KR20140019430A - 염색체 랜딩 패드 및 관련된 용도 - Google Patents

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Abstract

본원에서는 숙주 세포에서 하나 이상의 재조합 폴리뉴클레오티드를 안정하게 통합 및/또는 발현시키는 방법을 제공한다. 재조합 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 일부 천연 염색체 통합 부위에서 숙주 게놈 내로 통합된다. 통합은 특이적 염색체 위치를 표적화하는 하이브리드 리콤비나제를 사용함으로써, 또는 상동성 재조합에 의해 매개될 수 있다. 외래 유전자의 안정한 통합 및 강력한 전사 활성을 지지하는 숙주 세포 내의 천연 염색체 통합 부위는 CHO 게놈 중의 특이적 유전자인, 안키린 2 유전자 (Ank2), 절단 및 폴리아데닐화 특이적 인자 4 유전자 (Cpsf4), C-Mos 유전자 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자 내에 또는 그에 인접하게 존재한다. 부위-특이적 재조합 서열 (염색체 랜딩 패드)을 상기 특이적 염색체 위치 내로 삽입하기 위한 방법 및 핵산 분자 또한 제공한다. 천연 염색체 통합 부위 내로 통합된 염색체 랜딩 패드 또는 트랜스진을 함유하는 조작된 숙주 세포를 추가로 제공한다. 삽입된 염색체 랜딩 패드를 보유하는 숙주 세포에서 이종성 폴리뉴클레오티드를 통합시키고 발현시키기 위한 방법 및 조성물 (예컨대, 키트)을 추가로 제공한다.

Description

염색체 랜딩 패드 및 관련된 용도 {CHROMOSOMAL LANDING PADS AND RELATED USES}
우선권 서류에 대한 참조
본 출원은 35 U.S.C. §119(e)하에 2011년 4월 5일 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 61/516,612를 우선권 주장한다. 상기 언급된 출원일의 우선권은 본원에서 주장하는 바와 같고, 이 가특허 출원의 개시내용은 그 전문이 본원에서 참고로 포함된다.
서열 목록 포함
본 출원은 EFS 웹을 통해 본 명세서와 함께 전자 제출된 서열 목록의 전자 등가 서류 사본 및 EFS 웹을 통해 본 명세서와 함께 전자 제출된 컴퓨터 판독 가능한 형태의 서열 목록을 포함하고, 2012년 4월 5일 작성된 213476 바이트 크기의 파일명이 "37651505001 WOSEQUENCELISTING.txt"인 파일을 포함하며, 이는 그의 전문이 본원에서 참고로 포함된다.
이종성 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포의 게놈 내로 통합하는 것은 치료학적 목적을 위해 (예컨대, 유전자 요법), 및 시험관내에서 유용한 단백질 또는 폴리펩티드를 제조하는 데 통상 실시된다. 비상동성 재조합에 의해 게놈 중의 무작위 위치에 삽입하기 위해서는 선별 및 클론 확장을 수회에 걸쳐 수행함으로써 허용되는 발현 시스템을 제조하여야 한다. 상기 접근법은 또한 새 유전자에 대한 발현 시스템이 요구될 때마다 매번 반복되어야 한다. 무작위적인 통합 이벤트의 성질에 기인하여, 재조합 유전자가 삽입되는 위치 중 일부는 전사 이벤트를 전혀 지지하지 못한다. 이는 발현 수준이 유전자좌의 국소 유전적 환경의 효과 (위치 효과)에 의해 크게 영향을 받기 때문이다. 추가로, 많은 염색체 부위로부터의 발현은 시간이 경과함에 따라 감소한다. 일부 경우에서, 이러한 불안정성은 트랜스진의 DNA 메틸화에 기인한다. 그 결과, 통합된 유전자의 발현 수준은 통합 부위에 따라 큰 폭의 차이를 보인다. 추가로, 일부 경우에서 외인성 DNA의 게놈 내로의 무작위적인 통합은 중요한 세포 유전자를 파괴시킬 수 있고, 이로써, 표현형은 변경될 수 있다.
무작위 삽입 이외에도, 게놈 중의 정의된 부위에 트랜스진을 통합하기 위한 것으로 리콤비나제-매개 통합이 기술된 바 있다. 그러나, 통합된 트랜스진을 안정하게 고효율로 발현시키는 것은 여전히 번거로우며, 원하는 통합된 세포를 선별하기 위해서는 스크리닝된 클론들 다수가 필요하다.
당업계에서는 포유동물 세포에서 이종성 폴리뉴클레오티드를 안정하게 통합시키고/거나, 고수준으로 유전자를 발현시키기 위한 수단이 요구되고 있다. 본 개시내용은 이러한 요구 등을 다룬다.
개요
한 측면에서, 숙주 세포에서 이종성 폴리뉴클레오티드를 안정하게 통합시키고 발현시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 안키린 2 유전자 (Ank2), 절단 및 폴리아데닐화 특이적 인자 4 유전자 (Cpsf4), C-Mos 유전자 및 네프로시스틴(Nephrocystin)-1/Mal 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 내에 또는 그에 인접하게 위치하는 천연 염색체 부위에서 숙주 세포의 게놈 내로 이종성 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 것을 포함한다. 일부 방법에서, 이종성 폴리뉴클레오티드를 숙주 게놈 내로 삽입하는 것은 상동성 재조합에 의해 또는 하이브리드 리콤비나제(hybrid recombinase)에 의해 매개된다. 일부 방법에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 상기 방법 중 일부에서, 천연 염색체 삽입 부위는 Ank2 유전자의 경우 서열 번호 1의 130-131번 위치, Cpsf4 유전자의 경우 서열 번호 2의 629-630번 위치, C-Mos 유전자의 경우 서열 번호 3의 272-273번 위치, 또는 네프로시스틴-1/Mal 유전자의 경우 서열 번호 4의 239-240번 위치에 또는 그에 가깝게 존재한다. 일부 방법에서, 숙주 게놈 내로 통합시키고자 하는 이종성 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드, 예컨대 치료용 단백질 또는 산업용 단백질을 코딩할 수 있다.
관련된 측면에서, 이종성 폴리뉴클레오티드 서열을 포유동물 세포의 게놈 내로 안정하게 통합시키기 위한 재조합 또는 조작된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 재조합 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 제1 상동성 아암(arm), 이종성 폴리뉴클레오티드 서열, 및 제2 상동성 아암을 함유한다. 제1 및 제2 상동성 아암은 각각, 안키린 2 유전자 (Ank2), 절단 및 폴리아데닐화 특이적 인자 4 유전자 (Cpsf4), C-Mos 유전자 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 내에 또는 그에 인접하게 위치하는 천연 염색체 삽입 부위의 측면에 위치하는 5'- 및 3'-서열과 실질적으로 동일하다. 전형적으로, 천연 염색체 삽입 부위는 외래 유전자의 안정한 통합을 지지할 수 있다. 일부 방법에서, 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드, 예컨대 치료용 단백질 또는 산업용 단백질을 코딩한다. 일부 다른 방법에서, 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 부위-특이적 재조합 서열 (염색체 랜딩 패드(chromosomal landing pad))을 포함한다. 예를 들어, 부위-특이적 재조합 서열은 파지 인테그라제(phage integrase)에 의해 인식되는 인식 서열, 예컨대 phiC-31 파지 인테그라제에 의해 인식되는 attP 부위 또는 attB 부위일 수 있다. 일부 방법에서, 숙주 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 상기 방법에서, 천연 염색체 삽입 부위는 Ank2 유전자의 경우 서열 번호 1의 130-131번 위치, Cpsf4 유전자의 경우 서열 번호 2의 629-630번 위치, C-Mos 유전자의 경우 서열 번호 3의 272-273번 위치, 또는 네프로시스틴-1/Mal 유전자의 경우 서열 번호 4의 239-240번 위치에 또는 그에 가깝게 위치할 수 있다. 관련된 실시양태에서, 재조합 또는 조작된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터 또한 본 발명에서 제공한다.
또 다른 측면에서, 조작된 포유동물 세포를 제공한다. 세포는 안키린 2 유전자 (Ank2), 절단 및 폴리아데닐화 특이적 인자 4 유전자 (Cpsf4), C-Mos 유전자 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 내에 또는 그에 인접하게 위치하는 하나 이상의 천연 염색체 삽입 부위에서 그의 게놈 내로 안정하게 통합되어 있는 이종성 폴리뉴클레오티드를 보유한다. 전형적으로, 선택된 천연 염색체 삽입 부위는 외래 유전자의 안정한 통합을 지지한다. 상기 방법 중 일부에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드, 예컨대 치료용 단백질 또는 산업용 단백질을 코딩한다. 일부 다른 방법에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 부위-특이적 재조합 서열 (염색체 랜딩 패드)을 함유한다. 예를 들어, 부위-특이적 재조합 서열은 파지 인테그라제에 의해 인식되는 인식 서열, 예컨대 phiC-31 파지 인테그라제에 의해 인식되는 attP 부위 또는 attB 부위일 수 있다. 일부 바람직한 실시양태는 재조합 또는 조작된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에 관한 것이다. 상기 실시양태에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 Ank2 유전자의 경우 서열 번호 1의 130-131번 위치, Cpsf4 유전자의 경우 서열 번호 2의 629-630번 위치, C-Mos 유전자의 경우 서열 번호 3의 272-273번 위치, 또는 네프로시스틴-1/Mal 유전자의 경우 서열 번호 4의 239-240번 위치에서 또는 그에 가깝게 통합될 수 있다.
추가의 또 다른 관련된 측면에서, 이종성 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포의 게놈 내로 안정하게 통합시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 부위-특이적 재조합 서열을 세포의 게놈 내로 삽입시키는 단계로서, 여기서 삽입은 안키린 2 유전자 (Ank2), 절단 및 폴리아데닐화 특이적 인자 4 유전자 (Cpsf4), C-Mos 유전자 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 내에 또는 그에 인접하게 위치하는 천연 염색체 삽입 부위에서 이루어지는 것인 단계; 및 (b) 이종성 폴리뉴클레오티드를 삽입된 부위-특이적 재조합 서열에서 세포의 게놈 내로 상동성 재조합에 의해 통합시키는 단계를 수반한다. 본 방법을 위해 선택된 천연 염색체 삽입 부위는 전형적으로 외래 유전자의 안정한 통합을 지지한다. 일부 방법에서, 부위-특이적 재조합 서열은 파지 인테그라제에 의해 인식되는 제1 인식 서열, 예컨대 phiC-31 파지 인테그라제의 attP 부위 또는 attB 부위이다. 상기 방법에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 예컨대, 파지 인테그라제에 의해 인식되는 attB 부위 또는 attP 부위와 같이, 제1 인식 서열과 동족인 파지 인테그라제의 제2 인식 서열에 부착된다. 일부 방법에서, 사용되는 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 상기 방법에서, 부위-특이적 재조합 서열은 바람직하게 Ank2 유전자의 경우 서열 번호 1의 130-131번 위치, Cpsf4 유전자의 경우 서열 번호 2의 629-630번 위치, C-Mos 유전자의 경우 서열 번호 3의 272-273번 위치, 또는 네프로시스틴-1/Mal 유전자의 경우 서열 번호 4의 239-240번 위치에서 또는 그에 가깝게 게놈 내로 삽입될 수 있다. 일부 방법에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 표적 폴리펩티드-코딩 서열을 함유한다. 전형적으로, 이종성 폴리뉴클레오티드의 숙주 게놈 내로의 통합은 파지 인테그라제의 존재하에서 이루어진다. 상기 방법 중 일부에서, 파지 인테그라제는 세포 내로 도입된 벡터로부터 발현될 수 있다.
명세서의 나머지 부분과 특허청구범위를 참고함으로써 본 발명의 성질 및 장점에 관해 추가로 이해할 수 있다.
도 1은 강력한 전사 활성을 지지하는 천연 염색체 삽입 부위를 확인하기 위해 CHO 게놈 내로 무작위적으로 통합하는 데 사용되는 플라스미드의 구조를 보여주는 다이어그램이다. 플라스미드는 sv40 프로모터 구동 EGFP 발현 카세트를 함유한다. BamHI 부위는 (안정한 통합 이전에 선형화를 위해) EGFP와 히그로마이신 저항성 유전자 사이에 위치한다.
도 2는 CHO 게놈 중 확인된 천연 염색체 삽입 부위 내로 attP 부위를 도입하는 데 사용되는 플라스미드를 도시한 것이다. attP 부위는 Neo 유전자의 5'에 위치한다. 좌측-상동성 아암은 attP 및 Neo 유전자의 5'에서 클로닝되고; 우측-상동성 아암은 Neo 유전자의 3'에서 클로닝된다. HSV-TK 유전자는 음성 선별을 위해 사용된다. 제시된 서열은 phi-C31 파지 인테그라제에 의해 인식되는 attP 및 attB 부위의 이중 가닥 서열이다: attP (서열 번호 5 및 서열 번호 6), attB (서열 번호 7 및 서열 번호 8).
도 3은 CHO 세포 게놈의 안키린 2 (Ank2) 유전자 중 천연 염색체 삽입 부위 및 측면에 위치하는 서열 (서열 번호 1)을 보여주는 것이다
도 4는 CHO 세포 게놈의 절단 및 폴리아데닐화 특이적 인자 4 (Cpsf4) 유전자 중 천연 염색체 삽입 부위 및 측면에 위치하는 서열 (서열 번호 2)을 보여주는 것이다.
도 5는 CHO 세포 게놈의 C-Mos 유전자 중 천연 염색체 삽입 부위 및 측면에 위치하는 서열 (서열 번호 3)을 보여주는 것이다.
도 6은 CHO 세포 게놈의 네프로시스틴-1/Mal 유전자 중 천연 염색체 삽입 부위 및 측면에 위치하는 서열 (서열 번호 4)을 보여주는 것이다.
상세한 설명
I. 개관
본원에서는 재조합 유전자의 강력한 전사 활성을 수행할 수 있는 포유동물 세포 중의 천연 염색체 부위, 및 재조합 구축물의 부위-특이적 통합을 위한 "랜딩 패드"로서의 그의 용도를 개시한다. 구체적으로, 통합된 외래 유전자의 강력한 발현을 촉진시키는 포유동물 게놈 (예컨대, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 게놈) 중 여러 유전자 중의 염색체 위치를 확인하였다. 하기 기술하는 바와 같이, 이러한 천연 염색체 삽입 부위를 확인하는 것은 선별용 유전자 (예컨대, 히그로마이신-저항성 유전자 및 증강된 녹색 형광 단백질, EGFP을 코딩하는 유전자)를 함유하는 플라스미드의 게놈 내로 무작위적으로 통합시키는 것을 포함하였다. 무작위 통합시, 세포를 히그로마이신-저항에 대해 선별하고, 초기 형질감염 후 3주째에 형광 활성 세포 분류법 (FACS)을 사용하여 EGFP 발현에 대해 분류하였다. 선별된 세포를 회수하고, 선별 없이 수주 더 성장시켰다. 이어서, 세포를 다시 FACS 분류하였다. EGFP 수준이 가장 높은 세포를 96-웰 플레이트 중 개별 웰로 분류하였다. 클론을 단일 세포로부터 성장시키고, 수주 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 EGFP 발현에 대해 다시 시험하였다. 성장 속도가 모체 세포주의 성장 속도와 유사하거나, 그보다 더 높은 것을 확인하기 위해 세포를 추가로 스크리닝하였다. 이어서, 상기 유전자 중의 삽입 부위의 서열을 분석하였다. 상기 연구를 통해, 재조합 유전자로부터 안정적이고 강력한 전사 활성을 수행할 수 있는 천연 염색체 부위를 보유하는 수개의 유전자, 안키린 2 유전자 (Ank2), 절단 및 폴리아데닐화 특이적 인자 4 유전자 (Cpsf4), C-Mos 유전자 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자를 확인할 수 있었다.
