KR20230022868A - 재조합 수용체를 발현하는 공여자-배치 세포의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
예를 들어 복수의 공여자로부터, CD57 음성 및/또는 CD27 양성 T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포는 재조합 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR)로 조작된다. 또한, 상기 T 세포가 재조합 수용체(예를 들어 CAR)로 조작되거나 또는 그를 발현하는 조성물을 포함하는, 복수의 상이한 공여자로부터 유래된 CD57 음성 및/또는 CD27 양성 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 함유하는 조작된 T 세포 조성물이 본원에 제공된다. 또한, 암 면역요법과 관련된 것, 예를 들어 동종이계 요법을 위한 것 또는 상기 T 세포가 조성물이 투여되는 대상체(들)로부터 유래되지 않는 하나 이상의 대상체에게 투여하기 위한 것을 비롯한, 입양 요법에서 조작된 T 세포 조성물을 사용하는 방법이 제공된다.
Description
관련 출원의 상호-참조
본 출원은 2020년 5월 13일자로 출원된 "재조합 수용체를 발현하는 공여자-배치 세포의 제조 방법(PROCESS FOR PRODUCING DONOR-BATCHED CELLS EXPRESSING A RECOMBINANT RECEPTOR)"이라는 명칭의 미국 가출원 제63/024,505호의 우선권을 주장하며, 상기 내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로서 포함된다.
서열 목록의 참조에 의한 포함
본 출원은 전자적 형식의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 2021년 5월 12일에 생성된 72,208 바이트 크기의 파일명 735042023840SeqList.txt로 제공된다. 상기 서열 목록의 전자적 형식의 정보는 그 전체가 참조로서 포함된다.
분야
본 개시는 일부 측면에서, 예를 들어 복수의 공여자로부터의, CD57 음성 및/또는 CD27 양성 T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포는 재조합 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)로 조작된다. 또한, 상기 T 세포가 재조합 수용체(예를 들어 CAR)로 조작되거나 이를 발현하는 조성물을 포함한, 복수의 상이한 공여자로부터 유래된, CD57 음성 및/또는 CD27 양성 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 함유하는 조작된 T 세포 조성물이 본 개시에 포함된다. 또한, 암 면역요법과 관련된 것, 예를 들어 동종이계 요법을 위한 것 또는 상기 T 세포가 조성물이 투여되는 대상체(들)로부터 유래되지 않는 하나 이상의 대상체에게 투여하기 위한 것을 비롯한, 입양 요법에서 조작된 T 세포 조성물을 사용하는 방법이 제공된다.
질환 및 병태를 치료하기 위한 다양한 세포 치료 방법이 이용 가능하다. 세포 치료 방법 중에는 재조합 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체로 유전자 조작된 면역 세포, 예를 들어 T 세포를 포함하는 방법이 있다. 그러나 일부 경우에, 기존의 방법들 중의 일부는 생체 내에서 일관성, 효능 또는 지속성이 낮은 세포 집단을 초래할 수 있다. 병든 대상체에게 세포 요법으로서의 투여와 관련된 것을 포함하는, 이러한 세포 조성물을 제조 및/또는 조작하기 위한 개선된 방법이 필요하다.
공여자 풀 유래(from a donor pool) T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (A) 복수의 상이한 공여자들로부터 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 수득하는 단계, 각각의 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 포함하되, 상기 T 세포는 재조합 수용체로 유전자 조작된 T 세포를 포함함; 및 (b) 상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 조합하여 공여자 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 단계;이거나 또는 그를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 복수의 T 세포 조성물들 각각은 (a) 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (b) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산을 CD57 고갈된 세포 집단 내로 도입하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 단계;이거나 또는 그를 포함하는 방법에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 단계 (b) 전에, 상기 방법은 상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 CD57 고갈된 T 세포 집단을 자극하는 것을 포함한다.
또한, 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (A) 복수의 상이한 공여자들로부터 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 수득하는 단계, 각각의 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 재조합 수용체로 유전자 조작된 T 세포를 포함함; 및 (b) 상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 조합하여 공여자 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 단계;이거나 또는 그를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 복수의 T 세포 조성물들 각각은 (a) 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하고, 그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (b) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산을 CD27 농축된 세포 집단 내로 도입하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 단계;이거나 또는 그를 포함하는 방법에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 상기 단계 (b) 전에, 상기 방법은 상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 CD27 농축된 T 세포 집단을 자극하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 (c) 상기 도입 후 최대 96시간 동안 상기 조작된 세포를 인큐베이션하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션은 (약) 37℃±2℃의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션은 인큐베이션 개시시의 세포의 수와 비교하여 세포가 증폭되지 않거나 실질적으로 증폭되지 않는 조건 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (c) 상기 조성물에서 T 세포의 증폭을 위한 조건 하에 상기 조작된 T 세포 조성물을 배양하는(cultivating) 단계를 더 포함한다.
일부 구현예에서, CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하는 단계는 (i) (a) T 세포 마커(들)에 대해 표면 양성인 세포 및 (b) 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 세포 중의 하나를 선택하고, 그에 의해서 농축된 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (ii) 상기 농축된 세포 집단으로부터, (a) T 세포 마커(들)에 대해 표면 양성인 세포 및 (b) CD57- 세포 중의 다른 것에 대해 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계;를 포함한다. 일부 구현예에서, CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하는 단계는 (i) (a) T 세포 마커(들)에 대해 표면 양성인 세포 및 (b) 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 세포 중의 하나를 선택하고, 그에 의해서 농축된 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (ii) 상기 농축된 세포 집단으로부터, (a) T 세포 마커(들)에 대해 표면 양성인 세포 및 (b) CD27+ 세포 중의 다른 것에 대해 선택하고, 그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생산하는 단계;를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포 마커(들)는 CD3이다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포 마커(들)는 CD4이다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포 마커(들)는 CD8이다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포 표면 마커(들)는 CD4 및 CD8이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 본원에 제공된 방법 중 임의의 것의 단계 중 하나 이상 전에 또는 그 동안에 T 세포에서 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex; MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(T cell receptor; TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 TRAC의 발현을 녹아웃(knocking out)시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본원에 제공된 방법 중 임의의 것의 단계 중 하나 이상 전에 또는 그 동안에 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분의 발현을 녹아웃시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본원에 제공된 방법 중 임의의 것의 단계 중 하나 이상 전에 또는 그 동안에 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분의 발현을 녹아웃시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC)의 발현에 대해 녹아웃(K0)된다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분의 발현에 대해 녹아웃(K0)된다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분의 발현에 대해 녹아웃(K0)된다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분; 및 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분의 발현에 대해 녹아웃(K0)된다. 일부 구현예에서, 상기 MHC 또는 그의 성분은 베타-2-마이크로글로불린(β2M)이다. 일부 구현예에서, 상기 거대 TCR은 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC)이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 CD3에 대해 표면 음성인 상기 조작된 T 세포 조성물의 세포를 선택하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 CD3-인 상기 조작된 T 세포 조성물의 세포를 선택하는 단계는 상기 세포를 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계 및 상기 항체에 결합되지 않은 세포를 회수하여 음성 선택을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물의 세포는 CD3에 대해 표면 음성(CD3-)인 세포에 대해 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물의 세포는 CD3-에 대해 표면 음성이다.
임의의 구현예 중 일부에서, 본원에서는 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (b) 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단을 유전자 조작하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 단계, 상기 유전자 조작은, (1) 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포에서, (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 TRAC;의 발현을 녹아웃(knocking out)하는 단계; 및 (2) 상기 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산을 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 내로 도입하는 단계, 선택적으로 상기 이종 핵산은 내인성 MHC 및/또는 내인성 TCR에 대해 암호화하는 유전자의 유전자 좌 내로 삽입됨;를 포함하며, 상기 단계 (1)에서의 녹아웃 및 상기 단계 (2)에서의 도입은 어느 순서로든 동시에 또는 연속적으로 수행될 수 있음; (c) 복수의 상이한 공여자들에 대해 상기 단계 (a) 및 (b)를 반복하여 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 생산하는 단계, 각각의 공여자 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 세포로부터 생성됨; 및 (d) 상기 복수의 상이한 개별 공여자들 유래 상기 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 조합하는 단계;를 포함한다. 임의의 구현예 중 일부에서, 본원에서는 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (b) 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단을 유전자 조작하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 단계, 상기 유전자 조작은, (1) 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포에서, (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분; 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분;의 발현을 녹아웃시키는 단계; 및 (2) 상기 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산을 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 내로 도입하는 단계;를 포함하며, 상기 단계 (1)에서의 녹아웃 및 상기 단계 (2)에서의 도입은 어느 순서로든 동시에 또는 연속적으로 수행될 수 있음; (c) 복수의 상이한 공여자들에 대해 상기 단계 (a) 및 (b)를 반복하여 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 생산하는 단계, 각각의 공여자 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 세포로부터 생성됨; 및 (d) 상기 복수의 상이한 개별 공여자들 유래 상기 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 조합하는 단계;를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 MHC 또는 그의 성분은 베타-2-마이크로글로불린(β2M)이다. 일부 구현예에서, 상기 내인성 TCR은 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC)이다. 일부 구현예에서, 상기 이종 핵산은 내인성 MHC 및/또는 내인성 TCR을 암호화하는 유전자의 유전자 좌 내로 삽입된다. 일부 구현예에서, 상기 이종 핵산은 내인성 MHC를 암호화하는 유전자의 유전자 좌 내로 삽입된다. 일부 구현예에서, 상기 이종 핵산은 내인성 TCR을 암호화하는 유전자의 유전자 좌 내로 삽입된다.
임의의 구현예 중 일부에서, 본원에서는 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하고, 그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (b) 상기 CD27 농축된 T 세포 집단을 유전자 조작하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 단계, 상기 유전자 조작은, (1) 상기 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포에서, (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분; 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분;의 발현을 녹아웃시키는 단계; 및 (2) 상기 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산을 상기 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포 내로 도입하는 단계;를 포함하며, 상기 단계 (1)에서의 녹아웃 및 상기 단계 (2)에서의 도입은 어느 순서로든 동시에 또는 연속적으로 수행될 수 있음; (c) 복수의 상이한 공여자들에 대해 상기 단계 (a) 및 (b)를 반복하여 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 생산하는 단계, 각각의 공여자 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 세포로부터 생성됨; 및 (d) 상기 복수의 상이한 개별 공여자들 유래 상기 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 조합하는 단계;를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 MHC 또는 그의 성분은 베타-2-마이크로글로불린(β2M)이다. 일부 구현예에서, 상기 내인성 TCR은 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC)이다. 일부 구현예에서, 상기 이종 핵산은 내인성 MHC 및/또는 내인성 TCR을 암호화하는 유전자의 유전자 좌 내로 삽입된다. 일부 구현예에서, 상기 이종 핵산은 내인성 MHC를 암호화하는 유전자의 유전자 좌 내로 삽입된다. 일부 구현예에서, 상기 이종 핵산은 내인성 TCR을 암호화하는 유전자의 유전자 좌 내로 삽입된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 각각에 대해 반복된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 CD3에 대해 표면 음성(CD3-)인 조작된 T 세포 조성물의 세포를 선택하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물의 세포를 선택하는 단계는 세포를 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계 및 상기 항체에 결합되지 않은 세포를 회수하고, 그에 의해서 음성 선택을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물의 세포는 CD3에 대해 표면 음성(CD3-)인 세포에 대해 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물의 세포는 CD3-에 대해 표면 음성이다.
일부 구현예에서, 상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 조합 전에 동결 보존되고 해동되었다.
일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 (약) 75% 초과의 CD3+/CD57- 세포, (약) 80% 초과의 CD3+/CD57- 세포, (약) 85% 초과의 CD3+/CD57- 세포, (약) 90% 초과의 CD3+/CD57- 세포, 또는 (약) 95% 초과의 CD3+/CD57- 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 (약) 75% 초과의 CD57- 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 (약) 80% 초과의 CD57- 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 (약) 85% 초과의 CD57- 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 (약) 90% 초과의 CD57- 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 (약) 95% 초과의 CD57- 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 (약) 40% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포, (약) 45% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포, (약) 50% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포, (약) 55% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포, (약) 60% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포, (약) 65% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포 또는 (약) 70% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 (약) 40% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 (약) 45% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 (약) 50% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 (약) 55% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 (약) 60% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 (약) 65% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 (약) 70% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 (약) 75% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 (약) 80% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 75% 초과 또는 (약) 75% 초과의 CD27+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 80% 초과 또는 (약) 80% 초과의 CD27+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 85% 초과 또는 (약) 85% 초과의 CD27+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 90% 초과 또는 (약) 90% 초과의 CD27+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 95% 초과 또는 (약) 95% 초과의 CD27+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 40% 초과 또는 (약) 40% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 45% 초과 또는 (약) 45% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 50% 초과 또는 (약) 50% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 55% 초과 또는 (약) 55% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 60% 초과 또는 (약) 60% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 65% 초과 또는 (약) 65% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 70% 초과 또는 (약) 70% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 75% 초과 또는 (약) 75% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 독립적으로 80% 초과 또는 (약) 80% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 (약) 1:5 내지 (약) 5:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 (약) 1:3 내지 (약) 3:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 (약) 1:2 내지 (약) 2:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 조작된 T 세포 조성물은 약 1:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 녹아웃 전에, 상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 CD57 고갈된 T 세포 집단을 자극하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 녹아웃 전에, 상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 CD27 농축된 T 세포 집단을 자극하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 녹아웃 및 이종 핵산의 도입은 동시에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 녹아웃 및 이종 핵산의 도입은 어느 순서로든 연속적으로 수행된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, (a) (i) T 세포 마커(들)에 대해 표면 양성인 세포 및 (ii) 복수의 상이한 공여자들 유래 공여자 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 세포 중 하나에 대해 선택하고, 그에 의해서 세포의 농축된 집단을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 세포의 농축된 집단으로부터, (i) T 세포 마커(들)에 대해 표면 양성인 세포 및 (ii) CD57- 세포 중 다른 하나를 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계;이거나 또는 그를 포함하는 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공된다.
임의의 구현예 중의 일부에서, (a) (i) T 세포 마커(들)에 대해 표면 양성인 세포 및 (ii) 복수의 상이한 공여자들 유래 공여자 샘플로부터 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 세포 중 하나에 대해 선택하고, 그에 의해서 세포의 농축된 집단을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 세포의 농축된 집단으로부터, (i) T 세포 마커(들)에 대해 표면 양성인 세포 및 (ii) CD27+ 세포 중 다른 하나를 선택하고, 그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계;이거나 또는 그를 포함하는 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 T 세포 마커(들)는 CD3이다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포 마커(들)는 CD4이다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포 마커(들)는 CD8이다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포 표면 마커(들)는 CD4 및 CD8이다.
일부 구현예에서, 상기 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자들 유래 세포를 포함하는 풀링된 샘플이고, 이에 의해서 상기 방법은 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 상기 공여자 샘플은 개별 공여자 유래 샘플이고, 상기 단계 (i) 및 (ii)는 복수의 상이한 공여자들 유래 공여자 샘플 각각에 대해 개별적으로 반복되고, 이에 의해서 상기 방법은 각각의 개별 공여자에 대해 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 각각의 개별 공여자에 대해 CD57 고갈된 T 세포 집단을 함께 조합하여 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생산하는 것을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자들 유래 세포를 포함하는 풀링된 샘플이고, 이에 의해서 상기 방법은 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 상기 공여자 샘플은 개별 공여자 유래 샘플이고, 상기 단계 (i) 및 (ii)는 복수의 상이한 공여자들 유래 공여자 샘플 각각에 대해 개별적으로 반복되며, 이에 의해서 상기 방법은 각각의 개별 공여자에 대한 CD27 농축된 T 세포 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 각각의 개별 공여자에 대한 CD27 농축된 T 세포 집단을 함께 조합하여 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생산하는 것을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 T 세포 마커(들)는 CD3이다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포 마커(들)는 CD4이다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포 마커(들)는 CD8이다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포 표면 마커(들)는 CD4 및 CD8이다.
상기 제공된 구현예 중 임의의 것의 일부에서, 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 상기 공여자 샘플로부터의 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 선택하고, 그에 의해서 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생산하는 단계, 여기서 상기 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자들 유래 인간 T 세포에 대해 농축된 풀링된 세포 집단임,이거나 또는 그를 포함한다.
상기 제공된 구현예 중 임의의 것의 일부에서, 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은, (a) 공여자 샘플로부터의 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계, 상기 공여자 샘플은 개별 공여자 유래 인간 T 세포에 대해 농축됨; (b) 복수의 상이한 개별 공여자들에 대해 상기 단계 (a)를 반복하는 단계; 및 (c) 각각의 개별 공여자로부터의 각각의 CD57 고갈된 T 세포 집단을 조합하고, 그에 의해서 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계;이거나 또는 그를 포함한다.
상기 제공된 구현예 중 임의의 것의 일부에서, T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 공여자 샘플로부터의 T 세포에 대해 선택하고, 그에 의해서 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계, 여기서 상기 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자들 유래 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포에 대해 농축된 풀링된 세포 집단임,이거나 또는 그를 포함한다.
상기 제공된 구현예 중 임의의 것의 일부에서, 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은, (a) 공여자 샘플로부터의 T 세포에 대해 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계, 상기 샘플은 개별 공여자 유래 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포에 대해 농축됨; (b) 복수의 개별 공여자에 대해 상기 단계 (a)를 반복하는 단계; 및 (c) 각각의 개별 공여자로부터의 각각의 CD57 고갈된 T 세포 집단을 조합하고, 그에 의해서 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계;이거나 또는 그를 포함한다.
상기 제공된 구현예 중 임의의 것의 일부에서, T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 공여자 샘플로부터의 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 T 세포에 대해 선택하고, 그에 의해서 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계, 여기서 상기 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자들 유래 인간 T 세포에 대해 농축된 풀링된 세포 집단임,이거나 또는 그를 포함한다.
상기 제공된 구현예 중 임의의 것의 일부에서, 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은, (a) 공여자 샘플로부터의 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 T 세포에 대해 선택하고, 그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계, 상기 공여자 샘플은 개별 공여자 유래 인간 T 세포에 대해 농축됨; (b) 복수의 상이한 개별 공여자들에 대해 상기 단계 (a)를 반복하는 단계; 및 (c) 각각의 개별 공여자로부터의 각각의 CD27 농축된 T 세포 집단을 조합하고, 그에 의해서 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계;이거나 또는 그를 포함한다.
상기 제공된 구현예 중 임의의 것의 일부에서, 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 공여자 샘플로부터의 T 세포에 대해 선택하고, 그에 의해서 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계, 여기서 상기 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자로부터의 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에 대해 농축된 풀링된 세포 집단임,이거나 또는 그를 포함한다.
임의의 제공된 구현예 중 일부에서, 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은, (a) 공여자 샘플로부터의 T 세포에 대해 선택하고, 그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계, 상기 샘플은 개별 공여자로부터의 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에 대해 농축됨; (b) 복수의 상이한 공여자들에 대해 상기 단계 (a)를 반복하는 단계; 및 (c) 각각의 개별 공여자로부터의 각각의 CD27 농축된 T 세포 집단을 조합하고, 그에 의해서 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계;이거나 또는 그를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 인간 T 세포에 대해 농축된 공여자 샘플은 CD3+ T 세포에 대해 선택하는 것에 의해 수득된다. 일부 구현예에서, 상기 인간 T 세포에 대해 농축된 공여자 샘플은 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포에 대해 선택하는 것에 의해 수득된다. 일부 구현예에서, 상기 인간 T 세포에 대해 농축된 공여자 샘플은 CD4+ T 세포에 대해 선택하는 것에 의해 수득된다. 일부 구현예에서, 상기 인간 T 세포에 대해 농축된 공여자 샘플은 CD8+ T 세포에 대해 선택하는 것에 의해 수득된다. 일부 구현예에서, 상기 인간 T 세포에 대해 농축된 공여자 샘플은 (약) 85% 초과의 CD3+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 인간 T 세포에 대해 농축된 공여자 샘플은 (약) 90% 이상의 CD3+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 인간 T 세포에 대해 농축된 공여자 샘플은 (약) 95% 초과의 CD3+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 인간 T 세포에 대해 농축된 공여자 샘플은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 인간 T 세포에 대해 농축된 공여자 샘플은 (약) 1:5 내지 (약) 5:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 인간 T 세포에 대해 농축된 공여자 샘플은 (약) 1:3 내지 (약) 3:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 인간 T 세포에 대해 농축된 공여자 샘플은 (약) 1:2 내지 (약) 2:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 인간 T 세포에 대해 농축된 공여자 샘플은 약 1:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포에 대해 선택하는 단계는 CD3+ T 세포에 대해 선택하는 단계이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포에 대해 선택하는 단계는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포에 대해 선택하는 단계이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 CD57-인간 T 세포에 대해 농축된 공여자 샘플은 CD57- T 세포에 대해 선택함으로써 수득된다.
일부 구현예에서, (a) CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포는 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC);의 발현을 위해 녹아웃(KO)되고/되거나; (b) 상기 방법은 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포에서 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 TRAC의 발현;을 녹아웃시키는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포는 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분; 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분;의 발현을 위해 녹아웃(KO)된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포에서 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분; 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분;의 발현을 녹아웃시키는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, (a) 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포는 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC);의 발현을 위해 녹아웃(KO)되고/되거나; (b) 상기 방법은 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포에서 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC);의 발현을 녹아웃시키는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포는 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분; 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분;의 발현에 대해 녹아웃(KO)된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포에서 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분; 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분;의 발현을 녹아웃시키는 것을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포는 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분; 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분;의 발현에 대해 녹아웃(KO)된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포에서 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분; 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분;의 발현을 녹아웃시키는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포는 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분; 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분;의 발현에 대해 녹아웃(KO)된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포에서 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분; 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분;의 발현을 녹아웃시키는 것을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 내인성 MHC 또는 그의 성분은 β2M이다. 일부 구현예에서, 상기 내인성 TCR은 TRAC이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 CD3에 대해 표면 음성(CD3-)인 녹아웃된 세포를 선택하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 CD3-인 녹아웃된 세포를 선택하는 것은 세포를 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키고, 상기 항체에 결합되지 않은 세포를 회수하여 음성 선택을 수행하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 녹아웃된 세포는 CD3에 대해 표면 음성(CD3-)인 세포에 대해 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 녹아웃된 세포는 CD3-에 대해 표면 음성이다.
일부 구현예에서, (a) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드는 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 내로 도입되고/되거나; (b) 상기 방법은 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 내로 도입함으로써 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드는 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 내로 도입됨으로써 조작된 T 세포 조성물을 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 내로 도입함으로써 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, (a) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 내로 도입되고/되거나; (b) 상기 방법은 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 내로 도입함으로써 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 내로 도입됨으로써 조작된 T 세포 조성물을 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 내로 도입함으로써 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 것을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 녹아웃 및 이종 핵산의 도입은 동시에 수행된다. 일부 구현예에서, ㅍ녹아웃 및 이종 핵산의 도입은 어느 순서로든 연속적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포가 녹아웃되고/되거나 이종 핵산에 도입되기 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포가 녹아웃되기 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포가 이종 핵산에 도입되기 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포가 녹아웃되고 이종 핵산에 도입되기 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포가 녹아웃되고/되거나 이종 핵산에 도입된 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포가 녹아웃된 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포가 이종 핵산에 도입된 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포가 녹아웃되고 이종 핵산에 도입된 후에 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드는 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포 내로 도입됨으로써 조작된 T 세포 조성물을 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포 내로 도입함으로써 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, (a) 상기 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포 내로 도입되고/되거나; (b) 상기 방법은 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포 내로 도입함으로써 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 것을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 녹아웃 및 이종 핵산의 도입은 동시에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 녹아웃 및 이종 핵산의 도입은 어느 순서로든 연속적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포가 이종 핵산에 녹아웃 및/또는 도입되기 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포가 녹아웃되기 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포가 이종 핵산에 도입되기 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포가 녹아웃되고 이종 핵산에 도입되기 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포가 이종 핵산에 녹아웃 및/또는 도입된 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포가 녹아웃된 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포가 이종 핵산에 도입된 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 조합은 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포가 녹아웃되고 이종 핵산에 도입된 후에 수행된다.
또한, 임의의 제공된 구현예 중 일부에서, 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은, (i) 공여자 샘플로부터 (a) CD3에 대해 표면 양성(CD3+)이거나, 또는 CD4 및/또는 CD8에 대해 표면 양성(CD4+ 및/또는 CD8+)인 세포 및 (b) CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 세포 중의 하나에 대해 선택하고, 그에 의해서 농축된 세포 집단을 생성하는 단계; (ii) 상기 농축된 세포 집단으로부터, (a) CD3+, 또는 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포 및 (b) CD57- 세포 중의 다른 것을 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (iii) 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포를 상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극하는 단계; (iv) 상기 자극된 세포를 유전자 조작하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 단계, 상기 유전자 조작은: (1) 상기 자극된 세포에서, (a) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (b) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC),의 발현을 녹아웃시키는 단계; 및 (2) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 자극된 세포 내로, 선택적으로 TRAC를 암호화하는 유전자의 유전자 좌 내로 도입하는 단계;를 포함하며, 상기 단계 (1)에서의 녹아웃 및 상기 단계 (2)에서의 도입은 어느 순서로든 동시에 또는 연속적으로 수행될 수 있음; (v) 상기 조작된 T 세포 조성물을 최대 96 시간 동안, 선택적으로 (약) 37℃±2℃의 온도에서 인큐베이션하는 단계, 선택적으로 상기 인큐베이션은 증식 또는 증폭을 촉진시키는 조건하에 상기 세포를 배양하는 단계를 더 포함함; (vi) 복수의 상이한 공여자들에 대해 상기 단계 (i) 내지 (v)를 반복하여 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 생산하는 단계, 여기서 각각의 공여자 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 세포로부터 생성됨; 및 (vii) 상기 복수의 상이한 공여자들 유래 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 조합하는 단계;이거나 또는 그를 포함한다.
일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단에서의 CD57+ T 세포의 빈도는 공여자 샘플에서의 CD57+ T 세포의 빈도의 약 또는 약 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만이다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단에서의 CD57+ T 세포의 빈도는 공여자 샘플에서의 CD57+ T 세포의 빈도의 약 35% 미만이다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단에서의 CD57+ T 세포의 빈도는 공여자 샘플에서의 CD57+ T 세포의 빈도의 약 30% 미만이다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단에서의 CD57+ T 세포의 빈도는 공여자 샘플에서의 CD57+ T 세포의 빈도의 약 25% 미만이다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단에서의 CD57+ T 세포의 빈도는 공여자 샘플에서의 CD57+ T 세포의 빈도의 약 20% 미만이다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단에서의 CD57+ T 세포의 빈도는 공여자 샘플에서의 CD57+ T 세포의 빈도의 약 10% 미만이다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단에서의 CD57+ T 세포의 빈도는 공여자 샘플에서의 CD5+ T 세포의 빈도의 약 50% 미만이다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단에서의 CD57+ T 세포의 빈도는 공여자 샘플에서의 CD5+ T 세포의 빈도의 약 1% 미만이다.
일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 약 20% 미만의 CD57+ T 세포, 약 15% 미만의 CD57+ T 세포, 약 10% 미만의 CD57+ T 세포, 약 5% 미만의 CD57+ T 세포, 약 1% 미만의 CD57+ T 세포, 또는 약 0.1% 미만의 CD57+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단은 약 20% 미만의 CD57+ T 세포, 약 15% 미만의 CD57+ T 세포, 약 10% 미만의 CD57+ T 세포, 약 5% 미만의 CD57+ T 세포, 약 1% 미만의 CD57+ T 세포, 또는 약 0.1% 미만의 CD57+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 약 20% 미만의 CD57+ T 세포, 약 15% 미만의 CD57+ T 세포, 약 10% 미만의 CD57+ T 세포, 약 5% 미만의 CD57+ T 세포, 약 1% 미만의 CD57+ T 세포, 또는 약 0.1% 미만의 CD57+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 약 5% 미만의 CD57+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단은 약 5% 미만의 CD57+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 약 5% 미만의 CD57+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 CD57+ T 세포가 없거나 본질적으로 없다. 일부 구현예에서, 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단은 CD57+ T 세포가 없거나 본질적으로 없다. 일부 구현예에서, 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 CD57+ T 세포가 없거나 본질적으로 없다.
또한, 임의의 제공된 구현예 중 일부에서, 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은, (i) 공여자 샘플로부터 (a) CD3에 대해 표면 양성(CD3+)이거나, 또는 CD4 및/또는 CD8에 대해 표면 양성(CD4+ 및/또는 CD8+)인 세포 및 (b) CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 세포 중의 하나에 대해 선택하고, 그에 의해서 농축된 세포 집단을 생성하는 단계; (ii) 상기 농축된 세포 집단으로부터, (a) CD3+, 또는 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포 및 (b) CD27+ 세포 중의 다른 것을 선택하고, 그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (iii) CD27 농축된 T 세포 집단의 세포를 상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극하는 단계; (iv) 상기 자극된 세포를 유전자 조작하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 단계, 상기 유전자 조작은: (1) 상기 자극된 세포에서, (a) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분; 및/또는 (b) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분;의 발현을 녹아웃시키는 단계; 및 (2) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 자극된 세포 내로 도입하는 단계;를 포함하며, 상기 단계 (1)에서의 녹아웃 및 상기 단계 (2)에서의 도입은 어느 순서로든 동시에 또는 연속적으로 수행될 수 있음; (v) 상기 조작된 T 세포 조성물을 최대 96 시간 동안 인큐베이션하는 단계; (vi) 복수의 상이한 공여자들에 대해 상기 단계 (i) 내지 (v)를 반복하여 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 생산하는 단계, 여기서 각각의 공여자 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 세포로부터 생성됨; 및 (vii) 상기 복수의 상이한 공여자들 유래 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 조합하는 단계;이거나 또는 그를 포함한다.
일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단에서의 CD27- T 세포의 빈도는 공여자 샘플에서의 CD27- T 세포의 빈도의 약 또는 약 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만이다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단에서의 CD27- T 세포의 빈도는 공여자 샘플에서의 CD27- T 세포의 빈도의 약 35% 미만이다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단에서의 CD27- T 세포의 빈도는 공여자 샘플에서의 CD27- T 세포의 빈도의 약 30% 미만이다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단에서의 CD27- T 세포의 빈도는 공여자 샘플에서의 CD27- T 세포의 빈도의 약 25% 미만이다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단에서의 CD27- T 세포의 빈도는 공여자 샘플에서의 CD27- T 세포의 빈도의 약 20% 미만이다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 내의 CD27- T 세포의 빈도는 공여자 샘플 내의 CD27- T 세포의 빈도의 약 10% 미만이다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 내의 CD27- T 세포의 빈도는 공여자 샘플 내의 CD5+ T 세포의 빈도의 약 50% 미만이다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 내의 CD27- T 세포의 빈도는 공여자 샘플 내의 CD27- T 세포의 빈도의 약 1% 미만이다.
일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 약 20% 미만의 CD27- T 세포, 약 15% 미만의 CD27- T 세포, 약 10% 미만의 CD27- T 세포, 약 5% 미만의 CD27- T 세포, 약 1% 미만의 CD27- T 세포, 또는 약 0.1% 미만의 CD27- T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단은 약 20% 미만의 CD27- T 세포, 약 15% 미만의 CD27- T 세포, 약 10% 미만의 CD27- T 세포, 약 5% 미만의 CD27- T 세포, 약 1% 미만의 CD27- T 세포, 또는 약 0.1% 미만의 CD27- T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 약 20% 미만의 CD27- T 세포, 약 15% 미만의 CD27- T 세포, 약 10% 미만의 CD27- T 세포, 약 5% 미만의 CD27- T 세포, 약 1% 미만의 CD27- T 세포, 또는 약 0.1% 미만의 CD27- T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 약 5% 미만의 CD27- T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단은 약 5% 미만의 CD27- T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 약 5% 미만의 CD27- T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 CD27- T 세포가 없거나 본질적으로 없다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단은 CD27- T 세포가 없거나 본질적으로 없다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 CD27- T 세포가 없거나 본질적으로 없다.
일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포는 공여자 샘플의 세포의 것과 비교하여 하나 이상의 분자의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타낸다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포는 공여자 샘플의 세포의 것과 비교하여 하나 이상의 분자의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타낸다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포는 공여자 샘플의 세포의 것과 비교하여 하나 이상의 분자의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타낸다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자는 나이브 T 세포의 마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자는 CD27, Ki67, CD25, CD28, CCR7, 및/또는 CD45RA이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포는 공여자 샘플의 세포의 것과 비교하여 CD27 및/또는 Ki67의 발현에서 더 낮은 CV를 나타낸다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포는 공여자 샘플의 세포의 것과 비교하여 CD27의 발현에서 더 낮은 CV를 나타낸다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포는 공여자 샘플의 세포의 것과 비교하여 Ki67의 발현에서 더 낮은 CV를 나타낸다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포는 공여자 샘플의 세포의 것과 비교하여 CD27의 발현에서 더 낮은 CV를 나타낸다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포는 공여자 샘플의 세포의 것과 비교하여 Ki67의 발현에서 더 낮은 CV를 나타낸다.
일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단의 세포는 공여자 샘플의 세포의 것과 비교하여 하나 이상의 분자의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타낸다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포는 공여자 샘플의 세포의 것과 비교하여 하나 이상의 분자의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타낸다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자는 나이브 T 세포의 마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자는 Ki67, CD25, CD28, CCR7, 및/또는 CD45RA이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자는 Ki67이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자는 CCR7이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자는 CD45RA이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자는 CD28이거나 또는 그를 포함한다.
일부 구현예에서, 공여자 샘플은 성분채집술 생성물 또는 백혈구성분채집술 생성물이거나 또는 그를 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 적어도 약 또는 약 2명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 5명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 10명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 15명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 20명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 25명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 50명의 상이한 공여자, 또는 적어도 약 또는 약 100명의 상이한 공여자, 또는 상기 중의 어느 것들 사이의 임의의 범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 5 내지 25명의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 25 내지 50명의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 50 내지 100명의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 100% 미만의 인간 백혈구 항원(HLA) 매칭된, 약 90% 미만의 HLA 매칭된, 약 80% 미만의 HLA 매칭된, 약 70% 미만의 HLA 매칭된, 약 60% 미만의 HLA 매칭된, 또는 약 50% 미만의 HLA 매칭된 2명 이상의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 100%의 HLA 매칭되지 않은 적어도 2명의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 개별 공여자는 공여자 샘플이 개별 공여자로부터 수득되는 시점에 건강하거나 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되지 않는다. 일부 구현예에서, 개별 공여자는 공여자 샘플이 개별 공여자로부터 수득되는 시점에 질환 또는 병태를 갖는 것이다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 공여자 샘플이 적어도 1명의 공여자로부터 수득되는 시점에 건강하거나 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되지 않는 적어도 1명의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 공여자 샘플이 적어도 1명의 공여자로부터 수득되는 시점에 질환 또는 병태를 갖는 적어도 1명의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자 중 공여자 각각은 공여자 샘플이 각각의 상이한 공여자로부터 수득되는 시점에 건강하거나 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되지 않는 것이다.
일부 구현예에서, 선택은 면역친화도-기반 선택이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역친화도-기반 선택은 T 세포를 CD57에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키고 항체에 결합되지 않은 세포를 회수하여 음성 선택을 수행하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 선택은 면역친화도-기반 선택이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역친화도-기반 선택은 T 세포를 CD27에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키고 항체에 결합된 세포를 회수하여 양성 선택을 수행하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역친화도-기반 선택은 T 세포를 CD3, CD4, 또는 CD8에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키고 항체에 결합된 세포를 회수하여 양성 선택을 수행하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역친화도-기반 선택은 T 세포를 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키고 항체에 결합된 세포를 회수하여 양성 선택을 수행하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역친화도-기반 선택은 T 세포를 CD4에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키고, 항체에 결합된 세포를 회수하여 양성 선택을 수행하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역친화도-기반 선택은 T 세포를 CD8에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키고, 항체에 결합된 세포를 회수하여 양성 선택을 수행하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 고체 표면 상에 고정된다. 일부 구현예에서, 고체 표면은 자성 입자이다. 일부 구현예에서, 항체는 친화도 크로마토그래피 매트릭스 상에 고정되거나 또는 그에 부착된다. 일부 구현예에서, 항체는 매트릭스 상에 고정된 결합 시약과 가역적 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 결합 파트너를 더 포함하며, 그에 의해 항체는 상기 접촉 동안 상기 크로마토그래피 매트릭스에 가역적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 결합 시약은 결합 파트너에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 뮤테인이다.
일부 구현예에서, (a) 상기 방법은 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 동결 보존하는 것을 더 포함하고/하거나; (b) CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 동결 보호제와 함께 제형화된다. 일부 구현예에서, 방법은 CD57 고갈된 T 세포 집단을 동결 보존하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 동결 보존하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단은 동결 보호제와 함께 제형화된다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 동결 보호제와 함께 제형화된다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 후속 단계 전에 해동된다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단은 후속 단계 전에 해동된다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 후속 단계 전에 해동된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 CD27 농축된 T 세포 집단을 동결 보존하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 동결 보존하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단은 동결 보호제와 함께 제형화된다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 동결 보호제와 함께 제형화된다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단은 후속 단계 전에 해동된다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 후속 단계 전에 해동된다.
일부 구현예에서, 내인성 MHC 또는 그의 성분은 MHC 부류 I 단백질 또는 그의 성분이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 MHC 또는 그의 성분은 β2M을 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 TCR 또는 그의 성분은 TRAC 및/또는 T 세포 수용체 베타 불변(T cell receptor beta constant; TRBC)를 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 TCR 또는 그의 성분은 TRAC를 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 TCR 또는 그의 성분은 TRBC를 포함한다. 일부 구현예에서, 녹아웃은 내인성 β2M 유전자 및/또는 내인성 TRAC 유전자에 의해 암호화되는 생성물의 발현을 감소시키거나 파괴하는 제제를 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 녹아웃은 내인성 β2M 유전자에 의해 암호화되는 생성물의 발현을 감소시키거나 파괴하는 제제를 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 녹아웃은 내인성 TRAC 유전자에 의해 암호화되는 생성물의 발현을 감소시키거나 파괴하는 제제를 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 녹아웃은 β2M 및/또는 TRAC의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 제제를 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 녹아웃은 β2M의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 제제를 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 녹아웃은 TRAC의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 제제를 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 녹아웃은 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), TAL-이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 CRISPR-Cas9 조합물을 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 녹아웃은 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 녹아웃은 TAL-이펙터 뉴클레아제(TALEN)를 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 녹아웃은 CRISPR-Cas 조합물을 세포 내로 도입하는 것을 포함한다.
임의의 제공된 구현예에서, 본원에서는 CD57 고갈된 T 세포 집단을 유전자 조작하는 방법이 제공되며, 상기 방법 중 어느 것에 의해 생산된 세포 내로 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 조작은 세포를 선택하는 단계 중 하나 이상 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 조작된 T 세포가 CD57+ T 세포에 대해 고갈되지 않은 방법과 비교하여, 재조합 수용체의 발현에서 더 낮은 CV를 나타낸다.
임의의 제공된 구현예에서, 본원에서는 CD57 고갈된 T 세포 집단을 유전자 조작하는 방법이 제공되며, 상기 방법 중 어느 것에 의해 생산된 세포 내로 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 조작은 세포를 선택하는 단계 중 하나 이상 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 조작된 T 세포가 CD27- T 세포에 대해 고갈되지 않은 방법과 비교하여, 재조합 수용체의 발현에서 더 낮은 CV를 나타낸다.
일부 구현예에서, 상기 도입은 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터와 이종 폴리뉴클레오티드의 표적화된 삽입을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터이다. 일부 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 β2M 유전자 또는 TRAC 유전자의 유전자 좌 내로 삽입된다. 일부 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 β2M 유전자의 유전자 좌 내로 삽입된다. 일부 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 TRAC 유전자의 유전자 좌 내로 삽입된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 도입 후 96시간 이하 동안 조작된 세포를 인큐베이션하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 약 37℃±2℃의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 도입 후 최대 72시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 도입 후 최대 48 시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 도입 후 최대 24시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 바이러스 벡터를 CD57 고갈된 T 세포 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포의 게놈 내로 통합시키는 것을 초래한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 바이러스 벡터를 CD57 고갈된 T 세포의 게놈 내로 통합시키는 것을 초래한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 풀링된 CD57 고갈된 T 세포의 게놈 내로의 바이러스 벡터의 통합을 초래한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 바이러스 벡터를 CD27 농축된 T 세포의 게놈 내로 통합시키는 것을 초래한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 풀링된 CD27 농축된 T 세포의 게놈 내로의 바이러스 벡터의 통합을 초래한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건 하에 세포를 배양하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 배양은 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 재조합 사이토카인은 IL-2, IL-7 및 IL-15 중의 하나 이상이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 방법에 의해 생산된 세포를 수확 또는 수집하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 수확 또는 수집은 임계 수의 세포가 방법에 의해 생산된 시점에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 임계 수에 도달하는 시간은 CD57+ T 세포를 고갈시키는 것을 포함하지 않는 방법보다 적은 시간이다. 일부 구현예에서, 상기 임계 수에 도달하는 시간은 CD27-T 세포를 고갈시키는 것을 포함하지 않는 방법보다 적은 시간이다. 일부 구현예에서, (a) 상기 방법은 동결 보호제의 존재 하에 동결 보존을 위해 수확된 또는 수집된 세포를 제형화하는 것을 더 포함하고/하거나; (b) 상기 수확된 또는 수집된 세포는 약학적으로 허용가능한 부형제의 존재 하에 제형화된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 동결 보호제의 존재 하에 동결 보존을 위해 수확된 또는 수집된 세포를 제형화하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 수확된 또는 수집된 세포는 약학적으로 허용가능한 부형제의 존재 하에 제형화된다.
일부 구현예에서, 상기 재조합 수용체는 질환 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련되고, 특이적이고/이거나 발현된 표적 항원과 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 질환 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환, 또는 종양 또는 암이다. 일부 구현예에서, 상기 질환 또는 병태는 종양 또는 암이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 항원은 종양 항원이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 표피 당단백질 2(EPG-2), 표피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; FC 수용체 상동물 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 클래스 5D(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 2량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 패밀리 8 멤버 A를 함유하는 루신 리치 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스트론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나제 유사 고아 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토머라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원 또는 보편적 태그(universal tag) 및/또는 비오티닐화된 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체(pathogen)에 의해 발현된 분자와 연관된 항원 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 재조합 수용체는 기능적 비-TCR 항원 수용체 또는 TCR 또는 그의 항원-결합 단편이거나 또는 그를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 구현예에서, 상기 재조합 수용체는 항원-결합 도메인, 스페이서(spacer) 및/또는 힌지 영역(hinge region)을 포함하는 세포외 도메인(extracellular domain), 막관통 도메인(transmembrane domain) 및 공자극 신호전달 영역(costimulatory signaling region)을 포함하는 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호전달 도메인, T 세포 수용체(TCR) 성분의 신호전달 도메인 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 신호전달 도메인이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3 사슬의 세포내 신호전달 도메인이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬 또는 그의 신호전달 부분이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 공자극 신호전달 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 세포내 신호전달 도메인 또는 그의 신호전달 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 공자극 신호전달 영역은 CD28의 세포내 신호전달 도메인 또는 그의 신호전달 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 공자극 신호전달 영역은 4-1BB의 세포내 신호전달 도메인 또는 그의 신호전달 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 공자극 신호전달 영역은 ICOS의 세포내 신호전달 도메인 또는 그의 신호전달 부분을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법에 의해 생산된 T 세포는 질환 또는 병태를 갖는 적어도 하나의 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, T 세포의 적어도 일부는 적어도 하나의 대상체에 대해 동종이계이다. 일부 구현예에서, 상기 질환 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 종양 또는 암이다. 일부 구현예에서, 상기 질환 또는 병태는 종양 또는 암이다. 일부 구현예에서, 상기 방법에 의해 생산된 T 세포는 하나 이상의 단위 용량으로서 투여를 위해 제형화되고, 상기 세포는 적어도 약 100개 단위 용량의 세포, 적어도 약 200개 단위 용량의 세포, 적어도 약 300개 단위 용량의 세포, 적어도 약 400개 단위 용량의 세포, 적어도 약 500개 단위 용량의 세포, 적어도 약 600개의 단위 용량, 적어도 약 또는 적어도 약 1,000개 단위 용량의 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 방법에 의해 생산된 T 세포는 하나 이상의 단위 용량으로서 투여를 위해 제형화되고, 상기 세포는 약 100개 내지 약 1000개의 단위 용량, 약 100개 내지 약 500개의 단위 용량, 약 100개 내지 약 200개의 단위 용량, 약 250개 내지 약 500개의 단위 용량, 또는 약 500개 내지 1000개의 단위 용량을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 방법에 의해 생산된 T 세포는 적어도 2명의 대상체, 적어도 5명의 대상체, 적어도 10명의 대상체, 적어도 25명의 대상체, 적어도 50명의 대상체, 적어도 100명의 대상체, 적어도 200명의 대상체, 적어도 500명의 대상체, 또는 적어도 1,000명의 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 방법에 의해 생산된 T 세포는 약 2명 내지 1000명의 대상체, 약 5명 내지 500명의 대상체, 약 10명 내지 약 200명의 대상체, 약 20명 내지 약 150명의 대상체, 또는 약 25명 내지 약 50명의 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 1천만개 내지 7천5백만개의 세포/세포의 mL 수/세포의 농도를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 (약) 5.0×106 내지 1×109, 5.0×106 내지 5.0×108, 5.0×106 내지 2.5×108, 5.0×106 내지 1.0×108, 5.0×106 내지 7.5×107, 1×107 내지 1×109, 1×107 내지 5.0×108, 1×107 내지 2.5×108, 1×107 내지 1.0×108, 1.0×107 내지 7.5×107, 1.0×107 내지 5.0×107, 1.0×107 내지 2.5×107, 1.5×107 내지 2.25×107, 2.5×107 내지 1.0×109, 또는 2.5×107 내지 7.5×108개의 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 (약) 5.0×106 내지 1×109, 1.0×107 내지 1.0×109, 2.5×107 내지 1×109, 5.0×107 내지 1.0×109, 7.5×107 내지 1.0×109, 1.0×108 내지 1.0×109, 5.0×107 내지 7.5×108, 5×107 내지 5.0×108, 5×107 내지 2.5×108, 5.0×107 내지 1.0×108, 또는 5.0×107 내지 7.5×107개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 5.0×106개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 1.0×107개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 1.5×107개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 3.0×107개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 4.5×107개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 6.0×107개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 8.0×107개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 1.0×108개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 1.5×108개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 3.0×108개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 4.5×108개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 6.0×108개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 8.0×108개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 1.0×109개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포를 상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극하고, 그에 의해서 자극된 T 세포 집단을 생산하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포를 상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극하고, 그에 의해서 자극된 T 세포 집단을 생산하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포를 상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극하고, 그에 의해서 자극된 T 세포 집단을 생산하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포를 상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극하고, 그에 의해서 자극된 T 세포 집단을 생산하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포를 상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극하고, 그에 의해서 자극된 T 세포 집단을 생산하는 것을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 자극 조건은 자극 시약의 존재를 포함하며, 상기 자극 시약은 TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 (i) TCR 복합체의 구성원에 특이적으로 결합하는, 선택적으로 CD3에 특이적으로 결합하는 1차 제제(primary agent) 및 (ii) T 세포 공자극 분자에 특이적으로 결합하는 2차 제제(secondary agent)를 함유하되, 선택적으로 상기 공자극 분자는 CD28, CD137 (4-1-BB), OX40 또는 ICOS로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 1차 제제 및 2차 제제 중의 적어도 하나는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 1차 제제는 항-CD3 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고, 상기 2차 제제는 항-CD28 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fv 단편, 및 단일-쇄 Fv 단편 (scFv)으로 구성된 군으로부터 선택된 1가 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 항원 결합 단편은 Fab이다. 일부 구현예에서, 상기 항원 결합 단편은 scFv이다. 일부 구현예에서, 상기 1차 제제 및 2차 제제는 복수의 스트렙타비딘 분자 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하는 올리고머 입자 시약의 표면 상에 가역적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 분자 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 비오틴, 아비딘, 비오틴 유사체 또는 비오틴 뮤테인, 아비딘 유사체 또는 아비딘 뮤테인 및/또는 그의 생물학적 활성 단편에 결합하거나 그에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 1차 제제는 항-CD3 Fab를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 2차 제제는 항-CD28 Fab를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 1차 제제는 항-CD3 Fab를 함유하고, 2차 제제는 항-CD28 Fab를 함유한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 자극 시약을 T 세포로부터 분리하는 것을 더 포함하며, 상기 분리는 T 세포를 물질과 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 물질은 1차 제제와 2차 제제 및 올리고머 입자 시약 사이의 결합을 역전시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 물질은 자유 결합 파트너(free binding partner)이고/이거나 경쟁 제제이다. 일부 구현예에서, 상기 물질은 스트렙타비딘-결합 펩티드, 비오틴 또는 그의 생물학적 활성 단편, 또는 비오틴 유사체 또는 그의 생물학적 활성 단편이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 물질은 비오틴 또는 비오틴 유사체이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 자극 조건은 하나 이상의 재조합 시토카인의 존재를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 자극 조건은 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15 중 하나 이상의 존재를 포함한다. 일부 구현예에서, (a) 상기 방법은 동결 보호제의 존재 하에 동결 보존을 위해 자극된 T 세포를 제형화하는 것을 더 포함하고/하거나; (b) 자극된 T 세포는 동결 보호제의 존재 하에 제형화된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 동결 보호제의 존재 하에 동결 보존을 위해 자극된 T 세포를 제형화하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 자극된 T 세포는 동결 보호제의 존재 하에 제형화된다.
본원에서는 본원에 제공된 임의의 방법에 의해 생산된 T 세포 집단을 함유하는 조성물이 제공된다.
본원에서는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포에 대해 농축된 T 세포 집단을 함유하는 공여자 풀 유래 T 세포를 함유하는 조성물이 제공되며, 여기서 상기 세포 집단은 복수의 상이한 공여자들 유래이고, 상기 복수의 상이한 공여자들은 100% 인간 백혈구 항원(HLA) 매칭되지 않은 적어도 2명의 공여자를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 T 세포는 재조합 수용체로 유전자 조작된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 중의 CD57+ T 세포의 빈도는 조성물 중의 총 T 세포의 약 또는 약 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만이다. 일부 구현예에서, 조성물 중의 CD57+ T 세포의 빈도는 조성물 중의 총 T 세포의 약 20% 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 20% 미만의 CD57+ T 세포, 약 15% 미만의 CD57+ T 세포, 약 10% 미만의 CD57+ T 세포, 약 5% 미만의 CD57+ T 세포, 약 1% 미만의 CD57+ T 세포, 또는 약 0.1% 미만의 CD57+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 15% 미만의 CD57+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 10% 미만의 CD57+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 5% 미만의 CD57+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 1% 미만의 CD57+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 0.1% 미만의 CD57+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 CD57+ T 세포를 함유하지 않거나 또는 본질적으로 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 75% 초과의 CD3+/CD57- 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 80% 초과의 CD3+/CD57- 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 85% 초과의 CD3+/CD57- 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 90% 초과의 CD3+/CD57- 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 95% 초과의 CD3+/CD57- 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 40% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 45% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 50% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 55% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 60% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 65% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 70% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 40% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 45% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 50% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 40% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 60% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 65% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 70% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 75% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다.
또한, 본원에서는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에 대해 농축된 T 세포 집단을 함유하는 공여자 풀 유래 T 세포를 함유하는 조성물이 제공되며, 여기서 상기 세포 집단은 복수의 상이한 공여자들 유래이고, 상기 복수의 상이한 공여자들은 100% 인간 백혈구 항원(HLA) 매칭되지 않은 적어도 2명의 공여자를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 T 세포는 재조합 수용체로 유전자 조작된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 중의 CD27- T 세포의 빈도는 조성물 중의 총 T 세포의 약 또는 약 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만이다. 일부 구현예에서, 조성물 중의 CD27- T 세포의 빈도는 조성물 중의 총 T 세포의 약 15% 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 10% 미만의 CD27- T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 5% 미만의 CD27- T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 1% 미만의 CD27- T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 0.1% 미만의 CD27- T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 CD27- T 세포를 함유하지 않거나 또는 본질적으로 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 75% 초과의 CD27+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 80% 초과의 CD27+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 85% 초과의 CD27+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 90% 초과의 CD27+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 95% 초과의 CD27+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 40% 초과의 CD27+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 45% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 50% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 55% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 60% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 65% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 70% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 (약) 1:5 내지 (약) 5:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 (약) 1:3 내지 (약) 3:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 (약) 1:2 내지 (약) 2:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 약 1:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것과 비교하여, 하나 이상의 분자의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것보다 적어도 20% 더 낮거나, 적어도 40% 더 낮거나, 적어도 60% 더 낮거나, 또는 적어도 80% 더 낮다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자는 나이브 T 세포의 마커이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 분자는 CD27, Ki67, CD25, CD28, CCR7, 및/또는 CD45RA이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것과 비교하여, CD27 및/또는 Ki67의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것과 비교하여, CD27의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것과 비교하여, Ki67의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것과 비교하여, CD27 및 Ki67의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것보다 적어도 20% 더 낮거나, 적어도 40% 더 낮거나, 적어도 60% 더 낮거나, 또는 적어도 80% 더 낮다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것보다 적어도 20% 더 낮다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포에 대해 농축되지 않은 세포 집단의 변동 계수(CV)보다 적어도 40% 더 낮다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포에 대해 농축되지 않은 세포 집단의 변동 계수(CV)보다 적어도 60% 더 낮다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포에 대해 농축되지 않은 세포 집단의 변동 계수(CV)보다 적어도 80% 더 낮다.
일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것과 비교하여, 하나 이상의 분자의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것보다 적어도 20% 더 낮거나, 적어도 40% 더 낮거나, 적어도 60% 더 낮거나, 또는 적어도 80% 더 낮다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자는 나이브 T 세포의 마커이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 분자는 Ki67, CD25, CD28, CCR7, 및/또는 CD45RA이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에 대해 농축되지 않은 세포 집단의 변동 계수(CV)와 비교하여 Ki67의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것보다 적어도 20% 더 낮거나, 적어도 40% 더 낮거나, 적어도 60% 더 낮거나, 또는 적어도 80% 더 낮다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것보다 적어도 20% 더 낮다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에 대해 농축되지 않은 세포 집단의 변동 계수(CV)보다 적어도 40% 더 낮다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에 대해 농축되지 않은 세포 집단의 변동 계수(CV)보다 적어도 60% 더 낮다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에 대해 농축되지 않은 세포 집단의 변동 계수(CV)보다 적어도 80% 더 낮다.
일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 적어도 약 또는 약 2명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 5명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 10명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 15명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 20명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 25명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 50명의 상이한 공여자, 또는 적어도 약 또는 약 100명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 2명의 상이한 공여자, 약 5명의 상이한 공여자, 약 10명의 상이한 공여자, 약 15명의 상이한 공여자, 약 20명의 상이한 공여자, 약 25명의 상이한 공여자, 약 50명의 상이한 공여자, 또는 약 100명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 2명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 5명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 10명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 20명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 25명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 50명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 100명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 (약) 25명 미만의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 100% 미만의 인간 백혈구 항원(HLA) 매칭된 공여자, 약 90% 미만의 HLA 매칭된 공여자, 약 80% 미만의 HLA 매칭된 공여자, 약 70% 미만의 HLA 매칭된 공여자, 약 60% 미만의 HLA 매칭된 공여자, 또는 약 50% 미만의 HLA 매칭된 공여자인 2명 이상의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 100% HLA 매칭되지 않은 적어도 2명의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 세포가 적어도 1명의 공여자로부터 수득되는 시점에 건강하거나 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되지 않는 적어도 1명의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 세포가 적어도 1명의 공여자로부터 수득되는 시점에 질환 또는 병태를 갖는 적어도 1명의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자 중 공여자 각각은 세포가 각각의 상이한 공여자로부터 수득되는 시점에 건강하거나 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되지 않는 것이다.
일부 구현예에서, T 세포는 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 임의로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC);의 발현을 위해 녹아웃된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포는 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분의 발현을 위해 녹아웃된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포는 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분의 발현을 위해 녹아웃된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포는 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분; 및 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분;의 발현을 위해 녹아웃된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 MHC는 MHC 부류 I 단백질 또는 그의 성분이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 MHC는 베타-2-마이크로글로불린(β2M)이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 TCR 또는 그의 성분은 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 및/또는 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC)이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 TCR 또는 그의 성분은 T-세포 수용체 알파 불변(TRAC)이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 β2M 유전자 또는 TRAC 유전자의 유전자 좌 내로 삽입된다. 일부 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 TRAC 유전자의 유전자 좌 내로 삽입된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 CD3에 대해 표면 음성(CD3-)인 녹아웃된 T 세포를 선택하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, CD3-인 녹아웃된 T 세포를 선택하는 것은 세포를 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키는 것 및 항체에 결합되지 않은 세포를 회수하여 음성 선택을 수행하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 녹아웃된 T 세포는 CD3에 대해 표면 음성(CD3-)인 세포에 대해 선택된다. 일부 구현예에서, 녹아웃된 T 세포는 CD3-에 대해 표면 음성이다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 동결 보호제(cryprotectant)를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 함유한다.
일부 구현예에서, 상기 재조합 수용체는 질환 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련되고, 특이적이고/이거나 발현된 표적 항원과 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 질환 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환, 또는 종양 또는 암이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 항원은 종양 항원이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 표피 당단백질 2(EPG-2), 표피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; FC 수용체 상동물 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 클래스 5D(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 2량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 패밀리 8 멤버 A를 함유하는 루신 리치 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스트론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나제 유사 고아 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토머라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원 또는 보편적 태그(universal tag) 및/또는 비오티닐화된 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체(pathogen)에 의해 발현된 분자와 연관된 항원 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 표적 항원은 CD19이다.
일부 구현예에서, 상기 재조합 수용체는 기능적 비-TCR 항원 수용체 또는 TCR 또는 그의 항원-결합 단편이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 구현예에서, 상기 재조합 수용체는 항원-결합 도메인, 스페이서 및/또는 힌지 영역을 포함하는 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 공자극 신호전달 영역을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 도메인은 scFv를 포함하는 항원-결합 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 도메인은 scFv인 항원-결합 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호전달 도메인, T 세포 수용체(TCR) 성분의 신호전달 도메인 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 신호전달 도메인이거나 또는 그를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3 사슬의 세포내 신호전달 도메인이거나 또는 그를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 쇄 또는 그의 신호전달 부분이거나 또는 그를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 공자극 신호전달 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 세포내 신호전달 도메인 또는 그의 신호전달 부분을 함유한다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 질환 또는 병태를 갖는 대상체의 치료를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 질환 또는 병태는 암 또는 종양이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는 하나 이상의 단위 용량으로서 투여를 위해 제형화되고 상기 세포는 적어도 약 100개 단위 용량의 세포, 적어도 약 200개 단위 용량의 세포, 적어도 약 300개 단위 용량의 세포, 적어도 약 400개 단위 용량의 세포, 적어도 약 500개 단위 용량의 세포, 적어도 약 600개의 단위 용량, 적어도 약 또는 적어도 약 1,000개 단위 용량의 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 방법에 의해 생산된 T 세포는 하나 이상의 단위 용량으로서 투여를 위해 제형화되고, 상기 세포는 약 100개 내지 약 1000개의 단위 용량, 약 100개 내지 약 500개의 단위 용량, 약 100개 내지 약 200개의 단위 용량, 약 250개 내지 약 500개의 단위 용량, 또는 약 500개 내지 1000개의 단위 용량을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는 적어도 2명의 대상체, 적어도 5명의 대상체, 적어도 10명의 대상체, 적어도 25명의 대상체, 적어도 50명의 대상체, 적어도 100명의 대상체, 적어도 200명의 대상체, 적어도 500명의 대상체, 또는 적어도 1,000명의 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 방법에 의해 생산된 T 세포는 약 2명 내지 1000명의 대상체, 약 5명 내지 500명의 대상체, 약 10명 내지 약 200명의 대상체, 약 20명 내지 약 150명의 대상체, 또는 약 25명 내지 약 50명의 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 1천만개 내지 7천5백만개의 세포/mL를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 (약) 5.0×106 내지 1×109, 5.0×106 내지 5.0×108, 5.0×106 내지 2.5×108, 5.0×106 내지 1.0×108, 5.0×106 내지 7.5×107, 1×107 내지 1×109, 1×107 내지 5.0×108, 1×107 내지 2.5×108, 1×107 내지 1.0×108, 1.0×107 내지 7.5×107, 1.0×107 내지 5.0×107, 1.0×107 내지 2.5×107, 1.5×107 내지 2.25×107, 2.5×107 내지 1.0×109, 또는 2.5×107 내지 7.5×108개의 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 (약) 5.0×106 내지 1×109, 1.0×107 내지 1.0×109, 2.5×107 내지 1×109, 5.0×107 내지 1.0×109, 7.5×107 내지 1.0×109, 1.0×108 내지 1.0×109, 5.0×107 내지 7.5×108, 5×107 내지 5.0×108, 5×107 내지 2.5×108, 5.0×107 내지 1.0×108, 또는 5.0×107 내지 7.5×107개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 5.0×106개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 1.0×107개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 5.0×107개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 1.0×108개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 5.0×108개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 1.0×109개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다.
본원에서 제공되는 임의의 조성물을 함유하는 용기가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 용기는 백(bag)이다. 일부 구현예에서, 상기 용기는 냉동 백이다. 일부 구현예에서, 상기 용기는 (약) 15 mL 내지 150 mL, 20 mL 내지 100 mL, 20 mL 내지 80 mL, 20 mL 내지 60 mL, 20 mL 내지 40 mL, 40 mL 내지 100 mL, 40 mL 내지 80 mL, 40 mL 내지 60 mL, 60 mL 내지 100 mL, 60 mL 내지 80 mL 또는 80 mL 내지 100 mL(각각의 경계 포함); 또는 적어도 또는 적어도 약 15 mL, 적어도 또는 적어도 약 20 mL, 적어도 또는 적어도 약 30 mL, 적어도 또는 적어도 약 40 mL, 적어도 또는 적어도 약 50 mL, 적어도 또는 적어도 약 60 mL, 적어도 또는 적어도 약 70 mL, 적어도 또는 적어도 약 80 mL 또는 적어도 또는 적어도 약 90 mL; 및/또는 100 mL 이하의 부피의 조성물로 충전된다. 일부 구현예에서, 상기 용기는 (약) 1 mL 내지 10 mL, 또는 약 2 ml 내지 5 ml의 부피의 조성물로 충전된다. 일부 구현예에서, 상기 용기는 (약) 0.1 cm-1 내지 100 cm-1; 1 cm-1 내지 50 cm-1, 1 cm-1 내지 20 cm-1, 1 cm-1 내지 10 cm-1, 1 cm-1 내지 7 cm-1, 1 cm-1 내지 6 cm-1, 1 cm-1 내지 3 cm-1, 1 cm-1 내지 2 cm-1, 2 cm-1 내지 20 cm-1, 2 cm-1 내지 10 cm-1, 2 cm-1 내지 7 cm-1, 2 cm-1 내지 6 cm-1, 2 cm-1 내지 3 cm-1, 3 cm-1 내지 20 cm-1, 3 cm-1 내지 10 cm-1, 3 cm-1 내지 7 cm-1, 3 cm-1 내지 6 cm-1, 6 cm-1 내지 20 cm-1, 6 cm-1 내지 10 cm-1, 6 cm-1 내지 7 cm-1, 7 cm-1 내지 20 cm-1, 7 cm-1 내지 10 cm-1, 또는 7 cm-1 내지 20 cm-1(각각의 경계 포함); 또는 약, 또는 적어도 3 cm-1, 4 cm-1, 5 cm-1, 6 cm-1, 7 cm-1, 10 cm-1, 15 cm-1, 또는 20 cm-1;인 표면적 대 부피 비의 조성물로 충전된다.
본원에서는 본원에 제공된 임의의 조성물을 질환 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 투여하는 것이거나 또는 그를 포함하는 치료 방법이 제공되며, 여기서 상기 조성물의 T 세포는 대상체로부터 유래되지 않는 것이다.
또한, 본원에서는 본원에 제공된 임의의 조성물을 질환 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 투여하는 것이거나 또는 그를 포함하는 치료 방법이 제공되며, 여기서 상기 조성물의 T 세포의 적어도 일부는 대상체로부터 유래되지 않는 것이다.
일부 구현예에서, 상기 조성물의 T 세포의 100% 미만은 대상체의 T 세포와 HLA-동일하다. 일부 구현예에서, 상기 질환 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 종양 또는 암이다. 일부 구현예에서, 상기 질환 또는 병태는 암이다.
또한 본원에서는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 본원에 제공된 임의의 조성물의 용도가 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 질환 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 종양 또는 암이다. 일부 구현예에서, 상기 질환 또는 병태는 암 또는 종양이다.
도 1은, 1차 인간 T 세포에 대한 예시적인 제조 공정에서 자극 시작 후 약 240 시간 이상, 또는 세포의 형질도입이 없는 유사한 공정에 대한, 총 세포수(도 1a), 폴드 증폭(fold expansion)(도 1b), % 생존력(percent viability)(도 1c) 및 7명의 상이한 공여자(공여자 A-G)로부터 얻어진 CD8+ T 세포 중에서 % Ki67+ 세포(세포 주기 엔트리와 관련된 마커; 도 1d)를 도시한다.
도 2a는 1차 인간 T 세포에 대한 예시적인 공정에서 자극 시작 후 약 216 시간에 걸쳐 다양한 시점에 CD57 및 Ki67 발현에 대한 유세포 분석을 보여준다. 도 2b는 3명의 상이한 공여자(공여자 A-C)에서 자극 및 배양 동안 세포 집단에서 CD57+ 세포의 백분율을 보여준다. 도 2c는 자극 및 배양 동안 세포 집단에서 CD57+ 세포 또는 CD57- 세포 중 Ki67+ 세포의 백분율을 보여준다. 도 2d는 3명의 다른 공여자(공여자 A-C)에서 자극 및 배양 동안 CD4+ 세포 집단에서 CD57+ 세포의 백분율을 보여준다. 도 2e는 자극 후 시간에 따른 공여자 세포 조성물로부터의 세포에 대한 CD57 및 Ki67 발현을 보여준다. 한 공여자 세포 조성물의 세포는 수확 기준(수확까지 8일)에 도달하는데 8일이 필요한데 반해, 또 다른 공여자 세포 조성물은 수확 기준(수확까지 7일)에 도달하는데 7일만이 필요하였다. 도 2f는 도 2e에 나타낸 공여자 세포 조성물로부터의 세포에 대한 CD45RA 및 CD27 발현을 보여준다.
도 3a는 1차 인간 T 세포에 대한 예시적인 제조 공정에서 자극 및 배양 동안 세포 집단에서 CD57+ 세포 및 CD57- 세포 사이의 CD69 및 CD25 발현(활성화와 관련된 마커)에 대한 유세포 분석을 보여준다. 도 3b는 T 세포 분화 표현형(예를 들어 나이브-유사 T 세포, 이펙터 T(TEFF) 세포, 기억 T 세포, 중앙 기억 T(TCM), 이펙터 기억 T(TEM) 세포, 이펙터 기억 RA T(TEMRA) 세포) 및 CD57 또는 Ki67과 관련된 다양한 표면 마커의 발현에 대한 계층적 클러스터링 분석을 보여준다. 각각의 로우(row)는 개별 공여자의 세포 집단을 나타내고, 칼럼(column)은 T 세포 분화 표현형과 관련된 마커 또는 마커 조합물을 나타낸다.
도 4a는, (1) 100% CD57+ 세포; (2) 75% CD57+ 세포; (3) 25% CD57+ 세포; 및 (4) 0% CD57+ 세포의 빈도의 빈도로 CD57+ 및 CD57- 세포의 혼합물을 함유하는 적정 세포 조성물에 대한 예시적인 제조 공정에서 자극 시작 후 대략 240 시간 동안 총 세포의 수(좌측 매널) 및 생존 세포의 백분율(우측 패널)을 보여준다. 예시적인 수확 기준은 좌측 패널에서 점선으로 표시된다. 도 4b는 자극 시작 후 48 시간에 세포 배양 웰의 이미지를 보여주며, 자극 시약의 존재하에 적정된 세포 조성물의 자극 및 배양에서 세포 클러스터링을 보여준다. 도 4c는 적정 된 세포 조성물의 자극 및 배양에서 자극 시작 후 12 시간 및 48 시간에 배양 배지에 존재하는 IL-2(㎍/mL)의 양을 보여준다.
도 5a 및 5b는 CD57+ T 세포(도 5a), CD27+ CD28+ T 세포(도 5b)의 백분율을 보여준다. 도 5c는 CD57+ 세포가 고갈되지 않았거나(고갈되지 않음) CD57+ 세포가 고갈된(고갈됨) 상이한 4명의 공여자 세포 조성물에 대한 CD27의 발현을 보여준다. 도 5d는 고갈된 및 고갈되지 않은 CD3+ 공여자 세포 조성물에서의 Ki67 발현을 보여준다. 도 5e는 CD57+ 세포가 고갈되었거나(고갈됨) CD57+ 세포가 고갈되지 않은(고갈되지 않음) 공여자로부터 얻은 1 차 CD8+ 세포에 대한 수확(자극 시작부터 수확 기준에 도달한 시간)까지의 배양 기간을 보여준다. 도 5g는 CD57+ 세포가 고갈되었거나(고갈됨) 또는 CD57+ 세포가 고갈되지 않은(고갈되지 않은) 공여자 세포 조성물에서의 형질도입 후 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포의 백분율을 보여준다.
도 6a는 예시적인 제조 공정을 사용하여 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 세포를 조작하기 위해 비-호지킨 림프종(NHL) 환자로부터 수득된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 CD57+ T 세포의 백분율을 나타내는 위스커 플롯(whisker plot)을 보여준다. 박스는 사분위수 범위를 나타내고 수염은 데이터 세트의 전체 범위를 나타낸다. 도 6b는 NHL 환자로부터 얻은 다양한 세포 집단에서 CD57+CD8+ 세포의 백분율 및 Ki67+ 세포의 백분율 간의 관계를 보여준다. 도 6c는 T 세포 분화 표현형(예를 들어 나이브-유사 T 세포, 이펙터 T(TEFF) 세포, 기억 T 세포, 중앙 기억 T(TCM), 터미널 이펙터 세포)과 관련된 다양한 표면 마커의 발현 및 NHL 환자로부터 얻은 세포 집단에서의 CD57의 발현에 대한 계층적 클러스터링 분석을 보여준다. 각각의 로우(row)는 개별 환자를 나타내고, 칼럼(column)은 T 세포 분화 표현형과 관련된 마커 또는 마커 조합물을 나타낸다. 도 6d는 CD27 및 CD45RA 발현 상태에 의해 그룹핑된 세포 제형화의 서브세트에서 Ki67을 발현하는 생존 CD57+ 세포의 백분율을 보여준다. 도 6e는 CD27 및 CD45RA 발현(좌측 패널)에 의해 분류된 세포 집단의 서브 세트에서 생존, CD8+CD57+ 세포의 백분율 및 CD27 및 CD45RA 발현(우측 패널)에 의해 분류된 세포 집단의 서브세트에서 생존, CD4+CD57+ 세포의 백분율을 보여준다.
도 7은 치료적 T 세포 산출 조성물(예를 들어 의약 생성물)에서 중앙 기억/나이브 유사 CD4+ T 세포의 백분율과 수확 척도(Spearman ρ: -0.54; p-값: <0.001)를 달성하기 위한 배가 집단 수 사이의 관계를 나타낸다. 치료적 T 세포 산출 조성물(예를 들어 의약 생성물)에서 CD8+ T 세포에 대해 유사한 결과가 관찰되었다.
도 8a는 생산 과정의 증폭 단계 중 높은(0.35×106개의 세포/mL) 및 낮은(0.05×106개의 세포/mL) 시드 밀도에 대해 수확 척도를 달성하기 위한 배가 집단 수를 나타낸다. 도 8b는 생산 과정의 증폭 단계 중 시드 밀도의 함수로서 치료적 산출 조성물에서 CD27+CAR+CD8+ T 세포의 백분율을 나타낸다. 도 8c는 T 세포 산출 조성물에서 중앙 기억T 세포의 양에 대한 처리 기간의 영향을 나타낸다.
도 9a-9d는 특정 임계값 수준 이상 또는 이하인 CD4+ CAR+ T 세포 중(무진행 생존에 대해 도 9a, 반응 기간에 대해 도 9c) 및 CD8+ CAR+ T 세포 중(무진행 생존에 대해 도 9b, 반응 기간에 대해 도 9d) CCR7+CD27+ CAR+ T 세포 비율을 함유한 조성물을 투여받은 군으로 나뉜, CAR+ T 세포 조성물을 투여받은 대상체에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선을 나타낸다.
도 10은 CD8+/CAR+ T 세포에서 "높은(high)" 또는 "낮은(low)" 집단 배가 수(population doubling, PDL)를 갖는 환자에 대한 최적 분할 로그 순위 테스트에 기초한 PFS 곡선을 나타낸다. 낮은 PDL은 <6 PDL을 지칭하고, >6 PDL은 높은 PDL을 지칭한다.
도 11은 NHL 환자에서 유래된 CD4+ 농축(좌측 패널) 및 CD8+ 농축(우측 패널) 투입 조성물에서 CD27+CD28+ T 세포의 백분율을 나타낸다.
도 12는 CD4+ 농축 투입 조성물에서 이펙터 기억 T 세포의 백분율과 수확 척도(Spearman ρ: 0.43; p-값: <0.001)를 달성하는데 필요한 배가 집단 수 사이의 관계를 나타낸다. CD8+ 농축 투입 조성물에 대해 유사한 결과가 관찰되었다.
도 13a 내지 13d는 다양한 비-증폭 및 증폭된 조작 공정을 포함하여 제조 실행 동안 및 이후의 총 생존 세포(도 13a), 생존력(도 13b) 및 표현형(도 13c 및 13d)을 보여준다.
도 14는 다양한 비-증폭 및 증폭된 조작 공정을 포함하여 제조 수행 동안 및 제조 후 CD4+ 및 CD8+ 세포 집단에서 CD57+ 세포의 백분율을 보여준다.
도 15는 공여자 1 및 공여자 2로부터의 CD57+ 적정된 조성물에서 활성화(상부 패널) 및 형질도입 후(하부 패널)에서 CD4+ 및 CD8+ 세포 구획에서 카스파제 3-음성, CD27-양성(Cas3-CD27+) 세포의 빈도를 나타낸다. 좌측 칼럼: CD4+ 세포; 우측 칼럼: CD8+ 세포. NT: CD57 적정 없음.
도 16 및 도 17은 각각 활성화(상부 패널) 및 형질도입 후(하부 패널)에서 공여자 1 및 공여자 2 CD57+ 적정된 조성물로부터의 CD4+(도 16a 및 17a) 및 CD8+(도 16b 및 17b) 세포의 CCR7/CD45RA 표현형의 빈도를 도시한다. Aph: 성분채집술 샘플; %: % CD57+ 적정된 세포; NT: No CD57 적정.
도 18 및 도 19는 각각 활성화(상부 패널) 및 형질도입 후(하부 패널)에서 공여자 1 및 공여자 2 CD57+ 적정된 조성물로부터의 CD4+(도 18a 및 19a) 및 CD8+(도 18b 및 19b) 세포의 CD27/CD28 표현형의 빈도를 도시한다. Aph: 성분채집술 샘플; %: % CD57+ 적정된 세포; NT: No CD57 적정.
도 20 및 도 21은 각각 활성화(상부 패널) 및 형질도입 후(하부 패널)에서 공여자 1 및 공여자 2 CD57+ 적정된 조성물로부터의 CD4+(도 20a 및 21a) 및 CD8+(도 20b 및 21b) 세포의 CD27/CD57 표현형의 빈도를 도시한다. Aph: 성분채집술 샘플; %: % CD57+ 적정된 세포; NT: No CD57 적정.
도 22는 공여자 1 및 공여자 2로부터의 CD57+ 적정된 투입 조성물로부터 유래된 형질도입된 세포 조성물에서의 CD4+:CD8+ 비율을 나타낸다. NT: No CD57 적정.
도 23은 공여자 1 및 공여자 2로부터의 CD27+ 적정된 조성물에서의 활성화(상부 패널) 및 형질도입 후(하부 패널)의 CD4+ 및 CD8+ 세포 구획에서의 카스파제 3-음성, CD57-양성(Cas3-CD57+) 세포의 빈도를 나타낸다. 좌측 칼럼: CD4+ 세포; 우측 칼럼: CD8+ 세포. NT: No CD27 적정.
도 24 및 도 25는 각각 활성화(상부 패널) 및 형질도입 후(하부 패널)에서 공여자 1 및 공여자 2 CD27+ 적정된 조성물로부터의 CD4+(도 24a 및 25a) 및 CD8+(도 24b 및 25b) 세포의 CCR7/CD45RA 표현형의 빈도를 도시한다. Aph: 성분채집술 샘플; %: % CD27+ 적정된 세포; NT: No CD27 적정.
도 26 및 도 27은 각각 활성화(상부 패널) 및 형질도입 후(하부 패널)에서 공여자 1 및 공여자 2 CD27+ 적정된 조성물로부터의 CD4+(도 26a 및 27a) 및 CD8+(도 26b 및 27b) 세포의 CD27/CD28 표현형의 빈도를 도시한다. Aph: 성분채집술 샘플; %: % CD27+ 적정된 세포; NT: No CD27 적정.
도 28 및 도 29는 각각 활성화(상부 패널) 및 형질도입 후(하부 패널)에서 공여자 1 및 공여자 2 CD27+ 적정된 조성물로부터의 CD4+(도 28a 및 29a) 및 CD8+(도 28b 및 29b) 세포의 CD27/CD28 표현형의 빈도를 도시한다. Aph: 성분채집술 샘플; %: % CD27+ 적정된 세포; NT: No CD27 적정.
도 30은 공여자 1 및 공여자 2로부터의 CD27+ 적정된 투입 조성물로부터 유래된 형질도입된 세포 조성물에서 CD4+:CD8+ 비율을 나타낸다. NT: No CD27 적정.
도 31a 및 31b는 CD27+ 세포(CD27)에 대해 농축되거나 CD57+ 세포(CD57)의 고갈된, CD27 또는 CD57 선택(NS) 없이, 선택(B) 전 조성물에서 활성화(상부 패널) 및 형질도입 후(하부 패널)에서 CD4+ 및 CD8+ 세포 구획에서 각각 CD27-양성(CD27+) 또는 CD57-양성(CD57+) 세포의 빈도를 보여준다. 좌측 칼럼: CD4+ 세포; 우측 칼럼: CD8+ 세포.
도 32a 및 32b는 활성화(상부 패널) 및 형질도입 후(하부 패널)에서 CD4+(도 32a) 및 CD8+(도 32b)의 CCR7/CD45RA 표현형의 빈도를 나타낸다. B: 선택 전; NS: CD27 또는 CD57 선택 없음; CD27: CD27+ 세포에 대해 농축됨; CD57: CD57+ 세포의 고갈.
도 33a는 CD57 고갈된 세포 집단에서 CD57 및 CD3 발현(상부 패널), 및 순도, 고갈, 및 수율(하부 패널)을 나타낸다.
도 33b는 CD27 농축된 세포 집단에서 CD27 및 CD3 발현(상부 패널), 및 순도, 고갈, 및 수율(하부 패널)을 나타낸다.
도 33c는 CD27 또는 CD27 및 CD3에 대해 농축된 세포 집단에서 CD27 및 CD3 발현(상부 패널), 및 CD27 및 CD3에 대해 농축된 세포 집단에서 순도, 고갈, 및 수율(하부 패널)을 나타낸다.
도 34는 CD3 고갈된 세포 집단에서 TCR 및 CD3 발현(상부 패널), 및 순도, 고갈, 및 수율(하부 패널)을 나타낸다.
도 2a는 1차 인간 T 세포에 대한 예시적인 공정에서 자극 시작 후 약 216 시간에 걸쳐 다양한 시점에 CD57 및 Ki67 발현에 대한 유세포 분석을 보여준다. 도 2b는 3명의 상이한 공여자(공여자 A-C)에서 자극 및 배양 동안 세포 집단에서 CD57+ 세포의 백분율을 보여준다. 도 2c는 자극 및 배양 동안 세포 집단에서 CD57+ 세포 또는 CD57- 세포 중 Ki67+ 세포의 백분율을 보여준다. 도 2d는 3명의 다른 공여자(공여자 A-C)에서 자극 및 배양 동안 CD4+ 세포 집단에서 CD57+ 세포의 백분율을 보여준다. 도 2e는 자극 후 시간에 따른 공여자 세포 조성물로부터의 세포에 대한 CD57 및 Ki67 발현을 보여준다. 한 공여자 세포 조성물의 세포는 수확 기준(수확까지 8일)에 도달하는데 8일이 필요한데 반해, 또 다른 공여자 세포 조성물은 수확 기준(수확까지 7일)에 도달하는데 7일만이 필요하였다. 도 2f는 도 2e에 나타낸 공여자 세포 조성물로부터의 세포에 대한 CD45RA 및 CD27 발현을 보여준다.
도 3a는 1차 인간 T 세포에 대한 예시적인 제조 공정에서 자극 및 배양 동안 세포 집단에서 CD57+ 세포 및 CD57- 세포 사이의 CD69 및 CD25 발현(활성화와 관련된 마커)에 대한 유세포 분석을 보여준다. 도 3b는 T 세포 분화 표현형(예를 들어 나이브-유사 T 세포, 이펙터 T(TEFF) 세포, 기억 T 세포, 중앙 기억 T(TCM), 이펙터 기억 T(TEM) 세포, 이펙터 기억 RA T(TEMRA) 세포) 및 CD57 또는 Ki67과 관련된 다양한 표면 마커의 발현에 대한 계층적 클러스터링 분석을 보여준다. 각각의 로우(row)는 개별 공여자의 세포 집단을 나타내고, 칼럼(column)은 T 세포 분화 표현형과 관련된 마커 또는 마커 조합물을 나타낸다.
도 4a는, (1) 100% CD57+ 세포; (2) 75% CD57+ 세포; (3) 25% CD57+ 세포; 및 (4) 0% CD57+ 세포의 빈도의 빈도로 CD57+ 및 CD57- 세포의 혼합물을 함유하는 적정 세포 조성물에 대한 예시적인 제조 공정에서 자극 시작 후 대략 240 시간 동안 총 세포의 수(좌측 매널) 및 생존 세포의 백분율(우측 패널)을 보여준다. 예시적인 수확 기준은 좌측 패널에서 점선으로 표시된다. 도 4b는 자극 시작 후 48 시간에 세포 배양 웰의 이미지를 보여주며, 자극 시약의 존재하에 적정된 세포 조성물의 자극 및 배양에서 세포 클러스터링을 보여준다. 도 4c는 적정 된 세포 조성물의 자극 및 배양에서 자극 시작 후 12 시간 및 48 시간에 배양 배지에 존재하는 IL-2(㎍/mL)의 양을 보여준다.
도 5a 및 5b는 CD57+ T 세포(도 5a), CD27+ CD28+ T 세포(도 5b)의 백분율을 보여준다. 도 5c는 CD57+ 세포가 고갈되지 않았거나(고갈되지 않음) CD57+ 세포가 고갈된(고갈됨) 상이한 4명의 공여자 세포 조성물에 대한 CD27의 발현을 보여준다. 도 5d는 고갈된 및 고갈되지 않은 CD3+ 공여자 세포 조성물에서의 Ki67 발현을 보여준다. 도 5e는 CD57+ 세포가 고갈되었거나(고갈됨) CD57+ 세포가 고갈되지 않은(고갈되지 않음) 공여자로부터 얻은 1 차 CD8+ 세포에 대한 수확(자극 시작부터 수확 기준에 도달한 시간)까지의 배양 기간을 보여준다. 도 5g는 CD57+ 세포가 고갈되었거나(고갈됨) 또는 CD57+ 세포가 고갈되지 않은(고갈되지 않은) 공여자 세포 조성물에서의 형질도입 후 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포의 백분율을 보여준다.
도 6a는 예시적인 제조 공정을 사용하여 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 세포를 조작하기 위해 비-호지킨 림프종(NHL) 환자로부터 수득된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 CD57+ T 세포의 백분율을 나타내는 위스커 플롯(whisker plot)을 보여준다. 박스는 사분위수 범위를 나타내고 수염은 데이터 세트의 전체 범위를 나타낸다. 도 6b는 NHL 환자로부터 얻은 다양한 세포 집단에서 CD57+CD8+ 세포의 백분율 및 Ki67+ 세포의 백분율 간의 관계를 보여준다. 도 6c는 T 세포 분화 표현형(예를 들어 나이브-유사 T 세포, 이펙터 T(TEFF) 세포, 기억 T 세포, 중앙 기억 T(TCM), 터미널 이펙터 세포)과 관련된 다양한 표면 마커의 발현 및 NHL 환자로부터 얻은 세포 집단에서의 CD57의 발현에 대한 계층적 클러스터링 분석을 보여준다. 각각의 로우(row)는 개별 환자를 나타내고, 칼럼(column)은 T 세포 분화 표현형과 관련된 마커 또는 마커 조합물을 나타낸다. 도 6d는 CD27 및 CD45RA 발현 상태에 의해 그룹핑된 세포 제형화의 서브세트에서 Ki67을 발현하는 생존 CD57+ 세포의 백분율을 보여준다. 도 6e는 CD27 및 CD45RA 발현(좌측 패널)에 의해 분류된 세포 집단의 서브 세트에서 생존, CD8+CD57+ 세포의 백분율 및 CD27 및 CD45RA 발현(우측 패널)에 의해 분류된 세포 집단의 서브세트에서 생존, CD4+CD57+ 세포의 백분율을 보여준다.
도 7은 치료적 T 세포 산출 조성물(예를 들어 의약 생성물)에서 중앙 기억/나이브 유사 CD4+ T 세포의 백분율과 수확 척도(Spearman ρ: -0.54; p-값: <0.001)를 달성하기 위한 배가 집단 수 사이의 관계를 나타낸다. 치료적 T 세포 산출 조성물(예를 들어 의약 생성물)에서 CD8+ T 세포에 대해 유사한 결과가 관찰되었다.
도 8a는 생산 과정의 증폭 단계 중 높은(0.35×106개의 세포/mL) 및 낮은(0.05×106개의 세포/mL) 시드 밀도에 대해 수확 척도를 달성하기 위한 배가 집단 수를 나타낸다. 도 8b는 생산 과정의 증폭 단계 중 시드 밀도의 함수로서 치료적 산출 조성물에서 CD27+CAR+CD8+ T 세포의 백분율을 나타낸다. 도 8c는 T 세포 산출 조성물에서 중앙 기억T 세포의 양에 대한 처리 기간의 영향을 나타낸다.
도 9a-9d는 특정 임계값 수준 이상 또는 이하인 CD4+ CAR+ T 세포 중(무진행 생존에 대해 도 9a, 반응 기간에 대해 도 9c) 및 CD8+ CAR+ T 세포 중(무진행 생존에 대해 도 9b, 반응 기간에 대해 도 9d) CCR7+CD27+ CAR+ T 세포 비율을 함유한 조성물을 투여받은 군으로 나뉜, CAR+ T 세포 조성물을 투여받은 대상체에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선을 나타낸다.
도 10은 CD8+/CAR+ T 세포에서 "높은(high)" 또는 "낮은(low)" 집단 배가 수(population doubling, PDL)를 갖는 환자에 대한 최적 분할 로그 순위 테스트에 기초한 PFS 곡선을 나타낸다. 낮은 PDL은 <6 PDL을 지칭하고, >6 PDL은 높은 PDL을 지칭한다.
도 11은 NHL 환자에서 유래된 CD4+ 농축(좌측 패널) 및 CD8+ 농축(우측 패널) 투입 조성물에서 CD27+CD28+ T 세포의 백분율을 나타낸다.
도 12는 CD4+ 농축 투입 조성물에서 이펙터 기억 T 세포의 백분율과 수확 척도(Spearman ρ: 0.43; p-값: <0.001)를 달성하는데 필요한 배가 집단 수 사이의 관계를 나타낸다. CD8+ 농축 투입 조성물에 대해 유사한 결과가 관찰되었다.
도 13a 내지 13d는 다양한 비-증폭 및 증폭된 조작 공정을 포함하여 제조 실행 동안 및 이후의 총 생존 세포(도 13a), 생존력(도 13b) 및 표현형(도 13c 및 13d)을 보여준다.
도 14는 다양한 비-증폭 및 증폭된 조작 공정을 포함하여 제조 수행 동안 및 제조 후 CD4+ 및 CD8+ 세포 집단에서 CD57+ 세포의 백분율을 보여준다.
도 15는 공여자 1 및 공여자 2로부터의 CD57+ 적정된 조성물에서 활성화(상부 패널) 및 형질도입 후(하부 패널)에서 CD4+ 및 CD8+ 세포 구획에서 카스파제 3-음성, CD27-양성(Cas3-CD27+) 세포의 빈도를 나타낸다. 좌측 칼럼: CD4+ 세포; 우측 칼럼: CD8+ 세포. NT: CD57 적정 없음.
도 16 및 도 17은 각각 활성화(상부 패널) 및 형질도입 후(하부 패널)에서 공여자 1 및 공여자 2 CD57+ 적정된 조성물로부터의 CD4+(도 16a 및 17a) 및 CD8+(도 16b 및 17b) 세포의 CCR7/CD45RA 표현형의 빈도를 도시한다. Aph: 성분채집술 샘플; %: % CD57+ 적정된 세포; NT: No CD57 적정.
도 18 및 도 19는 각각 활성화(상부 패널) 및 형질도입 후(하부 패널)에서 공여자 1 및 공여자 2 CD57+ 적정된 조성물로부터의 CD4+(도 18a 및 19a) 및 CD8+(도 18b 및 19b) 세포의 CD27/CD28 표현형의 빈도를 도시한다. Aph: 성분채집술 샘플; %: % CD57+ 적정된 세포; NT: No CD57 적정.
도 20 및 도 21은 각각 활성화(상부 패널) 및 형질도입 후(하부 패널)에서 공여자 1 및 공여자 2 CD57+ 적정된 조성물로부터의 CD4+(도 20a 및 21a) 및 CD8+(도 20b 및 21b) 세포의 CD27/CD57 표현형의 빈도를 도시한다. Aph: 성분채집술 샘플; %: % CD57+ 적정된 세포; NT: No CD57 적정.
도 22는 공여자 1 및 공여자 2로부터의 CD57+ 적정된 투입 조성물로부터 유래된 형질도입된 세포 조성물에서의 CD4+:CD8+ 비율을 나타낸다. NT: No CD57 적정.
도 23은 공여자 1 및 공여자 2로부터의 CD27+ 적정된 조성물에서의 활성화(상부 패널) 및 형질도입 후(하부 패널)의 CD4+ 및 CD8+ 세포 구획에서의 카스파제 3-음성, CD57-양성(Cas3-CD57+) 세포의 빈도를 나타낸다. 좌측 칼럼: CD4+ 세포; 우측 칼럼: CD8+ 세포. NT: No CD27 적정.
도 24 및 도 25는 각각 활성화(상부 패널) 및 형질도입 후(하부 패널)에서 공여자 1 및 공여자 2 CD27+ 적정된 조성물로부터의 CD4+(도 24a 및 25a) 및 CD8+(도 24b 및 25b) 세포의 CCR7/CD45RA 표현형의 빈도를 도시한다. Aph: 성분채집술 샘플; %: % CD27+ 적정된 세포; NT: No CD27 적정.
도 26 및 도 27은 각각 활성화(상부 패널) 및 형질도입 후(하부 패널)에서 공여자 1 및 공여자 2 CD27+ 적정된 조성물로부터의 CD4+(도 26a 및 27a) 및 CD8+(도 26b 및 27b) 세포의 CD27/CD28 표현형의 빈도를 도시한다. Aph: 성분채집술 샘플; %: % CD27+ 적정된 세포; NT: No CD27 적정.
도 28 및 도 29는 각각 활성화(상부 패널) 및 형질도입 후(하부 패널)에서 공여자 1 및 공여자 2 CD27+ 적정된 조성물로부터의 CD4+(도 28a 및 29a) 및 CD8+(도 28b 및 29b) 세포의 CD27/CD28 표현형의 빈도를 도시한다. Aph: 성분채집술 샘플; %: % CD27+ 적정된 세포; NT: No CD27 적정.
도 30은 공여자 1 및 공여자 2로부터의 CD27+ 적정된 투입 조성물로부터 유래된 형질도입된 세포 조성물에서 CD4+:CD8+ 비율을 나타낸다. NT: No CD27 적정.
도 31a 및 31b는 CD27+ 세포(CD27)에 대해 농축되거나 CD57+ 세포(CD57)의 고갈된, CD27 또는 CD57 선택(NS) 없이, 선택(B) 전 조성물에서 활성화(상부 패널) 및 형질도입 후(하부 패널)에서 CD4+ 및 CD8+ 세포 구획에서 각각 CD27-양성(CD27+) 또는 CD57-양성(CD57+) 세포의 빈도를 보여준다. 좌측 칼럼: CD4+ 세포; 우측 칼럼: CD8+ 세포.
도 32a 및 32b는 활성화(상부 패널) 및 형질도입 후(하부 패널)에서 CD4+(도 32a) 및 CD8+(도 32b)의 CCR7/CD45RA 표현형의 빈도를 나타낸다. B: 선택 전; NS: CD27 또는 CD57 선택 없음; CD27: CD27+ 세포에 대해 농축됨; CD57: CD57+ 세포의 고갈.
도 33a는 CD57 고갈된 세포 집단에서 CD57 및 CD3 발현(상부 패널), 및 순도, 고갈, 및 수율(하부 패널)을 나타낸다.
도 33b는 CD27 농축된 세포 집단에서 CD27 및 CD3 발현(상부 패널), 및 순도, 고갈, 및 수율(하부 패널)을 나타낸다.
도 33c는 CD27 또는 CD27 및 CD3에 대해 농축된 세포 집단에서 CD27 및 CD3 발현(상부 패널), 및 CD27 및 CD3에 대해 농축된 세포 집단에서 순도, 고갈, 및 수율(하부 패널)을 나타낸다.
도 34는 CD3 고갈된 세포 집단에서 TCR 및 CD3 발현(상부 패널), 및 순도, 고갈, 및 수율(하부 패널)을 나타낸다.
복수의 상이한 공여자(또는 공여자 풀)로부터의 CD57 음성 (CD57-) T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, 상기 제공된 방법에 의해 생산된 조성물을 포함하는, CD57- 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포를 함유하는 조성물이 제공되되, 상기 T 세포는 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다. 또한, 복수의 상이한 공여자(또는 공여자 풀)로부터 CD27 양성(CD27+) T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에서 제공된다. 또한, 상기 제공된 방법에 의해 생산된 조성물을 포함하는, CD27+ 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포를 함유하는 조성물이 제공되되, 상기 T 세포는 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포는 재조합 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전자 조작된다. 일부 측면에서, 본원에 제공된 상기 방법은 세포를 선택, 분리, 농축, 자극, 활성화, 유전자 조작(예를 들어 재조합 수용체로 세포를 조작하고/하거나 면역 유전자를 녹아웃(knocking out)시킴)하고/하거나 인큐베이션 또는 증폭시켜서 예를 들어 출발 공여자 샘플, 예를 들어 백혈구성분채집술 또는 성분채집술 샘플과 비교하여, 감소된 빈도의 CD57+ T 세포를 갖는 조성물을 생산하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 제공된 상기 방법은 세포를 선택, 분리, 농축, 자극, 활성화, 유전자 조작(예를 들어 재조합 수용체로 세포를 조작하고/하거나 면역 유전자를 녹아웃시킴)하고/하거나 인큐베이션 또는 증폭시켜서 예를 들어 출발 공여자 샘플, 예를 들어 백혈구성분채집술 또는 성분채집술 샘플과 비교하여, 감소된 빈도의 CD27- T 세포를 갖는 조성물을 생산하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제공된 방법은 복수의 개별 공여자로부터 재조합 수용체(예를 들어 CAR)를 발현하도록 조작된 CD57- 세포에서 농축된 T 세포의 조성물을 개별적으로 제조 또는 생산하는 것을 포함할 수 있다. 상기 개별 방법은 CD57- T 세포에서 농축된 T 세포를 선택하고, 상기 T 세포를 자극 또는 활성화시키고, 유전자 조작(예를 들어 재조합 수용체로 세포를 조작하고/하거나 면역 유전자를 녹아웃시킴)하고/하거나, 세포를 인큐베이션 또는 증폭시켜서 각각의 개별 공여자로부터 재조합 수용체(예를 들어 CAR)을 발현하는 CD57- T 세포를 함유하는 조성물을 생산하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 방법은 복수의 개별 공여자로부터 재조합 수용체(예를 들어 CAR)를 발현하도록 조작된 CD27+ 세포에서 농축된 T 세포의 조성물을 개별적으로 제조 또는 생산하는 것을 포함할 수 있다. 상기 개별 방법은 CD27+ T 세포에서 농축된 T 세포를 선택하고, 상기 T 세포를 자극 또는 활성화시키고, 유전자 조작(예를 들어 재조합 수용체로 세포를 조작하고/하거나 면역 유전자를 녹아웃시킴)하고/하거나, 세포를 인큐베이션 또는 증폭시켜서 각각의 개별 공여자로부터 재조합 수용체(예를 들어 CAR)을 발현하는 CD27+ T 세포를 함유하는 조성물을 생산하는 것을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 조작된 조성물은 개별 공여자 유래 샘플, 집단, 또는 세포의 조성물로부터 생성된다. 일부 측면에서, 개별 공여자로부터의 조작된 조성물은 하나 이상의 다른 개별 공여자로부터의 조작된 조성물과 조합되어 복수의 상이한 공여자로부터의 풀링된 조작된 조성물(또는 '복수의 상이한 공여자들로부터의 모여서 풀이 형성된 조작된 조성물')(pooled engineered composition from a plurality of different donors)을 생성한다. 복수의 개별 공여자로부터의 세포의 샘플, 집단, 또는 조성물은 조작 후에 임의의 시간에 조합되어 풀링된 조작된 조성물(또는 '모여서 풀이 형성된 조작된 조성물')을 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 제공된 방법은 조작된 세포 조성물을 생산하는 임의의 하나 이상의 단계와 관련하여 복수의 공여자로부터의 세포를 단일 조성물로 풀링 또는 조합하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 CD57- T 세포에서 농축된 T 세포를 선택하고, 상기 T 세포를 자극 또는 활성화시키고, 유전자 조작(예를 들어 재조합 수용체로 세포를 조작하고/하거나 면역 유전자를 녹아웃시킴)하고/하거나, 세포를 인큐베이션 또는 증폭시켜서 복수의 공여자로부터 재조합 수용체(예를 들어 CAR)를 발현하는 CD57- T 세포를 함유하는 풀링된 조성물을 생산하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법에서, CD57- T 세포에서 농축된 T 세포를 선택하고, 상기 T 세포를 자극 또는 활성화시키고, 유전자 조작(예를 들어 재조합 수용체로 세포를 조작하고/하거나 면역 유전자를 녹아웃시킴)하고/하거나, 세포를 인큐베이션 또는 증폭시키는 임의의 하나 이상 단계 전에 또는 그 단계에서, 상기 세포는 상기 공정에서의 후속 단계를 위해 복수의 공여자로부터 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 CD27+ T 세포에서 농축된 T 세포를 선택하고, 상기 T 세포를 자극 또는 활성화시키고, 유전자 조작(예를 들어 재조합 수용체로 세포를 조작하고/하거나 면역 유전자를 녹아웃시킴)하고/하거나, 세포를 인큐베이션 또는 증폭시켜서 복수의 공여자로부터 재조합 수용체(예를 들어 CAR)를 발현하는 CD27+ T 세포를 함유하는 풀링된 조성물을 생산하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법에서, CD27+ T 세포에서 농축된 T 세포를 선택하고, 상기 T 세포를 자극 또는 활성화시키고, 유전자 조작(예를 들어 재조합 수용체로 세포를 조작하고/하거나 면역 유전자를 녹아웃시킴)하고/하거나, 세포를 인큐베이션 또는 증폭시키는 임의의 하나 이상 단계 전에 또는 그 단계에서, 상기 세포는 상기 공정에서의 후속 단계를 위해 복수의 공여자로부터 조합될 수 있다. 일부 측면에서, 상기 조작된 조성물은 복수의 상이한 개별 공여자로부터의 세포의 샘플, 집단, 또는 조성물로부터 생성되고, 그에 의해서 풀링된 조작된 조성물을 생성한다. 복수의 상이한 개별 공여자로부터의 세포의 샘플, 집단, 또는 조성물은 유전자 조작 전에, 그 동안에, 또는 그 후에 임의의 시간에 조합될 수 있다. 일부 측면에서, 복수의 상이한 개별 공여자로부터의 세포의 샘플, 집단, 또는 조성물은 유전자 조작 전에 또는 그 동안에 조합된다.
특정 구현예는, 예를 들어 복수의 공여자로부터, 조작된 T 세포, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 조작된 T 세포를 생성하기 위한 기존 방법은 T 세포의 집단 또는 조성물이 증식 또는 증폭하는 단계(steps), 스테이지(stages) 또는 페이스(phases)를 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 그러나, 일부 경우에, 집단 또는 조성물의 일부는 어떠한 증식 또는 증폭도 나타내지 않을 수 있거나, 또는 일부 경우에, 천천히 증폭될 수 있고, 따라서 조작 공정을 완료하기 위해 추가의 날들(days)을 필요로 한다. 추가로, 일부 경우에, 특정 공여자로부터의 집단 또는 조성물은 어떠한 증식 또는 증폭도 나타내지 않을 수 있거나, 또는 일부 경우에, 또 다른 공여자로부터 유래된 것보다 더 천천히 증폭될 수 있고, 따라서 조작 공정을 완료하기 위해 추가의 날들을 필요로 한다. 일부 측면에서, 이는 이들이 생산되는 상이한 개별 공여자 대상체 사이에서 실질적인 가변성을 나타내는 조작된 T 세포(예를 들어 CAR T 세포)의 조성물을 생성할 수 있다.
일부 측면에서, 복수의 공여자로부터 유래된 조작된 세포 조성물을 생성 또는 제조하기 위한 기존 방법 또는 공정을 포함한, 조작된 세포 조성물을 생성 또는 제조하기 위한 기존 방법 또는 공정은 제조 공정에서 이종성(heterogeneity)을 초래할 수 있다. 일부 측면에서, 기억 T 세포와 연관된 표현형은 임상 결과에 영향을 미칠 수 있다(예를 들어 문헌 [Fraietta 등, Nat Med. 2018; 24(5):563-571]; 및 [Larson 등, Cancer Res. 2018; 78(13 Suppl):Abstract nr 960] 참조). 일부 경우에, 초기 기억 T 세포 표현형을 나타내는 세포에 대한 농축은 조작된 세포 조성물의 제조를 개선시킬 수 있다(예를 들어 문헌 [Singh 등, Sci Trans Med 2016; 8(320):320ra3] 참조).
상기 제공된 방법 및 조성물은 이들 문제를 다룬다. 상기 제공된 방법 및 조성물은 적어도 부분적으로, 복수의 공여자로부터의 농축된 CD57- T 세포로부터 생성된, CD57- T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물에 관한 것이다. 일부 측면에서, 상기 조작된 T 세포 조성물을 생산하는데 사용된 농축된 CD57- T 세포 조성물은 상이한 T 세포 조성물 중에서 더 일관된 특징을 나타내고, 이는 예를 들어 T 세포를 자극 또는 조작하기 위한 공정 동안 증식 및 증폭을 겪는 더 일관된 능력을 포함한다. 상기 제공된 방법 및 조성물은 또한 적어도 부분적으로, 복수의 공여자로부터의 농축된 CD27+ T 세포로부터 생성된, CD27+ T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물에 관한 것이다. 일부 측면에서, 상기 조작된 T 세포 조성물을 생산하는데 사용된 농축된 CD27+ T 세포 조성물은 상이한 T 세포 조성물 중에서 더 일관된 특징을 나타내고, 이는 예를 들어 T 세포를 자극 또는 조작하기 위한 공정 동안 증식 및 증폭을 겪는 더 일관된 능력을 포함한다. CD57(HNK1 및 LEU7로도 알려짐)은 T 및 NK 림프구의 표면 상에서 발현될 수 있는 베타-1,3-글루쿠로닐트랜스퍼라제이다. 일부 측면에서, CD57 발현, 예를 들어 표면 발현은 T 및 NK 세포의 성숙한, 이펙터-분화된 서브세트와 연관된다. 일부 측면에서, CD57 발현은 특정 측면에서 지속적인 증식 및 세포 생존에 영향을 미칠 수 있는, 공동-자극 수용체 CD28 및 CD27의 발현이 결여된 T 세포 또는 T 세포 집단에 상응한다. 특정 측면에서, CD57 발현은 또한 보다 적은 또는 감소된 증식 능력을 갖는 세포를 확인할 수 있다. 일부 측면에서, CD57+CD28- 세포 집단은 CD57- 세포 집단과 비교하여 단축된 텔로미어 길이(telomere length) 및 감소된 증식 능력을 입증할 수 있다(문헌 [Strioga, Pasukoniene, & Characiejus, Immunol. (2011)]에서 검토됨). 대조적으로, CD27(또한 TNFRSF7로도 알려짐) CD27은 보다 어리고 보다 건강한 공여자에서 보다 강력하게 발현되는 경향이 있고(문헌 [van Lier 등, J. Immunol. (1987) 139(5):1589-96] 참조), CD27+ T 세포의 보다 높은 함량은 치료된 환자에서 면역요법의 보다 우수한 결과와 상관관계가 있다(문헌 [Worel 등, Blood (2019) 134 (Suppl. 1):1935] 참조). CD27은 또한 CD57 마커에 대해 반비례 관계를 갖는다(문헌 [Kared 등, Cancer Immunol. Immunother. (2016) 65(4):441-52] 참조). 따라서, 세포 조성물에서 CD27+ 세포를 농축하는 것은 조성물에서 CD57+ 세포의 감소된 또는 실질적으로 감소된 빈도를 초래할 수 있는 것으로 본원에서 고려된다.
특정 구현예는 출발 세포 물질(예를 들어 공여자 샘플)로부터 또는 본원에 기재된 제조 방법에 기재된 임의의 다른 단계에 의해 생산된 세포로부터 CD57+ T 세포 빈도의 감소가 유전자 조작 공정에서 사용되는 경우에 보다 큰 증식 능력을 갖는 세포를 농축시킬 것으로 고려된다. 일부 측면에서, CD57+ T 세포의 음성 선택은 보다 우수하게 증폭되도록 하는 세포를 예비-농축함으로써 제조 성공 및 약물 제품 일관성을 개선시킨다. 예를 들어 CD57+ 세포의 음성 선택은 CD27+ 세포를 예비-농축할 수 있는 반면, CD27+ 세포의 양성 선택은 CD57- 세포를 예비-농축할 수 있다. 추가로, 일부 구현예에서, 증가된 증식 능력을 나타내는 세포를 갖는 세포의 집단 또는 조성물을 농축하는 것은 이펙터 세포 분화의 정도를 감소시킬 수 있고, 이는 자가 설정에서 대상체에 걸쳐 또는 동종이계 설정에서 배치(batches)에 걸쳐 개선된 표적 제품 프로파일 일관성을 지원해야 한다(CD27+, CCR7+ T 세포).
일부 구현예에서, 상기 방법은 대안적 공정보다 더 빠르고 더 효율적일 수 있는 방식으로, 동종이계 세포 요법을 포함한 세포 요법에 적합한 유전자 조작된 T 세포 조성물을 생성하거나 생산하는 공정과 관련하여 사용된다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 상기 방법은 대안적 공정으로부터 가능할 수 있는 것보다 더 넓은 대상체 집단으로부터 조작된 T 세포의 조성물을 생성하거나 생산하기 위한 높은 성공률을 갖는다. 따라서, 일부 측면에서, 세포 요법을 위한 조작된 T 세포 조성물을 생성하기 위한 상기 제공된 방법의 속도 및 효율은 일부 대안적인 방법에 의해 가능할 수 있는 것보다 더 넓은 대상체 집단에 대한 세포 요법 치료, 예를 들어 자가 요법의 더 용이한 계획 및 조정을 가능하게 한다. 일부 측면에서, 예를 들어 하류 공정에서 세포 집단의 일관성을 개선함으로써 CD57+ 세포(예를 들어 CD57+ T 세포)의 고갈이 유리한 것으로 고려된다. 유사하게, 예를 들어 CD57+ 세포의 빈도를 감소시킴으로써 및/또는 하류 공정에서 세포 집단의 일관성을 개선함으로써 CD27+ 세포(예를 들어 CD27+ T 세포)의 선택이 또한 유리한 것으로 고려된다. 예를 들어 본원에서 CD57+ 세포를 고갈시키는 것은 고갈된 조성물이 세포 증식 속도에서 개선된 일관성을 나타내도록, 더 적거나 또는 감소된 증식 능력을 갖는 세포를 고갈시킬 수 있는 것으로 관찰된다. 또 다른 예로서, CD27+ 세포의 농축은, 농축된 조성물이 세포 증식 속도에서 개선된 일관성을 나타내도록, 더 많거나 또는 증가된 증식 능력을 갖는 세포를 농축시킬 수 있다. 관련하여, 세포 증식 속도에서 일관성을 개선하는 것은 세포 집단이 수확 기준에 도달하기 위해 요구되는 기간에서 일관성을 개선할 수 있다. 본원에서 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 벡터로 세포 집단을 형질도입하기 전에 CD57+ 세포를 고갈시키는 것이 형질도입된 세포의 CAR 발현에서 일관성을 개선할 수 있는 것으로 추가로 관찰된다.
일부 측면에서, 예를 들어 CD57+ T 세포를 제거하거나 또는 소량의 CD57+ T 세포에 대해 스크리닝함으로써 개선된 증식 능력을 갖는 유입 공여자 세포를 사전-선택(pre-selecting)하는 것은 세포 요법을 생성하는 공정에서 사용되는 세포의 수에 비해 개선된 공정 제어를 제공할 수 있다. 특정 구현예에서, CD57의 발현은 지연된 또는 불량한 성장을 나타내는 세포를 표시하는 바이오마커로서 역할을 할 수 있다. 반대로, CD27의 발현은 개선된 또는 증가된 성장을 나타내는 세포를 표시하는 바이오마커로서 역할을 할 수 있다. 따라서, 상기 제공된 구현예 중 일부는 세포를 자극, 유전자 조작, 또는 증폭하기 위한 공정 전에 CD57+ 세포를 선택적으로 제거하기 위해 하나 이상의 선택 시약 또는 공정 단계를 이용하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, CD57+ 세포는 CD27+ 세포를 선택하는 것에 의해 제거 또는 감소될 수 있다. 일부 측면에서, 이러한 시약 및 공정 단계는 CD8+ 및 CD4+ 선택 전략과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, CD57+ 세포의 선택은 CD8+ 또는 CD4+ 선택을 위한 임의의 단계 전에 세포의 샘플, 조성물, 또는 집단으로부터 CD57+ 세포를 제거 또는 고갈시키기 위해 사용된다. CD27+ 세포의 선택은 CD8+ 또는 CD4+ 선택을 위한 임의의 단계 전에 세포의 샘플, 조성물, 또는 집단에서 CD27+ 세포를 농축시키고/시키거나 CD57+ 세포의 빈도를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, CD57+ T 세포의 선택은 CD8+ 또는 CD4+ 선택을 위한 임의의 단계 전에 세포의 샘플, 조성물 또는 집단으로부터 CD57+ T 세포를 제거 또는 고갈시킴으로써, CD57-고갈된 집단을 생산하기 위해 사용된다. 일부 측면에서, 예를 들어 CD8+ 또는 CD4+ 선택을 위한 임의의 단계 전에 음성 선택(양성 선택과 반대임)에 의해 CD57+ 세포를 고갈시키는 것이 유리할 수 있다. 일부 측면에서, 예를 들어 CD8+ 또는 CD4+ 선택을 위한 임의의 단계 전에 음성 선택에 의해 CD57+ 세포를 고갈시키는 것은 CD57-고갈된 집단이 CD57 선택 단계에 사용된 하나 이상의 시약 또는 용액에 의해 오염될 가능성을 감소시킨다. 일부 측면에서, 이러한 시약 및 공정 단계는 CD3+ 선택 전략과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, CD57+ 세포의 선택은 CD3+ 선택을 위한 임의의 단계 전에 세포의 샘플, 조성물 또는 집단으로부터 CD57+ 세포를 제거 또는 고갈시키기 위해 사용된다. CD27+ 세포의 선택은 CD3+ 선택을 위한 임의의 단계 전에 세포의 샘플, 조성물 또는 집단에서 CD27+ 세포를 농축시키고/시키거나 CD57+ 세포의 빈도를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, CD57+ T 세포의 선택은 CD3+ 선택을 위한 임의의 단계 전에 세포의 샘플, 조성물 또는 집단으로부터 CD57+ T 세포를 제거 또는 고갈시킴으로써, CD57-고갈된 집단을 생산하기 위해 사용된다. 일부 측면에서, 예를 들어 CD3+ 선택을 위한 임의의 단계 전에 음성 선택(양성 선택과 반대임)에 의해 CD57+ 세포를 고갈시키는 것이 유리할 수 있다. 일부 측면에서, 예를 들어 CD3+ 선택을 위한 임의의 단계 전에 음성 선택에 의해 CD57+ 세포를 고갈시키는 것은 CD57-고갈된 집단이 CD57 선택 단계에 사용된 하나 이상의 시약 또는 용액에 의해 오염될 가능성을 감소시킨다.
예를 들어 일부 구현예에서, CD3+ 세포의 고갈은 이전에 CD27+ 세포를 고갈시키고/시키거나 CD27+ 세포를 농축시킨 세포 조성물(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단)의 유전자 조작 후에 CD3+ 세포를 제거 또는 고갈시키기 위해 사용된다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단은 T-세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분을 암호화하는 하나 이상의 유전자를 파괴하기 위해, 예를 들어 섹션 E.2에 기재된 바와 같이 유전자 조작에 적용된다. 일부 구현예에서, T 세포 수용체 알파 불변 TRAC 영역은 TCR 복합체 형성 및 CD3 세포-표면 발현을 파괴하도록 녹아웃되어, TRAC에 대해 성공적으로 녹아웃된 세포는 CD3의 세포 표면 발현을 나타내지 않는다. 따라서, TRAC 녹아웃에 적용된 CD57 농축된 및/또는 CD27 농축된 조성물에서 CD3+ 세포의 고갈은 CD3을 여전히 발현하는 편집되지 않은 세포의 제거를 보장하게 된다.
일부 구현예에서, CD57+ T 세포의 선택은 CD8+ 또는 CD4+ 선택을 위한 임의의 단계 후에 세포의 샘플, 조성물, 또는 집단으로부터 CD57+ T 세포를 제거 또는 고갈시키는데 사용된다. 유사하게, 일부 구현예에서, CD27+ T 세포의 선택은 CD8+ 또는 CD4+ 선택을 위한 임의의 단계 후에 샘플, 조성물 또는 세포 집단으로부터 CD57+ T 세포를 농축시키고/시키거나 CD57+ T 세포의 빈도를 감소시키기 위해 사용된다. 일부 측면에서, 상기 시약 및 공정 단계는 CD3+ 선택 전략과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, CD57+ T 세포의 선택은 CD3+ 선택을 위한 임의의 단계 전에 세포의 샘플, 조성물, 또는 집단으로부터 CD57+ T 세포를 제거 또는 고갈시키는데 사용된다. 일부 구현예에서, CD57+ T 세포의 선택은 CD3+ 선택을 위한 임의의 단계 후에 세포의 샘플, 조성물, 또는 집단으로부터 CD57+ T 세포를 제거 또는 고갈시키는데 사용된다. 일부 구현예에서, CD57+ 세포는, 예를 들어 칼럼에서 CD57+ 세포를 결합하는 CD57-지향된 자성 비드를 사용하여 선택되거나 제거되고, 칼럼 플로우-쓰루(결합되지 않은 분획)는 CD57+ 고갈된 세포 소스, 예를 들어 CD57- T 세포에 대해 농축된 세포의 집단을 함유하게 된다. 일부 구현예에서, CD57+ T 세포는 CD57-지향된 자성 비드를 사용하여 선택되거나 제거되고, 칼럼 플로우-쓰루는 CD57+ 고갈된 세포 소스, 예를 들어 CD57- T 세포에 대해 농축된 세포의 집단을 함유하게 된다. 일부 구현예에서, CD27+ T 세포는 예를 들어 칼럼에서 CD27+ T 세포에 결합하는 CD27-지시된 자기 비드 또는 다른 시약으로 선택되거나 농축되고, 이어서 칼럼 플로우-쓰루(비결합 분획)는 CD27+ 농축된 세포 집단의 용리 전에 폐기될 수 있는 CD27- 세포 집단을 함유하게 된다.
