KR102209330B1 - 이식 유전자 발현의 조절을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

분비 조직 내 안전한 잠복처 좌위로부터 이식 유전자를 발현시키기 위한 뉴클레아제, 및 이러한 뉴클레아제의 사용 방법, 및 이로부터 유래한 클론 및 동물.

Description

이식 유전자 발현의 조절을 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR REFULATION OF TRANSGENE EXPRESSION}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 미국 가출원 제61/537,349호(출원일: 2011년 9월 21일); 미국 가출원 제61/560,506호(출원일: 2011년 11월 16일); 및 미국 가출원 제61/670,490호(출원일: 2012년 7월 11일)의 이익을 주장하며, 이들의 개시 내용은 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
기술분야
본 개시 내용은 게놈 편집의 분야에 속한다.
유전자 치료는 인간 치료법의 새로운 시대를 위한 엄청난 잠재력을 가지고 있다. 이들 방법론은 표준 의료 행위에 의해 다루어질 수 없었던 병태에 대한 치료를 가능하게 할 것이다. 유전자 치료는 이식 유전자에 융합된 특이적인 외인성 프로모터에 의해, 또는 게놈 내로의 삽입 위치에서 발견되는 내인성 프로모터에 의해 제어될 수 있는, 유전자 좌위의 붕괴 또는 교정, 및 발현가능한 이식 유전자의 삽입과 같은 게놈 편집 기법의 다수의 변형을 포함할 수 있다.
이식 유전자의 전달 및 삽입은 이러한 기술의 임의의 실제 구현을 위해 해결되어야 하는 장애물의 예이다. 예를 들어, 다양한 유전자 전달 방법이 치료적 용도에 잠재적으로 이용가능하지만, 모두 발현의 수준과 안정성, 지속성 사이에서 상당한 트레이드오프(tradeoff)를 수반한다. 에피솜(예를 들어, 염기성 아데노바이러스, AAV 및 플라스미드 기반 시스템)으로서 이식 유전자를 제공하는 방법은 대체로 안전하며, 높은 초기 발현 수준을 가져올 수 있지만, 이들 방법은 활발한 에피솜 복제가 결여되며, 이는 유사 분열 활성 조직에서 발현의 지속 기간을 제한할 수 있다. 반면, 원하는 이식 유전자의 무작위적인 통합(예를 들어, 렌티바이러스를 통합하는 것)을 가져오는 전달 방법은 더 지속적인 발현을 제공하지만, 무작위적인 삽입의 비표적화 성질로 인하여 수용 세포에서 조절되지 않는 성장을 유발할 수 있으며, 이는 잠재적으로 무작위적으로 통합된 이식 유전자 카세트의 부근에서 발암유전자의 활성화를 통하여 악성 종양으로 이어진다. 게다가, 이식 유전자 통합은 복제로 생기는 손실을 피하지만, 이식 유전자에 융합된 외인성 프로모터의 최종 침묵을 방지하지 않는다. 시간이 지나면서, 이와 같은 침묵은 대부분의 무작위적인 삽입 사건을 위한 이식 유전자 발현의 감소를 가져온다. 추가적으로, 이식 유전자의 통합은 모든 표적 세포에서 거의 일어나지 않으며, 이는 관심이 있는 이식 유전자의 충분히 높은 발현 수준을 달성하여 원하는 치료적 효과를 획득하는 것을 어렵게 만든다.
최근에, 선택된 게놈 좌위로 삽입을 편향하는 위치 특이적 뉴클레아제를 이용한 절단을 사용하는, 이식 유전자 통합을 위한 새로운 전략이 개발되었다(예를 들어, 공유인 미국 특허 제7,888,121호 참조). 이러한 접근법은, 인근 발암유전자의 활성화 또는 유전자 침묵의 위험의 최소화를 위한 정확한 이식 유전자의 위치 선정을 가능하게 하므로, 전형적인 통합 접근법에 비하여 개선된 이식 유전자 발현, 증가된 안정성 및 발현 지속성의 전망을 제공한다.
하나의 접근법은 돌연변이 유전자를 교정하기 위하여 동족 좌위로 이식 유전자의 통합, 예를 들어 내인성 좌위로 야생형 이식 유전자의 삽입을 수반한다. 대안적으로, 이식 유전자는 유익한 특성을 위하여 특별히 선택된 비동족 좌위로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 인자 IX(FIX) 이식 유전자의 표적화 이식에 관한 미국 특허공개 제20120128635호를 참조한다. 내인성 조절 요소에 의해 발휘된 발현 제어를 여전히 유지하면서 내인성 유전자의 발현을 이식 유전자로 대체하고자 하는 경우 동족 좌위를 표적화하는 것은 유용할 수 있다. 내인성 좌위 내 또는 근처에서 절단하는 특이적 뉴클레아제가 사용될 수 있으며, 이식 유전자는 상동성 지정 수선(homology directed repair: HDR)을 통하여 또는 비상동성 말단 연결(non-homologous end joining: NHEJ) 동안 말단 포획에 의해 절단 위치에서 통합될 수 있다. 통합 공정은 공여체와 내인성 좌위 사이의 이식 유전자 공여체에서 상동성 영역의 사용 또는 비사용에 의해 결정된다.
대안적으로, 이식 유전자는 안전한 잠복처 좌위에서 발견되는 프로모터를 이용하거나, 또는 삽입 전에 이식 유전자에 융합되는 외인성 프로모터에 의해 이식 유전자의 발현 조절을 가능하게 할 수 있는 게놈 내 특이적인 "안전한 잠복처" 위치 내로 삽입될 수 있다. 인간 세포에서 AAVS1 및 CCR5 유전자, 및 뮤린 세포에서 Rosa26을 포함하여 이와 같은 "안전한 잠복처" 좌위 몇몇이 기재된 바 있다(예를 들어, 공유인 미국 특허출원 제20080299580호, 제20080159996호 및 제201000218264호 참조). 상기 기재된 바와 같이, 안전한 잠복처에 특이적인 뉴클레아제가 이용되어 이식 유전자 구조체가 HDR-구동 공정 또는 NHEJ-구동 공정에 의해 삽입된다.
유전자 치료의 특히 매력적인 적용은 분비되는 유전자 산물의 부족에 의해 야기되거나 치료용 단백질의 분비에 의해 치료될 수 있는 장애의 치료를 포함한다. 각각의 수용 세포가 치료용 유전자 산물을 높은 수준으로 발현한다면, 이와 같은 장애는 많지 않은 수의 세포로 치료용 이식 유전자의 전달을 통하여 잠재적으로 다루어질 수 있다. 이와 같은 시나리오에서, 다수의 세포로 유전자 전달에 대한 필요성의 경감은 그 이외의 난치성 징후에 대한 유전자 치료의 성공적인 개발을 가능하게 할 수 있다. 이와 같은 적용은 영구적이고 안전하며 매우 높은 수준의 이식 유전자 발현을 필요로 할 것이다. 따라서, 이들 특성을 나타내는 안전한 잠복처의 개발은 유전자 치료 분야에서 상당한 유용성을 제공할 것이다.
상당한 수의 장애는 분비되는 유전자 산물의 부족에 의해 야기되거나, 또는 치료용 단백질의 분비에 의해 치료될 수 있다. 예를 들어, 응고 장애는 응고 연쇄 반응에서 인자가 어떤 방식으로 비정상적인, 즉 돌연변이 단백질의 발현 또는 생산이 부족한 매우 일반적인 유전 장애이다. 대부분의 응고 장애는 혈우병, 예를 들어 혈우병 A(인자 VIII 결핍), 혈우병 B(인자 IX 결핍), 또는 혈우병 C(인자 XI 결핍)를 일으킨다. 이들 장애에 대한 치료는 종종 중증도와 관련된다. 가벼운 혈우병에 있어서 치료는 저발현 인자의 발현을 증가시키도록 설계된 치료법을 수반할 수 있는 반면, 더 심각한 혈우병에 있어서 치료는 출혈 사건을 방지하기 위하여 결여된 응고 인자의 정기적인 주입(보통 주 2~3회)을 포함한다. 중증 혈우병 환자는 종종 다양한 유형의 스포츠에 참여하는 것을 단념하게 하고 일상적인 부상을 피하기 위하여 추가의 예방 조치를 취해야 한다.
알파-1 항트립신(A1AT) 결핍은 혈액과 폐에서 부적절한 A1AT 수준에 이르게 하는 알파 1-항트립신의 부족한 생산에 의해 야기되는 상염색체 열성 질환이다. 이는 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 및 간 장애의 발달과 관련될 수 있다. 현재, 이러한 결핍과 관련된 질환의 치료는 외인성 A1AT의 주입 및 폐 또는 간 이식을 수반할 수 있다.
리소좀 축적병(LSD)은 일반적으로 폐기물 지질, 당단백질 및 뮤코다당류의 분해에 수반되는 기능성 개별 리소좀 단백질의 결핍을 특징으로 하는 희귀한 대사성 단일유전자 질환 군이다. 이들 질환은, 특이적 효소의 오작용으로 인하여 재순환을 위하여 이러한 화합물들을 처리할 수 없으므로, 세포 내 이러한 화합물의 축적을 특징으로 한다. 일반적인 예로는 고셔병(글루코세레브로시다아제 결핍 - 유전자명: GBA), 파브리병(α 갈락토시다제 결핍 - GLA), 헌터병(이두로네이트-2-설파타제 결핍 - IDS), 후를러병(알파-L 이두로니다제 결핍 - IDUA) 및 니만-피크병(스핑고미엘린 포스포다이에스테라제 1 결핍 - SMPD1)을 포함한다. 함께 그룹화할 경우, LSD는 발병률이 출생 인구 7000명 중 약 1명이다. 이들 질환은 이로 고통받는 사람에게 엄청난 영향을 미친다. 이들 질환은 보통 우선 특징적인 얼굴과 신체 성장 패턴을 가질 수 있고 중등도 내지 중증 정신 지체가 있을 수 있는 아기에서 진단된다. 치료 선택권은, 보통 많은 용량으로 정맥 주사를 통하여 결여된 효소가 환자에게 주어지는 효소 보충 요법(ERT)을 포함한다. 이와 같은 치료는 단지 증상만을 치료하고 병을 고치는 것이 아니므로, 따라서 환자는 자신의 나머지 인생 동안 이들 단백질의 반복 투약을 받아야 하고, 잠재적으로 주사된 단백질에 대한 중화 항체를 발현할 수 있다. 종종 이들 단백질은 혈청 반감기가 짧아서, 환자는 또한 상기 단백질의 빈번한 주입을 견디어야 한다. 예를 들어, 세레자임(Cerezyme(등록상표)) 제품(이미글루세라제)을 받는 고셔병 환자는 1주 당 3번 주입받아야 한다. 이 효소의 생산 및 정제 또한 문제가 있어서, 이러한 치료는 매우 비용이 많이 든다(환자 당 년간 100,000달러 초과).
제I형 당뇨병은 췌장 베타 세포의 면역-매개 파괴가 상기 세포의 주요 분비 산물인 인슐린의 심한 결핍을 가져오는 장애이다. 기초 인슐린 수준의 복원은 이 장애의 다수의 더 심각한 합병증의 상당한 경감을 제공하며, 상기 합병증은 거대 혈관을 수반하는 "대혈관" 합병증(허혈성 심질환(협심증 및 심근경색증), 뇌졸증 및 말초 혈관 질환)뿐만 아니라, 작은 혈관에 대한 손상에 의한 "미세혈관" 합병증을 포함할 수 있다. 미세혈관 합병증은 당뇨망막병증을 포함할 수 있는데, 당뇨망막병증은 안구의 망막에서의 혈관 형성에 영향을 미치고, 시각 증상, 시력 감소, 그리고 잠재적으로는 실명, 당뇨병성 신장질환(신장 조직에서 반흔 변환, 소변 중 적은 양 또는 점진적으로 더 많은 양의 단백질의 손실, 및 최종적으로 투석을 필요로 하는 만성 신장 질환을 수반할 수 있음)으로 이어질 수 있다. 당뇨병성 말초신경병증은 다리에서 혈관성 질환과 함께, 발에서 저린 느낌, 아린감 및 통증을 야기하고, 관련된 감염의 결과로서 치료가 어렵고 때때로 절단을 필요로 할 수 있는 당뇨병과 관련된 발 문제(예컨대, 당뇨병성 족부궤양)의 위험의 원인이 된다.
항체는 이의 결합 가소성(binding plasticity)이 다양한 범위의 치료법의 개발을 위하여 활용된 분비되는 단백질 산물이다. 치료용 항체는 질환(예를 들어, 황반변성에서 VEGF)뿐만 아니라, 지속성 및 복제가 호스를 위태롭게 하는 세포(예를 들어, 암 세포뿐만 아니라 자가면역 질환에서 특정 면역 세포)의 매우 선택적인 살해를 직접 야기하는 표적 단백질의 중화에 사용될 수 있다. 이와 같은 적용에서, 치료용 항체는 자신의 항체에 대한 신체의 정상적인 반응을 이용하여 항체의 표적 항원을 보유하는 표적 단백질 또는 세포의 선택적인 살해, 중화, 또는 소거를 달성한다. 따라서 항체 치료는 종양학, 류머티스학, 이식, 및 안질환을 포함하여 다수의 인간 병태에 널리 적용되어 왔다. 항체 치료법의 예로는, 황반변성의 치료를 위한 루센티스(Lucentis(등록상표); 제넨테크(Genentech) 제품), 비호지킨 림프종의 치료를 위한 리툭산(Rituxan(등록상표); 바이오젠 아이덱(Biogen Idec) 제품), 및 유방암의 치료를 위한 헤르셉틴(Herceptin(등록상표); 제넨테크 제품)을 포함한다. 알부민은 간에서 생성되고 혈액으로 분비되는 단백질이다. 인간에서, 혈청 알부민은 혈액 중에서 발견되는 단백질의 60%를 구성하고, 이의 기능은 콜로이드 삼투압을 조절함으로써 혈액 부피를 조절하는 것으로 보인다. 이는 또한 용해도가 낮은 분자, 예를 들어 지용성 호르몬, 담즙염, 유리 지방산, 칼슘 및 트랜스페린을 위한 운반체로서의 역할을 한다. 추가적으로, 혈청 알부민은 와파린, 페노부타존(phenobutazone), 클로피브레이트 및 페니토인을 포함하여 치료제를 운반한다. 인간에서, 알부민 좌위는 고도로 발현되어, 매일 대략 15g의 알부민 단백질을 생성한다. 알부민은 자가 분비 기능이 없으며, 단일 대립유전자성 넉아웃과 관련된 임의의 표현형으로 나타나지 않고 단지 가벼운 표현형 관찰만이 이중 대립유전자성(biallelic) 넉아웃에 대하여 발견된다(문헌[Watkins et al (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:9417] 참조).
알부민은 또한, 치료제의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 치료용 시약과 결합할 때 사용되어 왔다. 예를 들어, Osborn et al(J Pharm Exp Thera (2002) 303(2):540)은 혈청 알부민-인터페론 알파 융합 단백질의 약물동력학을 개시하고, 융합 단백질은 대략 140배 더 느린 소거율을 가져서 융합물의 반감기가 인터페론 알파 단백질 단독에 대한 것보다 18배 더 길었음을 입증하였다. 알부민 융합물인 최근 개발 중인 치료용 단백질의 다른 예로는 알부린-지(Albulin-G(상표명)), 카데바(Cardeva(상표명)) 및 알부그라닌(Albugranin(상표명))(테바 파마슈티컬 인더스트리즈(Teva Pharmaceutical Industries), 각각 인슐린, b형 나트륨이뇨펩타이드(b-type natriuretic), 또는 GCSF에 융합됨), 신크리아(Syncria(등록상표); 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline) 제품, 글루카곤-유사 펩타이드-1에 융합됨) 및 알부페론 α-2B(Albuferon α-2B; IFN-알파에 융합됨)를 포함한다(문헌[Current Opinion in Drug Discovery and Development, (2009), vol 12, No. 2. p. 288] 참조). 이들 경우에서, 알부린-지(상표명), 카데바(상표명) 및 신크리아(등록상표)는 모두 알부민이 융합물의 N-말단 상에서 발견되는 융합 단백질인 반면, 알부그라닌(상표명) 및 알부페론 알파 2G는 알부민이 융합물의 C-말단 상에 있는 융합물이다.
따라서, 임의의 관련 독성을 피하면서 치료적으로 적절한 수준으로 원하는 이식 유전자를 발현하는데 사용될 수 있고, 원하는 조직 유형으로 이식 유전자의 발현을 제한하여, 예를 들어 혈우병, 당뇨병, 리소좀 축적병 및 A1AT 결핍증과 같은 유전병을 치료할 수 있는 추가적인 방법 및 조성물에 대한 필요성이 남아 있다. 추가적으로, 암과 같은 기타 질환의 치료를 위하여 치료적으로 적절한 수준으로 원하는 이식 유전자를 발현하는 추가적인 방법 및 조성물에 대한 필요성이 남아 있다.
이식 유전자의 표적화된 삽입 및 후속적인 발현, 예를 들어 간과 같은 분비 조직으로부터 이식 유전자의 발현을 위하여 세포의 게놈에서 안전한 잠복처를 만들기 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에 개시되어 있다. 일 양태에서, 게놈의 관심 영역(예를 들어, 알부민 유전자)에서 표적 위치에 결합하는 비자연적으로 발생하는 징크 핑거 단백질(zinc-finger protein: ZFP)이 본 명세서에 기재되어 있으며, 여기서 ZFP는 하나 이상의 조작된 징크 핑거 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, ZFP는 관심의 표적 게놈 영역을 절단하는 징크 핑거 뉴클레아제(zinc-finger nuclease: ZFN)이며, 여기서 ZFN은 하나 이상의 조작된 징크 핑거 결합 도메인 및 뉴클레아제 절단 도메인 또는 절단 절반-도메인(half-domain)을 포함한다. 절단 도메인 및 절단 절반-도메인은, 예를 들어 다양한 제한효소 및/또는 호밍 핵산내부가수분해효소(homing endonuclease)로부터 얻을 수 있다. 일 실시형태에서, 절단 절반-도메인은 IIS형 제한효소(예를 들어, Fok I)로부터 유래한다. 임의의 실시형태에서, 징크 핑거 도메인, 예를 들어 표 1, 3, 5 또는 8의 단일 행에 나타낸 바와 같은 순서로 인식 나선형 도메인을 가지는 징크 핑거 단백질은 알부민 유전자에서 표적 위치를 인식한다.
다른 양태에서, 게놈의 관심 영역(예를 들어, 알부민 유전자)에서 표적 위치에 결합하는 전사 활성자인자 유사 효과기(Transcription Activator Like Effector: TALE)가 본 명세서에 기재되어 있으며, 여기서 TALE는 하나 이상의 조작된 TALE 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, TALE는 관심의 표적 게놈 영역을 절단하는 뉴클레아제(TALEN)이며, 여기서 TALEN은 하나 이상의 조작된 TALE DNA 결합 도메인 및 뉴클레아제 절단 도메인 또는 절단 절반-도메인을 포함한다. 절단 도메인 및 절단 절반 도메인은, 예를 들어 다양한 제한효소 및/또는 호밍 핵산내부가수분해효소로부터 얻어질 수 있다. 일 실시형태에서, 절단 절반-도메인은 IIS형 제한효소(예를 들어, Fok I)로부터 유래한다. 임의의 실시형태에서, TALE DNA 결합 도메인, 예를 들어 표 12의 단일 행에 나타낸 표적 서열을 가지는 TALE DNA 결합 도메인은 알부민 유전자에서 표적 위치를 인식한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 ZFN 및/또는 TALEN은, 예를 들어 선도 서열, 비번역순서(trailer sequence) 또는 인트론과 같은 유전자 내 또는 유전자에 인접한 암호화 또는 비암호화 영역, 또는 암호화 영역의 상류 또는 하류의 비전사 영역 내에서 관심의 영역에 결합하고/하거나 이를 절단할 수 있다. 임의의 실시형태에서, ZFN은 알부민 유전자에 결합하고/하거나 이를 절단한다. 다른 실시형태에서, ZFN 및/또는 TALEN은 안전한-잠복처 유전자, 예를 들어 CCR5 유전자, PPP1R12C(또한 AAVS1로도 알려짐) 유전자 또는 Rosa 유전자에 결합하고/하거나 이를 절단한다. 예를 들어, 미국 특허공개 제20080299580호; 제20080159996호 및 제201000218264호를 참조한다. 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 징크 핑거 및/또는 TALE 뉴클레아제 중 하나 이상을 포함하는 조성물이 본 명세서에 기재되어 있다. 임의의 실시형태에서, 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제와 조합하여 하나 이상의 징크 핑거 및/또는 TALE 뉴클레아제를 포함한다.
다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 ZFN 및/또는 TALEN을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 본 명세서에 기재되어 있다. 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어 mRNA일 수 있다. 일부 양태에서, mRNA는 화학적으로 개질될 수 있다(예를 들어, 문헌[Kormann et al, (2011) Nature Biotechnology 29(2):154-157] 참조).
다른 양태에서, 프로모터에 작동가능하게 연결된, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 ZFN 및/또는 TALEN을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 ZFN 및/또는 TALEN 발현 벡터가 본 명세서에 기재되어 있다. 일 실시형태에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 일 양태에서, 바이러스 벡터는 조직 특이적 친화성(tropism)을 나타낸다.
다른 양태에서, 하나 이상의 ZFN 및/또는 TALEN 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 본 명세서에 기재되어 있다. 숙주 세포는 하나 이상의 ZFP 또는 TALEN 발현 벡터로 안정적으로 형질변환 또는 일시적으로 형질감염될 수 있거나 또는 이의 조합일 수 있다. 일 실시형태에서, 숙주 세포는 배아 줄기 세포이다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 ZFP 및/또는 TALEN 발현 벡터는 숙주 세포에서 하나 이상의 ZFN 및/또는 TALEN을 발현한다. 다른 실시형태에서, 숙주 세포는 외인성 폴리뉴클레오타이드 공여체 서열을 추가로 포함할 수 있다. 적당한 숙주 세포의 비제한적인 예로는 진핵 세포 또는 세포주, 예를 들어 분비 세포(예를 들어, 간 세포, 점막 세포, 침샘 세포, 뇌하수체 세포 등), 혈액 세포(적혈구), 줄기 세포 등을 포함한다. 본 명세서에 기재된 실시형태 중 임의의 것에서, 숙주 세포는, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 다른 포유동물 세포 배아의 배아 세포를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 세포 내 알부민 유전자를 절단하기 위한 방법이 본 명세서에 기재되어 있으며, 상기 방법은 세포 내로 ZFN(들) 또는 TALEN(들)이 발현되고 하나 이상의 알부민 유전자가 절단되도록 하는 조건 하에서 하나 이상의 알부민 유전자 내 표적 위치에 결합하는 하나 이상의 ZFN 및/또는 TALEN을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서, 임의의 표적 유전자 내 게놈 서열은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 ZFN 또는 TALEN(또는 상기 ZFN 또는 TALEN을 암호화하는 벡터) 및 ZFN 및/또는 TALEN을 이용하여 표적화된 절단 후 유전자 내로 삽입된 "공여" 서열(예를 들어, 이식 유전자)를 사용하여 대체된다. 공여체 서열은 ZFN 또는 TALEN 벡터에 존재하거나, 별도의 벡터(예를 들어, Ad 또는 LV 벡터)에 존재할 수 있거나, 또는 대안적으로 상이한 핵산 전달 메커니즘을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 표적 좌위(예를 들어, 알부민 유전자, 다른 안전한 잠복처 유전자 등)로 공여체 뉴클레오타이드 서열의 이와 같은 삽입은 표적 좌위(예를 들어, 알부민)의 유전자 제어 요소의 제어 하에서 공여체에 의해 운반되는 이식 유전자의 발현을 가져온다. 일부 양태에서, 예를 들어 알부민 유전자로, 관심의 이식 유전자의 삽입은 온전한 외인성 단백질 서열의 발현을 가져오고 임의의 알부민이 암호화되는 아미노산이 결핍된다. 다른 양태에서, 발현되는 외인성 단백질은 융합 단백질이고, (예를 들어, 내인성 표적 좌위 유래, 또는 대안적으로 이식 유전자 상의 알부민-암호화 서열 유래의) 알부민 유전자에 의해 또는 이식 유전자에 의해 암호화되는 아미노산을 포함한다. 일부 경우에서 알부민 서열은 외인성 단백질의 아미노(N)-말단 부분 상에 존재할 것인 반면, 다른 경우에서 알부민 서열은 외인성 단백질의 카복시(C)-말단 부분 상에 존재할 것이다. 다른 경우에서 알부민 서열은 외인성 단백질의 N-말단 및 C-말단 부분 둘 다에 존재할 것이다. 알부민 서열은 전장 야생형 또는 돌연변이 알부민 서열을 포함할 수 있거나, 또는 대안적으로 부분적인 알부빈 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 임의의 실시형태에서, 알부민 서열(전장 또는 부분)은 융합되는 이식 유전자에 의해 발현되는 폴리펩타이드의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 작용하고/하거나 운반체로서 작용한다. 일부 실시형태에서 알부민-이식 유전자 융합은 세포 내부 내인성 좌위에 위치하는 한편, 다른 실시형태에서 알부민-이식 유전자 암호화 서열은 게놈 내부 안전한 잠복처로 삽입된다. 일부 양태에서, 안전한 잠복처는 AAVS1, Rosa, HPRT 또는 CCR5 좌위로부터 선택된다(공유인 미국 특허공개 제20080299580호, 제20080159996호 및 제201000218264호, 및 미국 가특허출원 제61/556,691호).
다른 양태에서, 본 발명은 생체 내 알부민 프로모터(예를 들어, 내인성 또는 외인성 알부민 프로모터)의 제어 하에서 이식 유전자를 발현하는데 사용될 수 있는 방법 및 조성물을 기재한다. 일부 양태에서, 이식 유전자는 관심의 치료용 단백질을 암호화할 수 있다. 이식 유전자는 본 발명의 방법이 결핍되거나 결여된 단백질의 생성(예를 들어, "단백질 대체")에 사용될 수 있도록 하는 단백질을 암호화할 수 있다. 일부 경우에서, 단백질은 리소좀 축적병에 대한 치료에 수반될 수 있다. 수포성 표피박리증 또는 AAT 결핍 폐기종만큼 다양한 병태를 위한 단백질 치료제를 포함하여 다른 치료용 단백질이 발현될 수 있다. 다른 양태에서, 이식 유전자는 발현되는 단백질이 이 단백질에게 신규하고 바람직한 특성(증가된 반감기, 변화된 혈장 소거 특징 등)을 주는 특징을 갖도록 하는 서열(예를 들어 조작된 서열)을 포함할 수 있다. 조작된 서열은 또한 알부민 서열로부터 유래한 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 이식 유전자는 치료용 단백질, 치료용 호르몬, 혈장 단백질, 항체 등을 암호화한다. 일부 양태에서, 이식 유전자는 응고 장애와 같은 혈액 장애에 수반되는 단백질을 암호화할 수 있다. 일부 양태에서, 이식 유전자는 구조 핵산(shRNAs, miRNAs 등)을 암호화한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 생체내 유전자 이식 동물 시스템에서 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 유전자 이식 동물은 이식 유전자가 인간 유전자를 암호화하는 모델 개발에 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 유전자 이식 동물은 해당하는 내인성 좌위에서 넉아웃될 수 있으며, 이는 인간 단백질이 별개로 연구될 수 있는 생체내 시스템의 개발을 가능하게 한다. 이와 같은 유전자 이식 모델은 관심의 인간 단백질과 상호작용하거나 상기 단백질을 개질시킬 수 있는 소분자, 거대 생체분자 또는 다른 독립체를 동정하는 목적을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 다른 양태에서, 유전자 이식 동물은, 예를 들어 관심의 항체 또는 다른 생체분자를 생산하는 생산 목적을 위해 사용될 수 있다. 임의의 실시형태에서, 동물은 작은 포유동물, 예를 들어 개, 토끼 또는 설치류, 예를 들어 래트, 마우스 또는 기니피그이다. 다른 실시형태에서, 동물은 비인간 영장류이다. 다른 추가의 실시형태에서, 동물은 농장 동물, 예를 들어 소, 염소 또는 돼지이다. 일부 양태에서, 이식 유전자는 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 것에 의해 얻어지는 동물 배아 또는 줄기 세포(예를 들어, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 간 줄기 세포 등)내 선택된 좌위(예를 들어, 알부민 또는 안전한 잠복처) 내로 통합된 후, 살아있는 동물이 태어나도록 배아는 이식된다. 그 후 동물은 성적으로 성숙되고 자손을 생산하는 것을 가능하게 하는데, 여기서 자손의 적어도 일부는 통합된 이식 유전자를 포함한다.
