JP2020533957A - Ｃｒｉｓｐｒリポーター非ヒト動物およびその使用 - Google Patents

Ｃｒｉｓｐｒリポーター非ヒト動物およびその使用 Download PDF

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Abstract

ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性非相同末端結合（ＮＨＥＪ）活性および／または標的ゲノム遺伝子座の外因性ドナー核酸とのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換えを評価するための方法および組成物が提供される。この方法および組成物は、２つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ切断部位の間の配列の標的化された切り出し、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ切断部位の近傍の配列の破壊を検出および測定するため、ならびに／または第１のリポータータンパク質のコード配列を異なる第２のリポータータンパク質のコード配列に変換するためのＣＲＩＳＰＲリポーターの外因性ドナー核酸とのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換えを測定するために、ゲノムに組み込まれたＣＲＩＳＰＲリポーターなどのＣＲＩＳＰＲリポーターを含む非ヒト動物を使用する。これらの非ヒト動物を作製および使用するための方法および組成物も提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年７月３１日に出願された米国特許出願第６２／５３９，２７９号の利益を主張する。
ＥＦＳ ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表の参照
ファイル５１６５６５ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに記載された配列表は７２．７キロバイトであり、２０１８年７月３１日に作成され、本明細書により参照により組み込まれる。
背景
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術は、有望かつ新しい治療モダリティである。しかしながら、ｉｎ ｖｉｖｏで導入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ剤による突然変異生成または標的遺伝子改変の効率を評価するより良好な手段が必要である。ｉｎ ｖｉｖｏでのそのような活性の評価は、一本鎖ＤＮａｓｅ感受性アッセイ、デジタルＰＣＲ、または次世代シーケンシングなどの、様々な分子アッセイに現在依拠している。導入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ剤の活性をより効率的に評価し、ｉｎ ｖｉｖｏで特定の組織または細胞型を標的にするための様々な送達方法およびパラメーターを評価するためのより良好な方法および手段が必要である。
要旨
ｉｎ ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性非相同末端結合活性および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換え活性を評価するための方法および組成物が提供される。一態様では、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列の間の核酸のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性切り出しを評価するためのＣＲＩＳＰＲリポーターを含む非ヒト動物であって、ＣＲＩＳＰＲリポーターが、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれ、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列によって挟まれた第１のポリアデニル化シグナル、次いで、第１のリポータータンパク質のコード配列と、第２のリポータータンパク質のコード配列とを任意の順序で含むリポーターカセットを含み、第１のリポータータンパク質と第２のリポータータンパク質とが異なっている、非ヒト動物が提供される。
一部のそのような非ヒト動物では、ＣＲＩＳＰＲリポーターはまた、ＣＲＩＳＰＲリポーターの外因性ドナー核酸とのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換えを評価するためのものである。必要に応じて、第１のリポータータンパク質は、第３のガイドＲＮＡ標的配列を含み、ＣＲＩＳＰＲリポーターの外因性ドナー核酸との組換えは、第１のリポータータンパク質のコード配列を、第３のリポータータンパク質のコード配列に変化させる。必要に応じて、第１のリポータータンパク質のコード配列を、単一のコドンを変化させることによって、第３のリポータータンパク質のコード配列に変化させる。必要に応じて、第３のガイドＲＮＡ標的配列は、外因性ドナー核酸によって改変された第１のリポータータンパク質のコード配列の一部と重複する。
一部のそのような非ヒト動物では、第１および第２のリポータータンパク質の１つは、蛍光リポータータンパク質を含む。必要に応じて、蛍光リポータータンパク質は、強化型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）または強化型青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）を含む。必要に応じて、第１および第２のリポータータンパク質は、蛍光リポータータンパク質および非蛍光リポータータンパク質を含む。必要に応じて、蛍光リポータータンパク質を、フローサイトメトリーアッセイにおいて検出することができ、非蛍光タンパク質を、組織化学的アッセイにおいて検出することができる。一部のそのような非ヒト動物では、第１および第２のリポータータンパク質の１つは、ベータ−ガラクトシダーゼタンパク質を含む。
一部のそのような非ヒト動物では、第１のポリアデニル化シグナルも、第１のリコンビナーゼのためのリコンビナーゼ認識部位によって挟まれている。必要に応じて、第１のリコンビナーゼのためのリコンビナーゼ認識部位は、ｌｏｘＰ配列である。
一部のそのような非ヒト動物では、リポーターカセットは、介在内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または介在２Ａペプチドコード配列によって隔てられた、第１のリポータータンパク質のコード配列と、第２のリポータータンパク質のコード配列とを含む多シストロン性核酸を含む。必要に応じて、多シストロン性核酸は、介在Ｐ２Ａペプチドコード配列によって隔てられた、ベータ−ガラクトシダーゼコード配列と、強化型青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）コード配列または強化型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）コード配列とを含む。
一部のそのような非ヒト動物では、ＣＲＩＳＰＲリポーターは、標的ゲノム遺伝子座で内因性プロモーターに作動可能に連結されている。
一部のそのような非ヒト動物では、ＣＲＩＳＰＲリポーターの５’末端は、３’スプライシング配列をさらに含む。
一部のそのような非ヒト動物では、ＣＲＩＳＰＲリポーターは、選択カセットを含まない。一部のそのような非ヒト動物では、ＣＲＩＳＰＲリポーターは、選択カセットをさらに含む。必要に応じて、選択カセットは、第２のレコンビナーゼのためのリコンビナーゼ認識部位によって挟まれている。必要に応じて、選択カセットは、薬物耐性遺伝子を含む。
一部のそのような非ヒト動物では、第１のガイドＲＮＡ標的配列と、第２のガイドＲＮＡ標的配列との距離は、約５００塩基対未満である。
一部のそのような非ヒト動物では、第１のガイドＲＮＡ標的配列と、第２のガイドＲＮＡ標的配列は、同一であり、それぞれ、配列番号４１を含む。
一部のそのような非ヒト動物では、非ヒト動物は、ラットまたはマウスである。必要に応じて、非ヒト動物は、マウスである。
一部のそのような非ヒト動物では、標的ゲノム遺伝子座は、セーフハーバー遺伝子座である。必要に応じて、セーフハーバー遺伝子座は、Ｒｏｓａ２６遺伝子座である。必要に応じて、ＣＲＩＳＰＲリポーターは、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに挿入されている。
一部のそのような非ヒト動物では、非ヒト動物はマウスであり、標的ゲノム遺伝子座はＲｏｓａ２６遺伝子座であり、ＣＲＩＳＰＲリポーターは、内因性Ｒｏｓａ２６プロモーターに作動可能に連結され、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに挿入され、５’から３’に向かって：（ａ）３’スプライシング配列；（ｂ）（ｉ）第１および第２のｌｏｘＰ部位；ならびに（ｉｉ）第１のガイドＲＮＡ標的配列と第２のガイドＲＮＡ標的配列が同一であり、それぞれ、配列番号４１、４３、４４、４５、４６、または４７を含む、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列によって挟まれた第１のポリアデニル化シグナル；および（ｃ）５’から３’に向かって、（ｉ）ベータ−ガラクトシダーゼコード配列；（ｉｉ）Ｐ２Ａコード配列；（ｉｉｉ）配列番号４２を含む第３のガイドＲＮＡ標的配列を含む、強化型青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）コード配列；および（ｉｖ）第１のポリアデニル化シグナルと、第２のポリアデニル化シグナルとが異なっている、第２のポリアデニル化シグナルを含む、リポーターカセットを含む。必要に応じて、ＣＲＩＳＰＲリポーターは、（ｄ）リポーターカセットの３’側の選択カセットをさらに含み、この選択カセットは、ＦＲＴ部位によって挟まれ、５’から３’に向かって：（ｉ）ヒトユビキチンプロモーターに作動可能に連結されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼコード配列；および（ｉｉ）第３のポリアデニル化シグナルを含む。
一部のそのような非ヒト動物では、非ヒト動物は、標的ゲノム遺伝子座のＣＲＩＳＰＲリポーターについてヘテロ接合性である。一部のそのような非ヒト動物では、非ヒト動物は、標的ゲノム遺伝子座のＣＲＩＳＰＲリポーターについてホモ接合性である。
別の態様では、ｉｎ ｖｉｖｏでゲノム核酸を切り出すＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの能力を試験する方法が提供される。一部のそのような方法は、（ａ）上記非ヒト動物のいずれかに、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲリポーター中の第１のガイドＲＮＡ標的配列にハイブリダイズするように設計された第１のガイドＲＮＡ；（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲリポーター中の第２のガイドＲＮＡ標的配列にハイブリダイズするように設計された第２のガイドＲＮＡ；および（ｉｉｉ）Ｃａｓタンパク質を導入するステップ；ならびに（ｂ）第１および第２のリポータータンパク質の少なくとも１つの活性または発現を測定するステップを含む。
一部のそのような方法では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。一部のそのような方法では、Ｃａｓタンパク質は、タンパク質の形態で非ヒト動物に導入される。一部のそのような方法では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡの形態で非ヒト動物に導入される。一部のそのような方法では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡの形態で非ヒト動物に導入され、ＤＮＡは、非ヒト動物中の１つまたは複数の細胞型において活性なプロモーターに作動可能に連結されている。
一部のそのような方法では、第１のガイドＲＮＡと、第２のガイドＲＮＡは同一であり、それぞれ、配列番号２に記載の配列を含む。
一部のそのような方法では、ステップ（ｂ）で測定されるリポータータンパク質は、蛍光リポータータンパク質であり、ステップ（ｂ）は、フローサイトメトリーアッセイを含む。一部のそのような方法では、ステップ（ｂ）で測定されるリポータータンパク質は、ベータ−ガラクトシダーゼタンパク質であり、ステップ（ｂ）は、組織化学染色アッセイを含む。
一部のそのような方法では、ステップ（ａ）におけるガイドＲＮＡは、ＲＮＡの形態で導入される。一部のそのような方法では、ステップ（ａ）におけるガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で非ヒト動物にそれぞれ導入され、ＤＮＡは、非ヒト動物中の１つまたは複数の細胞型において活性なプロモーターに作動可能に連結されている。
一部のそのような方法では、導入するステップは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達、脂質ナノ粒子媒介性送達、または流体力学的送達を含む。必要に応じて、導入は、ＡＡＶ媒介性送達を含む。必要に応じて、導入するステップは、ＡＡＶ８媒介性送達を含み、ステップ（ｂ）は、非ヒト動物の肝臓中のリポータータンパク質の活性を測定することを含む。
別の態様では、ｉｎ ｖｉｖｏでゲノム核酸を切り出すＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの能力を最適化する方法が提供される。一部のそのような方法は、（Ｉ）第１の非ヒト動物において１回目のｉｎ ｖｉｖｏでゲノム核酸を切り出すＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの能力を試験する上記方法のいずれかを実施するステップ；（ＩＩ）変数を変化させ、第２の非ヒト動物において変化した変数を用いて２回目のステップ（Ｉ）の方法を実施するステップ；および（ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）におけるリポータータンパク質の活性または発現と、ステップ（ＩＩ）における少なくとも１つのリポータータンパク質の活性または発現とを比較し、リポータータンパク質のより高い活性または発現をもたらす方法を選択するステップを含む。
一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変化した変数は、送達方法である。一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変化した変数は、ガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質を非ヒト動物に導入する送達方法である。一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変化した変数は、投与経路である。一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変化した変数は、ガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質を非ヒト動物に導入する投与経路である。一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変化した変数は、非ヒト動物に導入されるガイドＲＮＡの濃度または量である。一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変化した変数は、非ヒト動物に導入されるガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質の濃度または量である。一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変化した変数は、非ヒト動物に導入されたＣａｓタンパク質の濃度または量と比較した、非ヒト動物に導入されたガイドＲＮＡの濃度または量である。一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変化した変数は、非ヒト動物に導入されたガイドＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡの形態またはガイドＲＮＡの配列）である。一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変化した変数は、非ヒト動物に導入されたＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓタンパク質の形態）である。
別の態様では、ｉｎ ｖｉｖｏでゲノム核酸の外因性ドナー核酸とのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換えを試験する方法が提供される。一部のそのような方法は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲリポーターがまた、ＣＲＩＳＰＲリポーターの外因性ドナー核酸とのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換えを評価するためのものであり、第１のポリアデニル化シグナルがＣＲＩＳＰＲリポーターから除去されており、第１のリポータータンパク質のコード配列が第３のガイドＲＮＡ標的配列を含む、上記非ヒト動物のいずれかを提供し、この非ヒト動物に、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲリポーター中の第３のガイドＲＮＡ標的配列にハイブリダイズするように設計されたガイドＲＮＡ；（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質；および（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲリポーターと組み換わり、第１のリポータータンパク質のコード配列を、第３のリポータータンパク質のコード配列に変化させることができる外因性ドナー核酸を導入するステップ；ならびに（ｂ）第３のリポータータンパク質の活性または発現を測定するステップを含む。
一部のそのような方法では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。一部のそのような方法では、Ｃａｓタンパク質は、タンパク質の形態で非ヒト動物に導入される。一部のそのような方法では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡの形態で非ヒト動物に導入される。一部のそのような方法では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡの形態で非ヒト動物に導入され、ＤＮＡは、非ヒト動物中の１つまたは複数の細胞型において活性なプロモーターに作動可能に連結されている。
一部のそのような方法では、ステップ（ｂ）で測定される第３のリポータータンパク質は、蛍光リポータータンパク質であり、ステップ（ｂ）は、フローサイトメトリーアッセイを含む。一部のそのような方法では、第１のリポータータンパク質は、強化型青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）であり、第３のガイドＲＮＡは、配列番号１４に記載の配列を含む。一部のそのような方法では、第１のリポータータンパク質は、強化型青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）であり、第３のリポータータンパク質は、強化型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）である。
一部のそのような方法では、外因性ドナー核酸は、配列番号１５または配列番号１６に記載の配列を含む。一部のそのような方法では、外因性ドナー核酸は、一本鎖デオキシヌクレオチドである。
一部のそのような方法では、ステップ（ａ）におけるガイドＲＮＡは、ＲＮＡの形態で導入される。一部のそのような方法では、ステップ（ａ）におけるガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で非ヒト動物に導入され、ＤＮＡは、非ヒト動物中の１つまたは複数の細胞型において活性なプロモーターに作動可能に連結されている。
一部のそのような方法では、導入するステップは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達、脂質ナノ粒子媒介性送達、または流体力学的送達を含む。必要に応じて、導入するステップは、ＡＡＶ媒介性送達を含む。必要に応じて、導入するステップは、ＡＡＶ８媒介性送達を含み、ステップ（ｂ）は、非ヒト動物の肝臓中のリポータータンパク質の活性を測定することを含む。
別の態様では、ｉｎ ｖｉｖｏでゲノム核酸の外因性ドナー核酸との組換えを誘導するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの能力を最適化する方法が提供される。一部のそのような方法は、（Ｉ）第１の非ヒト動物において１回目のｉｎ ｖｉｖｏでのゲノム核酸の外因性ドナー核酸とのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換えを試験する上記方法のいずれかを実施するステップ；（ＩＩ）変数を変化させ、第２の非ヒト動物において変化した変数を用いて２回目のステップ（Ｉ）の方法を実施するステップ；および（ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）における第３のリポータータンパク質の活性または発現と、ステップ（ＩＩ）における第３のリポータータンパク質の活性または発現とを比較し、第３のリポータータンパク質のより高い活性または発現をもたらす方法を選択するステップを含む。
一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変化した変数は、送達方法である。一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変化した変数は、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、および外因性ドナー核酸のうちの１つまたは複数を非ヒト動物に導入する送達方法である。一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変化した変数は、投与経路である。一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変化した変数は、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、および外因性ドナー核酸のうちの１つまたは複数を非ヒト動物に導入する投与経路である。一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変化した変数は、非ヒト動物に導入されたガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、および外因性ドナー核酸のうちの１つまたは複数の濃度または量である。一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変化した変数は、非ヒト動物に導入された外因性ドナー核酸（例えば、外因性ドナー核酸の形態または配列）である。一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変化した変数は、非ヒト動物に導入されたＣａｓタンパク質の濃度または量と比較した、非ヒト動物に導入されたガイドＲＮＡの濃度または量である。一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変化した変数は、非ヒト動物に導入されたガイドＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡの形態または配列）である。一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変化した変数は、非ヒト動物に導入されたＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓタンパク質の形態または配列）である。
図１Ａは、５’から３’に向かって：３’スプライシング配列；第１のｌｏｘＰ部位；第１のガイドＲＮＡ標的配列；第１のＰｇｋポリアデニル化シグナル；第２のガイドＲＮＡ標的配列；第２のｌｏｘＰ部位；ｌａｃＺ遺伝子；Ｐ２Ａコード配列；強化型青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）コード配列；ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル；第１のＦｒｔ部位；ネオマイシン耐性遺伝子コード配列に作動可能に連結されたヒトユビキチンおよびＥｍ７プロモーター；第２のＰｇｋポリアデニル化シグナル；ならびに第２のＦｒｔ部位を含む、ＬＳＬ−ＬａｃＺ：ｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子（ＭＡＩＤ２６３４；正確な縮尺ではない）を示す。
図１Ｂは、第１のｌｏｘＰ部位、第１のＰｇｋポリアデニル化シグナル、および第２のｌｏｘＰ部位を含むＬＳＬ−ＬａｃＺ：ｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子の領域の略図における様々なガイドＲＮＡ標的配列の位置を示す（正確な縮尺ではない）。
図２は、導入遺伝子が、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンを標的にするための一般的略図を示す。
図３は、５’から３’に向かって：３’スプライシング配列；第１のｌｏｘＰ部位；Ｅｍ７プロモーター；ネオマイシン耐性遺伝子コード配列；３重のポリアデニル化シグナル；第２のｌｏｘＰ部位；強化型青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）コード配列；およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む、ＬＳＬ−ｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子（ＭＡＩＤ２６５２；正確な縮尺ではない）を示す。
図４Ａ〜図４Ｅは、ＬＳＬ−ＬａｃＺ：ｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子を含むｌａｃＺ染色されたマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）を示す。図４Ａ中の細胞は未処理であり、図４Ｂ中の細胞は第１のＰｇｋポリアデニル化シグナルを切り出すためにＣｒｅリコンビナーゼプラスミドをエレクトロポレーションされたものであり、図４Ｃ中の細胞は切り出しのために第１のＰｇｋポリアデニル化シグナルを標的にするためにｇＵ３およびｇＤ１合成ｓｇＲＮＡと一緒に複合体化されたＣａｓ９タンパク質を含むリボ核タンパク質複合体をエレクトロポレーションされたものであり、図４Ｄ中の細胞は切り出しのために第１のＰｇｋポリアデニル化シグナルを標的にするためにｇＵ３およびｇＤ２合成ｓｇＲＮＡと一緒に複合体化されたＣａｓ９タンパク質を含むリボ核タンパク質複合体をエレクトロポレーションされたものであり、図４Ｅ中の細胞は切り出しのために第１のＰｇｋポリアデニル化シグナルを標的にするためにｇＵ２およびｇＤ１合成ｓｇＲＮＡと一緒に複合体化されたＣａｓ９タンパク質を含むリボ核タンパク質複合体をエレクトロポレーションされたものである。
図５は、エレクトロポレーションの３日後のＬＳＬ−ＬａｃＺ：ｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子を含むｌａｃＺ染色されたマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）を示す。細胞に、合成ｓｇＲＮＡ ｃＧＭ４およびｃＧＭ５と一緒に複合体化されたＣａｓ９タンパク質を含むリボ核タンパク質複合体、合成ｓｇＲＮＡ ｃＧＭ４およびｃＧＭと一緒に複合体化されたＣａｓ９タンパク質を含むリボ核タンパク質複合体、合成ｓｇＲＮＡ ｃＧＭ４およびｃＧＭ３と一緒に複合体化されたＣａｓ９タンパク質を含むリボ核タンパク質複合体、合成ｓｇＲＮＡ ９１７２（非カット対照ガイドＲＮＡ）と一緒に複合体化されたＣａｓ９タンパク質を含むリボ核タンパク質複合体、Ｃａｓ９タンパク質のみ、またはＣｒｅリコンビナーゼプラスミドをエレクトロポレーションした。
図６は、エレクトロポレーションの３日後のＬＳＬ−ＬａｃＺ：ｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子を含むｌａｃＺ染色されたマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）を示す。細胞は、未処理であったか、Ｃａｓ９プラスミドおよびｓｇＲＮＡ＃１６プラスミドをエレクトロポレーションされたものであったか、またはＣｒｅリコンビナーゼプラスミドをエレクトロポレーションされたものであった。
図７は、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡ、またはＣｒｅリコンビナーゼｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を注射した１週間後のＬＳＬ−ＬａｃＺ：ｅＢＦＰマウスから単離されたｌａｃＺ染色された肝臓を示す。処理条件は、Ｃａｓ９＋ｐＡ除去ｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ＃１６）、ｓｇＲＮＡ ｇＵ２およびｇＤ１と共にＣａｓ９、対照非カットｓｇＲＮＡと共にＣａｓ９、ならびにＣｒｅリコンビナーゼを含んでいた。
図８は、Ｃａｓ９＋ｐＡ除去ｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ＃１６）、ｓｇＲＮＡ ｇＵ２およびｇＤ１と共にＣａｓ９、またはＬＮＰ−Ｃｒｅリコンビナーゼで処理されたＬＳＬ−ＬａｃＺ：ｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーターマウスに由来する肝臓試料のｌａｃＺ免疫組織化学を示す。未処理のマウスに由来する肝臓試料を、対照として使用した。褐色に染色された細胞は、ＬＡＣＺタンパク質の発現を示す。
図９は、ｅＢＦＰをｅＧＦＰに変換するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびｓｓＯＤＮ修復鋳型による処理後のｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子（ＭＡＩＤ２００９０を生成するためのＣｒｅリコンビナーゼによる処理後のＬＳＬ−ｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子）を含むマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）の明視野および蛍光顕微鏡（ｅＧＦＰ）画像を示す。上の行は、明視野画像を示し、下の行は、蛍光顕微鏡画像（ｅＧＦＰ）を示す。
図１０Ａは、ｅＢＦＰをｅＧＦＰに変換するためのエレクトロポレーションによるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体およびｓｓＯＤＮ修復鋳型（ＦＷまたはＲＥＶ）を用いた処理後のＲｏｓａ２６遺伝子座でゲノムに組み込まれたｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子（ＭＡＩＤ２００９０を生成するためのＣｒｅリコンビナーゼによる処理後のＬＳＬ−ｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子）を含むマウスから単離された造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）の明視野および蛍光顕微鏡（ｅＧＦＰ）画像を示す。上の行は、エレクトロポレーションの４８時間後の明視野画像を示し、下の行は、蛍光顕微鏡画像（ｅＧＦＰ）を示す。
図１０Ｂは、ｅＢＦＰをｅＧＦＰに変換するためのエレクトロポレーションによるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体およびｓｓＯＤＮ ＦＷ修復鋳型を用いた処理後のＲｏｓａ２６遺伝子座でゲノムに組み込まれたｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子（ＭＡＩＤ２００９０を生成するためのＣｒｅリコンビナーゼによる処理後のＬＳＬ−ｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子）を含むマウスから単離された造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）の明視野および蛍光顕微鏡（ｅＧＦＰ）画像を示す。上の行は、未処理の対照細胞を示し、下の行は、処理された細胞を示す。１列目は、エレクトロポレーションの７日後の明視野画像を示し、２列目および３列目は、蛍光顕微鏡画像（ｅＧＦＰ）を示す。
図１１は、示されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣｒｅリコンビナーゼ構成成分の注射の１週間後のＲｏｓａ２６遺伝子座で組み込まれたＬＳＬ−ＬａｃＺ：ｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子を含むマウスから収穫された肝臓から単離された細胞中での次世代シーケンシングによって決定された非相同末端結合効率（リード数）を示す。
定義
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、コードアミノ酸および非コードアミノ酸ならびに化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸を含めた、任意の長さのポリマー形態のアミノ酸を含む。この用語は、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの、修飾されたポリマーも含む。
タンパク質は、「Ｎ末端」および「Ｃ末端」を有すると言える。「Ｎ末端」という用語は、遊離のアミン基（−ＮＨ２）を有するアミノ酸を末端とする、タンパク質またはポリペプチドの出発点に関する。「Ｃ末端」という用語は、遊離のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を末端とする、アミノ酸の鎖（タンパク質またはポリペプチド）の終了点に関する。
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはその類似体もしくは修飾バージョンを含めた、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを含む。これらの用語は、プリン塩基、ピリミジン塩基、または他の天然、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む、一本鎖、二本鎖、および多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびにポリマーを含む。
核酸は、モノヌクレオチドが、１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸がその近くの３’酸素にリン酸ジエステル連結によって一方向に付着するように反応してオリゴヌクレオチドが生じるので、「５’末端」および「３’末端」を有すると言える。オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素と連結していなければ、「５’末端」と称される。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸と連結していなければ、「３’末端」と称される。核酸配列も、より大きなオリゴヌクレオチドの内部にあったとしても、５’および３’末端を有すると言われ得る。直鎖状または環状ＤＮＡ分子のいずれでも、別個のエレメントは、「下流」または３’エレメントの「上流」または５’側にあると称される。
「ゲノムに組み込まれた」という用語は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノム中に組み込まれるように、細胞中に導入された核酸を指す。細胞のゲノム中への核酸の安定な組込みのために任意のプロトコールを使用することができる。
「発現ベクター」または「発現構築物」という用語は、特定の宿主細胞または生物中での作動可能に連結されたコード配列の発現にとって必要な適切な核酸配列に作動可能に連結された所望のコード配列を含有する組換え核酸を指す。原核生物中での発現にとって必要な核酸配列は通常、プロモーター、オペレーター（任意選択）、およびリボソーム結合部位、ならびに他の配列を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、ならびに終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルを使用することが一般に公知であるが、必要な発現を犠牲にすることなく、一部のエレメントを欠失させ、他のエレメントを付加することができる。
「標的化ベクター」という用語は、相同組換え、非相同末端結合媒介性ライゲーション、または細胞のゲノム中の標的位置への組換えの任意の他の手段によって導入することができる組換え核酸を指す。
「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つのエレメントを含み、ウイルスベクター粒子へのパッケージングにとって十分な、またはそれを許容するエレメントを含む組換え核酸を指す。ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の核酸を、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで細胞中に移動させる目的で、ベクターおよび／または粒子を使用することができる。いくつかの形態のウイルスベクターが公知である。
タンパク質、核酸、および細胞に関して「単離された」という用語は、タンパク質、核酸、または細胞の実質的に純粋な調製物に至るまで、およびそれを含めた、ｉｎ ｓｉｔｕにおいて通常存在し得る他の細胞性または生物性構成成分に関して比較的精製されたタンパク質、核酸、および細胞を含む。「単離された」という用語はまた、天然に存在する対応物を有しないタンパク質および核酸または化学的に合成された、かくして、他のタンパク質もしくは核酸が実質的に混入していないタンパク質もしくは核酸も含む。「単離された」という用語はまた、それらが天然では付随する多くの他の細胞性構成成分または生物性構成成分（例えば、他の細胞タンパク質、核酸、または細胞性もしくは細胞外構成成分）から分離または精製されたタンパク質、核酸、または細胞も含む。
「野生型」という用語は、正常な状態または状況（突然変異体、疾患にかかっている、変更された状態または状況などとは対照的に）において見出される構造および／または活性を有する実体を含む。野生型遺伝子およびポリペプチドは、多くの場合、多数の異なる
形態（例えば、対立遺伝子）で存在する。
「内因性配列」という用語は、細胞または非ヒト動物中に天然に存在する核酸配列を指す。例えば、非ヒト動物の内因性Ｒｏｓａ２６配列は、非ヒト動物中のＲｏｓａ２６遺伝子座に天然に存在する天然のＲｏｓａ２６配列を指す。
「外因性」分子または配列は、通常は細胞内にその形態では存在しない分子または配列を含む。通常存在するとは、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して存在することを含む。外因性分子または配列は、例えば、内因性配列のヒト化バージョンなど細胞内の対応する内因性配列の突然変異バージョンを含んでもよく、または細胞内の内因性配列に対応するが、形態が異なる（すなわち、染色体内にない）配列を含んでもよい。対照的に、内因性分子または配列は、特定の環境条件下で特定の発生段階にある特定の細胞内にその形態で通常存在する分子または配列を含む。
「異種」という用語は、核酸またはタンパク質に関して使用される場合、その核酸またはタンパク質が、同じ分子内で天然には一緒に存在しない少なくとも２つのセグメントを含むことを示す。例えば、「異種」という用語は、核酸のセグメントまたはタンパク質のセグメントに関連して使用される場合、その核酸またはタンパク質が、天然では同じ互いとの関係（例えば、接合している）では見出されない２つまたはそれよりも多くの部分配列を含むことを示す。一例として、核酸ベクターの「異種」領域は、天然では他の分子と関連しては見出されない、別の核酸分子内にあるかまたはそれに付着した核酸のセグメントである。例えば、核酸ベクターの異種領域は、天然ではコード配列と関連しては見出されない配列に挟まれたコード配列を含み得る。同様に、タンパク質の「異種」領域は、天然では他のペプチド分子と関連しては見出されない、別のペプチド分子内にあるかまたはそれに付着したアミノ酸のセグメント（例えば、融合タンパク質、またはタグを有するタンパク質）である。同様に、核酸またはタンパク質は、異種標識または異種分泌もしくは局在化配列を含み得る。
「コドン最適化」は、アミノ酸を指定する３塩基対のコドンの組合せの多重性によって示される通り、コドンの縮重を活用し、一般に、特定の宿主細胞における発現の増強のために、ネイティブなアミノ酸配列を維持しながらネイティブな配列の少なくとも１つのコドンを宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって核酸配列を改変するプロセスを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸を、天然に存在する核酸配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、または任意の他の宿主細胞を含めた所与の原核細胞または真核細胞において使用の頻度が高いコドンに置換されるように改変することができる。コドン使用表は、例えば「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」において容易に利用可能である。これらの表は、いくつかのやり方で適合させることができる。あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるNakamuraら（２０００年）Nucleic Acids Research ２８巻：２９２頁を参照されたい。特定の宿主において発現させるための特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズムも利用可能である（例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅを参照されたい）。
「プロモーター」は、ＤＮＡの制御領域であり、通常、特定のポリヌクレオチド配列に対して妥当な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩを方向付けることができるＴＡＴＡボックスを含む。プロモーターは、転写開始率に影響を及ぼす他の領域をさらに含み得る。本明細書に開示されるプロモーター配列は、作動可能に連結したポリヌクレオチドの転写をモジュレートする。プロモーターは、本明細書に開示される細胞型（例えば、真核細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、齧歯類細胞、多能性細胞、１細胞期胚、分化細胞、またはこれらの組合せ）の１つまたは複数において活性であってよい。プロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生制御型プロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）であってよい。プロモーターの例は、例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１７６７７２に見出すことができる。
構成的プロモーターは、あらゆる発生段階であらゆる組織または特定の組織において活性であるものである。構成的プロモーターの例としては、ヒトサイトメガロウイルス極初期（ｈＣＭＶ）プロモーター、マウスサイトメガロウイルス極初期（ｍＣＭＶ）プロモーター、ヒト伸長因子１アルファ（ｈＥＦ１α）プロモーター、マウス伸長因子１アルファ（ｍＥＦ１α）プロモーター、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ニワトリベータアクチンハイブリッド（ＣＡＧまたはＣＢｈ）プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、およびベータ２チューブリンプロモーターが挙げられる。
誘導性プロモーターの例としては、例えば、化学的制御型プロモーターおよび物理的制御型プロモーターが挙げられる。化学的制御型プロモーターとしては、例えば、アルコール制御型プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター）、テトラサイクリン制御型プロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、ｔｅｔ−Ｏｎプロモーター、もしくはｔｅｔ−Ｏｆｆプロモーター）、ステロイド制御型プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体のプロモーター、もしくはエクジソン受容体のプロモーター）、または金属制御型プロモーター（例えば、金属タンパク質プロモーター）が挙げられる。物理的制御型プロモーターとしては、例えば、温度制御型プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）および光制御型プロモーター（例えば、光誘導性プロモーターまたは光抑制性プロモーター）が挙げられる。
組織特異的プロモーターは、例えば、神経特異的プロモーター、グリア特異的プロモーター、筋肉細胞特異的プロモーター、心臓細胞特異的プロモーター、腎臓細胞特異的プロモーター、骨細胞特異的プロモーター、内皮細胞特異的プロモーター、または免疫細胞特異的プロモーター（例えば、Ｂ細胞プロモーターまたはＴ細胞プロモーター）であってよい。
発生制御型プロモーターとしては、例えば、発生の胚形成期の間にのみ、または成体細胞においてのみ活性であるプロモーターが挙げられる。
「作動可能な連結」または「作動可能に連結した」とは、２つまたはそれよりも多くの構成成分（例えば、プロモーターおよび別の配列エレメント）が、どちらの構成成分も正常に機能し、構成成分の少なくとも１つが他の構成成分の少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介し得る可能性が許容されるように近位にあることを含む。例えば、プロモーターがコード配列の転写のレベルを１つまたは複数の転写制御因子の存在または非存在に応答して調節する場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結している可能性がある。作動可能な連結は、互いと連続しているまたはトランスに作用する配列を含み得る（例えば、制御配列は、コード配列の転写を調節するための距離で作用し得る）。
核酸の「相補性」とは、核酸の一方の鎖内のヌクレオチド配列が、その核酸塩基群の配向に起因して、対向する核酸鎖上の別の配列と水素結合を形成することを意味する。ＤＮＡ内の相補的な塩基は一般にはＡとＴおよびＣとＧである。ＲＮＡでは、相補的な塩基は一般にはＣとＧおよびＵとＡである。相補性は、完全なものまたは実質的／十分なものであり得る。２つの核酸間の完全な相補性とは、２つの核酸が、２重鎖内のあらゆる塩基が相補的な塩基とワトソン・クリック対形成によって結合した２重鎖を形成できることを意味する。「実質的な」または「十分な」相補性とは、一方の鎖内の配列が対向する鎖内の配列と徹底的におよび／または完全に相補的ではないが、ハイブリダイゼーション条件のセット（例えば、塩濃度および温度）の下で２つの鎖上の塩基間に十分な結合が生じて安定なハイブリッド複合体が形成されることを意味する。そのような条件は、ハイブリダイズした鎖のＴｍ（融解温度）を予測するためのシーケンスおよび標準の数学的算出を使用することにより、または常套的な方法を使用することによってＴｍを経験的に決定することにより、予測することができる。Ｔｍは、２つの核酸鎖の間で形成されるハイブリダイゼーション複合体の集団が５０％変性する（すなわち、二本鎖核酸分子の集団が半分解離して一本鎖になる）温度を含む。Ｔｍを下回る温度ではハイブリダイゼーション複合体の形成が有利であるが、Ｔｍを上回る温度ではハイブリダイゼーション複合体内の鎖の融解または分離が有利である。Ｔｍは、水性１Ｍ ＮａＣｌ溶液中のＧ＋Ｃ含有量が分かっている核酸に関しては、例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）を使用することによって推定することができるが、他の公知のＴｍコンピュータ計算では、核酸の構造特性を考慮に入れる。
「ハイブリダイゼーション条件」は、１つの核酸鎖が第２の核酸鎖と相補鎖相互作用および水素結合によって結合してハイブリダイゼーション複合体が生じる累積的環境を含む。そのような条件は、核酸を含有する水性または有機溶液の化学成分およびそれらの濃度（例えば、塩、キレート剤、ホルムアミド）、ならびに混合物の温度を含む。インキュベート時間の長さまたは反応チャンバーの寸法などの他の因子が環境に寄与し得る。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるSambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第２版、１．９０〜１．９１頁、９．４７〜９．５１頁、１１．４７〜１１．５７頁（Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, N.Y.、１９８９年）を参照されたい。
