggaacta aataaaggtt 77880 gaggagccac agggaagctc ttccgtaagc accaaatgaa agtgtctcag aattgtgtag 77940 gtcagaaaat acacaacagc catcgtaggg caagctcaca agtttgaatc ttaagtgcta 78000 taatactatt gatagatcac aaaacaagtg tgtttcatat tatctttttg aacatgcttt 78060 tgcacaaaac tgatatcgtt tctgcttttt ggaaaacaga aaaagaaaca tttacaaaaa 78120 atcttgtaat catttctaat tagtgtcatc ttgaaatgat ggctctgaaa cccctgaatg 78180 tgcttgcgct gatgcatctg agctgtggca ggtcttcctg atgtgtgaac tcaaatacac 78240 taagcccaca attctttgta acagtgaaga gcaccagttc caccatgctt ttctcttgga 78300 cttggatcaa tctgtgtgct ctgagatggg tggtgatatt cagacctgct ttgtctaata 78360 ggacctttga ccttctttgt gcagaactgt tagggacgtg ccacctctga gttatccctg 78420 cggaactaca actcagtcat ttcacacttt tgttgataag cattaccact tgaggttccc 78480 aaagagatag tttatttaaa atgggatata tacagtgtgg gctgtgcaag tctgtttttc 78540 cagaggagga gatgtggagc tgggggacag ggccaagggc ctaaaacaca atagaggaag 78600 tctggcaggg cttcaggatg aactctgagg atcaactgtt tcctgcaata aattgctaag 78660 ccaaatctgt tttaacttta taacacatgc aattctgaag ctgacctcca tggccatcaa 78720 aggttatcag agtggaaagc cctaaacaat cagaaaacta cactgcttct tcaaagttag 78780 ttcagaagaa ctagaaagca aaattaaact taacccaaaa gcaacttgca gctacagtag 78840 tgtcctgact gtacccttgg caggataagt ttgattgtca agaaggaaaa tgagtatata 78900 ttttaccttg gtttttgcat tgacatttgc tccctgcttc agaagaaagt tgaccatttt 78960 cacattccca tagtgacagg ccacgattaa aggagtgtaa ccaagctgca acgacagatc 79020 ccaaagtaca agtgttatac ggctagtagt taatcaacaa aggtaaggtt tcaattattg 79080 cacatggcat ctttgggatg caaatatagg acaagcagtc cctaaccacg cagaacttta 79140 catcagcaag ggagataaga cacacaggtg acttaactta gctaaaagaa ctgagaattg 79200 caaaatgata ggacatgtca atgggaagga gaagactcta gtagaagcag gtgggatgag 79260 tgaaatgtgg aaggaagaag ggaaggatag gaagatgtgc agtaaagaga tgacatacac 79320 attggccatg atagacacat tgcactcata aactcactga ggctgcttaa gtggcacaaa 79380 acttgcacaa gattgggccc atcaatattt tatctgaacg agagagggag cccatgaggc 79440 tccgtccctc ccagaggggc tattagcaat taacacctgt ttggggagca atgtcactgt 79500 cttcagtagt gtagctatag aaaaactgcc ctcactccat ggaatgactt cccacctagg 79560 ttcagattag taaatctagt taaacccatt cgcccttaca taaaaagaag gcaggcaagc 79620 tggagggtgg gggagaggca tgttgagaag ggcgctggtg ggagagggaa gggatgagcc 79680 cgggaatgaa ggagcaaaaa caactcatta tataagtaat aagtgacact aaaacaatag 79740 caaaaagaat ggataagaaa acaatagcac agagagaacc aatccccctc aagatgatca 79800 aggacagagc cagaacagtg aggcagatgt aggagctaaa gcagaagtca gagggtgggc 79860 aacaacctgt agaactagag tcttagactg agtccagagg ccactttctc aactccagtc 79920 tgattctagc agacacgggg aagcatgcgg tttatacttg agaatgaact tttaagaaga 79980 gagtcctcgg gcatgagctg acctgaatga ggccaaccaa gaatcagcca aaccagaact 80040 ggtgacaaca ccgtcaagag atctgctgta cctttgtgta ggcatcctgg tcagccccgt 80100 gtttggtgag aatgtcagca acgttcactt tatcttcttg ggctgcaagg tgtaaggatg 80160 tgagcccact ctgtagcaag aatggaagca agggaacaca tcagagaggg aaacacacgg 80220 tcatctacag gatcgtgttt tgaagagtcg gaatgcatat ggcatctctc cagacatccc 80280 atcttctcac atttcagata aatccttgga gtaaacatga gttttcaacc aagatatagt 80340 ctctgcagaa aattatgttt tctgtatctg gtatttatga tttcagcttt taaaatagtt 80400 ttgttaataa ctttccagat aatattcatt tcaagcctac ctacacttcc tcatgactct 80460 acttatttac ttcaattaac agactaaaca aatattgctg caactttata accctggcaa 80520 taatcaatat tttcatcaat aaagtatcat attaatgttt aaaatacatt gagttactgg 80580 aagtaagctc agaatatttt ttccagcact cagtttactt tgcggggagg cggggagggt 80640 ttgtcttcca gatggtaaat tttttaaagt aaccctgtca cttatatagc actgtaaaac 80700 ttggccaatt ttatggggaa aaaagtttat gcactgggta tcaagtaata aatgtgttta 80760 tttgaataca tggcaaaggt acagtcatag attaataaaa aattaaggaa tagagagggg 80820 agaagctgtt tatccaacca atgccacacc ctaccagcct taatatatat aagtagctcc 80880 ctcaagaaaa actgagattt aagggtatca aatataattt tagcaggcaa tttttgagtg 80940 cttttgttat actaggaaga actcacatga tttggacata gctatgaacc aatttcctgc 81000 ctatgtacag ttcatagtct agcttagaat atatccatcc tatatcttac actcctccaa 81060 ataacactcc aatatcctta ctgttttccc tcttctacta ttttaggtat tggtgattga 81120 acttagggcc ttaggcaaag cacacaaata cttcactatt gactcgcaac cccagttctc 81180 tttttacctt ttattactaa ggggcccaga ctaatcatag acccatttaa tagctcaagc 81240 tggttttgag tttatgagtc tcctgattca gccagcctct cagtagctgg aaatacaagc 81300 ctatgccatc aaatctagca atgttgctac tttgctcaag gtcaggtagc atcctggcta 81360 actggccagc cctattgatc atggctggaa ggctcgtttc ccccccatta gcattgaggt 81420 cgagaaaact gaacatggcc ttcaagcccc attgcttcca gcatggcact ataccaagaa 81480 aataacagcc attctgacca ttgaaaacat ggggtggcac atatatagag aaaaacattc 81540 tatgactctt cagggggctt tcccttgagg gcttcgtgct ccttactcgt tgagtaatct 81600 cagatcagct gtgaacctgt gagtcaaaac aatgactagc ttgactagaa aggcccataa 81660 agcatcagcc tgagaaagaa atctgttttt gaattaaaat tctgtcattt ataaacaaat 81720 attatttaat cctacaacat aagaatctta atattaagac aaagcagagg atacatcctc 81780 aagttgaaat ttttttcttg tgatttcttg agagagagtc tctagcccaa gctggcctaa 81840 aagtcgggat cctccacaac tgaataattt tcttcatgac tgggtatgca agtcaaaaat 81900 ctctttaaag atctgctaag gagctgctta cactcttcaa aagcaaatag taatgcactg 81960 gaaaggacac catcaaggag aacagagtta atctgctcta tgttttgaaa attaaaagac 82020 atgctctcag aaacattgtg tgattagttt cacgtactgt ctagaatgtt tctctttgag 82080 ctgttggtca gagctgacct gaagacaccc taaacaatag agggtattta tcttgattga 82140 tcatcagaac ttggtggtaa gacactagca atcactgaaa acactacaca ttttggtcac 82200 agaacatgag aaaatcaagt tgctactggc caggaagcct ctcccagttt tggtaattac 82260 tgggagtgct atgcaggctg ctagaggagg gagaagtcat caaaaatctc agccagctgt 82320 aaagctgtga gccacaataa tgactggctt gactagaaat gcccataggt ataatagagg 82380 cacaagtgtt atggaggtca ccaatttctt tataactgga ttgaaagctc actccatagg 82440 ataaaacatg tatggttggt gttgaaaatc ctgctaagaa cctgtggctg agtggggtta 82500 actcataggt ccgaggagtg aatctattac tattatgttg ctaaatgggc acgatatcaa 82560 atttctacct atattataaa tgccactttc tgacctcacc agagaagttt ctttatgaaa 82620 taaatagtgg ttaacataga aaatcataac tgattaaagt gcagagatta attatctgtg 82680 gattgctcag ctataaacag gacattgata ttatccccat caccaagact ggggaccatc 82740 atggaagaag ggacaaaaag agtgttaaga gccagagatt ggacaggagc agagtaaaac 82800 aatgtcctct ggagatgaca gttctgttgc tctcgtgaac tgacagtagc tatggttgcc 82860 agcacaagac ctacacaaga tgtagccagc caacattcta gcatggaatg agaagagggg 82920 ctcatgagcc cctacctagt tagatatgga cagtttatag cttctgggtg tatttgagtc 82980 agatttcttt tctgtgtatg ctcactggta ggtcaactgt caccaatgga tggtgccaaa 83040 cctacaagac tctgggcaac acaaattgga cctcatgagt taattttttt ttttaagaag 83100 acaagagatt aagaggagtt ggaagatgga gaaataatgg gagaagaatg atgggtgaat 83160 gtgaccaaaa taaattgtat ggtattctca aaatattaat aaaatattac atataaaaat 83220 attttaatct gctcaagatg gcacttaatg tttaaaaata agtttctcct gattgttttc 83280 aaatgaatgt gcttttaggc aaacagtaaa tagatgtatg ccccctcctt tataaactga 83340 tattaaataa tatattttgt atctgagtgt caggatttcc ccacctattc aaatgattgc 83400 ctaaaaggtg ggcttcaaat gtgcatcaaa ccctccctac tgtctgggtg atattagttt 83460 tcattattat gtttttatgt tcattctttt aaaatgcaaa tctgggaaga ctattgcagc 83520 tccacgttgt ggcttaagca tatctgccaa attttcaagg caacactaaa tcttcaaatg 83580 ctacttgaag ttgggatcac tgggtagact tagaatactg ggagtccatg aggatgaagc 83640 acccatcttt catttgtgat gctctcccac tgcatcctta tgtaacaaaa aaccctcacc 83700 agatgtcaaa atgtgctcat gttatcctgt tggacttctc aacctctgga atcataagtc 83760 attttgaaac tcttatcttt ataaagttcc caatcttaag ttacttgtca tagcaagaga 83820 ctaaaacatt acactgtatg aaaggatctg ggaggagttt caacacaaag atgaggaatg 83880 caatgggaca cttctgagtg ataaagacag ggaccagagt tctaggtaca cgtgagacaa 83940 tctacctgaa tcacagttct tctaaagagt gcatattata tactccagtt aatgttagta 84000 agcaaattga tattccaaaa gtacaggtta atttactagt cacacattga aagcacagta 84060 tttttggaaa atcccaagaa gcttaatttt tatcttgccc aatcacgtgg tcaagagatt 84120 caaatggtca gttaataggc acagcctgta actttcagtt tctcagcagg tggctccagg 84180 ttgataagta agcaaatctg tagtaggcat acactttcat gtttgaatga ttttaccctt 84240 atattgttga ctactatatt ttaattaata tggtcatcta cagaggctat ttactgggag 84300 gggaagctta aattactgtg tggctttctc taaaagggat ttctaactag agtcactacc 84360 taaggtaggc tgaaggtggc ttaaaaatct gtatttcagt aagttctcag accacaatgc 84420 agagataaac gctgtcgttt ggcttgggtg gtagatacgg acctgctagc tcatattccc 84480 ctgtgaagcc caacctccag ttggaaccac tcttttgtct gtctctgtcc ctggctccct 84540 agccactttc ttactgcaat ttgcaattac aagcagcaga aactagggca ctgtggctgc 84600 tgaagagcag atcttaactc ccatgggcta gcttcttgag atgcccacac catgctgaga 84660 agctgagagt gcagggcagc acaaattgat aatggaactg gcttaagaag aaaagtgaag 84720 acccacaatg ggggttaagg aaggcaaagc tgtgggagca attgccatcc atcccctagt 84780 ttctagctga gcttcccttc cttctgtctt ggcatttttg acacagccct gcttcctttg 84840 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cnnnnnnnnn nnnnnnnnat 84900 acacacgcac acatacatgc atgccatttt tgttccaaac aatcttcgct tggttttttg 84960 tttgaatttc tccaatacac tcgactgaag ccagagtcta taacacaata ccttggttga 85020 catgtggata ttggctcctt tttccagaag caaggtgacc atatctgtgt gcccctcttg 85080 tgaggccaga tgcagtggag tgaccccttg cttcgtcaca gtgttagtct cagctccata 85140 gttgagtagt gtggaagcta tttgcatctg attcttcttg gcagcaatgt gtaaaggagt 85200 ataaccattc tacaacagaa ataaaaatat ggatatgaca caagcgcaca cacacacaca 85260 cacacacaca cacacacaca tcacacacac atcacacaca cacatcacac acatagagaa 85320 cacctgttaa gtgctcacat atttatctcc aatggaaata ataaagtata atcaggcaga 85380 aaagataaat gtaagctgac agacagttaa ttcaaactct tagttatgaa atgtttctat 85440 ctaaccttag catctttgca agcaaatgaa aaatatcctc atcacactct agaacagaca 85500 caggcataaa aacatcaagt ctgaaagtcc cttcatcact agcttctctg ccaaacaaga 85560 aaagaaagta cggcggactc ctcttcatgt gatagtcctt gagaacctgg tggtagattt 85620 catctctgtc taatgatttc tctaggtctt ctctcttcca ggctaagcat ccattccttc 85680 agttattcct gaccctttgg tcatttctag tcctctctcg ccaaaagaca acctgctctg 85740 agctgattat gatctgttca taatgctctg gaatcgtgtg atttcacacc acagaattct 85800 atacatcaga tattacttta cccacacaga atcaaattga gtaacttcta tggtattttt 85860 ataacacttg tactcaaatg gttctaacta gagtattctc tccactccct gaacaaatgc 85920 tgttgaagtc ctagaataag ccaagttctg tgataggtaa aggtgggaac acaaagggag 85980 gtaagatttg tgttgttagg aatctaatgt aacattatta ttttccaatc atgataaata 86040 ttttaaaata tgatcttaaa tatgtttata aatgagttac tgaaatacac aacatctgtg 86100 tatattttca acataaaaac ctattcataa acagtataca ctaaaataac ctgtttatgg 86160 gtaacctggc ttggtaggag ctgtgtttga atataggtaa aagatataca ccaagaaggg 86220 attggtagtc aagagaccca cttaaaagta ttcacaactc agttgaccca gatgaacact 86280 taaaaagcaa agagacagga gagtcctttt aggggcagtg tgaaaatttt gatgttagaa 86340 ggaacgaggg tatgaaagtt atgttttata ggcaagaagg agaaacctac aacacctttg 86400 tcaagttaca cttctcagta tctaaaacac tgactgctag gaataagatt aatctccaca 86460 agctcatatg cactcgcaat tggtaattcc cagctccaaa aattgcagaa aggtttaaga 86520 caaagcaatt ggtagaaata gtttttaaaa gtcacaaaaa attattacta tatcaggaag 86580 ttatctaaaa gcaaggacca tgtgtactca gattacagct acatggcacc tgggaatcct 86640 aggctgtagt cctcaccttg gcagtggcat gaggggaagc acccttctcc agcagcagca 86700 gcgccacctt ctggttgtca taatgagcag caacatggag cggggtaagg ccattctgta 86760 aaggtggtgt ttaaatctca gcattagtac attattagcg ttagctgctc tgaaactatc 86820 aggatgcatg gacggcgcta tcaattaatt acaatgttaa ttaattaatg tggccaatgg 86880 aaagaagaaa aacagataca tgataatctt catatcagaa acaactaaga ttggaaatgt 86940 tggcgctgaa aattagcaaa cggaagcttt ctgatcacga caagcaaaag ttaagtttct 87000 gtatacgtca caaaaattct tcctgataca gagcagctgt gagccctcta ggataagatt 87060 tcatattaga ggcactgaaa ataatggttc taaattgcag ggtacagcca cagtcagggt 87120 catatacgtg tgtatttggt gtacttttgc ctggatcatt catcttcatt tcttatgagt 87180 gataaaaaca gtcaacagtc ggatggtaaa aacatactac agaaacctct taccttccct 87240 gctgagtctg cagctgcacg gcgctgcaag agaagttttg ccacatccat gcttccgtac 87300 ttggctgcta cgtgcagggg agtgaaaccc ttctatagtt tgacaaagaa atgtgacaat 87360 taggttgttt ttatttttta acttcagttc cttaaataaa aatttgttat aatccattaa 87420 gctaacacta ttggttctcc atttgtgaaa actgatggca tgatatctgt taatcatgaa 87480 tcagtaaaaa ggtaaggaat gcaatttaac cagaactggt aggacctttg ctaggcttga 87540 tggagtgaac aacaacaaat gtatttggag tcttagagac tgaaacttga tatgaacgga 87600 ttttagattc ataatatcca gtggtgttgg tatactgttc tgattcgtga atggaaaacg 87660 aagtaccaaa aagctcatct ttcatcttgt ctctaaaact aacacaacca agtgaacagc 87720 tgccttcaat ttcttacagt cccttttata gtatttttca tttcaaattt atttaaatta 87780 tagagtattt aaaaagcttg agttaaaata attatttgaa ttatttagca tattttctgc 87840 aaaactggcc agatagatga tatatatata tatatatata tatatatata tatactccta 87900 aaaatatcct tttaacactc agaaatttgt ccccatgctg tccagtcaca tgtgtctcca 87960 gtcacatcta tcatccttgt gtgccagcgg ctgactaata ctagatagtt aacaacactg 88020 aagcttcaac aatgtgcttt tagaagatgc ctatcccagt ctggacaaac atccagggag 88080 cctacatgag accattctag accctctgca tacatgtcac agttgtgtag cttgatctat 88140 ttgtgggact cctagcagtg ggaccacagg ctgtccctaa cactttggct gacttttggg 88200 aaccaatttc tcatgcttgg ttgccttgcc caaccttaat acaagaggag gagcttagtc 88260 ctaccaaaac ctgttaaatc atgctttatt gatacccatg agagatcttc ccctttccaa 88320 acagtaacag aggagaaatg tattgttagg gtgcagaggg gaggtgggga gggacttgga 88380 ggagaggaga gaggggaaaa tgcagttgaa atgtaaaata aatgaataca tttaattaat 88440 aataaaaaga tgcctgccct atatattttg tacggaaaca ctcactgtcc catgagccta 88500 accaacagca gttcaatgag cagaatgcta taaatagagt ctcagtcctg gtggcactat 88560 gatgtcaacc catcctccag gacagatgct tcagccacat gcttttctgg aacaatagtg 88620 ggagttggag aattctaaca ctgaccagga tctagaaaat caaccaagca attacttctg 88680 ctctgagaac tatttaagtc cctgtactgg ctgtctgtgt gtcagtgtga cacagctaga 88740 gtcatcagag aagaaagagc atccgttgaa gaaatgtctc catgagatcc agctataaag 88800 cattttctca attcgtgact gatatgagag agcccagtcg ctctcatatc cctgggctgg 88860 tggtcctggg gtctataaga gaccaggctg agaaagccag taagcagcac tccttcatgg 88920 cttctgtatc agctcctacg tccagggtcc tgcccagttt gagttcctgt cctgacttct 88980 ttcactaatg aacatcaata tggaagtgta agccaaagaa acccttgcct ccccaacttg 89040 ctttttggtc atggtgtttt gtccacagca atagaaaccc taactaagtc cccatcaaaa 89100 tcatcatcca gtgattcaaa tattcatctc cgaagaacca atactgccct ttcatagagt 89160 cacaagacaa attattttta attaaggttg catttttttc tttcttttag aaaagaaaga 