JP6441425B2 - 染色体のランディングパッドおよび関連使用 - Google Patents
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Description
本出願は、米国特許法第119条の下で2011年4月5日に出願された米国仮特許出願第61/516,612号の優先権の利益を主張する。前述の出願日の優先権が、本明細書によって主張され、仮特許出願の開示内容は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
本出願は、EFS webによって電子的に本明細書とともに提出された配列表の電子的に等価なハードコピーおよびEFS webによって電子的に本明細書とともに提出された配列表のコンピュータによって読み取り可能な形式を含有し、213476バイトの大きさであり、2012年4月5日に作成され、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる「37651505001WOSEQUENCELISTING.txt」と名づけられたファイルを含有する。
組換え遺伝子の強力な転写活性および組換えコンストラクトの部位特異的組込みのための「ランディングパッド」としてのその使用を可能にする哺乳類細胞中の天然染色体部位が、本明細書において開示される。具体的には、組み込まれた外来遺伝子の強力な発現を促進する、哺乳類ゲノム(例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)ゲノム)中のいくつかの遺伝子中の染色体位置を同定した。以下に記載されるように、これらの天然染色体の挿入部位の同定は、選択のための遺伝子(例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子および増強された緑色蛍光タンパク質、EGFPをコードする遺伝子)を含有するプラスミドのゲノムへの無作為の組込みを含んでいた。無作為の組込みの際、細胞を、最初のトランスフェクションの3週間後に、ハイグロマイシン耐性について選択し、蛍光活性化セルソーティング(Fluorescent Activated Cell Sorting(FACS)を使用してEGFP発現について選別した。選択した細胞を、さらに数週間、選択せずに回復させ、増殖させた。次いで、細胞を、再度FACS選別した。最高EGFPレベルを有する細胞を、96ウェルプレートの個々のウェルに選別した。単細胞からクローンを増殖させ、数週間培養した。次いで、細胞を、EGFP発現について再試験した。親の細胞株の増殖速度に匹敵するか、またはそれより高い増殖速度を有するものを同定するために、細胞をさらにスクリーニングした。次いで、これらの遺伝子中の挿入部位の配列を分析した。これらの研究の結果、組換え遺伝子からの安定な、強力な転写活性を可能にする天然染色体部位を有するいくつかの遺伝子、アンキリン2遺伝子(Ank2)、切断およびポリアデニル化特異的因子4遺伝子(Cpsf4)、C−Mos遺伝子およびネフロシスチン−1/Mal遺伝子が同定された。
別に定義されることのない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および化学用語は、この開示内容が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。以下の参考文献は、当業者に、本開示内容において使用される用語の多くの一般的な定義を提供する:Academic Press Dictionary of Science and Technology, Morris (ed.), Academic Press (1st ed., 1992); Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Smith et al.(Eds.), Oxford University Press (revised ed., 2000); Encyclopaedic Dictionary of Chemistry, Kumar (Ed.), Anmol Publications Pvt. Ltd. (2002); Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Singleton et al. (Eds.), John Wiley & Sons (3rd ed., 2002); Dictionary of Chemistry, Hunt (Ed.), Routledge (1st ed., 1999); Dictionary of Pharmaceutical Medicine, Nahler (Ed.), Springer-Verlag Telos (1994); Dictionary of Organic Chemistry, Kumar and Anandand (Eds.), Anmol Publications Pvt. Ltd. (2002);およびA Dictionary of Biology (Oxford Paperback Reference), Martin and Hine (Eds.), Oxford University Press (4th ed., 2000)。本開示内容に具体的に適用する場合のこれらの用語の一部のさらなる説明が本明細書において提供される。