또 추가의 양태에서, 염색체의 내인성 좌위(예를 들어, 알부민 유전자) 내로, 예를 들어 배아의 염색체 내로 핵산 서열의 위치 특이적 통합을 위한 방법이 본 명세서에서 제공된다. 임의의 실시형태에서, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 배아를 (i) 적어도 하나의 DNA 벡터(DNA 벡터는 통합될 핵산 서열에 측접하는 상류 서열 및 하류 서열을 포함함), 및 (ii) 표적 좌위(예를 들어, 알부민 좌위)에서 통합 위치를 인식하는 징크 핑거 및/또는 TALE 뉴클레아제를 암호화하는 적어도 하나의 RNA 분자를 이용하여 주입하는 단계, 및 (b) 핵산 서열을 염색체 내로 통합하기 위하여, 배아를 배양하여 징크 핑거 및/또는 TALE 뉴클레아제의 발현을 가능하게 하는 단계(여기서, 징크 핑거 뉴클레아제 또는 TALEN에 의해 통합 위치로 도입된 이중 가닥 파괴는 DNA 벡터를 이용한 상동 재조합을 통해 수선된다).
적당한 배아는 여러 가지 상이한 척추동물 종, 예를 들어 포유동ㅁㄹ, 조류, 파충류, 양서류, 및 어류 종으로부터 유래할 수 있다. 일반적으로, 적당한 배아는 수집, 주입 및 배양되어 징크 핑거 또는 TALE 뉴클레아제의 발현을 가능하게 할 수 있는 배아이다. 일부 실시형태에서, 적당한 배아는 작은 포유동물(예를 들어, 설치류, 토끼 등), 반려 동물, 가축 및 영장류 유래의 배아를 포함할 수 있다. 설치류의 비제한적인 예로는 마우스, 래트, 햄스터, 게르빌루스쥐, 및 기니피그를 포함할 수 있다. 반려 동물의 비제한적인 예로는 고양이, 개, 토끼, 고슴도치 및 페럿을 포함할 수 있다. 가축의 비제한적인 예로는 말, 염소, 양, 돼지, 라마, 알파카 및 소를 포함할 수 있다. 영장류의 비제한적인 예로는 꼬리감는원숭이, 침팬지, 여우원숭이, 마카크, 마모셋, 타마린, 거미원숭이, 다람쥐원숭이 및 버빗원숭이를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 적당한 배아는 어류, 파충류, 양서류 또는 조류 유래의 배아를 포함할 수 있다. 대안적으로, 적당한 배아는 곤충 배아, 예를 들어 초파리 배아 또는 모기 배아일 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법 또는 조성물 중 임의의 것에서, 조작된 좌위(예를 들어, 알부민 좌위)를 포함하는 세포는 줄기 세포일 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있는 구체적인 줄기 세포 유형은 배아 줄기 세포(ESC), 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 및 간(hepatic) 또는 간(liver) 줄기 세포를 포함한다. iPSC는 환자 샘플 및 정상 대조군으로부터 유래할 수 있는데, 여기서 환자 유래 iPSC는 관심 유전자에서 정상적인 유전자 서열로 돌연변이될 수 있거나, 또는 정상적인 세포가 관심의 유전자에서 공지된 질환 대립 유전자로 변경될 수 있다. 유사하게, 간 줄기 세포는 환자로부터 분리될 수 있다. 그 후, 이러한 세포는 조작되어 관심의 이식 유전자를 발현하고, 확장되며, 그 후 환자 내로 재도입된다.
본 명세서에서 기재된 방법 중 임의의 것에서, 징크 핑거 뉴클레아제(들) 및/또는 TALEN(들)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 DNA, RNA 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 임의의 실시형태에서,폴리뉴클레오타이드는 플라스미드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 mRNA를 포함한다.
또한 적어도 하나의 DNA 벡터(DNA 벡터는 통합될 핵산 서열에 측접하는 상류 서열 및 하류 서열을 포함함), 및 염색체의 통합 위치를 인식하는 징크 핑거 뉴클레아제를 암호화하는 적어도 하나의 RNA 분자를 포함하는 배아가 제공된다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 배아 중 임의의 것으로부터 유래한 유기체가 또한 제공된다(예를 들어, 성적으로 성숙하게 발달하고 자손을 생산할 수 있게 한 배아).
다른 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 약물 라이브러리의 스크리닝에 있어서 세포, 세포주 및 동물(예를 들어, 유전자 이식 동물), 및/또는 응고 인자 장애로 고통받는 동물의 치료에 있어서의 사용을 위한 다른 치료용 조성물(즉, 항체, 구조 RNA 등)의 용도가 제공된다. 이와 같은 스크리닝은 조작된 세포주 또는 1차 세포를 이용하여 세포 수준에서 시작할 수 있고, 전체 동물(예를 들어, 인간)의 치료 수준까지 진행할 수 있다.
본 발명의 ZFP 및/또는 TALEN을 포함하는 키트가 또한 제공된다. 키트는 ZFP 또는 TALEN을 암호화하는 핵산, (예를 들어 적당한 발현 벡터에 함유된 RNA 분자 또는 ZFP 또는 TALEN 암호화 유전자), 공여체 분자, 적당한 숙주 세포주, 본 발명의 방법을 실행하기 위한 설명서 등을 포함할 수 있다.
따라서, 본 명세서에서의 개시 내용은 다음 실시형태를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:
1. 내인성 알부민 유전자 및 절단 도메인에 결합하는 DNA-결합 단백질을 포함하는 비자연적으로 발생하는 융합 단백질로서, 상기 융합 단백질은 내인성 알부민 유전자를 개질시킴.
2. DNA-결합 단백질이 징크 핑거 단백질을 포함하는 것인, 실시형태 1의 융합 단백질.
3. 징크 핑거 단백질이 인식 나선형 영역을 포함하는 4개, 5개 또는 6개의 징크 핑거 도메인을 포함하고, 징크 핑거 단백질은 표 1, 표 3, 표 5 또는 표 8의 단일 행에 나타낸 인식 나선형 영역을 포함하는 것인, 실시형태 2의 융합 단백질.
4. DNA-결합 단백질이 TALE DNA-결합 도메인을 포함하는 것인, 실시형태 1의 융합 단백질.
5. TALE DNA-결합 도메인이 표 12의 단일 행에 나타낸 표적 서열에 결합하는 것인, 실시형태 4의 융합 단백질.
6. 실시형태 1 내지 5의 융합 단백질을 하나 이상 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
7. 실시형태 1 내지 5에 따른 융합 단백질을 하나 이상, 또는 실시형태 6에 따른 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상 포함하는 단리된 세포.
8. 세포가 줄기 세포 또는 배아 세포인 것인, 실시형태 7의 세포.
9. 줄기 세포가 배아 줄기 세포(ESC), 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 간 줄기 세포(hepatic stem cell) 및 간 줄기 세포(liver stem cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 실시형태 8의 세포.
10. 실시형태 1 내지 5에 따른 융합 단백질 또는 실시형태 6에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 실시형태 7 내지 9에 따른 세포를 포함하는 키트.
11. 세포에서 내인성 알부민 유전자를 절단하는 방법으로서, 상기 방법은 세포 내로 하나 이상의 융합 단백질이 발현되고 알부민 유전자가 절단되도록 하는 조건 하에서 실시형태 6에 따른 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상 포함하는 하나 이상의 발현 벡터를 도입하는 단계를 포함하는 것인 방법.
12. 폴리뉴클레오타이드가 AAV 벡터를 포함하는 것인, 실시형태 11의 방법.
13. 세포가 간 세포인 것인, 실시형태 11의 방법.
14. 내인성 알부민 유전자 내로 이식 유전자를 도입하는 방법으로서, 상기 방법은 이식 유전자가 내인성 알부민 유전자 내로 통합되도록 이식 유전자를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오타이드의 존재 하에서 실시형태 15 내지 17 중 임의의 것의 방법에 따른 내인성 알부민 유전자를 절단하는 단계를 포함하는 것인 방법.
15. 이식 유전자가 치료용 단백질을 발현하는 것인, 실시형태 14의 방법.
16. 치료용 단백질이 리소좀 축적병, 수포성 표피박리증, AAT 결핍 폐기종 또는 응고 장애와 같은 혈약 장애를 치료하는데 수반되는 것인, 실시형태 15의 방법.
17. 이식 유전자의 발현이 내인성 알부민 제어 서열에 의해 구동되는 것인, 실시형태 15 또는 16의 방법.
18. 이식 유전자가 알부민 서열을 추가로 포함하는 것인, 실시형태 15 내지 17 중 임의의 것의 방법.
19. 알부민 서열이 단백질의 아미노(N)-말단 및/또는 카복시(C)-말단 부분 상에 존재하는 것인, 실시형태 18의 방법.
20. 내인성 알부민 유전자 내로 통합되는 이식 유전자로부터 발현되는 폴리펩타이드의 혈청 반감기를 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 실시형태 18 또는 실시형태 19의 방법에 따라서 내인성 알부민 유전자 내로 이식 유전자를 도입하는 단계를 포함하되, 상기 이식 유전자는 폴리펩타이드의 혈청 반감기가 증가되도록 폴리펩타이드 및 알부민 서열을 발현하는 것인 방법.
21. 폴리펩타이드의 결핍에 의해 야기되는 질환이 있는 개체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 이식 유전자가 단리된 세포에서 발현되도록 실시형태 14 내지 19의 방법에 따라서 단리된 세포 내로 폴리펩타이드를 암호화하는 이식 유전자를 도입하는 단계; 및 피험체 내로 단리된 세포를 도입함으로써 질환을 치료하는 단계를 포함하는 방법.
22. 세포가 간 세포 또는 줄기 세포인 것인, 실시형태 21의 방법.
23. 줄기 세포가 배아 줄기 세포(ESC), 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 간 줄기 세포(hepatic stem cell) 및 간 줄기 세포(liver stem cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 실시형태 22의 세포.
이들 양태 및 다른 양태는 개시 내용을 전체로서 고려하여 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
도 1, 패널 A 및 B는 내인성 염색체 표적의 ZFN 절단 후 NHEJ를 통한 불완전한 수선은 표적화된 좌위의 작은 삽입 또는 결실("삽입결실(indel)")을 가져온 정도까지 그 정도를 정량화하는 Cel-I 미스매치 분석(서베이어(Surveyor(상표명)), 트랜스제노믹(Transgenomic))의 결과를 도시하는 겔이다. 분석의 설명에 대하여는 문헌[Horton et al. Methods Mol Biol. (2010) 649:247-56]을 참조한다. 도 1a는 Neuro2A 세포로 형질감염된 마우스 알부민 유전자로 표적화된 ZFN에 대한 발현 구조체를 사용한 결과를 나타내는데, 여기서 상기 세포는 형질감염 후 37℃에서 3일 동안 처치된 후, Cel-I 분석을 통하여 개질된 표적 위치의 분획물에 대하여 분석되었다. 도 1b는 세포가 형질감염 후 성장하는 3일 동안 저온 충격(30℃)을 받게 되는 것을 제외하고, 도 1a와 동일한 ZFN과 세포에 대한 결과를 나타낸다. 레인의 하단에 나타낸 미스매치 백분율, 또는 % 삽입결실은 ZFN 활성의 측정값이고 마우스 알부민 특이적 ZFN이 Neuro 2A 세포에서 내인성 염색체 표적의 절단 후 최대 53%의 삽입결실을 유도할 수 있음을 입증한다.
도 2, 패널 A 및 B는 플라스미드 DNA의 2가지 농도, 즉 20 또는 40ng으로 개 알부민 특이적 ZFN 쌍 SBS 33115/SBS34077을 발현하는 구조체로 형질감염된 개 D17 세포에 대하여 수행한 Cel-I 미스매치 분석의 결과를 도시하는 겔이다. 도 2A는 3을 후의 결과를 나타내는 반면, 도 2B는 10일 후의 결과를 나타낸다. ZFN 쌍은 제3일에 표적 위치 서열의 약 25~30%로 삽입결실을 유도할 수 있었다.
도 3, 패널 a 및 b는 관심의 다양한 종으로부터의 알부민 유전자의 정렬을 나타낸다. 도 3a는 인간(H. 사피엔스(H. sapiens), 서열번호 160), 붉은털 짧은꼬리 원숭이(rhesus macaque monkey)(M. 물라타(M. mulatta), 서열번호 73), 마모셋(C. 자쿠스(C. jacchus), 서열번호 74), 개(C. 파밀리아리스(C. familiaris), 서열번호 75), 래트(R. 노르베기쿠스(R. norvegicus), 서열번호 75) 및 마우스(M. 무스쿨루스(M. musculus), 서열번호 76)의 엑손 1 및 인트론 1의 5' 영역의 정렬을 나타낸다. 3b는, ZFN 표적화를 위해 선택된 알부민 유전자 내 좌위인 인트론 1의 나머지 및 엑손 2의 작은 단편의 정렬을 나타낸다. 이 영역은 인간(서열번호 161), 붉은털 짧은꼬리 원숭이(서열번호 77), 마모셋(서열번호 78), 개(서열번호 79), 래트(서열번호 80) 및 마우스(M. 무스쿨루스 , 서열번호 81)의 좌위 1 내지 좌위 5를 포함한다. 도시된 서열은 개시 코돈 ATG(도 3a의 큰 박스) 및 엑손 1 및 인트론 1의 경계선(도 3a), 및 인트론 1 및 엑손 2(도 3b)를 나타낸다.
도 4, 패널 A 및 B는 간영양성(hepatotrophic) AAV8 벡터로부터 발현된 알부민-특이적 ZFN으로 주입된 마우스로부터 생검된 간 조직 유래의 게놈 DNA에 대하여 수행된 Cel-I 미스매치 분석의 결과를 도시한다. 결과는 ZFN 쌍의 2개 세트(쌍 1: SBS30724와 SBS30725, 및 쌍 2: SBS30872와 SBS30873)가 꼬리 정맥 주사를 통하여 정맥 내로 주사된 10마리의 야생형 마우스(번호 273~282)로부터의 것이다. 도 4A는 쌍 1 위치를 포함하는 앰플리콘에 존재하는 삽입결실을 정량화하는 겔이고, 도 4B는 쌍 2 위치를 포함하는 앰플리콘에 존재하는 삽입결실을 정량화하는 다른 겔이다. 간 생검에서 ZFN-유도 개질을 보유하는 알부민 유전자의 백분율은 레인의 하단에 표시되어 있고, 알부민 ZFN 쌍은 뉴클레아제가 생체내로 전달될 때 표적의 최대 17%까지 개질할 수 있음을 입증한다.
도 5, 패널 A 및 B는 상이한 키메라 AAV 벡터로부터 발현된 알부민-특이적 ZFN으로 주입된 마우스로부터 생검된 간 조직 유래의 게놈 DNA에 대하여 수행된 Cel-I 미스매치 분석의 결과를 나타낸다. 실험의 상세 내용은 실시예 5에 제공되어 있다. 도 5A는 ZFN이 AAV-매개 유전자 전달을 통하여 동물 내로 도입될 때 생체내 간에서 알부민 표적을 절단할 수 있음을 입증한다. 간 생검에서 ZFN-유도 개질을 보유하는 알부민 유전자의 백분율은 최대 16%까지의 범위에 있었다. 도 5B는 항-플래그 항체 또는 항-p65를 사용한 간 조직의 웨스턴 블롯을 나타낸다. ZFN을 암호화하는 오픈 리딩 프레임은 폴리펩타이드 플래그-태그를 암호화하는 서열에 융합되었다. 따라서, 항-플래그 항체는 ZFN을 검출하였고, ZFN을 받은 마우스에서 ZFN 발현을 입증하였다. 항-p65 항체는 이들 실험에서 로딩 대조군으로서의 역할을 하였으며, 비슷한 양의 단백질이 각각의 레인에 로딩되었음을 나타내었다.
도 6은 상이한 용량의 상이한 AAV 혈청형의 전달을 통하여 마우스 알부민 특이적 ZFN 쌍 30724/30725로 처치된 후, Cel-I 분석을 사용하여 유전자 개질에 대하여 평가된 마우스의 그룹에서 마우스 연구의 결과를 나타낸다. 이 연구에서 시험된 AAV 혈청형은 AAV2/5, AAV2/6, AAV2/8.2 및 AAV2/8(상세 내용에 대하여는 본문 참조). 용량 수준은 5e10 바이러스 게놈으로부터 1e12 바이러스 게놈까지의 범위이었으며, 그룹 당 3마리의 마우스를 주사하였다. 또한 2배체 세포 당 존재하는 바이러스 게놈을 계산하였으며, 이는 각각의 레인의 하단에 표시되어 있다. 각각의 처치에 의해 유도된 삽입결실 백분율은 또한 각각의 레인의 아래에 표시되어 있으며, 이러한 ZFN 쌍은 알부민 좌위를 절단할 수 있음을 입증한다. 대조군 마우스는 인산 완충 식염수가 주사되었다. 비특이적 밴드가 또한 도면에 도시되어 있다.
도 7은 생체내 마우스 알부민 좌위로 삽입된 이식 유전자로부터의 인간 인자 IX(F.IX)의 발현을 도시하는 그래프이다. 인간 F.IX 공여체 이식 유전자는 야생형 마우스에서 마우스 알부민-특이적 ZFN으로 절단 후 인트론 1 또는 인트론 12에서 마우스 알부민 유전자화로 삽입되었다. 그래프는 벡터의 주사 후 8주의 기간에걸쳐서 F.IX의 발현 수준을 나타낸다. 마우스 알부민의 인트론 1 또는 인트론 12를 표적화하는 ZFN 쌍뿐만 아니라 대조군으로서 인간 유전자에 대하여 표적화된 ZFN이 이 실험에서 사용되었다. 공여체 F.IX 유전자는 인트론 1로의 삽입 후 사용되도록 설계되었고, 따라서 인트론 12로 삽입될 때는 적절하게 발현되지 않는다. 인간 F.IX 이식 유전자는 마우스 알부민 인트론 1 좌위로 삽입 후 적어도 8주 동안 활발한 수준으로 발현된다.
도 8, 패널 A 및 B는 ZFN-유도 F.IX 이식 유전자 삽입 후 혈우병 마우스의 혈장에서 인간 F.IX 유전자의 발현 및 기능성을 도시하는 그래프이다. 알부민 인트론 1 특이적 ZFN 및 인간 F.IX 공여체를 사용하여 도 7에 기재된 실험을 혈우병 마우스에서 반복하였다. 처치 후 2주 째에, 혈청에서의 발현 수준(도 8A) 및 응고 시간(도 8B)를 분석하였다. 혈우병 마우스에서 인간 F.IX 이식 유전자의 발현은 정상적인 마우스의 수준으로 응고 시간을 회복시킬 수 있었다.
도 9(서열번호 82)는 엑손 1과 인트론 1의 부분을 포함하는 인간 알부민 유전자 서열의 분절을 제공한다. 서열에 걸친 수평 막대는 징크 핑거 뉴클레아제의 표적 위치를 나타낸다.
도 10은 인간인 H. 사피엔스(서열번호 154), 게먹이 원숭이 변종(cynologous monkey variant)(여기서 'C' 및 'S'는 2개의 상이한 게놈 서열 공급원으로부터 유래함): M. 파실쿨라리스 _c(M. fascicularis_c, 서열번호 155) 및 M. 파실쿨라리스 _s(M. fascicularis_s, 서열번호 156) 및 붉은털 원숭이인 M. 물라타(서열번호 157)을 포함하여 다양한 영장류 종 유래의 인트론 1에서 알부민 유전자의 분절의 정렬을 나타낸다. 상기 도면은 알부민 특이적 TALEN의 DNA 표적 위치를 나타낸다(서열 위의 수평 막대에 의해 나타내어짐).
도 11, 패널 a 내지 c는 인간 알부민에 대하여 표적화된 ZFN 또는 TALEN으로 처치된 HepG2 세포로부터 단리된 게놈 DNA에 대하여 수행된 Cel-I 분석의 결과(도 11a 및 도 11b) 및 상이한 갭 공간을 가지는 TALEN의 NHEJ 활성(도 11c)을 나타낸다. 뉴클레아제는 일시적인 플라스미드 형질감염을 통하여 HepG2 세포로 도입되었으며, Cel-I 분석을 통하여 표적 개질에 대하여 3일 후에 정량화되었다. TALE DNA 결합 도메인의 2가지 변형이 사용되었으며, 상기 변형은 C-말단 절단 지점의 위치, 즉 +17 형태 및 +63 형태에서 상이하였다(본문 참조). 사용된 쌍은 표 10에 기재되어 있다. 추가적으로, 3개의 ZFN 쌍이 또한 시험되었으며, Cel 1 분석에 의해 검출된 삽입결실 %는 레인의 하단에 표시되어 있다. 도 11c는 TALEN 결합 위치 사이의 갭 공간(bp)의 관점에서 NHEJ 활성을 도시하는 그래프이다.
도 12, 패널 A, B 및 C는 붉은털 짧은꼬리 원숭이 알부민 좌위에 관한 ZFN 쌍의 결과를 도시한다. 도 12A는, 400ng의 ZFN 농도를 사용하여 수행한 3가지의 독립적인 모든 실험의 RF/6A 세포에서 시험된 35396/36797와 비교하여 35396/36806 쌍에 대한 NHEJ 활성의 백분율을 나타낸다. 도 12B는 각각의 ZFN의 50ng 내지 400ng에서 2개의 쌍에 대한 용량 적정을 나타내며, 여기서 샘플은 절단 후 제3일에 분석되었다. 도 12B의 하반부는 ZFN 400ng을 사용하여 제3일 또는 제10일에 2개의 쌍을 비교하는 다른 실험을 도시한다. 도 12C는 비교될 3개의 ZFN의 SELEX 분석(100mM 염 농도로 수행됨)의 결과를 도시하는데, 여기서 중앙선 위의 막대 크기는 예상된 위치에 대한 결과를 나타내는 반면(즉, 상기 선 위 1.0의 값을 가지는 단일 막대는 SELEX 분석에서 분석된 위치에서의 모든 염기가 예상된 염기였음을 의미할 것임), 상기 선 아래의 막대는 예상되지 않은 염기의 존재를 나타낸다. 나누어진 막대는 다른 염기의 상대적인 기여를 나타낸다.
도 13, 패널 A 및 B는 마우스에서 알부민 좌위로 huGLa 이식 유전자 공여체(파브리병으로 고통받는 환자에서 결핍됨)의 삽입을 입증한다. 도 13A는 이식 유전제에 의해 암호화된 huGLa 단백질에 대한 웨스턴 블롯을 나타내는데, 여기서 화살표는 추정된 단백질을 나타낸다. ZFN과 공여체(샘플 1-1, 1-2 및 1-3) 둘 다를 받은 마우스 유래 마우스 샘플과 ZFN만을 받은 샘플(4-1, 4-2, 4-3) 또는 huGLa 공여체("hu 파브리 공여체")만을 받은 샘플(샘플 5-1 및 5-2)과의 비교로 인간 간 용해물 대조군과 일치하는 밴드의 확인에 이르게 된다. 도 13B는 huGLa 특이적 ELISA 키트를 사용한 ELISA 결과를 도시하는데, 여기서 샘플은 바이러스 도입 후 제14일 또는 제30일에 마우스로부터 분석하였다(상세 내용에 대하여는 본문 참조). 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다(n=3). 결과는 ZFN 및 공여체 둘 다를 받은 마우스가 ZFN만을 받은 마우스 또는 공여체만을 받은 마우스보다 더 높은 양의 huGLa 신호를 가짐을 입증한다.
예를 들어 분비 조직에서 이식 유전자를 발현하기 위하여, 내인성 알부민 유전자를 개질하기 위한 조성물 및 방법이 본 명세서에 개시되어 있다. 일부 실시형태에서, 이식 유전자는 내인성 알부민 유전자로 삽입되어 또한 간 조직에 제한된 매우 높은 발현 수준을 가능하게 한다. 이식 유전자는 치료 이익을 제공하는 것을 포함하여 임의의 단백질 또는 펩타이드를 암호화할 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 분비 조직에서 고도로 발현되는 좌위로부터 치료적으로 유익한 단백질(이식 유전자 유래)을 발현하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이식 유전자는 혈액의 장애, 예를 들어 응고 장애, 및 다양한 다른 단일 유전자 질환에 수반되는 단백질을 암호화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이식 유전자는, 이식 유전자의 발현이 알부민 발현 제어 요소에 의해 제어되어 고농도로 이식 유전자 암호화 단백질의 간-특이적 발현을 가져오도록 내인성 알부민 좌위로 삽입될 수 있다. 발현될 수 있는 단백질은 응고 인자, 예컨대 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XIII, vWF 등, 항체, 리소좀 축적병에 관련된 단백질, 인슐린, 알파 1-항트립신, 및 정말로 이렇게 발현될 때 이익을 제공하는 임의의 펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다.
추가적으로, 임의의 이식 유전자는 궁극적으로 분비 조직 내로의 이식에서의 사용을 위하여 환자 유래 세포, 예를 들어 환자 유래 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 또는 다른 유형의 줄기 세포(비제한적 세트로서 배아, 조혈, 신경 또는 중간엽)로 도입될 수 있다. 이식 유전자는 이들 세포에서 관신의 임의의 영역으로, 예를 들어 알부민 유전자 또는 안전한 잠복처 유전자(이에 제한되는 것은 아님)로 도입될 수 있다. 이들 변경된 줄기 세포는 예를 들어 간세포로 분화되고 간으로 이식될 수 있다. 대안적으로, 이식 유전자는 특이적 조직을 표적화하는 바이러스 또는 다른 전달 시스템의 사용을 통하여 원하는 대로 분비 조직으로 보내질 수 있다. 예를 들어, 전달 비히클로서 간-영양성(liver-trophic) 아데노바이러스 관련 바이러스(adenovirus associated virus: AAV) 벡터 AAV8의 사용으로, 특이적 뉴클레아제가 이식 유전자와 함께 동시 전달될 때 원하는 좌위에서 이식 유전자의 통합을 가져올 수 있다.
총론
방법의 실시뿐만 아니라 본 명세서에 개시된 조성물의 제조 및 사용은 달리 표시되어 있지 않다면 분자 생물학, 생화학, 염색질 구조 및 분석, 컴퓨터 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 및 당업계의 기분 범위 내에 있는 바와 같은 관련 분야에서 통상적인 기법을 이용한다. 이들 기법은 문헌에 충분하게 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 및 Third edition, 2001]; [Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 및 정기적인 최신판]; [METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego] 시리즈; [Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998]; [METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999]; 및 [METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999]을 참조한다.