89220 aaatttggtt ttagtagttc ttggaaaaga gtgaatcttc tggccttttc ccgtgtggca 89280 caaacgtagg atgtaggatg attaaatcta aagctagcat ccatccacag aaattcaact 89340 gctgttgagg gtcttctctc tgttttccat gcacagaagg gttggatggt gctagcttgg 89400 gatgaagtag atttctctga cacaacatta tatggaggaa gaaaagcaaa ccccttatcc 89460 ttacaatgca gctgaagttg tgcccaccct ttatacagtt ggaaaccctt attagacaaa 89520 actgcatagt attttcactt cagaatgaca gggatagagg gcatctctcg agtcacaggg 89580 ccacttcttg cagtgttaat ctcatcagtc ataatctccc tctggtacct ctggtattta 89640 taaacactta aagttacaat gatgagtcac ccagcatcca gccagccttg ctcactaaac 89700 cattctgttt aacaagtgct tctattttat taccctattg aactgattat tttttcaatc 89760 ctaaaaatcc ttgaaaggca aaaggttatt ttctattcct ttacttgtac atgtattaat 89820 tctattcctc atccacaaaa atggctgtta aatttcttgg gttaccatta tcactgtata 89880 tttgttcctc ggcatctaag ctctgatttt tttctttttg aagaattttg aaaattcatt 89940 caccttttca gatgtcttca tttggaaaat tatcaatttc catgtcagaa cattttaaaa 90000 gatacattat tattttatgt ataagagtgt gtgccccact gggcagtggt ggcacacacc 90060 tttaatccta gcactcggga ggcagagaca gggggatctc tgtgagtttg agaccagcct 90120 ggtctacaag agctagttcc aggacagcct acgaagccac agagaaacct tgtctcaaaa 90180 tccacccccc caaaaaaagg agtgtgtgcc tgaacgtatg agtgtgtacc acatggtgct 90240 tcggaggcca gtagaaggtg tcaaaatccc tggaactgga gttagagatg gctgtacatt 90300 tctttgtggt tgccaggtcc tctgtaagag caacaggtgc tcttaactgc tgagctctct 90360 ctccagccca tgtcagaaca tctttggcag ccatgttcca gtaggcttgt gctgatggta 90420 actcgtgggc aaatctcact tctgagggct caggggccaa actattcact acttcattac 90480 acacttacta acttcttccc acccaggcat actatttact cctacttatt gaaagtcacc 90540 tgaaatggca ttttaattca tcgaactgct attgcacata tggaaagtac attgccctgg 90600 gacaagctca tgtatcctag gactctattt gccttgtttt tctgttcttc tgcactagct 90660 cagtctaatt tgctctagct ctttgggtgt gttcatgctt caatgtaact cgtctccacg 90720 tagtgaattt cttgtggaat atatccacga gaaggaaaag cagccctgca ccaccacagg 90780 atcttgagta caggataaga tattactctt ttattttgtg tgtgtgtgtt atataactca 90840 tgaactgatg tgcaaacctg ttctgtctag acactgcaaa taactgggag gaaagtaaag 90900 ctggtaaagg ttagtgtggt ggtttgaata agtggccccc attggatcag gcacctaaac 90960 acttggtccc cgctggtggc actctttgtg gtagctatgg aacctgtaat aggtacagtc 91020 ttgctggagg aagtatatca ttggagaaag cagatgaatg ttgacagcct tgccttactt 91080 ccctactttc tctccttcct ggtgtgctgg taaaatgtgc tcacccaggt ctcttctttg 91140 accacccatt gccacaccat ctctcccatt ataaacatct accctctgga accataagcc 91200 aaaataaact cactcttata taagatgctt ttggttatag tattttatgt tagcaacaaa 91260 aaagtaactg atacagttgg acactacaaa ggaaatgaga tagcaaatga gaagtgacgg 91320 agctagcact aggaaaggca ggatggagca aagggagctg ccactcaact ctgtcaccca 91380 gcattgccag tctaacacag tattttctac tttatcagtg atgccagttc aacatattag 91440 agaatctccc tccccacttt tttattcctc tagagaatat attttacagt aaaaaaagaa 91500 attaagagtg gcctttgctt cgtggtaata caatcatgac cattacattt cttgatgcct 91560 ataccagaag gaactagcac tttaattaga agatgggatg caagactcct tgaagatgct 91620 acaaaaaatt ttgcaatccc ttcccatcat tttgatcata atctagacta cttgagaaag 91680 aaacaagtca gaggtctgac agagattgtt cccttcctgg aactcttctg cagttgagca 91740 aagccttaac ttggcacttg cattctctta accgctcacc cccccttacc ttggtcgcta 91800 aggagtgtgc tgctcctgct tccaagagga cagaggccac atctacctgt ccttcccgag 91860 cagagatgtg cagtggtgtg tacccatttg tagtggctgc atctggatga gccatatgtt 91920 gtagaagcag ctggacaatc tctgtcttac ccagtcggga ggcaatatgt aaaggtgtct 91980 gttcctccta caactcaagg caagagatca gttaggtccc agcaaacccg atcttgcagg 92040 aatgtgtact tctcaaatac ttcatgatac cttctttgaa tctctaggaa tctctactca 92100 aaaacaaaaa tggttactac ccctgtcatg gtttatttgt atttgttata gaagtgatcc 92160 atttggtcac aaaatctccc ttaaattttt aaacagattt tatttattgc tttgtttata 92220 tgtatgagtg tcaacatgta tggaagggaa acatgcatgt gcagttcctt tggaagtcag 92280 aagaggcatc agatcccctg gatttggagt tacaggcacc aatgagtcac ttagttggtg 92340 tggaagccaa accccgtctt ctataagggc accatcgagt actcttaact acttagcccc 92400 tcccttagat ttttaagtag aaaatacatt cataaacttg gtcattgttt gatgaacaac 92460 caaaaaacat ctcttaatcc ttaagtcttc aaccctctct tgtgcttact tattggtgaa 92520 ctcacggttt tcaaggagaa agaaattcag tccagaaatc ctaagaccta gattcttctc 92580 caagagcttt tacggagagg caggatttat tctgggaacc gaatcaagag aaaagaccca 92640 aggaaactgg aaaatgctat tcctacttca ctcctgagcc aaggacacaa atgctggtca 92700 atttgttctg ggagaacttc ggataaagac tacattgtaa tatgatttaa agagagattg 92760 ttccaggaag ccctgcagat gggcctgtga tgcacatcta ggacttcaaa gatgaaatag 92820 aactctggca aaatgaaaat gaagtgaact ctctgccaag tgttttttgc tctaaaaaca 92880 gagaggatgg aactgagtag aaggggcagg aagaacaaca cattcagcaa ggctcagaag 92940 accacctgac tctaacgtgt ggtcacaaat aatgttctca gggttaaaag aactaggaag 93000 aaccactgtc tcttataaaa ataaaattga gagtaccctt aggaatgcaa aagagtgtat 93060 ctttataaac ttccccaggg taagtcatca taaaagcacg gaaggaaaag ctgggcaagc 93120 tgccagtgat aagaatgaaa agagaaaaaa atatactaaa tctgtccaaa taaatacaat 93180 actttaacat tatgtttttt taaaaaaaat tgtaggaaga gaagaagtag catcacatga 93240 atttcaaaaa gaaagtggtt aataagcaaa agcaacacaa ttattttacc aatagaattc 93300 aagttctata aaaatctata acttatacat tttttcatgc atgatatatt tatgacttgt 93360 ctgacttgtc ctggtaaaca acaaaagaaa gcataaactg tattattcag caattttttc 93420 cagataaagt gaacaagaat gtaatgaggt ctcaaaaact gttcaaggtc attaagctat 93480 taaaacagac actaaaggta gatacaataa gatggccaag aaggaaatga tcaggacaag 93540 gtgagcagga atgagcacaa gagtaaatgg ggagcaaagc aatcagcatc aagtcaggac 93600 ccttcaagag cctcacacta tctgcatctt ggttctccca tagacctctg ctggcagagc 93660 ccaaaggagg tgggtacaga aagccacaca ctgaaatatc aactatgaac tttttaaatt 93720 gttggttttc ttttatgtat atggggaaat tgtgaatttt aaagaggagg gggagattgg 93780 gggcaatggt aatctttgga gctcttatca actgaccatc tctaactggc agtaattcct 93840 gggttaggga tactggttaa tgaaccagta gttaaactac agttccctgg tcctcagacc 93900 ctaaagagat aagggcttgt ctgttcactt gttcgtctgt ttaaataaaa gttaataacg 93960 ttttacccaa ttttaatcat tttgctttat ttccatccaa aagtggaaaa gaaaataata 94020 taattttgct attataaaat tccttcagta tttacacagg tatgtaaggt cttttcatgt 94080 ctgagcaatt atttctttgt tgaaatggaa agtttgtatc tgctacccca ggataaagtt 94140 aaccgaaatc aaggcaaaga attgggaaag tgcagaagac tcatgagagt ggacaacatc 94200 atggaggagc tctggtcccc tgaccttgtc ctagaaggcc ttctcatgaa gcacaagcga 94260 ctgtgtcaca gcccagacag gaagtgaagg tctctgcttc actactgtct actttgctcc 94320 taggcagcca aaattaggga gacttgctga accccagctt ttacaaaaag acagaaagaa 94380 tagcagttgg accaaagttt aaaatgtgga tgtgattcct gctaataatg ctctccaaaa 94440 ccatgtttac tggcagctga gcaaaataag ttaagtttca aatcagatta agcctaagga 94500 tcctgccatt gctcaaacct aaaagcaaag ataaggccca caatggtacc aacagaacaa 94560 tccacagtgc agtgcacaag cattccagat ccaggggttt gaatgtagtt cttggtcacc 94620 tatctccgca agctttaggc ttggctttcc tggacagaga aatgagcaga accagatgct 94680 aaagtcacag cagcagtcct agccatggtg tttagaagtt taaaggctca tgcagtcaaa 94740 atagacaaaa agataggcag taaaagaggt ccagatggaa aaaaaaaaaa aacctctaaa 94800 taggttacag tgtgtttaaa ggtatccata gccttaagaa agaaaataaa aagagtatag 94860 acaattatag aaaaaagttt aaaatgacaa cataaatata taaaaatgaa taagccatgt 94920 agagatggga aatacacagg gagtctggat cctatacagc attgtgttga ttttgaattt 94980 tttgattgct gataagtaaa tgacagctgc taagagacat gggattttcg aacaggactg 95040 ataaattgaa ccaacctaga cactttagga ctatcttaac ttttaaaaag aagtttgaaa 95100 aatgtatttg tcaaatggaa atcaaagatg ctttggggaa gaggttttgc ttttgttttg 95160 atgtgaaaca agaggctgtg gattccttcc aggttaatat ggatcagggt tgactgggta 95220 agacctcctg aatcttgata ggtaacatat atcaacaaag gttacagctc atttccccag 95280 gtcttggcca ttatctcaat tttctcaggg actcctaaag atgccttcat ccacagaaaa 95340 caggaaatag tcctgagaac agggtaccca cattcccaag ggatgcagtg ggtggttgtt 95400 ggttatttgg taggttatgg atgtttgtta tcatataagg gaatatagga gtataggata 95460 aaaagacaat tattaatctc ggatattttg tattggcatg gattttagta tattgataca 95520 aattttaagt tatttttgtt gtactacata tagtttcgac ttttgtttag ggtattgtgc 95580 ttatgcagct catttaaaaa tgcagtatat aattaagaaa ggagtatcta atctataatc 95640 aaacttgtag tcatattagg tatgttttaa aggctacatg ggaatacatt agagagatag 95700 atgattttca aacagaatat ggcatttaag atgtttaata acctaaggtt tttcatgaca 95760 atgagacata tctgctcctg gaagcaccaa attactttat aaaaggatga tgggcatcaa 95820 agaacctcaa tatggagttt gctttcagtg tggcaagctt agtcatttag gcaagaaact 95880 gttcttgcct tgactgttga catatgctaa tcagactgga caagtaggac acaggaaaaa 95940 gactgttgga ctttgtcaaa acaaaacagg acagtccttc agaattcctg attcacagaa 96000 gagtctgtca ggtattctgc aggccacagg caaaagcaac agtcgaactt tgtcaataca 96060 aaacaagata gcccttcaaa tttcctattt cactgtaaag tctgccagat attacagtcc 96120 tgtaggtgga agatggatgc cccaacattg cagaggaact ttgtgtgact gtctaggcag 96180 ccatatgtct ctgttgttag gtaatattaa agccctctgg ggtctttgat ggacttaaag 96240 actaaataga gttatagttt ttccacagtt ttggtagaaa ttaaattatg tataaaaatt 96300 tggatcagta ggaaaagata gataatgtac tattttctct gaatttgcta aatacaaatg 96360 tactgaatat tgtaaatata attcttattt gataactatt ttgttgtata tagttttact 96420 ttcaaaacct ttcattttct tttagacaat atggaaaagg aaatagaaaa tacagtaggg 96480 caaggaaaca tggctgcatt taggaaagaa agaatgcaac acaaagggaa ggggattaca 96540 ttttaaaaag agaaaggaaa agcaaactaa cttgaaacag acaattgtga tcaggtgacc 96600 tccagtgcct attattctga gataataaat acacagaata tttaactata taagcaccag 96660 agtagagaga aaagtagaca tcataacaaa aagggagaaa taaaacaggg aaagcttcag 96720 aacttttaag acatttttga ttttaggtaa cttggaaaga gtcagtatgc aaatctgatt 96780 accttgggta ataagaaatt atgtttagta tatatggcac tatatagtac aggcaaaact 96840 ataaatttac agaacaggta aatgtgtaag tgatttttga agattaaaga ctgataaaaa 96900 ctaaagtcaa gtctatactt cttgtttact aaatttacta aataaagcca aactccattc 96960 aaatgttcct atatcttcag tgttttttca ctccatacac ttatatagta tgtctttttt 97020 ctaaagtact attgacctga tgctcttaat ttaacatcct atggaaactc ttattgactg 97080 tcaatttgag agattgagaa aaacacatag gacattggtt gagcacactt ttgagtgttt 97140 gtgacagcat ttccagagat gattaactaa tggatgagga gtaaaacttc tctaattgtg 97200 agaagactgg ggtcccagat gaagcacact agcaaagcat gcaccctctt tgcgttctag 97260 ccactgtgat gtgtgtagct ttgctttgct gtgctattta tcctcatacc aagcacagaa 97320 atatagagcc atccactcat atcctgagac ccctaaacca gtgagcccaa aaaattctct 97380 ccttccttta agttattttc tccagtattt atcacagtaa tgaaaagttc attgatatgt 97440 acactgtgga cattcaaaat caaggaatta aagaagatac cccatcttag aaagggggtc 97500 acatactgca atagaagaat gttactgagt tagcacctac cctggctctg gcatccacaa 97560 gagcaccatt cctcaagaga catcggacac ctgtgtcagc acctcccctg gctctggcat 97620 ccacaagagc accattcctc aagagacatc ggacaacttc cacctgccca gcccgggctg 97680 ccatgtgaag tgcagtttca ccacgctgcc agaaaacaaa gattgcccaa tcgtaaataa 97740 tcccactgct ctgtgtagca aagaataaag atgtcctttt tggtgaaatt cagcaagata 97800 tccaagtgta taaatgatct acaaagaggc ataattgttc agttcagaaa aacatagttt 97860 tgcatcttct gtatctttag aagggcaaat gtttgtaaat attttctgtc gatgacaaac 97920 cagtgaactt acccaaatat ccagactact ctatggttta accacatgat cagtcttggt 97980 aacttacatg ggtgaagatg tgatctttca tcctacaaac ctacatgatc tgtcattgat 98040 cccattcaat gagaaactcc agatgtcaga gatcaagtca acacattgca aaatataaat 98100 cacatcaatt atatcataaa taaatttctt ctcaaattgc aaaccttgct tctgaacaaa 98160 atcttatgtc tgatgtcttt ttttgtgaaa ttagaccaca acttatcata ggataaatct 98220 aatttttcca gtagttatcc tgatcatttt aataattgta tttgattaca gatggtgatg 98280 gagatgggta ctgagagata gtagtagctg ttaacagttt catttgtcac tccttggttg 98340 tctatgtaat actaaggtct aatactcatc gtgaggcaat gaagaagatg gttagagaca 98400 agagattatg ctcataggga aacctgttat caccaaaggg agcagggacg ttgtcattca 98460 agtaatctca tagttagagc acaatattag actaaaacaa gttgactcag cacaaccttt 98520 tcagaggata agttggcaat aaccaagcag aggaacacat tccacaggat ctaattcacc 98580 ttcaaacttg cctatgttgg aatgggatgt ttctgaaaaa ctcctgtgaa catcttctga 98640 ttctttgagc aaaataccct tgaatgtaaa agatttaaca tgaaataagt ggggttcatt 98700 gctcacagtt cccttttctc accatgatgg tgtccattgc ttcgggagtt acgggaaatt 98760 tgggtcaaac aatgtcatta gaaagcattg acctggatgt tgacttgaat gttctcttct 98820 tacaggtagc taacttgtct tctggtggcc ttattttctg atggcaaatt ttgactttgt 98880 aaagtaaatg tatatgaaac atgttttata aaatgacatt agtcaagctt gtctttaagt 98940 ctccatatgt atggtgagag atttcctctt tgggaaacta tggttttatc cttttttctt 99000 ctgtaattca catgtctcta aataactgag actggtatct tacaattaca gaaaaaaaag 99060 aaaaactaga aatttaattt ctaggtctga tgaagatttg ctatttcatt aattttgtag 99120 aaataaaggc aagataatac tttttagaaa ttaagtcaaa gatgcctcta tgtgtttcta 99180 tgtaatgttg aatttacgtg tttattttaa gccccacttt attattaagt tttcaaaata 99240 taacaatttt ctctaatact agtcttaata tttaaaaaac tgttacttta cacctatatt 99300 aaattaccct ctggcttcta cacatttgaa gtgatgcata tatatatata tatatatata 99360 tatatatata tatatatatt gtttaagtct cattttaatg tctctggagt tcctggcatt 99420 tgctgtaaac tatgattacc tttttatatt tacattccta ttgtttatgc agaaatataa 99480 ggaaaagaaa gtcaccaaat attgcatatt gccttactta ggaccttctg tttcctgatt 99540 gtcaggaata gcctgatacc ctatttaaac aacttaactt tagacactgg tagagaaaag 99600 actttaaata taatataaag tgggaacttg accatgaatc tgctaattgg ttataagaag 99660 ataaaaattc ttaatgtcct gtgctgtgct ctcaagaccc cttgagtgct tgccattcta 99720 ctctaacaat gaattgtcag tgaatatgtt agaggtgtat aatagaacac aggtcagcag 99780 ttaaagttca cctataagtt ttctgggaaa ggaagttata aggaaaaaaa tgtgtctaca 99840 aatgttcttg gtgcatctta cactgggtat gaattttcag acaaaaacga aactggcagg 99900 agaatgcgca tgtgagtgtt caaagcgagt accaagagtc atgcccctct tacacagctt 99960 taaaagtggc tccgcagaca gctacattga ctctcacttc ggttgcatct agttggaaag 100020 catcaaagca caaaagacag aattgcattc acaatgcaac acgatgccag caacacagag 100080 gtgccaaggg tgggtgcatg gaggtgggga catgactgac actgtcacag caagcaggca 100140 gtccgtgtcc acacagcttt gtaatcaaat cccaaggttc tagatccagt agcaatgtcc 100200 taatgtctcg agaacacaca agttcacagg caccacctgc tagagaaagt tatattcctc 100260 taaatgtaga gttgccagat tcagcaaata aatagttcaa gtgtccattt ctattttaat 100320 tccagacaat cgggtgatta ttttaccatg ttttagtggt tgcatgacat ctacttagac 100380 tcaaaggagt tcagtgtttt atctggaatg aaaattgaat agggagttct gtgtcctgac 100440 cagcagctct acactgtctc ctatctgaag gatatagctt taaaaataaa atgaacaaac 100500 aaaaaacatc caaggatcct gctaagaagg ggtgggttga ctgaagttcc caagtgcttg 100560 