일부 구현예에서, CD57+ T 세포의 선택은 CD3+ 선택을 위한 임의의 단계 후에 세포의 샘플, 조성물, 또는 집단으로부터 CD57+ T 세포를 제거 또는 고갈시키는데 사용된다. 유사하게, 일부 구현예에서, CD27+ T 세포의 선택은 CD3+ 선택을 위한 임의의 단계 후에 샘플, 조성물 또는 세포 집단으로부터 CD57+ T 세포를 농축시키고/시키거나 CD57+ T 세포의 빈도를 감소시키기 위해 사용된다. 일부 측면에서, 상기 시약 및 공정 단계는 CD3+ 선택 전략과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, CD57+ T 세포의 선택은 CD3+ 선택을 위한 임의의 단계 전에 세포의 샘플, 조성물, 또는 집단으로부터 CD57+ T 세포를 제거 또는 고갈시키는데 사용된다. 일부 구현예에서, CD57+ T 세포의 선택은 CD3+ 선택을 위한 임의의 단계 후에 세포의 샘플, 조성물, 또는 집단으로부터 CD57+ T 세포를 제거 또는 고갈시키는데 사용된다. 일부 구현예에서, CD57+ 세포는, 예를 들어 칼럼에서 CD57+ 세포를 결합하는 CD57-지향된 자성 비드를 사용하여 선택되거나 제거되고, 칼럼 플로우-쓰루(결합되지 않은 분획)는 CD57+ 고갈된 세포 소스, 예를 들어 CD57- T 세포에 대해 농축된 세포의 집단을 함유하게 된다. 일부 구현예에서, CD57+ T 세포는 CD57-지향된 자성 비드를 사용하여 선택되거나 제거되고, 칼럼 플로우-쓰루는 CD57+ 고갈된 세포 소스, 예를 들어 CD57- T 세포에 대해 농축된 세포의 집단을 함유하게 된다. 일부 구현예에서, CD27+ T 세포는 예를 들어 칼럼에서 CD27+ T 세포에 결합하는 CD27-지시된 자기 비드 또는 다른 시약으로 선택되거나 농축되고, 이어서 칼럼 플로우-쓰루(비결합 분획)는 CD27+ 농축된 세포 집단의 용리 전에 폐기될 수 있는 CD27- 세포 집단을 함유하게 된다.
특정 구현예는, CD57 + T 세포가 덜 증식될 것이기 때문에 일부 기존의 생체외 T-세포 활성화 또는 증폭 프로토콜이 일정 시간 후, 예를 들어 상기 공정의 첫번째 48시간 후에 CD57+ T 세포의 존재를 감소시킬 가능성이 높다는 것을 고려한다. 일부 측면에서, CD57+ 세포(예를 들어 CD57+ T 세포)는 그러한 공정에서 죽거나 강력한 증폭이 가능한 세포의 하위 집합에 의해 빈도가 감소한다. 동일한 공정은 강건한 증폭을 수행할 수 있는 세포의 서브세트, 예를 들어 CD27+ 세포의 빈도를 향상시킬 수 있다. 그러나 이러한 공정에서 CD57+ T 세포의 자연적 감소가 발생할 수 있지만 자연적 감소는 높은 증식 능력(예를 들어 CD57- 세포)을 나타내는 공정에 들어가는 세포의 양을 제어하지 않는다. 따라서, 일부 측면에서, CD57+ 세포(예를 들어 CD57+ T 세포)는 생존 가능하지만 증식성이 적은 세포이기 때문에 공정에 입력되는 총괄 출발 세포수에 기여한다. 따라서 일부 구현예에서, CD57+ T 세포를 제거하거나 또는 샘플, 조성물 또는 집단에서 낮은 CD57+ T 세포 함량을 확인하는 이점은 CD57-T 세포, 예를 들어 증식 능력이 있는 세포가 유입 물질에서 소수 집단을 구성하지 않는다는 것을 보장한다. CD27+ 세포의 농축은 또한 CD27- 및/또는 CD57+ 세포가 유입되는 물질에서 소수의 집단을 구성하지 않는다는 것을 보장할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 낮은 빈도의 CD57+ T 세포 또는 감소된 증식 세포의 비율을 보장하는 것은 공정 시간 연장, 세포 분화 증가 및/또는 조작 공정 동안 수확 기준을 충족하지 못하는 것과 관련된 발생률을 줄일 수 있다.
일부 측면에서, 상기 제공된 방법은 T 세포 조성물을 조작하는 공정, 예를 들어 세포 요법용 재조합 수용체-발현 T 세포를 함유하는 조성물을 생성하는 제조공정 동안, 많은 세포가 항-CD3/항-CD8 항체의 존재하에 세포의 인큐베이션과 같이 자극 후 CD25 및 CD69를 포함하는 T 세포의 자극 또는 활성화와 관련된 마커를 발현하거나 상향 조절한다는 발견에 기반한다. 일부 측면에서, Ki67의 발현에 기초하여 나타낸 바와 같이 세포의 일부만이 세포 주기에 진입하는 것으로 관찰된다. 일부 경우에, Ki67+ 세포는 CD27 및 CD28을 발현하는 세포를 포함하는 반면, Ki67-집단은 CD57+ 세포에 대해 농축되는 것으로 관측되고 CD27-CD28-표현형을 나타내었다. 일부 측면에서, CD57+ 세포는 본원에서 자극 또는 활성화와 관련된 표현형을 나타내는 것으로 관찰되었으며 제조 공정의 초기 단계에서 지속되었다. 일부 측면에서, CD57+ T 세포의 빈도는 자극 후 약 48 시간 후에 감소하였으며, 이는 일반적으로 T 세포 증폭 및 생존력 증가와 일치하였다. 일부 측면에서, 공정 및 생성물 이종성을 결과하는 성장 요소(growth factor) 및/또는 자극 시약을 지속적으로 사용하는 동안 세포의 특정 유형, 예를 들어 CD57+ 세포(예를 들어 CD57+ T 세포)는 자극 또는 배양 도중 저 증폭 또는 무증폭을 나타냈다.
일부 측면에서, CD57+ 세포(예를 들어 CD57+ T 세포)가 선택되고 자극 전에 다양한 비율로 CD57-세포(예를 들어 CD57+ T 세포)와 결합될 때, 자극 전의 세포 조성물(예를 들어 투입 조성물) 중의 CD57+ T 세포의 빈도는 보다 긴 공정 기간과 관련된다. 일부 측면에서, 또한 세포 조성물, 예를 들어 CAR+ T 세포를 함유하는 조성물은, 상기 조성물 중의 T 세포의 95% 이상, 예를 들어 100%가 CD57+ T 세포이었을 때 증폭 또는 증식되지 않는 것으로 관찰되었다. 더 낮은 빈도의 CD57+ T 세포를 함유하는 유입 조성물은 조작된 세포 조성물이 더 일관된 CD4+:CD8+ 비율, 뿐만 아니라 1:1에 더 가까운 CD4+:CD8+ 비율을 나타내는 것으로 또한 본원에서 관찰된다.
일부 측면에서, CD27+ T 세포는 조작된 T 세포, CD57+ 세포, 예를 들어 CD57+ T 세포를 생성하는 제조 공정 동안 세포를 증폭시키는데 기여할 수 있다(예를 들어 일반적으로 증폭되지 않으며 조작된 세포 조성물(예를 들어 투여를 위한 세포 조성물) 중의 세포에 최소로 기여하는 것으로 관측되었다). 따라서 CD57+ T 세포의 존재는 제조 공정에 영향을 줄 수 있으며, 또한 공정의 변동성(예를 들어 배양 및/또는 증폭 동안) 및 기타 세포 조성물 속성에 기여하는 것으로 관찰되었다. 일부 측면에서, 본원에서 제공된 방법의 임의의 단계들 전에, 동안, 또는 그 전에, 예를 들어 본원에서 제공되는 제조 공정의 시작 시점에, 예를 들어 세포의 자극 전에 CD57+ T 세포의 선택적인 고갈은 상기 조작된 세포 조성물의 일관성, 품질 및 효능을 개선시킬 수 있다. 대안적인 접근법으로서, 본원에 제공된 방법의 단계 중 임의의 단계 전에, 그 동안에, 또는 그 전에 CD27+ 세포의 선택적 농축은 조작된 세포 조성물의 일관성, 품질 및 효능을 개선할 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 상기 제공된 방법은, 복수의 공여자로부터 유래된 세포 요법을 포함한, 세포 요법을 생성하는 공정 기간을 감소시킬 수 있으며, 따라서 특정 측면에서, 제조 스케쥴의 일관성을 개선시킬 수 있다. 추가로, 일부 측면에서, 세포 요법을 위한 조작된 세포를 생성하는 상기 제공된 방법의 속도 및 효율성은 일부 대체 방법으로 가능할 수 있는 것보다 더 광범위한 대상체 집단에 대해 자가 요법과 같은 세포 요법 치료의 계획 및 조정을 보다 용이하게 한다. 일부 측면에서, 제공된 조작된 세포 및 이러한 세포를 생산하는 방법은 입양 세포 요법과 연관된 비용을 감소시키면서, 또한 이러한 절차의 일관성 및 이용가능성을 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 제공된 조작된 세포, 조성물 및 방법은 세포가 투여될 수 있는 대상체(예를 들어 환자)의 HLA 유형 또는 하위유형과 무관하게 사용될 수 있고, 이는 일부 측면에서 보다 다양한 수용자에게 "기성품" 전달을 허용할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 조성물 및 방법은 질환 또는 장애를 치료하기 위해 조작된 동종이계 세포를 사용하여 입양 세포 요법을 제공하는데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 동종이계 세포를 사용하는 것은 특정 이점을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 공지된 안전성 및 효능 프로파일을 갖는 세포는 보다 다양한 환자에 대해 제조될 수 있다. 예를 들어 세포는 건강한 공여자로부터 유래될 수 있고, 유전자 조작에 적합한 세포를 제공하기에 너무 아플 수 있는 대상체에게 전달될 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 특정 입양 세포 치료 요법(adoptive cell therapy regimen)에 전형적으로 사용되는 세포 또는 세포 유형에서 결함 또는 질환을 가질 수 있고, 따라서 건강한 공여자로부터의 세포는 질환이 있는 세포를 대체 또는 보충하는데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 동종이계 세포를 조작 또는 투여하는 능력은 세포의 제조를 미리 허용하고, 이는 환자에게 전달되기 전에 필요한 시간을 감소시킬 수 있다. 일부 경우에, 조작된 동종이계 세포는 이식편-대-숙주 질환 또는 숙주-대-이식편 질환을 유발하는 보다 낮은 위험을 나타낼 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 제공된 방법은 세포 요법, 예를 들어 조작된 T 세포의 집단 또는 조성물에 유용한 세포를 생성하는 공정 동안 임의의 시점(예를 들어 개시)에 무-증식성 세포의 적어도 일부를 성공적으로 제거한다. 일부 측면에서, 비-증식성 세포의 적어도 일부는 본원에 제공된 방법 중 임의의 방법의 임의의 단계 전에, 그 동안에, 또는 그 후에 제거될 수 있다. 일부 측면에서, 이것은 개시 또는 그러한 공정 전에 CD57+ 세포(예를 들어 CD57+ T 세포)를 선택함으로써, 또는 무 또는 저 CD57+ T 세포 함량을 갖는 세포 조성물 또는 집단만이 상기 공정에 사용되고, 상기 공정의 성공, 예를 들어 세포 요법에 사용하기 적합한 세포 집단을 성공적으로 생성하는 속도 또는 빈도를 향상시키는 것이 보장되도록 스크리닝함으로써 성취된다. 일부 측면에서, 이는 개시 또는 이러한 공정 전에 CD27+ 세포(예를 들어 CD27+ T 세포)를 농축하는 것을 통해, 또는 높은 CD27+ T 세포 함량을 갖는 세포 조성물 또는 집단만이 이러한 공정에 사용되는 것을 보장하도록 스크리닝하는 것을 통해 달성된다.
일부 구현예에서, CD57+ 세포는 공여자 샘플로부터 고갈된다. 일부 구현예에서, 공여자 샘플은 개별 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자로부터의 세포를 포함하는 풀링된 세포 집단이다. 일부 측면에서, CD57+ 세포의 고갈은 유전자 조작을 포함한 이러한 공정의 또 다른 단계 전에 CD57+ 세포(예를 들어 CD57+ T 세포)를 선별하는 것을 통해 달성된다. 일부 구현예에서, CD57+ 세포(예를 들어 CD57+ T 세포)를 선별하는 것은 T 세포를 자극하기 전에 수행된다. 일부 구현예에서, CD57+ 세포(예를 들어 CD57+ T 세포)를 선별하는 것은 세포를 자극한 후에 수행된다. 일부 구현예에서, CD57+ 세포(예를 들어 CD57+ T 세포)를 선별하는 것은 세포를 유전자 조작(예를 들어 녹아웃 및/또는 넉인)하기 전에 수행된다. 일부 구현예에서, CD57+ 세포(예를 들어 CD57+ T 세포)를 선별하는 것은 개별 공여자 유래 공여자 샘플에 대해 수행된다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 개별 공여자로부터의 CD57+ 세포에 대해 고갈된 개별 공여자 샘플 각각은 이어서 조합되어 풀링된 공여자 세포 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 개별 공여자로부터의 개별 공여자 샘플 각각은 CD57+ T 세포에 대해 고갈되기 전에 조합되어, 풀링된 공여자 샘플은 CD57+ 세포에 대해 고갈된다.
일부 구현예에서, CD27+ 세포는 공여자 샘플로부터 농축된다. 일부 측면에서, CD27+ 세포의 농축은 유전자 조작을 포함한 이러한 공정의 또 다른 단계 전에 CD27+ 세포(예를 들어 CD27+ T 세포)에 대해 선택하는 것을 통해 달성된다. 일부 구현예에서, CD27+ 세포(예를 들어 CD27+ T 세포)에 대해 선택하는 것은 T 세포를 자극하기 전에 수행된다. 일부 구현예에서, CD27+ 세포(예를 들어 CD27+ T 세포)에 대해 선택하는 것은 세포를 자극한 후에 수행된다. 일부 구현예에서, CD27+ 세포(예를 들어 CD27+ T 세포)에 대해 선택하는 것은 세포를 유전자 조작(예를 들어 녹아웃 및/또는 넉인)하기 전에 수행된다. 일부 구현예에서, CD27+ 세포(예를 들어 CD27+ T 세포)에 대해 선택하는 것은 개별 공여자 유래 공여자 샘플에 대해 수행된다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 개별 공여자로부터의 CD27+ 세포에 대해 농축된 개별 공여자 샘플 각각은 이어서 조합되어 풀링된 공여자 세포 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 개별 공여자로부터의 개별 공여자 샘플 각각은 CD27+ T 세포에 대해 농축되기 전에 조합되어, 풀링된 공여자 샘플은 CD27+ 세포에 대해 농축된다.
일부 구현예에서, 상기 제공된 방법은, 예를 들어 증식, 배양 또는 증폭 동안 세포 요법으로서 사용하기 위한 필요한 수의 T 세포를 산출하기 위해 수확까지 필요한 기간 및 세포의 배가 횟수를 감소시킨다. 따라서, 이론에 근거함이 없이, 일부 구현예는 상기 제공된 방법이 개선된 증식 용량을 나타내는 유입 공여자 세포, 예를 들어 공여자 샘플로부터의 세포의 충분한 수를 증가 또는 입증하는 것을 고려한다.
일부 구현예에서, 농축된 CD57- T 세포의 집단으로부터 생성된 상기 세포 요법은 대안 공정에서 생성된 세포 요법제보다 분화도가 낮은 T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 복수의 상이한 공여자로부터 유래된 세포 요법을 포함한, 상기 세포 요법의 감소된 세포 분화는 (예를 들어 대안 공정과 비교하여) 상기 제공된 공정에 의해서 생성된 세포 요법, 예를 들어 가변 양의 CD57+ T 세포를 함유하는 세포의 집단으로부터 생성되는 세포 요법 중에서의 일관성을 개선시킨다. 특정 구현예에서, 상기 세포 요법의 감소된 세포 분화는 상기 세포 요법의 생성물 품질 프로파일을 개선시킨다.
특정 측면은 CD57이 T 세포에 더하여 NK 및 NKT 세포에 의해 발현되며, 이들 모두는 생물학적 샘플, 예를 들어 백혈구 성분 채집술 물질(leukapheresis material)에 존재할 수 있음을 고려한다. 따라서, 일부 구현예에서, CD57+ 세포(예를 들어 CD57+ T 세포)에 대한 음성 선택은 잔여 비-T 세포를 감소시키고 T 세포 순도를 개선시킨다. 따라서, 상기 제공된 방법은 예를 들어 자극, 형질도입, 또는 증폭에 의해서 가공되는 T 세포의 집단의 순도 뿐만 아니라 세포 요법을 생성하는 T 세포 순도를 증가시킨다.
본원에서 언급된 특허 문헌, 과학 논문 및 데이터베이스를 포함한 모든 출판물은 각각의 개별 출판물이 개별적으로 참조로 통합된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함된다. 여기에 제시된 정의가 여기에 참조로 포함된 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 출판물에 제시된 정의와 상반되거나 달리 부합하지 않는 경우, 여기에 제시된 정의가 여기에 참조로 포함된 정의보다 우선한다.
여기에 사용된 섹션 제목은 단지 조직화를 위한 목적이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
I. 재조합 수용체로 유전자 조작된 농축된 CD57- T 세포의 조성물
복수의 상이한 공여자로부터의 조작된 T 세포 조성물, 및 이를 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자로부터의 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 수득하는 것이거나 또는 그를 포함하는 복수의 풀(pool)로부터 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에서 제공되고, 각각의 조작된 T 세포 조성물은 상기 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 함유하되, 상기 T 세포는 재조합 수용체로 유전자 조작된 T 세포를 포함하고; 상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 조합하여 공여자 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생산한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자로부터의 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 수득하는 것이거나 또는 그를 포함하는 복수의 풀(pool)로부터 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에서 제공되고, 각각의 조작된 T 세포 조성물은 상기 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 함유하되, 상기 T 세포는 재조합 수용체로 유전자 조작된 T 세포를 포함하고; 상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 조합하여 공여자 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생산한다. 일부 구현예에서, 상기 유전자 조작된 조성물의 T 세포는 동일한 재조합 수용체로 조작된다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물에서 재조합 수용체를 발현하는 T 세포 각각은 동일한 재조합 수용체를 발현한다.
일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 개별 공여자로부터 생성된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터 생성된 조작된 T 세포 조성물은 개별 공여자로부터 생성된 하나 이상의 다른 조작된 T 세포 조성물과 조합되어, 복수의 상이한 공여자로부터의 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자로부터 생성된다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자로부터의 공여자 샘플은 조합되어 풀링된 공여자 샘플을 생성하고, 상기 풀링된 공여자 샘플은 조작되어 복수의 상이한 공여자로부터의 조작된 T 세포 조성물을 생성한다.
일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 적어도 약 또는 약 2명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 5명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 10명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 15명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 20명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 25명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 50명의 상이한 공여자, 또는 적어도 약 또는 약 100명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 적어도 약 또는 약 2명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 적어도 약 또는 약 5명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 적어도 약 또는 약 10명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 적어도 약 또는 약 15명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 적어도 약 또는 약 20명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 적어도 약 또는 약 25명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 적어도 약 또는 약 50명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 적어도 약 또는 약 100명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 25명 미만의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 50명 미만의 상이한 공여자를 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 매칭된(matched) 100% 미만의 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen; HLA), 매칭된 약 90% 미만의 HLA, 매칭된 약 80% 미만의 HLA, 매칭된 약 70% 미만의 HLA, 매칭된 약 60% 미만의 HLA, 또는 매칭된 약 50% 미만의 HLA인 2명 이상의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 매칭된 100% 미만의 인간 백혈구 항원(HLA)인 2명 이상의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 매칭된 90% 미만의 인간 백혈구 항원(HLA)인 2명 이상의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 매칭된 80% 미만의 인간 백혈구 항원(HLA)인 2명 이상의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 매칭된 70% 미만의 인간 백혈구 항원(HLA)인 2명 이상의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 매칭된 60% 미만의 인간 백혈구 항원(HLA)인 2명 이상의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 매칭된 50% 미만의 인간 백혈구 항원(HLA)인 2명 이상의 공여자를 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 세포가 적어도 1명의 공여자로부터 수득되는 때에 건강하거나 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되지 않는 적어도 1명의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 세포가 적어도 1명의 공여자로부터 수득되는 때에 질환 또는 병태를 갖는 적어도 1명의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자 중 공여자 각각은 세포가 각각의 상이한 공여자로부터 수득되는 때에 건강하거나 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포에서 농축된 세포 집단을 포함하는 공여자 풀 유래 T 세포를 포함하며, 여기서 세포 집단은 복수의 상이한 공여자로부터 유래되고, 여기서 복수의 상이한 공여자들은 매칭된 100% 인간 백혈구 항원(HLA)이 아닌 적어도 2명의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에서 농축된 세포의 집단을 포함하는, 공여자 풀 유래 T 세포를 포함하고, 여기서 세포의 집단은 복수의 상이한 공여자로부터 유래되고, 복수의 상이한 공여자들은 매칭된 100% 인간 백혈구 항원(HLA)이 아닌 적어도 2 명의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포는 재조합 수용체로 유전자 조작된 T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (a) 개별 공여자 유래 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생산하고; (b) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산을 CD57 고갈된 세포 집단 내로 도입하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생성함으로써 생산된다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (a) 개별 공여자 유래 샘플로부터 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하고, 그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생산하고; (b) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산을 CD27 농축된 세포 집단 내로 도입하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생성함으로써 생산된다.
일부 구현예에서, 상기 재조합 수용체는 질환 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련되고, 특이적이고/이거나 발현된 표적 항원과 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 질환 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환, 또는 종양 또는 암이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 항원은 종양 항원이다. 일부 구현예에서, 상기 표적 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 표피 당단백질 2(EPG-2), 표피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; FC 수용체 상동물 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 클래스 5D(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 2량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 패밀리 8 멤버 A를 함유하는 루신 리치 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스트론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나제 유사 고아 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토머라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원 또는 보편적 태그(universal tag) 및/또는 비오티닐화된 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체(pathogen)에 의해 발현된 분자와 연관된 항원 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 재조합 수용체는 기능성 비-TCR 항원 수용체 또는 TCR 또는 이의 항원-결합 단편이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 구현예에서, 상기 재조합 수용체는 항원-결합 도메인, 스페이서 및/또는 힌지 영역을 포함하는, 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 공자극 신호전달 영역을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 도메인은 scFv를 포함하는 항원-결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호전달 도메인, T 세포 수용체(TCR) 성분의 신호전달 도메인 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 신호전달 도메인이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3 사슬, 임의로 CD3-제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 신호전달 부분의 세포내 신호전달 도메인이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 신호전달 부분의 세포내 신호전달 도메인이다. 일부 구현예에서, 상기 공자극 신호전달 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS 또는 이의 신호전달 부분의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 공자극 신호전달 영역은 4-1BB의 세포내 신호전달 도메인 또는 그의 신호전달 부분을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 생존 T 세포, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, 및/또는 CD8+ T 세포이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 T 세포 조성물의 세포는 생존 T 세포, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, 및/또는 CD8+ T 세포 또는 상기 중 임의의 것의 조합이거나 이를 포함한다. 다양한 구현예에서, 조작된 T 세포 조성물의 세포는 생존가능한 CD57- T 세포, CD57- CD3+ T 세포, CD57- CD4+ T 세포, CD57- CD8+ T 세포, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 조합이거나 이를 포함한다. 다양한 구현예에서, 조작된 T 세포 조성물의 세포는 생존가능한 CD27+ T 세포, CD27+ CD3+ T 세포, CD27+ CD4+ T 세포, CD27+ CD8+ T 세포, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 조합이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 1:5 내지 (약) 5:1의 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 1:3 내지 (약) 3:1의 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 1:2 내지 (약) 2:1의 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 약 1:1의 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 75% 초과의 CD3+/CD57- 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 80% 초과의 CD3+/CD57- 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 85% 초과의 CD3+/CD57- 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 (약) 90% 초과의 CD3+/CD57- 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 75% 초과의 CD3+/CD57- 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 40% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 45% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 50% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 55% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 55% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 60% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 65% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 70% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 조성물 내의 CD57+ T 세포의 빈도는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단 내의 CD57+ T 세포의 빈도의 (약) 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물 내의 CD57+ T 세포의 빈도는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단 내의 CD57+ T 세포의 빈도의 (약) 30% 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물 내의 CD57+ T 세포의 빈도는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단 내의 CD57+ T 세포의 빈도의 (약) 20% 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물 내의 CD57+ T 세포의 빈도는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단 내의 CD57+ T 세포의 빈도의 (약) 10% 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물 내의 CD57+ T 세포의 빈도는 CD57에 대해 표면 음성인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단 내의 CD57+ T 세포의 빈도의 (약) 5% 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물 내의 CD57+ T 세포의 빈도는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단 내의 CD57+ T 세포의 빈도의 (약) 1% 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물 내의 CD57+ T 세포의 빈도는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단 내의 CD57+ T 세포의 빈도의 (약) 0.1% 미만이다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 20% 미만의 CD57+ T 세포, 약 15% 미만의 CD57+ T 세포, 약 10% 미만의 CD57+ T 세포, 약 5% 미만의 CD57+ T 세포, 약 1% 미만의 CD57+ T 세포, 또는 약 0.1% 미만의 CD57+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 20% 미만의 CD57+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 15% 미만의 CD57+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 10% 미만의 CD57+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 5% 미만의 CD57+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 1% 미만의 CD57+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 0.1% 미만의 CD57+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 CD57+ T 세포가 없거나 본질적으로 없다.
일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는 CD57에 대해 표면 음성인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단(CD57-)과 비교하여 하나 이상의 분자의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD57에 대해 표면 음성인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단(CD57-)보다 적어도 20% 더 낮거나, 적어도 40% 더 낮거나, 적어도 60% 더 낮거나, 또는 적어도 80% 더 낮다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD57에 대해 표면 음성인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단(CD57-)보다 적어도 20% 더 낮다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD57에 대해 표면 음성인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단(CD57-)보다 적어도 40% 더 낮다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD57에 대해 표면 음성인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단(CD57-)보다 적어도 60% 더 낮다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD57에 대해 표면 음성인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단(CD57-)보다 적어도 80% 더 낮다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD57에 대해 표면 음성인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단(CD57-)보다 적어도 90% 더 낮다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자는 나이브 T 세포의 마커, 선택적으로 CD27, Ki67, CD25, CD28, CCR7, 및/또는 CD45RA를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자는 CD27, Ki67, CD25, CD28, CCR7, 및/또는 CD45RA이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자는 CD27이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자는 Ki67이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는 CD57에 대해 표면 음성인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단(CD57-)과 비교하여 CD27 및/또는 Ki67의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는 CD57에 대해 표면 음성인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단(CD57-)과 비교하여 CD27의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는 CD57에 대해 표면 음성인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단(CD57-)과 비교하여 Ki67의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는 CD57 (CD57-)에 대해 표면 음성인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포의 집단의 것과 비교하여, CD27 및 Ki67의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD57 (CD57-)에 대해 표면 음성인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포의 집단의 것보다 적어도 20% 더 낮거나, 적어도 40% 더 낮거나, 적어도 60% 더 낮거나, 또는 적어도 80% 더 낮다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD57 (CD57-)에 대해 표면 음성인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포의 집단의 것보다 적어도 20% 더 낮다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD57 (CD57-)에 대해 표면 음성인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포의 집단의 것보다 적어도 40% 더 낮다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD57 (CD57-)에 대해 표면 음성인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포의 집단의 것보다 적어도 60% 더 낮다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD57 (CD57-)에 대해 표면 음성인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포의 집단의 것보다 적어도 80% 더 낮다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD57 (CD57-)에 대해 표면 음성인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포의 집단의 것보다 적어도 90% 더 낮다.
일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 75% 초과의 CD3+/CD27+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 80% 초과의 CD3+/CD27+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 85% 초과의 CD3+/CD27+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 90% 초과의 CD3+/CD27+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 75% 초과의 CD3+/CD27+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 40% 초과의 CD3+/CD27+/재조합 수용체+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 40% 초과의 CD3+/CD27+/재조합 수용체+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 50% 초과의 CD3+/CD27+/재조합 수용체+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 55% 초과의 CD3+/CD27+/재조합 수용체+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 55% 초과의 CD3+/CD27+/재조합 수용체+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 60% 초과의 CD3+/CD27+/재조합 수용체+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 65% 초과의 CD3+/CD27+/재조합 수용체+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 (약) 70% 초과의 CD3+/CD27+/재조합 수용체+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 조성물 내의 CD27- T 세포의 빈도는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단 내의 CD27- T 세포의 빈도의 (약) 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물 내의 CD27- T 세포의 빈도는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단 내의 CD27- T 세포의 빈도의 (약) 30% 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물 내의 CD27- T 세포의 빈도는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단 내의 CD27- T 세포의 빈도의 (약) 20% 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물 내의 CD27- T 세포의 빈도는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단 내의 CD27- T 세포의 빈도의 (약) 10% 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물 내의 CD27- T 세포의 빈도는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단 내의 CD27- T 세포의 빈도의 (약) 5% 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물 내의 CD27- T 세포의 빈도는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단 내의 CD27- T 세포의 빈도의 (약) 1% 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물 내의 CD27- T 세포의 빈도는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단 내의 CD27- T 세포의 빈도의 (약) 0.1% 미만이다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 20% 미만의 CD27- T 세포, 약 15% 미만의 CD27- T 세포, 약 10% 미만의 CD27- T 세포, 약 5% 미만의 CD27- T 세포, 약 1% 미만의 CD27- T 세포, 또는 약 0.1% 미만의 CD27- T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 20% 미만의 CD27- T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 15% 미만의 CD27- T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 10% 미만의 CD27- T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 5% 미만의 CD27- T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 1% 미만의 CD27- T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 0.1% 미만의 CD27- T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 CD27- T 세포가 없거나 본질적으로 없다.
일부 구현예에서, 조성물의 세포는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단의 것과 비교하여, 하나 이상의 분자의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타낸다. 일부 구현예에서, 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단의 것보다 적어도 20% 더 낮거나, 적어도 40% 더 낮거나, 적어도 60% 더 낮거나, 또는 적어도 80% 더 낮다. 일부 구현예에서, 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단의 것보다 약 20% 더 낮다. 일부 구현예에서, 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단의 것보다 약 40% 더 낮다. 일부 구현예에서, 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단의 것보다 약 60% 더 낮다. 일부 구현예에서, 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단의 것보다 약 80% 더 낮다. 일부 구현예에서, 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단의 것보다 약 90% 더 낮다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자는 나이브 T 세포의 마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자는 Ki67, CD25, CD28, CCR7, 및/또는 CD45RA이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자는 CD28 이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자는 CD45RA이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자는 Ki67이다. 일부 구현예에서, 조성물의 세포는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에서 농축되지 않은 세포 집단의 것과 비교하여, Ki67 의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타낸다.
일부 구현예에서, 조성물의 T 세포는 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 임의로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(T cell receptor alpha constant; TRAC)의 발현에 대해 녹아웃된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 MHC는 MHC 부류 I 단백질 또는 이의 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 MHC는 베타-2-마이크로글로불린(β2M)을 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 TCR 또는 이의 성분은 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 및/또는 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC) 를 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 TCR 또는 이의 성분은 T-세포 수용체 알파 불변(TRAC)을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물의 T 세포는 (i) 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) T 세포 수용체 알파 불변(TRAC)의 발현에 대해 녹아웃된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물의 T 세포는 (i) 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및 (ii) T 세포 수용체 알파 불변(TRAC)의 발현에 대해 녹아웃된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드는 TRAC 유전자의 유전자 좌 내로 삽입된다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 질환 또는 병태를 갖는 대상체의 치료를 위한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 질환 또는 병태를 갖는 대상체의 치료에 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 질환 또는 병태를 치료하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 질환 또는 병태는 암 또는 종양이다.
일부 구현예에서, 조성물의 세포는 1회 이상의 단위 용량으로서 투여하기 위해 제형화되고, 세포는 적어도 약 100개 단위 용량의 세포, 적어도 약 200개 단위 용량의 세포, 적어도 약 300개 단위 용량의 세포, 적어도 약 400개 단위 용량의 세포, 적어도 약 500개 단위 용량의 세포, 적어도 약 600개의 단위 용량, 적어도 약 1,000개 단위 용량의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 단위 용량은 밀리리터당 약 1천만개 내지 7천5백만개의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 단위 용량은 (약) 5.0×106 내지 2.25×107, 5.0×106 내지 2.0×107, 5.0×106 내지 1.5×107, 5.0×106 내지 1.0×107, 5.0×106 내지 7.5×106, 7.5×106 내지 2.25×107, 7.5×106 내지 2.0×107, 7.5×106 내지 1.5×107, 7.5×106 내지 1.0×107, 1.0×107 내지 2.25×107, 1.0×107 내지 2.0×107, 1.0×107 내지 1.5×107, 1.5×107 내지 2.25×107, 1.5×107 내지 2.0×107, 또는 2.0×107 내지 2.25×107개의 세포, 선택적으로 (약) 5.0×106 내지 2.25×107, 5.0×106 내지 2.0×107, 5.0×106 내지 1.5×107, 5.0×106 내지 1.0×107, 5.0×106 내지 7.5×106, 7.5×106 내지 2.25×107, 7.5×106 내지 2.0×107, 7.5×106 내지 1.5×107, 7.5×106 내지 1.0×107, 1.0×107 내지 2.25×107, 1.0×107 내지 2.0×107, 1.0×107 내지 1.5×107, 1.5×107 내지 2.25×107, 1.5×107 내지 2.0×107, 또는 2.0×107 내지 2.25×107개의 재조합 수용체-발현 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 용기 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 5.0 x 106개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 1.0×107개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 1.5×107개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 3.0×107개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 4.5×107개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 6.0×107개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 8.0×107개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 1.0×108개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 1.5×108개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 3.0×108개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 4.5×108개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 6.0×108개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 8.0×108개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 단위 용량은 약 1.0×109개의 재조합 수용체-발현 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 용기는 백(bag), 선택적으로로 냉동 백(freezing bag)이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (약) 15 mL 내지 150 mL, 20 mL 내지 100 mL, 20 mL 내지 80 mL, 20 mL 내지 60 mL, 20 mL 내지 40 mL, 40 mL 내지 100 mL, 40 mL 내지 80 mL, 40 mL 내지 60 mL, 60 mL 내지 100 mL, 60 mL 내지 80 mL 또는 80 mL 내지 100 mL(각각의 경계 포함); 또는 적어도 (약) 15 mL, 적어도 (약) 20 mL, 적어도 (약) 30 mL, 적어도 (약) 40 mL, 적어도 (약) 50 mL, 적어도 (약) 60 mL, 적어도 (약) 70 mL, 적어도 (약) 80 mL 또는 적어도 (약) 90 mL; 및/또는 100 mL 이하인 부피의 조성물로 충전된 냉동 백에 포함된다.
일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는 적어도 2명의 대상체, 적어도 5명의 대상체, 적어도 10명의 대상체, 적어도 25명의 대상체, 적어도 50명의 대상체, 적어도 100명의 대상체, 적어도 200명의 대상체, 적어도 500명의 대상체, 또는 적어도 1,000명의 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는 적어도 2명의 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는 적어도 5명의 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는 적어도 10명의 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는 적어도 25명의 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는 적어도 50명의 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는 적어도 100명의 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는 적어도 200명의 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는 적어도 500명의 대상체에게 투여하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는 적어도 1,000명의 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 동결 보호제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다.
II. 재조합 수용체로 유전자 조작된 농축된 CD57- T 세포의 조성물을 생산하는 방법
일부 구현예에서, 상기 제공된 방법은 생물학적 샘플(예를 들어 공여자 샘플)로부터의 세포 또는 세포 집단을 분리, 선택 또는 농축시켜서 재조합 수용체로 조작된 농축된 세포, 예를 들어 CD57- T 세포의 하나 이상의 조성물을 생산하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 방법은 생물학적 샘플(예를 들어 공여자 샘플)로부터의 세포 또는 세포 집단을 분리, 선택 또는 농축시켜서 재조합 수용체로 조작된 농축된 세포, 예를 들어 CD27+ T 세포의 하나 이상의 조성물을 생산하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 방법은 생물학적 샘플(예를 들어 공여자 샘플), 예를 들어 동종이계 공급원으로부터 수득된 것들로부터의 세포 또는 그의 집단의 분리를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 동종이계 공급원은 하나 이상의 공여자, 예를 들어 하나 이상의 공여자이다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 공여자는 특정한 질환 또는 병태를 갖지 않거나 또는 세포 요법을 필요로 하지 않거나 또는 세포 요법이 투여될 것이다.
일부 구현예에서, 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에서 제공되며, 상기 방법은 (A) 복수의 상이한 공여자들로부터 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 수득하는 단계, 각각의 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 포함하되, 상기 T 세포는 재조합 수용체로 유전자 조작된 T 세포를 포함함; 및 (B) 상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 조합하여 공여자 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 단계이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 T 세포 조성물은, (a) 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (b) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산을 CD57 고갈된 세포 집단 내로 도입하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 단계이거나 또는 그를 포함하는 방법에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에서 제공되며, 상기 방법은 (A) 복수의 상이한 공여자들로부터 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 수득하는 단계, 각각의 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 포함하되, 상기 T 세포는 재조합 수용체로 유전자 조작된 T 세포를 포함함; 및 (B) 상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 조합하여 공여자 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 단계이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 복수의 T 세포 조성물은, (a) 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하고, 그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생산하는 단계; 및 (b) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산을 상기 CD27 농축된 세포 집단 내로 도입하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 단계;이거나 또는 그를 포함하는 방법에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물 내의 T 세포에 의해 발현되는 재조합 수용체는 동일한 재조합 수용체이다. 일부 측면에서, 상기 재조합 수용체를 발현하는 조작된 T 세포 조성물 내의 각각의 T 세포는 동일한 재조합 수용체를 발현한다.
일부 측면에서, 본원에서는 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (b) 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단을 유전자 조작하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 단계, 상기 유전자 조작은, (1) 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포에서, (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 TRAC의 발현을 녹아웃(knocking out)하는 단계; 및 (2) 상기 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산을 녹아웃된 T 세포 조성물의 세포 내로 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 내로 도입하는 단계, 선택적으로 상기 이종 핵산은 내인성 MHC 및/또는 내인성 TCR에 대해 암호화하는 유전자의 유전자 좌 내로 삽입됨;를 포함하며, 상기 단계 (1)에서의 녹아웃 및 상기 단계 (2)에서의 도입은 어느 순서로든 동시에 또는 연속적으로 수행될 수 있음; (c) 복수의 상이한 공여자들에 대해 상기 단계 (a) 및 (b)를 반복하여 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 생산하는 단계, 각각의 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 세포로부터 생성됨; 및 (d) 상기 복수의 상이한 개별 공여자로부터의 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 조합하는 단계;이거나 또는 그를 포함한다.
일부 측면에서, 본원에서는 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하고, 그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (b) 상기 CD27 농축된 T 세포 집단을 유전자 조작하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 단계, 상기 유전자 조작은, (1) 상기 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포에서, (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 TRAC의 발현을 녹아웃시키는 단계; 및 (2) 상기 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산을 녹아웃된 T 세포 조성물의 세포 내로 상기 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포 내로 도입하는 단계, 선택적으로 상기 이종 핵산은 내인성 MHC 및/또는 내인성 TCR에 대해 암호화하는 유전자의 유전자 좌 내로 삽입됨;를 포함하며, 상기 단계 (1)에서의 녹아웃 및 상기 단계 (2)에서의 도입은 어느 순서로든 동시에 또는 연속적으로 수행될 수 있음; (c) 복수의 상이한 공여자들에 대해 상기 단계 (a) 및 (b)를 반복하여 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 생산하는 단계, 각각의 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 세포로부터 생성됨; 및 (d) 상기 복수의 상이한 개별 공여자로부터의 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 조합하는 단계;이거나 또는 그를 포함한다.
일부 측면에서, 본원에서는 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) (i) T 세포 마커에 대해 표면 양성인 세포 및 (ii) 복수의 상이한 공여자들 유래 공여자 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 세포 중의 하나에 대해 선택하고, 그에 의해서 농축된 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 농축된 세포 집단으로부터, (i) T 세포 마커의 세포 표면 및 (ii) CD57-세포 중의 다른 하나를 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 집단을 생성하는 단계;이거나 또는 그를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자로부터의 세포를 갖는 풀링된 샘플이며, 그에 의해서 상기 방법은 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생산한다. 일부 측면에서, 본원에서는 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) (i) T 세포 마커에 대해 표면 양성인 세포 및 (ii) 복수의 상이한 공여자들 유래 공여자 샘플로부터 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 세포 중의 하나에 대해 선택하고, 그에 의해서 농축된 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 농축된 세포 집단으로부터, (i) T 세포 마커의 세포 표면 및 (ii) CD27+세포 중의 다른 하나를 선택하고, 그에 의해서 CD27 농축된 집단을 생성하는 단계;이거나 또는 그를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자로부터의 세포를 갖는 풀링된 샘플이며, 그에 의해서 상기 방법은 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생산한다.
일부 측면에서, 본원에서는 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 제공되되, 상기 방법은 공여자 샘플로부터의 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 선택하는 단계이거나 또는 그를 포함하되, 상기 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자들 유래 인간 T 세포에 대해 농축된 풀링된 세포 집단이고, 그에 의해서 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성한다. 일부 측면에서, 본원에서는 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 제공되되, 상기 방법은 공여자 샘플로부터 T 세포에 대해 선택하는 단계이거나 또는 그를 포함하되, 상기 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자들 유래 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포에 대해 농축된 풀링된 세포 집단이고, 그에 의해서 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성한다. 일부 측면에서, 본원에서는 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 제공되되, 상기 방법은 공여자 샘플로부터의 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 T 세포에 대해 선택하는 단계이거나 또는 그를 포함하되, 상기 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자들 유래 인간 T 세포에 대해 농축된 풀링된 세포 집단이고, 그에 의해서 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성한다. 일부 측면에서, 본원에서는 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 제공되되, 상기 방법은 공여자 샘플로부터 T 세포에 대해 선택하는 단계이거나 또는 그를 포함하되, 상기 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자로부터의 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에 대해 농축된 풀링된 세포 집단이고, 그에 의해서 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성한다.
일부 측면에서, 본원에서는 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, (a) 공여자 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계, 상기 공여자 샘플은 개별 공여자 유래 인간 T 세포에 대해 농축됨; (b) 복수의 상이한 개별 공여자들에 대해 상기 단계 (a)를 반복하는 단계; 및 (c) 상기 개별 공여자 각각으로부터의 각각의 CD57 고갈된 T 세포 집단을 조합하고, 그에 의해서 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계;이거나 또는 그를 포함한다. 일부 측면에서, 본원에서는 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, (a) 공여자 샘플로부터 T 세포에 대해 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계, 상기 샘플은 개별 공여자 유래 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포에 대해 농축됨; (b) 복수의 상이한 공여자들에 대해 상기 단계 (a)를 반복하는 단계; 및 (c) 상기 개별 공여자 각각으로부터의 각각의 CD57 고갈된 T 세포 집단을 조합하고, 그에 의해서 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계;이거나 또는 그를 포함한다.
일부 측면에서, 본원에서는 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, (a) 공여자 샘플로부터 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 T 세포에 대해 선택하고, 그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계, 상기 공여자 샘플은 개별 공여자 유래 인간 T 세포에 대해 농축됨; (b) 복수의 상이한 개별 공여자들에 대해 상기 단계 (a)를 반복하는 단계; 및 (c) 상기 개별 공여자 각각으로부터의 각각의 CD27 농축된 T 세포 집단을 조합하고, 그에 의해서 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계;이거나 또는 그를 포함한다. 일부 측면에서, 본원에서는 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, (a) 공여자 샘플로부터 T 세포에 대해 선택하고, 그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계, 상기 샘플은 개별 공여자로부터의 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에 대해 농축됨; (b) 복수의 상이한 공여자들에 대해 상기 단계 (a)를 반복하는 단계; 및 (c) 상기 개별 공여자 각각으로부터의 각각의 CD27 농축된 T 세포 집단을 조합하고, 그에 의해서 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계;이거나 또는 그를 포함한다.
또한, 일부 측면에서, 본원에서는 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, (i) 공여자 샘플로부터의 (a) CD3, CD4, 및/또는 CD8에 대해 표면 양성(CD3+, CD4+, 및/또는 CD8+)인 T 세포 및 (b) CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 세포 중의 하나에 대해 선택하고, 그에 의해서 농축된 세포 집단을 생성하는 단계; (ii) 상기 농축된 세포 집단으로부터 (a) CD3+, CD4+, 및/또는 CD8+ 세포 및 (b) CD57- 세포 중의 다른 것에 대해 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (iii) 자극 조건 하에 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포를 자극하는 단계; (iv) 상기 자극된 세포에서, (a) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (b) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC)의 발현을 녹아웃시키는 단계; (v) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 녹아웃된 세포 내로, 선택적으로 TRAC에 대해 암호화하는 유전자의 유전자 좌 내로 도입하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (vi) 상기 조작된 세포를 최대 96시간 동안, 선택적으로 (약) 37℃±2℃의 온도에서 인큐베이션하는 단계; 및 (vii) 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건 하에 상기 세포를 배양하는 단계;를 포함하되, 상기 공여자 샘플은 개별 공여자로부터 유래된 샘플이고, 상기 단계 (i) 내지 (vii) 중의 임의의 단계는 복수의 공여자 샘플을 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 조성물 내로 조합하기 전에 복수의 상이한 공여자들 유래 공여자 샘플 각각에 대해 개별적으로 반복된다.
또한, 일부 측면에서, 본원에서는 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 제공되되, 상기 방법은, (i) 공여자 샘플로부터의 (a) CD3, CD4, 및/또는 CD8에 대해 표면 양성(CD3+, CD4+, 및/또는 CD8+)인 T 세포 및 (b) CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 세포 중의 하나에 대해 선택하고, 그에 의해서 농축된 세포 집단을 생성하는 단계; (ii) 상기 농축된 세포 집단으로부터 (a) CD3+, CD4+, 및/또는 CD8+ 세포 및 (b) CD27+ 세포 중의 다른 것에 대해 선택하고, 그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (iii) 자극 조건 하에 상기 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포를 자극하는 단계; (iv) 상기 자극된 세포에서, (a) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (b) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC)의 발현을 녹아웃시키는 단계; (v) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 녹아웃된 세포 내로, 선택적으로 TRAC에 대해 암호화하는 유전자의 유전자 좌 내로 도입하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (vi) 상기 조작된 세포를 최대 96시간 동안, 선택적으로 (약) 37℃±2℃의 온도에서 인큐베이션하는 단계; 및 (vii) 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건 하에 상기 세포를 배양하는 단계;를 포함하되, 상기 공여자 샘플은 개별 공여자로부터 유래된 샘플이고, 상기 단계 (i) 내지 (vii) 중의 임의의 단계는 복수의 공여자 샘플을 풀링된 CD27 농축된 T 세포 조성물 내로 조합하기 전에 복수의 상이한 공여자들 유래 공여자 샘플 각각에 대해 개별적으로 반복된다.
일부 측면에서, 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 유전자 조작된다. 일부 측면에서, 상기 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 유전자 조작된다. 일부 구현예에서, 상기 유전자 조작은 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리펩티드를 집단의 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 유전자 조작은 예를 들어 하나 이상의 분자, 예를 들어 하나 이상의 유전자 좌의 표적화된 파괴에 의한 유전자 파괴를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 유전자 파괴된 세포는 "녹아웃된" 것으로 언급된다. 이종 폴리펩티드 및 유전자 파괴(예를 들어 녹아웃)를 도입하는 것은 동시에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 이종 폴리펩티드 및 유전자 파괴(예를 들어 녹아웃)를 도입하는 것은 어느 순서로든 순차적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 이종 폴리펩티드는 T 세포의 파괴된 (예를 들어 녹아웃된) 유전자 좌 내로 도입된다.
A. 공여자
일부 구현예에서, 하나 이상의 공여자 샘플의 분리, 선택, 또는 농축으로부터 생성된 조작된 조성물은 공여자의 HLA 유형 또는 하위유형과 무관하게 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 공여자 샘플의 분리, 선택 또는 농축으로부터 생성된 조작된 조성물은 조작된 조성물이 투여될 수 있는 대상체의 HLA 유형 또는 하위유형과 무관하게 사용될 수 있다. 조작된 조성물이 공여자 및/또는 대상체 HLA 유형 또는 하위유형과 무관하게 사용될 수 있는 것은, 일부 측면에서, 보다 다양한 수용자에게 "기성품" 전달을 허용할 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 조성물 및 방법은 질환 또는 장애를 치료하도록 조작된 동종이계 세포를 사용하여 입양 세포 요법을 제공하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 동종이계 세포를 사용하는 것은 특정 이점을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 공지된 안전성 및 효능 프로파일을 갖는 세포는 보다 다양한 환자용으로 제조될 수 있다. 예를 들어 세포는 건강한 공여자로부터 유래될 수 있고, 유전자 조작에 적합한 세포를 제공하기에 너무 아플 수 있는 대상체에게 전달될 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 전형적으로 특정 입양 세포 치료 요법에 사용되는 세포 또는 세포 유형에서 결함 또는 질환을 가질 수 있고, 이에 따라 건강한 공여자로부터의 세포가 질환에 걸린 세포를 대체하거나 보충하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 동종이계 세포를 조작하거나 투여하는 능력은 세포의 제조를 미리 허용하고, 이는 환자에게 전달되기 전에 필요한 시간을 감소시킬 수 있다. 일부 경우에, 조작된 동종이계 세포는 이식편-대-숙주 질환 또는 숙주-대-이식편 질환을 유발할 위험이 보다 낮을 수 있다.
일부 측면에서, 상기 공여자 샘플은 개별 공여자 유래 샘플이다. 일부 측면에서, 복수의 상이한 개별 공여자 유래 샘플은 공여자 샘플과 조합된다. 일부 측면에서, 공여자 샘플은 복수의 상이한 개별 공여자 유래 샘플이다. 일부 측면에서, 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자들 유래 샘플이다. 일부 측면에서, 개별 공여자는 인간이다. 일부 측면에서, 복수의 상이한 공여자 각각은 인간이다. 일부 측면에서, 복수의 상이한 공여자들은 인간 공여자이다.
일부 측면에서, 상기 개별 공여자는 특정 치료 개입, 예를 들어 세포가 분리, 가공 및/또는 조작되는 입양 세포 요법을 필요로 하는 환자가 아니다. 일부 측면에서, 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 각각은 특정 치료 개입, 예를 들어 세포가 분리, 가공 및/또는 조작되는 입양 세포 요법을 필요로 하는 환자가 아니다. 일부 측면에서, 복수의 상이한 공여자들은 특정 치료 개입, 예를 들어 세포가 분리, 가공 및/또는 조작되는 입양 세포 요법을 필요로 하는 환자가 아니다.
일부 측면에서, 상기 개별 공여자는 특정 치료 개입, 예를 들어 세포가 분리, 가공 및/또는 조작되는 입양 세포 요법을 필요로 하는 환자이다. 일부 측면에서, 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 각각은 특정 치료적 개입, 예를 들어 세포가 분리, 가공 및/또는 조작되는 입양 세포 요법을 필요로 하는 환자이다. 일부 측면에서, 복수의 상이한 공여자들은 특정 치료적 개입, 예를 들어 세포가 분리, 가공 및/또는 조작되는 입양 세포 요법을 필요로 하는 환자이다.
일부 측면에서, 농축된 세포, 예를 들어 CD57- T 세포의 생성된 조작된 조성물은 대상체를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 측면에서, 농축된 세포, 예를 들어 CD27+ T 세포의 생성된 조작된 조성물은 대상체를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 대상체는 공여자가 아니다. 일부 구현예에서, 대상체는 복수의 상이한 공여자 중 하나가 아니다. 일부 구현예에서, 조성물의 T 세포는 대상체로부터 유래되지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물의 T 세포의 적어도 일부는 대상체로부터 유래되지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물의 T 세포의 100% 미만은 대상체의 T 세포와 HLA-동일하다. 일부 구현예에서, 조성물의 T 세포의 적어도 일부는 대상체에 대해 동종이계이다. 일부 구현예에서, 조성물의 T 세포의 전부는 대상체에 대해 동종이계이다.
일부 측면에서, 농축된 세포, 예를 들어 CD57- T 세포의 생성된 조작된 조성물은 대상체를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 측면에서, 농축된 세포, 예를 들어 CD27+ T 세포의 생성된 조작된 조성물은 대상체를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 대상체는 공여자이다. 일부 구현예에서, 대상체는 복수의 상이한 공여자 중 하나이다. 일부 구현예에서, 조성물의 T 세포의 적어도 일부는 대상체로부터 유래되지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물의 T 세포의 100% 미만은 대상체의 T 세포와 HLA-동일하다. 일부 구현예에서, 조성물의 T 세포의 적어도 일부는 대상체에 대해 동종이계이다.
일부 구현예에서, 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은 개별 공여자로부터의 1차 인간 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 개별 공여자 유래 샘플(예를 들어 공여자 샘플) 각각은 조합된다. 일부 구현예에서, 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은 복수의 상이한 공여자로부터의 1차 인간 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 적어도 약 또는 약 2명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 5명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 10명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 15명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 20명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 25명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 50명의 상이한 공여자, 또는 적어도 약 또는 약 100명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 2명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 공여자는 약 5명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 10명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 15명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 20명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 25명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 30명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 40명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 50명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 60명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 80명의 상이한 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 100명의 상이한 공여자를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 공여자는 인간 백혈구 항원(HLA) 매칭에 대해 평가된다. 상기 HLA 매칭은 분해능 수준에 의존하고, 어느 HLA 유전자 좌(예를 들어 "마커")가 평가된다. 일부 경우에, 약 6개의 마커 및 약 12개의 마커가 HLA 매칭을 결정하기 위해 평가된다. 예를 들어 평가될 수 있는 10개의 HLA 마커는 HLA-A, -B, -C, -DRB1, 및 -DQB1 유전자 좌이다. 이러한 경우에, 2개의 개체가 모든 유전자 좌를 공유하는 경우(예를 들어 10/10), 2개의 개체는 100% HLA 매칭될 것이다. 예를 들어 평가될 수 있는 8개의 HLA 마커는 HLA-A, -B, -C, 및 -DRB1 유전자 좌이다. 이러한 경우에, 2개의 개체가 모든 유전자 좌를 공유하는 경우(예를 들어 8/8), 2개의 개체는 100% HLA 매칭될 것이다(문헌 [Tiercy, Haematologica 2016; 101(6):680-7] 참조).
일부 구현예에서, 공여자는 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 또는 적어도 12개의 HLA 마커에 대해 평가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 공여자는 하나 이상의 다른 공여자에 대한 HLA 매칭에 대해 평가되고, 여기서 100% HLA 매칭은 공여자가 평가되는 각각의 HLA 마커(예를 들어 6/6, 8/8, 10/10, 또는 12/12 마커)에 대한 매칭에 대해 평가된다는 것을 나타낸다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 100% 미만의 인간 백혈구 항원(HLA) 매칭, 약 90% 미만의 HLA 매칭, 약 80% 미만의 HLA 매칭, 약 70% 미만의 HLA 매칭, 약 60% 미만의 HLA 매칭, 또는 약 50% 미만의 HLA 매칭인 2명 이상의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 100% 미만의 인간 백혈구 항원(HLA) 매칭인 2명 이상의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 90% 미만의 HLA 매칭인 2명 이상의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 80% 미만의 HLA 매칭된 2명 이상의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 70% 미만의 HLA 매칭된 2명 이상의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 60% 미만의 HLA 매칭된 2명 이상의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 약 50% 미만의 HLA 매칭된 2명 이상의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 100% HLA 매칭되지 않은 적어도 2명의 공여자를 포함한다.
일부 구현예에서, 개별 공여자는 공여자 샘플이 개별 공여자로부터 수득되는 시점에 건강하거나 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되지 않는 것이다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 개별 공여자의 개별 공여자 각각은 공여자 샘플이 개별 공여자로부터 수득되는 시점에 건강하거나 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되지 않는 것이다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 공여자 샘플이 적어도 1명의 공여자로부터 수득되는 시점에 건강하거나 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되지 않는 적어도 1명의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 공여자 샘플이 복수의 상이한 공여자로부터 수득되는 시점에 건강하거나 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되지 않는 것이다. 일부 구현예에서, 개별 공여자는 공여자 샘플이 개별 공여자로부터 수득되는 시점에 질환 또는 병태를 갖는 것이다. 일부 구현예에서, 개별 공여자 각각은 공여자 샘플이 개별 공여자로부터 수득되는 시점에 질환 또는 병태를 갖는 것이다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 공여자 샘플이 적어도 1명의 공여자로부터 수득되는 시점에 질환 또는 병태를 갖는 적어도 1명의 공여자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자들은 공여자 샘플이 공여자로부터 수득되는 시점에 건강하거나 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되지 않는 것이다.
일부 구현예에서, 개체는 상기 개체로부터의 샘플에서 CD57 및/또는 CD27을 발현하는 T 세포의 빈도에 기초하여 공여자로서 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 개체는 샘플에서 T 세포 중 CD57+ 세포의 낮은 빈도에 기초하여 공여자로서 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 개체는 상기 개체로부터의 샘플에서 T 세포 중 CD57- 세포의 빈도가 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 10% 미만인 경우에 공여자로서 선택된다. 일부 구현예에서, 개체는 상기 개체로부터의 샘플에서 T 세포 중 CD57- 세포의 빈도가 약 0% 내지 약 50%, 또는 약 0% 내지 약 30%인 경우에 공여자로서 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 개체는 개체로부터의 샘플에서 T 세포 중 CD57- 세포의 빈도가 약 50% 미만인 경우에 공여자로서 선택된다. 일부 구현예에서, 개체로부터의 샘플 내의 T 세포 중 CD57-세포의 빈도가 약 40% 미만인 경우, 개체는 공여자로서 선택된다. 일부 구현예에서, 개체로부터의 샘플 내의 T 세포 중 CD57-세포의 빈도가 약 30% 미만인 경우, 개체는 공여자로서 선택된다. 일부 구현예에서, 개체로부터의 샘플 내의 T 세포 중 CD57-세포의 빈도가 약 20% 미만인 경우, 개체는 공여자로서 선택된다. 일부 구현예에서, 개체로부터의 샘플 내의 T 세포 중 CD57-세포의 빈도가 약 10% 미만인 경우, 개체는 공여자로서 선택된다.
일부 구현예에서, 개체는 샘플 내의 T 세포 중 CD27+ 세포의 높은 빈도에 기초하여 공여자로서 선택된다. 일부 구현예에서, 개체로부터의 샘플 내의 T 세포 중 CD27+ 세포의 빈도가 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%인 경우, 개체는 공여자로서 선택된다. 일부 구현예에서, 개체로부터의 샘플 내의 T 세포 중 CD27+ 세포의 빈도가 약 50% 내지 약 100%, 또는 약 70% 내지 약 100%인 경우, 개체는 공여자로서 선택된다. 일부 구현예에서, 개체로부터의 샘플 내의 T 세포 중 CD27+ 세포의 빈도가 적어도 약 50%인 경우, 개체는 공여자로서 선택된다. 일부 구현예에서, 개체로부터의 샘플 내의 T 세포 중 CD27+ 세포의 빈도가 적어도 약 60%인 경우, 개체는 공여자로서 선택된다. 일부 구현예에서, 개체로부터의 샘플 내의 T 세포 중 CD27+ 세포의 빈도가 적어도 약 70%인 경우, 개체는 공여자로서 선택된다. 일부 구현예에서, 개체로부터의 샘플 내의 T 세포 중 CD27+ 세포의 빈도가 적어도 약 80%인 경우, 개체는 공여자로서 선택된다. 일부 구현예에서, 개체로부터의 샘플 내의 T 세포 중 CD27+ 세포의 빈도가 적어도 약 90%인 경우, 개체는 공여자로서 선택된다.
B. 샘플 및 샘플 제제
특정 구현예에서, 상기 제공된 방법은 생물학적 샘플로부터 세포를 분리, 선택, 또는 농축하여 하나 이상의 농축된 세포 집단, 예를 들어 CD57- T 세포(CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)를 생성하는 것과 관련하여 사용된다. 특정 구현예에서, 상기 제공된 방법은 생물학적 샘플로부터 세포를 분리, 선택, 또는 농축하여 하나 이상의 농축된 세포 집단, 예를 들어 CD27+ T 세포(CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)를 생성하는 것과 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 방법은 생물학적 샘플(예를 들어 공여자 샘플), 예를 들어 하나 이상의 공여자, 예를 들어 특정 질환 또는 병태를 갖지 않거나 또는 세포 요법을 필요로 하지 않거나 또는 세포 요법이 투여될 것인 공여자로부터 수득되거나 또는 그로부터 유래된 공여자 샘플로부터 세포 또는 그의 집단의 분리를 포함한다.
일부 측면에서, 공여자 샘플은 개별 공여자 유래 샘플이다. 일부 측면에서, 복수의 상이한 개별 공여자 유래 샘플은 공여자 샘플로 조합된다. 일부 측면에서, 공여자 샘플은 복수의 상이한 개별 공여자 유래 샘플이다. 일부 측면에서, 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자들 유래 샘플이다. 일부 측면에서, 개별 공여자는 인간이다. 일부 측면에서, 복수의 상이한 공여자 각각은 인간이다. 일부 측면에서, 복수의 상이한 공여자들은 인간 공여자이다.
일부 측면에서, 생성된 농축된 세포, 예를 들어 CD57- T 세포(CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)의 하나 이상의 집단은 대상체를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 측면에서, 상기 생성된 농축된 세포, 예를 들어 CD27+ T 세포(CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)의 하나 이상의 집단은 대상체를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 대상체는 공여자가 아니다. 일부 측면에서, 대상체는 사람, 예를 들어 특정 치료적 개입, 예를 들어 세포가 분리되고, 가공되고/되거나 조작되는 입양 세포 요법을 필요로 하는 환자인 대상체이다. 따라서, 일부 구현예에서, 세포는 1차 세포, 예를 들어 1차 인간 세포이다.
일부 구현예에서, 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은 개별 공여자로부터의 1차 인간 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 개별 공여자 유래 샘플(예를 들어 공여자 샘플) 각각은 조합된다. 일부 구현예에서, 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은 복수의 상이한 공여자로부터의 1차 인간 T 세포를 포함한다.
샘플은 조직, 유액 및 공여자로부터 직접 취한 다른 샘플을 포함한다. 생물학적 샘플은 생물학적 공급원으로부터 직접 얻은 샘플 또는 가공된 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 체액, 예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀, 조직 및 기관 샘플, 예를 들어 이들로부터 유래한 가공된 샘플을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 측면에서, 샘플은 혈액 또는 혈액-유래 샘플이거나, 또는 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술 산물로부터 유래된 것이다. 예시적인 샘플은 전혈, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 관련 림프 조직, 점막 관련 림프 조직, 비장, 기타 림프 조직, 간, 폐, 위장, 소장, 대장, 신장, 췌장, 유방, 뼈, 전립선, 자궁 경부, 고환, 난소, 편도선 또는 기타 기관, 및/또는 이들로부터 유래되는 세포를 포함한다. 샘플은 세포 요법과 관련하여, 예를 들어 입양 세포 요법, 자가 및 동종 원으로부터의 샘플을 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 자가 공급원(예를 들어 공여자)으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플은 전혈 샘플, 버피 코트 샘플, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플, 미분획 T 세포 샘플(unfractionated T cell sample), 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 채혈 제품 또는 백혈구 채취 제품이거나 또는 이들을 포함한다.
일부 구체예에서, 공여자의 순환 혈액으로부터의 세포는 예를 들어 성분채집술(apheresis) 또는 백혈구성분채집술(leukapheresis)에 의해 수득된다. 일부 측면에서, 상기 샘플은 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 핵 형성 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판을 비롯한 림프구를 포함하고, 일부 측면에서 적혈구 및 혈소판 이외의 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 공여자로부터 수집된 혈액 세포는, 예를 들어 혈장 분획을 제거하기 위하여, 후속 처리 단계를 위해 적절한 완충제 또는 배지에 세포를 위치시키기 위하여, 세척된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척된다. 일부 구현예에서, 상기 세척 용액은 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 많은 또는 모든 2가 양이온이 부족하다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조자의 지시에 따라 반자동 "흐름-통과(flow-through)"원심 분리기 (예를 들어 Cobe 2991 세포 처리기, Baxter)에 의해 수행된다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조자의 지시에 따라 접선 유동 여과(TFF)에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 세척 후, 다양한 생체 적합성 완충제, 예를 들어 Ca++/ Mg++ 프리 PBS에서 재현탁된다. 특정 구현예에서, 혈액 세포 샘플의 성분이 제거되고 세포는 배양 배지에 직접 재현탁된다.
일부 구현예에서, 세포를 함유하는 상기 샘플(예를 들어 공여자 샘플, 예를 들어 성분 채집 생성물 또는 백혈구 성분 제품)은 성분채집 또는 백혈구 감소 도중에 부가된 하나 이상의 항-응고제, 예를 들어 헤파린을 제거하기 위해서 세척된다.
일부 구현예에서, 세포를 함유하는 상기 샘플(예를 들어 공여자 샘플, 예를 들어 전혈 샘플, 버피 코트 샘플, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플, 비분획 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분 채집 생성물 또는 백혈구 생성 제품)은 동결 보존되고/되거나 동결 방지(예를 들어 동결)된 후, 상기 세포의 집단을 분리, 선택, 활성화, 자극, 파괴(disrupting)(예를 들어 녹아웃(knocking out)), 조작(예를 들어 넉킹 인(knock in)), 형질도입, 형질감염, 인큐베이션, 배양, 수확, 제형화하고/하거나 상기 제형화된 세포 집단을 대상체에 투여하는 임의의 단계 이전에 해동되고 선택적으로 세척된다.
일부 구현예에서, 대상체의 자가 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 함유한 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은 제조에 적절한 품질을 보장하는 적합한 방법으로 수집된다. 한 측면에서, PBMC를 함유한 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은 분획화된 전혈에서 유래된다. 일부 구현예에서, 공여자로부터의 전혈은, 자가 단핵 세포(mononuclear cell, MNC)가 우선적으로 농축된 반면, 다른 세포 표현형, 예를 들어 적혈구가 수집된 세포 조성물에서 감소된 경우, 세포 표현형 사이의 밀도 차를 이용하고 원심력을 이용하여 백혈구 성분채집술에 의해 분획화된다. 일부 구현예에서, 자가 혈장은 MNC 수집 중 동시에 수집되며, 이는 일부 측면에서 연장된 백혈구 성분채집술 생성물의 안정성을 허용할 수 있다. 한 측면에서, 자가 혈장은 백혈구 성분채집술 생성물에 첨가되어 백혈구 성분채집술 생성물 매트릭스의 완충 용량을 개선한다. 일부 측면에서, 백혈구 성분채집술 생성물을 생성하기 위해 가공된 전혈의 총 부피는 (약) 2L, 4L, 6L, 8L, 10L, 12L, 14L, 16L, 18L 또는 20L이거나 상기 중 임의의 사이의 임의의 값이다. 일부 구현예에서, 수집된 자가 혈장의 부피는 (약) 10mL, 50mL, 100mL, 150mL, 200mL, 250mL 또는 300mL 이상이거나 상기 중 임의의 사이의 부피이다. 일부 구현예에서, 백혈구 성분채집술 생성물은, 백혈구 성분채집술 수집 완료 후 약 48 시간 이내에 공정 내 동결 보존을 위한 절차, 예를 들어 세척 및 제형화를 거친다. 일부 구현예에서, 백혈구 성분채집술 생성물은, 예를 들어 백혈구 성분채집술 수집 완료 후 약 2 시간, 6 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간 또는 48 시간 이내에 하나 이상의 세척 단계를 거친다. 일부 측면에서, 하나 이상의 세척 단계는 백혈구 성분채집술 수집 중 항응고제, 백혈구 성분채집술 생성물에 축적되었을 수 있는 세포 폐기물, 잔여 혈소판 및/또는 세포의 잔해를 제거한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충제 교환은 하나 이상의 세척 단계 중 수행된다. 일부 구현예에서, 샘플은 성분채집술 생성물이거나 또는 성분채집술 생성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 백혈구성분채집술 생성물이거나 또는 백혈구성분채집술 생성물을 포함한다.
특정 구현예에서, 성분 채집 생성물 또는 백혈구 생성 제품은 동결 보존되고/되거나 동결 방지된(예를 들어 동결된) 후, 하기 기술한 바와 같이 세포 농축, 선택 또는 분리 단계(예를 들어 T 세포 선택 또는 분리 단계)에 적용하기 전에 해동시킨다. 일부 구현예에서, 동결 보존되고/되거나 동결 방지된 성분 채집 생성물 또는 백혈구 생성 제품은 T 세포 선택 또는 분리 단계에 적용한 후에는, 상기 세포의 집단을 분리, 선택, 활성화, 자극, 파괴(예를 들어 녹아웃), 조작(예를 들어 넉킹 인), 형질도입, 형질감염, 인큐베이션, 배양, 수확, 제형화하고/하거나 상기 제형화된 세포 집단을 대상체에 투여하는 단계들과 같은 후속 단계들 도중 또는 그 사이에 추가의 동결 보존 및/또는 동결 방지 단계가 수행되지 않는다. 예를 들어 해동된 동결 보존되고/되거나 동결 방지된 성분 채집 생성물 또는 백혈구 생성 제품은 다운스트림 공정동안, 예를 들어 T 세포 활성화/자극 또는 형질도입 공정동안 해동되고 선택적으로 세척되기 전에 재차 동결 보존되고/되거나 동결 방지되지 않는다.
특정 구현예에서, 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물은, 동결 보존 용액 또는 완충제에서 적어도 (약) 5×106 세포/mL, 10×106 세포/mL, 20×106 세포/mL, 30×106 세포/mL, 40×106 세포/mL, 50×106 세포/mL, 60×106 세포/mL, 70×106 세포/mL, 80×106 세포/mL, 90×106 세포/mL, 100×106 세포/mL, 110×106 세포/mL, 120×106 세포/mL, 130×106 세포/mL, 140×106 세포/mL 또는 150×106 세포/mL 또는 상기 중 임의의 사이의 임의의 값의 밀도로 동결 보존되고/되거나 동결 방지(예를 들어 냉동)된다. 일부 구현예에서, 동결 보존 용액 또는 완충제는, 예를 들어 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 또는 기타 적합한 세포 동결 배지를 선택적으로 포함하는 DMSO 용액이거나 상기를 함유한다.
특정 구현예에서, 상기 동결 보존되고/되거나 동결 방지된 성분 채집 생성물 또는 백혈구 생성 제품은 뱅킹(banking)되고(예를 들어 상기 샘플을 동결하기 전에 T 세포 선택 없이), 이것은 일부 측면에서 후속 제조 단계들에 보다 유연성을 허용할 수 있다. 일부 측면에서, 동결 보존되고/되거나 동결 방지된 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물은 백(bag)과 같은 다중 동결 보존 컨테이너로 분취되며, 이는 각각 상기 생성물의 가공에 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물의 생존 가능한 총 세포수가 15×109개 미만의 세포인 경우, 상기 동결 보존되고/되거나 동결 방지된 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물은 4개의 동결 보존 컨테이너, 예를 들어 백으로 분취된다. 일부 구현예에서, 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물의 생존 가능한 총 세포수가 15-30×109개의 세포인 경우, 상기 동결 보존되고/되거나 동결 방지된 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물은 8개의 동결 보존 컨테이너, 예를 들어 백으로 분취된다.
한 측면에서, 선택 전에 세포를 뱅킹하는 것은 다운스트림 공정에 대한 세포수율을 증가시키고, 세포를 조기에 뱅킹하는 것은 그것들이 보다 건강하다는 것을 의미할 수 있으며 제조 성공 기준을 보다 용이하게 충족시킬 수 있다. 또 다른 측면에서, 일단 해동되면, 상기 동결 보존되고/되거나 동결 방지된 성분 채집 생성물 또는 백혈구 생성 제품은 하나 이상의 상이한 선택법에 적용시킬 수 있다. 이러한 접근법의 이점은 다른 것들 중에서 예를 들어 상기 샘플의 공여자 및/또는 또다른 수용자에서와 같은 대상체의 질환 또는 병태에 대한 세포 요법의 세포의 이용률, 효능, 및/또는 다른 측면을 향상시키는 것이다.
일부 구현예에서, 상기 공여자는 또한 대상체이고/이거나 상기 공여자는 질환 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, 상기 공여자는 개별 공여자이다. 일부 구현예에서, 개별 공여자는 질환 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, 공여자는 복수의 상이한 공여자이다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자 중 적어도 1명의 공여자는 질환 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, 샘플(예를 들어 공여자 샘플, 예를 들어 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 샘플)은 공여자가 질환 또는 병태로 진단된 후의 시간에, 수집되고, 이전의 세포 선택 전에 또는 그 없이 (예를 들어 이전의 T 세포 선택, 예를 들어 크로마토그래피에 의한 선택 없이) 동결보존되고/되거나 동결보호된다. 일부 측면에서, 동결 보존의 시기는 또한 상기 공여자가 상기 질환 또는 병태에 대한 임의의 초기 치료, 상기 질환 또는 병태에 대한 치료를 위해 표지된 처치, 방사선 및/또는 화학요법 이외의 임의의 치료 중의 하나 이상을 받기 전이다. 일부 구현예에서, 상기 샘플은 질환의 초기 치료 후 질환의 최초 재발 후, 및 상기 대상체가 상기 질환에 대한 후속 치료를 받기 전에 수집된다. 상기 초기 및/또는 후속 치료는 세포 요법과는 다른 요법일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 수집된 세포는 초기 및/또는 후속 치료 후 세포 요법에 사용될 수 있다. 한 측면에서, 사전 세포 선택이 없는 상기 동결 보존되고/되거나 동결 보호된 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은 예를 들어 크로스오버(crossover)할 수 있고 나중에 치료를 요구할 수 있는 무작위 클리닉 시험에서 비-치료 환자들과 관련된 것과 같은 선불 비용(up-front costs)을 줄이는데 도움이 될 수 있다.
일부 구현예에서, 공여자는 또한 대상체이고/이거나 공여자는 질환 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, 공여자는 개별 공여자이다. 일부 구현예에서, 개별 공여자는 질환 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, 공여자는 복수의 상이한 공여자이다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자 중 적어도 1명의 공여자는 질환 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, 샘플(예를 들어 공여자 샘플, 예를 들어 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 샘플)은 질환에 대한 제2 치료 라인 후 질환의 제 2 재발 후, 및 대상체가 질환에 대한 후속 치료를 받기 전의 시간에, 이전 세포 선택(예를 들어 크로마토그래피에 의한 이전 T 세포 선택, 예를 들어 선택 없음) 전에 또는 그 없이 수집되고 동결 보존되고/되거나 동결 보호된다. 일부 구현예에서, 환자들은 예를 들어 특정 위험 인자들을 분석함으로써 제 2 라인의 치료 후에 재발할 가능성이 높은 것으로 식별된다. 일부 구현예에서, 상기 위험 인자들은 질환 유형 및/또는 유전학, 예를 들어 더블-히트 림프종(double-hit lymphoma), 1차 불응성 암 또는 활성화된 B-세포 림프종에 기반한다. 일부 구현예에서, 상기 위험 인자들은 임상적 표현, 예를 들어 제 1 라인 치료 후 조기 재발, 또는 치료후 기타 불량한 예후 지표(예를 들어 IPI(International Prognostic Index) > 2)에 기반한다.
일부 구현예에서, 공여자는 또한 대상체이고/이거나 공여자는 질환 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, 공여자는 개별 공여자이다. 일부 구현예에서, 개별 공여자는 질환 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, 공여자는 복수의 상이한 공여자이다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자 중 적어도 1명의 공여자는 질환 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플(예를 들어 공여자 샘플, 예를 들어 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 샘플)은, 상기 공여자가 질환으로 진단 받기 전의 시점에 사전 세포 선택 없이 (예를 들어 크로마토그래피에 의한 선택과 같은 사전 T 세포 선택 없이) 수집되고 동결 보존되고/되거나 동결 보호된다. 일부 측면에서, 상기 공여자는 건강한 대상체일 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 공여자는 생후 말기 단계에서 세포 요법이 필요한 경우에 질환을 일으키거나 질환으로 진단 받을 위험이 없는 세포를 뱅킹 또는 저장하도록 선택할 수 있다. 일부 경우에, 공여자는 유전적 변이, 유전적 이상, 유전적 혼란, 가족력, 단백질 이상(예를 들어 단백질 생산 및/또는 가공 결함)과 같은 인자들, 및 질환을 일으킬 수 있는 라이프스타일 선택에 기초하여 질환을 일으킬 위험이 있는 것으로 간주될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 예방적으로 수집된다.
일부 구현예에서, 세포의 상기 동결 보존되고/되거나 동결 보호된 샘플(예를 들어 공여자 샘플, 예를 들어 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 샘플), 예를 들어 사전 세포 선택에 적용되지 않은(예를 들어 크로마토그래피에 의한 선택과 같은 사전 T 세포 선택 없는) 세포의 샘플은 12시간, 24시간, 36시간, 또는 48시간, 또는 그 초과의 기간, 또는 0.5일, 1일, 1.5일, 또는 2일, 또는 그 초과의 기간동안 저장되거나 뱅킹된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플은 1주, 2주, 3주, 또는 4주 또는 그 초과의 기간동안 저장되거나 뱅킹된다. 일부 샘플은 장기간 저장 또는 장기간 뱅킹으로 배치된다. 일부 측면에서, 상기 샘플은 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년, 15년, 16년, 17년, 18년, 19년, 20년, 25년, 30년, 35년, 40년, 또는 그 초과의 기간동안 저장된다.
일부 구현예에서, 공여자로부터 채취한 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 샘플은 냉각된 환경에서 저장 또는 처리 시설로 운송되고/되거나, 저장 시설에서 극저온 저장되거나 처리 시설에서 처리된다. 일부 구현예에서, 공여자는 개별 공여자이다. 일부 구현예에서, 공여자는 복수의 상이한 공여자이다. 일부 구현예에서, 운송하기 전에, 상기 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은 예를 들어 T 세포, 예를 들어 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, 및/또는 CD8+ T 세포를 선택함으로써 처리된다. 일부 구현예에서, 상기 처리는 운송 후 및 상기 샘플(예를 들어 공여자 샘플)을 극저온 저장 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 처리는 극저온 저장 후 상기 샘플(예를 들어 공여자 샘플)을 해동시키기 전에 수행된다.
일부 구현예에서, 공여자는 또한 대상체이고/이거나 공여자는 질환 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, 공여자는 개별 공여자이다. 일부 구현예에서, 개별 공여자는 질환 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심된다. 일부 구현예에서, 공여자는 복수의 상이한 공여자이다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자 중 적어도 1명의 공여자는 질환 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심된다. 상기 공여자, 및 따라서 그들의 세포가 질환에 대한 광범위한 치료를 받지 않을 때 및/또는 질환 또는 병태를 발생시키거나 그의 진단을 받기 전의 단계에서 공여자가 그들의 세포를 저장하게 함으로써, 상기 세포는 1회 또는 복수회의 라운드의 치료 후에 수확된 세포와 비교하여 세포 요법에 사용하기 위한 특정 이점을 가질 수 있다. 예를 들어 1회 또는 그 이상의 라운드의 치료 전에 수확된 세포는 보다 높은 수준의 특정 세포 활성을 나타내고, 보다 신속하게 성장하고/하거나 수회의 라운드의 치료를 받은 세포 보다 유전자 조작에 더 수용적일 수 있다. 본원에서 기술된 구현예에 따르는 이점의 또다른 예는 편의성을 포함할 수 있다. 예를 들어 세포 요법에 필요로 하기 전에 공여자의 세포를 수집함으로써, 선택적으로 처리함으로써, 그리고 저장함으로써 상기 세포는 수용자가 나중에 그것들을 필요로 하는 경우 및 필요로 할 때 신속하게 이용할 수 있게 된다. 이것은 성분 채집 실험실 용량을 증가시켜서, 기술자에게 성분 채집 수고 공정을 계획하는데 보다 큰 유연성을 제공한다.
일부 구현예에서, 공여자 샘플은 세포를 선택하고, 인큐베이션하고, 활성화하고, 자극하고, 조작하고 (예를 들어 녹아웃 및/또는 넉킹 인), 형질도입하고, 형질감염시키고, 배양하고, 증폭하고, 수확하고/하거나 제형화하는 임의의 단계 전에 냉동, 예를 들어 동결 보존되고/되거나 동결 보호된다. 샘플로부터의 세포의 극저온 저장 및 처리를 위한 예시적 방법 및 시스템, 예를 들어 성분채집술 샘플은 국제공개공보 제WO2018/170188호에 기술된 것들을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법 및 시스템은 환자가 세포 요법을 필요로 하기 전에 성분채집술 샘플을 수집한 다음, 재조합 수용체(예를 들어 CAR)로 상기 세포, 예를 들어 T 세포를 조작하는 공정에서 나중에 사용하기 위해 상기 성분채집술 샘플을 동결 보존에 적용시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 상기 공정은 본원에서 기술된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 성분채집술 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은 공여자(예를 들어 개별 공여자 또는 복수의 상이한 공여자)로부터 수집되고, 세포들의 집단의 후속 T 세포 선택, 활성화, 자극, 파괴(예를 들어 녹아웃), 조작(예를 들어 넉킹 인), 형질도입, 형질감염, 인큐베이션, 배양, 수확, 제형화, 및/또는 대상체에 제형화된 세포 집단의 투여 이전에 저온 저장된다. 이러한 구체예에서, 동결 보존된 성분채집술 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은 상기 샘플(예를 들어 공여자 샘플)을 하나 이상의 선택 단계, 예를 들어 본원에 기술된 임의의 것에 적용시키기 전에 해동된다.
일부 구현예에서, 세포들의 동결 보존되고/되거나 동결 보호된 샘플(예를 들어 공여자 샘플, 예를 들어 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 샘플), 예를 들어 사전 세포 선택에 적용되지 않은(예를 들어 크로마토그래피에 의한 선택과 같은 사전 T 세포 선택 없는) 세포의 샘플은 세포 요법을 위한 세포 집단, 예를 들어 CAR+ T 세포를 함유하는 T 세포 집단의 제조를 위한 다운스트림 공정에 사용하기 전에 해동된다. 일부 구현예에서, 그와 같은 세포들의 동결 보존되고/되거나 동결 보호된 샘플(예를 들어 공여자 샘플, 예를 들어 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 샘플)은, 조작된 T 세포 요법, 예를 들어 CAR+ T 세포 요법을 위해 본원에서 제공된 방법과 관련하여 사용된다. 특정 구체예에서, 상기 수확/제형화 단계들 이전 또는 도중에 추가의 동결 보존 단계는 수행되지 않는다.
일부 구현예에서, 동결 보존되고/되거나 동결 보호된 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물(예를 들어 공여자 샘플)이 해동된다. 일부 구현예에서, 해동된 세포 조성물은, 일부 경우에 원치 않거나 바람직하지 않은 성분을 제거 또는 감소시킬 수 있는 희석(예를 들어 무혈청 배지 이용) 및/또는 세척(예를 들어 무혈청 배지 이용)의 대상이 된다. 일부 경우에, 희석 및/또는 세척은, 그렇지 않으면 연장된 실온 노출 시 세포의 생존 능력, 수율, 회수에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 해동 샘플에 함유된 동결 보호제, 예를 들어 DMSO의 존재를 제거하거나 감소시킨다. 일부 구현예에서, 희석 및/또는 세척은, 무혈청 배지, 예를 들어 국제출원 PCT/US2018/064627에 기재된 것으로 해동된 동결 보존 생성물의 배지 교환을 가능하게 하며, 상기 국제출원은 본원에서 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 보충물로 보충된 기본 배지(예를 들어 OpTmizer™ T-세포 증폭 기본 배지(ThermoFisher))를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 보충물는 무혈청이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는, 예를 들어 추가 보충물(예를 들어 OpTmizer™ T-세포 증폭 보충물(ThermoFisher))에 의해 제공되는 세포의 유지, 증폭 및/또는 활성화를 위한 하나 이상의 추가 성분으로 보충된 기본 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 혈청 대체 보충물, 예를 들어 면역 세포 혈청 대체제, 예를 들어 ThermoFisher, #A2596101, CTS™ 면역 세포 혈청 대체제 또는 문헌[Smith 등, Clin Transl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31]에 기재된 면역 세포 혈청 대체제를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 유리 형태의 아미노산, 예를 들어 L-글루타민을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 디펩티드 형태의 L-글루타민(예를 들어 L-알라닐-L-글루타민), 예를 들어 Glutamax™(ThermoFisher)의 디펩티드를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 재조합 사이토카인, 예를 들어 재조합 인간 IL-2, 재조합 인간 IL-7 및/또는 재조합 인간 IL-15를 더 포함한다.
C. CD57- T 세포의 선택 및/또는 CD57+ T 세포의 고갈
일부 구현예에서, CD57-농축된 집단(풀링된 CD57-농축된 T 세포 집단 및/또는 CD57-농축된 T 세포 집단)은 생물학적 샘플(예를 들어 공여자 샘플)로부터 수득된다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD57-농축된 T 세포 집단 및/또는 CD57-농축된 T 세포 집단은 생물학적 샘플(예를 들어 공여자 샘플)로부터 선택, 분리, 또는 농축된다. 일부 구현예에서, 공여자 샘플은 개별 공여자 유래 샘플이다. 일부 구현예에서, 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자로부터의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상이한 개별 공여자로부터의 각각의 복수의 샘플이 조합되어 공여자 샘플을 생성한다.
일부 구현예에서, 공여자 샘플은 개별 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자 유래 공여자 샘플은 CD57- T 세포에 대해 농축되어 CD57-농축된 T 세포 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 개별 공여자로부터의 CD57-농축된 T 세포 집단이 조합되어 풀링된 CD57-농축된 T 세포 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자로부터의 공여자 샘플은 CD57- T 세포에 대해 농축되어 풀링된 CD57- T 세포 집단을 생산한다.
특정 구현예에서, CD57+ T 세포는 생물학적 샘플(예를 들어 공여자 샘플)로부터 제거되거나, 분리되거나, 또는 고갈된다. 특정 구현예에서, 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 99.9%의 CD57+ T 세포가 공여자 샘플로부터 제거되거나, 분리되거나, 또는 고갈된다.
특정 구현예에서, 공여자 샘플로부터 CD57- T 세포를 선택하거나, 분리하거나, 또는 농축하기 전에 공여자 샘플로부터 세포의 서브세트, 예를 들어 T 세포의 서브세트가 선택, 분리, 또는 농축된다. 일부 구현예에서, 세포의 서브세트, 예를 들어 T 세포는 농축된 CD57- T 세포의 집단으로부터 선택, 분리, 또는 농축된다.
일부 구현예에서, 풀링된 CD57-농축된 T 세포 집단 및/또는 CD57-농축된 T 세포 집단은 예를 들어 선택, 분리, 또는 농축 전에 공여자 샘플의 CD57+ T 세포를 약 또는 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01%, 또는 0.001% 미만 함유한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단은 공여자 샘플의 CD57+ T 세포를 약 또는 20% 미만 함유한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단은 공여자 샘플의 CD57+ T 세포를 약 또는 5% 미만 함유한다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단은 공여자 샘플의 CD57+ T 세포를 약 또는 1% 미만 함유한다. 다양한 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단은 공여자 샘플의 CD57+ T 세포를 약 또는 0.1% 미만 함유한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단은 공여자 샘플의 CD57+ T 세포를 약 또는 0.01% 미만 함유한다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단 내의 CD57+ T 세포의 빈도는 공여자 샘플 내의 CD57+ T 세포의 빈도의 (약) 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1%, 또는 0.1% 미만이다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 3% 미만, (약) 2% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만, 또는 (약) 0.01% 미만의 CD57+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단은 CD57+ T 세포를 함유하지 않거나 또는 본질적으로 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단은 공여자 샘플의 세포와 비교하여 하나 이상의 분자의 발현에서 더 낮은 변동 계수(oefficient of variation; CV)를 나타낸다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자는 나이브 T 세포, 임의로 CD27, Ki67, CD25, CD28, CCR7, 및/또는 CD45RA의 마커이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자는 CD27이다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단은 CD27의 발현에서 더 낮은 CV를 나타낸다.
특정 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포는 공여자 샘플의 세포보다 덜 분화된다(예를 들어 선택, 분리, 또는 농축 전에). 특정 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단은 공여자 샘플보다 더 높은 빈도의 나이브-유사 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단은 공여자 샘플보다 (약) 또는 적어도 (약) 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배 초과의 나이브-유사 세포를, 예를 들어 선택, 분리, 또는 농축 전에 포함한다.
일부 구현예에서, 나이브-유사 세포는 나이브 T 세포 또는 중심 기억 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 세포는 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ T 세포의 양성 또는 높은 수준을 발현하는 세포를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 세포는 CD27+이다. 일부 측면에서, 세포는 CD28+이다. 일부 측면에서, 세포는 CCR7+이다. 특정 측면에서, CCR7은 나이브 또는 나이브-유사 T 세포(예를 들어 CCR7+CD45RA+ 또는 CCR7+CD27+) 및 중심 기억 T 세포 (CCR7+CD45RA-)에 의해 발현된다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포 또는 나이브-유사 T 세포 상에서 발현된 마커에 대해 표면 양성인 T 세포는 CCR7+CD45RA+이고, 여기서 세포는 CD27+ 또는 CD27-이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포 또는 나이브-유사 T 세포 상에서 발현된 마커에 대해 표면 양성인 T 세포는 CD27+CCR7+이고, 여기서 세포는 CD45RA+ 또는 CD45RA-이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포 또는 나이브-유사 T 세포 상에서 발현된 마커에 대해 표면 양성인 T 세포는 CD62L-CCR7+이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 세포는 분화의 초기 단계의 세포(예를 들어 CCR7+CD27+인 세포)를 포함한다.
특정 구현예에서, 중앙 기억 T 세포는 다양한 분화 단계에서 세포를 포함할 수 있으며 특정 세포 마커의 양성 또는 고 발현(예를 들어 표면 발현) 및/또는 다른 세포 마커의 음성 또는 저 발현(예를 들어 표면 발현)에 의해서 특징지워질 수 있다. 일부 측면에서, 덜 분화된 세포, 예를 들어 중앙 기억 세포는 보다 오래 살아남고 덜 신속하게 고갈(exhaust)됨으로써 지속성 및 내구성을 증가시킬 수 있다. 일부 측면에서, 세포 요법, 예를 들어 CAR-T 세포 요법에 대한 반응자(responder)는 중앙 기억 유전자의 발현을 증가시켰다[문헌 「Fraietta 등, (2018) Nat Med. 24(5):563-571」 참조]. 일부 측면에서, 중앙 기억 T 세포는 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, 및/또는 CD127의 양성 또는 고 발현에 의해서 특징지워진다. 일부 측면에서, 중앙 기억 T 세포는 CD45RA 및/또는 그란자임 B(granzyme B)의 음성 또는 저 발현에 의해서 특징지워진다. 특정 구현예에서, 중앙 기억 T 세포 또는 중앙 기억 T 세포 위에 발현된 마커에 표면 양성인 T 세포는 CCR7+CD45RA-이다.
특정 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈 T 세포 집단은 예를 들어 선택, 분리, 또는 농축 전에 생물학적 샘플보다 (약), 또는 적어도 (약) 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배 더 많은 CD27+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈 T 세포 집단은 예를 들어 선택, 분리, 또는 농축 전에 생물학적 샘플보다 (약), 또는 적어도 (약) 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배 더 많은 CD28+ T 세포를 포함한다. 다양한 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈 T 세포 집단은 예를 들어 선택, 분리, 또는 농축 전에 생물학적 샘플보다 (약), 또는 적어도 (약) 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배 더 많은 CD25+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈 T 세포 집단은 예를 들어 선택, 분리, 또는 농축 전에 생물학적 샘플보다 (약), 또는 적어도 (약) 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배 더 많은 CCR7+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈 T 세포 집단은 예를 들어 선택, 분리, 또는 농축 전에 생물학적 샘플보다 (약), 또는 적어도 (약) 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배 더 많은 CD45RA+ 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, T 세포, 예를 들어 CD3+ T 세포는 공여자 샘플로부터 CD57- T 세포를 선택, 분리 또는 농축하기 전에 공여자 샘플로부터 선택, 분리 또는 농축된다. 일부 구현예에서, T 세포, 예를 들어 CD3+ T 세포는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단으로부터 선택, 분리 또는 농축된다. 특정 구현예에서, T 세포, 예를 들어 CD3+ T 세포를 선택, 분리 또는 농축하는 것은 공여자 샘플로부터의 세포의 양성 선택을 수반한다.
일부 구현예에서, CD57+ 세포는 공여자 샘플, 세포 조성물 또는 세포 집단으로부터 선택, 분리 또는 농축되고, 그에 의해서 분리 또는 선택된 CD57+ 세포 및 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생산한다.
특정 구현예에서, CD3+T 세포는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD57- CD3+ T 세포의 집단 및 농축된 CD57- 세포의 비-선택된 집단을 생산한다. 특정 구현예에서, CD3+T 세포는 농축된 CD57- 세포의 비-선택된 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD57-CD3+ T 세포의 집단을 생산한다. 다양한 구현예에서, CD3+ T 세포는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD57- CD3+ T 세포의 집단 및 CD57- 세포에 대해 농축된 비-선택된 집단을 생산하고, 이어서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포는 농축된 CD57- 세포의 비-선택된 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD57-CD4+ T 세포 또는 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 생산한다.
특정 구현예에서, T 세포, 예를 들어 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 서브세트는 공여자 샘플로부터 CD57- T 세포를 선택, 분리 또는 농축하기 전에 공여자 샘플로부터 선택, 분리 또는 농축된다. 일부 구현예에서, T 세포, 예를 들어 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 서브세트는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단으로부터 선택, 분리 또는 농축된다. 특정 구현예에서, T 세포, 예를 들어 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 서브세트를 선택, 분리 또는 농축하는 것은 샘플로부터의 세포의 양성 선택을 수반한다.
일부 구현예에서, CD57+ 세포는 공여자 샘플, 세포 조성물 또는 세포 집단으로부터 선택, 분리 또는 농축되고, 그에 의해서 분리 또는 선택된 CD57+ 세포 및 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생산한다. 특정 구현예에서, CD57+ 세포는 생물학적 샘플로부터 선택, 분리 또는 농축되고, 그에 의해서 분리 또는 선택된 CD57+ 세포 및 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생산한다.
특정 구현예에서, CD4+ T 세포는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단 및 CD57- 세포에 대해 농축된 비-선택된 집단을 생산한다. 특정 구현예에서, CD8+ T 세포는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD57- CD8+ T 세포의 집단 및 농축된 CD57- 세포의 비-선택된 집단을 생산한다. 특정 구현예에서, CD8+ T 세포는 농축된 CD57- 세포의 비-선택된 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 생산한다. 특정 구현예에서, CD4+ T 세포는 농축된 CD57- 세포의 비-선택된 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단을 생산한다.
특정 구현예에서, CD4+ T 세포는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단 및 CD57- 세포에 대해 농축된 비-선택된 집단을 생산하고, 이어서 CD8+ T 세포는 농축된 CD57- 세포의 비-선택된 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 생산한다. 다양한 구현예에서, CD4+ T 세포는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단 및 CD57- 세포에 대해 농축된 비-선택된 집단을 생산하고, 이어서 CD8+ T 세포는 농축된 CD57- 세포의 비-선택된 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 생산한다.
특정 구현예에서, (1) CD4+ T 세포는 공여자 샘플로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD4+ T 세포의 집단 및 CD4- 세포에 대해 농축된 비-선택된 집단을 생산하고; (2) CD8+ T 세포는 농축된 CD4- 세포의 비-선택된 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD8+ T 세포의 집단을 생산하고; (3) CD57+ T 세포는 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단으로부터 고갈되고, 농축된 CD57-CD4+ 및 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 생산한다. 특정 구현예에서, (1) CD8+ T 세포는 공여자 샘플로부터 농축, 선택, 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD8+ T 세포의 집단 및 CD8- 세포에 대해 농축된 비-선택된 집단을 생산하고; (2) CD4+ T 세포는 농축된 CD4- 세포의 비-선택된 집단으로부터 농축, 선택, 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD4+ T 세포의 집단을 생산하고; (3) CD57+ T 세포는 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단으로부터 고갈되고, 농축된 CD57-CD4+ 및 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 생산한다.
특정 구현예에서, CD4+ T 세포는 공여자 샘플로부터 농축, 선택, 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD4+ T 세포의 집단을 생산하고, 이어서 CD57+ 세포는 농축된 CD4+ T 세포의 집단으로부터 제거되고, 그에 의해서 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단을 생산한다. 특정 구현예에서, CD8+ T 세포는 공여자 샘플로부터 농축, 선택, 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD8+ T 세포의 집단을 생산하고, 이어서 CD57+ 세포는 농축된 CD8+ T 세포의 집단으로부터 제거되고, 그에 의해서 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 생산한다.
일부 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단은 분리, 선택 및/또는 농축 후에 동결, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 보호된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단은 분리, 선택 및/또는 농축 후에 동결, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 보호된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단은 분리, 선택 및/또는 농축 후에 동결, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 보호된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단은 분리, 선택 및/또는 농축 후에 동결, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 보호된다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단은 인큐베이션, 활성화, 자극, 조작(예를 들어 녹아웃 및/또는 넉킹 인), 형질도입, 형질감염, 배양, 증폭, 수확 및/또는 제형화의 임의의 단계 전에 동결, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 보호된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단은 인큐베이션, 활성화, 자극, 조작(예를 들어 녹아웃 및/또는 넉킹 인), 형질도입, 형질감염, 배양, 증폭, 수확 및/또는 제형화의 임의의 단계 전에 동결, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 보호된다. 일부 구현예에서, 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단은 인큐베이션, 활성화, 자극, 조작(예를 들어 녹아웃 및/또는 넉킹 인), 형질도입, 형질감염, 배양, 증폭, 수확 및/또는 제형화의 임의의 단계 전에 동결, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 보호된다. 일부 구현예에서, 농축된 CD57-CD3+ T 세포의 집단은 세포의 집단을 인큐베이션, 활성화, 자극, 조작(예를 들어 녹아웃 및/또는 넉킹 인), 형질도입, 형질감염, 배양, 증폭, 수확 및/또는 제형화하는 임의의 단계 전에 동결, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 보호된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 동결 보호된 투입 조성물은 예를 들어 (약) -80℃에서 12 시간 내지 7 일, 24 시간 내지 120 시간, 또는 2 일 내지 5 일 동안 저장된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 동결 보호된 투입 조성물은 (약) -80℃에서 10 일, 9 일, 8 일, 7 일, 6 일, 또는 5 일, 4 일, 3 일, 2 일, 또는 1 일 미만의 시간 동안 저장된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 동결 보호된 투입 조성물은 (약) -70℃ 내지 -80℃에서 3 일 미만 동안, 예를 들어 약 2 일 동안 저장된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 특정 세포 유형 또는 세포 집단을 지칭할 때 "고갈" 또는 "제거"는 예를 들어 조성물의 총 세포 수 또는 부피와 비교하여, 또는 다른 세포 유형에 비해, 예를 들어 집단 또는 세포에 의해 발현된 마커에 기초한 음성 선택에 의해, 또는 고갈될 세포 집단 또는 세포 상에 존재하지 않는 마커에 기초한 양성 선택에 의해 세포 유형 또는 집단의 수 또는 백분율을 감소시키는 것을 지칭한다. 일반적으로, 용어 고갈 또는 제거는 조성물로부터 세포, 세포 유형 또는 집단의 완전한 제거를 필요로 하지 않는다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 특정 세포 유형 또는 세포 집단을 지칭할 때 "고갈"은 예를 들어 조성물의 총 세포 수 또는 부피와 비교하여, 또는 다른 세포 유형에 비해, 예를 들어 집단 또는 세포에 의해 발현된 마커에 기초한 양성 선택에 의해, 또는 고갈될 세포 집단 또는 세포 상에 존재하지 않는 마커에 기초한 음성 선택에 의해 세포 유형 또는 집단의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 지칭한다. 일반적으로, 용어 농축은 조성물로부터 다른 세포, 세포 유형 또는 집단의 완전한 제거를 필요로 하지 않고, 이렇게 농축된 세포에 대해 농축된 조성물에서 또는 심지어 거의 100%로 존재하도록 하는 것을 필요로 하지 않는다.
일부 측면에서, 세포 요법, 예를 들어 입양 세포 요법을 위해 공여자, 예를 들어 인간 공여자로부터 수득된 세포 집단 또는 세포 조성물은 낮은 성장 또는 느린 성장을 나타낼 수 있어서, 이들은 치료 조성물을 생성하기 위한 수확 세포(예를 들어 수확 기준)에 대한 임계값에 도달하지 않거나(예를 들어 성장 없음), 또는 특정 기간(예를 들어 느린 성장) 내에 치료 조성물을 생성하기 위한 수확 세포(예를 들어 수확 기준)에 대한 임계값에 도달하지 않는다. 일부 측면에서, 이러한 세포 집단의 일부는 높은 빈도의 CD57+ 세포, 예를 들어 임계값 초과의 CD57+의 빈도를 함유할 수 있다. 다른 측면에서, 세포 요법, 예를 들어 입양 세포 요법을 위한 공여자, 예를 들어 인간 공여자로부터 수득된 세포 집단 또는 세포 조성물은 성장 없음 또는 느린 성장을 나타내는 집단과 비교하여 개선된 성장을 나타낼 수 있다. 일부 측면에서, 이러한 세포 집단 또는 세포 조성물은 낮은 빈도의 CD57+ 세포, 예를 들어 임계값보다 적은 빈도의 CD57+ 세포를 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 개선된 성장을 나타내는 세포 집단 또는 세포 조성물은 표현형을 나타내거나 또는 나이브-유사 또는 중심 기억-유사 표현형, 예를 들어 CD27+, CD28+ 및/또는 CCR7+와 연관된 마커를 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 인간으로부터의 공여자 샘플(예를 들어 백혈구성분채집술 또는 성분채집술 샘플) 내의 T 세포 중에서 CD57+ T 세포 발현의 가변성 또는 이종성이 있다는 관찰에 기초하며, 이는 일부 측면에서, 동일한 제조 공정을 사용하는 경우에도, 복수의 상이한 공여자로부터의 입양 세포 요법에 사용하기 위해 생산된 조작된 T 세포 조성물의 표현형 및 기능의 가변성을 초래할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 방법은 공여자 샘플로부터 CD57+ T 세포를 선택하는 것, 분리하는 것, 또는 농축하는 것에 의해, 예를 들어 공여자 샘플로부터 CD57+ T 세포를 제거하는 것, 분리하는 것, 또는 고갈시키는 것에 의해 이러한 가변성을 제어하거나 또는 감소시킨다. 이어서, 이러한 세포는 세포 요법을 위한 세포를 조작하거나 또는 제조하기 위한 공정에서 사용되어 생성물 사이의 가변성을 최소화하면서, 또한 특정 생성물 속성 및 특징, 예를 들어 대상체에게의 투여 시에 확장 및 지속되는 능력을 개선할 수 있다.
D. CD27+ T 세포의 선택 및/또는 CD27+ T 세포의 고갈
일부 구현예에서, CD27+ 농축된 집단(풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단)은 생물학적 샘플(예를 들어 공여자 샘플)로부터 수득된다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단은 생물학적 샘플(예를 들어 공여자 샘플)로부터 선택, 분리, 또는 농축된다. 일부 구현예에서, 공여자 샘플은 개별 공여자 유래 샘플이다. 일부 구현예에서, 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자로부터의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상이한 개별 공여자로부터의 각각인 복수의 샘플은 공여자 샘플을 생성하도록 조합된다.
일부 구현예에서, 공여자 샘플은 개별 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자 유래 공여자 샘플은 CD27+ T 세포에 대해 농축되어 CD27 농축된 T 세포 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 개별 공여자로부터의 CD27 농축된 T 세포 집단은 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생산하도록 조합된다. 일부 구현예에서, 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자로부터의 공여자 샘플은 CD27+ T 세포가 농축되어 풀링된 CD27+ T 세포 집단을 생산한다.
특정 구현예에서, CD27- T 세포는 생물학적 샘플(예를 들어 공여자 샘플)로부터 제거, 분리 또는 고갈된다. 특정 구현예에서, 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 99.9%의 CD27- T 세포가 공여자 샘플로부터 제거, 분리 또는 고갈된다.
특정 구현예에서, 공여자 샘플로부터 CD27+ T 세포를 선택, 분리 또는 농축하기 전에 공여자 샘플로부터 세포의 서브세트, 예를 들어 T 세포의 서브세트가 선택, 분리 또는 농축된다. 일부 구현예에서, 세포의 서브세트, 예를 들어 T 세포는 농축된 CD27+ T 세포의 집단으로부터 선택, 분리 또는 농축된다.
일부 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단은 예를 들어 선택, 분리 또는 농축 전에 공여자 샘플의 CD27- T 세포를 약 또는 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01% 또는 0.001% 미만으로 함유한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단은 공여자 샘플의 CD27- T 세포를 약 또는 20% 미만으로 함유한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단은 공여자 샘플의 CD27- T 세포를 약 또는 5% 미만으로 함유한다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단은 예를 들어 선택, 분리 또는 농축 전에 공여자 샘플의 CD27- T 세포를 약 또는 1% 미만으로 함유한다. 다양한 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단은 공여자 샘플의 CD27- T 세포를 약 또는 0.1% 미만으로 함유한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단은 공여자 샘플의 CD27- T 세포를 약 또는 0.01% 미만으로 함유한다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단 내의 CD27- T 세포의 빈도는 공여자 샘플 내의 CD27- T 세포의 빈도의 (약) 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만이다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 3% 미만, (약) 2% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만, 또는 (약) 0.01% 미만의 CD27- T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단은 CD27- T 세포가 부재이거나 본질적으로 부재이다.
일부 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단은 공여자 샘플의 세포의 것과 비교하여 하나 이상의 분자의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타낸다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자는 나이브 T 세포의 마커, 임의로 Ki67, CD25, CD28, CCR7, 및/또는 CD45RA이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 분자는 Ki67이다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포는 Ki67의 발현에서 더 낮은 CV를 나타낸다.
특정 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포는 예를 들어 선택, 분리, 또는 농축 전에 공여자 샘플의 세포보다 덜 분화된다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단은 공여자 샘플보다 더 큰 빈도의 나이브-유사 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단은 예를 들어 선택, 분리, 또는 농축 전에 공여자 샘플보다 나이브-유사 세포를 적어도 (약) 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배 더 많이 포함한다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 세포는 나이브 T 세포 또는 중심 기억 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 세포는 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ T 세포의 양성 또는 높은 수준을 발현하는 세포를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 세포는 CD28+이다. 일부 측면에서, 세포는 CCR7+이다. 특정 측면에서, CCR7은 나이브 또는 나이브-유사 T 세포(예를 들어 CCR7+CD45RA+ 또는 CCR7+CD27+) 및 중심 기억 T 세포 (CCR7+CD45RA-)에 의해 발현된다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포 또는 나이브-유사 T 세포 상에서 발현된 마커에 대해 표면 양성인 T 세포는 CCR7+CD45RA+이고, 여기서 세포는 CD27+ 또는 CD27-이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포 또는 나이브-유사 T 세포 상에서 발현된 마커에 대해 표면 양성인 T 세포는 CD27+CCR7+이고, 여기서 세포는 CD45RA+ 또는 CD45RA-이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포 또는 나이브-유사 T 세포 상에서 발현된 마커에 대해 표면 양성인 T 세포는 CD62L-CCR7+이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 세포는 분화의 초기 단계의 세포(예를 들어 CCR7+CD27+인 세포)를 포함한다.
특정 구현예에서, 중심 기억 T 세포는 다양한 분화 상태의 세포를 포함할 수 있고, 특정 세포 마커의 양성 또는 높은 발현 (예를 들어 표면 발현) 및/또는 다른 세포 마커의 음성 또는 낮은 발현 (예를 들어 표면 발현)을 특징으로 할 수 있다. 일부 측면에서, 덜 분화된 세포, 예를 들어 중심 기억 세포는 더 오래 생존하고 덜 신속하게 고갈되고, 그에 의해서 지속성 및 내구성이 증가된다. 일부 측면에서, 세포 요법, 예를 들어 CAR-T 세포 요법에 대한 반응자는 중심 기억 유전자의 증가된 발현을 갖는다. 예를 들어 문헌 [Fraietta 등, (2018) Nat Med. 24(5):563-571]을 참조한다. 일부 측면에서, 중심 기억 T 세포는 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, 및/또는 CD127의 양성 또는 높은 발현을 특징으로 한다. 일부 측면에서, 중심 기억 T 세포는 CD45RA 및/또는 그랜자임 B의 음성 또는 낮은 발현을 특징으로 한다.
특정 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된T 세포 집단은 생물학적 샘플, 예를 들어 선택, 분리, 또는 농축 전에 CD57+ T 세포를 (약) 또는 적어도 (약) 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배 더 포함한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된T 세포 집단은 생물학적 샘플, 예를 들어 선택, 분리, 또는 농축 전에 CD28+ T 세포를 (약) 또는 적어도 (약) 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배 더 포함한다. 다양한 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단은 예를 들어 선택, 분리 또는 농축 전에 생물학적 샘플보다 (약) 또는 적어도 (약) 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배 또는 10-배 더 많은 CD25+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단은 예를 들어 선택, 분리 또는 농축 전에 생물학적 샘플보다 (약) 또는 적어도 (약) 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배 또는 10-배 더 많은 CCR7+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단은 예를 들어 선택, 분리 또는 농축 전에 생물학적 샘플보다 (약) 또는 적어도 (약) 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배 또는 10-배 더 많은 CD45RA+ 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, T 세포, 예를 들어 CD3+ T 세포는 공여자 샘플로부터 CD27+ T 세포를 선택, 분리 또는 농축하기 전에 공여자 샘플로부터 선택, 분리 또는 농축된다. 일부 구현예에서, T 세포, 예를 들어 CD3+ T 세포는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단으로부터 선택, 분리, 또는 농축된다. 특정 구현예에서, T 세포, 예를 들어 CD3+ T 세포의 선택, 분리 또는 농축은 공여자 샘플로부터의 세포의 양성 선택을 수반한다.
일부 구현예에서, CD27- 세포는 공여자 샘플, 세포 조성물 또는 세포 집단으로부터 선택, 분리, 또는 농축되고, 그에 의해서 분리 또는 선택된 CD27- 세포 및 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단을 생산한다.
특정 구현예에서, CD3+ T 세포는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD27+ CD3+ T 세포의 집단 및 농축된 CD27+ 세포의 비-선택된 집단을 생산한다. 특정 구현예에서, CD3+ T 세포는 농축된 CD27+ 세포의 비-선택된 집단으로부터 농축되거나, 선택되거나, 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD27+CD3+ T 세포의 집단이 생성된다. 다양한 구현예에서, CD3+ T 세포는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD27+ CD3+ T 세포의 집단 및 CD27+ 세포에 대해 농축된 비-선택된 집단을 생산하고, 이어서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포는 농축된 CD27+ 세포의 비-선택된 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD27+CD4+ T 세포 또는 CD27+ CD8+ T 세포의 집단을 생산한다.
특정 구현예에서, T 세포, 예를 들어 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 서브세트는 공여자 샘플로부터 CD27+ T 세포를 선택, 분리 또는 농축하기 전에 공여자 샘플로부터 선택, 분리 또는 농축된다. 일부 구현예에서, T 세포, 예를 들어 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 서브세트는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단으로부터 선택, 분리 또는 농축된다. 특정 구현예에서, T 세포, 예를 들어 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 서브세트를 선택, 분리 또는 농축하는 것은 샘플로부터 세포의 양성 선택을 수반한다.
일부 구현예에서, CD27- 세포는 공여자 샘플, 세포 조성물 또는 세포 집단으로부터 선택, 분리 또는 농축되고, 그에 의해서 분리 또는 선택된 CD27- 세포 및 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단을 생산한다. 특정 구현예에서, CD27- 세포는 생물학적 샘플로부터 선택, 분리 또는 농축되고, 그에 의해서 분리 또는 선택된 CD27- 세포 및 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단을 생산한다.
특정 구현예에서, CD4+ T 세포는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD27+CD4+ T 세포의 집단 및 CD27+ 세포에 대해 농축된 비-선택된 집단을 생산한다. 특정 구현예에서, CD8+ T 세포는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD27+ CD8+ T 세포의 집단 및 농축된 CD27+ 세포의 비-선택된 집단을 생산한다. 특정 구현예에서, CD8+ T 세포는 농축된 CD27+ 세포의 비-선택된 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD27+ CD8+ T 세포의 집단을 생산한다. 특정 구현예에서, CD4+ T 세포는 농축된 CD27+ 세포의 비-선택된 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD27+CD4+ T 세포의 집단을 생산한다.
특정 구현예에서, CD4+ T 세포는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD27+CD4+ T 세포의 집단 및 CD27+ 세포에 대해 농축된 비-선택된 집단을 생산하고, 이어서 CD8+ T 세포는 농축된 CD27+ 세포의 비-선택된 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD27+CD8+ T 세포의 집단을 생산한다. 다양한 구현예에서, CD4+ T 세포는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD27+CD4+ T 세포의 집단 및 CD27+ 세포에 대해 농축된 비-선택된 집단을 생산하고, 이어서 CD8+ T 세포는 농축된 CD27+ 세포의 비-선택된 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD27+CD8+ T 세포의 집단을 생산한다.
특정 구현예에서, (1) CD4+ T 세포는 공여자 샘플로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD4+ T 세포의 집단 및 CD4- 세포에 대해 농축된 비-선택된 집단을 생산하고; (2) CD8+ T 세포는 농축된 CD4- 세포의 비-선택된 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD8+ T 세포의 집단을 생산하고; (3) CD27+ T 세포는 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD27+CD4+ 및 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 생산한다. 특정 구현예에서, (1) CD8+ T 세포는 공여자 샘플로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD8+ T 세포의 집단 및 CD8- 세포에 대해 농축된 비-선택된 집단을 생산하고; (2) CD4+ T 세포는 농축된 CD4- 세포의 비-선택된 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD4+ T 세포의 집단을 생산하고; (3) CD27+ 세포는 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD27+CD4+ 및 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 생산한다.
특정 구현예에서, CD4+ T 세포는 공여자 샘플로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD4+ T 세포의 집단을 생산하고, 이어서 CD27+ 세포는 농축된 CD4+ T 세포의 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD27+CD4+ T 세포의 집단을 생산한다. 특정 구현예에서, CD8+ T 세포는 공여자 샘플로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD8+ T 세포의 집단을 생산하고, 이어서 CD27+ 세포는 농축된 CD8+ T 세포의 집단으로부터 농축, 선택 또는 분리되고, 그에 의해서 농축된 CD27+CD8+ T 세포의 집단을 생산한다.