정의
용어 "핵산", "폴리뉴클레오타이드", 및 "올리고뉴클레오타이드"는 상호교환적으로 사용되며, 선형 또는 환형 형태, 및 단일 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중합체를 말한다. 본 개시 내용의 목적을 위하여, 이들 용어는 중합체의 길이에 대한 제한으로서 해석되어서는 안 된다. 용어는 자연적인 뉴클레오타이드의 공지된 유사체뿐만 아니라 염기, 당 및/또는 인산염 모이어티(예를 들어, 포스포로티오에이트 주쇄)에서 개질된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오타이드의 유사체는 동일한 염기쌍형성 특이성을 가지며; 즉 A의 유사체는 T와 염기쌍을 형성할 것이다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 말하는데 상호교환적으로 사용된다. 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 해당하는 자연적으로 발생하는 아미노산의 화학적 유사체 또는 개질된 유도체인 아미노산 중합체에 적용된다.
"결합"은 고분자 사이(예를 들어, 단백질과 핵산 사이)의 서열-특이적인, 비공유 상호작용을 말한다. 전체로서 상호작용이 서열-특이적인 한, 결합 상호작용의 모든 요소가 서열-특이적(예를 들어, DNA 주쇄에서 인산염 잔기와 접촉)일 필요는 없다. 이와 같은 상호 작용은 일반적으로 10-6　M-1 이하의 해리 상수(Kd)를 특징으로 한다. "친화성"은 결합 강도를 말하며: 증가된 결합 친화성은 더 낮은 Kd 값과 관련이 있다.
"결합 단백질"은 다른 분자에 비공유적으로 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은 예를 들어 DNA 분자(DNA-결합 단백질), RNA 분자(RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자(단백질-결합 단백질)에 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우에, 이는 그 자체에 결합(동종이량체, 동종삼량체 등을 형성함)할 수 있고/있거나, 상이한 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자에 결합할 수 있다. 결합 단백질은 하나 초과 유형의 결합 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 징크 핑거 단백질은 DNA-결합, RNA-결합 및 단백질-결합 활성을 가진다.
"징크 핑거 DNA 결합 단백질"(또는 결합 도메인)은 하나 이상의 징크 핑거를 통하여 서열-특이적 방식으로 DNA와 결합하는, 단백질 또는 더 큰 단백질 내 도메인이며, 상기 징크 핑거는 구조가 아연 이온의 배위를 통하여 안정화되는 결합 도메인 내부 아미노산 서열의 영역이다. 용어 징크 핑거 DNA 결합 단백질은 종종 징크 핑거 단백질 또는 ZFP로 축약된다.
"TALE DNA 결합 도메인" 또는 "TALE"는 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위를 포함하는 폴리펩타이드이다. 반복 도메인은 TALE의 동족 표적 DNA 서열에 TALE의 결합에 수반된다. 단일 "반복 단위"(또한 "반복체"로서 지칭되기도 함)는 전형적으로 길이가 33~35개 아미노산이고, 자연적으로 발생하는 TALE 단백질 내에서 다른 TALE 반복 서열과 적어도 일부 서열 상동성을 나타낸다. 예를 들어, 미국 특허공개 제20110301073호를 참조하며, 이는 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
징크 핑거 및 TALE 결합 도메인은, 예를 들어 자연적으로 발생하는 징크 핑거 또는 TALE 단백질의 인식 나선형 영역의 조작(하나 이상의 아미노산을 변경)하는 것을 통하여 "조작"되어 미리 결정된 뉴클레오타이드 서열에 결합할 수 있다. 그러므로, 조작된 DNA 결합 단백질(징크 핑거 또는 TALE)은 비자연적으로 발생하는 단백질이다. DNA-결합 단백질을 조작하기 위한 방법의 비제한적인 예는 설계 및 선택이다. 설계된 DNA 결합 단백질은, 설계/조성물이 주로 합리적인 기준에서 생기는 자연에서 발생하지 않는 단백질이다. 설계에 대한 합리적인 기준은 기존 ZFP 및/또는 TALE 설계 및 결합 데이터의 정보를 저장하는 데이터베이스에서 정보를 처리하기 위한 컴퓨터화된 알고리즘 및 치환 규칙의 적용을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제6,140,081호; 제6,453,242호; 및 제6,534,261호를 참조하고; 또한 WO　제98/53058호; WO　제98/53059호; WO　제98/53060호; WO　제02/016536호 및 WO　제03/016496호 및 미국 공개 제20110301073호를 참조한다.
"선택된" 징크 핑거 단백질 또는 TALE는 생성이 주로 경험적 공정, 예컨대 파지 디스플레이, 상호작용 트랩(interaction trap) 또는 잡종 선택에서 생기는 자연에서 발견되지 않는 단백질이다. 예를 들어, US　제5,789,538호; US 제5,925,523호; US　제6,007,988호; US　제6,013,453호; US 제6,200,759호; WO　제95/19431호; WO　제96/06166호; WO　제98/53057호; WO　제98/54311호; WO　제00/27878호; WO　제01/60970호; WO　제01/88197호; WO　제02/099084호 및 미국 공개 제20110301073호를 참조한다.
"재조합"은 2개의 폴리뉴클레오타이드 사이 유전자 정보의 교환 공정을 말한다. 이러한 개시 내용의 목적을 위하여, "상동성 재조합(HR)"은, 예를 들어 상동성 지정 수선 메커니즘을 통하여 세포에서 이중 가닥 파괴의 수선 동안 일어나는 이와 같은 교환의 특수 형태를 말한다. 이러한 공정은 공여체로부터 표적으로 유전자 정보의 전달에 이르게 하기 때문에, 뉴클레오타이드 서열 상동성을 필요로 하고, "표적" 분자(즉, 이중 가닥 파괴를 겪은 것)의 주형 수선에 대한 "공여" 분자를 사용하며, "비교차 유전자 전환" 또는 "짧은 구역(short tract) 유전자 전환"으로 다양하게 공지되어 있다. 임의의 특정 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 이와 같은 전달은 파괴된 표적과 공여체 사이에서 형성되는 이형이중가닥 DNA의 미스매치 교정, 및/또는 "합성-의존성 가닥 어닐링"(여기서, 공여체는 표적의 일부가 될 유전자 정보를 재합성하는데 사용됨), 및/또는 관련 공정을 수반할 수 있다. 이와 같은 특수 HR은 종종 표적 분자의 서열의 변경을 가져와서 공여체 폴리뉴클레오타이드의 서열의 일부 또는 모두 표적 폴리뉴클레오타이드로 통합된다.
본 개시 내용의 방법에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 표적화된 뉴클레아제는 미리 결정된 위치에서 표적 서열(예를 들어, 세포 염색질)에서 이중 가닥 파괴를 형성하며, 파괴된 영역에서 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상동성을 가지는 "공여체" 폴리뉴클레오타이드는 세포 내로 도입될 수 있다. 이중 가닥 파괴의 존재는 공여체 서열의 통합을 용이하게 하는 것으로 나타났다. 공여체 서열은 물리적으로 통합될 수 있거나, 또는 대안적으로 공여체 폴리뉴클레오타이드는 상동성 재조합을 통하여 파괴의 수선을 위하여 주형으로서 사용되어, 세포 염색질 내로 공여체에서와 같이 뉴클레오타이드 서열의 모두 또는 부분의 도입을 가져온다. 따라서, 세포 염색질에서 제1 서열은 변경될 수 있고, 임의의 실시형태에서는 공여체 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 서열로 전환될 수 있다. 따라서, 용어 "대체한다" 또는 "대체"의 사용은 하나의 뉴클레오타이드 서열을 다른 것으로 대체(즉, 정보를 제공하는 의미에서 서열의 대체)하는 것을 나타내는 것으로 이해될 수 있으며, 하나의 폴리뉴클레오타이드를 다른 것으로 물리적 또는 화학적으로 대체하는 것을 반드시 필요로 하는 것은 아니다.
본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 징크-핑거 또는 TALEN 단백질의 추가적인 쌍은 세포 내부 추가적인 표적 위치의 추가적인 이중가닥 절단에 사용될 수 있다.
세포 염색질에서 관심의 영역 내 서열의 표적화된 재조합 및/또는 대체 및/또는 변경을 위한 방법의 임의의 실시형태에서, 염색체 서열은 외인성 "공여체" 뉴클레오타이드 서열을 가지는 상동성인 재조합에 의해 변경된다. 파괴의 영역에 상동성인 서열이 존재한다면, 이와 같은 상동성 재조합은 세포 염색질 내 이중가닥 파괴의 존재에 의해 자극된다.
본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 제1 뉴클레오타이드 서열("공여체 서열")은 관심의 영역에서 게놈 서열과 상동성이지만 동일하지는 않은 서열을 함유할 수 있으며, 이에 의하여 상동성 재조합을 자극하여 관심의 영역에 동일하지 않은 서열을 삽입할 수 있다. 따라서 임의의 실시형태에서, 관심의 영역에서 서열에 상동성인 공여체 서열의 부분은 대체되는 게놈 서열에 대하여 약 80 내지 99%(또는 이 사이의 임의의 값) 서열 동일성을 나타낸다. 다른 실시형태에서, 예를 들어 101개의 인접한 염기쌍에 걸친 공여체와 게놈 서열 사이에서 단 1개의 뉴클레오타이드만 상이하다면, 공여체와 게놈 서열 사이의 상동성은 99%보다 높다. 임의의 경우에서, 새로운 서열이 관심의 영역으로 도입되도록, 공여체 서열의 비상동성 부분은 관심의 영역에 존재하지 않는 서열을 함유할 수 있다. 이들 경우에서, 비상동성 서열은, 관심의 영역에서 서열과 상동성이거나 동일한, 일반적으로 50~1,000개 염기쌍(또는 이 사이의 임의의 정수 값) 또는 1,000 초과의 임의의 수의 염기쌍의 서열에 의해 측접된다. 다른 실시형태에서, 공여체 서열은 제1 서열에 비상동성이고, 비상동성 재조합 메커니즘에 의해 게놈으로 삽입된다.
본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 것은 관심의 유전자(들)의 발현을 방해하는 공여체 서열의 표적화된 통합에 의해 세포 내 하나 이상의 표적 서열의 부분적 또는 완전한 불활성화에 사용될 수 있다. 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 유전자를 가지는 세포주가 또한 제공된다.
또한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적화된 통합의 방법은 또한 하나 이상의 외인성 서열을 통합하는데 사용될 수 있다. 외인성 핵산 서열은, 예를 들어 하나 이상의 유전자 또는 cDNA 분자, 또는 암호화 또는 비암호화 서열의 임의의 유형뿐만 아니라 하나 이상의 대조군 요소(예를 들어, 프로모터)를 포함할 수 있다. 추가적으로, 외인성 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 분자(예를 들어, 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 억제 RNA(RNAi), 마이크로RNA(miRNA) 등)를 생성할 수 있다.
"절단"은 DNA 분자의 공유결합한 주쇄의 파괴를 말한다. 절단은 다양한 방법, 예를 들어 인산다이에스터 결합의 효소 또는 화학적 가수분해(이에 제한되는 것은 아님)에 의해 개시될 수 있다. 단일가닥 절단 및 이중가닥 절단 둘 다 가능하며, 이중가닥 절단은 2개의 별개의 단일가닥 절단 사건의 결과로서 일어날 수 있다. DNA 절단은 평활 말단 또는 엇갈린 말단(staggered end)의 생성을 가져올 수 있다. 임의의 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드는 표적화된 이중가닥 DNA 절단에 사용된다.
"절단 절반-도메인"은 제2 폴리펩타이드(동일 또는 상이함)와 함께 절단 활성(바람직하게는 이중가닥 절단 활성)을 가지는 복합체를 형성하는 폴리펩타이드 서열이다. 용어 "제1 및 제2 절단 절반-도메인"; "+ 및 - 절단 절반-도메인" 및 "우측 및 좌측 절단 절반-도메인"은 이량체화되는 절단 절반-도메인의 쌍을 말하는데 상호교환적으로 사용된다.
"조작된 절단 절반-도메인"은, 다른 절단 절반-도메인(예를 들어 다른 조작된 절단 절반-도메인)과 함께 절대적인 이종이량체를 형성하도록 개질된 절단 절반-도메인이다. 또한, 미국 특허공개 제2005/0064474호, 제20070218528호, 제2008/0131962호 및 제2011/0201055호를 참조하며, 이들은 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
용어 "서열"은 임의의 길이의 뉴클레오타이드 서열을 말하며, 이는 DNA 또는 RNA일 수 있고; 선형, 환형 또는 분지형일 수 있으며 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다. 용어 "공여체 서열"은 게놈으로 삽입되는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 공여체 서열은 임의의 길이, 예를 들어 길이가 2개 내지 10,000개 뉴클레오타이드(또는 이 사이 또는 이것 초과의 임의의 정수 값), 바람직하게는 길이가 약 100개 내지 1,000개 뉴클레오타이드(또는 이 사이의 임의의 정수), 더 바람직하게는 길이가 약 200개 내지 500개 뉴클레오타이드를 가질 수 있다.
"염색질"은 세포 게놈을 포함하는 핵단백질 구조이다. 세포 염색질은 색한, 주로 DNA, 및 단백질, 예를 들어 히스톤 및 비히스톤(non-histone) 염색체 단백질을 포함한다. 대부분의 진핵 세포 염색질은 뉴클레오솜의 형태로 존재하며, 여기서 뉴클레오솜 핵은 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4를 각각 2개씩 포함하는 팔량체와 회합된 DNA의 대략 150개 염기쌍을 포함하고; (유기체에 따라서 다양한 길이를 가지는) 링커 DNA가 뉴클레오솜 코어 사이에서 확장한다. 히스톤 H1의 분자는 일반적으로 링커 DNA와 회합된다. 본 개시 내용의 목적을 위하여, 용어 "염색질"은 원핵세포 및 진핵세포 둘 다의 모든 유형의 세포 핵단백질을 포함하는 것으로 의미한다. 세포 염색질은 염색체 및 에피솜 염색질을 둘 다 포함한다.
"염색체"는 세포의 게놈의 모두 또는 일부분을 포함하는 염색질 복합체이다. 세포의 게놈은 종종 이의 핵형에 의해 특징지어지며, 핵형은 세포의 게놈을 포함하는 염색체 모두를 수집한 것이다. 세포의 게놈은 하나 이상의 염색체를 포함할 수 있다.
"에피솜"은 복제되는 핵산, 핵단백질 복합체 또는 세포의 염색체 핵형의 부분이 아닌 핵산을 포함하는 다른 구조이다. 에피솜의 예로는 플라스미드 및 특정 바이러스 게놈을 포함한다.
"표적 위치" 또는 "표적 서열"은, 결합을 위한 충분한 조건이 존재한다면, 결합 분자가 결합하는 핵산의 일부분을 한정하는 핵산 서열이다.
"외인성" 분자는 세포에 정상적으로는 존재하지 않지만, 하나 이상의 유전자, 생화학적 또는 다른 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있는 분자이다. "세포 내 정상적인 존재"는 세포의 특정 발달 단계 및 환경 조건에 대하여 측정된다. 따라서, 예를 들어 근육의 배발달 동안에만 존재하는 분자는 성체 근육 세포에 대하여 외인성 분자이다. 유사하게, 열충격에 의해 유도된 분자는 비열충격 세포에 대하여 외인성 분자이다. 외인성 분자는 예를 들어 기능부전 내인성 분자의 기능성 형태 또는 정상적인 기능성 내인성 분자의 기능부전 형태를 포함할 수 있다.
외인성 분자는 그 중에서도 예컨대 조합한 화학 공정에 의해 생성되는 소분자, 또는 고분자, 예를 들어 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지방단백질, 다당류, 상기 분자의 임의의 개질된 유도체, 또는 상기 분자 중 하나 이상을 포함하는 임의의 복합체일 수 있다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하고, 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으며; 선형, 분지형 또는 환형일 수 있고; 임의의 길이를 가질 수 있다. 핵산은 이중복합체(duplex)를 형성할 수 있는 것뿐만 아니라 삼중복합체(triplex)-형성 핵산을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,176,996호 및 제5,422,251호를 참조한다. 단백질은 DNA-결합 단백질, 전사 인자, 염색질 리모델링 인자, 메틸화 DNA 결합 단백질, 중합효소, 메틸라제, 데메틸라제, 아세틸라제, 데아세틸라제, 키나제, 포스파타제, 인테그라제, 재조합효소, 리가제, 토포아이소메라제, 자이라제 및 헬리카제를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
외인성 분자는 내인성 분자와 동일한 유형의 분자, 예를 들어 외인성 단백질 또는 핵산일 수 있다. 예를 들어 외인성 핵산은 감염 바이러스 게놈, 세포 내로 도입되는 플라스미드 또는 에피솜, 또는 세포에 정상적으로 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 세포 내로 외인성 분자의 도입을 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 지질-매개 전달(즉, 리포좀, 예를 들어 및 양이온성 지질), 전기천공, 직접 주사, 세포 융합, 입자 충격, 인산칼슘 공침, DEAE-덱스트란-매개 전달 및 바이러스 벡터-매개 전달을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 외인성 분자는 또한 내인성 분자와 동일한 유형의 분자이지만 세포가 유래한 종과는 상이한 종으로부터 유래한 것일 수 있다. 예를 들어, 인간 핵산 서열은 원래 마우스 또는 햄스터로부터 유래한 세포주로 도입될 수 있다.
대조적으로, "내인성" 분자는 특정 환경 조건 하에서 특정 발달 단계에서 특정 세포에 정상적으로 존재하는 것이다. 예를 들어, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘드리아, 엽록체 또는 다른 세포 기관의 게놈, 또는 자연적으로 발생하는 에피좀 핵산을 포함할 수 있다. 추가적인 내인성 분자는 단백질, 예를 들어 전사 인자 및 효소를 포함할 수 있다.
"융합" 분자는 둘 이상의 서브유닛 분자가 연결, 바람직하게는 공유 결합된 분자이다. 서브유닛 분자는 분자의 동일한 화학적 유형일 수 있거나, 또는 분자의 상이한 화학적 유형일 수 있다. 융합 분자의 제1 유형의 예로는 융합 단백질(예를 들어, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인과 하나 이상의 활성화 도메인 사이의 융합물) 및 융합 핵산(예를 들어, 상기 기재된 융합 단백질을 암호화하는 핵산)을 포합하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 융합 분자의 제2 융합의 예로는 삼중복합체-형성 핵산과 폴리펩타이드 사이의 융합물, 및 작은 홈 결합제(minor groove binder)와 핵산 사이의 융합물을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
세포에서 융합 단백질의 발현은 세포로 융합 단백질의 전달로부터 또는 세포로 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 전달에 의해 생성될 수 있으며, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 전사되고 전사물은 번역되어 융합 단백질을 생성한다. 트랜스-스플라이싱(trans-splicing), 폴리펩타이드 절단 및 폴리펩타이드 결찰은 또한 세포 내 단백질의 발현에 수반될 수 있다. 세포로 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 전달을 위한 방법은 본 개시 내용의 다른 곳에 제시되어 있다.
본 개시 내용의 목적을 위하여, "유전자"는 유전자 산물을 암호화하는 DNA 영역(하기 참조)뿐만 아니라, 유전자 산물의 생성을 조절하는 조절 서열이 암호화 및/또는 전사된 서열에 인접하여 존재하든 하지 않든 유전자 산물의 생성을 조절하는 모든 DNA 영역을 포함한다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열, 종결자, 번역 조절 서열, 예컨대 리보솜 결합 위치 및 내부 리보솜 유입점, 인핸서, 사일렌서, 인슐레이터, 경계 요소, 복제 개시점, 매트릭스 부착점 및 좌위 제어 영역을 포함하지만, 이로 반드시 제한되는 것은 아니다.
"유전자 발현"은 유전자 산물로, 유전자에 포함된 정보의 전환을 말한다. 유전자 산물은 유전자(예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, ㄱ구구조 RNA 또는 RNA의 임의의 다른 유형)의 직접적인 전사 산물 또는 mRNA의 번역에 의해 생성되는 단백질일 수 있다. 유전자 산물은 또한 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화, 및 편집과같은 공정에 의해 개질되는 RNA, 및 예를 들어 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화, 및 글리코실화에 의해 개질된 단백질을 포함한다.
유전자 발현의 "조정"은 유전자의 활성에서의 변화를 말한다. 발현의 조정은 유전자 활성화 및 유전자 억압을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 게놈 편집(예를 들어, 절단, 변경, 불활성화, 무작위 돌연변이)는 발현을 조정하는데 사용될 수 있다. 유전자 불활성화는 본 명세서에 기재된 바와 같은 ZFP 또는 TALEN을 포함하지 않는 세포와 비교하여 유전자 발현에 있어서의 임의의 감소를 말한다. 따라서, 유전자 불활성화는 부분적 또는 완전할 수 있다.
"관심의 영역"은 예를 들어 유전자 내부 또는 유전자에 인접한 유전자 또는 비암호화 영역과 같은 세포 염색질의 임의의 영역이며, 여기서 외인성 분자에 결합하는 것이 바람직하다. 결합은 표적화된 DNA 절단 및/또는 표적화된 재조합의 목적을 위한 것일 수 있다. 관심의 영역은, 예를 들어 염색체, 에피솜, 세포 기관 게놈(예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체), 또는 감염 바이러스 게놈에 존재할 수 있다. 관심의 영역은 유전자의 암호화 영역 내, 예를 들어 선도 서열, 비번역순서 또는 인트론과 같은 전사되는 비암호화 영역, 또는 암호화 영역의 상류 또는 하류의 비전사 영역 내에 있을 수 있다. 관심의 영역은 단일 뉴클레오타이드 쌍 또는 길이가 최대 2,000개 뉴클레오타이드 쌍, 또는 뉴클레오타이드 쌍의 임의의 정수값만큼 작을 수 있다.
"진핵" 세포는 진균 세포(예컨대, 효모), 식물 세포, 동물 세포, 포유동물 세포 및 인간 세포(예를 들어, T-세포)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
"분비 조직"은 생성물을 분비하는 조직이다. 위장관으로 국재화되는 분비 조직의 예로는 소화관(gut), 췌장, 및 담낭을 정렬하는 세포를 포함한다. 다른 분비 조직으로는 간, 안구와 관련된 조직 및 점막, 예컨대 침샘, 젖샘, 전립선, 및 뇌하수체, 및 내분비계의 다른 구성원을 포함한다. 추가적으로, 분비 조직은 분비를 할 수 있는 조직 유형의 개별적인 세포를 포함한다.
용어 "작동적 연결" 및 "작동적으로 연결된"(또는 "작동가능하게 연결된")은 둘 이상의 성분(예컨대, 서열 요소)의 병렬에 관하여 상호교환적으로 사용되며, 여기서 둘 다의 성분이 정상적으로 기능하고 성분 중 적어도 하나가 다른 성분 중 적어도 하나에 대하여 발휘되는 기능을 매개할 수 있는 가능성을 허용하도록 성분이 배치된다. 예시에 의하여, 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 응하여 전사 조절 서열이 암호화 서열의 전사 수준을 제어한다면, 전자 조절 서열, 예컨대 프로모터는 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 전사 조절 서열은 일반적으로 암호화 서열과 시스로(in cis) 작동적으로 연결되지만, 이에 직접적으로 인접할 필요는 없다. 예를 들어, 인핸서는 인접하지 않은 경우에도 암호화 서열에 작동적으로 연결되는 전사 조절 서열이다.
융합 폴리펩타이드에 대하여, 용어 "작동적으로 연결된"은, 성분이 그렇게 연결되지 않은 바와 같이, 각각의 성분이 다른 성분에 연결되어 동일한 기능을 실행한다는 사실을 말할 수 있다. 예를 들어, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인이 활성화 도메인에 융합되어 있는 융합 폴리펩타이드에 대하여, 융합 폴리펩타이드에서 ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인 부분이 표적 위치 및/또는 결합 위치에 결합할 수 있는 한편, 활성화 도메인은 유전자 발현을 상향 조절할 수 있는 경우, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인 및 활성화 도메인은 작동적으로 연결되어 있다. ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인이 절단 도메인에 융합되어 있는 융합 폴리펩타이드에 대하여, 융합 폴리펩타이드에서 ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인 부분이 표적 위치 및/또는 결합 위치에 결합할 수 있는 한편, 절단 도메인은 표적 위치의 부근에서 DNA를 절단할 수 있는 경우, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인 및 절단 도메인은 작동적으로 연결되어 있다.
단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산의 "기능적 단편"은 서열이 전장 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일하지 않은 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산이고, 또한 전장 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일한 기능을 유지한다. 기능적 단편은 상응하는 본래의 분자보다 더 많은, 더 적은 또는 이와 동일한 잔기 수를 가질 수 있고/있거나 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 치환체를 함유할 수 있다. 핵산의 기능(예를 들어, 암호화 기능, 다른 핵산과 잡종을 맞드는 능력)을 결정하기 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 유사하게, 단백질 기능을 결정하기 위한 방법이 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 DNA-결합 기능은, 예를 들어 필터-결합, 전기영동이동도 변화(electrophoretic mobility-shift), 또는 면역침강 분석법에 의해 결정될 수 있다. 상기 문헌[Ausubel et al.]을 참조한다. 다른 단백질과 상호작용하는 단백질의 능력은, 예를 들어 상호면역침전(co-immunoprecipitation), 이중 잡종 분석법(two-hybrid assay) 또는 상보성(유전적 및 생화학적 모두)에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Fields et al. (1989) Nature 340:245-246]; 미국 특허 제5,585,245호 및 PCT WO 제98/44350호를 참조한다.
"벡터"는 세포에 유전자 서열을 전달 할 수 있다. 전형적으로, "벡터 구조체", "발현 벡터", 및 "유전자 전달 벡터"는 관심의 유전자의 발현을 지시할 수 있고 표적 세포에 유전자 서열을 전달할 수 있는 임의의 핵산 구조체를 의미한다. 따라서, 상기 용어는 클로닝, 및 발현 비히클뿐만 아니라 벡터를 통합하는 것을 포함한다.
"리포터 유전자" 또는 "리포터 서열"은, 바람직하게는 반드시 통상적인 분석법으로 측정되는 것은 아니지만, 용이하게 측정되는 단백질 산물을 생산하는 임의의 서열을 말한다. 적당한 리포터 유전자는 항생물질 저항성(예를 들어, 앰피실린 저항성, 네오마이신 저항성, G418 저항성, 퓨로마이신 저항성)을 매개하는 단백질을 암호화하는 서열, 유색 또는 형광 또는 발광 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질, 강화된 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 루시페라제)을 암호화하는 서열, 향상된 세포 성장 및/또는 유전자 증폭을 매개하는 단백질(예를 들어, 다이하이드로폴레이트 리덕타제)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 에피토프 태그는 예를 들어 FLAG, His, myc, Tap, HA 또는 임의의 검출가능한 아미노산 서열 중 하나 이상의 복사체를 포함한다. "발현 태그"는 관심 유전자의 발현을 모니터링하기 위하여 원하는 유전자 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는 리포터를 암호화하는 서열을 포함한다.
뉴클레아제
이식 유전자, 예를 들어 알부민에 특이적인 뉴클레아제의 삽입을 위해 유전자를 표적화하는데 유용한 조성물, 특히 뉴클레아제가 본 명세서에 기재되어 있다. 임의의 실시형태에서, 뉴클레아제는 자연적으로 발생하는 것이다. 다른 실시형태에서, 뉴클레아제는 비자연적으로 발생하는, 즉 DNA-결합 도메인 및/또는 절단 도메인에서 조직된 것이다. 예를 들어, 자연적으로 발생하는 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 변경되어 선택된 표적 위치(예를 들어, 조작되어 동족 결합 위치와 상이한 위치에 결합한 메가뉴클레아제)에 결합할 수 있다. 다른 실시형태에서, 뉴클레아제는 이종 DNA-결합 및 절단 도메인(예를 들어, 징크 핑거 뉴클레아제; TAL-효과기 뉴클레아제; 이종 절단 도메인을 가지는 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인)을 포함한다.