tttggagggg gctgcaggga aacaatttaa agacaaacag atgaaaccaa tgaagaaatt 100620 taggacaact gccatgtggg agctaaagac tagcacagac attgccaaat ctaagatttg 100680 tccaaagcct gaaaggattg gaatacaaga aatctatgtg caggtctaaa tctctccatg 100740 tcccttctga gaccacacaa cagctaagga agcaacaaaa ttttggaatt gatcacttaa 100800 gtggtagttt gtggattatt ttttgaagga ttttcaaagg tctctactac atgaaatttc 100860 agctgggtgt ggtggagcag aactttaatc ccagcactca ggggtcagag acaagtatat 100920 ctctgagttc aaggctagcc tggtctacag agtgagtttc aagacagcca gggttacata 100980 gagaaactct gcctttaaaa accaaaaagg aaagagaaaa agaaatttca gctaagctcc 101040 ccatttaata taattgcata tatcattgtg gtaatatgat gatatatttt aacatatcac 101100 tattacttct ttaactcctg tgggtgttgt gaggcaaatg aggaaagtgg taaaatatag 101160 gggagaataa aaagaaaata gcattagtgg gtcagcacac aggagtactt ttcttgaaat 101220 cactgtcctg tgtgcaagaa tattcaggtt caatttcttc ttttgtttgt tttttgttaa 101280 gacaaaataa aattaaacaa aaatttaaaa attgtaggag ttaataaatc catgtcatat 101340 aatataaaaa ggggagaatc tggatattga gtaaataatt cctatgactg atctgtctct 101400 gttaatcttt tgataagagt ttatgatagc aaaagattaa taagtaaaac aatgaatcct 101460 tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctgtg tgtgtgtgtg 101520 tgtgtgtgtg tgtgtttata aggcagggat tcagatgact tcctcaattg ctctccatct 101580 atttttttga agtaggatct ctcagcaacc tgaagcccat cagtttggct agactagcta 101640 gtcataatcc ccaggggtcc tcttttctgt ctccaaagcc agcactggga ttgcagaaac 101700 acccagtact ttttacagtg agtgacaggg atggaactca gagcctcata cttacatggc 101760 actcacttta atgactgtgc catctctctg gccccatgac ttctttaggc attcaaaaaa 101820 gaaaaaaagt ttaaactcaa gttggcacac taggaaatgg ctcccatact tggtgattaa 101880 aaattctcat gcaatgttac attaaggcca atatgctgtg actaaggaaa cctaaataca 101940 gacctgaaat tctttaatgg ttttatgctc tcacttttga ataatatgaa gagtgtatca 102000 aataaattgg cttcccctat ggactctgtc ccagcaccag agccttcaga cactacataa 102060 agagcagaga aatgagaatg tctgaagggc acaggtgaaa gagcaccttg gcattctgct 102120 tcacaactta aacggggaaa gctaatcccc aaattagcac atgatacact caacagctac 102180 aagtatgagc actttaataa atgaccatta atgtttatgt agggcgaaat atttaaaaaa 102240 attcaatccc cctgtggtcc caggagtgtc tactatctga ataaacacat atagtgggtt 102300 ctccttccct ggggaaaatt tgcatcatta tttgcaatga aacagtgaaa gattgtaaag 102360 ggtagttcaa gacaatgaga gaaacacatg aatcagctga aaatactagt ttaggccaga 102420 cagaattctg gaacacccag tacttaatgg cagaaagaaa ggtgcccaga gaccagcatt 102480 catctcataa tattgttgat aactacttcg ggctcgagaa aactccactg cacatataaa 102540 caagatggaa gttaaactca gtaggacatg gcaaatgtaa tgtagaatag aggatacttt 102600 gatatcacaa acaatcaccc tcactgaggc caatatctgg ttagtctttg ccaacattga 102660 ttatggagct cattttaatg gaaattacct ggaatacaat gcattcaagc aaactagggt 102720 gagccctgaa aactattttg ccatccatcg ttcattcact ttcaaaggtg tgtgtttctc 102780 tgaagcacac cgaaggctga ctcagactca caagtcacct gccttagttt cccaacagct 102840 agggactgca gatgtgtatg accacacagc ctcggggagt tttaaaaaca caccctgttt 102900 tactacatgc attagatgaa tgtttcatcc atccgcacca ggaagcctaa gctgtgtgga 102960 tccctacctt ccatttgttt tctgacacct gattctgcat tcagcaaagt tccaaacgtt 103020 acattacaaa acgttatttc agaggccctt ctcggcgctc tgatgacaca cacatacaag 103080 cccacacacg cccactctga ttcgtttgtt ttctaacacc tgattctgca ttcagcaaag 103140 ttccaaacgt tacatcacaa aacgttattt cagaggccct tcttggcgct ctgatgacac 103200 acacatacaa gcccacacac gcccactctg attctctcac tctttctccc tgtggttatt 103260 ctgacccaag ccatactcac aatgttagtg acatctggag aggctccgtt ctgcagcaga 103320 aggaggacaa tgttcaagtg gcccatgaaa gcagccacat gtattggtgt gaggccagac 103380 tgcgaaacaa agcaacagta gttttactcc tctgcaccgt gggctttggg gcttcttcag 103440 ataaataaga caagcgaaaa ggacagaaga tggatgagag gaagagggag gcataagagg 103500 aaatgtttgg tgagaagctg aaacactttt ctacctctgt tatagcttgg attgaagccc 103560 catatttcac cagcagttcc atgactttga tgcggttttt cttgcaggca atgtgcagtg 103620 gagtaaaacc attctgtgca aaagacaatc gagttagttg aaaacatgca gaaacaggtc 103680 tcacacagct ccatgctggc acatcacagg cgataatgtt gcatcgtcac ataatgtcac 103740 cgtctcttcc gaccctatag aggtggaaat ttgggatgag aagtggtggg gtgtgtgtgc 103800 ttttgggaag cgaattttgc ttctgtcatt gtgagtgcat acagagaaga caaaagcaga 103860 ggaaggtatg tgagcttact tttcagggga gaaaaaaaat ggagggcaat tatgtattag 103920 atgggctaaa gtgttttagg ctgtcttgac cggtcaggtg atggagaaaa agatggagtg 103980 agcagaggta cattttgatg agggagggcc agtttctcag agcataagaa tcgttcatct 104040 acttcaaaaa gctagcaata gcaatatgat ggctttataa aaagtgtttc agctttgcta 104100 ttattttctt agggagagtt tcaaattagc agaaatcatt tggctgacag tatttataaa 104160 agaagttaag ttttatatta aaacatgtgt accaatcaga tatatttggt tttataaaaa 104220 aattaacttc ccagatatat tttattttag gtggaaatga ttgcattcct gaatattttc 104280 aagaaagata tggtgaactt ctggatgcct gacagatgac acctctgaga gctaaagtta 104340 agtggggctt ctggaaggta atctaggtta ctattcagga attggagaaa tcacataaaa 104400 atttacctag ccccatgcta aattgttatg ttttatatct gttgtctttt tatttgaata 104460 attgttcttt tacagagtga tctctaactt gtcaattaac agtttcaaat gtcccagtgg 104520 ggactgactg tcatttgata ttttggtatg ttaccagttc tcaggaaaac atggtttcat 104580 ttagtcagtg acaatgtatc ctttttagtg gagtggtgga cctaatttgt tgagtcgtgt 104640 tccctgttta taaactatgt caccagccag agataagtag taacaagtac atgtggcttt 104700 aaaatgcatg caactaatca cctgtcgtag attacaaact ggttcttcac tatctaaaga 104760 aaagtgtttt caacttctta tgagaaaatt cagttcttca catatttgaa catgaccctg 104820 gaagtttaat cattttctaa gtaaatagta atagatggat tccaccgaaa tttttcaaat 104880 aaattagtat gctcaatatt taataattta atttatttat tactttactt attgatcaaa 104940 tggttgattg acttttgaga tagtgtgagc tcatttatcc caggctggca ccataggatg 105000 acctcctacc gctacctcct gaaagctaag attataggca tgtgccatca tgtgtcatct 105060 gtgtggtgct ggagatcaaa cctaggatct catagatgtt aggccagtat tctaccaatt 105120 cagctactac cctagcccaa tatttaatca ttttaacaag agactcccaa aactgaagtg 105180 aattttagtt gacataaatc atgtaaacat ataggaaaac aaagcaatgt gatcttaaag 105240 tgagaattag aaaatgaatg gcataaatta gtacctgccc aacatactaa ttggttagtc 105300 tataagtgaa gcaagaaaga tttgttccat attattagac catgggagac acaaagctac 105360 tgtgagatgg cttcctacat tttctcttga gcaggccatg gaatgctttc ttcaaaatgt 105420 tttgcagggc agtaatacac tgagaatcac caagcccatg gttatgtagt cagtccataa 105480 agaaaatatc caagtgaact ctcaaaagct tctgtcttag accttcttaa agagtcaaat 105540 atattcacca tttttaaatc tttgttttcc ctaggagatt cataaagatg aaacttttca 105600 tacctgtgtc ctaaatccag ctagtatttt gaagtgccta gaattgattt tgttatttct 105660 ttttccctct gagacagggt ttctctcttt agacctggct gtcctggaac tagctctcta 105720 gaccaggttg gcctcgaatt cagagatcag cctgcctttg cctcctgagt gctgggattt 105780 aaggaatgca ccaccacatc ctgttatttc ttattttata acatctagct tctattttaa 105840 aacactcacc atcccagagt ttcctactgt ttgtaactca caggtttcag aaataataat 105900 ctggtgttct cctaaatctg ctcatgttca ctaccactta ggaaactatg gaagcatgaa 105960 ttaggctgtc agctttcacg gggtgacaag cttggcagct attaagtgtg gatttataaa 106020 catgcatggg tgcatgtgcc attggccaat caatgtgatt ttcctttctc aggctgtatt 106080 tggtgaatgt ggattgggcc aggtttacca gggctctcgc attcgggttg gctctcttgt 106140 ccagaaggag tttggtgaca cggtagtgac cacaatgtgc agcaacatga agggcagtca 106200 ggtaatccag ggtgacatca tctacaggtg ccttgtgctg tagcaggtgc ttcacacatt 106260 ccacatggtc cccctgtgca gccatgtgaa gaggagacag cccattctgc acaccaaaac 106320 aaagaaaaac caagtccatg ttttgttttt attactctca tgtttggggc cctaataaag 106380 ttaatcttta tcagcaacac agctggaggc aggagaaata actcttcctt aatatccaga 106440 tgcagaacag attatgttaa gtaaatagag aaggaaaggg tatatttaat tttataacca 106500 taagaatctt tagcaaaaga cattacatgt ttttcatagt gtcaattcaa cttgagtttt 106560 aaaaattatg agaatagtat tagatatata gaaatgctgg cgcatgcata aatcatttgt 106620 atctaatact acacatagca atctccatta gattatctct ctacttgcat ttcttttccc 106680 ataatcagag aaggacttgg gtaaaggagg gaaaagtgtg ttcatgggtg aagcagatag 106740 gaaaaaattc accatgtctt aggttcaggc ttcagaaaaa ttctgagatg cttttttcca 106800 atagtaatac aagacttacc ttaaagtagg aggaaagaga caggtaagtg ctagaagaac 106860 aggaaaacag tgcaggtcat atatcaatga cctcatggct ctcaaacttg aggacagcct 106920 agatttctga ttactaatat agacacaaac agctttcacc ttaactctga aggcaatcaa 106980 tagtaaaact taaaagatag agtaagccat tcttcatggt cagtctaagt taaaaacaac 107040 tccctatttt gtggagttgg ttctctcctt ccacctttac ataggttcta gaagttttgc 107100 ttgataggtg ctttatagcc tgctgagcca tcttgtcgaa tctccaacca ccaccccctt 107160 ttttaagggt agccaaataa acttcaagga agtactcaca aaattttagg aagaaattgg 107220 aatattgttg tgctaactag ccacacaggt accatcaaat atagttcgtt gataaaaaaa 107280 aaaaaaaaag ctattttggt aaccatgata tcgattcaaa gaagtagaaa tcatgtatgc 107340 aaaaaattac aaaaaaaggc tcacagccca atattctcat caggaaaggc aacttcaaga 107400 atgagaaaca gccacaacct aatatatgaa aatcctaatt gtggttgttt tcgggtggaa 107460 gagttcaagg gaattaaaaa tgatgttatt tgtttctgaa atgaactgca ttaagaattg 107520 ttgctttgat atttagaaat atgttaaatg gactttgaaa acaagagcag gttgataaga 107580 aagtatgcac tggaggggaa gataatgtcc aggtacagaa aaaacaacat ggccattgac 107640 aatgttcaga ctggagtggt aaattctcat ctgaaatttc tgtcattcac tgatgctgct 107700 ttatccattt gaaggttatg tgtaaaacta gtcaccattt caatctttgt ttaacccagg 107760 gtcccccagt aatttccaac tgtccttttc atccttctct tctaaaatat ctccatttcc 107820 ttttagccac caccctcaga aacacttcct actagggacc accagtggct acactacgcc 107880 aagtaacagg cgattttcac tatccttctt gtcttccact tcaggactct cctgaattac 107940 ttattcctgc agaagcccct catccaaccc tgcctctact ccctgggaca caggtccctc 108000 tagtattttc ctgctgctcc tctcagcctt tcttcctagt aatctccact cctttgtgtc 108060 actcaccaac ctgcagaaac agtctttacc aaggacccca tgcacaccac acttgcctag 108120 gatacagagt aggcaacagg aactaataaa cacaacatgc agccaacaaa gataagacca 108180 gatatctaca ccaagaaaca acttaaacat cattacacca gatgactaga tcccagcaaa 108240 aaaacacaaa cattaacgac caagacaaca accccctcta aaagcaataa tcccccccca 108300 aaaaatgtaa tttaactgaa gcacaaggac ttcaaaataa caattaggaa tatattcaaa 108360 gaccttaaag atatatgaat aagtgcctta atgaagaccc tgaaaacaca aacagttgaa 108420 tgaaataatg aaaacatctc aagaaataaa aataaaatca ctagagaaaa tccaaactga 108480 aataaaactg gaaatgaaaa cttgaggata tcaaacaaaa acctcagaga taagccccac 108540 cagaaattac aagccatgaa aacgagaatt ccagatcttg ttttaaaacc ttttattaaa 108600 gatttattta tttattttgt atagagtgtt ctgactgcat gtatgcctgc acaccagtag 108660 tgggcacaag atctcattat agatagttgt gagccaatgt gtggttgctg agaattcagg 108720 acctctgaag atcagccagt gttcttaacc tctgaaccaa ctcttcagcc ctaagaattc 108780 cagatcttga agccaaggta gaagaaatgg atatctcagt ccaagaagat gtgagatcaa 108840 aaaaaaaaaa aaaaacccac ccaggaaatc tgggacacca tgaaaagacc aaacccataa 108900 ataaataata catatgtagg aataagaaga aaaccaggac aaaggcatag aaaatatttt 108960 aataagatga tagaagaaaa tttctccagt ctaaagaaag atatgcctat caaggtacaa 109020 gaagcatata gaataccaaa cagacagaac aagaaaagaa actgctcgtg acacataata 109080 attaaggcac taaatgttca gaacaaagga aggatattaa aaaacttcat gggagaaaaa 109140 ccaagtcaca tttaaagtca gactcgttac aataacaccc aacttttcaa tgtagactgt 109200 gaaagccagg cgtgcctgga gttgtgttat acaatctcta agagacaaca gatgctatcc 109260 aagattacta tatacctgag gatttggaga aagagtcgtg tgcatactct ataagacaga 109320 agaaaaacaa atgcaagcac tttatgttgg gaccacactt gaaagacctc aatagtaagg 109380 aagacctcaa cagtaaggaa gcaaatgtgt catcaggtaa gtagattggg agggtgaata 109440 aggagaggag ttcagcggca taagagactt tgtgagagag gtcaggcgtg gttggaaggg 109500 ctgagacaac aggatttgcc ttgggtaata tgttcagcat agctgggttg cagaaaaaag 109560 aactgaaaac aggggcctct tgcaaccatc caagtgcaac gcatggtggc aatgaggctg 109620 ttcaacaatt tctgatttag tgatgtatat agaaggaaaa agtaacagaa tctggagtga 109680 gaaaaggagg agcccagcat agtatgaggt atctgagaaa tttaaagaat gagatgccca 109740 tgaatgaata tacaaaattc agagaaggct atatttaggg gtaggcaatg tatcacaacc 109800 ttgttttgaa ctgcccagta aatatccaag aagtcaagag aagctgtcat gaacatgtag 109860 aattctagaa atatccacat gggtgttagc agagtacagg tactgtttaa agatgaactt 109920 cagaggacgt gaataggaga gacagagcca acacaaaatg tggcctctaa cacagaattg 109980 gtaacatcca gagaacaggg agataaagag gaaatagtca cagagactgg ggagcagatg 110040 ctggagatgc agaaggaatc caaagaaatg tcgtgtccta gaaggcaaat gagaaaagcg 110100 tttggaaaag gaaggactgg gaagctgtgc caggtgatag aaataggata gaacacgggc 110160 tccacgggct ctgattcatg cacctagata gctgtgaaag tgggagtttg tggacattgt 110220 ctcctgcttg cttcagtttt tctcagtgtt gtatgaagaa aaaagagatg tctaagcaat 110280 atagagaaga attgtcgctt ggttagatag cagggagcaa gatgagtcac tatggaaatt 110340 gcactgtaat ttgtcagcca atacactggg ctaaactaag gttagtgata atgagtctga 110400 agggacttcg tgattggggc cacactcagg tacaagaatg tgacatggac ttagtcacca 110460 gaggctgtag ggagttgttc aagggagtga tggaaatgga acttcattgt tcagaggtaa 110520 gggcccaggg tgaagatgga aacagtacaa ctgcctggga ttagagactc agagtgagcg 110580 agctgagacc taggaggggt ggttggagaa tgtgaggtta gagacaggaa ctacacagac 110640 cttacagtca gtaagtacag ttgagaattc ataatcatgg attatggtga agattcattt 110700 tgctgagagc tatagctttc aaagaatgag gagaagttgc tttgaggagg aagactgggt 110760 aactcaaaac tgagagctgt agtggggaca caatgccacg catgtgctag tggcatggtc 110820 ctactccaac cccgtcaggt catctgctcc aagtccatta ccctcacaga gctctgcttt 110880 tcataatctt ctcctgtctc tcctgccctg gagattctaa gtttcttcat gatactttct 110940 gtttagtatt catcttgcta gttcctgggt aaccagaaca gtgcctggca cattgtattt 111000 tctccataca tgacatagat ggatgtggga ctcaaggggt gtcaccatgc ggttaccaac 111060 actctatgct gaacccttaa atttaaatga ctcctgatta gacaggaaag tcatctcaaa 111120 aatcacactt tgatcatcca tactcttgct ggttatgaat ctattttaac caaagggtaa 111180 aggtcacttg aaaatttctt ggaagaccat gtaggcctca attttataag tattttaaaa 111240 ttttgggtgt aacatgattg gactgaaatt ttgtttccgt ttaaattgca ctctacttcc 111300 tcaacaagct ctccaccatt acctctgcct aacccagtct aaagtgttgc atattttaaa 111360 atatgttttt gcaacattca tagtacagaa tgataatgaa aacaatgcag atagcttact 111420 tcactttatg tatttcttgt acgaagctag tttttttttt tttttttttt taatggctgg 111480 tggaacatat cttagagaat gactgagttc tctatatatg ttaagtgtgt gtactggttc 111540 gctccaaatg atatcaatga aattatcaat taaaaaagaa attgagccag gcatgaaggc 111600 acatgccttt aatctcggca catgccttta atcttaggag gcaaaggcag gctgatttct 111660 gagttggagg acaaaccagt ctacagagga agtttaagga tggccagggc tatacagaga 111720 aactgtttca aaacaccaat tcaatattta tgatgtacaa aattatctat