일부 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단은 분리, 선택 및/또는 농축 후에 동결, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 보호된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD27+CD4+ T 세포의 집단은 분리, 선별 및/또는 농축 후에 동결, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 보호된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD27+ CD8+ T 세포의 집단은 분리, 선별 및/또는 농축 후에 동결, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 보호된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD27+ CD3+ T 세포의 집단은 분리, 선별 및/또는 농축 후에 동결, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 보호된다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단은 세포의 집단을 인큐베이션, 활성화, 자극, 조작(예를 들어 녹아웃 및/또는 넉킹 인), 형질도입, 형질감염, 배양, 증폭, 수확 및/또는 제형화하는 임의의 단계 전에 동결, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 보호된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD27+CD4+ T 세포의 집단은 세포의 집단을 인큐베이션, 활성화, 자극, 조작(예를 들어 녹아웃 및/또는 넉킹 인), 형질도입, 형질감염, 배양, 증폭, 수확 및/또는 제형화하는 임의의 단계 전에 동결, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 보호된다. 일부 구현예에서, 농축된 CD27+ CD8+ T 세포의 집단은 세포의 집단을 인큐베이션, 활성화, 자극, 조작(예를 들어 녹아웃 및/또는 넉킹 인), 형질도입, 형질감염, 배양, 증폭, 수확 및/또는 제형화하는 임의의 단계 전에 동결, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 보호된다. 일부 구현예에서, 농축된 CD27+ CD3+ T 세포의 집단은 세포의 집단을 인큐베이션, 활성화, 자극, 조작(예를 들어 녹아웃 및/또는 넉킹 인), 형질도입, 형질감염, 배양, 증폭, 수확 및/또는 제형화하는 임의의 단계 전에 동결, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 보호된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 동결 보호된 투입 조성물은 예를 들어 (약) -80℃에서 12 시간 내지 7 일, 24 시간 내지 120 시간, 또는 2 일 내지 5 일 동안 저장된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 동결 보호된 투입 조성물은 10 일, 9 일, 8 일, 7 일, 6 일, 또는 5 일, 4 일, 3 일, 2 일, 또는 1 일 미만의 시간 동안 (약) -80℃에서 저장된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 동결 보호된 투입 조성물은 3 일 미만 동안, 예를 들어 약 2 일 동안 (약) -70℃ 또는 -80℃에서 저장된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 특정 세포 유형 또는 세포 집단을 지칭할 때 "고갈" 또는 "제거"는, 예를 들어 조성물의 총 세포 수 또는 부피와 비교하여, 또는 다른 세포 유형에 비해, 예를 들어 집단 또는 세포에 의해 발현된 마커에 기초한 음성 선택에 의해, 또는 고갈될 세포 집단 또는 세포 상에 존재하지 않는 마커에 기초한 양성 선택에 의해, 세포 유형 또는 집단의 수 또는 백분율을 감소시키는 것을 지칭한다. 일반적으로, 용어 고갈 또는 제거는 조성물로부터 세포, 세포 유형 또는 집단의 완전한 제거를 필요로 하지 않는다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 특정 세포 유형 또는 세포 집단을 지칭할 때 "농축"은, 예를 들어 조성물의 총 세포수 또는 부피와 비교하여, 또는 다른 세포 유형에 비해, 예를 들어 집단 또는 세포에 의해 발현된 마커에 기초한 양성 선택에 의해, 또는 고갈될 세포 집단 또는 세포 상에 존재하지 않는 마커에 기초한 음성 선택에 의해, 세포 유형 또는 집단의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 지칭한다. 일반적으로, 용어 농축은 조성물로부터 다른 세포, 세포 유형 또는 집단의 완전한 제거를 필요로 하지 않고, 이렇게 농축된 세포에 대해 농축된 조성물 중에 또는 (심지어 거의) 100%로 존재하도록 하는 것을 필요로 하지 않는다.
일부 측면에서, 세포 요법, 예를 들어 입양 세포 요법을 위해 공여자, 예를 들어 인간 공여자로부터 수득된 세포 집단 또는 세포 조성물은 낮은 성장 또는 느린 성장을 나타낼 수 있어서, 그들은 치료 조성물을 생성하기 위한 수확 세포(예를 들어 수확 기준)에 대한 임계값에 도달하지 않거나 (예를 들어 성장 없음), 또는 특정 기간 (예를 들어 느린 성장) 내에 치료 조성물을 생성하기 위한 수확 세포(예를 들어 수확 기준)에 대한 임계값에 도달하지 않는다. 일부 측면에서, 이러한 세포 집단 중 일부는 높은 빈도의 CD27- 세포, 예를 들어 임계값보다 높은 빈도의 CD27- 세포를 함유할 수 있다. 다른 측면에서, 세포 요법, 예를 들어 입양 세포 요법을 위해 공여자, 예를 들어 인간 공여자로부터 수득된 세포 집단 또는 세포 조성물은 성장 없음 또는 느린 성장을 나타내는 집단과 비교하여 개선된 성장을 나타낼 수 있다. 일부 측면에서, 이러한 세포 집단 또는 세포 조성물은 낮은 빈도의 CD27- 세포, 예를 들어 임계값보다 낮은 빈도의 CD27- 세포를 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 개선된 성장을 나타내는 세포 집단 또는 세포 조성물은 표현형을 나타내거나, 또는 나이브-유사 또는 중심 기억-유사 표현형, 예를 들어 CD27+, CD28+ 및/또는 CCR7+와 연관된 마커를 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 인간으로부터의 공여자 샘플(예를 들어 백혈구성분채집술 또는 성분채집술 샘플) 내의 T 세포 중에서 CD57+ T 세포 발현의 가변성 또는 이종성(heterogeneity)이 있다는 관찰에 기초하며, 이는 일부 측면에서, 동일한 제조 공정을 사용하는 경우에도, 복수의 상이한 공여자로부터의 입양 세포 요법에 사용하기 위해 생산된 조작된 T 세포 조성물의 표현형 및 기능의 가변성을 초래할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 방법은 공여자 샘플로부터 CD27+ T 세포를 선택하는 것, 분리하는 것, 또는 농축하는 것, 예를 들어 공여자 샘플로부터 CD27+ T 세포를 농축하는 것, 선택하는 것, 또는 분리하는 것에 의해 이러한 가변성을 제어하거나 감소시킨다. 이어서, 이러한 세포는 특정 생성물 속성 및 특징, 예를 들어 대상체에게 투여시 확장 및 지속되는 능력을 또한 개선하면서, 생성물 사이의 가변성을 최소화하기 위해 세포 요법을 위한 세포를 조작하거나 제조하는 방법에 사용될 수 있다.
1. 세포 선택
일부 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단의 선택, 분리 또는 농축은 하나 이상의 제조 및/또는 비-친화도 기반 세포 분리 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단의 선택, 분리 또는 농축은 하나 이상의 제조 및/또는 비-친화도 기반 세포 분리 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어 원치 않는 성분을 제거하고, 원하는 성분을 농축하고, 특정 시약에 민감한 세포를 용해 또는 제거하기 위해, 하나 이상의 시약의 존재 하에 세포를 세척, 원심 분리 및/또는 인큐베이션한다. 일부 구현예에서, 세포는 밀도, 부착 특성, 크기, 감도 및/또는 특정 성분에 대한 내성과 같은 하나 이상의 특성에 기초하여 분리된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 밀도 기반 세포 분리 방법, 예를 들어 적혈구를 용해시켜 말초혈로부터 백혈구를 준비하는 것과 퍼콜(Percoll) 또는 피콜(Ficoll) 구배를 통한 원심 분리를 포함한다. 특정 구현예에서, 선택, 분리, 및 농축을 위한 방법, 기술, 및 시약은 예를 들어 국제공개공보 제WO2013/124474호 및 제WO2015/164675호에 기술되어 있으며, 상기 공보는 그 전체가 본원에서 참조로 포함된다.
특정 구현예에서, CD57- 세포는 하나 이상의 선택 단계를 포함하는 공정 또는 과정에서 분리, 농축, 또는 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 단계는 음성 선택이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, CD57- 세포는 CD57+ 세포의 분리 또는 제거에 의해서 분리, 농축, 또는 선택된다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단은 집단으로부터의 CD57+ 세포의 음성 선택으로부터 발생한다. 특정 구현예에서, CD27+ 세포는 하나 이상의 선택 단계를 수반하는 공정 또는 절차에서 분리, 농축 또는 선택된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 선택 단계는 음성 선택이거나 이를 수반한다. 특정 구현예에서, CD27+ 세포는 CD27- 세포의 분리 또는 제거에 의해 분리되거나, 농축되거나, 또는 선택된다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 Cd27 농축된 T 세포 집단은 집단으로부터의 CD27- 세포의 음성 선택으로부터 발생한다.
특정 구현예에서, 2가 항체는 CD57+ 세포를 고밀도 세포 또는 비드에 연결하는데 사용된다. 특정 구현예에서, 2가 항체는 CD27- 세포를 고밀도 세포 또는 비드에 연결하는데 사용된다. 이 기술은 적혈 세포(예를 들어 RosetteSepTM STEMCELL Technologies), 또는 표적 세포, 예를 들어 CD57+ 또는 CD27- T 세포를, 제거를 위한 밀도 구배에 커플링하는 임의의 다른 유사하거나 적합한 기술에서 가장 유망하게 사용되어 왔다.
일부 구현예에서, 선택 단계의 적어도 일부는, 선택 시약과 함께 세포를 인큐베이션하는 것을 포함한다. 예를 들어 선택 방법의 일부로서, 선택 시약 또는 시약과의 인큐베이션은 하나 이상의 특정 분자, 예를 들어 표면 단백질, 세포내 마커 또는 핵산과 같은 표면 마커의 표현 또는 존재에 기초한, 하나 이상의 상이한 세포 유형의 선택을 위해 하나 이상의 선택 시약을 사용하여 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 표면 단백질은 CD57, CD4, 또는 CD8를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 표면 단백질은 CD27, CD4, 또는 CD8을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 표면 단백질은 CD57을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 표면 단백질은 CD27을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 표면 단백질은 CD4 및/또는 CD8을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 표면 단백질은 CD3를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 시약 또는 시약을 사용하는 임의의 공지된 방법이 이러한 마커에 기초한 분리를 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 시약(들)은 친화도 또는 면역 친화도-기반 분리인 분리를 초래한다. 예를 들어 상기 선택은 일부 측면에서, 하나 이상의 마커, 전형적으로 세포 표면 마커, 예를 들어 항체 또는 이러한 마커에 특이적으로 결합하는 결합 파트너와의 인큐베이션에 의한 세포의 발현 또는 발현 수준에 기초하여 세포 및 세포 집단의 분리를 위한 시약 또는 시약과의 인큐베이션을 포함하고, 이어서 일반적으로 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 않은 세포로부터 항체 또는 결합 파트너에 결합된 세포의 세척 단계 및 분리가 이어진다. 일부 구현예에서, 세포의 분리를 위한 상기 시약(들)은 CD4, CD8, 또는 CD57에 결합하거나 또는 그들을 인식하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 분리를 위한 시약(들)은 CD4, CD8, 또는 CD27에 결합하거나 이를 인식하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 분리를 위한 시약(들)은 CD57에 결합하거나 이를 인식하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 분리를 위한 시약(들)은 CD27에 결합하거나 이를 인식하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 분리를 위한 시약(들)은 CD4 또는 CD8에 결합하거나 이를 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 분리를 위한 시약(들)은 CD3에 결합하거나 이를 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이거나 이를 포함한다.
이러한 공정의 일부 측면에서, 다량의 세포를 원하는 양의 친화도-기반 선택 시약과 혼합한다. 면역 친화도-기반 선택은 분리되는 세포와 세포상의 마커에 특이적으로 결합하는 분자, 예를 들어 항체 또는 고체 표면의 다른 결합 파트너, 예를 들어 입자, 사이에 유리한 에너지 상호 작용을 야기하는 임의의 시스템 또는 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 비드, 예를 들어 세포의 마커에 특이적인 선택 제제(예를 들어 항체)로 코팅된 자기 비드와 같은 입자를 사용하여 수행된다. 상기 입자(예를 들어 비드)는 에너지가 요구되는 상호작용의 촉진을 돕기 위해 일정한 세포 밀도 대 입자(예를 들어 비드)비로 흔들거나 혼합하면서 튜브 또는 백과 같은 용기에서 세포와 인큐베이션 또는 혼합될 수 있다. 다른 경우에, 상기 방법은 선택의 전부 또는 일부가 원심 챔버의 내부 공동(cavity)에서, 예를 들어 원심 회전 하에, 수행되는 세포의 선택을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 친화도-기반 선택 시약과 같은 선택 시약과 함께하는 세포의 인큐베이션은 원심 챔버에서 수행된다. 특정 구현예에서, 분리(isolation, separation)는 국제공개공보 제WO2009/072003호 또는 미국출원공개공보 제US20110003380 A1호에 기재된 시스템, 장비(device) 또는 장치(apparatus)를 사용하여 수행된다. 한 구현예에서, 상기 시스템은 국제공개공보 제WO2016/073602호에 기술된 시스템이다.
일부 구현예에서, 원심 분리 챔버의 공동에서 이러한 선택 단계 또는 그의 일부(예를 들어 항체-코팅된 입자, 예를 들어 자기 비드와의 인큐베이션)를 수행함으로써, 사용자는 다양한 용액의 부피와 같은 특정 파라미터를 제어할 수 있고, 처리 및 그 타이밍 동안 용액의 첨가는 다른 이용 가능한 방법과 비교하여 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어 인큐베이션 동안 공동 내 액체 부피를 감소시키는 능력은 공동의 총 세포수에 영향을 미치지 않으면서, 선택에 사용된 입자(예를 들어 비드 시약)의 농도 및 용액의 화학적 총 전위를 증가시킬 수 있다. 이는 처리되는 세포와 선택에 사용되는 입자 사이의 쌍별 상호 작용(pairwise interactions)을 향상시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 시스템, 회로 및 제어와 관련될 때 챔버에서 인큐베이션 단계를 수행하는 것은 사용자가 인큐베이션 동안 원하는 시간(들)에 용액의 교반을 수행할 수 있게 하며, 이는 또한 상호 작용을 향상시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 선택 단계의 적어도 일부는 원심 분리 챔버에서 수행되며, 이는 선택 시약과 함께하는 세포의 인큐베이션을 포함한다. 이러한 공정의 일부 측면에서, 제조업체의 지침에 따르면, 일정 부피의 세포는 동일한 수의 세포 및/또는 세포 부피를 선택하기 위해, 튜브 또는 용기에서 유사한 선택을 수행할 때, 일반적으로 사용되는 것보다 훨씬 적은 양의 원하는 친화도-기반 선택 시약과 혼합된다. 일부 구현예에서, 동일한 수의 세포 및/또는 동일한 부피에 대한 튜브 또는 용기-기반 인큐베이션에서 세포의 선택에 사용되는 상기 동일한 선택 시약의 양의 5% 이하, 10% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 50% 이하, 60%이하, 70% 이하 또는 80% 이하인 선택 시약 또는 시약의 양이 제조자의 지시에 따라 사용된다.
일부 구현예에서, 선택, 예를 들어 세포의 면역 친화도-기반 선택을 위해, 세포는 또한 선택 시약, 예를 들어 그 집단의 다른 세포, 예를 들어 항체에는 존재하지 않고 농축 및/또는 고갈시키고자 하는 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합하는 분자를 함유하는 집단에서 챔버의 공동에서 인큐베이션되며, 상기 항체는 스캐폴드 예를 들어 중합체 또는 표면, 예를 들어 비드, 예를 들어 자기 비드, 예를 들어 CD4 및 CD8에 모노클론성(monoclonal) 항체에 커플링된(coupled) 자기 비드에 선택적으로 결합하는 것이다. 일부 구현예에서, 기술된 바와 같이, 상기 선택 시약은, 동요(shaking) 또는 회전(rotation)과 함께 튜브에서 선택을 수행할 때의 동일한 수의 세포 또는 동일한 양의 세포의 선택과 거의 동일하거나 유사한 선택 효율을 달성하기 위해 일반적으로 사용되거나 필요한 선택 시약의 양과 비교하여, 실질적으로 (예를 들어 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 이하의 양) 미만의 양으로 챔버의 공동(cavity) 내의 세포에 첨가된다. 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션은 세포 및 선택 시약에 선택 완충제를 첨가하여 수행되며, 예를 들어 10mL 내지 200mL의 시약, 예를 들어 적어도 (약) 10mL, 20mL, 30mL, 40mL, 50mL, 60mL, 70mL, 80mL, 90mL, 100mL, 150mL 또는 200mL의 시약과 함께 인큐베이션하여 표적 부피를 달성한다. 일부 구현예에서, 선택 완충제 및 선택 시약은 세포에 첨가하기 전에 예비 혼합된다. 일부 구현예에서, 선택 완충제 및 선택 시약은 별도로 세포에 첨가된다. 일부 구현예에서, 선택 인큐베이션은 주기적으로 온화한 혼합 조건으로 수행되며, 이는 에너지적으로 선호되는 상호 작용을 촉진시키고, 그에 의해서 높은 선택 효율을 달성하면서도 전체 선택 시약의 사용을 덜 허용할 수 있다.
일부 구현예에서, 선택 시약과의 인큐베이션의 총 지속 시간은 약 5분 내지 6시간, 예를 들어 30분 내지 3시간, 예를 들어 적어도 30분, 60분, 120분 또는 180분 또는 적어도 약 30분, 60분, 120분 또는 180분 이상이다.
일부 구현예에서, 상기 인큐베이션은 일반적으로 혼합 조건, 예를 들어 스피닝(spinning)의 존재 하에, 일반적으로 비교적 낮은 힘 또는 속도, 예를 들어 세포를 펠렛(pellet)화하기 위해 사용된 것보다 낮은 속도와 같은 혼합 조건 하에 수행되며, 약 600rpm 내지 1700rpm(예를 들어 600rpm, 1000rpm, 또는 1500rpm 또는 1700rpm 또는 약 600rpm, 1000rpm, 또는 1500rpm 또는 1700rpm 또는 적어도 600rpm, 1000rpm, 또는 1500rpm 또는 1700rpm)으로부터, 예를 들어 80g 내지 100g 또는 약 80g 내지 100g(예를 들어 80g, 85g, 90g, 95g 또는 100g 또는 약 80g, 85g, 90g, 95g 또는 100g 또는 적어도 80g, 85g, 90g, 95g 또는 100g)으로부터의 챔버의 샘플 또는 벽(wall) 또는 다른 용기의 RCF에서와 같다. 일부 구현예에서, 상기 스핀은 이러한 저속에서 스핀의 반복된 간격을 사용하여 수행되고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 초 동안의 스핀(spin) 및/또는 휴식, 예를 들어 약 1 또는 2 초에서 스핀(spin) 후 약 5, 6, 7 또는 8 초 동안 휴식 기간이 수행된다.
일부 구현예에서, 이러한 공정는 챔버가 일체화된 완전 폐쇄 시스템 내에서 수행된다. 일부 구현예에서, 이 방법(및 일부 측면에서, 하나 이상의 추가 단계, 예를 들어 혈액성분채집술(apheresis) 샘플과 같은 세포를 포함하는 샘플을 세척하는 이전 세척 단계)은 세포가 다음과 같이 자동화된 방식으로 수행되며, 예를 들어 자동화된 프로그램을 사용하여 단일 폐쇄 시스템에서 세척 및 결합 단계를 완료하기 위해 시약 및 기타 성분을 적절한 시간에 챔버로 끌어당겨 빼내고 원심 분리한다.
일부 구현예에서, 세포 및 선택 시약 및/또는 시약의 인큐베이션 및/또는 혼합 후, 상기 인큐베이션된 세포는 특정 시약 또는 시약의 존재 또는 부재에 기초하여 세포를 선택하기 위해 분리된다. 일부 구현예에서, 상기 분리는 선택 시약과 함께 세포의 인큐베이션이 수행된 동일한 폐쇄 시스템에서 수행된다. 일부 구현예에서, 선택 시약과의 인큐베이션 후, 선택 시약이 결합된 세포를 포함하는 인큐베이션된 세포를, 세포의 면역 친화도-기반 분리를 위한 시스템으로 옮긴다. 일부 구현예에서, 상기 면역 친화도-기반 분리 시스템은 자기(magnetic) 분리 칼럼이거나 이를 포함한다.
이러한 분리 단계는, 세포가 시약에 결합한 세포, 예를 들어 항체 또는 결합 파트너는 추가 사용을 위해 보유되는 양성 선택, 및/또는, 시약에 결합하지 않은 세포, 예를 들어 항체 또는 결합 파트너가 보유되는 음성 선택에 기초할 수 있다. 일부 예에서, 두 분획은 추가 사용을 위해 보유된다. 일부 측면에서, 이종 집단에서 세포 유형을 특이적으로 식별하는 항체가 이용 가능하지 않은 경우, 음성 선택이 특히 유용할 수 있어서, 원하는 집단 이외의 세포에 의해 발현된 마커에 기초하여 분리가 가장 잘 수행된다.
일부 구현예에서, 공정 단계는 친화도 기반 선택을 수행할 수 있는 시스템 또는 장치를 사용하는 것과 같이 인큐베이션된 및 세포의 음성 및/또는 양성 선택을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 분리는, 양성 선택에 의한 특정 세포 집단에 대한 농축 또는 음성 선택에 의한 특정 세포 집단의 고갈에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 양성 또는 음성 선택은 양성 또는 음성적으로 선택된 세포의 상대적으로 더 높은 수준(markerhigh)으로 발현 또는 발현된(marker+) 하나 이상의 표면 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 다른 결합제와 함께 세포를 인큐베이션함으로써 달성된다.
상기 분리는 특정 세포 집단 또는 특정 마커를 발현하는 세포의 100% 농축 또는 제거를 초래할 필요는 없다. 예를 들어 마커를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포에 대한 양성 선택 또는 농축은 그러한 세포의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 지칭하지만, 마커를 발현하지 않는 세포가 완전히 부재할 필요는 없다. 마찬가지로, 마커를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포의 음성 선택, 제거 또는 결핍은 그러한 세포의 수 또는 백분율을 감소시키는 것을 말하지만, 그러한 모든 세포를 완전히 제거할 필요는 없다.
일부 구현예에서, 하나의 단계로부터 양성 또는 음성으로 선택된 분획에 후속 양성 또는 음성 선택과 같은 다른 분리 단계가 수행되는, 수 회의 분리 단계가 수행된다. 일부 예에서, 단일 분리 단계는, 예를 들어 각각 음성 선택을 표적으로하는 마커에 특이적인 복수의 항체 또는 결합 파트너와 세포를 인큐베이션함으로써 다수의 마커를 동시에 발현하는 세포를 결핍시킬 수 있다. 마찬가지로, 복수의 세포 유형은 세포를 다양한 세포 유형에서 발현된 복수의 항체 또는 결합 파트너와 인큐베이션함으로써 동시에 양성적으로 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 하나의 단계로부터 양성 또는 음성 선택된 분획이 동일한 분리 단계, 예를 들어 반복된 양성 또는 음성 선택에 적용되는 경우 분리 단계가 반복되고/되거나 1회 이상 수행된다. 일부 구체예에서, 단일 분리 단계는, 예를 들어 선택된 세포의 순도를 증가시키고/시키거나 음성으로 선택된 분획으로부터 음성으로 선택된 세포를 추가로 제거하고/하거나 고갈시키기 위해 1회 이상 반복 및/또는 수행된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 분리 단계가 2 회, 3 회, 4 회, 5 회, 6 회, 7 회, 8 회, 9 회, 10 회 또는 10 회 이상 수행된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 선택 단계는 1 회 내지 10 회, 1 회 내지 5 회, 또는 3 회 내지 5 회 수행 및/또는 반복된다.
예를 들어 일부 측면에서, 예를 들어 CD3+, CD4+, CD8+, 또는 CD57+ T 세포와 같이 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커를 양성 또는 발현하는 T 세포의 특이적 서브세트는 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 분리된다. 일부 측면에서, T 세포, 예를 들어 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD3+, CD4+, CD8+, 또는 CD27- T 세포의 특이적 서브세트는 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 분리된다. 일부 구현예에서, 이러한 세포는 이러한 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 결합 파트너와의 인큐베이션에 의해 선택된다. 일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는, 자기(magnetic) 비드 또는 상자성(paramagnetic) 비드와 같은 선택을 수행하기 위해 고체 지지체 또는 매트릭스에 직접적으로 또는 간접적으로 컨쥬게이션될 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 CD57+ T 세포는 CD4 마이크로비드(Microbeads), CD8 마이크로비드, 또는 CD57 마이크로비드(Miltenyl Biotec)를 사용하여 선택, 예를 들어 양성 선택될 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 CD27- T 세포는 CD4 마이크로비드, CD8 마이크로비드, 또는 CD27 마이크로비드 (Miltenyl Biotec)로 선택, 예를 들어 양성으로 선택될 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, CD3+ T 세포는 CD3 마이크로비드(Miltenyl Biotec)를 사용하여 선택, 예를 들어 양성 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, CD57- 세포는 CD57 발현에 양성인 세포의 음성 선택에 의해서 PBMC로부터 분리된다. 특정 구현예에서, CD27+ 세포는 CD27 발현에 대해 음성인 세포의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 다양한 구현예에서, T 세포는, B 세포, 단핵구 또는 CD14와 같은 다른 백혈구와 같은 비-T 세포에서 발현된 마커의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 일부 측면에서, a CD3+ 선택 단계는 비-T 세포로부터 T 세포를 분리하는데 사용된다. 상기 CD3+ 집단은 하나 이상의 나이브-형(naive-like), 기억, 및/또는 이펙터(effector) T 세포 서브세트에서 상대적으로 높은 정도로 발현되는 CD4+ 또는 CD8+, 마커들에 양성 또는 음성 선택에 의해서 서브세트으로 분류될 수 있다. 일부 측면에서, CD4+ 및 CD8+ 선택 단계는 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포 독성 T 세포를 분리하기 위해 사용된다. 이러한 CD4+ 및 CD8+ 집단은, 하나 이상의 나이브, 기억 및/또는 이펙터 T 세포 서브세트에서 상대적으로 높은 정도로 발현되거나 발현된 마커에 대한 양성 또는 음성 선택에 의해 서브세트으로 추가로 분류될 수 있다.
일부 구현예에서, CD8+ 세포는 예를 들어 CD57의 표면 발현에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해 CD57- T 세포를 추가로 농축 또는 고갈시킨다. 특정 구현예에서, CD4+ 세포는 예를 들어 CD57의 표면 발현에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해 CD57- T 세포를 추가로 농축 또는 고갈시킨다. 특정 구현예에서, CD3+ 세포는 예를 들어 CD57의 표면 발현에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해, CD57- T 세포에 대해 추가로 농축되거나 고갈된다. 일부 구현예에서, CD8+ 세포는 예를 들어 CD27의 표면 발현에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해, CD27+ T 세포에 대해 추가로 농축되거나 고갈된다. 특정 구현예에서, CD4+ 세포는 예를 들어 CD27의 표면 발현에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해, CD27+ T 세포에 대해 추가로 농축되거나 고갈된다. 특정 구현예에서, CD3+ 세포는 예를 들어 CD27의 표면 발현에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해, CD27+ T 세포에 대해 추가로 농축되거나 고갈된다.
일부 구현예에서, CD8+ T 세포는, 예를 들어 각각의 서브세트와 관련된 표면 항원에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해, 나이브(naive), 중앙 기억, 이펙터(effector) 기억 및/또는 중심 기억 줄기 세포가 추가로 농축되거나 고갈된다. 일부 구현예에서, 중앙 기억 T(TCM) 세포의 농축은 투여 후 장기 생존, 증폭 및/또는 생착을 개선시키는 것과 같은 효능을 증가시키기 위해 수행되며, 이는 일부 측면에서 이러한 서브세트에서 특히 강력하다. Terakura 등, (2012) Blood.1:72-82; Wang 등, (2012) J Immunother. 35(9):689-701 을 참고한다. 일부 구현예에서, TCM-농축된 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포의 조합은 효능을 추가로 향상시킨다.
일부 측면에서, CD8+ 세포 집단 또는 서브세트를 제조하는데 사용된 동일한 CD4 발현-기반 선택 단계는, CD4-기반 분리로부터의 양성 및 음성 분획이 선택적으로 하나 이상의 추가 양성 또는 음성 선택 단계 후에 방법의 후속 단계에서 유지되고 사용되는 것과 같이, CD4+ 세포 집단 또는 서브세트를 생산하는데 또한 사용된다. 일부 구현예에서, CD4+ 세포 집단에 대한 선택 및 CD8+ 세포 집단에 대한 선택은 동시에 수행된다. 일부 구현예에서, CD4+ 세포 집단 및 CD8+ 세포 집단에 대한 선택은 임의의 순서로 순차적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 세포를 선택하기 위한 방법은 공개된 미국 출원번호 US20170037369에 기재된 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 선택된 CD4+ 세포 집단 및 선택된 CD8+ 세포 집단은 선택 후에 조합될 수 있다. 일부 양상에서, 선택된 CD4+ 세포 집단 및 선택된 CD8+ 세포 집단은 본원에 기재된 바와 같은 생물반응기 백(bag)에서 조합될 수 있다.
다양한 구현예에서, 공여자 샘플, 예를 들어 PBMC 또는 기타 백혈 세포의 샘플은 농축된 CD57- 세포를 함유하는 음성 분획이 유지되는 CD57+ T 세포의 선택에 적용된다. 일부 구현예에서, CD57- 세포로 농축된 음성 분획은 양성 분획이 유지되는 CD3+ T 세포의 선택에 적용된다. 특정 구현예에서, CD8+ T 세포는 CD57- 세포로 농축된 음성 분획으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CD57- 세포로 농축된 음성 분획은 음성 및 양성 분획 둘 다가 유지되는 CD8+ T 세포의 선택에 적용된다. 특정 구현예에서, CD4+ T 세포는 음성 분획으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, CD57- 세포로 농축된 음성 분획으로부터 음성 및 양성 분획이 둘 다 유지되는 CD4+ T 세포의 선택에 적용된다. 특정 구현예에서, CD8+ T 세포는 음성 분획으로부터 선택된다.
다양한 구현예에서, 공여자 샘플, 예를 들어 PBMC 또는 기타 백혈 세포의 샘플은 농축된 CD27+ 세포를 함유하는 음성 분획이 유지되는 CD27- T 세포의 선택에 적용된다. 일부 구현예에서, CD27+ 세포로 농축된 음성 분획은 양성 분획이 유지되는 CD3+ T 세포의 선택에 적용된다. 특정 구현예에서, CD8+ T 세포는 CD27+ 세포로 농축된 음성 분획으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CD27+ 세포로 농축된 음성 분획은 음성 및 양성 분획 둘 다가 유지되는 CD8+ T 세포의 선택에 적용된다. 특정 구현예에서, CD4+ T 세포는 음성 분획으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, CD27+ 세포로 농축된 음성 분획으로부터 음성 및 양성 분획이 둘 다 유지되는 CD4+ T 세포의 선택에 적용된다. 특정 구현예에서, CD8+ T 세포는 음성 분획으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 분리될 인큐베이션된 샘플 또는 세포의 집단(예를 들어 공여자 샘플)은, 상자성 비드(예를 들어 다인비드(Dynalbead) 또는 MACS® 비드와 같은)와 같은, 자기적 반응 입자 또는 미세입자와 같이, 작은, 자화성(magnetizable) 또는 자기적(magnetically) 반응성 물질을 포함하는 선택 시약과 함께 인큐베이션된다. 상기 자기적(magnetically) 반응성 물질, 예를 들어 입자는, 일반적으로 결합 파트너, 예를 들어 항체에 직접 또는 간접적으로 부착되어 있으며, 이는 분자, 예를 들어 표면 마커에 결합하여 세포, 세포들 또는 세포 집단에 존재하며, 분리, 예를 들어 부정적으로 또는 긍정적으로 선택되는 것이 요구된다. 일부 측면에서, 상기 선택제는 상자성 비드(paramagnetic bead) 및, CD3, CD4, CD8, 또는 CD57에 결합하거나 그들을 인식하는 부착된 항체 또는 그의의 항원 결합 단편이거나 또는 그들을 포함한다. 일부 측면에서, 선택제는 CD3, CD4, CD8, 또는 CD27에 결합하거나 이를 인식하는 부착된 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 상자성 비드이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 선택제는 CD3, CD4, CD8, 또는 CD57 MACS® 마이크로비드(microbead)이다. 일부 구현예에서, 선택제는 CD3, CD4, CD8, 또는 CD27 MACS® 마이크로비드이다.
일부 구현예에서, 자성 입자 또는 비드는 항체 또는 다른 결합 파트너와 같은 특정 결합 부재에 결합된 자기적으로 반응성 물질을 포함한다. 자기 분리 방법에 사용하기 위한 많은 잘 알려진 자기 반응성 물질은, 예를 들어 Molday, 미국특허 제4,452,773호 및 유럽 특허 명세서 EP 452342 B에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다. Owen 미국특허 제4,795,698 호 및 Liberti 등, 미국특허 제5,200,084호에 기재된 콜로이드 크기의 입자(Colloidal sized particles)도 사용될 수 있다.
상기 인큐베이션은 항체, 또는 결합 파트너, 일반적으로 자성 입자 또는 비드에 부착된 이러한 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 2차 항체 또는 다른 시약과 같은 분자, 구체적으로 샘플 내 세포에 존재하는 경우 세포 표면 분자에 결합하는 조건 하에 수행된다.
특정 구현예에서, 자기 반응성 입자는 1차 항체 또는 다른 결합 파트너, 2 차 항체, 렉틴(lectins), 효소 또는 스트렙타비딘(streptavidin)으로 코팅된다. 특정 구현예에서, 자성 입자는 하나 이상의 마커에 특이적인 1차 항체의 코팅을 통해 세포에 부착된다. 특정 구현예에서, 상기 비드보다는 상기 세포가 1차 항체 또는 결합 파트너로 표지된 후, 세포 유형 특이적 2 차 항체-또는 다른 결합 파트너(예를 들어 스트렙타비딘(streptavidin))-코팅 된 자성 입자가 첨가된다. 특정 구현예에서, 스트렙타비딘(streptavidin)-코팅된 자성 입자는 비오티닐화된(biotinylated) 1차 또는 2차 항체와 함께 사용된다.
일부 측면에서, 샘플이 자기장에 배치되는 절차에서 분리가 달성되고, 자기 응답성 또는 자화성 입자가 부착된 셀은 자석에 끌려 라벨링되지 않은 세포로부터 분리될 것이다. 양성 선택을 위해, 자석에 끌리는 세포는 유지되며; 음성 선택을 위해, 끌리지 않은 세포(라벨링되지 않은 세포)가 유지된다. 일부 측면에서, 양성 및 음성 선택의 조합은 동일한 선택 단계 동안 수행되며, 여기서 양성 및 음성 분획은 유지되고 추가로 처리되거나 추가 분리 단계를 거친다.
일부 구현예에서, 친화도-기반 선택은 자기 활성화 세포 분류(MACS)(Miltenyi Biotech, Auburn, CA)를 통한 것이다. Magnetic Activated Cell Sorting(MACS), 예를 들어 CliniMACS 시스템은 자화된 입자가 부착된 셀을 고순도로 선택할 수 있다. 특정 구현예에서, MACS는 비-표적 및 표적 종(species)이 외부 자기장의 적용 후에 순차적으로 용리되는(eluted) 모드에서 작동한다. 즉, 자화 입자에 부착된 세포는 부착되지 않은 종(species)이 용리되는 동안 제자리에 유지된다. 이어서, 이 제 1 용리 단계가 완료된 후, 자기장에 포획되고 용리되는 것이 방지된 종(species)은 이들이 용리 및 회수될 수 있도록 어떤 방식으로도 자유롭게된다. 특정 구현예에서, 비-표적-세포는 이종 세포 집단으로부터 표지되고 결핍된다. 다양한 구현예에서, 상기 선택제는 CD3, CD4, CD8, 또는 CD57 MACS® 마이크로비드이다. 특정 구현예에서, 비-표적 세포는 세포의 이종 집단으로부터 표지되고 고갈된다. 다양한 구현예에서, 선택제는 CD3, CD4, CD8, 또는 CD27 MACS® 마이크로비드이다.
일부 구현예에서, 친화도 시약의 차선 수율 농도는 시약에 결합된 세포의 회수 또는 분리 및 시약과 세포의 인큐베이션을 수반하는 주어진 선택 또는 농축에서 결합 세포의 최적 또는 최대 수율에 도달하는데 필요하거나 이에 사용되는 농도 이하의 농도이다("수율(yield)"은 예를 들어 시약에 의해 표적화되거나 시약이 이에 특이적이거나 시약이 특이적이고 결합할 수 있는 마커를 갖는 인큐베이션 중 총 세포수에 비해 그렇게 회수되거나 선택된 세포의 수임). 차선 수율 농도는, 일반적으로 상기 공정 또는 단계에서 시약에 결합된 세포 회수 시, 결합 세포, 예를 들어 CD57+, CD4+ 또는 CD8+ T 세포 중 전부 미만, 예를 들어 70% 이내의 수율을 달성하는 시약의 농도 또는 양이다. 차선 수율 농도는, 일반적으로 상기 공정 또는 단계에서 시약에 결합된 세포 회수 시, 결합 세포, 예를 들어 CD27-, CD4+ 또는 CD8+ T 세포 중 전부 미만, 예를 들어 70% 이내의 수율을 달성하는 시약의 농도 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 친화도 시약의 차선 수율 농도는 일반적으로는, 이러한 방법 또는 단계에서 상기 시약에 결합된 세포의 회수시, 결합된 세포, 예를 들어 CD3+ T 세포의, 전부보다 낮은, 예를 들어 70% 이하의 수율을 달성하는 시약의 농도 또는 양이다. 일부 구현예에서, (약) 50%, 45%, 40%, 30% 또는 25% 이내의 수율이 친화도 시약의 차선 농도에 의해 달성된다. 농도는 세포 당 입자 또는 표면의 수 또는 질량 및/또는 세포 당 제제(예를 들어 항체 단편과 같은 항체)의 질량 또는 분자 수의 측면에서 표현될 수 있다.
일부 구현예에서, 예를 들어 CD57+, CD4+, 또는 CD8+ T 세포에 대한 친화도를 갖는 2개 이상의 선택 시약 각각 또는 하나 이상에 대해 차선 수율 농도로 작동하는 경우, 이러한 시약 중 하나 이상은 다른 것(들)에 의해 인식된 세포 유형(들)과 비교하여 그 시약에 의해 인식된 세포 유형의 비율을 편향시키기 위해 상기 다른 시약(들) 중 하나 이상보다 더 높은 농도로 사용된다. 일부 구현예에서, 예를 들어 CD57+, CD3+, CD4+, 또는 CD8+ T 세포에 대한 친화도를 갖는 2개 이상의 선택 시약 각각 또는 하나 이상에 대해 차선 수율 농도로 작동하는 경우, 이러한 시약 중 하나 이상은 다른 것(들)에 의해 인식된 세포 유형(들)과 비교하여 그 시약에 의해 인식된 세포 유형의 비율을 편향시키기 위해 상기 다른 시약(들) 중 하나 이상보다 더 높은 농도로 사용된다. 일부 구현예에서, 예를 들어 CD27-, CD4+, 또는 CD8+ T 세포에 대한 친화도를 갖는 2개 이상의 선택 시약 각각 또는 하나 이상에 대해 차선 수율 농도로 작동하는 경우, 이러한 시약 중 하나 이상은 다른 것(들)에 의해 인식된 세포 유형(들)과 비교하여 그 시약에 의해 인식된 세포 유형의 비율을 편향시키기 위해 상기 다른 시약(들) 중 하나 이상보다 더 높은 농도로 사용된다. 일부 구현예에서, 예를 들어 CD27-, CD3+, CD4+, 또는 CD8+ T 세포에 대한 친화도를 갖는 2개 이상의 선택 시약 각각 또는 하나 이상에 대해 차선 수율 농도로 작동하는 경우, 이러한 시약 중 하나 이상은 다른 것(들)에 의해 인식된 세포 유형(들)과 비교하여 그 시약에 의해 인식된 세포 유형의 비율을 편향시키기 위해 상기 다른 시약(들) 중 하나 이상보다 더 높은 농도로 사용된다. 예를 들어 비율을 편향시키는 것이 바람직한 마커에 특이적으로 결합하는 시약은 비율을 증가시키는 것이 얼마나 요구되는지에 따라 다른 시약(들)에 비해 절반, 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 또는 그 초과만큼 증가되는 농도(예를 들어 세포 당 제제 또는 질량)로 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 차선의 범위에서 및/또는 시약의 포화를 달성하기에 충분한 세포로 작동하는 경우, 면역친화도 시약의 양은 농축된 세포의 대략적인 수율에 비례한다. 특정 구현예에서, 농축된 또는 선택된 세포, 예를 들어 CD57-, CD4+, 또는 CD8+ T 세포를 함유하는 생성된 집단의 목적하는 비율에 의존하는 면역친화도 시약의 적절한 양 또는 농도는 일상적인 문제(as a matter of routine)로서 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, 농축된 또는 선택된 세포, 예를 들어 CD27+, CD4+, 또는 CD8+ T 세포를 함유하는 생성된 집단의 목적하는 비율에 의존하는 면역친화도 시약의 적절한 양 또는 농도는 일상적인 문제로서 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, 농축된 또는 선택된 세포, 예를 들어 CD3+ T 세포를 함유하는 생성된 집단의 목적하는 비율에 의존하는 면역친화도 시약의 적절한 양 또는 농도는 일상적인 문제로서 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 분리 및/또는 분리 단계는, 면역 친화도 시약이, 예를 들어 전문이 국제공개공보 제WO2015/164675호에 기재된 바와 같은 스트렙타비딘 뮤테인(streptavidin mutein)과의 펩티드 리간드 상호 작용을 통해 가역적으로 결합된 자기 비드를 사용하여 수행된다. 상기 자기 비드의 예는 Streptamers®이다. 일부 구현예에서, 분리 및/또는 단계는 Miltenyi Biotec에서 시판되는 것과 같은 자기 비드를 사용하여 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 자기적으로 반응하는 입자는 후속 인큐베이션, 배양 및/또는 조작될 세포에 부착된 채로 남고; 일부 측면에서, 입자는 환자에게 투여하기 위해 세포에 부착된 채로 남는다. 일부 구현예에서, 자화성(magnetizable) 또는 자기 응답성 입자(magnetically responsive particles)는 세포로부터 제거된다. 세포로부터 자화성 입자를 제거하는 방법은 공지되어 있으며, 예를 들어 경쟁 비-표지 항체, 자화성 입자 또는 절단 가능한 링커에 접합된 항체 등의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 자화성 입자는 생분해성(biodegradable)이다.
일부 구현예에서, 분리 및/또는 선택은 농축된 T 세포, 예를 들어 CD57- T 세포, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 하나 이상의 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 분리 및/또는 선택은 농축된 T 세포, 예를 들어 CD27+ T 세포, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 하나 이상의 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 2개 이상의 별개의 집단은 단일 공여자 샘플로부터 분리, 선택, 농축 또는 수득된다. 일부 구현예에서, 별개의 집단은 동일한 개별 공여자로부터 수집, 수거(taken) 및/또는 수득된 별명의 공여자 샘플로부터 분리, 선택, 농축 및/또는 수득된다.
특정 구현예에서, 분리 및/또는 선택은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD57- CD3+ T 세포를 포함하는 농축된 T 세포(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)의 하나 이상의 집단을 생산한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단은 본질적으로 CD57- CD3+ T 세포로 구성된다.
특정 구현예에서, 분리 및/또는 농축은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD57-CD4+ T 세포를 포함하는 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단을 생산한다. 특정 구현예에서, CD4+ T 세포의 투입 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD8+ T 세포를 포함하고/하거나, CD8+ T 세포를 함유하지 않고/않거나, CD8+ T 세포를 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 집단은 본질적으로 CD57-CD4+ T 세포로 구성된다.
특정 구현예에서, 분리 및/또는 농축은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD57- CD8+ T 세포를 포함하는 농축된 CD57- CD8+ T 세포의 집단을 생산한다. 특정 구현예에서, CD8+ T 세포의 집단은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD4+ T 세포를 함유하고/하거나, CD4+ T 세포를 함유하지 않고/않거나, CD4+ T 세포를 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단은 본질적으로 CD57- CD8+ T 세포로 구성된다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단은 본질적으로 CD57-CD4+ T 세포로 구성된다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단은 본질적으로 CD57- CD3+ T 세포로 구성된다.
특정 구현예에서, 분리 및/또는 선택은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD27+ CD3+ T 세포를 포함하는 농축된 T 세포(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)의 하나 이상의 집단을 초래한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단은 본질적으로 CD27+ CD3+ T 세포로 구성된다.
특정 구현예에서, 분리 및/또는 농축은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD27+CD4+ T 세포를 포함하는 농축된 CD27+CD4+ T 세포의 집단을 초래한다. 특정 구현예에서, CD4+ T 세포의 투입 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD8+ T 세포를 포함하고/하거나, CD8+ T 세포를 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 집단은 본질적으로 CD27+CD4+ T 세포로 구성된다.
특정 구현예에서, 분리 및/또는 농축은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD27+ CD8+ T 세포를 포함하는 농축된 CD27+ CD8+ T 세포의 집단을 초래한다. 특정 구현예에서, CD8+ T 세포의 집단은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD4+ T 세포를 함유하고/하거나, CD4+ T 세포를 함유하지 않고/않거나, CD4+ T 세포를 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단은 CD27+CD8+ T 세포로 본질적으로 구성된다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단은 CD27+CD4+ T 세포로 본질적으로 구성된다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단은 CD27+ CD3+ T 세포로 본질적으로 구성된다.
a. 크로마토그래피에 의한 세포 선택
본원에서 제공된 상기 방법의 측면에서, 공여자 샘플의 세포는, 예를 들어 T 세포는 크로마토그래피 분리, 예를 들어 친화도 크로마토그래피 또는 겔 투과 크로마토그래피를 포함한 칼럼 크로마토그래피에 의한 분리에 의해서 선택된다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 T 세포는 친화도 크로마토그래피 또는 겔 투과 크로마토그래피를 포함하는 칼럼 크로마토그래피에 의한 것과 같은 크로마토그래피 분리에 의해 분리, 선택 또는 농축된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 표적 세포, 예를 들어 분리, 선택 또는 농축된 세포(예를 들어 CD57+ 세포)의 표면 상에 위치한 수용체 분자(예를 들어 CD57)에 결합하는 수용체 결합 시약을 이용한다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 CD27+ T 세포는 크로마토그래피 분리에 의해, 예를 들어 친화도 크로마토그래피 또는 겔 투과 크로마토그래피를 포함하는 칼럼 크로마토그래피에 의해 분리되거나, 선택되거나, 또는 농축된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 표적 세포, 예를 들어 분리되거나, 선택되거나, 또는 농축될 세포(예를 들어 CD27+ 세포)의 표면 상에 위치하는 수용체 분자(예를 들어 CD27)에 결합하는 수용체 결합 시약을 사용한다. 상기 방법은 (흔적 없는) 세포 친화도 크로마토그래피 기술(CATCH)로 설명될 수 있고, 전문이 여기에 참조로 포함된 국제공개공보 제WO2013/124474호 및 제WO2015/164675호에 기재된 임의의 방법 또는 기술을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, CD57+ 세포는 크로마토그래피 분리에 의해 음성으로 선택된다. 특정 구현예에서, CD27- 세포는 크로마토그래피 분리에 의해 음성으로 선택된다.
일부 구현예에서, 표적 세포(예를 들어 CD57+ 세포)는 세포 표면 상에 수용체 분자를 갖거나 발현하여, 분리되거나, 선택되거나, 또는 농축될 세포는 적어도 하나의 공통 특이적 수용체 분자(예를 들어 CD57)의 존재에 의해 정의된다. 일부 구현예에서, 표적 세포(예를 들어 CD27- 세포)는 세포 표면 상에 수용체 분자를 갖거나 발현하여, 분리되거나, 선택되거나, 또는 농축될 세포는 적어도 하나의 공통 특이적 수용체 분자(예를 들어 CD27)의 존재에 의해 정의된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 공여자 샘플은 또한 수용체 분자가 결여된 추가의 세포를 함유할 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, T 세포는 복수의 세포 유형, 예를 들어 적혈구 또는 B 세포를 함유하는 공여자 샘플로부터 분리, 농축, 및/또는 선택된다. 특정 구현예에서, CD57+ 세포는 복수의 세포 유형, 예를 들어 적혈구 또는 B 세포를 함유하는 공여자 샘플로부터 분리, 농축, 및/또는 선택되고, 그에 의해서 분리된 CD57+ 세포 및 세포의 비-선택된 집단, 예를 들어 농축된 CD57- T 세포의 집단을 제공한다. 특정 구현예에서, CD27- 세포는 복수의 세포 유형, 예를 들어 적혈구 또는 B 세포를 함유하는 공여자 샘플로부터 분리, 농축, 및/또는 선택되고, 그에 의해서 분리된 CD27- 세포 및 세포의 비-선택된 집단, 예를 들어 농축된 CD27+ T 세포의 집단을 제공한다.
일부 구현예에서, 수용체 결합 제제는 예를 들어 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상)에 직접 또는 간접적으로 결합된 크로마토그래피 칼럼에 포함된다. 일부 구현예에서, 수용체 결합 제제는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)이 칼럼에 추가될 때 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상) 상에 존재한다. 일부 구현예에서, 수용체 결합 제제는 시약, 예를 들어 친화도 시약을 통해 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상)에 간접적으로 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 친화도 시약은 칼럼의 고정상에 공유적 또는 비공유적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 친화도 시약은 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상)에 가역적으로 고정된다. 일부 경우에, 친화도 시약은 공유 결합을 통해 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상)에 고정된다. 일부 측면에서, 친화도 시약은 비공유적으로 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상)에 가역적으로 고정된다.
일부 구현예에서, 수용체 결합 시약은, 샘플이 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 추가될 때 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상) 상에 친화도 시약을 통해 예를 들어 직접적으로(예를 들어 공유적 또는 비공유적) 또는 간접적으로 결합되어 존재할 수 있다. 따라서, 샘플(예를 들어 공여자 샘플) 첨가 시, 표적 세포는 수용체 결합 시약에 의해 결합되고 칼럼의 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상)에 고정될 수 있다. 대안적으로, 일부 구현예에서, 수용체 결합 시약은 샘플(예를 들어 공여자 샘플)에 첨가될 수 있다. 상기 방식으로, 수용체 결합 시약은 샘플(예를 들어 공여자 샘플)의 표적 세포(예를 들어 T 세포)에 결합하고, 이어서 샘플은 친화도 시약을 포함하는 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상)에 첨가될 수 있으며, 여기서 표적 세포에 이미 결합된 수용체 결합 시약은 친화도 시약에 결합하고, 이로써 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상) 상에 표적 세포를 고정한다. 일부 구현예에서, 수용체 결합 시약은, 수용체 결합 시약에 포함된 여기에 기재된 바와 같은 결합 파트너 C를 경유하여 여기에 기재된 바와 같은 친화도 시약에 결합한다.
일부 측면에서, 수용체 결합 시약이 상기 샘플(예를 들어 공여자 샘플)에 부가된다. 특정 구현예에서, 상기 수용체 결합 시약은, 상기 세포, 예를 들어 상기 표적 세포의 표면 위의 상기 수용체 분자에 특이적으로 결합하는 결합 부위 B를 갖는다. 일부 측면에서, 상기 수용체 결합 시약은 또한 친화도 시약의 결합 부위 Z에 특이적으로 및 가역적으로 결합할 수 있는 결합 파트너 C를 포함한다. 예를 들어 특정 측면에서, CD57에 결합하거나 또는 그것을 인식하는 수용체 결합 시약이 상기 샘플(예를 들어 공여자 샘플)에 부가되며, 그는 결합 부위 B에서 CD57 발현에 대해 양성인 세포의 표면 위의 CD57에 결합한다. 특정 측면에서, CD27에 결합하거나 그를 인식하는 수용체 결합 시약이 샘플(예를 들어 공여자 샘플)에 첨가되어 결합 부위 B에서 CD27 발현에 대해 양성인 세포의 표면에서 CD27에 결합한다.
특정 측면에서, 친화도 시약은 또한 결합 파트너 C에 의해 결합될 수 있는 2개 이상의 결합 부위 Z를 함유할 수 있고, 이로써 수용체 결합 시약의 다량체화를 제공한다. 따라서 여기에 사용되는 상기 친화도 시약은 또한 다량체화 시약일 수 있다. 친화도 시약은 예를 들어 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인, 아비딘, 아비딘 뮤테인 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 일부 측면에서, 상이한 크로마토그래피 매트릭스가 상이한 친화도 시약에 결합되고, 분리를 위한 다중 성분 시스템을 형성하는 칼럼의 층을 이룰 수 있다.
일부 구현예에서, 2개 이상의 수용체 결합 시약은, 예를 들어 친화도 시약 상에 존재하는 하나 또는 복수의 결합 부위 Z를 통해 친화도 시약과 연관, 예를 들어 가역적 또는 비가역적으로 결합된다. 일부 경우에, 이것은 수용체 결합 시약이 서로 밀접하게 배치되는 결과를 초래하여, 세포 표면 분자(예를 들어 선택 마커)를 갖는 표적 세포가 특정 분자(예를 들어 선택 마커)에 결합할 수 있는 수용체 결합 시약과 접촉을 야기할 경우 열성 효과(avidity effect)가 발생할 수 있다.
일부 구현예에서, 동일한, 즉 동일한 선택 마커 결합 특이성을 갖는 2개 이상의 상이한 수용체 결합 시약이 친화도 시약에 가역적으로 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 상이한 선택 마커에 결합하는 2개 이상의 상이한 수용체 결합 시약 및 일부 경우에 3 또는 4개의 상이한 수용체 결합 시약을 사용하는 것이 가능하다. 일부 측면에서, 2개 이상의 선택 제제 각각은 상이한 분자(예를 들어 선택 마커), 예를 들어 제 1 분자, 제 2 분자 등에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 세포 표면 분자와 같은 상이한 분자(예를 들어 선택 마커)는 동일한 표적 세포 상에 존재할 수 있다. 다른 경우에, 세포 표면 분자와 같은 상이한 분자(예를 들어 선택 마커)는 동일한 세포 집단에 존재하는 상이한 표적 세포 상에 존재할 수 있다. 일부 경우에, 제 3, 제 4 등의 수용체 결합 시약이 동일한 시약과 연합할 수 있고, 각각은 상이한 결합 부위를 더 함유한다.
일부 구현예에서, 2개 이상의 상이한 수용체 결합 시약은 동일한 결합 파트너 C를 함유한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 상이한 수용체 결합 시약은 상이한 결합 파트너를 함유한다. 일부 측면에서, 제 1 수용체 결합 시약은 친화도 시약 상에 존재하는 결합 부위 Z1에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 파트너 C1을 가질 수 있고, 제 2 수용체 결합 시약은 친화도 시약 상에 존재하는 결합 부위 Z1 또는 결합 부위 Z2에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 파트너 C2를 가질 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 친화도 시약에 포함된 복수의 결합 부위 Z는 수용체 결합 시약에 포함된 결합 파트너 C1 및 C2에 각각 가역적으로 결합할 수 있는 결합 부위 Z1 및 Z2를 포함한다. 일부 구현예에서, C1 및 C2가 동일하고/하거나 Z1 및 Z2가 동일하다. 다른 측면에서, 복수의 결합 부위 Z 중 하나 이상이 상이할 수 있다. 다른 경우에, 복수의 결합 파트너 C 중 하나 이상이 상이할 수 있다. 각각의 결합 파트너 C가 결합 부위 Z 중 하나와 상호 작용, 예를 들어 특이적으로 결합할 수 있는 한, 결합 부위 Z를 함유하는 친화도 시약과 양립 가능한 상이한 결합 파트너 C의 임의의 조합을 선택하는 것은 당업자의 수준 이내이다.
특정 구현예에서, 샘플, 예를 들어 세포 및 수용체 결합 시약(예를 들어 항체)을 함유하는 공여자 샘플은, 부착 또는 고정된 친화도 시약(예를 들어 결합 시약)을 함유하는 크로마토그래피 매트릭스에 로딩되거나 상기와 접촉한다. 특정 측면에서, 친화도 시약은 수용체 결합 시약의 결합 파트너 C에 특이적으로 결합하는 복수의 결합 부위 Z를 갖는다. 특정 측면에서, 수용체 결합 시약은 결합 파트너 C와 결합 부위 Z 사이의 상호 작용에 의해 친화도 시약에 결합한다. 따라서, 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 표적 세포는, 크로마토그래피 매트릭스 상의 수용체 결합 시약의 결합 부위 Z와 친화도 시약의 하나 이상의 결합 부위 Z에 의해 형성되는 복합체를 통해 고정된다. 추가 측면에서, 세포, 예를 들어 표적 세포는 크로마토그래피 매트릭스에서 남은 샘플을 예를 들어 세정, 방출 또는 세척함으로써 샘플(예를 들어 공여자 샘플)에서 고갈될 수 있다. 특정 측면에서, 수용체 결합 시약은 세포를 함유하는 샘플에 포함될 수 있거나 또는 예를 들어 샘플이 크로마토그래피 매트릭스에 첨가되기 전에 부착된 친화도 또는 다량체화 시약에 결합하기 위해 크로마토그래피 매트릭스에 적용되거나 접촉될 수 있다.
일부 구현예에서, 크로마토그래피 매트릭스는, 예를 들어 음성 선택에 의해 샘플(예를 들어 공여자 샘플)로부터 표적 세포를 제거하거나 분리하기 위해 사용된다. 예를 들어 특정 구현예에서, 샘플(예를 들어 CD57+ 세포 및 CD57- 세포를 함유하는 공여자 샘플)은 CD57에 결합하거나 그를 인식하는 수용체 결합 시약과 접촉되거나 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 샘플(예를 들어 공여자 샘플) 및 수용체 결합 시약은 매트릭스 상에 로딩되고, 여기서 일부 측면에서, 복합체는 고정화된 또는 부착된 친화도 시약, 수용체 결합 시약, 및 CD57+ T 세포에 의해 형성된다. 일부 구현예에서, 비결합된 세포는 크로마토그래피 매트릭스로부터 제거되거나 세정되어서, 결합된 CD57+ 세포를 제거하고, CD57- 세포에 대해 농축된 샘플, 예를 들어 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)을 제공한다. 예를 들어 특정 구현예에서, 샘플(예를 들어 CD27- 세포 및 CD27+ 세포를 함유하는 공여자 샘플)은 CD27에 결합하거나 이를 인식하는 수용체 결합 시약과 접촉되거나 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 샘플(예를 들어 공여자 샘플) 및 수용체 결합 시약은 매트릭스 상에 로딩되고, 여기서 일부 측면에서, 복합체는 고정화된 또는 부착된 친화도 시약, 수용체 결합 시약, 및 CD27+ T 세포에 의해 형성된다. 일부 구현예에서, 비결합된 세포는 크로마토그래피 매트릭스로부터 제거되거나 세정되어, 결합된 CD27- 세포를 제거하고, CD27+ 세포에 대해 농축된 샘플, 예를 들어 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)을 제공한다.
특정 구현예에서, 상기 크로마토그래피 매트릭스는 예를 들어 양성 선택에 의해서 샘플(예를 들어 공여자 샘플)로부터 표적 세포를 분리, 선택, 또는 농축하는데 사용된다. 예를 들어 일부 구현예에서, CD4+ 또는 CD8+ T 세포 및 다른 세포, 예를 들어 비-T 세포 면역 세포를 함유하는 샘플은 CD4 또는 CD8에 결합하거나 또는 그를 인식하는 수용체 결합 시약과 접촉되거나 또는 그를 사용하여 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 상기 샘플 및 상기 수용체 결합 시약은, 일부 측면에서 상기 고정되거나 또는 부착된 친화도 시약, 상기 수용체 결합 시약, 및 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 의해서 복합체가 형성되는 상기 매트릭스 위에 로딩된다. 특정 구현예에서, 미결합 세포는 상기 크로마토그래피 매트릭스로부터 제거되거나 또는 세정된다. 특정 구현예에서, 상기 고정된 CD4+ 또는 CD8+ 세포는 경쟁 시약의 첨가에 의해서, 예를 들어 상기 복합체를 파괴함으로써 제거되거나 또는 방출된다. 따라서 일부 측면에서, 상기 분리, 방출, 또는 용리된 CD4+ 또는 CD8+ 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 대해 농축된 세포의 샘플, 조성물, 또는 집단이다.
특정 구현예에서, 상기 크로마토그래피 매트릭스는 예를 들어 양성 선택에 의해서 샘플(예를 들어 공여자 샘플)로부터 표적 세포를 분리, 선택, 또는 농축하는데 사용된다. 예를 들어 일부 구현예에서, CD3+ T 세포 및 다른 세포, 예를 들어 비-T 세포 면역 세포를 함유하는 샘플은 CD3에 결합하거나 또는 그를 인식하는 수용체 결합 시약과 접촉되거나 또는 그를 사용하여 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 상기 샘플 및 상기 수용체 결합 시약은, 일부 측면에서 상기 고정되거나 또는 부착된 친화도 시약, 상기 수용체 결합 시약, 및 CD3+ T 세포에 의해서 복합체가 형성되는 상기 매트릭스 위에 로딩된다. 특정 구현예에서, 미결합 세포는 상기 크로마토그래피 매트릭스로부터 제거되거나 또는 세정된다. 특정 구현예에서, 상기 고정된 CD3+ 세포는 경쟁 시약의 첨가에 의해서, 예를 들어 상기 복합체를 파괴함으로써 제거되거나 또는 방출된다. 따라서 일부 측면에서, 상기 분리, 방출, 또는 용리된 CD3+ 세포는 CD3+ T 세포에 대해 농축된 세포의 샘플, 조성물, 또는 집단이다.
일부 측면에서, 경쟁 시약은 상기 크로마토그래피 칼럼 상에 로딩된다. 일부 구현예에서, 결합 파트너 C와 결합 부위 Z 사이에 형성된 가역적 결합은 경쟁 시약에 의해 파괴될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 경쟁 시약은 친화도 시약의 결합 부위 Z에 결합할 수 있는 결합 부위를 갖는다. 일부 구현예에서, 경쟁 시약은 하나 이상의 결합 부위 Z에 대한 결합 파트너 C와 결합을 두고 경쟁할 수 있는 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 스트렙타비딘 결합-펩티드일 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 경쟁 시약은 친화도 시약과 복합체를 형성하고, 그에 의해서 크로마토그래피 매트릭스 상에 고정된다. 일부 구현예에서, 결합 파트너 C 및 경쟁 시약은 상이하고, 상기 경쟁 시약은 결합 파트너의 친화도에 비해 하나 이상의 결합 부위 Z에 대해 보다 높은 결합 친화도를 나타낸다. 여기에 제공된 임의의 방법의 특정 측면에서, 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상)에서 표적 세포(예를 들어 T 세포)를 분리하기 위해 친화도 시약에 대한 선택 제제(예를 들어 수용체 결합 제제)의 결합을 파괴하는 크로마토그래피 칼럼의 고정상에 경쟁 시약의 첨가가 필요하지 않다.
상기 경쟁적 결합의 결과로, 결합 파트너 C 및 결합 부위 Z에서 수용체 결합 시약과 친화도 시약 사이의 결합이 대체된다. 특정 구현예에서, 친화도 시약, 수용체 결합 시약 및 세포, 예를 들어 표적 세포를 함유하는 부착된 복합체를 갖는 크로마토그래피 매트릭스에 경쟁 시약의 첨가 또는 로딩으로 크로마토그래피 매트릭스에서 세포가 방출된다. 일부 측면에서, 수용체 결합 시약은 결합 부위 B에서 세포의 수용체 분자를 향한 낮은 친화도를 가져서, 수용체 결합 시약은 경쟁 시약의 존재하에 세포에서 해리된다. 따라서, 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 표적 세포는, 결합된 수용체 결합 분자가 없거나 본질적으로 없는 크로마토그래피 매트릭스로에서 용출된다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 표적 세포, 경쟁 시약 및 수용체 결합 시약을 포함하는 제 1 크로마토그래피 칼럼의 용출물에서 용출 샘플이 수집된다. 특정 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 매트릭스 및 동시에 겔 투과 매트릭스로서도 작용할 수 있는 적절한 고정상을 갖는 제 2 크로마토그래피 칼럼에 용출 샘플이 로딩된다. 특정 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 매트릭스는 상기에 고정된 친화도 시약을 갖는다. 일부 측면에서, 수용체 결합 시약 및 경쟁 시약은 친화도 시약 상의 결합 부위 Z에 결합하고, 이로써 크로마토그래피 매트릭스 상에 고정된다. 결과적으로, 특정 측면에서, 분리된 표적 세포를 함유하는 용출 샘플은 수용체 결합 시약 및 경쟁 시약이 고갈된다. 따라서, 일부 측면에서, 임의의 반응물이 없는 표적 세포는, 이제 예를 들어 여기에 기재된 임의의 방법에 의한 가공을 위한 추가 사용을 위한 상태에 있다.
일부 구현예에서, 샘플(예를 들어 공여자 샘플)의 세포, 예를 들어 표적 세포는 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상)에서 남은 샘플을 예를 들어 세정, 방출 또는 세척함으로써 샘플에서 고갈될 수 있다. 일부 구현예에서, 1회 이상(예를 들어 2, 3, 4, 5, 6)의 세척 단계가 사용되어 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 고정상)에서 결합되지 않은 세포 및 잔해물이 제거된다. 일부 구현예에서, 적어도 2회의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플은 하나 이상의 세척 단계가 수행되기 전에 적어도 (약) 5, 10, 15, 16, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 120 분 동안 매트릭스에 침투하도록 허용된다. 일부 구현예에서, 세척 단계는 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 또는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 120 분 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 세척 단계는 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 또는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60 분 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 120, 100, 90, 80, 70, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 5 내지 60 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 5 내지 50 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 5 내지 40 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 5 내지 30 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 5 내지 20 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 5 내지 10 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 10 내지 60 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 20 내지 60 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 30 내지 60 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 40 내지 60 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 칼럼(예를 들어 고정상)에 첨가된 후 (약) 50 내지 60 분 이내에 하나 이상의 세척 단계가 수행된다.
일부 구현예에서, 여러 라운드의 분리 단계가 수행되고, 여기서 한 단계에서 양성 또는 음성 선택된 분획은 후속 양성 또는 음성 선택과 같은 또 다른 분리 단계를 거친다. 특정 구현예에서, 선택, 분리 및 농축을 위한 방법, 기술 및 시약은 예를 들어 국제공개공보 제WO2015/164675호에 기술되어 있으며, 상기 공보는 그 전체가 본원에서 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 단일 선택 단계를 사용하여 샘플(예를 들어 공여자 샘플)에서 표적 세포(예를 들어 CD57- T 세포)를 분리할 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 선택 단계는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)로부터 표적 세포(예를 들어 CD27+ T 세포)를 분리하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 선택 단계는 단일 크로마토그래피 칼럼에서 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 단일 선택 단계는 복수의 마커를 동시에 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있다. 마찬가지로, 복수의 세포 유형이 동시에 양성 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 선택 단계는 반복되고/되거나 1회 이상 수행되며, 여기서 한 단계에서 양성 또는 음성 선택된 분획은 반복적인 양성 또는 음성 선택과 같은 동일한 선택 단계를 거친다. 일부 구현예에서, 단일 선택 단계는 반복되고/되거나 1회 이상 수행되어, 예를 들어 선택된 세포의 순도를 증가시키고/시키거나 음성 선택된 분획에서 음성 선택 세포를 더 제거하고/하거나 고갈시킨다. 특정 구현예에서, 1 회 이상의 선택 단계는 2 회, 3 회, 4 회, 5 회, 6 회, 7 회, 8 회, 9 회, 10 회 또는 10 회 이상 수행된다. 특정 구현예에서, 1 회 이상의 선택 단계는 1 내지 10 회, 1 내지 5 회 또는 3 내지 5 회 수행되고/되거나 반복된다. 일부 구현예에서 2개의 선택 단계가 수행된다.
세포 선택은 하나 이상의 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 크로마토그래피 칼럼은 폐쇄 시스템에 포함된다. 일부 구현예에서, 폐쇄 시스템은, 예를 들어 사용자(예를 들어 인간) 입력이 필요없거나 상기가 최소로 필요한 자동화된 폐쇄 시스템이다. 일부 구현예에서, 세포 선택은 순차적(예를 들어 순차적 선택 기술)으로 수행된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 크로마토그래피 칼럼은 순차적으로 배열된다. 예를 들어 제 1 칼럼은 산출 칼럼(예를 들어 용리액)이 제 2 크로마토그래피 칼럼에 예를 들어 연결된 튜브를 통해 공급될 수 있도록 배향될 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 크로마토그래피 칼럼은 순차적으로 배열될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 선택은 순차적인 양성 및 음성 선택 단계를 수행함으로써 달성될 수 있고, 후속 단계는 이전 단계의 음성 및/또는 양성 분획을 추가 선택의 대상으로 하며, 여기서 전체 공정는 동일한 튜브 또는 튜브 세트에서 수행된다.
일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, CD4+ 또는 CD8+ 집단 중 하나를 농축하도록 제 1 선택이 달성되고, 제 1 선택에서 비선택 세포가 제 2 선택에 대한 세포의 공급원으로 사용되어 CD4+ 또는 CD8+ 집단 중 나머지 다른 하나를 농축하는 순차적인 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 추가 선택(들)은, CD4+ 또는 CD8+ 집단 중 하나 또는 둘 다의 서브세트, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ 발현에 대해 양성인 세포의 농축을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, 제 1 선택으로 CD3+ 집단의 농축을 초래하고, 선택된 세포가 제 2 선택을 위한 세포의 공급원으로 사용되어 CD3+ 집단을 농축하는 순차적인 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, 제 1 선택으로 제 1 고정상(예를 들어 제 1 크로마토그래피 칼럼)의 CD3+ 집단의 농축이 초래되고, 결합되지 않은 세포를 함유하는 통과액이 제 2 선택을 위한 세포의 공급원으로 사용되어 제 2 고정상(예를 들어 제 2 크로마토그래피 칼럼)의 CD3+ 집단을 농축하는 순차적인 선택의 대상이 되고, 여기에서 제 1 및 제 2 고정상은 순차적으로 배열된다. 일부 구현예에서 추가 선택(들)은, 수행되어 CD3+ 집단, 예를 들어 중앙 기억T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ 발현에 양성인 세포의 농축을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은 순차적 선택의 대상이 될 수 있으며, 여기서 제 1 선택이 CD3+ 집단을 농축시키기 위해서 수행되며, 상기 선택된 세포는 CD4+ 집단을 농축시키는 제 2 선택을 위한 세포의 소스로서 사용된다. 일부 구현예에서, 추가 선택(들)은, CD4+ 또는 CD8+ 집단 중 하나 또는 둘 다의 서브세트, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ 발현에 대해 양성인 세포의 농축을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, 제 1 선택으로 CD3+ 집단의 농축이 초래되고, 선택된 세포가 제 2 선택을 위한 세포의 공급원으로 사용되어 CD8+ 집단을 농축하는 순차적인 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 추가 선택(들)은, CD3+CD8+ 집단의 서브세트, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ 발현에 대해 양성인 세포의 농축을 초래할 수 있다. T 세포의 특정 서브세트(예를 들어 CD3+ 세포), 예를 들어 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ T 세포를 높은 수준으로 발현하거나 이에 대해 양성인 세포가 연속적인 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 선택됨이 고려된다.
일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, CD57- 집단을 농축하도록 제 1 선택이 달성되고, 상기 선택된 세포는 CD3+ 집단을 농축하는 순차적인 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, 제 1 선택으로 제 1 고정상(예를 들어 제 1 크로마토그래피 칼럼)의 CD57- 집단의 농축이 초래되고, 결합되지 않은 세포를 함유하는 통과액이 제 2 선택을 위한 세포의 공급원으로 사용되어 제 2 고정상(예를 들어 제 2 크로마토그래피 칼럼)의 CD3+ 집단을 농축하는 순차적인 선택의 대상이 되고, 여기에서 제 1 및 제 2 고정상은 순차적으로 배열된다. 일부 구현예에서, 추가 선택(들)은, CD57- 집단의 서브세트, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ 발현에 대해 양성인 세포의 농축을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, 제 1 선택으로 CD57- 집단의 농축을 초래하고, 선택된 세포가 제 2 선택을 위한 세포의 공급원으로 사용되어 CD3+ 집단을 농축하는 순차적인 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서 추가 선택(들)은, 수행되어 CD57-CD3+ 집단, 예를 들어 중앙 기억T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ 발현에 양성인 세포의 농축을 초래할 수 있다. T 세포의 특정 서브세트(예를 들어 CD57- 세포), 예를 들어 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ T 세포를 높은 수준으로 발현하거나 이에 대해 양성인 세포가 연속적인 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 선택됨이 고려된다.
일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, CD27+ 집단을 농축하도록 제 1 선택이 달성되고, 상기 선택된 세포는 CD3+ 집단을 농축하는 순차적인 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, 제 1 선택으로 제 1 고정상(예를 들어 제 1 크로마토그래피 칼럼)의 CD27+ 집단의 농축이 초래되고, 결합되지 않은 세포를 함유하는 통과액이 제 2 선택을 위한 세포의 공급원으로 사용되어 제 2 고정상(예를 들어 제 2 크로마토그래피 칼럼)의 CD3+ 집단을 농축하는 순차적인 선택의 대상이 되고, 여기에서 제 1 및 제 2 고정상은 순차적으로 배열된다. 일부 구현예에서, 추가 선택(들)은, CD27+ 집단의 서브세트, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ 발현에 대해 양성인 세포의 농축을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, 제 1 선택으로 CD27+ 집단의 농축을 초래하고, 선택된 세포가 제 2 선택을 위한 세포의 공급원으로 사용되어 CD3+ 집단을 농축하는 순차적인 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서 추가 선택(들)은, 수행되어 CD27+CD3+ 집단, 예를 들어 중앙 기억T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ 발현에 양성인 세포의 농축을 초래할 수 있다. T 세포의 특정 서브세트(예를 들어 CD27+ 세포), 예를 들어 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ T 세포를 높은 수준으로 발현하거나 이에 대해 양성인 세포가 연속적인 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 선택됨이 고려된다.
일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, CD3+ 집단을 농축하도록 제 1 선택이 달성되고, 상기 선택된 세포는 CD57- 집단을 농축하는 순차적인 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, 제 1 선택으로 제 1 고정상(예를 들어 제 1 크로마토그래피 칼럼)의 CD3+ 집단의 농축이 초래되고, 결합되지 않은 세포를 함유하는 통과액이 제 2 선택을 위한 세포의 공급원으로 사용되어 제 2 고정상(예를 들어 제 2 크로마토그래피 칼럼)의 CD57- 집단을 농축하는 순차적인 선택의 대상이 되고, 여기에서 제 1 및 제 2 고정상은 순차적으로 배열된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, CD3+ 집단을 농축하도록 제 1 선택이 달성되고, 상기 선택된 세포는 CD27+ 집단을 농축하는 순차적인 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, 제 1 선택으로 제 1 고정상(예를 들어 제 1 크로마토그래피 칼럼)의 CD3+ 집단의 농축이 초래되고, 결합되지 않은 세포를 함유하는 통과액이 제 2 선택을 위한 세포의 공급원으로 사용되어 제 2 고정상(예를 들어 제 2 크로마토그래피 칼럼)의 CD27+ 집단을 농축하는 순차적인 선택의 대상이 되고, 여기에서 제 1 및 제 2 고정상은 순차적으로 배열된다. 일부 구현예에서, 추가 선택(들)은, CD3+ 집단의 서브세트, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ 발현에 대해 양성인 세포의 농축을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, 제 1 선택으로 CD3+ 집단의 농축을 초래하고, 선택된 세포가 제 2 선택을 위한 세포의 공급원으로 사용되어 CD57- 집단을 농축하는 순차적인 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서 추가 선택(들)은, 수행되어 CD3+CD57- 집단, 예를 들어 중앙 기억T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ 발현에 양성인 세포의 농축을 초래할 수 있다. T 세포의 특정 서브세트(예를 들어 CD57- 세포), 예를 들어 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ T 세포를 높은 수준으로 발현하거나 이에 대해 양성인 세포가 연속적인 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 선택됨이 고려된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은, 제 1 선택으로 CD3+ 집단의 농축을 초래하고, 선택된 세포가 제 2 선택을 위한 세포의 공급원으로 사용되어 CD27+ 집단을 농축하는 순차적인 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서 추가 선택(들)은, 수행되어 CD3+CD27+ 집단, 예를 들어 중앙 기억T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ 발현에 양성인 세포의 농축을 초래할 수 있다. T 세포의 특정 서브세트(예를 들어 CD27+ 세포), 예를 들어 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ T 세포를 높은 수준으로 발현하거나 이에 대해 양성인 세포가 연속적인 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 선택됨이 고려된다.
일부 구현예에서, 세포 선택은 병행(예를 들어 병행 선택 기술)하여 수행된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 크로마토그래피 칼럼은 병행 배열된다. 예를 들어 샘플(예를 들어 공여자 샘플)이, 예를 들어 제 1 칼럼을 통과할 필요없이 샘플을 각 칼럼에 부가될 수 있는 튜브를 통해 샘플이 동시에 2 이상의 칼럼에 로딩되도록 2 이상의 칼럼이 배열될 수 있다. 예를 들어 병행 선택 기술을 사용하여, 세포 선택은, 예를 들어 폐쇄 시스템에서 양성 및/또는 음성 선택 단계를 동시에 수행함으로써 달성될 수 있고, 여기서 전체 공정는 동일한 튜브 또는 튜브 세트에서 수행된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, 샘플이 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼에 로딩되는 병행 선택의 대상이 되고, 여기서 각 칼럼은 세포 집단의 선택을 수행한다.
일부 구현예에서, 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼은 개별적으로 CD57-, CD3+, CD4+ 또는 CD8+ 집단의 선택을 수행한다. 일부 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 또는 겔 투과 크로마토그래피를 포함하는 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼은 독립적으로 동일한 세포 집단의 선택을 수행한다. 예를 들어 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼은 CD57- 세포의 선택을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 또는 겔 투과 크로마토그래피를 포함하는 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼은 독립적으로 상이한 세포 집단의 선택을 수행한다. 예를 들어 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼은 독립적으로 CD57- 세포, CD4+ 세포, CD3+ 및/또는 CD8+ 세포의 선택을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 순차적 선택 기술을 사용하는 추가의 선택(들)은 병행 선택을 통해 선택된 하나 또는 모든 세포 집단의 서브세트에 대해 농축하도록 수행될 수 있다. 예를 들어 선택된 세포는, 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+을 발현하거나 또는 그에 대해 양성인 세포에 대해 추가 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, 병행 선택이 2개 이상의 칼럼 상에서 CD57- 집단에 대해 농축하도록 수행되는 병행 선택에 적용된다. 일부 구현예에서, 추가의 선택(들)은 CD57- 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+의 서브세트에 대해 농축하도록 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, 선택이 2개 이상의 칼럼 상에서 CD57- 집단 및 CD3+ 집단에 대해 농축하도록 수행되는 병행 선택에 적용된다. 일부 구현예에서, 추가의 선택(들)은 CD57- 집단 및 CD3+ 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+의 서브세트에 대해 농축하도록 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, 선택이 2개 이상의 칼럼 상에서 CD57- 집단 및 CD4+ 집단에 대해 농축하도록 독립적으로 수행되는 병행 선택에 적용된다. 일부 구현예에서, 추가의 선택(들)은 CD57- 집단 및 CD4+ 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+의 서브세트에 대해 농축하도록 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, 병행 선택이 CD57- 집단 및 CD8+ 집단에 대해 농축하도록 수행되는 병행 선택에 적용된다. 일부 구현예에서, 추가의 선택(들)은 CD57- 집단 및 CD8+ 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+의 서브세트에 대해 농축하도록 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, 병행 선택이 CD4+ 집단 및 CD8+ 집단에 대해 농축하도록 수행되는 병행 선택에 적용된다. 추가의 선택(들)은 CD4+ 집단 및 CD8+ 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+의 서브세트에 대해 농축하도록 수행될 수 있다. 일부 측면에서, T 세포의 특정 서브세트(예를 들어 CD3+, CD4+, CD8+ T 세포), 예를 들어 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ T 세포를 높은 수준으로 발현하거나 이에 대해 양성인 세포가 양성 또는 음성 병행 선택 기술에 의해 선택됨이 고려된다. 일부 구현예에서, 순차적 및 병행 선택 기술이 조합으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼은 개별적으로 CD27+, CD3+, CD4+ 또는 CD8+ 집단의 선택을 수행한다. 일부 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 또는 겔 투과 크로마토그래피를 포함하는 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼은 독립적으로 동일한 세포 집단의 선택을 수행한다. 예를 들어 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼은 CD27+ 세포의 선택을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 또는 겔 투과 크로마토그래피를 포함하는 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼은 독립적으로 상이한 세포 집단의 선택을 수행한다. 예를 들어 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼은 독립적으로 CD27+ 세포, CD4+ 세포, CD3+ 및/또는 CD8+ 세포의 선택을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 순차적 선택 기술을 사용하는 추가의 선택(들)은 병행 선택을 통해 선택된 하나 또는 모든 세포 집단의 서브세트에 대해 농축하도록 수행될 수 있다. 예를 들어 선택된 세포는, 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+을 발현하거나 또는 그에 대해 양성인 세포에 대해 추가 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, 병행 선택이 2개 이상의 칼럼 상에서 CD27+ 집단에 대해 농축하도록 수행되는 병행 선택에 적용된다. 일부 구현예에서, 추가의 선택(들)은 CD27+ 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+의 서브세트에 대해 농축하도록 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, 선택이 2개 이상의 칼럼 상에서 CD27+ 집단 및 CD3+ 집단에 대해 농축하도록 수행되는 병행 선택에 적용된다. 일부 구현예에서, 추가의 선택(들)은 CD27+ 집단 및 CD3+ 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+의 서브세트에 대해 농축하도록 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, 선택이 2개 이상의 칼럼 상에서 CD27+ 집단 및 CD4+ 집단에 대해 농축하도록 독립적으로 수행되는 병행 선택에 적용된다. 일부 구현예에서, 추가의 선택(들)은 CD27+ 집단 및 CD4+ 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+의 서브세트에 대해 농축하도록 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은, 병행 선택이 CD27+ 집단 및 CD8+ 집단에 대해 농축하도록 수행되는 병행 선택에 적용된다. 일부 구현예에서, 추가의 선택(들)은 CD27+ 집단 및 CD8+ 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+의 서브세트에 대해 농축하도록 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 2개의 칼럼은 병렬 선택에 사용된다. 일부 구현예에서, 2개의 칼럼은 동일한 세포 유형(예를 들어 동일한 선택 마커)에 대해 선택된다. 일부 구현예에서, 2개의 칼럼은 각각 CD57- T 세포에 대해 선택된다. 일부 구현예에서, 2개의 칼럼은 각각 CD27+ T 세포에 대해 선택된다. 일부 구현예에서, 2개의 칼럼은 상이한 세포 유형(예를 들어 상이한 선택 마커)에 대해 선택된다. 일부 구현예에서, 2개의 칼럼 중 하나는 CD57- T 세포에 대해 선택되고, 2개의 칼럼 중 다른 하나는 CD3+ 세포에 대해 선택된다. 일부 구현예에서, 2개의 칼럼 중 하나는 CD27+ T 세포에 대해 선택되고, 2개의 칼럼 중 다른 하나는 CD3+ 세포에 대해 선택된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 선택 단계는 하나 이상의 시점에 또는 조작된 세포 조성물을 생성하기 위한 공정 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 선택 단계는, 예를 들어 조작된 세포 조성물의 추가 정제, 특정 세포 하위 유형의 선택, 생존 가능한 세포의 선택, 조작된 세포의 선택 및/또는 세포의 비율, 총 수 또는 농도를 조정하기 위한 다중 선택 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 선택 단계는 인큐베이션 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 선택 단계는 수확 및 수집 전에 수행된다.
일부 구현예에서, 세포 조성물은 개별 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 세포 조성물 각각은 조합되어 복수의 개별 공여자로부터의 풀링된 세포 조성물을 생성하였다. 일부 구현예에서, 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다. 일부 측면에서, 개별 공여자로부터 유래된 세포 조성물은 각각 하나 이상의 시점에 또는 조작된 세포 조성물을 생성하기 위한 공정의 특정 단계 후에 하나 이상의 추가의 선택 단계에 개별적으로 적용되고, 이어서 조합되어 풀링된 세포 조성물을 생성한다.
일부 측면에서, 이러한 방법(예를 들어 선택 단계)은 예를 들어 폐쇄 시스템에서, 본원에 제공된 바와 같은 자극 및/또는 조작된 세포 조성물로부터의 복수의 상이한 세포 집단이 농축되고/되거나 분리되는 순차적 선택을 이용함으로써 단일 공정 스트림에 의해 달성된다. 자극 및/또는 조작된 세포 조성물에서 개별 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 자극 및/또는 조작된 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다. 일부 측면에서, 상기 방법(예를 들어 선택 단계(예를 들어 선택 단계))은, 본원에 제공된 바와 같은 샘플(예를 들어 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물)에서 복수의 상이한 세포 집단이 농축 및/또는 분리되는 순차적 선택을 이용함으로써 폐쇄 시스템에서와 같은 단일 공정 흐름으로 달성된다. 일부 측면에서, 동일한 용기 또는 용기 세트, 예를 들어 튜브 세트에서 선택 또는 분리의 수행은 순차적인 양성 및 음성 선택 단계, 이전 단계의 음성 및/또는 양성 분획를 추가 선택의 대상으로 하는 후속 단계를 수행함으로써 달성되고, 여기서 전체 공정는 동일한 튜브 또는 튜브 세트에서 수행된다. 한 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물은, CD4+ 또는 CD8+ 집단 중 하나를 농축하도록 제 1 선택이 수행되고, 제 1 선택에서 비선택 세포가 제2 선택을 위한 세포의 공급원으로 사용되어 CD4+ 또는 CD8+ 집단 중 나머지 다른 하나를 농축하는 순차적인 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 추가 선택(들)을 수행하여 CD4+ 또는 CD8+ 집단 중 하나 또는 둘 다의 서브세트, 예를 들어 CD57- 세포를 농축할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 선택(들)은 CD4+ 또는 CD8+ 집단, 예를 들어 CD27+ 세포 중 하나 또는 둘 다의 서브세트에 대해 농축하도록 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 자극 및/또는 조작된 세포의 조성물은 생존 세포에 대해 순차적인 선택을 받는다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 자극 및/또는 조작된 세포의 조성물 중 세포의 비 또는 총 수는 제어되거나 조정된다.
일부 측면에서, 상기 방법(예를 들어 선택 단계(예를 들어 선택 단계))은, 본원에 제공된 바와 같은 자극 및/또는 조작된 세포의 조성물에서 복수의 상이한 세포 집단이 농축 및/또는 분리되는 순차적 선택을 이용함으로써 폐쇄 시스템에서와 같은 단일 공정 흐름으로 달성된다. 일부 측면에서, 동일한 용기 또는 용기 세트, 예를 들어 튜브 세트에서 선택 또는 분리의 수행은 순차적인 음성 및 양성 선택 단계, 이전 단계의 음성 및/또는 양성 분획를 추가 선택의 대상으로 하는 후속 단계를 수행함으로써 달성되고, 여기서 전체 공정는 동일한 튜브 또는 튜브 세트에서 수행된다. 한 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 자극 및/또는 조작된 세포의 조성물은, CD57+ 집단을 제거하도록 제 1 선택이 수행되는 순차적인 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 추가 선택(들)을 수행하여 CD4+ 또는 CD8+ 집단 중 하나 또는 둘 다, 예를 들어 CD57-CD4+ 또는 CD57-CD8+ 세포를 농축할 수 있다. 한 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 자극 및/또는 조작된 세포의 조성물은 제 1 선택이 CD27- 집단을 제거하도록 수행되는 순차적인 선택을 받는다. 일부 구현예에서, 추가의 선택(들)은 CD4+ 또는 CD8+ 집단, 예를 들어 CD27+CD4+ 또는 CD27+CD8+ 세포 중 하나 또는 둘 다에 대해 농축하도록 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 자극 및/또는 조작된 세포의 조성물은 생존 세포에 대해 순차적인 선택을 받는다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 자극 및/또는 조작된 세포의 조성물 중 세포의 비 또는 총 수는 제어되거나 조정된다.
한 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 자극 및/또는 조작된 세포의 조성물은, CD3+ 집단을 농축하도록 제 1 선택이 수행되는 순차 선택에 적용된다. 일부 구현예에서, 추가 선택(들)은 CD3+ 집단의 서브세트, 예를 들어 CD57- 세포에 대해 농축하도록 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 추가 선택(들)은 생존 가능한 세포에 대해 농축하도록 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 추가 선택(들)은 생존 가능한 CD57-CD3+ 세포의 서브세트, 예를 들어 CD3+CD57-CD4+ 또는 CD57-CD3+CD8+ 세포에 대해 농축하도록 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 선택(들)은 CD3+ 집단, 예를 들어 CD27+ 세포의 서브세트에 대해 농축하도록 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 선택(들)은 생존 세포에 대해 농축하도록 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 선택(들)은 CD27+CD3+ 세포, 예를 들어 생존가능한 CD27+CD3+CD4+ 또는 CD27+CD3+CD8+ 세포의 서브세트를 농축되도록 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 생존 세포를 선택하는 것은 자극 및/또는 조작된 세포 또는 그의 서브세트의 조성물로부터 사멸 세포를 제거하는 것을 포함하거나 또는 그로 구성된다.
한 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 자극 및/또는 조작된 세포의 조성물)은, CD57+ 세포를 제거하도록 제 1 선택이 수행되는 후속 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 추가 선택(들)은 CD57- 집단의 서브세트, 예를 들어 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포를 농축하도록 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 추가 선택(들)은 생존 가능한 세포를 농축하도록 수행될 수 있다. 한 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 자극 및/또는 조작된 세포의 조성물은 제 1 선택이 CD27- 세포를 제거하도록 수행되는 순차적 선택을 받는다. 일부 구현예에서, 추가의 선택(들)은 CD27+ 집단, 예를 들어 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포의 서브세트에 대해 농축하도록 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 생존 가능한 세포의 선택은 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물 또는 이의 서브세트에서 사멸 세포를 제거하는 것을 포함하거나 그로 구성된다.
일부 구현예에서, 본 섹션에 개시된 방법(예를 들어 선택 단계)은 순차적인 선택 기술을 사용하여 수행될 필요가 없다. 일부 구현예에서, 본 섹션에 개시된 방법(예를 들어 선택 단계)은 병행 선택 기술과 조합하여 순차적인 선택 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 단계는 순차적인 선택을 적용하지 않을 수 있거나 또는 폐쇄 시스템 또는 동일한 튜브를 사용하는 용기 세트에서 발생하지 않는 순차적인 선택을 적용할 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 단계는 예를 들어 단일 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 단일 단계에서 완료된다. 일부 구현예에서, 선택 단계는 병행 선택 기술을 사용하여 완수된다. 예를 들어 선택 단계는, 예를 들어 폐쇄 시스템에서 양성 및/또는 음성 선택 단계를 동시에 수행함으로써 달성되고, 여기서 전체 공정는 동일한 튜브 또는 튜브 세트에서 수행된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물)은, 자극 및/또는 조작된 세포의 조성물이 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼에 로딩되는 병행 선택에 적용되고, 여기서 각 칼럼은 세포 집단의 선택을 수행한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼은 개별적으로 CD57-, CD3+, CD4+ 또는 CD8+ 집단의 선택을 수행한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼은 동일한 세포 집단의 선택을 수행한다. 예를 들어 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼은 CD57- 세포의 선택을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼은 개별적으로 CD27+, CD3+, CD4+, 또는 CD8+ 집단의 선택을 수행한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼은 동일한 세포 집단의 선택을 수행한다. 예를 들어 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼은 CD27+ 세포의 선택을 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 또는 겔 투과 크로마토그래피를 포함하는 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼은 독립적으로 동일한 세포 집단의 선택을 수행한다. 일부 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 또는 겔 투과 크로마토그래피를 포함하는 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼은 독립적으로 상이한 세포 집단의 선택을 수행한다. 일부 구현예에서, 추가 선택(들)은 병행 선택을 통해 선택된 하나 또는 모든 세포 집단의 서브세트에 대해 농축하도록 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포(예를 들어 CD57- 세포)를 함유하는 자극 및/또는 조작된 세포의 조성물은 병행 선택에 적용되며, 여기서 병행 선택은 CD4+ 집단 및 CD8+ 집단 또는 CD3+ 집단에 대해 농축하도록 수행된다. 일부 구현예에서, 표적 세포(예를 들어 CD27+ 세포)를 함유하는 자극 및/또는 조작된 세포의 조성물은 병행 선택에 적용되며, 여기서 병행 선택은 CD4+ 집단 및 CD8+ 집단 또는 CD3+ 집단에 대해 농축하도록 수행된다.
일부 구현예에서, 선택 단계는 여기 기재된 바와 같은 선택 제제로 표지된 비드를 사용하여 수행될 수 있고, 예를 들어 제 2 선택 제제로 표지된 비드를 사용하거나 또는 상기 기재된 바와 같은 칼럼 크로마토그래피에 양성 분획을 노출시킴으로써 제 2 선택 마커를 농축하도록 양성 분획의 추가 양성 선택 후에 제 1 선택 단계의 양성 및 음성 분획이 유지될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 선택 단계는 본원에 기재된 바와 같은 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 선택 단계는 비드 분리 및 칼럼 크로마토그래피를 포함하는 하나 이상의 방법을 사용하여 달성된다. 일부 구현예에서, 선택 단계는 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 달성된다.
일부 측면에서, 단일 또는 동일한 분리 또는 분리 용기 또는 용기 세트, 예를 들어 단일 칼럼 또는 칼럼 세트 및/또는 동일한 튜브 또는 튜브 세트에서 또는 동일한 분리 매트릭스 또는 배지 또는 시약, 예를 들어 동일한 자성 매트릭스, 친화도 표지된 고체 지지체 또는 항체 또는 기타 결합 파트너를 사용하여 복수의 집단을 분리하는 것은, 예를 들어 비용, 시간, 복잡성, 샘플 처리의 필요성, 자원, 시약 또는 장비 사용의 감소를 초래하는 분리를 간소화하는 특성을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 특징은 방법과 관련된 비용, 효율, 시간 및/또는 복잡성을 최소화하고/하거나 감염, 오염 및/또는 온도 변화로 인한 피해와 같은 세포 생성물에 대한 잠재적인 피해를 피한다는 점에서 유리하다. 여기에 제공된 방법은 온-칼럼 자극과 조합된 세포 선택 전 또는 후 둘 다에 다중 선택 단계로 표적 집단의 농축을 가능하게 한다.
여기에 제공된 방법은 성공적으로 자극 및/또는 조작된 세포의 선택 및 농축을 더 가능하게 한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 상기 기재된 순차 선택, 병행 선택 또는 단일 선택 절차가 사용되어 재조합 수용체(예를 들어 CAR, TCR)를 발현하는 자극 세포를 확인할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체(예를 들어 CAR)를 발현하는 세포는, 서브세트 세포, 예를 들어 CD4+ CAR+ T 세포, CD8+ CAR+ T 세포, 및/또는 생존 가능한 세포에 대해 더 농축될 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 단계는 재조합 수용체(예를 들어 CAR, TCR)를 발현하는 세포 및/또는 이의 서브세트의 비율, 농도 또는 총 수의 제어 또는 조정을 가능하게 한다.
일반적으로, 고정상(예를 들어 선택 수지)의 결합 용량은 특정 수의 표적 모이어티, 예를 들어 T 세포와 같은 표적 세포를 선택하기 위해 얼마나 많은 고정상이 필요한지에 영향을 미친다. 결합 용량, 예를 들어 고정상(예를 들어 선택 수지)의 mL 당 고정될 수 있는 표적 세포의 수를 사용하여 하나 이상의 칼럼 상에 포획되는 표적 세포의 수를 결정하거나 제어할 수 있다. 하나 이상의 크로마토그래피 칼럼이 여기에 개시된 온-칼럼 세포 선택 및 자극을 위해 사용될 수 있다. 복수의 칼럼이 사용되는 경우, 상기는 순차적으로, 병행하여 또는 이의 적절한 조합으로 배열될 수 있다. 따라서, 고정상(예를 들어 선택 수지)의 결합 용량을 사용하여 단일 칼럼 접근법에서의 시약 양 또는 다중 칼럼 접근법에서 각 칼럼에 대한 시약 양을 표준화할 수 있다.
일부 구현예에서, 여기에 사용된 고정상의 결합 용량은, 과량의 표적 세포가 고정상에 로딩될 경우, 주어진 용매 및 세포 농도 조건에서 고정상에 결합된 표적 세포의 최대 수이다. 일부 구현예에서, 상기 결합 용량은 고정상 mL 당 (약) 100만±25 백만 표적 세포(예를 들어 T 세포) 범위이다. 일부 구현예에서, 여기에 개시된 고정상(예를 들어 선택 수지)의 정적 결합 용량은 고정상 mL 당 약 75 백만 내지 약 125 백만 표적 세포 범위이다. 한 측면에서, 온-칼럼 세포 선택 및 자극을 위해 여기에 사용된 고정상의 결합 용량은 정적 결합 용량이다. 일부 구현예에서, 상기 정적 결합 용량은 고정상, 예를 들어 특정 용매 및 세포 농도 조건에서에서 고정될 수 있는 세포의 최대량이다. 일부 구현예에서, 여기에 개시된 고정상(예를 들어 선택 수지)의 정적 결합 용량은 고정상 mL 당 약 50 백만 내지 약 100 백만 표적 세포 범위이다. 일부 구현예에서, 상기 정적 결합 용량은 고정상 mL 당 (약) 100만±25 백만 표적 세포(예를 들어 T 세포) 범위이다. 일부 구현예에서, 여기에 개시된 고정상(예를 들어 선택 수지)의 정적 결합 용량은 고정상 mL 당 약 75 백만 내지 약 125 백만 표적 세포 범위이다. 일부 구현예에서, 고정상(예를 들어 선택 수지)의 정적 결합 용량은, 고정상 mL 당 약 10 백만 내지 약 20 백만, 약 20 백만 내지 약 30 백만, 약 30 백만 내지 약 40 백만, 약 40 백만 내지 약 50 백만, 약 50 백만 내지 약 60 백만, 약 60 백만 내지 약 70 백만, 약 70 백만 내지 약 80 백만, 약 80 백만 내지 약 90 백만, 약 90 백만 내지 약 100 백만, 약 110 백만 내지 약 120 백만, 약 120 백만 내지 약 130 백만, 약 130 백만 내지 약 140 백만, 약 140 백만 내지 약 150 백만, 약 150 백만 내지 약 160 백만, 약 160 백만 내지 약 170 백만, 약 170 백만 내지 약 180 백만, 약 180 백만 내지 약 190 백만 또는 약 190 백만 내지 약 200 백만 표적 세포이다.
일부 구현예에서, 여기에 사용된 고정상의 결합 용량은, 결합되지 않은 표적 세포의 유의미한 돌파구가 발생하기 전 주어진 흐름 조건 하에 고정상에 결합한 표적 세포의 수이다. 한 측면에서, 온-칼럼 세포 선택을 위해 여기에 사용된 고정상의 결합 용량은 동적 결합 용량, 즉 샘플 적용 중 패킹된 크로마토그래피 칼럼의 작동 조건 하에서의 결합 용량이다. 일부 구현예에서, 동적 결합 용량은 표적 세포의 공지된 농도를 함유하는 샘플을 로딩하고 통과액을 모니터닝함으로써 결정되고, 결합되지 않은 표적 세포가 칼럼을 통과하기 전에 표적 세포는 특정 중단점까지 고정상에 결합할 것이다. 일부 구현예에서, 상기 동적 결합 용량은 고정상 mL 당 (약) 100만±25 백만 표적 세포(예를 들어 T 세포) 범위이다. 일부 구현예에서, 여기에 개시된 고정상(예를 들어 선택 수지)의 동적 결합 용량은 고정상 mL 당 (약) 75 백만 내지 (약) 125 백만 표적 세포 범위이다. 일부 구현예에서, 여기에 개시된 고정상(예를 들어 선택 수지)의 동적 결합 용량은 고정상 mL 당 약 50 백만 내지 약 100 백만 표적 세포 범위이다. 일부 구현예에서, 고정상(예를 들어 선택 수지)의 동적 결합 용량은, 고정상 mL 당 약 10 백만 내지 약 20 백만, 약 20 백만 내지 약 30 백만, 약 30 백만 내지 약 40 백만, 약 40 백만 내지 약 50 백만, 약 50 백만 내지 약 60 백만, 약 60 백만 내지 약 70 백만, 약 70 백만 내지 약 80 백만, 약 80 백만 내지 약 90 백만, 약 90 백만 내지 약 100 백만, 약 110 백만 내지 약 120 백만, 약 120 백만 내지 약 130 백만, 약 130 백만 내지 약 140 백만, 약 140 백만 내지 약 150 백만, 약 150 백만 내지 약 160 백만, 약 160 백만 내지 약 170 백만, 약 170 백만 내지 약 180 백만, 약 180 백만 내지 약 190 백만 또는 약 190 백만 내지 약 200 백만 세포이다.
일부 구현예에서, 상기 고정상은 20 mL이다. 일부 구현예에서, 상기 고정상은 20 억±5 억 세포의 결합 용량을 갖는다.
일반적으로, 크로마토그래피 방법은 유체 크로마토그래피, 전형적으로 액체 크로마토그래피이다. 일부 측면에서, 크로마토그래피는, 세포, 예를 들어 표적 세포를 함유하는 유체 샘플이, 예를 들어 중력 흐름에 의해 또는 크로마토그래피 매트릭스를 함유하는 칼럼의 한쪽 말단에서 펌프에 의해 적용되고, 상기 유체 샘플이 칼럼의 나머지 다른 말단의 칼럼에 존재하는 통과해 흐르는 방식으로 수행될 수 있다. 또한, 크로마토그래피는, 분리될 세포를 함유하는 유체 샘플이, 예를 들어 피펫 팁 내에 패킹된 크로마토그래피 매트릭스를 함유하는 칼럼의 한쪽 말단에서 피펫에 의해 적용되고, 상기 유체 샘플이 들어가서 칼럼의 나머지 다른 말단에 있는 로마토그래피 매트릭스/피펫 팁에 존재하는 "상하(up and down)" 방식으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 크로마토그래피는 또한 크로마토그래피 물질(고정상)이, 예를 들어 흔들기, 회전 또는 예를 들어 피펫에 의해 유체 샘플의 반복적인 접촉 및 제거 하에서 세포를 함유하는 샘플과 인큐베이션되는 배치 모드(batch mode)로 수행될 수 있다.
일부 측면에서, 물질이 세포의 크로마토그래피 분리에 적합한 한, 임의의 물질이 본 발명의 맥락에서 크로마토그래피 매트릭스로 이용될 수 있다. 특정 측면에서, 적합한 크로마토그래피 물질은, 세포 분리 및/또는 세포 분리를 위해 원하는 조건 하에 패킹된 크로마토그래피 칼럼으로 사용될 경우, 세포 생존 능력에 적어도 무해하거나 본질적으로 무해하거나, 예를 들어 유해하지 않다. 일부 측면에서, 크로마토그래피 매트릭스는 미리 정의된 위치(location), 전형적으로 미리 정의된 적소(position)에 남아있는 반면, 분리될 샘플 및 그 안에 포함된 성분의 위치는 변경된다. 따라서, 일부 측면에서, 크로마토그래피 매트릭스는 "고정상(stationary phase)"이다.
전형적으로, 각각의 크로마토그래피 매트릭스는 고체 또는 반고체 상의 형태를 갖는 반면, 분리/분리될 표적 세포를 함유하는 샘플은 유체상이다. 크로마토그래피 분리를 달성하는 데 사용되는 이동상은 마찬가지로 유체상이다. 크로마토그래피 매트릭스는, 종이 기질 또는 막을 포함(실시예 섹션 참조)하는 미립자 물질(임의의 적절한 크기 및 모양) 또는 단일체 크로마토그래피 물질일 수 있다. 따라서, 크로마토그래피는 칼럼 크로마토그래피 및 평면 크로마토그래피 둘 다일 수 있다. 표준 크로마토그래피 칼럼 외에, 여기에 기재된 바와 같은 칼럼 기반/통과액 방식 기반 세포의 크로마토그래피 분리를 위해 양방향 흐름 또는 피펫 팁을 허용하는 칼럼이 사용될 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 양방향 흐름을 허용하는 피펫 팁 또는 칼럼은 본 발명의 방법에 유용한 크로마토그래피 칼럼에 의해서 구성된다. 일부 측면에서, 미립자 매트릭스 물질이 사용되고, 상기 미립자 매트릭스 물질은, 예를 들어 약 5 ㎛ 내지 약 200 ㎛ 또는 약 5 ㎛ 내지 약 400 ㎛ 또는 약 5 ㎛ 내지 약 600 ㎛의 평균 입자 크기를 가질 수 있다. 일부 측면에서, 평면 크로마토그래피가 사용되고, 매트릭스 물질은, 평면 크로마토그래피에 적합한 임의의 물질, 예를 들어 통상적인 셀룰로스 기반 또는 유기 중합체 기반 막(예를 들어 종이 막, 니트로셀룰로스 막 또는 폴리비닐리덴 디플로우라이드(polyvinylidene difluoride, PVDF) 막) 또는 실리카 코팅 유리판일 수 있다. 한 구현예에서, 크로마토그래피 매트릭스/고정상은 비-자성 재료 또는 비-자화가능한 재료이다.
일부 측면에서, 크로마토그래피 매트릭스/고정상은 비자성 물질 또는 비자화 가능 물질이다. 상기 물질은 유도체화 실리카 또는 가교된 겔을 포함할 수 있다. 가교된 겔(전형적으로 비드 형태로 제조됨)은 가교된 다당류와 같은 천연 중합체를 기반으로 할 수 있다. 폴리사카라이드 매트릭스의 예는 제한되지는 않지만 아가로스 겔(agarose gel)(예를 들어 상이한 비드 및 포어 크기로 상업적으로 입수가능한 SuperflowTM 아가로스 또는 Sepharose® 물질 예를 들어 SuperflowTMSepharose®) 또는 가교된 덱스트란(들)의 겔을 포함한다. 추가의 예시적인 구체예는 Sephadex® 또는 Superdex®(둘 다 GE Healthcare로부터 구입가능함)로서 (다양한 비드 크기로 그리고 다양한 포어 크기를 갖는 것으로) 상업적으로 입수가능한, 덱스트란이 공유결합되는 미립자 가교된 아가로스 매트릭스이다. 상기 크로마토그래피 물질의 또다른 예시적 구체예는 또한 GE Healthcare로부터 구입가능한 상이한 비드 및 포어 크기로 입수가능한 Sephacryl®이다.
일부 구현예에서, 가교된 겔은 또한 합성 중합체, 예를 들어 자연에서 일어나지 않는 중합체 클래스에 기반할 수 있다. 적합한 예는 아가로스 겔 또는 가교된 덱스트란(들) 겔을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 가교된 겔은 또한 합성 중합체, 즉 자연에서 발생하지 않는 중합체 부류에 기초할 수 있다. 일반적으로, 세포 분리를 위한 크로마토그래피 고정상이 기초하는 상기 합성 중합체는 극성 단량체 단위를 갖고, 따라서 그 자체가 극성인 중합체이다. 따라서, 일부 경우에, 상기 극성 중합체는 친수성이다. 친수성 분자(지방성이라고도 함)는 일부 측면에서 물 분자와 쌍극자-쌍극자 상호 작용을 형성할 수 있는 모이어티를 함유한다. 일반적으로, 소수성 분자(친유성이라고도 함)는 물과 분리되는 경향을 갖는다.
적합한 합성 중합체의 예시적인 예는 폴리아크릴아미드(들), 스티렌-디비닐벤젠 겔 및 아크릴레이트 및 디올의 공중 합체 또는 아크릴아미드 및 디올의 공중합체이다. 예시적인 예는 Fractogel®로 시판되는 폴리메타크릴레이트 겔이다. 추가 예는 Toyopearl®로 시판되는 에틸렌 글리콜 및 메타크릴레이트의 공중합체이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 고정상은 또한 천연 및 합성 중합체 성분, 예를 들어 복합 매트릭스 또는 복합물 또는 다당류 및 아가로스의 공중합체, 예를 들어 폴리아크릴아미드/아가로스 복합물 또는 다당류 및 N, N'-메틸렌비스아크릴아미드의 공중합체를 포함할 수 있다. 덱스트란 및 N, N'-메틸렌비스아크릴아미드의 공중합체의 예시적인 예는 상기 언급된 Sephacryl® 계열 물질이다. 유도체화 실리카는 합성 또는 천연 중합체에 결합된 실리카 입자를 포함할 수 있다. 상기 구현예의 예는 다당류 접목 실리카, 폴리비닐-피롤리돈 접목 실리카, 폴리에틸렌 옥사이드 접목 실리카, 폴리(2-히드록시에틸아스파트아미드) 실리카 및 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 접목 실리카를 포함하나 이에 국한되지 않는다.
본 발명에 이용되는 크로마토그래피 매트릭스는, 일부 구현예에서, 예를 들어 여기에 기재된 바와 같은 제거 카트리지에 사용될 경우 겔 여과(크기 배제로도 공지) 매트릭스이다. 겔 여과는 적어도 본질적으로 분리될 세포와 상호 작용을 하지 않도록 설계된 속성으로 특성화될 수 있다. 따라서, 겔 여과 매트릭스는 주로 크기를 기준으로 여기에 정의된 바와 같은 세포 또는 기타 생물학적 독립체의 분리를 가능하게 한다. 각각의 크로마토그래피 매트릭스는 상기 언급된 바와 같은 전형적으로 미립자 다공성 물질이다. 크로마토그래피 매트릭스는 특정 배제 한계를 가질 수 있으며, 이는 전형적으로 분자가 세공에 들어가는 것에서 완전히 배제되는 상기 분자량의 관점에서 정의된다. 크기 배제 한계를 정의하는 각각의 분자량은, 분리될 표적 세포(또는 생물학적 독립체)의 무게에 해당하는 무게 이하로 선택될 수 있다. 상기 구현예에서, 표적 세포는 크기 배제 크로마토그래피 매트릭스의 세공으로 들어가는 것이 방지된다. 마찬가지로, 친화도 크로마토그래피 매트릭스인 고정상은 선택된 표적 세포의 크기보다 더 작은 크기의 세공을 가질 수 있다. 예시적인 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 매트릭스 및/또는 겔 여과 매트릭스는 0 내지 약 500 nm의 평균 세공 크기를 갖는다.
수용체 결합 분자 또는 경쟁 시약과 같은 샘플(예를 들어 공여자 샘플)에 존재하는 다른 성분은 세공의 배제 한계 이하의 크기를 가질 수 있고, 상기는 크기 배제 크로마토그래피 매트릭스의 세공에 들어갈 수 있다. 세공 부피에 부분적으로 또는 완전히 들어갈 수 있는 상기 성분 중, 세공 부피에 덜 접근하는 보다 큰 분자는 일반적으로 먼저 용출되는 반면, 가장 작은 분자는 마지막에 용출된다. 일부 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피 매트릭스의 배제 한계는 표적 세포의 최대 폭 미만이 되도록 선택된다. 따라서, 세공 부피에 접근하는 성분은, 일반적으로 표적 세포보다 크기 배제 크로마토그래피 매트릭스 안/상에서 더 오래 머무를 것이다. 따라서, 표적 세포는 샘플의 다른 물질/성분과 별개로 크로마토그래피 칼럼의 용출액에서 수집될 수 있다. 따라서, 수용체 결합 시약 또는 적용 가능한 경우 경쟁 시약과 같은 성분은 표적 세포보다 겔 여과 매트릭스에서 보다 나중 시점에 용출된다. 겔 투과 매트릭스가, 샘플에 존재하는 수용체 결합 시약 및/또는 경쟁 시약과 같은 시약에 결합할 수 있는 결합 부위, 예를 들어 결합 부위 Z를 포함하는 친화도 시약(일반적으로 상기에 공유 결합)을 포함하는 경우, 상기 분리 효과는 더 증가될 것이다. 수용체 결합 시약 및/또는 경쟁 시약은 친화도 시약의 결합 부위 Z에 의해 결합될 것이고, 이로써 겔 투과 매트릭스 상에 고정될 것이다. 상기 방법은 일반적으로 본 발명에 사용된 바와 같은 제거 카트리지에서 수행되고, 일부 구현예에서 본 발명에 따른 방법, 조합 및 키트는 상기 겔 여과 매트릭스를 포함하고/하거나 이용한다. 그러므로 각 방법에서, 세포는 크기를 기준으로 분리된다.
본 발명에 이용되는 크로마토그래피 매트릭스는 또한 하나 이상의 자기적 유인 가능 입자 또는 자성 유체와 같은 자기적 유인 가능 물질을 포함할 수 있다. 각각의 자기적 유인 가능 입자는 표적 세포에 결합할 수 있는 결합 부위를 갖는 다량체화 시약 또는 친화도 시약을 포함할 수 있다. 자기적 유인 가능 입자는 반자성, 강자성, 상자성 또는 초상자성 물질을 함유할 수 있다. 초상자성 물질은 영구 자화를 초래하지 않으면서 유도 자기장이 있는 자기장에 반응한다. 산화철을 기반으로 한 자성 입자는, 예를 들어 Dynal Biotech의 Dynabeads®로서, Miltenyi Biotec의 자성 MicroBeads로서, CPG Inc.의 자성 다공성 유리 비드로서 및 몇 가지만 예로 들자면 Roche Applied Science, BIOCLON, BioSource International Inc., micromod, AMBION, Merck, Bangs Laboratories, Polysciences 또는 Novagen Inc.와 같은 다양한 다른 출처에서 상업적으로 이용 가능하다. 초상자성 Co 및 FeCo에 기초한 자성 나노 입자 및 강자성 Co 나노 결정이, 예를 들어 문헌 「Hutten, A. 등, (J. Biotech. (2004), 112, 47-63)」에 기재되어 있다. 그러나, 일부 구현예에서, 본 발명에 이용된 크로마토그래피 매트릭스는 임의의 자기적 유인 가능 물질이 없다.
수용체 결합 시약
위에서 기술한 바와 같이, 특정 측면에서, 본원에서 제공된 상기 방법은 수용체 결합 시약을 사용한다. 일부 구현예에서, 이 섹션에서 기술된 상기 시약은 수용체 결합 시약이다. 일부 구현예에서, 상기 수용체 결합 시약은 세포의 표면 상의 분자, 예를 들어 세포 표면 분자에 결합한다. 일부 경우에, 상기 세포 표면 분자는 선택 마커이다. 일부 구현예에서, 상기 수용체 결합 시약은 샘플 중의 하나 이상의 세포에 의해서 발현된 선택 마커에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용 전체에 걸쳐 분자, 예를 들어 세포 표면 분자 또는 세포 표면 수용체에 대한 특이적 결합에 대한 언급은 제제가 이러한 분자에만 결합한다는 것을 반드시 의미하지는 않는다. 예를 들어 분자에 특이적으로 결합하는 시약은 일반적으로는 예를 들어 면역 분석, BIAcore® KinExA 3000 인스트루먼트(Sapidyne Instruments, Boise, ID) 또는 다른 분석에 의해서 결정된 훨씬 낮은 친화도를 갖는 다른 분자에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 특정 자극 조건하에 그의 친화도 또는 결합력이 충분한 통계학적 크기의 랜덤 펩티드 또는 폴리펩티드의 수집에 대해 동일한 제제의 평균 친화도 또는 결합력에 비해 적어도 5 배 많이, 예를 들어 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 250 또는 500 배 많이, 또는 심지어는 적어도 1000 배 많이 되도록 표적 분자에 결합하는 시약의 능력을 갖는다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 표적 세포(예를 들어 T 세포)는 세포 표면 상에 분자, 예를 들어 선택 마커를 갖거나 발현하여, 선택될 세포가 하나 이상의 특이적인 공통 분자(예를 들어 선택 마커)의 존재에 의해 정의된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은 또한 분자(예를 들어 선택 마커)가 없는 추가 세포를 함유할 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, T 세포는 다중 세포 유형, 예를 들어 적혈구 또는 B 세포를 함유하는 샘플(예를 들어 공여자 샘플)에서 선택될 수 있다. 선택 마커 및 수용체 분자는 본원에서는 호환가능하게 세포 표면 분자를 지칭하는 것으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 표면, 예를 들어 표적 세포 표면에 위치한 수용체 분자는 본 발명에 따른 방법에서 크로마토그래피 분리 과정 중 세포 표면에 공유 또는 비공유 결합된 상태로 유지되는 한 임의의 분자일 수 있다. 수용체 분자는 수용체 결합 시약이 유도될 수 있는 분자이다. 일부 구현예에서, 수용체는 막 수용체 단백질과 같은 펩티드 또는 단백질이다. 일부 구현예에서, 수용체는 지질, 다당류 또는 핵산이다. 단백질인 수용체는 주변 막 단백질 또는 통합된 막 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 막에 걸쳐 하나 이상의 도메인이 있을 수 있다. 특정 구현예에서, 수용체 분자는 면역 세포의 표면 단백질, 예를 들어 CD4, CD8, 또는 CD57이다. 특정 구현예에서, 수용체 분자는 면역 세포의 표면 단백질, 예를 들어 CD4, CD8, 또는 CD27이다. 일부 경우에, T 세포에 있어서 상기 수용체 분자는 CD3이다. 일부 경우에, T 세포에 있어서 상기 수용체 분자는 CD4 또는 CD8이다. 일부 구현예에서, 수용체 분자는 원하는 세포 집단 또는 서브세트, 예를 들어 혈액 세포의 집단 또는 서브세트, 예를 들어 림프구(예를 들어 T 세포, CD57+ T 세포, CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포)를 정의하는 항원일 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체 분자는 원하는 세포 집단 또는 서브세트를 정의하는 항원, 예를 들어 혈액 세포, 예를 들어 림프구 (예를 들어 T 세포, CD27+ T 세포, CD4+ T 세포, 또는 CD8+ T 세포)의 집단 또는 서브세트일 수 있다.