ハイブリダイゼーションには、２つの核酸が相補配列を含有することが必要であるが、塩基間にミスマッチがある可能性がある。２つの核酸間のハイブリダイゼーションのための妥当な条件は、周知の変数である核酸の長さおよび相補の度合いに依存する。２つのヌクレオチド配列間の相補の度合いが大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の値が大きい。短い相補性のひと続き（例えば、３５ヌクレオチドもしくはそれ未満、３０ヌクレオチドもしくはそれ未満、２５ヌクレオチドもしくはそれ未満、２２ヌクレオチドもしくはそれ未満、２０ヌクレオチドもしくはそれ未満、または１８ヌクレオチドもしくはそれ未満にわたる相補性）を有する核酸間のハイブリダイゼーションに関しては、ミスマッチの位置が重要になる（Sambrookら、上記、１１．７〜１１．８頁を参照されたい）。一般には、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の例示的な最小長としては、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、および少なくとも約３０ヌクレオチドが挙げられる。さらに、相補領域の長さおよび相補の度合いなどの因子に応じて、必要に応じて温度および洗浄溶液の塩濃度を調整することができる。
ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能なその標的核酸のポリヌクレオチド配列と１００％相補的である必要はない。さらに、ポリヌクレオチドは、介在するか、または隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように１つまたは複数のセグメントを超えてハイブリダイズし得る（例えば、ループ構造またはヘアピン構造）。ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、標的とされる標的核酸配列内の標的領域に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の配列相補性を含み得る。例えば、２０ヌクレオチドのうち１８ヌクレオチドが標的領域と相補的であり、したがって、それと特異的にハイブリダイズするｇＲＮＡは、９０％の相補性になる。この例では、残りの非相補性ヌクレオチドは、密集していても相補的なヌクレオチドが散在していてもよく、互いとまたは相補的なヌクレオチドと連続している必要はない。
核酸内の核酸配列の特定のひと続き間のパーセント相補性は、ＢＬＡＳＴプログラム（基本的な局所的アラインメント検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Altschulら（１９９０年）J. Mol. Biol.、２１５巻：４０３〜４１０頁；ZhangおよびMadden（１９９７年）Genome Res.、７巻：６４９〜６５６頁）を使用して、または、SmithおよびWaterman（Adv. Appl. Math.、１９８１年、２巻、４８２〜４８９頁）のアルゴリズムを使用する、デフォルト設定を使用したＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を使用することにより、常套的に決定することができる。
本明細書において提示される方法および組成物では、種々の異なる構成成分を使用する。説明全体を通して、一部の構成成分は、活性なバリアントおよび断片を有し得る。そのような構成成分としては、例えば、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびガイドＲＮＡが挙げられる。これらの構成成分のそれぞれについての生物活性は本明細書の他の箇所に記載されている。「機能的」という用語は、生物活性または機能を示すタンパク質または核酸（またはその断片もしくはバリアント）の固有の能力を指す。そのような生物活性または機能は、例えば、ガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡ配列に結合するＣａｓタンパク質の能力を含んでもよい。機能的断片またはバリアントの生物機能は、元のものであるが、基本的な生物機能を保持するものと比較して、同じであってよいか、または実際には、変化していてもよい（例えば、その特異性もしくは選択性もしくは効能に関して）。
「バリアント」という用語は、集団中で最も優勢である配列と（例えば、１個のヌクレオチドが）異なるヌクレオチド配列または集団中で最も優勢である配列と（例えば、１個のアミノ酸が）異なるタンパク質配列を指す。
タンパク質を言う場合の「断片」という用語は、完全長タンパク質よりも短いか、または少ないアミノ酸を有するタンパク質を意味する。核酸を言う場合の「断片」という用語は、完全長核酸よりも短いか、または少ないヌクレオチドを有する核酸を意味する。断片は、例えば、Ｎ末端断片（すなわち、タンパク質のＣ末端の一部の除去）、Ｃ末端断片（すなわち、タンパク質のＮ末端の一部の除去）、または内部断片であってもよい。
「配列同一性」または「同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関しては、２つの配列内の、指定の比較ウインドウにわたって最大の対応でアラインメントした場合に同じである残基に言及する。タンパク質に関して配列同一性のパーセンテージが使用される場合、同一でない残基の位置は、多くの場合、保存的アミノ酸置換によって異なっており、その場合、アミノ酸残基は、類似の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されるため、分子の機能的性質は変化しない。配列が保存的置換によって異なる場合、パーセント配列同一性を上向きに調整して置換の保存的性質を補正することができる。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言える。この調整を行う方法は周知である。一般には、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングし、それにより、パーセンテージ配列同一性を増大させることを伴う。したがって、例えば、同一のアミノ酸にはスコア１を付し、非保存的置換にはスコアゼロを付す場合、保存的置換には、ゼロと１の間のスコアを付す。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実行される通り算出される。
「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアラインメントされた配列（完全にマッチする残基の数が最大）を比較ウインドウにわたって比較することによって決定される値を含み、ここで、比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の一部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでよい。パーセンテージは、両方の配列内に同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定してマッチする位置の数を得、マッチする位置の数を比較のウインドウ内の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。別段の指定がない限り（例えば、短い方の配列は連結した異種配列を含む）、比較ウインドウは、比較される２つの配列の短い方の全長である。
別段の指定のない限り、配列同一性／類似性値は、ＧＡＰバージョン１０を以下のパラメーターを使用して得られる値を含む：ギャップ重みづけ５０および長さ重みづけ３、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリング行列を使用したヌクレオチド配列についての％同一性および％類似性；ギャップ重みづけ８および長さ重みづけ２、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用したアミノ酸配列についての％同一性および％類似性；またはその任意の等価のプログラム。「等価のプログラム」は、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰバージョン１０によって生じた対応するアラインメントと比較して同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基マッチおよび同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを生じさせる任意の配列比較プログラムを含む。
「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列内に通常存在するアミノ酸の、サイズ、電荷、または極性が同様の異なるアミノ酸による置換を指す。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、またはロイシンなどの非極性（疎水性）残基による別の非極性残基の置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例としては、１つの極性（親水性）残基による別の極性（親水性）残基の置換、例えば、アルギニンとリシンの間の置換、グルタミンとアスパラギンの間の置換、またはグリシンとセリンの間の置換が挙げられる。さらに、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基による別の塩基性残基の置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの１つの酸性残基による別の酸性残基の置換が保存的置換のさらなる例である。非保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、もしくはメチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基によるシステイン、グルタミン、グルタミン酸もしくはリシンなどの極性（親水性）残基の置換および／または極性残基による非極性残基の置換が挙げられる。典型的なアミノ酸カテゴリー化を以下で表１に要約する。
「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、人工的な環境、および人工的な環境（例えば、試験管）内で起こるプロセスまたは反応を包含する。「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、天然の環境（例えば、細胞または生物体または体）および天然の環境内で起こるプロセスまたは反応を包含する。「ｅｘ ｖｉｖｏ」という用語は、個体の体から取り出された細胞およびそのような細胞内で起こるプロセスまたは反応を包含する。
「リポーター遺伝子」という用語は、内因性もしくは異種プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントに作動可能に連結されたリポーター遺伝子配列を含む構築物が、プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントの活性化にとって必要な因子を含有する（または含有するようにすることができる）細胞に導入された場合、容易かつ定量可能にアッセイされる遺伝子産物（典型的には、酵素）をコードする配列を有する核酸を指す。リポーター遺伝子の例としては、限定されるものではないが、ベータ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）をコードする遺伝子、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子、蛍ルシフェラーゼ遺伝子、ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子、および蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。「リポータータンパク質」は、リポーター遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。
本明細書で使用される「蛍光リポータータンパク質」という用語は、リポータータンパク質に直接由来する、蛍光性基質上のリポータータンパク質の活性に由来する、または蛍光タグ付き化合物への結合に対する親和性を示すタンパク質に由来するものであってよい、蛍光に基づいて検出可能であるリポータータンパク質を意味する。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、およびＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、およびＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、およびＴ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＣＦＰ、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、およびＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ＲＦＰ、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、およびＪｒｅｄ）、オレンジ蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、およびｔｄＴｏｍａｔｏ）、ならびに細胞中での存在をフローサイトメトリー法によって検出することができる任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。
二本鎖切断（ＤＳＢ）に応答した修復は、主に２つの保存的ＤＮＡ修復経路：相同組換え（ＨＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって起こる。あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるKasparekおよびHumphrey（２０１１年）Seminars in Cell & Dev. Biol.、２２巻：８８６〜８９７頁を参照されたい。同様に、外因性ドナー核酸によって媒介される標的核酸の修復は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の任意のプロセスを含んでもよい。
「組換え」という用語は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の任意のプロセスを含み、任意のメカニズムによって起こってもよい。組換えは、相同組換え修復（ＨＤＲ）または相同組換え（ＨＲ）によって起こり得る。ＨＤＲまたはＨＲは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし得、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断が生じた分子）を修復するための鋳型として「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の移行を導く核酸修復の形態を含む。いかなる特定の理論にも制約されることなく、そのような移行には、切断された標的とドナーの間で形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／または、標的の一部になる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される、合成に依存する鎖アニーリング、および／または関連するプロセスが伴い得る。一部の場合では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が標的ＤＮＡに組み込まれる。それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wangら（２０１３年）Cell、１５３巻：９１０〜９１８頁；Mandalosら（２０１２年）PLOS ONE、７巻：ｅ４５７６８：１〜９頁；およびWangら（２０１３年）Nat Biotechnol.、３１巻：５３０〜５３２頁を参照されたい。
ＮＨＥＪは、切断末端を互いとまたは外因性配列と、相同な鋳型を必要とせずに直接ライゲーションすることによる核酸の二本鎖切断の修復を含む。連続していない配列のＮＨＥＪによるライゲーションは、多くの場合、二本鎖切断の部位付近に欠失、挿入、または転座をもたらし得る。例えば、ＮＨＥＪは、切断末端と外因性ドナー核酸の末端の直接ライゲーションによる外因性ドナー核酸の標的化組込みももたらし得る（すなわち、ＮＨＥＪに基づく捕捉）。そのようなＮＨＥＪ媒介性標的化組込みは、相同組換え修復（ＨＤＲ）経路が容易に使用可能でない場合（例えば、非分裂細胞、初代細胞、および相同性に基づくＤＮＡ修復が不十分に行われる細胞において）に外因性ドナー核酸を挿入するために好ましい可能性がある。さらに、相同組換え修復とは対照的に、切断部位に隣接する配列同一性の大きな領域（Ｃａｓ媒介性切断によって創出される突出部を越える）に関する知見は必要なく、これは、ゲノム配列に関する知見が限られているゲノムを有する生物体への標的化挿入を試みる場合に有益であり得る。組込みは、外因性ドナー核酸と切断されたゲノム配列の間の平滑末端のライゲーションによって、または、切断されるゲノム配列においてＣａｓタンパク質によって生成されるものと適合する突出部に挟まれた外因性ドナー核酸を使用した粘着末端（すなわち、５’または３’突出部を有する）のライゲーションによって進行し得る。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１１／０２０７２２、ＷＯ２０１４／０３３６４４、ＷＯ２０１４／０８９２９０、およびMarescaら（２０１３年）Genome Res.、２３巻（３号）：５３９〜５４６頁を参照されたい。平滑末端をライゲーションする場合、断片接合に必要なマイクロホモロジーの生成領域に標的および／またはドナー切除が必要な場合があり、これにより、標的配列に望ましくない変更が生じる可能性がある。
１つまたは複数の記載されている要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に記載されていない他の要素を含み得る。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、タンパク質を単独で、または他の成分と組み合わせて含有し得る。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という移行句は、特許請求の範囲が、請求項に記載されている指定の要素ならびに特許請求された発明の基本および新規の特性（単数または複数単数または複数）に実質的に影響を及ぼさない要素を包含するものと解釈されるべきであることを意味する。したがって、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、本発明の請求項において使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等であると解釈されることを意図しない。
「必要に応じた」または「必要に応じて」とは、その後に記載されている事象または状況が生じる場合と生じない場合があること、ならびに、当該説明が、事象または状況が生じる例および事象または状況が生じない例を含むことを意味する。
値の範囲の明示は、範囲内のまたは範囲を規定する全ての整数、および範囲内の整数によって規定される全ての部分範囲を含む。
文脈からそうでないことが明らかでない限り、「約」という用語は、記載値の標準の測定の誤差限界（例えば、ＳＥＭ）の範囲内の値を包含する。
「および／または」という用語は、関連する列挙されている項目の１つまたは複数のありとあらゆる可能性のある組合せ、ならびに代替（「または」）として解釈される場合には組合せがないことを指し、それを包含する。
「または（ｏｒ）」という用語は、特定の一覧のうちの任意の１メンバーを指し、その一覧のメンバーの任意の組合せも含む。
「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単数形の冠詞は、文脈によりそうでないことが明確に規定されない限り、複数の参照対象を含む。例えば、「１つの（ａ）Ｃａｓタンパク質」または「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）Ｃａｓタンパク質」という用語は、それらの混合物を含めた複数のＣａｓタンパク質を含み得る。
統計的に有意なとは、ｐ≦０．０５であることを意味する。
詳細な説明
Ｉ．概要
ｉｎ ｖｉｖｏでの導入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ剤の送達の効率およびそれによる突然変異生成または標的遺伝子改変の効率の評価は、現在、一本鎖ＤＮａｓｅ感受性アッセイ、デジタルＰＣＲ、または次世代シーケンシングなどの様々な分子アッセイに依拠している。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ剤の活性をより効率的に評価し、ｉｎ ｖｉｖｏで特定の組織または細胞型を標的にするための様々な送達方法およびパラメーターを評価するためのより良好な方法および手段が必要である。
ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性非相同末端結合（ＮＨＥＪ）活性および／または標的ゲノム核酸の外因性ドナー核酸とのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換えを評価するための方法および組成物が提供される。この方法および組成物は、２つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ切断部位の間の配列の標的化された切り出しもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ切断部位の近傍の配列の破壊を検出および測定するため、ならびに／または第１のリポータータンパク質のコード配列を異なる第２のリポータータンパク質のコード配列に変換するためのＣＲＩＳＰＲリポーターの外因性ドナー核酸とのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換えを検出および測定するためにＣＲＩＳＰＲリポーター（例えば、ゲノムに組み込まれたＣＲＩＳＰＲリポーター）を含む細胞および非ヒト動物を使用する。一部のそのようなＣＲＩＳＰＲリポーターは、２つまたはそれより多い異なる型のリポーター遺伝子を含む多機能リポーターであってもよい。これらのリポーターは、非ヒト動物のｉｎ ｖｉｖｏでのイメージング、フローサイトメトリーもしくは他の方法による動物から単離された細胞中での蛍光の検出、または非ヒト動物から単離された組織の組織化学的染色などの、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性を検出および測定するための様々な方法の使用を可能にするため、単一の型のリポーター遺伝子を含むＣＲＩＳＰＲリポーターを超える改善である。このように、１つのリポータータンパク質の限界は、別のリポータータンパク質の利点によって相殺することができる。例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子によってコードされる）および蛍光タンパク質は、一部のリポーターにおいて組み合わせて使用される。ＬａｃＺは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性修復の正確な境界を可視化するために組織切片を採取する能力を可能にする。ＬａｃＺ染色は永続的であり、裸眼または標準的な明視野拡大によって可視化することができる。ｅＢＦＰまたはｅＧＦＰなどの蛍光リポータータンパク質は、正確に編集された、編集されていない、および代替的に編集された細胞の正確な計数を可能にする。蛍光リポータータンパク質により、編集された細胞の正確な比率について単一細胞ベースで組織を分析することができる（例えば、ＦＡＣＳ分析による）。
ｌａｃＺ遺伝子を有する本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲリポーターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ作用の際に赤色蛍光タンパク質から緑色蛍光タンパク質への変化を報告する「信号機」リポーターなどの他のリポーターを超えるさらなる利点を有する。ベータ−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子は、あらゆるリポーターのうち最も完全に確立されており、信頼できる。ｌａｃＺ遺伝子を含む本明細書に記載のリポーターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの作用時に組織学的カラーリードアウトを産生するように設計される。ベータ−ガラクトシダーゼは、基質を、眼に見える青色色素に変換する多重代謝回転酵素であるため、検出可能な蛍光シグナルのために細胞あたり数万個のタンパク質を必要とする蛍光リポータータンパク質よりも感度が高い可能性がある。蛍光タンパク質と比較して、ベータ−ガラクトシダーゼは、よい細胞型特異的発現パターンを示し得るより高解像度のシグナルを産生する。信号機蛍光リポーターは、偶然の読み枠変化をもたらすＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性突然変異を必要とする。対照的に、本明細書に記載のｌａｃＺリポーターは、読み枠に依存しない；むしろ、それらは転写ポリアデニル化終結シグナルを欠失させるか、または不活化するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ切断部位間の単純な欠失のみを必要とし、それによって、下流のベータ−ガラクトシダーゼコード配列の発現を可能にする。２つの異なる蛍光シグナルの比率の分析および解釈を必要とする信号機および同様の二重蛍光タンパク質リポーター系と違って、ｌａｃＺリポーター系は、対立遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性化後に非改変状態のシグナルのないものから始まって、強力なリポーターシグナルになる。
さらに、本明細書に開示される一部のＣＲＩＳＰＲリポーターは、それらがｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＮＨＥＪ活性の試験を可能にするだけでなく、異なるリードアウトによるｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性ＨＤＲ活性の試験も可能にするという点で、多機能リポーターである。ＣＲＩＳＰＲ誘導性組換えを試験するための一部のそのようなリポーターは、そのリポータータンパク質を異なるリポータータンパク質に変換するためにリポータータンパク質をコードする遺伝子中の単一のコドンだけを変化させることを必要とするため、リポータータンパク質の全コード配列を欠失させ、異なるリポータータンパク質の配列と置き換える必要があった場合よりも小さい外因性ドナー核酸を使用することができる。一部のそのようなリポーターでは、蛍光リポータータンパク質は、異なる蛍光リポータータンパク質（例えば、ｅＢＦＰからｅＧＦＰに、またはその逆）に変換される。そのような変換は、正確に編集された、編集されていない、および代替的に編集された細胞の正確な計数を可能にし、編集された細胞の正確な比率についてＦＡＣＳ分析によって単一細胞ベースで組織を分析することができる。
ゲノムに組み込まれた核酸を切り出すか、もしくは破壊する、および／またはｉｎ ｖｉｖｏでの標的ゲノム核酸の外因性ドナーとの組換えを容易にするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの能力を試験および測定するため、ならびにｉｎ ｖｉｖｏでのゲノムに組み込まれた核酸を切り出すか、もしくは破壊する、および／または標的ゲノム遺伝子座の外因性ドナーとの組換えを容易にするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの能力を最適化するために、これらの非ヒト動物を作製および使用するための方法および組成物も提供される。
ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲリポーターを含む非ヒト動物
本明細書に開示される方法および組成物は、ＣＲＩＳＰＲリポーターを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲリポーターを改変する、導入されたクラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系またはそのような系の構成成分の能力を評価する。
本明細書に開示される方法および組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲリポーター内での２つの部位特異的切断事象を誘導し、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により２つの切断部位間の介在配列を切り出す、またはｉｎ ｖｉｖｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲリポーター内での部位特異的切断事象を誘導し、ＮＨＥＪに媒介される小さい挿入および欠失（インデル）により近隣の配列を破壊するＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質と複合体化したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む）の能力を試験することによって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用する。本明細書に開示される方法および組成物はまた、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲリポーターと外因性ドナー核酸との組換えを誘導して、第１のリポータータンパク質のコード配列を修復して、それを異なる第２のリポータータンパク質のコード配列に変換するＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質と複合体化したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む）の能力を試験することによって、ＣＲＳＩＰＲ／Ｃａｓ系を使用する。
Ａ．対合したｇＲＮＡを使用してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性破壊もしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性切り出しを測定するため、および／または標的ゲノム核酸の外因性ドナー核酸とのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換えを測定するためのＣＲＩＳＰＲリポーター
２つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ切断部位間の配列の標的化された切り出しもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ切断部位の近傍の配列の標的化された破壊を検出および測定するため、ならびに／または標的核酸の外因性ドナー核酸とのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換えを検出および測定するためのＣＲＩＳＰＲリポーターが、本明細書で提供される。本明細書で提供されるＣＲＩＳＰＲリポーターは、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列によって挟まれたポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーター、次いで、１つまたは複数のリポータータンパク質のコード配列を含むリポーターカセットを含んでもよい。あるいは、またはさらに、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターは、カノニカルなポリアデニル化ヘキサマー（ＡＡＴＡＡＡ、ポリＡ認識モチーフまたはポリＡ認識配列と呼ばれる）に、またはその近傍に第３のガイドＲＮＡ標的配列を含んでもよい。Ｐｇｋポリアデニル化シグナル中のカノニカルなポリアデニル化ヘキサマーの近傍のガイドＲＮＡ標的配列の例としては、配列番号４８〜５２が挙げられる。しかしながら、任意の所望のガイドＲＮＡ標的配列を、ＣＲＩＳＰＲリポーター中に含有させるか、または操作して、任意のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡの組合せを試験することができる。あるいは、またはさらに、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターは、第１および第２のリコンビナーゼ認識部位によって挟まれていてもよい。ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターは、１つまたは複数のリポータータンパク質の転写および発現を防止する。しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼによる第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列の切断ならびに転写ターミネーターまたはポリアデニル化シグナルを含む介在配列の切り出しの際に、１つまたは複数のリポータータンパク質のコード配列によって転写を進行させて、その発現を可能にすることができる。あるいは、ポリＡ認識モチーフ（カノニカルなポリアデニル化ヘキサマーＡＡＴＡＡＡ）での、またはその近傍でのガイドＲＮＡ標的配列の切断ならびにＮＨＥＪに媒介される小さい挿入および欠失（インデル）によるポリＡ認識モチーフの破壊の際に、１つまたは複数のリポータータンパク質のコード配列によって転写を進行させて、その発現を可能にすることができる。
任意の転写ターミネーターまたはポリアデニル化シグナルを使用することができる。本明細書で使用される場合、「転写ターミネーター」は、転写の終結を引き起こすＤＮＡ配列を指す。真核生物では、転写ターミネーターは、タンパク質因子によって認識され、終結の後、ポリ（Ａ）ポリメラーゼの存在下でｍＲＮＡ転写物にポリ（Ａ）尾部を付加するプロセスであるポリアデニル化が起こる。哺乳動物のポリ（Ａ）シグナルは、典型的には、切断およびポリアデニル化効率を増強するように働く多様な補助配列によって挟まれていてもよい、約４５ヌクレオチド長のコア配列からなる。コア配列は、切断およびポリアデニル化特異性因子（ＣＰＳＦ）によって認識される、高度に保存された必要とされる上流エレメント（ポリＡ認識モチーフ、ｍＲＮＡ中のＡＡＴＡＡＡまたはＡＡＵＡＡＡ）、ならびに切断刺激因子（ＣｓｔＦ）によって結合される、きちんと定義されていない下流の領域（ＵまたはＧおよびＵに富む）からなる。使用することができる転写ターミネーターの例としては、例えば、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）ポリアデニル化シグナル、サルウイルス４０（ＳＶ４０）後期ポリアデニル化シグナル、ウサギベータ−グロビンポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）ポリアデニル化シグナル、ＡＯＸ１転写終結配列、ＣＹＣ１転写終結配列、または真核細胞中での遺伝子発現を調節するのに好適であることが公知の任意の転写終結配列が挙げられる。
必要に応じて、ポリアデニル化シグナルはまた、部位特異的リコンビナーゼのためのリコンビナーゼ認識部位によって挟まれていてもよい。リコンビナーゼを、ポリアデニル化シグナルの切り出しのための陽性対照として使用することができる。部位特異的リコンビナーゼは、２つの組換え部位が単一の核酸内で物理的に隔てられているか、または別々の核酸上にある、リコンビナーゼ認識部位間の組換えを容易にすることができる酵素を含む。リコンビナーゼの例としては、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、およびＤｒｅリコンビナーゼが挙げられる。Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子の一例は、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエクソンが、原核細胞中でのその発現を防止するためにイントロンによって隔てられているＣｒｅｉである。そのようなリコンビナーゼは、核への局在化を容易にする核局在化シグナル（例えば、ＮＬＳ−Ｃｒｅｉ）をさらに含んでもよい。リコンビナーゼ認識部位は、部位特異的リコンビナーゼによって認識され、組換え事象のための基質として働くことができるヌクレオチド配列を含む。リコンビナーゼ認識部位の例としては、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ｒｏｘ、ならびにｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、およびｌｏｘ５１７１などのｌｏｘ部位が挙げられる。
第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列は、同じか、または異なっていてもよく、任意の好適なガイドＲＮＡ標的配列を使用することができる。任意の所望のガイドＲＮＡ標的配列を、ＣＲＩＳＰＲリポーター中に含有させるか、または操作して、任意のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡの組合せを試験することができる。ガイドＲＮＡ標的配列は、本明細書の他の箇所により詳細に記載されている。一例として、第１のガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号４１、４３、４４、または４５に記載の配列を含んでもよく、第２のガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号４１、４６、または４７に記載の配列を含んでもよい。第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列（またはそれぞれ、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列内の第１および第２のＣａｓ切断部位）は、試験しようとする任意の所望の距離によって隔てられていてもよい。例えば、それらは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、もしくは１０００塩基対（ｂｐ）、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、もしくは１０００ｂｐ以下、または約５〜１００、５〜２００、５〜３００、５〜４００、５〜５００、５〜６００、５〜１０００、６〜１００、６〜２００、６〜３００、６〜４００、６〜５００、６〜６００、６〜１０００、１０〜１００、１０〜２００、１０〜３００、１０〜４００、１０〜５００、１０〜６００、１０〜１０００、５０〜１００、５０〜２００、５０〜３００、５０〜４００、５０〜５００、５０〜６００、５０〜１０００、１００〜１０００、２００〜１０００、３００〜１０００、４００〜１０００、もしくは５００〜１０００ｂｐによって隔てられていてもよい。特定の例では、ガイドＲＮＡ標的配列またはＣａｓ切断部位は、約１０００塩基対未満、約６００塩基対未満、約５００塩基対未満、約２００塩基対未満、または約１００塩基対未満によって隔てられていてもよい。あるいは、それらは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、もしくは１００ｋｂもしくはそれより多い塩基対によって隔てられていてもよいか、または約１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜４０、１〜５０、１〜１００、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１０〜１００、２０〜３０、２０〜４０、２０〜５０、２０〜１００、３０〜４０、３０〜５０、３０〜１００、４０〜５０、４０〜１００、もしくは５０〜１００ｋｂによって隔てられていてもよい。例えば、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列または第１および第２のＣａｓ切断部位は、約５ｂｐ〜１０ｋｂ、６ｂｐ〜１０ｋｂ、１０ｂｐ〜１０ｋｂ、５０ｂｐ〜１０ｋｂ、１００ｂｐ〜１０ｋｂ、２００ｂｐ〜１０ｋｂ、３００ｂｐ〜１０ｋｂ、４００ｂｐ〜１０ｋｂ、または５００ｂｐ〜１０ｋｂによって隔てられていてもよい。
第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列（または第１および第２のＣａｓ切断部位）は、必要に応じて、ポリＡ認識モチーフ（カノニカルなポリアデニル化シグナルヘキサマーＡＡＴＡＡＡ）にある（すなわち、重複している）か、またはその近傍にある。例えば、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列または第１および第２のＣａｓ切断部位の一方または両方は、カノニカルなポリアデニル化シグナルヘキサマーから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、もしくは１０００ｂｐ以内、または約１〜１００、１〜２００、１〜３００、１〜４００、１〜５００、１〜６００、１〜１０００、５〜１００、５〜２００、５〜３００、５〜４００、５〜５００、５〜６００、５〜１０００、１０〜１００、１０〜２００、１０〜３００、１０〜４００、１０〜５００、１０〜６００、１０〜１０００、５０〜１００、５０〜２００、５０〜３００、５０〜４００、５０〜５００、５０〜６００、５０〜１０００、１００〜１０００、２００〜１０００、３００〜１０００、４００〜１０００、もしくは５００〜１０００ｂｐの間にあってよい。必要に応じて、第３のガイドＲＮＡ標的配列（またはＣａｓ切断部位）は、ポリＡ認識モチーフ（カノニカルなポリアデニル化シグナルヘキサマーＡＡＴＡＡＡ）にある（すなわち、重複している）か、またはその近傍にある。例えば、第３のガイドＲＮＡ標的配列または第３のＣａｓ切断部位は、カノニカルなポリアデニル化シグナルヘキサマーから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、もしくは１０００ｂｐ以内、または約１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜４０、１〜５０、１〜６０、１〜７０、１〜８０、１〜９０、１〜１００、１〜２００、１〜３００、１〜４００、１〜５００、１〜６００、１〜１０００、５〜１０、５〜２０、５〜３０、５〜４０、５〜５０、５〜６０、５〜７０、５〜８０、５〜９０、５〜１００、５〜２００、５〜３００、５〜４００、５〜５００、５〜６００、５〜１０００、１０〜１０、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、１０〜７０、１０〜８０、１０〜９０、１０〜１００、１０〜２００、１０〜３００、１０〜４００、１０〜５００、１０〜６００、１０〜１０００、５０〜１００、５０〜２００、５０〜３００、５０〜４００、５０〜５００、５０〜６００、５０〜１０００、１００〜１０００、２００〜１０００、３００〜１０００、４００〜１０００、もしくは５００〜１０００ｂｐの間にあってよい。例えば、第３のガイドＲＮＡ標的配列または第３のＣａｓ切断部位は、カノニカルなポリアデニル化シグナルヘキサマーから約１０〜２２０、２０〜２００、２０〜４０、２９、６５〜８５、７６、１８５〜２０５、または１９５ｂｐ以内にあってよい。
第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列は、それぞれ、第１および第２のリコンビナーゼ認識部位に関してどこにでもあってよい。第１のガイドＲＮＡ標的配列は、第１のリコンビナーゼ認識部位の上流もしくは下流にあってもよく、または第１のリコンビナーゼ認識部位と重複してもよい。同様に、第２のガイドＲＮＡ標的配列は、第２のリコンビナーゼ認識部位の上流もしくは下流にあってもよく、または第２のリコンビナーゼ認識部位と重複してもよい。さらに、第１のガイドＲＮＡ標的配列は、挟まれた転写ターミネーターもしくはポリアデニル化シグナルの上流にあってもよく、または転写ターミネーターもしくはポリアデニル化シグナルと重複してもよい。同様に、第２のガイドＲＮＡ標的配列は、挟まれた転写ターミネーターもしくはポリアデニル化シグナルの下流にあってもよく、または転写ターミネーターもしくはポリアデニル化シグナルと重複してもよい。
任意の好適なリポータータンパク質を使用することができる。一部のリポーターにおいて、１つまたは複数のリポータータンパク質は、ベータ−ガラクトシダーゼタンパク質を含む。他のリポーターにおいては、２つまたはそれより多い異なるリポータータンパク質が存在する。必要に応じて、２つまたはそれより多いリポータータンパク質は、異なる型のリポータータンパク質であってもよい。例えば、２つまたはそれより多い異なるリポータータンパク質は、本明細書の他の箇所で定義される少なくとも１つの蛍光リポータータンパク質および少なくとも１つの非蛍光リポータータンパク質を含んでもよい。蛍光リポータータンパク質の例は、本明細書の他の箇所に提供される。非蛍光リポータータンパク質としては、例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ（例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ、蛍ルシフェラーゼ、およびＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ）、およびベータ−グルクロニダーゼなどの、組織化学アッセイまたは生物発光アッセイにおいて使用することができるリポータータンパク質が挙げられる。一部のリポーターは、さらなる機能を提供し、異なる型のアッセイを、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ活性を検出および測定するために実施することができるようにするために、フローサイトメトリーアッセイにおいて検出することができるリポータータンパク質（例えば、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化型ＢＦＰ（ｅＢＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、もしくは強化型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）などの蛍光リポータータンパク質）と、組織化学的アッセイにおいて検出することができるリポータータンパク質（例えば、ベータ−ガラクトシダーゼタンパク質）との両方を含む。そのような組織化学的アッセイの一例は、青色の沈降物をもたらす、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−ｂーＤ−ガラクトピラノシド）の加水分解によるｉｎ ｓｉｔｕでのベータ−ガラクトシダーゼ発現の可視化、またはベータ−メチルウンベリフェリルガラクトシド（ＭＵＧ）およびフルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）などの蛍光性基質の使用である。
２つまたはそれより多いリポータータンパク質がＣＲＩＳＰＲリポーターに含まれる場合、２つまたはそれより多いリポータータンパク質のコード配列は、多シストロン性核酸を含んでもよい。多シストロン性発現構築物は、同じｍＲＮＡから２つまたはそれより多い別々のタンパク質（すなわち、同じプロモーターから産生される転写物）を同時に発現する。タンパク質の多シストロン性発現のための好適な戦略としては、例えば、２Ａペプチドの使用および内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の使用が挙げられる。例えば、そのような核酸は、介在内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または介在２Ａペプチドコード配列によって隔てられた２つまたはそれより多いリポータータンパク質のコード配列を含んでもよい。一例として、そのような多シストロン性ベクターは、ｍＲＮＡの内部領域からの翻訳の開始を可能にするための１つまたは複数の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用することができる。別の例として、そのような多シストロン性ベクターは、１つまたは複数の２Ａペプチドを使用することができる。これらのペプチドは、一般に、１８〜２２アミノ酸の長さを有する小さい「自己切断性」ペプチドであり、同じｍＲＮＡから等モルレベルの複数の遺伝子を産生する。リボソームは、２Ａペプチドと、そのすぐ下流のペプチドとの間の「切断」をもたらす、２ＡペプチドのＣ末端でのグリシル−プロリルペプチド結合の合成をスキップする。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるKim et al. (2011) PLos One 6(4): e18556を参照されたい。「切断」は、Ｃ末端上に見出されるグリシン残基とプロリン残基の間で起こり、これは、上流のシストロンが末端に付加される２〜３個の追加の残基を有するが、下流のシストロンがプロリンから始まることを意味している。結果として、「切断除去される」下流のペプチドは、そのＮ末端にプロリンを有する。２Ａにより媒介される切断は、全ての真核細胞中での普遍的な現象である。２Ａペプチドは、ピコルナウイルス、昆虫ウイルスおよびＣ型ロタウイルスから同定されている。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるSzymczak et al. (2005) Expert Opin Biol Ther 5: 627-638を参照されたい。使用することができる２Ａペプチドの例としては、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）；ブタテッショウウイルス−１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）；ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）；およびＦＭＤＶ ２Ａ（Ｆ２Ａ）が挙げられる。例示的なＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、およびＦ２Ａ配列は、以下のもの：Ｔ２Ａ（ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ；配列番号３）；Ｐ２Ａ（ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ；配列番号４）；Ｅ２Ａ（ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ；配列番号５）；およびＦ２Ａ（ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ；配列番号６）を含む。ＧＳＧ残基を、これらのペプチドのいずれかの５’末端に付加して、切断効率を改善することができる。