A. DNA-결합 도메인
임의의 실시형태에서, 뉴클레아제는 메가뉴클레아제(호밍 핵산내부가수분해효소)이다. 자연적으로 발생하는 메가뉴클레아제는 15~40개 염기쌍 절단 위치를 인식하고, 일반적으로 4개의 패밀리로 그룹화된다: LAGLIDADG 패밀리, GIY-YIG 패밀리, His-Cyst box 패밀리 및 HNH 패밀리. 예시적인 호밍 핵산내부가수분해효소는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII을 포함한다. 이들의 인식 서열은 공지되어 있다. 또한 미국 특허 제5,420,032호; 미국 특허 제6,833,252호; 문헌[Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]; [Dujon et al. (1989) Gene 82:1, 118]; [Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127]; [Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228]; [Gimble et al. (1996) J. Mol . Biol. 263:163-180]; [Argast et al. (1998) J. Mol . Biol . 280:345-353] 및 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) 카탈로그를 참조한다.
임의의 실시형태에서, 뉴클레아제는 조작된(비자연적으로 발생하는) 호밍 핵산내부가수분해효소(메가뉴클레아제)를 포함한다. 호밍 핵산내부가수분해효소 및 메가뉴클레아제, 예컨대 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII의 인식 서열은 공지되어 있다. 또한, 미국 특허 제5,420,032호; 미국 특허 제6,833,252호; 문헌[Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]; [Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118]; [Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127]; [Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228]; [Gimble et al. (1996) J. Mol . Biol. 263:163-180]; [Argast et al. (1998) J. Mol . Biol . 280:345-353] 및 뉴 잉글랜드 바이오랩 카탈로그를 참조한다. 추가적으로, 호밍 핵산내부가수분해효소 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 특이성은 조작되어 비자연적인 표적 위치에 결합할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Chevalier et al. (2002) Molec . Cell 10:895-905]; [Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962]; [Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659]; [Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66]; 미국 특허공개 제20070117128호를 참조한다. 호밍 핵산내부가수분해효소 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 전체로서 뉴클레아제의 맥락에서 변경될 수 있거나(즉, 뉴클레아제가 동족 절단 도메인을 포함하도록), 또는 이종 절단 도메인에 융합될 수 있다.
다른 실시형태에서, DNA-결합 도메인은 자연적으로 발생하거나 조작되는(비자연적으로 발생하는) TALE DNA 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허공개 제2011/0301073호를 참조하며, 이는 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다. 잔토모나스 종(genus Xanthomonas)의 식물 병원성 박테리아는 중요한 작물 식물에서 다수의 질환을 야기하는 것으로 공지되어 있다. 잔토모나스의 병원성은 식물 세포 내로 25개 초과의 상이한 효과기 단백질을 주입하는 보존된 III형 분비(type III secretion: T3S) 시스템에 좌우된다. 이들 주입된 단백질 중에 식물 전사 활성인자를 모방하고 식물 전사체를 조작하는 전사 활성인자-유사 효과기(transcription activator-like effector: TALE)가 있다(문헌[Kay et al (2007) Science 318:648-651] 참조). 이들 단백질은 DNA 결합 도메인 및 전사 활성화 도메인을 함유한다. 가장 잘 특징지어진 TALE 중 하나는 잔토모나스 캄페스트그리스 pv. 베시카토리아(Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria) 유래의 AvrBs3이다(문헌[Bonas et al (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136] 및 WO 제2010079430호 참조). TALE는 탠덤 반복체(tandem repeat)의 중앙 도메인을 함유하며(각각의 반복체는 대략 34개의 아미노산을 함유함), 이들 단백질의 DNA 결합 특이성에 대한 핵심이다. 추가적으로, 이들은 핵 위치 신호 및 산성 전사 활성화 도메인을 함유한다(검토를 위하여, 문헌[Schornack S, et al (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272] 참조). 추가적으로, 식물병원성 박테리아 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum) 2개의 유전자에서, 지정된 brg11 및 hpx17은 R. 솔라나세아룸 생태형 1 균주 GMI1000(R. solanacearum biovar 1 strain GMI1000)에서 및 생태형 4 균주 RS1000(biovar 4 strain RS1000)에서 잔토모나스의 AvrBs3 패밀리에 상동성인 거승로 발견되었다(문헌[Heuer et al (2007) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384] 참조). 이들 유전자는 뉴클레오타이드 서열에서 서로 98.9% 동일성이 있지만, hpx17의 반복 도메인에서 1,575bp의 결실에 의해 상이하다. 그러나, 유전자 산물 둘다 잔토모나스의 AvrBs3 패밀리 단백질과 서열 동일성이 40% 미만이다.
따라서 일부 실시형태에서, 표적 좌위(예를 들어, 알부민 또는 안전한 잠복처)에서 표적 위치에 결합하는 DNA 결합 도메인은 식물 병원균 잔토모나스로(문헌[Boch et al, (2009) Science 326: 1509-1512] 및 [Moscou and Bogdanove, (2009) Science326: 1501] 참조)부터 유래한 것 및 랄스토니아(문헌[Heuer et al (2007) Applied and Environmental Microbiology 73(13): 4379-4384)]로부터 유래한 것; 미국 특허공개 제2011/0301073호 및 미국 특허공개 제20110145940호와 유사한 TALE 유래의 조작된 도메인이다.
임의의 실시형태에서, DNA 결합 도메인은 아연 핑거 단백질(예를 들어, 알부민 또는 안전한-잠복처 유전자에서 표적 위치에 결합하는 징크 핑거 단백질)을 포함한다. 바람직하게, 징크 핑거 단백질은 조작되어 선택된 표적 위치에 결합된다는 점에서 비자연적으로 발생하는 것이다. 예를 들어, 문헌[Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol . 20:135-141]; [Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem . 70:313-340]; [Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol . 19:656-660]; [Segal et al. (2001) Curr . Opin . Biotechnol . 12:632-637]; [Choo et al. (2000) Curr . Opin. Struct . Biol . 10:411-416]; 미국 특허 제6,453,242호; 제6,534,261호; 제6,599,692호; 제6,503,717호; 제6,689,558호; 제7,030,215호; 제6,794,136호; 제7,067,317호; 제7,262,054호; 제7,070,934호; 제7,361,635호; 제7,253,273호; 및 미국 특허공개 제2005/0064474호; 제2007/0218528호; 제2005/0267061호를 참조하며, 이들 모두 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
조작된 징크 핑거 결합 또는 TALE 도메인은 자연적으로 발생하는 징크 핑거 단백질에 비하여 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작하는 방법은 합리적인 설계 및 다양한 유형의 선택을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 합리적인 설계는, 예를 들어 삼중(또는 사중) 뉴클레오타이드 서열 및 개별적인 징크 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 각각의 삼중 또는 사중 뉴클레오타이드 서열은 특정 삼중 또는 사중 서열에 결합하는 징크 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 회합한다. 예를 들어, 공유인 미국 특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호를 참조하며, 이는 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
파지 디스플레이 및 이중 잡종 시스템을 포함하여 예시적인 선택 방법이 미국 특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,410,248호; 제6,140,466호; 제6,200,759호; 및 제6,242,568호; 뿐만 아니라 WO　제98/37186호; WO　제98/53057호; WO　제00/27878호; WO　제01/88197호 및 GB 제2,338,237호에 개시되어 있다. 추가적으로, 징크 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 향상은 예를 들어 공유인 WO　제02/077227호에 기재된 바 있다.
추가적으로, 이들 및 다른 참조 문헌에 개시된 바와 같이, DNA-결합 도메인(예를 들어, 멀티-핑거 아연 핑거 단백질 또는 TALE 도메인)은, 예를 들어 길이가 5개 이상의 아미노산인 링커를 포함하여 임의의 적당한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 길이가 6개 이상의 아미노산인 예시적인 링커 서열에 대하여 미국 특허 제6,479,626호; 제6,903,185호; 및 제7,153,949호를 참조한다. 본 명세서에 기재된 DNA 결합 단백질은 단백질의 개별적인 아연 핑거 사이에 적당한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 추가적으로, 아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 향상은 예를 들어 공유인 WO　제02/077227호에 기재된 바 있다.
표적 위치의 선택; 융합 단백질(및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 설계 및 구성을 위한 방법 및 DNA-결합 도메인은 당업자에게 공지되어 있으며, 상세하게는 미국 특허 제6,140,0815호; 제789,538호; 제6,453,242호; 제6,534,261호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,200,759호; WO　제95/19431호; WO　제96/06166호; WO　제98/53057호; WO　제98/54311호; WO　제00/27878호; WO　제01/60970호; WO　제01/88197호; WO　제02/099084호; WO　제98/53058호; WO　제98/53059호; WO 제98/53060호; WO 제02/016536호 및 WO 제03/016496호 및 미국 공개 제20110301073호에 기재되어 있다.
추가적으로, 이들 및 다른 참조 문헌에 개시된 바와 같이, DNA-결합 도메인(예를 들어, 멀티-핑거 아연 핑거 단백질)은, 예를 들어 길이가 5개 이상의 아미노산인 링커를 포함하여 임의의 적당한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 길이가 6개 이상의 아미노산인 예시적인 링커 서열에 대하여 미국 특허 제6,479,626호; 제6,903,185호; 및 제7,153,949호를 참조한다. 본 명세서에 기재된 단백질은 단백질의 개별적인 아연 핑거 사이에 적당한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
B. 절단 도메인
임의의 적당한 절단 도메인은 DNA-결합 도메인에 작동적으로 연결되어 뉴클레아제를 형성할 수 있다. 예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인은 뉴클레아제 도메인에 융합되어 조작된 (ZFP) DNA 결합 도메인을 통하여 의도된 핵산 표적을 인식할 수 있는 ZFN-기능성 독립체를 형성하고, 뉴클레아제 활성을 통하여 DNA가 ZFP 결합 위치 근처에서 절단되는 것을 야기하였다. 예를 들어, 문헌[Kim et al. (1996) Proc Nat'l Acad Sci USA 93(3):1156-1160]을 참조한다. 보다 최근에, ZFN은 다양한 유기체에서 게놈 개질에 사용된 바 있다. 예를 들어, 미국 특허공개 제20030232410호; 제20050208489호; 제20050026157호; 제20050064474호; 제20060188987호; 제20060063231호; 및 국제 공개 WO 제07/014275호를 참조한다. 마찬가지로, TALE DNA-결합 도메인은 뉴클레아제 도메인에 융합되어 TALEN을 형성하였다. 예를 들어, 미국 공개 제20110301073호를 참조한다.
상기 언급된 바와 같이, 절단 도메인은 DNA-결합 도메인, 예를 들어 뉴클레아제 유래의 절단 도메인 및 징크 핑거 DNA-결합 도메인 또는 TALEN DNA-결합 도메인 및 절단 도메인, 또는 상이한 뉴클레아제 유래의 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인 및 절단 도메인과 이종일 수 있다. 이종 절단 도메인은 임의의 핵산내부가수분해효소 또는 핵산말단가수분해효소로부터 얻어질 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 예시적인 핵산내부가수분해효소로는 제한효소 및 호밍 핵산내부가수분해효소를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, [2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA]; 및 [Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]을 참조한다. DNA를 절단하는 추가적인 효소가 공지되어 있다(예를 들어, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 마이크로코칼 뉴클레아제; 효모 HO 핵산내부가수분해효소; 또한 문헌[Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993] 참조). 이들 효소(또는 이의 기능성 단편) 중 하나 이상은 절단 도메인 및 절단 절반-도메인의 공급원으로서 사용될 수 있다.
유사하게, 절단 절반-도메인은 상기 제시된 바와 같이 임의의 뉴클레아제 또는 이의 부분으로부터 유래할 수 있으며, 이는 절단 활성을 위해 이량화를 필요로 한다. 일반적으로, 융합 단백질이 절단 절반-도메인을 포함한다면, 2개의 융합 단백질이 절단을 위해 필요하다. 대안적으로, 2개의 절단 절반-도메인을 포함하는 단일 단백질이 사용될 수 있다. 2개의 절단 절반-도메인은 동일한 핵산내부가수분해효소(또는 이의 기능성 단편)로부터 유래할 수 있거나, 또는 각각의 절단 절반-도메인은 상이한 핵산내부가수분해효소(또는 이의 기능성 단편)로부터 유래할 수 있다. 추가적으로, 2개의 융합 단백질을 위한 표적 위치는 서로에 대하여 바람직하게 배치되어, 각각의 표적 위치에 대한 2개의 융합 단백질의 결합은 서로에 대한 공간 배향으로 절단 절반-도메인을 배치하며, 이는 예를 들어 이량체화함으로써 절단 절반-도메인이 기능성 절단 도메인을 형성할 수 있게 한다. 따라서 임의의 실시형태에서, 표적 위치의 근처 모서리는 5~8개 뉴클레오타이드로, 또는 15~18개 뉴클레오타이드로 분리된다. 그러나, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍의 임의의 완전한 수{왜 우리는 항상 수식어 "완전한" 및 "정수"를 사용하고 있을까, 이들은 정말 필요할까? 이들은 단지 제한적인 것으로 보이며, 이들의 사용은 우리에게 차선책까지 열어준 것처럼 보일 것임}는 2개의 표적 위치(예를 들어, 2 내지 50개 뉴클레오타이드 쌍 이상) 사이에서 개입할 수 있다. 일반적으로, 절단 위치는 표적 위치 상이에 놓인다.
제한효소(restriction endonuclease, restriction enzyme)는 다수의 종에 존재하며, (인식 위치에서) DNA에 서열-특이적 결합을 하고 결합 위치에서 또는 그 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한효소(예를 들어, IIS형)는 인식 위치로부터 제거되는 위치에서 DNA를 절단하고 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 가진다. 예를 들어, IIS형 효소 Fok　I는 하나의 가닥 상의 인식 위치로부터의 9개 뉴클레오타이드 그리고 다른 가닥 상의 인식 위치로부터의 13개 뉴클레오타이드에서 DNA의 이중가닥 절단을 촉진시킨다. 예를 들어, 미국 특허 제5,356,802호; 제5,436,150호 및 제5,487,994호; 뿐만 아니라 문헌[Li et al. (1992) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 89:4275-4279]; [Li et al. (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:2764-2768]; [Kim et al. (1994a) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91:883-887]; [Kim et al. (1994b) J. Biol . Chem . 269:31,978-31,982]을 참조한다. 따라서 일 실시형태에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 IIS형 제한효소로부터의 절단 도메인(또는 절단 절반-도메인) 및 하나 이상의 징크 핑거 결합 도메인을 포함하며, 이는 조작될 수 있거나 조작되지 않을 수 있다.
절단 도메인이 결합 도메인과 분리가능한 예시적인 IIS형 제한효소로는 Fok 　I가 있다. 이러한 특정 효소는 이량체로서 활성적이다. 문헌[Bitinaite et al. (1998) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95: 10,570-10,575]. 따라서, 본 개시 내용의 목적을 위하여, 개시된 융합 단백질에서 사용된 Fok　I 효소의 일부분은 절단 절반-도메인으로 고려된다. 따라서, 징크 핑거-Fok　I 융합물을 사용하는 세포 서열의 표적화된 이중가닥 절단 및/또는 표적화된 대체물에 대하여, 2개의 융합 단백질(각각 FokI 절단 절반-도메인을 포함함)은 촉매 반응으로 활성인 절단 도메인을 재구성하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, DNA 결합 도메인 및 2개의 Fok　I 절단 절반-도메인을 함유하는 단일 폴리펩타이드 분자가 또한 사용될 수 있다.
절단 도메인 또는 절단 절반-도메인은 절단 활성을 유지, 또는 다량체화(예를 들어, 이량체화)하여 기능성 절단 도메인을 형성하는 능력을 유지하는 단백질의 임의의 부분일 수 있다.
예시적인 IIS형 제한 효소는 국제 공개 WO 제07/014275호에 기재되어 있으며, 이는 전체가 본 명세서에 포함된다. 추가적인 제한효소는 또한 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 함유하며, 이들은 본 개시 내용에 의해 고려된다. 예를 들어, 문헌[Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420]을 참조한다.
임의의 실시형태에서, 절단 도메인은, 예를 들어 미국 특허공개 제20050064474호; 제20060188987호; 제20080131962호 및 제20110201055호(이들의 개시 내용 모두는 전체가 본 명세서에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 동종이량체화를 최소화 또는 방지하는 하나 이상의 조작된 절단 절반-도메인(또한 이량체화 도메인 돌연변이체로서도 지칭됨)을 포함한다. Fok I의 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538번 위치에서의 아미노산 잔기는 Fok I 절단 절반-도메인의 이량체화에 영항을 미치기 위한 모든 표적이다.
절대적인 이종이량체를 형성하는 Fok I의 예시적인 조작된 절단 절반-도메인은 제1 절단 절반-도메인이 Fok I의 490 및 538번 위치의 아미노산 잔기에서의 돌연변이를 포함하고 제2 절단 절반-도메인은 486 및 499번 위치의 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함하는 쌍을 포함한다.
따라서, 일 실시형태에서, 490번에서의 돌연변이는 Glu(E)를 Lys(K)으로 대체하고; 538번에서의 돌연변이는 Iso(I)를 Lys(K)로 대체하며; 486번에서의 돌연변이는 Gln(Q)을 Glu(E)로 대체하고; 499번 위치에서의 돌연변이는 Iso(I)를 Lys(K)로 대체한다. 구체적으로, 본 명세서에 기재된 조작된 절단 절반-도메인은 하나의 절단 절반-도메인에서 490번 위치에서의 돌연변이(E→K) 및 538번에서의 돌연변이(I→K)에 의해 제조되어 "E490K:I538K"으로 지정된 조작된 절단 절반-도메인을 제조하였고, 다른 절단 절반-도메인에서 486번 위치에서의 돌연변이(Q→E) 및 499번에서의 돌연변이(I→L)에 의해 제조되어 "Q486E:I499L"로 지정된 조작된 절단 절반-도메인을 제조하였다. 본 명세서에 기재된 조작된 절단 절반-도메인은 비정상적인 절단이 최소화 또는 제거되는 절대적인 이종이량체 돌연변이체이다. 예를 들어, 미국 특허공개 제2008/0131962호를 참조하며, 이의 개시 내용은 모든 목적을 위하여 전체가 참조로 포함된다.
임의의 실시형태에서, 조작된 절단 절반-도메인은 486, 499 및 496번(야생형 FokI에 대하여 번호가 매겨짐) 위치에서의 돌연변이, 예를 들어 486번 위치에서 야생형 Gln(Q) 잔기를 Glu(E) 잔기로, 499번 위치에서 야생형 Iso(I) 잔기를 Leu(L) 잔기로, 496번 위치에서 야생형 Asn(N) 잔기를 Asp(D) 또는 Glu(E) 잔기로(또한 각각 "ELD" 및 "ELE" 도메인으로도 지칭됨) 대체하는 돌연변이를 포함한다. 다른 실시형태에서, 조작된 절단 절반-도메인은 490, 538 및 537번(야생형 FokI에 대하여 번호가 매겨짐) 위치에서의 돌연변이, 예를 들어 490번 위치에서 야생형 Glu(E) 잔기를 Lys(K) 잔기로, 538번 위치에서 야생형 Iso(I) 잔기를 Lys(K) 잔기로, 537번 위치에서 야생형 His(H) 잔기를 Lys(K) 잔기 또는 Arg(R) 잔기로(또한 각각 "KKK" 및 "KKR" 도메인으로도 지칭됨) 대체하는 돌연변이를 포함한다. 다른 실시형태에서, 조작된 절단 절반-도메인은 490 및 537번(야생형 FokI에 대하여 번호가 매겨짐) 위치에서의 돌연변이, 예를 들어 490번 위치에서 야생형 Glu(E) 잔기를 Lys(K) 잔기로, 537번 위치에서 야생형 His(H) 잔기를 Lys(K) 잔기 또는 Arg(R) 잔기로(또한 각각 "KIK" 및 "KIR" 도메인으로도 지칭됨) 대체하는 돌연변이를 포함한다. (미국 특허공개 제20110201055호 참조). 본 명세서에 기재된 조작된 절단 절반-도메인은 임의의 적당한 방법을 사용하여, 예를 들어 미국 특허공개 제20050064474호; 제20080131962호 및 제20110201055호에 기재된 바와 같이 야생형 절단 절반-도메인(Fok I)의 위치 지정 돌연변이에 의해 제조될 수 있다.
대안적으로, 뉴클레아제는 소위 "분할-효소" 기술을 사용하여 핵산 표적 위치에서 생체내에서 집합될 수 있다(예를 들어, 미국 특허공개 제20090068164호 참조). 이와 같은 분할 효소의 성분은 개별적인 발현 구조체에서 발현될 수 있거나, 또는 개별적인 성분이 분리된 하나의 오픈 리딩 프레임에서, 예를 들어 자가 절단 2A 펩타이드 또는 IRES 서열에 의해 연결될 수 있다. 성분은 개별적인 징크 핑거 결합 도메인 또는 메가뉴클레아제 핵산 결합 도메인의 도메인일 수 있다.
뉴클레아제는, 예를 들어 WO 제2009/042163호 및 제20090068164호에 기재된 바와 같은 효모 기반 염색체 시스템에서 사용 전에 활성에 대하여 스크리닝될 수 있다. 튜클레아제 발현 구조체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 용이하게 설계될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허공개 제20030232410호; 제20050208489호; 제20050026157호; 제20050064474호; 제20060188987호; 제20060063231호; 및 국제 공개 WO 제07/014275호를 참조한다. 뉴클레아제의 발현은 구성 프로모터 및 유도성 프로모터, 예를 들어 라피노스 및/또는 갈락토스의 존재 하에서 활성화(탈억압화)되고 글루코스의 존재 하에서 억압되는 갈락토키나제 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
표적 위치
상기 상세 내용이 기재된 바와 같이, DNA 도메인은 조작되어, 예를 들어 알부민 또는 안전한-잠복처 유전자의 좌위에서 선택된 임의의 서열에 결합할 수 있다. 조작된 DNA-결합 도메인은 자연적으로 발생하는 DNA-결합 도메인에 비하여 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작하는 방법은 합리적인 설계 및 다양한 유형의 선택을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 합리적인 설계는, 예를 들어 삼중(또는 사중) 뉴클레오타이드 서열 및 개별적인 (예를 들어, 징크 핑거) 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 각각의 삼중 또는 사중 뉴클레오타이드 서열은 특정 삼중 또는 사중 서열에 결합하는 DNA 결합 도메인의 하나 이상의 아미노산 서열과 회합한다. 예를 들어, 공유인 미국 특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호를 참조하며, 이는 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다. TAL-효과기 도메인의 합리적인 설계가 또한 실행될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허공개 제20110301073호를 참조한다.
파지 디스플레이 및 이중 잡종 시스템을 포함하여, DNA-결합 도메인에 적용가능한 예시적인 선택 방법이 미국 특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,410,248호; 제6,140,466호; 제6,200,759호; 및 제6,242,568호; 뿐만 아니라 WO　제98/37186호; WO　제98/53057호; WO　제00/27878호; WO　제01/88197호 및 GB 제2,338,237호에 개시되어 있다.
표적 위치의 선택; 융합 단백질(및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 설계 및 구성을 위한 방법 및 뉴클레아제는 당업자에게 공지되어 있으며, 상세하게는 미국 특허출원공개 제20050064474호 및 제20060188987호에 기재되어 있으며, 이는 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
추가적으로, 이들 및 다른 참조 문헌에 개시된 바와 같이, DNA-결합 도메인(예를 들어, 멀티-핑거 아연 핑거 단백질)은, 예를 들어 길이가 5개 이상의 아미노산인 링커를 포함하여 임의의 적당한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 예를 들어, 길이가 6개 이상의 아미노산인 예시적인 링커 서열에 대하여 미국 특허 제6,479,626호; 제6,903,185호; 및 제7,153,949호를 참조한다. 본 명세서에 기재된 단백질은 단백질의 개별적인 DNA-결합 도메인 사이에 적당한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 또한 미국 공개 제20110301073호를 참조한다.
공여체
상기 언급한 바와 같이, 외인성 서열의 삽입(또한 "공여체 서열" 또는 "공여체"라고도 함)은 예를 들어 돌연변치 유전자의 교정을 위하여 또는 야생형 유전자의 증가된 발현을 위한 것이다. 공여체 서열은 전형적으로 위치되는 게놈 서열과 동일하지 않은 것은 용이하게 명백할 것이다. 공여체 서열은 상동성인 2개 영역에 의해 측접된 비상동성 서열을 함유하여 관심의 영역에서 효과적인 HDR을 가능하게 할 수 있다. 추가적으로, 공여체 서열은 세포 염색질에서 관심의 영역에 상동성이 아닌 서열을 함유하는 벡터 분자를 포함할 수 있다. 공여체 분자는 세포 염색질에 상동성인 여러 개의 비연속적 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 관심의 영역에 정상적으로는 존재하지 않는 서역의 표적화된 삽입을 위하여, 상기 서열은 공여체 핵산 분자에 존재할 수 있고, 관심의 영역에서 서열에 상동성인 영역에 의하여 측접될 수 있다.
공여체 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA, 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있고, 선형 또는 환형 형태로 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허공개 제20100047805호 및 제20110207221호를 참조한다. 선형 형태로 도입된 경우, 공여체 서열의 말단은 당업자에게 공지된 방법에 의하여 (예를 들어, 핵산말단가수분해효소에 의한 분해로부터) 보호될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 다이데옥시뉴클레오타이드 잔기는 선형 분자의 3' 말단에 추가되고/되거나 자가 보완적인 올리고뉴클레오타이드는 하나 또는 양쪽 말단에 결찰된다. 예를 들어, 문헌[Chang et al. (1987) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84:4959-4963]; [Nehls et al. (1996) Science 272:886-889]을 참조한다. 외인성 폴리뉴클레오타이드를 분해로부터 보호하는 추가적인 방법은 말단 아미노 기(들)의 첨가 및 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기와 같은 개질된 뉴클레오타이드간 연결의 사용을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 복제 개시점, 프로모터 및 항생물질 저항성을 암호화하는 유전자와 같은 추가적인 서열을 가지는 벡터 분자의 부분으로서 세포 내로 도입될 수 있다. 게다가, 공여체 폴리뉴클레오타이드는 네이키드(naked) 핵산으로서, 리포좀 또는 폴록사머와 같은 제제와 함께 복합체화되는 도입될 수 있으며, 또는 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레드로바이러스, 레티바이러스 및 인테그라제 결핍 렌티바이러스(IDLV))에 의해 전달될 수 있다.
공여체는 일반적으로 삽입되어 이의 발현은 통합 위치에서 내인성 프로모터, 즉 알부민 유전자의 발현을 구동하는 프로모터에 의해 구동된다. 그러나, 공여체는 프로모터 및/또는 인핸서, 예를 들어 구성 프로모터 또는 유도성 또는 조직 특이적 프로모터를 포함할 수 있다.
공여체 분자는 내인성 유전자 내로 삽입되며, 내인성 유전자의 모두, 일부가 발현되거나 내인성 유전자의 어느 것도 발현되지 않는다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 이식 유전자는 알부민 좌위로 삽입될 수 있어, 예를 들어 이식 유전자와의 융합물로서 내인성 알부민 서열의 일부가 발현되거나 내인성 알부민 서열의 어느 것도 발현되지 않는다. 다른 실시형태에서, (예를 들어, 알부민 암호화 서열을 가지는 또는 이를 가지지 않는) 이식 유전자는 임의의 내인성 좌위, 예를 들어 안전한-잠복처 좌위로 통합된다. 예를 들어, 미국 특허공개 제20080299580호; 제20080159996호 및 제201000218264호를 참조한다.