일부 측면에서, 세포 표면 분자, 예를 들어 선택 마커는, 원하는 세포 집단 또는 서브세트, 예를 들어 혈액 세포의 집단 또는 서브세트, 예를 들어 림프구(예를 들어 T 세포, T 헬퍼 세포, 예를 들어 CD57- T 세포, CD3+ T 세포, CD8+ T세포, CD4+ T 헬퍼 세포, B 세포 또는 자연 살해 세포), 단핵구 또는 줄기 세포, 예를 들어 CD34-양성 말초 줄기 세포 또는 Nanog 또는 Oct-4 발현 줄기 세포를 정의하는 항원일 수 있다. 일부 측면에서, 세포 표면 분자, 예를 들어 선택 마커는, 원하는 세포 집단 또는 서브세트, 예를 들어 혈액 세포의 집단 또는 서브세트, 예를 들어 림프구(예를 들어 T 세포, T 헬퍼 세포, 예를 들어 CD27+ T 세포, CD3+ T 세포, CD8+ T세포, CD4+ T 헬퍼 세포, B 세포 또는 자연 살해 세포), 단핵구 또는 줄기 세포, 예를 들어 CD34-양성 말초 줄기 세포 또는 Nanog 또는 Oct-4 발현 줄기 세포를 정의하는 항원일 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 T 세포 또는 T 세포의 하위 세트의 표면 상에 발현된 마커, 예를 들어 CD57, CD25, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA 및/또는 CD45RO일 수 있다. T 세포의 예로는 CMV 특이적 CD8+ T 림프구, 세포 독성 T 세포, 기억 T 세포 및 조절 T 세포(Treg)와 같은 세포가 포함된다. Treg의 예시적인 예는 CD4 CD25 CD45RA Treg 세포를 포함하고, 기억 T 세포의 예시적인 예는 CD62L CD8+ 특이적 중앙 기억 T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 수용체 결합 시약은 결합 부위 B를 갖거나 함유한다. 특정 구현예에서, 결합 부위 B는 1가이다. 일부 측면에서, 1가 결합 부위 B는 면역글로불린 유사 기능, 압타머 또는 MHC 분자를 가진 1가 항체 단편 또는 단백질성 결합 분자이거나 상기를 함유한다. 1가 항체 단편의 예는 Fab 단편, FV 단편 및 2가 단일 사슬 Fv 단편을 포함한 단일 사슬 Fv 단편(scFv)을 포함하나 이에 국한되지 않는다. (재조합) 항체 단편의 예는 Fab 단편, FV 단편, 단일 사슬 Fv 단편(scFv), 2가 항체 단편, 예를 들어 (Fab)2'-단편, 디아바디, 트리아바디(Iliades, P., 등, FEBS Lett (1997) 409, 437-441), 데카바디(Stone, E., 등, Journal of Immunological Methods (2007) 318, 88-94) 및 기타 도메인 항체(Holt, L.J., 등, Trends Biotechnol. (2003), 21, 11, 484-490)이다. 일부 구현예에서, 수용체 분자 결합 시약의 하나 이상의 결합 부위는 "듀오칼린(duocalin)"으로도 공지된 2량체 리포칼린 뮤테인과 같은 2가 단백질성 인공 결합 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체 결합 시약은 단일 제2 결합 부위를 가질 수 있으며, 즉 1가일 수 있다. 1가 수용체 결합 시약의 예는, 1가 항체 단편, 항체 유사 결합 특성을 갖는 단백질성 결합 분자 또는 MHC 분자를 포함하나 이에 국한되지 않는다.
적합한 단백질성 결합 분자의 추가 예는 EGF 유사 도메인, 크링글 도메인(Kringle-domain), 피브로넥틴 유형 I 도메인, 피브로넥틴 유형 Ⅱ 도메인, 피브로넥틴 유형 Ⅲ 도메인, PAN 도메인, G1a 도메인, SRCR 도메인, Kunitz/Bovine 췌장 트립신 억제제 도메인, 텐다미스타트(tendamistat), Kazal-유형 세린 프로테아제 억제제 도메인, Trefoil(P-유형) 도메인, von Willebrand 인자 유형 C 도메인, 아나필라톡신 유사 도메인, CUB 도메인, 다이로글로블린(thyroglobulin) 유형 I 반복, LDL-수용체 클래스 A 도메인, Sushi 도메인, 결합 도메인, 트롬보스폰딘(Thrombospondin) 유형 I 도메인, 면역 글로불린 도메인 또는 면역 글로불린 유사 도메인 (예를 들어 도메인 항체 또는 낙타 중쇄 항체), C-유형 렉틴 도메인, MAM 도메인, von Willebrand 인자 유형 A 도메인, 소마토메딘(Somatomedin) B 도메인, WAP-유형 4개의 이황화물 코어 도메인, F5/8 유형 C 도메인, 헤모펙신(Hemopexin) 도메인, SH2 도메인, SH3 도메인, 라미닌-유형 EGF 유사 도메인, C2 도메인, "카파바디(Kappabodies)"(Ill. 등, Protein Eng (1997) 10, 949-57 참조, 소위 "미니바디(minibody)"(Martin 등, EMBO J (1994) 13, 5303-5309), 디아바디(Holliger 등, PNAS USA (1993)90, 6444-6448. 참조), 소위 "야누시스(Janusis)"(Traunecker 등, EMBO J (1991) 10, 3655-3659 또는 Traunecker 등, Int J Cancer (1992) Suppl 7, 51-52. 참조), 나노바디, 마이크로바디, 아필린(affilin), 아피바디(affibody), 크노틴(knottin), 유비퀴틴, 아연-핑거 단백질, 자가 형광 단백질 또는 류신-리치 반복 단백질이다. 항체 유사 기능을 갖는 핵산 분자의 예는 압타머이다. 압타머는 정의된 3 차원 모티프로 접히고, 주어진 표적 구조에 대해 높은 친화도를 나타낸다.
특정 측면에서, 수용체 결합 단백질은 결합 파트너 C를 함유한다. 일부 측면에서, 수용체 결합 시약에 포함된 결합 파트너 C는, 예를 들어 탄화수소 기반(중합체 포함)일 수 있고, 질소-, 인-, 황-, 카르벤-, 할로겐- 또는 슈도할로겐 기를 포함할 수 있다. 상기는 알코올, 유기산, 무기산, 아민, 포스핀, 티올, 이황화물, 알칸, 아미노산, 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 지질, 당류, 올리고당류 또는 다당류일 수 있다. 추가 예로서, 상기는 또한 양이온, 음이온, 다중 양이온, 다중 음이온, 다중 양이온, 전해질, 고분자 전해질, 탄소 나노튜브 또는 탄소 나노폼(nanofoam)일 수 있다. 일반적으로, 상기 결합 파트너는 다른 물질에 대해서보다 다량체화 시약의 결합 부위에 대해 보다 높은 친화도를 갖는다. 각각의 결합 파트너의 예는 크라운 에테르, 면역 글로불린, 이의 단편 및 항체 유사 기능을 갖는 단백질성 결합 분자를 포함하나 이에 국한되지 않는다.
일부 구현예에서, 수용체 결합 시약에 포함된 결합 파트너 C는 비오틴을 포함하고, 친화도 시약은 비오틴에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 유사체 또는 아비딘 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체 결합 시약에 포함된 결합 파트너 C는 스트렙타비딘 또는 아비딘에 가역적으로 결합하는 비오틴 유사체를 포함하고, 친화도 시약은 각각의 비오틴 유사체에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘, 아비딘, 스트렙타비딘 유사체 또는 아비딘 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체 결합 시약에 포함된 결합 파트너 C는 스트렙타비딘 또는 아비딘 결합 펩티드를 포함하고, 친화도 시약은 각각의 스트렙타비딘 또는 아비딘 결합 펩티드에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘, 아비딘, 스트렙타비딘 유사체 또는 아비딘 유사체를 포함한다.
일부 구현예에서, 수용체 결합 시약에 포함된 결합 파트너는 스트렙타비딘 결합-펩티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 서열은 일반적인 화학식 His-Pro-Xaa(여기서 Xaa는 글루타민, 아스파라긴 또는 메티오닌)를 갖는 서열을 함유하고, 예를 들어 서열번호 78에 제시된 서열에 함유된 것이다. 일부 구현예에서, 펩티드 서열은 서열번호 69에 제시에 제시된 일반식, 예를 들어 서열번호 79에 제시된 것을 갖는다. 한 구체예에서, 펩티드 서열은 Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(Strep-tag®로도 명명, 서열번호 75에 제시됨)이다. 한 구체예에서, 상기 펩티드 서열은 Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (Strep-tag®로도 명명, 서열번호 90에 제시됨)이다. 한 구체예에서, 펩티드 서열은 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(Strep-tag® Ⅱ로도 명명, 서열번호 69에 제시됨)이고, 이는 미국특허 제6,103,493호에 기재되어 있고, 예를 들어 Strep-Tactin® 상표로 시판된다. 스트렙타비딘 결합-펩티드는, 예를 들어 미국특허 제5,506,121호에 기재된 "Strep-tag®"와 같은 단일 펩티드 또는 예를 들어 국제공개공보 제WO 02/077018호 또는 미국특허 제7,981,632호에 기재된 바와 같은 2개 이상의 개별 결합 분자의 순차적 배열을 갖는 스트렙타비딘 결합-펩티드일 수 있다.
일부 구현예에서, 수용체 결합 시약의 결합 파트너 C는 친화도 태그로서 당업자에게 공지된 모이어티를 포함한다. 상기 구현예에서, 친화도 시약은 상응하는 결합 파트너, 예를 들어 친화도 태그에 결합하는 것으로 공지된 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 공지된 친화도 태그의 몇 가지 예시적인 예로서, 수용체 결합 시약에 포함된 결합 파트너는 디니트로페놀 또는 디곡 시게닌, 올리고히스티딘, 폴리히스티딘, 면역 글로불린 도메인, 말토스 결합 단백질, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(glutathione-S-transferase, GST), 키틴 결합 단백질(chitin binding protein, CBP) 또는 티오레독신, 칼모둘린 결합 펩티드(calmodulin binding peptide, CBP), FLAG'-펩티드, HA-태그, VSV-G- 태그, HSV-태그, T7 에피토프, 말토오스 결합 단백질(maltose binding protein, MBP), 단순 포진 바이러스 당 단백질 D 서열의 HSV 에피토프, 전사 인자 c-myc 서열의 "myc" 에피토프, V5-태그 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)를 포함할 수 있다. 상기 구현예에서, 친화도 시약의 하나 이상의 결합 부위 사이에 형성된 복합체, 이 경우 항체 또는 항체 단편 및 항원은 자유 항원, 즉 자유 펩티드(에피토프 태그) 또는 자유 단백질(예를 들어 MBP 또는 CBP)을 첨가함으로써 경쟁적으로 파괴될 수 있다. 친화도 태그는 올리고뉴클레오티드 태그일 수도 있다. 상기 올리고뉴클레오티드 태그는, 예를 들어 친화도 시약에 연결되거나 포함된 상보적 서열을 가진 올리고뉴클레오티드와 혼성화하는 데 사용될 수 있다.
국제공개공보 제WO 2013/011011호에 따라(모든 목적을 위해 이의 전문이 여기에 참조로 포함됨), 수용체 결합 시약과 표적 세포 상의 수용체 분자 사이의 결합 강도는, 수용체 결합 시약을 통해 친화도 시약에 대한 표적 세포의 결합 가역성에 필수적이지 않을 수 없다. 오히려, 결합의 강도와 관계없이, 결합 부위 B를 통한 수용체 결합 시약과 수용체 분자 사이의 결합에 대한 평형 해리 상수(KD)가, 예를 들어 약 10-3 내지 약 10-7 M 의 KD 범위로 낮은 친화도가거나 예를 들어 약 10-7 내지 약 1×10-10 M의 KD 범위로 높은 친화도인지가 중요하고, 표적 세포는 결합 부위 B를 통한 수용체 결합 시약과 수용체 분자의 결합의 해리가 충분히 빠르게 발생하는 한 가역적으로 염색될 수 있다. 이와 관련하여 결합 부위 B를 통한 수용체 결합 시약과 수용체 분자 사이의 결합에 대한 해리 속도 상수(koff)는 약 3×10-5 sec-1 이상의 값을 가질 수 있다(상기 해리 속도 상수는 수용체 결합 시약의 결합 부위 B와 표적 세포 표면 상의 수용체 분자 사이에 형성된 복합체의 해리 반응을 특징짓는 상수이다). 수용체 결합 시약의 결합 부위 B와 표적 세포 표면 상의 수용체 분자 사이의 결합 반응에 대한 결합 속도 상수(kon)는 임의의 값을 가질 수 있다. 수용체 분자와 수용체 결합 시약 사이의 충분히 가역적인 결합을 보장하기 위해, 약 3×10-5 sec-1 이상, 약 5×10-5 sec-1 이상, 예를 들어 (약) 1×10-4 sec-1 이상, 5×10-4 sec-1 이상, 1×10-3 sec-1 이상, 5×10-3 sec-1 이상, 1×10-2 sec-1 이상, 1×10-1 sec-1 이상 또는 5×10-1 sec-1 이상의 값을 갖는 결합 평형의 koff 값을 선택하는 것이 유리하다. 여기에 사용된 바와 같은 동역학 및 열역학 상수의 값은 대기압, 즉 1.013 bar 및 실온, 즉 25℃의 조건을 참조함에 유의한다.
일부 구현예에서, 수용체 결합 시약은 수용체 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 단일(1가) 결합 부위 B를 갖는다. 일부 구현예에서, 수용체 결합 시약은 수용체 분자에 결합할 수 있는 2개 이상(즉, 3, 4 또는 또한 5개의 동일한 결합 부위 B를 포함하는 복수의 결합 부위 B)을 갖는다. 상기 임의의 구현예에서, 결합 부위(들) B (각각)을 통한 수용체 분자의 결합은 약 3×10-5 sec-1 이상의 koff 값을 가질 수 있다. 따라서, 수용체 결합 시약은 1가, 예를 들어 1가 항체 단편 또는 1가 인공 결합 분자(단백질 또는 기타), 예를 들어 리포칼린 패밀리의 폴리펩티드("Anticalin®"으로도 공지)에 기초한 뮤테인 또는 두 결합 부위가 유지되는 항체 또는 단편과 같은 2가 분자, 예를 들어 F(ab')2 단편일 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체 분자는 3×10-5 sec-1 이상의 koff 속도를 제공하는 펜타머 IgE 분자와 같은 다가 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 Fab는 항-CD57 Fab이다. 특정 구현예에서, 상기 Fab 항-CD4 Fab이다. 일부 구현예에서, 상기 Fab는 항-CD8 Fab이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 여기에 기재된 가역적인 세포 친화도 크로마토그래피 기술을 통한 생물학적 물질의 (흔적이 없는) 분리를 제공하는 것은 표적 세포 상의 수용체 분자와 적어도 결합 부위 B를 통한 수용체 결합 시약의 결합의 koff 속도(3×10-5 sec-1 이상)가 아닌 분자 수준 상에서이다. 오히려, 예를 들어 미국특허 제7,776,562호 또는 국제공개공보 제WO02/054065호에 기재된 바와 같이, 고정된 친화도 시약을 통해 매개된 열성 효과와 함께 결합 수용체 결합 시약의 결합 부위 B와 수용체 분자 사이의 낮은 친화도 결합은 표적 세포의 가역적이고 흔적 없는 분리를 허용한다. 상기 구현예에서, 친화도 시약의 2개 이상의 결합 부위 Z와 2개 이상의 수용체 결합 시약의 결합 파트너 C 사이에 복합체가 형성될 수 있고, 이는 (표적 세포에서 수용체 결합 시약의 해리를 교대로 초래하는 결합 부위 Z와 결합 파트너 C 사이에 형성된 결합 (복합체)를 파괴할 경쟁 시약의 첨가를 통해) 친화도 크로마토그래피 매트릭스에서 표적 세포의 가역적인 고정 및 후속적인 용출을 가능하게 한다. 상기 언급된 바와 같이, 상기 낮은 결합 친화도는, 결합 부위 B를 통한 수용체 결합 시약과 표적 세포 표면 상의 수용체 분자의 결합에 대해 약 1.0×10-3 M 내지 약 1.0×10-7 M 범위의 해리 상수(KD)로 특징지워질 수 있다.
일부 구현예에서, 선택 마커는 CD57일 수 있고, 수용체-결합 제제는 특이적으로 CD57에 결합한다. 일부 측면에서, CD3에 특이적으로 결합하는 수용체-결합 제제는, 항-CD57 항체, 항-CD57 항체의 2가 항체 단편, 항-CD57 항체의 1가 항체 단편 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD57 결합 분자로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 선택 제제는 항-CD57 Fab 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 선택 마커는 CD27일 수 있고, 수용체 결합 제제는 CD27에 특이적으로 결합한다. 일부 양상에서, CD27에 특이적으로 결합하는 수용체 결합 제제는 항-CD27-항체, 항-CD27 항체의 2가 항체 단편, 항-CD27-항체의 1가 항체 단편, 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD27 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 제제는 항-CD27 Fab 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 선택 마커는 CD4일 수 있고, 선택 제제는 특이적으로 CD4에 결합한다. 일부 측면에서, CD4에 특이적으로 결합하는 선택 제제는, 항-CD4 항체, 항-CD4 항체의 2가 항체 단편, 항-CD4 항체의 1가 항체 단편 및 항체 유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD4 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD4 항체, 예를 들어 2가 항체 단편 또는 1가 항체 단편(예를 들어 CD4 Fab 단편)은 13B8.2 항체 또는 CD4에 대한 특이적 결합을 유지하는 13B8.2의 기능적 활성 돌연변이체에서 유래될 수 있다. 예를 들어 13B8.2 항체 또는 m13B8.2의 예시적인 돌연변이체는 미국특허 제7,482,000호, 미국특허출원 제US2014/0295458호 또는 국제공개공보 제WO2013/124474호; 및 문헌 「Bes, C, 등, J Biol Chem 278, 14265-14273 (2003)」에 기재되어 있다. "ml3B8.2"로 명명된 돌연변이체 Fab 단편은, 미국특허 제7,482,000호에 기재된 바와 같이, CD4 결합 뮤린 항체 13B8.2의 가변 도메인 및 중쇄에 대해 감마 유형의 인간 불변 CH1 도메인 및 카파 유형의 인간 불변 경쇄 도메인을 함유하는 불변 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, 항-CD4 항체, 예를 들어 13B8.2 항체의 돌연변이체는, 카바트(Kabat) 넘버링에 의해 각각, 가변 경쇄에서 H91A 아미노산 대체, 가변 경쇄에서 Y92A 아미노산 대체, 가변 중쇄에서 H35A 아미노산 대체 및/또는 가변 중쇄에서 R53A 아미노산 대체를 함유한다. 일부 측면에서, ml3B8.2에서 13B8.2 Fab 단편의 가변 도메인에 비해, 경쇄의 91번 위치(서열번호 96의 93번 위치)에서 His 잔기는 Ala으로 돌연변이되고, 중쇄의 53번 위치(서열번호 95의 55번 위치)에서 Arg 잔기는 Ala으로 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 항-CD4 또는 이의 단편에 가역적으로 결합하는 시약은 상업적으로 이용 가능하거나 상업적으로 이용 가능한 시약(예를 들어 카탈로그 번호 6-8000-206 또는 6-8000-205 또는 6-8002-100; IBA GmbH, Gottingen, Germany)에서 유래된다. 일부 구현예에서, 수용체-결합 제제는 항-CD4 Fab 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD4 Fab 단편은 서열번호 95에 제시된 서열을 갖는 가변 중쇄 및 서열번호 96에 제시된 서열을 갖는 가변 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD4 Fab 단편은 서열번호 95에 제시된 서열을 갖는 가변 중쇄의 CDR 및 서열번호 96에 제시된 서열을 갖는 가변 경쇄의 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, 선택 마커는 CD8일 수 있고, 수용체-결합 제제는 특이적으로 CD8에 결합한다. 일부 측면에서, CD8에 특이적으로 결합하는 수용체-결합 제제는, 항-CD8 항체, 항-CD8 항체의 2가 항체 단편, 항-CD8 항체의 1가 항체 단편 및 항체 유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD8 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD8 항체, 예를 들어 2가 항체 단편 또는 1가 항체 단편(예를 들어 CD8 Fab 단편)은 OKT8 항체(예를 들어 ATCC CRL-8014) 또는 CD8에 대한 특이적 결합을 유지하는 이의 기능적 활성 돌연변이체에서 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD8 또는 이의 단편에 가역적으로 결합하는 시약은 상업적으로 이용 가능하거나 상업적으로 이용 가능한 시약(예를 들어 카탈로그 번호 6-8003 또는 6-8000-201; IBA GmbH, Gottingen, Germany)에서 유래된다. 일부 구현예에서, 수용체-결합 제제는 항-CD8 Fab 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD8 Fab 단편은 서열번호 97에 제시된 서열을 갖는 가변 중쇄 및 서열번호 98에 제시된 서열을 갖는 가변 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD8 Fab 단편은 서열번호 97에 제시된 서열을 갖는 가변 중쇄의 CDR 및 서열번호 98에 제시된 서열을 갖는 가변 경쇄의 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, 선택 마커는 CD3일 수 있고, 수용체-결합 제제는 특이적으로 CD3에 결합한다. 일부 측면에서, CD3에 특이적으로 결합하는 수용체-결합 제제는, 항-CD3 항체, 항-CD3 항체의 2가 항체 단편, 항-CD3 항체의 1가 항체 단편 및 항체 유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD3 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체, 예를 들어 2가 항체 단편 또는 1가 항체 단편(예를 들어 CD3 Fab 단편)은 OKT3 항체(예를 들어 ATCC CRL-8001; 예를 들어 문헌 「Stemberger 등, PLoS One. 2012; 7(4): e35798」 참조) 또는 CD3에 대한 특이적 결합을 유지하는 이의 기능적 활성 돌연변이체에서 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD3 또는 이의 단편에 가역적으로 결합하는 시약은 상업적으로 이용 가능하거나 상업적으로 이용 가능한 시약(예를 들어 카탈로그 번호 6-8000-201, 6-8001-100; IBA GmbH, Gottingen, Germany)에서 유래된다. 일부 구현예에서, 수용체-결합 제제는 항-CD3 Fab 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 Fab 단편은 서열번호 93에 제시된 서열을 갖는 가변 중쇄 및 서열번호 94에 제시된 서열을 갖는 가변 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 Fab 단편은 서열번호 93에 제시된 서열을 갖는 가변 중쇄의 CDR 및 서열번호 94에 제시된 서열을 갖는 가변 경쇄의 CDR을 포함한다.
임의의 상기 예에서, 2가 항체 단편은 (Fab)2'-단편 또는 2가 단일 사슬 Fv 단편일 수 있는 반면, 1가 항체 단편은 Fab 단편, FV 단편 및 단일 사슬 Fv 단편(scFv)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 임의의 상기 예에서, 항체 유사 결합 특성을 가진 단백질성 결합 분자는 압타머(aptamer), 리포칼린(lipocalin) 패밀리의 폴리펩티드에 기초한 뮤테인(mutein), 글루바디(glubody), 안키린(ankyrin) 스캐폴드에 기초한 단백질, 결정성 스캐폴드에 기초한 단백질, 아드넥틴(adnectin) 및 아비머(avimer)일 수 있다.
특정 구현예에서, 크로마토그래피 분리에 의한 분리 및/또는 선택은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD57-CD3+ T 세포를 포함하는 농축된 T 세포(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)의 하나 이상의 집단을 생산한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 본질적으로 CD57-CD3+ T 세포로 구성된다.
특정 구현예에서, 크로마토그래피 분리에 의한 분리 및/또는 선택은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD27+ CD3+ T 세포를 포함하는 농축된 T 세포(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)의 하나 이상의 집단을 생산한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 본질적으로 CD27+CD3+ T 세포로 구성된다.
특정 구현예에서, 크로마토그래피 분리에 의한 분리 및/또는 농축은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD57-CD4+ T 세포를 포함하는 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단을 생산한다. 특정 구현예에서, CD4+ T 세포의 투입 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD8+ T 세포를 포함하고/하거나, CD8+ T 세포를 함유하지 않고/않거나, CD8+ T 세포를 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 본질적으로 CD57-CD4+ T 세포로 구성된다.
특정 구현예에서, 크로마토그래피 분리에 의한 분리 및/또는 농축은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD27+CD4+ T 세포를 포함하는 농축된 CD27+CD4+ T 세포의 집단을 생산한다. 특정 구현예에서, CD4+ T 세포의 투입 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD8+ T 세포를 포함하고/하거나, CD8+ T 세포를 함유하지 않고/않거나, CD8+ T 세포를 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 본질적으로 CD27+CD4+ T 세포로 구성된다.
특정 구현예에서, 크로마토그래피 분리에 의한 분리 및/또는 농축은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD57+ CD8+ T 세포를 포함하는 농축된 CD57+ CD8+ T 세포의 집단을 초래한다. 특정 구현예에서, CD8+ T 세포의 집단은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD4+ T 세포를 함유하고/하거나, CD4+ T 세포를 함유하지 않고/않거나, CD4+ T 세포를 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 본질적으로 CD57+ CD8+ T 세포로 구성된다.
특정 구현예에서, 크로마토그래피 분리에 의한 분리 및/또는 농축은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD27+ CD8+ T 세포를 포함하는 농축된 CD27+ CD8+ T 세포의 집단을 초래한다. 특정 구현예에서, CD8+ T 세포의 집단은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD4+ T 세포를 함유하고/하거나, CD4+ T 세포를 함유하지 않고/않거나, CD4+ T 세포를 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 본질적으로 CD27+ CD8+ T 세포로 구성된다.
2. 선택된 조성물
특정 구현예에서, 제공된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 조작된 T 세포 조성물을 생성하기 위해 T 세포를 자극, 활성화, 조작(예를 들어 녹아웃 및/또는 녹아웃), 형질도입, 배양, 또는 증폭하기 위한 방법과 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 예를 들어 생물학적 샘플(예를 들어 공여자 샘플), 예를 들어 하나 이상의 면역 세포를 함유하는 공여자 세포 집단의 분리, 선택, 또는 농축으로부터 초래된다.
일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단은 개별 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 하나의 다른 개별 공여자로부터의 CD57 고갈된 T 세포 집단과 조합되어 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 복수의 개별 공여자로부터의 각각의 CD57 고갈된 T 세포 집단을 조합하여 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다.
일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 10%, 5%, 1%, 또는 0.1% 미만의 CD57+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 공여자 샘플에 존재하는 CD57+ T 세포의 빈도의 (약) 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만을 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 집단의 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 CD4+ T 세포는 CD57-CD4+ T 세포이다. 특정 구현예에서, 상기 집단의 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 CD8+ T 세포는 CD57-CD8+ T 세포이다. 특정 구현예에서, 상기 집단의 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 CD3+ T 세포는 CD57-CD3+ T 세포이다.
특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 생존가능한 T 세포, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, 및/또는 CD8+ T 세포이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포는 생존가능한 T 세포, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, 및/또는 CD8+ T 세포이거나 이를 포함한다. 다양한 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포는 생존가능한 CD57- T 세포, CD57- CD3+ T 세포, CD57-CD4+ T 세포, CD57- CD8+ T 세포이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 1:5 내지 (약) 5:1의 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 1:3 내지 약 3:1의 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 1:2 내지 약 2:1의 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, T 세포를 농축시키는 것은 생물학적 샘플로부터 CD57+ 세포를 선택 또는 제거한 다음, 예를 들어 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 생산하기 위해 CD57에 대해 음성으로 선택된 집단으로부터 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에 대해 개별적으로 선택하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 이들 집단은 예를 들어 후속적으로 개별적으로 동결 보호되고 저장되고/되거나 재조합 수용체를 발현하도록 개별적으로 조작된 바와 같이 별개로 유지된다. 특정 구현예에서, 별개의 집단은 예를 들어 1:1의 CD57-CD4+ T 세포 대 CD57-CD8+ T 세포의 비율로 조합된다.
일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 75% 초과의 CD3+/CD57- 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 80% 초과의 CD3+/CD57- 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 85% 초과의 CD3+/CD57- 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 90% 초과의 CD3+/CD57- 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 75% 초과의 CD3+/CD57- 세포를 포함한다.
특정 구현예는 샘플, 집단, 또는 세포를 함유하는 조성물에서 CD57 발현의 양, 예를 들어 CD57+ T 세포의 양이 임의의 적합한 공지된 수단에 의해 측정될 수 있다는 것을 고려한다. 일부 구현예에서, CD57 발현은 샘플, 집단, 또는 조성물에서 CD57+ 세포, 예를 들어 샘플, 집단, 또는 조성물 중 CD57+ T 세포의 양, 빈도, 또는 백분율을 측정, 평가, 또는 결정하기 위해 샘플, 집단, 또는 조성물에서 측정된다. 특정 구현예에서, CD57 발현은 샘플, 집단, 또는 조성물에서 CD57+ 세포, 예를 들어 샘플, 집단, 또는 조성물 중 CD57+ T 세포의 양, 빈도, 또는 백분율을 측정, 평가, 또는 결정하기 위해 샘플, 집단, 또는 조성물에서 측정된다.
일부 구현예에서, 보다 높은 백분율의 CD57+ 세포를 갖는 세포 조성물은 증식성 증폭이 가능한 보다 낮은 백분율의 세포를 생성할 수 있다. 일부 경우에, 높은 백분율의 CD57+ 세포를 갖는 조작된 세포 조성물은 감소된 증식 능력과 연관되고, 세포 요법을 위한 조작된 T 세포 조성물을 생산하기 위한 제조 공정에서 연장된 공정 시간, 임계 세포 수를 달성하기 위한 보다 높은 배가(doublings), 증가된 세포 분화, 및/또는 수확 기준을 충족시키기 위한 실패를 초래할 수 있다.
또한, 일부 측면에서, 증식 증폭할 수 있는 세포의 집단을 확인하는 방법이 제공되며, 이 방법은 집단에서 CD57+ 세포의 빈도를 측정하는 것을 포함하며, 여기서 세포의 집단은 CD57+ 세포의 빈도가 임계값 빈도 미만인 경우에 증폭할 수 있는 것으로 확인된다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 역치 빈도는 (약) 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1%, 또는 0.1% 미만인 백분율이다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 증폭할 수 있는 집단은 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건 하에 4, 5, 6, 7 또는 8일 이내에 적어도 (약) 2배, 4배, 8배, 또는 16배 증폭한다.
또한, T 세포의 집단의 증폭 용량을 결정하는 방법이 제공되되, 상기 방법은 T 세포의 집단에서 CD57 발현과 관련된 형질(trait)의 값을 측정하는 것을 포함하되, 상기 T 세포의 집단은, 상기 형질의 값이 (약) 상기 형질의 임계값 미만인 경우 증폭가능한 것으로 결정된다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 임계값은, i) CD57 발현과 관련된 형질(trait)의 값의 평균값 또는 중앙값 측정치 미만인 (약), 또는 25% 이내, 20%, 15% 이내, 10% 이내, 또는 5% 이내이고/이거나, 복수의 참조 T 세포 집단에서, (약) 상기 평균값 또는 중앙값 측정치 미만인 표준 편차 미만이고; ii) 복수의 참조 T 세포 집단으로부터의 집단 중에서, CD57 발현과 관련된 형질의 최저 측정치 미만, 선택적으로 상기 최저 측정치 미만인, 50% 이내, 25% 이내, 20% 이내, 15% 이내, 10% 이내, 또는 5% 이내이며; iii) 복수의 참조 T 세포 조성물로부터의 샘플의 65%, 75%, 80%, 85% 초과로부터 계산된 CD57 발현과 관련된 형질의 평균값 또는 중앙값 측정치 미만이되, 상기 복수의 참조 T 세포 집단은 T 세포의 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건하에 배양될 때 증폭하지 않은 복수의 집단이며, 선택적으로 상기 세포는 4, 5, 6, 7 또는 8일의 배양일 이내에 적어도 (약) 2-배, 4-배, 8-배, 또는 16-배 증폭되지 않는다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 형질은 총 T 세포, CD4+ T 세포, 또는 CD8+ T 세포에서 발현된 CD57 폴리펩티드의 수준 또는 양이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 형질은 상기 세포 집단 중에 존재하는 CD57+ T 세포, CD57+CD4+ T 세포, 또는 CD57+CD8+ T 세포의 빈도, 백분율, 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 형질은 CD3+ T 세포에서 발현된 CD57 폴리펩티드의 수준 또는 양이다. 일부 구현예에서, 형질은 세포 집단에 존재하는 CD57+CD3+ T 세포 T 세포의 빈도, 백분율, 또는 양이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 형질은 상기 세포 집단 중의 상기 T 세포 중에 존재하는 CD57 mRNA의 수준 또는 양이다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 형질은 CD57를 암호화하는 유전자(B3GAT1)의 염색질(chromatin) 접근성의 수준 또는 양이다.
특정 구현예에서, 제공된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 조작된 T 세포 조성물을 생성하기 위해 T 세포를 자극, 활성화, 조작(예를 들어 녹아웃 및/또는 녹아웃), 형질도입, 배양 또는 증폭하기 위한 방법과 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 예를 들어 생물학적 샘플(예를 들어 공여자 샘플), 예를 들어 하나 이상의 면역 세포를 함유하는 공여자 세포 집단의 분리, 선택 또는 농축으로부터 생성된다.
일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단은 개별 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 1개의 다른 개별 공여자로부터의 CD27 농축된 T 세포 집단과 조합되어 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 복수의 개별 공여자로부터의 각각의 CD27 농축된 T 세포 집단은 조합되어 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다.
일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 약 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만의 CD27- T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 공여자 샘플에 존재하는 CD27- T 세포의 빈도의 (약) 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만을 함유한다. 특정 구현예에서, 집단의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99%의 CD4+ T 세포는 CD27+CD4+ T 세포이다. 특정 구현예에서, 상기 집단의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99%의 CD8+ T 세포는 CD27+CD8+ T 세포이다. 특정 구현예에서, 집단의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99%의 CD3+ T 세포는 CD27+CD3+ T 세포이다.
특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 생존 T 세포, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포는 생존 T 세포, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포이거나 이를 포함한다. 다양한 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포는 생존가능한 CD27+ T 세포, CD27+ CD3+ T 세포, CD27+CD4+ T 세포, CD27+ CD8+ T 세포, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 조합이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 1:5 내지 (약) 5:1의 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 1:3 내지 (약) 3:1의 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 1:2 내지 (약) 2:1의 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, T 세포를 농축하는 것은 생물학적 샘플로부터 CD27- 세포를 선택하거나 제거한 다음, CD27에 대해 음성으로 선택된 집단으로부터 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에 대해 별도로 선택하여, 예를 들어 농축된 CD27+CD4+ T 세포의 집단 및 농축된 CD27+CD8+ T 세포의 집단을 생산하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 이들 집단은 별도로 유지되고, 예를 들어 후속적으로 별도로 동결 보호되고 저장되고/되거나 재조합 수용체를 발현하도록 별도로 조작된다. 특정 구현예에서, 별개의 집단은 예를 들어 1:1의 CD27+CD4+ T 세포 대 CD27+CD8+ T 세포의 비율로 조합된다.
특정 구현예는 샘플, 집단, 또는 세포를 함유하는 조성물에서 CD27 발현의 양, 예를 들어 CD27+ T 세포의 양은 임의의 적합한 공지된 수단에 의해 측정될 수 있는 것으로 고려된다. 일부 구현예에서, CD27 발현은 샘플, 집단 또는 조성물에서 CD27-세포, 예를 들어 샘플, 집단 또는 조성물 중 CD27- T 세포의 양, 빈도 또는 백분율을 측정, 평가 또는 결정하기 위해 샘플, 집단 또는 조성물에서 측정된다. 특정 구현예에서, CD27 발현은 샘플, 집단 또는 조성물에서 CD27-세포, 예를 들어 샘플, 집단 또는 조성물 중 CD27- T 세포의 양, 빈도 또는 백분율을 측정, 평가 또는 결정하기 위해 샘플, 집단 또는 조성물에서 측정된다.
일부 구현예에서, 더 높은 백분율의 CD27- 세포를 갖는 세포 조성물은 증식성 증폭이 가능한 더 낮은 백분율의 세포를 생성할 수 있다. 일부 경우에, 높은 백분율의 CD27- 세포를 갖는 조작된 세포 조성물은 감소된 증식 능력과 연관되고, 연장된 공정 시간, 임계 세포 수를 달성하기 위한 더 높은 배가, 증가된 세포 분화 및/또는 세포 요법을 위한 조작된 T 세포 조성물을 생산하기 위한 제조 공정에서 수확 기준을 충족시키지 못하는 것을 생성할 수 있다.
일부 측면에서, 증폭이 가능한 세포 집단을 확인하는 방법이 또한 제공되고, 상기 방법은 집단에서 CD27- 세포의 빈도를 측정하는 것을 포함하고, 여기서 세포 집단은 CD27- 세포의 빈도가 임계 빈도 미만인 경우 증폭이 가능한 것으로 확인된다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 임계 빈도는 (약) 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만인 백분율이다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 증폭이 가능한 집단은 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건 하에 4, 5, 6, 7 또는 8일 이내에 적어도 (약) 2배, 4배, 8배 또는 16배로 증폭된다.
일부 측면에서, T 세포 집단의 증폭 능력을 결정하는 방법이 또한 제공되고, 상기 방법은 T 세포 집단에서 CD27 발현과 연관된 형질의 값을 측정하는 것을 포함하고, 여기서 T 세포 집단이 형질의 값이 상기 형질의 (대략) 임계값 미만인 경우 증폭이 가능한 것으로 결정된다.
일부 구현예에서, 임계값은: i) 복수의 참조 T 세포 집단에서 CD27 발현과 연관된 형질의 평균 또는 중앙값 측정치 미만인 (약) 25% 이내, 또는 25% 이내, 20% 이내, 15% 이내, 10% 이내, 또는 5% 이내이고/이거나, (대략) 상기 평균 또는 중앙값 측정치 미만인 (약) 1 표준 편차 미만이며; ii) 복수의 참조 T 세포 집단 중의 집단에서 CD27 발현과 연관된 형질의 최저 측정치 미만, 선택적으로 최저 측정치의 50% 이내, 25% 이내, 20% 이내, 15% 이내, 10% 이내, 또는 5% 이내이며; iii) 복수의 참조 T 세포 조성물로부터의 샘플의 65%, 75%, 80%, 85% 초과로부터 계산된 CD27 발현과 연관된 형질의 평균 또는 중앙값 측정치 미만이며; 여기서 복수의 참조 T 세포 집단은 T 세포의 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건 하에 배양될 때 증폭되지 않은 복수의 집단이며, 선택적으로 여기서 세포는 4, 5, 6, 7 또는 8일 이내의 배양에 의해 적어도 (약) 2배, 4배, 8배, 또는 16배 증폭하지 않았다.
일부 구현예에서, 상기 형질은 총 T 세포, CD4+ T 세포, 또는 CD8+ T 세포에서 발현된 CD27 폴리펩티드의 수준 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 형질은 세포 집단에 존재하는 CD27- T 세포, CD27-CD4+ T 세포, 또는 CD27-CD8+ T 세포의 빈도, 백분율, 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 형질은 CD3+ T 세포에서 발현된 CD27 폴리펩티드의 수준 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 형질은 세포 집단에 존재하는 CD27-CD3+ T 세포 T 세포의 빈도, 백분율, 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 형질은 세포 집단에 존재하는 CD27 mRNA의 수준 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 형질은 CD27 (CD27)을 암호화하는 유전자의 염색질 접근성의 수준 또는 양이다.
일부 구현예에서,상기 방법은 T 세포의 집단에서 하나 이상의 제 2 유전자 생성물의 발현과 연관된 제 2 형질의 제 2 값을 측정하는 것을 더 포함하며, 여기서 집단은 형질의 값이 (대략) 상기 형질의 임계값 미만이고, 상기 제 2 형질의 제 2 값이 (대략) 상기 제 2 형질의 제 2 임계값 초과인 경우에 증폭될 수 있다.
일부 구현예에서, 제 2 유전자 생성물은 나이브-유사 T 세포와 연관된 마커이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제 2 유전자 생성물은 CD27, CD28, CCR7, 또는 CD45RA로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제 2 유전자 생성물은 CD27 및 CD28이다.
특정 구현예에서, 음성 발현, 예를 들어 CD57 또는 CD57-의 음성 발현은 예를 들어 표준 기술, 예를 들어 항체-염색을 수반하는 기술을 이용하여 검출되는, 백그라운드 발현의 수준과 동등하거나 그보다 낮은 발현이다. 특정 구현예에서, 음성 발현, 예를 들어 CD27 또는 CD27+의 음성 발현은, 예를 들어 표준 기술, 예를 들어 항체-염색을 수반하는 기술을 이용하여 검출되는, 백그라운드 발현의 수준과 동등하거나 그보다 낮은 발현이다. 특정 구현예에서, 음성 발현은 제한되지는 않지만 예를 들어 면역 조직 화학, 면역 형광 또는 유세포 분석 기반 기술과 같은 단백질 또는 유전자 발현을 평가하기 위한 적절한 기술에 의해서 검출되는 백그라운드 발현의 수준과 동등하거나 그보다 낮은 발현이다. 일부 구현예에서, 양성 발현, 예를 들어 특정 단백질의 양성 발현은 백그라운드를 상회하는 양, 수준, 또는 농도에서 상기 단백질의 표면 발현이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 음성 발현, 예를 들어 특정 단백질의 음성 발현은 백그라운드 또는 그를 하회하는 양, 수준, 또는 농도에서 상기 단백질의 표면 발현이거나 또는 그를 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 방법은 상기 단백질 또는 유전자(예를 들어 CD57)에 대해 양성 또는 음성 발현으로 샘플, 조성물, 또는 집단 중의 세포를 정량화하도록 샘플, 조성물, 또는 집단에서 하나 이상의 단백질 또는 유전자(예를 들어 CD57)의 발현을 평가, 측정, 결정, 및/또는 정량화하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 샘플, 집단, 또는 조성물 중 하나 이상의 단백질 또는 유전자(예를 들어 CD27)의 발현을 평가, 측정, 결정, 및/또는 정량화하는 단계, 예를 들어 단백질 또는 유전자(예를 들어 CD27)에 대한 양성 또는 음성 발현을 갖는 샘플, 집단, 또는 집단 내의 세포를 정량화하는 단계 중 하나 이상의 단계를 포함한다. 상기 단계들은 발현과 관련된 임의의 적절한 특성을 평가, 측정, 결정, 및/또는 정량화하는 것, 예를 들어 단백질, 표면 단백질, mRNA, 또는 유전자 접근성, 예를 들어 후생 유전자 접근성(epigenetic gene accessibility)을 측정하는 것을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질(예를 들어 CD57)의 발현은 상기 단백질, 또는 세포의 표면 위에서 발현된, 상기 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 수준, 양, 또는 농도를 평가, 측정, 결정, 및/또는 정량화하는 것이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질(예를 들어 CD27)의 발현은 세포의 표면 상에서 발현된 단백질, 또는 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 수준, 양, 또는 농도를 평가, 측정, 결정, 및/또는 정량화하는 단계이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 단백질(예를 들어 CD57)의 발현은 상기 단백질의 표면 발현, 예를 들어 상기 세포의 표면 상의 상기 단백질의 수준, 양, 또는 농도를 평가, 측정, 결정, 및/또는 정량화함으로써 평가된다. 특정 구현예에서, 단백질(예를 들어 CD27)의 발현은 세포의 표면 상에서의 단백질, 예를 들어 단백질의 수준, 양, 또는 농도의 표면 발현을 평가, 측정, 결정, 및/또는 정량화함으로써 평가된다. 특정 구현예에서, 상기 단백질의 표면 발현에 양성인 세포의 양, 빈도, 또는 백분율, 상기 표면 단백질을 측정하는데 사용된 기술의 백그라운드 신호보다 높은 상기 표면상의 단백질의 높은 양, 농도, 또는 밀도를 갖는 세포. 특정 구현예에서, 단백질(예를 들어 CD57)의 표면 발현은 면역 조직 화학, 면역 형광 또는 유세포 분석 기반 기술에 의해서 측정된다. 특정 구현예에서, 단백질(예를 들어 CD27)의 표면 발현은 면역조직화학, 면역형광, 또는 유동 세포 분석 기반 기술에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 단백질의 표면 발현에 양성인 세포의 양, 빈도, 또는 백분율은 면역 조직 화학, 면역 형광 또는 유세포 분석 기반 기술에 의해서 결정된다.
특정 구현예에서, 상기 샘플, 조성물, 또는 집단에서 단백질 발현, 예를 들어 표면 발현에 음성 또는 양성인 세포의 양, 빈도, 또는 백분율은 유세포 분석에 의해서 결정된다. 일부 구현예에서, 상기 단백질은 CD3, CD4, CD8, CD25, CD27, CD28, CD57, CCR7, 또는 CD45RA이다. 특정 구현예에서, 상기 단백질은 CD57이다. 특정 구현예에서, 상기 단백질은 CD27이다.
특정 구현예에서, 상기 샘플, 집단, 또는 조성물에서 단백질(예를 들어 CD57)의 발현은 단백질의 수준, 양, 또는 농도를 평가, 측정, 결정, 및/또는 정량화하기 위한 임의의 적합한 방법이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 샘플, 집단, 또는 조성물에서 단백질(예를 들어 CD27)의 발현은 단백질의 수준, 양, 또는 농도를 평가, 측정, 결정, 및/또는 정량화하기 위한 임의의 적합한 방법이거나 이를 포함한다. 상기 방법은 면역분석, 핵산-기반 또는 단백질-기반 압타머 기술, HPLC(고정밀 액체 크로마토그래피), 펩티드 시퀀싱(예를 들어 Edman 분해 시퀀싱 또는 질량 분석법(예를 들어 MS/MS), 선택적으로, HPLC에 커플링) 및 전술한 것 중의 마이크로어레이 적응(핵산, 항체 또는 단백질-단백질(즉, 비-항체) 어레이 포함)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 면역분석은 면역학적 반응에 기초하여, 예를 들어 유전자 생산물에 대한 항체 또는 항원 결합 항체 단편의 결합을 검출함으로써, 단백질을 검출하는 방법 또는 분석이거나 이를 포함한다. 면역분석은 정량적 면역세포화학 또는 면역 조직화학, ELISA(직접적, 간접적, 샌드위치, 경쟁적, 다중 및 휴대용 ELISA 포함(예를 들어 미국특허 7,510,687 참조)), 웨스턴 블롯팅(하나, 둘 이상의 차원 블롯팅 또는 다른 크로마토그래피 수단 포함, 선택적으로, 펩티드 시퀀싱 포함 함), 효소 면역 분석(EIA), RIA(방사성 면역 분석) 및 SPR(표면 플라즈몬 공명)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 단백질 또는 그의 대응하는 유전자의 발현은 단백질(예를 들어 CD57)을 암호화하는 mRNA(또는 상기 mRNA로부터 유래된 cDNA 생성물)을 측정함으로써 측정, 평가, 또는 정량화된다. 특정 구현예에서, 단백질 또는 그의 대응하는 유전자의 발현은 단백질(예를 들어 CD27)을 암호화하는 mRNA(또는 상기 mRNA로부터 유래된 cDNA 생성물)을 측정함으로써 측정, 평가, 또는 정량화된다. 특정 구현예에서, 상기 mRNA(또는 대응하는 cDNA)의 양 또는 수준은, 역전사 효소(rt) PCR, 액적 디지털 PCR, 실시간 및 정량화 PCR 방법을 포함하는, 중합 효소 연쇄 반응(PCR)(예를 들어 TAQMAN®, 분자 표지(molecular beacon), LIGHTUPTM, SCORPIONTM, SIMPLEPROBES® 포함; 예를 들어 미국특허 제5,538,848호; 제5,925,517호; 제6,174,670호; 제6,329,144호; 제6,326,145호 및 제6,635,427호 참고); 노던 블롯팅; 서던 블롯팅, 예를 들어 역전사 생성물 및 유도체의; 블롯팅 어레이, 마이크로어레이, 또는 in situ-합성 어레이를 포함한, 어레이 기반 방법; 및 시퀀싱, 예를 들어 합성에 의한 시퀀싱, 파이로시퀀싱, 디데옥시 시퀀싱 또는 리게이션에 의한 시퀀싱, 또는 당 업계에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 평가, 측정, 결정,및/또는 정량화되고, 예를 들어 HELICOS®, ROCHE® 454, ILLUMINA®/SOLEXA®, ABI SOLiD®, 및 POLONATOR® 시퀀싱으로서 그러한 특정 플랫폼을 포함하는, Shendure 등, Nat. Rev. Genet. 5:335-44 (2004) 또는 Nowrousian, Euk. Cell 9(9): 1300-1310 (2010)에서 논의되었다. 일부 구현예에서, mRNA의 발현은 차세대 시퀀싱 방법 예를 들어 RNA 시퀀싱(RNA-Seq)에 의해서 결정된다. RNA 시퀀싱 방법은 가장 일반적인 DNA 시퀀싱 플랫폼(HiSeq systems(Illumina), 454 Genome Sequencer FLX System(Roche), Applied Biosystems SOLiD(Life Technologies), IonTorrent(Life Technologies))에 적용되었다. 이들 플랫폼은 RNA의 cDNA로의 초기 역전사를 요구한다. 반대로, 단일 분자 시퀀서(single molecule sequencer) HeliScope(Helicos BioSciences)는 RNA를 시퀀싱용 주형으로 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 그에 상응하는 유전자의 발현은 단백질의 후생 유전학적 분석이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 유전자의 접근성 예를 들어 CD57을 암호화하는 B3GAT1의 접근성에 대해 평가된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 그의 대응하는 유전자의 발현은 단백질의 후성적 분석이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 유전자의 접근성, 예를 들어 CD27을 암호화하는 CD27 유전자의 접근성에 대해 평가된다. 상기 후생 유전학적 분석은 제한되지는 않지만 시퀀싱(ATAC-seq)을 이용하여 크롭마틴 접근성을 조사하는 유전자전위효소-접근가능한 염색질에 대한 평가(Assay for Transposase-Accessible Chromatin)를 비롯한 임의의 적절한 공지의 수단에 의해서 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 농축된 CD57- 세포 집단(예를 들어 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단, CD57 고갈된 T 세포 집단, 및/또는 조작된 T 세포 조성물)은 (약) 또는 (약) 20%, 15%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.01%, 또는 0.001% 미만의 CD57+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57- 세포 집단은 CD57+ 세포를 본질적으로 함유하지 않는다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57- 세포 집단은 (약) 20% 미만의 CD57+ 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57- 세포 집단은 (약) 10% 미만의 CD57+ 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 농축된 CD57- 세포 집단은 (약) 5% 미만의 CD57+ 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, 농축된 CD57- 세포 집단은 (약) 1%, 0.1%, 또는 0.01% 미만의 CD57+ 세포를 함유한다.
특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 또는 적어도 (약) 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99%, 또는 (약) 100%의 CD57- T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 80%의 CD57- T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 95%의 CD57- T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 99%, 99.9%, 또는 99.99%의 CD57- T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 모든 또는 본질적으로 모든 세포는 CD57- T 세포이다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 또는 적어도 (약) 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99%, 또는 (약) 100%의 CD57-CD3+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 70%의 CD57-CD3+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 80%의 CD57-CD3+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 95%의 CD57-CD3+ T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 99%, 99.9%, 또는 99.99%의 CD57-CD3+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 모든 또는 본질적으로 모든 세포는 CD57-CD3+ T 세포이다.
일부 구현예에서, 농축된 CD27+ 세포 집단(예를 들어 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단, CD27 농축된 T 세포 집단, 및/또는 조작된 T 세포 조성물)은 (약) 또는 (약) 20%, 15%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.01%, 또는 0.001% 미만의 CD27- T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD27+ 세포 집단은 CD27- 세포를 본질적으로 함유하지 않는다. 특정 구현예에서, 농축된 CD27+ 세포 집단은 (약) 20% 미만의 CD57- 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD27+ 세포 집단은 (약) 10% 미만의 CD27- 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 농축된 CD27+ 세포 집단은 (약) 5% 미만의 CD27- 세포를 함유한다. 농축된 CD27+ 세포 집단은 (약) 1%, 0.1%, 또는 0.01% 미만의 CD27- 세포를 함유한다.
특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 또는 적어도 (약) 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99%, 또는 (약) 100%의 CD27+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 80%의 CD27+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 95%의 CD27+ T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 99%, 99.9%, 또는 99.99%의 CD27+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 모든 또는 본질적으로 모든 세포는 CD27+ T 세포이다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 또는 적어도 (약) 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99%, 또는 (약) 100%의 CD27+CD3+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 70%의 CD27+CD3+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 80%의 CD27+CD3+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 95%의 CD27+CD3+ T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 99%, 99.9%, 또는 99.99%의 CD27+CD3+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 모든 또는 본질적으로 모든 세포는 CD27+CD3+ T 세포이다.
특정 구현예에서, 상기 농축된 CD57- 세포의 집단(예를 들어 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단, CD57 고갈된 T 세포 집단, 및/또는 조작된 T 세포 조성물)의 세포는 생존가능한 세포이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 CD27+ 세포의 집단(예를 들어 풀링된 CD27 고갈된 T 세포 집단, CD27 농축된 T 세포 집단, 및/또는 조작된 T 세포 조성물)의 세포는 생존가능한 세포이거나 또는 그를 포함한다.
일부 구현예에서, 생존가능한 세포는 제한되지는 않지만 염료 흡수 분석(예를 들어 칼세인 AM 분석(calcein AM assay)), XTT 세포 생존 분석 및 염료 배제 분석(예를 들어 트립판 블루, 에오신(Eosin) 또는 프로피듐 염료 배제 분석(propidium dye exclusion assay))을 포함할 수 있는 분석으로 평가된다. 특정 구현예에서, 생존가능한 세포는 하나 이상의 세포 사멸 마커(apoptotic marker), 예를 들어 아넥신 V(Annexin V) 또는 활성 카스파제 3(카스파제 3)의 음성 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 생존가능한 세포는 제한되지는 않지만 카스파제 2, 카스파제 3, 카스파제 6, 카스파제 7, 카스파제 8, 카스파제 9, 또는 카스파제 10, Bcl-2 패밀리 멤버(family member), 예를 들어 Bax, Bad, 및 Bid, Annexin V, 또는 TUNEL 염색(staining)을 포함할 수 있는 하나 이상의 세포 사멸 마커의 발현에 음성이다. 특정 구현예에서, 상기 생존가능한 세포는 활성 카스파제 3 음성이다. 특정 구현예에서, 상기 생존가능한 세포는 Annexin V 음성이다. 특정 구현예에서, 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포의 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 65%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 75%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 85%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 97%, 적어도 (약) 99%, 적어도 (약) 99.5%, 적어도 (약) 99.9%, 또는 (약) 100%는 생존가능한 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 생존가능한 세포는 생존가능한 CD3+, 생존가능한 CD4+, 생존가능한 CD8+, 생존가능한 CD57-, 생존가능한 CD57-CD3+, 생존가능한 CD57-CD4+, 또는 생존가능한 CD57-CD8+ T 세포, 또는 그들의 임의의 조합물이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포의 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 65%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 75%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 85%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 97%, 적어도 (약) 99%, 적어도 (약) 99.5%, 적어도 (약) 99.9%, 또는 (약) 100%는 생존가능한 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 생존가능한 세포는 생존가능한 CD3+, 생존가능한 CD4+, 생존가능한 CD8+, 생존가능한 CD27+, 생존가능한 CD27+CD3+, 생존가능한 CD27+CD4+, 또는 생존가능한 CD27+CD8+ T 세포, 또는 그들의 임의의 조합물이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 생존가능한 세포는 활성 카스파제 3 음성이다. 특정 구현예에서, 상기 생존가능한 세포는 Annexin V 음성이다.
특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 또는 적어도 (약) 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99%, 또는 (약) 100%의 CD57-CD4+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 80%의 CD57-CD4+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 90%의 CD57- T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 95%의 CD57-CD4+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 모든 또는 본질적으로 모든 세포는 CD57-CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 또는 적어도 (약) 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99%, 또는 (약) 100%의 CD57-CD8+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 80%의 CD57-CD8+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 90%의 CD57-CD8+ T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 95%의 CD57-CD8+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 모든 또는 본질적으로 모든 세포는 CD57-CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 또는 적어도 (약) 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99%, 또는 (약) 100%의 CD57-CD3+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 80%의 CD57-CD3+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 90%의 CD57-CD3+ T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 95%의 CD57-CD3+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 모든 또는 본질적으로 모든 세포는 CD57-CD3+ T 세포이다.
특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 또는 적어도 (약) 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99%, 또는 (약) 100%의 CD27+CD4+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 80%의 CD27+CD4+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 90%의 CD27+ T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 95%의 CD27+CD4+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 모든 또는 본질적으로 모든 세포는 CD27+CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 또는 적어도 (약) 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99%, 또는 (약) 100%의 CD27+CD8+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 80%의 CD27+CD8+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 90%의 CD27+CD8+ T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 95%의 CD27+CD8+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 모든 또는 본질적으로 모든 세포는 CD27+CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 또는 적어도 (약) 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99%, 또는 (약) 100%의 CD27+CD3+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 80%의 CD27+CD3+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 90%의 CD27+CD3+ T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 95%의 CD27+CD3+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 모든 또는 본질적으로 모든 세포는 CD27+CD3+ T 세포이다.
특정 구현예에서, 농축된 CD57-세포의 집단 중의 세포 빈도는 나이브-유사 세포이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 세포가 나이브 및/또는 나이브-유사 세포임을 나타내는 하나 이상의 마커의 발현에 대해 양성인 T 세포이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 T 세포에서 나이브 또는 나이브-유사 상태와 연관이 있는 마커의 발현에 대해 양성인 세포이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 세포가 나이브가 아님 및/또는 나이브-유사 세포가 아님을 나타내는 하나 이상의 마커의 발현에 대해 음성인 T 세포이다. 특정 구현예에서, T 세포내 비-나이브 또는 비-나이브-유사 상태로는, 예를 들어 이펙터 T(TEFF) 세포, 기억 T 세포, 중앙 기억T 세포(TCM), 이펙터 기억 T(TEM) 세포, 및 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 세포가 나이브 및/또는 나이브-유사 세포이고, 및/또는 T 세포에서 나이브 또는 나이브-유사 상태와 연관이 있음을 나타내는 적어도 하나 이상의 마커의 발현에 대해 양성이다. 일부 구현예에서, 마커는 세포 표면 상에서 발현된다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 세포가 비-나이브 및/또는 비-나이브-유사 세포이고, 및/또는 T 세포에서 비-나이브 또는 비-나이브-유사 상태와 연관이 있음을 나타내는 적어도 하나 이상의 마커의 발현에 대해 음성이다.
T 세포가 나이브 및/또는 나이브-유사 T 세포이고, 및/또는 T 세포에서 나이브 또는 나이브-유사 상태와 연관이 있음을 나타내는 마커로는 CD27, CD28, CD45RA, CD62L, 및/또는 CCR7을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포, 예를 들어 나이브-유사 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 CD27, CD28, CD45RA, 및/또는 CCR7의 발현에 대해 양성이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 CD27, CD28, CD45RA, 및/또는 CCR7 중 하나 이상의 표면 발현에 대해 양성이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포, 예를 들어 상기 나이브-유사 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 CD62L의 발현에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포, 예를 들어 상기 나이브-유사 CD3+ T 세포는 CD62L의 발현에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포, 예를 들어 상기 나이브-유사 CD3+, CD4+, 및/또는 CD8+ T 세포는 CD62L의 발현에 대해 음성이다.
세포가 비-나이브 및/또는 비-나이브-유사 T 세포이고, 및/또는 T 세포에서 비-나이브 또는 비-나이브-유사 상태와 연관이 있음을 나타내는 마커로는, CD25, CD45RO, CD56, KLRG1, 및/또는 CD95를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포, 예를 들어 나이브-유사 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 CD25, CD45RO, CD56, 및/또는 KLRG1의 발현에 대해 음성이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포, 예를 들어 나이브-유사 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 비-나이브 또는 비-나이브-유사 세포와 연관된 마커의 낮은 발현을 가진다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포, 예를 들어 나이브-유사 CD3+ T 세포는 CD25, CD45RO, CD56, 및/또는 KLRG1의 발현에 대해 음성이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포, 예를 들어 나이브-유사 CD3+ T 세포는 비-나이브 또는 비-나이브-유사 세포와 연관된 마커의 낮은 발현을 가진다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 CD95의 낮은 발현을 가진다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 CD25, CD45RO, CD56, 및/또는 KLRG1 중 하나 이상의 표면 발현에 대해 음성이다.
일부 구체예에서, 비-나이브 또는 비-나이브-유사 세포와 연관이 있는 마커의 낮은 발현은 비-나이브-유사 세포인 세포내 발현, 및/또는 비-나이브 및/또는 비-나이브-유사 T 세포이고, 및/또는 T 세포에서 비-나이브 또는 비-나이브-유사 상태와 연관이 있음을 나타내는 하나 이상의 마커에 대해 양성인 세포내 발현보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 더 적은 발현이거나, 또는 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 비-나이브 또는 비-나이브-유사 세포와 연관이 있는 마커의 낮은 발현은 이펙터 T(TEFF) 세포, 기억 T 세포, 중앙 기억T 세포(TCM), 및/또는 이펙터 기억 T(TEM) 세포내 마커의 발현보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 더 적은 발현이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포가 비-나이브 및/또는 비-나이브-유사 T 세포이고, 및/또는 T 세포에서 비-나이브 또는 비-나이브-유사 상태와 연관이 있음을 나타내는 마커로는, 하나 이상의 사이토카인을 포함한다. 예를 들어 특정 구현예에서, 비-나이브 또는 비-나이브-유사 T 세포는 IL-2, IFN-γ, IL-4, 및 IL-10 중 하나 이상의 발현 및/또는 제조에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인이 분비된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은, 예를 들어 분비를 예방, 억제, 또는 감소시키는 시제로 치료하는 동안 또는 이후에 비-나이브-유사 T 세포에 의해 내부적으로 발현된다.
특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포, 예를 들어 나이브-유사 CD57- T 세포는 CD45RA 및 CCR7의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 양성이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포, 예를 들어 나이브-유사 CD27+ T 세포는 CD45RA 및 CCR7의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 양성이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 CD4+ T 세포는 CD45RA 및 CCR7의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 양성이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 CD8+ T 세포는 CD45RA 및 CCR7의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 양성이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 CD3+ T 세포는 CD45RA 및 CCR7의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 양성이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 CD45RA, CD27, 및 CCR7의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 양성이고, CD45RO의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 음성이다. 특정 구현예에서, 나이브-유사 CD4+ T 세포는 CD45RA, CD27, 및 CCR7의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 양성이고, CD45RO의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 CD8+ T 세포는 CD45RA, CD27, 및 CCR7의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 양성이고, CD45RO의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 CD3+ T 세포는 CD45RA, CD27, 및 CCR7의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 양성이고, CD45RO의 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 음성이다.
특정 구현예에서, 농축된 CD57- T 세포(예를 들어 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단)의 집단은 CD25 발현에 대해 양성인 (약) 또는 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%의 T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 또는 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%의 CD57-CD25+ T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 10% 내지 60%, 20% 내지 50%, 또는 25% 내지 40%(각각의 경계 포함)의 CD25+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 10% 내지 60%, 20% 내지 50%, 또는 25% 내지 40%(각각의 경계 포함)의 CD57-CD25+ T 세포를 함유한다.
특정 구현예에서, 농축된 CD27+ T 세포(예를 들어 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단)의 집단은 CD25 발현에 대해 양성인 (약) 또는 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%의 T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 또는 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%의 CD27+CD25+ T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 10% 내지 60%, 20% 내지 50%, 또는 25% 내지 40%(각각의 경계 포함)의 CD25+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 10% 내지 60%, 20% 내지 50%, 또는 25% 내지 40%(각각의 경계 포함)의 CD27+CD25+ T 세포를 함유한다.
특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 CD27 발현에 대해 양성인 (약) 또는 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%의 T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 또는 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%의 CD57-CD27+ T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 10% 내지 60%, 20% 내지 50%, 또는 25% 내지 40%(각각의 경계 포함)의 CD27+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 10% 내지 60%, 20% 내지 50%, 또는 25% 내지 40%(각각의 경계 포함)의 CD57-CD27+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 25%의 CD27+ T 세포를 함유한다.
특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 CD57 발현에 대해 양성인 (약) 또는 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%의 T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 또는 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%의 CD57-CD27+ T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 10% 내지 60%, 20% 내지 50%, 또는 25% 내지 40%(각각의 경계 포함)의 CD57- T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 10% 내지 60%, 20% 내지 50%, 또는 25% 내지 40%(각각의 경계 포함)의 CD57-CD27+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 25%의 CD57- T 세포를 함유한다.
특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 CD28 발현에 대해 양성인 (약) 또는 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%의 T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 또는 적어도 (약) 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%의 CD57-CD28+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 5% 내지 (약) 50%, (약) 5% 내지 (약) 35%, 또는 (약) 10% 내지 (약) 25%(각각의 경계 포함)의 CD28+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 5% 내지 (약) 50%, (약) 5% 내지 (약) 35%, 또는 (약) 10% 내지 (약) 25%(각각의 경계 포함)의 CD57-CD28+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 25%의 CD28+ T 세포를 함유한다.
특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 CD28 발현에 대해 양성인 (약) 또는 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%의 T 세포를 함유한다. 다양한 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 또는 적어도 (약) 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%의 CD27+CD28+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 5% 내지 (약) 50%, (약) 5% 내지 (약) 35%, 또는 (약) 10% 내지 (약) 25%(각각의 경계 포함)의 CD28+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 5% 내지 (약) 50%, (약) 5% 내지 (약) 35%, 또는 (약) 10% 내지 (약) 25%(각각의 경계 포함)의 CD27+CD28+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 25%의 CD28+ T 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 CCR7 발현에 대해 양성인 (약) 또는 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 또는 적어도 (약) 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% CD57- CCR7+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 5% 내지 (약) 50%, 또는 (약) 5% 내지 (약) 35%, 또는 (약) 10% 내지 (약) 25%(각각의 경계 포함)의 CCR7+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 5% 내지 (약) 50%, 또는 (약) 5% 내지 (약) 35%, 또는 (약) 10% 내지 (약) 25%(각각의 경계 포함)의 CD57- CCR7+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 25%의 CCR7+ T 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 CCR7 발현에 대해 양성인 (약) 또는 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 또는 적어도 (약) 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% CD27+ CD45RA+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 5% 내지 (약) 50%, 또는 (약) 5% 내지 (약) 35%, 또는 (약) 10% 내지 (약) 25%(각각의 경계 포함)의 CCR7+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 5% 내지 (약) 50%, 또는 (약) 5% 내지 (약) 35%, 또는 (약) 10% 내지 (약) 25%(각각의 경계 포함)의 CD27+ CCR7+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 25%의 CCR7+ T 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 CCR7 발현에 대해 양성인 (약) 또는 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 또는 적어도 (약) 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% CD57-CD45RA+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 5% 내지 (약) 50%, 또는 (약) 5% 내지 (약) 35%, 또는 (약) 10% 내지 (약) 25%(각각의 경계 포함)의 CD45RA+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 5% 내지 (약) 50%, 또는 (약) 5% 내지 (약) 35%, 또는 (약) 10% 내지 (약) 25%(각각의 경계 포함)의 CD57-CD45RA+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 25%의 CD45RA+ T 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 CCR7 발현에 대해 양성인 (약) 또는 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 또는 적어도 (약) 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% CD27+CD45RA+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 5% 내지 (약) 50%, 또는 (약) 5% 내지 (약) 35%, 또는 (약) 10% 내지 (약) 25%(각각의 경계 포함)의 CD45RA+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 5% 내지 (약) 50%, 또는 (약) 5% 내지 (약) 35%, 또는 (약) 10% 내지 (약) 25%(각각의 경계 포함)의 CD27+CD45RA+ T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 25%의 CD45RA+ T 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 고갈된 집단(예를 들어 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단) 내의 나이브-유사 세포의 빈도는 생물학적 샘플 내의 나이브-유사 세포의 빈도보다 적어도 (약) 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 더 크다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 내의 하나 이상의 CD25+ T 세포, CD27+ T 세포, CD28+ T 세포, CCR7+ T 세포, 또는 CD45RA+ T 세포의 빈도는 생물학적 샘플 내의 각각의 세포의 빈도보다 적어도 (약) 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 더 크다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40%의 CD27+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40%의 CD28+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%의 CD27+CD28+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 70% 또는 80%의 CD27+CD28+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 또는 25%의 CCR7+ T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 고갈된 집단(예를 들어 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단) 내의 나이브-유사 세포의 빈도는 생물학적 샘플 내의 나이브-유사 세포의 빈도보다 적어도 (약) 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 더 크다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 내의 하나 이상의 CD25+ T 세포, CD27+ T 세포, CD28+ T 세포, CCR7+ T 세포, 또는 CD45RA+ T 세포의 빈도는 생물학적 샘플 내의 각각의 세포의 빈도보다 적어도 (약) 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 더 크다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40%의 CD27+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40%의 CD28+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%의 CD27+CD28+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 70% 또는 80%의 CD27+CD28+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 적어도 (약) 10%, 15%, 20%, 또는 25%의 CCR7+ T 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, 선택된 세포 조성물(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 유전자 조작에 사용하기 위한 세포 집단, 예를 들어 유전자 조작되거나 또는 유전자 조작된 세포를 생산하는 과정을 겪을 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포는 재조합 수용체를 암호화하는 핵산으로 처리되거나, 접촉되거나, 또는 인큐베이션될 것이다. 특정 구현예에서, 투입 조성물은 T 세포, 생존가능한 T 세포, CD57-T 세포, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및/또는 그의 서브세트를 함유한다.
특정 구현예에서, 선택된 세포 조성물(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 유전자 조작에 사용하기 위한 세포 집단, 예를 들어 유전자 조작될 세포 또는 유전자 조작된 세포를 생산하는 과정을 겪을 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포는 재조합 수용체를 암호화하는 핵산으로 처리되거나, 접촉되거나, 또는 인큐베이션될 것이다. 특정 구현예에서, 투입 조성물은 T 세포, 생존 T 세포, CD27+ T 세포, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및/또는 그의 서브세트를 함유한다.
일부 구현예에서, 세포 생존력은 염료 흡수 검정(예를 들어 칼세인 AM 검정), XTT 세포 생존력 검정, 및 염료 배제 검정(예를 들어 트리판 블루, 에오신, 또는 프로피듐 염료 배제 검정)을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는 검정으로 평가된다. 특정 구현예에서, 생존 세포는 하나 이상의 아폽토픽 마커(apoptotic markers), 예를 들어 아넥신 V 또는 활성 카스파제 3의 음성 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, 생존 세포는 카스파제 또는 활성 카스파제, 예를 들어 카스파제 2, 카스파제 3, 카스파제 6, 카스파제 7, 카스파제 8, 카스파제 9, 또는 카스파제 10, Bcl-2 패밀리 구성원, 예를 들어 Bax, Bad, 및 Bid, 아넥신 V, 또는 TUNEL 염색을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 아폽토픽 마커의 발현에 대해 음성이다. 특정 구현예에서, 생존 세포는 활성 카스파제 3 음성이다. 특정 구현예에서, 생존 세포는 아넥신 V 음성이다.
일부 구현예에서, 투입 조성물은 농축된 CD57-T 세포 집단, 예를 들어 생존 CD57- T 세포(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)를 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)의 세포의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%는 CD57- T 세포, 예를 들어 생존 CD57- T 세포이다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%는 CD57- T 세포, 예를 들어 생존 CD57- T 세포이다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%는 CD57- T 세포, 예를 들어 생존가능한 CD57- T 세포이다. 일부 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 CD57- T 세포, 예를 들어 생존가능한 CD57- T 세포로 본질적으로 구성된다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단은 CD57- T 세포, 예를 들어 생존가능한 CD57- T 세포로 본질적으로 구성된다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 CD57- T 세포, 예를 들어 생존가능한 CD57- T 세포로 본질적으로 구성된다.
특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 농축된 CD3+ T 세포에 대해 농축된 세포의 집단이다. 특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 CD3+ T 세포인 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100% 세포이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 CD3+ T 세포인 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100% 세포이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 CD3+ T 세포로 본질적으로 구성된다. 특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 CD57-, 예를 들어 생존가능한 CD57- T 세포인 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100% 세포 CD3+ T 세포이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 농축된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포, 예를 들어 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에 대해 농축된 세포의 집단이다. 특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 CD3+ T 세포(CD4+ 및 CD8+ T 세포)인 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100% 세포이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 CD4+ 및 CD8+ T 세포인 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100% 세포이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 CD4+ 및 CD8+ T 세포로 본질적으로 구성된다. 특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 CD57-, 예를 들어 생존가능한 CD57- T 세포인 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100% 세포 CD3+ T 세포(CD4+ 및 CD8+ T 세포)이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 농축된 CD4+ T 세포의 집단이다. 특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 세포는 CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 투입 집단은 본질적으로 CD4+ T 세포로 구성된다. 특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 CD57-, 예를 들어 생존가능한 CD57- T 세포인 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100% 세포 CD4+ T 세포이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 농축된 CD8+ T 세포의 집단이다. 특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 세포는 CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 본질적으로 CD8+ T 세포로 구성된다. 특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 CD57-, 예를 들어 생존가능한 CD57- T 세포인 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100% 세포 CD8+ T 세포이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단으로부터의 세포 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단으로부터의 세포는 혼합, 조합, 및/또는 풀링되어 CD57-CD4+ T 세포 및 CD57-CD8+ T 세포를 함유하는 투입 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)을 생성한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포 및 CD57-CD8+ T 세포의 집단은 세포를 자극하기 전에, 예를 들어 자극 조건 하에 세포를 배양하기 전에 풀링, 혼합, 및/또는 조합된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ 및 CD57-CD8+ T 세포의 집단은 동결, 예를 들어 동결 보존, 및 농축된 CD57-CD4+ 및 CD57-CD8+ T 세포의 집단의 해동 후에 풀링, 혼합, 및/또는 조합된다.
특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ 세포 집단으로부터의 세포를 농축된 CD57-CD8+ 세포 집단으로부터의 세포와 혼합, 풀링 및/또는 조합하여 투입 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)을 생산, 생성 또는 제조한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단은 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 99.9%의 CD57-CD4+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단은 100% CD57-CD4+ T 세포를 함유하거나 약 100% CD57-CD4+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 농축된 T 세포의 집단은 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD57-CD8+ T 세포를 포함 또는 함유하고/하거나 CD57-CD8+ T 세포를 포함하지 않으며/않거나 CD57-CD8+ T 세포가 없거나 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 본질적으로 CD57-CD4+ T 세포로 구성된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단은 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 99.9% CD57-CD8+ T 세포를 함유하거나, 또는 (약) 100% CD57-CD8+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단은 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만의 CD57-CD4+ T 세포를 포함하거나 함유하고/하거나 또는 CD57-CD4+ T 세포를 함유하지 않고/않거나 CD57-CD4+ T 세포가 없거나 또는 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 본질적으로 CD57-CD8+ T 세포로 구성된다.
일부 구현예에서, 투입 조성물은 농축된 CD27+ T 세포, 예를 들어 생존가능한 CD27+ T 세포(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)의 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)의 세포의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%는 CD27+ T 세포, 예를 들어 생존가능한 CD27+ T 세포이다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단의 세포의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%는 CD27+ T 세포, 예를 들어 생존가능한 CD27+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 약 100%는 CD27+ T 세포, 예를 들어 생존가능한 CD27+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 본질적으로 CD27+ T 세포, 예를 들어 생존가능한 CD27+ T 세포로 구성된다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단은 본질적으로 CD27+ T 세포, 예를 들어 생존가능한 CD27+ T 세포로 구성된다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 본질적으로 CD27+ T 세포, 예를 들어 생존가능한 CD27+ T 세포로 구성된다.
특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 농축된 CD3+ T 세포에 대해 농축된 세포의 집단이다. 특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 CD3+ T 세포인 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 세포이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 CD3+ T 세포인 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 세포이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 CD3+ T 세포로 본질적으로 구성된다. 특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 CD27+, 예를 들어 생존가능한 CD27+ T 세포인 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 세포 CD3+ T 세포이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 농축된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포, 예를 들어 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에 대해 농축된 세포의 집단이다. 특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 CD3+ T 세포(CD4+ 및 CD8+ T 세포)인 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 세포이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 CD4+ 및 CD8+ T 세포인 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 세포이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 CD4+ 및 CD8+ T 세포로 본질적으로 구성된다. 특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 CD27+, 예를 들어 생존가능한 CD27+ T 세포인 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 세포 CD3+ T 세포(CD4+ 및 CD8+ T 세포)이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 농축된 CD4+ T 세포의 집단이다. 특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD27 농축된T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된T 세포 집단)의 세포의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%는 CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 투입 집단은 본질적으로 CD4+ T 세포로 구성된다. 특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 CD27+, 예를 들어 생존가능한 CD27+ T 세포인 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 세포 CD4+ T 세포이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 농축된 CD8+ T 세포의 집단이다. 특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD27 농축된T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된T 세포 집단)의 세포의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%는 CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD27 농축된T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된T 세포 집단)은 본질적으로 CD8+ T 세포로 구성된다. 특정 구현예에서, 투입 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 CD27+, 예를 들어 생존가능한 CD27+ T 세포인 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 (약) 100%의 세포 CD8+ T 세포이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 농축된 CD27+CD4+ T 세포 집단으로부터의 세포 및 농축된 CD27+CD8+ T 세포 집단으로부터의 세포는 혼합, 조합 및/또는 풀링되어 CD27+CD4+ T 세포 및 CD27+CD8+ T 세포를 함유하는 투입 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)을 생성한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD27+CD4+ T 세포 및 CD27+CD8+ T 세포의 집단은 세포를 자극하기 전에, 예를 들어 자극 조건 하에 세포를 배양하기 전에 풀링, 혼합 및/또는 조합된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD27+CD4+ T 세포의 집단으로부터의 세포 및 CD27+CD8+ T 세포의 집단으로부터의 세포는 농축된 CD27+CD4+ 및 CD27+CD8+ T 세포의 집단을 동결, 예를 들어 동결 보존, 및 해동시킨 후 풀링되고, 혼합되고/되거나 조합된다.
특정 구현예에서, 농축된 CD27+CD4+ 세포 집단으로부터의 세포를 농축된 CD27+CD8+ 세포 집단으로부터의 세포와 혼합, 풀링 및/또는 조합하여 투입 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)을 생산, 생성 또는 제조한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD27+CD4+ T 세포의 집단은 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 99.9%의 CD27+CD4+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD27+CD4+ T 세포의 집단은 100% CD27+CD4+ T 세포를 함유하거나 약 100% CD27+CD4+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 농축된 T 세포의 집단은 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD27+CD8+ T 세포를 포함 또는 함유하고/하거나 CD27+CD8+ T 세포를 포함하지 않으며/않거나 CD27+CD8+ T 세포가 없거나 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 본질적으로 CD27+CD4+ T 세포로 구성된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD27+CD8+ T 세포의 집단은 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 99.9% CD27+CD8+ T 세포를 함유하거나, 또는 (약) 100% CD27+CD8+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD27+CD8+ T 세포의 집단은 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만의 CD27+CD4+ T 세포를 포함하거나 함유하고/하거나 또는 CD27+CD4+ T 세포를 함유하지 않고/않거나 CD27+CD4+ T 세포가 없거나 또는 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 본질적으로 CD27+CD8+ T 세포로 구성된다.
특정 구현예에서, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포는 1:10 내지 10 : 1, 1:5 내지 5:1, 4:1 내지 1:4, 1:3 내지 3:1, 2:1 내지 1:2, 1.5:1 내지 1:1.5, 1.25:1 내지 1:1.25, 1.2:1 내지 1:1.2, 1.1:1 내지 1:1.1, 또는 약 1:1 또는 1:1의 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비로 풀링, 혼합 및/또는 조합된다. 특정 구현예에서, 생존가능한 CD4+ T 세포 및 생존가능한 CD8+ T 세포는 1:10 내지 10 : 1, 1:5 내지 5:1, 4:1 내지 1:4, 1:3 내지 3:1, 2:1 내지 1:2, 1.5:1 내지 1:1.5, 1.25:1 내지 1:1.25, 1.2:1 내지 1:1.2, 1.1:1 내지 1:1.1, 또는 약 1:1 또는 1:1의 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비로 풀링, 혼합 및/또는 조합된다.
특정 구현예에서, 투입 조성물(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 (약) 50×106, 100×106, 150×106, 200×106, 250×106, 300×106, 350×106, 400×106, 450×106, 500×106, 550×106, 600×106, 700×106, 800×106, 900×106, 1,000×106, 1,100×106 또는 1,200×106개 또는 50×106, 100×106, 150×106, 200×106, 250×106, 300×106, 350×106, 400×106, 450×106, 500×106, 550×106, 600×106, 700×106, 800×106, 900×106, 1,000×106, 1,100×106 또는 1,200×106개 이상의 T 세포, 예를 들어 생존 가능한 T 세포, 생존 가능한 CD3+ T 세포 또는 생존 가능한 혼합 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 양을 갖는다. 특정 구현예에서, 투입 조성물(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 (약) 50×106, 100×106, 150×106, 200×106, 250×106, 300×106, 350×106, 400×106, 450×106, 500×106, 550×106, 600×106개 또는 50×106, 100×106, 150×106, 200×106, 250×106, 300×106, 350×106, 400×106, 450×106, 500×106, 550×106, 600×106개 이상의 CD4+ T 세포, 예를 들어 생존 가능한 CD4+ T 세포의 양을 갖는다. 특정 구현예에서, 투입 조성물(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 (약) 50×106, 100×106, 150×106, 200×106, 250×106, 300×106, 350×106, 400×106, 450×106, 500×106, 550×106, 600×106개 또는 50×106, 100×106, 150×106, 200×106, 250×106, 300×106, 350×106, 400×106, 450×106, 500×106, 550×106, 600×106개 이상의 CD8+ T 세포, 예를 들어 생존 가능한 CD8+ T 세포의 양을 갖는다. 특정 구현예에서, 투입 조성물(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 (약) 50×106, 100×106, 150×106, 200×106, 250×106, 300×106, 350×106, 400×106, 450×106, 500×106, 550×106, 600×106, 700×106, 800×106, 900×106, 1,000×106, 1,100×106 또는 1,200×106개 또는 50×106, 100×106, 150×106, 200×106, 250×106, 300×106, 350×106, 400×106, 450×106, 500×106, 550×106, 600×106, 700×106, 800×106, 900×106, 1,000×106, 1,100×106 또는 1,200×106개 이상의 T 세포, 예를 들어 생존 가능한 T 세포, 생존 가능한 CD3+ T 세포 또는 생존 가능한 혼합 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 양을 갖는다. 특정 구현예에서, 투입 조성물(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 (약) 50×106, 100×106, 150×106, 200×106, 250×106, 300×106, 350×106, 400×106, 450×106, 500×106, 550×106, 600×106개 또는 50×106, 100×106, 150×106, 200×106, 250×106, 300×106, 350×106, 400×106, 450×106, 500×106, 550×106, 600×106개 이상의 CD4+ T 세포, 예를 들어 생존 가능한 CD4+ T 세포의 양을 갖는다. 특정 구현예에서, 투입 조성물(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 (약) 50×106, 100×106, 150×106, 200×106, 250×106, 300×106, 350×106, 400×106, 450×106, 500×106, 550×106, 600×106개 또는 50×106, 100×106, 150×106, 200×106, 250×106, 300×106, 350×106, 400×106, 450×106, 500×106, 550×106, 600×106개 이상의 CD8+ T 세포, 예를 들어 생존 가능한 CD8+ T 세포의 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 세포의 양은, 동일한 조성물에서 함께 풀링, 혼합 및/또는 결합된 생존 가능한 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 양이다. 상기 구현예에서, CD4+ 및 CD8+ T 세포는 1:3 내지 3:1, 2:1 내지 1:2, 1.5:1 내지 1:1.5, 1.25:1 내지 1:1.25, 1.2:1 내지 1:1.2, 1.1:1 내지 1:1.1 또는 약 1:1 또는 1:1의 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비율로 존재한다. 일부 구현예에서, 세포의 양은, (약) 1:1의 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비율로 함께 풀링, 혼합 및/또는 결합된 생존 가능한 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 양이다.
특정 구현예에서, 투입 조성물(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 (약) 300×106 내지 600×106 T 세포, 예를 들어 생존 가능한 CD3+ 세포, 또는 혼합된 생존가능한 CD4+ 및 생존 가능한 CD8+ 세포(예를 들어 (약) 1:1의 비율로 혼합됨)의 양을 갖는다. 특정 구현예에서, 투입 조성물(예를 들어 CD27 농축된T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된T 세포 집단)은 (약) 300×106 내지 600×106 T 세포, 예를 들어 생생존 가능한 CD3+ 세포, 또는 혼합된 생존 가능한 CD4+ 및 생존 가능한 CD8+ 세포(예를 들어 (약) 1:1의 비율로 혼합됨)의 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 (약) 300×106, 예를 들어 생존 가능한 CD3+ 세포 또는 혼합된 생존 가능한 CD4+ 및 생존 가능한 CD8+ 세포(예를 들어 (약) 1:1의 비율로 혼합됨)의 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 (약) 400×106, 예를 들어 생존 가능한 CD3+ 세포 또는 혼합된 생존 가능한 CD4+ 및 생존 가능한 CD8+ 세포(예를 들어 (약) 1:1의 비율로 혼합됨)의 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 (약) 500×106, 예를 들어 생존 가능한 CD3+ 세포 또는 혼합된 생존 가능한 CD4+ 및 생존 가능한 CD8+ 세포(예를 들어 (약) 1:1의 비율로 혼합됨)의 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 (약) 600×106, 예를 들어 생존 가능한 CD3+ 세포 또는 혼합된 생존 가능한 CD4+ 및 생존 가능한 CD8+ 세포(예를 들어 (약) 1:1의 비율로 혼합됨)의 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 (약) 700×106, 예를 들어 생존 가능한 CD3+ 세포 또는 혼합된 생존 가능한 CD4+ 및 생존 가능한 CD8+ 세포(예를 들어 (약) 1:1의 비율로 혼합됨)의 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 (약) 800×106, 예를 들어 생존 가능한 CD3+ 세포 또는 혼합된 생존 가능한 CD4+ 및 생존 가능한 CD8+ 세포(예를 들어 (약) 1:1의 비율로 혼합됨)의 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 (약) 900×106, 예를 들어 생존 가능한 CD3+ 세포 또는 혼합된 생존 가능한 CD4+ 및 생존 가능한 CD8+ 세포(예를 들어 (약) 1:1의 비율로 혼합됨)의 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 (약) 100×107, 예를 들어 생존 가능한 CD3+ 세포 또는 혼합된 생존 가능한 CD4+ 및 생존 가능한 CD8+ 세포(예를 들어 (약) 1:1의 비율로 혼합됨)의 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 (약) 110×107, 예를 들어 생존 가능한 CD3+ 세포 또는 혼합된 생존 가능한 CD4+ 및 생존 가능한 CD8+ 세포(예를 들어 (약) 1:1의 비율로 혼합됨)의 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 (약) 120×107, 예를 들어 생존 가능한 CD3+ 세포 또는 혼합된 생존 가능한 CD4+ 및 생존 가능한 CD8+ 세포(예를 들어 (약) 1:1의 비율로 혼합됨)의 양을 갖는다.
특정 구현예에서, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포는 투입 조성물(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 (대략) 최대 표적 수(2n)의 T 세포, 예를 들어 생존가능한 T 세포, 생존가능한 CD3+ T 세포, 또는 생존가능한 혼합된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 갖도록 풀링, 혼합, 및/또는 조합된다. 특정 구현예에서, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포는, 투입 조성물(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 (대략) 최대 표적 수(2n)의 T 세포, 예를 들어 생존가능한 T 세포, 생존가능한 CD3+ T 세포, 또는 생존가능한 혼합된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 갖도록 풀링되고, 혼합되고, 및/또는 조합된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물이 적어도 n의 CD4+ T 세포를 함유하고, 농축된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물 (예를 들어 CD4+ T 세포 조성물과 동일한 공여자로부터, 예를 들어 공여자로부터의 동일한 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 샘플로부터 유래됨)이 적어도 n의 CD8+ T 세포를 함유하고, CD4+ T 세포 조성물로부터의 n의 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 조성물로부터의 n의 CD8+ T 세포가 풀링되고, 혼합되고, 및/또는 조합되어 (즉, 1:1 CD4+ 대 CD8+ 비), 표적 수 (2n)의 T 세포를 함유하는 투입 조성물을 생성한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물이 적어도 n개의 CD4+ T 세포를 함유하고, 농축된 CD8+ T 세포(예를 들어 CD4+ T 세포 조성물과 동일한 공여자로부터, 예를 들어 상기 공여자로부터의 동일한 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 샘플로부터 유래됨)를 포함하는 조성물이 적어도 n개의 CD8+ T 세포를 함유하는 경우, CD4+ T 세포 조성물로부터의 n개의 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 조성물로부터의 n개의 CD8+ T 세포는 풀링되고, 혼합되고/되거나 조합되어 (즉, 1:1의 CD4+ 대 CD8+ 비율로) 표적 수(2n)의 투입 조성물을 생성한다. 이들 구현예에서, 투입 조성물은 표적 수(2n) 미만의 T 세포를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물이 n개 미만의 CD4+ T 세포를 함유하고, 농축된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물(예를 들어 CD4+ T 세포 조성물과 동일한 공여자로부터, 예를 들어 공여자로부터의 동일한 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 샘플로부터 유래됨)이 n개 초과의 CD8+ T 세포를 함유하거나, 또는 그 반대인 경우, CD4+ 또는 CD8+ T 세포 조성물의 세포는 투입 조성물이 최대 표적 수(2n)의 T 세포를 함유하도록 대안적 세포 유형을 보충하는데 사용된다. 임의의 선행 구현예에서, 표적 수(2n)는 300×106, 350×106, 400×106, 450×106, 500×106, 550×106, 600×106, 700×106, 800 ×106, 900×106, 1,000×106, 1,100×106, 또는 1,200×106개일 수 있다.
특정 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물로부터의 450×106개의 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물로부터의 450×106개의 CD8+ T 세포(예를 들어 CD4+ T 세포 조성물과 동일한 공여자로부터, 예를 들어 공여자로부터의 동일한 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 샘플로부터 유래됨)를 풀링하고, 혼합하고/하거나 조합하여 900×106개의 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 함유하는 투입 조성물(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)을 생성한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물로부터의 450×106개의 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물로부터의 450×106개의 CD8+ T 세포(예를 들어 CD4+ T 세포 조성물과 동일한 공여자로부터, 예를 들어 공여자로부터의 동일한 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 샘플로부터 유래됨)를 풀링하고, 혼합하고/하거나 조합하여 900×106개의 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 함유하는 투입 조성물(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)을 생성한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물이 450×106개 미만의 CD4+ T 세포를 함유하고, 농축된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물(예를 들어 CD4+ T 세포 조성물과 동일한 공여자로부터, 예를 들어 공여자로부터의 동일한 성분채집술 또는 백혈구성분채집술 샘플로부터 유래됨)이 450×106개 미만의 CD8+ T 세포를 함유하는 경우, CD4+ T 세포 조성물의 모든 세포 및 CD8+ T 세포 조성물의 모든 세포를 풀링하고, 혼합하고/하거나 조합하여 투입 조성물을 생성한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물 중 어느 하나가 450×106개 미만의 CD4+ 또는 CD8+ 세포를 함유하는 한편, 다른 조성물이 450×106개 초과의 CD8+ 세포 또는 CD4+ 세포를 함유하는 경우, 900×106개 이하의 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 조합하여 투입 조성물을 생성한다. 투입 조성물 내의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 총 수는 900×106개 미만일 수 있다. 다시 말해서, 농축된 CD4+ T 세포를 포함하는 조성물의 세포는 농축된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물을 보충하기 위해, 또는 그 반대로, T 세포의 표적 수(2n) 이하, 예를 들어 자극될 900×106개 이하의 T 세포를 포함하는 투입 조성물을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
상기 구현예에서, 세포 선택, 분리, 분리, 농축 및/또는 정제 공정은 선택된 조성물(예를 들어 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단)을 제조하는 맥락에서 논의되지만, 본원에 개시된 세포 선택, 분리, 분리, 농축 및/또는 정제 공정은 임의의 후속 단계(예를 들어 활성화, 자극, 조작, 형질도입, 형질감염, 인큐베이션, 배양, 수확, 제형화 및/또는 대상체에게 제형화된 세포 집단의 투여) 동안, 그 전에 또는 그 사이에 임의의 적합한 조합 및/또는 순서로 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어 T 세포 선택, 분리, 분리, 농축 및/또는 정제 단계는 T 세포 활성화/자극과 T 세포 형질도입 사이에 수행될 수 있다. 또 다른 구체예에서, T 세포 선택, 분리, 분리, 농축 및/또는 정제 단계는 T 세포 형질도입 후에, 그러나 세포를 수확하기 전에, 수집하기 전에, 및/또는 제형화하기 전에 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, T 세포 선택, 분리, 분리, 농축 및/또는 정제 단계는 세포를 정제 또는 청징 단계로서 수확하기 직전에 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피에 의한 T 세포 선택 단계는 T 세포 활성화/자극과 T 세포 형질도입 사이에 수행된다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피에 의한 T 세포 선택 단계는 T 세포 형질도입 후에, 그러나 세포를 수확하기 전에, 수집하기 전에, 및/또는 제형화하기 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피에 의한 T 세포 선택 단계는 세포를 수확하기 직전에 수행된다. 추가로, 본원에 개시된 세포 선택, 분리, 분리, 농축 및/또는 정제 공정은 복수의 상이한 개별 공여자로부터의 CD57 고갈된 T 세포 집단을 조합하여 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생산하는 임의의 단계 동안, 그 전에 또는 그 사이에 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 개시된 세포 선택, 분리, 분리, 농축 및/또는 정제 공정은 또한 복수의 상이한 개별 공여자로부터의 CD27 농축된 T 세포 집단을 조합하여 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생산하는 임의의 단계 동안, 그 전에 또는 그 사이에 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
일부 구현예에서, 선택된 조성물(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 세포를 자극하기 전에, 예를 들어 자극 조건 하에 세포를 배양하기 전에, 예를 들어 무혈청 배지를 사용하여 하나 이상의 희석 및/또는 세척 단계에 적용된다. 일부 구현예에서, 선택된 조성물(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 세포를 자극하기 전에, 예를 들어 자극 조건 하에 세포를 배양하기 전에, 예를 들어 무혈청 배지를 사용하여 하나 이상의 희석 및/또는 세척 단계에 적용된다. 일부 구현예에서, 희석 및/또는 세척 단계는 무혈청 배지, 예를 들어 본원에 참조로 포함된 PCT/US2018/064627에 기재된 것 내로의 배지 교환을 허용한다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 보충물로 보충된 기본 배지(예를 들어 OpTmizer™ T-세포 증폭 기본 배지(ThermoFisher))를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 보충물는 무혈청이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는, 예를 들어 추가 보충물(예를 들어 OpTmizer™ T-세포 증폭 보충물(ThermoFisher))에 의해 제공되는 세포의 유지, 증폭 및/또는 활성화를 위한 하나 이상의 추가 성분으로 보충된 기본 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 혈청 대체 보충물, 예를 들어 면역 세포 혈청 대체제, 예를 들어 ThermoFisher, #A2596101, CTS™ 면역 세포 혈청 대체제 또는 문헌[Smith 등, Clin Transl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31]에 기재된 면역 세포 혈청 대체제를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 유리 형태의 아미노산, 예를 들어 L-글루타민을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 디펩티드 형태의 L-글루타민(예를 들어 L-알라닐-L-글루타민), 예를 들어 Glutamax™(ThermoFisher)의 디펩티드를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 재조합 사이토카인, 예를 들어 재조합 인간 IL-2, 재조합 인간 IL-7 및/또는 재조합 인간 IL-15를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 선택된 조성물(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 출발 샘플, 예를 들어 공여자 샘플로부터 생성된 CD57-CD8+ T 세포에 대해 농축된 집단을, 출발 샘플, 예를 들어 공여자 샘플로부터 생성된 CD57-CD4+ T 세포에 대해 농축된 집단과 혼합하고, 조합하고/하거나 풀링함으로써 생성된다. 일부 구현예에서, CD57-CD4+ T 세포에 대해 농축된 집단은 출발 샘플(예를 들어 공여자 샘플)로부터 CD8+ T 세포에서 농축된 집단을 생성하는 과정 동안 생성된 CD8-음성 분획으로부터 생성된다. 특정 구현예에서, 선택된 조성물(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 (약) 1:1의 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비율을 갖고, 예를 들어 세포를 자극하기 전에, 예를 들어 세포를 자극 조건 하에 배양하기 전에, 하나 이상의 세척 단계, 예를 들어 국제출원 제PCT/US2018/064627호에 기재된 무혈청 배지로 처리된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세척 단계는 알부민을 함유하는 PBS/EDTA 완충제로부터 무혈청 배지 내로의 배지 교환을 허용하고, 이는 또한 세포 자극에 사용된다.
일부 구현예에서, 선택된 조성물(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 출발 샘플, 예를 들어 공여자 샘플로부터 생성된 CD27+CD8+ T 세포에 대해 농축된 집단을, 출발 샘플, 예를 들어 공여자 샘플로부터 생성된 CD27+CD4+ T 세포에 대해 농축된 집단과 혼합하고, 조합하고/하거나 풀링함으로써 생성된다. 일부 구현예에서, CD27+CD4+ T 세포에 대해 농축된 집단은 출발 샘플(예를 들어 공여자 샘플)로부터 CD8+ T 세포에서 농축된 집단을 생성하는 과정 동안 생성된 CD8-음성 분획으로부터 생성된다. 특정 구현예에서, 선택된 조성물(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 (약) 1:1의 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비율을 갖고, 예를 들어 세포를 자극하기 전에, 예를 들어 세포를 자극 조건 하에 배양하기 전에, 하나 이상의 세척 단계, 예를 들어 국제출원 제PCT/US2018/064627호에 기재된 무혈청 배지로 처리된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세척 단계는 알부민을 함유하는 PBS/EDTA 완충제로부터 무혈청 배지 내로의 배지 교환을 허용하고, 이는 또한 세포 자극에 사용된다.
E. 농축된 CD57-세포의 집단의 유전자 조작
복수의 상이한 공여자로부터의 조작된 T 세포 조성물, 및 이를 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자로부터 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 수득하는 것이거나 또는 그를 포함하는 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 각각의 조작된 T 세포 조성물은 상기 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 함유하되, 상기 T 세포는 재조합 수용체로 유전자 조작된 T 세포를 포함하고; 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 조합하여 공여자 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생산한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자로부터 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 수득하는 것이거나 또는 그를 포함하는 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 각각의 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD27(CD27+)에 대해 표면 양성인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 함유하되, 상기 T 세포는 재조합 수용체로 유전자 조작된 T 세포를 포함하고; 및 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 조합하여 공여자 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생산한다. 일부 구현예에서, 유전자 조작된 조성물의 T 세포는 동일한 재조합 수용체로 조작된다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포 조성물에서 재조합 수용체를 발현하는 T 세포의 각각은 동일한 재조합 수용체를 발현한다.
일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 개별 공여자로부터 생산된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터 생성된 조작된 T 세포 조성물은 개별 공여자로부터 생산된 하나 이상의 다른 조작된 T 세포 조성물과 조합되어, 복수의 상이한 공여자로부터의 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자로부터 생산된다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자로부터의 공여자 샘플을 조합하여 풀링된 공여자 샘플을 생산하고, 풀링된 공여자 샘플을 조작하여 복수의 상이한 공여자로부터의 조작된 T 세포 조성물을 생산한다.
상기 제공된 방법 중에는 T 세포의 하나 이상의 집단, 예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 유전자 조작(예를 들어 녹아웃 및/또는 녹아웃)하는 방법이 있다. 또한 상기 제공된 방법 중에는 T 세포의 하나 이상의 집단, 예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 유전자 조작(예를 들어 녹아웃 및/또는 녹아웃)하는 방법이 있다. 본원에 개시된 유전자 조작 공정은 복수의 상이한 개별 공여자로부터의 세포 집단을 조합하여 풀링된 T 세포 조성물을 생성하는 임의의 단계 동안, 그 전에, 그 후에 또는 그 사이에 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 유전자 조작은 복수의 개별 공여자로부터의 세포 조성물을 조합하는 임의의 단계 전에 수행된다. 예를 들어 유전자 조작은 개별 공여자로부터의 세포 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단) 상에서 수행될 수 있고, 개별 공여자로부터의 조작된 세포 조성물은 그 후에 하나 이상의 다른 개별 공여자로부터의 조작된 세포 조성물과 조합되어 풀링된 조작된 조성물을 생성할 수 있다. 일부 측면에서, 유전자 조작은 복수의 개별 공여자로부터의 세포 조성물을 조합한 후에 수행된다. 예를 들어 유전자 조작은 복수의 상이한 공여자로부터의 세포 집단(예를 들어 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단) 상에서 수행되어 풀링된 조작된 조성물을 생산할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 집단을 유전자 조작하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 유전자 조작된 세포 집단은 CD57 고갈된 T 세포 집단 또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단이다. 일부 구현예에서, 유전자 조작된 세포 집단은 CD27 농축된 T 세포 집단 또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단이다. 일부 구현예에서, 유전자 조작은 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 세포의 집단에 도입하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 유전자 조작은 세포의 집단에서 하나 이상의 분자(예를 들어 유전자 좌 또는 그의 일부)를 파괴 (예를 들어 녹아웃)하는 것이거나, 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 조작은 세포 집단에서 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하고, 하나 이상의 분자(예를 들어 유전자 좌 또는 그의 일부)를 파괴 (예를 들어 녹아웃)하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 조작은 표적화된 삽입(예를 들어 녹아웃)에 의해 이종 폴리뉴클레오티드를 녹아웃된 유전자 좌 또는 그의 일부 내로 도입하는 것이거나, 또는 그를 포함한다. 일부 측면에서, 이종 폴리뉴클레오티드의 도입은 파괴(예를 들어 녹아웃)와 동시에 수행된다. 일부 측면에서, 이종 폴리뉴클레오티드의 도입 및 파괴는 어느 순서로든 순차적으로 수행된다. 일부 측면에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 키메라 항원 수용체(CAR)인 재조합 수용체를 암호화한다. 일부 구현예에서, CAR은 파괴된 분자(예를 들어 유전자 좌 또는 그의 일부) 내로 녹아웃된다. 일부 측면에서, 키메라 항원 수용체(CAR)는 TRAC 유전자 좌 또는 그의 일부 내로 녹아웃된다.
일부 구현예에서, 도입은 본원에, 예를 들어 섹션 II.D에 제공된 일반적 조작을 위한 임의의 방법에 의해 수행된다. 일부 측면에서, 상기 제공된 방법은 형질도입된 T 세포를 세포의 게놈 내로의 바이러스 벡터의 통합을 허용하는 조건 하에 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포 집단, 예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 예를 들어 집단의 세포를 본원에, 예를 들어 섹션 III.E에 기재된 임의의 자극 조건, 예를 들어 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극함으로써 자극 또는 활성화된다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 유전자 조작 전에 자극 또는 활성화된다.
일부 구현예에서, T 세포 집단, 예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 예를 들어 집단의 세포를 본원에, 예를 들어 섹션 III.E에 기재된 임의의 자극 조건, 예를 들어 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극함으로써 자극 또는 활성화된다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 유전자 조작 전에 자극 또는 활성화된다.
상기 제공된 방법은 상기 조작된 세포가 세포의 집단을 증폭시킬 목적으로 추가로 배양되지는 않는 방법을 포함할 수 있다. 예를 들어 일부 측면에서, 수확된 세포는, 인큐베이션 또는 배양 초기의 생존 가능한 총 세포수에 비해 인큐베이션 또는 배양 말기에 생존 가능한 총 세포의 양이 증가되는 임의의 인큐베이션 또는 배양을 거치지 않았다. 일부 구현예에서, 수확된 세포는, 상기 인큐베이션 또는 배양 공정의 시작에 비해 인큐베이션 또는 배양 공정의 말기에 생존 가능한 총 세포수를 명백하게 증가시킬(예를 들어 증폭시킬) 목적을 위한 임의의 인큐베이션 또는 배양 단계를 거치지 않았다. 일부 구현예에서, 세포는 증폭을 초래할 수 있는 조건 하에 인큐베이션 또는 배양되나, 인큐베이션 또는 배양 조건이 세포 집단을 증폭시킬 목적으로 수행되지 않는다. 일부 구현예에서, 수확된 세포는 증폭 단계를 포함하지 않는 공정로 제조되었으나 증폭을 거쳤을 수 있다. 일부 구현예에서, 증폭 단계를 포함하지 않는 제조 공정는 비증폭 또는 최소한으로 증폭된 공정로 지칭된다. "비증폭(non-expanded)" 공정는 "최소한으로 증폭된(minimally expanded)" 공정로도 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 비증폭 또는 최소한으로 증폭된 공정는 증폭 단계를 포함하지 않는 공정임에도 증폭을 거친 세포를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 수확된 세포는 전체적으로 세포 집단의 증폭을 감소, 억제, 최소화 또는 제거하도록 설계된 배지 조성을 포함하는 인큐베이션 또는 배양 단계를 거쳤을 수 있다. 일부 구현예에서, 수집, 수확 또는 제형화된 세포는, 세포가 인큐베이션 또는 배양의 전부 또는 일부 동안 흔들림, 회전, 떨림 또는 관류되는 조건 하에 또는 생물 반응기에서 수행된 인큐베이션 또는 배양을 이전에 겪지 않았다.
특정 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 배양되고, 예를 들어 고정된 시간 동안 또는 증폭에 대한 임계 한계에 도달할 때까지 T 세포 분열, 성장 또는 증폭을 촉진하거나 허용하는 조건하에서 배양된다. 일부 측면에서 상기 배양은 본원에서, 예를 들어 섹션 II.F에서 기술된 임의의 방법에 의해서 수행된다.
특정 구현예에서, CD57- T 세포의 하나 이상의 초기 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)으로부터 유전자 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, CD27+ T 세포의 하나 이상의 초기 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)으로부터 유전자 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 초기 집단은 개별 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 초기 집단은 적어도 하나의 다른 개별 공여자로부터의 초기 집단과 조합되어 복수의 상이한 공여자로부터의 풀링된 초기 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 초기 집단은 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 집단의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극되고, 그에 의해서 자극된 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 집단의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극되고, 그에 의해서 자극된 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 자극된 집단은 개별 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 자극된 집단은 하나 이상의 다른 개별 공여자로부터의 자극된 조성물과 조합되어 복수의 공여자로부터의 자극된 조성물을 생성한다. 일부 구현예에서, 자극된 집단은 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 상기 자극, 예를 들어 자극 조건하에 상기 세포를 배양하는 것은 설정 또는 고정된 양의 시간, 예를 들어 2일 미만의 양의 시간 또는 18시간 내지 30시간의 양의 시간동안 수행된다. 일부 측면에서, 상기 자극 시약을 사용한 자극은 (약) 20±4시간 동안 수행된다.
특정 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 자극된 집단의 세포로 도입됨으로써 형질전환된 집단을 발생시킨다. 특정 구현예에서, 세포는, 세포를 유전자 조작하는 동안 또는 후에, 예를 들어 재조합 단백질을 암호화하는 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오티드의 통합을 허용하거나 또는 재조합 단백질의 발현을 허용하기에 충분한 시간량 동안 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 세트 또는 고정된 시간량, 예를 들어 18 시간 초과 또는 4 일 미만, 예를 들어 72 시간±6 시간의 시간량 동안 인큐베이션된다. 임의의 제공된 구현예에서, 도입은 자극 시약으로 자극된 후에 세포 상에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 조작 단계는, 자극 시약이 세포에 첨가되거나 배양되거나 또는 접촉된 때부터 30 시간 이내와 같이 자극이 시작 또는 개시된 때부터 설정된 시간량 내에 시작되거나 개시된다. 특정 구현예에서, 조작 단계는, 자극 시약이 세포에 첨가되거나 배양되거나 또는 접촉된 후 18 시간 내지 30 시간, 예를 들어 20 시간±4 시간에 시작되거나 개시된다.
특정 구현예에서, 이어서 형질전환된 집단이, 예를 들어 설정된 양의 시간 동안 또는 임계 증폭이 달성될 때까지 증폭되고, 이로써 증폭 집단이 생성된다. 일부 구현예에서, 형질전환된 집단은 개별 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 형질전환된 집단은 하나 이상의 다른 개별 공여자로부터의 형질전환된 집단과 조합되어 복수의 공여자로부터의 형질전환된 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 형질전환된 집단은 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 형질전환된 집단 또는 증폭 집단은 수확 또는 수집되고, 선택적으로 예를 들어 대상체에 투여하기 위해 또는 동결 보존을 위해 제형화된다. 일부 구현예에서, 집단은 CD57-CD4+ T 세포 및 CD57-CD8+ T 세포이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 집단은 CD57-CD3+ T 세포이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 집단은 CD27+CD4+ T 세포 및 CD27+CD8+ T 세포이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 집단은 CD27+CD3+ T 세포이거나 이를 함유한다.
특정 구현예에서, 농축된 T 세포 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 수집되고, 동결 보호를 위해 제형화되고, 냉동되고(예를 들어 동결 보호됨)/되거나, 재조합 수용체를 발현하는 농축된 T 세포의 조작된 조성물을 생성하는 방법의 임의의 단계 전, 동안, 또는 후에 0℃ 미만, -20℃ 미만, 또는 -70℃ 또는 -80℃ 미만으로 저장될 수 있다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포 집단은 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단이다. 일부 구현예에서, 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 일 이하의 시간의 양 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 주 이하의 시간량 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 주 이상의 시간의 양 동안 또는 8 주 이상 동안 저장될 수 있다. 저장 후, 농축된 T 세포 집단은 해동될 수 있고, 가공은 공정의 동일한 지점에서 재개될 수 있다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)의 초기 집단은 동결 보호되고, 추가의 가공, 예를 들어 자극 조건 하의 인큐베이션 전에 저장된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 초기 집단은 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단이다. 특정 구현예에서, 조작된 T 세포의 배양된 및/또는 제형화된 조성물은 대상체로서 예를 들어 자가 세포 요법으로서 투여되기 전에 동결 보호되고 저장된다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 조작된 세포가 세포를 자극하는 단계, 및 이어서 재조합 수용체, 예를 들어 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로, 예를 들어 녹아웃된 유전자 좌 또는 그의 일부에 도입(예를 들어 녹아웃)하는 단계를 포함하는 공정에 의해 생성되는 것과 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, 유전자 조작은 하나 이상의 유전자 좌 또는 그의 일부를 파괴(예를 들어 녹아웃)하는 것을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 자극은 18 내지 30 시간, 예를 들어 약 24 시간 동안 수행되고, 폴리뉴클레오티드의 도입은 후속적으로 수행된다. 특정 구현예에서, 세포는 폴리뉴클레오티드의 도입이 개시된 후 3 일 내에, 예를 들어 동결 보존을 위해 제형화되거나 대상체에게 투여되도록 수확 또는 수집된다. 일부 구현예에서, 수확 또는 수집된 세포는 개별 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 수확 또는 수집된 세포는 하나 이상의 다른 개별 공여자로부터의 수확 또는 수집된 세포와 조합되어 복수의 상이한 공여자로부터의 수확 또는 수집된 세포를 생성한다. 일부 구현예에서, 수확 또는 수집된 세포는 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다. 다양한 구현예에서, 세포는, 예를 들어 동결 보존을 위해 제형화되거나 자극 조건 하의 인큐베이션이 개시된 후 4일 내에 대상체에게 투여되도록 수확 또는 수집된다. 일부 구현예에서, 제형화된 집단은 개별 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 제형화된 집단은 하나 이상의 다른 개별 공여자로부터의 제형화된 집단과 조합되어 복수의 상이한 공여자로부터의 제형화된 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 제형화된 집단은 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다.
특정 구현예에서, 2개의 초기 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단으로부터 유전자 조작된 T 세포 조성물을 생성하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 농축된 CD57- T 세포의 2개의 집단은 자극 조건 하에 별도로 인큐베이션되고, 그에 의해서 2개의 별개의 자극된 집단을 생산한다. 특정 구현예에서, 2개의 초기 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단으로부터 유전자 조작된 T 세포 조성물을 생성하기 위한 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 구현예에서, 농축된 CD27+ T 세포의 2개의 집단은 자극 조건 하에 별도로 인큐베이션되고, 그에 의해서 2개의 별개의 자극된 집단을 생산한다. 특정 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드가 2개의 별개의 자극 집단의 세포로 도입되고, 이로써 2개의 별개의 형질전환된 집단이 생성된다. 특정 구현예에서, 이어서 2개의 별개의 형질전환된 집단이, 예를 들어 고정된 시간량 동안 또는 임계 증폭이 달성될 때까지 증폭되고, 이로써 2개의 별개의 증폭 집단이 초래된다. 특정 구현예에서, 2개의 별개의 형질전환된 집단 또는 2개의 별개의 증폭 집단이 수확 또는 수집되고, 선택적으로 예를 들어 대상체에 투여하기 위해 또는 동결 보존을 위해 제형화된다. 특정 구현예에서, 2개의 별개의 집단은 동일한 개별 공여자로부터의 동일한 생물학적 샘플 또는 상이한 생물학적 샘플에서 기원하거나 유래된다. 특정 구현예에서, 2개의 별개의 집단은 상이한 공여자로부터의 상이한 생물학적 샘플로부터 기원하거나 유래된다. 일부 구현예에서, 2개의 별개의 집단은 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단 및 CD57- CD8+ T 세포의 별개의 집단이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 2개의 별개의 집단은 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단 및 CD27+ CD8+ T 세포의 별개의 집단이거나 이를 함유한다.