非ヒト動物中、ｉｎ ｖｉｖｏでの発現のために、ＣＲＩＳＰＲリポーターを、任意の好適なプロモーターに作動可能に連結することができる。非ヒト動物は、本明細書の他の箇所に記載される任意の好適な非ヒト動物であってもよい。一例として、ＣＲＩＳＰＲリポーターを、内因性Ｒｏｓａ２６遺伝子座のＲｏｓａ２６プロモーターなどの、標的ゲノム遺伝子座の内因性プロモーターに作動可能に連結することができる。あるいは、ＣＲＩＳＰＲリポーターを、外因性プロモーターに作動可能に連結することができる。プロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生制御型プロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）であってよい。そのようなプロモーターは周知であり、本明細書の他の箇所で考察される。
本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲリポーターは、他の構成成分を同様に含んでもよい。一部のＣＲＩＳＰＲリポーターは、ＣＲＩＳＰＲリポーターの５’末端に３’スプライシング配列を、および／またはＣＲＩＳＰＲリポーターの３’末端のリポータータンパク質のコード配列の後に第２のポリアデニル化シグナルをさらに含む。一部のＣＲＩＳＰＲリポーターは、例えば、薬物耐性タンパク質のコード配列を含む選択カセットをさらに含んでもよい。あるいは、本明細書に開示される一部のＣＲＩＳＰＲリポーターは、選択カセットを含まない。好適な選択マーカーの例として、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）が挙げられる。必要に応じて、選択カセットは、部位特異的リコンビナーゼのためのリコンビナーゼ認識部位によって挟まれていてもよい。ＣＲＩＳＰＲリポーターが上記の陽性対照としての使用のためのポリアデニル化シグナルを挟むリコンビナーゼ認識部位も含む場合、必要に応じて、異なるリコンビナーゼによって認識される異なるセットのリコンビナーゼ認識部位が、選択カセットを挟むために使用される。
ＣＲＩＳＰＲリポーターはまた、リポーターカセット中に転写ターミネーターまたはポリアデニル化シグナルを含んでもよい（すなわち、１つまたは複数のリポータータンパク質のコード配列の後または下流）。一部のＣＲＩＳＰＲリポーターにおいて、１つまたは複数のリポータータンパク質のコード配列を含むリポーターカセットの上流の第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列によって挟まれた転写ターミネーターまたはポリアデニル化シグナルは、１つまたは複数のリポータータンパク質のコード配列の後の転写ターミネーターまたはポリアデニル化シグナルとは異なっている。他のＣＲＩＳＰＲリポーターにおいては、１つまたは複数のリポータータンパク質のコード配列を含むリポーターカセットの上流の第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列によって挟まれた転写ターミネーターまたはポリアデニル化シグナルは、１つまたは複数のリポータータンパク質のコード配列の後の転写ターミネーターまたはポリアデニル化シグナルと同じものである。
上記のＣＲＩＳＰＲリポーターエレメントの代わりに、またはそれに加えて、本明細書で提供されるＣＲＩＳＰＲリポーターは、ガイドＲＮＡ標的配列と、異なるリポータータンパク質のコード配列に変換することができるリポータータンパク質のコード配列とを含んでもよい。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼによるガイドＲＮＡ標的配列の切断および外因性ドナー核酸によるリポータータンパク質コード配列の修復の際に、リポータータンパク質のコード配列は、異なるリポータータンパク質のコード配列に変換される。必要に応じて、元のリポータータンパク質のコード配列を、単一のコドンを変化させることによって、異なるリポータータンパク質のコード配列に変化させることができる。例えば、一部のそのようなＣＲＩＳＰＲリポーターは、リポータータンパク質のコード配列の上流にポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターを含まない。他のそのようなＣＲＩＳＰＲリポーターは、上記のリポータータンパク質のコード配列の上流にポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターを含む。一部のそのようなＣＲＩＳＰＲリポーターは、単一のリポータータンパク質コード配列を含む。例えば、図３ならびに配列番号１８、５７、および６０を参照されたい。他のそのようなＣＲＩＳＰＲリポーターは、上記の２つまたはそれより多いリポータータンパク質のコード配列を含む。例えば、図１Ａならびに配列番号１７、５８、および５９を参照されたい。一部のそのようなＣＲＩＳＰＲリポーターは、例えば、薬物耐性タンパク質のコード配列を含む選択カセットをさらに含んでもよい。あるいは、一部のそのようなＣＲＩＳＰＲリポーターは、選択カセットを含まない。
任意の好適なガイドＲＮＡ標的配列を本明細書の他の箇所に記載のように使用することができる。一例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号４２または５６に記載の配列を含んでもよい。ガイドＲＮＡ配列は、リポータータンパク質のコード配列の内部にあってよく、必要に応じて、コード配列を異なるリポータータンパク質のコード配列に変換するための外因性ドナー配列との組換え時に変更されるコード配列の領域から規定の距離内にあってもよい。あるいは、ガイドＲＮＡ配列は、リポータータンパク質のコード配列の外部にあり、それに隣接していてもよい。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列は、リポータータンパク質のコード配列の５’もしくは３’末端から、または変更しようとするコード配列の領域から、１、５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、もしくは１０００塩基対（ｂｐ）以内にあるか、または約１〜１００、１〜２００、１〜３００、１〜４００、１〜５００、１〜１０００、５〜１０００、１０〜５０００、５０〜１０００、１００〜１０００、２００〜１０００、３００〜１０００、４００〜１０００、もしくは５００〜１０００ｂｐの間にあってもよい。特定の例では、ガイドＲＮＡ標的配列は、変更しようとする領域の約１０００塩基対以内もしくは約５００塩基対以内にあってよいか、または変更しようとする領域と重複してもよい。あるいは、ガイドＲＮＡ標的配列は、リポータータンパク質のコード配列の５’もしくは３’末端から、または変更しようとするコード配列の領域から、約１、２、３、４、５、もしくは１０ｋｂ以内にあるか、または約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、もしくは１〜１０ｋｂの間にあってもよい。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列は、リポータータンパク質のコード配列の５’もしくは３’末端から、または変更しようとするコード配列の領域から、約１ｂｐ〜１ｋｂ、１ｂｐ〜２ｋｂ、１ｂｐ〜３ｋｂ、１ｂｐ〜４ｋｂ、１ｂｐ〜５ｋｂ、または１ｂｐ〜１０ｋｂの間にあってもよい。
蛍光リポータータンパク質などの、本明細書の他の箇所に記載される任意の好適なリポータータンパク質を使用することができる。特定の例では、リポータータンパク質を、単一のコドンを変化させることによって異なるリポータータンパク質に変換することができる。例えば、強化型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）は、緑色蛍光を発するが、６６位でのヒスチジンからチロシンへの単一のアミノ酸置換（Ｙ６６Ｈ）は、青色蛍光へのスペクトルシフト（すなわち、ｅＧＦＰからｅＢＦＰへの変換）をもたらす。同様に、ｅＢＦＰにおける逆の置換（Ｈ６６Ｙ）は、ｅＢＦＰをｅＧＦＰに変換することができる。スペクトルシフトをもたらし得るｅＧＦＰ中の突然変異の他の例としては、Ｔ２０３Ｙ（黄色の誘導体）およびＹ６６Ｗ（シアン色の誘導体）が挙げられる。ｅＧＦＰにおける突然変異のさらに他の例は、ｅＧＦＰをＢＦＰに変換することができる（例えば、ｅＧＦＰの６４〜６７位のＬＴＹＧをＦＸに突然変異させる）。１つの特定例では、元のリポータータンパク質はＧＦＰまたはｅＧＦＰであり、ＢＦＰまたはｅＢＦＰに変換されるか、またはその逆である。別の特定例では、元のリポータータンパク質はＧＦＰまたはｅＧＦＰであり、ＣＦＰまたはｅＣＦＰに変換されるか、またはその逆である。別の特定例では、元のリポータータンパク質はＧＦＰまたはｅＧＦＰであり、ＹＦＰまたはｅＹＦＰに変換されるか、またはその逆である。
１つの例示的なＣＲＩＳＰＲリポーターは、５’から３’に向かって：（ａ）３’スプライシング配列；（ｂ）（ｉ）第１のリコンビナーゼのための第１および第２のリコンビナーゼ認識部位（例えば、ＣｒｅリコンビナーゼのためのｌｏｘＰ部位）；ならびに（ｉｉ）第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列（例えば、それぞれ、配列番号４１を含むガイドＲＮＡ標的配列）によって挟まれた第１のポリアデニル化シグナル；（ｃ）５’から３’に向かって：（ｉ）ベータ−ガラクトシダーゼコード配列；（ｉｉ）Ｐ２Ａコード配列；（ｉｉｉ）蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、または強化型ＢＦＰ（ｅＢＦＰ））コード配列（必要に応じて、第３のガイドＲＮＡ標的配列を含む）；および（ｉｖ）第２のポリアデニル化シグナルを含むリポーターカセットを含む。必要に応じて、ＣＲＩＳＰＲリポーターは、配列番号４１、４３、４４、４５、４６、および４７を含むガイドＲＮＡ標的配列を含む。第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列は、例えば、配列番号４３および配列番号４６、配列番号４３および配列番号４７、配列番号４４および配列番号４６、配列番号４４および配列番号４７、配列番号４５および配列番号４６、配列番号４５および配列番号４７、配列番号４３および配列番号４１、配列番号４４および配列番号４１、配列番号４５および配列番号４１、配列番号４１および配列番号４６、または配列番号４１および配列番号４７を含んでもよい。あるいは、それぞれが配列番号４１を含んでもよい。必要に応じて、ＣＲＩＳＰＲリポーターは、第１のポリアデニル化シグナル内に１つまたは複数のガイドＲＮＡ標的配列をさらに含む。そのようなガイドＲＮＡ標的配列の例としては、配列番号４８〜５２が挙げられる。必要に応じて、第１のポリアデニル化シグナルおよび第２のポリアデニル化シグナルは異なる。必要に応じて、ＣＲＩＳＰＲリポーターは、第２のリコンビナーゼのためのリコンビナーゼ認識部位（例えば、ＦｌｐリコンビナーゼのためのＦＲＴ部位）によって挟まれた選択カセット（例えば、リポーターカセットの３’）をさらに含んでもよい。選択カセットは、例えば、５’から３’に向かって：（ｉ）第３のポリアデニル化シグナル（例えば、アンチセンスの向きに）；および（ｉｉ）プロモーターに作動可能に連結された薬物耐性遺伝子のコード配列（例えば、アンチセンスの向きに）（例えば、ヒトユビキチンプロモーターなどの構成的プロモーターに作動可能に連結されたネオマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）コード配列）を含んでもよい。あるいは、選択カセットは、第２のリコンビナーゼのためのリコンビナーゼ認識部位（例えば、ＦｌｐリコンビナーゼのためのＦＲＴ部位）によって挟まれていてもよく、５’から３’に向かって：（ｉ）プロモーターに作動可能に連結された薬物耐性遺伝子のコード配列（例えば、センスの向きに）（例えば、ヒトユビキチンプロモーターおよびＥＭ７プロモーターなどの構成的プロモーターに作動可能に連結されたネオマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）コード配列）；ならびに（ｉｉ）第３のポリアデニル化シグナル（例えば、センスの向きのＰｇｋポリアデニル化シグナル）を含む。例えば、図１Ａおよび配列番号１７を参照されたい。必要に応じて、ＣＲＩＳＰＲリポーターは、リコンビナーゼによる処理および選択カセットの切り出し後の選択カセットを含むＣＲＩＳＰＲリポーターであってもよい。例えば、図１ＡならびにＦｌｐリコンビナーゼによる処理およびネオマイシン選択カセットの切り出し後の配列番号１７を参照されたい。必要に応じて、ＣＲＩＳＰＲリポーターは、リコンビナーゼによる処理および第１のポリアデニル化シグナルの切り出し後のＣＲＩＳＰＲリポーター（選択カセットを含む、または含まない）であってもよい。例えば、図１Ａならびに配列番号５８（またはｅＢＦＰからｅＧＦＰへの変換の際の配列番号５９）をもたらす、Ｃｒｅリコンビナーゼによる処理およびＰｇｋポリアデニル化シグナルの切り出し後の配列番号１７を参照されたい。
別の例示的なＣＲＩＳＰＲリポーターは、５’から３’に向かって：（ａ）３’スプライシング配列；（ｂ）第１のリコンビナーゼのための第１および第２のリコンビナーゼ認識部位（例えば、ＣｒｅリコンビナーゼのためのｌｏｘＰ部位）によって挟まれたガイドＲＮＡ標的配列（例えば、配列番号４８、４９、５０、５１、または５２）を含む第１のポリアデニル化シグナル；（ｃ）５’から３’に向かって：（ｉ）ベータ−ガラクトシダーゼコード配列；（ｉｉ）Ｐ２Ａコード配列；（ｉｉｉ）蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、または強化型ＢＦＰ（ｅＢＦＰ））コード配列（必要に応じて、第２のガイドＲＮＡ標的配列を含む）；および（ｉｖ）第２のポリアデニル化シグナルを含むリポーターカセットを含む。必要に応じて、第１のポリアデニル化シグナルおよび第２のポリアデニル化シグナルは異なる。必要に応じて、ＣＲＩＳＰＲリポーターは、第２のリコンビナーゼのためのリコンビナーゼ認識部位（例えば、ＦｌｐリコンビナーゼのためのＦＲＴ部位）によって挟まれた選択カセット（例えば、リポーターカセットの３’）をさらに含んでもよい。選択カセットは、例えば、５’から３’に向かって：（ｉ）第３のポリアデニル化シグナル（例えば、アンチセンスの向きに）；および（ｉｉ）プロモーターに作動可能に連結された薬物耐性遺伝子のコード配列（例えば、アンチセンスの向きに）（例えば、ヒトユビキチンプロモーターなどの構成的プロモーターに作動可能に連結されたネオマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）コード配列）を含んでもよい。あるいは、選択カセットは、第２のリコンビナーゼのためのリコンビナーゼ認識部位（例えば、ＦｌｐリコンビナーゼのためのＦＲＴ部位）によって挟まれていてもよく、５’から３’に向かって：（ｉ）プロモーターに作動可能に連結された薬物耐性遺伝子のコード配列（例えば、センスの向きに）（例えば、ヒトユビキチンプロモーターおよびＥＭ７プロモーターなどの構成的プロモーターに作動可能に連結されたネオマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）コード配列）；ならびに（ｉｉ）第３のポリアデニル化シグナル（例えば、センスの向きのＰｇｋポリアデニル化シグナル）を含む。例えば、図１Ａおよび配列番号１７を参照されたい。必要に応じて、ＣＲＩＳＰＲリポーターは、リコンビナーゼによる処理および選択カセットの切り出し後の選択カセットを含むＣＲＩＳＰＲリポーターであってもよい。例えば、図１ＡならびにＦｌｐリコンビナーゼによる処理およびネオマイシン選択カセットの切り出し後の配列番号１７を参照されたい。必要に応じて、ＣＲＩＳＰＲリポーターは、リコンビナーゼによる処理および第１のポリアデニル化シグナルの切り出し後のＣＲＩＳＰＲリポーター（選択カセットを含む、または含まない）であってもよい。例えば、図１Ａならびに配列番号５８（またはｅＢＦＰからｅＧＦＰへの変換の際の配列番号５９）をもたらす、Ｃｒｅリコンビナーゼによる処理およびＰｇｋポリアデニル化シグナルの切り出し後の配列番号１７を参照されたい。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換えのみを試験するための例示的なＣＲＩＳＰＲリポーターは、５’から３’に向かって：（ａ）３’スプライシング配列；（ｂ）第１のリコンビナーゼ認識部位（例えば、ＣｒｅリコンビナーゼのためのｌｏｘＰ部位）；（ｃ）第１のポリアデニル化シグナル（例えば、３重のポリアデニル化シグナル）；（ｄ）プロモーターに作動可能に連結された薬物耐性遺伝子（例えば、ＥＭ７プロモーターに作動可能に連結されたネオマイシン耐性遺伝子）；（ｅ）第２のリコンビナーゼ認識部位；（ｆ）ガイドＲＮＡ標的配列を含む蛍光タンパク質コード配列（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、または強化型ＢＦＰ（ｅＢＦＰ））；ならびに（ｇ）第２のポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル）を含む。例えば、図３および配列番号１８を参照されたい。必要に応じて、ＣＲＩＳＰＲリポーターは、リコンビナーゼによる処理ならびに選択カセットおよび第１のポリアデニル化シグナルの切り出し後のＣＲＩＳＰＲリポーターであってもよい。例えば、図３ならびに配列番号５７（またはｅＢＦＰからｅＧＦＰへの変換の際の配列番号６０）をもたらす、Ｃｒｅリコンビナーゼによる処理ならびにネオマイシン選択カセットおよび３重のポリアデニル化シグナルの切り出し後の配列番号１８を参照されたい。
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲリポーターは、任意の形態にあってもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲリポーターは、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクター中にあってもよい。同様に、ＣＲＩＳＰＲリポーターを、上流のポリアデニル化シグナルの除去時にリポータータンパク質の発現を方向付けることができる発現構築物中のプロモーターに作動可能に連結することができる。同様に、ＣＲＩＳＰＲリポーターは、本明細書の他の箇所で定義される標的化ベクター中にあってもよい。例えば、標的化ベクターは、ＣＲＩＳＰＲリポーターを挟む相同アームであって、ゲノム組込みを容易にするための所望の標的ゲノム遺伝子座との組換えを方向付けるのに好適である相同アームを含んでもよい。
同様に、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲリポーターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにあってもよく、それらはｅｘ ｖｉｖｏ（例えば、ゲノムに組み込まれるか、もしくは染色体外にある）で細胞（例えば、胚性幹細胞）内にあってもよいか、またはそれらはｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、ゲノムに組み込まれるか、もしくは染色体外にある）で生物（例えば、非ヒト動物）中にあってもよい。ｅｘ ｖｉｖｏの場合、ＣＲＩＳＰＲリポーターは、胚性幹細胞（例えば、マウスもしくはラット胚性幹細胞）または人工多能性幹細胞（例えば、ヒト人工多能性幹細胞）などの、全能性細胞などの、任意の生物に由来する任意の細胞型中にあってもよい。ｉｎ ｖｉｖｏの場合、ＣＲＩＳＰＲリポーターは、任意の型の生物（例えば、以下にさらに記載される非ヒト動物）中にあってもよい。
Ｂ．ＣＲＩＳＰＲリポーターを含む細胞および非ヒト動物
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲリポーターを含む細胞および非ヒト動物も提供される。ＣＲＩＳＰＲリポーターを、細胞もしくは非ヒト動物のゲノム（すなわち、染色体）中に安定に組み込むか、または染色体の外部に位置させることができる（例えば、染色体外で複製するＤＮＡ）。必要に応じて、ＣＲＩＳＰＲリポーターは、ゲノム中に安定に組み込まれる。安定に組み込まれるＣＲＩＳＰＲリポーターを、非ヒト動物のゲノム中に無作為に組み込むか（すなわち、トランスジェニック）、または非ヒト動物のゲノムの所定の領域中に組み込むことができる（すなわち、ノックイン）。必要に応じて、ＣＲＩＳＰＲリポーターは、セーフハーバー遺伝子座などの、ゲノムの所定の領域中に安定に組み込まれる。ＣＲＩＳＰＲリポーターが安定に組み込まれる標的ゲノム遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲリポーターについてヘテロ接合性であるか、またはＣＲＩＳＰＲリポーターについてホモ接合性であってもよい。二倍体の生物体は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子が存在する場合にはホモ接合体と記載され、２つの対立遺伝子が異なる場合にはヘテロ接合体と記載される。
本明細書に提供される細胞は、例えば、真菌細胞（例えば、酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、およびヒト細胞を含む、例えば、真核細胞であってもよい。「動物」という用語は、哺乳動物、魚類、および鳥類を含む。哺乳動物細胞は、例えば、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、齧歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、またはハムスター細胞であってもよい。他の非ヒト哺乳動物としては、例えば、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、雄ウシ、シカ、バイソン、畜産動物（例えば、雌ウシ、去勢雄ウシなどのウシ種；ヒツジ、ヤギなどのヒツジ種；ならびにブタおよびイノシシなどのブタ種）が挙げられる。鳥類としては、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、アヒルなどが挙げられる。家畜動物および農業動物も含まれる。「非ヒト」という用語はヒトを排除する。
また、細胞は、任意の型の未分化または分化状態であってもよい。例えば、細胞は、全能性細胞、多能性細胞（例えば、ヒト多能性細胞もしくはマウス胚性幹（ＥＳ）細胞もしくはラットＥＳ細胞などの非ヒト多能性細胞）、または非多能性細胞であってもよい。全能性細胞は、任意の細胞型を生じさせ得る未分化細胞を含み、多能性細胞は、１種よりも多くの分化細胞型に発達する能力を有する未分化細胞を含む。そのような多能性および／または全能性細胞は、例えば、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などのＥＳ細胞またはＥＳ様細胞であってよい。ＥＳ細胞は、胚に導入されると発生中の胚の任意の組織に寄与することが可能な胚由来全能性または多能性細胞を含む。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊から引き出すことができ、３つの脊椎動物胚葉（内胚葉、外胚葉、および中胚葉）のいずれの細胞にも分化させることができる。
ヒト多能性細胞の例としては、ヒトＥＳ細胞、ヒト成体幹細胞、発生制限されたヒト前駆細胞、およびヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、例えば、プライミングされたヒトｉＰＳ細胞およびナイーブなヒトｉＰＳ細胞が挙げられる。人工多能性幹細胞は、分化した成体細胞から直接誘導することができる多能性幹細胞を含む。例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘファミリーの転写因子（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５）、Ｍｙｃファミリーの転写因子（例えば、ｃ−Ｍｙｃ、ｌ−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ）、Ｋｒｕｅｐｐｅｌ様ファミリー（ＫＬＦ）の転写因子（例えば、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５）、ならびに／またはＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、および／もしくはＧｌｉｓ１などの関連する転写因子を含んでもよい、特定のセットの再プログラミング因子を細胞に導入することによって、ヒトｉＰＳ細胞を生成することができる。また、例えば、転写因子の作用を模倣する低分子であるｍｉＲＮＡ、または分化系列指定子の使用によって、ヒトｉＰＳ細胞を生成することもできる。ヒトｉＰＳ細胞は、３つの脊椎動物胚葉、例えば、内胚葉、外胚葉、または中胚葉の任意の細胞に分化するその能力を特徴とする。ヒトｉＰＳ細胞はまた、好適なｉｎ ｖｉｔｒｏ培養条件下で無制限に増殖するその能力を特徴とする。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるTakahashiおよびYamanaka（２００６年）Cell、１２６巻：６６３〜６７６頁を参照されたい。プライミングされたヒトＥＳ細胞およびプライミングされたヒトｉＰＳ細胞は、埋込み後の胚盤葉上層細胞のものと類似する特徴を発現し、分化系列指定および分化を約束された細胞を含む。ナイーブなヒトＥＳ細胞およびナイーブなヒトｉＰＳ細胞は、埋込み前の胚の内部細胞塊のＥＳ細胞のものと類似する特徴を発現し、分化系列指定を約束されていない細胞を含む。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるNicholsおよびSmith（２００９年）Cell Stem Cell、４巻：４８７〜４９２頁を参照されたい。
本明細書で提供される細胞はまた、生殖細胞（例えば、精子または卵母細胞）であってもよい。細胞は、有糸分裂性細胞または有糸分裂不活性細胞、減数分裂性細胞または減数分裂不活性細胞であってもよい。同様に、細胞はまた、初代体細胞であってもよく、または初代体細胞ではない細胞であってもよい。体細胞は、配偶子、生殖細胞、生殖母細胞、または未分化幹細胞ではない任意の細胞を含む。例えば、細胞は、肝臓細胞、腎臓細胞、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、間葉細胞、ケラチノサイト、血液細胞、メラニン細胞、単球、単核細胞、単球前駆細胞、Ｂ細胞、赤血球−巨核球、好酸球、マクロファージ、Ｔ細胞、膵島ベータ細胞、外分泌細胞、膵臓前駆細胞、内分泌前駆細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、ニューロン、グリア細胞、神経幹細胞、ニューロン、肝芽細胞、肝細胞、心筋細胞、骨格筋芽細胞、平滑筋細胞、導管細胞、腺房細胞、アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、ＰＰ細胞、胆管細胞、白色もしくは褐色脂肪細胞、または眼細胞（例えば、小柱網細胞、網膜色素上皮細胞、網膜微小血管内皮細胞、網膜周皮細胞、結膜上皮細胞、結膜線維芽細胞、虹彩色素上皮細胞、角膜実質細胞、水晶体上皮細胞、非色素性毛様体上皮細胞、眼脈絡膜線維芽細胞、光受容体細胞、神経節細胞、双極細胞、水平細胞、もしくは無軸索細胞）であってもよい。
本明細書で提供される好適な細胞は、初代細胞も含む。初代細胞は、生物体、器官、または組織から直接単離された細胞または細胞培養物を含む。初代細胞は、形質転換されておらず不死でもない細胞を含む。初代細胞は、以前に組織培養物中で継代されていないかまたは以前に組織培養物中で継代されているが、組織培養物中で無制限に継代することはできない、生物体、器官、または組織から得られる任意の細胞を含む。そのような細胞は、従来の技法によって単離することができ、例えば、体細胞、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、間葉細胞、ケラチノサイト、メラニン細胞、単球、単核細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、ニューロン、グリア細胞、肝細胞、骨格筋芽細胞、および平滑筋細胞を含む。例えば、初代細胞は、結合組織、筋組織、神経系組織、または上皮組織に由来してよい。
本明細書で提供される他の好適な細胞は、不死化細胞を含む。不死化細胞は、通常無制限には増殖しないが、突然変異または変更に起因して、正常な細胞の老化を逃れ、その代わりに分裂し続け得る多細胞生物に由来する細胞を含む。そのような突然変異または変更は、天然に起こり得るか、または意図的に誘導され得る。不死化細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞または２９３Ｔ細胞）、およびマウス胚線維芽細胞（例えば、３Ｔ３細胞）が挙げられる。多数の型の不死化細胞が周知である。不死化細胞または初代細胞は、組換え遺伝子またはタンパク質の培養または発現のために一般に使用される細胞を含む。
本明細書で提供される細胞はまた、１細胞期胚（すなわち、受精した卵母細胞または受精卵）も含む。そのような１細胞期胚は、任意の遺伝的背景（例えば、マウスについては、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、１２９、またはその組合せ）に由来するものであって
もよく、新鮮であるか、または凍結されていてもよく、自然交配またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精から誘導されたものであってもよい。
本明細書で提供される細胞は、正常で健康な細胞であってもよく、または疾患を有するか、もしくは突然変異体を担持する細胞であってもよい。
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲリポーターを含む非ヒト動物を、本明細書の他の箇所に記載の方法によって作製することができる。「動物」という用語は、哺乳動物、魚類、および鳥類を含む。哺乳動物としては、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウマ、雄ウシ、シカ、バイソン、ヒツジ、ウサギ、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモット）、および畜産動物（例えば、雌ウシおよび雄の仔牛などのウシ種；ヒツジおよびヤギなどのヒツジ種；ならびにブタおよびイノシシなどのブタ種）が挙げられる。鳥類としては、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、およびアヒルなどが挙げられる。家畜動物および農業動物も含まれる。「非ヒト動物」という用語はヒトを排除する。好ましい非ヒト動物としては、例えば、マウスおよびラットなどの齧歯類が挙げられる。
非ヒト動物は、任意の遺伝的背景に由来するものであってもよい。例えば、好適なマウスは、１２９株、Ｃ５７ＢＬ／６株、１２９とＣ５７ＢＬ／６のミックス、ＢＡＬＢ／ｃ株、またはＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ株に由来するものであってもよい。１２９系統の例としては、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、および１２９Ｔ２が挙げられる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Festingら（１９９９年）Mammalian Genome、１０巻：８３６頁を参照されたい。Ｃ５７ＢＬ系統の例としては、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌ＿ｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６，Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ，Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａが挙げられる。適切なマウスはまた、上述の１２９系統および上述のＣ５７ＢＬ／６系統のミックス（例えば、５０％１２９および５０％Ｃ５７ＢＬ／６）に由来してよい。同様に、適切なマウスは、上述の１２９系統のミックスまたは上述のＢＬ／６系統のミックス（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統）に由来してよい。
同様に、ラットは、例えば、ＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、またはＦｉｓｈｅｒ Ｆ３４４もしくはＦｉｓｈｅｒ Ｆ６などのＦｉｓｃｈｅｒラット系統を含めた任意のラット系統に由来してよい。ラットはまた、上記の２種またはそれよりも多くの系統のミックスに由来する系統から得ることもできる。例えば、適切なラットは、ＤＡ系統またはＡＣＩ系統に由来してよい。ＡＣＩラット系統は、黒色アグーチを有し、腹部および足が白色であり、ＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有すると特徴付けられる。そのような系統は、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含めた種々の供給源から入手可能である。Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチコートおよびＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有すると特徴付けられる。そのようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒおよびＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含めた種々の供給源から入手可能である。一部の場合では、適切なラットは、近交系ラット系統に由来してよい。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０２３５９３３を参照されたい。
Ｃ．標的ゲノム遺伝子座
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲリポーターを、細胞または非ヒト動物中の標的ゲノム遺伝子座でゲノムに組み込むことができる。遺伝子を発現することができる任意の標的ゲノム遺伝子座を使用することができる。
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲリポーターを安定に組み込むことができる標的ゲノム遺伝子座の例は、非ヒト動物のゲノム中のセーフハーバー遺伝子座である。組み込まれた外因性ＤＮＡと宿主ゲノムとの相互作用は、組込みの信頼性および安全性を制限し、標的遺伝子改変に起因しないが、その代わりに、周囲の内因性遺伝子に対する組込みの意図しない効果に起因する明白な表現型効果をもたらし得る。例えば、無作為に挿入される導入遺伝子を、位置効果およびサイレンシングにかけて、その発現を信頼できない、かつ予測できないものにすることができる。同様に、染色体遺伝子座への外因性ＤＮＡの組込みは、周囲の内因性遺伝子およびクロマチンに影響し、それによって、細胞挙動および表現型を変更することができる。セーフハーバー遺伝子座は、細胞挙動または表現型を明白に変更することなく（すなわち、宿主細胞に対するいかなる有害な効果もなく）、導入遺伝子または他の外因性核酸を目的の全ての組織中で安定かつ確実に発現させることができる染色体遺伝子座を含む。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるSadelainら（２０１２年）Nat.Rev.Cancer １２巻：５１〜５８頁を参照されたい。必要に応じて、セーフハーバー遺伝子座は、挿入される遺伝子配列の発現が、近隣の遺伝子からの任意のリードスルー発現によって乱されないものである。例えば、セーフハーバー遺伝子座は、外因性ＤＮＡが、内因性遺伝子構造または発現に有害に影響することなく、予測可能な様式で組み込み、機能し得る染色体遺伝子座を含んでもよい。セーフハーバー遺伝子座は、例えば、非必須であり、欠けてもよく、または明白な表現型結果なしに破壊することができる遺伝子内の遺伝子座などの、遺伝子外領域または遺伝子内領域を含んでもよい。
例えば、Ｒｏｓａ２６遺伝子座およびヒトにおけるその等価物は、あらゆる組織においてオープンなクロマチン構成を提供し、胚発生の間および成体において遍在的に発現される。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるZambrowiczら（１９９７年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９４巻：３７８９〜３７９４頁を参照されたい。さらに、Ｒｏｓａ２６遺伝子座を高効率で標的とすることができ、Ｒｏｓａ２６遺伝子の破壊は明白な表現型をもたらさない。セーフハーバー遺伝子座の他の例としては、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、およびアルブミンが挙げられる。例えば、それぞれ、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，８８８，１２１号；第７，９７２，８５４号；第７，９１４，７９６号；第７，９５１，９２５号；第８，１１０，３７９号；第８，４０９，８６１号；第８，５８６，５２６号；ならびに米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号；第２００５／０２０８４８９号；第２００５／００２６１５７号；第２００６／００６３２３１号；第２００８／０１５９９９６号；第２０１０／００２１８２６４号；第２０１２／００１７２９０号；第２０１１／０２６５１９８号；第２０１３／０１３７１０４号；第２０１３／０１２２５９１号；第２０１３／０１７７９８３号；第２０１３／０１７７９６０号；および第２０１３／０１２２５９１号を参照されたい。Ｒｏｓａ２６遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子座の二対立遺伝子標的化は、負の結果を有さず、したがって、異なる遺伝子またはリポーターを２つのＲｏｓａ２６対立遺伝子に標的化することができる。一例では、ＣＲＩＳＰＲリポーターは、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンなどの、Ｒｏｓａ２６遺伝子座のイントロンに組み込まれる。
Ｄ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、転写物、およびＣａｓ遺伝子の発現に関与する、またはＣａｓ遺伝子の活性を方向付ける他のエレメントを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型系であり得る。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｖ型系（例えば、Ｖ−Ａ亜型またはＶ−Ｂ亜型）であり得る。本明細書に開示される組成物および方法において使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、天然に存在しないものであり得る。「天然に存在しない」系は、それらの天然に存在する状態から変更もしくは突然変異させたか、自然には天然に付随する少なくとも１つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないか、または、天然には付随しない少なくとも１つの他の構成成分が付随する系の１つまたは複数の構成成分などの、人間の手の関与を示す任意のものを含む。例えば、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、天然には一緒に存在しないｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質、天然には存在しないＣａｓタンパク質、または天然には存在しないｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ複合体を使用することができる。
（１）Ｃａｓタンパク質およびＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド
Ｃａｓタンパク質は、一般に、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、下でより詳細に記載されている）と相互作用し得る少なくとも１つのＲＮＡ認識または結合ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、二量体形成ドメイン、および他のドメインも含み得る。一部のそのようなドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメイン）は、天然のＣａｓタンパク質に由来するものであってもよい。他のそのようなドメインを付加して、改変Ｃａｓタンパク質を作製することができる。ヌクレアーゼドメインは、核酸分子の共有結合の切断を含む核酸切断に対する触媒活性を有する。切断により、平滑末端または付着末端が生じ得、これは一本鎖または二本鎖であり得る。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、一般には平滑切断生成物を創出させる。あるいは、野生型Ｃｐｆ１タンパク質（例えば、ＦｎＣｐｆ１）は５ヌクレオチド５’突出部を有する切断生成物を生じさせることができ、切断は非標的化鎖のＰＡＭ配列から１８番目の塩基対の後ろおよび標的化鎖の２３番目の塩基の後ろで起こる。Ｃａｓタンパク質は、標的ゲノム遺伝子座に二本鎖切断（例えば、平滑末端を伴う二本鎖切断）を創出させる完全な切断活性を有してもよいか、またはそれは標的ゲノム遺伝子座において一本鎖切断を創出するニッカーゼであってもよい。
Ｃａｓタンパク質の例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕ１９６６、ならびにそのホモログまたは改変バージョンが挙げられる。
例示的なＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質、またはＣａｓ９に由来するタンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来し、一般には、保存的アーキテクチャを有する４つの重要なモチーフを共有する。モチーフ１、２、および４はＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３はＨＮＨモチーフである。例示的なＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉに由来する。Ｃａｓ９ファミリーメンバーのさらなる例は、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１３１８３３に記載されている。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９９ＺＷ２が割り当てられる）は例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｊ７ＲＵＡ５が割り当てられる）は別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉに由来するＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ０Ｐ８９７が割り当てられる）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるKimら（２０１７年）Nat.Comm.８巻：１４５００頁を参照されたい。ＳａＣａｓ９はＳｐＣａｓ９より小さく、ＣｊＣａｓ９はＳａＣａｓ９とＳｐＣａｓ９の両方よりも小さい。例示的なＣａｓ９タンパク質は、配列番号５３（配列番号５４によってコードされる）に記載されている。
Ｃａｓタンパク質の別の例は、Ｃｐｆ１（ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １由来のＣＲＩＳＰＲ）タンパク質である。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９の特有のアルギニンリッチクラスターに対する対応物と一緒に、Ｃａｓ９の対応するドメインと相同なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含有する大きなタンパク質（約１３００アミノ酸）である。しかし、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠き、ＲｕｖＣ様ドメインは、Ｃｐｆ１配列では連続しており、それとは対照的に、Ｃａｓ９ではＨＮＨドメインを含む長い挿入断片を含有する。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるZetscheら（２０１５年）Cell、１６３巻（３号）：７５９〜７７１頁を参照されたい。例示的なＣｐｆ１タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ． ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、およびＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅに由来する。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ａ０Ｑ７Ｑ２に割り当てられる）は例示的なＣｐｆ１タンパク質である。
Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（すなわち、天然に存在するもの）、改変Ｃａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓタンパク質バリアント）、または野生型もしくは改変Ｃａｓタンパク質の断片であってよい。Ｃａｓタンパク質はまた、野生型または改変Ｃａｓタンパク質の触媒活性に関して活性なバリアントまたは断片であってもよい。触媒活性に関して活性なバリアントまたは断片は、野生型または改変Ｃａｓタンパク質またはその一部に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも大きな配列同一性を含み得、活性なバリアントは、所望の切断部位をカットする能力を保持し、したがって、ニック誘導活性または二本鎖切断誘導活性を保持する。ニック誘導活性または二本鎖切断誘導活性についてのアッセイは公知であり、一般に、切断部位を含有するＤＮＡ基質に対するＣａｓタンパク質の全体的な活性および特異性を測定する。
Ｃａｓタンパク質を、核酸結合親和性、核酸結合特異性、および酵素活性のうちの１つまたは複数が増大または低減するように改変することができる。Ｃａｓタンパク質を、安定性などの、タンパク質の任意の他の活性または性質が変化するように改変することもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つまたは複数のヌクレアーゼドメインを改変するか、欠失させるか、または不活化することもでき、Ｃａｓタンパク質を、タンパク質の機能に必須ではないドメインを取り除くため、またはＣａｓタンパク質の活性または性質を最適化する（例えば、増強するか、または低下させる）ために短縮することもできる。
改変Ｃａｓタンパク質の一例は、非特異的ＤＮＡ接触を低減するように設計された変更（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）を担持するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の高忠実度バリアントである改変ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１タンパク質である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるKleinstiverら（２０１６年）Nature ５２９巻（７５８７号）：４９０〜４９５頁を参照されたい。改変Ｃａｓタンパク質の別の例は、オフターゲット効果を低減するように設計された改変ｅＳｐＣａｓ９バリアント（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるSlaymakerら（２０１６年）Science ３５１巻（６２６８号）：８４〜８８頁を参照されたい。他のＳｐＣａｓ９バリアントとしては、Ｋ８５５ＡおよびＫ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａが挙げられる。
Ｃａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃｐｆ１タンパク質は、一般に、おそらく二量体立体配置にある標的ＤＮＡの両方の鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも２つのヌクレアーゼドメインも含み得る。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、一般に、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインは、それぞれ二本鎖ＤＮＡの異なる鎖をカットして、ＤＮＡにおける二本鎖切断を生じさせることができる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるJinekら（２０１２年）Science、３３７巻：８１６〜８２１頁を参照されたい。