挿入された異種ポリヌクレオチド(外因性遺伝子または導入遺伝子)の安定な、効率的な発現を支援する天然染色体の組込み部位を含有するいくつかの特定の遺伝子が、本明細書に記載される。これらの天然染色体の組込み部位は、宿主細胞における異種ポリヌクレオチドの安定な組込みおよび/または発現に適している。例えば、有用なポリペプチド(例えば、治療用または産業用タンパク質)をコードする導入遺伝子または組換え遺伝子は、宿主細胞においてそのように組み込まれ、発現され得る。さらに、これらの部位は、宿主ゲノムへの部位特異的組換え配列(染色体のランディングパッド)の挿入のために使用され得る。このように挿入された染色体のランディングパッドを有する宿主細胞は、順に、異種ポリヌクレオチドの挿入および発現のために使用できる。
一態様では、相同組換えによって異種ポリヌクレオチドを天然染色体の組込み部位に安定に組み込むための方法および組成物が開示される。異種ポリヌクレオチド(導入遺伝子または部位特異的組換え配列)を、本明細書に記載される天然染色体の組込み部位または特定の染色体位置で宿主ゲノム中に挿入するための、ポリヌクレオチド分子およびベクター(「挿入ベクター」)が、本明細書において提供される。ポリヌクレオチドおよび/または挿入ベクターは、通常、異種ポリヌクレオチド配列(例えば、組換え遺伝子または染色体のランディングパッド)、第1の相同性アームおよび第2の相同性アームを含む。ポリヌクレオチドまたはベクターは、さらにまた、陽性および/または陰性選択のためのマーカー遺伝子または配列を含み得る。
本明細書において開示される天然染色体の組込み部位の1つまたは複数で、ゲノム中に安定に組み込まれている異種ポリヌクレオチド(組換え遺伝子または染色体のランディングパッド)を含有する、組換えまたは遺伝子操作された宿主細胞が、本明細書において提供される。組換え遺伝子が開示された部位で組み込まれた細胞は、その遺伝子によってコードされるポリペプチドの安定な強力な発現が可能となる。染色体のランディングパッドが組み込まれた細胞は、標的ポリヌクレオチドまたは対象とする遺伝子の効率的な部位特異的組込みおよび/または発現が可能となる。遺伝子操作された宿主細胞はまた、以下に説明されるように、このような挿入された染色体のランディングパッドを有し、次いで、ランディングパッド中に組み込まれた1種または複数の導入遺伝子を有する細胞を含み得る。ポリヌクレオチド分子を使用することまたは上記のベクターを挿入することによって、種々の細胞が、本明細書に記載される特定の染色体位置の1つまたは複数で、組換え遺伝子または染色体のランディングパッドを挿入することによって修飾され得る。
上記のように、ポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチドまたは導入遺伝子(すなわち、「対象とするポリヌクレオチド」または「対象とする遺伝子」)は、本明細書において開示される天然染色体の組込み部位に直接的に組み込まれ得る。以下に記載される治療用または産業用タンパク質のいずれかの安定な効率のよい発現および製造は、この方法で達成され得る。あるいは、標的ポリヌクレオチドは、本明細書に開示される天然染色体の組込み部位にすでに挿入されている染色体のランディングパッドによって宿主ゲノム中に組み込まれ得る。本明細書に記載された染色体のランディングパッドを有する遺伝子操作された宿主細胞を使用して、細胞において異種ポリヌクレオチドまたは導入遺伝子を組み込み、発現させるためのベクター(「ターゲッティングベクター」)および方法も提供される。種々の有用な標的ポリペプチドをコードする対象とするポリヌクレオチドは、本明細書において記載された遺伝子操作された宿主細胞のゲノム中に安定に組み込まれ得る。対象とするポリヌクレオチドは、宿主細胞にとって内因性または外因性のいずれかであり得る。外因性ポリヌクレオチドとは、宿主細胞中に天然に存在しない配列を有する核酸分子であるのに対し、内因性ポリヌクレオチドは、宿主細胞中に予め存在する配列を有する核酸分子である。発現され得るタンパク質またはポリペプチドの多数の具体的な例は、以下に記載される。