또한 예를 들어 T 세포 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건하에, 예를 들어 본원에서, 예를 들어 섹션 II.F.에서 기술된 임의의 조건하에 인큐베이션 또는 배양 동안 증폭 또는 증식할 수 있는 세포의 집단을 식별하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 집단에서 CD57+ 의 빈도를 측정하는 것이거나 또는 그를 포함하되, CD57+ 세포의 빈도가 임계 빈도 미만인 경우 상기 세포는 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 집단에서 CD57+ 세포의 빈도를 측정하는 단계이거나 이를 포함하고, CD57+ 세포의 빈도가 임계 빈도 미만이면, 집단은 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 임계 빈도는 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 임계값은 (약) 20%이다. 일부 구현예에서, 증폭될 수 있는 집단은 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건하의 배양 동안 10, 11, 12, 13, 또는 14 일 이내에 적어도 2-배, 3-배, 4-배, 또는 5-배 증폭한다. 특정 구현예에서, 증폭될 수 있는 집단은 배양 동안, 예를 들어 본원에서 예를 들어 섹션 II.F.에서 제공된 배양 동안 11일 이내에 적어도 4-배 증폭한다.
일부 구현예에서, T 세포 집단의 CD57 발현과 관련된 형질(train)의 값을 측정하거나 또는 그를 포함하되, 상기 형질의 값이 상기 형질의 임계값 미만인 경우 T 세포의 집단은 세포 요법을 증폭시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 형질은 상기 용량의 총 T 세포, CD4+ T 세포, 또는 CD8+ T 세포 중에 존재하는 CD57에 의해 암호화된 폴리펩티드의 수준 또는 양이다. 특정 구현예에서, 상기 형질은 상기 용량의 총 T 세포, CD4+ T 세포, 또는 CD8+ T 세포의 표면 상에 존재하는 CD57에 의해서 암호화된 폴리펩티드의 수준 또는 양이고, 특정 구현예에서, 상기 형질은 CD57의 발현에 대해 양으로 존재하는 T 세포, CD4+ T 세포, 또는 CD8+ T 세포의 빈도, 백분율, 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 형질은 상기 T 세포 중에 존재하는 제 2 유전자의 mRNA의 수준 또는 양이다. 특정 구현예에서, 상기 CD57의 수준 또는 양.
특정 구현예에서, 상기 임계값은 CD57 발현과 관련된 상기 형질의 평균값 또는 중앙값 측정치 미만인 (약), 또는 25% 이내, 20% 이내, 15% 이내, 10% 이내, 또는 5% 이내이고/이거나 복수의 참조 T 세포 집단에서, 상기 평균값 또는 중앙값 측정치 미만인 하나의 표준 편차 미만이다. 특정 구현예에서, 상기 임계값은 복수의 참조 T 세포 집단으로부터의 집단에서, CD57 발현과 관련된 상기 형질의 최저 측정치 미만, 선택적으로 50% 이내, 25% 이내, 20% 이내, 15% 이내, 10% 이내, 또는 5% 이내이다. 일부 구현예에서, 상기 임계값은 복수의 참조 T 세포 집단으로부터의 샘플의 65%, 75%, 80%, 85% 초과로부터 계산된 CD57 발현과 관련된 상기 형질의 평균값 또는 중앙값 측정치 미만이다.
일부 구현예에서, T 세포 집단의 CD27 발현과 관련된 형질(train)의 값을 측정하거나 또는 그를 포함하되, 상기 형질의 값이 상기 형질의 임계값 초과인 경우 T 세포의 집단은 세포 요법을 증폭시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 형질은 상기 용량의 총 T 세포, CD4+ T 세포, 또는 CD8+ T 세포 중에 존재하는 CD27에 의해 암호화된 폴리펩티드의 수준 또는 양이다. 특정 구현예에서, 상기 형질은 상기 용량의 총 T 세포, CD4+ T 세포, 또는 CD8+ T 세포의 표면 상에 존재하는 CD27에 의해서 암호화된 폴리펩티드의 수준 또는 양이다. 특정 구현예에서, 상기 형질은 CD27의 발현에 대해 양으로 존재하는 T 세포, CD4+ T 세포, 또는 CD8+ T 세포의 빈도, 백분율, 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 형질은 상기 T 세포 중에 존재하는 제 2 유전자의 mRNA의 수준 또는 양이다. 특정 구현예에서, 상기 CD27의 수준 또는 양.
특정 구현예에서, 상기 임계값은 CD27 발현과 관련된 상기 형질의 평균값 또는 중앙값 측정치 초과인 (약), 또는 25% 이내, 20% 이내, 15% 이내, 10% 이내, 또는 5% 이내이고/이거나 복수의 참조 T 세포 집단에서, 상기 평균값 또는 중앙값 측정치 초과인 하나의 표준 편차 초과이다. 특정 구현예에서, 상기 임계값은 복수의 참조 T 세포 집단으로부터의 집단에서, CD27 발현과 관련된 상기 형질의 최고 측정치 초과, 선택적으로 50% 이내, 25% 이내, 20% 이내, 15% 이내, 10% 이내, 또는 5% 이내이다. 일부 구현예에서, 상기 임계값은 복수의 참조 T 세포 집단으로부터의 샘플의 65%, 75%, 80%, 85% 초과로부터 계산된 CD57 발현과 관련된 상기 형질의 평균값 또는 중앙값 측정치 초과이다.
특정 구현예에서, 상기 복수의 참조 T 세포 집단은 T 세포의 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건하에 배양될 때 증폭하지 않는 복수의 집단이며, 선택적으로 상기 세포는 배양, 예를 들어 본원에서, 예를 들어 섹션 III.C.에서 기술된 배양 10, 11, 12, 13, 또는 14일 이내에 적어도 3-배, 4-배, 또는 5-배까지 종폭되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 참조 T 세포 집단은 배양 11일 이내에 적어도 4-배까지 증폭하지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 수확은 상기 조작된 T 세포 조성물 또는 T 세포의 조작된 집단이 임계 수의 T 세포, 생존가능한 T 세포, 조작된 T 세포 또는 생존가능한 조작된 T 세포, 또는 임계 농도의 T 세포, 생존가능한 T 세포, 조작된 T 세포 또는 생존가능한 조작된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포, 생존가능한 T 세포, 조작된 T 세포 또는 생존가능한 조작된 T 세포의 임계수 또는 농도는 자극 개시 후 (약) 4, 5, 6 또는 7일 이내에 도달한다.
일부 구현예에서, 조작된 T 세포의 복수의 조성물 또는 증폭된 T 세포의 집단, T 세포, 생존가능한 T 세포, 조작된 T 세포 또는 생존가능한 조작된 T 세포의 임계수 또는 농도는 상기 복수의 집단의 적어도 (약) 또는 적어도 (약) 70%, 80%, 90% 또는 95%에서 자극 개시 후 (약) 5 또는 6일 이내에 도달한다. 일부 구현예에서, T 세포, 생존가능한 T 세포, 조작된 T 세포 또는 생존가능한 조작된 T 세포의 임계수 또는 농도는 자극 개시 후 (약) 2, 3, 4 또는 5 집단 배가 이내에 도달한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 또한, CD57과 관련된 형질의 값이 임계값 미만인 경우 및 제 2 유전자의 발현과 관련된 형질이 제 2 임계값 미만인 경우 상기 조성물, 예를 들어 상기 조작된 조성물이 증폭될 수 있도록 제 2 유전자의 발현과 관련된 형질의 값을 측정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제 2 유전자는 나이브-유사 세포의 마커이며, 예를 들어 제한되지는 않지만 CD25, CD27, CD28, CCR7, 또는 CD45RA이다. 일부 구현예에서, 상기 제 2 유전자는 CD27를 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 또한 제 2 유전자의 발현과 연관된 형질의 값을 측정하여, CD27 발현과 연관된 형질의 값이 임계값보다 큰 경우 및 제 2 유전자의 발현과 연관된 형질이 제 2 임계값보다 큰 경우, 조성물, 예를 들어 조작된 조성물이 증폭될 수 있도록 하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제 2 유전자는 나이브-유사 세포의 마커, 예를 들어 비제한적으로 CD25, CD28, CCR7 또는 CD45RA이다.
1. 재조합 수용체의 유전자 조작
CD57- T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물의 제조 방법이 본원에 제공된다. 또한 상기 방법에 의해 생산된 CD57- T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 CD57-농축된 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)을 유전자 조작함으로써 생산된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 CD57 고갈된 T 세포 집단은 유전자 조작되어 조작된 T 세포 조성물을 생산한다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 CD57 고갈된 T 세포 집단은 유전자 조작된 후 하나 이상의 다른 개별 공여자의 유전자 조작된 T 세포 조성물과 조합되어 복수의 공여자로부터의 공여자 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생산한다. 일부 구현예에서, 복수의 공여자로부터의 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 유전자 조작되어 복수의 공여자로부터의 공여자 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생산한다.
일부 구현예에서, 유전자 조작은 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산을 CD57 고갈된 세포 집단 내로 도입함으로써 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 조작은 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산을 풀링된 CD57 고갈된 세포 집단 내로 도입함으로써 공여자 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 것을 포함한다.
또한 CD27+ T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 또한 상기 방법에 의해 생산된 CD27+ T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 CD27+ 농축된 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)을 유전자 조작함으로써 생산된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 CD27 농축된 T 세포 집단은 유전자 조작되어 조작된 T 세포 조성물을 생산한다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 CD27 농축된 T 세포 집단은 유전자 조작된 후 하나 이상의 다른 개별 공여자의 유전자 조작된 T 세포 조성물과 조합되어 복수의 공여자로부터의 공여자 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생산한다. 일부 구현예에서, 복수의 공여자로부터의 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 유전자 조작되어 복수의 공여자로부터의 공여자 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생산한다.
일부 구현예에서, 유전자 조작은 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산을 CD27 농축된 세포 집단 내로 도입함으로써 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 조작은 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산을 풀링된 CD27 농축된 세포 집단 내로 도입함으로써 공여자 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 것을 포함한다.
폴리뉴클레오티드, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오티드의 세포 내로의 도입은 다수의 공지된 벡터 중 임의의 것을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 벡터는 아데노-연관, 렌티바이러스 및 감마레트로바이러스 시스템을 포함한 바이러스를 포함한다. 예시적인 방법은 바이러스, 예를 들어 아데노-연관, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 형질도입을 통한 것을 포함한, 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드의 전달을 위한 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 자극된 세포의 집단은 유전자 조작되어, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써, 형질전환된 세포의 집단(본원에서 세포의 형질전환된 집단으로도 지칭됨)을 생성한다.
특정 구현예에서, 세포는 세포가 자극 조건 하에, 예를 들어 본원에 제공된 방법 중 임의의 것에 의해, 예를 들어 섹션 III.E에서 자극, 활성화, 및/또는 인큐베이션된 후에 유전자 조작, 형질전환, 또는 형질도입된다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 유전자 조작 전에 집단의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극된다. 일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단은 유전자 조작 전에 집단의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극된다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 유전자 조작 전에 집단의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 자극된 집단은 이전에 CD57- T 세포에 대해 농축되었다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 유전자 조작 전에 집단의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극된다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단은 유전자 조작 전에 집단의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극된다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 유전자 조작 전에 집단의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 자극된 집단은 이전에 CD27+ T 세포에 대해 농축되었다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 자극된 집단은 이전에 CD3+, CD4+, 및/또는 CD8+ T 세포 중 하나 이상에 대해 농축되었다.
특정 구현예에서, 유전자 조작 방법은 재조합 단백질, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)의 하나 이상의 세포를 접촉시키거나 상기를 도입시킴으로써 수행된다. 특정 구현예에서, 집단은 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단이다. 특정 구현예에서, 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 세포에 대해 이종성이다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 세포에 대해 이종이다. 특정 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티이드는 그것이 전달되는 임의의 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터에 고유하지 않다. 특정 구현예에서, 이종 핵산 분자 또는 이종 폴리뉴클레오티드는 세포에 고유하지 않다. 특정 구현예에서, 이종 핵산 분자 또는 이종 폴리 뉴클레오티드는 세포에 의해 고유하게 발현되지 않는 단백질, 예를 들어 재조합 단백질을 암호화한다. 특정 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 도입 전에 세포에서 발견되지 않는 핵산 서열이거나 상기를 함유한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 자극된 세포는, 형질도입 보조제의 존재 하에 조작, 예를 들어 형질도입된다. 예시적인 형질도입 보조제는 다가양이온, 피브로넥틴 또는 피브로넥틴-유래 단편 또는 변이체 및 레트로넥틴(RetroNectin)을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 특정 구현예에서, 세포는 다가양이온, 피브로넥틴 또는 피브로넥틴-유래 단편 또는 변이체 및/또는 레트로넥틴의 존재 하에 조작된다. 특정 구현예에서, 세포는 폴리브렌, DEAE-덱스트란, 프로타민 설페이트, 폴리-L-리신 또는 양이온성 리포솜인 다가양이온의 존재 하에 조작된다. 특정 구현예에서, 세포는 프로타민 설페이트의 존재 하에 조작된다.
일부 구현예에서, 유전자 조작, 예를 들어 형질도입은 무혈청 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 정의된 또는 잘 정의된 세포 배양 배지이다. 특정 구현예에서, 무혈청 배지는 공정된, 예를 들어 여과되어 억제제 및/또는 성장인자가 제거된 제어 배양 배지이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 단백질을 함유한다. 특정 구현예에서, 무혈청 배지는 혈청 알부민, 가수분해물, 성장 인자, 호르몬, 담체 단백질 및/또는 부착 인자를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 사이토카인의 존재하에 조작된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 T 세포에 의해 발현되고/되거나 내인성인 수용체에 결합하고 /하거나 수용체에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 사이토카인의 4- 알파-헬릭스 다발 패밀리의 구성원이거나이를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인의 4- 알파-헬릭스 다발 패밀리의 구성원은 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-9(IL-9), 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-15(IL-15), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF) 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-15 이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-7이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 재조합 IL-2이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 자극 동안 존재했던 것과 동일하거나 유사한 배지의 존재 하에 유전자 조작, 형질전환, 또는 형질도입된다. 일부 구현예에서, 세포는 유전자 파괴 동안 존재했던 것과 동일하거나 유사한 배지의 존재 하에 유전자 조작, 형질전환, 또는 형질도입된다. 특정 구현예에서, 세포는 자극 동안 존재했던 것과 동일한 농도의 동일한 사이토카인을 갖는 배지에서 유전자 파괴, 조작, 형질전환, 또는 형질도입된다.
일부 구현예에서, 세포는 자극 동안 존재했던 것과 동일하거나 유사한 배지의 존재 하에 유전자 조작, 형질전환, 또는 형질도입된다. 일부 구현예에서, 세포는 자극 동안 존재했던 것과 동일한 사이토카인을 갖는 배지에서 유전자 조작, 형질전환, 또는 형질도입된다. 특정 구현예에서, 세포는 자극 동안 존재했던 것과 동일한 농도의 동일한 사이토카인을 갖는 배지에서 유전자 조작, 형질전환, 또는 형질도입된다.
a.
표적화된
통합(예를 들어
넉킹
인)
본원에 제공된 일부 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 CD57-농축된 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)의 세포 내로 도입된다. 본원에 제공된 일부 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 CD27+ 농축된 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)의 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 레보난트 수용체(rebominant receptor)를 암호화한다. 일부 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 표적화된 삽입(예를 들어 넉킹 인)에 의해 도입된다. 일부 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 유전자 좌 또는 그의 부분, 예를 들어 파괴된(예를 들어 녹아웃된) 유전자 좌 내로 삽입(예를 들어 넉킹 인)된다.
상동성-지시된 수선(Homology-directed repair; HDR)는 세포의 유전자 조작, 예를 들어 넉킹 인을 위해 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단이다. 일부 구현예에서, 세포는 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단이다. 일부 구현예에서, 유전자 조작(예를 들어 넉킹 인)은 전이 유전자, 예를 들어 게놈, 예를 들어 TRAC 및/또는 β2M 유전자 좌의 특정 위치에서 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 주형 폴리뉴클레오티드의 특정 부분의 표적화된 통합을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴(예를 들어 DNA 손상) 및 하나 이상의 상동성 암(예를 들어 상기 유전자 파괴 주변 서열에 상동성인 핵산 서열을 함유)을 함유하는 주형 폴리뉴클레오티드의 존재는 HDR을 유도 또는 지시할 수 있고, 상동성 서열이 DNA 수선을 위한 주형으로 작용한다. 유전자 파괴를 둘러싼 내인성 유전자 서열과 주형 폴리뉴클레오티드에 포함된 5' 및/또는 3' 상동성 암 사이의 상동성에 기반하여, 세포 DNA 수선 기계는 주형 폴리뉴클레오티드를 사용하여 DNA 손상을 수선하고 유전자 파괴의 부위에서 유전 정보를 재합성할 수 있고, 이로써 유전자 파괴 부위 또는 그 근처에서 주형 폴리뉴클레오티드에 전이 유전자 서열을 효과적으로 삽입하거나 통합할 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 TRAC 및/또는 β2M 유전자 좌에서의 유전자 파괴는 여기에 기재된 표적화된 유전자 파괴를 생성하기 위한 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다.
또한 여기에 기재된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 구현예에서, 제공된 폴리뉴클레오티드는 내인성 TRAC 및/또는 β2M 유전자 좌에서 재조합 수용체, 예를 들어 재조합 TCR의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 표적화하기 위해, 예를 들어 HDR을 포함한 여기에 기재된 방법에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 폴리뉴클레오티드는 내인성 TRAC 유전자 좌에서 재조합 수용체, 예를 들어 재조합 TCR의 부분을 암호화하는 전이 유전자 서열을 표적화하기 위해, 예를 들어 HDR을 수반하는 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 재조합 수용체 또는 이의 일부(예를 들어 재조합 수용체의 하나 이상의 사슬(들), 영역(들) 또는 도메인(들))를 암호화하는 전이 유전자(외인성 또는 이종 핵산 서열) 및 내인성 게놈 부위, 예를 들어 내인성 TRAC 및/또는 β2M 유전자 좌 또는 그 근처 서열에 상동성인 상동성 서열(예를 들어 상동성 암)을 함유하는 폴리뉴클레오티드이거나 이를 포함한다. 일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 선형 DNA 단편으로 도입되거나 벡터에 포함된다. 일부 측면에서, 유전자 파괴를 유도하는 단계 및 표적화된 통합을 위한 단계(예를 들어 주형 폴리뉴클레오티드의 도입에 의해)는 동시에 또는 순차적으로 수행된다.
(i)
상동성
-지시된 수선(
HDR
)
일부 구현예에서, 상동성-지시된 수선(HDR)은 게놈, 예를 들어 TRAC 및/또는 β2M 유전자 좌의 하나 이상의 표적 부위(들)에서 하나 이상의 핵산 서열, 예를 들어 전이 유전자 서열의 표적화된 통합 또는 삽입을 위해 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상동성-지시된 수선(HDR)은 게놈 내의 하나 이상의 표적 부위(들), 예를 들어 TRAC 유전자 좌에서 하나 이상의 핵산 서열, 예를 들어 전이 유전자 서열의 표적화된 통합 또는 삽입을 위해 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제-유도 HDR을 사용하여 표적 서열 변경, 특정 표적 위치에서 전이 유전자의 통합 및/또는 특정 표적 유전자에서 돌연변이의 편집 또는 수선을 할 수 있다.
표적 부위에서 핵산 서열의 변경은 외인성으로 제공된 주형 폴리뉴클레오티드(도너 폴리뉴클레오티드 또는 주형 서열로도 지칭)를 사용하여 HDR에 의해 발생할 수 있다. 예를 들어 주형 폴리뉴클레오티드는 주형 폴리뉴클레오티드 내에 함유된 전이 유전자의 삽입과 같은 표적 서열의 변경을 제공한다. 일부 구현예에서, 플라스미드 또는 벡터가 상동성 재조합을 위한 주형으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 선형 DNA 단편이 상동성 재조합을 위한 주형으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 서열과 주형 폴리뉴클레오티드 사이의 상동성-지시된 수선의 대안적인 방법(예를 들어 단일 가닥 어닐링(single strand annealing))에 의해 표적 서열의 변경을 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 표적 서열의 주형 폴리뉴클레오티드로 달성된 변경은 뉴클레아제, 예를 들어 CRISPR/Cas9와 같은 표적화된 뉴클레아제에 의한 절단에 의존한다. 뉴클레아제에 의한 절단은 이중 가닥 파손 또는 2 개의 단일 가닥 파손을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, "재조합(recombination)"은 2 개의 폴리뉴클레오티드 사이의 유전 정보 교환 과정을 지칭한다. 일부 구현예에서, "상동성 재조합(homologous recombination, HR)"은, 예를 들어 상동성-지시 수선 기제를 통해 세포에서 이중 가닥 파손 수선 동안 발생하는 상기 교환의 특화된 형태를 지칭한다. 상기 과정은 뉴클레오티드 서열 상동성을 필요로 하고, 표적 DNA(즉, 예를 들어 내인성 유전자의 표적 부위에서 이중 가닥 파손을 경험한 DNA)의 주형 수선을 위해 주형 폴리뉴클레오티드를 사용하며, 주형 폴리뉴클레오티드에서 표적으로 유전 정보를 전달하기 때문에 "비-교차 유전자 전환(non-crossover gene conversion)" 또는 "짧은 트랙 유전자 전환(short tract gene conversion)"으로 다양하게 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 상기 전달은 파손된 표적과 주형 폴리뉴클레오티드 사이에 형성되는 이종 이중체 DNA의 미스매치 교정 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드가 사용되어 표적 및/또는 관련 프로세스의 일부가 될 유전 정보를 재합성하는 "합성 의존적 가닥 어닐링(synthesis-dependent strand annealing)"을 포함할 수 있다. 상기 특화된 HR은 종종 표적 분자 서열의 변경을 초래하여 주형 폴리뉴클레오티드 서열의 일부 또는 전부가 표적 폴리뉴클레오티드에 통합된다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 전이 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오티드는 상동성 독립적 기제를 통해 세포의 게놈으로 통합된다. 본 방법은 세포의 게놈에서 이중 가닥 파손(double-stranded break, DSB)을 생성하고 뉴클레아제를 사용하여 주형 폴리뉴클레오티드 분자를 절단하여, 주형 폴리뉴클레오티드가 DSB 부위에서 통합된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 비-상동성 의존적 방법(예를 들어 NHEJ)을 통해 통합된다. 생체 내 절단시 주형 폴리뉴클레오티드는 표적화된 방식으로 DSB 위치에서 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다. 주형 폴리뉴클레오티드는 DSB를 생성하는데 사용되는 하나 이상의 뉴클레아제에 대해 하나 이상의 동일한 표적 부위를 포함할 수 있다. 따라서, 주형 폴리뉴클레오티드는 통합이 요청되는 내인성 유전자를 절단하는데 사용되는 하나 이상의 동일한 뉴클레아제에 의해 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 DSB를 유도하는데 사용되는 뉴클레아제와 상이한 뉴클레아제 표적 부위를 포함한다. 여기에 기재된 바와 같이, 표적 부위 또는 표적 위치의 유전자 파괴는 ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9 시스템 또는 TtAgo 뉴클레아제와 같은 임의의 기제에 의해 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, DNA 수선 기제는 (1) 단일 이중 가닥 파손, (2) 2 개의 단일 가닥 파손, (3) 표적 부위 각각의 쪽에 발생하는 파손이 있는 2 개의 이중 가닥 파손, (4) 표적 부위 각각의 쪽에 발생하는 이중 가닥 파손 및 2 개의 단일 가닥 파손이 있는 1 개의 이중 가닥 파손 및 2 개의 단일 가닥 파손, (5) 표적 부위 각각의 쪽에 발생하는 한 쌍의 단일 가닥 파손이 있는 4 개의 단일 가닥 파손 또는 (6) 1 개의 단일 가닥 파손 후에 뉴클레아제에 의해 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 주형 폴리뉴클레오티드가 사용되며 표적 부위는 대안적인 HDR에 의해 변경될 수 있다.
표적 부위의 주형 폴리뉴클레오티드로 달성된 변경은 뉴클레아제 분자에 의한 절단에 따라 달라진다. 뉴클레아제에 의한 절단은 닉, 이중 가닥 파손 또는 2 개의 단일 가닥 파손, 예를 들어 표적 부위에서 각각의 DNA 가닥 상에 하나를 포함할 수 있다. 표적 부위 상에 손상이 도입된 후, 파손 말단에서 절제가 발생하여 단일 가닥의 돌출된 DNA 영역을 초래한다.
정규 HDR에서, 표적 부위에 직접 통합되거나 전이 유전자를 삽입하거나 표적 부위의 서열을 수정하기 위한 주형으로 사용될 표적 부위에 대해 상동성 서열을 포함하는 이중 가닥 주형 폴리뉴클레오티드가 도입된다. 파손에서 절제 후, 상이한 경로, 예를 들어 이중 홀리데이 접점 모델(또는 이중 가닥 파손 수선, DSBR, 경로) 또는 합성 의존적 가닥 어닐링(synthesis-dependent strand annealing, SDSA) 경로에 의해 수선이 진행될 수 있다.
이중 홀리데이 접점 모델에서, 주형 폴리뉴클레오티드에서 상동성 서열에 대해 표적 부위의 2개의 단일 가닥 오버행에 의한 가닥 침입이 발생하고, 2개의 홀리데이 접합을 갖는 중간체 형성을 초래한다. 새로운 DNA가 침입 가닥의 말단에서 합성되면서 접점이 이동하여 절제에서 발생하는 간격을 채운다. 새로 합성된 DNA의 말단은 절제된 말단에 결찰되고, 접점이 풀어져, 대상 부위에서의 삽입, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오티드에 전이 유전자의 삽입을 초래한다. 주형 폴리뉴클레오티드와의 교차는 접점이 풀어질 때 발생할 수 있다.
SDSA 경로에서, 하나의 단일 가닥 오버행만이 주형 폴리뉴클레오티드를 침입하고 새로운 DNA가 침입 가닥의 말단에서 합성되어 절제에서 발생하는 간격을 채운다. 이어서 새로 합성된 DNA가 남은 단일 가닥 오버행에 어닐링하고, 새로운 DNA가 합성되어 간격을 채우고, 상기 가닥들이 결찰되어 변형된 DNA 이중 영역을 생성한다.
대안적인 HDR에서, 단일 가닥 주형 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오티드가 도입된다. 원하는 표적 부위를 변경하기 위한 표적 부위에서의 닉, 단일 가닥 파손 또는 이중 가닥 파손이 뉴클레아제 분자에 의해 매개되고, 손상에서의 절제가 발행하여 단일 가닥 오버행을 드러낸다. 여기에 기재된 바와 같이, DNA의 표적 부위를 정정 또는 변경하기 위한 주형 폴리뉴클레오티드 서열의 통합은 전형적으로 SDSA 경로에 의해 발생한다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 어닐링(ingle strand annealing, SSA), 단일 가닥 파손 수선(single-stranded break repair, SSBR), 미스매치 수선(mismatch repair, MMR), 염기 절제 수선(base excision repair, BER), 뉴클레오티드 절제 수선(nucleotide excision repair, NER), 가닥 내 교차 연결(intrastrand cross-link, ICL), 손상 통과 합성(translesion synthesis, TLS), 무오류 사후 복제 수선(postreplication repair, PRR)과 같은 기타 DNA 수선 경로가 세포에 의해 이용되어 뉴클레아제에 의해 형성된 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손을 수선할 수 있다.
(ii) 유전자 파괴(예를 들어 DNA 가닥 파손)의 배치
표적화 통합은 게놈에 있는 특정 유전자 또는 유전자 좌로 통합된 전이 유전자를 초래한다. 전이 유전자는 게놈에서 표적 부위 또는 하나 이상의 표적 부위(들) 중 하나 또는 그 근처 어디에서나 통합될 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 하나 이상의 표적 부위(들) 중 하나 또는 그 근처에서, 예를 들어 절단 부위의 상류 또는 하류에서 300, 250, 200, 150, 100, 50, 10, 5, 4, 3, 2, 1 이하의 염기쌍 이내, 예를 들어 표적 부위의 어느 한쪽의 100, 50, 10, 5, 4, 3, 2, 1 염기쌍 이내, 예를 들어 표적 부위의 어느 한쪽의 50, 10, 5, 4, 3, 2, 1 염기쌍 이내에서 통합된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자를 포함하는 통합 서열은 임의의 벡터 서열(예를 들어 바이러스 벡터 서열)을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 통합 서열은 벡터 서열(예를 들어 바이러스 벡터 서열)의 일부를 포함한다.
가닥 중 하나에서 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손은, 원하는 영역에서 변경이 생성(예를 들어 전이 유전자의 삽입 또는 돌연변이의 정정 발생)되도록 표적화된 통합을 위한 부위에 충분히 가까이 있어야 한다. 일부 구현예에서, 거리는 10, 25, 50, 100, 200, 300, 350, 400 또는 500개의 뉴클레오티드 이내이다. 일부 구현예에서, 파손이 말단 절제 중에 엑소뉴클레아제 매개 제거되는 영역 내에 있도록 파손이 표적화된 통합을 위한 부위에 충분히 가까이 있어야 할 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은, 절단 이벤트, 예를 들어 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손이 변경, 예를 들어 표적화된 삽입을 위한 부위가 될 바람직한 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 350, 400 또는 500 개의 뉴클레오티드 내에 위치하도록 구성된다. 파손, 예를 들어 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손은, 변경, 예를 들어 표적화된 삽입을 위한 부위가 될 바람직한 영역의 상류 또는 하류에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 변경될 바람직한 영역 내, 예를 들어 2개 이상의 돌연변이 뉴클레오티드에 의해 정의된 영역 내에 파손이 위치한다. 일부 구현예에서, 변경될 바람직한 영역에 바로 인접한, 예를 들어 표적화된 삽입을 위한 부위의 바로 상류 또는 하류에 파손이 위치한다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 파손은 제2 gRNA 분자에 의해 배치된 추가 단일 가닥 파손에 동반된다. 예를 들어 표적화 도메인은, 절단 이벤트, 예를 들어 2개의 단일 가닥 파손이 표적화된 삽입을 위한 부위의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 350, 400 또는 500 개의 뉴클레오티드 내에 위치하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 gRNA 분자는 Cas9 닉카제를 안내할 때, 단일 가닥 파손이 원하는 영역의 변경을 초래하도록 서로 충분히 가깝고, 제2 gRNA에 의해 위치되고, 추가 단일 가닥 파손이 동반되도록 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 gRNA 분자는, 예를 들어 Cas9이 닉카제인 경우, 상기 제2 gRNA에 의해 위치된 단일 가닥 파손이 상기 제1 gRNA 분자에 의해 위치된 파손의 10, 20, 30, 40 또는 50 개의 뉴클레오티드 내에 존재하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 2개의 gRNA 분자는, 예를 들어 본질적으로 이중 가닥 파손을 모방한, 상이한 가닥 상에 동일한 위치 또는 서로 몇 개의 뉴클레오티드 이내에 절단이 위치하도록 구성된다.
gRNA(단분자(또는 키메라) 또는 모듈식 gRNA) 및 Cas9 뉴클레아제가 HDR 매개 전이 유전자의 삽입 또는 정정을 유도하기 위한 목적으로 이중 가닥 파손을 유도하는 일부 구현예에서, 절단 부위는 표적화된 통합을 위한 부위에서 0-200 bp(예를 들어 0-175, 0 내지 150, 0 내지 125, 0 내지 100, 0 내지 75, 0 내지 50, 0 내지 25, 25 내지 200, 25 내지 175, 25 내지 150, 25 내지 125, 25 내지 100, 25 내지 75, 25 내지 50, 50 내지 200, 50 내지 175, 50 내지 150, 50 내지 125, 50 내지 100, 50 내지 75, 75 내지 200, 75 내지 175, 75 내지 150, 75 내지 125, 75 내지 100 bp) 떨어져 있다. 일부 구현예에서, 절단 부위는 표적화된 통합을 위한 부위에서 0-100 bp(예를 들어 0 내지 75, 0 내지 50, 0 내지 25, 25 내지 100, 25 내지 75, 25 내지 50, 50 내지 100, 50 내지 75 또는 75 내지 100 bp) 떨어져 있다.
일부 구현예에서, 오버행을 갖는 파손을 생성하기 위해 닉카제를 사용함으로써 HDR을 촉진할 수 있다. 일부 구현예에서, 오버행의 단일 가닥 특성은 예를 들어 NHEJ와는 반대로 세포가 HDR에 의한 파손을 수선할 가능성을 향상시킬 수 있다.
구체적으로, 일부 구현예에서, HDR은 제1 표적 부위에 대해 제1 닉카제를 표적화하는 제1 gRNA 및 제1 표적 부위로부터 반대 DNA 가닥 상에 있고 제1 닉을 상쇄하는 제2 표적 부위에 대해 제2 닉카제를 표적화하는 제2 gRNA를 선택함으로서 촉진된다. 일부 구현예에서, gRNA 분자의 표적화 도메인은 절단 이벤트가 미리 선택된 뉴클레오티드, 예를 들어 코딩 영역의 뉴클레오티드로부터 충분히 멀리 떨어져 위치하도록 구성되어 뉴클레오티드가 변경되지 않는다. 일부 구현예에서, gRNA 분자의 표적화 도메인은 인트론의 절단 이벤트가 인트론/엑손 경계 또는 자연적으로 발생하는 스플라이스 신호로부터 충분히 멀리 떨어져 위치하도록 구성되어 엑손 서열의 변경 또는 원하지 않는 스플라이스 이벤트를 방지한다. 일부 구현예에서, gRNA 분자의 표적화 도메인은 초기 엑손에 위치하도록 구성되어, 내인성 유전자의 결실 또는 녹아웃을 허용하고/거나 하나 이상의 표적 부위(들) 중 하나 또는 그 근처에서 전이 유전자의 인-프레임 통합을 허용한다.
일부 구현예에서, 이중 가닥 파손은 제2 gRNA 분자에 의해 위치된, 추가 이중 가닥 파손을 동반할 수 있다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 파손은 제2 gRNA 분자 및 제3 gRNA 분자에 의해 위치된, 2개의 추가 단일 가닥 파손을 동반할 수 있다.
일부 구현예에서, 2개의 gRNA, 예를 들어 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈식 gRNA는, 표적화된 통합을 위한 부위의 양쪽 모두에 이중 가닥 파손이 위치하도록 구성된다.
(iii) 주형 폴리뉴클레오티드
내인성 DNA에서 하나 이상의 표적 부위(들) 또는 그 근처 서열과 상동성을 갖는 주형 폴리뉴클레오티드를 사용하여 표적 DNA의 구조를 변경, 예를 들어 전이 유전자의 표적화된 삽입을 할 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적화된 삽입을 위해 전이 유전자, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열 측면에 상동성 서열(예를 들어 상동성 암)을 함유한다. 일부 구현예에서, 상동성 서열은 TRAC 및/또는 β2M 유전자 좌 중 하나 이상에서 전이 유전자를 표적화한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 상동성 암 사이에 추가 서열(코딩 또는 비코딩 서열), 예를 들어 조절 서열, 예를 들어 프로모터 및/또는 인핸서, 스플라이스 공여자 및/또는 수용체 부위, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 리보솜 건너뛰기 요소(예를 들어 2A 펩티드), 마커 및/또는 SA 부위를 암호화하는 서열 및/또는 하나 이상의 추가 전이 유전자를 포함한다.
주형 폴리뉴클레오티드에서 관심 서열은 프로모터가 있거나 없는 기능성 폴리펩티드(예를 들어 cDNA)를 암호화하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드에 함유된 전이 유전자는 세포 표면 수용체(예를 들어 재조합 수용체) 또는 이의 사슬, 항체, 항원, 효소, 성장 인자, 핵 수용체, 호르몬, 림포카인, 사이토카인, 리포터, 여기 중 어느 하나의 기능성 단편 또는 기능성 변이체 및 여기의 조합물을 암호화하는 서열을 포함한다. 전이 유전자는 암 치료에 유용한 하나 이상의 단백질, 예를 들어 하나 이상의 키메라 항원 수용체(CAR) 및/또는 재조합 T 세포 수용체(TCR)를 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 여기 섹션 IV에 기재된 임의의 재조합 수용체 또는 이의 임의의 사슬, 영역 및/또는 도메인을 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 재조합 T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 임의의 사슬, 영역 및/또는 도메인을 암호화한다.
(iv) 주형 폴리뉴클레오티드 전달
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 키메라 수용체를 암호화하는 주형 폴리뉴클레오티드와 같은 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 형태, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로서 세포 내로 도입된다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유한다.
일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들), 예를 들어 뉴클레아제 및/또는 gRNA외에 조작을 위해 주형 폴리뉴클레오티드가 세포로 도입된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드(들)는 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들)이 세포로 도입되기 전, 동시에 또는 후에 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드(들)는 제제와 동시에 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 제제 전에, 예를 들어 제제 전 1 내지 60 분(또는 그 사이의 임의의 시간), 제제 전 1 내지 24 시간(또는 그 사이의 임의의 시간) 또는 제제 전 24 시간 이상을 포함 하나 이에 제한되지 않는 제제 전 수 초 내지 수 시간 내지 수 일에 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 제제 전달 후 즉시, 예를 들어 제제 전달 후 (약) 30 초 내지 4 시간, 예를 들어 약 30 초, 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분, 6 분, 8 분, 9 분, 10 분, 15 분, 20 분, 30 분, 40 분, 50 분, 60 분, 90 분, 2 시간, 3 시간 또는 4 시간 및/또는 바람직하게는 제제 전달 후 4 시간 이내를 포함한, 제제 전달 후 수 초 내지 수 시간 내지 수 일에 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 제제 전달 후 4 시간 이상 후에 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 제제 후 1 초 내지 60 분 이내(또는 그 사이의 임의의 시간), 제제 후 1 내지 4 시간 이내(또는 그 사이의 임의의 시간) 또는 제제 후 4 시간 이상을 포함하나 이에 제한되지 않고 제제 후에 전달된다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들), 예를 들어 뉴클레아제 및/또는 gRNA와 동일한 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들), 예를 들어 뉴클레아제 및/또는 gRNA와 상이한 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 제제(들)와 동시에 전달된다. 기타 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 제제(들)의 전달 전 또는 후, 상이한 시간에 전달된다. 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들), 예를 들어 뉴클레아제 및/또는 gRNA에서 핵산의 전달을 위해 본원에 기재된 임의의 전달 방법은 주형 폴리뉴클레오티드 전달을 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 제제(들) 및 주형 폴리뉴클레오티드는 동일한 형식 또는 방법으로 전달된다. 예를 들어 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제(들) 및 주형 폴리뉴클레오티드 둘 다는 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터에 포함된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 Cas9 및 gRNA와 동일한 벡터 백본, 예를 들어 AAV 게놈, 플라스미드 DNA 상에 암호화된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 제제(들) 및 주형 폴리뉴클레오티드는 상이한 형식, 예를 들어 Cas9-gRNA 제제에 대해 리보 핵산-단백질 복합체(RNP) 및 주형 폴리뉴클레오티드에 대해 선형 DNA 형식이나 이들은 동일한 방법을 사용하여 전달된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 제제(들) 및 주형 폴리뉴클레오티드는 상이한 형식, 예를 들어 Cas9-gRNA 제제에 대해 리보 핵산-단백질 복합체(RNP)이고 주형 폴리뉴클레오티드는 AAV 벡터에 함유되고, RNP는 물리적 전달 방법(예를 들어 전기 천공)을 이용하여 전달되고, 주형 폴리뉴클레오티드는 AAV 바이러스 제제의 형질 도입을 통해 전달된다. 일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 제제(들)의 전달 직후, 예를 들어 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 또는 60 분 이내에 전달된다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 선형 또는 원형 DNA 또는 선형 RNA와 같은 선형 또는 원형 핵산 분자이고, 핵산 분자를 세포로 전달하기 위해 본원에 기재된 임의의 방법을 사용하여 전달될 수 있다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 비바이러스 벡터로 또는 비바이러스 벡터 내 뉴클레오티드 형태로 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 비바이러스 벡터는 예를 들어 미세 주입, 전기 천공, 일시적인 세포 압축 또는 압착(예를 들어 문헌[Lee, 등, (2012) Nano Lett 12: 6322-27]에 기재된 바와 같음), 지질 매개 형질 감염, 펩티드 매개 전달, 예를 들어 세포-침투 펩티드 또는 이의 조합물로 제한되지 않는, 유전자 전달을 위한 임의의 적합한 및/또는 공지된 비바이러스 방법에 의한 형질 도입 및/또는 형질 감염에 적합한 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 비바이러스 폴리뉴클레오티드는 본원에서 열거된 비바이러스 방법과 같이 여기에 기재된 비바이러스 방법에 의해 세포 내로 전달된다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA의 관심 영역과 상동성이 아닌 서열을 함유하는 벡터 분자에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스는 DNA 바이러스(예를 들어 dsDNA 또는 ssDNA 바이러스)이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 RNA 바이러스(예를 들어 dsRNA 또는 ssRNA 바이러스)이다. 예시적인 바이러스 벡터/바이러스에는 예를 들어 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 백시니아 바이러스, 폭스바이러스 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 또는 여기 다른 곳에 기재된 임의의 바이러스가 포함된다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 유래된 벡터와 같은 재조합 감염성 바이러스 입자를 사용하여 세포내로 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 감마-레트로바이러스 벡터(예를 들어 Koste 등, (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens 등, (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino 등, (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park 등, Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557 참조) 또는 HIV-1 유래 렌티바이러스 벡터를 사용하여 T 세포 내로 전달된다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 긴 말단 반복 서열(long terminal repeat sequence, LTR), 예를 들어 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 골수 증식육종 바이러스(myeloproliferative sarcoma virus, MPSV), 뮤린 배아 줄기 세포 바이러스(murine embryonic stem cell virus, MESV), 뮤린 줄기 세포 바이러스(murine stem cell virus, MSCV) 또는 비장 초점 형성 바이러스(spleen focus forming virus, SFFV)로부터 유래된 레트로바이러스 벡터를 갖는다. 대부분의 레트로바이러스 벡터는 뮤린 레트로바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 임의의 조류 또는 포유류 세포 출처로부터 유래된 것을 포함한다. 레트로바이러스는 전형적으로 인간을 포함하여 몇몇 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미하는, 암포트로픽(amphotropic)이다. 일 구현예에서, 발현될 유전자는 레트로바이러스의 gag, pol 및/또는 env 서열을 대체한다. 다수의 예시적인 레트로바이러스 시스템이 문헌[예를 들어 미국특허 제5,219,740호; 제6,207,453호; 제5,219,740호; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa 등, (1991) Virology 180:849-852; Burns 등, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; 및 Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드 및 뉴클레아제는 동일한 벡터, 예를 들어 AAV 벡터(예를 들어 AAV6) 상에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 AAV 벡터를 사용하여 전달되고 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들), 예를 들어 뉴클레아제 및/또는 gRNA는 상이한 형태, 예를 들어 뉴클레아제 및/또는 gRNA를 암호화하는 mRNA로 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드 및 뉴클레아제는 예를 들어 바이러스 벡터이나 별개의 벡터로 동일한 유형의 방법을 사용하여 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제, 예를 들어 뉴클레아제 및/또는 gRNA와 상이한 전달 시스템으로 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 생체 내에서, 예를 들어 gRNA 인식 서열이 측면에 있는 벡터 백본으로부터 절제된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 Cas9 및 gRNA와 별도의 폴리뉴클레오티드 분자 상에 있다. 일부 구현예에서, Cas9 및 gRNA는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체의 형태로 도입되고, 주형 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 분자, 예를 들어 벡터 또는 선형 핵산 분자, 예를 들어 선형 DNA로 도입된다. 전달을 위한 핵산 및 벡터 유형에는 본원에 기재된 것 중 어느 하나가 포함된다.
b. 형질도입
일부 구현예에서, 세포를 유전자 조작하는 것은 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 이종 폴리뉴클레오티드를 형질도입에 의해 세포 내로 도입하는 것이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 개별 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 세포는 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 세포는 바이러스 벡터로 형질도입된다. 일부 구현예에서, 바이러스는 아데노-연관 바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 감마레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다. 렌티바이러스 형질도입 방법이 공지되어 있다. 예시적인 방법이, 예를 들어 문헌 「Wang 등, (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper 등, (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen 등, (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; 및 Cavalieri 등, (2003) Blood. 102(2): 497-505」에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 형질도입은 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)의 하나 이상의 세포를 재조합 단백질, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 분자와 접촉시킴으로써 수행된다. 일부 구현예에서, 형질도입은 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)의 하나 이상의 세포를 재조합 단백질, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 분자와 접촉시킴으로써 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 접촉은 원심 분리, 예를 들어 스피노큘레이션(pinoculation)(예를 들어 원심 접종(centrifugal inoculation))으로 수행될 수 있다. 이러한 방법은 국제공개공보 제WO2016/073602호에 기재된 바와 같은 방법을 포함한다. 예시적인 원심 챔버는, A-200/F 및 A-200 원심 챔버 및 그러한 시스템과 함께 사용하기위한 다양한 키트를 포함하여 Sepax® 및 Sepax®2 시스템과 함께 사용하기위한 것을 포함하여 Biosafe SA에 의해 생산되고 판매되는 것들을 포함한다. 예시적인 챔버, 시스템 및 처리기구 및 캐비닛은 예를 들어 미국특허 제6,123,655호, 미국특허 번호 6,733,433 및 공개된 미국특허출원공개공보 US 2008/0171951 및 국제공개보 제WO 00/38762호에 기재되어있으며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이러한 시스템과 함께 사용하기위한 예시적인 키트는 BioSafe SA에 의해 판매되는 일회용 키트인 제품명 CS-430.1, CS-490.1, CS-600.1 또는 CS-900.2를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 바이러스 벡터를 자극된 세포 집단 중 (약) 300×106개 또는 300×106개 미만의 세포, 예를 들어 생존 가능한 T 세포로 형질도입하는 것과 관련하여 사용된다. 특정 구현예에서, 자극된 세포 집단 중 (약) 100×106개의 세포, 예를 들어 생존 가능한 T 세포가 형질도입된다.
일부 구현예에서, 상기 형질도입은 무혈청 배지 중에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 형질도입은 IL-2, IL-7, 및 IL-15의 존재하에서 수행된다. 특정 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 자극된 세포 집단의 세포는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포인, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 형질도입은 24시간 내지 48시간, 36시간 내지 12시간, 18시간 내지 30시간동안, 또는 (약) 24시간동안 수행된다. 특정 구현예에서, 상기 형질도입 단계는 인큐베이션, 예를 들어 자극 조건하의 인큐베이션의 시작 또는 개시후 2일 이내, 36시간 이내, 또는 30시간 이내에 개시된다.
일부 구현예에서, 시스템은 시스템에서 수행되는 형질도입 단계 및 하나 이상의 다양한 다른 가공 단계, 예를 들어 본원 또는 문헌[국제 공개 번호 WO2016/073602]에 기술된 바와 같은 원심분리 챔버 시스템으로 수행되거나 이와 관련하여 수행될 수 있는 하나 이상의 가공 단계의 측면을 작동, 자동화, 제어 및/또는 모니터링하기 위한 기기를 포함하여 다른 기기와 공동으로 포함되고/되거나 이와 공동으로 배치된다. 일부 구현예에서 상기 기기는 캐비닛 내에 포함되어 있다. 일부 구현예에서, 상기 기기에는 제어 회로, 원심분리기, 커버, 모터, 펌프, 센서, 디스플레이 및 사용자 인터페이스를 수용한 하우징을 포함한 캐비닛이 포함된다. 예시적인 디바이스가 문헌[미국특허 6,123,655, 미국특허 6,733,433 및 US 2008/0171951]에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 시스템은 일련의 용기, 예를 들어 백, 튜빙, 스톱콕, 클램프, 커넥터 및 원심분리 챔버를 포함한다. 일부 구현예에서, 백과 같은 용기는 동일한 백 또는 별도의 백과 같은 동일한 용기 또는 별도의 용기에 형질도입될 세포 및 바이러스 벡터 입자를 함유하는 백과 같은 하나 이상의 용기를 포함한다. 일부 구현예에서, 시스템은 챔버 내로 들어오는 희석제 및/또는 세척 용액 및/또는 방법 중에 성분 및/또는 집단을 희석, 재현탁 및/또는 세척하기 위한 기타 성분 같은 배지를 함유하는, 백 같은 하나 이상의 용기를 더 포함한다. 용기는 시스템의 하나 이상의 위치에, 예를 들어 입력 라인, 희석 라인, 세척 라인, 폐기물 라인 및/또는 산출 라인에 대응하는 위치에 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 챔버는 예를 들어 회전축 주위로 챔버를 회전시킬 수 있는 원심분리기와 결합되어 있다. 회전은 세포의 형질도입과 관련하여 및/또는 다른 가공 단계 중 하나 이상에서 인큐베이션 이전, 도중 및/또는 이후에 이루어질 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 하나 이상의 다양한 가공 단계는 예를 들어 특정 힘으로 회전되면서 수행된다. 챔버가 원심분리 중에 수직으로 위치하고 측벽과 축은 수직 또는 일반적으로 수직이며, 말단 벽은 수평 또는 일반적으로 수평이 되도록, 전형적으로 챔버는 수직 또는 일반적으로 수직 회전할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포를 함유하는 집단과 바이러스 벡터 입자를 함유하는 집단, 및 선택적으로 공기가 집단들을 공동에 제공하기 전에 조합되거나 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포를 함유하는 집단과 바이러스 벡터 입자를 함유하는 집단, 및 선택적으로 공기가 개별적으로 제공되고 공동(cavity)에서 조합 및 혼합된다. 일부 구현예에서, 세포를 함유하는 집단과 바이러스 벡터 입자를 함유하는 집단, 및 선택적으로 공기가 임의의 순서로 내부 공동에 제공될 수 있다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 세포 및 바이러스 벡터 입자를 함유하는 집단은, 이들이 원심분리 챔버 내부 또는 외부에서 조합 또는 혼합되든 및/또는 세포 및 바이러스 벡터 입자가 원심분리 챔버에 함께 또는 개별적으로, 예를 들어 동시에 또는 순차적으로 제공되든, 함께 조합된 또는 혼합된 투입 조성물이다.
일부 구현예에서, 형질도입 방법에서 공기와 같은 일정 부피의 기체의 흡입이 세포 및 바이러스 벡터 입자의 인큐베이션 전에 예를 들어 회전 전에 일어난다. 일부 구현예에서, 형질도입 방법에서 공기와 같은 일정 부피의 기체의 흡입이 세포 및 바이러스 벡터 입자의 인큐베이션 동안에 예를 들어 회전 동안에 일어난다.
일부 구현예에서, 형질도입 집단을 구성하는 세포 또는 바이러스 벡터 입자의 액체 부피, 및 선택적으로 공기 부피는 미리 정해진 부피일 수 있다. 상기 부피는 시스템과 관련된 회로에 프로그램되고/되거나 그 회로에 의해 제어되는 부피일 수 있다.
일부 구현예에서, 형질도입 집단과, 선택적으로 공기 등의 기체의 흡입은 원하는 또는 미리 정해진 부피가 챔버의 내부 공동으로 들어갈 때까지 수동으로, 반자동으로 및/또는 자동으로 제어된다. 일부 구현예에서, 시스템과 관련된 센서는 원심분리 챔버에 흘러 들어가고 그로부터 나오는 액체 및/또는 기체를 예를 들어 그 색상, 유속 및/또는 밀도를 통해 감지할 수 있고, 원하는 또는 미리 정해진 부피가 달성될 때까지 필요한 대로 흡입을 멈추거나 계속하도록 관련된 회로와 통신할 수 있다. 일부 측면에서, 시스템에서 기체(예를 들어 공기)가 아닌 액체만 감지하도록 프로그램되거나 액체만 감지할 수 있는 센서는 시스템 내로 흡입을 멈추지 않고 기체(예를 들어 공기)의 통과를 허용할 수 있도록 만들어질 수 있다. 일부 상기 구현예에서, 공기와 같은 기체 흡입이 필요한 동안 불투명 튜빙 조각을 센서 근처의 라인에 배치할 수 있다. 일부 구현예에서, 공기와 같은 기체의 흡입은 수동으로 제어될 수 있다.
제공된 방법의 측면에서, 원심분리 챔버의 내부 공동은 고속 회전을 거친다. 일부 구현예에서, 회전은 액체 투입 조성물과, 선택적으로 공기의 흡입 전에, 그와 동시에, 그 이후에 또는 간헐적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 회전은 액체 투입 조성물과, 선택적으로 공기의 흡입 이후에 수행된다. 일부 구현예에서, 회전은 내부 공동의 측벽의 내부 표면에 및/또는 세포의 표면층에 (약) 또는 적어도 (약) 200g, 300g, 400g, 500g, 600g, 700g, 800g, 1000g, 1100g, 1500g, 1600g, 1800g, 2000g, 2200g, 2500g, 3000g, 3200g, 3500g 또는 4000g의 상대 원심력으로 원심분리 챔버의 원심분리에 의해 이루어진다. 일부 구현예에서, 회전은 약 1100g 이상, 예를 들어 약 1200g 이상, 약 1400g 이상, 약 1600g 이상, 약 1800g이상, 약 2000g이상, 약 2400g이상, 약 2800g이상, 약 3000g이상 또는 약 3200g이상의 힘으로 원심분리에 의해 이루어진다. 구체적인 구현예에서, 원심분리에 의한 회전은 600g 내지 800g 사이의 힘으로 구성된다. 구체적인 구현예에서, 원심분리에 의한 회전은 (약) 693g의 힘으로 구성된다. 일부 구현예에서, 회전은 (약) 1600g의 힘으로 원심분리에 의해 이루어진다.
일부 구현예에서, 챔버의 공동 내의 기체(예를 들어 공기)가 챔버로부터 배출된다. 일부 구현예에서, 공기 등의 기체는 원심분리 챔버와 폐쇄 시스템의 일부로서 작동 가능하게 연결된 용기로 배출된다. 일부 구현예에서, 용기는 비어있거나 비어 있는 용기이다. 일부 구현예에서, 챔버의 공동 내의 공기 등의 기체는 멸균 배관 라인을 통해 챔버의 내부 공동에 작동 가능하게 연결된 필터를 통해 배출된다. 일부 구현예에서, 공기는 수동, 반자동 또는 자동 공정을 이용해 배출된다. 일부 구현예에서, 공기는, 형질도입이 개시되었거나 세포가 바이러스 벡터로 형질도입된 세포 등의 인큐베이션된 세포 및 바이러스 벡터 입자를 함유한 산출 집단을 챔버의 공동으로부터 발현하기 전에, 그와 동시에, 간헐적으로, 또는 그 이후에 챔버로부터 방출된다.
일부 구현예에서, 형질도입 및/또는 다른 인큐베이션은 연속 또는 반-연속 공정으로서 또는 그 일부로서 수행된다. 일부 구현예에서, 연속 공정은 세포 및 바이러스 벡터 입자, 예를 들어 형질도입 조성물(단일 기존 조성물로서 또는 동일한 용기 예를 들어 공동으로 연속적으로 끌어 넣음으로서, 그렇게 하여 그 부분을 혼합하여)의 연속 흡입 및/또는 인큐베이션의 적어도 일부 동안, 예를 들어 원심분리하는 동안, 용기로부터 액체의 연속 발현 또는 방출, 및 선택적으로 기체(예를 들어 공기)의 방출을 포함한다. 일부 구현예에서, 연속 흡입 및 연속 발현은 적어도 부분적으로 동시에 수행된다. 일부 구현예에서, 연속 흡입은 인큐베이션의 일부 중, 예를 들어 원심분리의 일부 중 일어나고, 연속 발현은 인큐베이션의 별도 일부 중 일어난다. 상기 둘은 교대로 될 수 있다. 따라서, 인큐베이션을 수행하는 중에, 연속 흡입 및 발현은 가공(예를 들어 형질도입)될 샘플의 전체 부피를 더 크게 할 수 있다.
일부 구현예에서, 인큐베이션은 연속 공정의 일부이고, 상기 방법은 인큐베이션 중 적어도 일부 동안 상기 형질도입 조성물을 공동 내로 챔버의 회전 동안 연속 흡입되게 하는 것, 및 인큐베이션의 일부 동안, 챔버의 회전 동안 적어도 하나의 개구를 통해 공동으로부터 액체의 연속 발현이 되게 하는 것, 그리고 선택적으로 기체(예를 들어 공기)를 방출하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 반-연속 인큐베이션은 조성물을 공동 내로 흡입, 인큐베이션, 공동으로부터 예를 들어 출력 용기로 액체의 발현, 및 선택적으로 공동으로부터 기체(예를 들어 공기)의 방출 사이를 번갈아 하고, 그런 후 가공을 위한 추가적인 세포 및 다른 시약, 예를 들어 바이러스 벡터 입자를 함유한 후속(예를 들어 제2, 제3 등) 조성물의 흡입 및 공정을 반복하여 수행된다. 예를 들어 일부 구현예에서, 인큐베이션은 반-연속 공정의 일부이고, 상기 방법은 인큐베이션 전에 형질도입 조성물을 상기 적어도 하나의 개구를 통해 공동 내로 흡입을 실행하고, 인큐베이션 후에, 공동으로부터 유체의 발현을 실행하는 단계; 세포 및 바이러스 벡터 입자를 포함한 다른 형질도입 조성물을 상기 내부 공동 내로 흡입을 실행하는 단계; 및 상기 다른 형질도입 조성물 내 상기 세포가 상기 벡터로 형질도입되는 조건에서 상기 내부 공동에서 상기 다른 형질도입 조성물을 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 상기 공정은 다수의 추가 라운드 동안 반복적인 방식으로 계속될 수 있다. 이와 관련하여, 반연속 또는 연속 방법은 훨씬 더 큰 부피 및/또는 수의 세포를 생산할 수 있다.
일부 구현예에서, 형질도입 인큐베이션의 일부는 원심분리 챔버에서 수행되고, 이는 회전 또는 원심분리를 포함하는 조건에서 수행된다.
구체적인 구현예에서, 바이러스 벡터를 이용한 세포의 형질도입은 세포 및 바이러스 입자를 함유하는 혼합물의 회전 접종, 예를 들어 원심분리이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 및 바이러스 입자를 함유하는 조성물을 일반적으로 상대적으로 작은 힘 또는 저속으로, 예를 들어 세포를 펠릿화하기 위해 사용되는 것보다 더 낮은 속도, 예를 들어 (약) 600rpm 내지 1700rpm(예를 들어 (약) 또는 적어도 600rpm, 1000rpm 또는 1500rpm 또는 1700rpm 이상)으로 회전시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 회전은 예를 들어 챔버 또는 공동의 내벽 또는 외벽에서 측정했을 때, (약) 100g 내지 4000g(예를 들어 (약) 또는 적어도 100g, 200g, 300g, 400g, 500g, 600g, 700g, 800g, 900g, 1000g, 1500g, 2000g, 2500g, 3000g 또는 3500g)의 힘, 예를 들어 상대 원심력으로 수행된다.
일부 구현예에서, 세포는 바이러스 벡터로 (약) 100g 내지 4000g, 200g 내지 1,000g, 500g 내지 1200g, 1000g 내지 2000g, 600g 내지 800g, 1200g 내지 1800g, 또는 1500g 내지 1800g의 힘, 예를 들어 상대 원심력으로 회전 접종된다. 특정 구현예에서, 세포는 바이러스 벡터 입자로 (약) 또는 적어도 100g, 200g, 300g, 400g, 500g, 600g, 700g, 800g, 900g, 1000g, 1200g, 1500g, 1600g, 2000g, 2500g, 3000g, 3200g, 또는 3500g 동안 회전 접종된다. 일부 구현예에서, 세포는 바이러스 벡터로 (약) 692g의 힘으로 형질도입된다. 구체적인 구현예에서, 세포는 바이러스 벡터로 (약) 1600g의 힘으로 형질도입된다. 일부 구현예에서, 상기 힘은 내부 공동의 측벽의 내부 표면 및/또는 세포의 표면층에서의 힘이다.
특정 구현예에서, 세포가 회전 접종되며, 예를 들어 세포 및 바이러스 벡터를 함유하는 세포 조성물이 약 5분 이상, 예를 들어 약 10분 이상, 약 15분 이상, 약 20분 이상, 약 30분 이상, 약 45분 이상, 약 60분 이상, 약 90분 이상 또는 약 120분 이상; 또는 (약) 5분 내지 120분, 30분 내지 90분, 15분 내지 60분, 15분 내지 45분, 30분 내지 60분 또는 45분 내지 60분 동안(각 수치 포함) 회전된다. 일부 구현예에서, 세포는 바이러스 벡터로 (약) 30분 동안 회전 접종된다. 특정 구현예에서, 세포는 바이러스 벡터로 (약) 60분 동안 회전 접종된다.
일부 구현예에서, 형질도입 방법은 원심분리 챔버에서 약 5분 이상, 예를 들어 약 10분 이상, 약 15분 이상, 약 20분 이상, 약 30분 이상, 약 45분 이상, 약 60분 이상, 약 90분 이상 또는 약 120분 이상 동안 형질도입 조성물과 선택적으로 공기의 회전 접종, 예를 들어 회전 또는 원심분리를 포함한다. 일부 구현예에서, 형질도입 조성물과, 선택적으로 공기는 원심분리 챔버에서 5분을 넘는 시간 동안 그러나 60분 이내, 45분 이내, 30분 이내 또는 15분 이내 동안 회전 또는 원심분리된다. 구체적인 구현예에서, 형질도입은 (약) 60분 동안 회전 또는 원심분리를 포함한다.
일부 구현예에서, 형질도입 방법은 원심분리 챔버에서 (약) 10분 내지 60분, 15분 내지 60분, 15분 내지 45분, 30분 내지 60분 또는 45분 내지 60분(각 수치 포함) 동안, 내부 공동의 측벽의 내부 표면 및/또는 세포의 표면층에 적어도 (약) 1000g, 1100g, 1200g, 1400g, 1500g, 1600g, 1800g, 2000g, 2200g, 2400g, 2800g, 3200g 또는 3600g의 힘으로, 형질도입 조성물과, 선택적으로 공기의 회전 또는 원심분리를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 형질도입 방법은 (약) 1600g으로 (약) 60분 동안 형질도입 조성물(예를 들어 세포 및 바이러스 벡터 입자)의 회전 또는 원심분리를 포함한다.
c. 바이러스 벡터 입자
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 재조합 감염성 바이러스 입자, 예를 들어 예를 들어 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV)로부터 유래된 벡터를 사용하여 세포(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포) 내로 전달 또는 도입된다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 재조합 감염성 바이러스 입자, 예를 들어 예를 들어 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV)로부터 유래된 벡터를 사용하여 세포(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포) 내로 전달 또는 도입된다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 감마-레트로바이러스 벡터를 사용하여 T 세포 내로 전달된다(예를 들어 Koste 등, (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens 등, (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino 등, (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park 등, Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557 참조).
일부 구현예에서, 상기 레트로바이러스 벡터는 긴 말단 반복 서열(LTR)를 가지며, 예를 들어 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus) (MoMLV), 골수 증식 육종 바이러스(myeloproliferative sarcoma virus)(MPSV), 뮤린 배아 줄기 세포 바이러스(murine embryonic stem cell virus)(MESV), 쥐 줄기 세포 바이러스(MSCV), 또는 비장 초점 형성 바이러스(spleen focus forming virus)(SFFV)로부터 유래된 레트로바이러스 벡터이다. 대부분의 레트로바이러스 벡터는 쥐 레트로바이러스(murine retroviruses)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 임의의 조류 또는 포유동물 세포 공급원으로부터 유래된 것들을 포함한다. 상기 레트로바이러스는 전형적으로 양쪽성(amphotropic)이며, 이는 인간을 포함하여 여러 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미한다. 한 구현예에서, 발현될 유전자는 레트로바이러스 개그(retroviral gag), 폴(pol) 및/또는 env 서열을 대체한다. 다수의 예시적인 레트로바이러스 시스템이 기술되어 있다[예를 들어 미국특허 제5,219,740호; 제6,207,453호; 제5,219,740호; 문헌 「Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990」; 「Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14」; 「Scarpa 등, (1991) Virology 180:849-852」; 「Burns 등, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037」; 및 「Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109」 참조].
바이러스 벡터 게놈은 전형적으로 패키징(packaging) 또는 생산자 세포주에 형질주입될 수 있는 플라스미드 형태로 구축된다. 이들 구체예 중의 어느 것에서, 재조합 단백질, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 핵산은 바이러스 벡터의 영역, 예를 들어 바이러스 게놈의 비필수 영역에 삽입되거나 위치된다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 특정 바이러스 서열 대신 바이러스 게놈에 삽입되어 복제 결함이 있는 바이러스를 생성한다.
게놈이 바이러스 벡터 게놈의 RNA 카피를 포함하는 레트로바이러스 입자를 생성하기 위해 임의의 공지된 다양한 방법을 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스-기반 유전자 전달 시스템을 만드는데 적어도 두 가지 성분이 관여한다: 첫째, 바이러스 벡터 입자를 생성하는데 필요한 효소뿐만 아니라 구조 단백질을 포괄(encompassing)하는 패키징 플라스미드(packaging plasmids), 둘째, 바이러스 벡터 자체, 즉, 전달될 유전 물질. 이러한 구성 요소 중 하나 또는 둘 다를 설계할 때 생물 안전 보호 장치를 도입할 수 있다.
일부 구현예에서, 패키징 플라스미드는, 외피 단백질(envelope proteins) 이외의 단백질인 HIV-1과 같은, 모든 레트로바이러스를 포함할 수 있다(Naldini 등, 1998). 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는, 독성과 관련된 추가적인 바이러스 유전자, 예를 들어 vpr, vif, vpu 및 nef, 및/또는 HIV의 1 차 트랜스활성제(transactivator)인 Tat가 결여될 수 있다. 일부 구현예에서, HIV-기반 렌티바이러스 벡터와 같은, 렌티바이러스 벡터는, 모 바이러스의 3 가지 유전자로 구성된다: 이는 재조합을 통한 야생형 바이러스의 재구성 가능성을 감소시키거나 제거하는 gag, pol 및 rev.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 게놈은, 바이러스 벡터 게놈으로부터 전사된 바이러스 게놈 RNA를 바이러스 입자로 패키징하는데 필요한 모든 성분을 포함하는, 패키징 세포주 내로 도입된다. 대안적으로, 바이러스 벡터 게놈은, 관심있는 하나 이상의 서열, 예를 들어 재조합 핵산 이외에 바이러스 성분을 암호화하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 그러나 일부 측면에서, 표적 세포에서 게놈의 복제를 방지하기 위해, 복제에 필요한 내인성 바이러스 유전자가 제거되고, 패키징 세포주에서 별도로 제공된다.
일부 구현예에서, 패키징 세포주는 입자를 생성하는데 필요한 성분을 포함하는 하나 이상의 플라스미드 벡터로 형질감염된다. 일부 구현예에서, 패키징 LTR, 시스-작용(cis-acting) 패키징 서열 및 관심 서열을 포함하는, 바이러스 벡터 게놈을 포함하는, 플라스미드, 즉 CAR과 같은 항원 수용체를 암호화하는 핵산; 및 바이러스 효소 및/또는 구조적 성분, 예를 들어 Gag, pol 및/또는 rev를 암호화하는 하나 이상의 헬퍼(helper) 플라스미드로 형질감염된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 입자를 생성하는 다양한 유전자 성분을 분리하기 위해 다수의 벡터가 이용된다. 이러한 일부 구현예에서, 패키징 세포에 별도의 벡터를 제공하는 것은 달리 복제 능력있는(competent) 바이러스를 생성할 수 있는 재조합 사건의 가능성을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 모든 레트로바이러스 성분을 갖는 단일 플라스미드 벡터가 사용될 수 있다.
패키징 세포(packaging cell)는 표적 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하는데 사용된다. 이러한 세포는 아데노바이러스를 패키징할 수 있는 293 세포를 포함한다. 유전자 요법에 사용되는 바이러스 벡터는 통상적으로 핵산 벡터를 바이러스 입자로 패키징하는 생산자 세포주(producer cell line)에 의해 생성된다. 벡터는 전형적으로 패키징 및 후속적으로 숙주 또는 표적 세포(적용가능한 경우) 내로의 통합에 필요한 최소 바이러스 서열을 함유하며, 다른 바이러스 서열은 발현될 단백질, 예를 들어 Cas9을 암호화하는 발현 카세트(expression cassette)에 의해 대체된다. 예를 들어 유전자 요법에 사용되는 AAV 벡터는 전형적으로 패키징 및 숙주 또는 표적 세포에서 유전자 발현에 필요한 AAV 게놈으로부터의 역위 말단 반복(ITR) 서열만을 갖는다. 상실된 바이러스 기능은 패키징 세포주에 의해 트랜스로 공급된다. 따라서, 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉 rep 및 cap를 암호화하는 헬퍼 플라스미드를 함유하지만, ITR 서열이 결여된 세포주에서 패키징된다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염된다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터의 AAV 유전자의 발현을 촉진한다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결여로 인해 유의한 양으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스로의 오염은 예를 들어 아데노바이러스가 AAV보다 더 민감한 열 처리에 의해 감소될 수 있다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자와 같은 레트로바이러스 벡터 입자는 슈도타입화되어(pseudotyped) 숙주 세포의 형질도입 효율을 증가시킨다. 예를 들어 일부 구현예에서 렌티바이러스 벡터 입자와 같은 레트로바이러스(retroviral) 벡터 입자는, VSV-G 당단백질로 슈도타입화되어(pseudotyped), 형질도입 될 수 있는 세포 유형을 증폭시키는 넓은 세포 숙주 범위를 제공한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는, 비-천연(non-native) 외피 당단백질을 암호화하는 플라스미드 또는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 신드비스(Sindbis) 바이러스 외피(envelope), GALV 또는 VSV-G와 같은 제노트로픽(xenotropic), 다방성(polytropic) 또는 양쪽성(amphotropic) 외피(envelope)를 포함하도록 형질감염된다.
일부 구현예에서, 패키징 세포주는, 바이러스 게놈 RNA를 렌티바이러스) 벡터 입자로 패키징을 위해 운송(trans)에 필요한 바이러스 조절 및 구조 단백질을 포함하는 성분을 제공한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 렌티바이러스 단백질을 발현하고 작용성 렌티바이러스 벡터 입자를 생성할 수 있는 임의의 세포주일 수 있다. 일부 측면에서, 적합한 패키징 세포주는 293 (ATCC CCL X), 293T, HeLA (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) 및 Cf2Th (ATCC CRL 1430) 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 패키징 세포주는 바이러스 단백질(들)을 안정적으로 발현한다. 예를 들어 일부 측면에서, gag, pol, rev 및/또는 다른 구조적 유전자를 포함하지만 LTR 및 패키징 성분이 없는 패키징 세포주가 구축될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는, 이종(heterologous) 단백질을 암호화하는 핵산 분자 및/또는 외피(envelope) 당단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터 게놈과 함께 하나 이상의 바이러스 단백질을 암호화하는 핵산 분자로 일시적으로 형질감염될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 및 패키징 및/또는 헬퍼(helper) 플라스미드는 형질감염 또는 감염을 통해 패키징 세포주 내로 도입된다. 패키징 세포주는 바이러스 벡터 게놈을 포함하는 바이러스 벡터 입자를 생성한다. 형질감염 또는 감염 방법은 잘 알려져 있다. 비제한적인 예에는 인산 칼슘(calcium phosphate), DEAE- 덱스트란(DEAE-dextran) 및 리포펙션(lipofection) 방법, 전기 천공법(electroporation) 및 미세주입법(microinjection)이 포함된다.
재조합 플라스미드 및 레트로바이러스 LTR 및 패키징 서열이 특정 세포주(예를 들어 인산 칼슘 침전에 의해)에 도입될 때, 패키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체가 바이러스 입자로 패키징될 수 있게 하고, 이어서 배양 배지 내로 분비될 수 있다. 이어서 일부 구현예에서, 재조합 레트로바이러스를 포함하는 배지를 수집하고, 임의로 농축시키고, 유전자 전이에 사용한다. 예를 들어 일부 측면에서, 패키징 플라스미드 및 전달 벡터를 패키징 세포주에 공동 형질감염시킨 후, 바이러스 벡터 입자는 배양 배지로부터 회수되고, 당업자에 의해 사용되는 표준 방법에 의해 적정된다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터와 같은 레트로 바이러스 벡터는 렌티바이러스 입자의 생성을 허용하는 플라스미드의 도입에 의해 예시적인 HEK 293T 세포주와 같은 패키징 세포주에서 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포는 형질감염되고/되거나, gag 및 pol을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 재조합 수용체, 예를 들어 항원 수용체, 예를 들어 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 선택적으로 및/또는 추가로 rev 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염되고/되거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 선택적으로 및/또는 추가로 VSV-G와 같은 비-천연(non-native) 외피(envelope) 당단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염되고/되거나 이를 포함한다. 이러한 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 HEK 293T 세포의 형질감염 대략 2일 후, 세포 상청액은 재조합 렌티바이러스 벡터를 포함하고, 이는 회수되고 적정될 수 있다.
회수 및/또는 생성된 레트로바이러스 벡터 입자는 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 표적 세포를 형질도입(transduce)하는데 사용될 수 있다. 일단 표적 세포에서, 바이러스 RNA는 역전사되고, 핵으로 유입(imported)되고, 숙주 게놈에 안정적으로 통합된다. 바이러스 RNA의 통합(integration) 후 1 일 또는 2 일 후에, 재조합 단백질, 예를 들어 CAR과 같은 항원 수용체의 발현이 검출될 수 있다.
b. 바이러스 벡터를 사용한
인큐베이션
특정 구현예에서, 세포(예를 들어 CD57-농축된 T 세포)를 형질전환 또는 형질도입하는 것은 예를 들어 바이러스 벡터의 존재 하에 세포를 인큐베이션하는 하나 이상의 단계이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포(예를 들어 CD27+ 농축된 T 세포)를 형질전환 또는 형질도입하는 것은 예를 들어 바이러스 벡터의 존재 하에 세포를 인큐베이션하는 하나 이상의 단계이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 형질전환된 세포 집단의 세포는 세포를 유전자 조작, 형질전환, 형질도입, 또는 형질감염시킨 후 인큐베이션된다.
특정 구현예에서, 인큐베이션은, 원심 분리, 떨림, 회전, 흔들림 또는 관류, 예를 들어 배지의 연속 또는 반 연속 관류를 수반하지 않는 조건과 같은 정적 조건 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 개시 전 또는 직후, 예를 들어 5 분, 15 분 또는 30 분 이내에, 세포는 백 또는 바이알과 같은 컨테이너로 전달(예를 들어 멸균 조건 하에 전달)되고, 인큐베이터에 배치된다.
일부 구현예에서, 상기 인큐베이션은 무혈청 배지 중에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 정의된 및/또는 잘 정의된 세포 배양 배지이다. 특정 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 처리된, 예를 들어 억제제 및/또는 성장 인자(growth factor)를 제거하도록 여과된 제어된 배양 배지이다. 일부 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 단백질을 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 혈청 알부민, 가수 분해물, 성장 인자, 호르몬, 담체 단백질 및/또는 부착 인자를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 배양 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 물질, 예를 들어 영양물질, 아미노산, 항생제, 이온, 및/또는 자극 인자, 예를 들어 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체, 및 세포 활성화를 위해 설계된 기타 물질 중 1가지 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 예를 들어 원심 회전하에, 국제공개공보 제WO2016/073602호에 기재된 바와 같은 원심분리기 챔버의 내부 공동에서 수행된다.
일부 구현예에서, 세포 및 선택적으로 이종 또는 재조합 폴리펩티드, 예를 들어 바이러스 벡터는 인큐베이션을 위한 컨테이너로 전달된다. 일부 구현예에서, 컨테이너는 바이알(vial)이다. 특정 구현예에서, 컨테이너는 백(bag)이다. 일부 구현예에서, 세포 및 선택적으로 이종 또는 재조합 폴리펩티드는 폐쇄되거나 또는 멸균 조건 하에 컨테이너로 전달된다. 일부 구현예에서, 이어서 컨테이너, 예를 들어 바이알 또는 백은 인큐베이션의 전부 또는 일부를 위해 인큐베이터에 배치된다. 특정 구현예에서, 인큐베이터는 (약) 16℃, 24℃ 또는 35℃ 또는 16℃, 24℃ 또는 35℃ 이상으로 설정된다. 일부 구현예에서, 인큐베이터는 (약) 37℃ 또는 37℃ ±2℃, ±1℃, ±0.5℃ 또는 ±0.1℃로 설정된다.
특정 구현예에서, 농축된 T 세포의 조성물은 하나 이상의 사이토카인의 존재하에서 배양된다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 T 세포에 의해서 발현되고/되거나 T 세포에 대해 내인성인 수용체에 결합하고/하거나 결합할 수 있는 것이다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 사이토카인의 4-알파-헬릭스 다발 패밀리의 멤버이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 4-알파-헬릭스 다발 패밀리의 멤버는 제한되지는 않지만, 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-9(IL-9), 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-15(IL-15), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 IL-15이거나 그것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 IL-7이거나 그것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 재조합 IL-2이거나 그것을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 세포는 재조합 사이토카인의 존재하에서 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 기본 배지는 균형 잡힌 염용액(예를 들어 PBS, DPBS, HBSS, EBSS)이다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), F-10, F-12, RPMI 1640, GMEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), 알파 MEM(alpha Minimal Essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 및 M199에서 선택된다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 복합 배지(예를 들어 RPMI-1640, IMDM)이다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 OpTmizer™ CTS™ T 세포 증폭 기본 배지(ThermoFisher)이다.
일부 구현예에서, 상기 기본 배지는 무기 염, 설탕, 아미노산, 선택적으로는 비타민, 유기산, 항산화제, 및/또는 완충액 또는 기타 공지의 세포 배양 영양물질의 혼합물을 함유한다. 영양물질에 더하여, 상기 배지는 또한 pH 및 삼투압을 유지하는 도움이 된다. 일부 측면에서, 상기 기본 배지의 시약은 세포 성장, 증식 및/또는 증폭을 지원한다. 다양한 상업적으로 이용가능한 기본 배지가 당해 분야의 숙련가에게 익히 알려져 있으며, 덜코스 변형된 이글스 배지(DMEM), 로스웰 파크 기억얼 인스티튜트 배지(Roswell Park Memorial Institute Medium; RPMI), 아이소코브스 변형된 덜코스 배지 및 한스 배지(Hams medium)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 기본 배지는 아이소코브스 변형된 덜코스 배지, RPMI-1640, 또는 α-MEM이다.
특정 구현예에서, 기본 배지는 추가 첨가제로 보충된다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 임의의 추가 첨가제로 보충되지 않는다. 세포 배양 배지에 대한 첨가제는 영양소, 설탕, 예를 들어 포도당, 아미노산, 비타민 또는 ATP 및 NADH와 같은 첨가제를 포함할 수 있으나 이에 국한되지 않는다.
특정 구현예에서, 세포는 이종 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 바이러스 벡터로 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 이종 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 바이러스 벡터로, (약) 또는 적어도 18 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 40 시간, 48 시간, 54 시간, 60 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간 또는 96 시간 이상 이상 동안 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션의 총 지속 기간은 (약) 또는 적어도 12 시간, 18 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 42 시간, 48 시간, 54 시간, 60 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간, 108 시간, 또는 120 시간이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션은 (약) 120 시간, 108 시간, 96 시간, 84 시간, 72 시간, 60 시간, 54 시간, 48 시간, 42 시간, 36 시간, 30 시간, 24 시간, 18 시간 또는 12 시간, 또는 그 이내에 완료된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 총 지속 기간은 (약) 12 시간 내지 120 시간, 18 시간 내지 96 시간, 24 시간 내지 72 시간, 또는 24 시간 내지 48 시간(경계 포함)이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 총 지속 기간은 (약) 1 시간 내지 48 시간, 4 시간 내지 36 시간, 8 시간 내지 30 시간 또는 12 시간 내지 24 시간(경계 포함)이다.
2. 유전자 파괴(녹아웃)
특정 구현예에서, 세포(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)는 유전적으로 파괴된다. 특정 구현예에서, 세포(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)는 유전적으로 파괴된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는, 예를 들어 분자를 암호화하는 핵산(예를 들어 DNA)의 기능 상실을 초래하는, 분자를 암호화하는 유전자를 작동불가능하게 만들어서 또는 핵산(예를 들어 DNA)의 영구적인 변화를 야기함으로써 하나 이상의 관심 분자의 발현을 파괴하는 것이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 관심 분자의 발현을 파괴하는 것은 하나 이상의 분자 또는 하나 이상의 분자를 암호화하는 유전자를 "녹아웃(knocking out)"하는 것으로 지칭된다.
일부 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단은 하나 이상의 관심 분자에 대해 녹아웃된다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 하나 이상의 관심 분자에 대해 녹아웃된다. 일부 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단은 하나 이상의 관심 분자에 대해 녹아웃된다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 하나 이상의 관심 분자에 대해 녹아웃된다. 특정 구현예에서, 관심 분자는 면역 반응을 유도하거나 자극하는데 관여하는 면역 유전자이다. 일부 구현예에서, 면역 유전자는 주요 조직 적합성 복합체(MHC), T-세포 수용체(TCR)를 암호화하는 하나 이상의 유전자, 또는 그의 성분 또는 베타 2-마이크로글로불린(베타 2m)이다.
제공된 방법 중에는 T 세포의 하나 이상의 집단, 예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 유전자 조작(예를 들어 파괴 또는 "녹아웃")하는 방법이 있다. 또한 제공된 방법 중에는 T 세포의 하나 이상의 집단, 예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 유전자 조작(예를 들어 파괴 또는 "녹아웃")하는 방법이 있다. 본원에 개시된 유전자 조작 공정은 복수의 상이한 개별 공여자로부터의 세포 집단을 조합하여 풀링된 T 세포 조성물을 생성하는 임의의 단계 동안, 그 전에, 그 후에 또는 그 사이에 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 유전자 조작(예를 들어 녹아웃)은 복수의 개별 공여자로부터의 세포 조성물을 조합하는 임의의 단계 전에 수행된다. 예를 들어 유전자 조작(예를 들어 녹아웃)은 개별 공여자로부터의 세포 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단) 상에서 수행될 수 있고, 개별 공여자로부터의 세포 조성물은 그 후에 하나 이상의 다른 개별 공여자로부터의 조작된 세포 조성물과 조합되어 풀링된 조작된 조성물을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 CD27 농축된 T 세포 집단이다. 일부 측면에서, 유전자 조작(예를 들어 녹아웃)은 복수의 개별 공여자로부터의 세포 조성물을 조합한 후에 수행된다. 예를 들어 유전자 조작(예를 들어 녹아웃)은 복수의 상이한 공여자로부터의 세포 집단(예를 들어 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단) 상에서 수행되어 풀링된 조작된 조성물을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자로부터의 세포 집단은 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단이다.
일부 구현예에서, 파괴(예를 들어 녹아웃)은 이종 폴리뉴클레오티드를 세포 집단 내로 도입하는 것과 동시에 수행된다. 일부 구현예에서, 파괴(예를 들어 녹아웃) 및 세포 집단 내로 이종 폴리뉴클레오티드의 도입은 어느 순서로든 순차적으로 수행된다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴는 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 를 암호화하는 하나 이상의 유전자 및/또는 T-세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분을 암호화하는 하나 이상의 유전자에서 유도된 하나 이상의 표적화된 유전자 파괴(예를 들어 녹아웃)를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 T-세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분을 암호화하는 하나 이상의 유전자에서 유도된 하나 이상의 표적화된 유전자 파괴(예를 들어 녹아웃)를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 TCRα 불변 도메인(또한 TCRα 불변 영역으로서 공지됨; 인간에서 TRAC에 의해 암호화됨) 및/또는 TCRβ 불변 도메인(또한 TCRβ 불변 영역으로서 공지됨; 인간에서 TRBC에 의해 암호화됨)을 암호화하는 유전자 중 하나 이상에서 유도된다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 TRAC 유전자 좌에서 유도된다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 TRBC 유전자 좌에서 유도된다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴는 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분을 암호화하는 하나 이상의 유전자에서 유도된 하나 이상의 표적화된 유전자 파괴(예를 들어 녹아웃)를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 MHC 부류 I 분자 또는 이의 성분을 암호화하는 하나 이상의 유전자에서 유도된 하나 이상의 표적화된 유전자 파괴(예를 들어 녹아웃)를 포함한다. 일부 구현예에서, MHC 부류 I 분자는 베타-2-마이크로글로불린(β2M)이다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 내인성 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자에서 유도된 하나 이상의 표적화된 유전자 파괴를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 β2M 유전자 좌에서 유도된다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴는 내인성 TRC알파 콘스타인 유전자(TRAC) 및 내인성 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자에서 유도된 하나 이상의 표적화된 유전자 파괴를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 TRAC 유전자 좌 및 β2M 유전자 좌에서 유도된다.
일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 DNA 손상 또는 닉(nick)을 초래한다. 일부 구현예에서, DNA 손상 부위에서 세포의 DNA 수선 기제의 작용은 이중 대립 유전자 프레임 이동 돌연변이, 유전자 전체 또는 일부의 결실과 같은 녹아웃(knock-out), 삽입, 미스센스(missense) 또는 프레임 이동 돌연변이를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 제1 또는 제 2 엑손 내와 같은 유전자의 하나 이상의 엑손 또는 이의 일부에 대해 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 표적 부위(들) 중 하나의 근처 영역에 있는 서열에 특이적으로 결합하거나 이와 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산이 표적화된 파괴를 위해 사용된다. 일부 측면에서, HDR을 위한 외인성 주형 폴리뉴클레오티드 부재 하에, 파괴, 표적화된 유전자 파괴는 유전자의 엑손 내에서 결실, 돌연변이 및/또는 삽입을 초래한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 재조합 수용체 및 상동성 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 주형 폴리뉴클레오티드가 HDR에 의한 유전자 파괴 부위에서 또는 근처에서 재조합 수용체 암호화 서열의 표적화된 통합을 위해 도입될 수 있다(여기 섹션 I.B. 참조).
일부 구현예에서, 유전자 파괴는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)를 도입함으로써 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 제제에는 유전자에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산이 포함된다. 일부 구현예에서, 제제에는 DNA 표적화 단백질 및 뉴클레아제 또는 RNA 가이드 뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질과 같은 다양한 성분이 포함된다. 일부 구현예에서, 제제는 예를 들어 TRAC 유전자 및/또는 β2M 유전자에서 하나 이상의 표적 위치를 표적화할 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴는 표적 부위("표적 위치(target position)", "표적 DNA 서열" 또는 "표적 위치(target location)"로도 지칭 및/또는 공지)에서 발생한다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들), 예를 들어 표적 부위를 지정하는 gRNA와 복합체를 이룬 Cas9 분자에 의해 변경되는 표적 DNA(예를 들어 게놈 DNA) 상의 부위이거나 이를 포함한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 표적 부위는 DNA 예를 들어 절단 또는 DNA 손상이 발생하는 내인성 TRAC 유전자 및/또는 β2M 유전자 좌에 있는 위치를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, HDR에 의한 핵산 서열의 통합은 표적 부위 또는 표적 서열에서 또는 근처에서 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 하나 이상의 뉴클레오티드가 첨가되는 DNA 상에 2개의 뉴클레오티드, 예를 들어 인접한 뉴클레오티드 사이의 부위일 수 있다. 표적 부위는 주형 폴리뉴클레오티드에 의해 변경되는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 표적 서열(예를 들어 gRNA가 결합하는 서열) 내에 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 표적 서열의 상류 또는 하류에 있다.
일부 구현예에서, 세포는 내인성 TRAC 유전자의 발현 및/또는 표면 발현을 감소시키는 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 억제 핵산, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA는 TRAC 발현을 억제하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 세포는 내인성 β2M 유전자의 발현 및/또는 표면 발현을 감소시키는 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 억제 핵산, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA는 β2M 발현을 억제하는데 사용된다. β2M 분자 및/또는 TRAC 분자의 세포 발현을 억제하기 위해 RNA 간섭 기술, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA를 사용하는 것을 비롯한 억제 핵산을 비롯한 억제 제제를 사용하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술 수준 내에 있다. 상업적으로 입수가능한 시약, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA 시약이 용이하게 입수가능하다.
일부 구현예에서, 세포는, 예를 들어 본원에 제공된 임의의 방법, 예를 들어 섹션 III.E에 의해, 세포가 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극, 활성화 및/또는 자극된 후에 유전적으로 파괴된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 자극된 집단은 이전에 CD57- T 세포에 대해 농축되었다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 자극된 집단은 이전에 CD27+ T 세포에 대해 농축되었다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 자극된 집단은 이전에 CD3+, CD4+, 및/또는 CD8+ T 세포 중 하나 이상에 대해 농축되었다. 일부 구현예에서, CD3+, CD4+, 및/또는 CD8+ T 세포 중 하나 이상에 대해 임의로 농축된 자극된 세포는 개별 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, CD3+, CD4+, 및/또는 CD8+ T 세포 중 하나 이상에 대해 임의로 농축된 자극된 세포는 개별 공여자로부터 유래되고, 하나 이상의 다른 개별 공여자로부터의 자극된 세포와 조합되어 복수의 상이한 공여자로부터의 자극된 세포를 생성한다. 일부 구현예에서, CD3+, CD4+, 및/또는 CD8+ T 세포 중 하나 이상에 대해 임의로 농축된 자극된 세포는 복수의 공여자로부터 유래된다.
a. 내인성
β2M
및
TRAC
유전자에서의 표적 부위
일부 구현예에서, 세포(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포)는 세포 내의 내인성 MHC 단백질 및/또는 내인성 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 단백질의 감소된 발현 및/또는 표면 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포)는 세포 내의 내인성 MHC 단백질 및/또는 내인성 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 단백질의 감소된 발현 및/또는 표면 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, β2M을 표적화하는 것은 조작된 세포에서 MHC 부류 I 발현의 광범위한 감소 또는 제거를 제공하거나 추가로 제공할 수 있는데, 그 이유는 β2M이, 일부 경우에, 세포 표면 상에서의 MHC 부류 I 분자의 안정한 발현에 필요할 수 있는 MHC 부류 I의 성분이기 때문이다.
일부 구현예에서, 세포는 β2M을 암호화하는 유전자의 파괴, 또는 β2M의 발현을 감소시키는 제제를 포함하거나 더 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 방법은 β2M을 억제 또는 파괴하는데 사용된다. β2M 유전자의 녹아웃을 위한 CRISPR 시스템을 사용하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. CRISPR을 통한 β2M 유전자의 녹아웃을 위한 상업적으로 입수가능한 키트, gRNA 벡터 및 공여자 벡터가 또한 용이하게 입수가능하다. 예를 들어 β2M 유전자의 녹아웃을 위한 상업적으로 입수가능한 시약은 예를 들어 GeneCopoeia로부터 입수가능하다(예를 들어 카탈로그 번호 HTN215171 참조).
일부 구현예에서, 유전자 파괴는 TCRα를 암호화하는 내인성 유전자 좌에서 표적화된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 TCRα 불변 도메인(인간에서 TRAC)을 암호화하는 유전자에서 표적화된다.
일부 구현예에서, 내인성 TCR을 포함하여 "T 세포 수용체(T cell receptor)" 또는 "TCR"은 가변 α 및 β 사슬(각각 TCRα 및 TCRβ로도 공지) 또는 가변 γ및 δ사슬(각각 TCRg 및 TCRd로도 공지) 또는 이의 항원 결합 부분을 함유하는 분자이고 이는 MHC 분자에 결합된 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ형태이다. 전형적으로, αβ및 γδ형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만, 이를 발현하는 T 세포는 별개의 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. 전형적으로 하나의 T 세포는 한 가지 유형의 TCR을 발현한다. TCR은 세포 표면에서 또는 가용성 형태로 발견될 수 있다. 일반적으로 TCR은 T 세포(또는 T 림프구)의 표면에서 발견되며, 이는 일반적으로 주요 조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC) 분자에 결합된 항원의 인식을 담당한다.
일부 구현예에서, TCR은 가변 도메인 및 불변 도메인(불변 영역으로도 공지), 막관통 도메인 및/또는 짧은 세포질 꼬리를 함유할 수 있다(예를 들어 문헌[Janeway 등, Immunobiology : The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997] 참조). 일부 구현예에서, TCR 사슬은 하나 이상의 불변 도메인을 함유한다. 예를 들어 주어진 TCR 사슬(예를 들어 TCRα 사슬 또는 TCRβ 사슬)의 세포 외 부분은 세포막에 인접한 2개의 면역 글로불린 유사 도메인, 예를 들어 가변 도메인(예를 들어 Vα 또는 Vβ전형적으로 Kabat 넘버링(Kabat 등, "of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.)에 기초한 1 내지 116 아미노산) 및 불변 도메인(예를 들어 α 사슬 불변 도메인 또는 TCR Cα, 전형적으로 Kabat 넘버링에 기초한 사슬의 117 내지 259 위치 또는 β 사슬 불변 도메인 또는 TCR Cβ전형적으로 Kabat에 기초한 사슬의 117 내지 295 위치)을 함유할 수 있다. 예를 들어 일부 경우에, 2개의 사슬에 의해 형성된 TCR의 세포 외 부분은 2개의 막 근위 불변 도메인과 2개의 막 원위 가변 도메인을 함유한다.
일부 구현예에서, 내인성 TCR Cα는 TRAC 유전자(IMGT 명명법)에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TRAC 유전자 좌에서, 근처 또는 내에서 표적화된다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)에서, 근처 또는 내에서 표적화된다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TCRα 불변 도메인을 암호화하는 오픈 리딩 프레임에서, 근처 또는 내에서 표적화된다.
일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오티드 내의 전이 유전자(예를 들어 외인성 핵산 서열)가 사용되어 표적 부위 및/또는 상동성 암의 위치를 안내할 수 있다. 일부 측면에서, 유전자 파괴의 표적 부위가 가이드로서 사용되어 HDR을 위해 사용되는 주형 폴리뉴클레오티드 및/또는 상동성 암을 설계할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 전이 유전자 서열(예를 들어 재조합 TCR 또는 이의 일부를 암호화)의 표적화된 통합의 바람직한 부위 근처에서 표적화될 수 있다. 일부 측면에서, 표적 부위는 TRAC 및/또는 β2M 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 내에 있다. 일부 측면에서, 표적 부위는 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 엑손 내에 있다. 일부 측면에서, 표적 부위는 TRAC 및/또는 β2M 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 인트론 내에 있다. 일부 측면에서, 표적 부위는 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 인트론 내에 있다. 일부 측면에서, 표적 부위는 β2M 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임의 인트론 내에 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 손상은 코딩 영역의 시작 또는 이에 근접하여(예를 들어 초기 코딩 영역, 예를 들어 시작 코돈 또는 나머지 코딩 서열에서 500bp 이내, 예를 들어 시작 코돈에서 처음 500bp 하류) 표적화된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 파손은 관심 유전자, 예를 들어 TRAC 및/또는 β2M의 초기 코딩 영역(전사 시작 부위 바로 다음 서열, 코딩 서열의 첫 번째 엑손 내 또는 전사 시작 부위의 500bp 이내(예를 들어 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 bp 미만) 또는 시작 코돈의 500 bp 이내(예를 들어 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 bp 미만)를 포함하여)에서 표적화된다.
일부 구현예에서, 표적 부위는 내인성 TRAC 유전자 좌의 엑손 내에 있다. 특정 구현예에서, 표적 부위는 내인성 TRAC 유전자 좌의 인트론 내에 있다. 일부 측면에서, 표적 부위는 TRAC 유전자 좌의 조절 또는 제어 요소, 예를 들어 프로모터, 5' 비번역 영역(untranslated region, UTR) 또는 3' UTR 내에 있다. 특정 측면에서, 표적 부위는 내인성 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 내에 있다. 특정 구현예에서, 표적 부위는 TRAC 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 내 엑손 내에 있다.
일부 구현예에서, 표적 부위는 내인성 β2M 유전자 좌의 엑손 내에 있다. 특정 구현예에서, 표적 부위는 내인성 β2M 유전자 좌의 인트론 내에 있다. 일부 측면에서, 표적 부위는 β2M 유전자 좌의 조절 또는 제어 요소, 예를 들어 프로모터, 5' 비번역 영역(UTR) 또는 3' UTR 내에 있다. 특정 구현예에서, 표적 부위는 내인성 β2M 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 내에 있다. 특정 구현예에서, 표적 부위는 β2M 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 내의 엑손 내에 있다.
특정 구현예에서, 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 파손은 관심 유전자 또는 유전자 좌, 예를 들어 TRAC 및/또는 β2M의 오픈 리딩 프레임에서 또는 내에서 표적화된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 관심 유전자 또는 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 내 인트론에서 또는 인트론 내에서 표적화된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 관심 유전자 또는 유전자 좌의 오픈 리딩 프레임 내 엑손 내에서 표적화된다.
특정 구현예에서, 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 파손은 인트론에서 또는 인트론 내에서 표적화된다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 파손은 엑손에서 또는 엑손 내에서 표적화된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 파손은 관심 유전자, 예를 들어 TRAC 및/또는 β2M의 엑손에서 또는 엑손 내에서 표적화된다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 파손은 TRAC 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌의 엑손 내에서 표적화된다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TRAC 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌의 제 1 엑손, 제 2 엑손, 제3 엑손 또는 제4 엑손 내에서이다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TRAC 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌의 제 1 엑손 내에서이다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 TRAC 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌에 있는 제 1 엑손의 5' 말단에서 500 염기 쌍(base pair, bp) 하류 내에 있다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 엑손 1의 최대 5' 뉴클레오티드 및 엑손 1의 최대 3' 뉴클레오티드의 상류 사이에 있다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TRAC 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌에 있는 제 1 엑손의 5' 말단에서 400 bp, 350 bp, 300 bp, 250 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp 또는 50 bp 하류 내에 있다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TRAC, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌에 있는 제 1 엑손의 5' 말단에서 1 bp 내지 400 bp, 50 내지 300 bp, 100 bp 내지 200 bp 또는 100 bp 내지 150 bp(각각의 경계 포함) 사이 하류에 있다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 TRAC 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌에 있는 제 1 엑손의 5' 말단에서 100 bp 내지 150 bp(경계 포함) 사이 하류에 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 파손은 β2M 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌의 엑손 내에서 표적화된다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 β2M 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌의 제 1 엑손, 제 2 엑손, 제3 엑손 또는 제4 엑손 내에서이다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 β2M 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌의 제 1 엑손 내에서이다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 β2M 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌에 있는 제 1 엑손의 5' 말단에서 500 염기 쌍(base pair, bp) 하류 내에 있다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 엑손 1의 최대 5' 뉴클레오티드 및 엑손 1의 최대 3' 뉴클레오티드의 상류 사이에 있다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 β2M 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌에 있는 제 1 엑손의 5' 말단에서 400 bp, 350 bp, 300 bp, 250 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp 또는 50 bp 하류 내에 있다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 β2M, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌에 있는 제 1 엑손의 5' 말단에서 1 bp 내지 400 bp, 50 내지 300 bp, 100 bp 내지 200 bp 또는 100 bp 내지 150 bp(각각의 경계 포함) 사이 하류에 있다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 β2M 유전자, 오픈 리딩 프레임 또는 유전자 좌에 있는 제 1 엑손의 5' 말단에서 100 bp 내지 150 bp(경계 포함) 사이 하류에 있다.
b. 유전자 파괴 방법
일부 측면에서, 유전자의 파괴, 예를 들어 녹아웃, 삽입, 미스센스(missense) 또는 프레임시프트 돌연변이, 예를 들어 이중대립유전자 프레임시프트 돌연변이, 유전자의 전부 또는 일부의 결실, 예를 들어 하나 이상의 엑손 또는 그의 일부의 결실, 및/또는 넉킹 인을 달성함으로써 유전자를 억제 또는 파괴시키는 방법을 수행한다. 일부 측면에서, 분자 또는 유전자의 파괴는 유전자 편집에 의해, 예를 들어 파괴를 위해 표적화된 영역에서 유전자에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA-결합 핵산을 사용하여 수행된다. 일부 측면에서, 파괴는 유전자 내의, 예를 들어 유전자의 엑손 내의 결실, 돌연변이 및/또는 삽입을 초래한다. 일부 측면에서, 이종 폴리뉴클레오티드의 도입의 파괴는 동시에 수행된다. 일부 측면에서, 이종 폴리뉴클레오티드의 도입의 파괴는 어느 순서로든 순차적으로 수행된다.
여기에 기재된 것을 포함하여 유전자 파괴를 생성하는 방법은 내인성 DNA의 유전자 파괴, 절단 및/또는 이중 가닥 손상(double strand break, DSB) 또는 표적 부위 또는 표적 위치에서의 닉(nick)을 유도하는 조작된 시스템과 같은 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)의 사용을 포함할 수 있어서 NHEJ(non-homologous end joining)와 같은 오류 발생 프로세스에 의한 손상의 수선 또는 HDR을 통한 주형 수선을 이용한 수선은 표적 부위 또는 위치에서 또는 근처에서 유전자의 녹아웃 및/또는 관심 서열(예를 들어 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 외인성 핵산 서열 또는 전이 유전자)의 삽입을 초래할 수 있다. 여기에 제공된 방법에 사용하기 위한 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)가 또한 제공된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 제제(들)가 전이 유전자 서열의 상동성-지시된 수선(HDR) 매개 표적화된 통합을 위해 여기에 제공된 주형 뉴클레오티드와 조합하여 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)에는 게놈의 특정 부위 또는 위치, 예를 들어 표적 부위 또는 표적 위치에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산이 포함된다. 일부 측면에서, TCR을 암호화하는 내인성 유전자의 표적화된 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 손상 또는 절단은 키메라 또는 융합 단백질에서와 같이 유전자 편집 뉴클레아제에 결합되거나 이와 복합체를 형성한 단백질 또는 핵산을 사용하여 달성된다. 일부 측면에서, 주요 조직 적합성 복합체(MHC)를 암호화하는 내인성 유전자의 표적화된 유전자 붕괴, 예를 들어 DNA 파괴 또는 절단은 단백질 또는 핵산을 사용하여 달성되고, 예를 들어 키메라 또는 융합 단백질에서 유전자 편집 뉴클레아제에 커플링되거나 그와 복합체화된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)에는 DNA 표적화 단백질 및 뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질 또는 RNA-가이드 뉴클레아제가 포함된다.
일부 구현예에서, 제제에는 RNA 가이드 뉴클레아제 또는 DNA 표적화 단백질 및 뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질과 같은 다양한 성분이 포함된다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 엔도뉴클레아제와 같은 뉴클레아제에 융합된 하나 이상의 징크 핑거 단백질(ZFP) 또는 전사 활성화제 유사 이펙터(transcription activator-like effector, TALE)와 같은 DNA 결합 단백질을 포함하는 DNA 표적화 분자를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드롬 핵산(CRISPR) 결합 뉴클레아제(Cas) 시스템(Cas 및/또는 Cfp1 포함)과 같은 RNA 가이드 뉴클레아제를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 하나 이상의 표적 부위(들), 유전자 또는 이의 일부의 서열에 표적화되도록 특이적으로 설계된 DNA 결합 표적화된 뉴클레아제 및 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN) 또는 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(transcription activator-like effector nucleases, TALEN)와 같은 유전자 편집 뉴클레아제 및 CRISPR 결합 뉴클레아제(Cas) 시스템과 같은 RNA 가이드 뉴클레아제를 포함한 서열 특이적 또는 표적화된 뉴클레아제와 같은 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제를 사용하여 수행된다. 예시적인 ZFN, TALE 및 TALEN이 예를 들어 문헌[Lloyd 등, Frontiers in Immunology, 4(221): 1-7 (2013)]에 기재되어 있다.
징크 핑거 단백질(ZFP), 전사 활성화제 유사 이펙터(TALE) 및 CRISPR 시스템 결합 도메인은 예를 들어 자연적으로 발생하는 ZFP 또는 TALE 단백질의 인식 나선 영역의 조작(하나 이상의 아미노산 변경)을 통해 미리 결정된 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 "조작될(engineered)" 수 있다. 조작된 DNA 결합 단백질(ZFP 또는 TALE)은 자연적으로 발생하지 않는 단백질이다. 설계에 대한 합리적인 기준에는 기존 ZFP 및/또는 TALE 설계 및 결합 데이터의 정보를 저장하는 데이터베이스에서 정보를 처리하기 위한 대체 규칙 및 전산화된 알고리즘의 적용이 포함된다. 예를 들어 문헌[미국특허 6,140,081; 6,453,242; 및 6,534,261; 또한 국제 출원 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496 및 미국 공개 번호 20110301073]을 참조한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 제제(들)는 예를 들어 관심 유전자, 예를 들어 TRAC 및/또는 β2M에서 또는 근처에서 하나 이상의 표적 부위(들)를 특이적으로 표적화한다. 일부 구현예에서, 제제에는 표적 부위(들)에 특이적으로 결합, 인식 또는 혼성화하는 ZFN, TALEN 또는 CRISPR/Cas9 조합물이 포함된다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas9 시스템은 특정 절단을 가이드하도록 조작된 crRNA/tracr RNA("단일 가이드 RNA(single guide RNA)"를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제에는 Argonaute 시스템(예를 들어 'TtAgo', (Swarts 등, (2014) Nature 507(7491): 258-261)로 공지되고, T. thermophilus 유래)에 기초한 뉴클레아제가 포함된다. 여기에 기재된 임의의 뉴클레아제 시스템을 사용한 표적화된 절단이 개발되어 HDR 또는 NHEJ 매개 프로세스를 이용하여 전이 유전자 서열, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 예를 들어 내인성 TCR 유전자에서 특정 표적 위치로 삽입시킬 수 있다.
일부 구현예에서, "징크 핑거 DNA 결합 단백질(zinc finger DNA binding protein)"또는 결합 도메인)은 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화된 결합 도메인 내 아미노산 서열 영역인, 하나 이상의 징크 핑거를 통해 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합하는 보다 큰 단백질 내 도메인이거나 단백질이다. 징크 핑거 DNA 결합 단백질 용어는 종종 징크 핑거 단백질 또는 ZFP(zinc finger protein)로 축약된다. ZFP 중에 전형적으로 9-18 뉴클레오티드 길이이고, 개별 핑거의 조립에 의해 생성된, 특정 DNA 서열을 표적화하는 인공 ZFP 도메인이 있다. ZFP는 단일 핑거 도메인이 약 30 개의 아미노산 길이이며 단일 베타 턴의 두 개의 시스테인과 아연을 통해 배위된 두 개의 불변 히스티딘 잔기를 함유하고 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 핑거를 갖는 알파 나선을 함유하는 것을 포함한다. 일반적으로, ZFP의 서열 특이성은 징크 핑거 인식 나선 상의 4개의 나선 위치(-1, 2, 3 및 6)에서 아미노산 치환을 함으로써 변경될 수 있다. 따라서, 예를 들어 ZFP 또는 ZFP 함유 분자는 자연적으로 발생하지 않고, 예를 들어 선택 표적 부위에 결합하도록 조작된다.
일부 경우에, DNA 표적화 분자는 DNA 절단 도메인에 융합된 징크 핑거 DNA 결합 도메인이거나 이를 포함하여 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 형성한다. 예를 들어 융합 단백질은 하나 이상의 IIS 유형 제한 효소의 절단 도메인(또는 절단 하프 도메인) 및 하나 이상의 징크 핑거 결합 도메인을 포함하며, 이는 조작되거나 조작되지 않을 수 있다. 일부 경우에, 절단 도메인은, 일반적으로 하나의 가닥 상의 제한 부위로부터 9 뉴클레오티드 및 다른 가닥 상의 제한 부위로부터 13 뉴클레오티드에서 DNA의 이중 가닥 절단을 촉매하는, IIS 유형 제한 엔도뉴클레아제 FokI 유래이다. 예를 들어 문헌[미국특허 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; Li 등, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li 등, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim 등, (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim 등, (1994b) J. Biol. Chem. 269: 978-982]을 참조한다. 일부 유전자 특이적으로 조작된 징크 핑거가 상업적으로 이용 가능하다. 예를 들어 수 천개의 표적에 대해 특이적으로 표적화된 징크 핑거를 제공하고, 징크 핑거 작제물에 대해 CompoZr로 명명되는 플랫폼이 이용 가능하다. 예를 들어 문헌[Gaj 등, Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405]을 참조한다. 일부 경우에, 상업적으로 이용 가능한 징크 핑거가 사용되거나 맞춤 설계된다.
일부 구현예에서, 예를 들어 TRAC 및/또는 β2M 유전자 내 하나 이상의 표적 부위(들)가 조작된 ZFN에 의한 유전자 파괴를 위해 표적화될 수 있다.
전사 활성화제 유사 이펙터(TALE)는 Xanthomonas 세균 종 유래 단백질이고, 다수의 반복 서열을 포함하며, 각각의 반복은 핵산 표적화 서열의 각 뉴클레오티드 염기에 특이적인 12 및 13 위치에서 2개의 잔기(RVD)를 포함한다. 유사한 모듈의 염기 당 염기 핵산 결합 특성을 가진 결합 도메인(MBBBD)은 상이한 세균 종으로부터 또한 유래될 수 있다. 새로운 모듈 단백질은 TAL 반복보다 더 많은 서열 가변성을 나타내는 장점이 있다. 일부 구현예에서, 상이한 뉴클레오티드 인식에 관련된 RVD는 C 인식을 위한 HD, T 인식을 위한 NG, A 인식을 위한 NI, G 또는 A 인식을 위한 NN, A, C, G 또는 T 인식을 위한 NS, T 인식을 위한 HG, T 인식을 위한 IG, G 인식을 위한 NK, C 인식을 위한 HA, C 인식을 위한 ND, C 인식을 위한 HI, G 인식을 위한 HN, G 인식을 위한 NA, G 또는 A 인식을 위한 SN 및 T 인식을 위한 YG, A 인식을 위한 TL, A 또는 G 인식을 위한 VT 및 A 인식을 위한 SW이다. 일부 구현예에서, 중요한 아미노산 12 및 13은 A, T, C 및 G 뉴클레오티드에 대한 특이성을 조절하고 특히 상기 특이성을 향상시키기 위해 다른 아미노산 잔기로 돌연변이될 수 있다.
일부 구현예에서, "TALE DNA 결합 도메인(TALE DNA binding domain)" 또는 "TALE"은 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위를 포함하는 폴리펩티드이다. 반복 가변 2잔기(repeat variable diresidue, RVD)를 각각 포함하는 반복 도메인은 코그니트(cognate) 표적 DNA 서열에 대한 TALE의 결합에 관여한다. 단일 "반복 단위(repeat unit)"("반복(repeat)"으로도 지칭)는 전형적으로 33-35 개의 아미노산 길이이며 자연적으로 발생하는 TALE 단백질 내 다른 TALE 반복 서열과 적어도 일부 서열 상동성을 나타낸다. TALE 단백질은 반복 단위 내에서 정규 또는 비정규 RVD를 사용하여 표적 부위에 결합하도록 설계될 수 있다. 예를 들어 문헌[미국특허 8,586,526 및 9,458,205]을 참조한다.
일부 구현예에서, "뉴클레아제(TALE-nuclease)"은 전사 활성화제 유사 이펙터(TALE)로부터 전형적으로 유래된 핵산 결합 도메인 및 핵산 표적 서열을 절단하는 뉴클레아제 촉매 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 촉매 도메인은 예를 들어 I-TevI, ColE7, NucA 및 Fok-I과 같은 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 도메인 또는 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, TALE 도메인은 예를 들어 I-CreI 및 I-OnuI과 같은 메가뉴클레아제 또는 이의 기능적 변이체에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, TALEN은 단량체성 TALEN이다. 단량체성 TALEN은 문헌[국제 출원 WO2012138927]에 기재된 I-TevI의 촉매 도메인과 조작된 TAL 반복의 융합과 같이 특이적 인식 및 절단을 위해 2량체화가 필요없는 TALEN이다. TALEN은 유전자 표적화 및 유전자 변경을 위해 설명되었고 사용되었다(예를 들어 문헌[Boch 등, (2009) Science 326(5959): 1509-12.; Moscou and Bogdanove (2009) Science 326(5959): 1501; Christian 등, (2010) Genetics 186(2): 757-61; Li 등, (2011) Nucleic Acids Res 39(1): 359-72] 참조).
일부 구현예에서, TRAC 및/또는 β2M 유전자가 조작된 TALEN에 의한 유전자 파괴를 위해 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, β2M 유전자는 조작된 TALEN에 의한 유전자 파괴를 위해 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, TRAC 유전자 및 β2M 유전자는 조작된 TALEN에 의한 유전자 파괴를 위해 표적화될 수 있다.
일부 구현예에서, "TtAgo"는 유전자 침묵에 관여하는 것으로 생각되는 원핵 생물 아르고누테(Argonaute) 단백질이다. TtAgo는 Thermus thermophilus 세균으로부터 유래된다. 예를 들어 문헌[Swarts 등, (2014) Nature 507(7491): 258-261,Sheng 등, (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 652]을 참조한다. "시스템(TtAgo system)"은 예를 들어 TtAgo 효소에 의해 절단하기 위한 가이드 DNA를 포함하여 필요한 모든 성분이다.
일부 구현예에서, 조작된 징크 핑거 단백질, TALE 단백질 또는 CRISPR/Cas 시스템은 자연에서 발견되지 않으며 이의 생산은 파지 디스플레이, 상호 작용 트랩 또는 하이브리드 선택과 같은 경험적 공정으로부터 주로 발생한다. 예를 들어 문헌[미국특허 제5,789,538호; 미국특허 제5,925,523호; 미국특허 제6,007,988호; 미국특허 제6,013,453호; 미국특허 제6,200,759호; 국제공개공보 제WO 95/19431호; 국제공개공보 제WO 96/06166호; 국제공개공보 제WO 98/53057호; 국제공개공보 제WO 98/54311호; 국제공개공보 제WO 00/27878호; 국제공개공보 제WO 01/60970호; 국제공개공보 제WO 01/88197호 및 국제공개공보 제WO 02/099084호]을 참조한다.
징크 핑거 및 TALE DNA 결합 도메인은, 예를 들어 자연적으로 발생하는 징크 핑거 단백질의 인식 나선 영역의 조작(하나 이상의 아미노산 변경)을 통해 또는 DNA 결합에 관여하는(반복 가변 2잔기 또는 RVD 영역) 아미노산의 조작에 의해 미리 결정된 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 따라서, 조작된 징크 핑거 단백질 또는 TALE 단백질은 자연적으로 발생하지 않는 단백질이다. 징크 핑거 단백질 및 TALE 조작을 위한 비제한적인 방법의 예는 설계 및 선택이다. 설계된 단백질은 이의 설계/구성이 주로 합리적인 기준에서 발생하는 자연에서 발생하지 않는 단백질이다. 설계에 대한 합리적인 기준에는 기존 ZFP 또는 TALE 설계(정규 및 비정규 RVD) 및 결합 데이터의 정보를 저장하는 데이터베이스에서 정보를 처리하기 위한 대체 규칙 및 전산화된 알고리즘의 적용이 포함된다. 예를 들어 문헌[미국특허 9,458,205; 8,586,526; 6,140,081; 6,453,242; 및 6,534,261; 또한 국제공개공보 제WO 98/53058호; 제WO 98/53059호; 제WO 98/53060호; 제WO 02/016536호 및 제WO 03/016496호]을 참조한다.
게놈 DNA의 표적화된 절단을 위한 다양한 방법 및 조성물이 기재되었다. 상기 표적화된 절단 이벤트는, 예를 들어 표적화된 돌연변이 유발을 유도하고, 세포 DNA 서열의 표적화된 결실을 유도하고, 미리 결정된 염색체 유전자 좌에서 표적화된 재조합을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 문헌[미국특허 제9,255,250호; 제9,200,266호; 제9,045,763호; 제9,005,973호; 제9,150,847호; 제8,956,828호; 제8,945,868호; 제8,703,489호; 제8,586,526호; 제6,534,261호; 제6,599,692호; 제6,503,717호; 제6,689,558호; 제7,067,317호; 제7,262,054호; 제7,888,121호; 제7,972,854호; 제7,914,796호; 제7,951,925호; 제8,110,379호; 제8,409,861호; 미국특허공개공보 제20030232410호; 제20050208489호; 제20050026157호; 제20050064474호; 제20060063231호; 제20080159996호; 제201000218264호; 제20120017290호; 제20110265198호; 제20130137104호; 제20130122591호; 제20130177983호; 제20130196373호; 제20140120622호; 제20150056705호; 제20150335708호; 제20160030477호 및 20160024474호]을 참조한다(이의 개시 전체가 참조로 삽입됨).
유전자 파괴를 도입할 수 있는 하나 이상의 제제가 또한 제공된다. 유전자 파괴를 도입할 수 있는 하나 이상의 제제(들)의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어 핵산 분자)가 또한 제공된다.