ヌクレアーゼドメインの１つまたは複数を欠失させるかまたは突然変異させ、その結果、もはや機能的でなくなるかまたは低下したヌクレアーゼ活性を有するようにすることができる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼドメインの１つを欠失させるかまたは突然変異させる場合、得られるＣａｓ９タンパク質は、ニッカーゼと称することができ、二本鎖ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ標的配列に一本鎖切断を生じさせることができるが、二本鎖切断を生じさせることはできない（すなわち、相補鎖または非相補鎖を切断できるが、両方は切断できない）。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する突然変異の例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の１０位におけるアスパラギン酸からアラニンへの）突然変異である。同様に、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＨＮＨドメインにおけるＨ９３９Ａ（アミノ酸８３９位においてヒスチジンからアラニンへ）、Ｈ８４０Ａ（アミノ酸８４０位においてヒスチジンからアラニンへ）、またはＮ８６３Ａ（アミノ酸Ｎ８６３位においてアスパラギンからアラニンへ）により、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換することができる。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する突然変異の他の例としては、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９に対応する突然変異が挙げられる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるSapranauskasら（２０１１年）Nucleic Acids Research、３９巻：９２７５〜９２８２頁およびＷＯ２０１３／１４１６８０を参照されたい。そのような突然変異は、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ媒介性突然変異誘発、または全遺伝子合成などの方法を使用して生じさせることができる。ニッカーゼを創出させる他の突然変異の例は、例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１７６７７２およびＷＯ２０１３／１４２５７８において見出すことができる。
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質の触媒ドメイン中の不活化突然変異の例も公知である。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９酵素（ＳａＣａｓ９）は、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を生成するためのＮ５８０位における置換（例えば、Ｎ５８０Ａ置換）およびＤ１０位における置換（例えば、Ｄ１０Ａ置換）を含んでもよい。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１０６２３６を参照されたい。
Ｃｐｆ１タンパク質の触媒ドメイン中の不活化突然変異の例も公知である。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、およびＭｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７（ＭｂＣｐｆ１、Ｃｐｆ１）に由来するＣｐｆ１タンパク質を参照すると、そのような突然変異は、ＡｓＣｐｆ１の９０８位、９９３位、もしくは１２６３位またはＣｐｆ１オルソログ中の対応する位置、またはＬｂＣｐｆ１の８３２位、９２５位、９４７位、もしくは１１８０位またはＣｐｆ１オルソログ中の対応する位置に突然変異を含んでもよい。そのような突然変異は、例えば、ＡｓＣｐｆ１の突然変異Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、およびＤ１２６３ＡもしくはＣｐｆ１オルソログ中の対応する突然変異、またはＬｂＣｐｆ１のＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７Ａ、およびＤ１１８０ＡもしくはＣｐｆ１オルソログ中の対応する突然変異のうちの１つまたは複数を含んでもよい。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／０２０８２４３を参照されたい。
Ｃａｓタンパク質を異種ポリペプチドに作動可能に連結して融合タンパク質とすることもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質を切断ドメインまたはエピジェネティック改変ドメインと融合することができる。あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０８９２９０を参照されたい。Ｃａｓタンパク質を、安定性の増大または低減をもたらす異種ポリペプチドと融合することもできる。融合したドメインまたは異種ポリペプチドは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部に位置し得る。
一例として、Ｃａｓタンパク質を、細胞内局在化をもたらす１つまたは複数の異種ポリペプチドと融合することができる。そのような異種ポリペプチドとしては、例えば、核へのターゲティングのための単節型ＳＶ４０ ＮＬＳおよび／または双節型アルファ−インポーチンＮＬＳなどの１つまたは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアへのターゲティングのためのミトコンドリア局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなどを挙げることができる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるLangeら（２００７年）J. Biol. Chem.、２８２巻：５１０１〜５１０５頁を参照されたい。そのような細胞内局在化シグナルは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の任意の場所に位置し得る。ＮＬＳは、塩基性アミノ酸のひと続きを含んでよく、また、一分配列であっても二分配列であってもよい。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質は、Ｎ末端のＮＬＳ（例えば、アルファ−インポーチンＮＬＳまたは単節型ＮＬＳ）およびＣ末端のＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳまたは双節型ＮＬＳ）を含む、２つまたはそれより多いＮＬＳを含んでもよい。Ｃａｓタンパク質はまた、Ｎ末端の２つもしくはそれより多いＮＬＳおよび／またはＣ末端の２つもしくはそれより多いＮＬＳを含んでもよい。
Ｃａｓタンパク質を細胞透過性ドメインまたはタンパク質形質導入ドメインと作動可能に連結することもできる。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ−１ ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来のＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ−１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来の細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列に由来してよい。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１３／１７６７７２を参照されたい。細胞透過性ドメインは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の任意の場所に位置し得る。
Ｃａｓタンパク質を蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグなどの追跡または精製をしやすくするための異種ポリペプチドに作動可能に連結することもできる。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、および任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、赤血球凝集素（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）、およびカルモジュリンが挙げられる。
Ｃａｓタンパク質を外因性ドナー核酸または標識された核酸に係留することもできる。そのような係留（すなわち、物理的連結）は、共有結合性相互作用または非共有結合性相互作用によって実現することができ、係留は直接的であってもよく（例えば、直接融合またはタンパク質上のシステインもしくはリシン残基の修飾またはインテイン修飾によって実現することができる化学的なコンジュゲーションによる）、ストレプトアビジンまたはアプタマーなどの１つまたは複数の介在するリンカーまたはアダプター分子を通じて実現することもできる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Pierceら（２００５年）Mini Rev. Med. Chem.、５巻（１号）：４１〜５５頁；Duckworthら（２００７年）Angew. Chem. Int. Ed. Engl.、４６巻（４６号）：８８１９〜８８２２頁；SchaefferおよびDixon（２００９年）Australian J. Chem.、６２巻（１０号）：１３２８〜１３３２頁；Goodmanら（２００９年）Chembiochem.、１０巻（９号）：１５５１〜１５５７頁；ならびにKhatwaniら（２０１２年）Bioorg. Med. Chem.、２０巻（１４号）：４５３２〜４５３９頁を参照されたい。タンパク質−核酸コンジュゲートを合成するための非共有結合性戦略としては、ビオチン−ストレプトアビジン法およびニッケル−ヒスチジン法が挙げられる。共有結合性タンパク質−核酸コンジュゲートを、適切に官能性をもたせた核酸およびタンパク質を多種多様な化学を使用して接続することによって合成することができる。これらの化学の一部は、オリゴヌクレオチドをタンパク質表面上のアミノ酸残基に直接付着させることを伴い（例えば、リシンアミンまたはシステインチオール）、他のより複雑なスキームは、タンパク質の翻訳後修飾または触媒もしくは反応性タンパク質ドメインの関与を必要とする。タンパク質を核酸に共有結合により付着させるための方法としては、例えば、オリゴヌクレオチドとタンパク質のリシンまたはシステイン残基の化学的架橋、発現タンパク質ライゲーション、化学酵素法、および光アプタマーの使用を挙げることができる。外因性ドナー核酸または標識された核酸をＣａｓタンパク質のＣ末端、Ｎ末端、または内部の領域に係留することができる。必要に応じて、外因性ドナー核酸または標識された核酸をＣａｓ９タンパク質のＣ末端またはＮ末端に係留する。同様に、Ｃａｓタンパク質を外因性ドナー核酸または標識された核酸の５’末端、３’末端、または内部の領域に係留することができる。すなわち、外因性ドナー核酸または標識された核酸を任意の配向および極性で係留することができる。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質を外因性ドナー核酸または標識された核酸の５’末端または３’末端に係留する。
Ｃａｓタンパク質は、任意の形態で提供することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質を、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態で提供することができる。あるいは、Ｃａｓタンパク質を、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡなどの、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で提供することができる。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を、特定の細胞または生物体におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞において使用の頻度が高いコドンに置換されるように改変することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞に導入する場合、Ｃａｓタンパク質は、細胞において一過性に、条件付きで、または構成的に発現させることができる。
ｍＲＮＡとして提供されるＣａｓタンパク質を、安定性および／または免疫原性特性の改善のために修飾することができる。修飾を、ｍＲＮＡ内の１つまたは複数のヌクレオシドに対して行うことができる。ｍＲＮＡ核酸塩基に対する化学修飾の例としては、プソイドウリジン、１−メチル−プソイドウリジン、および５−メチル−シチジンが挙げられる。例えば、Ｎ１−メチルプソイドウリジンを含有するキャップ付およびポリアデニル化されたＣａｓ ｍＲＮＡを使用することができる。同様に、Ｃａｓ ｍＲＮＡを、同義コドンを使用するウリジンの枯渇によって修飾することができる。
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を発現構築物中でプロモーターに作動可能に連結することができる。発現構築物は、目的の遺伝子または他の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を導くことができ、そのような目的の核酸配列を標的細胞に移行させることができる任意の核酸構築物を含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター内に入れることができる。あるいは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターとは別のベクターまたはプラスミド内に入れることができる。発現構築物において使用することができるプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生的に制限された前駆細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚の１つまたは複数において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってよい。必要に応じて、プロモーターは、Ｃａｓタンパク質の一方向の発現およびガイドＲＮＡの他方向の発現の両方を駆動する双方向プロモーターであってよい。そのような双方向プロモーターは、（１）３つの外部制御エレメント：遠位配列エレメント（ＤＳＥ）、近位配列エレメント（ＰＳＥ）、およびＴＡＴＡボックスを含有する完全な従来の一方向Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター；ならびに（２）ＰＳＥおよびＤＳＥの５’末端と逆配向で融合したＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターからなり得る。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスと隣接しており、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを付加することによって逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを創出することによってプロモーターを双方向性にすることができる。例えば、その全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００７４５３５を参照されたい。Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子およびガイドＲＮＡをコードする遺伝子を同時に発現させるために双方向プロモーターを使用することにより、送達を容易にするための緻密な発現カセットの生成が可能になる。
（２）ガイドＲＮＡ
「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）に結合し、Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の場所にターゲティングするＲＮＡ分子である。ガイドＲＮＡは、２つのセグメント：「ＤＮＡ標的化セグメント」および「タンパク質結合セグメント」を含み得る。「セグメント」は、ＲＮＡ内のヌクレオチドの連続したひと続きなどの、分子の区画または領域を含む。Ｃａｓ９に対するものなどの一部のｇＲＮＡは、２つの別々のＲＮＡ分子：「活性化因子−ＲＮＡ」（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）および「標的化因子−ＲＮＡ」（例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）を含み得る。他のｇＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子（単一のＲＮＡポリヌクレオチド）であり、「単一分子ｇＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ，」または「ｓｇＲＮＡ」とも称され得る。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１４／０６５５９６、ＷＯ２０１４／０８９２９０、ＷＯ２０１４／０９３６２２、ＷＯ２０１４／０９９７５０、ＷＯ２０１３／１４２５７８、およびＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたい。Ｃａｓ９に関しては、例えば、単一ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡと融合したｃｒＲＮＡ（例えば、リンカーを介して）を含み得る。Ｃｐｆ１に関しては、例えば、標的配列への結合および／または標的配列の切断を実現するためにはｃｒＲＮＡのみが必要である。「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」という用語は、２重分子（すなわち、モジュラー）ｇＲＮＡおよび単一分子ｇＲＮＡの両方を含む。
例示的な２分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「標的化因子−ＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子および対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「活性化因子−ＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）およびｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ ２重鎖の片方を形成するヌクレオチドのひと続き（すなわち、ｃｒＲＮＡ尾部）の両方を含む。ＤＮＡ標的化セグメントの下流（３’側）に位置するｃｒＲＮＡ尾部の例は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号３７）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。本明細書（例えば、配列番号２、１４、２０、２２、２４、２６、２８、２９、３０、３１、３５、３６または５５）に開示されるＤＮＡ標的化セグメント（すなわち、ガイド配列またはガイド）のいずれかを配列番号３７の５’末端に接合してｃｒＲＮＡを形成することができる。
対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（活性化因子−ＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ ２重鎖のあとの半分を形成するヌクレオチドのひと続きを含む。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドのひと続きは、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドのひと続きと相補的であり、ハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ ２重鎖を形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言うことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例は、ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号３８）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方が必要な系では、ｃｒＲＮＡおよび対応するｔｒａｃｒＲＮＡがハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡのみが必要な系では、ｃｒＲＮＡがｇＲＮＡになることができる。ｃｒＲＮＡは、逆の鎖（すなわち、相補鎖）とハイブリダイズすることにより、ガイドＲＮＡ標的配列を標的とする一本鎖ＤＮＡ標的化セグメントをさらにもたらす。細胞内での改変に使用する場合、所与のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子を使用する種に特異的になるように設計することができる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Maliら（２０１３年）Science、３３９巻：８２３〜８２６頁；Jinekら（２０１２年）Science、３３７巻：８１６〜８２１頁；Hwangら（２０１３年）Nat. Biotechnol.、３１巻：２２７〜２２９頁；Jiangら（２０１３年）Nat. Biotechnol.、３１巻：２３３〜２３９頁；およびCongら（２０１３年）Science、３３９巻：８１９〜８２３頁を参照されたい。
所与のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（ｃｒＲＮＡ）は、標的ＤＮＡ内の配列と相補的なヌクレオチド配列（すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列と逆の鎖上のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖）を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡと配列特異的にハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）によって相互作用する。したがって、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は、変動させることができ、ｇＲＮＡと標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の場所を決定する。主題のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントを、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列とハイブリダイズするように改変することができる。天然に存在するｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および生物体に応じて異なるが、多くの場合、２１〜４６ヌクレオチドの長さの２つのダイレクトリピート（ＤＲ）に挟まれた２１〜７２ヌクレオチドの長さの標的化セグメントを含有する（例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたい）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの場合では、ＤＲは３６ヌクレオチドの長さであり、標的化セグメントは３０ヌクレオチドの長さである。３’側に位置するＤＲが対応するｔｒａｃｒＲＮＡと相補的であり、ハイブリダイズし、それが今度はＣａｓタンパク質に結合する。
ＤＮＡ標的化セグメントは、少なくとも約１２ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約１７ヌクレオチド、少なくとも約１８ヌクレオチド、少なくとも約１９ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、または少なくとも約４０ヌクレオチドの長さを有し得る。そのようなＤＮＡ標的化セグメントは、約１２ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドまで、約１２ヌクレオチドから約８０ヌクレオチドまで、約１２ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドまで、約１２ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドまで、約１２ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドまで、約１２ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドまで、または約１２ヌクレオチドから約２０ヌクレオチドまでの長さを有し得る。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１５ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドまで（例えば、約１７ヌクレオチドから約２０ヌクレオチドまで、または約１７ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド、または約２０ヌクレオチド）であってよい。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００２４５２３を参照されたい。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９に関しては、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、１６から２０ヌクレオチドの間の長さまたは１７から２０ヌクレオチドの間の長さである。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９に関しては、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、２１から２３ヌクレオチドの間の長さである。Ｃｐｆ１に関しては、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、少なくとも１６ヌクレオチドの長さまたは少なくとも１８ヌクレオチドの長さである。
ｔｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態（例えば、全長ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）および様々な長さであってよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、一次転写産物またはプロセシングされた形態を含み得る。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡの一部としてかまたは２分子ｇＲＮＡの一部としての別々の分子として）は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の約２０ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約２６ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約３２ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約４５ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約４８ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約５４ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約６３ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約６７ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約８５ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、またはそれよりも多くのヌクレオチド）の全部または一部を含み得るか、それから本質的になり得るか、またはそれからなり得る。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例としては、１７１ヌクレオチド、８９ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、および６５ヌクレオチドバージョンが挙げられる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Deltchevaら（２０１１年）Nature、４７１巻：６０２〜６０７頁；ＷＯ２０１４／０９３６６１を参照されたい。単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例としては、ｓｇＲＮＡの＋４８、＋５４、＋６７、および＋８５バージョンに見出されるｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが挙げられ、ここで、「＋ｎ」は、最大＋ｎヌクレオチドの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡがｓｇＲＮＡに含まれることを示す。あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ８，６９７，３５９を参照されたい。
ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖の間のパーセント相補性は、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であり得る。ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖の間のパーセント相補性は、約２０個連続したヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であり得る。例として、ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖の間のパーセント相補性は、標的ＤＮＡの相補鎖内のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖の５’末端では１４個連続したヌクレオチドにわたって１００％であり、残りにわたっては０％の低さである。そのような場合では、ＤＮＡ標的化セグメントは、１４ヌクレオチドの長さとみなすことができる。別の例として、ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖の間のパーセント相補性は、標的ＤＮＡの相補鎖内のガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖の５’末端では７個連続したヌクレオチドにわたって１００％であり、残りにわたっては０％の低さである。そのような場合では、ＤＮＡ標的化セグメントは、７ヌクレオチドの長さとみなすことができる。一部のガイドＲＮＡでは、ＤＮＡ標的化セグメント内の少なくとも１７ヌクレオチドが標的ＤＮＡと相補的である。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは２０ヌクレオチドの長さであり得、ガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖とのミスマッチを１つ、２つ、または３つ含み得る。必要に応じて、ミスマッチはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接しない（例えば、ミスマッチはＤＮＡ標的化セグメントの５’末端にあるか、またはミスマッチはＰＡＭ配列から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９塩基対離れている）。
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いと相補的な２つのヌクレオチドのひと続きを含み得る。タンパク質結合セグメントの相補的なヌクレオチドはハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ ２重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。主題のｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントはＣａｓタンパク質と相互作用し、ｇＲＮＡは、結合したＣａｓタンパク質を、ＤＮＡ標的化セグメントを介して標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に方向付ける。
単一ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメントおよび足場配列（すなわち、ガイドＲＮＡのタンパク質結合またはＣａｓ結合配列）を有する。例えば、そのようなガイドＲＮＡは、５’ＤＮＡ標的化セグメントおよび３’足場配列を有する。例示的な足場配列は、
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ（バージョン１；配列番号３９）；ＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン２；配列番号７）； ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン３；配列番号８）；およびＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン４；配列番号９）
を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。任意のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするガイドＲＮＡとしては、例えば、ガイドＲＮＡの３’末端上の例示的なガイドＲＮＡ足場配列のいずれかと融合したガイドＲＮＡの５’末端上のＤＮＡ標的化セグメントを挙げることができる。すなわち、本明細書（例えば、配列番号２、１４、２０、２２、２４、２６、２８、２９、３０、３１、３５、３６または５５）に開示されるＤＮＡ標的化セグメント（すなわち、ガイド配列またはガイド）のいずれかを配列番号３９、７、８または９のいずれか１つの５’末端と接合して、単一のガイドＲＮＡ（キメラガイドＲＮＡ）を形成することができる。本明細書の他の箇所で開示されるガイドＲＮＡバージョン１、２、３、および４は、それぞれ足場バージョン１、２、３、および４と接合したＤＮＡ標的化セグメント（すなわち、ガイド配列またはガイド）を指す。
ガイドＲＮＡは、追加的な望ましい特徴（例えば、改変または制御された安定性；細胞内標的化；蛍光標識を用いた追跡；タンパク質またはタンパク質複合体の結合部位など）をもたらす改変または配列を含み得る。そのような改変の例としては、例えば、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））；３’ポリアデニル化尾部（すなわち、３’ポリ（Ａ）尾部）；リボスイッチ配列（例えば、安定性の制御ならびに／またはタンパク質および／もしくはタンパク質複合体による接近可能性の制御を可能にするため）；安定性調節配列；ｄｓＲＮＡ ２重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列；ＲＮＡを細胞内の場所（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）にターゲティングする改変または配列；追跡をもたらす改変または配列（例えば、蛍光分子との直接コンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分とのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列など）；タンパク質（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素などを含めたＤＮＡに作用するタンパク質）の結合部位をもたらす改変または配列；およびこれらの組合せが挙げられる。改変の他の例としては、工学的に操作されたステムループ２重鎖構造、工学的に操作されたバルジ領域、ステムループ２重鎖構造の工学的に操作されたヘアピン３’、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１５／０３７６５８６を参照されたい。バルジは、ｃｒＲＮＡ様領域および最小のｔｒａｃｒＲＮＡ様領域で構成される２重鎖内の対合していないヌクレオチドの領域であり得る。バルジは、２重鎖の片側に対合していない５’−ＸＸＸＹ−３’（配列中、Ｘは任意のプリンであり、Ｙは逆の鎖上のヌクレオチドとゆらぎ対を形成し得るヌクレオチドであり得る）、および、他方の側の２重鎖に対合していないヌクレオチド領域を含み得る。
非改変核酸は、分解されやすくてもよい。外因性核酸は、先天性免疫応答を誘導することもできる。改変は、安定性を導入し、免疫原性を低減させるのに役立ち得る。ガイドＲＮＡは、例えば、下記：（１）ホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素および／または１つもしくは複数の連結リン酸酸素の一方または両方の変更または置換え；（２）リボース糖上の２’ヒドロキシルの変更または置換えなどのリボース糖の構成要素の変更または置換え；（３）脱ホスホリンカーとのリン酸部分の置換え；（４）天然に存在する核酸塩基の改変または置換え；（５）リボース−リン酸骨格の置換えまたは改変；（６）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の改変（例えば、末端リン酸基の除去、改変もしくは置換えまたは部分のコンジュゲーション）；ならびに（７）糖の改変のうちの１つまたは複数を含む、改変ヌクレオシドおよび改変ヌクレオチドを含んでもよい。他の可能なガイドＲＮＡ改変としては、ウラシルまたはポリ−ウラシルトラクトの改変または置換えが挙げられる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／０４８５７７およびＵＳ２０１６／０２３７４５５を参照されたい。同様の改変を、Ｃａｓ ｍＲＮＡなどのＣａｓをコードする核酸に対して行うことができる。
一例として、ガイドＲＮＡの５’または３’末端のヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結を含んでもよい（例えば、塩基はホスホロチオエート基である改変リン酸基を有してもよい）。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’または３’末端の２、３、または４個の末端ヌクレオチドの間にホスホロチオエート連結を含んでもよい。別の例として、ガイドＲＮＡの５’および／または３’末端のヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル改変を有してもよい。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’および／または３’末端（例えば、５’末端）の２、３、または４個の末端ヌクレオチドに２’−Ｏ−メチル改変を含んでもよい。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１およびFinnら（２０１８年）Cell Reports ２２巻：１〜９頁を参照されたい。１つの特定例では、ガイドＲＮＡは、最初の３個の５’および３’末端ＲＮＡ残基に２’−Ｏ−メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。別の特定例では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用しない全ての２’ＯＨ基が２’−Ｏ−メチル類似体で置き換えられ、Ｃａｓ９と最小限に相互作用するガイドＲＮＡの尾部領域が５’および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結で改変されるように改変される。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるYinら（２０１７年）Nat. Biotech. ３５巻（１２号）：１１７９〜１１８７頁を参照されたい。
ガイドＲＮＡは、任意の形態でもたらすことができる。例えば、ｇＲＮＡは、ＲＮＡの形態で、２つの分子（別々のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）としてかまたは１つの分子（ｓｇＲＮＡ）としてのいずれかでもたらすことができ、必要に応じて、Ｃａｓタンパク質との複合体の形態でもたらすことができる。ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの形態でもたらすこともできる。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一のＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）をコードしていてもよく、別々のＲＮＡ分子（例えば、別々のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードしていてもよい。後者の場合、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、１つのＤＮＡ分子としてもたらすこともでき、それぞれｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをコードする別々のＤＮＡ分子としてもたらすこともできる。
ｇＲＮＡをＤＮＡの形態でもたらす場合、ｇＲＮＡを細胞において一過性に、条件付きで、または構成的に発現させることができる。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを発現構築物中でプロモーターに作動可能に連結することができる。例えば、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸などの、異種核酸を含むベクター内に入れることができる。あるいは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクターとは別のベクターまたはプラスミド内に入れることができる。そのような発現構築物に使用することができるプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生的に制限された前駆細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚の１つまたは複数において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってよい。そのようなプロモーターはまた、例えば、双方向プロモーターであってもよい。適切なプロモーターの特定の例としては、ヒトＵ６プロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、またはマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが挙げられる。
あるいは、ｇＲＮＡを、他の様々な方法によって調製することができる。例えば、ｇＲＮＡは、例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって調製することができる（例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたい）。ガイドＲＮＡは、化学合成によって調製された合成的に産生された分子であってもよい。
（３）ガイドＲＮＡ認識配列およびガイドＲＮＡ標的配列
「ガイドＲＮＡ認識配列」という用語は、結合のための十分な条件が存在すればｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡに存在する核酸配列を包含する。ガイドＲＮＡ認識配列という用語は、本明細書で使用される場合、標的二本鎖ＤＮＡの両方の鎖（すなわち、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖上の配列、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する非相補鎖上の対応する配列）を包含する。「ガイドＲＮＡ標的配列」という用語は、本明細書で使用される場合、具体的には、ＰＡＭに隣接する非相補鎖上（すなわち、ＰＡＭの上流または５’側）の配列を指す。すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列は、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖上の配列に対応する非相補鎖上の配列を指す。ガイドＲＮＡ標的配列は、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと等しいが、ウラシルの代わりにチミンである。一例として、Ｃａｓ９酵素に対するガイドＲＮＡ標的配列は、５’−ＮＧＧ−３’ＰＡＭに隣接する非相補鎖上の配列を指すことになる。ガイドＲＮＡ認識配列は、ガイドＲＮＡが相補性を有するように設計された配列を含み、ガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖とガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントのハイブリダイゼーションにより、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が促進される。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ではない。ガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、下でより詳細に記載されているＣａｓタンパク質の切断部位も含む。ガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、例えば、細胞の核もしくは細胞質内、またはミトコンドリアもしくは葉緑体などの細胞の細胞小器官内に位置し得る任意のポリヌクレオチドを含み得る。
標的ＤＮＡ内のガイドＲＮＡ認識配列は、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡによって標的にすることができる（すなわち、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡが結合することができる、またはＣａｓタンパク質またはｇＲＮＡがハイブリダイズすることができる、またはＣａｓタンパク質またはｇＲＮＡが相補的であり得る）。適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件としては、細胞において通常存在する生理的条件が挙げられる。他の適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）が公知である（例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるMolecular Cloning: A Laboratory Manual、第３版（Sambrookら、Harbor Laboratory Press、２００１年）を参照されたい）。Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡと相補的であり、それとハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は、「相補鎖」と称することができ、「相補鎖」と相補的な（したがって、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡとは相補的でない）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補鎖」または「鋳型鎖」と称することができる。