caaggcaata 111780 ccattaacat tggaagataa agctttgagc ttctctaatc tttttctctt tggggtaata 111840 ataatgagaa caatcactat tacttaatag tggagtcggt tgtggatgct gcaggtgtgt 111900 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtacttta tgagaggcca gtgtcttggt tttcttcatc 111960 ttgccctatt tctaacatta gggaatacca gcattattaa ggtgtgggac tggagtggaa 112020 tctggagaaa aatgtaagag gttcacatca gaatttttgt tatatttaag gatctaaaaa 112080 ttgtttcata tcccattaaa taatgctggg tgattaaatg tcaacttatg tttcatagta 112140 ttttctgata aacattagag aaacaagcaa cagtaagtgt acagatatca acaatgaaaa 112200 cctccaaaca attcatttac tgtgtggttt ttattcacat gtaaatgggt tttcttgctt 112260 gaacacttaa agtgagggga aaaaagttca gtgtataatg ccatacagaa cagaatgctt 112320 gatttagctt gctttgtggt tctttatagg tggctaatct taaggtatgc tgttcctatc 112380 acctttataa gtccctaata tagccaatca actctactat taactaatta ttctaactat 112440 tattatgaaa aagaaaaaga ttaaatatgt tcaaagcttg atctactagt gttcacatgt 112500 ttcatagagt catcttagaa agtcatataa tatgttagct catgcaatgt aattgtctca 112560 tatatattaa tatatctaat tttcttattc tttttgtttt ggtttttcta gtcagggttt 112620 ctctgtggtt ttggaggctg tcctggaact agctcttgta gaccaggctg gcctcgaact 112680 cacagagatc tgcctgcctc tgcctcccga gtgctgggtt taaaggcatg tgccaccaac 112740 acccagctaa tattcttatt ctgatacaat atggttagtc aagttttaat ctacaataaa 112800 aatagcttta aaagacagga ggaacctaga ggtattcatc tagcatatct tcatgcatgc 112860 atttgctcat tttaatagtt ttgcaagttt ggtattattt cttatttcta gcatatagaa 112920 taagtaaaaa actttaactg gtgctttagt tttaagagga gagattatag aaaatgcctt 112980 aagtgtcctt ggatgccgtc ttactcataa tgactcacct tggtccttgc cagcaaggga 113040 gcaccccgtt ccagcagcag cgccaccact tggtcatgcc cacttcgtgc agcacagtga 113100 agtggagtca acccatcctg acaagagaat taagataata aatctgagtt gtcactcatt 113160 tacaaacaat attatgtcta ttgccactga caggagagag gctctggtga cctaataaaa 113220 tcacaacaaa atggcagtac ttgcctaaca catgcacaca acacatacac acagagggag 113280 ggaaggggaa ggaggaagag gaagagaaaa gggtgaatga aagaaagaaa agagaaagga 113340 ttatgacata cagaactagg aagggaaaac tttggctccc cccaactctg tcctgataca 113400 ggtggactga ctggattaga acaggctgac ttctggtcaa atgtttgcaa acccagatga 113460 aaaggcacag agcacattga cggttgtatc atcctactta cttggagcca aagctgtggt 113520 tgtactgtta tgccctttga ttttagcttt cctttgcatc attttgattt aaaacttctt 113580 ctttctctaa tttgtccaag aatattcttt tatgaacagt aactactttc tcatattttc 113640 caaaagtatc ttgtggtgcc ctgaactttt catactcttt taagaatttt cagcatttaa 113700 caaaaatcat acaactattt caaagatgaa attcattagt aacaaataca actaaaacta 113760 tgaattttat agctagttaa aatgaaagga gactatcagt gctgccacca tacctgactt 113820 tgtcctttga gttgtgacaa tcaaactcag gtcttgaggt tttgtagcaa gcactttacc 113880 aaaggagctg tctccccagc cccaaataca gactctttaa gacttctgat tacctaatta 113940 aatttgagtg tcccacttat ttttgattag gattttgagt aataatgact ctttgcttta 114000 ttgcatctta ttagccactg aagaattaaa accaatgttg cagtttcgga gtgttagaat 114060 tagcatgaaa agacaacatt ttaaagaaag catttagcca cagctgttga gggctgccaa 114120 attattttca agattttcca gcaggaacag aaagagagat tgtggtgagg aaaatgataa 114180 tgattttctg tcttgataca agcaccctgt agtagtagta gtagtataag ctgtgtagta 114240 aatgacatag cctggtttct caaatgcatg cttggtggaa cttcatcttt ctttagtttg 114300 aggaatgtca gtcagatatc agaggactct gtgccctaga cacagtgaga acagaagaag 114360 atcaaaagcc tttgaccatt ctctatgagg tgaggctcca cactatgcac agagaggacc 114420 tatcatctgt cctacagcct tgagaaaatg acaagatgag acatgctggc ttacatggct 114480 ccaagtaaag ggagatacat cattttgcat gaactgcctg aaatactctc tctgtaatca 114540 tggtaaagcc acaaaaatac cttccacaca gtaggaactt tgtggagaac ttctggcata 114600 cccacaagag catcaaagaa tgagtgagga ccaagttctc agtctcatgg ttaatgaggc 114660 aatgcacctg cccttatgaa agaccaggga ctactgatgc taaattcatt gtctgacaag 114720 ctcagcctgg ctggaatttg aatctttact acaaagcaca ccatcaaatt actgccaatt 114780 cttgttgggg ttttatattc ctctaagtta tactttgaaa gctaaatttc actaccatcc 114840 aaagttccct tctccatgtg cctttccttc ttcactaaaa tcagacagac agacaggcag 114900 acagacagac agacagacag acagacagac annnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 114960 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 115020 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 115080 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 115140 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 115200 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 115260 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 115320 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 115380 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 115440 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 115500 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 115560 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 115620 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 115680 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 115740 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 115800 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 115860 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 115920 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 115980 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 116040 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 116100 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 116160 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 116220 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 116280 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnggt gtgtgtgtgt 116340 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtct gtccctgact 116400 ctttcccaca cctgctctct cttccaccct ctccacagtc cacagtactg agcatcaagt 116460 gtgggtggac tcagatatgc tgggcaagtg ttcttttact gagcaattcc accagcatct 116520 gactttttat ggaaagatgg agagctgatc tggcttgtgc tgtgttgggt ctcctgaatt 116580 cgtggtacaa gaaggaactc agagcactgt ggaggggatg aaagaacaga atgtccacac 116640 tctacacaga actaaagaat ctcctctttg catcttaatg cttgattaaa attcaattta 116700 ctttctctat ccaaaggcta cacaggaaca cagaatgtgg ccctgaattc ctttcccaat 116760 gcttccactt gataacttcg ctaagaacaa ttagttaaag gcaagacaag tgtaagagtc 116820 catatctctc tatttctgag tatgctttca tttttgaaaa caatgctatt agtgtttgta 116880 tgtgctatgc atgtgaccca tgaagacaag aacatctttg aagaaatcaa gaactactat 116940 agtgacaaat acaagcaaaa tcaattgctc actaatgaat acatgctcca gaacagcgtt 117000 aacaaaagca gtgaacaacc gtaagacacc agccaagatt gttaaaagtt attgcactaa 117060 gctttaaaaa cagggaagaa taatgacagc aatgcaggca gcagacaaag cctgagcatc 117120 ctcaggttct cagattgccc ccagtttcct acccacatca cagcaggaga aggtcccggg 117180 ttacaaggca aaggttgaag ccaggcaaaa ctacacaagg aaaaggtaca acactctgga 117240 cagacagaaa aacaattccc aaactcccat atggcatgat actgctgccc tggaacagtg 117300 ttataagaga aatgaggtgg gggttttgct tgtttgttat ggttggtttc agcaccattt 117360 ctggagctaa tgaaagaaaa caacttgtag tgttcgactg gtacagattc taaaagctaa 117420 acaattgcta gcttcaaggc gggtaagtgg cctggatttg acccttactg tttagtctgg 117480 agaatatgga gtcctaaaat gtaaaaatgc atggagcaaa tacatgttct atctaccctt 117540 ttcaatagac tttgttgttc acacataatt taccagggat ttctttcttt tcttttcttt 117600 tcttttcttt tcttttcttt ctttcttttt tttttcttgc ttgcttgttt agttgacagg 117660 gttttttgtt ttgttttaaa gagtttttag cttgactttt tttgacaatt tcctaaatgc 117720 ctgctatatt tcagcccacc ccttttgcca cttcaactct tcctgtgacc actccctcac 117780 actcatgacc tcgtctttat tattgctaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 117840 cacacacaca cacacacaca ccactgctga atctgtttgg aatagttcat gtgcgtctgt 117900 gttgagggct tacctcttgg gattggatat taccaggggc ttgtctctgg ggaaggctta 117960 ttgcccctct tccaacagca attaattgcc tgcagttttt cacctacatg tagcacccat 118020 ccagattccc ccaactgtac tggcatgtca cctgatgttg ttgttacacg ggccttgttt 118080 ccatgaccat agtcttagat ttcataaggt tgtatgaggc ttaactcata gctatgttat 118140 tttcctctca tatatagaag attccttctc atatatagaa gattctatct ctaaatgaaa 118200 tagggttttt tgtaggaggt tcttctgttt gttgttgaga cagggtctct ctacataatc 118260 caggctgacc tcaaactcac actgtggccc aggctgacct cagaattaca atccttttac 118320 tctcttctgt cagagtacta ggattacagg tgtacataat catattggga atacaggtgt 118380 acaagactat gcctggctca attttgtatt tcaaaactac tcaaaattct tgtgaagtct 118440 cttagtaccc aaatctactc cagaaagcca atattacaat acaacactct atatagatac 118500 atatatatgt ataatgtatg tttgagcaaa aagggcatat aatatcagca ttattacaaa 118560 aaatatgagt ggctaagtaa ttgatttaca ccttttcctt cctttcttct ttctttttaa 118620 agataattta atgcagccag gtggtgatgg ctcatgcctt taatcccagc actcgggagg 118680 cagaggcagg cagttcaagg ccaaccaggt ctaccaagcg agttccagga caaccaggac 118740 tgttacacag agaaaccctg tctcgagaga caaacaaaac cctaaaaaag agataatttc 118800 atgcatctga ggctagctaa ggataaaatt aaacttctga tctgtctgac tataccttct 118860 gaatgttgga tgttagtatt ttaagtgtgc tacaggtgtg taccaccata ctcatttgtg 118920 gtgctgggca tctagctgag ggctttatgc aagataggca ttcactgcac taactgagct 118980 gtatttccac tttgttaagg aaaataacat agctattagt taagcttcat gtaaccttat 119040 gaagttaggg ggtactggta gctaaattct gagatcagaa aatgccaaca ctatctagct 119100 taatgaatga cacaaacagg atttgagatc agacagcttg tctttttaac atagtttatt 119160 cactatatgt gcattaagat gttaggatat aattccactt tagaaatttg aaatgaatga 119220 agggctccac ttctactgag atgaaggttt accttgccaa ctgtctgctg actttctgtc 119280 agtgtgacaa tgaatatagc acaactaatt aaggagcaca aaaactgtca atatgcatga 119340 aaccagtttt gcataagtca cagtctcaag acttaaatgt gccaatcaat ctgccttctt 119400 gatgactacc caaaggagaa ctgtggatat gcaatctttg atctttattc ccagaaactg 119460 agcaagaaaa actatcacaa cgaggggcta gtagtctgtg tctctgggca tctatgagca 119520 aatattaatt tcattttatt agttgaaatc tgtgagtatt gtgtgagact caaatcaaac 119580 cccagagcaa tctccttgaa aatacactgc ttgtgtttgc tggctagtgt tgcaatgtat 119640 ggaatgaaag acagcagggc ttaagaactg taggaaattc aaagtgcaaa gatactcacc 119700 ctagttttgg catcaatctg accacctcga tccagtagga gcttcaccat gttggtattt 119760 cctcttttag aagctacgtg caggggagta attccattct atatcatggg aagaccaaac 119820 aataggttag atatgacaca gtatgagggc gtgacttcct agtaaagagt accaagggat 119880 tgggacctgc gtgacccatt gtatctaggg ttcaataggt ttgatcataa gtaataaaga 119940 agcccataaa ccatgggatg ctaattgtta gaaaatgaaa agttaaacaa aaattcatgt 120000 tggtcaaaaa aatacaatat tcacattgaa tgtaaaacaa gataagacac agaaggagga 120060 cgtctgtgtg gcagaagcta agcctcaaat tctaatattg agcccagtga aatatgttta 120120 taacactcat gtactgtaga gtttgagatc tcaaagtttt atatgtttaa aaatggaaaa 120180 atatgcatat taatatcagg ggtaattatt ctttaaagcc ccctcagaat aattcacaga 120240 gaaaaataac tggaaaatag tacatcatag tttcagaaca aaaaatttct tttccaaaca 120300 ggattttaat acaatagctc agactagcct agaacttgcg cataacatag gttagcctta 120360 aactagaact ccttctggct gatctgcaga gtcctaggat tatagatata tgccaccaca 120420 caagggttgt acaaagaatt ccaagaactg taatagtgca cacaagacta ctttgtctta 120480 taaggtatca ggtgtcatca ttatggcatg tatatgtgtc tgaaaatttt gtgtgtcaca 120540 gtttaccaaa tatgtaaaag actgtatcaa catgaatcat gcttaaaaaa tccattccat 120600 atgtgaattt tatactatca tgtaaatgaa tttttctaat ggaagcagaa tattacatgc 120660 ataattccat gcgctgtctt cctatgtatt ttaggaagac atcagaataa attttcaatt 120720 cgttaaccca tccacttgtg tatccactta agaaacactc cctacagagt gtgtgctatt 120780 tcatcactgt catctactga ctagaagctg atcattcatg tttttttttt tgcattattt 120840 tataatacag cagtagcagt caatgccatg ccaaaagtag cctcctcaac tactaatgca 120900 gacttactta ttttctatgt gtttgagtgt tctgccctca gggtccaaaa gaggacactg 120960 agtccctgga tctggaacta taggtggtga gcaactcaac aagggtggga gtcaaactca 121020 cacccaccag aaaaacaaaa ggctcacccc tgagtcatct ctccagcttc cagagtcttg 121080 ttttatttat tgggttatga tactatcctg tgattaagac agtgaaaact acagaatctt 121140 taggatggta aaagagggtt aaatataaga ccttaatgga agatttactt tcttaaaata 121200 cacgtgttta ccacataccc tggctgtgaa gtccactgca gctccccggt ttagaagaag 121260 agtcgccaca ttgacgtttc cataatgagc agctatgtgc aaaggggtga agccgctcta 121320 gagaaaagga gaaatggtgg gtagggatgg gcctcaccct gtggaaagcc accactgact 121380 aaccagaaaa cttactgggt aaccgactgc caagtacatg agcaacgcaa ctcatgtaag 121440 aaacgctgta atacaattct atggcttagt gttataagag agaaataaat accctacact 121500 ggctggaaat ttcattttta atttatgaga tgagttgtct atttaagcta tgtgtcttga 121560 aatctttagc ttatcagaga aactcagaat atgatgaaac cacataaagc ttcaaacaca 121620 ggattaacat ttactaatag atgttttcat ccagacattt taaaagcagc ctttttgttt 121680 tcatttcttt ttctatctcc atgtgtgggg gtggaggtat gaatagttgt atgtgtgtgc 121740 cagaggaggt gtgctacgtc tcctcctcaa gccctttctg gcttattccc ttgtgacagg 121800 gtctctcaaa acttggagta gctggcgagc agtaggaatg agcaatcaca tttccaccct 121860 cttagaagaa gggttataga tttgcacgtg gcacacccag cctttttact tgggctcagg 121920 aaactggaac tggggggtcc ttatgtttgc acagcaagtg gtgcatccct gctgagtcat 121980 cttcccccac cgattaatct tatttataaa agagcattgg ttggcatttt atctgcagga 122040 ctgtgaaaat ttctcaggaa aaatgtctag ttcattctac agcatccaca gtgattttct 122100 atccttttca caactgcata gactgtgaca tatcatgaaa aagatttaga aaccaatatt 122160 aaacaacttt tcttcctatt agattgtctt gcccagcctt gttatgaggg aatttgcctt 122220 gtcttagtgt acattgtttt gtcatgttgg gttgttgtct cttgaaggtt gtggtctctg 122280 gctctttttt gaagggaaac ggagcagaag tgggaacatg ggagaggaga agtggggaaa 122340 attggcagaa gtggagagag gggaaactgt agtcagaatg tattgtacaa gagaagaaac 122400 tattttttgg agcagaagtg ggtacatggg agaggaaaag tggggaaaat tggcagaagt 122460 ggagggaggg gaaactgtag tcagaatgta ttgtacaaga gaagaaacta tttttaatga 122520 aaaatacttg ggatcggtat gaatatgaaa taaaaatggt tcaattgaat ctaatttcaa 122580 atatgaacta aatataattt tatcactaaa ataaaatatg attaaaataa ccacattaag 122640 gaaatgatgt ggatatcaga aagatacctc atttcccaaa tgcttcaaaa acaaaatctg 122700 agaatcaaat gaagaaatca tttcattttc tgatgaagat atagttagat atttttgctg 122760 tttttcccaa tagatgtata ttagctggtt ccttattgag ttgctcaagg agctggtaat 122820 tttcattatg ctctatagtt ttcataactt aattaaaata tttgaaagga aacagcattc 122880 agtggctagt acatcctctc tgcagtttgc aggttatttc ttattttctt ttacttataa 122940 atggatttca atgtgtactc tattgcttta agaaatattc tataagccac aaccagtttt 123000 tattgacttt gtgtatagga tttggtgata ctgtgttcaa aatgctaaga taaacattta 123060 ggtggcttag gtaattgaag gctgcagatg aattcagcaa cataagttgc caataatttt 123120 