본원에서는 또한 원하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 균일하게 통합하기 위한 염색체 랜딩 패드로서의 천연 염색체 부위를 확인하는 것도 기술한다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 파지 인테그라제에 의해 인식되는 파지 부착 부위 attP를 상동성 재조합을 통해 천연 염색체 부위 내로 도입한다. 부위-특이적 재조합 서열 (즉, attP 부위)이 게놈 내로 삽입되어 있다면, 이때, 재조합 유전자는 파지 인테그라제의 존재하에서 파지 인테그라제 (예컨대, phiC-31 파지 인테그라제)에 의해 인식되는 동족 재조합 서열 (즉, attB 부착 부위)을 함유하는 벡터 사용으로 세포 내로 쉽게 도입될 수 있다. 파지 인테그라제를 통해 두 동족 재조합 서열 (즉, attB 및 attP 부위)은 재조합될 수 있고, 이로써 전체 attB-함유 벡터는 염색체 중 단일 attP 부위 내로 통합될 수 있다.
본원에서는 숙주 세포에서 이종성 폴리뉴클레오티드를 안정하게 통합시키고/거나, 그를 발현시키는 방법을 제공한다. 확인된 유전자 (즉, Cpsf4, Ank2, C-Mos, 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자) 중 하나 이상에, 또는 그의 가깝게 안정하게 통합되어 있는 이종성 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포 또한 제공한다. 이종성 폴리뉴클레오티드, 예컨대 부위-특이적 재조합 서열 (염색체 랜딩 패드)을 포유동물 세포의 게놈 내로, 특히, 본원에 개시된 하나 이상의 천연 염색체 삽입 부위 내로 삽입하는 데 유용한 폴리뉴클레오티드 및 관련 벡터를 추가로 제공한다. 본원에 개시된 하나 이상의 천연 염색체 삽입 부위에서 그의 게놈 내로 안정하게 통합되어 있는 이종성 부위-특이적 재조합 서열을 가지는 조작된 포유동물 세포를 추가로 제공한다. 또한, 관심 표적 폴리펩티드를 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포에서 하나 이상의 삽입된 염색체 랜딩 패드에 안정하게 통합시키고, 발현시키는 방법을 제공한다. 그렇게 생성된, 이종성 폴리뉴클레오티드를 발현하는 세포 또한 본원에서 제공한다.
본원에 기술된 특정의 방법, 프로토콜, 및 시약은 달라질 수 있다. 달리 명시하지 않는 한, 당업계의 기술 범위 내에 포함되어 있는 분자 생물학 (재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 종래 기법이 사용될 수 있다. 그러한 기법은 문헌에 상세하게 설명되어 있다. 예를 들어, 예시적인 방법은 하기 참고 문헌에 기술되어 있다:
Figure pct00001
II . 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용과 관련된 당업계의 숙련가가 통상 이해하고 있는 것과 같은 의미를 가진다. 하기 참고 문헌은 당업자에게 본 개시내용에서 사용되는 많은 용어들에 대한 일반적인 정의를 제공한다:
Figure pct00002
이들 용어 중 일부는 그가 본 개시내용에 구체적으로 적용됨에 따라 본원에서 추가로 명확해진다.
본원에서 사용되는 바, 단수 형태인 "하나("a", "an") 및 "그"라는 것은 문맥상 달리 명확하게 언급되지 않는 한, 복수 개의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "한 세포"라고 언급하는 것은 복수 개의 상기 세포를 포함하고, "한 단백질"이라고 언급하는 것은 하나 이상의 단백질 및 당업자에게 공지된 그의 등가물 등을 포함한다.
"작용제"라는 용어는 임의의 물질, 분자, 요소, 화합물, 엔티티, 또는 그의 조합을 포함한다. 예컨대, 단백질, 폴리펩티드, 소형 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오티드 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 천연 생성물, 합성 화합물, 또는 화학 화합물, 또는 2가지 이상의 물질의 조합일 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, "작용제," "물질," 및 "화합물"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
"염색체 랜딩 패드" (또는 간단하게 "랜딩 패드")라는 용어는 숙주 세포 (예컨대, 포유동물 세포, 예컨대 CHO 세포)의 게놈 내로 안정하게 통합되어 있는 부위-특이적 인식 서열 또는 부위-특이적 재조합 부위 (예컨대, attP 부위)를 의미한다. 특히, 부위-특이적 인식 서열 또는 재조합 부위는 본원에 개시된 수개의 특이적 유전자, 즉, 안키린 2 유전자 (Ank2), 절단 및 폴리아데닐화 특이적 인자 4 유전자 (Cpsf4), C-Mos 유전자 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자에 존재하는 하나 이상의 천연 염색체 삽입 부위에서 숙주 게놈 내로 삽입된다. 이종성 부위-특이적 재조합 서열이 숙주 게놈 내에 존재함에 따라 리콤비나제 (예컨대, phiC-31 인테그라제)는 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 트랜스진의 숙주 게놈 내로의 부위-특이적 삽입을 매개할 수 있다. 전형적으로, 랜딩 패드 내로 통합시키기 위해, 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 트랜스진을, 이 또한 리콤비나제에 의해 인식되는 동족 인식 서열 또는 재조합 부위 (예컨대, 삽입된 부위-특이적 재조합 부위가 attP 부위일 경우, attB 부위)에 부착시킨다.
"관심 폴리뉴클레오티드" (또는 "관심 유전자" 또는 "표적 유전자")라는 어구는 폴리펩티드 또는 단백질 생성물 ("관심 폴리펩티드" 또는 "표적 폴리펩티드")을 코딩하는 시스트론, 오픈 리딩 프레임 (ORF), 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 한다. 본원에 기술된 염색체 랜딩 패드를 보유하는 조작된 숙주 세포에서의 안정한 통합 및 발현을 위해, 관심 폴리뉴클레오티드는 코딩 서열, 및 또한 동족 부위-특이적 재조합 서열 (예컨대, attB 또는 attP 부위)에 작동가능하게 연결된 적절한 전사 조절 요소 (예컨대, 프로모터 서열)를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 치료용 단백질, 영양 단백질 및 산업상 유용한 단백질과 같이 각종 표적 폴리펩티드는 관심 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 그로부터 발현될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "내인성"이라는 용어는 보통 야생형 숙주에서 발견되는 핵산 또는 폴리펩티드를 의미하는 반면, "외인성"이라는 용어는 보통 야생형 숙주에서 발견되지 않는 핵산 또는 폴리펩티드를 의미한다.
"숙주 세포"는 이종성 폴리뉴클레오티드 서열을 그 안으로 도입시키고자 하는 것이거나, 상기 서열이 도입되어 있는 살아있는 세포를 의미한다. 살아있는 세포는 둘 모두를 포함한다. 이종성 폴리뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입시키는 수단은 주시되어 있으며, 그 예로는 예컨대, 형질감염, 전기천공, 인산칼슘 침전법, 미세주입법, 형질전환, 바이러스 감염 등이 있다. 세포 내로 도입시키고자 하는 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 대개 복제가능한 발현 벡터 또는 클로닝 벡터이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포를 조작하여 원하는 유전자를 그의 염색체 상에 또는 그의 게놈 중에 도입할 수 있다. 숙주로서의 역할을 할 수 있는 많은 숙주 세포 (예컨대, CHO 세포)가 당업계에 알려져 있다. 예컨대, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (3rd ed., 2001)]; 및 [Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003)]을 참조할 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다.
"뉴클레오티드 서열," "핵산 서열," "핵산," 또는 "폴리뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 단일 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 의미하며, 달리 제한하지 않는 한, 천연적으로 발생된 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 핵산에 하이브리드화하는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포함한다. 핵산 서열은 예컨대, 원핵 생물 서열, 진핵 생물 mRNA 서열, 진핵 생물 mRNA로부터의 cDNA 서열, 진핵 생물 DNA (예컨대, 포유동물 DNA)로부터의 게놈 DNA 서열, 및 합성 DNA 또는 RNA 서열일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
"작동가능하게 연결된" 또는 "작동가능하게 회합된"이라는 용어는 유전 요소가 그의 정상적인 기능을 수행할 수 있도록 하는 방식으로 연결된 유전 요소 사이의 기능적 결합을 의미한다. 예를 들어, 유전자의 전사가 프로모터의 제어하에 있고, 제조된 전사체가 정상적으로 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질로 정확하게 번역되었을 때, 유전자는 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 것이다. 유사하게, 인핸서 요소는 그를 통해 유전자의 전사가 상향 조절되었다면, 이는 관심 유전자와 작동가능하게 회합되어 있는 것이다.
"실질적으로 동일한" 핵산 또는 아미노산 서열이란 표준 파라미터를 사용하여 본원에 기술된 주지의 프로그램 (예컨대, BLAST) 중 하나에 의해 측정된 바, 참조 서열과 75%, 80% 또는 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함하는 핵산 또는 아미노산 서열을 의미하는 것이다. 서열 동일성은 바람직하게 95% 이상, 더욱 바람직하게 98% 이상, 및 가장 바람직하게 99% 이상이다. 일부 실시양태에서, 대상 서열은 참조 서열과 비교하였을 때, 그 길이가 대략적으로 동일한 것, 즉, 대략적으로 동일한 개수의 연속된 아미노산 잔기 (폴리펩티드 서열인 경우) 또는 뉴클레오티드 잔기 (폴리뉴클레오티드 서열인 경우)로 구성된 것이다.
서열 동일성은 당업계에 공지된 각종 방법으로 쉽게 측정될 수 있다. 예를 들어, BLASTN 프로그램은 (뉴클레오티드 서열의 경우) 디폴트로서 워드길이 (W)=11, 기대치 (E)=10, M=5, N=-4, 및 양 가닥 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드길이 (W)=3, 기대치 (E)=10, 및 BLOSUM62 점수화 매트릭스를 사용하였다 (문헌 [Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)] 참조). 서열 동일성(%)은 비교창에 걸쳐 최적으로 정렬된 두 서열을 비교함으로써 측정되는데, 여기서, 비교창에서 폴리뉴클레오티드 서열 중의 일부는 두 서열이 최적으로 정렬될 수 있도록 하기 위해 (부가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하여 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 상기 비율은 두 서열 모두에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 존재하는 위치의 개수를 측정하여 매칭되는 위치의 개수를 얻고, 매칭되는 위치의 개수를 비교창에 있는 위치의 총 개수로 나누고, 그 결과에 100을 곱함으로써 서열 동일성(%)을 얻음으로써 계산된다.
본원에서 사용도는 바, 단방향 부위-특이적 리콤비나제 (또는 간단하게 부위-특이적 리콤비나제)란 박테리아 또는 단세포 효모로부터 유래된 리콤비나제 군을 의미한다. 이는 티로신 리콤비나제 및 레솔바제/인버타제 또는 세린 리콤비나제 패밀리 (예컨대, 파지 인테그라제, 예컨대 파지 phiC31, R4, 및 TP-901로부터의 인테그라제), 둘 모두를 포함한다. 티로신 리콤비나제는 티로신 인테그라제 (예컨대, λ, HK022, P22, HP1 및 L5로부터의 인테그라제) 및 다른 티로신 리콤비나제 (예컨대, Cre 및 Flp)를 포함한다. 세린 리콤비나제의 예로는 세린 인테그라제 (예컨대, phiC-31, R4, TP901로부터의 인테그라제) 및 다른 세린 리콤비나제 (예컨대, γδ, Tn3, 파지 Mu 리콤비나제)를 포함한다.
바람직하게, 부위-특이적 리콤비나제는 상이한 두 DNA 인식 서열인 파지 부착 부위인 attP, 및 박테리아 부착 부위인 attB 사이의 단방향 부위-특이적 재조합을 매개하는 인테그라제 (특히, 파지 인테그라제)를 포함할 수 있다. 티로신 패밀리의 인테그라제, 예컨대 람다 인테그라제는 촉매성 티로신을 이용하여 가닥 절단을 매개하고, 보다 긴 attP 서열을 인식하는 경향이 있으며, 파지 또는 숙주 박테리아에 의해 코딩되는 다른 단백질을 필요로 한다. 세린 패밀리로부터의 파지 인테그라제 (예컨대, phiC-31 파지 인테그라제)는 크기가 더 크며, 가닥 절단을 위해 촉매성 세린을 사용하여 보다 짧은 attP 서열을 인식하고, 숙주 보조인자는 필요로 하지 않는다. attB 및 attP 부위는 상이한 서열이기 때문에, 재조합을 통해 attB 서열도 attP 서열도 아니며, 관련 인테그라제 효소에 대한 재조합 부위로서 기능적으로 인식되지 못하는 핵산 스트레치 (좌측인 경우, attL, 또는 우측인 경우, attR로 불린다)가 생성될 것이며, 효소가, 제1 재조합을 역전시킬 수 있는 제2 재조합을 촉매화시킬 수 있는 가능성을 제거한다. 이로써 단방향 부위-특이적 통합 이벤트가 이루어질 것이다.
Phi-C31 인테그라제란 포유동물 세포에서 게놈 재조합을 고효율로 긴밀한 서열 특이성으로 촉매화시킬 수 있는 파지 인테그라제를 의미한다. 상기 효소의 기능에 관한 특징 규명은 예컨대, 문헌 [Kuhstoss and Rao, J. Mol. Biol. 222, 897-908, 1991]; [Rausch and Lehmann, Nucleic Acids Research 19, 5187- 5189, 1991]; 및 [Groth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 5995-6000, 2000]과 같이 당업계에 기술되어 있다.
파지 인테그라제 (예컨대, 파지 phi-C31 인테그라제)의 천연 attB 및 attP 인식 부위의 길이는 일반적으로 약 34 내지 40개의 뉴클레오티드 길이이다. 예컨대, 본원의 도 2 및 또한 문헌 [Groth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5995-6000, 2000]을 참조할 수 있다. 상기 부위는 전형적으로 하기와 같이 배열되어 있다: attB는 제1 DNA 서열 attB5', 코어 영역, 및 제2 DNA 서열 attB3'을 포함하며, 5'→3'으로의 상대적인 순서는 attB5'-코어 영역-attB3'이다. attP는 제1 DNA 서열 attP5', 코어 영역, 및 제2 DNA 서열 attP3'을 포함하며, 5'→3'으로의 상대적인 순서는 attP5'-코어 영역-attP3'이다. Phi-C31의 attP 및 attB의 코어 영역은 서열 5'-TTG-3'을 가진다.
트랜스제닉 동물 또는 식물이란 동물 또는 식물의 하나 이상의 세포의 게놈 중에 트랜스진 또는 트랜스제닉 요소가 통합되어 있는 비인간 비인간 동물 또는 식물을 의미한다. 상기 용어는 유전자 변형을 포함하는 모든 세포 또는 거의 모든 세포를 가지는 동물 또는 식물 (예컨대, 완전한 트랜스제닉 동물, 특히 유전 트랜스진을 가지는 트랜스제닉 동물) 뿐만 아니라, 동물 또는 식물의 세포의 서브세트가 게놈상 통합된 트랜스진을 포함하도록 변형된 키메라 트랜스제닉 동물 또는 식물을 포함한다. 트랜스제닉 식물 또는 동물은 모든 발생 단계의 개별 동물 또는 식물을 포함한다. 트랜스제닉 동물인 경우, 본원에서는 가축 (예컨대, 닭, 돼지, 염소, 양, 소, 말, 토끼 등), 설치류 (예컨대, 마우스), 비인간 영장류 (예컨대, 레서스 원숭이) 및 애완동물 (예컨대, 고양이 및 개)가 고려된다. 일부 바람직한 실시양태에서, 동물은 마우스 또는 래트이다.
"치료 유전자"란 단백질 (예컨대, 분비된 단백질, 막 결합 단백질 (예컨대, 수용체), 구조 단백질, 세포질 단백질 등)을 비롯한, 숙주에게 어느 정도 치료학상 이익이 되는 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 기능성 RNA (안티센스, 해머헤드 리보자임) 등을 의미한다. 분비된 단백질로는 대상체의 체액 중에서 (예컨대, 혈액, 림프, 타액, 위장관 분비액 등 중에서) 발견될 수 있는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 대상체는 인간 대상체이고, 도입된 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 단백질 또는 다른 인간 유전자 생성물을 코딩한다.
"벡터" 또는 "구축물"이라는 용어는 폴리뉴클레오티드 서열 요소에 작동가능하게 연결된 유전자/유전자 생성물의 발현이 예측가능하게 제어될 수 있도록 하는 일정한 조직화 패턴으로 배열된 폴리뉴클레오티드 서열 요소를 의미한다. 전형적으로, 이는 외래 DNA를 숙주 세포 내로 도입하여 그의 복제 및/또는 전사를 촉진시키기 위해 외래 폴리뉴클레오티드 서열 세그먼트가 그로 스플라이싱될 수 있는 전달성 폴리뉴클레오티드 서열 (예컨대, 플라스미드 또는 바이러스)이다.