上記の遺伝子操作された宿主細胞は、対象とする任意のポリヌクレオチドの安定な発現のために有用である。対象とするポリヌクレオチドは、医学的または産業上の適用を有する種々のポリペプチドをコードし得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された宿主細胞中のランディングパッド中に組み込まれるべき、対象とする標的ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、治療用タンパク質をコードするものであり得る。治療用タンパク質の例として、因子VIII、因子IX、β−グロビン、低密度リポタンパク質受容体、アデノシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、α−アンチトリプシン、CD−18、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンセターゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ、グルコース6−ホスファターゼ、α−L−フコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、α−L−イズロニダーゼ、ガラクトース1−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、インターロイキン、サイトカイン、小ペプチドなどが挙げられる。遺伝子操作された宿主細胞において組み込まれた標的ポリヌクレオチドから発現され得るその他の治療用タンパク質として、例えば、ヘルセプチン(登録商標)、疾患を引き起こす細菌またはウイルスなどの種々の病原体のポリペプチド抗原(例えば、大腸菌、緑膿菌(P.aeruginosa)、黄色ブドウ球菌(S.aureus)、マラリア、HIV、狂犬病ウイルス、HBVおよびサイトメガロウイルス)ならびにラクトフェリン、チオレドキシンおよびβ−カゼインワクチン(caseinvaccines)などのその他のタンパク質を挙げることができる。
上記の遺伝子操作された宿主細胞を使用するためのキットが本明細書において提供される。キットは、当業者が、本明細書に開示された1つまたは複数の天然染色体の組込み部位で、標的導入遺伝子または挿入された染色体のランディングパッドを有する遺伝子操作された宿主細胞において、異種ポリヌクレオチドを、部位特異的に組込みおよび/または発現させることを可能にする。本明細書に記載された一部のキットは、ゲノム中の天然染色体の組込み部位で直接的に挿入された標的ポリヌクレオチドを有する、遺伝子操作された宿主細胞(例えば、CHO細胞)を含有する。一部のその他のキットは、ゲノム中の天然染色体の組込み部位に事前に組み込まれている、1つまたは複数の染色体のランディングパッドに挿入された標的ポリヌクレオチドを有する遺伝子操作された宿主細胞を含有する。本明細書に記載されたさらに一部のその他のキットは、1つまたは複数の天然染色体の組込み部位に染色体のランディングパッドが挿入された組換え細胞および標的ポリヌクレオチドを、染色体のランディングパッド(lads)中に挿入するためのその他の試薬を含有する。
CHOゲノムへの無作為の組込みのためのプラスミド:プラスミドは、Thyagarajan et al., (2001, Mol Cell Biol. 21(12):3926-34)に記載された元のattP含有プラスミドをベースとして修飾した。具体的には、元のプラスミドを、ゼオシンマーカーを、ネオマイシンマーカーと置換するよう修飾した。さらに、ホタルルシフェラーゼ遺伝子をSV40プロモーターによって制御されているEGFP遺伝子と置換した(図1)。
相同組換え:組込み部位をフランキングするゲノムDNAを同定し、陽性および陰性選択マーカーの両方を含有するプラスミド中にクローニングした(図2)。各部位について、長いほうの相同性アーム(3〜4kbの長さ)を、ネオマイシン耐性遺伝子の5’にクローニングする。短いほうの相同性アーム(1.5〜2kbの長さ)を、ネオマイシン耐性遺伝子の3’にクローニングする。1つの単一ファージ結合部位attPは、長いほうの相同性アームの末端に位置している。
Claims (36)
- 得られた宿主細胞における異種ポリヌクレオチドの安定な組込みおよび発現のための方
法であって、アンキリン2遺伝子(Ank2)のチャイニーズハムスター卵巣(CHO)
細胞において配列番号1の位置130〜131、またはその他の哺乳類細胞において配列
番号1の位置130〜131に対応する位置であるか、またはそれに約1kb未満内に位
置する天然染色体部位で、異種ポリヌクレオチドを宿主細胞のゲノム中に挿入し、天然染
色体部位で異種ポリヌクレオチドを組み込むことを含む、方法。 - 異種ポリヌクレオチドの挿入が、相同組換えによってか、またはハイブリッドリコンビ
ナーゼによって媒介される、請求項1に記載の方法。 - 宿主細胞が、哺乳類細胞である、請求項1に記載の方法。
- 宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、請求項1に記載の方
法。 - 異種ポリヌクレオチドが、ポリペプチドをコードする、請求項1に記載の方法。
- ポリペプチドが、治療用タンパク質または産業用タンパク質である、請求項5に記載の
方法。 - 哺乳類細胞のゲノム中に異種ポリヌクレオチド配列を安定に組み込むための組換えポリ
ヌクレオチドであって、
第1の相同性アームと、異種ポリヌクレオチド配列と、第2の相同性アームとを含み、
ここで、第1および第2の相同性アームが、それぞれ、アンキリン2遺伝子(Ank2
)のチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞において配列番号1の位置130〜13
1、またはその他の哺乳類細胞において配列番号1の位置130〜131に対応する位置