알부민 서열(내인성 또는 이식 유전자의 일부)이 이식 유전자와 함께 발현될 때, 알부민 서열은 전장 서열(야생형 또는 돌연변이) 또는 부분적 서열일 수 있다. 바람직하게 알부민 서열은 기능성이다. 이러한 전장 또는 부분적 알부민 서열의 기능의 비제한적인 예로는 이식 유전자(예를 들어, 치료용 유전자)에 의해 발현되는 폴리펩타이드의 혈청 반감기를 증가시키고/증가시키거나 운반체로서 작용하는 것을 포함한다.
또한, 발현을 위해 필요하지 않다면, 외인성 서열은 또한 전사 또는 번역 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 인슐레이터, 내부 리보솜 유입점, 2A 펩타이드 및/또는 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
전달
뉴클레아제, 이러한 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 공여체 폴리뉴클레오타이드 및 본 명세서에 기재된 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물이 임의의 적당한 수단에 의해 생체내 또는 생체외로 전달될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 뉴클레아제를 전달하는 방법은 예를 들어 미국 특허 제6,453,242호; 제6,503,717호; 제6,534,261호; 제6,599,692호; 제6,607,882호; 제6,689,558호; 제6,824,978호; 제6,933,113호; 제6,979,539호; 제7,013,219호; 및 제7,163,824호에 기재되어 있으며, 이들의 개시 내용은 모두 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 뉴클레아제 및/또는 공여체 구조체는 또한 하나 이상의 징크 핑거 또는 TALEN 단백질(들)을 암호화하는 서열을 함유하는 벡터를 사용하여 전달될 수 있다. 임의의 벡터 시스템은 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터; 헤르페스바이러스 벡터 및 아데노연관바이러스 벡터 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 미국 특허 제6,534,261호; 제6,607,882호; 제6,824,978호; 제6,933,113호; 제6,979,539호; 제7,013,219호; 및 제7,163,824호를 참조한다. 또한, 이들 벡터 중 임의의 것은 치료에 필요한 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있음을 분명할 것이다. 따라서, 하나 이상의 뉴클레아제 및 공여체 구조체가 세포 내로 도입될 때, 뉴클레아제 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드가 동일한 벡터 또는 상이한 벡터 상에 운반될 수 있다. 다양한 벡터가 사용될 때, 각각의 벡터는 하나 또는 다양한 뉴클레아제 및/또는 공여체 구조체를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
종래의 바이러스 및 비바이러스 기반 유전자 전달 방법은 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 및 표적 조직에서 뉴클레아제 및 공유체 구조체를 암호화하는 핵산을 도입하는데 사용될 수 있다. 비바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, 네이키드 핵산, 및 리포좀 또는 폴록사머와 같은 전달 비히클과 복합체화된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 및 RNA 바이러스를 포함하며, 이는 세포로 전달 후 에피좀 또는 통합된 게놈을 가진다. 유전자 치료 과정의 검토를 위하여, 문헌[Anderson, Science 256:808-813 (1992)]; [Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993)]; [Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993)]; [Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993)]; [Miller, Nature 357:455-460 (1992)]; [Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988)]; [Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995)]; [Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995)]; [Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds.) (1995)]; 및 [Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)]을 참조한다.
핵산의 비바이러스 전달 방법은 전기천공법, 리포펙션, 미세주입법, 유전자총법, 비로좀, 리포좀, 면역리포좀, 다양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 DNA의 제제-향상 흡수를 포함한다. 예를 들어 소니트론 2000 시스템(Sonitron 2000 system; 리치-마(Rich-Mar) 제품)을 사용하는 초음파천공법이 또한 핵산의 전달에 사용될 수 있다.
추가적인 예시적 핵산 전달 시스템은 아막사 바이오시스템즈(Amaxa Biosystems; 콜롱(Cologne) 제품, 독일 소재), 맥스사이트 사(Maxcyte, Inc.; 록빌(Rockville), 미국 메릴랜드주 소재), BTX 모레큘러 딜리버리 시스템즈(BTX Molecular Delivery Systems; 홀리스톤(Holliston) 제품, 미국 매사추세츠주 소재) 및 코페르니쿠스 테라퓨틱스 사(Copernicus Therapeutics Inc(예를 들어, 미국 제6008336호 참조)에 의해 제공되는 것을 포함한다. 리포펙션은, 예를 들어 미국 특허 제5,049,386호; 제4,946,787호; 및 제4,897,355호에 기재되어 있고, 리포펙션 시약은 상업적으로 판매되고 있다(예를 들어, 트랜스펙탐(Transfectam(상표명)) 및 리포펙틴(Lipofectin(상표명))). 폴리뉴클레오타이드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적당한 양이온성 및 중성 지질은 Felgner, WO 제91/17424호, WO 제91/16024호의 것을 포함한다.
면역지질(immunolipid) 복합체와 같은 표적화된 리포좀을 포함하여, 지질:핵산 복합체의 제조는 당업자에게 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Crystal, Science 270:404-410 (1995)]; [Blaese et al., Cancer Gene Ther . 2:291-297 (1995)]; [Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994)]; [Remy et al., Bioconjugate Chem . 5:647-654 (1994)]; [Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995)]; [Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992)]; 미국 특허 제4,186,183호, 제4,217,344호, 제4,235,871호, 제4,261,975호, 제4,485,054호, 제4,501,728호, 제4,774,085호, 제4,837,028호, 및 제4,946,787호 참조).
전달의 추가적인 방법은 엔진아씨 전달 비히클(EnGeneIC delivery vehicles: EDV)로 전달될 핵산을 패키징하는 것의 사용을 포함한다. 이러한 EDV는 구체적으로 항체의 하나의 팔은 표적 조직에 특이성을 가지고, 다른 팔은 EDV에 특이성을 가지는 이중특이성 항체를 사용하여 표적 조직으로 전달된다. 항체는 표적 세포 표면으로 EDV를 가져가고, 그 후 EDV는 엔도시토시스(endocytosis)에 의해 세포 내로 들어간다. 일단 세포 내에 있으면, 내용물이 방출된다(문헌[MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27(7):643] 참조).
조작된 ZFP를 암호화하는 핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용은 신체 내의 특이적인 세포로 바이러스를 표적화하고 핵으로 바이러스 페이로드를 수송하기 위해 고도로 발달된 공정을 이용한다. 바이러스 벡터는 환자에게 직접적으로 투여될 수 있거나(생체내) 또는 시험관내에서 세포를 치료하는데 사용될 수 있고 개질된 세포는 환자에게 투여된다(생체외). ZFP의 전달을 위한 종래의 바이러스 기반 시스템은 유전자 전달을 위하여 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노연관바이러스, 백시니아바이러스 및 단순헤르페스바이러스 벡터를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 아데노연관바이러스 유전자 전달 방법을 이용한 숙주 게놈에서의 통합이 가능하며, 종종 이는 삽입된 이식 유전자의 장기 발현을 초래한다. 추가적으로, 높은 형질도입 효율은 다수의 상이한 세포 유형 및 표적 세포에서 관찰되었다.
레트로바이러스의 굴성(tropism)은 외래 외막 단백질을 합체시킴으로써 변경될 수 있어, 표적 세포의 잠재적인 표적 집단을 확장시킬 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비분열 세포를 형질도입 또는 감염시킬 수 있고 전형적으로는 높은 바이러스 역가를 생성하는 레트로바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 좌우된다. 레트로바이러스 벡터는 최대 6~10kb의 외래 서열에 대한 패키징 능력을 가지는 시스(cis)-작용 긴말단반복순서(long terminal repeat: LTR)로 구성된다. 최소한의 시스-작용 LTR은 벡터의 복제 및 패키징에 충분하며, 그 후 표적 세포 내로 치료용 유전자를 통합시키는데 사용되어 영구적인 이식 유전자 발현을 제공한다. 널리 사용되는 레트로바이러스 벡터는 쥐 백혈병 바이러스(murine leukemia virus: MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus: GaLV), 원숭이 면역결핍 바이러스(Simian Immunodeficiency virus: SIV), 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus: HIV), 이의 조합을 기반으로 한 것들을 포함한다(예를 들어, 문헌[Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992)]; [Johann et al., J. Virol . 66:1635-1640 (1992)]; [Sommerfelt et al., Virol . 176:58-59 (1990)]; [Wilson et al., J. Virol . 63:2374-2378 (1989)]; [Miller et al., J. Virol . 65:2220-2224 (1991)]; PCT/US94/05700호 참조).
일시적인 발현이 바람직한 적용에서는, 아데노바이러스 기반 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스 기반 벡터는 다수의 세포 유형에서 형질도입 효율이 매우 높을 수 있고, 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 이와 같은 벡터를 이용하여, 발현의 높은 역가 및 높은 수준이 얻어졌다. 이러한 벡터는 비교적 단순한 시스템에서 다량으로 생산될 수 있다. 아데노연관 바이러스(Adeno-associated virus: "AAV") 벡터는 또한, 예를 들어 핵산 및 펩타이드의 시험관내 생성에서, 그리고 생체내 및 생체외 유전자 치료 과정을 위하여 세포를 표적 핵산으로 형질도입하는데 사용된다(예를 들어, 문헌[West et al., Virology 160:38-47 (1987)]; 미국 특허 제4,797,368호; WO 제93/24641호; [Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994)]; [Muzyczka, J. Clin . Invest. 94:1351 (1994)] 참조). 재조합 AAV 벡터의 구조는 다수의 간행물, 예를 들어 미국 특허 제5,173,414호; 문헌[Tratschin et al., Mol . Cell. Biol . 5:3251-3260 (1985)]; [Tratschin, et al., Mol . Cell. Biol . 4:2072-2081 (1984)]; [Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984)]; 및 [Samulski et al., J. Virol . 63:03822-3828 (1989)]에 기재되어 있다.
적어도 6가지의 바이러스 벡터 접근법이 임상 시험에서 유전자 전달을 위하여 현재 이용가능하며, 이는 보조 세포주(helper cell line) 내로 삽입되는 유전자에 의하여 결함이 있는 벡터의 상보성을 수반하는 접근법을 이용하여 형질도입 제제를 생성한다.
pLASN 및 MFG-S는 임상 시험에서 사용된 레트로바이러스 벡터의 예이다(Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech et al., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN은 유전자 치료 시험에서 사용된 첫번째 치료용 벡터였다. (Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)). 50% 이상의 형질도입 효율이 MFG-S 패키징된 벡터에 대하여 관찰되었다. (Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther . 1:111-2 (1997)).
재조합 아데노연관 바이러스 벡터(recombinant adeno-associated virus vector: rAAV)는 결함이 있으면서 비병원성인 파보바이러스 아데노연관 2형 바이러스에 기반하는 유망한 대안적인 유전자 전달 시스템이다. 모든 벡터는 이식 유전자 발현 카세트에 측접하는 AAV 145bp 역위 말단 반복(inverted terminal repeat)만을 유지하는 플라스미드로부터 유래한다. 형질도입된 세포의 게놈 내로의 통합으로 인하여 효율적인 유전자 전달 및 안정적인 이식 유전자 전달은 이러한 벡터 시스템을 위한 핵심적인 특성이다. (Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther . 9:748-55 (1996)). 다른 AAV 혈청형, 예를 들어 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV 8.2, AAV9, AAV rh10 및 위형(pseudotyped) AAV, 예를 들어 AAV2/8, AAV2/5 및 AAV2/6은 또한 본 발명에 따라서 사용될 수 있다.
복제-불능 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad)는 높은 역가로 생산될 수 있으며, 용이하게 다수의 상이한 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 이식 유전자가 Ad E1a, E1b, 및/또는 E3 유전자를 대체하고; 그 이후에 복제 불능 벡터가 트랜스로 결실된 유전자 기능을 제공하는 인간 293개 세포에서 증식되도록, 대부분의 아데노바이러스 벡터가 조작된다. Ad 벡터는, 비분열의 분화된 세포, 예컨대 간, 신장 및 근육에서 발견되는 세포를 포함하여, 다양한 유형의 생체내 조직을 형질도입할 수 있다. 통상적인 Ad 벡터는 운반 성능이 크다. 임상 시험에서 Ad 벡터의 사용의 예는 근육내 주사로 항-종양 면역화를 위한 폴리뉴클레오타이드 치료를 포함하였다(Sterman et al., Hum. Gene Ther . 7:1083-9 (1998)). 임상 시험에서 유전자 전달을 위한 아데노바이러스 벡터의 사용의 추가적인 예로는 문헌[Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996)]; [Sterman et al., Hum. Gene Ther . 9:7 1083-1089 (1998)]; [Welsh et al., Hum. Gene Ther . 2:205-18 (1995)]; [Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997)]; [Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998)]; [Sterman et al., Hum. Gene Ther . 7:1083-1089 (1998)]을 포함한다.
세포를 패키징하는 것은 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하는데 사용된다. 이와 같은 세포는 아데노바이러스를 패키징하는 293개의 세포, 및 레트로바이러스를 패키징하는 ψ2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 치료에 사용되는 바이러스 벡터는 보통 바이러스 입자 내로 핵산 벡터를 패키징하는 생산자(producer) 세포주에 의해 생성된다. 벡터는 전형적으로 숙주 내로의 패키징 및 후속적인 통합을 위해 필요로 하는 최소한의 바이러스 서열을 함유하고(적용가능하다면), 다른 바이러스 서열은 발현될 단백질을 암호화하는 발현 카세트에 의해 대체된다. 결함이 있는 바이러스 기능은 패키징 세포주에 의해 트랜스로 공급된다. 예를 들어, 유전자 치료에 사용되는 AAV 벡터는 통상적으로 숙주 게놈 내로의 패키징 및 통합을 위해 필요로 하는 AAV 게놈으로부터의 역위 말단 반복(inverted terminal repeat: ITR)(숙주 게놈 내로의 패키징 및 통합에 필요함)만을 가진다. 바이러스 DNA는 세포주에서 패키징되며, 다른 AAV 유전자, 즉 rep 및 cap를 암호화하지만, ITR 서열은 없는 보조 플라스미드를 함유한다. 세포주는 또한 보조자로서 아데노바이러스로 감염된다. 보조 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 보조 플라스미드 유래 AAV 유전자의 발현을 촉진한다. 보조 플라스미드는 ITR 서열의 결핍으로 인하여 상당한 양으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은, 예를 들어 AAV보다 아데노바이러스가 더 민감한 가열 처리에 의해 감소될 수 있다.
다수의 유전자 치료 적용에서, 유전자 치료 벡터가 특정 조직 유형으로 높은 특이도를 가지고 전달되는 것이 바람직하다. 따라서, 바이러스 벡터는, 바이러스의 외부 표며 상 바이러스 외피 단백질과의 융합 단백질로서 리간드를 발현함으로써 주어진 세포 유형에 대하여 특이성을 가지도록 개질될 수 있다. 관심의 세포 유형에 존재하는 것으로 공지된 수용체에 대하여 친화성을 가지는 리간드가 선택된다. 예를 들어, 문헌[Han et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 92:9747-9751 (1995)]은 몰로니 설치류 백혈병 바이러스는 gp70에 융합된 인간 헤레굴린을 발현하도록 개질될 수 있으며, 재조합 바이러스는 인간 표피 성장 인자를 발현하는 임의의 인간 유방암 세포를 감염시킨다. 이러한 원리는 다른 바이러스-표적 세포 쌍으로 확장될 수 있는데, 여기서 표적 세포는 수용체를 발현하고 바이러스는 세포-표면 수용체에 대한 리간드를 포함하는 융합 단백질을 발현한다. 예를 들어, 사상 파지는 사실상 임의의 선택된 세포 수용체에 대하여 특이적 결합 친화도를 가지는 항체 단편(예를 들어, FAB 또는 Fv)를 나타내도록 조작될 수 있다. 상기 설명은 바이러스 벡터에 주로 적용되지만, 동일한 원리가 비바이러스 벡터에 적용될 수 있다. 이와 같은 벡터는 특이적인 표적 세포에 의한 흡수를 선호하는 특이적 흡수 서열을 포함하도록 조작될 수 있다.
유전자 치료 벡터는 하기 기재된 바와 같이, 개별적인 환자로의 투여에 의해, 전형적으로는 전신 투여(예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 또는 두개내 주입) 또는 국소적 적용에 의해 생체내로 전달될 수 있다. 대안적으로, 보통 벡터를 포함한 세포에 대한 선택 후, 벡터는 생체외 세포, 예를 들어 개별적인 환저로부터 외식된 세포(예를 들어, 림프구, 골수 흡입, 조직 생검) 또는 보편적인 공여체 조혈 줄기 세포로 전달된 다음, 환자로 세포를 재이식할 수 있다.
뉴클레아제 및/또는 공여체 구조체를 함유하는 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 리포좀 등)는 또한 생체내에서 세포의 형질도입을 위하여 유기체에 직접적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 네이키드 DNA가 투여될 수 있다. 투여는 혈액 또는 조직 세포와의 최종적인 접촉에 분자를 도입하는데 정상적으로 사용되는 임의의 경로에 의하며, 상기 경로는 주사, 주입, 국소 적용 및 전기천공을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 이와 같은 핵산을 투여하는 적당한 방법이 이용가능하며 이는 당업자에게 널리 공지되어 있고, , 초과의 경로가 특정 조성물을 투여하는데 사용될 수 있지만, 특정 경로가 종종 다른 경로보다 더 간접적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드의 도입에 적당한 벡터는 비통합 렌티바이러스 벡터(non-integrating lentivirus vector: IDLV)를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Ory et al. (1996) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:11382-11388]; [Dull et al. (1998) J. Virol . 72:8463-8471]; [Zuffery et al. (1998) J. Virol . 72:9873-9880]; [Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222]; 미국 특허공개 제2009/054985호를 참조한다.
약학적으로 허용가능한 운반체는 부분적으로 투여될 특정 조성물뿐만 아니라 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 하기 기재된 바와 같이, 이용가능한 약학 조성물의 광범위하게 다양한 적당한 제형이 있다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989] 참조).
뉴클레아제-암호화 서열 및 공여체 구조체는 동일 또는 상이한 시스템을 사용하여 전달될 수 있음이 분명할 것이다. 예를 들어, 공여체 폴리뉴클레오타이드는 플리스미드에 의해 운반될 수 있는 한편, 하나 이상의 뉴클레아제는 AAV 벡터에 의해 운반될 수 있다. 또한, 상이한 벡터는 동일 또는 상이한 경로(근육내 주사, 꼬리 정맥 주사, 다른 정맥내 주사, 복강내 투여 및/또는 근육내 주사)에 의해 투여될 수 있다. 벡터는 동시에 또는 임의의 순차적인 순서로 전달될 수 있다.
생체외 및 생체내 투여 둘 다에 대한 제형은 액체 상태의 현탁액 또는 유화 액체를 포함한다. 활성 성분은 종종 약학적으로 허용가능하고 활성 성분과 혼화성인 부형제와 혼합된다. 적당한 부형제로는 예를 들어 물, 염분, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 및 이들의 조합물을 포함한다. 추가적으로, 조성물은 소량의 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정화제 또는 약학 조성물의 유효성을 향상시키는 다른 시약을 함유할 수 있다.
적용
본 발명의 방법 및 조성물은 임의의 환경에서 사용도리 수 있으며, 여기서 단백질(들)이 표적화된 세포로부터 분비되도록 하나 이상의 단백질을 암호화하는 이식 유전자를 공급하는 것이 요구된다. 따라서, 이러한 기술은 환자가 문제(예를 들어 발현 수준에서의 문제, 또는 저기능 또는 무기능으로 발현되는 단백질에 관한 문제)로 인하여 일부 단백질이 결핍된 상태인 병태에서 사용된다. 본 발명의 이용과 함께 특히 유용한 것은 이식 유전자의 발현으로 응고 장애에서 기능을 교정 또는 회복시키는 것이다. 추가적으로, A1AT-결핍 장애, 예컨대 COPD 또는 간 손상, 또는 분비 기관에 의한 외인성 단백질의 공급에 의하여 완화될 수 있는 다른 장애, 병태 또는 질환은 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 성공적으로 치료될 수 있다. 당뇨병과 같은 대사 질환인, 리소좀 축적병은 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있다.
치료적으로 유용하고 전형적으로 주사 또는 주입에 의해 전달되는 단백질은 또한 본 발명의 방법 및 조성물과 함께 유용하다. 비제한적인 예로서, 당뇨병 치료에서의 사용을 위한 C-펩타이드(예를 들어, 세빅스(Cebix) 제품인 에르사타(Ersatta(상표명))) 또는 인슐린의 생성. 추가 적용은 콜라겐 VII의 생성을 통한 수포성 표피 박리증의 치료를 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 분비 조직에서 IGF-1의 발현은 간경변증 및 지방단백질 리파제의 발현에 의한 지방단백질 리파제 결핍이 있는 환자에서 이 단백질의 수준을 증가시키는데 사용될 수 있다. 항체는 또한 치료적 이익, 예를 들어 암, 자가면역 및 다른 질환의 치료를 위해 분비될 수 있다. 응고와 관련된 다른 단백질은 분비 조직에서 생성되며, 피브리노겐, 프로트롬빈, 조직 인자, 인자 V, 인자 XI, 인자 XII(하게만 인자(Hageman factor)), 인자 XIII(피브린-안정화 인자), 폰빌레브란트인자(von Willebrand factor), 프리칼리크레인, 고분자량 키니노겐(피츠제럴드(Fitzgerald) 인자), 피브로넥틴, 항트롬빈 III, 헤파린 보조인자 II, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 단백질 Z-관련 프로테아제 억제제, 플라스미노겐, 알파 2-항플라스민, 조직 플라스미노겐 활성인자, 유로키나제, 플라스미노겐 활성인자 억제제-1 및 플라스미노겐 활성인자 억제제-2를 포함한다.
하기 실시예는, 뉴클레아제가 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN) 또는 TALEN을 포함하는 본 개시내용의 예시적인 실시형태에 관한 것이다. 이는 단지 예시의 목적을 위한 것이고 다른 뉴클레아제, 예를 들어 조작된 DNA-결합 도메인을 가지는 호밍 핵산내부가수분해효소(메가뉴클레아제) 및/또는 조작된 호밍 핵산내부가수분해효소(메가뉴클레아제) DNA-결합 도메인과 이종 절단 도메인의 자연적으로 발생하는 융합물이 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
실시예
실시예 1: 마우스 알부민 유전자에 대하여 표적화된 징크 핑거 단백질 뉴클레아제(ZFN)의 설계, 구조 및 특성화
징크 핑거 단백질은 마우스 알부민 유전자의 인트론 1, 12 및 13 내 절단 위치를 표적화하도록 설계되었다. 해당하는 발현 구조체는 플라스미드 내로 집합하고 통합되었다. AAV 또는 아데노바이러스 벡터는 본질적으로 문헌[Urnov et al. (2005) Nature 435(7042):646-651], [Perez et al (2008) Nature Biotechnology 26(7):808-816]에 기재된 바와 같고, 미국 특허 제6,534,261호에 기재된 바와 같다. 표 1은 예시적인 마우스 알부민 특이적 ZFP의 DNA 결합 도메인 내 인식 나선형을 나타내는 한편, 표 2는 이들 ZFP에 대한 표적 위치를 나타낸다. ZFP 인식 나선형에 의해 접촉되는 표적 위치의 뉴클레오타이드는 대문자로 표시되어 있고; 비접촉 뉴클레오타이드는 소문자로 표시되어 있다.
뮤린 알부민-특이적 징크 핑거 뉴클레아제 나선형 설계
표적
SBS #		 설계
F1 F2 F3 F4 F5 F6
인트론 1
30724		 TSGSLTR
(서열번호 1)		 RSDALST
(서열번호 2)		 QSATRTK
(서열번호 3)		 TSGHLSR
(서열번호 4)		 QSGNLAR
(서열번호 5)		 NA
인트론 1
30725		 RSDHLSA
(서열번호 6)		 TKSNRTK
(서열번호 7)		 DRSNLSR
(서열번호 8)		 WRSSLRA
(서열번호 9)		 DSSDRKK
(서열번호 10)		 NA
인트론 1
30732		 TSGNLTR
(서열번호 11)		 DRSTRRQ
(서열번호 12)		 TSGSLTR
(서열번호 1)		 ERGTLAR
(서열번호 13)		 TSANLSR
(서열번호 14)		 NA
인트론 1
30733		 DRSALAR
(서열번호 15)		 RSDHLSE
(서열번호 16)		 HRSDRTR
(서열번호 17)		 QSGALAR
(서열번호 18)		 QSGHLSR
(서열번호 19)		 NS
인트론 13
30759		 RSDNLST
(서열번호 20)		 DRSALAR
(서열번호 15)		 DRSNLSR
(서열번호 8)		 DGRNLRH
(서열번호 21)		 RSDNLAR
(서열번호 22)		 QSNALNR
(서열번호 23)
인트론 13
30761		 DRSNLSR
(서열번호 8)		 LKQVLVR
(서열번호 24)		 QSGNLAR
(서열번호 5)		 QSTPLFA
(서열번호 25)		 QSGALAR
(서열번호 18)		 NA
인트론 13
30760		 DRSNLSR
(서열번호 8)		 DGRNLRH
(서열번호 21)		 RSDNLAR
(서열번호 22)		 QSNALNR
(서열번호 23)		 NA NA
인트론 13
30767		 RSDNLSV
(서열번호 26)		 HSNARKT
(서열번호 27)		 RSDSLSA
(서열번호 28)		 QSGNLAR(서열번호 5) RSDSLSV
(서열번호 29)		 QSGHLSR
(서열번호 19)
인트론 13
30768		 RSDNLSE
(서열번호 30)		 ERANRNS
(서열번호 31)		 QSANRTK
(서열번호 32)		 ERGTLAR
(서열번호 13)		 RSDALTQ
(서열번호 33)		 NA
인트론 13
30769		 TSGSLTR
(서열번호 1)		 DRSNLSR
(서열번호 8)		 DGRNLRH
(서열번호 21)		 ERGTLAR
(서열번호 13)		 RSDALTQ
(서열번호 33)		 NA
인트론 12
30872 		QSGHLAR
(서열번호 34)		 RSDHLTQ
(서열번호 35)		 RSDHLSQ
(서열번호 36)		 WRSSLVA
(서열번호 37)		 RSDVLSE
(서열번호 38)		 RNQHRKT
(서열번호 39)
인트론 12
30873		 QSGDLTR
(서열번호 40)		 RSDALAR
(서열번호 41)		 QSGDLTR
(서열번호 40)		 RRDPLIN
(서열번호 42)		 RSDNLSV
(서열번호 26)		 IRSTLRD
(서열번호 43)
인트론 12
30876		 RSDNLSV
(서열번호 26)		 YSSTRNS
(서열번호 44)		 RSDHLSA
(서열번호 6)		 SYWSRTV
(서열번호 45)		 QSSDLSR
(서열번호 46)		 RTDALRG
(서열번호 47)
인트론 12
30877		 RSDNLST
(서열번호 20)		 QKSPLNT
(서열번호 48)		 TSGNLTR
(서열번호 11)		 QAENLKS
(서열번호 49)		 QSSDLSR
(서열번호 46)		 RTDALRG
(서열번호 47)
인트론 12
30882		 RSDNLSV
(서열번호 26)		 RRAHLNQ
(서열번호 50)		 TSGNLTR
(서열번호 11)		 SDTNRFK
(서열번호 51)		 RSDNLST
(서열번호 20)		 QSGHLSR
(서열번호 19)
인트론 12
30883		 DSSDRKK
(서열번호 10)		 DRSALSR
(서열번호 52)		 TSSNRKT
(서열번호 53)		 QSGALAR
(서열번호 18)		 RSDHLSR
(서열번호 54)		 NA
뮤린 알부민-특이적 ZFN의 표적 위치
표적 SBS # 표적 위치
인트론 1 30724 ctGAAGGTgGCAATGGTTcctctctgct (서열번호 55)
인트론 1 30725 ttTCCTGTAACGATCGGgaactggcatc (서열번호 56)
인트론 1 30732 aaGATGCCaGTTCCCGATcgttacagga (서열번호 57)
인트론 1 30733 agGGAGTAGCTTAGGTCagtgaagagaa (서열번호 58)
인트론 13 30759 acGTAGAGAACAACATCTAGattggtgg (서열번호 59)
인트론 13 30761 ctGTAATAGAAACTGACttacgtagctt (서열번호 60)
인트론 13 30760 acGTAGAGAACAACatctagattggtgg (서열번호 59)
인트론 13 30767 agGGAATGtGAAATGATTCAGatatata (서열번호 61)
인트론 13 30768 ccATGGCCTAACAACAGtttatcttctt (서열번호 62)
인트론 13 30769 ccATGGCCtAACAACaGTTtatcttctt (서열번호 62)
인트론 12 30872 ctTGGCTGTGTAGGAGGGGAgtagcagt (서열번호 63)
인트론 12 30873 ttCCTAAGTTGGCAGTGGCAtgcttaat (서열번호 64)
인트론 12 30876 ctTTGGCTTTGAGGATTAAGcatgccac (서열번호 65)
인트론 12 30877 acTTGGCTcCAAGATTTATAGccttaaa (서열번호 66)
인트론 12 30882 caGGAAAGTAAGATAGGAAGgaatgtga (서열번호 67)
인트론 12 30883 ctGGGGTAAATGTCTCCttgctcttctt (서열번호 68)
실시예 2: 뮤린 알부민-특이적 ZFN의 활성
표 1의 ZFN을 마우스 세포에서 내인성 표적 서열을 절단하는 능력에 대하여 시험하였다. 이를 성취하기 위하여, 표 1의 ZFN을 발현하는 구조체를 도 1에 나타낸 쌍형성으로 Neuro2A 세포 내로 형질감염시켰다. 그 후, 세포를 37℃에서 3일 동안 유지시키거나 또는 저온 충격(30℃, 공유인 미국 특허공개 제20110041195호 참조)을 주었다. 그 후, 게놈 DNA를 디엔이지(DNeasy) 키트(퀴아젠(Qiagen) 제품)를 사용하여 Neuro2A 세포로부터 단리하고 ZFN-절단에 의해 유도된 염색체 개질을 정량화하기 위하여 문헌[Perez et al, (2008) Nat. Biotechnol. 26: 808-816] 및 [Guschin et al, (2010) Methods Mol Biol. 649:247-56]에 기재된 바와 같이 Cel-I 분석(서베이어(상표명), 트랜스제노믹 제품)을 하였다. 이 분석에서, ZFN 표적 위치를 보유하는 DNA 단편을 증폭시키는데 PCR을 사용한 다음, 생성된 앰플리콘을 미스매치-특이적 뉴클레아제 Cel-I(Yang et al, (2000) Biochemistry 39, 3533-3541)로 분해한 다음, 아가로스 겔 상에서 원래의 앰플리콘과 절단된 앰플리콘을 분해하였다. 앰플리콘 절단 정도를 정량화함으로써, 앰플리콘 내 돌연변이된 대립유전자의 분획이 계산될 수 있고, 따라서 원래 세포 풀(pool)에서의 분획이 계산될 수 있다. 이들 실험에서, 모든 ZFN 쌍은 ELD/KKR FokI 돌연변이 쌍이었다(상기 기재됨).