일부 구현예에서, 유전자 억제(gene repression)는 RNA 간섭제인 억제성 핵산 분자를 사용하여 달성되며, 이는 유전자의 발현을 선택적으로 억제 또는 억제하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 유전자 억제는 RNA 간섭(RNAi), 짧은 간섭(short interfering) RNA(siRNA), 짧은 헤어핀(shRNA), 안티센스, 및/또는 리보자임에 의해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 간섭제는 또한, 비제한적으로, 자연 발생 miRNA 전구체 또는 miRNA-유사 RNA의 설계된 전구체와 동일한 RNA 종을 비롯한, shRNA를 생산하기 위해 세포내에서 가공될 수 있는 다른 RNA 종을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, RNA 간섭제는 RNAi 메카니즘을 통해 유전자 발현의 억제를 매개하는 것으로 관련 기술분야에 공지된 분자의 구조 특징을 갖는 적어도 부분적으로 이중 가닥 RNA, 또는 이러한 구조를 형성하기 위해 서로 혼성화하는 적어도 부분적으로 상보적인 부분을 포함하는 RNA 가닥이다. RNA가 서로 혼성화하는 상보적인 영역을 함유하는 경우, RNA는 자가 혼성화하는 것으로 언급될 것이다. 일부 구현예에서, 억제성 핵산, 예를 들어 RNA 간섭제는 표적 유전자에 실질적으로 상보적인 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 전사체에 표적화된 RNA 간섭제는 또한, 전사체를 암호화하고 전사체(transcript)의 합성을 지시하는 유전자에 표적화된 것으로 간주될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 영역은 RNA 간섭제의 안티센스 가닥과 혼성화하는 표적 전사체의 영역일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 전사체는 RNA 간섭에 의한 억제를 위한 표적인 임의의 RNA일 수 있다.
일부 구현예에서, RNA 간섭제는 (1) RNAi 제제가 약 15 내지 29개 뉴클레오티드 길이의 영역, 예를 들어 적어도 약 15, 약 17, 약 18, 또는 약 19개 뉴클레오티드 길이의 영역에 걸쳐 전사물에 적어도 대략 80%, 대략 85%, 대략 90%, 대략 91%, 대략 92%, 대략 93%, 대략 94%, 대략 95%, 대략 96%, 대략 97%, 대략 98%, 대략 99%, 또는 대략 100% 상보적인 부분, 예를 들어 가닥을 포함하고/하거나; (2) 포유동물 세포의 세포질 또는 핵 내에서 전형적으로 발견되는 조건(온도 배제) 하에 RNAi 제제의 한 가닥의 15개 뉴클레오티드의 스트레치 및 전사물의 15개의 뉴클레오티드 부분에 의해 형성된 듀플렉스의 Tm은 RNA 간섭제의 동일한 15개의 뉴클레오티드 및 그의 정확한 상보체에 의해 형성될 듀플렉스의 Tm보다 대략 15℃ 이하 또는 대략 10℃ 이하 더 낮고/낮거나; (3) 전사물의 안정성은 RNA 간섭제의 존재 하에 그의 부재와 비교하여 감소되는 경우에 "표적화된" 것으로 간주된다.
일부 구현예에서, RNA 간섭제는 선택적으로 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 또는 변형을 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 RNAi 제제가 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 변형된 뉴클레오티드 또는 백본 등을 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일부 구현예에서, RNA 간섭제는 전사 후에 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 간섭제는 약 15 내지 29개의 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스 부분을 포함하는 구조를 형성하도록 혼성화 또는 자가-혼성화하는 하나 이상의 가닥을 함유할 수 있고, 선택적으로 듀플렉스(duplex) 내에 하나 이상의 미스매치되거나 또는 쌍이 형성되지 않은(unpaired) 뉴클레오티드를 갖는다.
일부 구현예에서, 용어 "짧은 간섭 RNA"(siRNA)는 약 15 내지 29개의 뉴클레오티드 길이의 이중-가닥 부분을 포함하고 선택적으로 어느 한 가닥 또는 둘 다의 가닥 상에 단일-가닥 오버행(single-stranded overhang)(예를 들어 1-6개의 뉴클레오티드 길이)을 더 포함하는 핵산을 지칭한다. 일부 구현예에서, 이중-가닥 부분은 17 내지 21개의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 19개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 오버행은 각각의 가닥의 3' 말단 상에 존재하고, 약 또는 대략 2 내지 4개의 뉴클레오티드 길이일 수 있고, DNA 또는 뉴클레오티드 유사체로 구성될 수 있다. siRNA는 함께 혼성화하는 2개의 RNA 가닥으로부터 형성될 수 있거나, 또는 대안적으로 더 긴 이중-가닥 RNA로부터 또는 짧은 헤어핀 RNA와 같은 자가-혼성화 부분을 포함하는 단일 RNA 가닥으로부터 생성될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 하나 이상의 미스매치되거나 또는 쌍이 형성되지 않은 뉴클레오티드가 2개의 siRNA 가닥에 의해 형성된 듀플렉스에 존재할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일부 구현예에서, siRNA의 한 가닥("안티센스" 또는 "가이드" 가닥)은 표적 핵산, 예를 들어 mRNA 전사물과 혼성화하는 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 안티센스 가닥은 약 15개 내지 29개의 뉴클레오티드, 때때로 17개 내지 21개의 뉴클레오티드, 예를 들어 19개의 뉴클레오티드에 걸쳐 표적에 완전히 상보적이며, 이는 siRNA가 이러한 길이에 걸쳐 단일 미스매치 없이 표적 전사체에 혼성화한다는 것을 의미한다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 하나 이상의 미스매치 또는 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드가 siRNA 가닥과 표적 전사체 사이에 형성된 듀플렉스에 존재할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
일부 구현예에서, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)는 RNAi를 매개하기에 충분히 긴 (전형적으로 15 내지 29개의 뉴클레오티드 길이) 듀플렉스 구조를 형성하기 위해 혼성화되거나 혼성화할 수 있는 적어도 2개의 상보적 부분, 및 듀플렉스를 형성하는 2개의 서열의 말단을 연결하는 루프를 형성하는, 전형적으로 대략 1개 내지 10개의 뉴클레오티드 길이의 적어도 하나의 단일 가닥 부분을 포함하는 핵산 분자이다. 일부 구현예에서, 구조는 오버행을 더 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, shRNA의 자가-상보적 부분의 혼성화에 의해 형성된 듀플렉스는 siRNA의 것과 유사한 특성을 가질 수 있고, 일부 경우에, shRNA는 보존된 세포 RNAi 기구에 의해 siRNA로 가공될 수 있다. 따라서, shRNA는 siRNA의 전구체일 수 있고, 유사하게 표적 전사체의 발현을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, shRNA는 표적 핵산, 예를 들어 mRNA 전사체와 혼성화하는 부분을 포함하고, 약 15개 내지 29개의 뉴클레오티드, 때때로 17개 내지 21개의 뉴클레오티드, 예를 들어 19개의 뉴클레오티드에 걸쳐 표적에 완전히 상보적일 수 있다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 하나 이상의 미스매치 또는 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드가 shRNA 가닥과 표적 전사체 사이에 형성된 듀플렉스에 존재할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
c. 유전자 파괴를 위한 제제의 전달
일부 구현예에서, 인간에서 TRAC 및 β2M을 암호화하는 내인성 유전자의 표적화된 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 손상은 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들), 예를 들어 Cas9 및/또는 gRNA 성분을, 세포(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)로 도입 또는 전달하기 위한 많은 공지된 전달 방법 또는 비히클 중 어느 하나를 사용하여, 예를 들어 Cas9 분자 및 gRNA를 전달하기 위한 렌티바이러스 전달 벡터를 사용하여 또는 임의의 공지된 방법 또는 비히클을 사용하여, 세포로 전달 또는 도입함으로써 수행된다. 일부 구현예에서, 인간에서 TRAC 및 β2M을 암호화하는 내인성 유전자의 표적화된 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 손상은 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들), 예를 들어 Cas9 및/또는 gRNA 성분을, 세포(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)로 도입 또는 전달하기 위한 많은 공지된 전달 방법 또는 비히클 중 어느 하나를 사용하여, 예를 들어 Cas9 분자 및 gRNA를 전달하기 위한 렌티바이러스 전달 벡터를 사용하여 또는 임의의 공지된 방법 또는 비히클을 사용하여, 세포로 전달 또는 도입함으로써 수행된다. 예시적인 방법이 예를 들어 문헌[Wang 등, (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper 등, (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen 등, (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; 및 Cavalieri 등, (2003) Blood. 102(2): 497-505]에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 파손을 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)의 하나 이상의 성분을 암호화하는 핵산 서열이 예를 들어 여기 기재되거나 공지된 세포로 핵산을 도입시키는 임의의 방법에 의해 세포로 도입된다. 일부 구현예에서, CRISPR 가이드 RNA 및/또는 Cas9 효소와 같은 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)의 성분을 암호화하는 벡터가 세포로 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들), 예를 들어 Cas9/gRNA인 하나 이상의 제제(들)이 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체로 세포에 도입된다. RNP 복합체에는 RNA 또는 gRNA 분자와 같은 리보뉴클레오티드의 서열 및 Cas9 단백질 또는 이의 변이체와 같은 단백질이 포함된다. 예를 들어 Cas9 단백질은 Cas9 단백질 및 표적 서열을 표적화하는 gRNA 분자를 포함하는 RNP 복합체로서 예를 들어 전기천공 또는 기타 물리적 전달 방법을 이용하여 전달된다. 일부 구현예에서， RNP는 전기 천공 또는 기타 물리적 수단, 예를 들어 입자 총, 인산 칼슘 형질 감염, 세포 압축 또는 압착을 통해 세포로 전달된다. 일부 구현예에서, RNP는 추가 전달 제제(예를 들어 소분자 제제, 지질 등)를 필요로 하지 않고 세포의 혈장 막을 가로지를 수 있다. 일부 구현예에서, RNP로서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들), 예를 들어 CRISPR/Cas9의 전달은, 표적화된 파괴가 예를 들어 RNP가 도입되는 세포에서 세포의 자손으로 제제가 전달되지 않으면서 일시적으로 발생한다는 이점을 제공한다. 예를 들어 RNP에 의한 전달은 제제가 자손으로 유전되는 것을 최소화하고, 이로써 자손에서 표적 외 유전자 파괴의 가능성을 줄인다. 상기 경우에, 유전자 파괴 및 전이 유전자의 통합은 제제 자체없이 자손 세포로 유전될 수 있고, 이는 자손 세포로 전달되면서 표적 외 유전자 파괴를 더 도입할 수 있다.
유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들) 및 성분, 예를 들어 Cas9 분자 및 gRNA 분자는 다양한 전달 방법 및 제형 또는 예를 들어 문헌[국제공개공보 제WO 2015/161276호; 미국특허공개공보 제US 2015/0056705호, 제US 2016/0272999호, 제US 2017/0211075호; 또는 제US 2017/0016027호]에 기재된 방법을 사용하여 다양한 형태로 표적 세포에 도입될 수 있다. 상기 전달 방법 및 제형은 여기에 기재된 방법의 이전 또는 후속 단계에서 세포에 주형 폴리뉴클레오티드 및/또는 다른 제제를 전달하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자를 암호화하는 DNA 또는 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자를 포함하는 RNP 복합체는 공지된 방법에 의해 또는 여기에 기재된 바와 같이 세포로 전달될 수 있다. 예를 들어 Cas9 암호화 및/또는 gRNA 암호화 DNA는, 예를 들어 벡터(예를 들어 바이러스 또는 비바이러스성 벡터), 비벡터 기반 방법(예를 들어 있는 그대로의 DNA 또는 DNA 복합체 사용) 또는 이의 조합물에 의해 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 이의 제제(들) 및/또는 성분을 함유하는 폴리뉴클레오티드가 벡터(예를 들어 바이러스 벡터/바이러스 또는 플라스미드)에 의해 전달된다. 상기 벡터는 여기에 기재된 임의의 것일 수 있다.
일부 측면에서, 가이드 서열과 조합하여(및 선택적으로 이와의 복합체로) CRISPR 효소(예를 들어 Cas9 뉴클레아제)가 세포로 전달된다. 예를 들어 CRISPR 시스템 중 하나 이상의 요소는 I 유형, II 형 또는 III 유형 CRISPR 시스템에서 유래된다. 예를 들어 CRISPR 시스템 중 하나 이상의 요소는 Streptococcus pyogenes , Staphylococcus aureus 또는 Neisseria meningitides와 같은 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체에서 유래된다.
일부 구현예에서, Cas9 뉴클레아제(예를 들어 Staphylococcus aureus 유래 또는 Streptococcus pyogenes 유래 mRNA에 의해 암호화됨, 예를 들어 pCW-Cas9, Addgene #50661, Wang 등, (2014) Science, 3:343-80-4; 또는 카탈로그 번호 K002, K003, K005 또는 K006으로 Applied Biological Materials (ABM; Canada)로부터 구매 가능한 뉴클레아제 또는 닉카제 렌티바이러스 벡터) 및 표적 유전자(예를 들어 인간에서 TRAC 및/또는 β2M)에 특이적인 가이드 RNA가 세포로 도입된다. 일부 구현예에서, TRAC 및/또는 β2M 유전자와 같은 특정 유전자의 표적 부위를 표적화하는 표적화 도메인 서열이거나 이를 포함하는 gRNA 서열이 설계되거나 확인된다. CRISPR 게놈 편집을 위한 게놈 전체 gRNA 데이터베이스가 공개적으로 이용 가능하고, 이는 인간 게놈 또는 마우스 게놈에서 유전자의 구성적 엑손을 표적화하는 예시적인 단일 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA) 서열을 함유한다(예를 들어 genescript.com/gRNA-database.html 참조; 또한, Sanjana 등, (2014) Nat. Methods, 11:783-4 참조). 일부 측면에서, gRNA 서열은 비표적 부위 또는 위치에 대한 최소한의 표적 외 결합을 갖는 서열이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 이의 제제(들) 및/또는 성분을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또는 RNP 복합체가 비벡터 기반 방법(예를 들어 있는 그대로의 DNA 또는 DNA 복합체 사용)에 의해 전달된다. 예를 들어 DNA 또는 RNA 또는 단백질 또는 이의 조합물, 예를 들어 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체는 예를 들어 유기적으로 변형된 실리카 또는 규산염(Ormosil), 전기 천공, 일시적인 세포 압축 또는 압착(예를 들어 문헌[Lee, 등, (2012) Nano Lett 12: 6322-27, Kollmannsperger 등, (2016) Nat Comm 7, 10372 doi:10.1038/ncomms10372)]에 기재된 바와 같음), 유전자 총, 소노포레이션(sonoporation), 자성 감염, 지질 매개 형질 감염, 덴드리머(dendrimer), 무기 나노 입자, 인산 칼슘 또는 이의 조합물에 의해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 전기 천공을 통한 전달은 카트리지, 챔버 또는 큐벳에서 Cas9- 및/또는 gRNA- 암호화 DNA 또는 RNP 복합체와 세포를 혼합하고 정의된 지속 시간 및 진폭의 1회 이상의 전기적 자극을 적용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 전기 천공을 통한 전달은, 카트리지, 챔버 또는 큐벳으로 혼합물을 공급하는 장치(예를 들어 펌프)에 연결된 용기에서 Cas9- 및/또는 gRNA- 암호화 DNA와 세포가 혼합되는 시스템을 사용하여 수행되며, 여기서 정의된 지속시간 및 진폭의 1회 이상의 전기적 자극이 적용되고, 이 후 세포가 제2 용기로 전달된다.
일부 구현예에서, 전달 비히클은 비-바이러스성 벡터이다. 일부 구현예에서, 비-바이러스성 벡터는 무기 나노입자이다. 예시적인 무기 나노 입자에는 예를 들어 자성 나노 입자(예를 들어 Fe3MnO2) 및 실리카가 포함된다. 나노입자의 외부 표면은 페이로드(payload)의 부착(예를 들어 접합 또는 포집)을 허용하는 양전하 중합체(예를 들어 폴리에틸렌이민, 폴리리신, 폴리세린)로 접합될 수 있다. 일부 구현예에서, 비-바이러스성 벡터는 유기 나노입자이다. 예시적인 유기 나노입자에는 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)로 코팅된 중성 헬퍼 지질과 함께 양이온 지질을 함유하는 SNALP 리포솜 및 지질로 코팅된 프로타민(protamine) 핵산 복합체가 포함된다. 예시적인 지질 및/또는 중합체는 공지되어 있으며 제공된 구현예에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 비히클은 표적 세포가 나노입자 및 리포솜의 갱신을 증가시키도록 표적화 변형, 예를 들어 세포 특이적 항원, 단클론성 항체, 단일 사슬 항체, 압타머, 중합체, 설탕 및 세포 침투성 펩티드(예를 들어 미국 출원 2016/0272999에 기재)를 갖는다. 일부 구현예에서, 비히클은 융합생성(fusogenic) 및 엔도솜 불안정화 펩티드/중합체를 사용한다. 일부 구현예에서, 비히클은 산 유발성 구조적 변화(예를 들어 카고의 엔도솜 탈출을 가속화하도록)를 겪는다. 일부 구현예에서, 예를 들어 세포 구획 내에서 방출을 위해 자극 절단 가능 중합체가 사용된다. 예를 들어 환원성 세포 환경에서 절단되는 이황화물 기반 양이온성 중합체를 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 전달 비히클은 생물학적 비-바이러스성 전달 비히클이다. 일부 구현예에서, 비히클은 약화된 세균(예를 들어 침투적이나 발병 및 전이 유전자의 발현을 방지하도록 약화된 자연적 또는 인위적으로 조작된, 예를 들어 Listeria monocytogenes, 특정 Salmonella 균주, Bifidobacterium longum 및 변형된 Escherichia coli), 특정 세포를 표적화하도록 영양 및 조직 특이적 친화성(tropism)을 갖는 세균, 표적 세포 특이성을 변경하도록 변형된 표면 단백질을 갖는 세균이다. 일부 구현예에서, 비히클은 유전자 변경 박테리오파지(예를 들어 대형 패키징 용량, 보다 작은 면역원성을 갖고, 포유류 플라스미드 보유 서열을 함유하고 통합된 표적화 리간드를 갖는 조작된 파지)이다. 일부 구현예에서, 비히클은 포유류 바이러스 유사 입자이다. 예를 들어 변형된 바이러스 입자는 (예를 들어 "빈(empty)"입자의 정제 후 원하는 카고를 갖는 바이러스의 생체 외 조립에 의해) 생성될 수 있다. 비히클은 또한 표적화 리간드를 통합하도록 조작되어 표적 조직 특이성이 변경될 수 있다. 일부 구현예에서, 비히클은 생물학적 리포솜(liposome)이다. 예를 들어 생물학적 리포솜은 인간 세포, 예를 들어 대상체로부터 유래된 구형 구조로 파괴된 적혈구인 적혈구 고스트 유래 인지질계 입자(예를 들어 조직 표적화는 다양한 조직 또는 세포 특이적 리간드의 부착에 의해 달성될 수 있음) 또는 분비성 엑소좀 - 식균 작용 기원의 대상체 유래 막 결합 나노소포체(30-100 nm)(예를 들어 다양한 세포 유형에서 제조될 수 있고 따라서 표적화 리간드 필요없이 세포에 의해 흡수될 수 있음)이다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자를 암호화하는 RNA는 공지된 방법에 의해 또는 여기에 기재된 바와 같이 세포, 예를 들어 여기에 기재된 표적 세포로 전달될 수 있다. 예를 들어 Cas9 암호화 및/또는 gRNA 암호화 RNA는, 예를 들어 미세 주입법, 전기 천공, 일시적인 세포 압축 또는 압착(예를 들어 문헌[Lee, 등, (2012) Nano Lett 12: 6322-27)]에 기재된 바와 같음), 지질 매개 형질 감염, 펩티드 매개 전달 또는 이의 조합물에 의해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 전기 천공을 통한 전달은 카트리지, 챔버 또는 큐벳에서 Cas9 분자를 암호화하는 RNA 및/또는 gRNA 분자를 세포와 혼합하고 정의된 지속 시간 및 진폭의 1회 이상의 전기적 자극을 적용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 전기 천공을 통한 전달은, 카트리지, 챔버 또는 큐벳으로 혼합물을 공급하는 장치(예를 들어 펌프)에 연결된 용기에서 Cas9 분자를 암호화하는 RNA 및/또는 gRNA 분자가 세포와 혼합되는 시스템을 사용하여 수행되며, 여기서 정의된 지속시간 및 진폭의 1회 이상의 전기적 자극이 적용되고, 이 후 세포는 제2 용기로 전달된다.
일부 구현예에서, Cas9 분자는 공지된 방법에 의해 또는 여기에 기재된 바와 같이 세포로 전달될 수 있다. 예를 들어 Cas9 단백질 분자는, 예를 들어 미세 주입법, 전기 천공, 일시적인 세포 압축 또는 압착(예를 들어 문헌[Lee, 등, (2012) Nano Lett 12: 6322-27)]에 기재된 바와 같음), 지질 매개 형질 감염, 펩티드 매개 전달 또는 이의 조합물에 의해 전달될 수 있다. 전달은 gRNA를 암호화하는 DNA 또는 gRNA를 동반할 수 있다.
일부 구현예에서, 전기 천공을 통한 전달은 카트리지, 챔버 또는 큐벳에서 gRNA 분자를 갖는 Cas9 분자 또는 gRNA 분자를 갖지 않는 Cas9 분자와 세포를 혼합하고 정의된 지속 시간 및 진폭의 1회 이상의 전기적 자극을 적용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 전기 천공을 통한 전달은, 카트리지, 챔버 또는 큐벳으로 혼합물을 공급하는 장치(예를 들어 펌프)에 연결된 용기에서 gRNA 분자를 갖는 Cas9 분자 또는 gRNA 분자를 갖지 않는 Cas9 분자와 세포가 혼합되는 시스템을 사용하여 수행되며, 여기서 정의된 지속시간 및 진폭의 1회 이상의 전기적 자극이 적용되고, 이 후 세포는 제2 용기로 전달된다.
일부 구현예에서, 이의 제제(들) 및/또는 성분을 함유하는 폴리뉴클레오티드가 벡터 및 비-벡터 기반 방법의 조합에 의해 전달된다. 예를 들어 비로솜(virosome)은 불활성화 바이러스(예를 들어 HIV 또는 인플루엔자 바이러스)와 결합된 리포솜을 포함하며, 이는 바이러스 방법 또는 리포솜 방법 중 어느 하나 단독보다 더 효율적인 유전자 전달을 초래할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 이의 제제(들) 및/또는 성분이 세포로 전달된다. 예를 들어 일부 구현예에서, 게놈, 예를 들어 TRAC 및/또는 β2M 유전자 좌에서 2 이상의 위치의 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들)가 세포로 전달된다. 일부 구현예에서, 이의 제제(들) 및 성분이 한가지 방법을 사용하여 전달된다. 예를 들어 일부 구현예에서, TRAC 및/또는 β2M 유전자 좌의 유전자 파괴를 유도하는 제제(들)는 유전자 파괴를 위한 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서 전달된다. 일부 구현예에서, 하나의 폴리뉴클레오티드는 TRAC 및/또는 β2M 유전자 좌를 표적화하는 제제를 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 2 이상의 상이한 폴리뉴클레오티드는 TRAC 및/또는 β2M 유전자 좌를 표적화하는 제제를 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체로서 전달될 수 있고, 2 이상의 상이한 RNP 복합체는 혼합물로서 함께 또는 개별적으로 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들) 및/또는 이의 성분, 예를 들어 Cas9 분자 성분 및/또는 gRNA 분자 성분이 아닌 하나 이상의 핵산 분자, 예를 들어 HDR-지시 통합을 위한 주형 폴리뉴클레오티드(예를 들어 여기 섹션 I.B.에 기재됨)가 전달된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자, 예를 들어 주형 폴리 뉴클레오티드는 Cas 시스템의 하나 이상의 성분과 동시에 전달된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 Cas 시스템의 하나 이상의 성분이 전달되기 전 또는 후(예를 들어 약 1 분, 5 분, 10 분, 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 6 시간, 9 시간, 12 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 1 주, 2 주 또는 4 주 미만)에 전달된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오티드는 Cas 시스템의 하나 이상의 성분, 예를 들어 Cas9 분자 성분 및/또는 gRNA 분자 성분과 상이한 수단에 의해 전달된다. 핵산 분자, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오티드는 여기에 기재된 임의의 전달 방법에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어 핵산 분자, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스에 의해 전달될 수 있고, Cas9 분자 성분 및/또는 gRNA 분자 성분은 전기 천공에 의해 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 전이 유전자, 예를 들어 재조합 TCR, 재조합 CAR 및/또는 다른 유전자 생성물을 암호화하는 전이 유전자를 포함한다.
d. CD3+ T 세포의 고갈
일부 구현예에서, CD57 고갈된 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단(예를 들어 T 세포 집단 또는 풀링된 T 세포 집단)은 T-세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분을 암호화하는 하나 이상의 유전자에 대해 녹아웃된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 유전자는 T 세포 수용체 알파 불변(T cell receptor alpha constant; TRAC)이다. 일부 구현예에서, TRAC 녹아웃은 TCR 복합체의 형성, 및 그에 의한 CD3 세포 표면 발현을 파괴하여, TRAC에 대해 녹아웃된 세포는 CD3의 세포 표면 발현을 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, TRAC에 대해 녹아웃된 CD57 고갈된 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단은 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 의해 CD3+ 세포의 고갈에 적용된다. 일부 구현예에서, CD3+ 세포의 고갈은 CD3을 여전히 발현하는 CD57 고갈된 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단의 편집되지 않은 세포를 제거한다. CD3+ 세포는 CD3-음성 선택에 의해 T 세포 집단으로부터 고갈되어 CD3- T 세포에 대해 99% 순도를 갖는 T 세포 집단을 생산할 수 있다는 것이 본원에서 관찰된다. 이러한 방법은 동종이계 대상체에게 투여되는 경우에 생성된 T 세포 집단이 TCR-매개된 이식편-대-숙주 질환(graft-versus-host disease; GvHD)을 유발하지 않을 가능성을 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, CD3 고갈된 집단(CD3 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD3 고갈된 T 세포 집단)은 TCR 또는 그의 성분을 암호화하는 하나 이상의 유전자에 대해 녹아웃된 CD57 고갈된 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단으로부터 CD3+ 세포를 고갈시킴으로써 수득된다. 예를 들어 일부 구현예에서, TCR 또는 그의 성분(예를 들어 TRAC)을 암호화하는 하나 이상의 유전자에 대해 녹아웃된 CD57 고갈된 T 세포 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 CD3+ 세포의 고갈이다. 일부 구현예에서, TCR 또는 그의 성분 (예를 들어 TRAC)을 암호화하는 하나 이상의 유전자에 대해 녹아웃된 CD27 농축된 T 세포 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 CD3+ 세포의 고갈이다.
일부 구현예에서, 개별 공여자 유래 공여자 샘플은 CD57- T 세포에 대해 농축되고, TCR 또는 그의 성분(예를 들어 TRAC)을 암호화하는 하나 이상의 유전자에 대해 녹아웃되어 녹아웃된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생산하고, 이는 후속적으로 CD3+ 세포(CD3 고갈된 T 세포 집단)가 고갈된다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 개별 공여자로부터의 TCR 또는 그의 성분(예를 들어 TRAC)을 암호화하는 하나 이상의 유전자에 대해 녹아웃된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 조합되어 풀링된 녹아웃된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생산하고, 이는 후속적으로 CD3+ 세포(풀링된 CD3 고갈된 T 세포 집단)가 고갈된다. 일부 구현예에서, 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자로부터의 공여자 샘플은 CD57- T 세포에 대해 농축되고, TCR 또는 그의 성분(예를 들어 TRAC)을 암호화하는 하나 이상의 유전자에 대해 녹아웃되어 풀링된 녹아웃된 CD57- T 세포 집단을 생산한다.
특정 구현예에서, CD3+ T 세포는 녹아웃된 CD57 고갈된 T 세포 집단으로부터 제거, 분리 또는 고갈된다. 특정 구현예에서, 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 99.9%의 CD3+ T 세포가 녹아웃된 CD57 고갈된 T 세포 집단으로부터 제거, 분리 또는 고갈된다.
일부 구현예에서, CD3 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD3 고갈된 T 세포 집단은 예를 들어 선택, 분리 또는 농축 전에 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 CD3+ T 세포를 약 또는 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01% 또는 0.001% 미만으로 함유한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD3 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD3 고갈된 T 세포 집단은 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단의 CD3+ T 세포를 약 또는 20% 미만으로 함유한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD3 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD3 고갈된 T 세포 집단은 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단의 CD3+ T 세포를 약 또는 5% 미만으로 함유한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD3 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD3 고갈된 T 세포 집단은 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57 고갈된 T 세포 집단의 CD3+ T 세포를 약 또는 1% 미만으로 함유한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD3-고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD3-고갈된 T 세포 집단은 풀링된 CD57-고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57-고갈된 T 세포 집단의 CD3+ T 세포를 약 또는 0.1% 미만으로 함유한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD3-고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD3-고갈된 T 세포 집단은 풀링된 CD57-고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57-고갈된 T 세포 집단의 CD3+ T 세포를 약 또는 0.01% 미만으로 함유한다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD3-고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD3-고갈된 T 세포 집단에서 CD3+ T 세포의 빈도는 풀링된 CD57-고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57-고갈된 T 세포 집단에서 CD3+ T 세포의 빈도의 약 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1%, 또는 0.1% 미만이다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD3-고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD57-고갈된 T 세포 집단은 (약) 3% 미만, (약) 2% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만, 또는 (약) 0.01% 미만의 CD3+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD3-고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD3-고갈된 T 세포 집단은 CD3+ T 세포가 없거나 또는 본질적으로 없다.
일부 구현예에서, 개별 공여자 유래 공여자 샘플은 CD27+ T 세포에 대해 농축되고, TCR 또는 그의 성분(예를 들어 TRAC)을 암호화하는 하나 이상의 유전자에 대해 녹아웃되어, 녹아웃된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생산하고, 이는 후속적으로 CD3+ 세포(CD3-고갈된 T 세포 집단)가 고갈된다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 개별 공여자로부터의 TCR 또는 그의 성분(예를 들어 TRAC)을 암호화하는 하나 이상의 유전자에 대해 녹아웃된 CD27 농축된 T 세포 집단은 조합되어, 풀링된 녹아웃된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생산하고, 이는 후속적으로 CD3+ 세포(풀링된 CD3-고갈된 T 세포 집단)가 고갈된다. 일부 구현예에서, 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자로부터의 공여자 샘플은 CD27+ T 세포에 대해 농축되고, TCR 또는 그의 성분(예를 들어 TRAC)을 암호화하는 하나 이상의 유전자에 대해 녹아웃되어, 풀링된 녹아웃된 CD27+ T 세포 집단을 생산한다.
특정 구현예에서, CD3+ T 세포는 녹아웃된 CD27 농축된 T 세포 집단으로부터 제거되거나, 분리되거나, 또는 고갈된다. 특정 구현예에서, 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 99.9%의 CD3+ T 세포는 녹아웃된 CD27 농축된 T 세포 집단으로부터 제거되거나, 분리되거나, 또는 고갈된다.
일부 구현예에서, CD3 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD3 고갈된 T 세포 집단은 예를 들어 선택, 분리 또는 농축 전에 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 CD3+ T 세포를 약 또는 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01%, 또는 0.001% 미만 함유한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD3 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD3 고갈된 T 세포 집단은 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단의 CD3+ T 세포를 약 또는 20% 미만 함유한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD3 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD3 고갈된 T 세포 집단은 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단의 CD3+ T 세포를 약 또는 5% 미만 함유한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD3 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD3 고갈된 T 세포 집단은 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단의 CD3+ T 세포를 약 또는 1% 미만 함유한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD3 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD3 고갈된 T 세포 집단은 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단의 CD3+ T 세포를 약 또는 0.1% 미만 함유한다. 특정 구현예에서, 풀링된 CD3 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD3 고갈된 T 세포 집단은 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단의 CD3+ T 세포를 약 또는 0.01% 미만 함유한다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD3 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD3 고갈된 T 세포 집단 내의 CD3+ T 세포의 빈도는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단 내의 CD3+ T 세포의 빈도의 약 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1%, 또는 0.1% 미만이다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD3 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 3% 미만, (약) 2% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만, 또는 (약) 0.01% 미만의 CD3+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD3 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD3 고갈된 T 세포 집단은 CD3+ T 세포가 없거나 본질적으로 없다.
일부 구현예에서, 풀링된 CD3 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD3 고갈된 T 세포 집단은 분리, 선택 및/또는 농축 후에 동결, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 보호된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD3-CD4+ T 세포의 집단은 분리, 선별 및/또는 농축 후에 냉동, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 보호된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD3-CD8+ T 세포의 집단은 분리, 선별 및/또는 농축 후에 냉동, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 보호된다. 일부 구현예에서, 풀링된 CD3 고갈된 T 세포 집단 및/또는 CD3 고갈된 T 세포 집단은 세포의 집단을 증폭, 수확 및/또는 제형화하는 임의의 단계 전에 냉동, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 보호된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD3-CD4+ T 세포의 집단은 세포의 집단을 배양, 증폭, 수확 및/또는 제형화하는 임의의 단계 전에 냉동, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 보호된다. 일부 구현예에서, 농축된 CD3-CD8+ T 세포의 집단은 세포의 집단을 배양, 증폭, 수확 및/또는 제형화하는 임의의 단계 전에 냉동, 예를 들어 동결 보존 및/또는 동결 보호된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 동결 보호된 투입 조성물은 예를 들어 (약) -80℃에서 12 시간 내지 7 일, 24 시간 내지 120 시간, 또는 2 일 내지 5 일 동안 저장된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 동결 보호된 투입 조성물은 10 일, 9 일, 8 일, 7 일, 6 일, 또는 5 일, 4 일, 3 일, 2 일, 또는 1 일 미만의 시간 동안 (약) -80℃에서 저장된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 동결 보호된 투입 조성물은 3 일 미만 동안, 예를 들어 약 2 일 동안 약 -70℃ 또는 -80℃에서 저장된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 특정 세포 유형 또는 세포 집단을 지칭할 때 "고갈" 또는 "제거"는 예를 들어 조성물의 총 세포 수 또는 부피와 비교하여, 또는 다른 세포 유형에 비해, 예를 들어 집단 또는 세포에 의해 발현된 마커에 기초한 음성 선별에 의해, 또는 고갈될 세포 집단 또는 세포 상에 존재하지 않는 마커에 기초한 양성 선별에 의해 세포 유형 또는 집단의 수 또는 백분율을 감소시키는 것을 지칭한다. 일반적으로, 용어 고갈 또는 제거는 조성물로부터 세포, 세포 유형 또는 집단의 완전한 제거를 필요로 하지 않는다. 일부 구현예에서, CD3+ 세포는 섹션 II.D에 기재된 임의의 방법에 의해 고갈된다.
3. 유전자 조작된 세포의 예시적 특징
특정 구현예에서, 상기 제공된 방법은 CD57- T 세포에 대해 농축된 유전자 조작된 T 세포의 조성물을 생산한다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 방법은 CD27+ T 세포에 대해 농축된 유전자 조작된 T 세포의 조성물을 생산한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 개별 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 개별 공여자로부터의 조작된 T 세포 조성물은 하나 이상의 다른 개별 공여자로부터의 조작된 T 세포 조성물과 조합되어 복수의 상이한 공여자로부터의 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생산한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자로부터의 풀링된 조작된 T 세포 조성물이다.
일부 구현예에서, 제공된 세포 및 방법은 2M의 발현이 제거되거나 감소되는 것을 포함하며, 이는 일부 경우에, MHC 부류 I의 감소된 표면 발현을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, β2M의 발현을 조절하는 조절 분자 또는 유전자의 발현은 세포에서 감소, 파괴, 결실 또는 제거를 위해 표적화된다. 일부 경우에, β2M 유전자는 β2M 유전자의 발현을 억제, 파괴, 결실 또는 제거하는 제제를 사용하여 직접 표적화된다. 일부 구현예에서, 제공된 세포 및 방법은 β2M이 억제 또는 파괴되지 않은 참조 또는 상응하는 세포와 비교하여 내인성 β2M의 발현의 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 이하를 갖는 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 세포는 β2M에 대해 감소 또는 파괴된다. 일부 측면에서, 조성물 중 적어도 (약) 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 세포가 β2M 또는 β2M의 발현을 조절하는 조절 분자 또는 유전자의 발현의 유전자 파괴 또는 감소를 함유하는 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, β2M 또는 β2M 유전자의 발현을 조절하는 유전자는 파괴된다. 일부 구현예에서, 조성물 중 세포 또는 복수의 세포(예를 들어 (약) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 초과)는 유전자 파괴를 함유하고, 내인성 β2M 유전자 또는 β2M의 발현을 조절하는 조절 분자를 발현하지 않고, 인접 β2M 유전자 또는 β2M의 발현을 조절하는 조절 분자의 유전자를 함유하지 않고/않거나 β2M 또는 β2M의 발현을 조절하는 조절 분자를 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물 중 세포 또는 복수의 세포(예를 들어 세포의 조성물 중 적어도 또는 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 초과)는 β2M 유전자 또는 β2M의 발현을 조절하는 조절 분자의 유전자의 대립유전자 둘 다에서 녹아웃되거나 파괴되며, 즉 이러한 백분율의 세포에서 이중대립유전자 결실(biallelic deletion)을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제공된 세포 및 방법은 TRAC의 발현이 제거되거나 감소되는 것을 포함하며, 이는 일부 경우에, TCR의 감소된 표면 발현을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 TRAC의 발현을 조절하는 조절 분자 또는 유전자의 발현은 세포에서 감소, 파괴, 결실 또는 제거를 위해 표적화된다. 일부 경우에, 상기 TRAC 유전자는 TRAC 유전자의 발현을 억제, 파괴, 결실 또는 제거하는 제제를 사용하여 직접 표적화된다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 세포 및 방법은 TRAC가 억제 또는 파괴되지 않은 참조 또는 상응하는 세포와 비교하여 내인성 TRAC의 발현의 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 이하를 갖는 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 세포는 TRAC에 대해 감소 또는 파괴된다. 일부 측면에서, 조성물 중 적어도 (약) 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 세포가 TRAC의 유전자 파괴 또는 TRAC의 발현 또는 TRAC의 발현을 조절하는 조절 분자 또는 유전자의 발현의 감소를 함유하는 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, TRAC 또는 TRAC 유전자의 발현을 조절하는 유전자는 파괴된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물 중 세포 또는 복수의 세포(예를 들어 (약) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 초과)는 유전자 파괴를 함유하고, 내인성 TRAC 유전자 또는 TRAC의 발현을 조절하는 조절 분자를 발현하지 않고, 인접 TRAC 유전자 또는 TRAC의 발현을 조절하는 조절 분자의 유전자를 함유하지 않고/않거나 TRAC 또는 TRAC의 발현을 조절하는 조절 분자를 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 조성물 중 세포 또는 복수의 세포(예를 들어 세포의 조성물 중 적어도 또는 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 초과)는 TRAC 유전자 또는 TRAC의 발현을 조절하는 조절 분자의 유전자 둘 다의 대립유전자에서 녹아웃 또는 파괴되고, 즉 이러한 백분율의 세포에서 이중대립유전자 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제공된 세포 및 방법은 CD3의 세포 표면 발현이 제거 또는 감소되는 것을 포함하고, 이는 일부 경우에 TCR의 감소된 표면 발현을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 세포 및 방법은 CD3+ 세포가 고갈되지 않은 참조 또는 상응하는 세포 집단과 비교하여 CD3의 세포 표면 발현을 나타내는 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 더 적은 세포를 갖는 세포 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 세포는 CD3 세포 표면 발현에 대해 감소 또는 제거된다. 일부 측면에서, 상기 조성물 중 적어도 (약) 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 세포가 CD3을 발현하지 않는 조성물이 제공된다.
표적 유전자의 넉 다운 또는 녹아웃을 입증하거나 확인하기 위한 임의의 다양한 공지된 방법이 이용될 수 있다. 이러한 방법의 예는 노던 블롯팅(northern blotting), RT-PCR 또는 qRT-PCR을 비롯한 PCR, 증식 검정, 리포터 검정 또는 단백질 검출 방법(예를 들어 암호화된 단백질의 표면 염색에 대한 유세포 분석법)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 발현 수준 또는 정도는 표준 절차를 통해 결정될 수 있다. 조절 분자 또는 유전자가 억제되거나 파괴된 정도, 뿐만 아니라 MHC 및/또는 TCR 분자(또는 MHC 분자의 모든 대립유전자 또는 단상형)의 발현이 영향을 받거나 감소된 정도를 실험적으로 결정하거나 확인하는 것은 당업자의 수준 내에 있다. 일부 구현예에서, 면역친화도 시약은 세포를 선택하거나 확인하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 특정 MHC 및/또는 TRC 발현은 유세포 분석에 의해 확인된다. 일부 경우에, 하나 초과의 MHC 대립유전자, 예를 들어 특정 MHC 클래스(들)를 일반적으로 인식하는 광범위하게 반응성인 또는 단일형인 항체가 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 대립유전자 특이적 항체가 사용될 수 있다. 세포에 의해 발현된 특정 내인성 MHC 및/또는 원하는 MHC 검출의 특이성에 따라 특정 항체를 선택하는 것은 당업자의 수준 내에 있다. 항-HLA 항체를 비롯한 다양한 항-MHC 항체는 당업계에 널리 공지되어 있고, 상업적 및 사적 공급원으로부터 입수가능하다. 다양한 항-TCR 항체는 당업계에 널리 공지되어 있고, 상업적 및 사적 공급원으로부터 입수가능하다.
F. 자극
CD57-농축된 T 세포 집단, 예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 또는 풀링된 CD57 결실된 T 세포 집단을 자극하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 CD57 고갈된 T 세포 집단을 자극하여 자극된 T 세포 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 자극된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 하나 이상의 다른 개별 공여자로부터의 자극된 CD57 고갈된 T 세포 집단과 조합하여 복수의 상이한 공여자로부터의 자극된 T 세포 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자로부터의 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 자극하여 복수의 상이한 공여자로부터 자극된 T 세포 집단을 생산한다.
또한, CD27+ 농축된 T 세포 집단, 예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 자극하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 CD27 농축된 T 세포 집단을 자극하여 자극된 T 세포 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 자극된 CD27 농축된 T 세포 집단을 하나 이상의 다른 개별 공여자로부터의 자극된 CD27 농축된 T 세포 집단과 조합하여 복수의 상이한 공여자로부터의 자극된 T 세포 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자로부터의 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 자극하여 복수의 상이한 공여자로부터의 자극된 T 세포 집단을 생산한다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 조성물의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포를 자극하는 것과 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 조성물의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포를 자극하는 것과 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 세포, 예를 들어 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에서 신호, 예를 들어 TCR 및/또는 보조수용체(coreceptor)로부터 생성된 신호를 활성화 또는 자극하고/하거나 활성화 또는 자극할 수 있는 조건을 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 세포를 자극 시약, 예를 들어 세포를 활성화 또는 자극하고/하거나 활성화 또는 자극할 수 있는 시약으로 및/또는 그의 존재 하에 세포를 배양(culturing)하는 단계, 컬티베이팅(cultivating)하는 단계, 인큐베이팅(incubating)하는 단계, 활성화(activating)하는 단계, 증식(propagating)시키는 단계 중의 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 TCR 및/또는 보조수용체를 자극하고/하거나 활성화시킨다. 특정 구현예에서, 자극 시약은 섹션 IIE.1.에 기재된 시약이다.
특정 구현예에서, CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 세포를 유전자 조작(예를 들어 넉킹 인(knock in) 및/또는 녹아웃(kncking out))하기 전에, 예를 들어 섹션 II.D.에 제공된 기술에 의해 세포를 형질감염시키고/시키거나 형질도입하기 전에 자극 조건 하에 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57- T 세포의 하나 이상의 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 하나 이상의 조성물이 생물학적 샘플(예를 들어 공여자 샘플)로부터 분리, 선택, 농축 또는 수득된 후에 자극 조건 하에 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57- T 세포의 하나 이상의 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 이전에 동결 보존 및 저장되었고, 인큐베이션 전에 해동된다. 일부 구현예에서, 해동된 집단은 개별 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 해동된 집단은 하나 이상의 다른 개별 공여자로부터의 해동된 집단과 조합되어 복수의 공여자로부터의 해동된 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 해동된 집단은 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다.
특정 구현예에서, 농축된 CD57- T 세포의 하나 이상의 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은, 농축된 CD57- T 세포의 2개의 별개의 집단이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 T 세포의 2개의 별개의 조성물, 예를 들어 동일한 생물학적 샘플(예를 들어 공여자 샘플)로부터 선택, 분리 및/또는 농축된 농축된 T 세포의 2개의 별개의 조성물은 자극 조건 하에 별도로 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 2개의 별개의 조성물은 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, 2개의 별개의 조성물은 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, 2개의 별개의 조성물은 CD57-CD3+ T 세포의 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 2개의 별개의 조성물은 자극 조건 하에 별도로 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 단일 조성물은 자극 조건 하에 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 단일 조성물은 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 조성물이다. 특정 구현예에서, 단일 조성물은 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 조성물이다. 특정 구현예에서, 단일 조성물은 농축된 CD57-CD3+ T 세포의 조성물이다. 일부 구현예에서, 상기 단일 조성물은 인큐베이션 전에 별개의 조성물로부터 조합된 농축된 CD57-CD4+ 및 CD57-CD8+ T 세포의 조성물이다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 농축된 CD57- T 세포의 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 제공된 방법은 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단을 자극하기 위한 하나 이상의 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 제공된 방법은 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 자극하기 위한 하나 이상의 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단 및 농축된 CD57- CD8+ T 세포의 집단은 예를 들어 자극 조건, 예를 들어 섹션 II.E.에 기재된 임의의 자극 조건 하에 세포를 인큐베이션함으로써 자극된다. 특정 구현예에서, 자극 조건은 자극 시약의 존재이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 별개의 집단 및 농축된 CD57- CD8+ T 세포의 별개의 집단은 개별적으로 자극된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 별개의 집단은 농축된 CD57-CD4+ T 세포 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 조합된 조성물이 자극되도록 자극되기 전에 조합되거나 혼합된다.
특정 구현예에서, T 세포를 자극하는 방법 또는 공정은 공여자 샘플로부터 CD57+ 세포를 선택하거나 제거하는 단계, 및 이어서 CD57에 대해 음성적으로 선택된 집단으로부터 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 개별적으로 선택하여, 예를 들어 농축된 CD57-CD4+ T 세포 집단 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포 집단을 생산하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 별개의 집단은 자극 조건 하에 개별적으로 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ T 세포 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 별개의 집단은 자극 조건 하에 개별적으로 인큐베이션되는 것과 같이 조합된다. 일부 구현예에서, 자극은 자극 시약의 존재를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 시약은 항-CD3 및 항-CD28 항체 접합된 상자성 비드(paramagnetic bead)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 시약은 가역적으로 결합된 항-CD3 및 항-CD28 Fab를 갖는 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머 입자(streptavidin mutein oligomeric particle)이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 자극 조건 하에 인큐베이션되는 CD57-CD4+ T 세포의 집단은 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 65%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 75%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 85%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 98%, 적어도 (약) 99%, 적어도 (약) 99.5%, 적어도 (약) 99.9%, 또는 적어도 (약) 100%의 CD57-CD4+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건 하에 인큐베이션되는 CD57-CD4+ T 세포의 조성물은 CD57 발현에 양성이거나 또는 CD4 발현에 음성인 (약) 40% 미만, (약) 35% 미만, (약) 30% 미만, (약) 25% 미만, (약) 20% 미만, (약) 15% 미만, (약) 10% 미만, (약) 5% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1%, 또는 (약) 0.01% 미만의 T 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, 자극 조건하에서 배양되는 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단은 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 65%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 75%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 85%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 98%, 적어도 (약) 99%, 적어도 (약) 99.5%, 적어도 (약) 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD57-CD8+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건하에서 배양되는 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 조성물은 (약) 40% 미만, (약) 35% 미만, (약) 30% 미만, (약) 25% 미만, (약) 20% 미만, (약) 15% 미만, (약) 10% 미만, (약) 5% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만, 또는 (약) 0.01% 미만의 CD57 발현에 양성 또는 CD8 발현에 음성인 T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건하에서 배양되는 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 조성물은 (약) 40% 미만, (약) 35% 미만, (약) 30% 미만, (약) 25% 미만, (약) 20% 미만, (약) 15% 미만, (약) 10% 미만, (약) 5% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만, 또는 (약) 0.01% 미만의 CD57 발현에 양성 또는 CD8 발현에 음성인 T 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, 자극 조건하에서 배양되는 농축된 CD57-CD3+ T 세포의 집단은 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 65%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 75%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 85%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 98%, 적어도 (약) 99%, 적어도 (약) 99.5%, 적어도 (약) 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD57-CD3+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건하에서 배양되는 농축된 CD57-CD3+ T 세포의 조성물은 (약) 40% 미만, (약) 35% 미만, (약) 30% 미만, (약) 25% 미만, (약) 20% 미만, (약) 15% 미만, (약) 10% 미만, (약) 5% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만, 또는 (약) 0.01% 미만의 CD57 발현에 양성 또는 CD3 발현에 음성인 T 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, 농축된 CD57-CD4+ 및 CD57-CD8+ T 세포의 별도 조성물은 단일 조성물로 조합되고 자극 조건 하에 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션이 수행되고/되거나 완료된 후 농축된 CD57-CD4+ 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 개별 자극된 조성물이 단일 조성물로 조합된다.
특정 구현예에서, CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 세포를 유전자 조작(예를 들어 넉킹 인 및/또는 녹아웃)하기 전에, 예를 들어 섹션 II.D.에 제공된 기술에 의해 세포를 형질감염시키고/시키거나 형질도입하기 전에 자극 조건 하에 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD27+ T 세포의 하나 이상의 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 하나 이상의 조성물이 생물학적 샘플(예를 들어 공여자 샘플)로부터 분리, 선택, 농축 또는 수득된 후에 자극 조건 하에 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD27+ T 세포의 하나 이상의 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은 이전에 동결 보존 및 저장되었고, 인큐베이션 전에 해동된다. 일부 구현예에서, 해동된 집단은 개별 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 해동된 집단은 하나 이상의 다른 개별 공여자로부터의 해동된 집단과 조합되어 복수의 공여자로부터의 해동된 집단을 생산한다. 일부 구현예에서, 해동된 집단은 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다.
특정 구현예에서, 농축된 CD27+ T 세포의 하나 이상의 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)은, 농축된 CD27+ T 세포의 2개의 별개의 집단이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 농축된 T 세포의 2개의 별개의 조성물, 예를 들어 동일한 생물학적 샘플(예를 들어 공여자 샘플)로부터 선택, 분리 및/또는 농축된 농축된 T 세포의 2개의 별개 조성물은 자극 조건 하에 별도로 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 2개의 별개의 조성물은 농축된 CD27+CD4+ T 세포의 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, 2개의 별개의 조성물은 농축된 CD27+CD8+ T 세포의 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, 2개의 별개의 조성물은 CD27+CD3+ T 세포의 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 농축된 CD27+CD4+ T 세포 및 농축된 CD27+CD8+ T 세포의 2개의 별개의 조성물은 자극 조건 하에 별도로 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 단일 조성물은 자극 조건 하에 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 단일 조성물은 농축된 CD27+CD4+ T 세포의 조성물이다. 특정 구현예에서, 단일 조성물은 농축된 CD27+CD8+ T 세포의 조성물이다. 특정 구현예에서, 단일 조성물은 농축된 CD27+CD3+ T 세포의 조성물이다. 일부 구현예에서, 상기 단일 조성물은 인큐베이션 전에 별개의 조성물로부터 조합된 농축된 CD27+CD4+ 및 CD27+CD8+ T 세포의 조성물이다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 농축된 CD27+ T 세포의 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 제공된 방법은 농축된 CD27+CD4+ T 세포의 집단을 자극하기 위한 하나 이상의 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 제공된 방법은 농축된 CD27+CD8+ T 세포의 집단을 자극하기 위한 하나 이상의 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD27+CD4+ T 세포의 집단 및 농축된 CD27+CD8+ T 세포의 집단은 예를 들어 자극 조건, 예를 들어 섹션 II.E.에 기재된 임의의 자극 조건 하에 세포를 인큐베이션함으로써 자극된다. 특정 구현예에서, 자극 조건은 자극 시약의 존재이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD27+CD4+ T 세포의 별개의 집단 및 농축된 CD27+CD8+ T 세포의 별개의 집단은 개별적으로 자극된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD27+CD4+ T 세포 및 농축된 CD27+CD8+ T 세포의 별개의 집단은 농축된 CD27+CD4+ T 세포 및 농축된 CD27+CD8+ T 세포의 조합된 조성물이 자극되도록 자극되기 전에 조합되거나 혼합된다.
특정 구현예에서, T 세포를 자극하는 방법 또는 공정은 공여자 샘플로부터 CD27- 세포를 선택하거나 제거하는 단계, 및 이어서 CD27에 대해 음성적으로 선택된 집단으로부터 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 개별적으로 선택하여, 예를 들어 농축된 CD27+CD4+ T 세포 집단 및 농축된 CD27+CD8+ T 세포 집단을 생산하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD27+CD4+ T 세포 및 농축된 CD27+CD8+ T 세포의 별개의 집단은 자극 조건 하에 개별적으로 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD27+CD4+ T 세포 및 농축된 CD27+CD8+ T 세포의 별개의 집단은 자극 조건 하에 개별적으로 인큐베이션되는 것과 같이 조합된다. 일부 구현예에서, 자극은 자극 시약의 존재를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 시약은 항-CD3 및 항-CD28 항체 접합된 상자성 비드(paramagnetic bead)이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 시약은 가역적으로 결합된 항-CD3 및 항-CD28 Fab를 갖는 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머 입자(streptavidin mutein oligomeric particle)이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 자극 조건 하에 인큐베이션되는 CD27+CD4+ T 세포의 집단은 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 65%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 75%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 85%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 98%, 적어도 (약) 99%, 적어도 (약) 99.5%, 적어도 (약) 99.9%, 또는 적어도 (약) 100%의 CD27+CD4+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건 하에 인큐베이션되는 CD27+CD4+ T 세포의 조성물은 CD27 발현에 음성이거나 또는 CD4 발현에 음성인 (약) 40% 미만, (약) 35% 미만, (약) 30% 미만, (약) 25% 미만, (약) 20% 미만, (약) 15% 미만, (약) 10% 미만, (약) 5% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1%, 또는 (약) 0.01% 미만의 T 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, 자극 조건하에서 배양되는 농축된 CD27+CD8+ T 세포의 집단은 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 65%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 75%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 85%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 98%, 적어도 (약) 99%, 적어도 (약) 99.5%, 적어도 (약) 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD27+CD8+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건하에서 배양되는 농축된 CD27+CD4+ T 세포의 조성물은 (약) 40% 미만, (약) 35% 미만, (약) 30% 미만, (약) 25% 미만, (약) 20% 미만, (약) 15% 미만, (약) 10% 미만, (약) 5% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만, 또는 (약) 0.01% 미만의 CD57 발현에 양성 또는 CD8 발현에 음성인 T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건하에서 배양되는 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 조성물은 (약) 40% 미만, (약) 35% 미만, (약) 30% 미만, (약) 25% 미만, (약) 20% 미만, (약) 15% 미만, (약) 10% 미만, (약) 5% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만, 또는 (약) 0.01% 미만의 CD57 발현에 양성 또는 CD8 발현에 음성인 T 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, 자극 조건하에서 배양되는 농축된 CD27+CD3+ T 세포의 집단은 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 65%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 75%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 85%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 98%, 적어도 (약) 99%, 적어도 (약) 99.5%, 적어도 (약) 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD27+CD3+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건하에서 배양되는 농축된 CD27+CD3+ T 세포의 조성물은 (약) 40% 미만, (약) 35% 미만, (약) 30% 미만, (약) 25% 미만, (약) 20% 미만, (약) 15% 미만, (약) 10% 미만, (약) 5% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만, 또는 (약) 0.01% 미만의 CD57 발현에 음성 또는 CD3 발현에 음성인 T 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, 농축된 CD27+CD4+ 및 CD27+CD8+ T 세포의 별도 조성물은 단일 조성물로 조합되고 자극 조건 하에 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션이 수행되고/되거나 완료된 후 농축된 CD27+CD4+ 및 농축된 CD27+CD8+ T 세포의 개별 자극된 조성물이 단일 조성물로 조합된다.
일부 구현예에서, 자극 조건 하의 인큐베이션은, 배양(culture, cultivation), 자극, 활성화, 번식, 예를 들어 자극 조건의 존재 하에 인큐베이션, 예를 들어 증식, 증폭, 활성화 및/또는 집단에서 세포의 생존, 항원 노출 모방(mimic) 및/또는 유전자 조작, 예를 들어 재조합 항원 수용체의 도입을 위한 세포의 프라이밍(prime)을 유도하도록 설계된 조건을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 자극 조건에는 하나 이상의 특정 매체, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제, 예를 들어 영양, 아미노산, 항생제(antibiotics), 이온 및/또는 자극 요인(stimulatory factors) 예를 들어 사이토카인, 케모카인(chemokines), 항원, 결합 파트너, 융합 단백질(fusion proteins), 재조합 수용체 및 세포들을 활성화시키기 위해 설계된 기타 모든 제제가 포함될 수 있다.
일부 측면에서, 자극 조건 하에서의 자극 및/또는 인큐베이션은 Riddell 등의 미국특허 제6,040,177호, 문헌 [Klebanoff 등,(2012) J Immunother. 35(9): 651-660], [Terakura등, (2012) Blood.1:72-82], 및/또는 [Wang 등, (2012) J Immunother. 35(9):689-701]에 기재된 것과 같은 기술에 따라 수행된다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 CD57- T 세포(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)를 배양-개시 조성물 피더 세포(feeder cell), 예를 들어 비분할 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 (예를 들어 생성된 세포 집단이 증폭될 초기 집단의 각각의 T 림프구에 대해 적어도 약 5, 10, 20 또는 40 개 이상의 PBMC 피더 세포를 포함하도록) 첨가하고; 및 배양물을 (예를 들어 T 세포의 수를 증폭시키기에 충분한 시간 동안) 인큐베이션함으로써 증폭된다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 CD27+ T 세포(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)를 배양-개시 조성물 피더 세포(feeder cell), 예를 들어 비분할 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 (예를 들어 생성된 세포 집단이 증폭될 초기 집단의 각각의 T 림프구에 대해 적어도 약 5, 10, 20 또는 40 개 이상의 PBMC 피더 세포를 포함하도록) 첨가하고; 및 배양물을 (예를 들어 T 세포의 수를 증폭시키기에 충분한 시간 동안) 인큐베이션함으로써 증폭된다. 일부 측면에서, 비분할 피더 세포는 감마 조사된 PBMC 피더 세포를 포함 할 수 있다. 일부 구현예에서, PBMC에는 세포 분열을 방지하기 위해 약 3000 내지 3600 rad 범위의 감마선이 조사된다. 일부 측면에서, 피더 세포는 T 세포 집단의 첨가 전에 배양 배지에 첨가된다.
일부 구현예에서, 자극 조건은 인간 T 림프구의 성장에 적합한 온도, 예를 들어 약 25℃ 이상, 일반적으로 약 30℃ 이상, 및 일반적으로 약 37℃ 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 온도 변화는 배양 동안, 예를 들어 37℃ 내지 35℃에서 수행된다. 임의로, 인큐베이션은 비-분할 EBV-변형 림프모(lymphoblastoid)세포(LCL)를 피더 세포로서 첨가하는 것을 더 포함할 수 있다. LCL은 약 6000 내지 10,000rad 범위의 감마선으로 조사될 수 있다. 일부 측면에서 LCL 피더 세포는 임의의 적합한 양, 예를 들어 LCL 피더 세포 대 초기 T 림프구 적어도 약 10:1의 비와 같은 형태로 제공된다.
특정 구현예에서, 자극 조건은 자극 시약으로 세포를 인큐베이션, 배양(culturing 및/또는 cultivating)하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 시약은 섹션 III.A.1에 기재된 시약이다. 특정 구현예에서, 자극제는 비드를 함유하거나 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 자극제는 올리고머 시약, 예를 들어 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약을 함유하거나 또는 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건 하에 세포의 인큐베이션, 배양(culturing 및/또는 cultivating) 시작 및/또는 개시는 세포가 자극제와 접촉 및/또는 인큐베이션될 때 발생한다. 특정 구현예에서, 세포는, 세포를 유전자 조작, 예를 들어 형질도입 또는 형질감염하는 것과 같이 재조합 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)를 세포내로 도입하기 전, 동안 및/또는 후에 인큐베이션한다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 조성물은 (약) 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.5:1, 1.25:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.75:1, 0.67:1, 0.5:1, 0.3:1, 또는 0.2:1의 자극제 시약 및/또는 비드 대 세포의 비로 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 상기 자극제 시약 및/또는 비드 대 세포의 비는 2.5:1 내지 0.2:1, 2:1 내지 0.5:1, 1.5:1 내지 0.75:1, 1.25:1 내지 0.8:1, 1.1:1 내지 0.9:1이다. 특정 구현예에서, 상기 자극제 시약 및/또는 비드 대 세포의 비는 약 1:1 또는 1:1이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 (약), 또는 적어도 0.01 ㎍, 0.02 ㎍, 0.03 ㎍, 0.04 ㎍, 0.05 ㎍, 0.1 ㎍, 0.2 ㎍, 0.3 ㎍, 0.4 ㎍, 0.5 ㎍, 0.75 ㎍, 1 ㎍, 2 ㎍, 3 ㎍, 4 ㎍, 5 ㎍, 6 ㎍, 7 ㎍, 8 ㎍, 9 ㎍, 또는 10 ㎍의 자극 시약/106 세포의 존재하에 자극된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 (약) 4 ㎍의 자극 시약/106 세포의 존재하에 자극된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 (약) 0.8 ㎍의 자극 시약/106 세포의 존재하에 자극된다.
특정 구현예에서, 세포, 예를 들어 투입 집단의 세포는, (약) 0.01×106 세포/mL, 0.1×106 세포/mL, 0.5×106 세포/mL, 1.0×106 세포/mL, 1.5×106 세포/mL, 2.0×106 세포/mL, 2.5×106 세포/mL, 3.0×106 세포/mL, 4.0×106 세포/mL, 5.0×106 세포/mL, 10×106 세포/mL 또는 50×106 세포/mL 또는 0.01×106 세포/mL, 0.1×106 세포/mL, 0.5×106 세포/mL, 1.0×106 세포/mL, 1.5×106 세포/mL, 2.0×106 세포/mL, 2.5×106 세포/mL, 3.0×106 세포/mL, 4.0×106 세포/mL, 5.0×106 세포/mL, 10×106 세포/mL 또는 50×106 세포/mL 이상의 농도로 자극 조건 하에서, 예를 들어 자극 시약의 존재 하에서 자극되거나 자극의 대상, 예를 들어 배양된다. 특정 구현예에서, 세포, 예를 들어 투입 집단의 세포는, (약) 3.0×106 세포/mL 또는 3.0×106 세포/mL 이상의 농도로 자극 조건 하에서, 예를 들어 자극 시약의 존재 하에서 자극되거나 자극의 대상, 예를 들어 배양된다. 특정 구현예에서, 입력 세포는 생존 가능한 세포이다.
일부 구현예에서, 자극 및/또는 활성화 조건은, 특정 배지(media), 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제, 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예를 들어 사이토카인, 케모카인(chemokines), 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체 및 세포를 활성화시키도록 설계된 임의의 다른 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 자극 조건 또는 자극 시약이 존재하는 경우의 인큐베이션의 적어도 일부는, 예를 들어 국제공개번호 제WO2016/073602호에 기술된 것과 같은 원심 회전 하에 원심 챔버의 내부 공동(cavity)에서 수행된다. 일부 구현예에서, 원심 챔버에서 수행되는 인큐베이션의 적어도 일부는 자극 및/또는 활성화를 유도하기 위해 시약 또는 시약들과 혼합하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 선택된 세포와 같은 세포는 원심 챔버에서 자극 조건 또는 자극 시약과 혼합된다. 이러한 과정의 일부 측면에서, 다량의 세포는, 세포 배양 플레이트(plate) 또는 다른 시스템에서 유사한 자극을 수행될 때 일반적으로 사용되는 것보다 훨씬 적은 양의 하나 이상의 자극 조건 또는 제제와 혼합된다.
일부 구현예에서, 원심 챔버에서 혼합하지 않고 선택하는 경우 자극제는 실질적으로, 동일한 수 또는 동일한 부피의 세포의 선택의 대략 동일하거나 유사한 선택 효율을 달성하는데 필요한 자극제의 양과 비교하여 더 적은 양(예를 들어 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 이하의 양)으로 챔버의 공동 내의 세포에 첨가되며, 예를 들어 주기적으로 흔들거나 회전하는 튜브 또는 백에 넣는다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은, 예를 들어 10 mL 내지 200 mL, 적어도 또는 약 적어도 (약) 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 150 mL 또는 200 mL의 시약의 인큐베이션으로 표적 부피를 달성하기 위해, 세포 및 자극 시약에 인큐베이션 완충제를 첨가하여 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 완충제 및 자극 시약은 세포에 첨가하기 전에 예비 혼합된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 완충제 및 자극 시약은 세포에 별도로 첨가된다. 일부 구현예에서, 자극 인큐베이션은 주기적으로 온화한 혼합 조건으로 수행되며, 이는 에너지적으로 선호되는 상호 작용을 촉진시켜 세포의 자극 및 활성화를 달성하면서, 전반적으로 자극 시약을 덜 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 인큐베이션은 혼합 조건, 예를 들어 일반적으로 비교적 낮은 힘 또는 속도에서의 스피닝(spinning)의 존재 하에서, 예를 들어 세포를 펠렛(pellet)화하기 위해 사용된 것보다 낮은 속도에서, 예를 들어 약 600rpm 내지 1700rpm(예를 들어 600rpm 또는 1000rpm 또는 1500rpm 또는 1700rpm 또는 약 또는 적어도 600rpm 또는 1000rpm 또는 1500rpm 또는 1700rpm)에서, 약 80g 내지 100g(예를 들어 80g, 85g, 90g, 95g 또는 100g 또는 약 또는 적어도 80g, 85g, 90g, 95g 또는 100g)의 챔버의 샘플 또는 벽(wall) 또는 다른 용기의 RCF에서, 일반적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 스핀(spin)은, 이러한 저속에서 스핀의 반복된 간격에 이어서, 1초, 2초, 3초, 4초, 5초, 6초, 7초, 8초, 9초 또는 10초에 대한 스핀 및/또는 휴식과 같은 휴식 기간을 사용하여 수행되며, 예를 들어 약 1초 또는 2초 회전 후 약 5초, 6초, 7초 또는 8초 동안 휴식하는 것과 같다.
일부 구현예에서, 예를 들어 자극제와 함께하는, 인큐베이션의 총 지속 시간은, 1시간 내지 96시간, 1시간 내지 72시간, 1시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간, 또는 12시간 내지 24시간 사이 또는 약 1시간 내지 96시간, 1시간 내지 72시간, 1시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간, 또는 12시간 내지 24시간 사이, 예를 들어 적어도 (약) 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간 또는 72시간이다. 일부 구현예에서, 추가 인큐베이션은 1시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간 또는 12시간 내지 24시간 사이 또는 약 1시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간 또는 12시간 내지 24시간 사이 시간 동안이다.
일부 구현예에서, 자극, 예를 들어 자극 조건 하에 세포를 배양하는 것은 (약) 48 시간, 42 시간, 36 시간, 30 시간, 24 시간, 22 시간, 20 시간, 18 시간, 16 시간 또는 12 시간 또는 48 시간, 42 시간, 36 시간, 30 시간, 24 시간, 22 시간, 20 시간, 18 시간, 16 시간 또는 12 시간 미만 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 자극, 예를 들어 자극 조건 하에 세포를 배양하는 것은 20±4 시간 또는 (약) 16 시간 내지 24 시간 동안 수행된다. 특정 구현예에서, 자극, 예를 들어 자극 조건 하에 세포를 배양하는 것은 (약) 36 시간 내지 12 시간, 30 시간 내지 18 시간 또는 (약) 24 시간 또는 22 시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 자극, 예를 들어 자극 조건 하에 세포를 배양하는 것은 (약) 2 일 또는 1 일 또는 2 일 또는 1 일 미만 동안 수행된다.
특정 구현예에서, 선택된 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)의 (약) 50×106, 100×106, 150×106, 200×106, 250×106, 300×106, 350×106, 400×106, 450×106, 500×106, 550×106, 600×106, 700×106, 800×106, 900×106 또는 1,000×106개 또는 50×106, 100×106, 150×106, 200×106, 250×106, 300×106, 350×106, 400×106, 450×106, 500×106, 550×106, 600×106, 700×106, 800×106, 900×106 또는 1,000×106개 이상의 세포의 양이 자극되거나 자극의 대상, 예를 들어 자극 조건 하에 배양된다. 특정 구현예에서, 자극, 예를 들어 자극 조건 하에 배양되는 선택된 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)의 양은 (약) 50×106 세포, (약) 100×106 세포, (약) 150×106 세포, (약) 200×106 세포, (약) 250×106 세포, (약) 300×106 세포, (약) 350×106 세포, (약) 400×106 세포, (약) 450×106 세포, (약) 500×106 세포, (약) 550×106 세포, (약) 600×106 세포, (약) 700×106 세포, (약) 800×106 세포, (약) 900×106 세포 또는 (약) 1,000×106 세포 또는 상기 중 임의의 사이 임의의 값이다. 특정 구현예에서, 선택된 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)의 (약) 900 x 106 세포의 양이 자극, 예를 들어 자극 조건 하에 배양된다. 일부 구현예에서, 선택된 집단은 CD27 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 고갈된 T 세포 집단이다. 일부 구현예에서, 선택된 집단은 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단이다.
특정 구현예에서, 선택된 조성물(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 1:10 내지 10:1, 1:5 내지 5:1, 4:1 내지 1:4, 1:3 내지 3:1, 2:1 내지 1:2, 1.5:1 내지 1:1.5, 1.25:1 내지 1:1.25, 1.2:1 내지 1:1.2, 1.1:1 내지 1:1.1, 또는 약 1:1, 또는 1:1의 생존 CD4+ T 세포 대 생존 CD8+ T 세포의 비로 생존 CD4+ T 세포 및 생존 CD8+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 선택된 조성물(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)은 생존 CD4+ T 세포 및 생존 CD8+ T 세포를 약 1:1 또는 1:1의 생존 CD4+ T 세포 대 생존 CD8+ T 세포의 비로 포함한다. 특정 구현예에서, 선택된 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)의 (약) 450×106개의 CD4+ 세포의 양이 자극되고, 예를 들어 자극 조건 하에 배양된다. 특정 구현예에서, 선택된 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)의 (약) 450×106개의 CD8+ 세포의 양이 자극되고, 예를 들어 자극 조건 하에 배양된다. 특정 구현예에서, 선택된 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)의 (약) 450×106개의 CD4+ 세포의 양 및 (약) 450×106개의 CD8+ 세포의 양이 자극되고, 예를 들어 자극 조건 하에 배양된다. 일부 구현예에서, 선택된 집단은 CD27 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 고갈된 T 세포 집단이다. 일부 구현예에서, 선택된 집단은 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단이다.
특정 구현예에서, 자극 조건은 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에 및/또는 농축된 T세포의 조성물을 인큐베이션, 배양(culturing) 및/또는 컬티베이팅(cultivating)하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 재조합 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 T세포에 의해 발현되고/되거나 내인성(endogenous) 수용체에 결합하고/하거나 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 사이토카인의 4-알파-헬릭스(4-alpha-helix bundle) 다발 패밀리의 구성원이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인의 4- 알파-헬릭스4-알파-헬릭스(4-alpha-helix bundle) 다발 패밀리의 구성원은 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-9(IL-9), 인터루킨 12(IL-12), 인터루킨 15(IL-15), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF) 및 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 IL-15이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 IL-7이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 IL-2이거나 또는 그를 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인의 양 또는 농도는 국제단위(International Unit; IU)로 측정되고/되거나 정량화된다. 국제단위는 비타민, 호르몬, 사이토카인, 백신, 혈액 생성물, 및 유사한 생물학적으로 활성 물질을 정량화하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, IU는 비중 및 강도의 국제 참조 표준, 예를 들어 Human IL-2, 86/504에 대한 WHO 국제 표준(WHO 1st International Standard for Human IL-2, 86/504)과 비교하여 생물학적 제제의 효능의 측정 단위이거나 또는 그를 포함한다. 국제단위는 국제적 공동 연구 노력으로 발간된 생물학적 활동 단위를 보고하는 유일하게 인식되고 표준화된 방법이다. 특정 구현예에서, 집단, 샘플, 또는 사이토카인의 소스에 대한 상기 IU는 유사한 WHO 표준 제품과의 제품 비교 테스트를 통해 얻을 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, 집단, 샘플, 또는 인간 재조합 IL-2, IL-7, 또는 IL-15의 소스의 IU/mg은 각각 WHO 표준 IL-2 제품(NIBSC 코드: 86/500), WHO 표준 IL-17 제품(NIBSC 코드: 90/530) 및 WHO 표준 IL-15 제품(NIBSC 코드: 95/554)와 비교된다.
일부 구현예에서, IU/mg로 나타낸 생물학적 활성은 (ng/ml로 나타낸 ED50)-1×106에 해당한다. 특정 구현예에서, 재조합 인간 IL-2 또는 IL-15의 ED50은 CTLL-2 세포를 사용한 세포 증식(XTT 절단)의 절반-최대 자극(half-maximal stimulation)에 필요한 농도에 해당한다. 특정 구현예에서, 재조합 인간 IL-7의 ED50은 PHA_활성화된 인간 말초 혈액 림프구의 증식을 위한 절반-최대 자극에 필요한 농도에 해당한다. IL-2에 대한 IU의 분석 및 계산에 관한 세부 사항은 문헌 「Wadhwa 등, Journal of Immunological Methods (2013), 379 (1-2): 1-7」; 및 「Gearing and Thorpe, Journal of Immunological Methods (1988), 114 (1-2): 3-9」에 논의되어 있으며, IL-15에 대한 IU의 분석 및 계산에 관한 세부 사항은 문헌 「Soman 등, Journal of Immunological Methods (2009) 348 (1-2): 83-94」에 논의되어 있다.
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 상기 선택된 세포, 예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은, 1 IU/mL 내지 1,000 IU/mL, 10 IU/mL 내지 50 IU/mL, 50 IU/mL 내지 100 IU/mL, 100 IU/mL 내지 200 IU/mL, 100 IU/mL 내지 500 IU/mL, 250 IU/mL 내지 500 IU/mL, 또는 500 IU/mL 내지 1,000 IU/mL의 농도의 사이토카인, 예를 들어 인간 재조합 사이토카인의 존재하에 자극되거나 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 CD27 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 고갈된 T 세포 집단이다. 일부 구현예에서, 상기 선택된 세포는 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단이다.
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 상기 선택된 세포는, 1 IU/mL 내지 500 IU/mL, 10 IU/mL 내지 250 IU/mL, 50 IU/mL 내지 200 IU/mL, 50 IU/mL 내지 150 IU/mL, 75 IU/mL 내지 125 IU/mL, 100 IU/mL 내지 200 IU/mL, 또는 10 IU/mL 내지 100 IU/mL의 농도의 재조합 IL-2, 예를 들어 인간 재조합 IL-2의 존재하에 자극되거나 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 상기 투입 집단의 세포는, 50 IU/mL, 60 IU/mL, 70 IU/mL, 80 IU/mL, 90 IU/mL, 100 IU/mL, 110 IU/mL, 120 IU/mL, 130 IU/mL, 140 IU/mL, 150 IU/mL, 160 IU/mL, 170 IU/mL, 180 IU/mL, 190 IU/mL, 또는 100 IU/mL의 농도의 재조합 IL-2의 존재하에 자극되거나 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 상기 선택된 세포는, 100 IU/mL의 IL-2, 예를 들어 인간 재조합 IL-2의 존재하에 자극되거나 자극에 적용된다.
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 상기 선택된 세포는, 100 IU/mL 내지 2,000 IU/mL, 500 IU/mL 내지 1,000 IU/mL, 100 IU/mL 내지 500 IU/mL, 500 IU/mL 내지 750 IU/mL, 750 IU/mL 내지 1,000 IU/mL, 또는 550 IU/mL 내지 650 IU/mL의 농도의 재조합 IL-7, 예를 들어 인간 재조합 IL-7의 존재하에 자극되거나 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 상기 선택된 세포는, 50 IU/mL,100 IU/mL, 150 IU/mL, 200 IU/mL, 250 IU/mL, 300 IU/mL, 350 IU/mL, 400 IU/mL, 450 IU/mL, 500 IU/mL, 550 IU/mL, 600 IU/mL, 650 IU/mL, 700 IU/mL, 750 IU/mL, 800 IU/mL, 750 IU/mL, 750 IU/mL, 750 IU/mL, 또는 1,000 IU/mL의 농도의 IL-7의 존재하에 자극되거나 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 상기 선택된 세포는, 600 IU/mL의 재조합 IL-7, 예를 들어 인간 재조합 IL-7의 존재하에 자극되거나 자극에 적용된다.
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 상기 선택된 세포는, 1 IU/mL 내지 500 IU/mL, 10 IU/mL 내지 250 IU/mL, 50 IU/mL 내지 200 IU/mL, 50 IU/mL 내지 150 IU/mL, 75 IU/mL 내지 125 IU/mL, 100 IU/mL 내지 200 IU/mL, 또는 10 IU/mL 내지 100 IU/mL의 농도의 재조합 IL-15, 예를 들어 인간 재조합 IL-15의 존재하에 자극되거나 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 상기 선택된 집단의 세포는, 50 IU/mL, 60 IU/mL, 70 IU/mL, 80 IU/mL, 90 IU/mL, 100 IU/mL, 110 IU/mL, 120 IU/mL, 130 IU/mL, 140 IU/mL, 150 IU/mL, 160 IU/mL, 170 IU/mL, 180 IU/mL, 190 IU/mL, 또는 200 IU/mL의 농도의 재조합 IL-15의 존재하에 자극되거나 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 상기 선택된 세포는, 100 IU/mL의 IL-15, 예를 들어 인간 재조합 IL-15의 존재하에 자극되거나 자극에 적용된다.
특정 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 상기 선택된 집단으로부터의 세포는, IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15의 존재하에서 자극 조건하에 자극되거나 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15는 재조합이다. 특정 구현예에서, 상기 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15는 인간이다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 재조합 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15의 존재하에서 자극 조건하에 자극되거나 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 재조합 IL-2의 존재하에 또는 약 100 IU/m의 재조합 IL-2의 존재하에, 재조합 IL-7의 존재하에 또는 약 600 IU/m의 재조합 IL-7의 존재하에, 및 재조합 IL-15의 존재하에 또는 약 100 IU/m의 재조합 IL-2의 존재하에, 자극 조건하에 자극되거나 자극에 적용된다.
상기 조건은 하나 이상의 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제, 예를 들어 영양물질, 아미노산, 항생제, 이온, 및/또는 자극 요소, 예를 들어 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체, 및 상기 세포를 활성화하도록 설계된 임의의 다른 제제를 포함할 수 있다.
몇몇 측면에서, 자극은 Riddell 등의 미국특허 제6,040,177호, 문헌 「Klebanoff 등,(2012) J Immunother. 35(9): 651-660」, 「Klebanoff 등,(2012) J Immunother. 35(9): 651-660」, 「Terakura 등, (2012) Blood.1:72-82」 및/또는 「Wang 등, (2012) J Immunother. 35(9):689-701」에 설명된 기술에 따라 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 자극은 무혈청 배지 중에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 정의된 및/또는 잘 정의된 세포 배양 배지이다. 특정 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 처리된, 예를 들어 억제제 및/또는 성장 인자(growth factor)를 제거하도록 여과된 제어된 배양 배지이다. 일부 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 단백질을 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 혈청 알부민, 가수 분해물, 성장 인자, 호르몬, 담체 단백질 및/또는 부착 인자를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 자극은 본원 또는 국제출원 제PCT/US2018/064627호에 기재된 무혈청 배지로 수행된다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 보충물로 보충된 기본 배지(예를 들어 OpTmizer™ T-세포 증폭 기본 배지(ThermoFisher))를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 보충물는 무혈청이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는, 예를 들어 추가 보충물(예를 들어 OpTmizer™ T-세포 증폭 보충물(ThermoFisher))에 의해 제공되는 세포의 유지, 증폭 및/또는 활성화를 위한 하나 이상의 추가 성분으로 보충된 기본 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 혈청 대체 보충물, 예를 들어 면역 세포 혈청 대체제, 예를 들어 ThermoFisher, #A2596101, CTS™ 면역 세포 혈청 대체제 또는 문헌[Smith 등, Clin Transl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31]에 기재된 면역 세포 혈청 대체제를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 유리 형태의 아미노산, 예를 들어 L-글루타민을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 디펩티드 형태의 L-글루타민(예를 들어 L-알라닐-L-글루타민), 예를 들어 Glutamax™(ThermoFisher)의 디펩티드를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 재조합 사이토카인, 예를 들어 재조합 인간 IL-2, 재조합 인간 IL-7 및/또는 재조합 인간 IL-15를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 자극 조건 또는 자극 시약의 존재하에 상기 자극의 적어도 일부는 예를 들어 참조로 인용되는 국제공개공보 제WO2016/073602호에 기술된 바와 같이 원심 챔버의 내부 공동에서, 예를 들어 원심 회전하에 수행된다. 일부 구현예에서, 원심 챔버에서 수행된 상기 자극의 적어도 일부는 자극 및/또는 활성화를 유도하는 시약(들)과 혼합하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 선택된 세포는 상기 원심 챔버 중에서 자극 조건 또는 자극제와 혼합된다. 이러한 공정의 일부 측면에서, 일정 부피의 세포는, 세포 배양판 또는 다른 시스템에서 유사한 자극을 수행할 때 정상적으로 사용되는 것 보다 훨씬 적은 양의 하나 이상의 자극 조건 또는 제제와 혼합된다.
일부 구현예에서, 상기 자극은, 예를 들어 스피닝(spinning)의 존재하에서, 일반적으로는 비교적 적은 힘 또는 속도에서, 예를 들어 세포를 펠릿화하는 데 사용되는 속도보다 낮은 속도에서, 예를 들어 (약) 600 rpm 내지 1700 rpm (예를 들어 (약) 또는 적어도 600 rpm, 1000 rpm, 또는 1500 rpm 또는 1700 rpm), 예를 들어 약 80g 내지 100g(예를 들어 (약) 또는 적어도 80g, 85g, 90g, 95g, 또는 100g)의 챔버 또는 다른 용기의 샘플 또는 벽의 RCF에서, 혼합 조건하에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 스핀은 그러한 저속에서 스핀의 반복된 간격을 이용하여 수행된 후, 휴지 기간(rest period)을 가지며, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10초의 스핀 및/또는 휴지, 예를 들어 대략 1초 또는 2초의 스핀에 대략 5, 6, 7, 또는 8초의 휴지기를 갖는다.
특정 구현예에서, 자극은 원심 분리, 떨림, 회전, 흔들림 또는 관류, 예를 들어 배지의 연속 또는 반 연속 관류를 수반하지 않는 조건과 같은 정적 조건 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 개시 전 또는 직후, 예를 들어 5 분, 15 분 또는 30 분 이내에, 세포는 백 또는 바이알과 같은 컨테이너로 전달(예를 들어 멸균 조건 하에 전달)되고, 인큐베이터에 배치된다. 특정 구현예에서, 인큐베이터는 (약) 16℃, 24℃ 또는 35℃ 또는 16℃, 24℃ 또는 35℃ 이상으로 설정된다. 일부 구현예에서, 인큐베이터는 (약) 37℃ 또는 37℃ ±2℃, ±1℃, ±0.5℃ 또는 ±0.1℃로 설정된다. 특정 구현예에서, 정적 조건 하의 자극은 인큐베이터에 배치된 세포 배양 백에서 수행된다. 일부 구현예에서, 배양 백은, 단핵구가 존재하는 경우 백 표면에 부착할 수 있는 단일 웹 폴리올레핀 기체 투과성 필름으로 구성된다.
특정한 측면에서, 상기 방법은 세포의 표면 상의 분자(세포 표면 분자)에 결합할 수 있는 적어도 하나의 시약(예를 들어 친화도 시약 또는 자극 시약)이 시약(예를 들어 친화도 시약 또는 자극 시약)과 가역적으로 결합되는 가역성 시스템을 사용한다. 일부 경우에, 상기 시약은 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 갖는 시약(예를 들어 친화도 시약 또는 자극 시약)을 함유한다. 일부 경우에, 상기 시약(예를 들어 친화도 시약 또는 자극 시약)은 다량체화 시약( multimerization reagent)이다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 시약(예를 들어 친화도 시약 또는 자극 시약)은 상기 분자의 에피토프 또는 영역을 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 결합부위 B를 함유하고 상기 시약(예를 들어 친화도 시약 또는 자극 시약)의 적어도 하나의 결합 부위 Z에 특이적으로 결합하는 결합 파트너 C를 함유한다. 일부 경우에, 상기 결합 파트너 C와 상기 적어도 하나의 결합 부위 Z 사이의 결합 상호작용은 비-공유 상호작용이다. 일부 구현예에서, 상기 결합 파트너 C와 상기 적어도 하나의 결합 부위 Z 사이의 결합 상호작용, 예를 들어 비-공유 상호작용은 가역적이다.
일부 구현예에서, 가역적 결합은 경쟁 시약과 같은 물질, 즉 적어도 하나의 결합 부위 Z에 결합할 수 있는 결합 부위이거나 이를 함유하는 물질의 존재하에 매개될 수 있다. 일반적으로, 상기 물질(예를 들어 경쟁 시약)은 상기 시약 중에 존재하는 결합 부위 Z에 대한 보다 높은 결합 친화도에 기인하여 및/또는 상기 결합 파트너 C보다 높은 농도로 존재하는 것에 기인하여 경쟁자(competitor)로서 작용함으로서, 상기 시약으로부터 상기 결합 파트너를 탈착 및/또는 해리할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 결합 부위 Z에 대한 상기 물질(예를 들어 경쟁 시약)의 친화도는 상기 적어도 하나의 결합 부위 Z에 대한 제제(예를 들어 친화도 시약 또는 자극 시약)의 결합 파트너의 친화도보다 높다. 따라서, 일부 경우에, 상기 시약의 결합 부위 Z와 상기 시약(예를 들어 친화도 시약 또는 자극 시약)의 결합 파트너 C 사이의 결합은 상기 물질(경쟁 시약)의 첨가에 의해서 파괴됨으로써 상기 시약(예를 들어 친화도 시약 또는 자극 시약)과 시약(예를 들어 친화도 시약 또는 자극 시약)의 연합(association)을 가능하게 한다.
상기 가역적 시스템에서 사용될 수 있는 시약은 공지되어 있다[미국특허 제5,168,049호; 제5,506,121호; 제6,103,493호; 제7,776,562호; 제7,981,632호; 제8,298,782호; 제8,735,540호; 제9,023,604호; 및 국제공개공보 제WO2013/124474호 및 제WO2014/076277호 참조]. 가역적 상호작용을 형성할 수 있는 시약 및 결합 파트너, 및 그러한 결합을 되돌릴 수 있는 물질(예를 들어 경쟁 시약)은 하기 기술된다.
일부 구현예에서, 상기 자극은 예를 들어 형질도입(transduction) 전에 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래한다.
1. 자극 시약
특정 구현예에서, 상기 자극 조건은 자극 시약으로 상기 세포를 인큐베이션, 컬처링, 및/또는 배양하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 비드를 함유하거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 자극의 개시는 상기 세포가 자극 시약으로 인큐베이션되거나 또는 접촉될 때 일어난다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 올리고머 시약, 예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머를 함유하거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 시약은, TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인 및/또는 하나 이상의 공자극(costimulatory) 분자의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화 및/또는 활성화시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 자극 조건 또는 자극 시약은 하나 이상의 제제, 예를 들어 TCR 복합체의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 리간드를 포함한다. 비드는 하나 이상의 제제, 이를테면 비드 표면에 커플링, 컨쥬게이트 또는 연결(직간접적으로)된 제제를 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에서 상정된 제제는 RNA, DNA, 단백질(예를 들어 효소), 항원, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 항체 단편, 탄수화물, 지질 렉틴, 또는 원하는 표적에 대해 친화도를 갖는 기타 바이오분자를 포함할 수 있으며 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 원하는 표적은 T 세포수용체 및/또는 T 세포수용체의 성분이다. 특정 구현예에서, 원하는 표적은 CD3이다. 특정 구현예에서, 원하는 표적은 T 세포 공자극분자, 예를 들어 CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, 또는 ICOS이다. 하나 이상의 제제는 공지의 다양한 방법에 의해 비드에 직간접적으로 부착될 수 있다. 이러한 부착은 공유, 비공유, 정전기 또는 소수성 부착일 수 있고 예를 들어 화학적 수단, 기계적 수단 또는 효소적 수단을 비롯한 다양한 부착 수단에 의해 달성가능하다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예를 들어 Fab이다. 일부 구현예에서, 바이오분자(예를 들어 바이오티닐화된 항-CD3 항체)는 비드에 직접 부착된 또 다른 바이오분자(예를 들어 항-비오틴 항체)를 통해 간접적으로 부착될 수도 있다.
일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 비드(예를 들어 상자성 비드)에 부착되고 세포(예를 들어 T 세포) 상의 하나 이상의 하기 거대분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 제제(예를 들어 항체)를 함유한다: CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD25, CD27, CD28, CD29, CD31, CD44, CD45RA, CD45RO, CD54 (ICAM-1), CD127, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, PD-1, OX40, CD27L (CD70), 4-1BB (CD137), 4-1BBL, CD30L, LIGHT, IL-2R, IL-12R, IL-1R, IL-15R; IFN-감마R, TNF-알파R, IL-4R, IL-10R, CD18/CD1 1a(LFA-1), CD62L(L-selectin), CD29/CD49d (VLA-4), 노치 리간드(Notch ligand)(예를 들어 델타-유사 1/4, Jagged 1/2, 등), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, 및 CXCR3 또는 그들의 단편(이들 거대분자 또는 그들의 단편에 대응하는 리간드를 포함함). 일부 구현예에서, 상기 비드에 부착된 제제는 세포(예를 들어 T 세포) 상의 하나 이상의 하기 거대분자에 특이적으로 결합한다: CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA, 및/또는 CD45RO.
일부 구현예에서, 비드에 부착된 제제 중 하나 이상은 항체이다. 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체(면역글로불린 Fc 영역을 갖는 전장 항체 포함), 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 다중특이적 항체(예를 들어 이중특이적 항체, 디아바디, 및 단일-사슬 분자, 뿐만 아니라 항체 단편(예를 들어 Fab, F(ab')2, 및 Fv)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 항체 단편(항원-결합 단편 포함), 예를 들어 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 또는 (Fab')2 단편이다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함한 임의의 이소형의 불변 영역이 본원에서 고려되는 항체에 사용될 수 있고, 이러한 불변 영역은 임의의 인간 또는 동물 종(예를 들어 뮤린 종)으로부터 수득될 수 있는 것으로 인식될 것이다.
일부 구현예에서, 제제는 T 세포수용체의 하나 이상의 성분에 결합 및/또는 상기를 인식하는 항체이다. 특정 구현예에서, 제제는 항-CD3 항체이다. 특정 구현예에서, 제제는 공수용체에 결합 및/또는 상기를 인식하는 항체이다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 항-CD28 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 항-CD28 항체 및 항-CD3 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 하나 이상의 자극제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 자극제는 1차 및 2차 자극제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 자극제는 예를 들어 본원에서 기술된 항-CD3 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며, 상기 제 2 자극제는 항-CD28 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 자극제는 예를 들어 본원에서 기술된 항-CD3 Fab이며, 상기 제 2 자극제는 예를 들어 본원에서 기술된 항-CD28 Fab이다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 투입 조성물의 세포는, (약) 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.5:1, 1.25:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.75:1, 0.67:1, 0.5:1, 0.3:1 또는 0.2:1 비율의 자극 시약 대 세포의 존재 하에 자극된다. 특정 구현예에서, 자극 시약 대 세포의 비율은 2.5:1 내지 0.2:1, 2:1 내지 0.5:1, 1.5:1 내지 0.75:1, 1.25:1 내지 0.8:1, 1.1:1 내지 0.9:1이다. 특정 구현예에서, 자극 시약 대 세포의 비율은 (약) 1:1이다. 특정 구현예에서, 자극 시약 대 세포의 비율은 (약) 0.3:1이다. 특정 구현예에서, 자극 시약 대 세포의 비율은 (약) 0.2:1이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 (약), 또는 적어도 0.01 ㎍, 0.02 ㎍, 0.03 ㎍, 0.04 ㎍, 0.05 ㎍, 0.1 ㎍, 0.2 ㎍, 0.3 ㎍, 0.4 ㎍, 0.5 ㎍, 0.75 ㎍, 1 ㎍, 2 ㎍, 3 ㎍, 4 ㎍, 5 ㎍, 6 ㎍, 7 ㎍, 8 ㎍, 9 ㎍, 또는 10 ㎍의 자극 시약/106 세포의 존재하에 자극된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 (약) 4 ㎍/106 세포의 존재하에 자극된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 (약) 3 ㎍/106 세포의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 (약) 2.5 ㎍/106 세포의 존재하에 자극된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 (약) 2 ㎍/106 세포의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 (약) 1.8 ㎍/106 세포의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 (약) 1.6 ㎍/106 세포의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 (약) 1.4 ㎍/106 세포의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 (약) 1.2 ㎍/106 세포의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 (약) 1 ㎍/106 세포의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 (약) 0.8 ㎍/106 세포의 존재하에 자극된다. 다양한 구현예에서, 상기 세포는 (약) 0.8 ㎍/106 세포의 존재하에 자극된다.
일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 세포의 표면에서 분자와 결합하며, 상기 자극 시약과 상기 분자 사이의 결합은 상기 세포에서 자극 신호 전달을 유도, 전달(delivering), 또는 조절(modulating)할 수 있다. 일부 경우에, 상기 세포 표면 분자(예를 들어 수용체)는 신호 전달 분자이다. 일부 상기 경우에, 상기 자극 시약은 하나 이상의 표적 세포(예를 들어 T 세포)에 의해서 발현된 신호 전달 분자를 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 경우에, 상기 자극 시약은 세포 표면 분자, 예를 들어 수용체와 결합할 때 세포(예를 들어 T 세포)에서 자극 신호를 유도 또는 전달할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 자극 신호는 면역 자극(immunostimulatory)일 수 있으며, 이 경우 상기 자극제는 관련되거나 또는 세포(예를 들어 T 세포)에 의해서 면역 반응을 자극하는 신호를 유도, 전달, 또는 조절할 수 있으며, 예를 들어 면역 세포 증식 또는 증폭, 면역 세포 활성화, 면역 세포 분화, 사이토카인 분비, 세포 독성 활성 또는 면역 세포의 하나 이상의 다른 작용 활동을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 상기 자극 신호는 억제일 수 있으며, 이 경우 상기 자극 시약은 관련되거나 또는 세포(예를 들어 T 세포)에 의해서 면역 반응을 억제하는 신호를 유도, 전달, 또는 조절할 수 있으며, 예를 들어 면역 세포 증식 또는 증폭, 면역 세포 활성화, 면역 세포 분화, 사이토카인 분비, 세포 독성 활성 또는 면역 세포의 하나 이상의 다른 작용 활동을 억제한다.
일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 1차 자극제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 1차 자극제는 상기 샘플의 선택된 세포의 표면에서 수용체 분자와 결합한다. 따라서 일부 경우에, 상기 1차 자극제는 자극 신호를 전달, 유도, 또는 조절한다. 일부 측면에서, 상기 1차 자극제에 의한 자극 신호의 전달, 유도, 또는 조절은 상기 세포의 자극을 수행한다. 따라서 일부 경우에, 상기 1차 자극제는 상기 세포에 자극 신호를 전달하거나 1차 활성화 신호를 제공함으로써 상기 세포를 자극하고/하거나 활성화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 1차 자극제는 선택 마커의 하향 조절을 추가로 유도한다. 본원에서 사용되는 용어 '하향 조절'은 발현 감소, 예를 들어 이른 시점과 비교하여 선택 마커의 세포 표면 발현을 포괄할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 표적 세포(예를 들어 T 세포)는 TCR/CD3 복합체 ㅁ미및 공자극 분자, 예를 들어 CD28를 포함한다. 이러한 경우에, 상기 1차 자극제는 TCR/CD3 복합체와 결합함으로써, T 세포에서의 자극 신호(예를 들어 1차 신호, 예를 들어 1차 활성화 신호)를 전달하고, 상기 2차 자극제는 공자극 CD28 분자와 결합한다. 특정한 측면에서, 상기 1차 자극제 및/또는 상기 2차 자극제는 선택 마커(예를 들어 상기 표적 세포(예를 들어 T 세포)를 고정하는데 사용된 선택 마커)의 하향 조절을 더 유도한다.
일부 구현예에서, 상기 1차 자극제는 상기 세포, 예를 들어 T 세포에서 TCR/CD3 복합체-관련된 자극 신호(예를 들어 1차 신호)를 전달한다. 일부 구현예에서, 상기 1차 자극제는 자극수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM을 함유하는 분자에 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD3를 특이적으로 결합하는 상기 1차 자극제는 항-CD3-항체, 항-CD3-항체의 2가 항체 단편, 항-CD3-항체의 1가 항체 단편 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD3 결합 분자로 구성된 제제로부터 선택될 수 있다. 상기 2가 항체 단편은 (Fab)2'-단편 또는 2가 단일 사슬 Fv 단편일 수 있는 반면, 1가 항체 단편은 Fab 단편, FV 단편 및 단일 사슬 Fv 단편(scFv)으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 항체 유사 결합 특성을 가진 단백질성 CD28 결합 분자는 압타머(aptamer), 리포칼린(lipocalin) 패밀리의 폴리펩티드에 기초한 뮤테인(mutein), 글루바디(glubody), 안키린(ankyrin) 스캐폴드에 기초한 단백질, 결정성 스캐폴드에 기초한 단백질, 아드넥틴(adnectin) 및 아비머(avimer)일 수 있다.
일부 구현예에서, 항-CD3 단편은 하이브리도마 세포주 OKT3에 의해 생성된 CD3 결합 모노클론 항체(ATCC® CRL-8001TM; 미국특허 제4,361,549호 참조)로부터 유래될 수 있다. 상기 항-CD3 항체 OKT3의 중쇄의 가변 도메인 및 경쇄의 가변 도메인은 문헌 「Arakawa 등, J. Biochem. 120, 657-662 (1996)」에 기술되어 있으며 각각 서열번호 93 및 94에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD3 Fab는 각각 서열번호 93 및 94에 제시된 가변 중쇄 및 경쇄의 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 자극제는 2차 자극제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 2차 자극제는 상기 세포의 표면 상의 분자, 예를 들어 세포 표면 분자, 예를 들어 수용체 분자에 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 2차 자극제는 상기 1차 자극제에 의해서 결합된 분자를 통해 전달된 자극 신호를 강화, 감쇠 또는 변형시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 2차 자극제는 자극 신호, 예를 들어 2차 또는 추가의 자극 신호를 전달, 유도, 또는 조절한다. 일부 측면에서, 상기 2차 자극제는 상기 1차 자극제에 의해서 유도된 자극 신호를 강화 또는 증강시킨다. 일부 구현예에서, 상기 2차 자극제는 보조 분자에 결합하고/하거나 세포에서 보조 또는 2차 자극 신호를 자극하거나 유도할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 2차 자극제는 공자극 분자에 결합하고/하거나 공자극 신호를 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 2차 자극제를 포함할 수 있는 상기 자극제는, 공자극 분자, 보조 분자(accessory molecule), 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체(chemokine receptor), 면역 체크포인트 분자(immune checkpoint molecule), TNF 패밀리 또는 TNF 수용체 패밀리의 구성원일 수 있는 제 2 분자에 결합, 예를 들어 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 CD28일 수 있으며 상기 2차 자극제는 CD28을 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD28을 특이적으로 결합하는 상기 2차 자극제는 항-CD28-항체, 항-CD28-항체의 2가 항체 단편, 항-CD28-항체의 1가 항체 단편, 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD28 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 2가 항체 단편은 (Fab)2'-단편 또는 2가 단일 사슬 Fv 단편일 수 있는 반면, 1가 항체 단편은 Fab 단편, FV 단편 및 단일 사슬 Fv 단편(scFv)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 경우에, 항체 유사 CD3 결합 특성을 가진 단백질성 결합 분자는 압타머(aptamer), 리포칼린(lipocalin) 패밀리의 폴리펩티드에 기초한 뮤테인(mutein), 글루바디(glubody), 안키린(ankyrin) 스캐폴드에 기초한 단백질, 결정성 스캐폴드에 기초한 단백질, 아드넥틴(adnectin) 또는 아비머(avimer)일 수 있다.
일부 구현예에서, 항-CD28 Fab 단편은 항체(GenBank Accession No. AF451974.1하의 합성 단일 사슬 Fv 구성체(synthetic single chain Fv construct)로서 증착됨; 또한 문헌 「Vanhove 등, BLOOD, 15 July 2003, Vol. 102, No. 2, pages 564-570」 참조)로부터 유래될 수 있으며, 그의 가변 중쇄 및 경쇄는 각각 서열번호 91 및 92를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD28 Fab는 각각 서열번호 91 및 92에 제시된 가변 중쇄 및 경쇄의 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 CD90이고 상기 2차 자극제는 CD90를 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD90를 특이적으로 결합하는 상기 2차 자극제는 항-CD90-항체, 항-CD90-항체의 2가 항체 단편, 항-CD90-항체의 1가 항체 단편, 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD90 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 당해 분야 공지의 것으로부터 선택될 수 있다[문헌 「nti-CD90 antibody G7 ( 105201)」 참조].
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 CD95이고 상기 2차 자극제는 CD95를 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD95를 특이적으로 결합하는 상기 2차 자극제는 항-CD95-항체, 항-CD95-항체의 2가 항체 단편, 항-CD95-항체의 1가 항체 단편, 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD95 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 당해 분야 공지의 것으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어 일부 측면에서, 상기 항-CD90 항체는 예를 들어 문헌 「Paulsen 등, Cell Death & Differentiation 18.4 (2011): 619-631」에 기술된 바와 같은 모노클론성 마우스 항-인간 CD95 CH11(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)이거나 또는 항-CD95 mAb 7C11 또는 항-APO-1일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 T 세포 또는 B 세포 상의 분자는 CD137이고 상기 2차 자극제는 CD137을 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD137을 특이적으로 결합하는 상기 2차 자극제는 항-CD137-항체, 항-CD137-항체의 2가 항체 단편, 항-CD137-항체의 1가 항체 단편, 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD137 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 당해 분야 공지의 것으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어 상기 항-CD137 항체는 문헌 「Taraban 등, Eur J Immunol. 2002 Dec;32(12):3617-27」에 기술된 바와 같은 LOB12, IgG2a 또는 LOB12.3, IgG1일 수 있다. [예를 들어 US6569997, US6303121, 문헌 「Mittler 등, Immunol Res. 2004;29(1-3):197-208」 참조].
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 B 세포 상의 분자는 CD40일 수 있으며 상기 2차 자극제는 CD40을 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD40을 특이적으로 결합하는 상기 2차 자극제는 항-CD40-항체, 항-CD40-항체의 2가 항체 단편, 항-CD40-항체의 1가 항체 단편, 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD40 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 CD40L(CD154)일 수 있으며 상기 2차 자극제는 CD40L을 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD40L을 특이적으로 결합하는 상기 2차 자극제는 항-CD40L-항체, 항-CD40L-항체의 2가 항체 단편, 항-CD40L-항체의 1가 항체 단편, 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD40L 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 당해 분야 공지의 것으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어 일부 측면에서 상기 항-CD40L 항체는 문헌 「Blair 등, JEM vol. 191 no. 4 651-660」에 기술된 바와 같은 Hu5C8일 수 있다. [예를 들어 국제공개공보 제WO1999/061065호, 미국출원공개공보 제US20010026932호, 제US7547438호, 국제공개공보 제WO2001056603호 참조].
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 유도가능한 T 세포 공자극제(inducible T cell Costimulator; ICOS)일 수 있으며 상기 2차 자극제는 ICOS를 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, ICOS를 특이적으로 결합하는 상기 2차 자극제는 항-ICOS-항체, 항-ICOS-항체의 2가 항체 단편, 항-ICOS-항체의 1가 항체 단편, 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 ICOS 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 당해 분야 공지의 것으로부터 선택될 수 있다. [예를 들어 미국출원공개공보 제US20080279851호 및 문헌 「Deng 등, Hybrid Hybridomics. 2004 Jun;23(3):176-82」 참조].
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 T 세포의 활성화를 위한 링커(Linker for Activation of T cells; LAT)일 수 있으며 상기 2차 자극제는 LAT를 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, LAT를 특이적으로 결합하는 상기 2차 자극제는 항-LAT-항체, 항-LAT-항체의 2가 항체 단편, 항-LAT-항체의 1가 항체 단편, 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 LAT 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 당해 분야 공지의 것으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 CD27일 수 있으며 상기 2차 자극제는 CD27을 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD27을 특이적으로 결합하는 상기 2차 자극제는 항-CD27-항체, 항-CD27-항체의 2가 항체 단편, 항-CD27-항체의 1가 항체 단편, 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD27 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 당해 분야 공지의 것으로부터 선택될 수 있다. [예를 들어 국제공개공보 제WO2008/051424호 참조].
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 OX40일 수 있으며 상기 2차 자극제는 OX40을 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, OX40을 특이적으로 결합하는 상기 2차 자극제는 항-OX40-항체, 항-OX40-항체의 2가 항체 단편, 항-OX40-항체의 1가 항체 단편, 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 OX40 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 당해 분야 공지의 것으로부터 선택될 수 있다. [예를 들어 국제공개공보 제WO2013/038191호, 문헌 「Melero 등, Clin Cancer Res. 2013 Mar 1;19(5):1044-53」 참조].
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 HVEM일 수 있으며 상기 2차 자극제는 HVEM을 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, HVEM을 특이적으로 결합하는 상기 2차 자극제는 항-HVEM-항체, 항-HVEM-항체의 2가 항체 단편, 항-HVEM-항체의 1가 항체 단편, 및 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 HVEM 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 당해 분야 공지의 것으로부터 선택될 수 있다. [예를 들어 국제공개공보 제WO2006/054961호, 제WO2007001459호, 문헌 「Park 등, Cancer Immunol Immunother. 2012 Feb;61(2):203-14」 참조].
임의의 상기 구체예에서, 2가 항체 단편은 (Fab)2'-단편 또는 2가 단일 사슬 Fv 단편일 수 있는 반면, 1가 항체 단편은 Fab 단편, FV 단편 및 단일 사슬 Fv 단편(scFv)으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 임의의 상기 구체예에서, 항체 유사 결합 특성을 가진 단백질성 결합 분자는 압타머(aptamer), 리포칼린(lipocalin) 패밀리의 폴리펩티드에 기초한 뮤테인(mutein), 글루바디(glubody), 안키린(ankyrin) 스캐폴드에 기초한 단백질, 결정성 스캐폴드에 기초한 단백질, 아드넥틴(adnectin) 및 아비머(avimer)일 수 있다.
일부 측면에서, 상기 자극제는, 분자가 TCR, 키메라 항원 수용체, 또는 면역 수용체 티로신-기반 활성화 모티프 도는 ITAM인 표적 세포의 표변 위에 발현된 분자를 특이적을 표적화한다. 예를 들어 상기 표적 세포의 표면 위에 발현된 분자는 T 세포 또는 B 세포 항원 수용체 복합체, CD3 사슬, CD3 제타, T 세포수용체 또는 B 세포수용체의 항원-결합 부분, 또는 키메라 항원 수용체로부터 선택된다. 일부 경우에, 상기 자극제는 펩티드:MHC 부류 I 복합체를 표적화한다.
일부 구현예에서, 상기 자극제는 상기 표적 세포의 표면 위에 발현된 분자의 His-태그된 세포외 도메인(His-tagged extracellular domain)에 결합한다. 일부 경우에, 상기 자극제는 니켈 하전된 trisNTA(His-STREPPER 또는 His/Strep-tag®II Adapter라고도 함)과 접합된 펜티드 서열 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열번호 69에 제시된 Strep-tag®II라고도 함)을 함유한다. 일부 구현예에서, His-태그된 표적 세포의 표면 위에 발현된 상기 분자는 CD19이다.
일부 구현예에서, 상기 자극제는 상기 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 항체 부분에 특이적으로 결합한다. 일부 경우에, 상기 재조합 수용체의 항체 부분은 면역글로불린 콘스턴트 영역, 예를 들어 IgG4 힌지 영역, 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역의 적어도 일부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 콘스턴트 영역은 인간 IgG, 예를 들어 IgG4 또는 IgG1 중의 것이다. 일부 경우에, 상기 시약은 상기 IgG4 스페이서를 인식하는 αIgG로 로딩된다.
일부 구현예에서, 원하는 표적은 T 세포수용체 및/또는 T 세포수용체의 성분이다. 특정 구현예에서, 원하는 표적은 CD3이다. 특정 구현예에서, 원하는 표적은 T 세포 공자극 분자, 예를 들어 CD28, CD137(4-1-BB), OX40 또는 ICOS이다.
일부 구현예에서, 예를 들어 상기 자극제가 자극 시약 또는 수용체-결합 제제 시약과 결합되지 않을 때, 상기 자극제는 항체, 2가 항체 단편, F(ab)2, 또는 2가 단일-사슬 Fv 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 자극제가 상기 시약과 결합되지 않을 때, 상기 자극제는 결합 파트너 C를 포함하지 않는다.
a.
비드
시약
특정 구현예에서, 자극 시약은 세포, 예를 들어 T 세포를 활성화 및/또는 증폭시킬 수 있는 하나 이상의 제제와 컨쥬게이트 또는 연결된 입자, 예를 들어 생체 분자, 예를 들어 비드를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제는 비드에 결합된다. 일부 구현예에서, 비드는 생체 적합성(biocompatible), 즉 생물학적 용도에 적합한 물질로 구성된다. 일부 구현예에서, 비드는 배양된 세포, 예를 들어 배양된 T 세포에 비독성이다. 일부 구현예에서, 비드는 제제와 세포 사이의 상호 작용을 허용하는 방식으로 제제를 부착할 수 있는 임의의 입자일 수 있다.
일부 구현예에서, 자극 시약은, 비드 및 세포 표면의 거대 분자와 직접 상호 작용하는 하나 이상의 제제를 포함한다. 특정 구현예에서, 비드(예를 들어 상자성 비드)는 세포상의 하나 이상의 거대 분자(예를 들어 하나 이상의 세포 표면 단백질)에 특이적인 하나 이상의 제제(예를 들어 항체)를 통해 세포와 상호 작용한다. 특정 구현예에서, 비드(예를 들어 상자성 비드)는 본원에 기재된 제 1 제제, 예를 들어 1차 항체(예를 들어 항-비오틴 항체) 또는 다른 생체 분자로 표지된 다음, 제 2 제제, 예를 들어 2차 항체(예를 들어 비오티닐화된(biotinylated) 항-CD3 항체) 또는 다른 제 2 생체 분자(예를 들어 스트렙타비딘(streptavidin))가 첨가됨으로써, 2차 항체 또는 다른 제 2 생체 분자는 입자의 1차 항체 또는 다른 생체 분자와 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 비드는 약 0.001㎛ 초과, 약 0.01㎛ 초과, 약 0.1㎛ 초과, 약 1.0㎛ 초과, 약 10㎛ 초과, 약 50㎛ 초과, 약 100 ㎛ 초과, 또는 약 1000㎛ 초과 및 약 1500㎛ 이하의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 비드는 약 1.0㎛ 내지 약 500㎛, 약 1.0㎛ 내지 약 150㎛, 약 1.0㎛ 내지 약 30㎛, 약 1.0㎛ 내지 약 10㎛, 약 1.0㎛ 내지 약 5.0㎛, 약 2.0㎛ 내지 약 5.0㎛, 또는 약 3.0㎛ 내지 약 5.0㎛의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 비드는 약 3㎛ 내지 약 5㎛의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 비드는 적어도 (약) 또는 약 0.001㎛, 0.01㎛, 0.1㎛, 0.5 ㎛, 1.0㎛, 1.5㎛, 2.0㎛, 2.5㎛, 3.0㎛, 3.5㎛, 4.0㎛, 4.5 ㎛, 5.0㎛, 5.5㎛, 6.0㎛, 6.5㎛, 7.0㎛, 7.5㎛, 8.0㎛, 8.5㎛, 9.0㎛, 9.5㎛, 10㎛, 12㎛, 14㎛, 16㎛, 18㎛ 또는 20㎛의 직경을 갖는다. 특정 구현예에서, 비드는 직경이 4.5㎛ 또는 약 4.5㎛이다. 특정 구현예에서, 비드는 직경이 2.8㎛ 또는 약 2.8㎛이다.
일부 구현예에서, 비드는 0.001 g/㎤ 초과, 0.01 g/㎤ 초과, 0.05 g/㎤ 초과, 0.1 g/㎤ 초과, 0.5 g/㎤ 초과, 0.6 g/㎤ 초과, 0.7 g/㎤ 초과, 0.8 g/㎤ 초과, 0.9 g/㎤ 초과, 1 g/㎤ 초과, 1.1 g/㎤ 초과, 1.2 g/㎤ 초과, 1.3 초과 g/㎤, 1.4 g/㎤ 초과, 1.5 g/㎤ 초과, 2 g/㎤ 초과, 3 g/㎤ 초과, 4 g/㎤ 초과, 또는 5g/㎤ 초과의 밀도를 갖는다. 일부 구현예에서, 비드는 약 0.001g/㎤ 내지 약 100g/㎤, 약 0.01g/㎤ 내지 약 50g/㎤, 약 0.1g/㎤ 내지 약 10 g/㎤, 약 0.1g/㎤ 내지 약 .5 g/㎤, 약 0.5 g/㎤ 내지 약 1 g/㎤, 약 0.5 g/㎤ 내지 약1.5 g/㎤, 약 1g/㎤ 내지 약 1.5g/㎤, 약 1g/㎤ 내지 약 2g/㎤, 또는 약 1g/㎤ 내지 약 5g/㎤의 밀도를 갖는다. 일부 구현예에서, 비드는 약 0.5g/㎤, 약 0.6g/㎤, 약 0.7g/㎤, 약 0.8g/㎤, 약 0.9g/㎤, 약 1.0g/㎤, 약 1.1g/㎤, 약 1.2g/㎤, 약 1.3g/㎤, 약 1.4g/㎤, 약 1.5g/㎤, 약 1.6g/㎤, 약 1.7g/㎤, 약 1.8g/㎤, 약 1.9g/㎤, 또는 약 2.0 g/㎤의 밀도를 갖는다. 특정 구현예에서, 비드는 약 1.6 g/㎤의 밀도를 갖는다. 특정 구현예에서, 비드 또는 입자는 약 1.5 g/㎤의 밀도를 갖는다. 특정 구현예에서, 입자는 약 1.3 g/㎤의 밀도를 갖는다.
특정 구현예에서, 복수의 비드는 균일한 밀도를 갖는다. 특정 구현예에서, 균일한 밀도는 평균 비드 밀도의 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만의 밀도 표준 편차를 포함한다.
일부 구현예에서, 비드는 제제에 결합, 연결 또는 컨쥬게이트될 수 있는 비드 표면에 또는 근처에 하나 이상의 물질을 함유한다. 일부 구현예에서, 비드는 표면 작용성화된(functionalized), 즉 결합 분자, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 공유 결합을 형성할 수 있는 작용기를 포함한다. 특정 구현예에서, 비드는 표면-노출된 카르복실, 아미노, 히드록실, 토실, 에폭시 및/또는 클로로메틸 기를 포함한다. 특정 구현예에서, 비드는 표면 노출된 아가로오스(agarose) 및/또는 세파로오스(sepharose)를 포함한다. 특정 구현예에서, 비드 표면은 결합 분자에 결합하거나 부착할 수 있는 부착된 자극 시약을 포함한다. 특정 구현예에서, 생체 분자는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 비드는 표면 노출 단백질 A, 단백질 G 또는 비오틴(biotin)을 포함한다.