클로닝 벡터는 숙주 세포에서 자율적으로 복제가능하고, 하나 또는 소수의 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열 (전형적으로 플라스미드 또는 파지)이다. 외래 폴리뉴클레오티드 서열 단편은 단편이 복제 및 클로닝될 수 있도록 하기 위해 상기 부위에서 벡터로 스플라이싱될 수 있다. 벡터는 형질전환된 세포를 확인하는 데 사용하기 적합한 하나 이상의 마커를 포함할 수 있다. 예를 들어, 마커는 테트라시클린 또는 암피실린 저항성을 제공할 수 있다.
발현 벡터는 클로닝 벡터와 유사하지만, 숙주로의 형질전환 이후, 그로 클로닝된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 유도할 수 있다. 클로닝된 폴리뉴클레오티드 서열은 보통 특정의 조절 서열, 예컨대 프로모터 또는 인핸서의 제어하에 배치되어 있다 (즉, 그에 작동가능하게 연결되어 있다). 프로모터 서열은 구성적, 유도성, 또는 억제성일 수 있다.
III . 천연 염색체 통합 부위에의 이종성 폴리뉴클레오티드 삽입
본원에서는 삽입된 이종성 폴리뉴클레오티드 (외인성 유전자 또는 트랜스진)의 안정적이고 효율적인 발현을 지지하는 천연 염색체 통합 부위를 포함하는 수개의 특이적 유전자를 기술한다. 이러한 천연 염색체 통합 부위는 숙주 세포에서 이종성 폴리뉴클레오티드의 안정한 통합 및/또는 발현에 적합하다. 예를 들어, 유용한 폴리펩티드 (예컨대, 치료용 또는 산업용 단백질)를 코딩하는 트랜스진 또는 재조합 유전자는 숙주 세포에 그렇게 통합되어 발현될 수 있다. 추가로, 상기 부위는 부위-특이적 재조합 서열 (염색체 랜딩 패드)을 숙주 게놈 내로 삽입하는 데 사용될 수 있다. 상기 삽입된 염색체 랜딩 패드를 보유하는 숙주 세포는 결국 이종성 폴리뉴클레오티드의 삽입 및 발현에 사용될 수 있다.
천연 염색체 삽입 또는 통합 부위란 이종성 폴리뉴클레오티드가 예컨대, 무작위 통합을 통해 그 안으로 통합될 수 있으며, 세포의 게놈 중에 천연적으로 존재할 수 있는 것인 염색체 위치 또는 부위를 의미한다. 다시 말해, 부위는 예를 들어, 재조합 수단에 의해 게놈 내로 도입되지 않는다. 본원에서 사용되는 바, 상기 용어는 달리 언급하지 않는 한, 구체적으로는 외래 유전자의 안정한 통합과, 그의 효율적인 전사를 지지하며, 안키린 2 유전자 (Ank2), 절단 및 폴리아데닐화 특이적 인자 4 유전자 (Cpsf4), C-Mos 유전자, 및 본원에서는 또한 네프로시스틴-1/Mal 유전자로서도 기술되어 있는 Mal 유전자를 비롯한 CHO 게놈 중의 수개의 유전자 중 하나 내에 또는 그에 인접하게 위치하는 게놈 중의 위치를 의미한다. 이는 또한 기능 또는 활성이 유사한, 다른 포유동물 종 (예컨대, 마우스, 래트, 및 인간)에서 상기 유전자 또는 (서열 정렬에 의해 측정된 바) 상동성인 영역의 오르토로그에서의 염색체 위치를 포함한다.
본원에서 상세하게 설명되는 바와 같이, 본원에서 CHO 게놈 중에서 확인된 4개의 유전자 각각에 대하여 하나의 특이적인 천연 염색체 삽입 부위가 기술된다 ( "예시된 위치"; 도 3-6 참조). 그러나, 본원에서 고려되는 천연 염색체 삽입 부위가 이러한 특정 위치로 제한되는 것은 아니다. 통합된 이종성 폴리뉴클레오티드의 안정한 통합 및/또는 효율적인 전사가 지지되는 한, 예시된 위치와 관련하여 천연 염색체 삽입 부위의 정확한 위치가 중요하지는 않다. 오히려 천연 염색체 부위는 4개의 유전자 중 하나 내에 또는 그에 인접하게 있는 임의의 위치에 위치할 수 있다. 관심 4개의 유전자 중 하나 내에 또는 그에 인접하게 있는 특이적 염색체 위치가 통합된 외래 유전자의 안정한 통합 및 효율적인 전사를 지지하는지 여부는 당업계에 주지되어 있는 표준 방법, 또는 본원에서 예시된 방법에 따라 측정될 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, CHO 게놈에 대하여 본원에서 예시된 특이적 위치, 또는 다른 포유동물 게놈 (예컨대, 마우스, 래트, 및 인간 게놈)에서 (서열 정렬에 의해 측정된 바) 상응하는 위치가 천연 염색체 삽입 부위로서 사용된다. 일부 다른 실시양태에서, 본원에서 고려되는 천연 염색체 부위는 바람직하게 예시된 위치 중 하나에 근접하게, 예컨대 예시된 위치 중 하나로부터 약 1 kb, 500 bp, 250 bp, 100 bp, 50 bp, 25 bp, 10 bp 미만 이내에, 또는 약 5 bp 미만 이내에 위치한다. 추가의 일부 다른 실시양태에서, 사용되는 천연 염색체 부위는 예시된 위치 중 하나로부터 약 1,000, 2,500, 5,000개 이상의 염기쌍 만큼 이격된 곳에 위치한다.
이종성 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 재조합 유전자 또는 염색체 랜딩 패드)는 안정한 통합 및/또는 발현을 위해 본원에 기술된 천연 염색체 통합 부위 내로 쉽게 삽입될 수 있다. 이종성 폴리뉴클레오티드는 다양한 수단에 의해, 예컨대 상동성 재조합에 의해, 또는 통합 부위에서 표적 서열을 특이적으로 표적화하는 하이브리드 리콤비나제를 사용함으로써 숙주 게놈의 천연 염색체 통합 부위 내로 삽입될 수 있다. 상동성 재조합인 경우, 상동성 폴리뉴클레오티드 분자는 정렬되고, 그의 서열 스트레치를 교환한다. 트랜스진이 상동성 게놈 서열 측면에 위치할 경우, 상기 교환 동안 트랜스진이 도입될 수 있다. 예를 들어, 하기 기술하는 바와 같이, 염색체 랜딩 패드 (attP 부위-함유 서열)은 천연 염색체 통합 부위에서 숙주 게놈 내로 상기와 같이 삽입될 수 있다.
포유동물 세포에서 상동성 재조합의 효율은 상동성인 염색체 영역에 파손을 도입함으로써 개선될 수 있다. 이는 상기 영역에 뉴클레아제를 표적화시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 천연 염색체 위치의 서열을 인식하는 DNA 결합 단백질을 사용함으로써 달성될 수 있다. 상기와 같은 표적화를 달성하는 한가지 방법은 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하는 것이다. 상기 단백질은 모듈식 조성을 가지며, 개별 아연 핑거 도메인을 함유하는데, 이들은 각각 표적 서열 중의 3-뉴클레오티드 서열 (예컨대, 상기 기술된 천연 염색체 통합 부위)을 인식할 수 있다. 일부 실시양태는 다수의 염색체 위치를 표적화하는 개별 아연 핑거 도메인과 함께 조합하여 아연 핑거 뉴클레아제를 사용할 수 있다. 예를 들어, Cpsf4, Ank2, C-Mos, 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자 중 예시된 통합 부위 주변의 개시된 염색체 서열은 각각 조작된 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 표적화될 수 있는 8, 6, 7, 및 8개의 후보 부위를 함유한다.
상동성 재조합 이외에, Cpsf4, Ank2, c-Mos, 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자에서 또는 그에 근접한 위치에서의 천연 염색체 통합 부위로의 이종성 폴리뉴클레오티드의 삽입은 또한 하이브리드 리콤비나제의 사용을 통해 달성될 수 있다. 재조합 리콤비나제는 리콤비나제 도메인 (예컨대, phiC31 인테그라제로부터의 것)이 DNA 표적화 도메인 (예컨대, 아연 핑거 도메인)에 연결되어 있는 것인 조작된 단백질이다. 그러한 분자는 Cpsf4, Ank2, c-Mos, 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자에 또는 그에 근접한 위치에 포함되어 있는 부위에 표적화될 수 있다. 상기와 같은 재조합 단백질을 통해 재조합 구축물은 상기 염색체 위치로 통합될 수 있을 것이다. 이러한 접근법의 장점으로는 (하기 기술되는 바와 같이) 랜딩 패드를 사전에 도입할 필요없이 세포주로 표적화할 수 있는 점, 및 상동성 재조합보다 효율이 더 높다는 점을 포함한다.
비록 아연 핑거 단백질이 DNA에 결합할 수 있는 그의 능력에 대해 잘 연구되어 있고, 상기 적용에 적합하기는 하지만, 다른 접근법을 사용함으로써, 예를 들어, 또 다른 유형의 DNA 결합 도메인의 돌연변이화에 의해 Cpsf4, Ank2, c-Mos, 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자를 특이적으로 표적화할 수 있다. 다른 DNA 결합 도메인으로는 류신-지퍼 및 나선 대 나선 연결 구조를 포함한다. 또한 이러한 유전자에서 서열에 염기쌍을 형성하는 핵산 모이어티를 사용함으로써 Cpsf4, Ank2, c-Mos, 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자를 특이적으로 표적화할 수 있다.
일부 실시양태는 상동성 재조합에 의해 또는 하이브리드 리콤비나제를 이용함으로써 천연 염색체 통합 부위 내로 트랜스진을 직접적으로 통합시키는 것을 포함한다. 트랜스진은 하기 기술하는 바와 같이, 치료용 또는 산업용 단백질, 예컨대 호르몬 또는 효소를 코딩하는 임의의 재조합 유전자일 수 있다. 일부 다른 실시양태는 본원에 개시된 천연 염색체 통합 부위 내로 하나 이상의 리콤비나제에 의해 인식되는 부위 특이적 재조합 서열 (염색체 랜딩 패드)을 삽입하는 것에 관한 것이다. 본원에서 상세하게 설명되는 바와 같이, 숙주 게놈 내로 안정하게 삽입된 염색체 랜딩 패드는 결국 숙주 세포 (예컨대, CHO 세포 또는 다른 포유동물 세포)에서 트랜스진을 통합 및 발현시키는 데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 천연 염색체 통합 부위에 하나 이상의 염색체 랜딩 패드를 보유하는 조작된 숙주 세포는 임의의 원하는 표적 유전자를 부위-특이적으로 통합하고 안정하게 발현시키는 데 유용하다.
IV . 상동성 재조합을 통한 이종성 폴리뉴클레오티드의 통합
한 측면에서, 상동성 재조합을 통해 이종성 폴리뉴클레오티드를 천연 염색체 통합 부위 내로 안정하게 통합시키기 위한 방법 및 조성물을 개시한다. 본원에서는 본원에 기술된 천연 염색체 통합 부위 또는 특이적 염색체 위치에서 숙주 게놈 내로 이종성 폴리뉴클레오티드 (트랜스진 또는 부위-특이적 재조합 서열)를 삽입하기 위한 폴리뉴클레오티드 분자 및 벡터 ("삽입 벡터")를 제공한다. 폴리뉴클레오티드 및/또는 삽입 벡터는 전형적으로 이종성 폴리뉴클레오티드 서열 (예컨대, 재조합 유전자 또는 염색체 랜딩 패드), 제1 상동성 아암, 및 제2 상동성 아암을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 추가로는 또한 양성 및/또는 음성 선별을 위한 마커 유전자 또는 서열을 포함할 수 있다.
숙주 게놈 내로 통합시키고자 하는 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에 기술된 바와 같이 치료학상 또는 산업상 유용한 임의의 단백질을 코딩할 수 있다. 하기에서 상세하게 설명되는 바와 같이, 이는 또한 이어서 트랜스진의 삽입 및 발현에 사용되는 리콤비나제에 의해 인식되는 통합 부위 (염색체 랜딩 패드)일 수 있다. 제1 및 제2 상동성 아암은 상동성 재조합을 위해 이종성 폴리뉴클레오티드 서열을 특이적인 염색체 위치 (예컨대, 본원에 개시된 천연 염색체 삽입 부위)로 표적화하는 것으로 한다. 따라서, 이는 각각 천연 염색체 통합 부위의 5'- 및 3'-측면에 위치하는 서열과 실질적으로 동일한 서열이다. 상기에서 설명된 바와 같이, 천연 염색체 통합 부위는 4개의 특이적 유전자인, Ank2 유전자, Cpsf4 유전자, C-Mos 유전자, 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자 중 하나의 코딩 또는 비-코딩 영역 내에 또는 그에 인접하게 존재한다. 네프로시스틴-1 유전자는 Mal 유전자에 대해 5' 방향에서 발견된다. 삽입 부위는 네프로시스틴-1과 Mal 유전자 사이의 Mal 유전자에 대해 5' 방향일 수 있다. 상기 게놈 영역을 본원에서는 "네프로시스틴-1/Mal"로 기술한다. 상기 유전자 중 하나의 또는 그 주변의 주어진 위치에서의 이종성 폴리뉴클레오티드의 삽입을 통해 안정한 통합 및/또는 발현이 이루어지는지 여부를 쉽게 측정할 수 있는 바, 게놈 중 각 유전자와 관련하여 천연 염색체 통합 부위의 정확한 위치가 중요하지는 않다. 그럼에도 불구하고, 본원에서는 일부 바람직한 천연 염색체 통합 부위가 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에 대하여 기술되어 있다. 하기 실시예에서 예시하는 바와 같이, CHO 세포에 대한 천연 염색체 통합 부위는 바람직하게 Ank2 유전자의 경우 서열 번호 1의 130-131번 위치 사이에, Cpsf4 유전자의 경우 서열 번호 2의 629-630번 위치 사이에, C-Mos 유전자의 경우 서열 번호 3의 272-273 사이에, 또는 네프로시스틴-1/Mal 유전자의 경우 서열 번호 4의 239-240번 위치 사이에 존재할 수 있다. CHO 세포에 대한 천연 염색체 통합 부위는 또한 안키린 2 유전자의 경우, NCBI 번호 NW_003615916.1의 26,123-175,773번 위치 사이에 (서열 번호 9의 23 내지 152,773번 위치 사이에) 또는 안키린 2 유전자 (서열 번호 10)의 경우, NCBI 번호 NW_003635654.1의 뉴클레오티드 844-845 사이에, Cpsf4 유전자의 경우, NCBI NW_003614125.1의 858,966-859,967번 위치 사이에 (서열 번호 11의 966-967번 위치 사이에) 또는 Cpsf4 유전자의 경우, NCBI NW_003614125.1의 858,533-859,237번 위치 사이에 (서열 번호 11의 533-1237번 위치 사이에), C-Mos 유전자의 경우, NCBI NW_003614707.1의 400,355-400,356번 위치 사이에 (서열 번호 12의 355-356번 위치 사이에), 또는 C-Mos 유전자의 경우, NCBI NW_003614707.1의 398,595-399,212번 위치 사이에 (서열 번호 12), 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자의 경우, NCBI NW_003613665.1의 1,578,738-1,578,739번 위치 사이에 (서열 번호 13의 738-739번 위치 사이에) 또는 네프로시스틴-1/Mal 유전자의 경우, NCBI NW_003613665.1의 1,574,453-1,625,306번 위치 사이에 (서열 번호 13) 존재할 수 있다. 서열 및 NCBI 참조 번호는 그 전문이 본원에서 참고로 포함된다.