Cel-I 분석으로부터의 결과는 도 1에 표시되어 있으며, ZFN이 각각의 표적 위치에서 절단 및 그 결과로 일어나는 돌연변이를 유도할 수 있음을 입증한다. 각각의 레인 아래에 나타낸 "삽입결실 백분율" 값은 성공적으로 절단되고 그 후 NHEJ를 통하여 이중가닥 파괴의 세포 수선 동안 돌연변이된 ZFN 표적의 분획물을 나타낸다. 데이터는 또한 형질도입 과정이 저온 충격을 포함할 때 활성이 증가되었음을 입증한다.
실시예3 : 개 알부민-특이적 ZFN
개 알부민 좌위를 표적화하는 ZFN의 쌍을 생체내 모델에서의 사용을 위하여 구성하였다. 쌍은 실시예 1에 기재된 바와 같이 구성하였으며, 하기 표 3에 표시되어 있다. 각각의 ZFN에 대한 표적은 표 4에 제공되어 있다.
개 알부민-특이적 징크 핑거 뉴클레아제 나선형 설계
표적 SBS #
F1 F2 F3 F4 F5
인트론 1 33115 QRSNLDS
(서열번호 83)		 QSSDLSR
(서열번호 46)		 YHWYLKK
(서열번호 84)		 RSDDLSV
(서열번호 85)		 TSSNRTK
(서열번호 86)
인트론 1 34077 QSGNLAR
(서열번호 5)		 QYTHLVA
(서열번호 87)		 RSDHLST
(서열번호 88)		 RSDARTT
(서열번호 89)		 DRSALAR
(서열번호 15)
개 알부민-특이적 ZFN의 표적 위치
표적 SBS # 표적 위치
인트론 1 33115 agTATTCGTTTGCTcCAAaatatttgcc (서열번호 90)
인트론 1 34077 aaGTCATGTGGAGAGAAacacaaagagt (서열번호 91)
개 특이적 ZFN은 개 세포주 D17을 사용한 것을 제외하고, 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 활성에 대하여 시험관내에서 시험하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, ZFN은 본 연구에서 약 30% 삽입결실을 생성하는 것으로 나타났다.
실시예 4: 비인간 영장류 알부민 특이적 ZFN
붉은털 짧은꼬리 원숭이(마카카 물라타(Macaca mulatta))에서 알부민 좌위를 표적화하는 ZFN을 또한 만들었다. 쌍은 상기 기재된 바와 같이 구성하였으며, 하기 표 5에 표시되어 있다. ZFN에 대한 표적은 표 6에 표시되어 있다. 하기에 나타낸 바와 같이, SBS# 35396에 있어서 결합 위치에 대한 인간(서열번호 92) 및 붉은털 짧은꼬리 원숭이(서열번호 93) 서열(하기 표 7 및 8 참조)은 완벽하게 보존되어 있다. 인간과 붉은털 원숭이 서열간의 차이는 박스로 표시되어 있다.
Figure 112019083293942-pat00001
따라서, 붉은털 원숭이 알부민 특이적 쌍의 개발을 위하여, 35396은 붉은털 원숭이에서 인간 35364 파트너를 대체하도록 설계된 일련의 파트너와 쌍을 형성하였다. 이들 단백질은 하기(표 5)에 표적 서열(표 6)과 함께 표시되어 있다.
붉은털 원숭이 알부민-특이적 징크 핑거 뉴클레아제 나선형 설계
표적 SBS #
붉은털 원숭이 F1 F2 F3 F4 F5
인트론 1
36813		 QSGNLAR
(서열번호 5)		 HLGNLKT
(서열번호 94)		 LKHHLTD
(서열번호 95)		 DRSNLSR
(서열번호 8)		 RLDNRTA
(서열번호 96)
인트론 1 36808 QSGNLAR
(서열번호 5)		 LMQNRNQ
(서열번호 97)		 LKHHLTD
(서열번호 95)		 DRSNLSR
(서열번호 8)		 RSDHLTT
(서열번호 98)
인트론 1 36820 QRSNLVR
(서열번호 99)		 LRMNLTK
(서열번호 100)		 LKHHLTD
(서열번호 95)		 DRSNLSR
(서열번호 8)		 RSDHLTT
(서열번호 98)
인트론 1 36819 QRSNLVR
(서열번호 99)		 LRMNLTK
(서열번호 100)		 LKHHLTD
(서열번호 95)		 DRSNLSR
(서열번호 8)		 RSDHLTQ
(서열번호 35)
인트론 1 36806 QSGNLAR
(서열번호 5)		 LMQNRNQ
(서열번호 97)		 LKHHLTD
(서열번호 95)		 DRSNLSR
(서열번호 8)		 RSDHLTQ
(서열번호 35)
붉은털 원숭이 알부민-특이적 ZFN의 표적 위치
표적 SBS # 표적 위치
인트론 1 36813 ttAGGGACAGTTATGAAttcaatcttca (서열번호 101)
인트론 1 36808 ttAGGGACAGTTATGAAttcaatcttca (서열번호 101)
인트론 1 36820 ttAGGGACAGTTATGAAttcaatcttca (서열번호 101)
인트론 1 36819 ttAGGGACAGTTATGAAttcaatcttca (서열번호 101)
인트론 1 36806 ttAGGGACAGTTATGAAttcaatcttca (서열번호 101)
가장 큰 활성을 가지는 쌍을 결정하기 위하여 붉은털 원숭이 알부민 특이적 ZFN은 쌍을 지어서 시험하였다. 각각의 쌍에서, SBS#35396은 상기 기재된 방법을 사용하여 붉은털 원숭이 세포주 RF/6A에서 표 5 및 6에 나타낸 잠재적인 파트너와 함께 시험하였다.
Cel-I 분석을 사용하여 검출된 미스매치의 백분율에 의해 결정된 바와 같이, 결과로 나타난 활성은 행렬(표 7)의 본문에 표시되어 있으며, ZFN 쌍이 붉은털 원숭이 알부민 좌위에 대하여 활성을 가짐을 입증한다.
붉은털 짧은꼬리 원숭이 알부민 좌위에서의 활성
36813 36808 36820 36819 36806
35396 21% 26% 23% 30% 20.5%
SELEX 분석 및 시험관내 활성에 대한 각각의 쌍의 적정에 의해 서열 특이성을 비교함으로써, 2개의 쌍을 보다 광범위하게 시험하였다. 결과는 35396/36806 쌍이 가장 바람직한 선도 쌍이었음을 입증한다(도 12 참조).
인간 알부민 좌위의 서열과 다른 비인간 영장류의 서열의 비교는 유사한 쌍이 게먹이 원숭이와 같은 다른 영장류에서의 연구를 위하여 개발될 수 있음을 입증한다(도 3a 및 도 3b 참조).
실시예 5: 마우스내 ZFN에 의한 생체내 절단
알부민-특이적 ZFN을 알부민 생성의 정상적인 위치인 생체내 간으로 전달하기 위하여, 본 발명자들은 간-특이적 인핸서 및 프로모터로부터 알부민-특이적 ZFN을 발현하는, 간친화성 아데노연관 바이러스 벡터, 혈청형 8을 생성하였다(Shen et al, 상기 참조 및 Miao et al, 상기 참조). 성체 C57BL/6 마우스는 다음과 같은 알부민 유전자에서 게놈 편집을 받았다: 성체 마우스를 i.v.(정맥내) 주사에 의해 ZFN 쌍 1(SBS 30724 및 SBS 30725), 또는 ZFN 쌍 2(SBS 30872 및 SBS 30873)의 1 x 1011 v.g.(바이러스 게놈)/마우스로 처치하고 7일 후 희생시켰다. 쌍 1에 대한 표적 위치를 포함하는 알부민 유전자의 영역은 하기 2개의 PCR 프라이머를 사용하여 Cel-I 미스매치 분석을 위하여 PCR로 증폭시켰다:
Cel1 F1: 5' CCTGCTCGACCATGCTATACT 3'(서열번호 69)
Cel1R1: 5' CAGGCCTTTGAAATGTTGTTC 3'(서열번호 70)
쌍 2에 대한 표적 위치를 포함하는 알부민 유전자의 영역은 이들 PCR 프라이머를 사용하여 Cel-I 분석을 위하여 PCR로 증폭시켰다:
mAlb set4F4: 5' AAGTGCAAAGCCTTTCAGGA 3' (서열번호 71)
mAlb set4R4: 5' GTGTCCTTGTCAGCAGCCTT 3' (서열번호 72)
도 4에 나타낸 바와 같이, ZFN은 이 연구에서 생체내 표적 위치의 최대 17%까지로 삽입결실을 유도한다.
또한 인트론 1에서 서열을 표적화하는 마우스 알부민 특이적인 ZFN SBS30724 및 SBS30725를 두번째 연구에서 시험하였다. ZFN의 발현용 유전자를 앞서 기재한 바와 같이 AAV2/8 벡터에 도입하였다(Li et al (2011) Nature 475 (7355): 217). 바큘로바이러스 시스템에서 AAV 생성을 용이하게 하기 위하여, 키메라 혈청형 8.2 캡시드 유전자를 함유하는 바큘로바이러스를 사용하였다. 혈청형 8.2 캡시드는 AAV8의 캡시드 단백질 VP1에서 포스포리파제 A2 도메인이 키메라 캡시드를 형성하는 AAV2 캡시드 유래의 비슷한 도메인으로 대체되었다는 점에서 혈청형 8 캡시드와 상이하다. 바이러스 입자를 함유하는 ZFN의 생성은 HEK293 시스템 또는 당업계의 표준 방법을 사용하는 바큘로바이러스 시스템을 사용하는 제조에 의해 수행하였다(문헌[Li et al, 상기 참조] 참조, 예를 들어 미국 제6723551호 참조). 그 후, 마우스 알부민-특이적 ZFN을 암호화하는 AAV2/8 또는 AAV2/8.2의 1.0e11 전체 벡터 게놈의 200마이크로리터의 단일 용량을 사용하여 바이러스 입자를 정상 수컷 마우스(n=6)에 투여하였다. rAAV 벡터의 투여 후 제14일에, 마우스를 희생시키고, 간을 회수하였으며, 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 DNA 또는 전체 단백질에 대하여 진행하였다. AAV 벡터 게놈 복사체의 검출은 정량적 PCR에 의해 실행하였다. 간단하게, 다음과 같이 AAV 내부 bGHpA 서열에 특이적인 qPCR 프라이머를 만들었다:
올리고200 (정방향) 5'-GTTGCCAGCCATCTGTTGTTT-3' (서열번호 102)
올리고201 (역방향) 5'-GACAGTGGGAGTGGCACCTT-3'(서열번호 103)
올리고202 (프로브) 5'-CTCCCCCGTGCCTTCCTTGACC-3' (서열번호 104)
ZFN의 절단 활성을 LC-GX 장치(퍼킨엘머(Perkin Elmer) 제품)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라서 실행되는 Cel-I 분석을 사용하여 측정하였다. 생체내 ZFN의 발현은 표준 방법에 따라서 플래그-태그를 사용하여 측정하였다.
도 5(본 연구에서 각각의 마우스에 대함)에 나타낸 바와 같이, ZFN이 발현되었고, 마우스 간 유전자에서 표적을 절단한다. 각각의 마우스 샘플에서 생성된 % 삽입결실은 각각의 레인의 하단에 제공되어 있다. 벡터의 유형 및 이의 내용물은 레인의 위에 표시되어 있다. ZFN 절단 후 미스매치 수선(% 삽입결실로 나타냄)은 일부 마우스에서 거의 16%로 검출되었다.
또한 AAV2/5, AAV2/6, AAV2/8 및 AAV2/8.2를 포함한 다양한 AAV 혈청형의 사용을 통하여 전달될 때, 마우스 특이적 알부민 ZFN을 생체 내 활성에 대하여 시험하였다. 이들 AAV 벡터에서, 모든 ZFN 암호화 서열은 AAV2 ITS에 측접되며, 포함하고, 그 후 각각 AAV5, 6, 또는 8 유래의 캡시드 단백질을 사용하여 캡슐화된다. 8.2라는 명칭은 상기 기재한 바와 동일하다. SBS30724 및 SBS30725 ZFN을 앞서 기재한 바와 같이 AAV 내로 클로닝하고(Li et al, 상기 참조), 바이러스 입자를 상기 기재한 바와 같은 HEK293 일시적 형질감염 정제 또는 바큘로바이러스를 사용하여 제조하였다. 용량 당 5e10 내지 1e12 vg의 용량으로, 꼬리 주사를 통하여 마우스당 200㎕의 부피로 정상적인 마우스에서 투약을 수행하였다. 2배체 마우스 게놈 당 바이러스 게놈을 제14일에 분석하였고, 제30일 및 제60일에 분석한다. 추가적으로, 알부민 좌위의 ZFN 지정 절단을 앞서 기재한 바와 같이 제14일에 Cel-I 분석에 의해 분석하였고, 제30일 및 제60일에 분석한다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 최대 21% 삽입결실의 수준으로 절단이 관찰되었다. 또한 비교로서 이전 연구로부터의 샘플이 도면에 포함되어 있다(가장 우측, "미니-마우스" 연구-14일 및 배경 밴드("비특이적 밴드").
실시예 6: 공여체 핵산 및 알부민 ZFN의 생체내 동시 전달
인간 인자 IX: ZFN을 성체 야생형 마우스에서의 알부민 좌위로 응고 단백질 인자 IX(F.IX)에 대한 유전자를 통합하는 것을 표적화하는데 사용하였다. 이들 실험에서, 인트론 1 + 공여체("mAlb(인트론1)")를 표적화하는 마우스 알부민-특이적 ZFN 쌍 1 당 1 x 1011 v.g., 인트론 12 + 공여체("mAlb(인트론12)")를 표적화하는 마우스 알부민-특이적 ZFN 쌍 2 당 1 x 1011 v.g., 또는 대조군으로서 인간 유전자와 공여체를 표적화하는 ZFN 세트("대조군")로 I.V. 주사에 의해 마우스를 처리하였다. 인트론 1을 표적화하는 ZFN 쌍 #1은 30724/30725이었고, 엑손 12를 표적화하는 ZFN 쌍 2는 30872/30873이었다. 이들 실험에서, F.IX 공여체 이식 유전자는 ZFN-유도 절단 후 말단 포획을 통하여 통합되었다. 대안적으로, 절단 위치에 상동성인 팔이 이식 유전자에 측접하도록, F.IX 이식 유전자를 공여체 벡터로 삽입하였다. 각각의 경우에서, F.IX 이식 유전자는 "SA - 야생형 hF9 엑손 2-8" 카세트이었다(공유인 미국 특허출원 제61/392,333호 참조).
그 후 형질도입된 마우스를 혈청 인간 F.IX 수준에 대하여 샘플 조사하였으며, 상기 혈청 인간 F.IX 수준은 상승하였다(도 7(인트론 1로의 삽입 후 적어도 8주 동안 인간 F.IX의 안정화된 발현을 나타냄) 참조). 알부민 좌위로 표적화된 인간 F.IX 이식 유전자를 가지는 혈우병 마우스에서 응고 시간의 감소에 의해 입증된 바와 같이, 발현된 인간 F.IX는 또한 기능성이다(도 8 참조). 특히, 이식 유전자 삽입 후 2주 내에, 응고 시간은 야생형 마우스에서의 응고 시간과 유의적으로 상이하지 않다. 인트론 1 특이적 공여체가 인트론 12 좌위로 삽입될 때, huF.IX의 발현을 가져오는 올바른 스플라이싱은 일어날 수 없다. 이 샘플에서 신호의 결핍은 인트론 1 위치로 삽입될 인트론 1 공여체로부터의 신호가 정말로 올바른 이식 유전자 통합에 의한 것이며, 다른 비특이적 위치에서 무작위적인 통합 및 발현에 의한 것이 아님을 입증한다.
인간 알파 갈락토시다제(huGLa)의 삽입: 인간 F.IX 유전자의 삽입과 유사하게, 인간 알파 갈락토시다제를 암호화하는 유전자(파브리병이 있는 환자에서 결핍됨)를 마우스 알부민 좌위에 삽입하였다. F.IX 이식 유전자 대신에 알파 갈락토시다제 이식 유전자를 사용하여 상기 기재한 바와 같이 ZFN 쌍 30724/30725를 사용하였다. 이 실험에서, 마우스 당 3.0e11 바이러스 게놈의 용량으로 ZFN 쌍을 함유하는 AAV2/8 바이러스, 및 마우스 당 1.5e12 바이러스 게놈으로 huGLa 공여체를 함유하는 AAV2/8 바이러스로 3마리의 마우스를 처리하였다. 대조군 동물에는 ZFN 함유 바이러스만 또는 huGLa 공여체 바이러스만을 주었다. 간 호모제네이트에 대하여 수행한 웨스턴 블롯은 알파 갈락토시다제-특이적 신호의 증가를 나타내었으며, 이는 알파 갈락토시다네 유전자가 통합되고 발현되고 있음을 나타낸다(도 13a). 추가적으로, 인간 알파 갈락토시다제 분석 키트(시노(Sino) 제품)를 제조자의 프로토콜에 따라서 사용하여 간 용해물에 대하여 ELISA를 실행하였다. 도 13B에 나타낸 결과는 ZFN 및 huGLa 공여체 둘 다로 처치한 마우스에서 신호의 증가를 입증하였다.
실시예 7: 인간 일부민 특이적 ZFN의 설계.
인간 알부민 유전자에 대하여 특이성을 가지는 ZFN을 설계하기 위하여, 인간 알부민 인트론 1의 DNA 서열을 앞서 기재한 방법을 사용하여 분석하여 ZFN 결합에 대하여 가장 우수한 잠재력을 가지는 표적 서열을 확인하였다. 인트론(좌위 1~5) 전체에 걸친 영역을 선택하고, 몇몇 ZFN을 이들 영역을 표적화하도록 설계하였다(예를 들어, 좌위 1~3으로부터의 ZFN의 결합 위치를 나타내는 도 9 참조). 이 분석에서, 5개의 좌위가 알부민 인트론 1에서의 표적으로 확인되었다(도 3b). 표적 및 나선형은 표 8 및 표 9에 표시되어 있다.
인간 알부민-특이적 징크 핑거 뉴클레아제 나선형 설계
표적
SBS #
설계
F1 F2 F3 F4 F5 F6
인트론 1
35393		 QSSDLSR
(서열번호 46)		 LRHNLRA
(서열번호 105)		 DQSNLRA(서열번호 106) RPYTLRL
(서열번호 107)		 QSSDLSR
(서열번호 46)		 HRSNLNK
(서열번호 108)
인트론 1
35394		 QSSDLSR
(서열번호 46)		 HRSNLNK
(서열번호 108)		 DQSNLRA
(서열번호 106)		 RPYTLRL
(서열번호 107)		 QSSDLSR
(서열번호 46)		 HRSNLNK
(서열번호 108)
인트론 1
35396		 QSSDLSR
(서열번호 46)		 LKWNLRT
(서열번호 109)		 DQSNLRA
(서열번호 106)		 RPYTLRL
(서열번호 107)		 QSSDLSR
(서열번호 46)		 HRSNLNK
(서열번호 108)
인트론 1
35398		 QSSDLSR
(서열번호 46)		 LRHNLRA
(서열번호 105)		 DQSNLRA
(서열번호 106)		 RPYTLRL
(서열번호 107)		 QSSDLSR
(서열번호 46)		 HRSNLNK
(서열번호 108)
인트론 1
35399		 QSSDLSR
(서열번호 46)		 HRSNLNK
(서열번호 108)		 DQSNLRA
(서열번호 106)		 RPYTLRL
(서열번호 107)		 QSSDLSR
(서열번호 46)		 HRSNLNK
(서열번호 108)
인트론 1
35405		 QSSDLSR
(서열번호 46)		 WKWNLRA
(서열번호 110)		 DQSNLRA
(서열번호 106)		 RPYTLRL
(서열번호 107)		 QSSDLSR
(서열번호 46)		 HRSNLNK
(서열번호 108)
인트론 1
35361		 QSGNLAR
(서열번호 5)		 LMQNRNQ
(서열번호 9		 LKQHLNE
(서열번호 111)		 TSGNLTR
(서열번호 11)		 RRYYLRL
(서열번호 112)		 N/A
인트론 1
35364		 QSGNLAR
(서열번호 5)		 HLGNLKT
(서열번호 94)		 LKQHLNE
(서열번호 111)		 TSGNLTR
(서열번호 11)		 RRDWRRD
(서열번호 113)		 N/A
인트론 1
35370		 QSGNLAR
(서열번호 5)		 LMQNRNQ
(서열번호 9		 LKQHLNE
(서열번호 111)		 TSGNLTR
(서열번호 11)		 RRDWRRD
(서열번호 113)		 N/A
인트론 1
35379		 QRSNLVR
(서열번호 99)		 TSSNRKT
(서열번호 53)		 LKHHLTD
(서열번호 95)		 TSGNLTR
(서열번호 11)		 RRDWRRD
(서열번호 113)		 N/A
인트론 1
35458		 DKSYLRP
(서열번호 114)		 TSGNLTR
(서열번호 11) 		HRSARKR
(서열번호 115)		 QSSDLSR
(서열번호 46)		 WRSSLKT
(서열번호 116)		 N/A
인트론 1
35480		 TSGNLTR
(서열번호 11)		 HRSARKR
(서열번호 115)		 QSGDLTR
(서열번호 40)		 NRHHLKS
(서열번호 116)		 N/A N/A
인트론 1
35426		 QSGDLTR
(서열번호 40)		 QSGNLHV
(서열번호 117)		 QSAHRKN
(서열번호 118)		 STAALSY
(서열번호 119)		 TSGSLSR
(서열번호 120)		 RSDALAR
(서열번호 41)
인트론 1
35428		 QSGDLTR
(서열번호 40)		 QRSNLNI
(서열번호 121)		 QSAHRKN
(서열번호 118)		 STAALSY
(서열번호 119)		 DRSALSR
(서열번호 52)		 RSDALAR
(서열번호 41)
인트론 1
34931		 QRTHLTQ
(서열번호 122)		 DRSNLTR
(서열번호 123)		 QSGNLAR
(서열번호 5)		 QKVNRAG
(서열번호 124)		 N/A N/A
인트론 1
33940		 RSDNLSV
(서열번호 26)		 QNANRIT
(서열번호 125)		 DQSNLRA
(서열번호 106)		 QSAHRIT
(서열번호 126)		 TSGNLTR
(서열번호 11)		 HRSARKR
(서열번호 115)
인간 알부민-특이적 ZFN의 표적 위치
표적 SBS # 표적 위치
인트론 1
( 좌위 2) 		35393 ccTATCCATTGCACTATGCTttatttaa(서열번호 127)
인트론 1
( 좌위 2) 		35394 ccTATCCATTGCACTATGCTttatttaa(서열번호 127)
인트론 1
( 좌위 2) 		35396 ccTATCCATTGCACTATGCTttatttaa(서열번호 127)
인트론 1
( 좌위 2) 		35398 ccTATCCATTGCACTATGCTttatttaa(서열번호 127)
인트론 1
( 좌위 2) 		35399 ccTATCCATTGCACTATGCTttatttaa(서열번호 127)
인트론 1
( 좌위 2) 		35405 ccTATCCATTGCACTATGCTttatttaa(서열번호 127)
인트론 1
( 좌위 2) 		35361 ttTGGGATAGTTATGAAttcaatcttca(서열번호 128)
인트론 1
( 좌위 2) 		35364 ttTGGGATAGTTATGAAttcaatcttca(서열번호 128)
인트론 1
( 좌위 2) 		35370 ttTGGGATAGTTATGAAttcaatcttca(서열번호 128)
인트론 1
( 좌위 2) 		35379 ttTGGGATAGTTATGAAttcaatcttca(서열번호 128)
인트론 1
( 좌위 3) 		35458 ccTGTGCTGTTGATCTCataaatagaac(서열번호 129)
인트론 1
( 좌위 3) 		35480 ccTGTGCTGTTGATctcataaatagaac(서열번호 129)
인트론 1
( 좌위 3) 		35426 ttGTGGTTTTTAAAtAAAGCAtagtgca(서열번호 130)
인트론 1
( 좌위 3) 		35428 ttGTGGTTTTTAAAtAAAGCAtagtgca(서열번호 130)
인트론 1
( 좌위 4) 		34931
 acCAAGAAGACAGActaaaatgaaaata(서열번호 131)
인트론 1
( 좌위 4) 		33940 ctGTTGATAGACACTAAAAGagtattag (서열번호 132)
가장 큰 활성을 가지는 쌍을 결정하기 위하여 이들 뉴클레아제는 쌍을 지어서 시험하였다. 시험한 쌍의 결과 행렬은 하기 표 10 및 표 11에 표시되어 있으며, 여기서 이량체의 우측에 사용된 ZFN은 각각의 행렬의 상부에 걸쳐서 표시되어 있고, 이량체의 좌측에 사용된 ZFN은 각각의 행렬의 좌측에 열거되어 있다. Cel-I 분석을 사용하여 검출된 미스매치의 백분율에 의해 결정된 바와 같이, 결과로 나타난 활성은 행렬 둘 다의 본문에 표시되어 있다.