일부 구현예에서, 비드는 자기장에서 반응한다. 일부 구현예에서, 비드는 자기(magnetic) 비드이다. 일부 구현예에서, 자기(magnetic) 비드는 상자성이다. 특정 구현예에서, 자기(magnetic) 비드는 초상자성(superparamagnetic)이다. 특정 구현예에서, 비드는 이들이 자기장에 노출되지 않는 한 어떠한 자기 특성도 나타내지 않는다.
특정 구현예에서, 비드는 자기(magnetic) 코어, 상자성 코어 또는 초상 자성(superparamagnetic) 코어를 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 코어는 금속을 함유한다. 일부 구현예에서, 금속은 철, 니켈, 구리, 코발트, 가돌리늄(gadolinium), 망간, 탄탈륨 tantalum), 아연, 지르코늄 또는 이들의 임의의 조합일 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 특정 구현예에서, 자기 코어는 금속 산화물 (예를 들어 산화철), 페라이트(ferrites) (예를 들어 망간 페라이트(manganese ferrites), 코발트 페라이트(cobalt ferrites), 니켈 페라이트(nickel ferrites) 등), 적철광(hematite) 및 금속 합금 (예를 들어 CoTaZn)을 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 코어는 페라이트, 금속, 금속 합금, 산화철 또는 이산화 크롬(chromium dioxide) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 코어는 철 원소(elemental iron) 또는 이의 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 코어는 마그네타이트(magnetite)(Fe3O4), 마그헤마이트(maghemite)(γFe2O3) 또는 그레이그라이트(greigite) (Fe3S4) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 내부 코어는 산화철(예를 들어 Fe3O4)을 포함한다.
특정 구현예에서, 비드는 표면 기능화된 코트 또는 코팅으로 덮인 자기, 상자성 및/또는 초상 자성 코어를 포함한다. 일부 구현예에서, 코트는 중합체(polymer), 다당류(polysaccharide), 실리카, 지방산, 단백질, 탄소, 아가로스(agarose), 세파로오스(sepharose) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는 물질을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체(polymer)는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리(락트-코-글리콜산(lactic-co-glycolic acid)), 폴리 글루타르알데히드(polyglutaraldehyde), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리스티렌(polystyrene) 또는 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol) 일 수 있다. 특정 구현예에서, 외부 코트 또는 코팅은 폴리스티렌(polystyrene)을 포함한다. 특정 구현예에서, 외부 코팅은 표면 기능화(functionalized)된다.
일부 구현예에서, 자극 시약은 금속 산화물 코어(예를 들어 산화철 코어) 및 코트를 포함하는 비드를 포함하고, 여기서 금속 산화물 코어는 하나 이상의 다당류(예를 들어 덱스 트란)를 포함하고, 여기서 코트는 하나 이상의 다당류(예를 들어 아미노 덱스트란), 하나 이상의 중합체(예를 들어 폴리 우레탄) 및 실리카를 포함한다. 일부 구현예에서, 금속 산화물 코어는 콜로이드성(colloidal) 산화철 코어이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 제제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 제제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 항-CD3 항체, 항-CD28 항체 및 항-비오틴 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 항-비오틴(anti-biotin) 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드는 약 3㎛ 내지 약 10㎛의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 비드는 약 3㎛ 내지 약 5㎛의 직경을 갖는다. 특정 구현예에서, 비드는 약 3.5㎛의 직경을 갖는다.
일부 구현예에서, 자극 시약은 금속 산화물 코어(예를 들어 산화철 내부 코어) 및 코트(예를 들어 보호 코트)를 포함하는 비드에 부착된 하나 이상의 시약을 포함하고, 여기서 코트는 폴리스티렌을 포함한다. 특정 구현예에서, 비드는 상자성(예를 들어 초상자성(superparamagnetic)) 철 코어, 예를 들어 마그네타이트 (Fe3O4) 및/또는 마그헤마이트(maghemite)(γFe2O3)c를 포함하는 코어 및 폴리스티렌(polystyrene) 코트 또는 코팅을 포함하는 단분산성(monodisperse), 상자성(paramagnetic) (예를 들어 초상 자성(superparamagnetic)) 비드이다. 일부 구현예에서, 비드는 비-다공성(non-porous)이다. 일부 구현예에서, 비드는 하나 이상의 제제가 부착된 작용화된(functionalized) 표면을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 제제는 표면에서 비드에 공유 결합된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제는 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체, 및 표지된 항체 (예를 들어 비오티닐화(biotinylated) 항체), 예를 들어 표지된 항-CD3 또는 항-CD28 항체에 결합할 수 있는 항체 또는 그의 항원 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 비드는 약 1.5g/㎤의 밀도 및 약 1 ㎡/g 내지 약 4 ㎡/g 의 표면적을 갖는다. 특정 구현예에서; 비드는 직경이 약 4.5㎛이고 밀도가 약 1.5g/㎤인 단분산성(monodisperse) 초상자성(superparamagnetic) 비드이다. 일부 구현예에서, 비드 비드는 평균 직경이 약 2.8㎛이고 밀도가 약 1.3g/㎤인 단분산성(monodisperse) 초상자성(superparamagnetic) 비드이다.
일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 조성물은 (약) 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.5:1, 1.25:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.75:1, 0.67:1, 0.5:1, 0.3:1, 또는 0.2:1의 비드 대 세포의 비율로 자극 시약과 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 상기 비드 대 세포의 비율은 2.5:1 내지 0.2:1, 2:1 내지 0.5:1, 1.5:1 내지 0.75:1, 1.25:1 내지 0.8:1, 1.1:1 내지 0.9:1이다. 특정 구현예에서, 상기 비드 대 세포의 비율은 약 1:1 또는 1:1이다.
b. 올리고머
스트렙타비딘
뮤테인
시약
특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 올리고머 시약, 예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인 시약(streptavidin mutein reagent)을 함유하고, 그것은 하나 이상의 제제, 예를 들어 TCR 복합체의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 리간드에 콘쥬게이트되거나, 연결되거나, 또는 부착되는 것이다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 제제는 특정 결합 부위(예를 들어 결합 부위 Z)에서 올리고머 시약과 결합할 수 있는 부착된 결합 도메인 또는 결합 파트너(예를 들어 결합 파트너 C)를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 제제가 상기 올리고머 시약에 가역적으로 결합된다. 다양한 구현예에서, 상기 올리고머 시약은 특정 구현예에서 결합 도메인(예를 들어 결합 파트너 C)에서 복수의 제제에 가역적으로 결합되는 복수의 특정 결합 부위를 갖는다. 일부 구현예에서, 결합된 제제의 양은 경쟁 시약, 예를 들어 특정 결합 부위(예를 들어 결합 부위 Z)에 결합할 수도 있는 시약의 존재하에 감소된다.
일부 구현예에서, 상기 올리고머 자극 시약은, 적어도 하나의 제제(예를 들어 세포 예를 들어 T 세포에서 신호를 생성할 수 있는 제제)가 상기 올리고머 시약과 관련되는, 예를 들어 가역적으로 관련되는 가역적 시스템이거나 또는 포함한다. 상기 올리고머 자극 시약의 비제한적 예는 예를 들어 국제공개공보 제WO 2018/197949호에서 찾을 수 있으며, 상기 국제공개공보는 그 전체가 본원에서 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 시약은 상기 제제에 결합할 수 있는, 예를 들어 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 함유한다. 일부 경우에, 상기 시약은 세포 예를 들어 T 세포에서 신호를 생성할 수 있는 적어도 하나의 부착된 제제를 갖는 올리고머 입자 시약이다. 일부 구현예에서, 상기 제제는, 상기 분자의 에피토프 또는 영역에 특이적으로 결합할 수 있고 또한 상기 시약의 적어도 하나의 결합 부위, 예를 들어 상기 시약의 결합 부위 Z에 특이적으로 결합하는, 결합 파트너 C로도 지칭되는 결합 파트너를 함유하는, 적어도 하나의 결합 부위, 예를 들어 결합 부위 B를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 결합 파트너 C와 상기 적어도 하나의 결합 부위 Z 사이의 결합 상호작용은 비-공유 상호작용이다. 일부 경우, 상기 결합 파트너 C와 상기 적어도 하나의 결합 부위 Z 사이의 결합 상호작용은 공유 상호작용이다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 결합 부위 Z 사이의 결합 상호작용, 예를 들어 비-공유 상호작용은 가역적이다.
상기 가역적 시스템에서 올리고머 시약으로서 사용될 수 있는 물질은 공지되어 있다[미국특허 제5,168,049호; 제5,506,121호; 제6,103,493호; 제7,776,562호; 제7,981,632호; 제8,298,782호; 제8,735,540호; 제9,023,604호; 및 국제공개공보 제WO2013/124474호 및 제WO2014/076277호 참조]. 가역적 상호작용을 형성할 수 있는 시약 및 결합 파트너, 및 그러한 결합을 되돌릴 수 있는 물질(예를 들어 경쟁 시약)은 하기 기술된다.
일부 구현예에서, 상기 올리고머 시약은 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체(예를 들어 뉴트라비딘) 또는 그들의 혼합물의 올리고머이며, 여기서 상기 올리고머 시약은 상기 제제의 결합 도메인(예를 들어 결합 파트너 C)와 가역적으로 관련시키기 위한 하나 이상의 결합 부위를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 제제의 결합 도메인은 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체, 또는 스트렙타비딘-결합 펩티드 또는, 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체, 아비딘 또는 아미딘 뮤테인 또는 유사체에 특이적으로 결합할 수 있는 다른 분자일 수 있다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 제제(예를 들어 세포 예를 들어 T 세포에서 신호를 생성할 수 있는 제제)는, 상기 올리고머 시약, 예를 들어 상기 올리고머 시약 상에 존재하는 상기 복수의 특정 결합 부위(예를 들어 결합 부위 Z)와 관련되거나, 예를 들어 거기에 가역적으로 결합된다. 일부 경우에, 이것은, 상기 제제에 의해 결합되거나 인식되는 세포 표면 분자를 (그의 적어도 2개의 복제물에서) 각는 표적 세포가 상기 제제와 접촉하는 경우 결합활성 효과가 발생할 수 있도록 서로 근접하게 배열되는 제제를 생성한다.
일부 구현예에서, 상기 올리고머 제제는 스트렙타비딘 올리고머, 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머, 스트렙타비딘 유사체 올리고머, 아미딘 올리고머, 아비딘 뮤테인 또는 아비딘 유사체(예를 들어 뉴트라비딘) 또는 그들의 혼합물로 구성된 올리고머이다. 특정 구현예에서, 상기 올리고머 시약은 제제의 결합 도메인(예를 들어 결합 파트너 C)에 결합할 수 있는 특정 결합 부위를 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 결합 도메인은 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체, 또는 스트렙타비딘-결합 펩티드 또는, 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체, 아비딘 또는 아비딘 뮤테인 또는 유사체에 특이적으로 결합할 수 있는 다른 분자일 수 있다. 본원에 제공된 방법은, 상기 올리고머 시약이 올리고히스티딘 친화도 태그(oligohistidine affinity tag), 칼모듈린(calmodulin) 또는 그의 유사체, 칼모듈린 결합 펩티드(CBP), FLAG-펩티드, HA-태그, 말토스 결합 단백질(MBP), HSV 에피토프, myc 에피토프, 및/또는 비오티닐화된 담체 단백질에 결합할 수 있는 분자을 포함한다.
일부 구현예에서, 스트렙타비딘은 야생형 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체, 예를 들어 스트렙타비딘-유사 폴리펩티드일 수 있다. 유사하게, 일부 측면에서, 아비딘은 야생형 아비딘 또는 아비딘의 뮤테인 또는 유사체 예를 들어 뉴트라비딘, 천연 아비딘의 대안으로 이용 가능하고 보다 중성 pi를 전형적으로 나타내는 개질 아르기닌을 갖는 탈당화된 아비딘을 포함한다. 일반적으로, 아비딘의 탈당화된, 중성 형태는 상업적으로 이용 가능한 형태 예를 들어 "Extravidin"(Sigma Aldrich를 통해 이용 가능) 또는 "NeutrAvidin"(예를 들어 Thermo Scientific 또는 Invitrogen을 통해 이용 가능)을 포함한다.
일부 구현예에서, 시약은 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체이다. 일부 구현예에서, 야생형 스트렙타비딘(wt-스트렙타비딘)은 문헌[Argarana 외, Nucleic Acids Res 14(1986) 1871-1882(서열번호 66)]에 개시된 아미노산 서열을 갖는다. 일반적으로, 스트렙타비딘은 자연에서 4 개의 같은 서브 유닛의 사량체로 존재한다, 즉 동종-사량체이고, 각각의 서브 유닛은 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 비오틴 모방체에 대한 단일 결합 위치를 함유한다. 스트렙타비딘 서브 유닛의 예시적인 서열은 서열번호 66에 제시된 아미노산 서열이나, 상기 서열은 다른 Streptomyces 종으로부터 이의 상동물에 존재하는 서열을 또한 포함할 수 있다. 특히, 스트렙타비딘의 각각의 서브 유닛은 약 10-14M 정도의 평형 해리 상수(KD)로 비오틴에 대한 강력한 결합 친화도를 나타낼 수 있다. 일부 경우에, 스트렙타비딘은 4 개의 결합 위치 중 하나만이 작용성인 1가 사량체[문헌 「Howarth 등, (2006) Nat. Methods, 3:267-73」; 「Zhang 등, (2015) Biochem. Biophys. Res. Commun., 463:1059-63」 참조], 4 개의 결합 위치 중 2 개가 작용성인 2 가 사량체[문헌 「Fairhead 등, (2013) J. Mol. Biol., 426:199-214」 참조]로 존재할 수 있고 또는 단량체 또는 이량체 형태[문헌 「Wu 등, (2005) J. Biol. Chem., 280:23225-31」; 「Lim 등, (2010) Biochemistry, 50:8682-91」 참조]로 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 스트렙타비딘은 임의의 형태, 야생형 또는 미변형 스트렙타비딘, 예를 들어 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 비오틴 모방체에 대한 결합 부위를 함유하는 하나 이상의 작용성 서브 유닛을 포함하는 스트렙토마이세스 종(Streptomyces species)으로부터의 스트렙타비딘 또는 그의 기능적으로 활성인 단편일 수 있으며, 예를 들어 서열번호 66에 제시된 스트렙토마이세스 아비디니 세트(Streptomyces avidinii set)로부터의 야생형 스트렙타비딘 또는 그의 기능적으로 활성인 단편의 적어도 하나의 작용성 서브 유닛 또는 그의 기능적으로 활성인 단편을 함유한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 스트렙타비딘은 야생형 스트렙타비딘의 단편을 포함할 수 있으며, 이는 N-말단 및/또는 C-말단에서 단축된다. 이러한 최소 스트렙타비딘은 서열번호 66의 10번 내지 16번의 아미노산 위치의 영역에서 N-말단으로 시작하고 서열번호 66의 133번 내지 142번의 아미노산 위치의 영역에서 C-말단으로 종지하는 임의의 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘의 기능적 활성 단편은 서열번호 67에 제시된 아미노산의 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 예를 들어 서열번호 67에 제시된 것과 같은 스트렙타비딘은 추가로 서열번호 66에 제시된 넘버링 세트를 갖는 Ala13에 대응하는 위치에서 N-발단 메티오닌을 추가로 함유할 수 있다. 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인에서 잔기들의 위치에 관한 언급은 서열번호 66에서 잔기들의 넘버링과 관련이 있다.
스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인의 예는 예를 들어 국제공개공보 제WO 86/02077호, 독일특허출원 제 19641876 Al호, 미국특허 제6,022,951호, 국제공개공보 제WO 98/40396호 또는 제WO 96/24606호에 언급되어 있다. 스트렙타비딘 뮤테인의 예는 공지되어 있다[미국특허 제5,168,049호; 제5,506,121호; 제6,022,951호; 제6,156,493호; 제6,165,750호; 제6,103,493호; 또는 제6,368,813호; 국제공개공보 제WO2014/076277호 참조].
일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 미변형 또는 야생형 스트렙타비딘의 일부가 아니거나 또는 미변형 또는 야생형 스트렙타비딘의 일부만을 포함할 수 있는 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 미변형 또는 야생형 스트렙타비딘의 서브유닛과 비교하여, 예를 들어 서열번호 66에 제시된, 예를 들어 서열번호 67에 제시된 미변형 또는 야생형 스트렙타비딘 또는 그의 기능적 활성 단편과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환(대체)를 가질 수 있는 적어도 하나의 서브 유닛을 함유한다.
일부 구현예에서, 결합 도메인에 대한 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인(streptavidin mutein)의 평형 해리 상수(KD)는 1×10-4 M, 5×10-4 M, 1×10-5 M, 5x 10-5 M, 1×10-6 M, 5×10-6 M 또는 1×10-7 M 미만이지만, 일반적으로는 1×10-13 M, 1×10-12 M 또는 1×10-11 M 초과이다. 예를 들어 미국특허 제5,506,121호에 개시된 것과 같은 펩티드 서열(스트렙-태그(Strep-tags))은 비오틴 모방체(biotin mimics)로서 작용하고 대략 10-4 내지 10-5 M의 KD로 스트렙타비딘에 대한 결합 친화도를 입증한다[미국특허 제6,103,493호 또는 국제공개공보 제WO2014/076277호 참조]. 일부 구현예에서, 결합 친화도는 공지의 방법, 예를 들어 본원에서 기술된 임의의 방법에 의해서 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 시약, 예를 들어 시약, 예를 들어 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인은 펩티드 리간드 결합 파트너에 대한 결합 친화도를 나타내고, 상기 펩티드 리간드 결합 파트너는 제제(예를 들어 수용체-결합제 또는 선택제) 중에 존재하는 결합 파트너 C일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 펩티드 서열은 일반식 His-Pro-Xaa을 갖는 서열을 함유하며, 여기서 Xaa는 글루타민, 아스파라긴, 또는 메티오닌이며, 예를 들어 서열번호 83에 제시된 서열에 함유된다. 일부 구현예에서, 상기 펩티드 서열은 서열번호 83, 예를 들어 서열번호 74에 제시된 일반적인 방식을 갖는다. 한 구체예에서, 상기 펩티드 서열은 Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly('Strep-tag®'이라고도 함; 서열번호 75에 제시됨)이다. 한 구체예에서, 상기 펩티드 서열은 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys('Strep-tag® II'라고도 함; 서열번호 69에 제시됨)이다. 일부 구현예에서, 펩티드 리간드는 2 개 이상의 스트렙타비딘-결합 모듈의 순차적인 배열을 함유하고, 여기서 2 개의 모듈 사이 거리는 0 이상 및 50 개 이하의 아미노산이고, 여기서 1 개의 결합 모듈은 3 내지 8 개의 아미노산을 갖고 적어도 His-Pro-XaA 서열을 함유하고, 여기서 Xaa는 글루타민, 아스파라긴 또는 메티오닌이고, 다른 결합 모듈은 예를 들어 서열번호 84에 제시된 동일하거나 상이한 스트렙타비딘 펩티드 리간드를 갖는다[예를 들어 국제공개공보 제WO02/077018호; 미국특허 제7,981,632호 참조]. 일부 구현예에서, 펩티드 리간드는 임의의 서열번호 76 또는 77에 제시된 방식을 갖는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 펩티드 리간드는 임의의 서열번호 70-73, 또는 78-79에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 대부분의 경우, 이들 모두의 스트렙타비딘 결합-펩티드는 동일한 결합 부위, 즉 스트렙타비딘의 비오틴 결합 부위에 결합한다. 하나 이상의 스트렙타비딘 결합-펩티드가 결합 파트너 C, 예를 들어 C1 및 C2로서 사용되는 경우, 결합 파트너 C를 통해서 상기 하나 이상의 제제에 결합된 다량체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약은 전형적으로는 하나 이상의 스트렙타비딘 뮤테인로 구성된다.
일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 미국특허 제6,103,493호에 기술된 바와 같이 돌연변이체이다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 서열번호 66에 제시된 바와 같이 야생형 스트렙타비딘의 아미노산 서열에 기초한 아미노산 위치 44번 내지 53번의 영역 내에 적어도 하나의 돌연변이를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 하나 이상의 잔기 44, 45, 46 및/또는 47번에서 돌연변이를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은, 소수성 지방족 아미노산, 예를 들어 Val, Ala, Ile 또는 Leu, 45번 위치의 임의의 아미노산, 지방족 아미노산, 예를 들어 46번 위치의 소수성 지방족 아미노산으로 야생형 스트렙타비딘의 44번 위치의 Glu의 치환 및/또는 염기성 아미노산, 예를 들어 Arg 또는 Lys, 예를 들어 일반적으로는 Arg으로 47번 위치의 Val의 치환을 함유한다. 일부 구현예에서, Ala는 46번 위치에 있고/있거나 Arg는 47번 위치에 있고/있거나 Val 또는 Ile는 44번 위치에 있다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은, 예를 들어 서열번호 80 또는 서열번호 81 또는 82(스트렙타비딘 뮤테인 1, SAM1로도 알려짐) 또는 서열번호 86 또는 87에 제시된 아미노산의 서열을 함유하는 예시적인 스트렙타비딘 뮤테인에 제시된 것과 같은 야생형 스트렙타비딘의 아미노산 서열에 기반하는 잔기 Val44-Thr45-Ala46-Arg47을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은, 예를 들어 서열번호 85, 68, 또는 73에 제시된 아미노산의 서열을 함유하는 예시적인 스트렙타비딘 뮤테인(SAM2로도 알려짐)에 제시된 것과 같은 야생형 스트렙타비딘의 아미노산 서열에 기반하는 잔기 Ile44-Gly45-Ala46-Arg47을 함유한다. 일부 경우에, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 예를 들어 미국특허 제6,103,493호에 기술되어 있으며, 상표명 Strep-Tactin®으로 상업적으로 판매되고 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 서열번호 86 또는 서열번호 87에 제시된 아미노산의 서열을 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 분자는 서열번호 67, 81, 68, 86, 88, 82 또는 73 중의 임의의 것에 제시된 서열을 포함하는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인의 사량체(tetramer)이며, 이것은 사량체로서, 단량체당 1개의 N-말단 아민 및 4개의 리신(lysine)을 포함한, 20개의 1차 아민을 함유하는 분자이다.
일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 펩티드 리간드(Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly; Strep-tag®로도 불리워짐; 서열번호 75에 제시됨)에 대해 3.7×10-5 M 이거나 그 미만이고/이거나 펩티드 리간드(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys; Strep-tag® II로도 불리워짐; 서열번호 69에 제시됨)에 대해 7.1×10-5 M이거나 그 미만이고/이거나 서열번호 69, 76-78, 70-72, 74, 75, 83, 84 중의 임의의 것에 제시된 펩티드 리간드 중의 임의의 것에 대해 7.0×10-5 M, 5.0×10-5 M, 1.0×10-5 M, 5.0×10-6 M, 1.0×10-6 M, 5.0×10-7 M, 또는 1.0×10-7 M 이거나 그 미만이지만, 일반적으로는 1×10-13 M, 1×10-12 M 또는 1×10-11 M 초과인 평형 해리 상수(KD)에 의해서 특징지워지는 결합 친화도를 나타낸다.
일부 구현예에서, 생성되는 스트렙타비딘 뮤테인은 펩티드 리간드(Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly; Strep-tag®로도 불리워짐; 서열번호 75에 제시됨)에 대해 2.7×104 M-1이거나 그 초과이고/이거나 펩티드 리간드(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys; Strep-tag® II로도 불리워짐; 서열번호 69에 제시됨)에 대해 1.4×104 M-1이거나 그 초과이고/이거나 서열번호 69, 76-78, 70-72, 74, 75, 83, 84 중의 임의의 것에 제시된 펩티드 리간드 중의 임의의 것에 대해 1.43×104 M-1, 1.67×104 M-1, 2×104 M-1, 3.33×104 M-1, 5×104 M-1, 1×105 M-1, 1.11×105 M-1, 1.25×105 M-1, 1.43×105 M-1, 1.67×105 M-1, 2×105 M-1, 3.33×105 M-1, 5×105 M-1, 1×106 M-1, 1.11×106 M-1, 1.25×106 M-1, 1.43×106 M-1, 1.67×106 M-1, 2×106 M-1, 3.33×106 M-1, 5×106 M-1, 1×107 M- 1 이거나 그 초과이지만, 일반적으로는 (약) 1×1013 M-1, 1×1012 M-1 또는 1×1011 M-1 초과인 평형 결합 상수(KA)에 의해서 특징지워지는 결합 친화도를 나타낸다.
특정 구현예에서, 본원에서는 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체로 구성되고/되거나 그를 함유하는 올리고머 입자 시약이 제공된다. 특정 구현예에서, 본원에서 제공된 상기 올리고머 입자 시약은, 하나 이상의 제제, 예를 들어 자극제 및/또는 선택제에 가역적으로 결합하고/하거나 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 올리고머 입자 시약은 70 nm 내지 125 nm의 반경, 예를 들어 평균 반경; 1×107 g/mol 내지 1×109 g/mol의 분자량; 및/또는 1,000개 내지 5,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 올리고머 입자 시약은 하나 이상의 제제 예를 들어 세포의 표면에서 분자에, 예를 들어 수용체에 결합하는 제제에 결합, 예를 들어 가역적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 제제는 본원에서, 예를 들어 섹션 II.C.3에서 기술된 시약이다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예를 들어 결합 파트너, 예를 들어 스트렙타비딘 결합-펩티드, 예를 들어 Strep-tag® II를 함유하는 항체 또는 그의 항원 단편이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 제제는 결합 파트너, 예를 들어 스트렙타비딘 결합-펩티드, 예를 들어 Strep-tag® II를 함유하는 항-CD3 및/또는 항-CD28 Fab이다.
일부 구현예에서, 본원에서는 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체로 구성되고/되거나 그를 함유하는 올리고머 입자 시약이 제공된다. 특정 구현예에서, 본원에서 제공된 상기 올리고머 입자 시약은, 하나 이상의 제제, 예를 들어 자극제 및/또는 선택제에 가역적으로 결합하고/하거나 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 올리고머 입자 시약은 80 nm 내지 120 nm의 반경, 예를 들어 평균 반경; 7.5×106 g/mol 내지 2×108 g/mol의 분자량; 및/또는 500개 내지 10,000개의 양, 예를 들어 평균 양을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 올리고머 입자 시약은 하나 이상의 제제 예를 들어 세포의 표면에서 분자에, 예를 들어 수용체에 결합하는 제제에 결합, 예를 들어 가역적으로 결합된다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 제제는 섹션 II.C.3에 기술된 제제이다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 결합 파트너, 예를 들어 스트렙타비딘 결합-펩티드, 예를 들어 Strep-tag® II를 함유하는 항-CD3 및/또는 항-CD28 Fab, 예를 들어 Fab이다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 제제는 결합 파트너, 예를 들어 스트렙타비딘 결합-펩티드, 예를 들어 Strep-tag® II를 함유하는 항-CD3 및/또는 항-CD28 Fab이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 또는 적어도 (약) 0.01 ㎍, 0.02 ㎍, 0.03 ㎍, 0.04 ㎍, 0.05 ㎍, 0.1 ㎍, 0.2 ㎍, 0.3 ㎍, 0.4 ㎍, 0.5 ㎍, 0.75 ㎍, 1 ㎍, 2 ㎍, 3 ㎍, 4 ㎍, 5 ㎍, 6 ㎍, 7 ㎍, 8 ㎍, 9 ㎍, 또는 10 ㎍의 올리고머 자극 시약의 존재하에서 자극된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 4 ㎍의 존재하에서 자극된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 3 ㎍의 존재하에서 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 2.75 ㎍의 존재하에서 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 2.5 ㎍의 존재하에서 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 2.25 ㎍의 존재하에서 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 2 ㎍의 존재하에서 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 1.8 ㎍의 존재하에서 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 1.6 ㎍의 존재하에서 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 1.4 ㎍의 존재하에서 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 1.2 ㎍의 존재하에서 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 1 ㎍의 존재하에서 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 106개의 세포 당 (약) 0.8 ㎍의 존재하에서 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 측면에서, 상기 올리고머 자극 시약의 4 ㎍는 3 ㎍의 올리고머 입자 및 1 ㎍의 부착된 제제, 예를 들어 0.5 ㎍ 의 항-CD3 Fabs 및 0.5 ㎍ 의 항-CD28 Fabs이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 (약) 10×108, 9×108, 8×108, 7×108 , 6×108 , 5×108 , 4×108, 3×108, 2×108, 1×108의 올리고머 시약의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 (약) 7×108 , 6×108 , 5×108 , 4×108, 3×108의 올리고머 시약의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 (약) 7×108 내지 3×108의 올리고머 시약의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 (약) 6×108 내지 4×108의 올리고머 시약의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 (약) 6×108 내지 5×108의 올리고머 시약의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 (약) 5×108의 올리고머 시약의 존재하에 자극되거나 또는 자극에 적용된다.
일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 샘플의 선택된 세포는 (약) 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.5:1, 1.25:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.75:1, 0.67:1, 0.5:1, 0.3:1, 또는 0.2:1의 올리고머 시약 대 세포의 비율의 백분율로 자극되거나 또는 자극에 적용된다. 특정 구현예에서, 상기 올리고머 시약 대 세포의 비율은 2.5:1 내지 0.2:1, 2:1 내지 0.5:1, 1.5:1 내지 0.75:1, 1.25:1 내지 0.8:1, 1.1:1 내지 0.9:1이다. 특정 구현예에서, 상기 올리고머 시약 대 세포의 비율은 약 1:1 또는 1:1이다. 특정 구현예에서, 상기 올리고머 시약 대 세포의 비율은 약 0.3:1이거나 또는 0.3:1이다. 특정 구현예에서, 상기 올리고머 시약 대 세포의 비율은 약 0.2:1이거나 또는 0.2:1이다.
특정 측면에서, 올리고머 시약 내에서, 올리고머 입자와 부착된 제제 사이의 질량 비율은 약 3:1이다. 특정 측면에서, 올리고머 시약 내에서, 올리고머 입자, 부착된 항-CD3 Fab 및 부착된 항-CD28 Fab 사이의 질량 비율은 약 3:0.5:0.5이다. 특정 측면에서, 4 ㎍의 올리고머 시약은 3 ㎍의 올리고머 입자 및 1 ㎍의 부착된 제제, 예를 들어 0.5 ㎍의 항-CD3 Fab 및 0.5 ㎍의 항-CD28 Fab이거나 이를 포함한다. 다른 구체예에서, 106 세포 당 1.2 ㎍의 올리고머 시약은, 106 세포 당 0.9 ㎍의 올리고머 입자 및 0.3 ㎍의 부착된 제제, 예를 들어 0.15 ㎍의 항-CD3 Fab 및 0.15 ㎍의 항-CD28 Fab이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고머 시약은 무혈청 배지에 첨가되고, 자극은 예를 들어 문헌 국제출원 제PCT/US2018/064627호에 기재된 바와 같이 무혈청 배지에서 수행된다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 보충물로 보충된 기본 배지(예를 들어 OpTmizer™ T-세포 증폭 기본 배지(ThermoFisher))를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 보충물는 무혈청이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는, 예를 들어 추가 보충물(예를 들어 OpTmizer™ T-세포 증폭 보충물(ThermoFisher))에 의해 제공되는 세포의 유지, 증폭 및/또는 활성화를 위한 하나 이상의 추가 성분으로 보충된 기본 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 혈청 대체 보충물, 예를 들어 면역 세포 혈청 대체제, 예를 들어 ThermoFisher, #A2596101, CTS™ 면역 세포 혈청 대체제 또는 문헌[Smith 등, Clin Transl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31]에 기재된 면역 세포 혈청 대체제를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 유리 형태의 아미노산, 예를 들어 L-글루타민을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 디펩티드 형태의 L-글루타민(예를 들어 L-알라닐-L-글루타민), 예를 들어 Glutamax™(ThermoFisher)의 디펩티드를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 재조합 사이토카인, 예를 들어 재조합 인간 IL-2, 재조합 인간 IL-7 및/또는 재조합 인간 IL-15를 더 포함한다.
2. 자극 시약의 제거
일부 구현예에서, 자극 시작은 세포를 수집, 수확, 또는 제형화하기 전에 세포 또는 세포 집단으로부터 제거된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 인큐베이션, 예를 들어 섹션 I-D에서와 같이 본원에서 기술된 인큐베이션 후 또는 도중에 세포 또는 세포 집단으로부터 분리 또는 제거된다. 특정 구현예에서, 상기 세포 또는 세포 집단은 상기 인큐베이션 후에 그러나 상기 세포를 수집, 수확, 또는 제형화하기 전에 상기 자극 시약을 제거하는 공정, 과정, 단계, 또는 기법을 수행한다. 특정 구현예에서, 상기 세포 또는 세포 집단은 상기 인큐베이션 후에 상기 자극 시약을 제거하는 공정, 과정, 단계, 또는 기법(technique)을 수행한다. 특정 구현예에서, 상기 세포 또는 세포 집단은 인큐베이션 후에 자극 시약을 제거하는 공정, 과정, 단계, 또는 기법을 거친다. 일부 측면에서, 인큐베이션도중 세포로부터 자극 시약이 분리될 때, 상기 세포는 인큐베이션의 잔여 기간동안 분리 또는 제거 이전과 동일한 인큐베이션 조건으로 복귀된다.
특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 세포로부터 제거 및/또는 분리된다. 이론에 구애됨이 없이, 특정 구현예에서, 자극 시약과 세포 사이의 결합 및/또는 연합(association)은 일부 경우 인큐베이션도중에 시간에 따라 감소될 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 제제를 부가하여 자극 시약과 세포 사이의 결합 및/또는 연합을 감소시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 세포 배양 조건에서의 변화, 예를 들어 제제의 첨가는 자극 시약과 세포 사이의 결합 및/또는 연합을 감소시킬 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 자극 시약은 예를 들어 배양, 세포 배양 시스템 및/또는 용액으로부터 세포를 제거하지 않고 배양, 세포 배양 시스템 및/또는 세포와 별도로 용액으로부터 제거될 수 있다.
특정 구현예에서, 자극 시약은 일정 시간 경과 후 세포로부터 분리 및/또는 제거될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 일정 시간은 자극의 개시로부터의 일정 시간이다. 특정 구현예에서, 상기 인큐베이션의 시작은 세포가 자극 시약 및/또는 상기 자극 시약을 함유하는 배지 또는 용액과 접촉하는 시점 또는 대략 그 시점인 것으로 고려된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 상기 자극의 개시 후 (약) 120시간, 108시간, 96시간, 84시간, 72시간, 60시간, 48시간, 36시간, 24시간, 또는 12시간 이내에 세포로부터 제거 또는 분리된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 상기 자극이 개시된 후 (약) 48시간에 세포로부터 제거 또는 분리된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 상기 자극이 개시된 후 (약) 72시간에 세포로부터 제거 또는 분리된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 상기 자극이 개시된 후 (약) 96시간에 세포로부터 제거 또는 분리된다.
a.
비드
시약의 제거
특정 구현예에서, 상기 비드 자극 시약, 예를 들어 항-CD3/항-CD28 항체 접합된 상자성 비드는 상기 세포들 또는 상기 세포 집단으로부터 분리되거나 제거된다. 자극 시약(예를 들어 입자 예를 들어 비드 입자 또는 자화가능한 입자이거나 또는 그를 함유하는 자극 시약)을 제거하는 방법은 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 상기 자극 시약의 1차 항체에 결합하고 상기 세포 상의 그의 항원에 대한 친화도를 변경시켜서 온화한 분리(gentle detachment)를 허용하는 경쟁 항체, 예를 들어 비-표지된 항체가 사용될 수 있다. 일부 경우에, 분리 후에 상기 경쟁 항체는 입자(예를 들어 비드 입자)와 결합된 상태를 유지할 수 있으나 미반응 항체는 세척되거나 될 수 있고 세포는 분리, 선택, 농축 및/또는 활성화하는 항체가 없다. 상기 시약의 예로는 DETACaBEAD(Friedl 외 1995; Entschladen 외 1997)가 있다. 일부 구현예에서, 입자(예를 들어 비드 입자)는 절단 가능한 링커(예를 들어 DNA 링커)의 존재하에 제거될 수 있고, 입자-결합된 항체는 링커(예를 들어 CELLection, Dynal)에 접합된다. 일부 경우에, 링커 영역은 분리, 예를 들어 DNA 분해효소 또는 기타 방출 완충액의 추가로 세포로부터 입자(예를 들어 비드 입자)를 제거하기 위한 절단 가능한 위치를 제공한다. 일부 구현예에서, 기타 효소적 방법이 세포로부터 입자(예를 들어 비드 입자)를 방출시키기 위해 이용될 수도 있다. 일부 구현예에서, 입자(예를 들어 비드 입자 또는 자화성 입자)는 생분해성이다.
일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 자성, 상자성, 및/또는 초상자성(superparamagnetic)이고/이거나, 자성, 상자성, 및/또는 초상자성인 비드를 함유하며, 상기 자극 시약은 세포를 자기장에 노출시킴으로써 세포로부터 제거될 수 있다. 자기장을 발생시키는 자석을 함유하는 적당한 장치의 예로는 DynaMag CTS(제조원: Thermo Fisher), Magnetic Separator(제조원: Takara) 및 EasySep Magnet(제조원: Stem Cell Technologies)를 들 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 상기 제공된 방법의 완료 전에, 예를 들어 본원에서 제공된 방법에 의해서 생산된 조작된 세포를 수확, 수집, 및/또는 제형화하기 전에 상기 세포로부터 제거 또는 분리된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 세포를 조작한 후, 예를 들어 형질도입 또는 형질감염 후에 상기 세포로부터 세포로부터 제거 또는 분리된다.
일부 구현예에서, 상기 자극 비드 시약, 예를 들어 상기 자극 자기 비드 시약은, 상기 세포를 수집, 수확, 또는 제형화하기 전에 상기 세포 또는 세포 집단으로부터 분리 또는 제거된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 비드 시약, 예를 들어 상기 자극 자기 비드 시약은, 상기 인큐베이션, 예를 들어 섹션 I-D에서와 같이 본원에서 기술된 인큐베이션 도중 또는 그 후에 자기장에 노출함으로써 상기 세포 또는 세포 집단으로부터 분리 또는 제거된다. 특정 구현예에서, 상기 세포 또는 세포 집단은, 상기 인큐베이션 후 그러나 상기 세포를 수집, 수확, 또는 제형화하는 단계 전에 상기 자기장에 노출되어 상기 자극 비드 시약, 예를 들어 상기 자극 자기 비드 시약을 제거된다. 특정 구현예에서, 상기 세포 또는 세포 집단은, 상기 인큐베이션 후에 상기 자기장에 노출되어 상기 자극 비드 시약, 예를 들어 상기 자극 자기 비드 시약을 제거된다. 일부 측면에서, 상기 자극 비드 시약이 상기 인큐베이션도중에 상기 세포 또는 세포 집단으로부터 분리 또는 제거되는 경우, 상기 세포 또는 세포 집단은, 상기 인큐베이션의 잔여 기간동안 상기 자기장에 노출되기 전과 동일한 인큐베이션 조건으로 복귀된다.
특정 구현예에서, 상기 자극 비드 시약, 예를 들어 상기 자극 자기 비드 시약은, 예를 들어 자기장에 노출됨으로써 상기 인큐베이션의 (약) 120시간, 108시간, 96시간, 84시간, 72시간, 60시간, 48시간, 36시간, 24시간, 또는 12시간 이내에 상기 세포로부터 분리 또는 제거된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 비드 시약, 예를 들어 상기 자극 자기 비드 시약은, 예를 들어 자기장에 노출됨으로써 상기 인큐베이션의 (약) 72시간 후에 상기 세포로부터 분리 또는 제거된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 비드 시약, 예를 들어 상기 자극 자기 비드 시약은, 예를 들어 자기장에 노출됨으로써 상기 인큐베이션의 (약) 96시간 후에 상기 세포로부터 분리 또는 제거된다.
b. 올리고머 시약의 제거
일부 구현예에서, 인큐베이션된 T 세포의 집단은, 물질, 예를 들어 경쟁 제제(competition agent)를 첨가하는 것, 예를 들어 상기 자극제의 신호 전달을 방해, 예를 들어 단축 및/또는 종지하도록 T 세포에 첨가하는, 본원에 제공된 임의의 방법에 따라 생성 또는 발생된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션된 T 세포의 집단은 물질, 예를 들어 경쟁 제제, 예를 들어 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예를 들어 D-비오틴의 존재를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 물질, 예를 들어 경쟁 제제, 예를 들어 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예를 들어 D-비오틴은, 상기 물질이 배양도중에 외인적으로 첨가되지 않은 배양된 T 세포의 기준 집단 또는 제제 중의 물질의 양 보다 적어도 1.5-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 100-배, 적어도 1000-배 또는 그 보다 많은 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 배양된 T 세포의 집단 중의, 상기 물질, 예를 들어 경쟁 제제, 예를 들어 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예를 들어 D-비오틴의 양은, 10 μM 내지 100 μM, 100 μM 내지 1 mM, 100 μM 내지 500 μM 또는 10 μM 내지 100 μM이다. 일부 구현예에서, 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예를 들어 D-비오틴의 10 μM 또는 약 10 μM이 상기 세포 또는 세포 집단에 첨가되어 상기 세포 또는 세포 집단으로부터 상기 올리고머 자극 시약을 분리 또는 제거한다.
특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 제제(예를 들어 TCR 및/또는 공수용체를 자극하거나 활성화하는 제제)는, 예를 들어 상기 올리고머 시약 상에 존재하는 복수의 특정 결합 부위(예를 들어 결합 부위 Z)를 통해서 상기 올리고머 시약과 결합하고, 예를 들어 그에 가역적으로 결합된다. 일부 경우에, 이것은, 제제에 의해서 결합되거나 인식되는 세포 표면 분자를 갖는 표적 세포(그의 적어도 2개의 복제물)가 상기 제제와 접촉하는 경우 결합활성 효과(avidity effect)가 발생할 수 있도록 제제들이 서로 근접하게 배열되게 한다. 일부 측면에서, 상기 수용체 결합 시약은 결합 부위 B에서 세포의 수용체 분자에 대해 낮은 친화도를 가지므로, 상기 수용체 결합 시약은 경쟁 시약의 존재하에서 상기 세포로부터 해리된다. 따라서, 일부 구현예에서, 상기 제제는 경쟁 시약의 존재하에서 세포로부터 제거된다.
일부 구현예에서, 상기 올리고머 자극 시약은 가역적으로 부착된 항-CD3 및 항-CD28 Fab를 갖는 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머이다. 일부 구현예에서, 상기 Fab는 예를 들어 상기 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머에 대한 가역성 부착을 허용하는 스트렙타비딘 결합 도메인을 함유한다. 일부 경우에, 항-CD3 및 항-CD28 Fab는, T 세포 발현 CD3 및/또는 CD28이 가역적으로 부착된 Fab를 갖는 올리고머 자극 시약과 접촉하는 경우 결합활성 효과를 발생하도록 서로 근접하게 배열된다. 일부 측면에서, 상기 Fab는 CD3 및 CD28에 대한 낮은 친화도를 가지므로, 상기 fab는 경쟁 시약, 예를 들어 비오틴 또는 비오틴 변이체 또는 유사체의 존재하에 세포로부터 해리된다. 따라서, 일부 구현예에서, 상기 Fab는 경쟁 시약 예를 들어 D-비오틴의 존재하에서 세포로부터 제거 또는 해리된다.
일부 구현예에서, 상기 올리고머 자극 시약, 예를 들어 상기 자극 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약은 세포를 수집, 수확 또는 제형화하기 전에 세포(들) 집단으로부터 제거 또는 분리된다. 일부 구현예에서, 자극 올리고머 시약, 예를 들어 상기 자극 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약은, 인큐베이션, 본원에서 예를 들어 섹션 I-D에서 기술된 인큐베이션 후 또는 도중에 경쟁 시약, 예를 들어 비오틴, 또는 비오틴 유사체와 접촉 또는 그에 대한 노출에 의해서 세포들 또는 세포 집단으로부터 제거 또는 분리된다. 특정 구현예에서, 상기 세포들 또는 세포 집단은 경쟁 시약, 예를 들어 비오틴, 또는 비오틴 유사체와 접촉 또는 노출되어 상기 인큐베이션 후 그러나 상기 세포를 수집, 수확 또는 제형화하기 전에 자극 올리고머 시약, 예를 들어 상기 자극 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약을 제거한다. 특정 구현예에서, 상기 세포들 또는 세포 집단은 경쟁 시약, 예를 들어 비오틴, 또는 비오틴 유사체와 접촉 또는 노출되어 상기 인큐베이션 후에 자극 올리고머 시약, 예를 들어 상기 자극 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약을 제거한다. 일부 측면에서, 자극 올리고머 시약, 예를 들어 상기 자극 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약이 상기 인큐베이션 도중에, 예를 들어 경쟁 시약, 예를 들어 비오틴 또는 비오틴 유사체 예를 들어 D-비오틴과의 접촉 또는 노출에 의해서 분리 또는 제거될 때, 상기 세포는 상기 인큐베이션의 잔여 기간동안 상기 분리 또는 제거 이전과 동일한 인큐베이션 조건으로 복귀된다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 (약) 또는 적어도 0.01 μM, 0.05 μM, 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 10 μM, 100 μM, 500 μM, 0.01 μM, 1 mM, 또는 10 mM의 경쟁 시약과 접촉하여 세포로부터 올리고머 자극 시약을 분리 또는 제거한다. 다양한 구현예에서, 상기 세포는 (약) 또는 적어도 0.01 μM, 0.05 μM, 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 10 μM, 100 μM, 500 μM, 0.01 μM, 1 mM, 또는 10 mM의 비오틴 또는 비오틴 유사체 예를 들어 D-비오틴과 접촉하여 세포로부터 항-CD3 및 항-CD28 Fab를 분리 또는 제거한다.
특정 구현예에서, 상기 자극 올리고머 시약, 예를 들어 상기 자극 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약은 인큐베이션의 (약) 120시간, 108시간, 96시간, 84시간, 72시간, 60시간, 48시간, 36시간, 24시간, 또는 12시간 이내에, 예를 들어 상기 자극 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약의 존재하에 상기 세포로부터 제거 또는 분리된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 올리고머 시약, 예를 들어 상기 자극 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약은 인큐베이션의 (약) 48시간 후에, 예를 들어 상기 자극 올리고머 시약의 존재하에 상기 세포로부터 제거 또는 분리된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 인큐베이션의 (약) 72시간 후에 상기 세포로부터 제거 또는 분리된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 올리고머 시약, 예를 들어 상기 자극 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약은 인큐베이션의 (약) 96시간에 상기 세포로부터 제거 또는 분리된다.
G. 배양
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 조작된 T 세포의 조성물을 생성하는 방법은 예를 들어 상기 세포에 이종 폴리뉴클레오티드의 도입 후에, 선택적인 배양 단계 또는 세포가 생체외에서 증폭 또는 증식을 수행하는 단계와 관련하여 수행된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 조작된 T 세포 조성물을 배양한다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 배양된 조작된 T 세포 조성물을 하나 이상의 다른 개별 공여자로부터의 배양된 조작된 T 세포 조성물과 조합하여 복수의 상이한 공여자로부터의 배양된 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생성한다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자로부터의 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 배양한다.
일부 구현예에서, 상기 제공된 방법은 세포를 배양하기 위한, 예를 들어 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건하에 세포를 배양하기 위한 하나 이상의 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작하는 단계, 예를 들어 형질도입 또는 형질감염에 의해 세포에 재조합 폴리펩티드를 도입하고/하거나 하나 이상의 관심 대상 분자를 녹아웃시키는 단계 후에 증식 또는 증폭을 촉진하는 조건하에 배양된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 세포가 자극 조건하에 배양되고 재조합 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질도입 또는 형질감염된 후에 배양된다. 특정 구현예에서, 세포는 세포를 자극 조건 하에 인큐베이션하고, 하나 이상의 분자 또는 관심 분자의 발현을 방해하고, 재조합 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질도입 또는 형질감염시킨 후에 배양된다. 따라서 일부 측면에서, 농축된 T 세포의 형질전환된 집단의 세포가 배양된다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 형질전환된 집단은 미리 고갈되거나 또는 CD57+ T 세포로부터 분리된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 형질전환된 집단은 이전에 CD27- T 세포를 고갈시키거나 또는 그로부터 분리되었다. 일부 측면에서, 하나 이상의 형질전환된 집단은 개별 공여자로부터 유래된다. 일부 측면에서, 개별 공여자로부터의 형질전환된 집단은 하나 이상의 다른 개별 공여자의 형질전환된 집단과 조합되어 복수의 상이한 공여자로부터 형질전환된 집단을 생산한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 형질전환된 집단은 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공된 조작된 T 세포의 조성물을 생성하는 방법은 예를 들어 상기 세포에 이종 폴리뉴클레오티드의 도입 후에, 선택적인 배양 단계 또는 세포가 생체외에서 증폭 또는 증식을 수행하는 배양 단계를 요구하지 않는다. 일부 구현예에서, 조작된 세포 조성물을 생성 또는 제조하는 공정 또는 방법은 예를 들어 치료학적 조성물 중의 조작된 세포의 수를 증폭시키는 배양 단계를 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 상기 조작된 T 세포의 하나 이상의 집단은 농축된 T 세포의 2개의 개별적인 집단이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 별개의 집단은 개별 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 2개의 별개의 집단은 각각 또는 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 농축된 T 세포의 2개의 개별 집단, 예를 들어 상기 생물학적 샘플로부터 선택, 분리, 및/또는 농축된 농축된 T 세포의 2개의 개별 집단은 자극 조건하에서 개별적으로 배양된다.
특정 구현예에서, 상기 2개의 개별 집단은 농축된 CD4+ T 세포, 예를 들어 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 2개의 개별 집단은 농축된 CD8+ T 세포, 예를 들어 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포의 2개의 개별 집단, 예를 들어 농축된 CD57-CD4+ T 세포 및 농축된 CD57-CD8+ T 세포의 2개의 개별 집단은 예를 들어 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건하에 개별적으로 배양된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 단일 집단, 예를 들어 CD57-CD4+ T 세포 및 CD57-CD8+ T 세포를 포함하거나 또는 함유하는 단일 집단이 배양된다. 특정 구현예에서, 상기 단일 집단은 농축된 CD57-CD4+ T 세포의 집단이다. 일부 구현예에서, 상기 단일 집단은 상기 배양 전에 개별 집단으로부터 결합된 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 집단이다.
일부 구현예에서, 예를 들어 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건하에서, 배양되는 농축된 CD4+ T 세포(예를 들어 CD57-CD4+ T 세포)는 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 65%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 75%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 85%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 98%, 적어도 (약) 99%, 적어도 (약) 99.5%, 적어도 (약) 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD4+ T 세포(예를 들어 CD57-CD4+ T 세포)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 집단은 적어도 (약) 30%, 적어도 (약) 40%, 적어도 (약) 50%, 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 98%, 적어도 (약) 99%, 적어도 (약) 99.5%, 적어도 (약) 99.9%, 또는 (약) 100%의, 상기 재조합 수용체를 발현하고/하거나 상기 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질도입 또는 형질감염된 CD4+ T 세포(예를 들어 CD57-CD4+ T 세포)를 포함한다. 특정 구현예에서, 배양되는 농축된 CD4+ T 세포(예를 들어 CD57-CD4+ T 세포)는 (약) 40% 미만, (약) 35% 미만, (약) 30% 미만, (약) 25% 미만, (약) 20% 미만, (약) 15% 미만, (약) 10% 미만, (약) 5% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만, 또는 (약) 0.01% 미만의 CD8+ T 세포를 포함하고/하거나 CD8+ T 세포르 함유하지 않고/않거나 CD8+ T 세포가 부재하거나 실질적으로 부재하다.
일부 구현예에서, 예를 들어 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건하에서, 배양되는 농축된 CD8+ T 세포는 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 65%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 75%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 85%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 98%, 적어도 (약) 99%, 적어도 (약) 99.5%, 적어도 (약) 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD8+ T 세포(예를 들어 CD57-CD8+ T 세포)를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 집단은 적어도 (약) 30%, 적어도 (약) 40%, 적어도 (약) 50%, 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 98%, 적어도 (약) 99%, 적어도 (약) 99.5%, 적어도 (약) 99.9%, 또는 (약) 100%의, 상기 재조합 수용체를 발현하고/하거나 상기 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질도입 또는 형질감염된 CD8+ T 세포(예를 들어 CD57-CD8+ T 세포)를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건하에서 배양되는 농축된 CD8+ T 세포는 (약) 40% 미만, (약) 35% 미만, (약) 30% 미만, (약) 25% 미만, (약) 20% 미만, (약) 15% 미만, (약) 10% 미만, (약) 5% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만, 또는 (약) 0.01% 미만의 CD4+ T 세포를 포함하고/하거나 CD4+ T 세포르 함유하지 않고/않거나 CD4+ T 세포가 부재하거나 실질적으로 부재하다.
특정 구현예에서, 상기 2개의 개별 집단은 농축된 CD4+ T 세포, 예를 들어 농축된 CD27+CD4+ T 세포의 집단을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 2개의 개별 집단은 농축된 CD8+ T 세포, 예를 들어 농축된 CD27+CD8+ T 세포의 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포의 2개의 개별 집단, 예를 들어 농축된 CD27+CD4+ T 세포 및 농축된 CD27+CD8+ T 세포의 2개의 개별 집단은 예를 들어 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건하에 개별적으로 배양된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 단일 집단, 예를 들어 CD27+CD4+ T 세포 및 CD27+CD8+ T 세포를 포함하거나 또는 함유하는 단일 집단이 배양된다. 특정 구현예에서, 상기 단일 집단은 농축된 CD27+CD4+ T 세포의 집단이다. 일부 구현예에서, 상기 단일 집단은 상기 배양 전에 개별 집단으로부터 결합된 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 집단이다.
일부 구현예에서, 예를 들어 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건하에서, 배양되는 농축된 CD4+ T 세포(예를 들어 CD27+CD4+ T 세포)는 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 65%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 75%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 85%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 98%, 적어도 (약) 99%, 적어도 (약) 99.5%, 적어도 (약) 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD4+ T 세포(예를 들어 CD57-CD4+ T 세포)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 집단은 적어도 (약) 30%, 적어도 (약) 40%, 적어도 (약) 50%, 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 98%, 적어도 (약) 99%, 적어도 (약) 99.5%, 적어도 (약) 99.9%, 또는 (약) 100%의, 상기 재조합 수용체를 발현하고/하거나 상기 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질도입 또는 형질감염된 CD4+ T 세포(예를 들어 CD27+CD4+ T 세포)를 포함한다. 특정 구현예에서, 배양되는 농축된 CD4+ T 세포(예를 들어 CD27+CD4+ T 세포)는 (약) 40% 미만, (약) 35% 미만, (약) 30% 미만, (약) 25% 미만, (약) 20% 미만, (약) 15% 미만, (약) 10% 미만, (약) 5% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만, 또는 (약) 0.01% 미만의 CD8+ T 세포를 포함하고/하거나 CD8+ T 세포르 함유하지 않고/않거나 CD8+ T 세포가 부재하거나 실질적으로 부재하다.
일부 구현예에서, 예를 들어 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건하에서, 배양되는 농축된 CD8+ T 세포는 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 65%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 75%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 85%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 98%, 적어도 (약) 99%, 적어도 (약) 99.5%, 적어도 (약) 99.9%, 또는 (약) 100%의 CD8+ T 세포(예를 들어 CD27+CD8+ T 세포)를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 집단은 적어도 (약) 30%, 적어도 (약) 40%, 적어도 (약) 50%, 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 98%, 적어도 (약) 99%, 적어도 (약) 99.5%, 적어도 (약) 99.9%, 또는 (약) 100%의, 상기 재조합 수용체를 발현하고/하거나 상기 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질도입 또는 형질감염된 CD8+ T 세포(예를 들어 CD27+CD8+ T 세포)를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건하에서 배양되는 농축된 CD8+ T 세포는 (약) 40% 미만, (약) 35% 미만, (약) 30% 미만, (약) 25% 미만, (약) 20% 미만, (약) 15% 미만, (약) 10% 미만, (약) 5% 미만, (약) 1% 미만, (약) 0.1% 미만, 또는 (약) 0.01% 미만의 CD4+ T 세포를 포함하고/하거나 CD4+ T 세포르 함유하지 않고/않거나 CD4+ T 세포가 부재하거나 실질적으로 부재하다.
일부 구현예에서, 배양은 일반적으로 인간 T 림프구와 같은 1차 면역 세포의 성장에 적합한 온도, 예를 들어 (약) 25℃이상, 일반적으로 (약) 30℃ 이상, 및 일반적으로 (약) 37℃ 이상을 포함하는 조건하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 집단은 25 내지 38℃, 예를 들어 30 내지 37℃, 예를 들어 (약) 37℃±2℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 배양, 예를 들어 양성 또는 증폭이 원하는 또는 임계 밀도로 세포수 또는 세포의 용량을 초래할 때까지의 기간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 배양은 (약) 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일 이상을 초과하거나 또는 (약) 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일 이상 동안이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는, 상기 배양의 시작시의 세포의 양, 농도, 또는 밀도와 비교하여 적어도 (약) 50%, 적어도 (약) 60%, 적어도 (약) 70%, 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 100%, 적어도 (약) 150%, 적어도 (약) 1-배, 적어도 (약) 2-배, 적어도 (약) 3-배, 적어도 (약) 4-배, 적어도 (약) 5-배, 적어도 (약) 10-배, 적어도 (약) 20-배, 적어도 (약) 50-배 많은 세포의 양, 농도, 또는 밀도인 임계 증폭을 성취하도록 배양된다.
상기 구체예에서 기술된 바와 같이, 집단 배가의 수는 치료학적 T 세포 조성물(예를 들어 산출 조성물)로 치료 받은 대상체에서 무진행 생존 확률과 역의 상관 관계가 있다. 따라서 일부 구현예에서, 상기 집단 배가의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 또는 10 이하의 집단 배가이다. 일부 구현예에서, 상기 집단 배가의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 이하의 집단 배가이다. 일부 구현예에서, 집단 배가의 감소된 수(예를 들어 6 이하)는 적어도 (약) 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 나이브-유사 및/또는 중앙 기억 T 세포를 포함하는 T 세포 조성물(예를 들어 조작된 CD4+, CD8+ T 세포)를 증폭시킴으로써 성취된다. 일부 구현예에서, 집단 배가의 감소된 수(예를 들어 6 이하)는 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만의 T 세포 조성물(예를 들어 조작된 CD4+, CD8+ T 세포)를 증폭시킴으로써 성취된다. 일부 구현예에서, 집단 배가의 감소된 수(예를 들어 6 이하)는 0.05×106 cells/mL, 0.1×106 cells/mL, 0.15×106 cells/mL, 0.2×106 cells/mL, 0.25×106 cells/mL, 0.3×106 cells/mL, 0.35×106 cells/mL, 0.4×106 cells/mL, 0.45×106 cells/mL, 또는 그 이상보다 높은 시드 밀도를 사용함으로써 성취된다.
자극 조건은, 하나 이상의 특정 매질, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제, 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예를 들어 사이토카인, 케모카인(chemokines), 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체, 및 세포를 활성화시키도록 설계된 임의의 다른 제제를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, CD57- T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포의 조성물은 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에 배양된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 재조합 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 T 세포에 의해 발현되고/되거나 내인성(endogenous) 수용체에 결합하고/하거나 수용체에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 사이토카인의 4-알파-헬릭스 다발 패밀리(4-alpha-helix bundle family)의 구성원이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인의 4-알파-헬릭스 다발 패밀리(4-alpha-helix bundle family)의 구성원은 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-9(IL-9), 인터루킨 12(IL-12), 인터루킨 15(IL-15), 과립구 집락(granulocyte colony)-자극 인자 (G-CSF) 및 과립구-대식세포 집락(granulocyte-macrophage colony) 자극 인자(GM-CSF)를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 IL-15이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 IL-7이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 IL-2이거나 또는 그를 포함한다.
일부 측면에서, 인큐베이션은 리델(Riddell) 등의 미국특허 제6,040,177호, 문헌 [Klebanoff 등,(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura 등, (2012) Blood.1:72-82], 및/또는 [Wang 등, (2012) J Immunother. 35(9):689-701]에 기술된 기법에 따라 수행된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 자극 조건 또는 자극 시약의 존재하에 상기 인큐베이션의 적어도 일부는 예를 들어 국제공개공보 제WO2016/073602호에 기술된 바와 같이 원심 챔버의 내부 공동에서, 예를 들어 원심 회전하에 수행된다. 일부 구현예에서, 원심 챔버에서 수행된 상기 인큐베이션의 적어도 일부는 자극 및/또는 활성화를 유도하는 시약(들)과 혼합하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 선택된 세포는 상기 원심 챔버 중에서 자극 조건 또는 자극제와 혼합된다. 이러한 공정의 일부 측면에서, 일정 부피의 세포는, 세포 배양판 또는 다른 시스템에서 유사한 자극을 수행할 때 정상적으로 사용되는 것 보다 훨씬 적은 양의 하나 이상의 자극 조건 또는 제제와 혼합된다.
일부 구현예에서, 상기 배양은 상기 세포 및 자극제에 배양 완충액의 첨가로 수행하여 예를 들어 10 mL 내지 2,000 mL, 예를 들어 적어도 (약) 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 150 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL, 1,000 mL, 1,200 mL, 1,400 mL, 1,600 mL, 1,800 mL, 2,000 mL, 2,200 mL 또는 2,400 mL의 표적 용적을 성취한다. I일부 구현예에서, 상기 인큐베이션 완충액 및 자극제는 상기 세포에 분리하여 첨가된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 인큐베이션은 주기적인 온화한 혼합 조건으로 수행되고, 이것은 에너지적으로 바람직한 상호작용을 촉진하는데 도움을 줄 수 있으며 그에 의해서 세포의 자극 및 활성화를 성취하면서 보다 적은 총괄 자극제의 사용을 허용한다.
일부 구현예에서, 상기 인큐베이션은, 예를 들어 스피닝(spinning)의 존재하에서, 일반적으로는 비교적 적은 힘 또는 속도에서, 예를 들어 세포를 펠릿화하는 데 사용되는 속도보다 낮은 속도에서, 예를 들어 (약) 600 rpm 내지 (약) 1700 rpm (예를 들어 (약) 또는 적어도 600 rpm, 1000 rpm, 또는 1500 rpm 또는 1700 rpm), 예를 들어 약 80g 내지 100g(예를 들어 (약) 또는 적어도 80g, 85g, 90g, 95g, 또는 100g)의 챔버 또는 다른 용기의 샘플 또는 벽의 RCF에서, 혼합 조건하에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 스핀은 그러한 저속에서 스핀의 반복된 간격을 이용하여 수행된 후, 휴지 기간(rest period)을 가지며, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10초의 스핀 및/또는 휴지, 예를 들어 대략 1초 또는 2초의 스핀에 대략 5, 6, 7, 또는 8초의 휴지기를 갖는다.
특정 구현예에서, 배양은 폐쇄 시스템에서 수행된다. 특정 구현예에서, 배양은 멸균 조건 하에 폐쇄 시스템에서 수행된다. 특정 구현예에서, 배양은 제공된 시스템의 하나 이상의 단계와 동일한 폐쇄 시스템에서 수행된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 조성물은 폐쇄 시스템으로부터 제거되고 배양을 위한 생물 반응기(bioreactor)에 배치 및/또는 연결된다. 배양에 적합한 생물 반응기의 예시로 GE Xuri W25, GE Xuri W5, Sartorius BioSTAT RM 20 | 50, Finesse SmartRocker Bioreactor Systems, 및 Pall XRS Bioreactor Systems를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 생물 반응기는 배양 단계의 적어도 일부 동안 세포를 관류(perfuse) 및/또는 혼합하는데 사용된다.
일부 구현예에서, 혼합은 요동(rocking) 및/또는 움직임(motioning)이거나 이를 포함한다. 일부 경우에, 생물 반응기는 움직임(motioning) 또는 요동(rocking)의 영향을 받을 수 있으며, 이는 일부 측면에서 산소 전달을 증가시킬 수 있다. 생물 반응기의 움직임(motioning)은, 수평축을 따라 회전하는 것, 수직축을 따라 회전하는 것, 생물 반응기의 기울어지거나 경사진 수평 축에 따른 요동(rocking) 움직임, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 요동(rocking)으로 수행된다. 요동(rocking) 속도 및 요동(rocking) 각도는 원하는 교반(agitation)을 달성하도록 조정될 수 있다. 일부 구현예에서, 요동(rocking) 각도는 20˚, 19˚, 18˚, 17˚, 16˚, 15˚, 14˚, 13˚, 12˚, 11˚, 10˚, 9˚, 8˚, 7˚, 6˚, 5˚, 4˚, 3˚, 2˚ 또는 1˚이다. 특정 구현예에서, 요동 각도는 6 내지 16˚이다. 다른 구현예에서, 요동 각도는 7 내지 16˚이다. 다른 구현예에서, 요동 각도는 8 내지 12˚이다. 일부 구현예에서, 요동 속도는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 rpm 이다. 일부 구현예에서, 요동 속도는 4 내지 12 rpm, 예를 들어 4 내지 6 rpm(경계 포함)이다.
일부 구현예에서, 생물 반응기는 0.01 L/min, 0.05 L/min, 0.1 L/min, 0.2 L/min, 0.3 L/min, 0.4 L/min, 0.5 L/min, 1.0 L/min, 1.5 L/min, 또는 2.0 L/min 또는 2.0 L/min이상, 약 또는 적어도 0.01 L/min, 0.05 L/min, 0.1 L/min, 0.2 L/min, 0.3 L/min, 0.4 L/min, 0.5 L/min, 1.0 L/min, 1.5 L/min, 또는 2.0 L/min 또는 2.0 L/min이상에서 일정한 공기 흐름으로, 37℃ 또는 그 근처의 온도 및 5% 또는 그 근처의 CO2 수준을 유지한다. 특정 구현예에서, 배양의 적어도 일부는, 예를 들어 290 ml/day, 580 ml/day, 및/또는 1160 ml/day 의 속도로, 관류(perfusion)로 수행되며, 예를 들어 배양의 시작 및/또는 배양된 세포의 밀도와 관련된 타이밍에 의존한다. 일부 구현예에서, 세포 배양 증폭의 적어도 일부는 예를 들어 6 RMP 또는 10 RPM과 같은 5 내지 15 RPM의 일정한 요동 속도로, 6˚와 같이, 5˚ 내지 10˚의 각도의 요동(rocking) 움직임(motion)으로 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 배양 단계의 적어도 일부는 일정한 관류하에서, 예를 들어 느린 정상 속도(slow steady rate)의 관류하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 관류는 액체, 예를 들어 사용된 배지의 유출(outflow), 및 신선한 배지의 유입이거나 또는 그를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 관류는 사용된 배지를 신선한 배지로 대체한다. 일부 구현예에서, 상기 배양의 적어도 일부는 (약) 또는 적어도 (약) 100 mL/day, 200 mL/day, 250 mL/day, 275 mL/day, 290 mL/day, 300 mL/day, 350 mL/day, 400 mL/day, 450 mL/day, 500 mL/day, 550 mL/day, 575 mL/day, 580 mL/day, 600 mL/day, 650 mL/day, 700 mL/day, 750 mL/day, 800 mL/day, 850 mL/day, 900 mL/day, 950 mL/day, 1000 mL/day, 1100 mL/day, 1160 mL/day, 1200 mL/day, 1400 mL/day, 1500 mL day, 1600 mL/day, 1800 mL/day, 2000 mL/day, 2200 mL/day, 또는 2400 mL/day의 정상 속도의 관류하에서 수행된다.
특정 구현예에서, 세포 요법에 사용하기 위해 제공된 방법으로부터 생성된 조작된 T 세포 조성물은 활성이고 증폭되고/되거나, 대상체에게 투여될 때 생체내에서 활성화 및 증폭될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 생체내 효능, 활성, 및/또는 증폭을 나타내거나 이와 연관된 특징 및/또는 특성을 나타낸다. 예를 들어 일부 구현예에서, 이러한 특징 또는 특성은 생체내 대상체에의 투여 후 활성화, 증식 및/또는 증폭과 연관된 단백질, 예를 들어 표면 단백질의 발현을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 예를 들어 세포 요법에서 사용하기 위한, 상기 제공된 방법에 의해 생성 또는 생산된 조작된 T 세포 조성물은 대안적 및/또는 예시적인 공정(예를 들어 더 높은 빈도의 CD57+ T 세포를 함유하는 T 세포의 집단을 자극, 조작 및/또는 배양하는 공정)에 의해 생성 또는 생산된 세포보다 더 큰 CD25의 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 방법에 의해 생성 또는 생산된 조작된 T 세포 조성물의 세포는 대안적 및/또는 예시적인 공정에 의해 생성 또는 생산된 T 세포보다 더 큰 CD25의 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 공정에 의해 생성된 집단의 T 세포의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 100%는 CD25 염색에 대해 양성이고, 예를 들어 검출가능한 양의 CD25를 발현한다. 특정 구현예에서, 조작된 T 세포 조성물은 대안적 및/또는 예시적인 공정에 의해 생성 또는 생산된 세포의 조성물보다 더 큰 빈도의 CD25에 대해 양성인 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 예를 들어 대안적 및/또는 예시적인 공정에 의해 생성 또는 생산된 세포와 비교하여, 상기 조성물의 세포는 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 1-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 또는 적어도 5-배 더 많은 CD25를 발현한다.
특정 구현예에서, 예를 들어 세포 요법에서 사용하기 위한, 상기 제공된 방법에 의해 생성 또는 생산된 조작된 T 세포의 조성물은 대안적 및/또는 예시적인 공정(예를 들어 더 높은 빈도의 CD57+ T 세포를 함유하는 T 세포의 집단을 자극, 조작 및/또는 배양하는 공정)에 의해 생성 또는 생산된 세포보다 더 큰 CD27의 발현을 갖는다. 특정 구현예에서, 제공된 방법에 의해 생성 또는 생산된 조작된 조성물의 T 세포는 대안적 및/또는 예시적인 공정에 의해 생성 또는 생산된 T 세포보다 더 큰 CD27의 발현을 갖는다. 특정 구현예에서, 제공된 공정에 의해 생성된 조성물의 T 세포의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 100%는 CD27 염색에 대해 양성이고, 예를 들어 검출가능한 양의 CD27을 발현한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 대안적 및/또는 예시적인 공정에 의해 생성 또는 생산된 세포의 조성물보다 더 큰 빈도의 CD27에 대해 양성인 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는, 예를 들어 대안적 및/또는 예시적인 공정에 의해 생산 또는 생성된 세포와 비교하여, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 1-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 또는 적어도 5-배 더 많은 CD27을 발현한다. 특정 구현예에서, 예를 들어 세포 요법에서 사용하기 위한, 상기 제공된 방법에 의해 생산 또는 생성된 조작된 T 세포 조성물은 대안적 및/또는 예시적인 공정(예를 들어 더 높은 빈도의 CD57+ T 세포를 함유하는 T 세포의 집단을 자극, 조작 및/또는 배양하는 공정)에 의해 생산 또는 생성된 세포보다 더 낮은 CD27 발현의 변동 계수(CV)를 갖는다. 특정 구현예에서, 조작된 T 세포 조성물은 대안적 및/또는 예시적인 공정(예를 들어 더 높은 빈도의 CD57+ T 세포를 함유하는 T 세포의 집단을 자극, 조작 및/또는 배양하는 공정)에 의해 생산 또는 생성된 세포보다 더 낮은 CD27 발현의 변동 계수(CV)를 갖는다.
특정 구현예에서, 예를 들어 세포 요법에서 사용하기 위한, 상기 제공된 방법에 의해 생산 또는 생성된 조작된 T 세포의 조성물은 대안적 및/또는 예시적인 공정(예를 들어 더 높은 빈도의 CD27-T 세포를 함유하는 T 세포의 집단을 자극, 조작 및/또는 배양하는 공정)에 의해 생산 또는 생성된 세포보다 더 낮은 CD57의 발현을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 제공된 방법에 의해 생산 또는 생성된 조작된 조성물의 T 세포는 대안적 및/또는 예시적인 공정에 의해 생산 또는 생성된 T 세포보다 더 높은 CD57의 발현을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 제공된 공정에 의해 생성된 조성물의 T 세포의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 100%는 CD57 염색에 대해 음성이고, 예를 들어 검출가능한 양의 CD57을 발현하지 않는다. 특정 구현예에서, 조성물은 대안적 및/또는 예시적인 공정에 의해 생산 또는 생성된 세포의 조성물보다 더 높은 빈도의 CD57을 함유한다. 일부 구현예에서, 조성물의 세포는, 예를 들어 대안적 및/또는 예시적인 공정에 의해 생산 또는 생성된 세포와 비교하여, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 1-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 또는 적어도 5-배 더 적은 CD57을 발현한다. 특정 구현예에서, 예를 들어 세포 요법에서 사용하기 위한, 상기 제공된 방법에 의해 생성되거나 생산된 조작된 T 세포 조성물은 대안적 및/또는 예시적인 공정(예를 들어 더 높은 빈도의 CD27-T 세포를 함유하는 T 세포의 집단을 자극, 조작 및/또는 배양하는 공정)에 의해 생성되거나 생산된 세포보다 더 낮은 CD57 발현의 변동 계수(CV)를 갖는다. 특정 구현예에서,상기 조작된 T 세포 조성물은 대안적 및/또는 예시적인 공정(예를 들어 더 높은 빈도의 CD27-T 세포를 함유하는 T 세포의 집단을 자극, 조작 및/또는 배양하는 공정)에 의해 생성되거나 생산된 세포보다 더 낮은 CD57 발현의 변동 계수(CV)를 갖는다.
일부 구현예에서, 예를 들어 세포 요법에서 사용하기 위한, 상기 제공된 방법에 의해 생성되거나 생산된 조작된 T 세포는 대안적 및/또는 예시적인 공정(예를 들어 더 높은 빈도의 CD57+ T 세포를 함유하는 T 세포의 집단을 자극, 조작 및/또는 배양하는 공정)에 의해 생성되거나 생산된 세포보다 더 높은 Ki67의 발현을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 대안적 및/또는 예시적인 공정(예를 들어 더 높은 빈도의 CD57+ T 세포를 함유하는 T 세포의 집단을 자극, 조작 및/또는 배양하는 공정)에 의해 생성되거나 생산된 세포보다 더 높은 Ki67의 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, 예를 들어 세포 요법에서 사용하기 위한, 상기 제공된 방법에 의해 생성되거나 생산된 조작된 T 세포는 대안적 및/또는 예시적인 공정(예를 들어 더 높은 빈도의 CD27-T 세포를 함유하는 T 세포의 집단을 자극, 조작 및/또는 배양하는 공정)에 의해 생성되거나 생산된 세포보다 더 높은 Ki67의 발현을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 대안적 및/또는 예시적인 공정(예를 들어 더 높은 빈도의 CD27-T 세포를 함유하는 T 세포의 집단을 자극, 조작 및/또는 배양하는 공정)에 의해 생성되거나 생산된 세포보다 더 높은 Ki67의 발현을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 제공된 방법에 의해 생성되거나 생산된 조성물의 T 세포는 대안적 및/또는 예시적인 공정에 의해 생성되거나 생산된 T 세포보다 더 높은 Ki67의 발현을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 제공된 공정에 의해 생성된 조성물의 T 세포의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 100%는 Ki67 염색에 대해 양성이고, 예를 들어 검출가능한 양의 Ki67을 발현한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 대안적 및/또는 예시적인 공정에 의해 생성되거나 생산된 세포의 조성물보다 더 높은 Ki67에 대해 양성인 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 세포는, 예를 들어 대안적 및/또는 예시적인 공정에 의해 생성되거나 생산된 세포와 비교하여, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 1-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 또는 적어도 5-배 더 많은 Ki67을 발현한다. 특정 구현예에서, 예를 들어 세포 요법에서 사용하기 위한, 상기 제공된 방법에 의해 생성되거나 생산된 조작된 조성물은 대안적 및/또는 예시적인 공정(예를 들어 더 높은 빈도의 CD57+ T 세포를 함유하는 T 세포의 집단을 자극, 조작 및/또는 배양하는 공정)에 의해 생성되거나 생산된 세포보다 더 낮은 Ki67 발현의 변동 계수(CV)를 갖는다. 특정 구현예에서, 예를 들어 세포 요법에서 사용하기 위한, 상기 제공된 방법에 의해 생성되거나 생산된 조작된 조성물은 대안적 및/또는 예시적인 공정(예를 들어 더 높은 빈도의 CD27- T 세포를 함유하는 T 세포의 집단을 자극, 조작 및/또는 배양하는 공정)에 의해 생성되거나 생산된 세포보다 더 낮은 Ki67 발현의 변동 계수(CV)를 갖는다.
일부 구현예에서, 예를 들어 세포 요법에서 사용하기 위한, 상기 제공된 방법에 의해 생성되거나 생산된 조작된 T 세포 조성물은 대안적 및/또는 예시적인 공정(예를 들어 더 높은 빈도의 CD57+ T 세포를 함유하는 T 세포의 집단을 자극, 조작 및/또는 배양하는 공정)에 의해 생성되거나 생산된 세포보다 더 낮은 재조합 수용체(예를 들어 키메라 항원 수용체; CAR)의 발현의 변동 계수(CV)를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 대안적 및/또는 예시적인 공정(예를 들어 더 높은 빈도의 CD57+ T 세포를 함유하는 T 세포의 집단을 자극, 조작 및/또는 배양하는 공정)에 의해 생성되거나 생산된 세포보다 더 낮은 재조합 수용체(예를 들어 키메라 항원 수용체; CAR)의 발현의 변동 계수(CV)를 갖는다. 일부 구현예에서, 예를 들어 세포 요법에서 사용하기 위한, 상기 제공된 방법에 의해 생성되거나 생산된 조작된 T 세포 조성물은 대안적 및/또는 예시적인 공정(예를 들어 더 높은 빈도의 CD27- T 세포를 함유하는 T 세포의 집단을 자극, 조작 및/또는 배양하는 공정)에 의해 생성되거나 생산된 세포보다 더 낮은 재조합 수용체(예를 들어 키메라 항원 수용체; CAR)의 발현의 변동 계수(CV)를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 대안적 및/또는 예시적인 공정(예를 들어 더 높은 빈도의 CD27- T 세포를 함유하는 T 세포의 집단을 자극, 조작 및/또는 배양하는 공정)에 의해 생성되거나 생산된 세포보다 더 낮은 재조합 수용체(예를 들어 키메라 항원 수용체; CAR)의 발현의 변동 계수(CV)를 갖는다. 일부 구현예에서, 예를 들어 세포 요법에 사용하기 위한, 상기 제공된 방법에 의해 생성되거나 생산된 조작된 T 세포의 조성물은 대안적 및/또는 예시적인 공정(예를 들어 더 높은 빈도의 CD57+ T 세포를 함유하는 T 세포의 집단을 자극, 조작 및/또는 배양하는 공정)에 의해 생성되거나 생산된 세포보다 유전자 조작에 의해 세포 내로 도입된 재조합 수용체의 발현의 더 낮은 변동 계수(CV)를 갖는다. 일부 구현예에서, 예를 들어 세포 요법에 사용하기 위한, 상기 제공된 방법에 의해 생성되거나 생산된 조작된 T 세포의 조성물은 대안적 및/또는 예시적인 공정(예를 들어 더 높은 빈도의 CD27- T 세포를 함유하는 T 세포의 집단을 자극, 조작 및/또는 배양하는 공정)에 의해 생성되거나 생산된 세포보다 유전자 조작에 의해 세포 내로 도입된 재조합 수용체의 발현의 더 낮은 변동 계수(CV)를 갖는다.
특정 구현예에서, 예를 들어 세포 요법에 사용하기 위한, 상기 제공된 방법에 의해 생성되거나 생산된 조작된 T 세포의 조성물은 대안적 및/또는 예시적인 공정(예를 들어 더 높은 빈도의 CD57+ T 세포를 함유하는 T 세포의 집단을 자극, 조작 및/또는 배양하는 공정)에 의해 생성되거나 생산된 세포보다 CD28의 더 큰 발현을 갖는다. 특정 구현예에서, 예를 들어 세포 요법에 사용하기 위한, 상기 제공된 방법에 의해 생성되거나 생산된 조작된 T 세포의 조성물은 대안적 및/또는 예시적인 공정(예를 들어 더 높은 빈도의 CD27- T 세포를 함유하는 T 세포의 집단을 자극, 조작 및/또는 배양하는 공정)에 의해 생성되거나 생산된 세포보다 CD28의 더 큰 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 방법에 의해 생성되거나 생산된 조성물의 T 세포는 대안적 및/또는 예시적인 공정에 의해 생성되거나 생산된 T 세포보다 CD28의 더 큰 발현을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 제공된 방법에 의해 생성되거나 생산된 조성물의 T 세포의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 100%는 CD28 염색에 대해 양성이고, 예를 들어 검출가능한 양의 CD28을 발현한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 대안적 및/또는 예시적인 공정에 의해 생성되거나 생산된 세포의 조성물보다 CD28에 대해 양성인 더 큰 빈도의 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 조성물의 세포는 예를 들어 대안적 및/또는 예시적인 공정에 의해 생성되거나 생산된 세포와 비교하여 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 1-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 또는 적어도 5-배 더 많은 CD28을 발현한다.
특정 구현예에서, 상기 제공된 방법은 세포 요법에 사용하기에 적합한 조작된 T 세포의 조성물을 성공적으로 생성하거나 생산하는 것과 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 상기 조성물의 세포가 배양 동안 표적 세포 수, 밀도 및/또는 증폭을 달성하는 경우에 성공적으로 생성된다.
H. 수확, 수집, 및
제형화
일부 구현예에서, 세포 요법 및/또는 조작된 세포를 제조, 생성 또는 생산하기 위한 하나 이상의 공정 단계(예를 들어 원심 챔버 및/또는 폐쇄된 시스템에서 수행됨)은 세포의 제형화, 예를 들어 컬처링, 예를 들어 배양 및 증폭 전 또는 후에 상기 제공된 처리 단계, 및/또는 기술된 하나 이상의 다른 처리 단계로부터 생성된 유전자 조작된 세포의 제형화를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 제형화와 관련된 상기 제공된 방법은 처리중인 형질도입된 세포, 예를 들어 폐쇄된 시스템에서 위에서 기술한 처리 단계를 이용하여 형질도입되고/되거나 증폭된 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 형질도입된 세포는 개별 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 형질도입된 세포는 하나 이상의 다른 개별 공여자의 형질도입된 세포와 조합되어 복수의 상이한 공여자로부터의 형질도입된 세포를 생산한다. 일부 구현예에서, 형질도입된 세포는 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 증폭된 세포는 개별 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 증폭된 세포는 하나 이상의 다른 개별 공여자로부터의 증폭된 세포와 조합되어 복수의 상이한 공여자로부터의 증폭된 세포를 생산한다. 일부 구현예에서, 증폭된 세포는 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 상기 제형화 이전에 상기 세포로부터 제거되고/되거나 분리된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 상기 배양 후에 상기 세포로부터 제거되고/되거나 분리된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은, 예를 들어 증식 및/또는 증폭을 촉진시키는 조건하에, 상기 배양 후에 그리고 상기 배양된 세포를 제형화하기 전에 상기 세포로부터 제거되고/되거나 분리된다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 본원에서, 예를 들어 섹션 III.A.1에서 기술되는 자극 시약이다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 본원에서, 예를 들어 섹션 III.A.2에서 기술된 세포로부터 제거되고/되거나 분리된다.
일부 구현예에서, 상기 세포는, 상기 배양도중에 임계치의 세포수, 밀도, 및/또는 증폭이 달성된 후 0일 내지 10일, 0일 내지 5일, 2일 내지 7일, 0.5일 내지 4일, 또는 1일 내지 3일에 제형화된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는, 상기 배양도중에 임계치의 세포수, 밀도, 및/또는 증폭이 달성된 후 (약) 12시간, 18시간, 24시간, 1일, 2일, 또는 3일 이내에 제형화된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는, 상기 배양도중에 임계치의 세포수, 밀도, 및/또는 증폭이 달성된 후 (약) 1일 이내에 제형화된다.
특정 구현예에서, 자극의 개시에서 세포의 수집, 수확 또는 제형화까지의 시간량은 (약) 36 시간, 42 시간, 48 시간, 54 시간, 60 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간, 108 시간 또는 120 시간 또는 36 시간, 42 시간, 48 시간, 54 시간, 60 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간, 108 시간 또는 120 시간 미만이다. 특정 구현예에서, 자극의 개시에서 세포의 수집, 수확 또는 제형화까지의 시간량은 (약) 1.5 일, 2 일, 3 일, 4 일 또는 5 일 또는 1.5 일, 2 일, 3 일, 4 일 또는 5 일 미만이다. 일부 구현예에서, 자극의 개시에서 세포의 수집, 수확 또는 제형화까지 조작된 세포를 생성하기 위해 자극의 개시에서 세포의 수집, 수확 또는 제형화까지의 시간량은 (약) 36 시간 내지 120 시간, 48 시간 내지 96 시간 또는 48 시간 내지 72 시간(경계 포함) 또는 (약) 1.5 일 내지 5 일, 2 일 내지 4 일 또는 2 일 내지 3 일(경계 포함)이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션의 개시에서 세포의 수확, 수집 또는 제형화까지의 시간량은 (약) 48 시간, 72 시간 또는 96 시간 또는 48 시간, 72 시간 또는 96 시간 미만이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션의 개시에서 세포의 수확, 수집 또는 제형화까지의 시간량은 (약) 2 일, 3 일 또는 4 일 또는 2 일, 3 일 또는 4 일 미만이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션의 개시에서 세포의 수확, 수집 또는 제형화까지의 시간량은 48 시간±6 시간, 72 시간±6 시간 또는 96 시간±6 시간이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션의 개시에서 세포의 수확, 수집 또는 제형화까지의 시간량은 (약) 96 시간 또는 4 일이다.
특정 구현예에서, 세포는, 적어도 통합된 벡터가 게놈에서 검출된 경우 수확 또는 수집된다. 일부 구현예에서, 세포는 2배수체 게놈 당 안정적인 통합 벡터 카피 수(iVCN) 전에 수확 또는 수집된다. 특정 구현예에서, 세포는 통합된 벡터가 게놈에서 검출된 후이나 2배수체 게놈 당 안정적인 iVCN을 얻기 전에 수확 또는 수집된다. 일부 구현예에서, 수확되거나 수집된 세포는 개별 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터 수확되거나 수집된 세포는 하나 이상의 다른 개별 공여자로부터 수확되거나 수집된 세포와 조합되어 복수의 상이한 공여자로부터 수확되거나 수집된 세포를 생성한다. 일부 구현예에서, 수확되거나 수집된 세포는 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 세포는 2배수체 게놈 당 iVCN이 (약) 5.0, 4.0, 3.0, 2.5, 2.0, 1.75, 1.5, 1.25, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.75, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3 또는 0.25 카피 또는 5.0, 4.0, 3.0, 2.5, 2.0, 1.75, 1.5, 1.25, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.75, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3 또는 0.25 카피 이상을 얻기 전에 수확 또는 수집된다. 특정 구현예에서, 세포는 2배수체 게놈 당 iVCN이 (약) 1.0 카피를 얻기 전에 수확 또는 수집된다. 일부 구현예에서, 세포는 2배수체 게놈 당 iVCN이 (약) 0.5 카피를 얻기 전에 수확 또는 수집된다.
특정 구현예에서, 세포는, (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 20 이상 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 20 이상의 세포 집단의 세포 배가, 예를 들어 인큐베이션 중 발생하는 배가 전에 수확된다.
특정 구현예에서, 세포는, 총 세포수, 예를 들어 인큐베이션된 세포 또는 인큐베이션을 경험하는 세포의 총 수가, 투입 집단의 세포수, 예를 들어 자극 시약과 접촉되었던 총 세포수의 (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 20 또는 20 배 이상을 초과하기 전의 시기에 수확 또는 수집된다. 일부 구현예에서, 세포는, 인큐베이션된 총 세포수가 형질전환, 형질도입 또는 회전 접종되었던 총 세포수, 예를 들어 바이러스 벡터와 접촉되었던 총 세포수의 (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 20 또는 20 배 이상을 초과하기 전의 시기에 수확 또는 수집된다. 특정 구현예에서, 세포는 T 세포, 생존 가능한 T 세포, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CAR 발현 T 세포 또는 상기 중 임의의 조합물이다. 특정 구현예에서, 세포는 총 세포수가 투입 집단의 총 세포수를 초과하기 전의 시기에 수확 또는 수집된다. 다양한 구현예에서, 세포는 생존 가능한 CD3+ T 세포의 총 수가 투입 집단의 생존 가능한 CD3+ 세포의 총 수를 초과하기 전의 시기에 수확 또는 수집된다. 특정 구현예에서, 세포는, 총 세포수가 형질전환, 형질도입 또는 회전 접종된 세포의 총 수를 초과하기 전의 시기에 수확 또는 수집된다. 다양한 구현예에서, 세포는, 생존 가능한 CD3+ T 세포의 총 수가 형질전환, 형질도입 또는 회전 접종된 세포의 생존 가능한 CD3+ 세포의 총 수를 초과하기 전의 시기에 수확 또는 수집된다. 다양한 구현예에서, 세포는, 생존 가능한 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포의 총 수가 투입 집단의 생존 가능한 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포의 총 수를 초과하기 전의 시기에 수확 또는 수집된다. 특정 구현예에서, 세포는, 총 세포수가 형질전환, 형질도입 또는 회전 접종된 세포의 총 수를 초과하기 전의 시기에 수확 또는 수집된다. 다양한 구현예에서, 세포는, 생존 가능한 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포의 총 수가 형질전환, 형질도입 또는 회전 접종된 세포의 생존 가능한 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포의 총 수를 초과하기 전의 시기에 수확 또는 수집된다.
일부 구현예에서, 세포 치료 및/또는 조작된 세포를 제조, 생성 또는 생산하기 위한 제공된 방법은 세포의 제형화, 예를 들어 인큐베이션, 배양 및 조작 전 또는 후에 제공된 처리 단계 및/또는 기술된 바와 같은 하나 이상의 다른 처리 단계로부터 생성된 유전자 조작된 세포의 제형화를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 제형화와 관련된 제공된 방법은 폐쇄된 시스템에서 상기 처리 단계를 이용하여 형질도입 및/또는 증폭된 세포와 같은, 형질도입된 세포를 처리하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 항원 수용체로 조작된 세포, 예를 들어 CAR 또는 TCR를 포함하는 세포의 용량은, 약학적 조성물 또는 제형과 같은, 조성물 또는 제형으로서 제공된다. 이러한 조성물은, 제공된 방법, 예를 들어 질환, 병태 및 장애의 예방 또는 치료, 또는 검출, 진단 및 예후 방법에 따라 사용될 수 있다.
일부 경우에, 세포는, 세포 치료 및/또는 조작된 세포를 제조, 생성 또는 생산하기 위한 하나 이상의 단계 (예를 들어 원심 챔버 및/또는 폐쇄 시스템에서 수행)로 처리되며, 예를 들어 세포의 제형화, 예를 들어 배양 전 또는 후에 제공된 처리 단계로부터 생성된 유전자 조작된 세포의 제형화, 예를 들어 배양 및 증폭, 및/또는 기술된 바와 같은 하나 이상의 다른 처리 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 세포는 단일 단위 투여량 투여(dosage administration) 또는 다중 투여량 투여(dosage administration)와 같은 투여량 투여를 위한 양으로 제형화 될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 제형화와 관련된 제공된 방법은, 형질전환된 세포, 예를 들어 상기 기재된 처리 단계를 사용하여 형질도입 및/또는 증폭된 세포를 폐쇄 시스템에서 처리하는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 농축된 T 세포의 하나 이상의 조성물이 제형화된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 농축된 T 세포의 조성물은 하나 이상의 조성물이 조작 및/또는 배양된 후에 제형화된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 조성물은 투입 조성물이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 투입 조성물은 이전에 동결 보존(cryopreserved)되고 저장되고, 인큐베이션 전에 해동된다.
특정 구현예에서, 상기 제형화된 세포는 산출 세포이다. 일부 구현예에서, 제형화된 세포는 개별 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 제형화된 세포는 하나 이상의 다른 개별 공여자로부터의 제형화된 세포와 조합되어 복수의 상이한 공여자로부터의 제형화된 세포를 생산한다. 일부 구현예에서, 제형화된 세포는 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 농축된 T 세포의 제형화된 조성물은 농축된 T 세포의 투입 조성물이다. 특정 구현예에서, 상기 제형화된 CD4+ T 세포 및 제형화된 CD8+ T 세포는 산출 CD4+ T 및 CD8+ T 세포이다. 특정 구현예에서, 제형화된 세포 조성물, 예를 들어 농축된 CD4+ 및 CD8+ 세포의 제형화된 조성물은 산출 세포 조성물, 예를 들어 CD4+ 및 CD8+ 세포의 산출 조성물이다.
일부 구현예에서, 세포는 용기, 예를 들어 백 또는 바이알로 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 세포는, 상기 배양도중에 임계치의 세포수, 밀도, 및/또는 증폭이 달성된 후 0일 내지 10일, 0일 내지 5일, 2일 내지 7일, 0.5일 내지 4일, 또는 1일 내지 3일에 제형화된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는, 상기 배양도중에 임계치의 세포수, 밀도, 및/또는 증폭이 달성된 후 (약) 12시간, 18시간, 24시간, 1일, 2일, 또는 3일 이내에 제형화된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는, 상기 배양도중에 임계치의 세포수, 밀도, 및/또는 증폭이 달성된 후 (약) 1일 이내에 제형화된다.
특정 구현예에서, 상기 세포는, 상기 임계치가 달성되는 때와 무관하게 세포가 상기 배양도중에 보다 빠른 시점에 제형화되는 경우 보다 덜 활성화된 상태에서 수집되도록 최소 기간 또는 시간동안 배양된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는, 상기 배양도중에 임계치의 세포수, 밀도, 및/또는 증폭이 달성된 후 0일 내지 3일, 예를 들어 0일 내지 3일, 1일 내지 2일, (약) 1일, (약) 2일, 또는 (약) 3일에 제형화된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 상기 임계치의 세포수, 밀도, 및/또는 증폭을 활성화하고 상기 제형화 전의 최소 시간 또는 기간동안 배양된 상태를 유지한다. 일부 구현예에서, 상기 임계치를 달성한 세포는 그것들이 최소 시간 또는 기간, 예를 들어 1일 내지 14일, 2일 내지 7일, 또는 3일 내지 6일의 최소 시간 또는 기간, 또는 (약) 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 또는 7일 초과의 최소 시간 또는 기간동안 배양될 때까지 제형화되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 배양의 최소 시간 또는 기간은 3일 내지 6일이다.
일부 구현예에서, 세포는 약학적으로 허용가능한 완충제로 제형화되는데, 이는 일부 측면에서 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 처리(processing)는 배지를 대상체에게 투여하기 위해 약학적으로 허용가능하거나 바람직한 배지 또는 제형 완충제로 배지를 교환하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 처리 단계는 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있는, 약학적으로 허용가능한 완충액에서 세포를 대체하기 위해 형질도입 및/또는 증폭된 세포를 세척하는 것을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 이러한 약학적 형태의 예는 세포 및 조성물을 대상체에게 투여하기에 적합한 형태와 관련하여 하기에 기술될 수 있다. 일부 구현예에서 약학 조성물은 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는데 효과적인 양, 예를 들어 치료적 유효 또는 예방적 유효량으로 세포를 포함한다.
"약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분 이외의 약학적 제형의 성분을 나타내며, 이는 대상체에게 무독성이다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충제, 부형제, 안정제 또는 보존제를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
일부 측면에서, 담체의 선택은 특정 세포 및/또는 투여 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 다양한 적합한 제형이 존재한다. 예를 들어 약학 조성물은 보존제를 포함할 수 있다. 적합한 보존제는 예를 들어 메틸파라벤(methylparaben), 프로필파라벤(propylparaben), 벤조산나트륨 (sodium benzoate) 및 염화벤잘코늄(benzalkonium chloride)을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 둘 이상의 방부제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 이들의 혼합물은 일반적으로 총 조성물의 중량을 기준으로 약 0.0001% 내지 약 2%의 양으로 존재한다. 담체는 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 기재되어 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며 다음을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다: 포스페이트, 시트르산염(citrate) 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (옥타데실 디메틸벤질 암모늄 클로라이드(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride); 헥사메토늄 클로라이드(hexamethonium chloride);염화벤잘코늄(benzalkonium chloride); 벤제토늄 클로라이드(benzethonium chloride); 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀(resorcinol); 사이클로헥사놀(cyclohexanol); 3-펜탄올(3-pentanol); 및 m-크레졸); 저 분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린과 같은 단백질; 폴리 비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 글루코스, 마노스(mannose) 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스(sucrose), 만니톨, 트레할로스(trehalose) 또는 소르비톨(sorbitol)과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 카운터-이온(salt-forming counter-ions); 금속 착물 (예 : Zn- 단백질 착물); 및 / 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비이온성 계면 활성제.
일부 측면에서 완충제가 조성물에 포함된다. 적합한 완충제는 예를 들어 시트르산, 시트르산 나트륨, 인산, 인산 칼륨 및 다양한 다른 산 및 염을 포함한다. 일부 측면에서, 2 종 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 이의 혼합물은 일반적으로 총 조성물의 약 0.001 중량% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약학 조성물의 제조 방법은 공지되어있다. 자세한 예시적인 방법은 예를 들어 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)에 기재되어 있다.
제형은 수용액을 포함할 수 있다. 제형 또는 조성물은 또한, 세포로 치료되는 특정 징후(particular indication), 질환 또는 병태에 유용한 하나 이상의 활성 성분, 바람직하게는 세포에 상보적인 활성을 갖는 활성 성분을 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 활성은 서로 악영향을 미치지 않는다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다. 따라서, 일부 구현예에서, 약학 조성물은, 화학치료제, 예를 들어 아스파라기나제(asparaginase), 부설판(busulfan), 카보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 플로우로유라실(fluorouracil), 젬시타빈(gemcitabine), 히드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 파클리탁셀(paclitaxel), 리툭시맙(rituximab), 빈블라스틴(vinblastine) 및/또는 빈크리스틴(vincristine)과 같은 다른 약학적 활성제 또는 약물을 더 포함한다.
일부 구현예에서 조성물은 멸균 액체 제제, 예를 들어 등장성 수용액, 현탁액, 유제, 분산액 또는 점성 조성물로서 제공되며, 이는 일부 측면에서 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액체 조성물은, 예를 들어 물, 식염수(saline), 포스페이트 완충 식염수, 폴리올(polyol)(예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이들의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다. 멸균 주사용 용액은 적절한 담체, 희석제 또는 부형제, 예를 들어 멸균수, 생리 식염수, 포도당, 덱스트로오스(dextrose) 등과의 혼합물과 같은 용매에 세포를 혼입시킴으로써 제조될 수 있다. 조성물은 투여 경로 및 원하는 제형에 따라, 습윤제, 분산제 또는 유화제(예를 들어 메틸셀룰로오스), pH 완충제, 겔화 또는 점도 향상 첨가제, 보존제, 향미제 및/또는 색소와 같은 보조 물질을 포함할 수 있다. 적절한 준비를 준비하기 위해 일부 측면에서 표준 텍스트를 참조할 수 있다.
항균 방부제, 항산화제, 킬레이트제 및 완충제를 포함하여 조성물의 안정성 및 무균 성을 향상시키는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로 부탄올, 페놀 및 소르브산에 의해 보장될 수 있다. 주사 가능한 약학 형태의 흡수를 지속시키는 것은 흡수 지연제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트(aluminum monostearate) 및 젤라틴을 사용함으로써 야기될 수 있다.
일부 구현예에서, 제형 완충제는 동결 보존제(cryopreservative)를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 1.0% 내지 30% DMSO 용액, 예를 들어 5% 내지 20% DMSO 용액 또는 5% 내지 10% DMSO 용액을 포함하는 동결 보존 용액(cyropreservative solution)로 제형화된다. 일부 구현예에서, 동결 보존 용액은, 예를 들어 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민(HSA)을 함유하는 PBS, 또는 다른 적합한 세포 동결 배지이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 동결 보존 용액은 예를 들어 적어도 7.5% DMSO이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 처리 단계(processing steps)는 동결 보존 용액(cryopreservative solution)에서 세포를 대체하기 위해 형질도입된 및/또는 증폭된 세포를 세척하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 최종 농도가 12.5%, 12.0%, 11.5%, 11.0%, 10.5%, 10.0%, 9.5%, 9.0%, 8.5%, 8.0%, 7.5%, 7.0%, 6.5%, 6.0%, 5.5% 또는 5.0% 또는 약 12.5%, 12.0%, 11.5%, 11.0%, 10.5%, 10.0%, 9.5%, 9.0%, 8.5%, 8.0%, 7.5%, 7.0%, 6.5%, 6.0%, 5.5% 또는 5.0%인 DMSO 또는 1% 내지 15%, 6% 내지 12%, 5% 내지 10% 또는 6% 내지 8%인 DMSO 배지 및/또는 용액에서 동결, 예를 들어 동결, 예를 들어 동결 보존(cryopreserved) 또는 동결 보호(cryoprotected)된다. 특정 구현예에서, 최종 농도가 5.0%, 4.5%, 4.0%, 3.5%, 3.0%, 2.5%, 2.0%, 1.5%, 1.25%, 1.0%, 0.75%, 0.5% 또는 0.25% 또는 약 5.0%, 4.5%, 4.0%, 3.5%, 3.0%, 2.5%, 2.0%, 1.5%, 1.25%, 1.0%, 0.75%, 0.5% 또는 0.25%인 HSA, 또는 0.1% 내지 5%, 0.25% 내지 4%, 0.5% 내지 2%, 또는 1% 내지 2%인 HSA 배지 및/또는 용액으로 동결, 예를 들어 동결 보존 또는 동결 보호된다.
특정 구현예에서, 자극되고, 조작되고/되거나, 배양된 농축된 T 세포, 예를 들어 T 세포의 조성물은 제형화되고, 동결 보존된 다음, 일정 시간동안 저장된다. 특정 구현예에서, 상기 제형화되고, 동결 보존된 세포는, 상기 세포가 주입을 위해 방출될 때까지 저장된다. 특정 구현예에서, 상기 제형화되고 동결 보존된 세포는, 1일 내지 6개월, 1개월 내지 3개월, 1일 내지 14일, 1일 내지 7일, 3일 내지 6일, 6개월 내지 12개월, 또는 12개월 초과동안 저장된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 동결 보존되고 (약) 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일, 또는 그 기간 미만동안 저장된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 상기 저장 후 해동되고 투여된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 (약) 5일동안 저장된다.
일부 구현예에서, 제형화는, 배양된 또는 증폭된 세포와 같은 세포의 세척, 희석 또는 농축을 포함하는 하나 이상의 처리 단계를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 처리(processing)는, 주어진 복용량 또는 이의 분획으로 투여하기위한 세포수를 포함하는 단위 용량 형태 조성물과 같은, 원하는 농도 또는 수로 세포의 희석 또는 농도를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 처리 단계는 부피 감소를 포함하여 원하는 바에 따라 세포의 농도를 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 처리 단계는 부피-부가를 포함하여 원하는 바에 따라 세포의 농도를 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 처리는 형질도입 및/또는 증폭된 세포에 다량의 제형 완충제를 첨가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제형 완충제의 부피는 10mL 내지 1000mL 또는 약 10mL 내지 1000mL, 예를 들어 적어도 (약) 또는 약 또는 50mL, 100mL, 200mL, 300mL, 400mL, 500mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL 또는 1000 mL이다.
일부 구현예에서, 세포 조성물을 제형화하기 위한 이러한 처리 단계는 폐쇄 시스템에서 수행된다. 이러한 처리 단계의 예시는, 세포 처리 시스템과 관련된 하나 이상의 시스템 또는 키트와 연계되어 원심 챔버를 사용하여 수행될 수 있으며, 예를 들어 Sepax® 또는 Sepax 2® 세포 처리 시스템과 함께 사용하기위한 것을 포함하는, Biosafe SA에 의해 생산 및 판매되는 원심 챔버와 같다. 예시적인 시스템 및 공정는 국제공개공보 제WO2016/073602호에 기재되어있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 원심 챔버의 내부 공동으로부터 제형화된 조성물을 발현시키는 단계를 포함하며, 이는 전술한 바와 같은 상기 구현예들 중 어느 하나에서, 약학적으로 허용되는 완충제와 같은, 제형화 완충제로 제형화된 세포의 결과 조성물이다. 일부 구현예에서, 제형화된 조성물의 발현은, 용기, 예를 들어 폐쇄 시스템의 일부로서 원심 챔버와 작동 가능하게 연결되어 있는 백(bag)에 대한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 용기, 예를 들어 백은 산출 라인 또는 산출 위치에서 시스템에 연결된다.
일부 구현예에서, 원심 챔버 또는 세포 처리 시스템과 관련된 폐쇄 시스템은, 튜빙 라인의 각 단부에, 제형화된 조성물의 발현을 위해 하나 또는 복수의 용기가 연결될 수 있는 포트로 연결된, 다방향 튜빙 매니폴드(multi-way tubing manifold)를 포함하는 다중 포트 산출 키트(multi-port output kit)를 포함한다. 일부 측면에서, 원하는 수 또는 복수의 산출 용기, 예를 들어 백은 멀티-포트 산출(multi-port output)의 하나 이상, 일반적으로 2 개 이상, 예를 들어 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8 개 이상의 포트(ports)에 멸균 연결될 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, 하나 이상의 용기, 예를 들어 백은 포트 또는 모든 포트보다 적은 포트에 부착될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 시스템은 산출 조성물의 생체 의학 용기의 복수의 백으로의 발현에 영향을 줄 수 있다.
일부 측면에서, 세포는 단일 단위 투여량 투여(single unit dosage administration) 또는 다중 투여량 투여(multiple dosage administration)와 같은, 투여량 투여를 위한 양으로 복수의 산출 백(output bag) 중 하나 이상, 예를 들어 산출 백에 발현될 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, 백은 각각 주어진 용량 또는 이의 분획으로 투여하기위한 세포의 수를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 각각의 백은 투여를 위한 단일 단위 용량을 포함할 수 있고 또는 2 개 이상의 산출 백과 같은 복수의 산출 백 중 하나 이상, 또는 산출 백의 3 개 이상이 되도록 원하는 용량의 분획을 포함할 수 있고, 함께 투여를 위한 용량을 구성한다.
따라서, 용기, 예를 들어 산출 백은 일반적으로 투여될 세포, 예를 들어 이의 하나 이상의 단위 용량을 포함한다. 단위 용량은 대상체에게 투여될 세포의 양 또는 수, 또는 투여될 세포수의 2 배(또는 그 이상)일 수 있다. 이것은 대상에게 투여될 세포의 최저 용량 또는 최저 가능 용량일 수 있다.
일부 구현예에서, 각각의 용기, 예를 들어 백은 별도로 단위 용량의 세포를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 용기 각각은 동일하거나 대략 또는 실질적으로 동일한 수의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 단위 용량은 적어도 (약) 1×106, 2×106, 5×106, 1×107, 5×107 또는 1×108 개의 조작된 세포, 총 세포, T 세포 또는 PBMCs를 함유한다. 일부 구현예에서, 각각의 백에서 제형화된 세포 조성물의 부피는 10mL 내지 100mL, 예를 들어 적어도 (약) 20mL, 30mL, 40mL, 50mL, 60mL, 70mL, 80mL, 90mL 또는 100mL이다.
일부 구현예에서, 상기 방법에 의해 생성된 이러한 세포 또는 이러한 세포를 포함하는 조성물은 질환 또는 병태를 치료하기 위해 대상체에게 투여된다.
특정 구현예에서, 제공된 방법은 세포 요법에 적합한 CD57- T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물을 성공적으로 생성하거나 생산할 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 확률 또는 가능성을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 확률 또는 가능성은 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 또는 92% 내지 94%이다. 특정 구현예에서, 상기 제공된 방법은 공여자 샘플 또는 농축된 CD57- T 세포의 집단의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%로부터 세포 요법에 적합한 CD57- T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물을 성공적으로 생성하거나 생산한다.
특정 구현예에서, 제공된 방법은 세포 요법에 적합한 CD27+ T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물을 성공적으로 생성하거나 생성할 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 확률 또는 가능성을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 확률 또는 가능성은 85% 내지 100%, 90% 내지 95%, 또는 92% 내지 94%이다. 특정 구현예에서, 상기 제공된 방법은 공여자 샘플 또는 농축된 CD27+ T 세포의 집단의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%로부터 세포 요법에 적합한 CD27+ T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물을 성공적으로 생성하거나 생산한다.
특정 구현예에서, 자극의 개시에서 세포의 수집, 수확 또는 제형화까지 조작된 세포를 생성하기 위한 제공된 공정의 전체 지속 기간은 (약) 36 시간, 42 시간, 48 시간, 54 시간, 60 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간, 108 시간 또는 120 시간 또는 36 시간, 42 시간, 48 시간, 54 시간, 60 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간, 108 시간 또는 120 시간 미만이다. 특정 구현예에서, 자극의 개시에서 세포의 수집, 수확 또는 제형화까지 조작된 세포를 생성하기 위한 제공된 공정의 전체 지속 기간은 (약) 1.5 일, 2 일, 3 일, 4 일 또는 5 일 또는 1.5 일, 2 일, 3 일, 4 일 또는 5 일 미만이다. 일부 구현예에서, 자극의 개시에서 세포의 수집, 수확 또는 제형화까지 조작된 세포를 생성하기 위한 제공된 공정의 전체 지속 기간은 (약) 36 시간 내지 120 시간, 48 시간 내지 96 시간 또는 48 시간 내지 72 시간(경계 포함) 또는 (약) 1.5 일 내지 5 일, 2 일 내지 4 일 또는 2 일 내지 3 일(경계 포함)이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션의 개시에서 세포의 수확, 수집 또는 제형화까지 측정된 바와 같이 제공된 공정를 완료하기까지의 시간량은 (약) 48 시간, 72 시간 또는 96 시간 또는 48 시간, 72 시간 또는 96 시간 미만 또는 (약) 2 일, 3 일 또는 4 일 또는 2 일, 3 일 또는 4 일 미만이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션의 개시에서 세포의 수확, 수집 또는 제형화까지 측정된 바와 같이 제공된 공정를 완료하기까지의 시간량은 48 시간±6 시간, 72 시간±6 시간 또는 96 시간±6 시간이다.
일부 구현예에서, 인큐베이션은, 자극의 개시 후 (약) 24 시간 내지 120 시간, 36 시간 내지 108 시간, 48 시간 내지 96 시간 또는 48 시간 내지 72 시간(경계 포함)에 완료된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 자극의 개시로부터 (약) 120 시간, 108 시간, 96 시간, 72 시간, 48 시간 또는 36 시간 또는 120 시간, 108 시간, 96 시간, 72 시간, 48 시간 또는 36 시간 이내에 완료된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션은 24 시간±6 시간, 48 시간±6 시간 또는 72 시간±6 시간 후에 완료된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은, 자극의 개시 후 (약) 1 일 내지 5 일, 1.5 일 내지 4.5 일, 2 일 내지 4 일 또는 2 일 내지 3 일(경계 포함)에 완료된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 자극의 개시로부터 (약) 5 일, 4 일, 3 일, 2 일 또는 1.5 일 또는 5 일, 4 일, 3 일, 2 일 또는 1.5 일 이내에 완료된다.
일부 구현예에서, 전체 공정는 농축된 T 세포, 예를 들어 CD4+ 및 CD8+ T 세포 또는 CD3+ 세포의 단일 집단으로 수행된다. 특정 구현예에서, 공정는 농축된 T 세포의 단일 산출 집단을 생산 또는 생산하기 위한 공정 전 및/또는 중에 결합된 2개 이상의 농축된 T 세포(예를 들어 CD4 및 CD8 세포)의 선택된 집단으로 수행된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포는, 조작된 T 세포, 예를 들어 재조합 수용체를 발현하도록 형질도입된 T 세포이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 조작된 T 세포의 조성물은은, (i) (약) 18 내지 30 시간(경계 포함) 동안 자극 조건 하에 T 세포 함유 또는 T 세포 투입 집단을 인큐베이션하고, (ii) 자극 집단의 T 세포로 재조합 수용체를 암호화하는 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 도입시키고, (iii) 세포를 인큐베이션하고, 이어서 (iv) 인큐베이션된 세포를 수집 또는 수확함으로써 생성된다.
일부 구현예에서, 세포는, 자극 조건 하에 인큐베이션이 개시된 후 36 내지 108 시간 또는 1.5 일 내지 4.5 일 이내에 수확 또는 수집된다. 특정 구현예에서, 세포는, 형질전환(예를 들어 유전자 조작, 형질도입 또는 형질감염)된 T 세포가 24-48 시간 또는 1 일 내지 2 일의 시간 내에 20% 이상 증가 또는 감소하지 않는 게놈 당 안정적인 통합 벡터 카피 수(iVCN)를 달성한 후 48 시간 또는 2 일 내에 수집 또는 수확된다. 일부 구현예에서, 세포 집단의 측정된 iVCN이 집단에서 측정된 총 벡터 카피 수(VCN)의 (약) 20%, 15%, 10% 또는 5% 이내인 경우 통합이 안정적인 것으로 간주된다. 특정 구현예는, 안정적인 통합을 달성하기 위해 바이러스 벡터가 세포와 접촉 또는 도입된 후, 세포가 (약) 48 시간, 60 시간 또는 72 시간 또는 1 일, 2 일 또는 3 일 또는 48 시간, 60 시간 또는 72 시간 또는 1 일, 2 일 또는 3 일 이상 동안 인큐베이션되어야 함을 고려한다. 일부 구현예에서, 안정적인 통합은 인큐베이션의 (약) 72 시간 내에 발생한다. 일부 구현예에서, 형질전환된 T 세포의 총 수가 투입 집단 세포의 총 수이거나 또는 미만인 경우 세포는 수집 또는 수확된다. 다양한 구현예에서, 세포는, 투입 집단의 세포가 3, 2 또는 1 배 이상 배가되기 전의 시기에 수집 또는 수확된다.
특정 구현예에서, 조작된 T 세포의 조성물은, (i) 자극 시약, 예를 들어 본원에 기재된 자극 시약의 존재 하에 18 내지 30 시간(경계 포함) 동안 자극 조건 하에 T 세포를 포함하는 투입 집단을 인큐베이션하고, (ii) 예를 들어 바이러스 벡터의 존재 하에 자극된 T 세포를 회전 접종함으로써 재조합 수용체를 암호화하는 바이러스 벡터로 자극된 T 세포를 형질도입시키고, (iii) 18 시간 내지 96 시간(경계 포함) 동안 정적 조건 하에 형질도입된 T 세포를 인큐베이션하고, (iv) 자극 조건 하에 인큐베이션이 개시된 후 (약) 36 시간 내지 108 시간 내에 형질전환된 집단의 T 세포를 수확함으로써 생성된다.
일부 구현예에서, 제공된 방법과 관련된 공정는 대안적인 공정와 비교된다. 예를 들어 일부 구현예에서, 여기 제공된 방법은 세포를 증폭하는 단계를 함유하는 대안적인 공정와 비교된다. 특정 구현예에서, 대안적인 공정는 하나 이상의 특정 측면에서 상이할 수 있으나, 그렇지 않으면 제공된 방법과 관련된 공정와 동일한 특징, 측면, 단계, 시기, 시약 또는 조건을 함유한다. 일부 구현예에서, 대안적인 공정는 제공된 방법과 관련된 공정와 유사, 예를 들어 증폭을 포함하지 않거나 결여되나, 상이한 시약 및/또는 배지 제형; 인큐베이션, 형질도입, 형질감염 및/또는 배양 중 혈청의 존재; 투입 집단의 상이한 세포 조성, 예를 들어 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율; 상이한 자극 조건 및/또는 상이한 자극 시약; 자극 시약 대 세포의 상이한 비율; 상이한 벡터 및/또는 형질도입 방법; 세포의 인큐베이션, 형질도입 및/또는 형질감염을 위한 상이한 시기 또는 순서; 형질도입 또는 인큐베이션 중 존재하는 하나 이상의 재조합 사이토카인의 부재 또는 차이(예를 들어 상이한 사이토카인 또는 상이한 농도) 또는 세포의 수확 또는 수집을 위한 상이한 시기; 중 하나 이상을 포함하나 이에 국한되지 않는 방식으로 상이하다.