천연 염색체 통합 부위는 또한 세포주 유형별로 달라질 수 있음을 이해하여야 한다. 예를 들어, 두 세포주 유형의 천연 염색체 통합 부위의 정확한 위치에 기인하여 CHO DG44 세포주의 Ank2 유전자의 뉴클레오티드 서열은 CHO-1 세포의 Ank2 유전자의 뉴클레오티드 서열과 다를 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이종성 뉴클레오티드 서열 (트랜스진 또는 염색체 랜딩 패드)을 삽입시키기 위해 선택되는 천연 염색체 통합 부위는 CHO 게놈 중 각각의 상기 특이적 위치에 또는 그에 가깝게 위치할 수 있다. 세포주 유형간의 또는 다른 포유동물 세포 (예컨대, 마우스 세포, 래트 세포 및 인간 세포)에 대해 바람직한 천연 염색체 통합 부위는 상이한 포유동물 종에서 같은 유전자 중의 서열 상동성에 기초하여 결정될 수 있다.
일단 이종성 폴리뉴클레오티드 서열을 삽입하기 위한 정확한 천연 염색체 통합 부위가 결정되고 나면, 측면에 위치하는 서열과 실질적으로 동일한 상동성 아암을 쉽게 디자인하고, 합성할 수 있다. 원하는 부위에서 상동성 재조합을 지시할 수 있는 한, 상동성 아암의 길이는 중요하지는 않다. 따라서, 상동성 아암은 원하는 천연 염색체 삽입 부위의 측면에 위치하는 서열의 적어도 10 bp, 25 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 500 bp, 1 kb, 2, kb, 5 kb, 10 kb 이상 연속된 뉴클레오티드 쌍을 포함하는 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상동성 아암은 CHO 게놈에서 예시된 염색체 삽입 부위 중 하나 (도 3-6) 또는 다른 포유동물 게놈에서 (서열 정렬에 의해 측정된 바) 상응하는 위치 측면에 위치하는 서열과 동일한 서열을 포함한다. 일부 다른 실시양태에서, 천연 통합 부위의 측면에 위치하는 서열과 실질적으로 동일한 (예컨대, 75%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상 동일한) 서열이 본원에서 기술된 폴리뉴클레오티드 분자 및 벡터에서 상동성 아암으로서 사용된다. 예를 들어, 상동성 아암은 도 3-6에 제시된 CHO 세포에서의 각각의 상기 유전자 중의 예시된 천연 통합 부위의 측면에 위치하는 서열 중 일부 또는 그 모두를 포함할 수 있다.
다양한 종으로부터의 세포 (예컨대, CHO 세포) 중의 유전자 (Ank2, Cpsf4, C-Mos 유전자, 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자) 또한 당업계에 기술되어 있다. 예를 들어, 인간 Ank2 유전자 (수탁 번호 NG_009006; NW_003615916.1; NW_003635654.1), Cpsf4 유전자 (수탁 번호 EF191081; NW_003614125.1), C-Mos 유전자 (문헌 [Neel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 7842-6, 1982]; 및 [Morris et al., Hum. Genetics 81:339-342]); 수탁 번호 NW_003614707.1), 네프로시스틴-1/Mal 유전자 (문헌 [Alonso et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1997-2001, 1987]; 및 [Rancano et al., J. Biol. Chem. 269:8159-8164, 1994]; 수탁 번호 NW_003613665.1)는 모두 당업계에서 특징 규명이 되어 있다. 당업자는 다양한 적용을 위한 적절한 상동성 아암 서열을 쉽게 디자인하고 합성할 수 있다. 실시예에서 예시되는 바와 같이, 확인된 통합 부위 중 하나의 측면에 위치하며, 길이가 약 1 kb 내지 5 kb인 서열이 이종성 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 랜딩 패드)의 숙주 게놈 내로의 상동성 통합을 위한 삽입 벡터의 상동성 아암으로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전체 유전자좌가 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 전체 유전자좌 + 5' 및 3' 말단 중 1 이상의 말단 상의 1, 2 kb 이상이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예컨대 Cpsf4 유전자 및 C-Mos 유전자의 경우, 전체 유전자좌 + 각각의 5' 및 3' 말단 상의 2 kb가 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 예컨대 네프로시스틴-1/Mal 유전자 및 안키린-2 유전자의 경우, 전체 유전자좌가 사용될 수 있다.
일부 구체적인 실시양태에서, 숙주 게놈 내로 통합시키고자 하는 이종성 폴리뉴클레오티드 서열은 부위-특이적 리콤비나제, 예컨대 파지 인테그라제, 예컨대 phiC-31 파지 인테그라제에 의해 인식되는 부위-특이적 재조합 서열이다. 천연 염색체 통합 부위 내로 삽입시키고자 하는 부위-특이적 재조합 서열은 부위-특이적 재조합을 지지하고, 단방향 부위-특이적 리콤비나제에 의해 인식되는 임의 서열일 수 있다. 바람직하게, 부위-특이적 재조합 서열은 인테그라제 (예컨대, 티로신 인테그라제 또는 세린 인테그라제)에 의해 인식되는 파지 부착 부위 (예컨대, attP 부위) 또는 박테리아 부착 부위 (예컨대, attB 부위)를 포함한다. 상기 서열의 예로는 수개의 파지 인테그라제, 예컨대 phiC-31 인테그라제 또는 λ 인테그라제에 의해 인식되는 attB 및 attP 서열 (뿐만 아니라, 의사(pseudo) att 부위)을 포함한다. 또한 적합한 재조합 부위로는 돌연변이체 인테그라제에 의해 인식되는 서열을 포함한다. 파지 게놈을 그의 숙주 (예컨대, E. 콜라이(E. coli) 세포)의 게놈 내로 통합시키는 동안, 효소는 파지 게놈의 attP 부위와 박테리아 게놈의 attB 부위 사이의 DNA교환을 촉매화시켜 attL 및 attR 부위를 형성한다. 파지 인테그라제 (예컨대, phiC-31 인테그라제)에 의해 인식되는 부위-특이적 재조합 부위 (예컨대, attP 부위)를 (예컨대, 본원에 개시된 천연 염색체 통합 부위에서) 숙주 게놈 내로 삽입시킴으로써 동족 인식 부위 (예컨대, attB 부위)에 부착된 이종성 폴리뉴클레오티드를 파지 인테그라제에 의해 촉매화되는 부위-특이적 재조합을 통해 숙주 게놈 내로 쉽게 삽입시킬 수 있다.
임의의 부위-특이적 리콤비나제 (예컨대, 세린 또는 티로신 파지 인테그라제)에 의해 인식되는 파지 부착 부위 (attP) 및 박테리아 부착 부위 (attB 부위)는 본원에 기술된 부위-특이적 재조합 서열로서 사용될 수 있다. 주어진 파지 인테그라제에 의해 인식되는 야생형 (천연) attB 및 attP 부위 뿐만 아니라, 의사 부위, 둘 모두를 포함한다. 각종 파지 및 다른 종에 대한 부위-특이적 리콤비나제 및 그 각자의 인식 서열 (attP 및 attB 부위)은 당업계에 공지되어 있고, 특징 규명되어 있다. 그 예로는 λ 파지 인테그라제 (문헌 [Enquist et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43:1115-1120, 1979]), HK022 파지 인테그라제 (문헌 [Yagil et al., J. Mol. Biol. 207:695-717, 1989]), P22 파지 인테그라제 (문헌 [Leong et al., J. Biol. Chem. 260:4468-4477, 1985]), HP1 파지 인테그라제 (문헌 [Waldman et al., J. Bacteriol. 165:297-300, 1986]), L5 파지 인테그라제 (문헌 [Lee et al., J. Bacteriol. 175:6836-6841, 1993]), phiC-31 파지 인테그라제 (문헌 [Kuhstoss and Rao, J. Mol. Biol. 222:897-908, 1991]), R4 파지 (문헌 [Groth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5995-6000, 2000]), TP901 파지 인테그라제 (문헌 [Christiansen et al., J. Bacteriol. 178:5164-5173, 1996]), γδ 트랜스포존 레솔바제 (문헌 [Reed et al., Nature 300:381-383, 1982]), Tn3 트랜스포존 레솔바제 (문헌 [Krasnow et al., Cell 32:1313-1324, 1983) 및 Mu 파지 인버타제 Gin (문헌 [Kahmann et al., Cell 41:771-780, 1985])을 포함한다.
부위-특이적 리콤비나제에 의해 인식되는 야생형 재조합 부위 이외에도, 폴리뉴클레오티드 분자 또는 벡터 중에 존재하는 랜딩 패드 삽입을 위한 부위-특이적 재조합 서열은 또한 1 이상의 염기쌍 변경 (치환, 결실 또는 삽입)에 의해 야생형 인식 부위 (예컨대, 야생형 attP 부위)와 차이를 보이는 서열을 포함할 수 있다. 서열 변경은 부위-특이적 재조합 서열 내의 임의 위치에서 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 부위-특이적 재조합 서열은 야생형 인식 부위와 비교하여 다중의 서열 변경을 가진다. 상기와 같은 변형된 부위-특이적 재조합 서열 (예컨대, 변형된 attP 부위)은 본원에 기술된 바와 같이 조작된 숙주 세포의 게놈 내로 통합되고, 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 트랜스진을 재조합 부위 내로 도입시키기 위해서는 상응하는 인테그라제 (예컨대, 돌연변이체 phi-C31 인테그라제)의 야생형 또는 돌연변이체 버전이 필요할 수 있다. 다양한 돌연변이체 인테그라제 (예컨대, 돌연변이체 phiC-31 인테그라제) 또한 당업계에 알려져 있다. 예컨대, 문헌 [Smith et al., Nuc. Acids Res. 32, 2607-2617, 2004]; 및 [Kevarala et al., Mol. Ther. 17, 112-120, 2008]을 참조할 수 있다.
이종성 폴리뉴클레오티드 서열 (트랜스진 또는 염색체 랜딩 패드)을 숙주 세포의 게놈 내로 삽입하는 경우, 상기 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 벡터 ("삽입 벡터") 내에 존재한다. 이러한 벡터는 전형적으로 환형이고, 상동성 재조합을 위해 사용되기 이전에 선형화된다. 상동성 아암 및 이종성 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 랜딩 패드) 이외에도, 벡터는 또한 선별 또는 스크리닝에 적합한 마커, 복제 기점, 및 다른 요소를 함유할 수 있다. 본원 실시예에 예시되어 있는 바와 같이, 벡터는 양성 선별 마커 및 음성 선별 마커, 둘 모두를 포함할 수 있다. 벡터가 통합되어 있는 숙주 세포를 확인하는 데 양성 선별 마커, 예컨대 항생제 저항성 유전자가 사용된다. 상기와 같은 마커의 예로는 네오마이신 , 블라스티시딘, 히그로마이신 및 제오신에 대한 항생제 저항성 유전자를 포함한다. 음성 선별 마커, 예컨대 자살 유전자는 원하는 위치에서 상동성 재조합이 이루어진 세포는 유지시키면서, 벡터 서열이 무작위로 통합되어 있는 세포는 제거하는 역할을 한다. 상기와 같은 음성 선별 마커의 예로는 본원 실시예에서 예시된 바와 같은 HCV-TK 유전자가 있다. 양성 스크리닝 마커 (예컨대, 증강된 녹색 형광 단백질)는 (예컨대, 형광 활성 세포 분류, FACS에 의해) 벡터가 안정하게 통합되어 있는 숙주 세포를 확인하는 데 사용된다. 음성 스크리닝 마커, 예컨대 시안 형광 단백질은 벡터 서열이 무작위로 통합되어 있는 세포를 (예컨대, FACS에 의해) 확인하는 데 사용된다. 양성 스크리닝 마커는 함유하지만, 음성 스크리닝 마커는 함유하지 않는 세포에 대한 FACS를 통해 원하는 위치에서 상동성 재조합이 이루어진 세포를 확인할 수 있을 것이다.
삽입 벡터 (뿐만 아니라, 하기 기술되는 표적화 벡터)의 성분 중 한가지 더 말하자면 복제 기점이 있다. 복제 기점은 다합체 기점-결합 단백질에 의해 인식되고, 기점 부위에서 DNA 복제 효소를 조립하는 데 중요한 역할을 하는 다중의 짧은 반복 서열을 포함하는 독특한 DNA 세그먼트이다. 벡터에서 사용하는 데 적합한 복제 기점으로는 예컨대, EBV oriP, SV40, E. 콜라이 oriC, colE1 플라스미드 기점, ARS 등을 포함한다. 발현 벡터에서 또 다른 유용한 요소는 다중 클로닝 부위 또는 폴리링커이다. 일련의 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 코딩하는 합성 DNA는 플라스미드 벡터 내로 예를 들어, 프로모터 요소의 하류로 삽입된다. 편리하게 특이적 위치의 벡터로 DNA를 클로닝할 수 있도록 상기 부위는 조작된다.
이종성 폴리뉴클레오티드를 숙주 게놈 내로 삽입하기 위한 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 분자 생물학 분야에 공지되어 있는 표준 방법 (예컨대, [Sambrook et al., 상기 문헌 동일]; 및 [Brent et al., 상기 문헌 동일]) 및 본원의 개시내용에 따라 쉽게 구축될 수 있다. 벡터를 제조하기 위해, 상동성 아암 및 이종성 폴리뉴클레오티드 서열 (예컨대, 트랜스진 또는 염색체 랜딩 패드)을 포함하는 상기 기술된 폴리뉴클레오티드는 포유동물 숙주 세포를 형질감염시키기 위한 다양한 공지의 플라스미드 내로 삽입될 수 있다. 상기와 같은 공지의 플라스미드로는 예컨대, BPV, EBV, 백시니아 바이러스 기반 벡터, SV40, 2-㎛ 서클, pcDNA3.1, pcDNA3.1/GS, pYES2/GS, pMT, p IND, pIND(Sp1), pVgRXR (인비트로겐(Invitrogen)) 등, 또는 그의 유도체를 포함한다. 이러한 플라스미드는 모두 당업계에 기술되어 있고, 주지되어 있다 (문헌 [Botstein et al., Miami Wntr. SyTnp. 19:265-274, 1982]; [Broach, In: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces : Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., p. 445-470, 1981]; [Broach, Cell 28:203-204, 1982]; [Dilon et at., J. Clin. Hematol. Oncol. 10:39-48, 1980]; 및 [Maniatis, In: Cell Biology : A Comprehensive Treatise, Vol. 3, Gene Sequence Expression, Academic Press, NY, pp. 563-608, 1980]).
V. 이종성 폴리뉴클레오티드가 통합되어 있는 조작된 세포
본원에서는 본원에 개시된 천연 염색체 통합 부위 중 하나 이상의 부위에서 게놈 내로 안정하게 통합되어 있는 이종성 폴리뉴클레오티드 (재조합 유전자 또는 염색체 랜딩 패드)를 포함하는 재조합 또는 조작된 숙주 세포를 제공한다. 재조합 유전자가 개시된 부위에 통합되어 있는 세포를 통해 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 안정하고 강력하게 발현될 수 있다. 염색체 랜딩 패드가 통합되어 있는 세포를 통해 관심 표적 폴리뉴클레오티드 또는 유전자는 효율적으로 부위-특이적 통합 및/또는 발현될 수 있다. 하기 설명되는 바와 같이, 조작된 숙주 세포는 또한 상기와 같이 삽입된 염색체 랜딩 패드를 보유하고, 이어서, 하나 이상의 트랜스진이 랜딩 패드 내로 통합되어 있는 세포 또한 포함할 수 있다. 상기 기술된 폴리뉴클레오티드 분자 또는 삽입 벡터를 사용하여, 본원에 기술된 특이적 염색체 위치 중 하나 이상의 위치에 재조합 유전자 또는 염색체 랜딩 패드를 삽입함으로써 각종 세포를 변형시킬 수 있다.
상기 기술된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 삽입 벡터 (또는 하기 기술되는 표적화 벡터)는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 적절한 숙주 세포 (예컨대, 포유동물 세포 예컨대, CHO 세포) 내로 도입시킬 수 있다. 전형적으로, 적절한 제한 효소 분해를 통해 숙주 염색체에 상동성인 유리 말단을 생성한 후, 이어서, 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포로 형질감염시킬 수 있다. 당업계에서 통상적으로 실시되는 표준 프로토콜에 의해 선형화된 삽입 벡터를 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 예를 들어, 인산칼슘 공침전법에 의해, 종래 기계적인 방법, 예컨대 미세주입법 또는 전기천공에 의해, 리포좀에 내장된 플라스미드 삽입에 의해, 및 바이러스 벡터에 의해 벡터를 숙주 세포로 형질감염시킬 수 있다. 상기 기법은 모두 당업계에 주지되어 있고, 통상적으로 실시되는 것이다 (예컨대, 문헌 [Freshney, 상기 문헌 동일]; [Sambrook et al., 상기 문헌 동일]; 및 [Brent et al., 상기 문헌 동일]). 형질감염된 재조합 삽입 벡터를 보유하는 숙주 세포는 벡터 상에 존재하는 선별 마커를 사용하여 확인하고 단리시킬 수 있다. 이어서, 벡터 함유 세포를 선별할 수 있는 배지 중에서 다수의 수혜자 세포를 성장시킬 수 있다.