であるか、またはそれに約1kb未満内に位置する天然染色体の挿入部位をフランキング
する、5’−および3’−配列と実質的に同一である、組換えポリヌクレオチド。 - 天然染色体の挿入部位が、外来遺伝子の安定な組込みを支援する、請求項7に記載のポ
リヌクレオチド。 - 異種ポリヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコードする、請求項7に記載のポリヌク
レオチド。 - ポリペプチドが、治療用タンパク質または産業用タンパク質である、請求項9に記載のポリヌクレオチド。
- 異種ポリヌクレオチド配列が、部位特異的組換え配列(染色体のランディングパッド)
を含む、請求項7に記載のポリヌクレオチド。 - 部位特異的組換え配列が、ファージインテグラーゼによって認識される認識配列である
、請求項11に記載のポリヌクレオチド。 - ファージインテグラーゼが、phiC−31インテグラーゼである、請求項12に記載
のポリヌクレオチド。 - 認識配列が、ファージインテグラーゼによって認識されるattP部位またはattB
部位である、請求項12に記載のポリヌクレオチド。 - 哺乳類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、請求項7に記載の
ポリヌクレオチド。 - 請求項7に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター。
- アンキリン2遺伝子(Ank2)のチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞におい
て配列番号1の位置130〜131、またはその他の哺乳類細胞において配列番号1の位
置130〜131に対応する位置であるか、またはそれに約1kb未満内に位置する1つ
または複数の天然染色体の挿入部位で、そのゲノム中に安定に組み込まれる異種ポリヌク
レオチドを含む、遺伝子操作された哺乳類細胞。 - 天然染色体の挿入部位が、外来遺伝子の安定な組込みを支援する、請求項17に記載の
細胞。 - 異種ポリヌクレオチドが、ポリペプチドをコードする、請求項17に記載の細胞。
- ポリペプチドが、治療用タンパク質または産業用タンパク質である、請求項19に記載
の細胞。 - 異種ポリヌクレオチドが、部位特異的組換え配列(染色体のランディングパッド)を含
む、請求項17に記載の細胞。 - 部位特異的組換え配列が、ファージインテグラーゼによって認識される認識配列である
、請求項21に記載の細胞。 - ファージインテグラーゼが、phiC−31インテグラーゼである、請求項22に記載
の細胞。 - 認識配列が、ファージインテグラーゼによって認識されるattP部位またはattB
部位である、請求項22に記載の細胞。 - チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、請求項17に記載の細胞。
- 異種ポリヌクレオチドを、得られた哺乳類細胞のゲノム中に安定に組み込むための方法
であって、
(a)細胞のゲノム中に部位特異的組換え配列を挿入することであって、挿入位置は、
アンキリン2遺伝子(Ank2)のチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞において
配列番号1の位置130〜131、またはその他の哺乳類細胞において配列番号1の位置
130〜131に対応する位置であるか、またはそれに約1kb未満内に位置する天然染
色体の挿入部位である、挿入することと、
(b)挿入された部位特異的組換え配列で、異種ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に
相同組換えによって組み込むことと
を含む、方法。 - 天然染色体の挿入部位が、外来遺伝子の安定な組込みを支援する、請求項26に記載の
方法。 - 部位特異的組換え配列が、ファージインテグラーゼによって認識される第1の認識配列
である、請求項26に記載の方法。 - ファージインテグラーゼが、phiC−31インテグラーゼである、請求項28に記載
の方法。 - 第1の認識配列が、attP部位またはattB部位である、請求項28に記載の方法
。 - 異種ポリヌクレオチドが、第1の認識配列と同族であるファージインテグラーゼの第2
の認識配列と結合している、請求項28に記載の方法。 - 第2の認識配列が、attB部位またはattP部位である、請求項31に記載の方法
。 - 細胞が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、請求項26に記載の方法
。 - 異種ポリヌクレオチドが、プロモーター配列と作動可能に連結している、標的ポリペプ
チドをコードする配列を含む、請求項26に記載の方法。 - 組込みが、ファージインテグラーゼの存在下で生じる、請求項28に記載の方法。
- ファージインテグラーゼが、細胞に導入されたベクターから発現される、請求項35に
記載の方法。
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