taactgtaaa gcagcaatag gaatagcaac tgtgaattca gtctccacaa ttgtgatcaa 123180 gatcatttta ctctacatgt aggtggtgta ttcatgccaa aactaagggg gagatcagta 123240 tacaacccat aattatttta taaaatgtca aatctttttt ctattttcac cttgatattt 123300 cctgtcaccc agacatattc tgagtatatg tctattactg ttgtaacatg gggactgaaa 123360 catttcagcc tgcaggagag ctccttaaga gcaggattta aacaaaaaaa acaaaaaaca 123420 aaaaaaaaca aaaaaaacaa agcttcagga agtccctgaa catgactaga tccactaggt 123480 cccttcctgc cagagtaagc aatacaagac gagggtccct ctcaaataaa ccaagctgca 123540 aagaagacca gaccagaggc ctggaagaca caaaaaccag ctgagcttac tggaagaggt 123600 atagaccaga gtcacttgta aaggacactc tccagtctat tgattgctct gatgcctgca 123660 ggctgtgcaa tatgctccag tttctcaggt tttgtgagtt gtcacccatg ttggggtagg 123720 ctttggtgat gcagctgtct ttgagtcatt tctgctcctg ttaagtatac ccttgagaga 123780 gacaaggagc caaaacaatg ccatgacaag ttcctgatag cttgccaggc agcgggcctc 123840 agtttccatt tactggatct gaacaagcag ttcttggaaa gacaactcat gggcaaccaa 123900 gctgtaagca ccccacaacc ttatgcatgc ttgaaatagc taaagatagc ttctcccacc 123960 ctgaccagta agccagccac caaccaatcc tatagcaatc cttaaacttt gtgtttaaat 124020 ccaccaatca gcactcaaga ctaacctcac ctccctggaa tcccctaatc ttacttaaaa 124080 ggagcctgcc aagcttctct tggggtcagc attttgccac ccttacatgc aggtattttt 124140 gctttcaaat taaatgatct tgatggttgc atatgtgttt ggtggtcgtt ttgtggtact 124200 tctcatagac actaacaccc ctcatccata ttcttgtaag taacccctat aaaactcatt 124260 ggttcaccaa gctgtacttt tggtggtatc tgtgctttgg tttgttgtgg actcttgtct 124320 ggagtgcgta gacatgtgtg ctgtgtctcc ccaagaaaat tttcgctata caacaattat 124380 tcaagttaca atttagaaaa gaatttccca attattcaag tataatgttt tatcattaat 124440 tattaattga tgctttttca ttggccttga tgatcataat gcctcaggct ctgagttgtt 124500 gtacaactct ctgctggttt acaccctcca cgaggagtat ctaagaaatt aaagttacta 124560 aaattagtaa ttaagatcaa cttgtatgat tccagtcctg aacaatttca ccaagcaggt 124620 gagttgaagt atcctcaccc ccaaagtcat gcacaaaaaa agaacaaaca aaaagaaagg 124680 agtgcaaata agtcaagtaa attgcatctc agcggatgaa tgtgttaata aagatttgag 124740 aaatatgaca ttttctgtga atgctcatga atgctcacag gtctgcaatt tatccaagtt 124800 cccagctcag tgaggaataa aaattattct agagacacac cccacccaaa caagtcaacc 124860 ttcatacaca atcacttgct ttaagtgtag attaattttt atagcatact ttcaataatg 124920 tttattttgt gacaaaggag agaaaacaca cgcaaactag aggcttctgg acttaatgtc 124980 cttatttaca atgacctatt ttatgtgagg aaaatgattt aatggcaggc attttaagac 125040 ttacaggaaa aaagcaattg ctttgctcat gatgtgcaga gccattattg attataaaca 125100 atgtggtaaa gaaaaaagca gaaaaagtct tctactaaat aacagagaaa cctcctcaat 125160 ttttgcttcc ctacactcaa atctgtgcct tctcattaag aggaaaaatt catatctctt 125220 tgaaaaagtt tcagaataag gctcactcac taaaacataa gcaatgtagt gttttatttc 125280 atgctggact taaactattt aaatagttgg tttaataata tatgctatat caaatatatt 125340 tgaattatca atctttctta attacaggat ttttctctaa cagtttccca ctaatagaac 125400 cttaaccatt agtataaatt agtgagcatt tattttaaca ggataaaaac taaaaataaa 125460 taaaaataag gtaaatgttg gtataatggc aatactgtac ctctgttgtc ctattcacca 125520 tcatctgaag cagtgttttg tgggaaaaag agggaagatg ttaaacaatg caagattaaa 125580 gaaacagtag atctgttcgc tgcaactgag tatgctattc caacaagaca gagtgagaaa 125640 agccagctcc atcccacaac agtcattctt gctgactctc tctaattaat ggagtaaaca 125700 ggaagtctaa ctaaatgtct caacatggaa actggtcttc tgaagaaatc atttagcctg 125760 aatttttgtc actgtctccc aacggatact ccccttccat ctgaaatacc catggaaatg 125820 aattatgtgt cttcctgtcc agaattctgc attatcagca gagagtggtc cttggtcatc 125880 acccaggaga atactgcagt cggaggggac ctctccacag acatatcagc tcttaccttg 125940 gattgcacgt cagcattatg atcattctga agcaggaggg cggcagactt ggtgtcatct 126000 ttccgagccg caatgtgcag agccggcagc ctcaccttcc ctttagtgtc attctccaag 126060 aggatggcca ctgcctggtt gtgtccctgc tggagtgcca ccgctagagg agtaaagcca 126120 tcctagaata taatttacat gagtgggtga gactgacaac atactccaat gacaccaaag 126180 atgggatttc ctgacagagc cttagagcat cagctattca tccctgcaat agtattattt 126240 gttacataat gaagtgggtg atactgacaa ccaggacagg aaaatcactg tgaggagcag 126300 aagcagaatg gactctgcat ttgccctatg gtgcaatggc ttcattagat ggctctcttg 126360 atttccattc tgtatcctaa caagcctgct gattacagga gtgggccaaa tgggtgtttg 126420 taagaggaaa ataaaaatta gaacgaacac ttagctataa cataaaggga aaagaataga 126480 aaccaaatct aactgggagt ggaaaatatg ataatctata gagaaaattg agtgtctaat 126540 caacaatgca agagggatga atgttttttc attgtctgag agaaggtaat aatgactgtg 126600 gatagagtga ttgaaatcat ttatgttacg atgcttcaga cttaatgact ttaagctgta 126660 aattagatta gccattaatt ttgcaattac ttgtatttta gattgctaag atcatttcag 126720 tataaatttg tatatgctag ataacattta aaacccaact tctcttgtca acatgagaca 126780 gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gctcaataaa tgacagcaca 126840 gacaatacaa agttagaatg atctccagaa tcagatagaa aaccatgcaa cagaatttgg 126900 aaagtcatct ttgcatcttc agaagcaaat tgtttagctc ttggaaagat ggaaagtgtg 126960 tcactcctta attccatgag gcttccaagc aaatgttaga agtcttcctc atacagcagt 127020 aatgagggtg gtaggttgta caattgaaga tgtcatttca gggttgagag taattcaccc 127080 aaatctaact actcaatttg ttttcaacat taattgctta agtggtaact gtggcctttt 127140 aaggaaaaat atttctcatg ctacatacat cataccatgt atgtagcatg aactgtagta 127200 atatgttgac tgctcttttg attaagtttg agttttaaat acagcaaaaa gagtggagga 127260 gtagagtgca gtacctcttt ttttgttttt gttttgtttt gttttgtttt tcgaggcaga 127320 gtttccctgt gggaaacagc agtcctggct gtccgagaac tcactttgta gaccaggctg 127380 actcaaactc actgagatcc gtctgcctct gccttttgag tgctgtggtt atgtatacac 127440 caccactgcc tggcctagag tacagtctct taaggtcgag aatagcaaac agctgcagta 127500 tatgggagtg ttaagaacgg ggtagtttat gaatgaagaa cacatccatt atcttgagca 127560 tatttggatt tatttttcct tgcattctgc agcagtctgt attaatggca tgtggacttt 127620 gtttttgttc tgttttgttt ttccttagag acacagccta caaaatagaa ccccagtaaa 127680 aggattgtag ccttaaattt tggcagaatt ctggaggaag gaaaggagaa gaactctatt 127740 taaaaaatgc tgctggccag acagggatct cccttcggag gtctaaaagc tggattccaa 127800 ccatgcagaa ttcattctca tctgtatttc atggaagaag gctaagaaaa tgtgtaacta 127860 tttgttaaaa tacctcaatg aactctgtag gggaacaaac agctaagttc agcagttttg 127920 atttcatcat ttatatacta attctcctta tgagaaattt aaaactaagt atttcttcat 127980 gtgcatatac ttccctgcca tgtggaagga ttttgtaatc acctgatttt tttctaatgt 128040 gggtatagca cttggttcat aattaacttt ttcacattat tgctacacat gagcacagaa 128100 gtgctcttta cgtgtatctc acatactcca atgacaccaa agatgggatt tcctgacaga 128160 gcattagagc atcagctatt catccctgca atagtattat ttgttacata atggtacagt 128220 taaaagggag tgtgcacggt ttgtccatgt gaaccctggt aactatcaga gtaggtggta 128280 tggttcagga tatcaagttt ataaattttc caatcttata agaatttgcc ttagttatgc 128340 aatgatattg ttttaaaatg aaatgtaagg catactcatg gctaggcttc aacccccatc 128400 ccactttgtt tcctttgaaa gtgttgtatt ttgttagata accagagttc tgcaggcagg 128460 ccactgtaca tcctggcctc tgctggtgca gtgatcacta agggctattt ttggaaatac 128520 actgcaatat aagatatttg aagcataaac tctatataac atatttttgt aacattctct 128580 ttatacgtac atacatacat ataatagtat ctgtgaaata tcttctctat cattcatttg 128640 ctcaattact tactgagtgc acgaactctc agaaaccaat tggcttgttt ctaatgtcaa 128700 atgctcttga caggagttgc catgatcaca gtcacacacc tgtgtcatga tttgcatttt 128760 gtcataaata acattgttgt gacacagtcc ttagaaaatt gtactaacac aaatagctgt 128820 aagttatttc tgatagtcag aaatttttcc ttcaaggagt tgctttgaat cttaaaataa 128880 aatattgaaa aaaagcaaca aggataacat aattctaatt caatctttga ctgctataaa 128940 ccccaaaatc aagtcaggtc acatcgacag aagtgcgatt ttgtggtgtg gattcctaaa 129000 accccaggag aactgcaaat ttagggctga tttaggctcc acctatagca agataaaaaa 129060 aatcaagctt aatggtgatg gaagtaagaa tgtctgatca tgatcatgaa tctaaaatga 129120 agttataagt tcatgatgat gtgcacaagc ccaagtaact cactggccat tacagtgggt 129180 tacaaaatag taatatgaac attcccagca tgctttagac aaaacagtgg agagcctttg 129240 caactagtat aatcaatatg gaccttaaaa caaaagaacc agaaactgag actcacctct 129300 gtagcagtgc tctgattagc tccattttct agcaaatatt ttacaacatc aatgtgattc 129360 tcctgggcag ccatatacaa aggagtgaag ccattctgag gacagacaac aaaaacagaa 129420 tctcaatcat ttgtaaagtt tcagcaaaac cgaagtgaca tcataaggag agaatcacac 129480 actatgaaat gatgcccatg taatagcttc tgtatttatc aattcataaa tgaagtaaac 129540 aatatgaact attcaaactg ctagagatat ttgaagcata aactctatat aacatatttt 129600 ataacattct ctttatacgt acatacatac atataatagt agctgtgaaa tatcttctct 129660 atcattcatt tgctcaatta cttactgagt gcagctaaca gtagctgaac catccctagg 129720 atatagtgat aagcaggaca aacacatgtg cccttgtgga atacacatca taataatatt 129780 cattattatg ttcttatcaa aaaactcaac agaaatgtta caccatgagt taaaaattaa 129840 gtttgttaca tctttttatc tctgtatgat taagaatata ccaaccttgt tgagggggaa 129900 aaacacattt tttaaaagct gtactcaaat cctcaaagca attgggcaat tcttatatca 129960 gattattaaa gacagatgtt tacactttcc ttatattaat gagaatgagt aaaagtaaga 130020 tgaacacttg gagattatta accaaaccca gagagtagca aaaataggtt ttaaactact 130080 ttgttgaaat gaaattcttt tgcatgcact gtaaaagtgg aaacattatt caaagtgacc 130140 aataaccagc aaaatataaa tacaaattat gcaagtacaa taagtaaaga aatttaaatt 130200 ttgtttaaga aataaaatat acagggtcca aatagtgaaa ataattttaa tctaaaatag 130260 aaatcatcta agaagaataa attaacaata gtgttatgat ttgtgaataa ctactgctag 130320 ctggagagta tattttccaa ggcttatcaa gcaggtgaaa tacgttgtat tttaagaaca 130380 ctgaaggggt ggcggaagga tggaattaga tatttgaagg aagggaaagc caaggaagac 130440 tgttcaaaac aatgagtggg tgtggaatga ggatctttcg agacaagaaa gaggtagtga 130500 tgcagtaaga gaaaaagaac tttaacagag cacagacatt gctaacaatt ttcctctgat 130560 aaaattctct aggtagatca aaatgtcttc tgtatttatc agttcacaga ccatttcagc 130620 aaaccactat tgtccggaat gcatacaact tactcagcat tcttactgct tcagattatt 130680 aggtctaaca tatgaggcta ggagggacca tacacctgag tgaaaacaaa aaggttcaac 130740 agaaccagga gcccaatatc tccttcatgt ccaaactatg gtgcagatga cctgaccaca 130800 agactctacc tagtgttccc aagtacagtg ccagtccttg ctcagactct gtggtcgtct 130860 gttgtaggat attcctttac cctgcgtaaa gatgtgtcac tgtaattggt ttaatagaga 130920 ccagaatggc cattagcaag gcaggaagaa gcacagatga ggacttgtgg acagagagag 130980 ctctgagaaa aagaaaggcg gagtcaccag caaacacaga ataaccagaa tgagcataat 131040 ggagataaga taacaagctc atggaagaac acagattaaa atttatgggt taatttaagt 131100 tattagagct aattagaagc cagcataagc taagaccaag ctttcttaag taatgtaagt 131160 ctcttgtcat ttttgtgagt gggcagccca aagaaaagcc caactgcagt tgtcctctca 131220 tacatccttt ggccagcaga gtgatggtct tacatatatc catatctttc tgtagtattt 131280 atttcttgct gaccaaatac atgacgaaat aacttaagag agaaatgttt attagggttc 131340 aggatttttg gggaatttca tccaaccatg atgggaaaaa catggcagca cgagcagtca 131400 tgtcgaaggc agtgggagta tgaggtattg ggggttggca tgcctgtgga ccaggaagga 131460 gaaagaaagc tgcttcacaa ccaggggcag ggataacttc acagatctgc ccctagcact 131520 ccacttcttt cacataaagg tacttcctaa ggactctata aaagagtgtc acaacagagc 131580 agcaagtttt caaaatatga ccctttgggg tacactgcag attgaaatca tgacatcatt 131640 ctagtcactg ggatctgtaa attgtacaga ataggaatag aataaatgaa taggaaactg 131700 tccatcttca ctcaaatatt gcttaacaca gcattcctgg tctcctcata catatgtaaa 131760 agtactatta aatatatcat gttcctatgg ttttttacaa gggtttaaat ggaaaccatt 131820 aggaaaacat atataatttc tccttgctga tataaaaaaa ggttttggct tgagcctgaa 131880 agcaacctag atgccactca actaatgaat ggataaagaa aatgtggttc atatacacaa 131940 tggagtatta ttcagtggta aaaacaaatg acatattgaa atttgcaggc aaatggatgg 132000 aactagaaga aaccatcctg agtgatgtaa cccagtcaca gaaagacaaa tacagtatgt 132060 actcactcat aagtggatat tagacataaa acaaaggata accagccgat agtccataac 132120 tccagagaag ctaggaaaca aggaggaccc taagagagac atacatggac cccaaagaag 132180 gggaaaggga catgatctcc tgagtaaatt ggaagcatgg gggaggaagg aaggagcgaa 132240 gttggagaaa gaaaagggag gagggggagg ggaggagagc ttgaggaatc gggaaggtgg 132300 agctggggga agaacaaaga agaagagcaa ggaaagtgat accttggtag agggagtctt 132360 tatgggctta gcaagaaacc tggcactagg gaaattccca ggaatccaca aggatgaccc 132420 caactaagct aagcaatagt gaagaagcta ccttaaatgc ccttttccct ccaaacagat 132480 tgatgactac cttaatccag tagcagaagc agagattcac agctaagcac tgggccaaac 132540 tcccggaatc cagttgtaga gagggaggag tgatgagcaa aggggtcaag accacgctga 132600 ggaaacccac agaaacagcg gacttgagca agtgggagca cggggactcc agactgacag 132660 ctggggaacc tgcataagac caaaccaggc cctctcaaca tggctgtcag ttgagggact 132720 tgggcagtct ataggtccac tgacagcgga atcagtattt atccctagca catgaactga 132780 ctttttggag ctcattcccc atggagggat actctttcag cctagataca gggcagggcg 132840 gggggtgggg gggcgctcag tcctgcccca agtgatatga cagacttcga tgattccccc 132900 atgggaggcc tcaccctctc tgaggaatgg ctggggaagt ggggagatgc tatgaggaat 132960 gggagggcaa aagggagagg gaactgggat tggtatctat ttacaataat aattaaagca 133020 attttaaaag aaaaatattt atcaactgga aataaaagat tttggcttat cctaggtgca 133080 agcaaggaga gtagtataca ataattctgg aataatgtgt tcatatccct agactacaaa 133140 tggtttcaac catattattt actaatcatt gttcatgctt ctcagattag ttataactgt 133200 ctttcagacc cagaaatcat gctcaacttt ggagaattca acatcaaata ggaccctcat 133260 ctagaagctg tagaaaagcc tcacacaggg atgagcaatg ggtagagtgc ttgctgtgtg 133320 agcatgagga cctcagttca catccccagc agtgatgcaa atgtggggcc cacctgtgtg 133380 cttctgctta ttaaatacta tatacagtac ctctgtctac aggaaaatat caattatcta 133440 tcattcattt atatttattt agccaaaaca aaaatgtgct tggtagatag gtactgtcta 133500 acattgtact cagagagtga ctctgagaca aacacaaaaa ctctttgaca cacccagcac 133560 agtcaggtta gtaaagaggg actaaagaac agacagacac atagaaacgc ttacagaaga 133620 gtggcaatca tctggttcat gcttgctctg atggagcagc accacctaca ccagcaaccc 133680 agaatctctg tgggtttttg atgtacactc aatatccaca cacagaccag aggaaggctt 133740 tacctactcc cttatcctgg cctgaggaag gctttaccaa ctcccatggg tctaagtcac 133800 agtactggcc cttgataata gtatgcattc actgggaatt catctacctc ttacaccttc 133860 actcaaggtt tcctctgctc tccacacact ttccatagga acacccagtc caaagctcag 133920 ataaccaagc ttaaactatt ctagacagat tgggggacac acctaactac tcttttttta 133980 ttacatgtta tataaggaga atacagatga aggacacaga actcaatggt gtgagaaaca 134040 ttctgccagc aggatgtcac tagagtgact cagtgtaaag agtagggaaa ccacggaagt 134100 gcagaagcag aaaaagcttt ttagatggag ttgagaaaag agaggacaaa cgggtcttag 134160 gcatcactca gtgacagatg gtgaggggat tgggttcacc aggacttagc cctatctgcc 134220 tcactaagga cttggggctt tgttttaaat ggcttgagag tcatttgggt ttttcaaatg 134280 gggatttggt gtgaatacat ctgaatttta ggagattagg