부위-특이적 재조합 서열 (즉, attP 서열)을 천연 염색체 삽입 부위로 삽입시키기 위한 특이적 벡터는 본원에 예시되어 있다 (도 2). attP 서열 이외에도, 벡터 는 언급된 천연 염색체 삽입 부위에서의 상동성 재조합을 지지하는 상동성 아암, 및 또한 선별 마커를 보유한다. 원하는 천연 삽입 부위에서 CHO 게놈 내로 통합시키기 위해, 벡터를 먼저 제한 분해를 통해 선형화시켰다. 선형화된 서열을 숙주 세포 (예컨대, CHO 세포) 내로 형질감염시킨 후, 이어서, 세포를 양성 및 음성 선별하여 상동성 재조합을 통해 부위-특이적 재조합 부위 (attP 부위)가 통합되어 있는 세포를 확인한다. 이어서, 상기와 같이 확인된 세포를 추가로 조사하고 선택된 천연 염색체 삽입 부위에서의 이종성 폴리뉴클레오티드의 통합에 관해 확인할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 유전자에 의해 코딩되는 치료용 또는 산업용 단백질을 제조하는 데 재조합 유전자가 통합되어 있는 세포를 직접 사용할 수 있다. 별법으로, 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 염색체 랜딩 패드 내로 통합시킴으로써 표적 폴리펩티드를 제조하는 데 염색체 랜딩 패드가 삽입되어 있는 세포가 사용될 수 있다.
바람직하게, 천연 염색체 삽입 부위에 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위한 숙주 세포는 진핵 생물 세포이다. 진핵 생물 벡터/숙주 시스템, 및 포유동물 발현 시스템을 통해 특히 발현된 포유동물 단백질의 번역 후 변형이 적절하게 이루어질 수 있고, 예컨대 1차 전사체의 적절한 프로세싱, 발현된 생성물의 당화, 인산화 및 이롭게는 분비가 이루어질 수 있다. 그러므로, 진핵 생물 세포, 예컨대 포유동물 세포는 본원에 기술된 천연 염색체 위치에 이종성 폴리뉴클레오티드 (재조합 유전자 또는 염색체 랜딩 패드)를 삽입하는 데 바람직한 숙주 세포이다. 적합한 세포로는 동물 세포 (예컨대, 곤충, 설치류, 소, 염소, 토끼, 양, 비인간 영장류, 인간 등으로부터의 세포) 및 식물 세포 (예컨대, 벼, 옥수수, 목화, 담배, 토마토, 감자 등), 둘 모두를 포함한다. 상기와 같은 숙주 세포주의 구체적인 예로는 CHO, BHK, HEK293, VERO, HeLa, COS, MDCK, PER.C6, 및 W138을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 천연 염색체 위치에 사전 삽입되어 있는 랜딩 패드 내로 관심 폴리뉴클레오티드 또는 트랜스진이 이미 안정하게 통합되어 있는 재조합 세포를 제공한다. 숙주 게놈 내로 이미 삽입되어 있는 염색체 랜딩 패드 내로 표적 폴리뉴클레오티드를 통합시키기 위한 표적화 벡터는 하기에서 더욱 상세하게 기술한다. 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 랜딩 패드는 부위-특이적 리콤비나제 (예컨대, 파지 인테그라제 예컨대, phi-C31 인테그라제)에 의해 인식되는 인식 서열 (예컨대, attP 부위)을 포함한다. 리콤비나제에 의해 인식되는 동족 인식 서열 (예컨대, attB 부위)에 부착시킴으로써, 적절한 전사 조절 요소와 함께 관심 폴리뉴클레오티드를 리콤비나제에 의해 매개되는 부위-특이적 재조합을 통해 랜딩 패드 내로 통합시킨다. 재조합 세포 중의 통합된 관심 폴리뉴클레오티드는 산업 또는 치료를 위한 적용에 유용한 임의의 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 상기와 같은 폴리펩티드 및 단백질의 구체적인 예는 상기 기술되어 있다. 이는 예컨대, 효소 (예컨대, 프로테아제, 포스포리파제 등), 프로테아제 억제제, 호르몬 (예컨대, 뇌하수체 호르몬), 성장 인자, 시토카인, 케모카인, 케모탁신, 고나도트로핀, 지질-결합 단백질, 소마토메딘, 고나도트로핀, 및 면역글로불린을 포함한다. 관심 다른 단백질로는 항미생물성 폴리펩티드 (예컨대, 항박테리아성, 항진균성, 항바이러스성, 및/또는 항기생충성 폴리펩티드), 및 항체 또는 그의 항원-결합 항체 단편 (예컨대, FAb) (예컨대, 오르토클론 OKT-e (항-CD3), GPIIb/IIa 단일클론 항체)을 포함한다.
포유동물 세포 이외에도, 본원에 기술된 이종성 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위한 숙주 세포는 또한 효모 세포 또는 식물 세포일 수 있다. 그렇게 조작된 효모 또는 식물 세포는 효모 또는 식물 발현 벡터를 통해 숙주 내로 도입되는 트랜스진을 안정하게 통합 및 발현시키는 데 적합하다. 적합한 곤충 세포의 예로는 초파리 애벌레로부터의 세포를 포함한다. 곤충 세포가 사용될 때, 이종성 폴리뉴클레오티드는 적절한 삽입 벡터를 통해 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 당업계에 기술되어 있는 바와 같이 바큘로바이러스 벡터가 사용될 수 있다 (문헌 [Jasny, Science 238: 1653, 1987]; 및 [Miller et al., In: Genetic Engineering (1986), Setlow, J. K., et al., eds., Plenum, Vol. 8, pp. 277-297]). 곤충 세포가 숙주로서 사용될 때, 이종성 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위한 삽입 벡터에서 초파리-알콜 데히드로게나제 프로모터가 임의적으로 사용될 수 있다 (문헌 [Rubin, Science 240:1453-1459, 1988]).
VI . 표적 폴리뉴클레오티드의 염색체 랜딩 패드 내로의 통합
상기 기술된 바와 같이, 폴리펩티드를 코딩하는 표적 폴리뉴클레오티드 또는 트랜스진 (즉, "관심 폴리뉴클레오티드" 또는 "관심 유전자")은 본원에 개시된 천연 염색체 통합 부위 내로 직접적으로 통합될 수 있다. 하기 기술된 치료용 또는 산업용 단백질 중 임의의 것의 안정적이고 효율적인 발현 및 제조는 이러한 방식으로 달성될 수 있다. 별법으로, 표적 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 천연 염색체 통합 부위에 이미 삽입되어 있는 염색체 랜딩 패드를 통해 숙주 게놈 내로 통합될 수 있다. 본원에 기술된 삽입된 염색체 랜딩 패드를 보유하는 조작된 숙주 세포를 사용함으로써, 세포에서 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 트랜스진을 통합하고 발현시키는 벡터 ("표적화 벡터") 및 방법 또한 제공한다. 다양한 유용한 표적 폴리펩티드를 코딩하는 관심 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 조작된 숙주 세포의 게놈 내로 안정하게 통합될 수 있다. 관심 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 대해 내인성 또는 외인성일 수 있다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 천연적으로 존재하지 않는 서열을 가지는 핵산 분자인 반면, 내인성 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 이미 존재하고 있는 서열을 가지는 핵산 분자이다. 발현될 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 다수의 구체적인 예는 하기에 기술되어 있다.
사용하고자 하는 조작된 숙주에 따라, 다양한 표적화 벡터가 적합하게 사용된다. 삽입된 염색체 랜딩 패드를 보유하는 바람직한 숙주 세포는 포유동물 세포 (예컨대, CHO 세포)이기 때문에, 표적화 벡터는 진핵 생물 발현용 벡터가 바람직하다. 일반적으로, 표적화 벡터는 동족 재조합 부위 또는 인식 서열에 부착되어 있는 관심 유전자를 가질 것이다. 벡터 상의 동족 재조합 부위는 또한 삽입된 염색체 랜딩 패드를 인식하는 부위-특이적 리콤비나제 (예컨대, phiC-31 인테그라제)에 의해 인식된다. 따라서, 벡터 상의 동족 재조합 부위는 리콤비나제에 의해 매개되는 표적 폴리뉴클레오티드의 랜딩 패드 내로의 통합을 지지할 것이다. 예를 들어, 특이적 파지 인테그라제의 삽입된 파지 부착 부위 (attP)를 보유하는 조작된 숙주 세포에서의 통합 및 발현을 위해, 벡터는 동일한 인테그라제에 의해서도 또한 인식되는 동족 박테리아 부착 부위 (attB 부위)에 부착된 표적 폴리뉴클레오티드를 가질 것이다. 유사하게, 삽입된 랜딩 패드가 파지 인테그라제의 attB 부위를 포함할 경우, 표적화 벡터는 인테그라제에 의해 인식되는 동족 attP 부위를 포함할 것이다. 일부 파지 인테그라제, 예컨대 phi-C31 및 R4는 박테리아 부착 부위보다는 파지 부착 부위 (attP 부위)로의 통합을 선호한다. 이러한 효소의 경우, 표적화 벡터는 attB 부위를 보유하여야 하는 반면, 랜딩 패드는 attP 부위를 포함하여야 한다. 다른 파지 인테그라제는 파지 부착 부위보다는 우선적으로 박테리아 부착 부위 (예컨대, 의사 attB)로 통합된다. 이러한 선호도를 가지는 효소의 예로는 phiBT1 인테그라제 및 A118 인테그라제를 포함한다. 이러한 인테그라제가 사용될 때, 표적 벡터는 attB 부위 대신 attP 부위를 보유하여야 하는 반면, 숙주 세포는 삽입된 랜딩 패드 중 attB 부위를 함유하여야 한다.
랜딩 패드에의 통합시 표적 폴리뉴클레오티드 발현을 지지하기 위해, 표적화 벡터는 또한 표적 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열 및 다른 전사 조절 요소 (예컨대, 인핸서 서열)를 함유할 수 있다. 일반적으로, 프로모터는 그가 도입되는 세포 유형에서 기능성인 것으로 선택될 수 있다. 포유동물 숙주 세포에서의 발현을 위해 당업계에 공지된 다수의 프로모터가 사용될 수 있다. 그 예로는 마우스 메탈로티오네인 I 유전자 서열의 프로모터 (문헌 [Hamer et al., J Mol. Appl . Gen. 1:273-288, 1982]); 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터 (문헌 [McKnight, Cell 31:355-365, 1982]); SV40 조기 프로모터 (문헌 [Benoist et al., Nature ( London ) 290:304-310, 1981]); 효모 gal1 유전자 서열 프로모터 (문헌 [Johnston et al., Proc . Natl . Acad . Sci . ( USA ) 79:6971-6975, 1982]; [Silver et al., Proc . Natl . Acad . Sci . ( USA ) 81 :5951-59SS, 1984]), CMV 프로모터, EF-1 프로모터, 액틴 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 프로모터, 유비퀴틴 프로모터 및 티미딘 키나제 프로모터, 엑디손-반응성 프로모터(들), 테트라시클린-반응성 프로모터 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
추가로, 표적화 벡터는 선별 또는 스크리닝 마커 서열, 복제 기점 등을 가질 수 있다. 상기 기술된 삽입 벡터에서 사용되는 마커와 같이, 표적화 벡터 중의 선별 또는 스크리닝 마커 또한 오직 벡터를 함유하는 세포의 성장만을 선별 또는 스크리닝하는 수단을 제공한다. 그러한 선별 마커에는 전형적으로 2가지 유형이 있다: 약물 저항성 및 영양요구성. 약물 저항성 마커를 통해 세포는 해독되지 않으면, 세포를 사멸시킬 수도 있는 외인성으로 첨가된 약물을 해독시킬 수 있다. 영양요구성 마커를 통해 세포는 필수 성분 (보통 아미노산)이 부족한 배지 중에서 성장하는 동안 상기 필수 성분을 합성할 수 있다. 통상의 선별가능한 마커 유전자로는 항생제, 예컨대 암피실린, 테트라시클린, 카나마이신, 블레오마이신, 스트렙토마이신, 히그로마이신, 네오마이신, 제오신™, G418 등에 대해 저항성인 것을 포함한다. 선별가능한 영양요구성 유전자로는 히스티디놀의 존재하에 히스티딘 무함유 배지 중에서 성장할 수 있도록 하는 예를 들어, hisD를 포함한다.
선별 마커 서열 및 전사 조절 요소는, 일단 랜딩 패드에서 부위-특이적 재조합이 이루어지고 나면, 숙주 게놈 내로 표적 폴리뉴클레오티드와 함께 공동으로 통합될 수 있도록 하는 방식으로 벡터 중에 표적 폴리뉴클레오티드 및 동족 리콤비나제 인식 서열에 연결되어야 한다. 본원에 기술된 표적화 벡터는 본 명세서의 교시를 고려하여, 분자 생물학 분야에 공지되어 있는 방법을 사용함으로써 구축될 수 있다. 예컨대, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (3rd ed., 2001)]; [Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003)]; 및 [Freshney, Culture of Animal Cells : A Manual of Basic Technique , Wiley-Liss, Inc. (4th ed., 2000)]을 참조할 수 있다. 전형적으로, 랜딩 패드에 동족인 재조합 부위, 관심 폴리뉴클레오티드, 선별 마커를 코딩하는 서열, 및 본원에 기술된 다른 임의적인 요소를 적합한 벡터 골격 내로 삽입함으로써 표적화 벡터가 조립된다.
삽입된 염색체 랜딩 패드 및 표적화 벡터를 보유하는 조작된 숙주 세포 이외에도, 랜딩 패드 (예컨대, attP 부위)에서의 표적 폴리뉴클레오티드의 부위 특이적 통합을 위해서는 상응하는 리콤비나제 (예컨대, 파지 인테그라제, 예컨대 phiC-31 인테그라제)의 촉매 활성 또한 필요할 것이다. 리콤비나제 (예컨대, phiC-31 인테그라제)는 표적화 벡터의 도입 이전, 그와 동시에, 또는 그 이후에 표적 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 설명한 바와 같이, 다양한 파지 인테그라제가 고려된다. 표적 폴리뉴클레오티드를 조작된 숙주 세포 내로 통합시키는 데 사용되는 특이적 인테그라제는 표적화 벡터 중의 동족 인식 서열 및 숙주 게놈의 랜딩 패드 중의 부위-특이적 재조합 서열에 상응하고, 그를 인식하여야 한다. 일부 실시양태에서, 단방향 부위-특이적 리콤비나제는 세린 인테그라제이다. 시험관내 및 생체내 재조합에 유용할 수 있는 세린 인테그라제로는 파지 phi-C31, R4, TP901-1, phiBT1, Bxb1, RV-1, A118, U153, 및 phiFC1로부터의 인테그라제 뿐만 아니라, 긴 세린 인테그라제 패밀리 중의 다른 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예컨대, 문헌 [Gregory et al., J. Bacteriol , 185:5320-5323, 2003]; [Groth and Calos, J. Mol. Biol. 335:667-678, 2004]; [Groth et al., Proc . Natl . Aacd . Sci . 97:5995-6000, 2000]; [Olivares et al., Gene 278:167-176, 2001]; [Smith and Thorpe, Molec. Microbiol , 4: 122-129, 2002]; 및 [Stoll et al., J Bacteriol , 184:3657-3663, 2002]를 참조할 수 있다. 이러한 야생형 인테그라제 이외에도, 돌연변이를 보유하는 변경된 인테그라제 또한 당업계에 공지되어 있다 (예컨대, 문헌 [Sclimenti et al., Nuc . Acid Res . 29:5044-5051, 2001] 참조). 야생형과 비교하여 활성 또는 특이성이 변경된 상기와 같은 인테그라제 또한 재조합 반응, 및 표적 폴리뉴클레오티드의 조작된 숙주 게놈 내로의 통합에 유용하다.