인간 알부민-특이적 ZFN의 활성( % 돌연변이된 표적)
35393 35394 35396 35398 35399 35405 평균
35361 18 19 25 22 23 21 21
35364 n.d. 24 23 19 21 21 22
35370 21 19 22 n.d. 22 23 21
35379 21 21 n.d. 19 19 21 20
인간 알부민-특이적 ZFN의 활성( % 돌연변이된 표적)
　 35458 35480 평균
35426 4.5 7 3
35428 4.9 6 3.6
(주: 'n.d.'는 이 쌍에 대한 분석이 수행되지 않았음을 의미함)
따라서, 인간 알부민 인트론 1에서 표적 서열을 인식하는 고도로 활성적인 뉴클레아제가 개발되었다.
실시예 8: 알부민 특이적 TALEN의 설계
인간 알부민 인트론 1 내의 서열을 표적화하도록 TALEN을 설계하였다. 염기 인식은 정준 RVD-염기 대응(canonical RVD-base correspondence)을 사용하여 달성하였다("TALE 코드": A에 대하여는 NI, C에 대하여는 HD, G에 대하여는 NN(절반 반복체에서는 NK), T에 대해서는 NG). TALEN은 앞서 기재한 바와 같이 구성하였다(공유인 미국 특허공개 제20110301073호 참조). TALEN의 서브세트에 대한 표적은 게먹이 원숭이 및 붉은털 짧은꼬리 원숭이 알부민 유전자에서 보존되었다(도 10 참조). TALEN은 미국 제20110301073호에 기재된 바와 같이 "+17" 및 "+63" TALEN 주쇄에서 구성되었다. 시험된 TALEN에 대한 표적 및 수치적 식별자는 하기 표 12에 표시되어 있다.
알부민 특이적 TALEN
SBS # 위치 RVD의 # 서열번호
102249 gtTGAAGATTGAATTCAta 15 133
102250 gtTGAAGATTGAATTCATAac 17 133
102251 gtGCAATGGATAGGTCTtt 15 134
102252 atAGTGCAATGGATAGGtc 15 135
102253 atTGAATTCATAACTATcc 15 136
102254 atTGAATTCATAACTATCCca 17 137
102255 atAAAGCATAGTGCAATGGat 17 138
102256 atAAAGCATAGTGCAATgg 15 139
102257 ctATGCTTTATTTAAAAac 15 140
102258 ctATGCTTTATTTAAAAACca 17 141
102259 atTTATGAGATCAACAGCAca 17 142
102260 ctATTTATGAGATCAACAGca 17 158
102261 ttCATTTTAGTCTGTCTTCtt 17 143
102262 atTTTAGTCTGTCTTCTtg 15 144
102263 ctAATACTCTTTTAGTGTct 16 145
102264 atCTAATACTCTTTTAGTGtc 17 146
102265 atAATTGAACATCATCCtg 15 147
102266 atAATTGAACATCATCCTGag 17 148
102267 atATTGGGCTCTGATTCCTac 17 149
102268 atATTGGGCTCTGATTCct 15 150
102269 ttTTTCTGTAGGAATCAga 15 159
102270 ttTTTCTGTAGGAATCAGag 16 151
102271 ttATGCATTTGTTTCAAaa 15 152
102272 atTATGCATTTGTTTCAaa 15 153
그 후, TALEN은 내인성 염색체 표적에서 개질을 유도하는 능력에 대하여 HepG2 세포에서 쌍을 지어서 시험하였고, 결과는 +17 절단 지점을 보유하는 다수의 단백질은 활성적임을 나타내었다. 유사하게, +63 절단 지점을 보유하는 다수의 TALEN은 또한 활성적이었다(표 13 및 도 11 참조). 표 13에 나타낸 쌍 번호는 도 11에서 레인 위에 나타낸 쌍 번호에 대응함을 주목한다. 최적화되지 않은 알부민 ZFN의 3개의 세트와 나란히 비교한 결과는 TALEN 및 ZFN이 동일한 근사치 범위에 있는 활성을 가짐을 나타내었다.
HepG2 - C3a 세포에서 TALEN -유도 표적 개질
샘플 쌍 TALEN C17 % 개질, C17 TALEN C63 % 개질, C63 갭
1 102251:102249 15 102251:102249 0 12
2 102251:102250 0 102251:102250 0 10
3 102252:102249 0 102252:102249 8.3 15
4 102252:102250 32 102252:102250 8.0 13
5 102255:102253 38 102255:102253 21 13
6 102255:102254 43 102255:102254 0 11
7 102256:102253 0 102256:102253 23 15
8 102256:102254 28 102256:102254 16 13
9 102259:102257 18 102259:102257 15 13
10 102259:102258 15 102259:102258 0 11
11 102260:102257 15 102260:102257 13 15
12 102260:102258 24 102260:102258 11 13
13 102263:102261 0 102263:102261 16 17
14 102263:102262 0 102263:102262 15 16
15 102264:102261 0 102264:102261 22 18
16 102264:102262 0 102264:102262 17 17
20 102267:102265 47 102267:102265 9.8 13
21 102267:102266 4.7 102267:102266 0 11
22 102268:102265 4.2 102268:102265 7.9 15
23 102268:102266 10 102268:102266 0 13
24 102271:102269 14 102271:102269 0 12
25 102271:102270 0 102271:102270 0 11
26 102272:102269 0 102272:102269 0 13
27 102272:102270 0 102272:102270 0 12
ZFNs
17 35361:35396 31 35361:35396 29 6
18 35426:35458 10 35426:35458 7 6
19 34931:33940 7.3 34931:33940 7 6
앞서 언급한 바와 같이(공유인 미국 특허공개 제20110301073호 참조), 2개의 TALEN 표적 위치 사이의 갭 크기가 대략 11~15bp일 때, C17 TALEN은 활성이 더 큰 반면, C63 TALEN은 캡 크기가 18bp 이하에서 활성을 지속한다(도 10, 도 11c 및 표 13 참조).
본 명세서에서 언급된 모든 특허, 특허출원 및 간행물은 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
개시 내용은 이해의 명확화의 목적으로 예시 및 실시예로 약간 상세하게 제공되었지만, 본 개시 내용의 사상 또는 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형이 실시될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 상기 설명 및 실시예는 제한으로서 해석되어서는 안 된다.
SEQUENCE LISTING <110> SANGAMO BIOSCIENCES, INC. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR REGULATION OF TRANSGENE EXPRESSION <130> WO2013/044008 <140> PCT/US2012/056539 <141> 2012-09-21 <150> US 61/670,490 <151> 2012-07-11 <150> US 61/560,506 <151> 2011-11-16 <150> US 61/537,349 <151> 2011-09-21 <160> 165 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Thr Ser Gly Ser Leu Thr Arg 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Arg Ser Asp Ala Leu Ser Thr 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Gln Ser Ala Thr Arg Thr Lys 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Thr Ser Gly His Leu Ser Arg 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 11 Thr Ser Gly Asn Leu Thr Arg 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Asp Arg Ser Thr Arg Arg Gln 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 Glu Arg Gly Thr Leu Ala Arg 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Thr Ser Ala Asn Leu Ser Arg 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Asp Arg Ser Ala Leu Ala Arg 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Arg Ser Asp His Leu Ser Glu 1 5 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide 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ttccaggggt gtgtttcgtc gagatacacg taagaaatcc atttttctat 180 tgttcaactt ttattctatt ttcctagtaa aataaagttt tagtaaactc tgcatcttta 240 aagaattgtt ttgtcatgta tttctaaaat gggatagtat tttgtatttg tgaagtctta 300 caaagttatc ttattaataa aattcaaaca tcctaggtaa aataaaagg 349 <210> 74 <211> 349 <212> DNA <213> Callithrix jacchus <400> 74 ttaaagaagt atattagtgc taatttctct ccatttgtcc tagcttttct cttctgtcaa 60 ccccacgagc ctttggcaca atgaagtggg taacctttat ttcccttctc tttctcttta 120 gctcagctta ttccaggggt gtgtttcgtc gagatgcacg taagaatttc atttttctat 180 tgttcaactt ttattctttt tcctagtaac ataaagtttt agtaaactgc atttttaaag 240 aattattttg gcatttattt ctaaaatggg atgacatttg tatttgtgaa gtcttacaag 300 gttatattat taataaattt caaacatcct aggtaaaaga aaaagaggg 349 <210> 75 <211> 395 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 75 ttaaagaagt atattagtgt gaatttccct ctgttcgtcc taccttttct cttctatcaa 60 ccccacaagc ctttggcaca atgaagtggg taacttttat ttcccttttc tttctcttta 120 gctctgctta ttccaggggc ttggttcgac gagaagcatg taagaattct attttcctat 180 tgttcaactt tattttagtt tcctagtaaa ataaattttt ttttgtaaaa gaaattttta 240 gaaaaccctg catctttcca gaattgcttt tctttagcat ttatttctag acagtgatga 300 tattttatat ttgtgacccc tttgaaagtt attatttttt aagatctgcg agagagcatg 360 aagtggtggg ggcagggaga gggagaagca gggag 395 <210> 76 <211> 364 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 76 ttaaagaagt atattagagc gagtctttct gcacacagat cacctttcct atcaacccca 60 ctagcctctg gcaaaatgaa gtgggtaacc tttctcctcc tcctcttcgt ctccggctct 120 gctttttcca ggggtgtgtt tcgccgagaa gcacgtaaga gttttatgtt ttttcatctc 180 tgcttgtatt tttctagtaa tggaagcctg gtattttaaa atagttaaat tttcctttag 240 tgctgatttc tagattatta ttactgttgt tgttgttatt attgtcatta tttgcatctg 300 agaaccctta ggtggttata ttattgatat atttttggta tctttgatga caataatggg 360 ggat 364 <210> 77 <211> 521 <212> DNA <213> Macaca mulatta <400> 77 tcagaattgt ttagtggctg taattttctt ttgcccacta aggaaagtgc aaagtaactt 60 agagtgactt aaacttcaca gaacagagtt gaagattgaa ttcataactg tccctaagac 120 ctatccattg cactatgctt tatttaaaag ccacaaaacc tgtgctgttg atctcataaa 180 tagaacttgt atttatattt actttcattt tagtctgtct tctcagttgc tgttgatata 240 cactaaaaga gtattagata ttacctgttt gaatataaaa ctataaatat ctaataattt 300 taaaaatagt attcttgata attgaattat tcctctgttt aaaggcagaa gaaataattc 360 accattatcc tgactttttc tgtaggaatc agagcccaat attttgaaac aaatgcataa 420 tctaagtcaa atggaaagaa atataaaaag taacattatt acttcttgtt ttcttcagta 480 tttaacaacc cttttttttc tccccttccc cagacaagag t 521 <210> 78 <211> 523 <212> DNA <213> Callithrix jacchus <400> 78 tcagaattgt ttagtggcta attttctttt gaatatgtag aaaagtgcag agtgacttag 60 acagaatgac ttaaacttca cagaatagag ttgaagattg aattcataac tatcccaaag 120 acctattcat tgcactatgc cttatttaaa aatcacaaaa cctgtgctgt tgatctaata 180 aatagaactt gtatttatat ttactttcat ttcagcctgt cttctcagta gttgttaata 240 gacactgaga gtattagatg atatctaagt ctgaatataa agctataaat atttaataat 300 taaaaaatta gtattattgg taattgaatt attcttctgt ttaaaggcag gagaaataat 360 tcagcatcat cctgagtttt tctgtaggaa tcagagtcca atattttgaa gtaaatgcat 420 aatctaagtc aaatggaaaa aaatataaaa agtaatttta ttacttgttt tcctcagtat 480 ttcacaacct tttttttctc tctctctctg cccagacaaa agt 523 <210> 79 <211> 587 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 79 cctgaggaag ttatcttatt aatatatttc caacatccta tgtgaaaaaa aatagaatta 60 tttagtagct gtaactacct tctgtacatg aaggagctta gagtgcctta aacttcacag 120 aatatagttg acgttagaat tgatagctcc gtattcccaa aggctattgc actgtgattt 180 atgggaaaaa aaaaacccac aaacctgtgt tgctaatctt gtaaatagaa cttgtattta 240 tatttttcat ttcagtctgt cctctcagca gctgttaata gacattacaa gagcattaga 300 tcttatccaa gtttgaatat aaggctacaa atatttaatg attttaatga ttttttgaaa 360 tcatatcatt cgtgattgaa taacttatct gttttaatgc agaatgaata cttcatcatt 420 ctaagatttt tctgtcagga taagaggcaa atattttgga gcaaacgaat acttaagtca 480 tgtggagaga aacacaaaga gtaacatcat aacgaggtca ttttcttcag aatgtaacaa 540 atctgtttta tttttatttt tttctttttt cctctccaga taagagt 587 <210> 80 <211> 502 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 80 tttgaaagat tagttttaaa atttctttta attaaaataa aatgctagct agaatgattt 60 gaactatgtc agatacagct gaactcacta gtttcaaagg gcctgcctgc tctacctagc 120 tatactaaac acgcatagcc tgtattagta attttacgaa tggagtttcc acttatattt 180 acttttattt cttatttact attgccttag tagacattta caaacatgac tgaaacattc 240 cgtcttgggt ttgaatgcaa agttataagc acttaatgag tctttaaaaa taatagtttc 300 ggtgaaagaa taaaactctg aatgtagtcg aaaggaattg ccatcttccg attttcctgt 360 agcgattgga ggctgggaac ttcagggaat agtttaagtg agtgaagaga agggtgaaaa 420 gcagcgtgtt gtaatttgat gtcttcaata tttaaatatg ttttgtggtt tttttctctc 480 ccccattccc acagacaaga gt 502 <210> 81 <211> 505 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 81 tttgaaagct tagctttaaa tttcttttaa ttaaaaaaaa atgctaggca gaatgactca 60 aattacgttg gatacagttg aatttattac ggtctcatag ggcctgcctg ctcgaccatg 120 ctatactaaa aattaaaagt gtgtgttact aattttataa atggagtttc catttatatt 180 tacctttatt tcttatttac cattgtctta gtagatattt acaaacatga cagaaacact 240 aaatcttgag tttgaatgca cagatataaa cacttaacgg gttttaaaaa taataatgtt 300 ggtgaaaaaa tataactttg agtgtagcag agaggaacca ttgccacctt cagattttcc 360 tgtaacgatc gggaactggc atcttcaggg agtagcttag gtcagtgaag agaagaacaa 420 aaagcagcat attacagtta gttgtcttca tcaatcttta aatatgttgt gtggtttttc 480 tctccctgtt tccacagaca agagt 505 <210> 82 <211> 480 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 82 gtcgagatgc acgtaagaaa tccatttttc tattgttcaa cttttattct attttcccag 60 taaaataaag ttttagtaaa ctctgcatct ttaaagaatt attttggcat ttatttctaa 120 aatggcatag tattttgtat ttgtgaagtc ttacaaggtt atcttattaa taaaattcaa 180 acatcctagg taaaaaaaaa aaaaggtcag aattgtttag tgactgtaat tttcttttgc 240 gcactaagga aagtgcaaag taacttagag tgactgaaac ttcacagaat agggttgaag 300 attgaattca taactatccc aaagacctat ccattgcact atgctttatt taaaaaccac 360 aaaacctgtg ctgttgatct cataaataga acttgtattt atatttattt tcattttagt 420 atggctattg agtacttcaa atatgacaag tgcaactgag aaacaaaaac ttaaattgta 480 <210> 83 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 83 Gln Arg Ser Asn Leu Asp Ser 1 5 <210> 84 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 84 Tyr His Trp Tyr Leu Lys Lys 1 5 <210> 85 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 85 Arg Ser Asp Asp Leu Ser Val 1 5 <210> 86 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 86 Thr Ser Ser Asn Arg Thr Lys 1 5 <210> 87 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 87 Gln Tyr Thr His Leu Val Ala 1 5 <210> 88 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 88 Arg Ser Asp His Leu Ser Thr 1 5 <210> 89 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 89 Arg Ser Asp Ala Arg Thr Thr 1 5 <210> 90 <211> 28 <212> DNA <213> Canis sp. <400> 90 agtattcgtt tgctccaaaa tatttgcc 28 <210> 91 <211> 28 <212> DNA <213> Canis sp. <400> 91 aagtcatgtg gagagaaaca caaagagt 28 <210> 92 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 92 attgaattca taactatccc aaagacctat ccattgcact atgctttatt taaaaaccac 60 <210> 93 <211> 60 <212> DNA <213> Macaca mulatta <400> 93 attgaattca taactgtccc taagacctat ccattgcact atgctttatt taaaagccac 60 <210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 94 His Leu Gly Asn Leu Lys Thr 1 5 <210> 95 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 95 Leu Lys His His Leu Thr Asp 1 5 <210> 96 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 96 Arg Leu Asp Asn Arg Thr Ala 1 5 <210> 97 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 97 Leu Met Gln Asn Arg Asn Gln 1 5 <210> 98 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 123 Asp Arg Ser Asn Leu Thr Arg 1 5 <210> 124 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 124 Gln Lys Val Asn Arg Ala Gly 1 5 <210> 125 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 125 Gln Asn Ala Asn Arg Ile Thr 1 5 <210> 126 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 126 Gln Ser Ala His Arg Ile Thr 1 5 <210> 127 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 127 cctatccatt gcactatgct ttatttaa 28 <210> 128 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 128 tttgggatag ttatgaattc aatcttca 28 <210> 129 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 129 cctgtgctgt tgatctcata aatagaac 28 <210> 130 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 130 ttgtggtttt taaataaagc atagtgca 28 <210> 131 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 131 accaagaaga cagactaaaa tgaaaata 28 <210> 132 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 132 ctgttgatag acactaaaag agtattag 28 <210> 133 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 133 gttgaagatt gaattcata 19 <210> 134 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 134 gtgcaatgga taggtcttt 19 <210> 135 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 135 atagtgcaat ggataggtc 19 <210> 136 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 136 attgaattca taactatcc 19 <210> 137 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 137 attgaattca taactatccc a 21 <210> 138 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 150 atattgggct ctgattcct 19 <210> 151 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 151 tttttctgta ggaatcagag 20 <210> 152 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 152 ttatgcattt gtttcaaaa 19 <210> 153 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 153 attatgcatt tgtttcaaa 19 <210> 154 <211> 395 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 154 taaggaaagt gcaaagtaac ttagagtgac tgaaacttca cagaataggg ttgaagattg 60 aattcataac tatcccaaag acctatccat tgcactatgc tttatttaaa aaccacaaaa 120 cctgtgctgt tgatctcata aatagaactt gtatttatat ttattttcat tttagtctgt 180 cttcttggtt gctgttgata gacactaaaa gagtattaga tattatctaa gtttgaatat 240 aaggctataa atatttaata atttttaaaa tagtattctt ggtaattgaa ttattcttct 300 gtttaaaggc agaagaaata attgaacatc atcctgagtt tttctgtagg aatcagagcc 360 caatattttg aaacaaatgc ataatctaag tcaaa 395 <210> 155 <211> 393 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 155 taaggaaagt gcaaagtaac ttagagtgac ttaaacttca cagaacagag ttgaagattg 60 aattcataac tgtccctaag acctatccat tgcactatgc tttatttaaa agccacaaaa 120 cctgtgctgt tgatctcata aatagaactt gtatttatat ttactttcat tttagtctgt 180 cttctcagtt gctgttgata tacactaaaa gagtattaga tattacctgt ttgaatataa 240 aactataaat atctaataat tttaaaaata gtattcttga taattgaatt attcctctgt 300 ttaaaggcag aagaaataat tcaccattat cctgactttt tctgtaggaa tcagagccca 360 atattttgaa acaaatgcat aatctaagtc aaa 393 <210> 156 <211> 394 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 156 taaggaaagt gcaaagtaac ttagagtgac ttaaacttca cagaacagag ttgaagattg 60 aattcataac tgtccctaag acctatccat tgcactatgc tttatttaaa agccacaaaa 120 cctgtgctgt tgatctcata aatagaactt gtatttatat ttactttcat tttagtctgt 180 cttctcagtt gctgttgata tacactaaaa gagtattaga tattacctgt ttgaatataa 240 aactataaat atctaataat tttaaaaata gtattcttga taattgaatt attcctctgt 300 ttaaaggcag taagaaataa ttcaccatta tcctgacttt ttctgtagga atcagagccc 360 aatattttga aacaaatgca taatctaagt caaa 394 <210> 157 <211> 393 <212> DNA <213> Macaca mulatta <400> 157 taaggaaagt gcaaagtaac ttagagtgac ttaaacttca cagaacagag ttgaagattg 60 aattcataac tgtccctaag acctatccat tgcactatgc tttatttaaa agccacaaaa 120 cctgtgctgt tgatctcata aatagaactt gtatttatat ttactttcat tttagtctgt 180 cttctcagtt gctgttgata tacactaaaa gagtattaga tattacctgt ttgaatataa 240 aactataaat atctaataat tttaaaaata gtattcttga taattgaatt attcctctgt 300 ttaaaggcag aagaaataat tcaccattat cctgactttt tctgtaggaa tcagagccca 360 atattttgaa acaaatgcat aatctaagtc aaa 393 <210> 158 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 158 ctatttatga gatcaacagc a 21 <210> 159 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 159 tttttctgta ggaatcaga 19 <210> 160 <211> 353 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 160 ttaaagaagt atattagtgc taatttccct ccgtttgtcc tagcttttct cttctgtcaa 60 ccccacacgc ctttggcaca atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta 120 gctcggctta ttccaggggt gtgtttcgtc gagatgcacg taagaaatcc atttttctat 180 tgttcaactt ttattctatt ttcccagtaa aataaagttt tagtaaactc tgcatcttta 240 aagaattatt ttggcattta tttctaaaat ggcatagtat tttgtatttg tgaagtctta 300 caaggttatc ttattaataa aattcaaaca tcctaggtaa aaaaaaaaaa agg 353 <210> 161 <211> 523 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 161 tcagaattgt ttagtgactg taattttctt ttgcgcacta aggaaagtgc aaagtaactt 60 agagtgactg aaacttcaca gaatagggtt gaagattgaa ttcataacta tcccaaagac 120 ctatccattg cactatgctt tatttaaaaa ccacaaaacc tgtgctgttg atctcataaa 180 tagaacttgt atttatattt attttcattt tagtctgtct tcttggttgc tgttgataga 240 cactaaaaga gtattagata ttatctaagt ttgaatataa ggctataaat atttaataat 300 ttttaaaata gtattcttgg taattgaatt attcttctgt ttaaaggcag aagaaataat 360 tgaacatcat cctgagtttt tctgtaggaa tcagagccca atattttgaa acaaatgcat 420 aatctaagtc aaatggaaag aaatataaaa agtaacatta ttacttcttg ttttcttcag 480 tatttaacaa tccttttttt tcttcccttg cccagacaag agt 523 <210> 162 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: 'LAGLIDADG' family peptide motif sequence <400> 162 Leu Ala Gly Leu Ile Asp Ala Asp Gly 1 5 <210> 163 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 163 Asn Arg His His Leu Lys Ser 1 5 <210> 164 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 164 gttgaagatt gaattcataa c 21 <210> 165 <211> 364 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 165 ttagagaagt atattagagc gagtttctct gcacacagac cacctttcct gtcaacccca 60 ctagcctctg gcacaatgaa gtgggtaacc tttctcctcc tcctcttcat ctccggttct 120 gccttttcca ggggtgtgtt tcgccgagaa gcacgtaagc attctatgtt ttctcatctc 180 tacttttatt tttcgtagta acggaagcca ggtatttcaa aattacttaa attttccttt 240 ggtgatgatt aatatcacca ttattattat tattattatt attattatta catttgcatc 300 tgagaatcct tatgtggtta tattaatgta ttttagataa ctccgatgac aataatgggg 360 ggac 364

Claims (14)

  1. 내인성 알부민 유전자를 절단하는 비자연적으로 발생하는 TAL-효과기 도메인 뉴클레아제(TALEN)로서,
    TALEN은 제1 및 제2 TALEN을 포함하며 각각의 제1 및 제2 TALEN은 절단 도메인 및 내인성 알부민 유전자에서 표적 위치에 결합하는 TAL-효과기(TALE) DNA-결합 도메인을 포함하고,
    제1 TALEN은 서열번호 133에서 표적 위치에 결합하는 TALE DNA-결합 도메인을 포함하고 제2 TALEN은 서열번호 134 또는 135에서 표적 위치에 결합하는 TALE DNA-결합 도메인을 포함하거나;
    제1 TALEN은 서열번호 136에서 표적 위치에 결합하는 TALE DNA-결합 도메인을 포함하고 제2 TALEN은 서열번호 137 또는 138에서 표적 위치에 결합하는 TALE DNA-결합 도메인을 포함하거나;
    제1 TALEN은 서열번호 140 또는 141에서 표적 위치에 결합하는 TALE DNA-결합 도메인을 포함하고 제2 TALEN은 서열번호 142 또는 158에서 표적 위치에 결합하는 TALE DNA-결합 도메인을 포함하거나;
    제1 TALEN은 서열번호 143 또는 144에서 표적 위치에 결합하는 TALE DNA-결합 도메인을 포함하고 제2 TALEN은 서열번호 145 또는 146에서 표적 위치에 결합하는 TALE DNA-결합 도메인을 포함하거나;
    제1 TALEN은 서열번호 147 또는 148에서 표적 위치에 결합하는 TALE DNA-결합 도메인을 포함하고 제2 TALEN은 서열번호 149 또는 150에서 표적 위치에 결합하는 TALE DNA-결합 도메인을 포함하거나;
    제1 TALEN은 서열번호 159에서 표적 위치에 결합하는 TALE DNA-결합 도메인을 포함하고 제2 TALEN은 서열번호 152에서 표적 위치에 결합하는 TALE DNA-결합 도메인을 포함하는
    TAL-효과기 뉴클레아제(TALEN).
  2. 제1항의 제1 및 제2 TALEN을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제1항에 따른 TALEN을 하나 이상 포함하는, 단리된 세포.
  4. 제2항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상 포함하는, 단리된 세포.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 세포는 줄기 세포인 것인 세포.
  6. 제5항에 있어서, 상기 줄기 세포는 배아 줄기 세포(ESC), 유도 만능 줄기 세포(iPSC), 간 줄기 세포(hepatic stem cell) 및 간 줄기 세포(liver stem cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포.
  7. 제1항에 따른 TALEN, 제2항에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 제3항 또는 제4항의 세포를 포함하는 키트.
  8. 세포 내에서 내인성 알부민 유전자를 절단하는 시험관내 방법으로서, 상기 방법은,
    TALEN이 발현되고 알부민 유전자가 절단되도록 하는 조건 하에서, 제2항에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터를 상기 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는, 세포내 내인성 알부민 유전자의 절단 시험관내 방법.