Ｃａｓタンパク質は、核酸を、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡに存在する核酸配列の内部または外部の部位で切断し得る。「切断部位」は、Ｃａｓタンパク質により一本鎖切断または二本鎖切断が生じる、核酸の位置を含む。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体（ガイドＲＮＡ認識配列の相補鎖とハイブリダイズし、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成したｇＲＮＡを含む）の形成により、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡに存在する核酸配列内またはその付近（例えば、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡに存在する核酸配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれよりも多くの塩基対の範囲内）での一方または両方の鎖の切断がもたらされ得る。切断部位が、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する核酸配列の外部にある場合、切断部位はなお「ガイドＲＮＡ認識配列」またはガイドＲＮＡ標的配列内にあるとみなされる。切断部位は、核酸の一方の鎖上のみにあってもよく、両方の鎖上にあってもよい。切断部位は、核酸の両方の鎖上の同じ位置にあってもよく（平滑末端が生じる）、各鎖上の異なる部位にあってもよい（付着末端（すなわち、突出部）が生じる）。付着末端は、例えば、それぞれが異なる鎖上の異なる切断部位で一本鎖切断を生じさせる２つのＣａｓタンパク質を使用し、それにより、二本鎖切断を生じさせることによって生じさせることができる。例えば、第１のニッカーゼにより、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖上に一本鎖切断を創出することができ、第２のニッカーゼにより、ｄｓＤＮＡの第２の鎖上に一本鎖切断を創出することができ、その結果、突出部配列が創出される。一部の場合では、第１の鎖上のニッカーゼのガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、第２の鎖上のニッカーゼのガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、または１，０００塩基対離れている。
Ｃａｓタンパク質による標的ＤＮＡの部位特異的結合および／または切断は、（ｉ）ｇＲＮＡと標的ＤＮＡの間の塩基対合相補性および（ｉｉ）標的ＤＮＡ内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される短いモチーフの両方によって決定される場所で起こり得る。ＰＡＭは、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする鎖と逆の非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列に隣接し得る。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列の３’末端にＰＡＭが隣接し得る。あるいは、ガイドＲＮＡ標的配列の５’末端にＰＡＭが隣接し得る。例えば、Ｃａｓタンパク質の切断部位は、ＰＡＭ配列の約１〜約１０または約２〜約５塩基対（例えば、３塩基対）上流または下流であり得る。一部の場合では（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９または密接に関連するＣａｓ９を使用する場合）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−Ｎ１ＧＧ−３’（配列中、Ｎ１は任意のＤＮＡヌクレオチドである）であり得、標的ＤＮＡの非相補鎖のガイドＲＮＡ認識配列のすぐ３’側（すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列のすぐ３’側）である。したがって、相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−ＣＣＮ２−３’（配列中、Ｎ２は任意のＤＮＡヌクレオチドである）になり、標的ＤＮＡの相補鎖のガイドＲＮＡ認識配列のすぐ５’側である。一部のそのような場合では、Ｎ１とＮ２は相補的であり得、Ｎ１−Ｎ２塩基対は任意の塩基対であり得る（例えば、Ｎ１＝ＣおよびＮ２＝Ｇ；Ｎ１＝ＧおよびＮ２＝Ｃ；Ｎ１＝ＡおよびＮ２＝Ｔ；またはＮ１＝Ｔ、およびＮ２＝Ａ）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合では、ＰＡＭは、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲ（配列中、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴであり得、ＲはＧまたはＡであり得る）であり得る。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９の場合では、ＰＡＭは、例えば、ＮＮＮＮＡＣＡＣまたはＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列中、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴであってよく、ＲはＧまたはＡであってよい）であってよい。一部の場合では（例えば、ＦｎＣｐｆ１に関して）、ＰＡＭ配列は、５’末端の上流であり得、配列５’−ＴＴＮ−３’を有し得る。
ガイドＲＮＡ標的配列またはＰＡＭ配列に加えてガイドＲＮＡ標的配列の例を以下に提示する。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃａｓ９タンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前の２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であり得る。そのようなガイドＲＮＡ標的配列とそれに加えてＰＡＭ配列の例は、ＧＮ１９ＮＧＧ（配列番号１０）またはＮ２０ＮＧＧ（配列番号１１）である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１６５８２５を参照されたい。５’末端のグアニンにより、細胞におけるＲＮＡポリメラーゼによる転写を容易にすることができる。ガイドＲＮＡ標的配列とそれに加えてＰＡＭ配列の他の例としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＴ７ポリメラーゼによる効率的な転写を容易にするための、５’末端の２つのグアニンヌクレオチド（例えば、ＧＧＮ２０ＮＧＧ；配列番号１２）を挙げることができる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたい。他のガイドＲＮＡ標的配列とそれに加えてＰＡＭ配列は、５’ＧまたはＧＧおよび３’ＧＧまたはＮＧＧを含む、配列番号１０〜１２の４〜２２ヌクレオチドの長さを有し得る。さらに他のガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号１０〜１２の１４から２０ヌクレオチドの間の長さを有し得る。
ガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、細胞に対して内因性または外因性の任意の核酸配列であり得る。ガイドＲＮＡ認識配列またはガイドＲＮＡ標的配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列の場合もあり、非コード配列（例えば、制御配列）の場合もあり、両方を含む場合もある。
ＩＩＩ．ｉｎ ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性を評価する方法
生きている動物の組織および臓器へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの送達を評価するため、およびその中でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性を評価するための様々な方法が提供される。そのような方法により、本明細書の他の箇所に記載のＣＲＩＳＰＲリポーターを含む非ヒト動物を使用することができる。
Ａ．ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで標的ゲノム核酸を切り出すか、または破壊するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの能力を試験する方法
本明細書の他の箇所に記載のＣＲＩＳＰＲリポーターを含む非ヒト動物を使用してｉｎ ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性ＮＨＥＪ活性を評価するための様々な方法が提供される。そのような方法は、非ヒト動物に、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲリポーター中の第１のガイドＲＮＡ標的配列を標的にするように設計された第１のガイドＲＮＡ；（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲリポーター中の第２のガイドＲＮＡ標的配列を標的にするように設計された第２のガイドＲＮＡ；および（ｉｉｉ）Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）を導入するステップ；ならびに（ｂ）１つまたは複数の異なるリポータータンパク質の少なくとも１つの活性または発現を測定するステップを含んでもよい。必要に応じて、第１のガイドＲＮＡと第２のガイドＲＮＡは同一であってもよく、第１のガイドＲＮＡ標的配列と第２のガイドＲＮＡ標的配列は同一であってもよい。あるいは、第１のガイドＲＮＡと第２のガイドＲＮＡは異なっていてもよく、第１のガイドＲＮＡ標的配列と第２のガイドＲＮＡ標的配列は異なっていてもよい。第１のガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質をＣＲＩＳＰＲリポーターに方向付け、第２のガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質をＣＲＩＳＰＲリポーターに方向付け、第１のＣａｓ／ガイドＲＮＡ複合体が第１のガイドＲＮＡ標的配列を切断し、第２のＣａｓ／ガイドＲＮＡ複合体が第２のガイドＲＮＡ標的配列を切断し、１つまたは複数のリポータータンパク質の上流のポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターの切り出しをもたらす場合、リポータータンパク質の活性または発現が誘導される。あるいは、第１もしくは第２のガイドＲＮＡ標的配列または第３のガイドＲＮＡ標的配列が、ポリＡ認識モチーフ（カノニカルなポリアデニル化ヘキサマーＡＡＴＡＡＡ）にあるか、またはその近傍にある場合、第１および第２のガイドＲＮＡの対の代わりに単一のガイドＲＮＡを導入することができ、単一のガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質をＣＲＩＳＰＲリポーターに方向付け、Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体は、カノニカルなポリアデニル化ヘキサマーで、またはその近傍でガイドＲＮＡ標的配列を切断し、カノニカルなポリアデニル化ヘキサマーの破壊、その結果として、１つまたは複数のリポータータンパク質の上流のポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターの破壊をもたらす。
同様に、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性を評価するための上記で提供された様々な方法を使用して、本明細書の他の箇所に記載のＣＲＩＳＰＲリポーターを含む細胞を使用してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性をｅｘ ｖｉｖｏで評価することもできる。
ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を、本明細書の他の箇所に開示される任意の送達方法（例えば、ＡＡＶ、ＬＮＰ、またはＨＤＤ）および任意の投与経路によって、細胞または非ヒト動物に導入することができる。特定の方法では、ガイドＲＮＡ（または複数のガイドＲＮＡ）は、ＡＡＶ媒介性送達によって送達される。例えば、肝臓が標的化される場合、ＡＡＶ８を使用することができる。１つの特定例では、Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、および必要に応じて、外因性ドナー核酸（例えば、ｓｓＯＤＮ）は、本明細書の他の箇所に開示されるＡＡＶ８を介して送達される。別の特定例では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ（ＲＮＡの形態にある）ならびに必要に応じて、外因性ドナー核酸は、本明細書の他の箇所に開示されるＬＮＰを介して送達される。
標的ゲノム遺伝子座の改変を評価するための方法は、本明細書の他の箇所に提供され、周知である。標的ゲノム遺伝子座の改変の評価は、本明細書の他の箇所に開示される任意の細胞型、任意の組織型、または任意の臓器型におけるものであってもよい。一部の方法では、標的ゲノム遺伝子座の改変は、肝臓細胞中で評価される。
Ｂ．ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで標的ゲノム核酸を切り出すＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの能力を最適化する方法
細胞もしくは非ヒト動物へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの送達を最適化するため、またはｉｎ ｖｉｖｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性ＮＨＥＪ活性を最適化するための様々な方法が提供される。そのような方法は、例えば、（ａ）第１の非ヒト動物において１回目の本明細書の他の箇所に記載のＣＲＩＳＰＲリポーター中のポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターを切り出すＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの能力を試験する方法を実施するステップ；（ｂ）変数を変化させ、第２の非ヒト動物（すなわち、同じ種の）において変化した変数を用いて２回目のこの方法を実施するステップ；および（ｃ）ステップ（ａ）における１つまたは複数のリポータータンパク質の少なくとも１つの活性または発現と、ステップ（ｂ）における１つまたは複数の異なるタンパク質の少なくとも１つの活性または発現とを比較し、１つまたは複数の異なるリポータータンパク質の少なくとも１つのより高い活性または発現をもたらす方法（すなわち、より高い有効性をもたらす方法）を選択するステップを含んでもよい。
あるいは、ステップ（ｃ）において選択される方法は、より高い有効性、より高い精度、より高い一貫性、またはより高い特異性で、ＣＲＩＳＰＲリポーターの標的化された改変または１つもしくは複数の異なるリポータータンパク質の少なくとも１つの活性もしくは発現の増大をもたらす方法であってよい。より高い有効性とは、ＣＲＩＳＰＲリポーター中の標的遺伝子座の改変のレベルがより高いことを指す（例えば、より高いパーセンテージの細胞が、特定の標的細胞型内、特定の標的組織内、または特定の標的臓器内で標的化される）。より高い精度とは、ＣＲＩＳＰＲリポーター中の標的遺伝子座のより正確な改変を指す（例えば、余分な意図しない挿入および欠失（例えば、ＮＨＥＪインデル）を含まない、同じ改変を有するか、または所望の改変を有する、より高いパーセンテージの標的化された細胞）。より高い一貫性とは、１つより多い細胞型、組織型、または臓器型が標的化される場合、異なる型の標的化された細胞、組織、または臓器間でのＣＲＩＳＰＲリポーター中の標的遺伝子座のより一貫した改変（例えば、標的臓器内でのより多い数の細胞型の改変）を指す。特定の臓器を標的にする場合、より高い一貫性はまた、臓器内の全ての位置を通してより一貫した改変を指してもよい。より高い特異性とは、ＣＲＩＳＰＲリポーター内の標的化される遺伝子座に関するより高い特異性、標的化される細胞型に関するより高い特異性、標的化される組織型に関するより高い特異性、または標的化される臓器に関するより高い特異性を指してもよい。例えば、遺伝子座特異性の増大は、オフターゲットゲノム遺伝子座の少ない改変（例えば、ＣＲＩＳＰＲリポーター中の標的遺伝子座の改変の代わりに、またはそれに加えて、意図しない、オフターゲットゲノム遺伝子座での改変を有する標的化された細胞のパーセンテージがより低い）を指す。同様に、細胞型、組織、または臓器型特異性の増大は、特定の細胞型、組織型、または臓器型が標的化される場合、オフターゲット細胞型、組織型、または臓器型の改変が少ない（例えば、特定の臓器が標的化される場合（例えば、肝臓）、意図した標的ではない臓器または組織中の細胞の改変が少ない）ことを指す。
変化した変数は、任意のパラメーターであってもよい。一例として、変化した変数は、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質のうちの１つもしくは複数または全部が細胞または非ヒト動物に導入されるパッケージングまたは送達方法であってもよい。ＬＮＰ、ＨＤＤ、およびＡＡＶなどの、送達方法の例は、本明細書の他の箇所に開示される。別の例として、変化した変数は、非ヒト動物へのガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質のうちの１つもしくは複数または全部の導入のための投与経路であってもよい。静脈内、硝子体内、実質内、および点鼻などの投与経路の例は、本明細書の他の箇所に開示される。
別の例として、変化した変数は、導入されるガイドＲＮＡおよび導入されるＣａｓタンパク質のうちの１つもしくは複数または全部の濃度または量であってもよい。別の例として、変化した変数は、導入されるＣａｓタンパク質の濃度または量に対する、導入されるガイドＲＮＡの濃度または量であってもよい。
別の例として、変化した変数は、１つまたは複数のリポータータンパク質の発現または活性を測定するタイミングに対する、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質のうちの１つもしくは複数または全部を導入するタイミングであってもよい。別の例として、変化した変数は、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質のうちの１つもしくは複数または全部が導入される回数または頻度であってもよい。別の例として、変化した変数は、Ｃａｓタンパク質の導入のタイミングに対する、ガイドＲＮＡの導入のタイミングであってもよい。
別の例として、変化した変数は、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質のうちの１つもしくは複数または全部が導入される形態であってもよい。例えば、ガイドＲＮＡを、ＤＮＡの形態で、またはＲＮＡの形態で導入することができる。Ｃａｓタンパク質を、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質の形態で導入することができる。同様に、それぞれの構成成分は、オフターゲット効果を低減するため、送達を容易にするためなどに、安定性に関する様々な組合せの改変を含んでもよい。別の例として、変化した変数は、導入されるガイドＲＮＡ（例えば、異なる配列を有する異なるガイドＲＮＡを導入すること）および導入されるＣａｓタンパク質（例えば、異なる配列を有する異なるＣａｓタンパク質、または異なる配列を有するが、同じＣａｓタンパク質アミノ酸配列をコードする核酸を導入すること）のうちの１つもしくは複数または全部であってもよい。
Ｃ．ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで標的ゲノム核酸の外因性ドナー核酸との組換えを誘導するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの能力を試験する方法
本明細書の他の箇所に記載のＣＲＩＳＰＲリポーターを含む非ヒト動物を使用してｉｎ ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換え活性を評価するための様々な方法が提供される。ＣＲＩＳＰＲリポーターがリポータータンパク質のコード配列の上流にポリアデニル化シグナルを含むＣＲＩＳＰＲリポーターである場合、必要に応じて、ポリアデニル化シグナルは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性切り出しまたはリコンビナーゼ媒介性切り出しによって除去されている。そのような方法は、非ヒト動物に、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲリポーター中のガイドＲＮＡ標的配列を標的にするように設計されたガイドＲＮＡ；（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）；および（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲリポーターと組み換わり、ＣＲＩＳＰＲリポーター内のリポータータンパク質のコード配列を、異なるリポータータンパク質のコード配列に変化させることができる外因性ドナー核酸を導入するステップ；ならびに（ｂ）異なるリポータータンパク質の活性または発現を測定するステップを含んでもよい。ガイドＲＮＡ標的配列は、例えば、改変されるリポータータンパク質のコード配列の内部にあってもよい。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質を、本明細書の他の箇所に記載の外因性ドナー核酸に係留することができる。ガイドＲＮＡがＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質をＣＲＩＳＰＲリポーターに方向付け、Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体が、ガイドＲＮＡ標的配列を切断し、ＣＲＩＳＰＲリポーターが、外因性ドナー核酸と組み換わって、ＣＲＩＳＰＲリポーター内のリポータータンパク質のコード配列を、異なるリポータータンパク質のコード配列に変換する場合、リポータータンパク質の活性または発現が誘導されると予想される。外因性ドナー核酸は、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）またはＮＨＥＪ媒介性挿入によって、ＣＲＩＳＰＲリポーターと組み換わり得る。任意の型の外因性ドナー核酸を使用することができ、その例は本明細書の他の箇所に提供される。
同様に、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性を評価するための上記で提供された様々な方法を使用して、本明細書の他の箇所に記載のＣＲＩＳＰＲリポーターを含む細胞を使用してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性をｅｘ ｖｉｖｏで評価することもできる。
一例では、リポータータンパク質は、ＢＦＰまたはｅＢＦＰであり、外因性ドナー核酸は、単一のコドンを変更することによって、ＢＦＰまたはｅＢＦＰをコードする配列を、ＧＦＰまたはｅＧＦＰをコードする配列に変換する突然変異を含む。ＢＦＰまたはｅＢＦＰコード配列のこの領域を標的とする例示的なガイドＲＮＡは、配列番号４２に記載の標的化配列を含む。例示的な外因性ドナー核酸の配列は、配列番号１５または配列番号１６に記載される。別の例では、リポータータンパク質は、ＧＦＰまたはｅＧＦＰであり、外因性ドナー核酸は、単一のコドンを変更することによって、ＧＦＰまたはｅＧＦＰをコードする配列を、ＢＦＰまたはｅＢＦＰをコードする配列に変換する突然変異を含む。
ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、および外因性ドナー核酸を、本明細書の他の箇所に開示される任意の送達方法（例えば、ＡＡＶ、ＬＮＰ、またはＨＤＤ）および任意の投与経路によって、細胞または非ヒト動物に導入することができる。特定の方法では、ガイドＲＮＡ（または複数のガイドＲＮＡ）は、ＡＡＶ媒介性送達によって送達される。例えば、肝臓が標的化される場合、ＡＡＶ８を使用することができる。
標的ゲノム遺伝子座の改変を評価するための方法は、本明細書の他の箇所に提供され、周知である。標的ゲノム遺伝子座の改変の評価は、本明細書の他の箇所に開示される任意の細胞型、任意の組織型、または任意の臓器型におけるものであってもよい。一部の方法では、標的ゲノム遺伝子座の改変は、肝臓細胞中で評価される。
（１）外因性ドナー核酸
本明細書に開示される方法および組成物は、Ｃａｓタンパク質を用いたＣＲＩＳＰＲリポーターの切断後にＣＲＩＳＰＲリポーター（すなわち、標的ゲノム遺伝子座）を改変するために外因性ドナー核酸を使用する。そのような方法では、Ｃａｓタンパク質によりＣＲＩＳＰＲリポーターが切断されて一本鎖切断（ニック）または二本鎖切断が創出され、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介性ライゲーションまたは相同組換え修復事象によって外因性ドナー核酸が標的核酸と組み換えられる。必要に応じて、外因性ドナー核酸を用いた修復により、ガイドＲＮＡ標的配列またはＣａｓ切断部位が除去または破壊され、その結果、標的化された対立遺伝子がＣａｓタンパク質によって再度標的化されることができなくなる。
外因性ドナー核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、直鎖形態であっても環状形態であってもよいデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含み得る。例えば、外因性ドナー核酸は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であり得る。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるYoshimiら（２０１６年）Nat. Commun.、７巻：１０４３１頁を参照されたい。例示的な外因性ドナー核酸は、約５０ヌクレオチド〜約５ｋｂの長さであるか、約５０ヌクレオチド〜約３ｋｂの長さであるか、または約５０〜約１，０００ヌクレオチドの長さである。他の例示的な外因性ドナー核酸は、約４０〜約２００ヌクレオチドの長さである。例えば、外因性ドナー核酸は、約５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、１５０〜１６０、１６０〜１７０、１７０〜１８０、１８０〜１９０、または１９０〜２００ヌクレオチドの長さであってよい。あるいは、外因性ドナー核酸は、約５０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、８００〜９００、または９００〜１０００ヌクレオチドの長さであってよい。あるいは、外因性ドナー核酸は、約１〜１．５、１．５〜２、２〜２．５、２．５〜３、３〜３．５、３．５〜４、４〜４．５、または４．５〜５ｋｂの長さであってよい。あるいは、外因性ドナー核酸は、例えば、５ｋｂ以下、４．５ｋｂ以下、４ｋｂ以下、３．５ｋｂ以下、３ｋｂ以下、２．５ｋｂ以下、２ｋｂ以下、１．５ｋｂ以下、１ｋｂ以下、９００ヌクレオチド以下、８００ヌクレオチド以下、７００ヌクレオチド以下、６００ヌクレオチド以下、５００ヌクレオチド以下、４００ヌクレオチド以下、３００ヌクレオチド以下、２００ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下、または５０ヌクレオチド以下の長さであってよい。また、外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）は、より長くてもよい。
一実施例では、外因性ドナー核酸は、約８０ヌクレオチドから約２００ヌクレオチドの間の長さのｓｓＯＤＮである。別の例では、外因性ドナー核酸は、約８０ヌクレオチドから約３ｋｂの間の長さのｓｓＯＤＮである。そのようなｓｓＯＤＮは、例えば、それぞれが約４０ヌクレオチドから約６０ヌクレオチドの間の長さである相同アームを有してよい。そのようなｓｓＯＤＮはまた、例えば、それぞれが約３０ヌクレオチドから１００ヌクレオチドの長さである相同アームを有してもよい。相同アームは、対称的であってもよく（例えば、それぞれが４０ヌクレオチド、またはそれぞれが６０ヌクレオチドの長さである）、非対称的であってもよい（例えば、３６ヌクレオチドの長さの相同アームが１つと９１ヌクレオチドの長さの相同アームが１つ）。
外因性ドナー核酸は、追加的な望ましい特徴（例えば、改変または制御された安定性；蛍光標識を用いた追跡または検出；タンパク質またはタンパク質複合体の結合部位など）をもたらす改変または配列を含み得る。外因性ドナー核酸は、１つまたは複数の蛍光標識、精製タグ、エピトープタグ、またはこれらの組合せを含み得る。例えば、外因性ドナー核酸は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの蛍光標識などの、１つまたは複数の蛍光標識（例えば、蛍光タンパク質または他のフルオロフォアまたは色素）を含み得る。例示的な蛍光標識としては、フルオレセイン（例えば、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ））、テキサスレッド、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、５−（および−６）−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、およびＣｙ７などのフルオロフォアが挙げられる。オリゴヌクレオチドの標識のために広範囲の蛍光色素が商業的に入手可能である（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）。そのような蛍光標識（例えば、内部蛍光標識）を、例えば、外因性ドナー核酸の末端と適合する突出末端を有する切断された標的核酸に直接組み込まれた外因性ドナー核酸を検出するために使用することができる。標識またはタグは、外因性ドナー核酸の５’末端、３’末端、または内部にあってよい。例えば、外因性ドナー核酸の５’末端にＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＩＲ７００フルオロフォア（５’ＩＲＤＹＥ（登録商標）７００）をコンジュゲートすることができる。
外因性ドナー核酸はまた、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれるＤＮＡのセグメントを含む核酸挿入断片も含み得る。標的ゲノム遺伝子座への核酸挿入断片の組込みにより、標的ゲノム遺伝子座への目的の核酸配列の付加、標的ゲノム遺伝子座での目的の核酸配列の欠失、または標的ゲノム遺伝子座での目的の核酸配列の置換え（すなわち、欠失および挿入）をもたらすことができる。一部の外因性ドナー核酸は、標的ゲノム遺伝子座におけるいかなる対応する欠失も伴わずに標的ゲノム遺伝子座に核酸挿入断片が挿入されるように設計される。他の外因性ドナー核酸は、核酸挿入断片のいかなる対応する挿入も伴わずに標的ゲノム遺伝子座において目的の核酸配列が欠失するように設計される。さらに他の外因性ドナー核酸は、標的ゲノム遺伝子座において目的の核酸配列が欠失し、それが核酸挿入断片で置き換えられるように設計される。
核酸挿入断片または欠失および／もしくは置換えを受ける標的ゲノム遺伝子座の対応する核酸は種々の長さであってよい。例示的な核酸挿入断片または欠失および／もしくは置換えを受ける標的ゲノム遺伝子座の対応する核酸は、約１ヌクレオチド〜約５ｋｂの長さまたは約１ヌクレオチド〜約１，０００ヌクレオチドの長さである。例えば、核酸挿入断片または欠失および／もしくは置換えを受ける標的ゲノム遺伝子座の対応する核酸は、約１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、１５０〜１６０、１６０〜１７０、１７０〜１８０、１８０〜１９０、または１９０〜１２０ヌクレオチドの長さであってもよい。同様に、核酸挿入断片または欠失および／もしくは置換えを受ける標的ゲノム遺伝子座の対応する核酸は、１〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、８００〜９００、または９００〜１０００ヌクレオチドの長さであってもよい。同様に、核酸挿入断片または欠失および／もしくは置換えを受ける標的ゲノム遺伝子座の対応する核酸は、約１〜１．５、１．５〜２、２〜２．５、２．５〜３、３〜３．５、３．５〜４、４〜４．５、もしくは４．５〜５ｋｂの長さまたはそれより長くてもよい。
核酸挿入断片は、置換えの標的とされる配列の全部または一部と相同またはオーソロガスである配列を含んでもよい。例えば、核酸挿入断片は、標的ゲノム遺伝子座における置換えの標的とされる配列と比較して１つもしくは複数の点突然変異（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくはそれよりも多い）を含む配列を含んでもよい。必要に応じて、そのような点突然変異は、コードされたポリペプチド中での保存的アミノ酸置換（例えば、グルタミン酸［Ｇｌｕ、Ｅ］とのアスパラギン酸［Ａｓｐ、Ｄ］の置換）をもたらし得る。
（２）非相同末端結合媒介性挿入のためのドナー核酸
一部の外因性ドナー核酸は、標的ゲノム遺伝子座におけるＣａｓタンパク質媒介性切断によって創出される１つまたは複数の突出部と相補的な短い一本鎖領域を５’末端および／または３’末端に有する。これらの突出部は、５’および３’相同アームとも称され得る。例えば、一部の外因性ドナー核酸は、標的ゲノム遺伝子座の５’および／または３’標的配列におけるＣａｓタンパク質媒介性切断によって創出される１つまたは複数の突出部と相補的な短い一本鎖領域を５’末端および／または３’末端に有する。一部のそのような外因性ドナー核酸は、相補的な領域を５’末端のみに有するかまたは３’末端のみに有する。例えば、一部のそのような外因性ドナー核酸は、相補的な領域を、標的ゲノム遺伝子座の５’標的配列において創出される突出部に相補的な５’末端のみに有するかまたは標的ゲノム遺伝子座の３’標的配列において創出される突出部に相補的な３’末端のみに有する。他のそのような外因性ドナー核酸は、相補的な領域を５’および３’末端の両方に有する。例えば、他のそのような外因性ドナー核酸は、相補的な領域を５’および３’末端の両方に有し、これらは、例えば、それぞれ標的ゲノム遺伝子座におけるＣａｓ媒介性切断によって生じる第１および第２の突出部に相補的である。例えば、外因性ドナー核酸が二本鎖である場合、一本鎖の相補的な領域を、ドナー核酸の上鎖の５’末端およびドナー核酸の下鎖の５’末端から伸長させ、それにより、各末端に５’突出部を創出することができる。あるいは、一本鎖の相補的な領域をドナー核酸の上鎖の３’末端および鋳型の下鎖の３’末端から伸長させ、それにより、３’突出部を創出することができる。
相補的な領域は、外因性ドナー核酸と標的核酸の間のライゲーションを促進するのに十分な任意の長さであってよい。例示的な相補的な領域は、約１〜約５ヌクレオチドの長さ、約１〜約２５ヌクレオチドの長さ、または約５〜約１５０ヌクレオチドの長さである。例えば、相補的な領域は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドの長さであってよい。あるいは、相補的な領域は、約５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、または１４０〜１５０ヌクレオチドの長さであってよい、またはそれより長くてよい。
そのような相補的な領域は、ニッカーゼの２つの対によって創出される突出部と相補的であってよい。ＤＮＡの逆の鎖を切断して第１の二本鎖切断を創出する第１および第２のニッカーゼ、ならびにＤＮＡの逆の鎖を切断して第２の二本鎖切断を創出する第３および第４のニッカーゼを使用することにより、付着末端を有する２つの二本鎖切断を創出することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質を使用して、第１、第２、第３、および第４のガイドＲＮＡに対応する第１、第２、第３、および第４のガイドＲＮＡ標的配列にニックを入れることができる。第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列を、第１の切断部位が創出され、その結果、ＤＮＡの第１および第２の鎖上の第１および第２のニッカーゼによって創出されるニックにより二本鎖切断が創出される（すなわち、第１の切断部位が第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列内にニックを含む）ように位置付けることができる。同様に、第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列を、第２の切断部位が創出され、その結果、ＤＮＡの第１および第２の鎖上の第３および第４のニッカーゼによって創出されるニックにより二本鎖切断が創出される（すなわち、第２の切断部位が第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列内にニックを含む）ように位置付けることができる。必要に応じて、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列ならびに／または第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列内のニックにより、突出部を創出するニックをオフセットすることができる。オフセットウインドウは、例えば、少なくとも約５ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐであるかまたはそれよりも大きくてよい。それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ranら（２０１３年）Cell、１５４巻：１３８０〜１３８９頁；Maliら（２０１３年）Nat. Biotech.、３１巻：８３３〜８３８頁；およびShenら（２０１４年）Nat. Methods、１１巻：３９９〜４０４頁を参照されたい。そのような場合では、二本鎖外因性ドナー核酸は、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列内のニックによってならびに第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列内のニックによって創出される突出部に相補的である一本鎖の相補的な領域を有するように設計することができる。次いで、そのような外因性ドナー核酸を非相同末端結合媒介性ライゲーションによって挿入することができる。
（３）相同組換え修復によって挿入するためのドナー核酸
一部の外因性ドナー核酸は、相同アームを含む。外因性ドナー核酸が核酸挿入断片も含む場合、相同アームにより核酸挿入断片が挟まれていてよい。参照しやすくするために、本明細書では、相同アームを５’および３’（すなわち、上流および下流の）相同アームと称する。この用語法は、外因性ドナー核酸内の核酸挿入断片に対する相同アームの相対的な位置に関する。５’および３’相同アームは、本明細書においてそれぞれ「５’標的配列」および「３’標的配列」と称される標的ゲノム遺伝子座内の領域に対応する。
相同アームおよび標的配列は、当該２つの領域が互いに対して相同組換え反応の基質としての機能を果たすのに十分なレベルの配列同一性を共有する場合、互いに「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ）」または「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」。「相同性」という用語は、対応する配列と同一であるかまたは配列同一性を共有するＤＮＡ配列を包含する。所与の標的配列と外因性ドナー核酸に見出される対応する相同アームの間の配列同一性は、相同組換えが起こるのを可能にする任意の程度の配列同一性であってよい。例えば、外因性ドナー核酸（またはその断片）の相同アームおよび標的配列（またはその断片）によって共有される配列同一性の量は、配列が相同組換えを受けるように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性であってよい。さらに、相同アームと対応する標的配列の間の対応する相同領域は、相同組換えを促進するのに十分な任意の長さであってよい。例示的な相同アームは、約２５ヌクレオチド〜約２．５ｋｂの長さであるか、約２５ヌクレオチド〜約１．５ｋｂの長さであるか、または約２５〜約５００ヌクレオチドの長さである。例えば、所与の相同アーム（もしくは相同アームのそれぞれ）および／または対応する標的配列は、相同アームが標的核酸内の対応する標的配列との相同組換えを受けるのに十分な相同性を有するように、約２５〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、または４５０〜５００ヌクレオチドの長さの対応する相同領域を含み得る。あるいは、所与の相同アーム（もしくは各相同アーム）および／または対応する標的配列は、約０．５ｋｂ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ〜約２ｋｂ、または約２ｋｂ〜約２．５ｋｂの長さの対応する相同領域を含み得る。例えば、相同アームはそれぞれ約７５０ヌクレオチドの長さであってよい。相同アームは対称的であってもよく（それぞれの長さがほぼ同じサイズ）、非対称的であってもよい（一方が他方よりも長い）。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を外因性ドナー核酸と組み合わせて使用する場合、５’および３’標的配列は、必要に応じて、Ｃａｓ切断部位における一本鎖切断（ニック）または二本鎖切断の際の標的配列と相同アームの間の相同組換え事象の発生が促進されるように、Ｃａｓ切断部位（例えば、ガイドＲＮＡ標的配列の十分近くにある）に対して十分に近傍に位置する。「Ｃａｓ切断部位」という用語は、Ｃａｓ酵素（例えば、ガイドＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９タンパク質）によってニックまたは二本鎖切断が創出されるＤＮＡ配列を包含する。外因性ドナー核酸の５’および３’相同アームに対応する標的化遺伝子座内の標的配列は、Ｃａｓ切断部位における一本鎖切断または二本鎖切断の際の５’および３’標的配列と相同アームの間の相同組換え事象の発生が促進されるような距離にあれば、Ｃａｓ切断部位に対して「十分に近傍に位置する」。したがって、外因性ドナー核酸の５’および／または３’相同アームに対応する標的配列は、例えば、所与のＣａｓ切断部位から少なくとも１ヌクレオチドの範囲内または所与のＣａｓ切断部位から少なくとも１０ヌクレオチド〜約１，０００ヌクレオチドの範囲内であり得る。例として、Ｃａｓ切断部位は、標的配列の少なくとも一方または両方のすぐ隣にあり得る。
外因性ドナー核酸の相同アームに対応する標的配列とＣａｓ切断部位の空間的関係は変動し得る。例えば、標的配列がＣａｓ切断部位の５’側に位置する場合もあり、標的配列がＣａｓ切断部位の３’側に位置する場合もあり、標的配列がＣａｓ切断部位を挟んでいる場合もある。
Ｄ．ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで標的ゲノム核酸の外因性ドナー核酸との組換えを誘導するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの能力を最適化する方法
細胞もしくは非ヒト動物へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの送達を最適化するため、またはｉｎ ｖｉｖｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換え活性を最適化するための様々な方法が提供される。そのような方法は、例えば、（ａ）第１の非ヒト動物において１回目の標的ゲノム遺伝子座の本明細書の他の箇所に記載の外因性ドナー核酸とのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換えを試験する方法を実施するステップ；（ｂ）変数を変化させ、第２の非ヒト動物（すなわち、同じ種の）において変化した変数を用いて２回目のこの方法を実施するステップ；および（ｃ）ステップ（ａ）におけるリポータータンパク質の活性または発現と、ステップ（ｂ）におけるリポータータンパク質の活性または発現とを比較し、リポータータンパク質のより高い活性または発現をもたらす方法を選択する（すなわち、より高い有効性をもたらす方法を選択する）ステップを含んでもよい。
あるいは、ステップ（ｃ）において選択される方法は、より高い有効性、より高い精度、より高い一貫性、またはより高い特異性で、ＣＲＩＳＰＲリポーターの標的化された改変またはリポータータンパク質の活性もしくは発現の増大をもたらす方法であってよい。より高い有効性とは、ＣＲＩＳＰＲリポーター中の標的遺伝子座の改変のレベルがより高いことを指す（例えば、より高いパーセンテージの細胞が、特定の標的細胞型内、特定の標的組織内、または特定の標的臓器内で標的化される）。より高い精度とは、ＣＲＩＳＰＲリポーター中の標的遺伝子座のより正確な改変を指す（例えば、余分な意図しない挿入および欠失（例えば、ＮＨＥＪインデル）を含まない、同じ改変を有するか、または所望の改変を有する、より高いパーセンテージの標的化された細胞）。より高い一貫性とは、１つより多い細胞型、組織型、または内臓型が標的化される場合、異なる型の標的化された細胞、組織、または臓器間でのＣＲＩＳＰＲリポーター中の標的遺伝子座のより一貫した改変（例えば、標的臓器内でのより多い数の細胞型の改変）を指す。特定の臓器を標的にする場合、より高い一貫性はまた、臓器内の全ての位置を通してより一貫した改変を指してもよい。より高い特異性とは、ＣＲＩＳＰＲリポーター内の標的化される遺伝子座に関するより高い特異性、標的化される細胞型に関するより高い特異性、標的化される組織型に関するより高い特異性、または標的化される臓器に関するより高い特異性を指してもよい。例えば、遺伝子座特異性の増大は、オフターゲットゲノム遺伝子座の少ない改変（例えば、ＣＲＩＳＰＲリポーター中の標的遺伝子座の改変の代わりに、またはそれに加えて、意図しない、オフターゲットゲノム遺伝子座での改変を有する標的化された細胞のパーセンテージがより低い）を指す。同様に、細胞型、組織、または臓器型特異性の増大は、特定の細胞型、組織型、または臓器型が標的化される場合、オフターゲット細胞型、組織型、または臓器型の改変が少ない（例えば、特定の臓器が標的化される場合（例えば、肝臓）、意図した標的ではない臓器または組織中の細胞の改変が少ない）ことを指す。
変化する変数は、任意のパラメーターであってもよい。一例として、変化する変数は、ガイドＲＮＡ、外因性ドナー核酸、およびＣａｓタンパク質のうちの１つもしくは複数または全部が細胞または非ヒト動物に導入されるパッケージングまたは送達方法であってもよい。ＬＮＰ、ＨＤＤ、およびＡＡＶなどの、送達方法の例は、本明細書の他の箇所に開示される。別の例として、変化した変数は、非ヒト動物へのガイドＲＮＡ、外因性ドナー核酸、およびＣａｓタンパク質のうちの１つもしくは複数または全部の導入のための投与経路であってもよい。静脈内、硝子体内、実質内、および点鼻などの投与経路の例は、本明細書の他の箇所に開示される。
別の例として、変化する変数は、導入されるガイドＲＮＡ、導入されるＣａｓタンパク質、および導入される外因性ドナー核酸のうちの１つもしくは複数または全部の濃度または量であってもよい。別の例として、変化する変数は、導入されるＣａｓタンパク質の濃度もしくは量に対する導入されるガイドＲＮＡの濃度もしくは量、導入される外因性ドナー核酸の濃度もしくは量に対する導入されるガイドＲＮＡの濃度もしくは量、または導入されるＣａｓタンパク質の濃度もしくは量に対する導入される外因性ドナー核酸の濃度もしくは量であってもよい。
別の例として、変化する変数は、１つまたは複数のリポータータンパク質の発現または活性を測定するタイミングに対する、ガイドＲＮＡ、外因性ドナー核酸、およびＣａｓタンパク質のうちの１つもしくは複数または全部を導入するタイミングであってもよい。別の例として、変化する変数は、ガイドＲＮＡ、外因性ドナー核酸、およびＣａｓタンパク質のうちの１つもしくは複数または全部が導入される回数または頻度であってもよい。別の例として、変化する変数は、Ｃａｓタンパク質の導入のタイミングに対するガイドＲＮＡの導入のタイミング、外因性ドナー核酸の導入のタイミングに対するガイドＲＮＡの導入のタイミング、またはＣａｓタンパク質の導入のタイミングに対する外因性ドナー核酸の導入のタイミングであってもよい。
別の例として、変化する変数は、ガイドＲＮＡ、外因性ドナー核酸、およびＣａｓタンパク質のうちの１つもしくは複数または全部が導入される形態であってもよい。例えば、ガイドＲＮＡを、ＤＮＡの形態で、またはＲＮＡの形態で導入することができる。Ｃａｓタンパク質を、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質の形態で導入することができる。外因性ドナー核酸は、一本鎖、二本鎖、線状、環状などのＤＮＡ、ＲＮＡであってもよい。同様に、それぞれの構成成分は、オフターゲット効果を低減するため、送達を容易にするためなどに、安定性に関する様々な組合せの改変を含んでもよい。別の例として、変化する変数は、導入されるガイドＲＮＡ（例えば、異なる配列を有する異なるガイドＲＮＡを導入すること）、導入される外因性ドナー核酸（例えば、異なる配列を有する異なる外因性ドナー核酸を導入すること）、および導入されるＣａｓタンパク質（例えば、異なる配列を有する異なるＣａｓタンパク質、または異なる配列を有するが、同じＣａｓタンパク質アミノ酸配列をコードする核酸を導入すること）のうちの１つもしくは複数または全部であってもよい。
Ｅ．細胞および非ヒト動物へのガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質の導入
本明細書に開示される方法は、細胞または非ヒト動物に、ガイドＲＮＡ、外因性ドナー