일부 실시양태에서, 정제된 효소 폴리펩티드를 숙주 세포 내로 도입하여 표적화 벡터의 통합을 매개한다. 기능성 단백질을 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 파지 인테그라제 폴리펩티드, 예컨대 phiC-31 인테그라제를 리포솜, 코팅된 입자, 위스커, 미세주입법, 전기천공, 및 펩티드 수송체를 비롯한, 많은 수단에 의해 세포 내로 직접적으로 도입할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Siprashvili et al., Mol . Ther ., 9:721-728, 2004] 참조). 일부 다른 실시양태에서, 적합한 발현 벡터를 사용하여 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입할 수 있다. 인테그라제는 관심 유전자를 발현하는 동일한 표적화 벡터로부터 발현될 수 있다. 별법으로, 제2 벡터를 통해 인테그라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인테그라제를 코딩하는 DNA 서열을 발현 벡터 상에 숙주 세포 내로 도입한다. 이는 예컨대, 문헌 [Olivares et al., Gene , 278:167-176, 2001]; 및 Thyagarajan et al., Mol Cell Biol 21:3926-3934, 2001]과 같이 당업계에 기술되어 있는 바와 같이 수행될 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, 부위 특이적 통합은 리콤비나제 폴리펩티드를 코딩하는 RNA 분자의 일시적인 존재에 의존한다. 예를 들어, 파지 인테그라제를 코딩하는 mRNA 분자를 예컨대, 문헌 [Groth et al., J. Mol . Biol . 335:667-678, 2004]; 및 [Hollis et al., Repr . Biol . Endocrin . 1:79, 2003]에 기술되어 있는 바와 같이, 숙주 세포 내로 도입할 수 있고, 상기 세포에서 발현시킬 수 있다. 일반적으로는 표적화 벡터의 조작된 숙주 세포의 게놈 내로의 삽입을 위해 필요한 시간에만 오직 인테그라제가 존재하는 것이 바람직하다. 인테그라제-코딩 RNA (예컨대, mRNA)를 도입하면, 확실하게 일시적으로 발현될 수 있으며, 인테그라제-코딩 핵산이 표적 게놈 내로 영구적으로 혼입될 가능성은 제거된다. 부위-특이적 리콤비나제의 일시적인 발현은 또한 다른 수단을 통해서도 달성될 수 있다. 예를 들어, 효소를 발현하는 폴리뉴클레오티드를 조절가능한 프로모터 (즉, 발현이 선택적으로 유도될 수 있거나, 억제될 수 있는 프로모터)의 제어하에 배치할 수 있다.
표적 세포의 위치에 따라, 시험관내에서 또는 생체내에서 표적화 벡터 및/또는 파지 인테그라제를 발현하는 제2 벡터를 표적 세포 내로 도입하는 데 임의의 편리한 프로토콜이 사용될 수 있다. 예를 들어, 조작된 숙주 세포가 단리된 세포일 경우, 표적 세포의 생존가능성을 허용하는 세포 배양 조건하에서 예컨대, 표준 형질전환 기법을 사용함으로써 표적화 벡터를 직접 세포 내로 도입시킬 수 있다. 상기 기법으로는 바이러스 감염, 형질감염, 컨쥬게이션, 원형질 융합, 전기천공, 입자 총 기술, 인산칼슘 침전법, 직접 미세주입법, 바이러스 벡터 전달 등을 포함하나, 반드시 이에 한정될 필요는 없다. 방법 선택은 일반적으로 형질전환되는 세포 유형, 및 형질전환이 이루어지는 환경 (즉, 시험관내, 생체외, 또는 생체내)에 따라 달라진다. 이러한 방법에 대한 일반적인 논의는 예컨대, 문헌 [Brent et al., 상기 문헌 동일]에서 살펴볼 수 있다.
별법으로, 조작된 숙주 세포 또는 세포들이 다세포 유기체의 일부분일 경우, 표적화 벡터는 표적화 벡터가 숙주 세포(들) 내로 진입할 수 있는 방식으로, 예컨대 생체내 또는 생체외 프로토콜을 통해 유기체 또는 숙주에 투여될 수 있다. "생체내"란, 표적 구축물이 살아있는 동물의 체내로 투여된다는 것을 의미하는 것이다. "생체외"란, 세포 또는 기관이 신체 외부에서 변형되는 것을 의미하는 것이다. 전형적으로 상기 세포 또는 기관은 살아있는 신체로 다시 복귀하게 된다. 핵산 구축물을 투여하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터를 사용하여 (문헌 [Monahan et al., Gene Therapy 4:40-49, 1997]; [Onodera et al., Blood 91 :30-36, 1998]), "네이키드 DNA" 흡수 등에 의해 핵산 구축물을 양이온 지질과 함께 전달할 수 있다 (문헌 [Goddard, et al., Gene Therapy, 4:1231-1236, 1997]; [Gorman et al., Gene Therapy 4:983-992, 1997]; [Chadwick et al., Gene Therapy 4:937-942, 1997]; [Gokhale et al., Gene Therapy 4: 1289-1299, 1997]; [Gao and Huang, Gene Therapy 2:710-722, 1995]). 핵산 구축물의 생체외 투여를 위해 당업계에 주지된 세포 형질감염 기법 (상기 논의 참조)이 사용될 수 있다. 정확한 제제화, 투여 경로, 및 투여량은 실험적으로 선택될 수 있다. 예컨대, 문헌 [Fingl et al., 1975, in The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1 p 1]을 참조할 수 있다.
VII . 조작된 숙주 세포를 이용하여 발현시키고자 하는 표적 폴리펩티드 또는 단백질
상기 기술된 조작된 숙주 세포는 관심 임의의 폴리뉴클레오티드를 안정하게 발현시키는 데 유용하다. 관심 폴리뉴클레오티드는 의료용 또는 산업용으로 적용되는 다양한 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 숙주 세포에서 랜딩 패드 내로 통합시키고자 하는 관심 표적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 치료용 단백질을 코딩하는 것일 수 있다. 치료용 단백질의 예로는 인자 VIII, 인자 IX, β-글로빈, 저밀도 지질단백질 수용체, 아데노신 데아미나제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 스핑고마이엘리나제, 글루코세레브로시다제, 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절인자, α-안티트립신, CD-18, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기노숙시네이트 신테타제, 페닐알라닌 히드록실라제, 분지쇄 α-케토산 데히드로게나제, 푸마릴아세토아세테이트 히드롤라제, 글루코스 6-포스파타제, α-L-푸코시다제, β- 글루쿠로니다제, α-L-이듀로니다제, 갈락토스 1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제, 인터류킨, 시토카인, 소형 펩티드 등을 포함한다. 조작된 숙주 세포에서 통합된 표적 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있다는 다른 치료용 단백질로는 예컨대, 헤르셉틴(Herceptin)®, 각종 병원체, 예컨대 질환 유발 박테리아 또는 바이러스 (예컨대, E. 콜라이, P. 아에루기노사(P. aeruginosa), S. 아우레우스(S. aureus), 말라리아, HIV, 광견병 바이러스, HBV, 및 시토메갈로바이러스)로부터의 폴리펩티드 항원, 및 다른 단백질, 예컨대 락토페린, 티오레독신 및 베타-카제인백신을 포함할 수 있다.
관심 단백질에 대한 추가의 예로는 에리트로포이에틴, 조직 플라스미노겐 활성 인자 (tPA), 우로키나제, 스트렙토키나제, 뉴트로포에시스 자극 단백질 (이는 또한 필가스팀 또는 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)로도 공지되어 있다), 트롬보포이에틴 (TPO), 성장 호르몬, 헤모글로빈, 인슐리노트로핀, 이미글루세라제, 사르그라모스팀, 엔도텔린, 가용성 CD4, 및 항체 및/또는 그의 항원-결합 단편 (예컨대, FAb) (예컨대, 오르토클론 OKT-e (항-CD3), GPIIb/IIa 단일클론 항체), 섬모 신경 돌기 형질전환 인자 (CNTF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 뇌 유래 신경 돌기 인자 (BDNF), 부갑상샘 호르몬 (PTH)-유사 호르몬, 인슐린자극성 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 표피 성장 인자 (EGF), 산성 섬유아세포 성장 인자, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 형질전환 성장 인자 β, 신경 돌기 성장 인자 (NGF), 인터페론 (IFN) (예컨대, IFN-α2b, IFN-α2a, IFN-αN1, IFN-β1b, IFN-γ), 인터류킨 (예컨대, IL-1, IL-2, IL-8), 종양 괴사 인자 (TNF) (예컨대, TNF-α, TNF-β), 형질전환 성장 인자-α 및 -β, 카탈라제, 칼시토닌, 아르기나제, 페닐알라닌 암모니아 리아제, L-아스파라기나제, 펩신, 유리카제, 트립신, 키모트립신, 엘라스타제, 카르복시펩티다제, 락타제, 수크라제, 내인성 인자, 혈관활성 장 펩티드 (VIP), 칼시토닌, Ob 유전자 생성물, 콜레시스토키닌 (CCK), 세로토닌, 및 글루카곤을 포함하나, 반드시 이에 한정될 필요는 없다.
통합된 표적 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는, 관심 적합한 폴리펩티드로는 또한 특이적 막 단백질 또는 다른 세포내 단백질을 포함한다. 막 단백질의 예로는 아드레날린성 수용체, 세로토닌 수용체, 저밀도 지질단백질 수용체, CD-18, 사르코글리칸 (근이영양증인 경우, 결핍되어 있는 것) 등을 포함하나, 반드시 이에 한정될 필요는 없다. 유용한 세포내 단백질로는 주로 세포내 구획 내에 위치하는 단백질, 또는 세포 내에서 원하는 생물학적 활성을 보이는 단백질을 포함한다. 그러한 세포내 단백질로는 유전성 티로신혈증 1형을 앓는 대상체에서 결핍되어 있는 푸마릴아세토아세테이트 히드롤라제 (FAH)를 포함한다. 세포내 단백질의 다른 구체적인 예로는 항바이러스 단백질 (예컨대, 바이러스 복제 또는 감염된 세포의 선택적 사멸을 억제시킬 수 있는 단백질), 구조 단백질, 예컨대 콜라겐, 즉, VII형 콜라겐 COL7A1 유전자 (열성 이영양성 수포성 표피박리증 (RDEB)에서 결핍되어 있는 것), 및 디스트로핀 (근이영양증에서 결핍되어 있는 것)을 포함한다.
VIII . 키트 , 및 트랜스진이 통합되어 있는 트랜스제닉 동물
본원에서는 상기 기술된 조작된 숙주 세포를 사용하기 위한 키트를 제공한다. 키트를 통해 당업자는 본원에 개시된 하나 이상의 천연 염색체 통합 부위에 표적 트랜스진 또는 삽입된 염색체 랜딩 패드를 보유하는 조작된 숙주 세포에서 이종성 폴리뉴클레오티드를 부위-특이적으로 통합시키고/거나, 발현시킬 수 있다. 본원에 기술된 일부 키트는 표적 폴리뉴클레오티드가 게놈 중 천연 염색체 통합 부위에 직접 삽입되어 있는 조작된 숙주 세포 (예컨대, CHO 세포)를 포함한다. 일부 다른 키트는 게놈 중 천연 염색체 통합 부위 내로 사전 통합되어 있는 하나 이상의 염색체 랜딩 패드에 표적 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 있는 조작된 숙주 세포를 포함한다. 본원에 기술된 추가의 일부 다른 키트는 하나 이상의 천연 염색체 통합 부위에 염색체 랜딩 패드가 삽입되어 있는 재조합 세포 및 염색체 랜딩 패드 내로 표적 폴리뉴클레오티드를 삽입시키기 위한 다른 시약을 포함한다.
예시하는 바와 같이, 본원에 기술된 일부 키트는 하기 성분들, 본원에 기술된 천연 염색체 위치 중 하나 이상의 위치에 삽입된 랜딩 패드 (예컨대, attP 부위)를 보유하는 조작된 숙주 세포 (예컨대, CHO 세포주), 이종성 폴리뉴클레오티드를 클로닝 및 통합시키기 위한 표적화 벡터, 및 인테그라제 성분 (예컨대, phiC-31) 중 적어도 하나 이상을 포함한다. 키트는 임의적으로는 또한 표적화 벡터로 클로닝 및 숙주 세포에서 발현시키고자 하는 표적 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 전형적으로, 표적화 벡터로의 클로닝시, 이종성 표적 폴리뉴클레오티드는 삽입된 랜딩 패드에서의 통합을 위해 인테그라제에 의해서도 인식되는 동족 서열 (예컨대, attB 부위)에 부착된다. 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 인테그라제 성분은 임의의 적합한 형태로 (예컨대, 표적 세포 내로의 도입을 위해 제제화된 단백질로서, 또는 조작된 숙주 세포 내로의 도입 후, 원하는 인테그라제로 발현시키는 인테그라제 벡터로) 제공될 수 있다. 따라서, 일부 키트는 실질적으로 정제된 리콤비나제 폴리펩티드 (예컨대, phiC-31)를 포함할 수 있다. 일부 다른 키트는 숙주 세포에서 효소를 발현시킬 수 있는 제2 벡터를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 키트는 임의적으로 다른 성분, 예컨대 표적화 폴리뉴클레오티드를 클로닝시키기 위한 제한 효소, 제어 플라스미드, 완충제 등을 포함할 수 있다. 키트의 다양한 성분이 별개의 용기에 존재할 수 있거나, 또는 원하는 대로, 특정의 화합성 성분은 단일 용기 내로 사전 조합될 수 있다.
다양한 시약 이외에도, 본원에 기술된 키트는 전형적으로는 관심 폴리뉴클레오티드를 통합 및 발현시키는 데 있어서 키트의 성분을 사용하는 방법에 관한 설명서를 추가로 포함한다. 대상 방법 실시에 관한 설명서는 일반적으로 적합한 기록 매체 상에 기록되어 있다. 예를 들어, 설명서는 기판, 예컨대 종이 또는 플라스틱 등에 인쇄되어 있을 수 있다. 따라서, 설명서는 키트에 패키지 삽입물로서, 키트 또는 그의 성분의 용기의 라벨링 (즉, 패키징 또는 서브패키징과 결합되어 있는 것)으로 존재할 수 있다. 다른 실시양태에서, 설명서는 적합한 컴퓨터 판독가능한 저장 매체, 예컨대 CD-ROM, 디스켓 등에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로서 존재한다. 추가의 일부 다른 실시양태에서, 실제 설명서는 키트내 존재하지 않지만, 예컨대 인터넷을 통해 원격 소스로부터 설명서를 얻기 위한 수단으로 제공된다. 상기 실시양태의 일례는 설명서를 살펴볼 수 있고/거나, 그로부터 설명서를 다운로드 받을 수 있는 웹 어드레스를 포함하는 키트이다. 설명서와 마찬가지로, 설명서를 얻기 위한 수단도 적합한 기판 상에 기록되어 있다.
본원에 개시된 하나 이상의 천연 염색체 통합 부위에 이종성 폴리뉴클레오티드 (트랜스진 또는 염색체 랜딩 패드)를 삽입함으로써 그의 게놈이 변형되어 있는 것인 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물을 추가로 제공한다. 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물은 또한 염색체 랜딩 패드가 삽입되어 있고, 삽입된 랜딩 패드에 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드를 통합함으로써 추가로 변형되어 있는 게놈을 가질 수 있다. 본원에 기술된 방법으로 제조될 수 있는 트랜스제닉 동물의 예로는 마우스, 래트, 닭, 고양이, 개, 토끼, 돼지, 염소, 양, 소, 말 뿐만 아니라, 비인간 영장류, 예컨대 레서스 원숭이를 포함한다. 본원에 기술된 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물은 천연 염색체 통합 부위 중 하나 이상의 부위에서 게놈 내로 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 트랜스진을 통합함으로써 제조될 수 있다. 다른 트랜스제닉 동물 또는 식물은 본원에 기술된 바와 같이 게놈 내로 이미 삽입되어 있는 염색체 랜딩 패드로 표적 폴리뉴클레오티드를 통합시킴으로써 제조된다. 표적 세포는 본원에 기술된 시스템 및 방법을 사용하여 쉽게 유전자 변형될 수 있고, 본원에 기술된 트랜스제닉 동물을 제조하는 데 적합한 임의의 세포일 수 있다. 표적 세포는 예컨대, 배양물 중에서, 또는 다세포 유기체 (예컨대, 포배에서, 태아에서, 또는 출생후 동물 등에서)에서 단리될 수 있다. 예시적인 표적 세포로는 1차 세포, 2차 세포, 형질전환된 세포, 난세포, 수정란 세포, 단세포 배아, 체세포 (예컨대, 근육, 뼈, 연골, 인대, 힘줄, 피부 (진피, 표피 등)), 내장 세포 (예컨대, 폐, 간, 췌장, 위장관 (입, 위, 장) 등), 줄기 세포 (예컨대, 배아 줄기 세포 (예컨대, 배아 줄기 세포 표현형을 가지는 세포), 성체 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 등), 및 생식 세포 (예컨대, 원시 생식 세포, 배아 생식 세포 등)를 포함하나, 반드시 이에 한정될 필요는 없다.