ttgccaagaa tagagaggaa 134340 gaaatgtaaa acactctgac tatagttact gagaatgaac agaaggtttc tgtaacaatc 134400 ttgatgagag ttgaaaaggg aaactattga gataatttgt tttaatcaaa gataagctat 134460 tattgagaca tttatactac acttggtgac tagaaggagt acaagtggtt ttaatccata 134520 tatttattag tcaatttgaa tagttcttaa ttagttataa ctcttttcca gatccagaaa 134580 tcatgctgag ctttggggac tccaaatatc aagtaggact cgcatcaaaa atattttatg 134640 cttataaaaa tgccttgcac agggatgggc agatggctca gtgtagtaaa gagcttgctg 134700 tgtgagcttg agaacctgag ttcagatcct cagcagtgat ataaaagtga ggttcaccct 134760 aggtgtgggc agagacagac agatccttgg accccaccag tcagtcagtc tagccagggg 134820 agagatctgt gttcagtgag agaccctgtc tcaaatatca tgatgattat gatgaggagg 134880 agatcaatag atgaagacac caatgtccac ctctgggccc aaacacatgt acatattccc 134940 acccacaatg cttagcccac agcaggaata aaattaacaa tctgaattgt ttttatgtct 135000 gtgatagttt caatttatct ctaaattatt ctcaaacaca taagtctggt cccttgtttt 135060 taaatgcaga atgtcttaat agtttgctct taaagcatca gttatagagg gtttgatggt 135120 gggtggcttc taagtctagt gattaaaagt tgttgctctc tagctttaca ccctctttta 135180 ggtcaccttc tttagggaga aggaatcttt gtcatgatat cattcaagca gccacatgag 135240 agccatggga gaaggaaatg aaatttccca ccagggctat cttgctaacc atttgaaaag 135300 tacccagaga ctatgtgctc tacacaagaa attccttcag tgactgtggc tctgggggtc 135360 ctcactatga cctcatgagg gacactgaag cacaactagc caagctaagg ccctgatcag 135420 aaactgtgac aataacacat gtatgttgtt tgaagttgct aagtttagtt agaaaactat 135480 ttagtgccaa tgtttaataa gcacaaaacc cagtgagaga tgcccccaca tgctcagacc 135540 tgtatctctc ttgccagtta tacatgcctc ttgcctttct tacttcatag tccttccttt 135600 ctaccgagga aggaaattat ctaaaacagt taccttcaaa tgttttagac atgtaattct 135660 tcaaatgcta aaaataaaaa tctaaacaca ctgttcttct tgaggatgaa tgatgtataa 135720 gtggccctca gtgttcatca atcccctaac aaccaggaaa atggtactta actgtgctgg 135780 attccaaaaa ggcacatgag ggatacttcc tgtagaatcc tgggacctgg gttacctatg 135840 agttaaagca ctatgaccca acagccattg tatcctgtga ctatctattg aagtcagaaa 135900 agactagacc tctgcattga taagaaagaa tatatgaaac agatgactac tgtttatttg 135960 tctaggtcaa accacacata gtctgaagca gtattaaaaa aaaatttcaa tgtaatcttt 136020 gggttttctt acaggaagac tcagtgaata aatcttataa ccatacgtaa taatagaaaa 136080 tgagaatgga cacatatagt ctggagatag taagagtcaa atctcccctc tgaagaagtc 136140 acctgtcatt tttaagaagg ttaatgtcaa gactgagggt ttggttgtac tttttgcacg 136200 gggcagaatt cttcagcagc ccgacagtcg agcggttgac ccacattagg accaattggt 136260 tgttactact gtggtcatca ttctcactgc ctcacacatt cttcttctat taaagcagct 136320 tatgagatgg ggtaggaaag agtcctaaaa ttatcagcaa gcttgaaggt caggatgatt 136380 caaaccctgt ccctaaatac accatgaaca cccagctgtg aaggatggag gaaaccaatc 136440 tggactaatt gtagccatga aaataaagca gatgttggat attctggggg tgtgcttagg 136500 gaacaagaag gaaaaatagg attgtaaaat agtaaagctc aactgctctc ctgtctcatc 136560 ttctagattc aaatgactta cagatgcctg aagtcaatca cctcaggaca ttatctagga 136620 gaaagtggct tcgaatttgt acaacacagt gagcacctct ctcaaccaaa ttcgggattc 136680 ttcttttaga gaattgggac agaggaacaa cattgtctct tcttctaaac tatagccaac 136740 agatgtgtag ccgccatcat aggtctccag tgaaatacag tccagaataa atcagatgtt 136800 acagaaacca caggagcaac agagaaagac tctgagcctt tggttatgga ggaatcattt 136860 gatggtgggg ctatcctgaa gctcaccaac ctatctaaat tttattcaag aaggtcaaga 136920 aagttttctt tttctttttt tattcaagga caaggtgatc tattttctta tttgcaaatg 136980 gaaacatcct aattagtatg gcatctaaac aaaaatgcag ttttcaatat caccattagt 137040 ttaaaattaa acaccctagc ctggatatat ggctccgcaa ttaaagagca ctttttgcta 137100 ttcaagagga cctatgtttc atatgcagcc tccacatggt ggctcacagc catctgtaat 137160 ctctagttcc aggggatcca gttctcactt ctggactcta agagtaccag acatttacat 137220 agtgcataga catacatgag tatagcaaaa tacccataca cataaaatga aaataaatat 137280 ctctattttt taagtaaaat aaagcactct acccaggaaa tttgaagaat acataaagtg 137340 caataaatca gctgtgcaag caatgaaatt ttattattat tatttctttt agtttttgag 137400 atcaaaatat aattacatca tttttgcctt tcctatccac cctccaaact atcctatgta 137460 gtcctcctcc tttttccaat caaattcata gtccttttca ttaattgtta tgtgtgtgca 137520 catttatata ttttttccta aatacataat gacaacttgc tcagtcttta atgttacata 137580 tgttttcaag actgatgatt tggtaatgga taaccaattg gtgtgctgct tcctggggaa 137640 gactattctc ctcatagtat cccttagttg cctgtacaaa acctggaaag ttcaaagggg 137700 ccattgcagg agtaggggaa caacagagag gacaattgca gggtacaagt actctgaatg 137760 gggaaatgga aaaaaatagg aggctctaat tagggtaagg agggagataa aaaaaaaaag 137820 aagggagaag ggtaaaacaa cagtaaggaa gcctgggaaa gtcatgaaga atcacactat 137880 taactatcta tctaaaagta cctataatat acatagcatt tcatataaat atatgtatat 137940 agtttaatgc ttgtatttat aaacaaatat tattatatat aaatatacat atatagtgaa 138000 agtttcccat ctgtcctgga aatgctttct ccaagaacca agaaagacca cctaacaaaa 138060 gccaatacca gacattgaaa gccctctttt gagttgttgg gcctagctgt ccaagagact 138120 cccagaacat tacaggctat tgctattgcc cttggtttct ccacagagat gaaaggtaag 138180 tattgctgaa gacaccatgc acttcagaca cagggtcccg aggcccctga gctggaacta 138240 acatgaaagc ctcctaactg aggactagct ctaatgatac cagaaggagc catgaaagct 138300 tccaaaagag tgaagcaata atcggttcta ctagctatga tgtcaatacc gcagcaacaa 138360 ccatcatgtc aggataccct taagagtgca gtagaggcac tcataccttg acagacacca 138420 aaagcttttt aaatgaactc aagacacact caacaagaag gaaatcaaat tcctggtact 138480 tgaaacctag ccaactacca aaaactagaa aagtcacaga tcttggcaga cccccaaaga 138540 atcaaagagt aaaagagaaa aaacaaacaa acaacacata cacactgagt aaatttcttt 138600 aaagaaatgt tacattcatc gtggagtaaa ttcctctcct gatatctcat tcatctttat 138660 aaccacatgt ataaattctt ttgtaatgtg tatagaatga gtagttttaa agatagaaac 138720 tagaattata tcttgcagat gttgaaacct gagaaacaat tagaggagta atgaaaatgt 138780 ttgcgcagga gaaataaaat attttaataa agttactaaa tatttgaata ttgaaactga 138840 atggtcattt atcccctggc acattttctg gatttccaaa taaacattat agattataag 138900 atacaggttt tttgttttgt tttgttttgg gtttgtttgg ttgattggtt ttgcaagcag 138960 tgtgctctgc ctggcactgt aacaagagct ttaatatatc tgtttttgag cgacatcata 139020 cgtgacccag taacttatac aagaaagtat gttacattca aaaagcaaaa tattgactgt 139080 tcttcatatg aaatgagaga tttagtcaac agcaaccact gtaggatact ttaatttctc 139140 ctaccagaac aaaaatccca ttagcctgga gtccttatct tgaattaaat gactatgcta 139200 atttcatcag ttatcacttt caggacaacg agctcagatt agcatgggaa gtagcaaggc 139260 tgacccatgt tatttatgat aactgtagag catgctgcag ccttccagac acaggctgtt 139320 tcattccaag gaggaggtac ttacagcaac ctcttccttt agaaagtgct ttatttactc 139380 aaaataaaaa ataaatctgg atacatagaa tcctcaatcc cactataaaa gctacagttt 139440 ggacccaaag tctaaggaat tatattcacc ttcaaagttc atccatgaaa ggatattttt 139500 atatcttttc ctaaatagtc agaatttaaa gtctaacaaa aatctatttt gattgtcctg 139560 ccactagcca aagaagttca gggggagatt cctaacagac actcaaaata ggacatacag 139620 aaaaataatg ataatggtca actcagacag tagtgtcctg tcccgaagga ccaggtcaga 139680 gccacagaac tgtgtcaaac cagcttgagg actttctgtc aagggaacag agagcattgt 139740 caccctttct cctagagaat ttttaacttt aaggttctta aactcctata catattcttg 139800 catctcatac atctaattat aacaaaagga attcaaggta aaatgggctt ccaagaaaag 139860 catgccctgt tcctgagagg gatggaagga ataacacagc cagaaaagat agggtcctgc 139920 ctgctagaat gtggttgctg ctgcttggct cagcctactc tttttctgaa gagtcttttc 139980 aaattcttct tttgggaagc acaaaaaata aataaataaa caaacaaaaa acaagaatgc 140040 tccggaggag aaaaccagaa gaaactagtg attttccata acactgccta gatgtaccaa 140100 tttcaaaatg tagctgcccc cagacacaga cacacacaca cacacacaca cacacacaca 140160 cacacacact aatatattta gatatatttt ctggaacatg accatctaaa tcaatagttg 140220 tcaaagccaa tgagatggta attattacgc ttatacagga ccagttgttc acaaggcatt 140280 gccattgttg ttttgcaggg ctttcatcat ggactatgta aataccacgc acaccagttc 140340 tcctaaggaa tgactctgtt ttgatgtaag cacttccaca aagtcaatag ttggaatttg 140400 atctgttaat aaataattct ttcctgtccc aatggcatca acagtgcacg tgctctcttg 140460 ggaaaaacat tcagtgtctg agatagtggc agaatcctgc aacacagcca cagacagatt 140520 ctgccacaga accggggggt gggggggtag acaataagaa atgattttca gagatttaca 140580 gcatttaagt cattttctca ataaactaac agattatgaa gattaataat aattaccaga 140640 aataattaga aataattacc agaaaatgtt tgcgtatcac atgaggaggt atagggattg 140700 ggattaagaa ttgaaacgta tctagatttt ttttctgggc taataattga gagggaaaaa 140760 aaggagggaa aggattttcc tccataagga acccttgatt tacatttaaa tgtacattca 140820 tgtggaagag accaggaatg tctttactcc cattgccaca cataagcagt ttggctccat 140880 acatacgagg attaaaaact atgtgaccag atcataaaac aaatatatat ggcttgaaaa 140940 taggaggggg gccaggcggt ggtggcgcac gcctttaatc ccagcactcg ggaggcagag 141000 gcaggcgatc tctgtgagtt cgagaccagt ctggactaca agagctagtt ccaggatagg 141060 ttccaaagct atacagggag accctgtctc aaaaaaacaa aaagaaacag gaaaaaaaga 141120 aagatagaaa gaaaagaaaa agggaaagga aaccatacct gctgcaaaga catggccagg 141180 aggggggcca tagaggaagt aagtggagca acagaagaag ggagggcaat ggggtgaata 141240 tgagcaaaat gcaagatgaa atcatgtgtg aagatgtcat aatgaaaccc attattttgt 141300 gtgataattt tttaaatcat gataatattt aacaaataaa aacacaggtc ttgataaagt 141360 gatagaaaat ttaaaaatta gttattagcg gtaacaaaat aaaaagttag catttgggga 141420 cttgttggtt taattaataa aggggctaga gagattgtct ggtggaagag aatttgctat 141480 gcatgaaaat gaaggctagg ttcaaatctt caataactat gcataaagct gggtattgct 141540 gtacatatac ctgtgaccca gtactgtagg ggctggggac aggaaggtta ttagtgctac 141600 ctatctatca gccaggttta ataagagacc ctctctcaag agaatacagt aaagaatggc 141660 acagaaggac acctactgct ccccactaat ttccacatgt acagaagttc acacacccac 141720 atgtatggca tacatgcaca catactaaca cacacacaca cacacagaga gagagagaga 141780 gagacagaga gagagacaga gagagagaga gaaggaagga aggagagaac taaaataaaa 141840 taaaaattta ataaacagag attgtgtgtt gttcttcaat agtgcaatgg ttctgggcac 141900 ctggtgcaca cagtgcagtg tgttcaaact ctctacctgt ttctaacaag ccttttttcc 141960 ccctacagct tatgacccct gtttccaagc tgttatggca aggaaagttc cacactccca 142020 attactaaaa atgaacttct aaagagcttt gtccatctta ccccagaaaa gaacaatctt 142080 ttaacttcaa aggacaatta gtaaaaaatt acagatggca ttgtctacaa ccccaagccg 142140 ctgattatct cttttcaata atggagatag ataacatgac atgcctaata attagacctg 142200 cagacttcat ttattctata tttactgtgg gccaggactt tgcatctatc tcacatttgt 142260 agcaactcta cataataagt attactccca tagattagag gtgagataca gagctaagga 142320 gaggttaagt taacaggctc aacctcagaa tacaagcagg tgaaaccgag gttctcagct 142380 ggtggaccac aggcacttgc gtggagtctc catctctagt gccacactcc tggaatttgc 142440 cttgccactg tgtttctctc ccctttgtga ggttacgttt agctattctc tgaaaaatgc 142500 accccactcc ctttgatgct gtggttgtgc atgtgtttct ttccgttctt gtctctgctg 142560 gagataaacc ataacagctc atgcctgcta gcctagtact ctccctctga gctacacatt 142620 atggctaatt acttacccag gcattctatt ttacttgaac caagggttta tgctttaaaa 142680 gattgacttg tttcatcact ttcattaaac agttctttta tcattcctta ttatctggat 142740 aaaatcttga caggggcctt ctttaaatct tcaaaaagga gcctcacttg ggtgtaccac 142800 tgtttaaaat tcaaattcct ggtgcccaat acaataaaaa ataaatcttc ctactatgaa 142860 atagaaagga attctgttta ggtccaacca attgggttat tctattgata taataaatta 142920 aaggctttgg gaacactgtg gcacacccag ccttgtgctc ttcctggaat gaaattggct 142980 ccactgtctc ttgctactga tagtgaaaag ttttgaatta attcttttta tccaaatcat 143040 acataatcag tgtccaatga taagagtcat tgtattttta acagtctaat gctataattg 143100 gtaaagggca ggtaagtgta aagttcaggt tcatgaagac ataccttacc aggggactca 143160 tgttcaaaac caggacataa agaaacaaat actacttagg aacagttagg gatcttgtaa 143220 cctaagagac ctcaaaagct gtattccctg gttaagagtc atcaaagtgt cccatagtac 143280 agttagccag gattagaaca atactaaaca atgcccatgt ttttgtcaat gtacagaaga 143340 ctggcaatgt tacaaaatag ttcttgttag ccttccagtt tctttccact tctaaaagaa 143400 agaaggaagg aagaaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa ggaaggaagg aagaagggag 143460 ggagggaggg atggaaggag aaagggatgg aagaatggat ggagggaggg agggaagttt 143520 ggttttgatt ggttaaaata tctatttttt ttccaagaca gggtttttct atgttggcct 143580 ggctgtcctg gaacttgatg tgtagaccag gttggccttg aactcagaga tcagcctgtc 143640 tcagcctccc aagtgctagg tttaaaggca tatgccatca ccacctggcc taaaatatct 143700 attttaactt tagggaaatg attgttttaa ctttagggga aatatgttta ttatatgtcc 143760 atgtaaatgt tatataaaag tcagagggag gaaaactaaa gcagaatgag actcagattg 143820 gtttggttag gaacactggg atgacccagg catttctcct ttaaaacaga caattggctt 143880 tactaagcca gggtgtctga acactacttc cctggcctct ctgcctcacc tttattagat 143940 cctagggatg agcctttata ggacatcaga acataaagca atatttgacc ttgttgtgcc 144000 caaaatgtga tgcctgaccg actggagaaa ctgtaaagta agattcctcg gcacctacca 144060 ccccataaaa gccacacctg gattaaagat gctatgaaac caaatgaata gttagatcct 144120 ttaattgtgt gatattagaa tactgtagat caagagacaa attatatggg gctatcttta 144180 tttcgctatc aagtgaagta ttgaaaatta attctgagca agctactagc ttccaccaac 144240 tgagaaccta gggatgacac caagtctgtt tcattaaaat gcatatatac ctgcaggcag 144300 aactagatgg aatcagctga gtattaaatt ttacaaataa taataatatg aataatagca 144360 cttgaaatgg gcggggaaag cagtggtgga catagggaag aactagaggg gaagcaacag 144420 gggccgggtg gatcaaagca ttatttgtat gaacaaagat taagcaagta tttttaaaat 144480 aaaattaatg aactatagaa atgatccatt cttctgtaag gcaaaggaca cagtcagcta 144540 gacaaaacgg cagcccacag actgggaaaa gatattcacc aaccccacat ctgacagagg 144600 gctaatttcc aaaatataca aagaactcaa aaagctagtc tccaaaacac caaacaatcc 144660 aattaaaaag tggggtacag aactaaatag acaattctca atagaggaat ctaaaatggc 144720 tgaaagtcac ataagcaagc actctacatc cttagccatc agggaaatgc aaataaaaac 144780 aactctgaga taccatttta cacctgtcag aatggctaaa atcaaaaaca ccaatgacag 144840 tttgtgctgg gtaggatggg aagaaagggg aacactcctc cactgttggt gggagtgcca 144900 acttgcacag ccactttaga aatcagtatg gtggttcctc aggaaaatgg gaatcagtct 144960 accacaagat ccagcaattc cacttttagg tatatatcca aaagaagcac attcatgcaa 145020 gaaggacatc tgttcaacaa cgttcatagc aacattattt gtaatagcca gaacctggaa 145080 gcaacctaga tacccctcaa ctgaagaatg gatagagaaa atgtgataca tagatttaca 145140 caatggagta ctactcagct gggggggaaa agccaggggg ggggtcttga aatttgcagg 145200 caaatggatg gaactagaag aaaccattct gagtgaggta acccagtcac aagaagacaa 145260 aaatggtatg tactcattca tatatggatt ttagacatag agcaaaggag taccagccta 145320 aaatccacac ggccagagaa gctaggaaac aaggagggcc taagagaaaa atacatggtc 145380 tcccggagaa ggggaaaggg acaagatcta ctgaactaat tggagcatgg agggagggga 145440 gagggagata ggagaatgag agggggatga ggagggcagg agggagcagg aaggttgagt 145500 