核酸、およびＣａｓタンパク質のうちの１つもしくは複数または全部を導入することを含む。「導入」は、細胞または非ヒト動物に、核酸またはタンパク質が細胞の内部または非ヒト動物内の細胞の内部へのアクセスを獲得するような様式で核酸またはタンパク質を提示することを含む。導入は、任意の手段によって実現することができ、２つまたはそれより多い構成成分（例えば、２つの構成成分、または全部の構成成分）を任意の組合せで同時にまたは逐次的に細胞または非ヒト動物に導入することができる。例えば、ガイドＲＮＡの導入前にＣａｓタンパク質を細胞もしくは非ヒト動物に導入するか、またはガイドＲＮＡの導入後にそれを導入することができる。別の例として、外因性ドナー核酸を、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡの導入の前に導入するか、またはＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡの導入後にそれを導入することができる（例えば、外因性ドナー核酸を、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡの導入の約１、２、３、４、８、１２、２４、３６、４８、または７２時間前または後に投与することができる）。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１５／０２４０２６３およびＵＳ２０１５／０１１０７６２を参照されたい。さらに、２つまたはそれより多い構成成分を、同じ送達方法または異なる送達方法によって、細胞または非ヒト動物に導入することができる。同様に、２つまたはそれより多い構成成分を、同じ投与経路または異なる投与経路によって、非ヒト動物に導入することができる。
ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ）の形態でまたはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で細胞に導入することができる。ＤＮＡの形態で導入する場合、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。例えば、ガイドＲＮＡを、ＡＡＶによって送達し、Ｕ６プロモーターの下でｉｎ ｖｉｖｏで発現させることができる。そのようなＤＮＡは、１つまたは複数の発現構築物中にあってよい。例えば、そのような発現構築物は、単一の核酸分子の構成成分であってよい。あるいは、それらは２つまたはそれよりも多くの核酸分子中の任意の組合せで分けることができる（すなわち、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＤＮＡ、および１つまたは複数のｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡが別々の核酸分子の構成成分であってよい）。
同様に、Ｃａｓタンパク質は、任意の形態でもたらすことができる。例えば、Ｃａｓタンパク質を、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態でもたらすことができる。あるいは、Ｃａｓタンパク質を、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡなどの、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態でもたらすことができる。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を、特定の細胞または生物体におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞において使用の頻度が高いコドンに置換されるように改変することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞に導入する場合、Ｃａｓタンパク質は、細胞において一過性に、条件付きで、または構成的に発現させることができる。
Ｃａｓタンパク質またはガイドＲＮＡをコードする核酸を、発現構築物中でプロモーターに作動可能に連結することができる。発現構築物は、目的の遺伝子または他の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を方向付けることができ、そのような目的の核酸配列を標的細胞に移行させることができる任意の核酸構築物を含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、１つまたは複数のｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター中にあってもよい。あるいは、それは、１つまたは複数のｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターとは別であるベクターまたはプラスミド中にあってもよい。発現構築物に使用することができる好適なプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生的に制限された前駆細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚の１つまたは複数において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってよい。必要に応じて、プロモーターは、Ｃａｓタンパク質の一方向の発現およびガイドＲＮＡの他方向の発現の両方を駆動する双方向プロモーターであってよい。そのような双方向プロモーターは、（１）３つの外部制御エレメント：遠位配列エレメント（ＤＳＥ）、近位配列エレメント（ＰＳＥ）、およびＴＡＴＡボックスを含有する完全な従来の一方向Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター；ならびに（２）ＰＳＥおよびＤＳＥの５’末端と逆配向で融合したＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターからなり得る。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスと隣接しており、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを付加することによって逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを創出することによってプロモーターを双方向性にすることができる。例えば、その全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００７４５３５を参照されたい。Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子およびガイドＲＮＡをコードする遺伝子を同時に発現させるための双方向プロモーターを使用することにより、送達を容易にするための緻密な発現カセットの生成が可能になる。
外因性ドナー核酸、ガイドＲＮＡ、またはＣａｓタンパク質の安定性を増大させる（例えば、所与の保存条件下（例えば、−２０℃、４℃、もしくは周囲温度）で分解生成物が閾値未満、例えば出発核酸もしくはタンパク質の０．５重量％未満に留まる期間を延長させる；またはｉｎ ｖｉｖｏにおける安定性を増大させる）担体を含む組成物中で、外因性ドナー核酸、ガイドＲＮＡ、およびＣａｓタンパク質（またはガイドＲＮＡもしくはＣａｓタンパク質をコードする核酸）を提供することができる。そのような担体の非限定的な例としては、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸・ポリグリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート、および脂質微小管（ｌｉｐｉｄ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）が挙げられる。
核酸またはタンパク質の細胞または非ヒト動物への導入を可能にするための様々な方法および組成物が本明細書で提供される。核酸を種々の細胞型に導入するための方法は当該分野で公知であり、それらとして、例えば、安定トランスフェクション方法、一過性トランスフェクション方法、およびウイルス媒介性方法が挙げられる。
トランスフェクションプロトコールならびに核酸配列を細胞に導入するためのプロトコールは変動し得る。非限定的なトランスフェクション方法として、リポソーム；ナノ粒子；リン酸カルシウム（Grahamら（１９７３年）Virology、５２巻（２号）：４５６〜６７頁、Bacchettiら（１９７７年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、７４巻（４号）：１５９０〜４頁、およびKriegler, M（１９９１年）、Transfer and Expression:A Laboratory Manual. New York： W. H. Freeman and Company、９６〜９７頁）；デンドリマー；またはＤＥＡＥ−デキストランもしくはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを使用する、化学に基づくトランスフェクション方法が挙げられる。非化学的方法として、エレクトロポレーション、ソノポレーション、および光学的トランスフェクションが挙げられる。粒子に基づくトランスフェクションとして、遺伝子銃の使用、または磁石補助トランスフェクションが挙げられる（Bertram（２００６年）Current Pharmaceutical Biotechnology、７巻、２７７〜２８頁）。ウイルスによる方法をトランスフェクションのために使用することもできる。
核酸またはタンパク質の細胞への導入は、エレクトロポレーションによって、細胞質内注射によって、ウイルス感染によって、アデノウイルスによって、アデノ随伴ウイルスによって、レンチウイルスによって、レトロウイルスによって、トランスフェクションによって、脂質媒介性トランスフェクションによって、またはヌクレオフェクションによって媒介することもできる。ヌクレオフェクションは、核酸基体を細胞質だけでなく核膜を通って、および核内にも送達することを可能にする、改善されたエレクトロポレーション技術である。さらに、本明細書に開示される方法におけるヌクレオフェクションの使用は、一般には、通常のエレクトロポレーションよりもはるかに少ない細胞を必要とする（例えば、通常のエレクトロポレーションでは７百万個であるのと比較してたった約２百万個）。一例では、ＬＯＮＺＡ（登録商標）ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）システムを使用してヌクレオフェクションを実施する。
核酸またはタンパク質の細胞（例えば、接合体）への導入は、微量注射によって実現することもできる。受精卵（すなわち、１細胞期胚）中で、微量注射は、母系および／もしくは父系前核または細胞質へのものであってよい。微量注射が一方だけの前核へのものである場合、父系前核は、そのサイズがより大きいため、好ましい。ｍＲＮＡの微量注射は、細胞質内へのものであることが好ましいが（例えば、ｍＲＮＡを翻訳機構に直接送達するため）、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする、もしくはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの微量注射は核／前核へのものであることが好ましい。あるいは、核／前核と細胞質の両方への注射によって、微量注射を実行することができる：針を最初に核／前核に導入し、第１の量を注入することができ、１細胞期胚から針を除去しながら、第２の量を細胞質に注入することができる。Ｃａｓタンパク質を細胞質内に注射する場合、Ｃａｓタンパク質は、必要に応じて、核／前核への送達を確実にするために、核局在化シグナルを含む。微量注射を実行するための方法は周知である。例えば、Nagyら（Nagy A、Gertsenstein M、Vintersten K、Behringer R.、２００３年、Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbor、New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press）を参照されたい；Meyerら（２０１０年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、１０７巻：１５０２２〜１５０２６頁およびMeyerら（２０１２年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、１０９巻：９３５４〜９３５９頁も参照されたい。
核酸またはタンパク質を細胞または非ヒト動物に導入するための他の方法としては、例えば、ベクター送達、粒子媒介性送達、エキソソーム媒介性送達、脂質ナノ粒子媒介性送達、細胞透過性ペプチド媒介性送達、または埋込み型デバイス媒介性送達を挙げることができる。特定の例として、核酸またはタンパク質をポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸・ポリグリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート、または脂質微小管などの担体に入れて細胞または非ヒト動物に導入することができる。非ヒト動物への送達の一部の特定例としては、流体力学的送達、ウイルス媒介性送達（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達）、および脂質ナノ粒子媒介性送達が挙げられる。
核酸およびタンパク質の細胞または非ヒト動物への導入は、流体力学的送達（ＨＤＤ）によって実現することができる。流体力学的送達は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞内ＤＮＡ送達のための方法として出現した。実質細胞への遺伝子送達のためには、必須のＤＮＡ配列のみを、選択された血管を介して注射し、現行のウイルスおよび合成ベクターに付随する安全性の懸念を排除する必要がある。血流中に注射されると、ＤＮＡは血液が到達可能な種々の組織中の細胞に到達することが可能である。流体力学的送達では、大きく膜不浸透性の化合物が実質細胞に進入することを妨げる内皮および細胞膜の物理的関門を克服するために大きな体積の溶液を循環中の非圧縮性血液中に急速注射することによって生じる力を使用する。この方法は、ＤＮＡ送達に加えて、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＲＮＡ、タンパク質、および他の小さな化合物の効率的な細胞内送達に有用である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Bonamassaら（２０１１年）Pharm. Res.、２８巻（４号）：６９４〜７０１頁を参照されたい。
ＡＡＶ媒介性送達またはレンチウイルス媒介性送達などのウイルス媒介性送達によって、核酸の導入を達成することもできる。他の例示的なウイルス／ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスが挙げられる。ウイルスは、分裂細胞、非分裂細胞、または分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染し得る。そのようなウイルスを、免疫原性が低下するように操作することもできる。ウイルスは、複製能力を有してもよいか、または複製欠損性であってもよい（例えば、ビリオン複製および／またはパッケージングのさらなるラウンドにとって必要な１つまたは複数の遺伝子の欠損）。ウイルスは、一過的発現、長期的に続く発現（例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、もしくは３ヶ月間）、または永続的発現（例えば、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡの）を引き起こすことができる。例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）は、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、および１０１６ベクターゲノム／ｍＬを含む。
ｓｓＤＮＡ ＡＡＶゲノムは、相補的ＤＮＡ鎖の合成を可能にする２つの反転末端リピートによって挟まれた、２つのオープンリーディングフレーム、ＲｅｐおよびＣａｐからなる。ＡＡＶ導入プラスミドを構築する場合、導入遺伝子は、２個のＩＴＲの間に置かれ、ＲｅｐおよびＣａｐはｉｎ ｔｒａｎｓに供給することができる。ＲｅｐおよびＣａｐに加えて、ＡＡＶは、アデノウイルスに由来する遺伝子を含有するヘルパープラスミドを必要としてもよい。これらの遺伝子（Ｅ４、Ｅ２ａ、およびＶＡ）は、ＡＡＶ複製を媒介した。例えば、導入プラスミド、Ｒｅｐ／Ｃａｐ、およびヘルパープラスミドを、アデノウイルス遺伝子Ｅ１＋を含有するＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトして、感染性ＡＡＶ粒子を産生することができる。あるいは、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、およびアデノウイルスヘルパー遺伝子を、単一のプラスミド中で組み合わせることができる。同様のパッケージング細胞および方法を、レトロウイルスなどの他のウイルスのために使用することができる。
ＡＡＶの複数の血清型が同定されている。これらの血清型は、それらが感染する細胞型（すなわち、その向性）において異なり、特定の細胞型の選択的形質導入を可能にする。ＣＮＳ組織のための血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が挙げられる。心臓組織のための血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が挙げられる。腎臓組織のための血清型としては、ＡＡＶ２が挙げられる。肺組織のための血清型としては、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、およびＡＡＶ９が挙げられる。膵臓組織のための血清型としては、ＡＡＶ８が挙げられる。光受容体細胞のための血清型としては、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が挙げられる。網膜色素上皮組織のための血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が挙げられる。骨格筋組織のための血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が挙げられる。肝臓組織のための血清型としては、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９、特に、ＡＡＶ８が挙げられる。
向性は、異なるウイルス血清型に由来するキャプシドとゲノムとの混合物である、偽型化によってさらに精緻化することができる。例えば、ＡＡＶ２／５は、血清型５に由来するキャプシド中にパッケージングされた血清型２のゲノムを含有するウイルスを示す。偽型化されたウイルスの使用は、形質導入効率を改善する、ならびに向性を変更することができる。異なる血清型から誘導されるハイブリッドキャプシドを使用して、ウイルス向性を変更することもできる。例えば、ＡＡＶ−ＤＪは、８つの血清型に由来するハイブリッドキャプシドを含有し、ｉｎ ｖｉｖｏで広範囲の細胞型にわたって高い感染性を示す。ＡＡＶ−ＤＪ８は、ＡＡＶ−ＤＪの特性を示すが、脳による取込みが増強されている別の例である。ＡＡＶ血清型を、突然変異によって改変することもできる。ＡＡＶ２の突然変異による改変の例としては、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、およびＳ６６２Ｖが挙げられる。ＡＡＶ３の突然変異による改変の例としては、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆ、およびＴ４９２Ｖが挙げられる。ＡＡＶ６の突然変異による改変の例としては、Ｓ６６３ＶおよびＴ４９２Ｖが挙げられる。他の偽型化／改変されたＡＡＶバリアントとしては、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ８．２、およびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧが挙げられる。
導入遺伝子発現を促進するために、自己相補的なＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）バリアントを使用することができる。ＡＡＶは、ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムの相補鎖を合成するための細胞のＤＮＡ複製機構に依存するため、導入遺伝子発現は遅延し得る。この遅延に対処するために、感染時に自発的にアニーリングすることができる相補配列を含有するｓｃＡＡＶを使用して、宿主細胞のＤＮＡ合成に関する要件を除去することができる。しかしながら、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターを使用することもできる。
パッケージング能力を増大させるために、より長い導入遺伝子を、第１は３’スプライスドナーを有し、第２は５’スプライスアクセプターを有する、２つのＡＡＶ導入プラスミドの間に分裂させてもよい。細胞の同時感染の際に、これらのウイルスはコンカテマーを形成し、一緒にスプライシングされ、完全長の導入遺伝子を発現させることができる。これはより長い導入遺伝子発現を可能にするが、発現はあまり効率的ではない。能力を増大させるための同様の方法は、相同組換えを利用する。例えば、導入遺伝子を、２つの導入プラスミド間に分割することができるが、同時発現が相同組換えおよび完全長導入遺伝子の発現を誘導するように実質的な配列が重複する。
核酸およびタンパク質の導入は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介性送達によって達成することもできる。例えば、ＬＮＰ媒介性送達を使用して、Ｃａｓ ｍＲＮＡとガイドＲＮＡとの組合せまたはＣａｓタンパク質とガイドＲＮＡとの組合せを送達することができる。そのような方法による送達は、一過的なＣａｓ発現をもたらし、生分解性脂質は、クリアランスを改善し、許容性を改善し、免疫原性を低下させる。脂質製剤は、その細胞取込みを改善しながら、生体分子を分解から保護することができる。脂質ナノ粒子は、分子間力によって互いに物理的に会合する複数の脂質分子を含む粒子である。これらのものは、ミクロスフェア（単層および多層小胞、例えば、リポソームを含む）、エマルジョン、ミセル中の分散相、または懸濁液中の内部相を含む。そのような脂質ナノ粒子を使用して、送達のための１つまたは複数の核酸またはタンパク質を封入することができる。陽イオン脂質を含有する製剤は、核酸などのポリアニオンを送達するのに有用である。含有させることができる他の脂質は、中性脂質（すなわち、非荷電または両性イオン脂質）、陰イオン脂質、トランスフェクションを増強するヘルパー脂質、およびナノ粒子がｉｎ ｖｉｖｏで存在し得る時間の長さを増加させるステルス脂質である。好適な陽イオン脂質、中性脂質、陰イオン脂質、ヘルパー脂質、およびステルス脂質の例を、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／０１０８４０Ａ１に見出すことができる。例示的な脂質ナノ粒子は、陽イオン脂質および１つまたは複数の他の構成成分を含んでもよい。一例では、他の構成成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質を含んでもよい。別の例では、他の構成成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質およびＤＳＰＣなどの中性脂質を含んでもよい。別の例では、他の構成成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質、ＤＳＰＣなどの任意選択の中性脂質、およびＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３などのステルス脂質を含んでもよい。
ＬＮＰは、下記：（ｉ）封入およびエンドソーム脱出のための脂質；（ｉｉ）安定化のための中性脂質；（ｉｉｉ）安定化のためのヘルパー脂質；ならびに（ｉｖ）ステルス脂質のうちの１つもしくは複数または全部を含有してもよい。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるFinnら（２０１８年）Cell Reports ２２巻：１〜９頁およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。ある特定のＬＮＰでは、カーゴは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含んでもよい。ある特定のＬＮＰでは、カーゴは、外因性ドナー核酸を含んでもよい。ある特定のＬＮＰでは、カーゴは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸およびＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸を含んでもよい。ある特定のＬＮＰでは、カーゴは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および外因性ドナー核酸を含んでもよい。
封入およびエンドソーム脱出のための脂質は、陽イオン脂質であってもよい。脂質は、生分解性イオン化可能脂質などの生分解性脂質であってもよい。好適な脂質の一例は、３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエートである、リピドＡまたはＬＰ０１である。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるFinnら（２０１８年）Cell Reports ２２巻：１〜９頁およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。好適な脂質の別の例は、（（５−（（ジメチルアミノ）メチル）−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン−８，１−ジイル）ビス（デカノエート）とも呼ばれる、（（５−（（ジメチルアミノ）メチル）−１，３−フェニレン）ビス（オキシ）ビス（オクタン−８，１−ジイル）ビス（デカノエート）である、リピドＢである。好適な脂質の別の例は、２−（（４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイル（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）である、リピドＣである。好適な脂質の別の例は、３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−（オクタノイルオキシ）トリデシル３−オクチルウンデカノエートである、リピドＤである。他の好適な脂質としては、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（Ｄｌｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（ＭＣ３）としても公知である）が挙げられる。
本明細書に記載のＬＮＰ中での使用にとって好適な一部のそのような脂質は、ｉｎ ｖｉｖｏで生分解性である。例えば、そのような脂質を含むＬＮＰとしては、少なくとも７５％の脂質が、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から消失するものが挙げられる。別の例として、少なくとも５０％のＬＮＰが、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から消失する。
そのような脂質は、それらが中にある培地のｐＨに応じてイオン化可能であってよい。例えば、わずかに酸性の培地中では、脂質はプロトン化され、かくして、正電荷を担持し得る。逆に、例えば、ｐＨが約７．３５である血液などの、わずかに塩基性の培地中では、脂質はプロトン化されず、かくして、電荷を担持しなくてもよい。一部の実施形態では、脂質は、少なくとも約９、９．５、または１０のｐＨでプロトン化され得る。電荷を担持するそのような脂質の能力は、その固有のｐＫａと関連する。例えば、脂質は、独立に、約５．８〜約６．２の範囲のｐＫａを有してもよい。
中性脂質は、ＬＮＰを安定化し、そのプロセシングを改善するように機能する。好適な中性脂質の例としては、様々な中性非荷電または両性イオン性脂質が挙げられる。本開示における使用にとって好適な中性リン脂質の例としては、限定されるものではないが、５−ヘプタデシルベンゼン−１，３−ジオール（レゾルシノール）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リソホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リソホスファチジルエタノールアミン、およびその組合せが挙げられる。例えば、中性リン脂質を、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）からなる群から選択することができる。
ヘルパー脂質としては、トランスフェクションを増強する脂質が挙げられる。ヘルパー脂質がトランスフェクションを増強するメカニズムは、粒子安定性の増強を含んでもよい。ある特定の場合、ヘルパー脂質は、膜融合性を増強することができる。ヘルパー脂質としては、ステロイド、ステロール、およびアルキルレゾルシノールが挙げられる。好適なヘルパー脂質の例としては、コレステロール、５−ヘプタデシルレゾルシノール、およびコレステロールヘミスクシネートが挙げられる。一例では、ヘルパー脂質は、コレステロールまたはコレステロールヘミスクシネートであってもよい。
ステルス脂質としては、ナノ粒子がｉｎ ｖｉｖｏで存在し得る時間の長さを変更する脂質が挙げられる。ステルス脂質は、例えば、粒子凝集を低減させること、および粒径を制御することによって製剤プロセスを補助することができる。ステルス脂質は、ＬＮＰの薬物動態特性をモジュレートすることができる。好適なステルス脂質としては、脂質部分に親水性頭部基が連結された脂質が挙げられる。
ステルス脂質の親水性頭部基は、例えば、ＰＥＧ（ポリ（エチレンオキシド）と呼ばれることもある）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリアミノ酸、およびポリＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドに基づくポリマーから選択されるポリマー部分を含んでもよい。ＰＥＧという用語は、任意のポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマーを意味する。ある特定のＬＮＰ製剤において、ＰＥＧは、約２，０００ダルトンの平均分子量を有する、ＰＥＧ２０００とも呼ばれる、ＰＥＧ−２Ｋである。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。
ステルス脂質の脂質部分を、例えば、鎖が、例えば、アミドまたはエステルなどの１つまたは複数の官能基を含んでもよい、約Ｃ４〜約Ｃ４０の飽和または不飽和炭素原子を独立に含むアルキル鎖長を有するジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基を含むものなどの、ジアシルグリセロールまたはジアシルグリカミドから誘導することができる。ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基は、１つまたは複数の置換されたアルキル基をさらに含んでもよい。
一例として、ステルス脂質を、ＰＥＧ−ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ−ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ−ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド、およびＰＥＧ−ジステアロイルグリカミド、ＰＥＧ−コレステロール（１−［８’−（コレスタ−５−エン−３［ベータ］−オキシ）カルボキシアミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−［オメガ］−メチル−ポリ（エチレングリコール））、ＰＥＧ−ＤＭＢ（３，４−ジテトラデコキシルベンジル−［オメガ］−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＧ）、ポリ（エチレングリコール）−２０００−ジメタクリレート（ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＡ）、および１，２−ジステアリールオキシプロピル−３−アミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＡ）から選択することができる。１つの特定例では、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧであってよい。
ＬＮＰは、製剤中に異なるそれぞれのモル比の構成成分脂質を含んでもよい。ＣＣＤ脂質のモル％は、例えば、約３０モル％〜約６０モル％、約３５モル％〜約５５モル％、約４０モル％〜約５０モル％、約４２モル％〜約４７モル％、または約４５％であってもよい。ヘルパー脂質のモル％は、例えば、約３０モル％〜約６０モル％、約３５モル％〜約５５モル％、約４０モル％〜約５０モル％、約４１モル％〜約４６モル％、または約４４モル％であってもよい。中性脂質のモル％は、例えば、約１モル％〜約２０モル％、約５モル％〜約１５モル％、約７モル％〜約１２モル％、または約９モル％であってもよい。ステルス脂質のモル％は、例えば、約１モル％〜約１０モル％、約１モル％〜約５モル％、約１モル％〜約３モル％、約２モル％、または約１モル％であってもよい。
ＬＮＰは、封入しようとする核酸の生分解性脂質の正荷電アミノ基（Ｎ）と、負荷電リン酸基（Ｐ）との異なる比を有してもよい。これは、式Ｎ／Ｐによって数学的に表すことができる。例えば、Ｎ／Ｐ比は、約０．５〜約１００、約１〜約５０、約１〜約２５、約１〜約１０、約１〜約７、約３〜約５、約４〜約５、約４、約４．５、または約５であってもよい。
一部のＬＮＰでは、カーゴは、Ｃａｓ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含んでもよい。Ｃａｓ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡは、異なる比であってもよい。例えば、ＬＮＰ製剤は、約２５：１〜約１：２５の範囲、約１０：１〜約１：１０の範囲、約５：１〜約１：５の範囲、または約１：１のＣａｓ ｍＲＮＡのｇＲＮＡ核酸に対する比を含んでもよい。あるいは、ＬＮＰ製剤は、約１：１〜約１：５、または約１０：１のＣａｓ ｍＲＮＡのｇＲＮＡ核酸に対する比を含んでもよい。あるいは、ＬＮＰ製剤は、約１：１０、２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５、１：１０、または１：２５のＣａｓ
ｍＲＮＡのｇＲＮＡ核酸に対する比を含んでもよい。
一部のＬＮＰでは、カーゴは、外因性ドナー核酸およびｇＲＮＡを含んでもよい。外因性ドナー核酸およびｇＲＮＡは、異なる比であってもよい。例えば、ＬＮＰ製剤は、約２５：１〜約１：２５の範囲、約１０：１〜約１：１０の範囲、約５：１〜約１：５の範囲、または約１：１の外因性ドナー核酸のｇＲＮＡ核酸に対する比を含んでもよい。あるいは、ＬＮＰ製剤は、約１：１〜約１：５、約５：１〜約１：１、約１０：１、または約１：１０の外因性ドナー核酸のｇＲＮＡ核酸に対する比を含んでもよい。あるいは、ＬＮＰ製剤は、約１：１０、２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５、１：１０、または１：２５の外因性ドナー核酸のｇＲＮＡ核酸に対する比を含んでもよい。
好適なＬＮＰの特定例は、４．５の窒素のリン酸に対する（Ｎ／Ｐ）比を有し、４５：４４：９：２のモル比で生分解性陽イオン脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧを含有する。生分解性陽イオン脂質は、３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエートであってもよい。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるFinnら（２０１８年）Cell Reports ２２巻：１〜９頁を参照されたい。好適なＬＮＰの別の特定例は、５０：３８．５：１０：１．５のモル比でＤｌｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（ＭＣ３）、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ−ＤＭＧを含有する。
送達様式は、免疫原性を低下させるように選択することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質およびｇＲＮＡを、異なる様式（例えば、二様式送達）によって送達することができる。これらの異なる様式は、対象に送達される分子（例えば、Ｃａｓもしくは核酸をコードする、ｇＲＮＡもしくは核酸をコードする、または外因性ドナー核酸／修復鋳型）に対して異なる薬力学的特性または薬物動態特性を提供することができる。例えば、異なる様式は、異なる組織分布、異なる半減期、または異なる時間的分布をもたらすことができる。一部の送達様式は、この分子のより持続的な発現および存在をもたらすが、他の送達様式は、一過的であり、あまり持続的ではない（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質の送達）。例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質として、より一過的な様式でのＣａｓタンパク質の送達は、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体が唯一存在し、短期間にわたって活性であることを確保することができ、ＭＨＣ分子によって細胞の表面上に示される細菌由来Ｃａｓ酵素に由来するペプチドによって引き起こされる免疫原性を低下させることができる。そのような一過的送達はまた、オフターゲット改変の可能性を低減することもできる。
ｉｎ ｖｉｖｏでの投与は、例えば、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、または筋肉内を含めた任意の適切な経路によるものであってよい。全身性投与様式としては、例えば、経口および非経口経路が挙げられる。非経口経路の例としては、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、皮内、皮下、鼻内、および腹腔内経路が挙げられる。特定例は、静脈内輸注である。点鼻および硝子体内注射は、他の特定例である。局部投与様式としては、例えば、髄腔内、脳室内、実質内（例えば、線条体（例えば、尾状もしくは果核中）、大脳皮質、中心前回、海馬（例えば、歯状回もしくはＣＡ３領域中）、側頭皮質、扁桃体、前頭皮質、視床、小脳、髄質、視床下部、蓋、被蓋、または黒質への局部実質内送達）、眼内、眼窩内、結膜下、硝子体内、網膜下、および経強膜的経路が挙げられる。有意により少量の構成成分（全身的手法と比較して）は、全身的に（例えば、静脈内）投与される場合と比較して、局部的に（例えば、実質内または硝子体内）投与される場合に効果を発揮し得る。局部投与様式はまた、治療有効量の構成成分が全身的に投与される場合に起こり得る潜在的に毒性の副作用の発生を低減するか、または除去することもできる。
ｉｎ ｖｉｖｏでの投与は、例えば、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、または筋肉内を含めた任意の適切な経路によるものであってよい。特定例は、静脈内輸注である。ガイドＲＮＡおよび／もしくはＣａｓタンパク質（またはガイドＲＮＡおよび／もしくはＣａｓタンパク質をコードする核酸）を含む組成物を、１つまたは複数の生理学的および薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または補助剤を使用して製剤化することができる。製剤は、選択される投与経路に依存し得る。「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤、賦形剤、または助剤が製剤の他の成分に適合し、そのレシピエントに対して実質的に有害でないことを意味する。
投与の頻度および投与回数は、他の因子の中でも、外因性ドナー核酸、ガイドＲＮＡ、またはＣａｓタンパク質（またはガイドＲＮＡもしくはＣａｓタンパク質をコードする核酸）の半減期および投与経路に依存し得る。核酸またはタンパク質の細胞または非ヒト動物への導入は、１回またはある期間にわたって多数回実施することができる。例えば、ある期間にわたって少なくとも２回、ある期間にわたって少なくとも３回、ある期間にわたって少なくとも４回、ある期間にわたって少なくとも５回、ある期間にわたって少なくとも６回、ある期間にわたって少なくとも７回、ある期間にわたって少なくとも８回、ある期間にわたって少なくとも９回、ある期間にわたって少なくとも１０回、少なくとも１１回、ある期間にわたって少なくとも１２回、ある期間にわたって少なくとも１３回、ある期間にわたって少なくとも１４回、ある期間にわたって少なくとも１５回、ある期間にわたって少なくとも１６回、ある期間にわたって少なくとも１７回、ある期間にわたって少なくとも１８回、ある期間にわたって少なくとも１９回、またはある期間にわたって少なくとも２０回、導入を実施することができる。
Ｆ．ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性の測定
本明細書に開示される方法は、ＣＲＩＳＰＲリポーターによってコードされる１つまたは複数のリポータータンパク質の発現または活性を検出または測定するステップをさらに含んでもよい。発現または活性を検出または測定するための方法は、リポータータンパク質に依存すると予想される。
例えば、蛍光リポータータンパク質について、検出または測定は、非ヒト動物から単離された細胞の分光測光もしくはフローサイトメトリーアッセイもしくは蛍光顕微鏡観察または非ヒト動物自体の接写アッセイもしくはｉｎ ｖｉｖｏイメージングを含んでもよい。
ルシフェラーゼリポータータンパク質については、アッセイは、全てのタンパク質（ルシフェラーゼを含む）を放出させるために非ヒト動物から単離された細胞を壊して開けること、ルシフェリン（蛍ルシフェラーゼについて）またはコエレンテラジン（ウミシイタケルシフェラーゼについて）および全ての必要なコファクターを添加すること、ならびにルミノメーターを使用して酵素活性を測定することを含むルシフェラーゼリポーターアッセイを含んでもよい。ルシフェリンは、ルシフェラーゼ酵素によってオキシルシフェリンに変換される。この反応によって放出される一部のエネルギーは、光の形態にある。あるいは、非ヒト動物の生物発光イメージングを、非ヒト動物へのルシフェラーゼ基質（例えば、ルシフェリンまたはコエレンテラジン）の注射後に実施することができる。そのようなアッセイは、高感度の生きている動物の非侵襲的な光学イメージングを可能にする。
ベータ−ガラクトシダーゼリポータータンパク質については、アッセイは、非ヒト動物から単離された細胞または組織の組織化学的染色を含んでもよい。ベータ−ガラクトシダーゼは、Ｘ−Ｇａｌの加水分解を触媒し、顕微鏡下で容易に可視化することができる青色の沈降物を産生し、それによって、細胞または組織内でのＬａｃＺ発現の視覚的検出のための単純かつ好都合の方法を提供する。
他のリポータータンパク質およびそのようなリポータータンパク質の発現または活性を検出または測定するためのアッセイは、周知である。
あるいは、本明細書に開示される方法は、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーター配列が切り出された改変ＣＲＩＳＰＲリポーターを有する細胞を同定するステップまたは１つのリポータータンパク質のコード配列が変更され、異なるリポータータンパク質のコード配列に変換された改変ＣＲＩＳＰＲリポーターを有する細胞を同定するステップをさらに含んでもよい。種々の方法を使用して、標的化遺伝子改変を有する細胞を同定することができる。スクリーニングは、親染色体の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイを含み得る。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの定量的ＰＣＲによって行うことができる。リアルタイムＰＣＲでは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセットおよび非標的化参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅した配列を認識する蛍光プローブを含み得る。適切な定量的アッセイの他の例としては、蛍光媒介性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化されたプローブ（単数または複数単数または複数）への定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブ、またはＥＣＬＩＰＳＥ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００５／０１４４６５５を参照されたい）。
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）をスクリーニングに使用することもできる。次世代シーケンシングは、「ＮＧＳ」または「大規模並列処理配列決定」または「ハイスループットな配列決定」とも称され得る。ＭＯＡアッセイに加えてスクリーニング手段としてＮＧＳを使用して、標的化遺伝子改変の正確な性質およびそれが細胞型または組織型または臓器型にわたって一貫しているかどうかを定義することができる。
非ヒト動物における標的ゲノム遺伝子座の改変の評価は、任意の組織または臓器に由来する任意の細胞型におけるものであってもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲリポーターによってコードされる１つまたは複数のリポータータンパク質の発現または活性の検出または測定を、同じ組織もしくは臓器に由来する複数の細胞型において、または組織もしくは臓器内の複数の位置に由来する細胞において評価することができる。これは、標的組織または臓器内の細胞型が改変されているか、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓが組織もしくは臓器のどの部分に到達し、それらが改変されているかに関する情報を提供することができる。別の例として、ＣＲＩＳＰＲリポーターによってコードされる１つまたは複数のリポータータンパク質の発現または活性の検出または測定を、複数の組織型または複数の臓器において評価することができる。特定の組織または臓器が標的化される方法では、これは、どれぐらい効率的に組織または臓器が標的化されるか、および他の組織または臓器においてオフターゲット効果があるかどうかに関する情報を提供することができる。
一例として、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲリポーターは、ｌａｃＺ遺伝子と、蛍光リポータータンパク質をコードする遺伝子との両方を含むＣＲＩＳＰＲリポーターであってよく、これを使用して、ＮＨＥＪと相同組換え修復（ＨＤＲ）との両方を検出することができる。例えば、初代肝細胞を、ＣＲＩＳＰＲリポーターを含む非ヒト動物から収穫して、この細胞型においてＮＨＥＪおよびＨＤＲを誘導するための戦略を評価することができる。Ｃａｓ９を、例えば、ＡＡＶ、ｍＲＮＡ、またはタンパク質として導入し、ｇＲＮＡを、単一ガイドＲＮＡ（改変および非改変）またはモジュラー（二本鎖）ＲＮＡとして導入することができる。ＤＮＡ修復鋳型を、対称性もしくは非対称性一本鎖、対称性もしくは非対称性二本鎖、またはＡＡＶベクターとして導入することができる。特定例として、ｌａｃＺ染色を完了させて、ＮＨＥＪの成功を評価した後、蛍光顕微鏡観察およびＦＡＣＳ分析を使用してＨＤＲ効率を評価することができる。次いで、収集した情報を、成体非ヒト動物（例えば、マウス）に適用することができる。Ｃａｓ９、ガイドＲＮＡ、および修復鋳型を、上記に列挙された状態のいずれかにおいて導入することができる。
ＩＶ．ＣＲＩＳＰＲリポーターを含む非ヒト動物を作製する方法
本明細書の他の箇所に記載のＣＲＩＳＰＲリポーターを含む非ヒト動物を作製するための様々な方法が提供される。遺伝子改変生物を産生するための任意の都合のよい方法またはプロトコールが、そのような遺伝子改変非ヒト動物を作製するのに好適である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるChoら（２００９年）Current Protocols in Cell Biology４２巻：１９．１１：１９．１１．１〜１９．１１．２２頁およびGama Sosaら（２０１０年）Brain Struct. Funct. ２１４巻（２〜３号）：９１〜１０９頁を参照されたい。そのような遺伝子改変非ヒト動物を、例えば、標的遺伝子座（例えば、Ｒｏｓａ２６などのセーフハーバー遺伝子座）での遺伝子ノックインによって、または無作為に組み込まれる導入遺伝子の使用によって生成することができる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０９３６２２およびＷＯ２０１３／１７６７７２を参照されたい。ある構築物をＲｏｓａ２６遺伝子座に標的にする方法は、例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１２／００１７２９０、ＵＳ２０１１／０２６５１９８、およびＵＳ２０１３／０２３６９４６に記載されている。
例えば、本明細書の他の箇所に開示されるＣＲＩＳＰＲリポーターを含む非ヒト動物を作製する方法は、（１）ＣＲＩＳＰＲリポーターを含むように多能性細胞のゲノムを改変するステップ；（２）ＣＲＩＳＰＲリポーターを含む遺伝子改変された多能性細胞を同定または選択するステップ；（３）遺伝子改変された多能性細胞を、非ヒト動物宿主胚に導入するステップ；および（４）宿主胚を代理母に埋め込み、懐胎させるステップを含んでもよい。必要に応じて、改変された多能性細胞（例えば、非ヒトＥＳ細胞）を含む宿主胚を、胚盤胞期までインキュベートした後、代理母に埋め込み、懐胎させて、Ｆ０非ヒト動物を作製することができる。次いで、代理母は、ＣＲＩＳＰＲリポーターを含むＦ０世代の非ヒト動物を産むことができる。
この方法は、改変された標的ゲノム遺伝子座を有する細胞または動物を同定するステップをさらに含んでもよい。種々の方法を使用して、標的化遺伝子改変を有する細胞および動物を同定することができる。