트랜스제닉 동물 또는 식물은 당업자에 의해 통상 실시되는 방법을 사용함으로써 제조될 수 있다. 예컨대, 하기 문헌을 참조할 수 있다:
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및 미국 특허 번호 제5,175,384호, 및 미국 특허 번호 제4945050호, 제5175384호, 및 제5175385호.
실시예
하기 실시예는 본원에 기술된 범주를 제한하고자 하는 것이 아니라, 추가로 설명하기 위해 제공한다. 다른 변이형도 당업계의 숙련가에게는 쉽게 자명해질 것이며, 첨부된 특허청구범위에 포함된다.
실시예 1 강력한 전사 활성을 가진 천연 염색체 부위 확인
CHO 게놈 내로의 무작위 통합을 위한 플라스미드: 문헌 [Thyagarajan et al., (2001, Mol Cell Biol . 21(12):3926-34)]에 기술되어 있는 원래의 attP 함유 플라스미드에 기초하여 플라스미드를 변형시켰다. 구체적으로, 제오신 마커를 네오마이신 마커로 대체하여 원래의 플라스미드를 변형시켰다. 추가로, 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 SV40 프로모터에 의해 제어되는 EGFP 유전자로 대체하였다 (도 1).
안정한 형질감염: 변형된 플라스미드를 퀴아젠 미디프렙(Qiagen midiprep) 칼럼을 사용하여 정제하였다. 25 ㎍의 DNA를 밤새도록 제한 효소 BamHI로 분해하여 플라스미드를 선형화시켰다. 이어서, 생성된 선형 DNA로 CHO 세포를 형질감염시켜 안정하게 통합시켰다. 형질감염 후 2일이 경과하였을 때, 세포를 새 플레이트로 나누어 놓고, 안정한 통합 이벤트 선별을 위해 히그로마이신을 성장 배지에 첨가하였다. FACS 분석을 위해 수거하기 전 3일 동안 세포를 배양물 중에서 성장시켰다.
FACS: 히그로마이신 선별하에 배양물 중에서 3주 동안 성장시킨 후, 스크립스 FACS 코어 퍼실리티(Scripps FACS Core Facility)에서 대량 분류하기 위해 안정한 세포를 함께 풀링하고; EGFP 발현 세포 중 상위 1%를 수집하고, 배양 배지로 복귀시켜, 회복시키고 수주 동안 성장시켰다. 세포 배양 플레이트가 컨플루언트되었을 때, 세포를 수집하고, FACS에 의해 다시 분류하였다. 이 시점에서, EGFP 발현 세포 중 상위 1%를 개별 세포로 96웰 플레이트의 웰로 분류해내었다.
단일 세포 집단: 96웰 플레이트로 분류된 세포를 2 내지 3주 동안 상기 플레이트에서 성장시킨 후, 24웰 플레이트로 옮겨 놓았다. 1주후, 확장 배양을 위해 세포를 6웰 플레이트로 옮겨 놓았다. 이 단계에서, 단일 세포 집단이 안정하게 통합된 attP 함유 플라스미드 구축물을 함유하고, EGFP 발현을 유지하는지 확인하기 위해 EGFP 발현을 체크하였다.
성장 속도 체크: EGFP 발현을 확인한 후, 모체 CHO 세포주와 함께 단일 세포 집단을 성장 속도에 대해 체크하였다. 세포를 웰당 10,000개의 세포로 6웰 플레이트에 시딩하였다. 3개의 시점: 플레이팅 후 24시간째, 48시간째 및 72시간째에 세포 개수를 계수하였다. 안정성 연구를 위해 모체 CHO 세포주와 등가이거나, 그보다 빠른 속도로 성장하는 세포만을 추가로 배양하였다.
안정성 연구: 발현 안정성을 측정하기 위해 단일 세포 집단을 최대 4개월까지 추가로 배양하였다. 매달 1회씩 EGFP 발현에 대해 세포를 체크하였다. 배양 기간 종결시, 성장 속도 및 EGFP 발현, 둘 모두를 체크하여 단일 세포 집단이 EGFP 발현을 고수준으로 유지하였는지, 및 모체 CHO 세포만큼 빠른 속도로 또는 심지어 그보다 더 빠른 속도로 성장하였는지를 확인하였다. 이 단계 후, 염색체 통합 부위 확인을 위한 우수한 후보 물질로서 20개의 단일 세포 집단을 선택하였다.
통합 부위 확인: 상위 20개의 단일 세포 집단으로부터 게놈 DNA를 정제하였다. 개별 DNA 샘플의 농도를 체크하고, 4개의 평활 말단 생성 제한 효소: EcoRV, PvuI, StuI 및 HincII를 사용하는 효소 분해를 위해 10 ㎍의 전체 DNA를 사용하였다. 이어서, 페놀 및 클로로포름을 이용하여 완전하게 분해된 DNA 샘플을 정제하였다. 이어서, 에탄올을 사용하여 상기 DNA 샘플을 침전시키고, 이중 가닥 DNA 링커 분자 (게놈 워커 어댑터스(Genome Walker Adaptors))에 결찰시켰다.
히그로마이신 저항성 유전자에 기초하여 3개의 유전자 특이적 프라이머 (GSP)를 디자인하였다. GSP1 및 AP1 (어댑터 프라이머 1)을 1차 PCR 반응에서 사용하였고; GSP2 (네스티드유전자 특이적 프라이머) 및 AP2 (어댑터 프라이머 2)를 2차 PCR 반응에서 사용하였다. 필요한 경우, GSP3 및 AP2를 3차 PCR 반응에서 사용하여 특이적 생성물을 수득하였다.
그 결과, 안정한 통합 및 강력한 전사 활성을 지지하는 CHO 게놈 중의 천연 염색체 통합 부위는 안키린 2 유전자 (Ank2), 절단 및 폴리아데닐화 특이적 인자 4 유전자 (Cpsf4), C-Mos 유전자, 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자에 존재하는 것으로 나타났다. 이종성 서열의 통합을 위한 유전자의 정확한 위치는 각각 도 3-6에 명시되어 있다 (서열 번호 1-4).
실시예 2 확인된 천연 염색체 통합 부위에의 랜딩 패드 삽입
상동성 재조합: 통합 부위의 측면에 위치하는 게놈 DNA를 확인하고, 양성 및 음성 선별 마커, 둘 모두를 함유하는 플라스미드로 클로닝하였다 (도 2). 각 부위에 대해 보다 긴 상동성 아암 (길이가 3 내지 4 kb)을 네오마이신 저항성 유전자의 5'에 클로닝하였다. 보다 짧은 상동성 아암 (길이가 1.5 내지 2 kb)은 네오마이신 저항성 유전자의 3'에 클로닝하였다. 하나의 단일 파지 부착 부위 attP는 긴 상동성 아암의 말단에 위치하였다.
상동성 재조합 플라스미드를 NotI 효소로 분해하여 플라스미드를 선형화시켰다; 긴 상동성 아암은 상기 선형 DNA의 한쪽 말단에 위치하였다. CHO 세포로의 형질감염시, 네오마이신을 배양 배지에 첨가하여 상기 선형 DNA가 세포 염색체 내로 통합되어 있는 세포를 선별하였다. 4 내지 6주 경과 후 저항성 클론 풀을 수득하였다. 이어서, 플라스미드가 무작위로 통합되어 있는 세포를 사멸시키는 간시클로비르를 배양 배지에 첨가하여 세포를 음성 선별하였다. 표적 부위에서 상동성 재조합이 이루어진 세포만이 양성 및 음성 선별에서 살아남게 되었다. 상기 두 선별 회차 모두를 마친 후에, 살아남은 세포를 선별하고, 24웰 배양 플레이트 중에서 성장시키고, 6웰 플레이트로 확장시켰다. 이어서, 게놈 DNA를 상기 세포 클론으로부터 단리시키고, 표적화된 위치로의 attP 부위 통합에 대해 체크하였다.
랜딩 패드 통합: attP 부위가 원하는 위치 내로 삽입되었는지를 확인한 후, 파지 Phi-C31 인테그라제 시스템을 사용하여 재조합 유전자를 attP 부위 내로 통합시키는 데 상기 세포주를 사용할 수 있었다. 단일 attB 부위를 함유하는 플라스미드로 재조합 유전자를 클로닝하였다. 재조합 유전자 및 Phi-C31 인테그라제 유전자를 함유하는 플라스미드로 공형질감염시킬 때, 세포를 특이적 통합 이벤트에 대해 선별할 수 있었다.
비록 상기 발명은 명확한 이해를 목적으로 예시 및 일례에 의해 좀 더 상세하게 기술되기는 하였지만, 첨부된 특허청구범위의 정신 또는 범주로부터 벗어남 없이 본 발명에 대한 특정의 변형 및 수정이 이루어질 수 있다는 것이 본 발명의 교시를 고려하여 당업계의 숙련가에게는 쉽게 자명해질 것이다.
본 명세서에서 인용된 모든 공개 문헌, 데이터베이스, 진뱅크 서열, 특허, 및 특허 출원은 마치 이들이 각각 참고로 포함된다고 구체적으로 및 개별적으로 명시된 것과 같이 본원에서 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> The Scripps Research Institute Mauro, Vincent P. Zhou, Wei Cunningham, Bruce Edelman, Gerald M. <120> CHROMOSOMAL LANDING PADS AND RELATED USES <130> 37651-505001 / 1413.1 / PRM0035P <140> UNKNOWN <141> 2012-04-05 <150> US 61/516,612 <151> 2011-04-05 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 254 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <223> Ankyrin 2 <400> 1 aaaatttctt gctttcttct aaaagcatta tctataaata tttgttgtct aaaactcatt 60 tttcccatgt ttagtgtgtg tgtttatgcg tgagtgcata ttgtcttggc taccatgaag 120 agaaatatta tttttccttc cagtgttctt gagtggcaaa ttacttttct gttgcagtgt 180 gacaacacca ggggcagaag gggcagagac tcaaaaagcc acagaagttc ctgactctct 240 ctgtaagact cctg 254 <210> 2 <211> 1148 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <223> cleavage and polyadenylation specific factor 4 (Cpsf4) <400> 2 ataaaatcaa aataatgcat cttttgaaga aagcataaaa accaatatac agaattgtga 60 tatgacccgg catccctttt gggacggcag tgactgcagg cgagaaggag gggatggcag 120 agagcagtgt gaagtgggga gggcagctaa gagacctgag ggggagccag gtcctaggcc 180 tctgccgccg ctgccatgca taaaatcatc gccagcgtgg accctatcaa 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gtgcttcagt tgggtccctt gagccagctt gcttggacat cagtgcctca ttttttggac 1140 tatgtgct 1148 <210> 3 <211> 743 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <223> C-Mos <400> 3 cagacatttg ttgaactact tgccagggtt attagatgca acctttgtaa gaattaacat 60 ctgtaacttt aatgtctttg atccaaatac aatcacttat agaagtcaga tcacatacct 120 tttacgttca tcagaaggga gcattctgac actgtatttg atttaaacag caagttaaga 180 ctctgtaaca taacaacaca gtgacctccc aatatccctt tccaaggcaa gttaagccac 240 cccatgagtg tgagtttgct tcaagacaga ttctagactt cacagaaagc aagttcctgg 300 aatttaatgc agagttggag gaaggaagaa aggaacaaag gtgattgtga tgaccacggc 360 tgtaaatatc agcaagcgtg ggaaaacaga ggaaaagtca ggagaaatag acatggctca 420 gaatcactgg tacccatcta taatatggaa aagcagatgc tgaacacaaa ttcagggtct 480 ggccatcaaa ccacacattc ctcctttttt gttttataaa aatgcgctca gttttatgct 540 atatctctgg gagaatgggg aagagccttg ctctgtttat tcaaaaacgt ttctcaaagt 600 ggctaggagt tactcctctt agctgcttgg taaggtgttt tatgcataca ggtgataagt 660 gatcactttt catgtgacag ctgtgtccct ttgacttcag aatcacaggt tttgagaaga 720 caataaagga gagacatata aac 743 <210> 4 <211> 618 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <223> Nephrocystin-1/Mal <400> 4 cctccagaaa gccttgcggg tcaactaaga attcggtcta acgactcacc aaccctcaac 60 actcctcatc cctcaggccc ttgtctaaac tagccagacc cacccagccc agcgcccctc 120 tcctttgaaa ttcatcactt tctcaaagtg taacaggtgt caacgtatag tcttaataaa 180 ctaaccaagg acagattagt aatttcagaa aagttaattt caaagatgat caaacacaaa 240 agatcgtagc gattttaagt cataaccctc agtgctgagg aagactcgat gaaacaggcg 300 atgccctggt atatagtcta catttctgga cagcagtttg acaacatata gcgagcattg 360 atcctcctag gctggttgat tacattctca gcaatctccc acttacaata acttaaaagt 420 gtgacagaga tggatattta aatgtgttca ccacattttt tgcttataat agaaaagctg 480 aatatgaata aatgataggt attagtggga tggataaact aatccataga tggattaatg 540 ttatacaggg cttctcagtt cttcttttga gggaaaggat ttagtggcag gacacaaagc 600 ttaaacagaa gtttatat 618 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Bacteriophage phi-C31 <223> phi-C31 phage integrase attP site strand 1 <400> 5 ccccaactgg ggtaaccttt gagttctctc agttggggg 39 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acaagagctc agactgtcaa agcttagggg tttcttatgt 360 tccagtcttt ctagtttgaa agtaaaaata taagaataaa aaaatgaaag aaccatcaat 420 agaaacaaaa ccacagaaag ctgtgtagct ttggcacggt tgaggaagta tacactgggg 480 aagcctgacc ttttgaaaag ctgtgtcact gtccagtcct tccaagacct gaggctggtc 540 atctgctgac tccactatca ccaggctggt tttccttgga gacttctcct cattgggctc 600 aggagcttcc tcgggttctt gcacgatggg agaaccacgc tcgctagtca ctggggtctg 660 gagacaagac tttgcttcct ctgcaggggt actgatgtcc tcaggagtct tacagagaga 720 gtcaggaact tctgtggctt tttgagtctc tgccccttct gcccctggtg ttgtcacact 780 gcaacagaaa agtaatttgc cactcaagaa cactggaagg aaaaataata tttctcttca 840 tggtagccaa gacaatatgc actcacgcat aaacacacac actaaacatg ggaaaaatga 900 gttttagaca acaaatattt atagataatg cttttagaag aaagcaagaa attttagcag 960 aataaaataa acccatatta atgtagttag tataattata aacataatgg agcataattg 1020 catatcatta tttaatggaa ggaactgttg acactgacac tctggcagtt tggagtgact 1080 ctcatgcagc cttttaaaac ctcagtttgt aagtaagaac atcatttccc cttttttgct 1140 tcttgctttg tatccaacag ttttctgtcc caaaggtaca ttttactctc tctgtctttc 1200 ttttccttcg cttttctgt 1219 <210> 11 <211> 2001 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <223> Cpsf4 Gene <308> GenBank NCBI No. NW_003614125.1 <309> 2011-10-27 <400> 11 aaaaacggtt ctgaaaattg gaatgatacg gtaatttact gagaatatat tatttcttgg 60 gtctttccat tctttgttca tcatagatta aattaaattc atgtgaagag acagccccaa 120 gaacaagtcc agactcatca aaactttaag aatatgggcc ggtttcacca ctcagtggaa 180 aaaccatttg tggttcctac agaggatctg ggttatgtcc caacatccta tagcagcagc 240 ttacaatcct tcttacctct agttccagga ctttgatcac cgcttacatt acatatgcac 300 aattgacata catacatgtg gacaaaacac tcatacacat aaaatcaaaa taatgcatct 360 tttgaagaaa gcataaaaac caatatacag aattgtgata tgacccggca tcccttttgg 420 gacggcagtg actgcaggcg agaaggaggg gatggcagag agcagtgtga agtggggagg 480 gcagctaaga gacctgaggg ggagccaggt cttaggcctc tgccgccgct gccatgcata 540 aaatcatcgc cagcgtggac cctatcaagt tcgacttgga gatcgccatg gagcaacagc 600 tccaggccct tccctggata agtcgggggc tgctgtctga gaattcattt tgaaagctgc 660 ctgtggcaaa tgtggcatgt gtccattccg ccacattagt ggtgagaaga cagttgtgtg 720 caaacactgg ctaagagcac tctgcaagaa aggggaccag tgtgagttct tacatgagta 780 cgacatgacc aagatgcccg agtactactt ttactccaag ttcgggaaat gcaacaacaa 840 ggagtgcccc ttcctgtaca tcgaccctga gtctaagatt aaggactgcc cttggtatga 900 ccacggcttc tgtaagcatg gccccctgtg caggcatcgg cacactcgga gagtcatttg 960 tgtgaattac ctggtaggat tctgccctga ggaaccctag ggtagattca tgcaccctcc 1020 atttgaactg cccatgggaa ccactgagca acctccacta ccacaacaga tacagcctcc 1080 aacaaagatc attgggttca tgcagagtca aaatagcagt gcagggaacc tgggaccctg 1140 gacattggag caagtcactt actataagtg tggtaaaaaa ggacactatg ccaacagatg 1200 caccaaaggg