caggggaaga atagaggaga gcaagataag agataccata atagagagag agattatagg 145560 tttaaagaga aatcaggcac tagggaaatg tctggagatc tacaaagatg acaccaacta 145620 acaatctaat caacagagga gaggctacct taaatgccct cccctgataa tgaggttgat 145680 gattgactta tataccatcc tagagccttc atccagtaac tgatggaagc agaggcagac 145740 acccacagca aaacactgag gggaactctg gaatccagtt gcacagagga aggagtgatg 145800 agcaaagagg tcaagactag gctgaagaat cccacggaaa tagctgacct gaacaagggg 145860 gagctcatgg accccagact gatagctgag acactagtat aggactgttc cagactccct 145920 gatagagaat gtcagtttgg aggtctgggc aatctatgag gaccctggca gtggatcagt 145980 atttatccct atgatacaaa tggactttgg aagccctccc cacatggagg gatactctct 146040 cagcctagac acactggaga gagtctagac cctgctccaa attatatgac agactttgaa 146100 gattccccca tggaagacca caccctccct ggggagcaga aaggggttgg gataagggat 146160 ggggggtcag gggaggacgg gaggaaaagg gaattggaat tgccatgtaa gagaagcttg 146220 tttctaattt taaaaaaatt aaaaaaattc aaagtcaaca aagcaccata caggaaacag 146280 atatcttgtg tatttcccat ctttacatat actactttac tctctcttta aagattttac 146340 tattttaaac tatttttatc tatgacgttc tatatccatt ttcttttctt tttttttcag 146400 tatctaagca aatttttaaa catactgtac ttttttacaa gttttctgtg tctggaccca 146460 gctttactaa gtgcctgcag aattctctga ctgcatgagg taaatcttaa attgtcatgt 146520 cagctgcaat gtggcccagc ttagcgcatg gcactggcac atggcattga cagctgattc 146580 cagaggcagt tgtccatagc tgcacctctg tctgctgcct agcaccagct gacagagaga 146640 ctaaaggtct aggcatccat atccacctcc ttgtccaaaa cttttctgag ctttctcaga 146700 ctctatgttt ggatattcaa gccccacatt aggtgccata cacagttaaa ttttctatgg 146760 gccaccagct ctctcccaga taatgacaca gtgactgctt attaattatg aaagctcagc 146820 ctatagctta gggttgtgcc taactagctc ttataactta ttaacctatg tttatgttat 146880 taacctatgt ttaatcatgt ggtgttactt ctcccccatc ttgcacctcc tgtttcctct 146940 atgtgtctcc tggcatctcc tgtgcaccta cattcctcct cctcttcctt tgtctaccca 147000 gaaatcccac ctatacctcc tgcctagcta ttgaccatgt agctttttat tacacaatca 147060 cagcaacaca ccttcacaca acacacaaat atccccaaac acccatctgt gaaccacctt 147120 ggaaaatcca gttttaccaa agacccctgt aaaccattcc agttgaaact cccatctttg 147180 atatctcatc tcactcagta aacaaagagg ttattcaccc accatatccc cacactttgg 147240 aggccctggc ttccttcagg aagaagcatg ctagtcagtt tagccaacct gtcctccaca 147300 catgatgttc ctacttagta attatacatc tacaaaccac atactccttg actgtaaatt 147360 ctcacttgtc aactgattta ttcagagtca agccatttct ctcttccgtt atagaactgc 147420 attgctgcaa tccccaagag ttttctttac catccattac cataatgcac atggaggtgt 147480 catgggaacc ccagtttaca tgattaatgc agaaaatccc acaaatgcat acttctccat 147540 aacttaaaac ctgcaggaat ttaccaaata tcgattactt ggagcttgtt tcccttcata 147600 tttcaaaagt aattttatta atctactttc aaagaattca gatgtttgtc tcctgaatat 147660 cagactgctc ttcatttctg tattttggat taagttttta gaaagatata gaaaagagta 147720 gaattttaat ataaaattta ggatttgtgc tatgaatctt gcatttctac atctttttca 147780 tggttcttaa aaggaaagag tggttctatt tccctgagta tgccctccaa ttcatctaac 147840 accaaatgct ggatacataa atgccaagag taaaacagga atgggggggg agtgaaggag 147900 ggttcctatc agcatctatc agcttaaacc aatatctttt caaatttgct aagaggcatc 147960 agcaagatag ttagcttgcc tgtataaaca tctattttta aatcaaaatc tgagtcaact 148020 gataatggca cccatctaaa ttcatcaacg catcaacctt attgaatgac tgaggcattt 148080 agaaaaacaa ctttaaattt gattaagtgt tcccactcat aaattttctt acagtataat 148140 aaaaccattt gaaactattt accaggattc cctgccatgt gactcttaca ctgagttaac 148200 agtgtgctgt gcaaataagg attattttaa tctcacagtg atgacatcaa ttttccccta 148260 agatatgtta taagatgata tgattagggc cagaaagaaa agcttcaggg aatctgaaaa 148320 caaatgaatg atgaaatggt tttagcttat tatccttgag ttgtctccaa agcatataaa 148380 ccaccatgta ataactaata tcagagcttc taacaagcat ttactttgca acatttgcca 148440 catgtcaacg tctatcacat cactgggctc aatgaatcct ttggagaaat acaacactgt 148500 tctttttata aactgaaatg tgagcatcgc aggttagtgt cctgtcatcc taagggaacc 148560 ccccatcgcc tgttcaaaca caatttgctt tcagctccat gttttctaca tccactactg 148620 attgagacac agtctgggct acatgacaca cagggcttct cttgtgccct ctgaagcaag 148680 tgtggctgcc agactggcag cccttacatc atctgaggaa tttctactcc agagcaccca 148740 gaaacatatt tagaaagctc tgcaggtgac cacaattcag gagaatgttt gatacctcct 148800 gctctagagt aaaagcatgt tatattgcta taaacaaaat tgtctttcag ggctacggaa 148860 agagcgcaga gctgcctgcc tgcaggacaa ctgtttagcc actaacgtga cacccctgga 148920 tcacacccaa aagttgtatt ggagtagtaa aattttatag caccctgtgt ttccaagcct 148980 aagatgctac tgtacctaat ggaaaacatt gatgcttttt acaatggtac caatctttat 149040 ttaaaaaaaa aattgttaaa gttttacact aaagtatgtt tcaattctta tcaaaacatt 149100 gatgcaaaat tagctgaaaa tttgagttgc aagcaaaact gaaagtgatt aactaaaact 149160 tcataccatt acacagccaa aactggatgc cttatctgtc ataaatagat ttattaatct 149220 ctataatcaa aatgaaagaa cactaagctg attcaattat tttttttagt gtttcctagt 149280 ctggaatgtg tgtcatctat acattcatat ctcttagaca tgatgaggaa tgaataacac 149340 agggaataga tcctgctaca caaaggcaag ccactgggga tgtcccagag aatggattaa 149400 aatgagctag ctatatcttc tatagtaacc cagtgtggtt agcatgctaa aaagaaagcc 149460 tggggggaaa aatgcttgtt ttgtttgttt gtttgtttgt ttattgtttt taatgtagta 149520 tcaaccccag ggcttcccat ttgtgaaagg aataaatttt attagaaaaa tacacagtaa 149580 ttcctacaca gagatgtcat aaataccaag agtaaagtgg ggagcaaaat atcatgcatt 149640 ttttctatca aaaaataaag aaatcaggtt tattgtgcta ttcatattgt ttcttttttc 149700 ttaatttcaa taggatgata acttcctttt tatgatttaa tatatacatc ataaatgcag 149760 gattataatc tgccagtttt actcagtatt ttaataaagc cacagttggg taactaaaca 149820 aagtataggg agtcctgtat tattatagca gagccctccc atttggaatg ctggcttttt 149880 tataaagttt taaattttta ggaagaacag ccatcacata gcagcacaga gcgtccatga 149940 accacgtttc atggatatca ctgccatcgg ttcctcttct ctttgaaggt catcagacaa 150000 tgatgaacta gcatttacca agtgtttgaa aataagaaac taaaatacat gatttcgtag 150060 aatgctttgg ataaaataag taaaagaatt ttgggggaaa agtaaacaca ctatatcaat 150120 atgacaaaag catcctataa acttactcag agcagagaaa acccaaatgt gattaatacc 150180 tgtgactgtg cgttgatatt ggctccttct ttaactagaa ctttgacaac ttccgcttgt 150240 ccggccagtg atgcaatgtg aagagcagta tttcccttct gttttgataa aacagaaaga 150300 ataaaaaaca ttacagtttt ccaaattgtg tagaaaccaa catgtacaag aattttcaag 150360 ttcattcata gttcaaatta ttaaaatctg gtattttgtc aaggtaaaca ttcactttta 150420 tcaagcccac ctcgtaaagg atttgctgac atctaaaagt tggtaatctc ctgcagcatc 150480 tcacttcact gtcttttgta atacttagta ccatgatggg aacatcagag gactagatgt 150540 taacaaaacc acagcttgtg gacatgtgtg catgtgacag tccctgtaga attcaaggga 150600 tttgggggtg gggaatagta ctattgaaaa aaataccaat gtccttgaaa cattgcttat 150660 ttaactgtgc aaaagtaagt agggaggctg aagaaatggc tccatagtta acagcatatg 150720 cacacagacc ccatcaccca cattaggttg tttacaacca ctgtaatcgc agctccacat 150780 attggatgtc ctgttctgtc cccctcaggc acctgtacat atgtgcagat atgcacaaga 150840 tgcacgcgca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacaattt ataaaacaaa 150900 tctttcaaaa aatcaactgg ggactctcag tgagtggaca aacttgtgca agagttatgt 150960 ttctacctac aaggaaacat gtttttgatg aaaatatttc agaaattaaa aagtaaattc 151020 tatatcaacc ataaattact tacgatttct accacttgct acatcaaaat ttatgataag 151080 agtcaacaca gatgaaagaa aatgaaaatg tgattaagat aaataatgaa aatagaaaaa 151140 tcaaaacaga aacataaatt tttgaaccat aaagtttaat tctatttctc tttctgatac 151200 catataattg tagacccacc atccactaag catttgttgg actccatctc atcttataaa 151260 acattttttc tccagaaaat tctacagttt taatctaggc ttaaaagtaa acctcaaaaa 151320 aaaaaaaaaa gtaaatctct gccaggtggt ggtagcacac acctttaatc ccagcacttg 151380 ggaggcaggg gcaggtggat cgctgtgaat cccaggctag cctggtctac agagggagtt 151440 ccaggacagc caggactaca cagagaaacc ctgtctcaaa aatcaaaaca acaacaacaa 151500 aagtaaatca gaactgtgca tggtggagca cacctaaaat ccttacacta atgagggtga 151560 gtcatgtaca cccagaatcc cacagcacct ggatccacag ttgagatcct tgtttcaaaa 151620 aggcatgagc agaggcagag gcaggcggat ctctgtgagt tcgagaccag cctggtctac 151680 aaaagcgagt accaggacag cctccaaagc cacacagaaa ccttgtctca aaaaaccaaa 151740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaggacaag agctgcaggt tagtggtagt gcagcttcct 151800 gatgatgtaa gaccttggac tgatcacaaa aacttctttc cccaccacga aacacacaca 151860 cacacacaca cacacacaca cacacatgaa aaaggaagag aaggtagtgg aggggaagga 151920 agaagagaat aacctataat tttaaaatac caataagctt tagaaggaaa aataagagta 151980 ataacaaaca tttaagcaac caaaaagtgt tggatttaat gaacatgtta tgctaccatg 152040 gacaattcaa gggagggaaa tcctttgatc tatattaaaa tcaatattct aataattcta 152100 ggaattgaat tcatgtccca aaagttcttt tacagtagag cataaagggt ctgatatatt 152160 caaatcaaac agaatgaata ctagaaaagt cacatcaatt taaccacagc ataaaaatgc 152220 tctgctcatt tcaattgaga agacagtcct atcagttgag ttgttggctt gtttttaata 152280 aatggacttt aggaaaacag atgcaaatgt ctacagggga tcatgctgat ctaggcttct 152340 ttgtgaatcc aaggaggaat gatagtacat taagatctag atctgggctt ccagaattct 152400 tgagtctcac ctctaagtcc taaaacaaaa tgatccaaat gctggaggtt aaggaagaag 152460 gtgtcagtta tactcccgag tgctcaataa tccccagaaa acttgtgaat aactggaaaa 152520 ggctttcaac ctcttcctct tcaaaaacta aacagattac tataaattaa aaacaaacaa 152580 aaaaaaccct ctttctcatt gttaagaaac aaattctatg ggcaggagcg gtaccttagt 152640 ggcagaatcc acggaggacc ctcttcccag cagctcctgc accaggccca cgtggccttc 152700 cttggctgcc agatggagag cattgagtcc attctgagag aagaataagt gaggcttaga 152760 <210> 10 <211> 1219 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <223> Ankyrin 2 gene <308> GenBank NCBI No. NW_003635654.1 <309> 2011-10-27 <400> 10 taaaaaccct aggatgcaca atggctcatc ccaacacatg tctgcacagt ctagactata 60 tggattttca gatgaccttc aagcctgtat ctcatactgc ccatggattt ttctggttaa 120 ctttggtaac tttttagcct gacagataaa caaaagcttt ttctagtatt caactaggac 180 agtaacttga catggtagtt tggggcaaag aaaaacttca ctcactgaat gaccatattc 240 tttaaggatt tcctatgatg aaatctgggc tcacagggca acagctaaca ctgaacctgt 300 gtactccttt ctctagattt acaagagctc agactgtcaa agcttagggg tttcttatgt 360 tccagtcttt ctagtttgaa agtaaaaata taagaataaa aaaatgaaag aaccatcaat 420 agaaacaaaa ccacagaaag ctgtgtagct ttggcacggt tgaggaagta tacactgggg 480 aagcctgacc ttttgaaaag ctgtgtcact gtccagtcct tccaagacct gaggctggtc 540 atctgctgac tccactatca ccaggctggt tttccttgga gacttctcct cattgggctc 600 aggagcttcc tcgggttctt gcacgatggg agaaccacgc tcgctagtca ctggggtctg 660 gagacaagac tttgcttcct ctgcaggggt actgatgtcc tcaggagtct tacagagaga 720 gtcaggaact tctgtggctt tttgagtctc tgccccttct gcccctggtg ttgtcacact 780 gcaacagaaa agtaatttgc cactcaagaa cactggaagg aaaaataata tttctcttca 840 tggtagccaa gacaatatgc actcacgcat aaacacacac actaaacatg ggaaaaatga 900 gttttagaca acaaatattt atagataatg cttttagaag aaagcaagaa attttagcag 960 aataaaataa acccatatta atgtagttag tataattata aacataatgg agcataattg 1020 catatcatta tttaatggaa ggaactgttg acactgacac tctggcagtt tggagtgact 1080 ctcatgcagc cttttaaaac ctcagtttgt aagtaagaac atcatttccc cttttttgct 1140 tcttgctttg tatccaacag ttttctgtcc caaaggtaca ttttactctc tctgtctttc 1200 ttttccttcg cttttctgt 1219 <210> 11 <211> 2001 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <223> Cpsf4 Gene <308> GenBank NCBI No. NW_003614125.1 <309> 2011-10-27 <400> 11 aaaaacggtt ctgaaaattg gaatgatacg gtaatttact gagaatatat tatttcttgg 60 gtctttccat tctttgttca tcatagatta aattaaattc atgtgaagag acagccccaa 120 gaacaagtcc agactcatca aaactttaag aatatgggcc ggtttcacca ctcagtggaa 180 aaaccatttg tggttcctac agaggatctg ggttatgtcc caacatccta tagcagcagc 240 ttacaatcct tcttacctct agttccagga ctttgatcac cgcttacatt acatatgcac 300 aattgacata catacatgtg gacaaaacac tcatacacat aaaatcaaaa taatgcatct 360 tttgaagaaa gcataaaaac caatatacag aattgtgata tgacccggca tcccttttgg 420 gacggcagtg actgcaggcg agaaggaggg gatggcagag agcagtgtga agtggggagg 480 gcagctaaga gacctgaggg ggagccaggt cttaggcctc tgccgccgct gccatgcata 540 aaatcatcgc cagcgtggac cctatcaagt tcgacttgga gatcgccatg gagcaacagc 600 tccaggccct tccctggata agtcgggggc tgctgtctga gaattcattt tgaaagctgc 660 ctgtggcaaa tgtggcatgt gtccattccg ccacattagt ggtgagaaga cagttgtgtg 720 caaacactgg ctaagagcac tctgcaagaa aggggaccag tgtgagttct tacatgagta 780 cgacatgacc aagatgcccg agtactactt ttactccaag ttcgggaaat gcaacaacaa 840 ggagtgcccc ttcctgtaca tcgaccctga gtctaagatt aaggactgcc cttggtatga 900 ccacggcttc tgtaagcatg gccccctgtg caggcatcgg cacactcgga gagtcatttg 960 tgtgaattac ctggtaggat tctgccctga ggaaccctag ggtagattca tgcaccctcc 1020 atttgaactg cccatgggaa ccactgagca acctccacta ccacaacaga tacagcctcc 1080 aacaaagatc attgggttca tgcagagtca aaatagcagt gcagggaacc tgggaccctg 1140 gacattggag caagtcactt actataagtg tggtaaaaaa ggacactatg ccaacagatg 1200 caccaaaggg ccaattggca tttctcagtg gacagtgaca atagctgggc tctgtggagc 1260 agcctaagag acctgctgtt ggtaacaagc acttagctgc tcaatgtagt gctggcagga 1320 ctggctagag cctcaggcac acttgccagg gctcattttg aggggccatg tctgtcctat 1380 cattttgctg taatcttttt tctttaaaga aggaacatgt gcttcagttg ggtcccttga 1440 gccagcttgc ttggacatca gtgcctcatt ttttggacta tgtgctctct tccctcttgg 1500 agagagagaa gttgggaagg gctgtgtttc ttggtcctgt ttggaagatg actagcagtt 1560 cctttcaggg cctcattaaa caccagcacc gggataggat gggtggatca tgtgggactg 1620 tggccaggtc accctgcttt ctccaggtcc agccgaagcc tcgaggtgtg tctatgaatg 1680 tgacgtgaac aagggagcgc ttctagacaa acttggagca tttactgcct ggcctggccc 1740 tggctcttta gagaggtgtc aggatcccag gctgagctgc ttttctgggc ttgctttctt 1800 gtggatactt gcctgacagt gcttcgggca caccttcagt cagtgctgca ggccaccttt 1860 aaatagctga cccagttgaa ctgcacctac ctcctgccaa gcaaactctg tgctgtcatt 1920 cagaccccca tggcatgcag aggccaccca tccttgagcc tagaaaatgt gaatccatca 1980 tctgcaacct gctgggcaaa t 2001 <210> 12 <211> 2001 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <223> C-Mos gene <308> GenBank NCBI No. NW_003614707.1 <309> 2011-10-27 <400> 12 aaaaaaagca cagtgaactt gtgcactttt caggctataa tgattgttag tgctagtcct 60 cctcagctgc gttaaatcac tccaagcagc tattggatgc aagagttgca atacaaatag 120 caggcatttg tcgaaccact tgccaagatt attaggtgca accttcataa gaattaaaaa 180 ttgtaacttt aatgtcatta atcaaaatag aatcagtgat acaaaacatg cacacctcct 240 aagttcatca gaagggggat tctgatggat ttgatttcta cagcaagaag acttcttagc 300 aacaccccga cttcctacca gtccttcctt tccaggcaag tcaggtcacc cagattctag 360 accacagcca acaagttact ggaacttaac acagacttgg agggagagaa aaaggaacaa 420 agtgagtgtg atggccatag ctgtaaataa gcacaggaaa accaggagga acagacatgg 480 cacagaatca ctggaatcct tctatagtac agaaaagcag gcactaaaca taaattcagg 540 gcctggccac caaaccagac tcatcatttc caattttcat aatacagtgc tcattttcat 600 gccatatttt tgggggaaaa gaagagagca acaatcttac tctgtcattt aaacagtccc 660 tgaaagtgct caggagctac acttttcagc acttggtaaa gctttttttt tttttttttt 720 cttttttgct tacatgtgat aagtgaccac tttttatgtg acagctatgt gcttctgatt 780 ttagaactac aggttttgag aaggcaagtt aataaagaga gccgtttcta tcaacaactc 840 aaaattcata taacttcaaa tttctacttg atgttaataa tatggttcag tctgtcacct 900 tgggcataat cttttttatt tatttatatt ggaaacaagc ttcttttaca tgtcaatcta 960 agttctctct ccctcccttc ctcccctgcc cctgaccgac ccctttatac caatcccttt 1020 ctgctcccca gggaaggtga ggccttccat gggggatctt caaagtctgt catatcattt 1080 ggagcagggc ctagaccctc cccagtgtgt ctaggctgag aaagaatccc tctatgtgga 1140 gagggctcct tgggcataat atttaattgt ttgaacctca atgctttatt aagaaattag 1200 gataataatt attaaaaaaa ttttttgggg ggagaatgaa agttgggtat ttctgaacag 1260 attaacggga caaactatta aaaaatgtaa actatagagc attttagtat aatccccatt 1320 ctgtgccatt gtaccaaatg ccaaataaaa aggcatggca aaatataaaa gtgctgaaat 1380 taggtggtta gtggtggcac acacaccttc gatcccagca ttcgggaagc agaagcaggc 1440 ggatctctct gagttcaatg tcagcctggt ctacagagcg agttccagga cagccaaaga 1500 tacacagaga aaccctgtct tgaaatacct tcccccaaaa agagtactgg aatcacacta 1560 taaatttgct tgatatctat catatagata aaattacagc tctggactca gaactgtggg 1620 ctttaagggg gtaagagtaa tagggtgcct taaaactctg ggtatcacac aaaatacatt 1680 acaatgtgat tcattatttt gtgtgttcca gttttaagac aacctcataa ataattcatt 1740 tctaaagccc aatttagaat ataaggtatt agtgaaggaa tgattcacaa cttacacaca 1800 tctcaagttc actcttccat cactggccta tctactcaag tttaacagaa tgtccattat 1860 tcactacttg tttactttta tagatatttt aaattacaaa tgggttacat cctaataagc 1920 ccatcaaagg ttgaaagtac taataggtgg aaaatgcatt cattaaatgc tttacctaca 1980 aaatgtcaga gatggttatc a 2001 <210> 13 <211> 1001 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <220> <221> misc_feature <222> (310)..