スクリーニングステップは、例えば、親染色体の対立遺伝子（ＭＯＡ）の改変を評価するための定量的アッセイを含んでもよい。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの定量的ＰＣＲによって行うことができる。リアルタイムＰＣＲでは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセットおよび非標的化参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅した配列を認識する蛍光プローブを含んでもよい。
好適な定量的アッセイの他の例としては、蛍光媒介性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化されたプローブ（単数または複数単数または複数）への定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブ、またはＥＣＬＩＰＳＥ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００５／０１４４６５５を参照されたい）。
好適な多能性細胞の例は、胚性幹（ＥＳ）細胞（例えば、マウスＥＳ細胞またはラットＥＳ細胞）である。改変された多能性細胞を、例えば、（ａ）５’および３’標的部位に対応する５’および３’相同アームによって挟まれた挿入核酸であって、ＣＲＩＳＰＲリポーターを含む、挿入核酸を含む１つまたは複数の標的化ベクターを細胞中に導入すること；ならびに（ｂ）標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた挿入核酸をそのゲノム中に含む少なくとも１つの細胞を同定することによって生成することができる。あるいは、改変された多能性細胞を、（ａ）細胞中に、（ｉ）標的ゲノム遺伝子座内の標的配列にニックまたは二本鎖切断を誘導するヌクレアーゼ作用剤；ならびに（ｉｉ）標的配列の十分近くに位置する５’および３’標的部位に対応する５’および３’相同アームによって挟まれた挿入核酸であって、ＣＲＩＳＰＲリポーターを含む挿入核酸を含む１つまたは複数の標的化ベクターを導入すること；ならびに（ｃ）標的ゲノム遺伝子座に改変（例えば、挿入核酸の組込み）を含む少なくとも１個の細胞を同定することによって生成することができる。ニックまたは二本鎖切断を所望の標的配列に誘導する任意のヌクレアーゼ作用剤を使用することができる。好適なヌクレアーゼの例としては、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、およびクラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系またはそのような系の構成成分（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）が挙げられる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１３／０３０９６７０およびＵＳ２０１５／０１５９１７５を参照されたい。
ドナー細胞を、胚盤胞期または桑実胚前期（すなわち、４細胞期もしくは８細胞期）などの、任意の段階で宿主胚に導入することができる。生殖細胞系列を介して遺伝子改変を伝達することができる子孫が生成される。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２９４，７５４号を参照されたい。
あるいは、本明細書の他の箇所に記載の非ヒト動物を作製する方法は、（１）多能性細胞を改変するための上記の方法を使用してＣＲＩＳＰＲリポーターを含むように１細胞期胚のゲノムを改変すること；（２）遺伝子改変された胚を選択すること；および（３）遺伝子改変された胚を、代理母に埋め込み、懐胎させることを含んでもよい。生殖細胞系列を介して遺伝子改変を伝達することができる子孫が生成される。
核移植技術を使用して、非ヒト哺乳動物を生成することもできる。簡単に述べると、核移植のための方法は、（１）卵母細胞を除核するか、または除核された卵母細胞を提供するステップ；（２）除核された卵母細胞と混合しようとするドナー細胞または核を単離または提供するステップ；（３）この細胞または核を、除核された卵母細胞に挿入して、再構成された細胞を形成させるステップ；（４）再構成された細胞を、動物の子宮に埋め込んで、胚を形成させるステップ；および（５）胚を発生させるステップを含んでもよい。そのような方法では、卵母細胞は、一般には死んだ動物から回収されるが、それらを生きている動物の卵管および／または卵巣から単離することもできる。卵母細胞を、除核前に様々な周知の媒体中で成熟させることができる。卵母細胞の除核を、いくつかの周知の様式で実施することができる。再構成された細胞を形成するための除核された卵母細胞へのドナー細胞または核の挿入は、融合前の透明帯下でのドナー細胞の微量注射によるものであってもよい。接触／融合平面をわたるＤＣ電気パルスの適用（電気融合）によって、ポリエチレングリコールなどの融合促進化学物質への細胞の曝露によって、またはセンダイウイルスなどの不活化ウイルスを用いて、融合を誘導することができる。核ドナーとレシピエント卵母細胞との融合の前、間、および／または後の電気的および／または非電気的手段によって、再構成された細胞を活性化することができる。活性化法としては、電気パルス、化学誘導性ショック、精子による貫通、卵母細胞中の二価陽イオンレベルの増大、および卵母細胞中の細胞タンパク質のリン酸化の低減（キナーゼ阻害剤を手段とする）が挙げられる。活性化された再構成された細胞、または胚を、周知の培地中で培養した後、動物の子宮に移すことができる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００８／００９２２４９、ＷＯ１９９９／００５２６６、ＵＳ２００４／０１７７３９０、ＷＯ２００８／０１７２３４、および米国特許第７，６１２，２５０号を参照されたい。
本明細書に提供される様々な方法は、遺伝子改変されたＦ０動物の細胞がＣＲＩＳＰＲリポーターを含む、遺伝子改変された非ヒトＦ０動物の生成を可能にする。Ｆ０動物を生成するために使用される方法に応じて、ＣＲＩＳＰＲリポーターを有するＦ０動物内の細胞数は変化することが認識される。例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法による、対応する生物に由来する桑実胚前期胚（例えば、８細胞期マウス胚）へのドナーＥＳ細胞の導入により、Ｆ０動物のより高いパーセンテージの細胞集団が標的化遺伝子改変を含む目的のヌクレオチド配列を含む細胞を含むようになる。例えば、非ヒトＦ０動物の少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、８６％、８７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の細胞寄与が、標的化改変を有する細胞集団を含んでもよい。
遺伝子改変されたＦ０動物の細胞は、ＣＲＩＳＰＲリポーターについてヘテロ接合性であってよく、またはＣＲＩＳＰＲリポーターについてホモ接合性であってもよい。
上文または下で引用されている全ての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、受託番号などは、各項目が参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されるのと同じ程度に、あらゆる目的に関してその全体が参照により組み込まれる。違う時間に受託番号に異なるバージョンの配列が関連付けられている場合、本出願の有効な出願日において受託番号に関連付けられるバージョンを意味する。有効な出願日とは、該当する場合、受託番号に関して実際の出願日または優先出願の出願日の早い方を意味する。同様に、異なるバージョンの刊行物、ウェブサイトなどが違う時間に公開されている場合、別段の指定のない限り本出願の有効な出願日時点で直近に公開されたバージョンを意味する。特に他の指示がなければ、本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様を任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明を明瞭さおよび理解のために図表および例によって少し詳細に記載してきたが、ある特定の変化および改変を添付の特許請求の範囲内で実施することができることが明らかになろう。
配列の簡単な説明
添付の配列表に列挙されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、およびアミノ酸については３文字コードを使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端から始まり、フォワード方向に（すなわち、各線の左から右に）３’末端まで進む標準の慣習に従う。各ヌクレオチド配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖へのいかなる言及にも相補鎖が含まれると理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重バリアントも提供されることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まり、フォワード方向に（すなわち、各線の左から右に）カルボキシ末端まで進む標準の慣習に従う。
（実施例１）
ＣＲＩＳＰＲリポーターの検証
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術は、有望で新しい治療モダリティである。ｉｎ ｖｉｖｏでの導入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９剤による突然変異生成または標的遺伝子改変の効率の評価は、現在、一本鎖ＤＮａｓｅ感受性アッセイ、デジタルＰＣＲ、または次世代シーケンシングなどの様々な分子アッセイに依拠している。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、そのＲＮＡガイドの結合部位でのＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ）を触媒する。ＲＮＡガイドは、８７ヌクレオチドのトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と結合する４２ヌクレオチドのＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）からなってもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡと相補的であり、それと塩基対を形成して、機能的なｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡガイドを形成する。この二本鎖ＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質に結合して、特定の種配列についてゲノムに問い合わせることができる活性なリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成するようになる。鎖切断のための第２の要件は、Ｃａｓ９タンパク質が３’ＣＲＩＳＰＲ標的配列と直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識しなければならないということである。あるいは、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖を単一キメラＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と置き換えることによって、活性なＲＮＰ複合体を形成させることもできる。プロセシングされたｔｒａｃｒＲＮＡ配列に直接的に２０ヌクレオチドの種配列を融合することによって、このｓｇＲＮＡを形成させることができる。ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖が行うのと同じ方法で、また、類似する効率でＣａｓ９タンパク質とＤＮＡの両方と相互作用することができる。この細菌自然防御メカニズムは、哺乳動物細胞中で効率的に機能し、切断誘導性内因性修復経路を活性化することが示されている。二本鎖切断がゲノム中で起こる場合、修復経路は、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路または適切な鋳型が利用可能である場合、相同組換え修復（ＨＤＲ）によってＤＮＡを修正することを試みると予想される。本発明者らは、これらの経路を活用して、哺乳動物細胞におけるゲノム領域の部位特異的欠失またはＨＤＲを容易にすることができる。
生きている動物の組織および臓器へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の送達およびそこでの活性に関するより良好なアッセイを提供するために、Ｃａｓ９媒介性一本鎖または二本鎖切断事象後にｅＢＦＰをｅＧＦＰに（またはｅＧＦＰをｅＢＦＰに）変換するドナー配列を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導性非相同末端結合（ＮＨＥＪ）（例えば、Ｃａｓ９媒介性切断事象の一対によって引き起こされるＣａｓ９媒介性切り出し）および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導性相同組換え修復（ＨＤＲ）を報告する能力を有する遺伝的対立遺伝子を担持するマウスを開発した。本実施例で記載されるＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子は、マウスＧｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒ（Ｒｏｓａ２６）遺伝子座の改変に基づくものである。Ｒｏｓａ２６遺伝子座は、未知の機能の長い非コードＲＮＡの強力かつ遍在的な発現を示す。Ｒｏｓａ２６のホモ接合性欠失を有するマウスは、生存能力があり、健康で、繁殖力がある。本明細書に記載の第１のＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子の第１の一般的特性は、ポリアデニル化シグナルのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導性切り出しが、Ｒｏｓａ２６プロモーターから発現されるリポータータンパク質の発現を活性化し、次いで、酵素活性によって、または蛍光（または免疫アッセイもしくは他の手段）によってリポータータンパク質を検出することができるということである。本明細書に記載の第１のＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子の第２の一般的特性（および本明細書に記載の第２のＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子の特性）は、第１の蛍光リポータータンパク質をコードする遺伝子のドナー配列とのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導性組換えが、Ｒｏｓａ２６プロモーターから発現される第１の蛍光リポータータンパク質を、後に蛍光によって検出することができる異なる第２の蛍光リポータータンパク質に変換すると予想されるということである。本実施例に記載のＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子は、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに標的化されたものであり（図２を参照されたい）、Ｒｏｓａ２６遺伝子座の強力な普遍的発現およびＲｏｓａ２６遺伝子座を標的にする容易性を利用するものである。
第１のＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子（すなわち、ＬＳＬ−ＬａｃＺ：ｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子）は、図１Ａおよび配列番号１７に描かれる。それは、高解像度組織学的リポーターとしてｌａｃＺを、ならびに肝臓または他の標的臓器におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ＮＨＥＪ作用（例えば、標的配列の切り出し）の程度および位置の蛍光リポーターとしてｅＢＦＰ（またはあるいは、ｅＧＦＰ）を使用し、肝臓または他の標的臓器におけるドナー核酸との組換え後の送達されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導性ＨＤＲの程度および位置の蛍光リポーターとしてｅＧＦＰ（またはあるいは、ｅＢＦＰ）を使用する。さらに、ただ１つの臓器を標的にする場合、ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子を使用して、他の臓器および組織におけるオフターゲット効果を評価することもできる。したがって、ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９送達法を試験し、最適化することができる。第１のＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子の構成成分を、５’から３’に向かって、表３および配列番号１７に示す。第１のＰｇｋポリアデニル化シグナルを除去するためのＣｒｅリコンビナーゼによる処理後の第１のＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子の配列は、配列番号５８に記載される。ｅＢＦＰからｅＧＦＰへの変換後（例えば、以下により詳細に記載されるｓｓＯＤＮによる処理後）のＣｒｅ処理されたリポーター対立遺伝子の配列は、配列番号５９に記載される。
第１のＰｇｋポリアデニル化シグナルを挟む代わりのガイドＲＮＡ標的配列を使用することもできる。第１のＣＲＩＳＰＲリポーター中の異なるガイドＲＮＡ標的配列、第１のＣＲＩＳＰＲリポーター中のそれらのヌクレオチド位置、およびこれらのガイドＲＮＡ標的配列を標的とする対応するガイドＲＮＡ内のガイド配列をまとめる表を、表４に提供する。表４はまた、第１および第２のｌｏｘＰ部位の位置、第１のＰｇｋポリアデニル化シグナル、ならびに参照のためのｅＢＦＰコード配列も提供する。
第１のＰｇｋポリアデニル化シグナルは通常、ｌａｃＺ遺伝子からのベータ−ガラクトシダーゼタンパク質およびｅＢＦＰタンパク質の発現を遮断する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる第１のＰｇｋポリアデニル化シグナルを挟むガイドＲＮＡ標的配列（それぞれについて、配列番号４１、または第１のガイドＲＮＡ標的配列については配列番号４１、４３、４４、または４５および第２のガイドＲＮＡ標的配列については配列番号４１、４６、または４７）の切断後の第１のＰｇｋポリアデニル化シグナルの切り出しの際に、ｌａｃＺ遺伝子およびｅＢＦＰコード配列は通常発現されると予想される。次いで、ベータ−ガラクトシダーゼタンパク質およびｅＢＦＰタンパク質が発現され、これを使用して、ＮＨＥＪによるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導性切り出しによって改変された細胞を定量することができる。
Ｃａｓ９ヌクレアーゼによるｅＢＦＰコード配列内のガイドＲＮＡ標的配列（配列番号４２）の認識および切断ならびにドナー配列を用いた修復の誘導の際に、ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子中のｅＢＦＰコード配列を、相同組換え修復によって修復して、それを、ｅＧＦＰコード配列に変換することができる。次いで、ｅＧＦＰタンパク質が発現され、これを使用して、ＨＤＲによりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９とドナー配列との組合せによって改変された細胞を定量することができる。ｅＢＦＰコード配列を標的にするために使用されるガイドＲＮＡのガイド配列は、配列番号１４に記載の配列を含み、ｅＢＦＰコード配列を修復し、それをｅＧＦＰコード配列に変換するために使用することができるドナー核酸は、配列番号１５または配列番号１６に記載される。
第２のＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子（すなわち、ＬＳＬ−ｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子）は、図３および配列番号１８に描かれ、これを使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導性ＨＤＲを直接評価することができる。それは、肝臓または他の標的臓器におけるドナー核酸との組換え後のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導性ＨＤＲの程度および位置の蛍光リポーターとして、ｅＧＦＰ（またはあるいは、ｅＢＦＰ）を使用する。さらに、ただ１つの臓器を標的にする場合、ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子を使用して、他の臓器および組織におけるオフターゲット効果を評価することもできる。したがって、ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９送達法を試験し、最適化することができる。第２のＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子の構成成分を、５’から３’に向かって、表５および配列番号１８に示す。選択カセットを除去するためのＣｒｅリコンビナーゼによる処理後の第２のＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子の配列は、配列番号５７に記載される。ｅＢＦＰからｅＧＦＰへの変換後（例えば、以下により詳細に記載されるｓｓＯＤＮによる処理後）のＣｒｅ処理されたリポーター対立遺伝子の配列は、配列番号６０に記載される。
３重のポリアデニル化シグナルは、ｅＢＦＰタンパク質の発現を遮断する。Ｃｒｅリコンビナーゼによるポリアデニル化シグナルの切り出しの際に、ｅＢＦＰコード配列が発現される。Ｃａｓ９ヌクレアーゼによるｅＢＦＰコード配列内のガイドＲＮＡ標的配列（配列番号４２）の認識および切断ならびにドナー配列を用いた修復の誘導の際に、ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子中のｅＢＦＰコード配列を、相同組換え修復によって修復して、それをｅＧＦＰコード配列に変換することができる。次いで、ｅＧＦＰタンパク質が発現され、これを使用して、ＨＤＲによりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９とドナー配列との組合せによって改変された細胞を定量することができる。ｅＢＦＰコード配列を標的にするために使用されるガイドＲＮＡのガイド配列は、配列番号１４に記載の配列を含み、ｅＢＦＰコード配列を修復し、それをｅＧＦＰコード配列に変換するために使用することができるドナー核酸は、配列番号１５または配列番号１６に記載される。
ＬａｃＺは、ベータ−ガラクトシダーゼタンパク質をコードするＥ．ｃｏｌｉ中に天然に存在する遺伝子である。このタンパク質は、ラクトース中の２個の炭素環の間の結合を切断することによってラクトースの分解を担い、グルコースとガラクトースとを産生する。元々、Ｅ．ｃｏｌｉで使用されるｌａｃＺは、組織化学的リポーターとして使用することができるため、研究における重要な遺伝子である。ラクトース類似体であるＸ−Ｇａｌの存在下では、ベータ−ガラクトシダーゼは基質を加水分解して、顕微鏡下で容易に可視化される青色を産生すると予想される。
強化型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）は、青色から紫外線領域の光に曝露された場合に緑色の蛍光を発するタンパク質である。ｅＧＦＰは、クラゲであるＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａから元々単離されたＧＦＰから誘導された。蛍光および光安定性を増大させ、ならびに哺乳動物細胞における使用のために３７℃での適切なフォールディングを可能にする突然変異が操作された。主要な励起ピークは、４８８ナノメートル（ｎｍ）であり、ピーク発光は５０９ｎｍである。単一の突然変異Ｙ６６Ｈは、ｅＧＦＰを強化型青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）に変換し、その主要な励起ピークは３８０ｎｍにシフトし、ピーク発光は４４８ｎｍとなる。本発明者らは、先行するフロキシングされたポリ（Ａ）配列および適切なスプライシングシグナルを用いて、マウスＲｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロン中でのｌａｃＺおよびＰ２Ａに連結されたｅＢＦＰの発現を操作した。ポリ（Ａ）領域は転写を遮断するため、ポリ（Ａ）をフロキシングによって除去する前は、ｌａｃＺおよびｅＢＦＰコード配列は発現されない。ポリ（Ａ）をフロキシングによって除去する際に、ベータ−ガラクトシダーゼおよびｅＢＦＰタンパク質はＲｏｓａ２６プロモーターによって構成的に発現される。あるいは、ポリ（Ａ）を、Ｃａｓ９系を使用して除去して、配列を挟む２個のｓｇＲＮＡ部位を組み込むことによってその領域を欠失させることができる。フロキシングされる前および後の標的細胞は、Ｒｏｓａ２６での標的化ベクターの単一の、部位特異的な組込みを検出するためのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって最初に検証される。
図１Ａに描かれるＬｏｘ−Ｓｔｏｐ−Ｌｏｘ（ＬＳＬ）ＬａｃＺ−２Ａ−ｅＢＦＰ対立遺伝子（またはあるいは、ＬＳＬ ＬａｃＺ−２Ａ−ｅＧＦＰ対立遺伝子）は、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）ならびに成体マウス組織における有効なＮＨＥＪおよびＨＤＲリポーターであり得る。この対立遺伝子をＲｏｓａ２６中に組み込むことによって、ｌａｃＺまたはｅＢＦＰは通常、細胞および組織中で発現されない。Ｃａｓ９タンパク質と共にポリ（Ａ）を脱落させるためのｓｇＲＮＡの導入は、ｌａｃＺおよびｅＢＦＰ発現を作動させることができる。修復鋳型が提供されない場合、この欠失はＮＨＥＪ経路を使用して起こり得る。このように、この対立遺伝子を使用して、いつ、どこで、ＮＨＥＪが成体マウス内で起こったかを示すことができる。さらに、次いで、ガイドＲＮＡを導入して、ｅＢＦＰ、およびｅＢＦＰをｅＧＦＰに変換するＨ６６Ｙ突然変異を含有する修復ドナー（またはあるいは、ＬＳＬ ＬａｃＺ−２Ａ−ｅＧＦＰ対立遺伝子については、ｅＧＦＰをｅＢＦＰに変換するＹ６６Ｈ突然変異を含有する修復ドナー）中で二本鎖切断を誘導することができる。
Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系またはＣａｓ９誘導性ＮＨＥＪによってポリ（Ａ）領域を欠失させることにより、図１Ａに示されるＣＲＩＳＰＲ対立遺伝子を用いて標的化されたｍＥＳＣ中でＬａｃＺを作動させることができる。ＬＳＬ−ＬａｃＺ：ｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子中のポリ（Ａ）領域を欠失させるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の能力を試験するために、リポーター対立遺伝子を含む胚性幹細胞に、Ｃａｓ９と、ポリ（Ａ）領域の上流および下流を標的とするように設計された様々なガイドＲＮＡとのリボ核タンパク質複合体をエレクトロポレーションした。細胞を、６ウェルプレート上に播種し（３ｘ１０５細胞）、エレクトロポレーションの３日後、２時間にわたってＬａｃＺについて染色した。その結果を、図４Ａ〜図４Ｅに示す。この図面は、未処理の細胞（図４Ａ）、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするプラスミドをエレクトロポレーションした細胞（図４Ｂ）、およびｌａｃＺ遺伝子の上流のＰｇｋポリアデニル化シグナルを挟むガイドＲＮＡ標的配列を標的とする合成ｓｇＲＮＡと一緒に複合体化されたＣａｓ９タンパク質を含むリボ核タンパク質複合体をエレクトロポレーションした細胞（図４Ｃ〜図４Ｅ）を示す。図４Ａと比較した図４Ｂに示されるように、Ｃｒｅリコンビナーゼプラスミドによる処理は、ｌａｃＺの発現を活性化した。同様に、図４Ａと比較した図４Ｃ〜図４Ｅに示されるように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による処理は、ｌａｃＺの発現を活性化し、上流のポリアデニル化シグナルが切り出されたことを確認できる。図４Ｃにおける細胞を、Ｐｇｋポリ（Ａ）切り出しガイドＲＮＡ標的配列ｖ３およびｖ６（それぞれ、配列番号４４および配列番号４７）を標的とするｇＵ３およびｇＤ１ ｓｇＲＮＡを用いて標的化した。これらのガイドＲＮＡは、それぞれ、配列番号２２および配列番号２８に記載の配列を含んでいた。図４Ｄにおける細胞を、Ｐｇｋポリ（Ａ）切り出しガイドＲＮＡ標的配列ｖ３およびｖ５（それぞれ、配列番号４４および配列番号４６）を標的とするｇＵ３およびｇＤ２ ｓｇＲＮＡを用いて標的化した。これらのガイドＲＮＡは、それぞれ、配列番号２２および配列番号２６に記載の配列を含んでいた。図４Ｅにおける細胞を、Ｐｇｋポリ（Ａ）切り出しガイドＲＮＡ標的配列ｖ２およびｖ６（それぞれ、配列番号４３および配列番号４７）を標的とするｇＵ２およびｇＤ１ ｓｇＲＮＡを用いて標的化した。これらのガイドＲＮＡは、それぞれ、配列番号２０および配列番号２８に記載の配列を含んでいた。同様の結果が、ｇＵ１およびｇＤ１ ｓｇＲＮＡの組合せ、ｇＵ１およびｇＤ２ ｓｇＲＮＡの組合せ、ならびにｇＵ２およびｇＤ２ ｓｇＲＮＡの組合せについて観察された（データは示さない）。
Ｐｇｋポリアデニル化シグナル内を標的とするガイドＲＮＡの他の３つの組合せ（図１Ｂを参照されたい）：ｃＧＭ４＋ｃＧＭ５、ｃＧＭ４＋ｃＧＭ、およびｃＧＭ４＋ｃＧＭ３で処理することによって、ＬＳＬ−ＬａｃＺ：ｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子を含むマウスＥＳ細胞中で同様の実験を行った。ｃＧＭ、ｃＧＭ３、ｃＧＭ４、およびｃＧＭ５のガイドＲＮＡ標的配列は、それぞれ、配列番号４９、５０、５１、および５２に記載され、ガイドＲＮＡガイド配列は、それぞれ、配列番号３０、３１、３５、および３６に記載される。その結果を、図５に示す。Ｃｒｅを陽性対照として使用し、Ｃａｓ９のみ、またはＣａｓ９＋非カットガイドＲＮＡ（９１７２）を陰性対照として使用した。Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡの３つの組合せのそれぞれによる処理は、ｌａｃＺの発現を活性化し、上流のポリアデニル化シグナルが切り出されたことを確認できる。同様に、ポリアデニル化シグナルの上流と下流の両方に標的配列を有するガイドＲＮＡ＃１６を用いて、同様の実験を行った。ｇＲＮＡ＃１６のガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号４１に記載され、ガイドＲＮＡのガイド配列は、配列番号２に記載される。図６に示されるように、Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡ＃１６による処理は、ｌａｃＺの発現を活性化し、上流のポリアデニル化シグナルが切り出されたことを確認できる。
成体マウスにおけるＮＨＥＪリードアウトとしてのｌａｃＺの有効性を決定するために、図１Ａに示されるＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子を用いて標的化されたｍＥＳＣを、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法を使用して、８細胞のマウス胚に微量注射した。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５７６，２５９号；第７，６５９，４４２号；第７，２９４，７５４号；ＵＳ２００８／００７８００；およびPoueymirou et al. (2007) Nature Biotech. 25(1): 91-99を参照されたい。具体的には、透明帯に小さい孔を創出して、標的化されたｍＥＳＣの注射を容易にした。これらの注射された８細胞胚を、代理母に移して、導入遺伝子を担持する生きた子を産生した。代理母での懐胎の際に、注射された胚は、検出可能な宿主胚の寄与を担持しないＦ０マウスを産生した。完全にＥＳ細胞に由来するマウスは、正常で、健康で、繁殖力があった（生殖細胞系列伝達を有する）。この対立遺伝子を使用して、Ｃａｓ９系のオフターゲット編集能力を評価することができる。Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の尾静脈注射によってマウスに導入する場合、それらは肝臓を編集することができる。他の組織における編集の評価も、これらの送達方法を使用して行うことができる。注射後、様々なマウス組織を収穫し、ｌａｃＺ染色を完了する。導入されたＣａｓ９およびｓｇＲＮＡによって編集される全ての組織は、ｌａｃＺを発現し、かくして、予想外の組織がＣａｓ９編集によって影響されるかどうかの決定が可能となる。この系を使用して、さらなる送達方法ならびに様々なＡＡＶ血清型の編集能力を評価することができる。
Ｒｏｓａ２６遺伝子座に組み込まれたＬＳＬ−ＬａｃＺ：ｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子を含むマウスに、以下の群：（１）ポリＡ除去ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ＃１６）＋Ｃａｓ９脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）（４匹のマウス）；（２）ｇＵ２ガイドＲＮＡ＋ｇＤ１ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ９ ＬＮＰ（４匹のマウス）；（３）非カットガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ９ ＬＮＰ（２匹のマウス）；および（４）ＣｒｅリコンビナーゼＬＮＰ（１匹のマウス）を投与した。動物に、尾静脈注射によって、２００μＬのトリス食塩水スクロース緩衝液中の２ｍｇ／ｋｇのＬＮＰを投与した。Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡの形態にあり、ｇＲＮＡは、ＲＮＡの形態にあり、Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｍＲＮＡの形態にあった。注射の１週間後、動物を収穫し、全載イメージング／ｌａｃＺ染色のため、組織学／免疫組織化学分析のための１０％ホルマリン中での固定のため、および次世代シーケンシング（ＮＧＳ）のために組織を収集した。収集された組織は、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、骨格筋、生殖腺、心臓、肺、および脳を含んでいた。ベータ−ガラクトシダーゼ中での７２時間後の肝臓の全載ｌａｃＺ染色の結果を、図７に示す。簡単に述べると、肝臓を氷上で３０分間、ＰＦＡ中で固定した後、氷上で２０分間、３回リンスした。Ｘ−Ｇａｌを用いた染色は、氷上で７２時間であり、ＰＢＳ中で撹拌および洗浄した。肝臓を４℃で一晩、ホルマリン中で固定した後、ＰＢＳで洗浄した。Ｃｒｅ処理されたマウスは、豊富なｌａｃＺ染色を示したが、非カットガイドＲＮＡで処理されたマウスは、染色を示さなかった。２つの試験マウス群（ポリＡ除去ガイドＲＮＡ、またはｇＵ２とｇＤ１ガイドＲＮＡの組合せ）は両方とも、ｌａｃＺ染色を示したが、これは、上流のポリアデニル化シグナルが、ｉｎ ｖｉｖｏでマウスの肝臓中で切り出されたことを示している。これらの結果は、図８に示されるｌａｃＺの免疫組織化学分析の結果と一致している。簡単に述べると、ホルマリン固定パラフィン包埋肝臓切片を、脱パラフィン化した後、抗原回収し、次いで、遮断した。次いで、スライドをＬＡＣＺに対する抗体と共にインキュベートし、ＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）にコンジュゲートされた二次抗体と結合させた。次いで、これらの組織を、陽性細胞が褐色を示すまでＤＡＢ中でインキュベートした。次いで、スライドを走査し、陽性細胞を同定した。予想通り、ＣｒｅリコンビナーゼはＰｇｋ ｐＡのより容易な切り出しを可能にするが、ガイドＲＮＡはＮＨＥＪの効率および崩壊が起こるために２つの異なる位置で形成するｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９複合体の同時発生に依拠しているため、染色はＣｒｅリコンビナーゼのものよりも低かった。同様に、これらの結果は、図１１に示されるように様々なマウスから収穫された肝臓に由来する次世代シーケンシングの結果とも一致している。図１１に示されるように、編集効率（すなわち、ｇＲＮＡ標的配列間に欠失を有するリードの数）は、ｇＵ２＋ｇＤ１＋Ｃａｓ９マウスおよびポリＡ除去ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ９マウスについて、陰性対照マウス（非カットガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ９、またはＣａｓ９を含まないｇＵ２＋ｇＤ１）よりも高かった。全載染色および免疫組織化学分析と同様、Ｃｒｅリコンビナーゼ処理は、さらにより高い編集レベルをもたらした。これらの全載染色、免疫組織化学分析、およびＮＧＳの結果は、ＬＳＬ−ＬａｃＺ：ｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーターを、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性ＮＨＥＪ活性のためのリポーターとして効率的に使用することができることを示している。異なるガイドＲＮＡ標的配列をリポーター中に操作して、異なるガイドＲＮＡを試験することができる。
ＬＳＬ−ＬａｃＺ：ｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子中での相同組換え修復によってｅＢＦＰをｅＧＦＰに変換するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の能力を試験するために、Ｒｏｓａ２６遺伝子座でゲノムに組み込まれたＣｒｅリコンビナーゼ処理されたリポーター対立遺伝子（すなわち、上流のポリアデニル化シグナルが除去されたＬ−ＬａｃＺ：ｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子）を含む胚性幹細胞に、ｅＢＦＰをｅＧＦＰに変換するように設計された、Ｃａｓ９（２０μｇ）およびリボ核タンパク質複合体の形態のｅＢＦＰ中の標的配列を標的とするガイドＲＮＡ（２．５μｇ）およびｓｓＯＤＮ（３５μｇ）をエレクトロポレーションする。ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号４２に記載され、ガイドＲＮＡのガイド配列は、配列番号１４に記載される。２つのｓｓＯＤＮ（それぞれ、ＦおよびＲ、「フォワード」および「リバース」相補的一本鎖を表す；配列番号１５および配列番号１６）のいずれかを使用する。
図３に描かれるＬｏｘ−Ｓｔｏｐ−Ｌｏｘ（ＬＳＬ）ｅＢＦＰ／ｅＧＦＰ対立遺伝子もまた、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）ならびに成体マウス組織における有効なＨＤＲリポーターであり得る。ＬＳＬ−ｅＢＦＰ対立遺伝子をＲｏｓａ２６中に組み込むことによって、ｅＢＦＰは通常、細胞および組織中で発現されない。３重のポリアデニル化シグナルネオマイシンカセットがＣｒｅを用いて除去された場合、ｅＢＦＰは発現することができる。ガイドＲＮＡを導入してｅＢＦＰ中で二本鎖切断を誘導し、Ｈ６６Ｙ突然変異を含有する修復ドナーを導入して、ｅＢＦＰをｅＧＦＰに変換することができる（またはあるいは、ＬＳＬ−ｅＧＦＰリポーターについては、ｅＧＦＰ中で二本鎖切断を誘導し、Ｙ６６Ｈ突然変異を含有する修復ドナーを導入して、ｅＧＦＰをｅＢＦＰに変換する）。
上流のポリアデニル化シグナルがＣｒｅリコンビナーゼによって除去されたＬＳＬ−ｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子（Ｌ−ｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子）中での相同組換え修復によって、ｅＢＦＰをｅＧＦＰに変換するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の能力を試験するために、リポーター対立遺伝子を含む胚性幹細胞に、ｅＢＦＰをｅＧＦＰに変換するように設計された、Ｃａｓ９（２０μｇ）およびリボ核タンパク質複合体の形態のｅＢＦＰ中の標的配列を標的とするガイドＲＮＡ（２．５μｇ）およびｓｓＯＤＮ（３５μｇ）をエレクトロポレーションした。ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号４２に記載され、ガイドＲＮＡのガイド配列は、配列番号１４に記載される。２つのｓｓＯＤＮ（それぞれ、ＦおよびＲ、「フォワード」および「リバース」相補的一本鎖を表す；配列番号１５および配列番号１６）を別々の実験において使用した。図９に示されるように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびｓｓＯＤＮ Ｆは、ｅＢＦＰをｅＧＦＰに上手く変換し、ｅＧＦＰが発現される。図９の上の行は、明視野画像を示し、下の行は、蛍光顕微鏡画像（ｅＧＦＰ）を示す。
同様の実験を、ｅｘ ｖｉｖｏで造血幹細胞および前駆細胞中で実施した。上流のポリアデニル化シグナルが除去されたＬＳＬ−ｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子（Ｌ−ｅＢＦＰ ＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子）中での相同組換え修復によってｅＢＦＰをｅＧＦＰに変換するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の能力を試験するために、Ｒｏｓａ２６遺伝子座に組み込まれたリポーターを含有するマウスから骨髄細胞を抽出した。簡単に述べると、マウスから大腿骨および脛骨を収穫し、骨髄を抽出した。ＳＴＥＭＣＥＬＬからのＥａｓｙＳｅｐキットを使用して、造血細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）をさらに単離した。細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌ、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６、および３０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３を含むＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ（ＳＴＥＭ ｃｅｌｌ＃０９６５０）培地中、ウェルあたり２５０，０００〜１，０００，０００個の細胞の密度で２４ウェルプレート中に播種した。細胞に、ｅＢＦＰをｅＧＦＰに変換するように設計された、Ｃａｓ９、ｅＢＦＰ中の標的配列を標的とするガイドＲＮＡ、およびｓｓＯＤＮをエレクトロポレーションした。ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号４２に記載され、ガイドＲＮＡのガイド配列は、配列番号１４に記載される。使用したｓｓＯＤＮの配列は、配列番号１５および配列番号１６に記載される。
具体的には、室温で１０〜１５分間、２００ｎｇ〜１μｇのｓｇＲＮＡを１μｇのＣａｓ９タンパク質（ＰＮＡ Ｂｉｏ）と共にインキュベートした後、培養物中で１〜３時間後、１０，０００個のマウス造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）中にエレクトロポレーションすることによって、Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ ＲＮＰを使用し、生成した。マウスＨＳＰＣのための最適化されたエレクトロポレーション条件は、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用する、１７００Ｖ、２０ｍｓ、および１パルスである。１０ｎＭ ｓｓＯＤＮ＋Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡのＲＮＰを使用する以下のＥＰ条件を試験した：（１）１７２０Ｖ １０パルス幅、２パルス、および細胞密度：５ｅ６；（２）１６８０Ｖ ２０パルス幅、１パルス、および細胞密度：６ｅ７；ならびに（３）１７００Ｖ ２０パルス幅、１パルス、および細胞密度：１ｅ８。Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰおよびｓｓＯＤＮ ＦＷまたはＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰおよびｓｓＯＤＮ ＲＥＶを用いたエレクトロポレーション（１７２０Ｖ １０パルス幅、２パルス、細胞密度：５ｅ６）の４８時間後の明視野および蛍光顕微鏡画像を、図１０Ａに示す。未処理の細胞を、陰性対照として使用した。明視野画像を上の行に示し、蛍光顕微鏡画像（ｅＧＦＰ）を下の行に示す。エレクトロポレーションの７日後の細胞の画像を、図１０Ｂに示す。１列目は、明視野画像を示し、２列目および３列目は、蛍光顕微鏡画像（ｅＧＦＰ）を示す。一部のより大きい、分化した細胞では蛍光が特に明らかである。図１０Ａおよび図１０Ｂに示されるように、Ｌ−ｅＢＦＰリポーターマウスから単離された初代細胞中、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびｓｓＯＤＮはｅｘ ｖｉｖｏでｅＢＦＰをｅＧＦＰに上手く変換し、ｅＧＦＰが発現される。
ｉｎ ｖｉｖｏでの成体マウスにおけるＨＤＲリードアウトとしてのｅＧＦＰの有効性を決定するために、図１Ａもしくは図３に示されるＣＲＩＳＰＲリポーター対立遺伝子またはこれらの対立遺伝子のＣｒｅリコンビナーゼ処理バージョンを用いて標的化されたｍＥＳＣを、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法を使用して、８細胞のマウス胚に微量注射した。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５７６，２５９号；第７，６５９，４４２号；第７，２９４，７５４号；ＵＳ２００８／００７８００；およびPoueymirou et al. (2007) Nature Biotech. 25(1): 91-99を参照されたい。具体的には、透明帯に小さい孔を創出して、標的化されたｍＥＳＣの注射を容易にした。これらの注射された８細胞胚を、代理母に移して、導入遺伝子を担持する生きた子を産生した。代理母での懐胎の際に、注射された胚は、検出可能な宿主胚の寄与を担持しないＦ０マウスを産生した。完全にＥＳ細胞に由来するマウスは、正常で、健康で、繁殖力があった（生殖細胞系列伝達を有する）。Ｃａｓ９系を使用して成体マウス肝臓中の突然変異を補正する実現可能性を評価するために、このマウスを使用することができる。この目的のために、初代肝細胞をＬＳＬ−ｅＢＦＰ／ｅＧＦＰ標的化マウスから収穫し、これを使用して、これらの非分裂細胞中の点突然変異を補正する方法を評価する。最も効率的な手法を決定することができる。次いで、全ての材料を、脂質ナノ粒子もしくはアデノ随伴ウイルスの尾静脈注射によって、または別の好適な送達方法によって、マウスに導入する。これらのマウスの肝臓または他の組織を収穫し、ｅＧＦＰ発現の評価を実施して、正確に改変された細胞を探す。次世代シーケンシングもまた実施して、正確に改変された細胞を探す。次世代シーケンシングおよびＲＮＡｓｅｑは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が活性である肝臓または他の組織中の細胞型に関する情報を提供することができる。
（項目１）
第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列の間の核酸のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性切り出しを評価するためのＣＲＩＳＰＲリポーターを含む非ヒト動物であって、前記ＣＲＩＳＰＲリポーターが、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれ、前記第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列によって挟まれた第１のポリアデニル化シグナル、次いで、第１のリポータータンパク質のコード配列と、第２のリポータータンパク質のコード配列とを任意の順序で含むリポーターカセットを含み、前記第１のリポータータンパク質と前記第２のリポータータンパク質とが異なっている、非ヒト動物。
（項目２）
前記ＣＲＩＳＰＲリポーターが、前記ＣＲＩＳＰＲリポーターの外因性ドナー核酸とのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換えを評価するためのものでもある、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目３）
前記第１のリポータータンパク質が、第３のガイドＲＮＡ標的配列を含み、前記ＣＲＩＳＰＲリポーターの前記外因性ドナー核酸との組換えが、前記第１のリポータータンパク質の前記コード配列を、第３のリポータータンパク質のコード配列に変化させる、項目２に記載の非ヒト動物。
（項目４）
前記第１のリポータータンパク質の前記コード配列を、単一のコドンを変化させることによって、前記第３のリポータータンパク質の前記コード配列に変化させる、項目３に記載の非ヒト動物。
（項目５）
前記第３のガイドＲＮＡ標的配列が、前記外因性ドナー核酸によって改変された前記第１のリポータータンパク質の前記コード配列の一部と重複する、項目３または４に記載の非ヒト動物。