ccaattggca tttctcagtg gacagtgaca atagctgggc tctgtggagc 1260 agcctaagag acctgctgtt ggtaacaagc acttagctgc tcaatgtagt gctggcagga 1320 ctggctagag cctcaggcac acttgccagg gctcattttg aggggccatg tctgtcctat 1380 cattttgctg taatcttttt tctttaaaga aggaacatgt gcttcagttg ggtcccttga 1440 gccagcttgc ttggacatca gtgcctcatt ttttggacta tgtgctctct tccctcttgg 1500 agagagagaa gttgggaagg gctgtgtttc ttggtcctgt ttggaagatg actagcagtt 1560 cctttcaggg cctcattaaa caccagcacc gggataggat gggtggatca tgtgggactg 1620 tggccaggtc accctgcttt ctccaggtcc agccgaagcc tcgaggtgtg tctatgaatg 1680 tgacgtgaac aagggagcgc ttctagacaa acttggagca tttactgcct ggcctggccc 1740 tggctcttta gagaggtgtc aggatcccag gctgagctgc ttttctgggc ttgctttctt 1800 gtggatactt gcctgacagt gcttcgggca caccttcagt cagtgctgca ggccaccttt 1860 aaatagctga cccagttgaa ctgcacctac ctcctgccaa gcaaactctg tgctgtcatt 1920 cagaccccca tggcatgcag aggccaccca tccttgagcc tagaaaatgt gaatccatca 1980 tctgcaacct gctgggcaaa t 2001 <210> 12 <211> 2001 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <223> C-Mos gene <308> GenBank NCBI No. NW_003614707.1 <309> 2011-10-27 <400> 12 aaaaaaagca cagtgaactt gtgcactttt caggctataa tgattgttag tgctagtcct 60 cctcagctgc gttaaatcac tccaagcagc tattggatgc aagagttgca atacaaatag 120 caggcatttg tcgaaccact tgccaagatt attaggtgca accttcataa gaattaaaaa 180 ttgtaacttt aatgtcatta atcaaaatag aatcagtgat acaaaacatg cacacctcct 240 aagttcatca gaagggggat tctgatggat ttgatttcta cagcaagaag acttcttagc 300 aacaccccga cttcctacca gtccttcctt tccaggcaag tcaggtcacc cagattctag 360 accacagcca acaagttact ggaacttaac acagacttgg agggagagaa aaaggaacaa 420 agtgagtgtg atggccatag ctgtaaataa gcacaggaaa accaggagga acagacatgg 480 cacagaatca ctggaatcct tctatagtac agaaaagcag gcactaaaca taaattcagg 540 gcctggccac caaaccagac tcatcatttc caattttcat aatacagtgc tcattttcat 600 gccatatttt tgggggaaaa gaagagagca acaatcttac tctgtcattt aaacagtccc 660 tgaaagtgct caggagctac acttttcagc acttggtaaa gctttttttt tttttttttt 720 cttttttgct tacatgtgat aagtgaccac tttttatgtg acagctatgt gcttctgatt 780 ttagaactac aggttttgag aaggcaagtt aataaagaga gccgtttcta tcaacaactc 840 aaaattcata taacttcaaa tttctacttg atgttaataa tatggttcag tctgtcacct 900 tgggcataat cttttttatt tatttatatt ggaaacaagc ttcttttaca tgtcaatcta 960 agttctctct ccctcccttc ctcccctgcc cctgaccgac ccctttatac caatcccttt 1020 ctgctcccca gggaaggtga ggccttccat gggggatctt caaagtctgt catatcattt 1080 ggagcagggc ctagaccctc cccagtgtgt ctaggctgag aaagaatccc tctatgtgga 1140 gagggctcct tgggcataat atttaattgt ttgaacctca atgctttatt aagaaattag 1200 gataataatt attaaaaaaa ttttttgggg ggagaatgaa agttgggtat ttctgaacag 1260 attaacggga caaactatta aaaaatgtaa actatagagc attttagtat aatccccatt 1320 ctgtgccatt gtaccaaatg ccaaataaaa aggcatggca aaatataaaa gtgctgaaat 1380 taggtggtta gtggtggcac acacaccttc gatcccagca ttcgggaagc agaagcaggc 1440 ggatctctct gagttcaatg tcagcctggt ctacagagcg agttccagga cagccaaaga 1500 tacacagaga aaccctgtct tgaaatacct tcccccaaaa agagtactgg aatcacacta 1560 taaatttgct tgatatctat catatagata aaattacagc tctggactca gaactgtggg 1620 ctttaagggg gtaagagtaa tagggtgcct taaaactctg ggtatcacac aaaatacatt 1680 acaatgtgat tcattatttt gtgtgttcca gttttaagac aacctcataa ataattcatt 1740 tctaaagccc aatttagaat ataaggtatt agtgaaggaa tgattcacaa cttacacaca 1800 tctcaagttc actcttccat cactggccta tctactcaag tttaacagaa tgtccattat 1860 tcactacttg tttactttta tagatatttt aaattacaaa tgggttacat cctaataagc 1920 ccatcaaagg ttgaaagtac taataggtgg aaaatgcatt cattaaatgc tttacctaca 1980 aaatgtcaga gatggttatc a 2001 <210> 13 <211> 1001 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <220> <221> misc_feature <222> (310)..(348) <223> n is a, c, g, or t <223> Nephrocystin-1/Mal Gene <308> GenBank NCBI No. NW_003613665.1 <309> 2011-10-27 <400> 13 gaagccaaat cgcgagtctc acaaatgcca caggaaagct ctcgtagcta tggagtttac 60 catgcttaaa ctatttcaaa gtttagtttc ccggaacagg cgtcggaaag ctgcatagaa 120 cagagcaacg catggtacga ggtcgtgata gtgacgagac gcacagtctg aggactcccg 180 ggttacgtcc ccatccttag gaatccacag tagttgttct taggccgttt agcgaatccg 240 gtggcgctgg gtggcggcgc ccgctgatag cgtcatcttg ctgagctccc gttttggttt 300 ccctggcaan nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngc tcaggcgccg 360 cgggcaggag cttaagcttc aggtaggtgc atgggagggg gccccacatc ccagcccctc 420 gccaggaccc gagcgctggg ccgcagcgtt ctaacctcga tccccgccgt agacaaaacc 480 tccagaaagc cttgctagtc agctaacacc tcagtcctta acccctctca cccctcccgc 540 gcatgtctag actagtcaga tccaccccag tcctttgcca ctctgctttg aaagtcatcg 600 ctttctcaaa aatcaagtgt aacaggtgtc aagtgtagca agaatagtgt taatacctga 660 gatccgataa acgagccaag gacaggagat tagtaactta agttaatttc aaaggtagtc 720 aagcacctgc aaaagaggta agatcgtagc gattttaagt cataaccctc agtgctgagg 780 aagactcgat gaaacaggcg atgccctggt atatagtcta catttctgga cagcagtttg 840 acaacatata gcgagcattg atcctcctag gctggttgat tacattctca gcaatctccc 900 acttacaata acttaaaagt gtgacagaga tggatattta aatgtgttca ccacattttt 960 tgcttataat agaaaagctg aatatgaata aatgataggt a 1001

Claims (40)

  1. 안키린 2 유전자 (Ank2), 절단 및 폴리아데닐화 특이적 인자 4 유전자 (Cpsf4), C-Mos 유전자, 및 네프로시스틴(Nephrocystin)-1/Mal 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 내에 또는 그에 인접하게 위치하는 천연 염색체 부위에서 숙주 세포의 게놈 내로 이종성 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 것을 포함하는, 숙주 세포에서 이종성 폴리뉴클레오티드를 안정하게 통합시키고 발현시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오티드의 삽입이 상동성 재조합에 의해 또는 하이브리드 리콤비나제(hybrid recombinase)에 의해 매개되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 숙주 세포가 포유동물 세포인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 숙주 세포가 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 천연 염색체 삽입 부위가 Ank2 유전자의 경우 서열 번호 1의 130-131번 위치, Cpsf4 유전자의 경우 서열 번호 2의 629-630번 위치, C-Mos 유전자의 경우 서열 번호 3의 272-273번 위치, 네프로시스틴-1/Mal 유전자의 경우 서열 번호 4의 239-240번 위치에 또는 그에 가깝게 존재하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오티드가 폴리펩티드를 코딩하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 폴리펩티드가 치료용 단백질 또는 산업용 단백질인 방법.
  8. 제1 상동성 아암(arm), 이종성 폴리뉴클레오티드 서열, 및 제2 상동성 아암을 포함하며,
    여기서 제1 및 제2 상동성 아암은 각각, 안키린 2 유전자 (Ank2), 절단 및 폴리아데닐화 특이적 인자 4 유전자 (Cpsf4), C-Mos 유전자, 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 내에 또는 그에 인접하게 위치하는 천연 염색체 삽입 부위의 측면에 위치하는 5'- 및 3'-서열과 실질적으로 동일한 것인,
    이종성 폴리뉴클레오티드 서열을 포유동물 세포의 게놈 내로 안정하게 통합시키기 위한 재조합 폴리뉴클레오티드.
  9. 제8항에 있어서, 천연 염색체 삽입 부위가 외래 유전자의 안정한 통합을 지지하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  10. 제8항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드를 코딩하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  11. 제8항에 있어서, 폴리펩티드가 치료용 단백질 또는 산업용 단백질인 폴리뉴클레오티드.
  12. 제8항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오티드 서열이 부위-특이적 재조합 서열 (염색체 랜딩 패드(chromosomal landing pad))을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  13. 제12항에 있어서, 부위-특이적 재조합 서열이 파지 인테그라제(phage integrase)에 의해 인식되는 인식 서열인 폴리뉴클레오티드.
  14. 제13항에 있어서, 파지 인테그라제가 phiC-31 인테그라제인 폴리뉴클레오티드.
  15. 제13항에 있어서, 인식 서열이 파지 인테그라제에 의해 인식되는 attP 부위 또는 attB 부위인 폴리뉴클레오티드.
  16. 제8항에 있어서, 포유동물 세포가 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포인 폴리뉴클레오티드.
  17. 제16항에 있어서, 천연 염색체 삽입 부위가 Ank2 유전자의 경우 서열 번호 1의 130-131번 위치, Cpsf4 유전자의 경우 서열 번호 2의 629-630번 위치, C-Mos 유전자의 경우 서열 번호 3의 272-273번 위치, 네프로시스틴-1/Mal 유전자의 경우 서열 번호 4의 239-240번 위치에 또는 그에 가깝게 존재하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  18. 제8항의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  19. 안키린 2 유전자 (Ank2), 절단 및 폴리아데닐화 특이적 인자 4 유전자 (Cpsf4), C-Mos 유전자, 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 내에 또는 그에 인접하게 위치하는 하나 이상의 천연 염색체 삽입 부위에서 게놈 내로 안정하게 통합되어 있는 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 조작된 포유동물 세포.
  20. 제19항에 있어서, 천연 염색체 삽입 부위가 외래 유전자의 안정한 통합을 지지하는 것인 세포.
  21. 제19항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오티드가 폴리펩티드를 코딩하는 것인 세포.
  22. 제21항에 있어서, 폴리펩티드가 치료용 단백질 또는 산업용 단백질인 세포.
  23. 제19항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오티드가 부위-특이적 재조합 서열 (염색체 랜딩 패드)을 포함하는 것인 세포.
  24. 제23항에 있어서, 부위-특이적 재조합 서열이 파지 인테그라제에 의해 인식되는 인식 서열인 세포.
  25. 제24항에 있어서, 파지 인테그라제가 phiC-31 인테그라제인 세포.
  26. 제24항에 있어서, 인식 서열이 파지 인테그라제에 의해 인식되는 attP 부위 또는 attB 부위인 세포.
  27. 제19항에 있어서, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포인 세포.
  28. 제27항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오티드가 Ank2 유전자의 경우 서열 번호 1의 130-131번 위치, Cpsf4 유전자의 경우 서열 번호 2의 629-630번 위치, C-Mos 유전자의 경우 서열 번호 3의 272-273번 위치, 네프로시스틴-1/Mal 유전자의 경우 서열 번호 4의 239-240번 위치에 또는 그에 가깝게 통합되어 있는 것인 세포.
  29. (a) 부위-특이적 재조합 서열을 세포의 게놈 내로 삽입시키는 단계로서,
    여기서 삽입은 안키린 2 유전자 (Ank2), 절단 및 폴리아데닐화 특이적 인자 4 유전자 (Cpsf4), C-Mos 유전자, 및 네프로시스틴-1/Mal 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 내에 또는 그에 인접하게 위치하는 천연 염색체 삽입 부위에서 이루어지는 것인 단계; 및
    (b) 이종성 폴리뉴클레오티드를 삽입된 부위-특이적 재조합 서열에서 세포의 게놈 내로 상동성 재조합에 의해 통합시키는 단계
    를 포함하는, 이종성 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포의 게놈 내로 안정하게 통합시키는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 천연 염색체 삽입 부위가 외래 유전자의 안정한 통합을 지지하는 것인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 부위-특이적 재조합 서열이 파지 인테그라제에 의해 인식되는 제1 인식 서열인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 파지 인테그라제가 phiC-31 인테그라제인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 제1 인식 서열이 attP 부위 또는 attB 부위인 방법.
  34. 제31항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오티드가 제1 인식 서열과 동족인 파지 인테그라제의 제2 인식 서열에 부착되어 있는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 제2 인식 서열이 attB 부위 또는 attP 부위인 방법.
  36. 제29항에 있어서, 세포가 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 부위-특이적 재조합 서열이 Ank2 유전자의 경우 서열 번호 1의 130-131번 위치, Cpsf4 유전자의 경우 서열 번호 2의 629-630번 위치, C-Mos 유전자의 경우 서열 번호 3의 272-273번 위치, 네프로시스틴-1/Mal 유전자의 경우 서열 번호 4의 239-240번 위치에서 또는 그에 가깝게 게놈 내로 삽입되는 것인 방법.
  38. 제29항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오티드가 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 표적 폴리펩티드-코딩 서열을 포함하는 것인 방법.
  39. 제31항에 있어서, 통합이 파지 인테그라제의 존재하에서 이루어지는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 파지 인테그라제가 세포 내로 도입된 벡터로부터 발현되는 것인 방법.
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