  9. 제8항에 있어서, 개별적인 폴리뉴클레오타이드는 제1 및 제2 TALEN을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 AAV 벡터에 의해 운반되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 세포는 간 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. (a) 제1항에 따른 뉴클레아제를 암호화하는 하나 이상의 발현 벡터 또는 제2항에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 및
    (b) 치료용 단백질을 암호화하는 이식 유전자를 포함하는 공여 폴리뉴클레오타이드를 포함하는,
    리소좀 축적병, 수포성 표피박리증, AAT 결핍 폐기종 또는 혈액 장애 치료용 약학적 조성물로서,
    이때, 상기 발현 벡터 또는 상기 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레아제가 발현되는 조건 하에서 세포 내로 도입되고,
    내인성 알부민 유전자는 절단되어 상기 이식 유전자가 절단된 내인성 알부민 유전자 내로 통합되고,
    상기 치료용 단백질은 발현되는,
    리소좀 축적병, 수포성 표피박리증, AAT 결핍 폐기종 또는 혈액 장애 치료용 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 혈액 장애는 응고 장애인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 이식 유전자의 발현이 내인성 알부민의 제어 서열에 의해 구동되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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Families Citing this family (139)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013044008A2 (en) 2011-09-21 2013-03-28 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of transgene expression
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
EA038924B1 (ru) 2012-05-25 2021-11-10 Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния Способы и композиции рнк-специфической модификации днк-мишени и рнк-специфической модуляции транскрипции
HUE051612T2 (hu) 2012-07-11 2021-03-01 Sangamo Therapeutics Inc Eljárások és készítmények lizoszomális tárolási betegségek kezelésére
US10648001B2 (en) 2012-07-11 2020-05-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Method of treating mucopolysaccharidosis type I or II
US10883119B2 (en) 2012-07-11 2021-01-05 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for delivery of biologics
CN104704110B (zh) 2012-08-29 2018-06-01 桑格摩生物科学股份有限公司 用于治疗遗传性病状的方法和组合物
ES2824024T3 (es) 2012-10-10 2021-05-11 Sangamo Therapeutics Inc Compuestos modificadores de células T y usos de los mismos
KR20230154283A (ko) * 2012-11-01 2023-11-07 팩터 바이오사이언스 인크. 세포에서 단백질을 발현시키는 방법들과 생성물들
AU2013355327A1 (en) * 2012-12-05 2015-06-11 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for regulation of metabolic disorders
KR102531576B1 (ko) 2012-12-06 2023-05-11 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr-기초된 유전체 변형과 조절
ES2701749T3 (es) 2012-12-12 2019-02-25 Broad Inst Inc Métodos, modelos, sistemas y aparatos para identificar secuencias diana para enzimas Cas o sistemas CRISPR-Cas para secuencias diana y transmitir resultados de los mismos
ES2883590T3 (es) 2012-12-12 2021-12-09 Broad Inst Inc Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas
AU2014218621B2 (en) 2013-02-25 2019-11-07 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption
CA2902954A1 (en) 2013-03-01 2014-09-04 Regents Of The University Of Minnesota Talen-based gene correction
AU2014235794A1 (en) 2013-03-14 2015-10-22 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
WO2014153470A2 (en) 2013-03-21 2014-09-25 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of t cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
WO2014182700A1 (en) * 2013-05-10 2014-11-13 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
CA2910489A1 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
CN105793425B (zh) 2013-06-17 2021-10-26 布罗德研究所有限公司 使用病毒组分靶向障碍和疾病的crispr-cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用
RU2716420C2 (ru) 2013-06-17 2020-03-11 Те Брод Инститьют Инк. Доставка и применение систем crispr-cas, векторов и композиций для целенаправленного воздействия и терапии в печени
CN105492611A (zh) 2013-06-17 2016-04-13 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的优化的crispr-cas双切口酶系统、方法以及组合物
RU2725502C2 (ru) * 2013-06-17 2020-07-02 Те Брод Инститьют Инк. Доставка, конструирование и оптимизация систем, способы и композиции для целенаправленного воздействия и моделирования заболеваний и нарушений постмитотических клеток
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
CA2915834A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
CA2917961A1 (en) * 2013-07-10 2015-01-15 Joseph A. Majzoub Mrap2 knockouts
EP3988654A1 (en) 2013-08-28 2022-04-27 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions for linking dna-binding domains and cleavage domains
CA2926094C (en) 2013-10-17 2024-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
CA2926078C (en) 2013-10-17 2021-11-16 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
BR112016010175A2 (pt) 2013-11-11 2017-10-03 Sangamo Biosciences Inc Repressor genético, seus usos, e composição farmacêutica
SI3068881T1 (sl) * 2013-11-13 2019-05-31 Children's Medical Center Corporation Z nukleazo posredovano uravnavanje izražanja genov
ES2813367T3 (es) * 2013-12-09 2021-03-23 Sangamo Therapeutics Inc Métodos y composiciones para ingeniería genómica
AU2014361781B2 (en) 2013-12-12 2021-04-01 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, use and therapeutic applications of the CRISPR -Cas systems and compositions for genome editing
JP6712948B2 (ja) 2013-12-12 2020-06-24 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 組成物、及びヌクレオチドリピート障害におけるｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ系の使用方法
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
WO2015089486A2 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems
HUE051232T2 (hu) 2014-02-03 2021-03-01 Sangamo Therapeutics Inc Béta-talasszémia kezelésére szolgáló eljárások és készítmények
US10370680B2 (en) * 2014-02-24 2019-08-06 Sangamo Therapeutics, Inc. Method of treating factor IX deficiency using nuclease-mediated targeted integration
WO2015143046A2 (en) 2014-03-18 2015-09-24 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of zinc finger protein expression
US9522936B2 (en) 2014-04-24 2016-12-20 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered transcription activator like effector (TALE) proteins
BR112016025849A2 (pt) 2014-05-08 2017-10-17 Chdi Foundation Inc métodos e composições para o tratamento da doença de huntington
US9574211B2 (en) 2014-05-13 2017-02-21 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a disease
WO2015188065A1 (en) 2014-06-05 2015-12-10 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease design
US9816074B2 (en) 2014-07-25 2017-11-14 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modulating nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
WO2016014837A1 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Sangamo Biosciences, Inc. Gene editing for hiv gene therapy
US9616090B2 (en) 2014-07-30 2017-04-11 Sangamo Biosciences, Inc. Gene correction of SCID-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells
RS62334B1 (sr) 2014-09-16 2021-10-29 Sangamo Therapeutics Inc Postupci i sastavi za inženjering genoma posredovan nukleazom i korekciju kod matičnih ćelija hematopoeze
EP3985115A1 (en) 2014-12-12 2022-04-20 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
US10889834B2 (en) 2014-12-15 2021-01-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing targeted transgene integration
US20180002379A1 (en) 2015-01-21 2018-01-04 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for identification of highly specific nucleases
US10179918B2 (en) 2015-05-07 2019-01-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for increasing transgene activity
US10808020B2 (en) 2015-05-12 2020-10-20 Sangamo Therapeutics, Inc. Nuclease-mediated regulation of gene expression
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
CN108290933A (zh) 2015-06-18 2018-07-17 布罗德研究所有限公司 降低脱靶效应的crispr酶突变
US9957501B2 (en) 2015-06-18 2018-05-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Nuclease-mediated regulation of gene expression
CN108024544B (zh) 2015-07-13 2022-04-29 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于核酸酶介导的基因组工程化的递送方法及组合物
AU2016325613B2 (en) 2015-09-23 2020-06-25 Sangamo Therapeutics, Inc. Htt repressors and uses thereof
CN108473976B (zh) 2015-10-28 2022-07-19 桑格摩生物治疗股份有限公司 肝特异性构建体、因子viii表达盒及其使用方法
CN113636947A (zh) 2015-10-28 2021-11-12 爱康泰生治疗公司 用于递送核酸的新型脂质和脂质纳米颗粒制剂
WO2017074517A1 (en) * 2015-10-30 2017-05-04 Seracare Life Sciences, Inc. Adenovirus control virus
AU2016361350B2 (en) * 2015-11-23 2023-04-06 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for engineering immunity
WO2017100551A1 (en) * 2015-12-09 2017-06-15 Alexion Pharmaceuticals, Inc. HETEROLOGOUS UTR SEQUENCES FOR ENHANCED mRNA EXPRESSION
CN108699132B (zh) 2015-12-18 2023-08-11 桑格摩生物治疗股份有限公司 Mhc细胞受体的靶向破坏
JP7128741B2 (ja) 2015-12-18 2022-08-31 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｔ細胞受容体の標的化破壊
WO2017123757A1 (en) 2016-01-15 2017-07-20 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of neurologic disease
CA3011049A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions for linking dna-binding domains and cleavage domains
WO2018035377A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Factor Bioscience Inc. Nucleic acid products and methods of administration thereof
SG11201901364VA (en) 2016-08-24 2019-03-28 Sangamo Therapeutics Inc Engineered target specific nucleases
MX2019002207A (es) 2016-08-24 2019-07-15 Sangamo Therapeutics Inc Regulacion de la expresion genica usando nucleasas modificadas.
AU2017324462B2 (en) 2016-09-07 2024-03-21 Sangamo Therapeutics, Inc. Modulation of liver genes
BR112019007210A2 (pt) 2016-10-20 2019-08-13 Sangamo Therapeutics Inc métodos e composições para o tratamento da doença de fabry
CA3041668A1 (en) 2016-10-31 2018-05-03 Sangamo Therapeutics, Inc. Gene correction of scid-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells
US20180185516A1 (en) * 2016-12-09 2018-07-05 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery of target specific nucleases
US11647737B2 (en) 2016-12-29 2023-05-16 Asc Therapeutics Inc. Genetically modified rabbit expressing an exogenous protein in milk
US11357856B2 (en) 2017-04-13 2022-06-14 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for delivery of active agents
CN110799492B (zh) 2017-04-28 2023-06-27 爱康泰生治疗公司 用于递送核酸的新型羰基脂质和脂质纳米颗粒制剂
WO2018204469A2 (en) 2017-05-03 2018-11-08 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modification of a cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (cftr) gene
EP3640335A4 (en) 2017-06-15 2021-03-31 Toolgen Incorporated PLATFORM FOR EXPRESSION OF A PROTEIN OF INTEREST IN THE LIVER
US11512287B2 (en) 2017-06-16 2022-11-29 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted disruption of T cell and/or HLA receptors
CN110891419A (zh) 2017-07-31 2020-03-17 瑞泽恩制药公司 评价crispr/cas-诱导的与外源供体核酸的体内重组
JP2020533957A (ja) 2017-07-31 2020-11-26 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｃｒｉｓｐｒリポーター非ヒト動物およびその使用
MX2020001178A (es) 2017-07-31 2020-09-25 Regeneron Pharma Celulas madre embrionarias de raton transgenico con cas y ratones y usos de los mismos.
EP3668833A1 (en) 2017-08-16 2020-06-24 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
WO2019036030A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS
WO2019036028A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICULAR FORMULATIONS
US20220080055A9 (en) * 2017-10-17 2022-03-17 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for gene editing for hemophilia a
AU2018355343A1 (en) * 2017-10-24 2020-05-07 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of rare diseases
AU2018364660B2 (en) 2017-11-09 2022-05-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Genetic modification of cytokine inducible SH2-containing protein (CISH) gene
KR20200118468A (ko) 2018-02-08 2020-10-15 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 조작된 표적 특이적 뉴클레아제
WO2019161133A1 (en) 2018-02-15 2019-08-22 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Foxp3 targeting agent compositions and methods of use for adoptive cell therapy
CA3089331A1 (en) 2018-03-19 2019-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transcription modulation in animals using crispr/cas systems
MX2020010461A (es) 2018-04-05 2021-01-15 Juno Therapeutics Inc Linfocitos t que expresan un receptor recombinante, polinucleotidos y metodos relacionados.
EP3775238A1 (en) 2018-04-05 2021-02-17 Juno Therapeutics, Inc. Methods of producing cells expressing a recombinant receptor and related compositions
EP3781587A4 (en) 2018-04-18 2022-03-30 Sangamo Therapeutics, Inc. ZINC FINGER PROTEIN COMPOSITIONS FOR MODULATION OF HUNTINGTIN (HTT)
US11690921B2 (en) 2018-05-18 2023-07-04 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery of target specific nucleases
WO2020028830A1 (en) * 2018-08-03 2020-02-06 Sangamo Therapeutics, Inc. Improved clinical parameters by expression of factor viii
AU2019326408A1 (en) 2018-08-23 2021-03-11 Sangamo Therapeutics, Inc. Engineered target specific base editors
EP4268831A2 (en) 2018-09-12 2023-11-01 Fred Hutchinson Cancer Center Reducing cd33 expression to selectively protect therapeutic cells
US20210317430A1 (en) 2018-09-18 2021-10-14 Sangamo Therapeutics, Inc. Programmed cell death 1 (pd1) specific nucleases
WO2020069029A1 (en) 2018-09-26 2020-04-02 Emendobio Inc. Novel crispr nucleases
CN114207130A (zh) 2018-10-18 2022-03-18 英特利亚治疗股份有限公司 用于从白蛋白基因座进行转基因表达的组合物和方法
SG11202103732RA (en) 2018-10-18 2021-05-28 Intellia Therapeutics Inc Nucleic acid constructs and methods of use
EP3886869A4 (en) 2018-11-28 2022-07-06 Forty Seven, Inc. GENETICALLY MODIFIED CSPH RESISTANT TO ABLATIVE TREATMENT
EP3908568A1 (en) 2019-01-11 2021-11-17 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents
WO2020163379A1 (en) 2019-02-05 2020-08-13 Emendobio Inc. Crispr compositions and methods for promoting gene editing of ribosomal protein s19 (rps19) gene
WO2020163307A1 (en) 2019-02-06 2020-08-13 Emendobio Inc. New engineered high fidelity cas9
JP2022527809A (ja) 2019-04-03 2022-06-06 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 抗体コード配列をセーフハーバー遺伝子座に挿入するための方法および組成物
MX2021013223A (es) 2019-05-01 2022-02-17 Juno Therapeutics Inc Celulas que expresan un receptor quimerico de un locus cd247 modificado, polinucleotidos relacionados y metodos.
AU2020265741A1 (en) 2019-05-01 2021-11-25 Editas Medicine, Inc. Cells expressing a recombinant receptor from a modified TGFBR2 Locus, related polynucleotides and methods
CN113939595A (zh) 2019-06-07 2022-01-14 瑞泽恩制药公司 包括人源化白蛋白基因座的非人动物
SG11202111943UA (en) 2019-07-02 2021-11-29 Hutchinson Fred Cancer Res Recombinant ad35 vectors and related gene therapy improvements
WO2021028359A1 (en) 2019-08-09 2021-02-18 Sangamo Therapeutics France Controlled expression of chimeric antigen receptors in t cells
WO2021092513A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr and aav strategies for x-linked juvenile retinoschisis therapy
WO2021108363A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele
CN111088282B (zh) * 2020-03-23 2020-08-28 上海安民生物技术有限公司 Aavs1和h11安全港位点在重组表达蛋白中的应用
WO2021195079A1 (en) 2020-03-23 2021-09-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use
CN113061169B (zh) * 2020-03-24 2022-09-27 江南大学 一种转录调控蛋白及其在共轭亚油酸生产中的应用
KR20230022868A (ko) 2020-05-13 2023-02-16 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 재조합 수용체를 발현하는 공여자-배치 세포의 제조 방법
WO2021260186A1 (en) 2020-06-26 2021-12-30 Juno Therapeutics Gmbh Engineered t cells conditionally expressing a recombinant receptor, related polynucleotides and methods
WO2022098787A1 (en) 2020-11-04 2022-05-12 Juno Therapeutics, Inc. Cells expressing a chimeric receptor from a modified invariant cd3 immunoglobulin superfamily chain locus and related polynucleotides and methods
CA3213080A1 (en) 2021-03-23 2022-09-29 Krit RITTHIPICHAI Cish gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
KR20220136677A (ko) * 2021-04-01 2022-10-11 서울대학교산학협력단 인간 면역 글로불린 Fc 및 목적단백질을 생산하는 조류의 제조방법
CN115485367B (zh) * 2021-04-16 2023-09-12 杭州启函生物科技有限公司 用于细胞工程的安全港基因座
US20230149563A1 (en) 2021-10-27 2023-05-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for expressing factor ix for hemophilia b therapy
WO2023081756A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Precise genome editing using retrons
WO2023081900A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Juno Therapeutics, Inc. Engineered t cells expressing a recombinant t cell receptor (tcr) and related systems and methods
WO2023108047A1 (en) 2021-12-08 2023-06-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutant myocilin disease model and uses thereof
WO2023129940A1 (en) 2021-12-30 2023-07-06 Regel Therapeutics, Inc. Compositions for modulating expression of sodium voltage-gated channel alpha subunit 1 and uses thereof
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2023150623A2 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-tfr:gaa and anti-cd63:gaa insertion for treatment of pompe disease
WO2023150798A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for defining optimal treatment timeframes in lysosomal disease
WO2023150393A2 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Ensoma, Inc. Inhibitor-resistant mgmt modifications and modification of mgmt-encoding nucleic acids
US20230257432A1 (en) 2022-02-11 2023-08-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for screening 4r tau targeting agents
WO2023220040A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Synteny Therapeutics, Inc. Erythroparvovirus with a modified capsid for gene therapy
WO2023220043A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Synteny Therapeutics, Inc. Erythroparvovirus with a modified genome for gene therapy
WO2023220035A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Synteny Therapeutics, Inc. Erythroparvovirus compositions and methods for gene therapy
WO2024026474A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle
WO2024044723A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2024073606A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibody resistant modified receptors to enhance cell-based therapies

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090069259A1 (en) 2004-04-08 2009-03-12 Sangamo Biosciences, Inc. Treatment of neuropathic pain with zinc finger proteins
US20090098134A1 (en) 2007-06-01 2009-04-16 Omt, Inc. Compositions and methods for inhibiting endogenous immunoglobulin genes and producing transgenic human idiotype antibodies
US20110023158A1 (en) 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Bovine genome editing with zinc finger nucleases
US20110301073A1 (en) 2010-05-17 2011-12-08 Sangamo Biosciences, Inc. Novel DNA-binding proteins and uses thereof

Family Cites Families (100)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US789538A (en) 1904-11-11 1905-05-09 Colin E Ham Dumb-bell.
US4217344A (en) 1976-06-23 1980-08-12 L'oreal Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4186183A (en) 1978-03-29 1980-01-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis
US4261975A (en) 1979-09-19 1981-04-14 Merck & Co., Inc. Viral liposome particle
US4485054A (en) 1982-10-04 1984-11-27 Lipoderm Pharmaceuticals Limited Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV)
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US4774085A (en) 1985-07-09 1988-09-27 501 Board of Regents, Univ. of Texas Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators
US5422251A (en) 1986-11-26 1995-06-06 Princeton University Triple-stranded nucleic acids
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5176996A (en) 1988-12-20 1993-01-05 Baylor College Of Medicine Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
WO1991017424A1 (en) 1990-05-03 1991-11-14 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5420032A (en) 1991-12-23 1995-05-30 Universitge Laval Homing endonuclease which originates from chlamydomonas eugametos and recognizes and cleaves a 15, 17 or 19 degenerate double stranded nucleotide sequence
US5356802A (en) 1992-04-03 1994-10-18 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease
US5487994A (en) 1992-04-03 1996-01-30 The Johns Hopkins University Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
US5792632A (en) 1992-05-05 1998-08-11 Institut Pasteur Nucleotide sequence encoding the enzyme I-SceI and the uses thereof
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
US6140466A (en) 1994-01-18 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
CA2681922C (en) 1994-01-18 2012-05-15 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US6242568B1 (en) 1994-01-18 2001-06-05 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
ES2316148T3 (es) 1994-03-23 2009-04-01 Ohio University Acidos nucleicos compactados y su suministro a celulas.
US5585245A (en) 1994-04-22 1996-12-17 California Institute Of Technology Ubiquitin-based split protein sensor
EP2022856B1 (en) 1994-08-20 2011-09-14 Gendaq Limited Improvements in or relating to binding proteins for recognition of DNA
GB9824544D0 (en) 1998-11-09 1999-01-06 Medical Res Council Screening system
US5789538A (en) 1995-02-03 1998-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities
US5925523A (en) 1996-08-23 1999-07-20 President & Fellows Of Harvard College Intraction trap assay, reagents and uses thereof
JP2001500376A (ja) 1996-09-06 2001-01-16 カイロン コーポレイション 組換えａａｖベクターを使用する治療分子の肝臓特異的送達のための方法および組成物
GB9703369D0 (en) 1997-02-18 1997-04-09 Lindqvist Bjorn H Process
GB2338237B (en) 1997-02-18 2001-02-28 Actinova Ltd In vitro peptide or protein expression library
US6342345B1 (en) 1997-04-02 2002-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of molecular interactions by reporter subunit complementation
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
US6410248B1 (en) 1998-01-30 2002-06-25 Massachusetts Institute Of Technology General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites
EP1060261B1 (en) 1998-03-02 2010-05-05 Massachusetts Institute of Technology Poly zinc finger proteins with improved linkers
US6140081A (en) 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US7070934B2 (en) 1999-01-12 2006-07-04 Sangamo Biosciences, Inc. Ligand-controlled regulation of endogenous gene expression
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
US7030215B2 (en) 1999-03-24 2006-04-18 Sangamo Biosciences, Inc. Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US6794136B1 (en) 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
US6824987B1 (en) 1999-05-11 2004-11-30 President And Fellows Of Harvard College Small molecule printing
WO2001040798A2 (en) 1999-12-06 2001-06-07 Sangamo Biosciences, Inc. Methods of using randomized libraries of zinc finger proteins for the identification of gene function
WO2001059450A2 (en) 2000-02-08 2001-08-16 Sangamo Biosciences, Inc. Cells expressing zinc finger protein for drug discovery
US20020061512A1 (en) 2000-02-18 2002-05-23 Kim Jin-Soo Zinc finger domains and methods of identifying same
WO2001088197A2 (en) 2000-05-16 2001-11-22 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for interaction trap assays
CA2416664A1 (en) 2000-07-21 2002-01-31 Syngenta Participations Ag Zinc finger domain recognition code and uses thereof
JP2002060786A (ja) 2000-08-23 2002-02-26 Kao Corp 硬質表面用殺菌防汚剤
US7067317B2 (en) 2000-12-07 2006-06-27 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
GB0108491D0 (en) 2001-04-04 2001-05-23 Gendaq Ltd Engineering zinc fingers
AUPR446701A0 (en) * 2001-04-18 2001-05-17 Gene Stream Pty Ltd Transgenic mammals for pharmacological and toxicological studies
US20040224385A1 (en) 2001-08-20 2004-11-11 Barbas Carlos F Zinc finger binding domains for cnn
US6723551B2 (en) 2001-11-09 2004-04-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
US7262054B2 (en) 2002-01-22 2007-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants
US8106255B2 (en) 2002-01-23 2012-01-31 Dana Carroll Targeted chromosomal mutagenasis using zinc finger nucleases
AU2003218382B2 (en) 2002-03-21 2007-12-13 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
US7361635B2 (en) 2002-08-29 2008-04-22 Sangamo Biosciences, Inc. Simultaneous modulation of multiple genes
AU2003298574B2 (en) 2002-09-05 2008-04-24 California Institute Of Technology Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US7972854B2 (en) 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
EP1732614B1 (en) 2004-04-08 2008-12-24 Sangamo Biosciences Inc. Compositions for treating neuropathic and neurodegenerative conditions
AU2005287278B2 (en) 2004-09-16 2011-08-04 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions and methods for protein production
EP1797184B1 (en) * 2004-10-08 2012-09-26 VIRxSYS Corporation Targeted trans-splicing of highly abundant transcripts for in vivo production of recombinant proteins
EP1877583A2 (en) 2005-05-05 2008-01-16 Arizona Board of Regents on behalf of the Unversity of Arizona Sequence enabled reassembly (seer) - a novel method for visualizing specific dna sequences
US8043088B2 (en) 2005-05-16 2011-10-25 Johnson Douglas B Endodontic procedure employing simultaneous liquefaction and acoustic debridgement
KR101419729B1 (ko) 2005-07-26 2014-07-17 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 외래 핵산 서열의 표적화된 통합 및 발현
CA2626262C (en) 2005-10-18 2015-09-08 Homme W. Hellinga Rationally-designed meganucleases with altered sequence specificity and dna-binding affinity
EP2765195A1 (en) 2006-05-25 2014-08-13 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for gene inactivation
CA2651494C (en) 2006-05-25 2015-09-29 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered cleavage half-domains
CN105296527B (zh) 2006-08-11 2020-11-27 陶氏益农公司 锌指核酸酶介导的同源重组
CN101652475B (zh) * 2007-01-26 2014-03-19 辛那杰瓦生物制药股份有限公司 在禽类中进行转基因表达
WO2008091311A1 (en) 2007-01-26 2008-07-31 Synageva Biopharma Corp Transgene expression in avians
WO2008133938A2 (en) 2007-04-26 2008-11-06 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration into the ppp1r12c locus
EP2006388A1 (de) * 2007-06-19 2008-12-24 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Nukleinsäurekonstrukte zur Inaktivierung und konditionalen Mutagenese von Genen
US8790345B2 (en) 2007-08-21 2014-07-29 Zimmer, Inc. Titanium alloy with oxidized zirconium for a prosthetic implant
CA2700231C (en) 2007-09-27 2018-09-18 Sangamo Biosciences, Inc. Rapid in vivo identification of biologically active nucleases
DE102007056956B4 (de) 2007-11-27 2009-10-29 Moosbauer, Peter, Dipl.-Ing.(FH) Schaltung zur Regelung der Stromversorgung eines Verbrauchers und Verfahren zum Betrieb einer Schaltung
CA2725773C (en) 2008-05-28 2017-12-05 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions for linking dna-binding domains and cleavage domains
US8703489B2 (en) 2008-08-22 2014-04-22 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted single-stranded cleavage and targeted integration
EP3156494B8 (en) 2008-12-04 2018-09-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Genome editing in rats using zinc-finger nucleases
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
AU2010275432A1 (en) * 2009-07-24 2012-02-02 Sigma-Aldrich Co. Llc. Method for genome editing
KR102262704B1 (ko) 2009-08-11 2021-06-09 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 표적화 변형에 대한 동형접합성 유기체
FR2953287B1 (fr) 2009-11-27 2017-07-21 Mc Aci Dispositif de mesure de grandeurs parietales
PL2510096T5 (pl) * 2009-12-10 2018-06-29 Regents Of The University Of Minnesota Modyfikacja DNA zależna od efektora TAL
EP2615106B1 (en) 2010-02-08 2018-04-25 Sangamo Therapeutics, Inc. Engineered cleavage half-domains
CA2788850C (en) 2010-02-09 2019-06-25 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
US9175280B2 (en) 2010-10-12 2015-11-03 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating hemophilia B
US9405700B2 (en) 2010-11-04 2016-08-02 Sonics, Inc. Methods and apparatus for virtualization in an integrated circuit
WO2013044008A2 (en) * 2011-09-21 2013-03-28 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of transgene expression
US9833252B2 (en) 2013-03-15 2017-12-05 Microvention, Inc. Multi-component obstruction removal system and method

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090069259A1 (en) 2004-04-08 2009-03-12 Sangamo Biosciences, Inc. Treatment of neuropathic pain with zinc finger proteins
US20090098134A1 (en) 2007-06-01 2009-04-16 Omt, Inc. Compositions and methods for inhibiting endogenous immunoglobulin genes and producing transgenic human idiotype antibodies
US20110023158A1 (en) 2008-12-04 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Bovine genome editing with zinc finger nucleases
US20110301073A1 (en) 2010-05-17 2011-12-08 Sangamo Biosciences, Inc. Novel DNA-binding proteins and uses thereof

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