(348) <223> n is a, c, g, or t <223> Nephrocystin-1/Mal Gene <308> GenBank NCBI No. NW_003613665.1 <309> 2011-10-27 <400> 13 gaagccaaat cgcgagtctc acaaatgcca caggaaagct ctcgtagcta tggagtttac 60 catgcttaaa ctatttcaaa gtttagtttc ccggaacagg cgtcggaaag ctgcatagaa 120 cagagcaacg catggtacga ggtcgtgata gtgacgagac gcacagtctg aggactcccg 180 ggttacgtcc ccatccttag gaatccacag tagttgttct taggccgttt agcgaatccg 240 gtggcgctgg gtggcggcgc ccgctgatag cgtcatcttg ctgagctccc gttttggttt 300 ccctggcaan nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngc tcaggcgccg 360 cgggcaggag cttaagcttc aggtaggtgc atgggagggg gccccacatc ccagcccctc 420 gccaggaccc gagcgctggg ccgcagcgtt ctaacctcga tccccgccgt agacaaaacc 480 tccagaaagc cttgctagtc agctaacacc tcagtcctta acccctctca cccctcccgc 540 gcatgtctag actagtcaga tccaccccag tcctttgcca ctctgctttg aaagtcatcg 600 ctttctcaaa aatcaagtgt aacaggtgtc aagtgtagca agaatagtgt taatacctga 660 gatccgataa acgagccaag gacaggagat tagtaactta agttaatttc aaaggtagtc 720 aagcacctgc aaaagaggta agatcgtagc gattttaagt cataaccctc agtgctgagg 780 aagactcgat gaaacaggcg atgccctggt atatagtcta catttctgga cagcagtttg 840 acaacatata gcgagcattg atcctcctag gctggttgat tacattctca gcaatctccc 900 acttacaata acttaaaagt gtgacagaga tggatattta aatgtgttca ccacattttt 960 tgcttataat agaaaagctg aatatgaata aatgataggt a 1001

Claims (40)

  1. 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 서열 번호 1의 130-131번 위치 또는 다른 포유동물 세포 게놈에서 안키린 2 유전자 (Ank2) 중 서열 번호 1의 130-131번 위치에 대응하는 위치에 위치하는 천연 염색체 부위에서 포유동물 세포의 게놈 내로 이종성 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 것을 포함하는, 포유동물 세포에서 이종성 폴리뉴클레오티드를 안정하게 통합시키고 발현시키는 시험관내(in vitro) 또는 생체외(ex vivo) 방법.
  2. 제1항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오티드의 삽입이 상동성 재조합에 의해 또는 하이브리드 리콤비나제(hybrid recombinase)에 의해 매개되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 포유동물 세포가 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오티드가 폴리펩티드를 코딩하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 폴리펩티드가 치료용 단백질 또는 산업용 단백질인 방법.
  6. 제1 상동성 아암(arm), 이종성 폴리뉴클레오티드 서열, 및 제2 상동성 아암을 포함하며,
    여기서 제1 및 제2 상동성 아암은 각각, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 서열 번호 1의 130-131번 위치 또는 다른 포유동물 세포 게놈에서 안키린 2 유전자 (Ank2) 중 서열 번호 1의 130-131번 위치에 대응하는 위치에 위치하는 천연 염색체 삽입 부위의 측면에 위치하는 5'- 및 3'-서열과 80% 이상 동일한 것인,
    이종성 폴리뉴클레오티드 서열을 포유동물 세포의 게놈 내로 안정하게 통합시키기 위한 재조합 폴리뉴클레오티드.
  7. 제6항에 있어서, 천연 염색체 삽입 부위가 외래 유전자의 안정한 통합을 지지하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  8. 제6항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드를 코딩하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  9. 제8항에 있어서, 폴리펩티드가 치료용 단백질 또는 산업용 단백질인 폴리뉴클레오티드.
  10. 제6항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오티드 서열이 부위-특이적 재조합 서열 (염색체 랜딩 패드(chromosomal landing pad))을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  11. 제10항에 있어서, 부위-특이적 재조합 서열이 파지 인테그라제(phage integrase)에 의해 인식되는 인식 서열인 폴리뉴클레오티드.
  12. 제11항에 있어서, 파지 인테그라제가 phiC-31 인테그라제인 폴리뉴클레오티드.
  13. 제11항에 있어서, 인식 서열이 파지 인테그라제에 의해 인식되는 attP 부위 또는 attB 부위인 폴리뉴클레오티드.
  14. 제6항에 있어서, 포유동물 세포가 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포인 폴리뉴클레오티드.
  15. 제6항의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  16. 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 서열 번호 1의 130-131번 위치 또는 다른 포유동물 세포 게놈에서 안키린 2 유전자 (Ank2) 중 서열 번호 1의 130-131번 위치에 대응하는 위치에 위치하는 하나 이상의 천연 염색체 삽입 부위에서 게놈 내로 안정하게 통합되어 있는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 인체 내에 존재하는 세포를 제외한, 조작된 포유동물 세포.
  17. 제16항에 있어서, 천연 염색체 삽입 부위가 외래 유전자의 안정한 통합을 지지하는 것인 세포.
  18. 제16항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오티드가 폴리펩티드를 코딩하는 것인 세포.
  19. 제18항에 있어서, 폴리펩티드가 치료용 단백질 또는 산업용 단백질인 세포.
  20. 제16항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오티드가 부위-특이적 재조합 서열 (염색체 랜딩 패드)을 포함하는 것인 세포.
  21. 제20항에 있어서, 부위-특이적 재조합 서열이 파지 인테그라제에 의해 인식되는 인식 서열인 세포.
  22. 제21항에 있어서, 파지 인테그라제가 phiC-31 인테그라제인 세포.
  23. 제21항에 있어서, 인식 서열이 파지 인테그라제에 의해 인식되는 attP 부위 또는 attB 부위인 세포.
  24. 제16항에 있어서, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포인 세포.
  25. (a) 부위-특이적 재조합 서열을 포유동물 세포의 게놈 내로 삽입시키는 단계로서, 여기서 삽입은 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 서열 번호 1의 130-131번 위치 또는 다른 포유동물 세포 게놈에서 안키린 2 유전자 (Ank2) 중 서열 번호 1의 130-131번 위치에 대응하는 위치에 위치하는 천연 염색체 삽입 부위에서 이루어지는 것인 단계; 및
    (b) 이종성 폴리뉴클레오티드를 삽입된 부위-특이적 재조합 서열에서 세포의 게놈 내로 상동성 재조합에 의해 통합시키는 단계
    를 포함하는, 이종성 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포의 게놈 내로 안정하게 통합시키는 시험관내(in vitro) 또는 생체외(ex vivo) 방법.
  26. 제25항에 있어서, 천연 염색체 삽입 부위가 외래 유전자의 안정한 통합을 지지하는 것인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 부위-특이적 재조합 서열이 파지 인테그라제에 의해 인식되는 제1 인식 서열인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 파지 인테그라제가 phiC-31 인테그라제인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 제1 인식 서열이 attP 부위 또는 attB 부위인 방법.
  30. 제27항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오티드가 제1 인식 서열과 동족인 파지 인테그라제의 제2 인식 서열에 부착되어 있는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 제2 인식 서열이 attB 부위 또는 attP 부위인 방법.
  32. 제25항에 있어서, 세포가 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포인 방법.
  33. 제25항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오티드가 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 표적 폴리펩티드-코딩 서열을 포함하는 것인 방법.
  34. 제27항에 있어서, 통합이 파지 인테그라제의 존재하에서 이루어지는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 파지 인테그라제가 세포 내로 도입된 벡터로부터 발현되는 것인 방법.
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
KR1020137028897A 2011-04-05 2012-04-05 염색체 랜딩 패드 및 관련된 용도 KR101999410B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161516612P 2011-04-05 2011-04-05
US61/516,612 2011-04-05
PCT/US2012/032362 WO2012138887A1 (en) 2011-04-05 2012-04-05 Chromosomal landing pads and related uses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140019430A KR20140019430A (ko) 2014-02-14
KR101999410B1 true KR101999410B1 (ko) 2019-07-11

Family

ID=46000358

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137028897A KR101999410B1 (ko) 2011-04-05 2012-04-05 염색체 랜딩 패드 및 관련된 용도

Country Status (9)

Country Link
US (2) US8980579B2 (ko)
EP (1) EP2694661A1 (ko)
JP (2) JP2014511697A (ko)
KR (1) KR101999410B1 (ko)
CN (2) CN103597083B (ko)
AU (1) AU2012240164A1 (ko)
CA (1) CA2832095A1 (ko)
SG (3) SG10201914098YA (ko)
WO (1) WO2012138887A1 (ko)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014511697A (ja) 2011-04-05 2014-05-19 ザ スクリプス リサーチ インスティチュート 染色体のランディングパッドおよび関連使用
BR112015031639A2 (pt) * 2013-06-19 2019-09-03 Sigma Aldrich Co Llc integração alvo
MX2017005306A (es) 2014-10-23 2018-01-09 Regeneron Pharma Novedosos sitios de integracion en celulas cho y usos de estos.
CN107636148A (zh) * 2015-04-13 2018-01-26 哈佛学院董事及会员团体 细胞中代谢物的生产和检测
CL2016001661A1 (es) 2016-06-29 2017-03-03 Univ Chile Promotor hibrido de ß-actina (de cricetulus griseus) y citomegalovirus (cmv), con región rica en dinucleótidos, citosina-guanina, vectores, líneas celulares, procedimiento para producir proteínas recombinantes.
US20210309988A1 (en) * 2017-02-07 2021-10-07 Sigma-Aldrich Co. Llc Stable targeted integration
CN111372946B (zh) * 2017-02-17 2024-08-13 隆萨有限公司 难以表达的蛋白质的多位点特异性整合细胞
GB201703418D0 (en) * 2017-03-03 2017-04-19 Ge Healthcare Bio Sciences Ab Method for cell line development
US12058986B2 (en) 2017-04-20 2024-08-13 Egenesis, Inc. Method for generating a genetically modified pig with inactivated porcine endogenous retrovirus (PERV) elements
US20210246455A1 (en) * 2017-05-16 2021-08-12 Cairn Biosciences, Inc. Multiplex assay
GB201712678D0 (en) * 2017-08-07 2017-09-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa Process for the manipulation of nucleic acids
EP3837371A2 (en) * 2018-08-18 2021-06-23 Cairn Biosciences, Inc. Stem cell derived lineage barcoding
CA3134705A1 (en) * 2019-04-02 2020-10-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of introducing target-specific foreign gene
SG11202111525XA (en) * 2019-04-18 2021-11-29 Sigma Aldrich Co Llc Stable targeted integration
CA3157472A1 (en) * 2019-10-09 2021-04-15 The Jackson Laboratory High frequency targeted animal transgenesis
GB202019484D0 (en) * 2020-12-10 2021-01-27 Univ Edinburgh CHO cell modification
EP4416279A1 (en) 2021-10-14 2024-08-21 Asimov, Inc. Integrases, landing pad architectures, and engineered cells comprising the same
WO2023086822A2 (en) 2021-11-09 2023-05-19 Asimov Inc. Stable production systems for aav vector production
CN113999873B (zh) * 2021-12-31 2022-05-20 北京市疾病预防控制中心 一种基因修饰的非人动物的构建方法及其应用
WO2024211287A1 (en) * 2023-04-03 2024-10-10 Seagen Inc. Production cell lines with targeted integration sites

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100168016A1 (en) 2007-04-11 2010-07-01 The Jackson Laboratory Diagnosis and treatment of diseases caused by misfolded proteins

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5175385A (en) 1987-09-03 1992-12-29 Ohio University/Edison Animal Biotechnolgy Center Virus-resistant transgenic mice
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
JP2014511697A (ja) 2011-04-05 2014-05-19 ザ スクリプス リサーチ インスティチュート 染色体のランディングパッドおよび関連使用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100168016A1 (en) 2007-04-11 2010-07-01 The Jackson Laboratory Diagnosis and treatment of diseases caused by misfolded proteins

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Current Opinion in Biotechnology, Vol.18, pp.411-419 (2007)
Methods in Molecular Biology, Vol.308, pp.99-106 (2005)
Stem Cells, Vol.26, pp.119-126 (2008)*
The Journal of Cell Biology, Vol.143, No.5, pp.1305-1315 (1998)*

Also Published As

Publication number Publication date
JP2018011602A (ja) 2018-01-25
US20150152437A1 (en) 2015-06-04
JP6441425B2 (ja) 2018-12-19
JP2014511697A (ja) 2014-05-19
US10017786B2 (en) 2018-07-10
CN103597083A (zh) 2014-02-19
CA2832095A1 (en) 2012-10-11
CN105969807A (zh) 2016-09-28
SG10201602663RA (en) 2016-05-30
AU2012240164A1 (en) 2013-11-14
SG194118A1 (en) 2013-11-29
KR20140019430A (ko) 2014-02-14
EP2694661A1 (en) 2014-02-12
WO2012138887A1 (en) 2012-10-11
SG10201914098YA (en) 2020-02-27
US20120258541A1 (en) 2012-10-11
US8980579B2 (en) 2015-03-17
CN103597083B (zh) 2016-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101999410B1 (ko) 염색체 랜딩 패드 및 관련된 용도
AU2023274083A1 (en) Compositions and methods for treating non-age-associated hearing impairment in a human subject
KR20210049859A (ko) 게놈을 조절하는 방법 및 조성물
KR20230053735A (ko) 게놈의 조정을 위한 개선된 방법 및 조성물
AU2016376191A1 (en) Materials and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis and/or frontal temporal lobular degeneration
KR20200045517A (ko) 병태 및 질환 치료용 안티센스 올리고머
AU2016364667A1 (en) Materials and methods for treatment of Alpha-1 antitrypsin deficiency
KR20200126997A (ko) 인간 대상체에서의 비-노화-관련 청각 손상의 치료를 위한 조성물 및 방법
KR20210138587A (ko) 개선된 면역요법을 위한 조합 유전자 표적
CN107267524A (zh) 用于基因打靶和性状堆叠的工程化转基因整合平台(etip)
KR20220002609A (ko) 포유동물 세포의 특성을 변경하기 위한 인공 마이크로-rna 및 이들 생성물의 조성물을 사용한 포유동물 세포의 변형
CN107267482A (zh) 作为前列腺癌标志物的磷酸二酯酶4d7
AU2022200784B2 (en) Non-human animal exhibiting diminished upper and lower motor neuron function and sensory perception
KR20080096495A (ko) 소과 동물에서 배최장근 최대력, 근내 지방, 식용우소매유통 생산량 및 순 사료 섭취량으로부터 선택된 형질을평가하는 방법
KR20230034198A (ko) 종양 침윤 림프구의 활성화 및 확장 방법
KR101621273B1 (ko) 카텝신 ｃ의 용도
KR20220157944A (ko) 인간 대상체에서 비-연령-연관 청각 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법
KR20210107057A (ko) 핵산의 표적화 통합
KR101980815B1 (ko) 소의 도체형질 판별용 단일염기다형성 마커 및 이의 용도
KR20210065125A (ko) 인간의 앤젤만 증후군에서 부계 ube3a 유전자 발현을 복원하기 위한 조성물 및 방법
KR20220025806A (ko) 핵산의 무작위 구성 표적화 통합
KR20230027043A (ko) 핵산의 표적화 통합
CN115151558A (zh) 哺乳动物序列中的靶向整合增强基因表达
AU2012337708B2 (en) Marker for diagnosing forelimb-girdle muscular anomaly in mammal individual, and detection method using same
KR102545031B1 (ko) C3 사구체병증 모델로서의 보체 인자 h 유전자 녹아웃 래트

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)