（項目６）
前記第１および第２のリポータータンパク質の１つが、蛍光リポータータンパク質を含む、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
（項目７）
前記蛍光リポータータンパク質が、強化型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）または強化型青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）を含む、項目６に記載の非ヒト動物。
（項目８）
前記第１および第２のリポータータンパク質が、前記蛍光リポータータンパク質および非蛍光リポータータンパク質を含む、項目６または７に記載の非ヒト動物。
（項目９）
前記蛍光リポータータンパク質を、フローサイトメトリーアッセイにおいて検出することができ、前記非蛍光タンパク質を、組織化学的アッセイにおいて検出することができる、項目８に記載の非ヒト動物。
（項目１０）
前記第１および第２のリポータータンパク質の１つが、ベータ−ガラクトシダーゼタンパク質を含む、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
（項目１１）
前記第１のポリアデニル化シグナルも、第１のリコンビナーゼのためのリコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
（項目１２）
前記第１のリコンビナーゼのための前記リコンビナーゼ認識部位が、ｌｏｘＰ配列である、項目１１に記載の非ヒト動物。
（項目１３）
前記リポーターカセットが、介在内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または介在２Ａペプチドコード配列によって隔てられた、前記第１のリポータータンパク質の前記コード配列と、前記第２のリポータータンパク質の前記コード配列とを含む多シストロン性核酸を含む、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
（項目１４）
前記多シストロン性核酸が、介在Ｐ２Ａペプチドコード配列によって隔てられた、ベータ−ガラクトシダーゼコード配列と、強化型青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）コード配列または強化型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）コード配列とを含む、項目１３に記載の非ヒト動物。
（項目１５）
前記ＣＲＩＳＰＲリポーターが、前記標的ゲノム遺伝子座で内因性プロモーターに作動可能に連結されている、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
（項目１６）
前記ＣＲＩＳＰＲリポーターの５’末端が、３’スプライシング配列をさらに含む、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
（項目１７）
前記ＣＲＩＳＰＲリポーターが、選択カセットをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
（項目１８）
前記選択カセットが、第２のリコンビナーゼのためのリコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、項目１７に記載の非ヒト動物。
（項目１９）
前記選択カセットが、薬物耐性遺伝子を含む、項目１７または１８に記載の非ヒト動物。
（項目２０）
前記第１のガイドＲＮＡ標的配列と、前記第２のガイドＲＮＡ標的配列との距離が、約５００塩基対未満である、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
（項目２１）
前記第１のガイドＲＮＡ標的配列と、前記第２のガイドＲＮＡ標的配列が同一であり、それぞれ、配列番号４１を含む、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
（項目２２）
ラットまたはマウスである、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
（項目２３）
マウスである、項目２２に記載の非ヒト動物。
（項目２４）
前記標的ゲノム遺伝子座が、セーフハーバー遺伝子座である、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
（項目２５）
前記セーフハーバー遺伝子座が、Ｒｏｓａ２６遺伝子座である、項目２４に記載の非ヒト動物。
（項目２６）
前記ＣＲＩＳＰＲリポーターが、前記Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに挿入される、項目２５に記載の非ヒト動物。
（項目２７）
前記非ヒト動物がマウスであり、
前記標的ゲノム遺伝子座がＲｏｓａ２６遺伝子座であり、
前記ＣＲＩＳＰＲリポーターが内因性Ｒｏｓａ２６プロモーターに作動可能に連結され、前記Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに挿入され、５’から３’に向かって、
（ａ）３’スプライシング配列；
（ｂ）（ｉ）第１および第２のｌｏｘＰ部位；ならびに
（ｉｉ）第１のガイドＲＮＡ標的配列と、第２のガイドＲＮＡ標的配列が同一であり、それぞれ、配列番号４１を含む、前記第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列によって挟まれた第１のポリアデニル化シグナル；ならびに
（ｃ）５’から３’に向かって、
（ｉ）ベータ−ガラクトシダーゼコード配列；
（ｉｉ）Ｐ２Ａコード配列；
（ｉｉｉ）配列番号４２を含む第３のガイドＲＮＡ標的配列を含む、強化型青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）コード配列；および
（ｉｖ）前記第１のポリアデニル化シグナルと第２のポリアデニル化シグナルとが異なる、前記第２のポリアデニル化シグナルを含むリポーターカセット
を含む、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
（項目２８）
前記ＣＲＩＳＰＲリポーターが、
（ｄ）前記リポーターカセットの３’側の選択カセット
をさらに含み、前記選択カセットは、ＦＲＴ部位によって挟まれており、５’から３’に向かって、
（ｉ）ヒトユビキチンプロモーターに作動可能に連結されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼコード配列；および
（ｉｉ）第３のポリアデニル化シグナル
を含む、項目２７に記載の非ヒト動物。
（項目２９）
前記標的ゲノム遺伝子座で前記ＣＲＩＳＰＲリポーターについてヘテロ接合性である、前記項目のいずれかに記載の非ヒト動物。
（項目３０）
前記標的ゲノム遺伝子座で前記ＣＲＩＳＰＲリポーターについてホモ接合性である、項目１から２８のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目３１）
ｉｎ ｖｉｖｏでゲノム核酸を切り出すＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの能力を試験する方法であって、
（ａ）項目１から３０のいずれか一項に記載の非ヒト動物に、
（ｉ）前記ＣＲＩＳＰＲリポーター中の前記第１のガイドＲＮＡ標的配列にハイブリダイズするように設計された第１のガイドＲＮＡ；
（ｉｉ）前記ＣＲＩＳＰＲリポーター中の前記第２のガイドＲＮＡ標的配列にハイブリダイズするように設計された第２のガイドＲＮＡ；および
（ｉｉｉ）Ｃａｓタンパク質
を導入するステップ；ならびに
（ｂ）前記第１および第２のリポータータンパク質の少なくとも１つの活性または発現を測定するステップ
を含む、方法。
（項目３２）
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記Ｃａｓタンパク質が、タンパク質の形態で前記非ヒト動物に導入される、項目３１または３２に記載の方法。
（項目３４）
前記Ｃａｓタンパク質が、前記Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡの形態で前記非ヒト動物に導入される、項目３１または３２に記載の方法。
（項目３５）
前記Ｃａｓタンパク質が、前記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡの形態で前記非ヒト動物に導入され、前記ＤＮＡが、前記非ヒト動物中の１つまたは複数の細胞型において活性なプロモーターに作動可能に連結されている、項目３１または３２に記載の方法。
（項目３６）
前記第１のガイドＲＮＡと、前記第２のガイドＲＮＡが同一であり、それぞれ、配列番号２に記載の配列を含む、項目３１から３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
ステップ（ｂ）において測定された前記リポータータンパク質が、蛍光リポータータンパク質であり、ステップ（ｂ）が、フローサイトメトリーアッセイを含む、項目３１から３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
ステップ（ｂ）において測定された前記リポータータンパク質が、ベータ−ガラクトシダーゼタンパク質であり、ステップ（ｂ）が、組織化学染色アッセイを含む、項目３１から３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
ステップ（ａ）における前記ガイドＲＮＡがＲＮＡの形態で導入される、項目３１から３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
ステップ（ａ）における前記ガイドＲＮＡが、前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で前記非ヒト動物にそれぞれ導入され、前記ＤＮＡが、前記非ヒト動物中の１つまたは複数の細胞型において活性なプロモーターに作動可能に連結されている、項目３１から３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記導入するステップが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達、脂質ナノ粒子媒介性送達、または流体力学的送達を含む、項目３１から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記導入するステップが、ＡＡＶ媒介性送達を含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記導入するステップが、ＡＡＶ８媒介性送達を含み、ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物の肝臓中の前記リポータータンパク質の活性を測定することを含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
ｉｎ ｖｉｖｏでゲノム核酸を切り出すＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの能力を最適化する方法であって、
（Ｉ）第１の非ヒト動物において１回目の項目３１から４３のいずれか一項に記載の方法を実施するステップ；
（ＩＩ）変数を変化させ、第２の非ヒト動物において変化した変数を用いて２回目のステップ（Ｉ）に記載の方法を実施するステップ；および
（ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）における前記リポータータンパク質の活性または発現と、ステップ（ＩＩ）における少なくとも１つの前記リポータータンパク質の活性または発現とを比較し、前記リポータータンパク質のより高い活性または発現をもたらす方法を選択するステップ
を含む、方法。
（項目４５）
ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記ガイドＲＮＡおよび／または前記Ｃａｓタンパク質を前記非ヒト動物に導入する送達方法である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記ガイドＲＮＡおよび／または前記Ｃａｓタンパク質を前記非ヒト動物に導入する投与経路である、項目４４に記載の方法。
（項目４７）
ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドＲＮＡおよび／または前記Ｃａｓタンパク質の濃度または量である、項目４４に記載の方法。
（項目４８）
ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入されるＣａｓタンパク質の濃度または量と比較した、前記非ヒト動物に導入された前記ガイドＲＮＡの濃度または量である、項目４４に記載の方法。
（項目４９）
ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドＲＮＡである、項目４４に記載の方法。
（項目５０）
ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入される前記Ｃａｓタンパク質である、項目４４に記載の方法。
（項目５１）
ｉｎ ｖｉｖｏでゲノム核酸の外因性ドナー核酸とのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換えを試験する方法であって、
（ａ）前記ＣＲＩＳＰＲリポーターが、前記ＣＲＩＳＰＲリポーターの外因性ドナー核酸とのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換えを評価するためのものでもあり、前記第１のポリアデニル化シグナルが、前記ＣＲＩＳＰＲリポーターから除去されており、前記第１のリポータータンパク質の前記コード配列が、第３のガイドＲＮＡ標的配列を含む、項目１から３０のいずれか一項に記載の非ヒト動物を提供し、前記非ヒト動物に、
（ｉ）前記ＣＲＩＳＰＲリポーター中の前記第３のガイドＲＮＡ標的配列にハイブリダイズするように設計されたガイドＲＮＡ；
（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質；および
（ｉｉｉ）前記ＣＲＩＳＰＲリポーターと組み換わり、前記第１のリポータータンパク質の前記コード配列を、第３のリポータータンパク質のコード配列に変化させることができる外因性ドナー核酸
を導入するステップ；ならびに
（ｂ）前記第３のリポータータンパク質の活性または発現を測定するステップ
を含む、方法。
（項目５２）
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記Ｃａｓタンパク質が、タンパク質の形態で前記非ヒト動物に導入される、項目５１に記載の方法。
（項目５４）
前記Ｃａｓタンパク質が、前記Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡの形態で前記非ヒト動物に導入される、項目５１に記載の方法。
（項目５５）
前記Ｃａｓタンパク質が、前記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡの形態で前記非ヒト動物に導入され、前記ＤＮＡが、前記非ヒト動物中の１つまたは複数の細胞型において活性なプロモーターに作動可能に連結されている、項目５１に記載の方法。
（項目５６）
ステップ（ｂ）において測定された前記第３のリポータータンパク質が、蛍光リポータータンパク質であり、ステップ（ｂ）が、フローサイトメトリーアッセイを含む、項目５１から５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記第１のリポータータンパク質が、強化型青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）であり、前記第３のガイドＲＮＡが、配列番号１４に記載の配列を含む、項目５１から５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記第１のリポータータンパク質が、強化型青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）であり、前記第３のリポータータンパク質が、強化型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）である、項目５１から５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記外因性ドナー核酸が、配列番号１５または配列番号１６に記載の配列を含む、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記外因性ドナー核酸が、一本鎖デオキシヌクレオチドである、項目５１から５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
ステップ（ａ）における前記ガイドＲＮＡがＲＮＡの形態で導入される、項目５１から６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
ステップ（ａ）における前記ガイドＲＮＡが、前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で前記非ヒト動物に導入され、前記ＤＮＡが、前記非ヒト動物中の１つまたは複数の細胞型において活性なプロモーターに作動可能に連結されている、項目５１から６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記導入するステップが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達、脂質ナノ粒子媒介性送達、または流体力学的送達を含む、項目５１から６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記導入するステップが、ＡＡＶ媒介性送達を含む、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記導入するステップが、ＡＡＶ８媒介性送達を含み、ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物の肝臓中の前記リポータータンパク質の活性を測定することを含む、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
ｉｎ ｖｉｖｏでゲノム核酸の外因性ドナー核酸との組換えを誘導するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの能力を最適化する方法であって、
（Ｉ）第１の非ヒト動物において１回目の項目５１から６５のいずれか一項に記載の方法を実施するステップ；
（ＩＩ）変数を変化させ、第２の非ヒト動物において前記変化した変数を用いて２回目のステップ（Ｉ）に記載の方法を実施するステップ；および
（ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）における前記第３のリポータータンパク質の活性または発現と、ステップ（ＩＩ）における前記第３のリポータータンパク質の活性または発現とを比較し、前記第３のリポータータンパク質のより高い活性または発現をもたらす方法を選択するステップ
を含む、方法。
（項目６７）
ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記ガイドＲＮＡ、前記Ｃａｓタンパク質、および前記外因性ドナー核酸のうちの１つまたは複数を前記非ヒト動物に導入する送達方法である、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記ガイドＲＮＡ、前記Ｃａｓタンパク質、および前記外因性ドナー核酸のうちの１つまたは複数を前記非ヒト動物に導入する投与経路である、項目６６に記載の方法。
（項目６９）
ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドＲＮＡ、前記Ｃａｓタンパク質、および前記外因性ドナー核酸のうちの１つまたは複数の濃度または量である、項目６６に記載の方法。
（項目７０）
ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入される前記外因性ドナー核酸である、項目６６に記載の方法。
（項目７１）
ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入されるＣａｓタンパク質の濃度または量と比較した、前記非ヒト動物に導入された前記ガイドＲＮＡの濃度または量である、項目６６に記載の方法。
（項目７２）
ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドＲＮＡである、項目６６に記載の方法。
（項目７３）
ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入されるＣａｓタンパク質である、項目６６に記載の方法。

Claims (78)

  1. 第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列の間の核酸のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性切り出しを評価するためのＣＲＩＳＰＲリポーターを含む非ヒト動物であって、前記ＣＲＩＳＰＲリポーターが、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれ、前記第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列によって挟まれた第１のポリアデニル化シグナル、次いで、第１のリポータータンパク質のコード配列と、第２のリポータータンパク質のコード配列とを任意の順序で含むリポーターカセットを含み、前記第１のリポータータンパク質と前記第２のリポータータンパク質とが異なっている、非ヒト動物。
  2. 前記ＣＲＩＳＰＲリポーターが、前記ＣＲＩＳＰＲリポーターの外因性ドナー核酸とのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換えを評価するためのものでもある、請求項１に記載の非ヒト動物。
  3. 前記第１のリポータータンパク質が、第３のガイドＲＮＡ標的配列を含み、前記ＣＲＩＳＰＲリポーターの前記外因性ドナー核酸との組換えが、前記第１のリポータータンパク質の前記コード配列を、第３のリポータータンパク質のコード配列に変化させる、請求項２に記載の非ヒト動物。
  4. 前記第１のリポータータンパク質の前記コード配列を、単一のコドンを変化させることによって、前記第３のリポータータンパク質の前記コード配列に変化させる、請求項３に記載の非ヒト動物。
  5. 前記第３のガイドＲＮＡ標的配列が、前記外因性ドナー核酸によって改変された前記第１のリポータータンパク質の前記コード配列の一部と重複する、請求項３または４に記載の非ヒト動物。
  6. 前記第１および第２のリポータータンパク質の１つが、蛍光リポータータンパク質を含む、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
  7. 前記蛍光リポータータンパク質が、強化型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）または強化型青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）を含む、請求項６に記載の非ヒト動物。
  8. 前記第１および第２のリポータータンパク質が、前記蛍光リポータータンパク質および非蛍光リポータータンパク質を含む、請求項６または７に記載の非ヒト動物。
  9. 前記蛍光リポータータンパク質を、フローサイトメトリーアッセイにおいて検出することができ、前記非蛍光タンパク質を、組織化学的アッセイにおいて検出することができる、請求項８に記載の非ヒト動物。
  10. 前記第１および第２のリポータータンパク質の１つが、ベータ−ガラクトシダーゼタンパク質を含む、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
  11. 前記第１のポリアデニル化シグナルも、第１のリコンビナーゼのためのリコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
  12. 前記第１のリコンビナーゼのための前記リコンビナーゼ認識部位が、ｌｏｘＰ配列である、請求項１１に記載の非ヒト動物。
  13. 前記リポーターカセットが、介在内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または介在２Ａペプチドコード配列によって隔てられた、前記第１のリポータータンパク質の前記コード配列と、前記第２のリポータータンパク質の前記コード配列とを含む多シストロン性核酸を含む、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
  14. 前記多シストロン性核酸が、介在Ｐ２Ａペプチドコード配列によって隔てられた、ベータ−ガラクトシダーゼコード配列と、強化型青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）コード配列または強化型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）コード配列とを含む、請求項１３に記載の非ヒト動物。
  15. 前記ＣＲＩＳＰＲリポーターが、前記標的ゲノム遺伝子座で内因性プロモーターに作動可能に連結されている、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
  16. 前記ＣＲＩＳＰＲリポーターの５’末端が、３’スプライシング配列をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
  17. 前記ＣＲＩＳＰＲリポーターが、選択カセットをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
  18. 前記選択カセットが、第２のリコンビナーゼのためのリコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、請求項１７に記載の非ヒト動物。
  19. 前記選択カセットが、薬物耐性遺伝子を含む、請求項１７または１８に記載の非ヒト動物。
  20. 前記第１のガイドＲＮＡ標的配列と、前記第２のガイドＲＮＡ標的配列との距離が、約５００塩基対未満である、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
  21. 前記第１のガイドＲＮＡ標的配列と、前記第２のガイドＲＮＡ標的配列が同一であり、それぞれ、配列番号４１を含む、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
  22. ラットまたはマウスである、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
  23. マウスである、請求項２２に記載の非ヒト動物。
  24. 前記標的ゲノム遺伝子座が、セーフハーバー遺伝子座である、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
  25. 前記セーフハーバー遺伝子座が、Ｒｏｓａ２６遺伝子座である、請求項２４に記載の非ヒト動物。
  26. 前記ＣＲＩＳＰＲリポーターが、前記Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに挿入される、請求項２５に記載の非ヒト動物。
  27. 前記非ヒト動物がマウスであり、
    前記標的ゲノム遺伝子座がＲｏｓａ２６遺伝子座であり、
    前記ＣＲＩＳＰＲリポーターが内因性Ｒｏｓａ２６プロモーターに作動可能に連結され、前記Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに挿入され、５’から３’に向かって、
    （ａ）３’スプライシング配列；
    （ｂ）（ｉ）第１および第２のｌｏｘＰ部位；ならびに
    （ｉｉ）第１のガイドＲＮＡ標的配列と、第２のガイドＲＮＡ標的配列が同一であり、それぞれ、配列番号４１を含む、前記第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列によって挟まれた第１のポリアデニル化シグナル；ならびに
    （ｃ）５’から３’に向かって、
    （ｉ）ベータ−ガラクトシダーゼコード配列；
    （ｉｉ）Ｐ２Ａコード配列；
    （ｉｉｉ）配列番号４２を含む第３のガイドＲＮＡ標的配列を含む、強化型青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）コード配列；および
    （ｉｖ）前記第１のポリアデニル化シグナルと第２のポリアデニル化シグナルとが異なる、前記第２のポリアデニル化シグナルを含むリポーターカセット
    を含む、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
  28. 前記ＣＲＩＳＰＲリポーターが、
    （ｄ）前記リポーターカセットの３’側の選択カセット
    をさらに含み、前記選択カセットは、ＦＲＴ部位によって挟まれており、５’から３’に向かって、
    （ｉ）ヒトユビキチンプロモーターに作動可能に連結されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼコード配列；および
    （ｉｉ）第３のポリアデニル化シグナル
    を含む、請求項２７に記載の非ヒト動物。
  29. 前記標的ゲノム遺伝子座で前記ＣＲＩＳＰＲリポーターについてヘテロ接合性である、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
  30. 前記標的ゲノム遺伝子座で前記ＣＲＩＳＰＲリポーターについてホモ接合性である、請求項１から２８のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  31. ｉｎ ｖｉｖｏでゲノム核酸を切り出すＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの能力を試験する方法であって、
    （ａ）請求項１から３０のいずれか一項に記載の非ヒト動物に、
    （ｉ）前記ＣＲＩＳＰＲリポーター中の前記第１のガイドＲＮＡ標的配列にハイブリダイズするように設計された第１のガイドＲＮＡ；
    （ｉｉ）前記ＣＲＩＳＰＲリポーター中の前記第２のガイドＲＮＡ標的配列にハイブリダイズするように設計された第２のガイドＲＮＡ；および
    （ｉｉｉ）Ｃａｓタンパク質
    を導入するステップ；ならびに
    （ｂ）前記第１および第２のリポータータンパク質の少なくとも１つの活性または発現を測定するステップ
    を含む、方法。
  32. 前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記Ｃａｓタンパク質が、タンパク質の形態で前記非ヒト動物に導入される、請求項３１または３２に記載の方法。
  34. 前記Ｃａｓタンパク質が、前記Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡの形態で前記非ヒト動物に導入される、請求項３１または３２に記載の方法。
  35. 前記Ｃａｓタンパク質が、前記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡの形態で前記非ヒト動物に導入され、前記ＤＮＡが、前記非ヒト動物中の１つまたは複数の細胞型において活性なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項３１または３２に記載の方法。
  36. 前記第１のガイドＲＮＡと、前記第２のガイドＲＮＡが同一であり、それぞれ、配列番号２に記載の配列を含む、請求項３１から３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. ステップ（ｂ）において測定された前記リポータータンパク質が、蛍光リポータータンパク質であり、ステップ（ｂ）が、フローサイトメトリーアッセイを含む、請求項３１から３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. ステップ（ｂ）において測定された前記リポータータンパク質が、ベータ−ガラクトシダーゼタンパク質であり、ステップ（ｂ）が、組織化学染色アッセイを含む、請求項３１から３６のいずれか一項に記載の方法。
  39. ステップ（ａ）における前記ガイドＲＮＡがＲＮＡの形態で導入される、請求項３１から３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. ステップ（ａ）における前記ガイドＲＮＡが、前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で前記非ヒト動物にそれぞれ導入され、前記ＤＮＡが、前記非ヒト動物中の１つまたは複数の細胞型において活性なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項３１から３８のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記導入するステップが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達、脂質ナノ粒子媒介性送達、または流体力学的送達を含む、請求項３１から４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記導入するステップが、ＡＡＶ媒介性送達を含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記導入するステップが、ＡＡＶ８媒介性送達を含み、ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物の肝臓中の前記リポータータンパク質の活性を測定することを含む、請求項４２に記載の方法。
  44. ｉｎ ｖｉｖｏでゲノム核酸を切り出すＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの能力を最適化する方法であって、
    （Ｉ）第１の非ヒト動物において１回目の請求項３１から４３のいずれか一項に記載の方法を実施するステップ；
    （ＩＩ）変数を変化させ、第２の非ヒト動物において変化した変数を用いて２回目のステップ（Ｉ）に記載の方法を実施するステップ；および
    （ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）における前記リポータータンパク質の活性または発現と、ステップ（ＩＩ）における少なくとも１つの前記リポータータンパク質の活性または発現とを比較し、前記リポータータンパク質のより高い活性または発現をもたらす方法を選択するステップ
    を含む、方法。
  45. ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記ガイドＲＮＡおよび／または前記Ｃａｓタンパク質を前記非ヒト動物に導入する送達方法である、請求項４４に記載の方法。
  46. ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記ガイドＲＮＡおよび／または前記Ｃａｓタンパク質を前記非ヒト動物に導入する投与経路である、請求項４４に記載の方法。
  47. ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドＲＮＡおよび／または前記Ｃａｓタンパク質の濃度または量である、請求項４４に記載の方法。
  48. ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入されるＣａｓタンパク質の濃度または量と比較した、前記非ヒト動物に導入された前記ガイドＲＮＡの濃度または量である、請求項４４に記載の方法。
  49. ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドＲＮＡである、請求項４４に記載の方法。
  50. ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入される前記Ｃａｓタンパク質である、請求項４４に記載の方法。
  51. ｉｎ ｖｉｖｏでゲノム核酸の外因性ドナー核酸とのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換えを試験する方法であって、
    （ａ）前記ＣＲＩＳＰＲリポーターが、前記ＣＲＩＳＰＲリポーターの外因性ドナー核酸とのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性組換えを評価するためのものでもあり、前記第１のポリアデニル化シグナルが、前記ＣＲＩＳＰＲリポーターから除去されており、前記第１のリポータータンパク質の前記コード配列が、第３のガイドＲＮＡ標的配列を含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の非ヒト動物を提供し、前記非ヒト動物に、
    （ｉ）前記ＣＲＩＳＰＲリポーター中の前記第３のガイドＲＮＡ標的配列にハイブリダイズするように設計されたガイドＲＮＡ；
    （ｉｉ）Ｃａｓタンパク質；および
    （ｉｉｉ）前記ＣＲＩＳＰＲリポーターと組み換わり、前記第１のリポータータンパク質の前記コード配列を、第３のリポータータンパク質のコード配列に変化させることができる外因性ドナー核酸
    を導入するステップ；ならびに
    （ｂ）前記第３のリポータータンパク質の活性または発現を測定するステップ
    を含む、方法。
  52. 前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記Ｃａｓタンパク質が、タンパク質の形態で前記非ヒト動物に導入される、請求項５１に記載の方法。
  54. 前記Ｃａｓタンパク質が、前記Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡの形態で前記非ヒト動物に導入される、請求項５１に記載の方法。
  55. 前記Ｃａｓタンパク質が、前記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡの形態で前記非ヒト動物に導入され、前記ＤＮＡが、前記非ヒト動物中の１つまたは複数の細胞型において活性なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項５１に記載の方法。
  56. ステップ（ｂ）において測定された前記第３のリポータータンパク質が、蛍光リポータータンパク質であり、ステップ（ｂ）が、フローサイトメトリーアッセイを含む、請求項５１から５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記第１のリポータータンパク質が、強化型青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）であり、前記第３のガイドＲＮＡが、配列番号１４に記載の配列を含む、請求項５１から５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記第１のリポータータンパク質が、強化型青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）であり、前記第３のリポータータンパク質が、強化型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）である、請求項５１から５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記外因性ドナー核酸が、配列番号１５または配列番号１６に記載の配列を含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記外因性ドナー核酸が、一本鎖デオキシヌクレオチドである、請求項５１から５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. ステップ（ａ）における前記ガイドＲＮＡがＲＮＡの形態で導入される、請求項５１から６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. ステップ（ａ）における前記ガイドＲＮＡが、前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で前記非ヒト動物に導入され、前記ＤＮＡが、前記非ヒト動物中の１つまたは複数の細胞型において活性なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項５１から６０のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記導入するステップが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達、脂質ナノ粒子媒介性送達、または流体力学的送達を含む、請求項５１から６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記導入するステップが、ＡＡＶ媒介性送達を含む、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記導入するステップが、ＡＡＶ８媒介性送達を含み、ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物の肝臓中の前記リポータータンパク質の活性を測定することを含む、請求項６４に記載の方法。
  66. ｉｎ ｖｉｖｏでゲノム核酸の外因性ドナー核酸との組換えを誘導するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの能力を最適化する方法であって、
    （Ｉ）第１の非ヒト動物において１回目の請求項５１から６５のいずれか一項に記載の方法を実施するステップ；
    （ＩＩ）変数を変化させ、第２の非ヒト動物において前記変化した変数を用いて２回目のステップ（Ｉ）に記載の方法を実施するステップ；および
    （ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）における前記第３のリポータータンパク質の活性または発現と、ステップ（ＩＩ）における前記第３のリポータータンパク質の活性または発現とを比較し、前記第３のリポータータンパク質のより高い活性または発現をもたらす方法を選択するステップ
    を含む、方法。
  67. ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記ガイドＲＮＡ、前記Ｃａｓタンパク質、および前記外因性ドナー核酸のうちの１つまたは複数を前記非ヒト動物に導入する送達方法である、請求項６６に記載の方法。
  68. ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記ガイドＲＮＡ、前記Ｃａｓタンパク質、および前記外因性ドナー核酸のうちの１つまたは複数を前記非ヒト動物に導入する投与経路である、請求項６６に記載の方法。
  69. ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドＲＮＡ、前記Ｃａｓタンパク質、および前記外因性ドナー核酸のうちの１つまたは複数の濃度または量である、請求項６６に記載の方法。
  70. ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入される前記外因性ドナー核酸である、請求項６６に記載の方法。
  71. ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入されるＣａｓタンパク質の濃度または量と比較した、前記非ヒト動物に導入された前記ガイドＲＮＡの濃度または量である、請求項６６に記載の方法。
  72. ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドＲＮＡである、請求項６６に記載の方法。
  73. ステップ（ＩＩ）における前記変化した変数が、前記非ヒト動物に導入されるＣａｓタンパク質である、請求項６６に記載の方法。
  74. 第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列の間の核酸のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性切り出しを評価するためのＣＲＩＳＰＲリポーターを含む非ヒト動物細胞であって、前記ＣＲＩＳＰＲリポーターが、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれ、前記第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列によって挟まれた第１のポリアデニル化シグナル、次いで、第１のリポータータンパク質のコード配列と、第２のリポータータンパク質のコード配列とを任意の順序で含むリポーターカセットを含み、前記第１のリポータータンパク質と前記第２のリポータータンパク質とが異なっている、非ヒト動物細胞。
  75. 第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列の間の核酸のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性切り出しを評価するためのＣＲＩＳＰＲリポーターを含む非ヒト動物ゲノムであって、前記ＣＲＩＳＰＲリポーターが、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれ、前記第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列によって挟まれた第１のポリアデニル化シグナル、次いで、第１のリポータータンパク質のコード配列と、第２のリポータータンパク質のコード配列とを任意の順序で含むリポーターカセットを含み、前記第１のリポータータンパク質と前記第２のリポータータンパク質とが異なっている、非ヒト動物ゲノム。
  76. 相同アームによって挟まれたＣＲＩＳＰＲリポーターを含む標的化ベクターであって、前記ＣＲＩＳＰＲリポーターが、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列の間の核酸のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性切り出しを評価するためのものであり、前記ＣＲＩＳＰＲリポーターが、前記第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列によって挟まれた第１のポリアデニル化シグナル、次いで、第１のリポータータンパク質のコード配列と、第２のリポータータンパク質のコード配列とを任意の順序で含むリポーターカセットを含み、前記第１のリポータータンパク質と前記第２のリポータータンパク質とが異なっており、前記相同アームが、ゲノム組込みを容易にするための所望の標的ゲノム遺伝子座との組換えを方向付けるのに好適である、標的化ベクター。
  77. 請求項１から３０のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製するための方法であって、
    （ａ）標的ゲノム遺伝子座に組み込まれたＣＲＩＳＰＲリポーターを含むように多能性非ヒト動物細胞のゲノムを改変するステップであって、前記ＣＲＩＳＰＲリポーターが、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列の間の核酸のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性切り出しを評価するためのものであり、前記ＣＲＩＳＰＲリポーターが、前記第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列によって挟まれた第１のポリアデニル化シグナル、次いで、第１のリポータータンパク質のコード配列と、第２のリポータータンパク質のコード配列とを任意の順序で含むリポーターカセットを含み、前記第１のリポータータンパク質と前記第２のリポータータンパク質とが異なっている、ステップ；
    （ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲリポーターを含む遺伝子改変された多能性非ヒト動物細胞を同定または選択するステップ；
    （ｃ）前記遺伝子改変された多能性非ヒト動物細胞を、非ヒト動物宿主胚に導入するステップ；および
    （ｄ）代理母に前記非ヒト動物宿主胚を埋め込み、懐胎させるステップ
    を含む、方法。
  78. 請求項１から３０のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製するための方法であって、
    （ａ）標的ゲノム遺伝子座に組み込まれたＣＲＩＳＰＲリポーターを含むように非ヒト動物の１細胞期胚のゲノムを改変するステップであって、前記ＣＲＩＳＰＲリポーターが、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列の間の核酸のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導性切り出しを評価するためのものであり、前記ＣＲＩＳＰＲリポーターが、前記第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列によって挟まれた第１のポリアデニル化シグナル、次いで、第１のリポータータンパク質のコード配列と、第２のリポータータンパク質のコード配列とを任意の順序で含むリポーターカセットを含み、前記第１のリポータータンパク質と前記第２のリポータータンパク質とが異なっている、ステップ；
    （ｂ）遺伝子改変された非ヒト動物の１細胞期胚を選択するステップ；および
    （ｃ）代理母に前記遺伝子改変された非ヒト動物の１細胞期胚を埋め込み、懐胎させるステップ
    を含む、方法。
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