일부 구현예에서, 공여자 샘플에서 입력 세포(예를 들어 CD4+ 또는 CD8+ T 세포)의 분리, 농축 및/또는 선택에서 조작된 세포가 수집, 제형화 및/또는 동결 보호되는 시기까지 측정된 바와 같은 제공된 공정를 완료하기까지 필요한 시간의 양 또는 지속 기간은 (약) 48 시간, 72 시간, 96 시간, 120 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 7 일 또는 10 일 또는 48 시간, 72 시간, 96 시간, 120 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 7 일 또는 10 일 미만이다. 일부 구현예에서, 분리, 선택 또는 농축된 세포는 자극 전에 동결 보호되지 않고, 입력 세포의 분리, 농축 및/또는 선택에서 산출 세포가 수집, 제형화 및/또는 동결 보호되는 시기까지 측정된 바와 같은 제공된 공정를 완료하기까지 필요한 시간의 양 또는 지속 기간은 (약) 48 시간, 72 시간, 96 시간 또는 120 시간 또는 2 일, 3 일, 4 일 또는 5 일 또는 48 시간, 72 시간, 96 시간 또는 120 시간 또는 2 일, 3 일, 4 일 또는 5 일 미만이다.
특정 구현예에서, 제공된 방법은 생물학적 샘플(예를 들어 공여자 샘플)로부터 분리, 농축 또는 선택된 세포, 예를 들어 CD4+ 및 CD8+ T 세포 또는 CD3+ 세포의 집단에 대해 수행된다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 다른 방법 또는 공정과 비교하여 단축된 양의 시간 내에 공여자 샘플이 개별 공여자 또는 복수의 상이한 공여자로부터 수집될 때로부터 조작된 T 세포의 조성물을 생산하거나 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 공여자 샘플, 또는 농축, 분리, 또는 선택된 세포가 동결 보존되고 자극 또는 형질도입을 위한 단계 전에, 약 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일 이내, 또는 약 120시간, 96시간, 72시간, 또는 48시간 이내, 공여자 샘플이 개별 공여자 또는 복수의 상이한 공여자로부터 수집될 때로부터, (예를 들어 동결 보존 또는 투여를 위해) 조작된 T 세포가 수집, 수확, 또는 제형화될 때까지 저장되는 임의의 또는 모든 시간을 포함하여, 조작된 T 세포를 생산 또는 생성할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 방법은 공여자 샘플이 개별 공여자 또는 복수의 상이한 공여자로부터 수집될 때로부터 조작된 T 세포가 수집, 수확 또는 제형화될 때까지의 자극 또는 형질도입을 위한 단계 전에 공여자 샘플, 또는 농축, 분리 또는 선택된 세포가 동결 보존되고 약 6일 내지 8일(경계 포함) 내에 또는 그 사이에 저장되는 임의의 또는 모든 시간을 비롯한 조작된 T 세포를 생산 또는 생성할 수 있다.
III. 재조합 단백질을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드
일부 구현예에서, 제공된 방법은 이종 폴리뉴클레오티드를 CD57-세포에 대해 농축된 집단의 세포(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단) 내로 도입하는 것이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 개별 공여자로부터의 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 복수의 상이한 공여자로부터의 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 내로 도입된다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 CD27+ 세포에 대해 농축된 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)의 세포 내로 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 개별 공여자로부터의 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 복수의 상이한 공여자로부터의 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포 내로 도입된다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 발현 또는 하나 이상의 표적 분자가 파괴된 (예를 들어 녹아웃된) 세포의 집단 내로 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 재조합 단백질을 암호화한다. 이러한 재조합 단백질은 섹션 IIIA에 기재된 것과 같은 재조합 수용체를 포함할 수 있다. 세포 내로의 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오티드의 도입은 임의의 수의 공지된 벡터를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 벡터는 아데노-연관 및 렌티바이러스 및 감마레트로바이러스 시스템을 포함하는 바이러스를 포함한다. 예시적인 방법은 바이러스, 예를 들어 아데노-연관, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 형질도입(transduction)을 통한 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드의 전달을 포함한다. 일부 구현예에서, 자극된 세포의 집단은, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 도입하여 형질전환된 세포의 집단(본원에서 형질전환된 세포의 집단으로도 지칭됨)을 생성하도록 유전자 조작된다(예를 들어 넉킹 인된다(knocked in)). 일부 구현예에서, 자극된 세포의 집단은 유전적으로 조작된(예를 들어 넉킹 인된다), 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 유전적으로 파괴된(예를 들어 녹아웃된) 유전자 좌위 또는 부분 트로프 내로 도입하여, 형질전환된 세포의 집단(본원에서 형질전환된 세포의 집단으로도 지칭됨)을 생성한다.
특정 구현예에서, 재조합 단백질, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 세포에 도입된다. 특정 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 상기 세포에 이종이다. 특정 구현예에서, 상기 이종 폴리뉴클레오티드는 세포에 네이티브하지 않다. 특정 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 단백질, 예를 들어 상기 세포에 의해서 네이티브하게 발현되지 않는 재조합 단백질을 암호화한다. 특정 구현예에서, 상기 이종 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 상기 접촉 또는 도입 전에 상기 세포에서 발견되지 않는 핵산 서열이거나 또는 그를 함유한다.
특정 구현예에서, 상기 이종 폴리뉴클레오티드는 재조합 단백질을 암호화한다. 특정 구현예에서, 상기 재조합 단백질은 재조합 수용체이다. 일부 구현예에서, 상기 재조합 단백질은 재조합 항원 수용체, 예를 들어 재조합 TCR 또는 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
A. 재조합 수용체
일부 구현예에서, 하나 이상의 재조합 수용체(들)를 발현하거나 발현하도록 조작된 조작된 세포, 예를 들어 CD57- T 세포(예를 들어 CD57- T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물)가 제공된다. 일부 구현예에서, CD57- T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물은 개별 공여자로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 CD57- T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물을 하나 이상의 다른 개별 공여자로부터의 CD57- T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물과 조합하여 복수의 상이한 공여자로부터의 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생성한다. 일부 구현예에서, CD57- T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자로부터 유래한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 재조합 수용체(들)를 발현하거나 발현하도록 조작된 조작된 세포, 예를 들어 CD27+ T 세포(예를 들어 CD27+ T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물)가 제공된다. 일부 구현예에서, CD27+ T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물은 개별 공여자로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 CD27+ T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물은 하나 이상의 다른 개별 공여자로부터의 CD27+ T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물과 조합되어 복수의 상이한 공여자로부터의 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생성한다. 일부 구현예에서, CD27+ T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자로부터 유래한다.
수용체 중에는 항원 수용체 및 이의 하나 이상의 성분을 함유하는 수용체가 있다. 재조합 수용체는 키메라 수용체, 예를 들어 리간드-결합 도메인 또는 이의 결합 단편 및 세포 내 신호 전달 도메인 또는 영역, 작용성 비-TCR 항원 수용체, 키메라 항원 수용체(CAR), T 세포수용체(TCRs), 예를 들어 재조합 또는 형질전환 TCRs , 키메라 자가항체 수용체(CAAR) 및 상기의 임의의 성분를 포함할 수 있다. CAR과 같은 재조합 수용체는 일반적으로 일부 측면에서 링커 및/또는 트랜스멤브레인 도메인(들)을 통해 하나 이상의 세포 내 신호 전달 성분에 연결된 세포 외 항원(또는 리간드) 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 세포는 상이한 성분들, 도메인들 또는 영역들을 함유하는 둘 이상의 수용체를 발현시킨다. 일부 측면에서, 둘 이상의 수용체들은 재조합 수용체들의 특이성, 활성, 항원(또는 리간드) 결합, 기능 및/또는 발현의 공간적 또는 시간적 규제(regulation) 또는 제어를 허용한다.
1.
키메라
항원 수용체(
CARs
)
제공된 방법 및 용도의 일부 구현예에서, 키메라 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체는 상기 조작된 세포, 예를 들어 T 세포는, 세포내 신호 도메인으로 원하는 항원(예를 들어 종양 항원)에 대한 특이성을 제공하는 리간드-결합 도메인(예를 들어 항체 또는 항체 단편)을 조합하는 하나 이상의 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 도메인은 1차 활성화 신호 또는 1차 신호를 제공하는 T 세포 자극 또는 활성화 도메인과 같은 자극 또는 활성화 세포내 도메인 부분이다. 일부 구현예에서, 상기 세포내 신호 도메인은 이펙터 기능을 용이하게 하기 위해 공자극 신호 도메인을 함유하거나 추가로 함유한다. 일부 구현예에서, 면역 세포 내로 유전자 조작될 때 키메라 수용체는 T 세포 활성을 조절할 수 있고, 일부 경우에, T 세포 분화 또는 항상성을 조절할 수 있어, 입양 세포 치료 방법에 사용하기 위한 것과 같은, 생체 내 향상된 장수, 생존 및/또는 지속성을 가진 유전자 조작된 세포를 초래한다.
CAR를 포함하는 예시적인 항원 수용체 및 그러한 수용체를 세포 내로 조작 및 도입하기 위한 방법은 예를 들어 국제공개공보 제WO2000/14257호, 제WO2013/126726호, 제WO2012/129514호, 제WO2014/031687호, 제WO2013/166321호, 제WO2013/071154호, 제WO2013/123061호, 미국출원공개공보 US2002/131960, US2013/287748, US2013/0149337, 미국특허 번호 US6,451,995, US7,446,190, US8,252,592, US8,339,645, US8,398,282, US7,446,179, US6,410,319, US7,070,995, US7,265,209, US7,354,762, US7,446,191, US8,324,353, US8,479,118, 및 유럽 특허 출원 번호 EP2537416에서 서술된 것 및/또는 Sadelain 등, Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila 등, (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle 등, Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu 등, Cancer, 2012 March 18(2): 160-75에서 서술된 것을 포함한다. 일부 측면에서, 항원 수용체는 미국특허 번호 7,446,19에서 서술된 바와 같은 CAR, 및 국제공개공보 제WO2014055668 A1호에서 서술된 것을 포함한다. CAR의 예시는 상기 언급된 출판물, 제WO2014/031687호, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, 미국특허 번호 US7,446,190, 미국특허 번호 US78,389,282, Kochenderfer 등, 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang 등, (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; 및 Brentjens 등, Sci Transl Med. 2013 5(177)와 같은, 하나에서 서술된 바와 같은 CAR를 포함한다. WO2014/031687, US8,339,645, US 7,446,179, US2013/0149337, 미국특허 번호 US7,446,190, 및 미국특허 번호 US8,389,282, WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US2013/0149337, 미국특허 번호 US7,446,190, 및 미국특허 번호 US8,389,282을 역시 참고한다.
상기 키메라 수용체, 예를 들어 CAR은, 일반적으로 세포외 항원 결합 도메인, 예를 들어 항체 분자의 일부, 일반적으로는 상기 항체의 가변 중쇄 (VH) 영역 및/또는 가변 경쇄 (VL) 영역, 예를 들어 scFv 항체 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화된 항원은 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 구현예에서, 항원은 정상 또는 비-표적화 세포 또는 조직과 비교하여 질환 또는 병태의 세포, 예를 들어 종양 또는 병원성 세포에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 구현예에서, 항원은 정상 세포에서 발현되고 및/또는 조작된 세포에서 발현된다.
일부 구현예에서, 상기 수용체에 의해서 표적화된 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 인테그린), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산탈수효소 9(CA9, 또한 CAIX 또는 G250로 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2로 공지됨), 암태아성 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5, 또한 Fc 수용체 유사 5 또는 FCRH5로 공지됨), 태아성 아세틸콜린 수용체(태아성 AchR), 폴레이트 결합 단백질(FBP), 폴레이트 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화된 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 5D(GPRC5D), Her2/neu (수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-멜라노마-연관 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복 함유 8 패밀리 멤버 A(LRRC8A), 루이스 Y, 멜라노마-연관 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 온코페탈 항원, 멜라노마의 우선 발현된 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 세포영양막 당단백(TPBG, 또한 5T4로 공지됨), 종양-연관 당단백 72(TAG72), 티로시나아제 연관 단백질 1(TRP1, 또한 TYRP1또는 gp75로 공지됨), 티로시나아제 연관 단백질 2(TRP2, 또한 도파크롬 토토머라아제, 도파크롬 델타-이소머라아제 또는 DCT로 공지됨), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2), 윌름스 종양 1(WT- 1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현 항원, 또는 유니버설 태그로 연관된 항원, 및/또는 비오틴화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서 수용체에 의해 표적화된 항원은 다수의 공지된 B 세포 마커의 하나와 같은 B 세포 악성 종양과 연관된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항원은 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원이거나 또는 그를 포함한다. 상기 항원은 바이러스성 항원(예를 들어 HIV, HCV, HBV 등으로부터의 바이러스성 항원), 박테리아성 항원, 및/또는 기생성 항원이다.
일부 구현예에서, 항원 또는 항원 결합 도메인은 CD19이다. 일부 구현예에서, scFv는 CD19에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, CD19에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 FMC63 및 SJ25C1과 같은 마우스 유래 항체이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 예를 들어 미국특허 공개 번호 US2016/0152723에 서술된 바와 같은, 인간 항체이다.
일부 구현예에서, scFv는 FMC63으로부터 유래된다. FMC63은 일반적으로 인간 기원의 CD19를 발현하는 Nalm-1 및 -16 세포에 대해 생성된 마우스 단일클론 IgG1 항체를 가리킨다(Ling, N. R., 등, (1987). Leucocyte typeing III. 302). 일부 구현예에서, FMC63 항체는 각각 서열번호 38 및 39에 제시된 CDR H1 및 H2, 및 서열번호 40 또는 54에 제시된 CDR H3 및 서열번호 35에 제시된 CDR L1 및 서열번호 36 또는 55에 제시된 CDR L2 및 서열번호 37 또는 56에 제시된 CDR L3를 포함한다. 일부 구현예에서, FMC63 항체는 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, scFv는 서열번호 35의 CDRL1 서열, 서열번호 36의 CDRL2 서열, 및 서열번호 37의 CDRL3 서열을 함유하는 가변 경쇄 및/또는 서열번호 38의 CDRH1 서열, 서열번호 39의 CDRH2 서열 및 서열번호 40의 CDRH3 서열을 함유하는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열번호 41에 제시된 가변 중쇄 영역 및 서열번호 42에 제시된 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 서열번호 58에 제시되어 있다. 일부 구현예에서, scFv는 VH, 링커 및 VL을 순서대로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 VL, 링커 및 VH를 순서대로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열번호 43에 제시된 뉴클레오티드의 서열 또는 서열번호 43과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, scFv는 서열번호 43에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열번호 43과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, scFv는 SJ25C1로부터 유래된다. SJ25C1은 인간 기원의 CD19를 발현하는 Nalm-1 및 -16 세포에 대해 생성된 마우스 단일 클론 IgG1 항체이다 (Ling, N. R., 등, (1987). Leucocyte typeing III. 302). 일부 구현예에서, SJ25C1 항체는 CDRH1, 각각 서열번호 47-49에 제시된 H2 및 H3, 및 CDRL1, 각각 서열번호 44-46에 제시된 L2 및 L3를 포함한다. 일부 구현예에서, SJ25C1 항체는 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, scFv는 서열번호 44의 CDRL1 서열, 서열번호 45의 CDRL2 서열, 및 서열번호 46의 CDRL3 서열을 함유하는 가변 경쇄 및/또는 서열번호 47의 CDRH1 서열, 서열번호 48의 CDRH2 서열, 및 서열번호 49의 CDRH3 서열을 함유하는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열번호 50에 제시된 가변 중쇄 영역 및 서열번호 51에 제시된 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 서열번호 52에 제시되어 있다. 일부 구현예에서, scFv는 VH, 링커 및 VL을 순서대로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 VL, 링커 및 VH를 순서대로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열번호 53에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열번호 53과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 키메릭 항원 수용체는 항체 또는 항체 단편을 함유하는 세포외 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 키메라 항원 수용체는 항체 또는 단편을 함유하는 세포외 부분 및 세포내 신호 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 scFv를 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 항체 부분은 힌지 영역, 예를 들어 IgG4 힌지 영역, 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역과 같은 면역글로불린 불변 도메인의 적어도 부분을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 도메인 또는 부분은 IgG4 또는 IgG1와 같은, 인간 IgG의 것이다. 일부 측면에서, 불변 도메인의 일부는 항원-인식 성분, 예를 들어 scFv, 및 막 관통 도메인 사이의 스페이서 영역으로서 작용한다. 스페이서는 스페이서가 없을 때와 비교하여, 항원 결합 후 세포의 반응성을 증가시키는 길이를 가질 수 있다. 예시적인 스페이서는 Hudecek 등, (2013) Clin . Cancer Res., 19:3153, 국제 특허 출원 공개 WO2014031687, U.S. 특허 번호 8,822,647 또는 공개된 출원 번호 US2014/0271635에 서술된 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 불변 도메인 또는 부분은 IgG4 또는 IgG1와 같은, 인간 IgG의 것이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 ESKYGPPCPPCP(서열번호 1에 제시됨)를 가지고, 서열번호 2에 제시된 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열번호 3에 제시된 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열번호 4에 제시된 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 불변 도메인 또는 부분은 IgD의 것이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열번호 5에 제시된 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 스페이서는 임의의 서열번호 1, 3, 4 또는 5와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열번호 27-34에 제시된 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열번호 27-34와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 가진다.
일부 구현예에서, 항원 수용체는 세포외 도메인에 직접 또는 간접적으로 연결된 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메릭 항원 수용체는 세포외 도메인 및 세포내 신호 도메인을 연결하는 막 관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 도메인은 ITAM을 포함한다. 예를 들어 일부 측면에서, 항원 인식 도메인(예를 들어 세포외 도메인)은 CAR, 및/또는 다른 세포 표면 수용체를 통한 신호의 경우에, TCR 복합체와 같은, 항원 수용체 복합체를 통해 활성화를 모방하는 신호 성분과 같은, 하나 이상의 세포내 신호 성분에 일반적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 키메릭 수용체는 세포외 도메인 (예를 들어 scFv)과 세포내 신호 도메인 사이에 연결되거나 융합된 막 관통 도메인을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 항원-결합 성분(예를 들어 항체)은 하나 이상의 막 관통 및 세포내 신호 도메인에 연결된다.
한 구현예에서, 수용체, 예를 들어 CAR에서 도메인 중 하나와 자연적으로 연관되는 막 관통 도메인이 사용된다. 일부 경우에, 막 관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호 작용을 최소화하기 위해 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막 관통 도메인에 그러한 도메인의 결합을 피하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형된다.
일부 구현예에서 막 관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 각각 유래된다. 공급원이 천연인 경우, 일부 측면에서 도메인은 임의의 막-결합 또는 막 관통 단백질로부터 유래된다. 막 관통 영역은 T-세포수용체, CD28, CD3 입실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22의 알파, 베타 또는 제타 사슬(즉, 적어도 이의 막 관통 영역을 포함함)로부터 유래된 것들을 포함한다. 일부 측면에서, 합성 막 관통 도메인은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함한다. 일부 측면에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플렛은 합성 막 관통 도메인의 각각의 말단에서 발견될 것이다. 일부 구현예에서, 연결은 링커, 스페이서 및/또는 막 관통 도메인(들)에 의한 것이다. 일부 측면에서, 막 관통 도메인은 CD28의 막 관통 부분을 함유한다.
일부 구현예에서, 세포외 도메인 및 막 관통 도메인은 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 도메인 및 막 관통 도메인은 본원에 서술된 바와 같은, 스페이서에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 수용체는 CD28 세포외 부분과 같은, 막 관통 도메인이 유래하는 분자의 세포외 부분을 함유한다.
세포내 신호 도메인 중에는 천연 항원 수용체를 통한 신호, 공자극 수용체와 조합된 그러한 수용체를 통한 신호, 및/또는 공자극 수용체 단독을 통한 신호가 모방되거나 근사되는 것들이 있다. 일부 구현예에서, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 예를 들어 예를 들어 글라이신-세린 이중선, 글라이신 및 세린을 포함하는 것과 같은, 2개 및 10개 사이 아미노산 길이의 링커는 CAR의 막 관통 도메인 및 세포질 신호 도메인 사이 연결을 존재하고 형성한다.
T 세포 활성화는 2개 클래스의 세포질 신호 서열: TCR를 통해 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 것(1차 세포질 신호 서열), 및 항원-비의존적 방식으로 작용하여 2차 또는 공동-자극 신호를 제공하는 것(2차 세포질 신호 서열)에 의해 매개되는 바와 같이 서술되는 일부 측면에 있다. 일부 측면에서, CAR은 그러한 신호 성분의 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
수용체, 예를 들어 CAR은 적어도 하나의 세포내 신호 성분 또는 성분들을 일반적으로 포함한다. 일부 측면에서, CAR은 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호 서열을 포함한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호 서열은 면역 수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호 모티프를 함유할 수 있다. 1차 세포질 신호 서열을 함유하는 ITAM의 예시는 CD3 제타 사슬, FcR 감마, CD3 감마, CD3 델타 및 CD3 입실론으로부터 유도된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 내 세포질 신호 전달 분자(들)은 세포질 신호 도메인, 그의 부분, 또는 CD3 제타로부터 유래된 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 수용체는 T- 세포 활성화 및 세포독성, 예를 들어 CD3 제타 사슬을 매개하는 TCR CD3 사슬과 같은, TCR 복합체의 세포내 성분을 포함한다. 따라서, 일부 측면에서, 항원-결합 부분은 하나 이상의 세포 신호 모듈에 연결된다. 일부 구현예에서, 세포 신호 모듈은 CD 막 관통 도메인, CD3 세포내 신호 도메인, 및/또는 다른 CD3 막 관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체, 예를 들어 CAR은 Fc 수용체 γ, CD8, CD4, CD25, 또는 CD16과 같은 하나 이상의 추가 분자의 일부를 더 포함한다. 예를 들어 일부 측면에서, CAR 또는 다른 키메릭 수용체는 CD3-제타(CD3-ζ) 또는 Fc 수용체 γ 및 CD8, CD4, CD25 또는 CD16 사이의 키메릭 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR 또는 다른 키메릭 수용체의 결찰시, 수용체의 세포질 도메인 또는 세포내 신호 도메인은 면역 세포, 예를 들어 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포의 정상 이펙터 기능 또는 반응 중 적어도 하나를 활성화시킨다. 예를 들어 일부 상황에서, CAR은 사이토카인 또는 다른 인자의 분비와 같은, 세포분해 활성 또는 T-헬퍼 활성과 같은 T 세포의 기능을 유도한다. 일부 구현예에서, 항원 수용체 성분 또는 공자극 분자의 세포내 신호 전달 도메인의 절단된 부분은, 예를 들어 그것이 이펙터 기능 신호를 형질도입하는 경우, 온전한 면역자극 사슬 대신에 사용된다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 도메인 또는 도메인들은 T 세포수용체(TCR)의 세포질 서열을 포함하고, 일부 측면에서, 또한 자연 상황에서 항원 수용체 결합 후 신호 전달을 개시하기 위해 이러한 수용체와 협력하여 작용하는 공동- 수용체의 것들을 포함한다.
자연 TCR의 상황에서, 완전한 활성화는 일반적으로 TCR을 통한 신호뿐만 아니라 공자극 신호를 필요로 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 또한, 완전한 활성화를 촉진하기 위해, 2차 또는 공동-자극 신호를 생성하기 위한 성분은 CAR에 포함된다. 다른 구현예에서, CAR은 공자극 신호를 생성하기 위한 성분을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 추가 CAR은 동일한 세포에서 발현되고 2차 또는 공자극 신호를 생성하기 위한 성분을 제공한다.
일부 구현예에서, 키메릭 항원 수용체는 T 세포 공자극 분자의 세포내 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, CAR은 CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 및 ICOS와 같은, 공자극 수용체의 신호 도메인 및/또는 막 관통 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 동일한 CAR은 활성화 및 보조자극 성분 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 키메릭 항원 수용체는 막 관통 도메인 및 세포내 신호 도메인 사이와 같은, T 세포 공자극 분자 또는 그의 기능적 변이체로부터 유래된 세포내 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, T 세포 공자극 분자는 CD28 또는 41BB이다.
일부 구현예에서, 활성화 도메인은 1개 CAR 내 포함되는 반면, 보조자극 성분은 다른 항원을 인식하는 다른 CAR에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, CAR은 동일한 세포상에서 모두 발현된 활성화 또는 자극 CAR, 동시자극 CAR을 포함한다(WO 2014/055668 참고). 일부 측면에서, 세포는 하나 이상의 자극 또는 활성화 CAR 및/또는 공자극 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 질환 또는 병태에와 관련 있는 및/또는 특이적인 것 이외의 항원을 인식하는 CAR과 같은, 억제성 CAR(iCARs, Fedorov 등, Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December, 2013) 참고)을 더 포함하고, 이로 인해, 질환-표적 CAR를 통해 전달되는 활성화 신호는 억제성 CAR이 그의 리간드에 결합함으로써, 예를 들어 오프-표적 효과를 감소시키기 위해, 감소되거나 억제된다.
특정 구현예에서, 세포내 신호 도메인은 CD3(예를 들어 CD3-제타) 세포내 도메인에 연결된 CD28 막 관통 및 신호 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 도메인은 CD3 제타 세포내 도메인에 연결된, 키메릭 CD28 및 CD137(4-1BB, TNFRSF9) 공동-자극 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 세포질 부분에서 1개 이상, 예를 들어 2개 이상, 공자극 도메인 및 활성화 도메인, 예를 들어 1차 활성화 도메인을 포함한다. 예시적인 CAR은 CD3-제타, CD28, 및 4-1BB의 세포내 성분을 포함한다
일부 구현예에서, 항원 수용체는 마커를 더 포함하고 및/또는 CAR 또는 다른 항원 수용체를 발현하는 세포는 세포 표면 마커와 같은, 대용 마커를 더 포함하며, 이는 수용체를 발현하기 위해 세포의 형질도입 또는 조작을 확인하는데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 마커는 그러한 세포 표면 수용체(예를 들어 tEGFR)의 절단된 버전과 같은, CD34, NGFR, 또는 표피 성장 인자 수용체의 전부 또는 일부(예를 들어 절단된 형태)를 포함한다. 일부 구현예에서, 마커를 암호화하는 핵산은 절단가능한 링커 서열, 예를 들어 T2A와 같은 링커 서열을 암호화하는 폴리 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어 마커 및 선택적인 링커 서열은 공개된 특허 출원 WO 2014031687에 개시된 바와 같은 것일 수 있다. 예를 들어 마커는 T2A 절단가능한 링커 서열과 같은, 링커 서열에 선택적으로 연결된, 절단된 EGFR(tEGFR)일 수 있다.
절단된 EGFR(예를 들어 tEGFR)에 대한 예시적인 폴리펩티드는 서열번호 7 또는 16에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열번호 7 또는 16과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 포함한다. 예시적인 T2A 링커 서열은 서열번호 6 또는 17에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열번호 6 또는 17과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 마커는 T 세포에서 자연적으로 발견되지 않거나 T 세포의 표면에서 자연적으로 발견되지 않는 분자, 예를 들어 세포 표면 단백질, 또는 그의 일부이다. 일부 구현예에서, 분자는 비-자기 분자, 예를 들어 비-자기 단백질, 즉, 세포가 입양될 숙주의 면역계에 의해 "자기"로 인식되지 않는 것이다.
일부 구현예에서, 마커는 치료 기능을 제공하지 않고 및/또는 유전적 조작을 위한, 예를 들어 성공적으로 조작된 세포를 선택하기 위한 마커로서 사용되는 것 외에 다른 효과를 생산하지 않는다. 다른 구현예에서, 마커는 치료적 분자 또는 입양 전달 및 리간드와의 접촉시 세포의 반응을 향상시키고 및/또는 약화시키기 위해 공자극 또는 면역 체크포인트 분자와 같은, 생체 내에서 세포가 마주치는 리간드와 같은, 일부 원하는 효과를 달리 나타내는 분자일 수 있다.
일부 경우에, CAR은 1세대, 2세대 및/또는 3세대 CAR을 가리킨다. 일부 측면에서, 1세대 CAR은 항원 결합시 CD3-사슬 유도된 신호만을 제공하는 것이고; 일부 측면에서, 2세대 CAR은 CD28 또는 CD137과 같은 공자극 수용체로부터의 세포내 신호 도메인을 포함하는 것과 같은, 신호 및 공자극 신호를 제공하는 것이며; 일부 측면에서, 3세대 CAR은 상이한 공자극 수용체의 다중 공자극 도메인을 포함하는 것이다.
예를 들어 일부 구현예에서, CAR은 항체, 예를 들어 항체 단편, CD28 또는 그의 기능적 변이체의 막 관통 부분이거나 이를 함유하는 막 관통 도메인, 및 CD28 또는 그의 기능적 변이체의 신호 부분 및 CD3 제타 또는 그의 기능적 변이체의 신호 부분을 포함하는 세포내 신호 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, CAR은 항체, 예를 들어 항체 단편, CD28 또는 그의 기능적 변이체의 막 관통 부분이거나 이를 함유하는 막 관통 도메인, 및 4-1BB 또는 그의 기능적 변이체의 신호 부분 및 CD3 제타 또는 그의 기능적 변이체의 신호 부분을 포함하는 세포내 신호 도메인을 함유한다. 일부 그러한 구현예에서, 수용체는 힌지-전용 스페이서와 같은, Ig 힌지, 예를 들어 IgG4 힌지와 같은, 인간 Ig 분자와 같은, Ig 분자의 일부를 함유하는 스페이서를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 막 관통 도메인은 서열번호 8로 제시되는 아미노산 서열의 서열 또는 서열번호 8과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 포함하는 막 관통 도메인과 같은, 인간 CD28(예를 들어 수탁번호 P01747.1) 또는 그의 변이체의 막 관통 도메인이거나 이를 포함하고; 일부 구현예에서, 재조합 수용체의 부분을 함유하는 막 관통-도메인은 서열번호 9로 제시되는 아미노산 서열의 서열 또는 그와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 세포내 신호 성분(들)은 네이티브 CD28 단백질의 위치 186-187에서 LL이 GG로 치환된 도메인과 같은, 인간 CD28의 세포내 공자극 신호 도메인 또는 또는 그의 기능적 변이체 또는 부분을 함유한다. 예를 들어 세포내 신호 도메인은 서열번호 10 또는 11로 제시되는 아미노산의 서열 또는 서열번호 10 또는 11과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 서열번호 12로 제시되는 아미노산의 서열 또는 서열번호 12와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열과 같은, 4-1BB(예를 들어 수탁번호 Q07011.1) 또는 그의 변이체의 세포내 공자극 신호 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 세포내 신호 도메인은 미국특허 번호 7,446,190 또는 미국특허 번호 8,911,993에 서술된 바와 같은 인간 CD3 ζ의 이소형 3의 112 AA 세포질 도메인(수탁 번호 P20963.2) 또는 CD3 제타 신호 도메인과 같은, 인간 CD 제타 자극 신호 도메인 또는 그의 기능적 변이체를 포함한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 세포내 신호 도메인은 서열번호 13, 14 또는 15로 제시되는 아미노산의 서열 또는 서열번호 13, 14 또는 15와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 스페이서는 서열번호 1에 제시된 힌지 전용 스페이서와 같은, IgG4 또는 IgG1의 힌지 전용과 같은, IgG의 힌지 영역만을 함유한다. 다른 구현예에서, 스페이서는 선택적으로 CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결된, Ig 힌지, 예를 들어 IgG4- 유래 힌지이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열번호 4에 제시된 바와 같은, CH2 및 CH3 도메인에 연결된, Ig 힌지, 예를 들어 IgG4 힌지이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열번호 3에 제시된 바와 같은, 오직 CH3 도메인에 연결된, Ig 힌지, 예를 들어 IgG4 힌지이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 글라이신-세린 리치 서열 또는 공지된 플렉서블 링커와 같은 다른 다른 플렉서블 링커이거나 이를 포함한다.
예를 들어 일부 구현예에서, CAR은 scFvs, 스페이서, 예를 들어 면역글로불린 분자의 일부를 함유하는 스페이서, 예를 들어 힌지 영역 및/또는 하나 이상의 중쇄 분자의 불변 영역, 예를 들어 Ig-힌지 함유 스페이서, CD28-유래 막 관통 도메인의 전부 또는 일부를 함유하는 막 관통 도메인, CD-28-유래 세포내 신호 도메인, 및 CD3 제타 신호도메인을 포함하는 항체 단편과 같은 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 scFv와 같은 항체 또는 단편, 임의의 Ig- 힌지 함유 스페이서와 같은 스페이서, CD28-유래 막 관통 도메인, 4-1BB-유래 세포내 신호 도메인, 및 CD3 제타-유래 신호 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 그러한 CAR 구조물을 암호화하는 핵산 분자는 T2A 리보솜 스킵 요소를 암호화하는 서열 및/또는 tEGFR 서열, 예를 들어 CAR을 암호화하는 서열의 다운스트림을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 서열은 서열번호 6 또는 17에 제시된 T2A 리보솜 스킵 요소, 또는 서열번호 6 또는 17과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 항원 수용체(예를 들어 CAR)를 발현하는 T 세포는 비-면역원성 선택 에피토프로서 (예를 들어 동일한 구조물로부터 2개 단백질을 발현하기 위한 T2A 리보솜 스위치에 의해 분리된 CAR 및 EGFRt을 암호화하는 구조의 도입에 의해) 절단된 EGFR(EGFRt)을 발현하기 위해 생성될 수 있고, 그런 다음 그러한 세포를 검출하기 위한 마커로서 사용될 수 있다(미국특허 번호 8,802,374 참고). 일부 구현예에서, 서열은 서열번호 7 또는 16에 제시된 tEGFR 서열, 또는 서열번호 7 또는 16과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 암호화한다. 일부 경우에, T2A와 같은 펩티드는 2A 요소의 C-말단에서 펩티드 결합의 스킵(리보솜 스킵) 합성을 위한 리보솜을 야기할 수 있고, 2A 서열의 말단 및 다음 펩티드 다운스트림 사이의 분리를 초래한다(예를 들어 de Felipe. Genetic Vaccines and Ther . 2:13 (2004) 및 deFelipe 등, Traffic 5:616-626 (2004) 참고). 많은 2A 요소가 공지되어 있다. 본원에 개시된 방법 및 핵산에 사용될 수 있는 2A 서열의 예시는 미국특허 공개번호 20070116690에 서술된 바와 같이, 수족구 바이러스(F2A, 예를 들어 서열번호 21), 말 비염 A 바이러스(E2A, 예를 들어 서열번호 20), 토시 아시그나 바이러스(Thosea asigna virus)(T2A, 예를 들어 서열번호 6 또는 17), 및 돼지 테스코바이러스-1(P2A, 예를 들어 서열번호 18 또는 19)로부터 2A 서열이나, 이에 한정되지 않는다.
대상체에 투여된 세포에 의해 발현되는, CAR과 같은, 재조합 수용체는 치료되는 질환 또는 병태 또는 그의 세포에 발현된, 연관된 및/또는 특이적인 분자를 일반적으로 인식하거나 특이적으로 결합한다. 분자, 예를 들어 항원에 특이적으로 결합할 때, 수용체는 ITAM-형질도입된 신호와 같은, 면역자극 신호를 세포 내로 전달하여 질환 또는 병태를 표적하는 면역 반응을 촉진시킨다. 예를 들어 일부 구현예에서, 세포는 질환 또는 병태의 세포 또는 조직에 의해 발현되거나 질환 또는 병태와 관련된 항원에 특이적으로 결합하는 CAR을 발현한다.
2. T 세포수용체(
TCR
)
일부 구현예에서, 제공된 방법, 용도, 제조품 또는 조성물과 관련하여 사용되는 조작된 세포, 예를 들어 CD57- T 세포(예를 들어 CD57- T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물)는 표적 폴리펩티드, 예를 들어 종양, 바이러스 또는 자가면역 단백질의 항원의 펩티드 에피토프 또는 T 세포 에피토프를 인식하는 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 항원-결합 부분을 발현하는 세포이다.
일부 구현예에서, 상기 제공된 방법, 용도, 제조 물품 또는 조성물과 관련하여 사용된 조작된 세포, 예를 들어 T 세포(예를 들어 CD27+ T 세포에 대해 농축된 조작된 T 세포 조성물)는 종양, 바이러스 또는 자가면역 단백질의 항원과 같은, 표적 폴리펩티드의 펩티드 에피토프 또는 T 세포 에피토프를 인식하는 T 세포수용체(TCR) 또는 그의 항원-결합 부분을 발현하는 T 세포와 같은, 조작된 세포이다.
일부 구현예에서, "T 세포수용체" 또는 "TCR"은 가변 α 및 β 사슬(각각, TCRα 및 TCRβ로 공지됨) 또는 가변 γ 및 δ 사슬(각각, TCRα 및 TCRβ로 공지됨), 또는 그의 항원-결합 부분을 함유하고, MHC 분자에 결합된 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 분자이다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ 형태로 있다. 전형적으로, αβ 및 γδ 형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만, 그들을 발현하는 T 세포는 별개 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR은 세포 표면 상에서 또는 가용성 형태로 발견될 수 있다. 일반적으로, TCR은 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 항원을 인식하는 것이 일반적인 T 세포(또는 T 림프구)의 표면에서 발견된다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "TCR"은 전체 TCR 뿐만 아니라 그의 항원-결합 부분 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ 형태 또는 γδ 형태에 있는 TCR을 포함하는, 온전한 또는 전장 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 전장 TCR 미만이지만 MHC-펩티드 복합체에 결합된 것과 같은, MHC 분자에 결합된 특정 펩티드에 결합된 항원-결합 부분이다. 일부 경우에, TCR의 항원-결합 부분 또는 단편은 전장 또는 온전한 TCR의 구조적 도메인의 일부만을 함유할 수 있지만, MHC-펩티드 복합체와 같은, 펩티드 에피토프에 결합하여 전체 TCR이 결합한다. 일부 경우에, 항원-결합 부분은 특정 MHC-펩티드 복합체에 결합하기 위한 결합 부위를 형성하기에 충분한, TCR의 가변 α 사슬 및 가변 β 사슬과 같은, TCR의 가변 도메인을 함유한다. 일반적으로, TCR의 가변 사슬은 펩티드, MHC 및/또는 MHC-펩티드 복합체의 인식에 관여하는 상보성 결정 영역을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR의 가변 도메인은 초가변 루프, 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유하고, 이는 일반적으로 항원 인식 및 결합 능력 및 특이성에 대한 주요 기여자이다. 일부 구현예에서, TCR의 CDR 또는 그의 조합은 주어진 TCR 분자의 항원-결합 부위의 모두 또는 실질적으로 모두를 형성한다. TCR 사슬의 가변 도메인 내에 다양한 CDR은 일반적으로 프레임 워크 영역(FR)에 의해 분리되고, 이는 일반적으로 CDR과 비교하여 TCR 분자 사이에서 덜 가변성을 나타낸다(예를 들어 Jores 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia 등, EMBO J. 7:3745, 1988; see also Lefranc 등, Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003 참고). 일부 구현예에서, CDR3은 항원 결합 또는 특이성을 담당하는 주요 CDR이거나, 항원 인식, 및/또는 펩티드-MHC 복합체의 가공된 펩티드 부분과의 상호 작용을 위해 주어진 TCR 가변 도메인 상에 3개 CDR 중에서 가장 중요하다. 일부 상황에서, 알파 사슬의 CDR1은 특정 항원성 펩티드의 N-말단 부분과 상호 작용할 수 있다. 일부 상황에서, 베타 사슬의 CDR1은 펩티드의 C-말단 부분과 상호 작용할 수 있다. 일부 상황에서, CDR2는 MHC-펩티드 복합체의 MHC 부분과의 상호 작용 또는 인식에 가장 크게 기여하거나 이를 담당하는 1차 CDR이다. 일부 구현예에서, β-사슬의 가변 도메인은 추가적인 초가변 도메인(CDR4 또는 HVR4)을 함유할 수 있고, 이는 일반적으로 항원 인식이 아닌 초항원 결합에 관여한다(Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426).
일부 구현예에서, 또한, TCR은 불변 도메인, 막 관통 도메인 및/또는 짧은 세포질 테일을 함유할 수 있다(예를 들어 Janeway 등, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997 참고). 일부 측면에서, TCR의 각 사슬은 1개 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 1개 면역글로불린 불변 도메인, 막 관통 영역, 및 C-말단에서 짧은 세포질 테일을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 신호 전달의 매개에 관여하는 CD3 복합체의 불변 단백질과 관련된다.
일부 구현예에서, TCR 사슬은 하나 이상의 불변 도메인을 포함한다. 예를 들어 주어진 TCR 사슬의 세포외 부분(예를 들어 α-사슬 또는 β-사슬)은 세포 막에 인접한 가변 도메인(예를 들어 Vα 또는 Vβ; 전형적으로 카뱃 넘버링[문헌 「"Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.」 참조]에 기반한 아미노산 1 내지 116) 및 불변 도메인(예를 들어 α-사슬 불변 도메인 또는 Cα, 전형적으로 카뱃 넘버링에 기반한 사슬의 위치 117 내지 259 또는 Cβ, 전형적으로 카뱃에 기반한 사슬의 위치 117 내지 295)과 같은, 2개 면역글로불린-유사 도메인을 함유할 수 있다. 예를 들어 일부 경우에, 2개 사슬에 의해 형성된 TCR의 세포외 부분은 2개 막-근위 불변 도메인, 및 2개 막-원위 가변 도메인을 함유하고, 가변 도메인은 CDR을 각각 함유한다. TCR의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하는 데에서 짧은 연결 서열을 함유할 수 있고, 이에 따라 TCR의 2개 사슬을 연결한다. 일부 구현예에서, TCR은 각각의 α 및 β 사슬에서 추가 시스테인 잔기를 가질 수 있어, TCR은 불변 도메인에서 2 개 이황화 결합을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR 사슬은 막 관통 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 막 관통 도메인은 양으로 하전된다. 일부 경우에, TCR 사슬은 세포질 테일을 함유한다. 일부 경우에, 구조는 TCR이 CD3 및 그의 서브유닛과 같은 다른 분자와 결합되도록 한다. 예를 들어 막 관통 영역을 갖는 불변 도메인을 함유하는 TCR은 세포 막에서 단백질을 고정시키고 CD3 신호 장치 또는 복합체의 불변 서브유닛과 결합될 수 있다. CD3 신호 서브유닛(예를 들어 CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ζ 사슬)의 세포내 테일은 TCR 복합체의 신호 능력을 수반하는 하나 이상의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR은 2개 사슬 α 및 β(또는 선택적으로 γ 및 δ)의 헤테로다이머일 수 있거나 단일 사슬 TCR 구조일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 이황화 결합 또는 이황화 결합들에 의한 것과 같이, 연결된 2개 별도 사슬(α 및 β 사슬 또는 γ 및 δ 사슬)을 함유하는 헤테로다이머이다.
일부 구현예에서, TCR은 Vα,β 사슬의 서열과 같은, 공지된 TCR 서열(들)로부터 생성될 수 있고, 이는 실질적으로 전장 코딩 서열이 쉽게 이용가능하다. 세포 공급원으로부터, V 사슬 서열을 포함하는, 전장 TCR 서열을 획득하기 위한 방법은 잘 알려져 있다. 일부 구현예에서, TCR을 암호화하는 핵산은 주어진 세포 내 또는 이로부터 분리된 TCR-코딩 핵산의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, 또는 공개적으로 이용가능한 TCR DNA 서열의 합성과 같은, 다양한 공급원으로부터 획득될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR은 예를 들어 T 세포(예를 들어 세포독성 T 세포), T-세포 하이 브리도마 또는 다른 공개적으로 이용가능한 공급원과 같은, 생물학적 공급원으로부터 획득된다. 일부 구현예에서, T-세포는 생체 내(in vivo) 분리된 세포로부터 획득될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 티미칼리(thymically) 선택된 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 네오에피토프-제한 TCR이다. 일부 구현예에서, T-세포는 배양된 T-세포 하이브리도마 또는 클론일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 또는 그의 항원-결합 부분 또는 이의 항원-결합 단편은 TCR의 서열에 대한 지식으로부터 합성적으로 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR은 표적 폴리펩티드 항원, 또는 그의 표적 T 세포 에피토프에 대한 후보 TCR의 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인되거나 선택된 TCR로부터 생성된다. TCR 라이브러리는 PBMC, 비장 또는 다른 림프 기관에 존재하는 세포를 포함하여, 대상체로부터 분리된 T 세포로부터 Vα 및 Vβ의 레퍼토리의 증폭에 의해 생성될 수 있다. 일부 경우에, T 세포는 종양-침윤 림프구 (TIL)로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 라이브러리는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포로부터 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 건강한 대상체의 정상, 즉, 정상 TCR 라이브러리의 T 세포 공급원으로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, 일부 구현예에서, TCR은 질환에 걸린 대상체, 즉, 질환에 걸린 TCR 라이브러리의 T 세포 공급원으로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, 변성 프라이머는 인간으로부터 획득된, T 세포와 같은, 샘플 내 RT-PCR에 의한 것과 같은, Vα 및 Vβ의 유전자 레퍼토리를 증폭시키는데 사용된다. 일부 구현예에서, scTv 라이브러리는 증폭된 생성물이 링커에 의해 분리되도록 클로닝되거나 조립되는 나이브 Vα 및 Vβ 라이브러리로부터 조립될 수 있다. 대상체 및 세포의 공급원에 따라, 라이브러리는 HLA 대립유전자-특이적일 수있다. 대안적으로, 일부 구현예에서, TCR 라이브러리는 모(parent) 또는 스캐폴드 TCR 분자의 돌연변이유발 또는 다양화에 의해 생성될 수 있다. 일부 측면에서, TCR은 예를 들어 α 또는 β 사슬의 돌연변이유발에 의한 것과 같은, 지시된 진화에 적용된다. 일부 측면에서, TCR의 CDR 내의 특정 잔기는 변경된다. 일부 구현예에서, 선택된 TCR은 친화도 성숙에 의해 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원-특이적 T 세포는 펩티드에 대한 CTL 활성을 평가하기 위해 스크리닝함으로써와 같이, 선택될 수 있다. 일부 측면에서, TCR, 예를 들어 항원-특이적 T 세포 상에 존재하는 것은 결합 활성, 예를 들어 항원에 대한 특정 친화도 및 결합활성에 의한 것과 같이, 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR 또는 그의 항원-결합 부분은 변형 또는 조작된 것이다. 일부 구현예에서, 유도 진화 방법은 특정 MHC-펩티드 복합체에 대한 보다 높은 친화도를 가진 것과 같은, 변경된 특성을 가진 TCR을 생성하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 유도 진화는 효모 디스플레이(Holler 등, (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler 등, (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92), 파지 디스플레이(Li 등, (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54), 또는 T 세포 디스플레이(Chervin 등, (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84)를 포함하는 디스플레이 방법에 의해 획득되나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 디스플레이 접근은 공지된, 모(parent) 또는 기준 TCR을 엔지니어링 또는 변형하는 것을 포함한다. 예를 들어 일부 경우에, 야생형 TCR은 CDR의 하나 이상의 잔기가 돌연변이되는 돌연변이유도된 TCR을 생성하기 위한 주형으로서 사용될 수 있고, 원하는 표적 항원에 대한 보다 높은 친화도를 가지는 것과 같은, 원하는 변경된 물성을 가진 돌연변이체는 선택된다.
일부 구현예에서, 관심있는 TCR을 생산 또는 생성하는데 사용하기 위한 표적 폴리펩티드의 펩티드는 공지되어 있거나 쉽게 확인될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 또는 항원-결합 부분을 생성하는데 사용하기에 적합한 펩티드는 하기 서술된 표적 폴리펩티드와 같은, 관심있는 표적 폴리펩티드에서 HLA- 제한 모티프의 존재에 기초하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드는 이용가능한 컴퓨터 예측 모델을 사용하여 확인된다. 일부 구현예에서, MHC 부류 I 결합 부위를 예측하기 위해, 그러한 모델은 ProPred1(Singh and Raghava(2001) Bioinformatics 17(12):1236-1237), 및 SYFPEITHI(Schuler 등, (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007 참고)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, MHC-제한 에피토프는 HLA-A0201이고, 이는 모든 백인의 약 39-46%로 표현되므로, 적합한 TCR 또는 다른 MHC- 펩티드 결합 분자를 제조하는데 사용하기 위한 MHC 항원의 적절한 선택을 나타낸다.
컴퓨터 예측 모델을 사용하여 프로테아좀 및 면역-프로테아좀에 대한 HLA-A0201- 결합 모티프 및 절단 부위가 공지되어 있다. MHC 부류 I 결합 부위를 예측하기 위해, 그러한 모델은 ProPred1(Singh and Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237 2001에 보다 상세하게 서술됨), 및 SYFPEITHI(Schuler 등, SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-93 2007 참고)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, TCR 또는 그의 항원 결합 부분은 결합 특성과 같은, 하나 이상의 특성이 변경된 재조합으로 생성된 천연 단백질 또는 그의 돌연변이된 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 인간, 마우스, 래트, 또는 다른 포유동물과 같은, 다양한 동물 종으로부터 유래될 수 있다. TCR은 세포-결합 또는 가용성 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법의 목적을 위해, TCR은 세포의 표면 상에 발현된 세포-결합 형태이다.
일부 구현예에서, TCR은 전장 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 항원-결합 부분이다. 일부 구현예에서, TCR은 다이머 TCR(dTCR)이다. 일부 구현예에서, TCR은 단일-사슬 TCR(sc-TCR)이다. 일부 구현예에서, dTCR 또는 scTCR은 WO 03/020763, WO 04/033685, WO2011/044186에 서술된 바와 같은 바와 같은 구조를 가진다.
일부 구현예에서, TCR은 막 관통 서열에 상응하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR은 세포질 서열에 상응하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR은 CD3과 함께 TCR 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, dTCR 또는 scTCR을 포함하는, 임의의 TCR은 T 세포의 표면 상에 활성 TCR을 산출하는 신호 도메인에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 세포의 표면 상에 발현된다.
일부 구현예에서, dTCR은 TCR α 사슬 가변 도메인 서열에 상응하는 서열이 TCR α 사슬 불변 도메인 세포외 서열에 상응하는 서열의 N 말단에 융합된 제 1 폴리펩티드, 및 TCR β 사슬 가변 도메인 서열에 상응하는 서열이 TCR β 사슬 불변 도메인 세포외 서열에 상응하는 서열의 융합된 제 2 폴리펩티드를 함유하고, 제 1 및 제 2 폴리펩티드는 이황화 결합에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 결합은 자연 다이머 αβ TCR에 존재하는 자연 사슬간 이황화 결합에 상응할 수 있다. 일부 구현예에서, 사슬간 이황화 결합은 천연 TCR에 존재하지 않는다. 예를 들어 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스테인은 dTCR 폴리펩티드 쌍의 불변 도메인 세포외 서열 내로 혼입될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비-천연 이황화 결합 모두 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 막에 고정하기 위한 막 관통 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, dTCR은 가변 α 도메인, 불변 α 도메인 및 불변 α 도메인의 C- 말단에 부착된 제 1 다이머화 모티프를 함유하는 TCR α 사슬, 및 가변 β 도메인, 불변 β 도메인 및 불변 β 도메인의 C- 말단에 부착된 제 1 다이머화 모티프를 포함하는 TCR β 사슬을 함유하고, 상기 제 1 및 제 2 다이머화 모티프는 쉽게 상호 작용하여 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬을 함께 연결하는 제 1 다이머화 모티프에서 아미노산 및 제 2 다이머화 모티프에서 아미노산 사이 공유 결합을 형성한다.
일부 구현에서, TCR은 scTCR이다. 전형적으로, scTCR은 공지된 방법을 사용하여 생성된다(예를 들어 Soo Hoo, W. F. 등, PNAS (USA) 89, 4759 (1992); Wulfing, C. and Pluckthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994); Kurucz, I. 등, PNAS (USA) 90 3830 (1993); International published PCT Nos. WO 96/13593, WO 96/18105, WO99/60120, WO99/18129, WO 03/020763, WO2011/044186; 및 Schlueter, C. J. 등, J. Mol. Biol. 256, 859 (1996) 참고). 일부 구현예에서, scTCR은 TCR 사슬의 결합을 용이하게 하기 위해 도입된 비-천연 이황화 사슬간 결합을 함유한다(예를 들어 국제공개 PCT 번호 WO 03/020763 참고). 일부 구현예에서, scTCR은 그의 C-말단에 융합된 이종 류신 지퍼가 사슬 결합을 용이하게 하는 비-이황화 연결된 절단 TCR이다(예를 들어 국제공개 PCT 번호 WO 99/60120 참고). 일부 구현예에서, scTCR은 펩티드 링커를 통해 TCRβ 가변 도메인에 공유 결합된 TCRα 가변 도메인을 함유한다(예를 들어 국제공개 PCT 번호 WO 99/18129 참고).
일부 구현예에서, scTCR은 TCR α 사슬 가변 도메인에 상응하는 아미노산 서열로 구성된 제 1 세그먼트, TCR β 사슬 불변 도메인 세포외 서열에 상응하는 아미노산 서열의 N 말단에 융합된 TCR β 사슬 가변 도메인 서열에 상응하는 아미노산 서열로 구성된 제 2 세그먼트, 및 제 1 세그먼트의 C 말단을 제 2 세그먼트의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, scTCR은 α 사슬 세포외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 α 사슬 변이 영역 서열로 구성된 제 1 세그먼트, 및 서열 β 사슬 세포외 불변 및 막 관통 서열에 융합된 β 사슬 가변 도메인 서열로 구성된 제 2 세그먼트, 및, 선택적으로, 제 1 세그먼트의 C 말단을 제 2 세그먼트의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, scTCR은 β 사슬 세포외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 TCR β 사슬 변이 영역 서열로 구성된 제 1 세그먼트, 및 서열 α 사슬 세포외 불변 및 막 관통 서열에 융합된 α 사슬 가변 도메인 서열로 구성된 제 2 세그먼트, 및, 선택적으로, 제 1 세그먼트의 C 말단을 제 2 세그먼트의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 TCR 세그먼트를 연결하는 scTCR의 링커는 TCR 결합 특이성을 유지하면서 단일 폴리펩티드 가닥을 형성할 수 있는 임의의 링커일 수있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 링커 서열은 식 -P-AA-P-를 가질 수 있고, P는 프롤린이고 AA는 아미노산이 글라이신 및 세린인 아미노산 서열을 나타낸다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 세그먼트는 그의 가변 도메인 서열이 그러한 결합을 위해 배향되도록 쌍을 이룬다. 따라서, 일부 경우에, 링커는 제 1 세그먼트의 C 말단 및 제 2 세그먼트의 N 말단 사이 거리에 걸쳐서 충분한 길이를 갖거나, 반대로, 표적 리간드에 대한 scTCR의 결합을 차단하거나 감소시키기에는 너무 길지 않다. 일부 구현예에서, 링커는 10 내지 45개의 아미노산, 예를 들어 10 내지 30개의 아미노산 또는 26 내지 41개의 아미노산 잔기, 예를 들어 29, 30, 31 또는 32개의 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 식 -PGGG-(SGGGG)5-P-를 가지고, P는 프롤린이고, G는 글라이신이고, S는 세린이다(서열번호 22). 일부 구현예에서, 링커는 서열 GSADDAKKDAAKKDGKS를 가진다(서열번호 23).
일부 구현예에서, scTCR은 α 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기를 β 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기에 연결하는 공유 이황화 결합을 함유한다. 일부 구현예에서, 천연 TCR에서 사슬간 이황화 결합은 존재하지 않는다. 예를 들어 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스테인은 scTCR 폴리펩티드의 제 1 및 제 2 세그먼트의 불변 도메인 세포외 서열에 통합될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비-천연 이황화 결합 모두는 바람직할 수 있다.
도입된 사슬간 이황화 결합을 함유하는 dTCR 또는 scTCR의 일부 구현예에서, 천연 이황화 결합은 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 천연 사슬간 이황화 결합을 형성하는 하나 이상의 천연 시스테인은 세린 또는 알라닌과 같은 다른 잔기로 치환된다. 일부 구현예에서, 도입된 이황화 결합은 제 1 및 제 2 세그먼트 상에 비- 시스테인 잔기를 시스테인으로 돌연변이시킴으로써 형성될 수 있다. TCR의 예시적인 비-천연 이황화 결합은 공개된 국제 PCT 번호 WO2006/000830에서 서술된다.
일부 구현예에서, TCR 또는 그의 항원-결합 단편은 10-5 및 10-12M 사이 또는 약 10-5 및 10-12M 사이 및 그안에 모든 개별적인 값 및 범위의 표적 항원을 위한 평형 결합 상수를 가진 친화도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 MHC-펩티드 복합체 또는 리간드이다.
일부 구현예에서, α 및 β 사슬과 같은, TCR을 암호화하는 핵산 또는 핵산들은 PCR, 클로닝 또는 다른 적절한 수단에 의해 증폭될 수 있고, 적합한 발현 벡터 또는 벡터들로 클로닝될 수 있다. 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있고, 임의의 적합한 숙주를 형질전환 또는 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 증식 및 증폭 또는 발현을 위해 설계된 것들 또는 플라스미드 및 바이러스와 같은, 둘다를 포함한다.
일부 구현예에서, 벡터는 pUC series(Fermentas Life Sciences), pBluescript series(Stratagene, LaJolla, Calif.), pET series(Novagen, Madison, Wis.), pGEX series(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), 또는 pEX series(Clontech, Palo Alto, Calif.)의 벡터일 수 있다. 일부 경우에, 또한, λG10, λGT11, λZapII(Stratagene), λEMBL4, 및 λNM1149와 같은, 박테리오파지 벡터는 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 식물 발현 벡터는 pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19(Clontech)를 사용하고 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 동물 발현 벡터는 pEUK-Cl, pMAM 및 pMAMneo(Clontech)를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터와 같은 것들이 사용된다.
일부 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈과 같은, 조절 서열을 함유할 수 있고, 이는 벡터가 DNA- 또는 RNA- 기반인지를 고려하여 적절한 바와 같이, 벡터가 도입되기 위한 숙주의 유형(예를 들어 박테리아, 곰팡이, 식물, 또는 동물)에 특이적이다. 일부 구현예에서, 벡터는 TCR 또는 항원-결합 부분(또는 다른 MHC- 펩티드 결합 분자)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 비천연 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 비-바이러스 프로모터 또는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터, 및 뮤린 줄기 세포 바이러스의 장기 반복에서 발견되는 프로모터와 같은 바이러스 프로모터일 수 있다. 또한, 다른 공지된 프로모터도 고려된다.
일부 구현예에서, TCR을 암호화하는 벡터를 생성하기 위해, α 및 β 사슬은 관심있는 TCR을 발현하는 T 세포 클론으로부터 분리되고 발현 벡터로 클로닝된 총 cDNA로부터 PCR 증폭된다. 일부 구현예에서, α 및 β 사슬은 동일한 벡터 내로 클로닝된다. 일부 구현예에서, α 및 β 사슬은 상이한 벡터 내로 클로닝된다. 일부 구현예에서, 생성된 α 및 β 사슬은 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스 벡터 내로 통합된다.
일부 구현예에서, 상기 제공된 방법은 재조합 항원 수용체를 발현하는 세포를 질환 또는 병태를 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 항원 수용체를 발현하는 세포는 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다. 유전자 조작된 성분들, 예를 들어 재조합 수용체, 예를 들어 CAR 또는 TCR의 다양한 도입 방법은 익히 공지되어 있으며 상기 제공된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 예시적인 방법은 바이러스, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스, 형질도입, 전이인자(transposon) 및 전기 천공(electroporation)을 통한 수용체를 암호화하는 핵산의 전달 방법을 포함한다.
상기 수용체를 발현하고 상기 제공된 방법에 의해서 투여된 세포 중에는 조작된 세포가 있다. 상기 유전자 조작은 일반적으로 예를 들어 레트로바이러스 형질도입, 형질감염, 또는 형질전환에 의해서 상기 재조합물 또는 조작된 성분을 상기 세포를 함유하는 조성물로 암호화하는 핵산의 도입을 포함한다.
3.
키메라
자가-항체수용체(
CAAR
)
일부 구현예에서, 상기 제공된 방법, 용도, 제조 제품 및 조성물과 관련하여 사용된 조작된 세포에 의해서 발현된 재조합 수용체 중에는 키메라 자가항체 수용체(CAAR)가 있다. 일부 구현예에서, CAAR은 자가항체에 특이적다. 일부 구현예에서, CAAR를 발현하는 세포, 예를 들어 CARR을 발현하도록 조작된 T 세포는 자가항체-발현 세포에 특이적으로 결합하고 이를 죽이는 데 사용될 수 있지만, 정상 항체 발현 세포에는 그러하지 아니하다. 일부 구현예에서, CAAR-발현 세포는 자가면역 질환과 같은 자기-항원의 발현과 관련된 자가면역 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, CAAR-발현 세포는 궁극적으로 자가항체를 생산하고 그의 세포 표면 상에 자가항체를 표시하는 B 세포를 표적화할 수 있고, 이들 B 세포를 치료적 중재를 위한 질환-특이적 표적으로 표시할 수 있다. 일부 구현예에서, CAAR-발현 세포는 항원-특이적 키메라 자가항체 수용체를 사용하여 질환-유발 B 세포를 표적화함으로써 자가면역 질환에서 병원성 B 세포를 효율적으로 표적화하고 사멸시키는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 CAAR, 예를 들어 미국특허출원공보 제 2017/0051035호에 개시된 임의의 수용체이다.
일부 구현예에서, CAAR은 자가항체 결합 도메인, 막 관통 도메인, 및 세포내 신호 전달 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역은 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역은 1차 신호 전달 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호 전달 도메인, T 세포수용체(TCR) 요소의 신호 전달 도메인 및/또는 면역 수용체 티로신-계 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 신호 전달 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포내 신호 전달 영역은 2차 또는 공자극 신호 전달 영역(2차 세포내 신호 전달 영역)을 포함한다.
일부 구현예에서, 자가항체 결합 도메인은 자가항원 또는 그의 단편을 포함한다. 자가항원의 선택은 표적화 될 자가항체의 유형에 달려 있다. 예를 들어 자가항원은, 그것이 특정 질환 상태, 예를 들어 자기면역 질환, 예를 들어 자가항체-매개 자가면역 질환과 관련된, B 세포와 같은 표적 세포상의 자가항체를 인식하기 때문에 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 자가면역 질환은 심상성 천포창(pemphigus vulgaris, PV)을 포함한다. 예시적인 자가항원은 데스모글레인 1(Dsg1) 및 Dsg3을 포함한다.
4. 다중
표적화
일부 구현예에서, 상기 제공된 방법, 용도, 제조 제품 및 조성물과 관련하여 사용된 세포는 상기 세포 상에 2개 이상의 유전자 조작된 수용체의 발현과 같은 다중 표적화 전략을 포함하며, 각각 상이한 항원의 동일함을 인식하고 전형적으로 각각 상이한 세포내 신호 전달 성분을 포함한다. 그러한 다중 표적화 전략은 예를 들어 국제공개공보 제WO2014/055668 A1호(예를 들어 정상 세포와 같이 표적 상에 개별적으로 존재하지만 치료하고자 하는 질환 또는 병태의 세포에서만 함께 존재하는 두 개의 상이한 항원을 표적으로 하는 활성화 및 공자극 CAR의 조합을 기술함) 및 문헌 「Fedorov 등, Sci . Transl . Medicine, 5(215) (2013)」[활성화 CAR 및 억제 CAR을 발현하는 세포, 예를 들어 활성화 CAR이 정상 또는 비병출성 세포 모두에서 발현되는 하나의 항원 및 치료 대상의 질환 또는 병태의 세포에 결합하고, 억제성 CAR이 정상 세포 또는 치료를 원하지 않는 세포에서만 발현되는 다른 항원에 결합하는 것을 기술함]에 기술되어 있다.
예를 들어 일부 구현예에서, 세포는 일반적으로 제 1 수용체, 예를 들어 제 1 항원에 의해 인식되는 항원에 대한 특이적 결합시 세포에 활성화하거나 또는 자극하는 신호를 유도할 수 있는 제 1 유전자 조작된 항원 수용체(예를 들어 CAR 또는 TCR)을 발현하는 수용체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 일반적으로 제 2 수용체에 의해 인식되는 제 2 항원에 특이적으로 결합시 면역 세포에 공자극 신호를 유도할 수 있는 제 2 유전자 조작 항원 수용체(예를 들어 CAR 또는 TCR), 예를 들어 키메라 공자극 수용체를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 항원 및 제 2 항원은 동일하다. 일부 구현예에서, 제 1항원 및 제 2 항원은 상이하다.
일부 구현예에서, 제 1 및/또는 제 2 유전자 조작된 항원 수용체(예를 들어 CAR 또는 TCR)은 세포에 활성화 신호를 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체는 ITAM 또는 ITAM-유사 모티프를 함유하는 세포내 신호 전달 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 수용체에 의해 유도된 활성화는 신호 전달 또는 ITAM 인 산화 및/또는 ITAM 매개 신호 전달 캐스케이드의 개시와 같은 면역 반응의 개시를 초래하는 세포에서의 단백질 발현의 변화(예 : CD4 또는 CD8 등), NF-κB 및/또는 AP-1과 같은 하나 이상의 전사 인자의 활성화, 및/또는 NF-κB 및/또는 AP-1과 같은 유전자 발현의 유도 사이토카인, 증식 및/또는 생존과 같은 인자를 포함한다.
일부 구현예에서, 제 1 및/또는 제 2 수용체는 CD28, CD137(4-1BB), OX40 및/또는 ICOS와 같은 공자극 수용체의 세포내 신호 전달 도메인 또는 영역을 함유한다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 수용체는 상이한 공자극 수용체의 세포내 신호 전달 도메인을 함유한다. 하나의 구현예에서, 제 1 수용체는 CD28 공자극 신호 전달 영역을 포함하고, 제 2 수용체는 4-1BB 보조-자극 신호 전달 영역을 함유하거나 그 역도 마찬가지이다.
일부 구현예에서, 제 1 및/또는 제 2 수용체는 ITAM 또는 ITAM-유사 모티프를 포함하는 세포내 신호 전달 도메인 및 공자극 수용체의 세포내 신호 전달 도메인을 모두 함유한다.
일부 구현예에서, 제 1 수용체는 TAM 또는 ITAM-유사 모티프를 함유하는 세포내 신호 전달 도메인을 함유하고, 제 2 수용체는 공자극 수용체의 세포내 신호 전달 도메인을 함유한다. 동일한 세포에서 유도된 활성화 신호와 조합된 공자극 신호는 증가된 유전자 발현, 사이토카인 및 다른 인자의 분비 및 세포 사멸과 같은 T 세포 매개된 이펙터와 같은 견고하고 지속적인 면역 반응과 같은 면역 반응을 유발하는 신호이다.
일부 구현예에서, 제 1 수용체만의 결찰 또는 제 2 수용체만의 결찰은 어느 것도 강력한 면역 반응을 유도하지 않는다. 일부 양상에서, 단지 하나의 수용체가 결찰되다면, 세포는 항원에 대해 내성을 갖거나 비반응성이거나, 또는 억제되고/되거나 인자를 증식시키거나 분비하도록 유도되거나 작용기 기능을 수행하지 않는다. 그러나, 일부 이러한 구현예에서, 제 1 및 제 2 항원을 발현하는 세포의 만남과 같이 다수의 수용체가 결찰되었을 때, 예를 들어 하나 이상의 사이토카인의 분비, 증식, 지속성에 의해 지시되는 바와 같이, 및/또는 표적 세포의 세포 독성 사멸과 같은 면역 이펙터 기능을 수행하는 것과 같은, 완전한 면역 활성화 또는 자극과 같은 원하는 반응이 달성된다.
일부 구현예에서, 2개의 수용체는 세포에 대한 활성화 및 억제 신호를 각각 유도하여 수용체 중 하나에 의한 그의 항원에의 결합이 세포를 활성화시키거나 반응을 유도하지만 제 2 억제 수용체에 의한 결합 이 항원에 대한 신호는 그 반응을 억제하거나 약화시키는 신호를 유도한다. 예를 들어 활성화 CAR과 억제 CAR 또는 iCAR의 조합이다. 이러한 전략은 예를 들어 활성화 CAR이 질환 또는 병태에서 발현되는 항원에 결합 하나 정상 세포에서도 발현되며, 억제 수용체는 정상 세포에서 발현되는 별도의 항원에 결합하지만 질환이나 병태가 있는 세포가 아니다.
일부 구현예에서, 다중 표적화 전략은 특정 질환 또는 병태와 관련된 항원이 비 병사성 세포(non-diseased cell)에서 발현되고/되거나 일시적(예를 들어 유전자 조작과 관련된 자극시)으로 또는 영구적으로 조작된 세포 자체에서 발현되는 경우에 사용된다. 이러한 경우, 2개의 분리된 개별적 항원 수용체의 연결을 요구함으로써, 특이성, 선택성 및/또는 효능이 개선될 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 항원, 예를 들어 제 1항원 또는 제 2항원은 암세포에서와 같이 표적화 되는 세포, 조직 또는 질환 또는 병태 상에 발현된다. 한 양상에서, 세포, 조직, 질환 또는 질환 상태는 다발성 골수종 또는 다발성 골수종 세포이다. 일부 구현예에서, 복수의 항원 중 하나 이상은 일반적으로 정상 또는 비병사성 세포 또는 조직 및/또는 조작된 세포 자체와 같은 세포 치료법으로 표적화하는 것이 바람직하지 않은 세포에서 또한 발현된다. 이러한 구현예에서, 세포의 반응을 달성하기 위해 다중 수용체의 연결을 요구함으로써, 특이성 및/또는 효능이 달성된다.
B. 핵산,
백터
및 유전자 조작방법
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 농축된 CD57- T 세포의 집단(예를 들어 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단)의 세포는 재조합 수용체를 발현하도록 유전자 조작된다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 농축된 CD27+ T 세포의 집단(예를 들어 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단)의 세포는 재조합 수용체를 발현하도록 유전자 조작된다. 일부 구현예에서, 상기 조작은 재조합 수용체를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 수행된다. 또한 재조합 수용체 또는 그의 부분들 또는 성분들을 암호화하는 뉴클레오티드, 및 상기 핵산 및/또는 뉴클레오티드를 함유하는 벡터 또는 구조체(construct)가 제공된다.
일부 경우에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열은 신호 펩티드를 암호화하는 신호 서열을 함유한다. 일부 구체예에서, 신호 서열은 천연 폴리펩티드로부터 유래된 신호 펩티드를 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 조절 서열, 예를 들어 폴리뉴클레오티드가 도입될 숙주 유형(예를 들어 세균, 곰팡이, 식물 또는 동물)에 특이적인 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을, 폴리뉴클레오티드가 DNA 기반 또는 RNA 기반인지 고려하여 적절한 것으로 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 조절/제어 요소, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작 컨센선스(Kozak consensus) 서열, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 2A 서열 및 스플라이스 수용체 또는 공여자를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는, 재조합 수용체 및/또는 하나 이상의 추가 폴리펩티드(들)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 비천연 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 RNA pol I, pol Ⅱ 또는 pol Ⅲ 프로모터 중으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 RNA 폴리머라제 Ⅱ(예를 들어 CMV, SV40 초기 영역 또는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터)에 의해 인식된다. 다른 구현예에서, 프로모터는 RNA 폴리머라제 Ⅲ(예를 들어 U6 또는 H1 프로모터)에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 비바이러스 프로모터 또는 바이러스 프로모터, 예를 들어 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터 및 뮤린 줄기 세포 바이러스의 긴 말단 반복에서 발견되는 프로모터일 수 있다. 다른 공지된 프로모터도 고려된다.
일부 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이거나 이를 포함한다. 예시적인 구성적 프로모터는 시미안 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), 사이토메갈로바이러스 초기 직후 프로모터(CMV), 인간 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 인간 신장 인자 1α 프로모터(EF1α), 마우스 포스포글리세레이트 키나제 1 프로모터(PGK) 및 CMV 초기 인핸서와 결합된 닭 β-액틴 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 구성적 프로모터는 합성 또는 변경된 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 MND 프로모터, 골수 증식 육종 바이러스 인핸서를 갖는 변형된 MoMuLV LTR의 U3 영역을 함유하는 합성 프로모터이거나 이를 포함한다[문헌 「Challita 등, (1995) J. Virol. 69(2):748-755」 참조]. 일부 구현예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 바이러스 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 비-바이러스 프로모터이다. 일부 구현예에서, 예시적인 프로모터는, 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터 또는 이의 변형된 형태 또는 MND 프로모터를 포함할 수 있으나 이에 국한되지 않는다.
다른 구현예에서, 프로모터는 조절 프로모터(예를 들어 유도 가능 프로모터)이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 유도 가능 프로모터 또는 억제 가능 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 Lac 오퍼레이터 서열, 테트라사이클린 오퍼레이터 서열, 갈락토오스 오퍼레이터 서열 또는 독시사이클린 오퍼레이터 서열을 포함하거나 또는 이의 유사체이거나 Lac 억제제 또는 테트라사이클린 억제제 또는 이의 유사체를 인식하거나 이와 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 조절 요소, 예를 들어 프로모터를 포함하지 않는다.
일부 경우에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열은 신호 펩티드를 암호화하는 신호 서열을 함유한다. 일부 측면에서, 신호 서열은 천연 폴리펩티드로부터 유도된 신호 펩티드를 암호화할 수 있다. 다른 측면에서, 신호 서열은 서열번호 24에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되고 서열번호 25에 제시된 GMCSFR 알파 사슬의 예시적인 신호 펩티드와 같은 이종 또는 비-고유 신호 펩티드를 암호화할 수 있다. 일부 경우에, 재조합 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산 서열은 신호 펩티드를 암호화하는 신호 서열을 함유한다. 비제한적 예시적 신호 펩티드는, 예를 들어 서열번호 25에 제시되고 서열번호 24에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 GMCSFR 알파 사슬 신호 펩티드, 또는 서열번호 26에 제시된 CD8 알파 신호 펩티드를 들 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 추가 폴리펩티드, 예를 들어 하나 이상의 마커(들) 및/또는 하나 이상의 이펙터 분자를 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 마커(들)는 형질도입 마커, 대리 마커 및/또는 선택 마커를 포함한다. 예를 들어 하나 이상의 추가 폴리펩티드(들)를 암호화하는 도입된 추가 핵산 서열 중에는, 예를 들어 전달된 세포의 생존 능력 및/또는 기능을 촉진함으로써 요법의 효능을 개선할 수 있는 핵산 서열; 예를 들어 생체 내에서 생존 또는 국소화를 평가하기 위해 세포의 평가 및/또는 선택을 위한 유전자 마커를 제공하는 핵산 서열; 문헌 「Lupton S. D. 등, Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); 및 Riddell 등, Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)」에 기재된 바와 같이 예를 들어 생체 내에서 음성 선택에 세포를 예민하게 만들어 안정성을 개선하기 위한 핵산 서열이 포함되고; 또한 우성 양성 선택 가능 마커의 음성 선택 가능 마커와의 융합에서 유래된 2작용성 선택 가능 융합 유전자의 용도를 기술하는 국제공개공보 제WO1992/008796호 및 및WO1994/028143호 및 미국특허 제6,040,177호를 참조한다.
일부 구현예에서, 마커는 형질도입 마커 또는 대리 마커이다. 형질도입 마커 또는 대리 마커는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 검출하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 형질도입 마커는 세포의 변형을 나타낼 수 있거나 또는 세포의 변형을 확인할 수 있다. 일부 구현예에서, 대리 마커는 세포 표면에서 재조합 수용체, 예를 들어 CAR과 세포 표면에서 동시 발현되도록 만들어진 단백질이다. 특정 구현예에서 그러한 대리 마커는 거의 또는 전혀 활성을 갖지 않도록 변형된 표면 단백질이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열은 마커를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결되고, 2A 서열과 같은 리보솜 스킵을 야기하는 펩티드 또는 자가-절단 펩티드를 암호화하는 핵산 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)에 의해 선택적으로 분리된다. 외래 마커 유전자는 어떤 경우에는 조작된 세포와 관련하여 세포의 검출 또는 선택을 가능하게 하고 경우에 따라 세포 제거 및/또는 세포 자살을 촉진시킬 수 있다.
예시적인 대리 마커는 절단된 형태의 세포 표면 폴리펩티드 예를 들어 비-작용성이고 신호 또는 전장 형태의 세포 표면 폴리펩티드에 의해서 통상적으로 형질도입된 신호를 형질도입하지 않거나 형질도입할 수 없고/없거나 내재화할 수 없는 절단된 형태를 포함할 수 있다. 예시적인 절단된 세포 표피 폴리펩티드는 절단된 형태의 성장 인자 또는 다른 수용체, 예를 들어 절단된 인간 표피 성장 인자 수용체 2(예시적인 절단된 세포 표피 폴리펩티드(tHER2), 절단된 인간 표피 성장 인자 수용체(tEGFR, 서열번호 7 또는 16에 제시된 예시적인 tEGFR 서열) 또는 전립선 특이적 막 항원(PSMA) 또는 그의 변형된 형태, 예를 절단된 PSMA(tPSMA)를 포함한다. 일부 측면에서, tEGFR는 항체 세툭시맙(Erbitux®) 또는 기타 치료용 항-EGFR 항체 또는 결합 분자에 의해 인식되는 에피토프를 포함할 수 있으며, 이는 tEGFR 구조물에 의해 조작된 세포를 확인 또는 선택하고/하거나 상기 암호화된 외인성 단백질을 발현하는 세포들을 제거 또는 분리하는데 이용될 수 있다[미국특허 제8,802,374호 및 문헌 「Liu 등, Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434)」 참조]. 일부 측면에서, 예를 들어 대리 마커와 같은 마커는, CD34, NGFR, CD19 또는 절단된 CD19, 예를 들어 절단된 비-인간 CD19의 전부 또는 일부(예를 들어 절단된 형태)를 포함한다. 절단된 EGFR(예를 들어 tEGFR)에 대한 예시적인 폴리펩티드는 서열번호 7 또는 16에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열번호 7 또는 16과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 마커는 형광 단백질, 예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP), 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP), 예를 들어 슈퍼-폴드 GFP (sfGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 예를 들어 tdTomato, mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed 또는 DsRed2, 시안 형광 단백질(CFP), 청록색 형광 단백질(BFP), 강화 청색 형광 단백질(EBFP), 및 황색 형광 단백질(YFP), 및 형광 단백질의 종 변이체, 단량체 변이체, 코돈-최적화, 안정화된 및/또는 강화된 변이체를 포함하는 그의 변이체이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 마커는 효소, 예를 들어 루시퍼라아제, E. coli로부터 lacZ 유전자, 알칼리성 포스파타아제, 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP), 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(CAT)이거나 이를 포함한다. 예시적인 발광 리포터 유전자는 루시퍼라아제(luc), β-갈락토시다아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), β-글루쿠로니다아제(GUS) 또는 그의 변이체를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 효소의 발현은 상기 효소의 발현 및 작용 활성시 검출될 수 있는 기판의 첨가에 의해서 검출될 수 있다.
일부 구현예에서, 마커는 선택 마커이다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 외인성 제제 또는 약물에 내성을 부여하는 폴리펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 항생제 내성 유전자이다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 항생제 내성 유전자이고, 포유동물 세포에 항생제 내성을 부여한다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 퓨로마이신 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 블라스티시딘 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 제네티신 내성 유전자 또는 제오신 내성 유전자 또는 그의 변형된 형태이거나 이를 포함한다.
여기에 기재된 임의의 재조합 수용체 및/또는 추가 폴리펩티드(들)는 재조합 수용체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 임의의 조합, 배향 또는 배열로 함유하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 예를 들어 1개, 2개, 3개 이상의 폴리뉴클레오티드는 1개, 2개, 3개 이상의 상이한 폴리펩티드, 예를 들어 재조합 수용체 또는 이의 일부 또는 이의 성분 및/또는 하나 이상의 추가 폴리펩티드(들), 예를 들어 마커 및/또는 이펙터 분자를 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나의 폴리뉴클레오티드는 재조합 수용체, 예를 들어 CAR 또는 이의 일부 또는 이의 성분을 암호화하는 핵산 서열 및 하나 이상의 추가 폴리펩티드(들)를 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 하나의 벡터 또는 작제물은 재조합 수용체, 예를 들어 CAR 또는 이의 일부 또는 이의 성분을 암호화하는 핵산 서열을 함유하고, 별도의 벡터 또는 작제물은 하나 이상의 추가 폴리펩티드(들)를 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열과 하나 이상의 추가 폴리펩티드(들)를 암호화하는 핵산 서열은 2개의 상이한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산은 하나 이상의 추가 폴리펩티드(들)를 암호화하는 핵산의 상류에 존재한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산은 하나 이상의 추가 폴리펩티드(들)를 암호화하는 핵산의 하류에 존재한다.
특정 경우에, 하나의 폴리뉴클레오티드는 2개 이상의 상이한 폴리펩티드 사슬, 예를 들어 재조합 수용체 및 하나 이상의 추가 폴리펩티드(들), 예를 들어 마커 및/또는 이펙터 분자를 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 상이한 폴리펩티드 사슬, 예를 들어 재조합 수용체 및 하나 이상의 추가 폴리펩티드(들)를 암호화하는 핵산 서열은 2개의 별도의 폴리뉴클레오티드에 존재한다. 예를 들어 2개의 별도의 폴리뉴클레오티드가 제공되고, 각각은 세포 내 발현을 위해 세포로 개별적으로 전달되거나 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열 및 마커를 암호화하는 핵산 서열은 세포의 게놈 내의 상이한 위치에 존재하거나 삽입된다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열 및 마커를 암호화하는 핵산 서열은 2개의 상이한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
폴리뉴클레오티드가 제 1 및 제 2 핵산 서열을 함유하는 일부 구현예에서, 상이한 폴리펩티드 사슬 각각을 암호화하는 코딩 서열들(coding sequences)은 동일하거나 상이한 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 2 이상의 상이한 폴리펩티드 사슬의 발현을 유도하는 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 핵산 분자는 멀티시스트론(바이시스트론 또는 트리시스트론, 예를 들어 미국특허 제6,060,273호 참조)일 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열 및 하나 이상의 추가 폴리펩티드(들)를 암호화하는 핵산 서열은 동일한 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 선택적으로 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 자가 절단 펩티드 또는 리보솜 건너뛰기를 야기하는 펩티드, 예를 들어 2A 요소를 암호화하는 핵산에 의해 분리되어 있다. 예를 들어 예시적인 마커 및 선택적으로 리보솜 건너뛰기 서열은 국제공개공보 제WO2014/031687호에 개시된 바와 같은 임의의 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 전사 단위는 단일 프로모터로부터의 메시지에 의해서 유전자 생성물의 공발현(예를 들어 재조합 수용체 및 추가적인 폴리펩티드의 암호화)을 허용하는 IRES를 함유하는 비시스토로닉 유닛(bicistronic unit)으로서 조작될 수 있다. 대안으로는, 일부 경우에서, 단일 프로모터는 자가-절단 펩티드(예를 들어 2A 서열들) 또는 프로테아제 인식 부위(예를 들어 퓨린)을 암호화하는 서열에 의해 서로 분리된 2 또는 3개의 유전자들(예를 들어 마커 암호화 및 재조합 수용체 암호화)을 하나의 오픈 리딩 프레임(ORF)에 함유하는, RNA의 발현을 지시할 수 있다. ORF는 따라서 번역 도중(2A의 경우) 또는 번역 후에 개별적인 단백질로 가공되는, 단일 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에서, T2A와 같은 펩티드는, 리보솜으로 하여금 2A 요소의 C-말단에서 펩티드 결합 합성을 생략하도록(리보좀 스키핑) 할 수 있는데 이에 의해, 2A 서열의 말단과 다음 펩티드의 하류 사이가 분리된다[예를 들어 문헌 「de Felipe, Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004)」 및 「de Felipe 등, Traffic 5:616-626 (2004)」 참조]. 다양한 2A 요소가 알려져 있다. 본원에 개시된 방법 및 시스템에 사용가능한 2A 서열의 비제한적인 예로는, 구제역 바이러스(F2A, 예를 들어 서열번호 21), 말의 A형 비염 바이러스(E2A, 예를 들어 서열번호 20), 토세아 아시그나 바이러스(Thosea asigna virus)(T2A, 예를 들어 서열번호 6 또는 17), 및 돼지의 테스코바이러스-1(P2A, 예를 들어 서열번호 18 또는 19)을 들 수 있으며 이에 관해서는 미국특허출원공개공보 제US2007/0116690호에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체 및/또는 추가 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하나의 벡터에 함유되거나 하나 이상의 벡터(들)로 클로닝될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 벡터(들)는 숙주 세포, 예를 들어 조작을 위한 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 예시적인 벡터는 플라스미드 및 바이러스와 같이 도입, 번식 및 증폭 또는 발현 또는 둘 다를 위해 설계된 벡터를 포함한다. 일부 측면에서, 벡터는 발현 벡터, 예를 들어 재조합 발현 벡터이다. 일부 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 pUC 시리즈(Fermentas Life Sciences), pBluescript 시리즈(Stratagene, 미국 캘리포니아주 라호야 소재), pET 시리즈(Novagen, 미국 위스콘신주 매디슨 소재), pGEX 시리즈(Pharmacia Biotech, 스웨덴 웁살라 소재), 또는 pEX 시리즈(Clontech, 미국 캘리포니아주 팔로앨토 소재)의 벡터일 수 있다. 일부 경우에서, 박테리오파지 벡터, 예를 들어 λG10, λGT11, λZapII(Stratagene), λEMBL4, 및 λNM1149가 또한 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 식물 발현 벡터가 사용될 수 있으며, 이는 pBI01, pBI1012, pBI1013, pBI121 및 pBIN19(Clontech)를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물 발현 벡터는 pEUK-Cl, pMAM 및 pMAMneo(Clontech)를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 벡터가 사용된다.
일부 구현예에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체 및/또는 추가 폴리펩티드(들)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 또는 전이인자(transposons)를 통해 세포로 도입된다[예를 들어 문헌 「Baum 등, (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13:1050-1063; Frecha 등, (2010) Molecular Therapy 18:1748-1757; 및 Hackett 등, (2010) Molecular Therapy 18:674-683」 참조].
일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(들)은 재조합 감염성 바이러스 입자, 예를 들어 유인원 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV)로부터 유래한 벡터를 사용하여 세포에 도입된다. 특정 구현예에서, 벡터는 AAV 벡터이다. 특정 구현예에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8 벡터 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV2 또는 AAV6 벡터이다. 일부 구현예에서, 제제(들) 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드는 재조합 AAV에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드는 재조합 AAV에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, (i) 제제(들) 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드 및 (ii) 이종 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드는 재조합 AAV에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, (i) 제제(들) 및/또는 주형 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폴리뉴클레오티드 및 (ii) 이종 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드는 동일한 재조합 AAV에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, AAV는 그의 게놈을 숙주 세포, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 표적 세포의 게놈 내로 도입할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(들)는 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 감마-레트로바이러스 벡터를 사용하여 T 세포 내로 도입된다(예를 들어 문헌 [Koste 등, (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25]; [Carlens 등, (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46]; [Alonso-Camino 등, (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93]; [Park 등, Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557] 참조).
일부 구현예에서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 일부 측면에서, 레트로바이러스 벡터는 긴 말단 반복부 서열(LTR), 예를 들어 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 골수 증식성 육종 바이러스(MPSV), 뮤린 배아 줄기세포 바이러스(MESV), 뮤린 줄기세포 바이러스(MSCV), 비장 병원체 형성 바이러스(SFFV), 또는 아데노-관련 바이러스(AAV)로부터 유래한 레트로바이러스 벡터를 가질 수 있다. 대부분의 레트로바이러스 벡터는 뮤린 레트로바이러스로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 임의의 조류 또는 포유류 세포 공급원으로부터 유래한 것을 포함한다. 레트로바이러스는 통상적으로 양쪽성이며, 이는 이들이 인간을 포함하는 여러 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미한다. 하나의 구현예에서, 발현될 유전자는 레트로바이러스 gag, pol 및/또는 env 서열을 대체한다. 다수의 예시적 레트로바이러스 시스템이 기재된 바 있다[예를 들어 미국특허 제5,219,740호; 제6,207,453호; 제5,219,740호; 문헌 「Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14」; 「Scarpa 등, (1991) Virology 180:849-852」;「Burns 등, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037」; 및 「Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109」 참조].
렌티바이러스 형질도입 방법은 공지되어 있다. 예시적 방법은, 예를 들어 문헌 「Wang 등, (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701」; 「Cooper 등, (2003) Blood. 101:1637-1644」; 「Verhoeyen 등, (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114」 및 「Cavalieri 등, (2003) Blood. 102(2): 497-505」에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 상기 재조합 수용체 및/또는 하나 이상의 추가의 폴리펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 레트로 바이러스 형질도입, 형질감염 또는 형질전환에 의해서 배양된 세포를 함유하는 집단으로 도입된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(들)은 전기천공을 이용하여 T 세포내로 도입된다[예를 들어 문헌 「Chicaybam 등, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298」 및 「Van Tedeloo 등, (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437」 참조]. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 트랜스포지션(transposition)를 통해 T 세포내로 전달된다[예를 들어 문헌 「Manuri 등, (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437」; 「Sharma 등, (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74」; 및 「Huang 등, (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126」 참조]. 면역 세포에서 유전 물질, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터를 도입하여, 발현시키는 다른 방법으로는 인산칼륨 형질도입[예를 들어 문헌 「Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.」에 기재된 바와 같음], 원형질체 융합, 양이온성 리포솜 매개 형질도입; 텅스텐 입자 촉진 미립자 충격[문헌 「Johnston, Nature, 346: 776-777(1990)」]; 및 스트론튬 인산염 DNA 공-침전[문헌 「Brash 등, Mol Cell Biol, 7: 2031-2034(1987)」 참조] 및 국제공개공보 제WO 2014055668호 및 미국특허 제7,446,190호를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 T 세포는 증식 도중 또는 증식 후에 예를 들어 T 세포수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)로 형질도입될 수 있다. 원하는 수용체 유전자의 도입을 위한 이러한 형질도입은 예를 들어 임의의 적합한 레트로바이러스 벡터로 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체 및/또는 추가 폴리펩티드(들)을 암호화하는 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(들) 또는 벡터(들)은 발현동안 또는 발현 후 세포, 예를 들어 T 세포에 도입될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드(들) 또는 벡터(들)의 도입은 적절한 임의의 레트로바이러스 벡터를 사용하여 수행될 수 있다. 이어서 생성되는 유전자 조작된 세포들은 초기 자극(예를 들어 항-CD3/항-CD28 자극)으로부터 유리될 수 있고, 이어서, 예를 들어 새로 도입된 재조합 수용체를 통하여 제 2 유형의 자극으로 자극될 수 있다. 이 제 2 유형의 자극은 펩티드/MHC 분자 형태의 항원 자극, 유전적으로 도입된 수용체의 동족(가교성) 리간드(예를 들어 CAR의 천연 항원 및/또는 리간드) 또는(예를 들어 수용체 내 불변 영역을 인식함으로써) 새로운 수용체의 구조 내에 직접 결합하는 기타 리간드(항체 등)를 포함할 수 있다. 예를 들어 문헌 「Cheadle 등, "Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy" Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 」 또는 「Barrett 등, Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014)」를 참조한다.
일부 경우에, 세포, 예를 들어 T 세포가 활성화되는 것을 요하지 않는 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 일부 경우에서, 세포는 활성화 전에 선택 및/또는 형질도입될 수 있다. 따라서, 세포는, 세포의 배양 전에 또는 후에, 그리고 경우에 따라서는 상기 배양과 동시에 적어도 일부의 상기 배양도중에 조작될 수 있다.
C. 유전자 조작을 위한 세포 및 세포의 준비
일부 구현에에서 조작된 세포, 예를 들어 유전자 조작된 또는 변형된 세포, 및 세포를 조작하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 세포의 하나 이상의 유전자 좌(genetic locus)는 유전적으로 파괴된다(예를 들어 녹아웃된다). 일부 구현예에서, TRAC의 유전자 좌 및/또는 그의 일부 및 β2M의 유전자 좌 또는 그의 일부는 세포에서 녹아웃된다. 일부 구현예에서, 세포는 TRAC 및 β2M에 대해 녹아웃된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 재조합 수용체 및/또는 부가적인 폴리펩티드, 예를 들어 본원에서 기술된 임의의 것이 조작을 위한 세포 내로 도입된다(예를 들어 넉킹 인된다). 일부 측면에서, 상기 폴리뉴클레오티드 및/또는 그의 일부는 이종성이며, 즉 예를 들어 조작되는 세포 및/또는 그러한 세포가 유도된 유기체에서 통상적으로 발견되지 않는 것 같은 다른 생물 또는 세포로부터 얻은 것과 같은 세포 또는 세포로부터 수득된 샘플에 통상적으로 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 여러 상이한 세포 유형으로부터의 다양한 도메인을 암호화하는 핵산의 키메라 조합물을 포함하여 자연계에서 발견되지 않거나 또는 자연계에서 발견된 핵산 서열로부터 변형된 핵산 서열과 같이 자연 발생적 핵산 서열은 아니다.
일부 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드의 파괴 및 도입은 동시에 수행된다. 일부 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드의 파괴 및 도입은 어느 순서로든 순차적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 이종 뉴클레오티드는 세포에서 파괴된 유전자 좌 또는 그의 부분 내로 녹아웃된다. 일부 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 녹아웃된 TRAC 유전자 좌 내로 녹아웃된다.
세포는 일반적으로 포유류 세포와 같은 진핵 세포이고, 전형적으로 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 혈액, 골수, 림프 또는 림프 기관으로부터 유래되며, 타고난 면역 또는 적응 면역의 세포, 예를 들어 림프구를 비롯한 골수 또는 림프 세포, 전형적으로 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함한다. 다른 예시적인 세포는 유도된 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)를 포함하여 다능성 및 만능 줄기 세포와 같은 줄기 세포를 포함한다. 세포는 전형적으로 1차 세포, 예를 들어 개별 공여자 또는 복수의 공여자로부터 직접 분리되고/되거나 개별 공여자 또는 복수의 상이한 공여자로부터 분리되고 동결된 것이다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포의 하나 이상의 서브 세트 또는 전체 T 세포 집단, CD4+ 세포, CD8+ 세포 및 이들의 모집단과 같은 다른 세포 유형, 예를 들어 기능, 활성화 상태, 성숙도, 항원 특이성, 항원 수용체의 유형, 특정 기관 또는 구획에서의 존재, 마커 또는 사이토카인 분비 프로파일 및/또는 분화 정도에 의존적일 수 있다. 치료될 대상과 관련하여, 세포는 동종 및/또는 자기 조직일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 치료될 대상체와 관련하여 동종이계이다. 상기 방법 중에는 상용(off-the-shelf) 방법이 포함된다. 일부 측면에서, 예를 들어 상용 기술의 경우, 세포는 다능성 및/또는 다능성, 예를 들어 줄기 세포, 예를 들어 iPSC이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 개별 공여자 또는 복수의 상이한 공여자로부터 세포를 분리하는 것, 그를 제조, 가공, 배양, 및/또는 조작하는 것, 및 그를 동결 보존 전 또는 후에 대상체 내로 재도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 공여자이다. 일부 구현예에서, 대상체는 공여자가 아니다.
T 세포 및/또 CD4+ 및/또는CD8+ T 세포의 서브 타입 및 서브세트 중에서, 천연 T(TN) 세포, 이펙터 T 세포(TEFF), 기억 T 세포 및 그의 서브-타입, 예를 들어 줄기 세포 기억 T(TSCM), 센트럴 기억 T(TCM), 이펙터 기억 T(TEM), 또는 말단분화 이펙터 기억(terminally differentiated effector memory) T 세포, 종양-침윤 림프구(tumor-infiltrating lymphocytes; TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼(helper) T 세포, 세포독성 T 세포, 점막 관련 불변 T(mucosa-associated invariant T; TMAIT) 세포, 자연적으로 발생하는 및 적응 조절 T(adaptive regulatory Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예를 들어 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 폴리큘러 헬퍼(follicular helper) T 세포, 알파/베타 T 세포, 및 델타/감마 T 세포가 있다.
일부 구현예에서, 세포는 천연 킬러 세포(NK cell)이다. 일부 구현예에서, 세포는 단핵 세포 또는 과립구, 예를 들어 골수 세포, 대 식세포, 호중구, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구 및/또는 호염기구이다.
일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 분자를 발현하지 않고, 이를 암호화하는 유전자(들)는 유전적으로 파괴된(예를 들어 녹아웃된) 것이다. 일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작을 통해 도입된(넉킹 인된) 하나 이상의 핵산을 포함하고, 그에 의해서 그러한 핵산의 재조합 또는 유전자 조작된 생성물을 발현한다. 일부 구현예에서, 핵산은 이종성이며, 즉 예를 들어 조작되는 세포 및/또는 그러한 세포가 유도된 유기체에서 통상적으로 발견되지 않는 세포는 다른 유기체 또는 세포로부터 얻어진 것과 같이 세포 또는 세포로부터 수득된 샘플에 통상적으로 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산은 여러 상이한 세포 유형으로부터 다양한 도메인을 암호화하는 핵산의 키메라 조합물을 포함하여 자연계에서 발견되지 않는 핵산과 같이 자연 발생적 핵산은 아니다.
일부 구현예에서, 조작된 세포의 제조는 하나 이상의 배양 및/또는 제조 단계를 포함한다. 형질전환 수용체, 예를 들어 CAR을 암호화하는 핵산의 도입을 위한 세포는 샘플, 예를 들어 생물학적 샘플, 예를 들어 개별 공여자 또는 복수의 상이한 공여자로부터 수득되거나 또는 그로부터 유래된 것으로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포가 분리되는 공여자는 질환 또는 병태를 갖거나 또는 세포 요법을 필요로 하는 것이거나, 또는 세포 요법이 투여될 것이다. 일부 구현예에서, 세포가 분리되는 복수의 상이한 공여자 중 적어도 하나는 질환 또는 병태를 갖거나 또는 세포 요법을 필요로 하는 것이거나, 또는 세포 요법이 투여될 것이다. 일부 구현예에서 대상체는 특정 치료 개입, 예를 들어 세포가 분리, 가공 및/또는 조작되는 입양 세포 요법을 필요로 하는 인간이다.
따라서, 한 구현예에서 세포는 일차 세포, 예를 들어 일차 인간 세포이다. 샘플(예를 들어 공여자 샘플)에는 분리, 원심 분리, 유전자 조작(예를 들어 바이러스 벡터를 이용한 형질도입), 세척 및/또는 배양과 같은 하나 이상의 처리 단계에서 생성되는 샘플뿐만 아니라 조직에서 추출한 조직, 유체 및 기타 샘플이 포함된다. 생물학적 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은 생물학적 소스 또는 처리된 샘플에서 직접 얻은 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플로는 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀, 조직 및 기관 샘플(이로부터 유도된 가공 샘플 포함)과 같은 체액이 있으나 이에 국한되지 않는다. 일부 측면에서, 공여자 샘플은 개별 공여자로부터 유래된 샘플이다. 일부 측면에서, 개별 공여자 유래 공여자 샘플은 공여자 샘플 또는 하나 이상의 다른 개별 공여자와 조합되어 복수의 상이한 공여자로부터 공여자 샘플을 생성한다. 일부 측면에서, 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다.
한 측면에서, 세포가 유래되거나 분리되는 샘플은 혈액 또는 혈액 유래 샘플이고, 또는 성분채집술 또는 백혈구 추출물에서 유도된 것이다. 예시적인 샘플은 전혈, 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 관련 림프 조직, 점막 관련 림프 조직, 비장, 기타 림프 조직, 간, 폐, 전립선, 자궁 경부, 고환, 난소, 편도선 또는 다른 기관에서 유도된 세포, 및/또는 이로부터 유도된 세포를 포함한다. 샘플(예를 들어 공여자 샘플)은 세포 치료와 관련하여, 예를 들어 적용 세포 치료, 자기 및 동종 원천으로부터의 샘플을 포함한다. 공여자 샘플은 세포 요법, 예를 들어 입양 세포 요법의 맥락에서, 동종이계 공급원으로부터의 샘플을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 세포주, 예를 들어 T 세포주에서 유래한다. 일부 구현예에서 세포는 이종의 소스, 예를 들어 마우스, 래트, 비인간 영장류 및 돼지로부터 수득된다.
일부 구현예에서, 세포의 분리는 하나 이상의 제조 및/또는 비친화도에 기초한 세포 분리 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포를 세척, 원심 분리 및/또는 하나 이상의 시약의 존재하에, 예를 들어 원하지 않는 성분을 제거하고, 원하는 성분을 농축시키고, 특정 시약에 민감한 세포를 용해 시키거나 제거하기 위해 배양한다. 일뷰 구체예에서, 세포는 밀도, 부착 성질, 크기, 민감성 및/또는 특정 성분에 대한 내성과 같은 하나 이상의 특성에 기초하여 분리된다.
일부 구체예에서, 환자의 순환 혈액으로부터의 세포는 예를 들어 성분채집술 또는 백혈구 제거에 의해 얻어진다. 샘플에는 T 세포, 단핵 세포, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판을 비롯한 일부 림프구가 포함되어 있으며 일부 측면에서는 적혈구 및 혈소판 이외의 세포가 포함되어 있다.
일부 구현예에서, 개별 공여자 또는 복수의 상이한 공여자로부터 수집된 혈액 세포를 세척하여 예를 들어 혈장 분획을 제거하고 후속 공정 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 세포를 위치시킨다. 일부 구현예에서, 세포는 인산 환충 식염수(PBS)로 세척한다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 다수 또는 모든 2가 양이온이 부족하다. 일부 측면에서 세척 단계는 반자동 "플로우 스루(flow-through)" 원심 분리기(예를 들어 the Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter)를 제조사의 지침에 따라 수행한다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조사의 지시에 따라 접선 유동 여과(TFF)에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 세포는 세척 후 다양한 생체 적합성 완충액, 예를 들어 Ca++/Mg++ 부재 PBS에 재현탁된다. 특정 구현예에서, 혈액 세포 샘플의 성분을 제거하고 세포를 배양 배지에 직접 재현탁한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 적혈구를 용해시켜 퍼콜(Percoll) 또는 피콜(Ficoll) 구배를 통해 원심 분리하여 말초 혈액으로부터 백혈구를 제조하는 것과 같은 밀도-기반 세포 분리방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 분리 방법은 표면 마커, 예를 들어 표면 단백질, 세포내 마커 또는 핵산과 같은 하나 이상의 특정 분자의 세포에서의 발현 또는 존재에 기초한 상이한 세포 유형의 분리를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 마커에 기초한 임의의 공지된 분리 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 분리는 친화도 또는 면역 친화도-기재분리이다. 예를 들어 일부 측면에서 분리는 세포의 예를 들어 그러한 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와의 배양에 의해, 전형적으로 세포 표면 마커의 세포 발현 또는 발현 수준에 기초한 세포 및 세포 집단의 분리를 포함하며, 일반적으로 세척 단계 및 항체 또는 결합 파트너에 결합한 세포를 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 않은 세포로부터 분리하는 단계를 포함한다.
이러한 분리 단계는 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 않은 세포가 보유되는 시약에 결합된 세포가 추가 사용을 위해 보유된 양성 선택 및/또는 음성 선택에 기초할 수 있다. 한 구체예에서, 두 분획은 추후 사용을 위해 보유된다. 일부 측면에서, 음성 선택은 이종 집단에서 세포 유형을 특이적으로 식별하는 항체가 이용 가능하지 않은 경우에 특히 유용할 수 있어, 원하는 집단 이외의 세포에 의해 발견된 마커에 기초하여 분리가 가장 잘 수행된다.
분리는 특정 세포 집단 또는 특정 마커를 발현하는 세포의 100% 농축 또는 제거를 수반할 필요는 없다. 예를 들어 마커를 발현하는 세포와 같은 특정 유형의 세포에 대한 양성 또는 농축은 그러한 세포의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 말하지만, 마커를 발현하지 않는 세포가 완전히 없게 할 필요는 없다. 마찬가지로, 마커를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포의 음성 선택, 제거 또는 고갈은 그러한 세포의 수 또는 백분율을 감소시키는 것을 의미하지만 그러한 모든 세포를 완전히 제거할 필요는 없다.
일부 구체예에서, 한 번의 단계로부터 양 또는 음으로 선택된 분획이 후속적인 양성 또는 음성의 선택과 같은 다른 분리 단계를 거치는 다중 단계의 분리 단계가 수행된다. 일부 구체예에서, 단일 분리 단계는 복수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 세포를 항온 처리함으로써, 복수의 마커를 동시에 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있으며, 각각은 음성 선택을 목표로 하는 마커에 특이적이다. 마찬가지로, 여러 세포 유형은 다양한 세포 유형에서 발현되는 복수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 세포를 배양함으로써 동시에 양성으로 선택될 수 있다.
예를 들어 일부 측면에서, 양성이거나 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ T 세포의 높은 수준을 발현하는 세포와 같은 T 세포의 서브세트는 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 분리된다.
예를 들어 CD3+, CD28+ T 세포는 항-CD3/항-CD28 접합된 자기 비드(conjugated magnetic bead)(예를 들어 DYNABEADS®M-450 CD3/CD28 T 세포 증폭기)를 사용하여 적극적으로 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 분리는 음성 선택에 의한 양성 선택 또는 특정 세포군의 고갈에 의해 특정 세포 집단에 대한 농축에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 양성 또는 음성 선택는 양성 또는 음성으로 선택된 세포 상에 상대적으로 높은 수준(마커 하이(high))으로 발현되거나 발현되는 하나 이상의 표면 마커(마커+)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 다른 결합제와 세포를 인큐베이션시킴으로써 달성된다.
일부 구현예에서, T 세포는 B 세포, 단구 또는 CD14와 같은 다른 백혈구와 같은 비 T 세포에서 발현된 마커의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플로부터(예를 들어 개별 공여자로부터 또는 복수의 상이한 공여자로부터) 분리된다. 일부 측면에서, CD4+ 또는 CD8+ 선택 단계는 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포 독성 T 세포를 분리하는데 사용된다. 이러한 CD4+ 및 CD8+ 모집단은 하나 이상의 순진, 기억 및/또는 이펙터 T 세포 서브세트에서 상대적으로 높은 정도로 발현되거나 표현된 마커에 대한 양성 또는 음성 선택에 의해 서브세트으로 추가 분류될 수 있다.
일부 구현예에서, CD8+ 세포는 각각의 부분 집단과 관련된 표면 항원에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해서, 네이비(naive), 센트럴 기억, 이펙터 기억(effector memory) 및/또는 센트럴 기억 줄기 세포(central memory stem cell)를 추가로 농축하거나 고갈시킨다. 일부 구현예에서, 센트럴 기억 T(TCM) 세포에 대한 농축은 증폭 및/또는 생체내 투여를 개선하는 것과 같은 효능을 증가시키기 위해 수행되며, 일부 측면에서는 특히 이러한 서브세트에서 강건하다[문헌 「Terakura 등, (2012) Blood,1:72-82; Wang 등, (2012) J Immunother . 35(9):689-701」 참조]. 일부 구현예에서, TCM-농축 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포를 결합시키는 것은 효능을 추가로 강화시킨다.
일부 구현예에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 서브 세트에 모두 존재한다. PBMC는 항-CD8 및 항-CD62L 항체를 사용하는 것과 같은, CD62L-CD8+ 및/또는 CD62L+CD8+ 분획을 농축하거나 고갈시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 센트럴 기억(central memory) T(TCM) 세포에 대한 농축은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, 및/또는 CD127의 양성 또는 고표면 발현에 기초하며; 일부 측면에서 그것은 CD45RA 및/또는 그랜자임 B(granzyme B)를 발현하거나 고도로 발현하는 세포에 대한 음성 선택에 기초한다. 일부 구현예에서, 중앙 기억 T (TCM) 세포에 대한 농축은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD27, 및/또는 CD127의 양성 또는 높은 표면 발현에 기반한다. 일부 구현예에서, 중앙 기억 T (TCM) 세포에 대한 농축은 CD62L, CCR7, CD28, 및/또는 CD27의 양성 또는 높은 표면 발현에 기반한다. 일부 구현예에서, 중앙 기억 T (TCM) 세포에 대한 농축은 CCR7, CD28, 및/또는 CD27의 양성 또는 높은 표면 발현에 기반한다. 일부 구현예에서, 중앙 기억 T (TCM) 세포에 대한 농축은 CD28 및 CD27의 양성 또는 높은 표면 발현에 기반한다. 일부 구현예에서, TCM 세포에 대해 농축된 CD8+ 집단의 분리는 CD4, CD14, CD45RA를 발현하는 세포의 고갈 및 CD62L을 발현하는 세포에 대한 양성 선택 또는 농축에 의해 수행된다. 일부 측면에서, TCM 세포에 대해 농축된 CD8+ 집단의 분리는 CD4, CD14, CD45RA를 발현하는 세포의 고갈 및 CD27 및 CD28을 발현하는 세포에 대한 양성 선택 또는 농축에 의해 수행된다. 일부 측면에서, 센트럴 기억 T(TCM) 세포에 대한 농축은 CD14 및 CD45RA의 발현에 기초한 음성 선택 및 CD62L에 기초한 양성 선택을 실시한 CD4 발현에 기초하여 선택된 세포의 음성 분획으로 시작하여 수행한다. 일부 측면에서, 이러한 선택은 동시에 수행되고 다른 양상에서는 어느 순서로 순차적으로 수행된다. 일부 구현예에서, CD8+ 세포 집단 또는 부분 집단을 제조하는데 사용된 동일한 CD4 발현-기반 선택 단계는 또한 CD4+ 세포 집단 또는 서브세트를 생산하는데 사용되어 CD4-기반 분리로부터의 양성 및 음성 분획을 둘 다 유지시켜서 상기 방법의 후속 단계에서 사용한 후, 선택적으로 하나 이상의 추가의 양성 또는 음성 선택 단계를 수행한다.
특정 구체예에서, PBMC의 샘플 또는 다른 백혈구 샘플(예를 들어 공여자 샘플, 예를 들어 개별 공여자 또는 복수의 상이한 공여자들 유래 샘플)은 CD4+ 세포의 선택에 적용되며, 여기서 음성 및 양성 분획 둘 다가 유지된다. 이어서, 음성 분획은 CD14 및 CD45RA 또는 CD19의 발현에 기초한 음성 선택, 및 중심 기억 T 세포의 마커 특징, 예를 들어 CD62L 또는 CCR7에 기초한 양성 선택에 적용되며, 여기서 양성 및 음성 선택은 어느 순서로든 수행된다.
CD4+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 가진 세포 집단을 확인함으로써 네이비하고 센트럴 기억 및 효과 세포로 분류된다. CD4+ 림프구는 표준 방법으로 얻을 수 있다. 일부 구현예에서, 천연의 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 센트럴 기억 CD4+ 세포는 CD62L+ 및 CD45RO+이다. 일부 구현예에서, 이펙터 CD4+ 세포는 CD62L- 및 CD45RO-이다.
한 구체예에서, 음성 선택에 의한 CD4+ 세포를 농축하기 위해, 단클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 양성 및/또는 음성 선택을 위한 세포의 분리를 허용하기 위해 자기 비드 또는 상자성 비드와 같은 고체 지지체 또는 매트릭스에 결합된다. 예를 들어 일부 구현예에서, 세포 및 세포 집단은 면역 자기(또는 친화력 자기) 분리 기술을 사용하여 분리 또는 분리된다[문헌 「Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher ⓒ Humana Press Inc., Totowa, NJ」에서 검토됨].
일부 측면에서, 분리될 세포의 샘플 또는 집단(예를 들어 공여자 샘플, 예를 들어 개별 공여자 또는 복수의 상이한 공여자)은 상자성 비드(예를 들어 Dynalbeads 또는 MACS 비드)와 같은 자기적으로 반응하는 입자 또는 미세 입자와 같은 작고 자화 가능한 또는 자기적으로 반응하는 물질로 배양된다. 자기 반응 물질, 예를 들어 입자는 세포, 세포 또는 분리하고자하는 세포 집단 상에 존재하는 분자, 예를 들어 표면 마커에, 예를 들어 음성 또는 양성으로 선발하는 것이 바람직하다는 것을 의미, 특이적으로 결합하는 항체와 같은 결합 파트너에 직접 또는 간접적으로 부착된다.
일부 구현예에서, 자성 입자 또는 비드는 항체 또는 다른 결합 파트너와 같은 특정 결합 부재에 결합된 자기 반응 물질을 포함한다. 자기 분리법에 많이 사용되는 자기 반응 재료가 있다. 적합한 자성 입자는 몰데이(Molday)의 미국특허 제4,452,773호 및 유럽특허 제452342 B호에 개시되어 있으며, 이는 본원에 참고로 인용된다. 오웬(Owen)의 미국특허 제4,795,698호 및 리버티(Liberti) 등의 미국특허 제5,200,084호에 기재된 것과 같은 콜로이드 상 입자는 다른 예이다.
일반적으로 배양은 샘플 내의 세포에 존재하는 경우, 자성 입자 또는 비드에 결합된 항체 또는 결합 파트너 또는 이 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 이차 항체 또는 다른 시약과 같은 분자가 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 조건 하에 수행된다.
일부 측면에서, 샘플은 자기장에 놓이며, 자기적으로 반응하는 또는 자화 가능한 입자가 부착된 세포는 자석에 끌려가서 표지가 없는(unlabeled) 세포로부터 분리될 것이다. 긍정적인 선택의 경우, 자석에 끌리는 세포는 유지된다; 음성 선택의 경우 끌리지 않는 세포(표지가 없는 세포)은 유지된다. 일부 구현예에서, 양성 및 음성 선택의 조합은 양성 및 음성 분획이 보유되고 추가 처리되거나 추가 분리 단계에 종속되는 동일한 선택 단계에서 수행된다.
특정 구현예에서, 자기적 응답 입자는 1 차 항체 또는 다른 결합 파트너, 2차 항체, 렉틴, 효소 또는 스트렙타비딘에 코팅된다. 특정 구현예에서, 자성 입자는 하나 이상의 마커에 특이적인 1차 항체의 코팅을 통해 세포에 부착된다. 일부 구현예에서, 비드보다는 세포가 1차 항체 또는 결합 파트너로 표지되고, 이어서 세포-유형 특이적인 2차 항체 또는 다른 결합 파트너(예를 들어 스트렙타빈)-코팅 자성 입자가 첨가된다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘-코팅 자성 입자는 바이오티닐화된 1차 또는 2차 항체와 함께 사용된다.
일부 구현예에서, 자기적으로 반응하는 입자는 후속 배양, 배양 및/또는 조작되는 세포에 부착된 채로 남게 된다; 일부 구현예에서 입자는 환자에게 투여하기 위해 세포에 부착된 채로 남는다. 일부 구현예에서, 자화가능하거나 또는 자기적으로 반응하는 입자는 세포로부터 제거된다. 세포로부터 자화 가능한 입자를 제거하는 방법은 공지되어 있으며, 예를 들어 경쟁하는 비 표지된 항쳉 및 자화 가능한 입자 또는 절단 가능한 리어에 접합된 항체를 포함된다. 일부 구현예에서, 자화 가능한 입자는 생분해성이다.
일부 구현예에서, 친화도-기재 선택은 자기-활성화 세포 분류(MACS)(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 통해 이루어진다. 자기화성화 세포 분류(MACS) 시스템은 자화된 입자가 부착되 세포를 고순도로 선택할 수 있다. 일부 구현예에서, MACS는 비 표적종 및 표적종을 외부 자기장의 적용 후에 순차적으로 용출시키는 모드로 작동한다. 즉 자화된 입자에 부착된 세포는 부착되지 않은 화학종이 용리되는 동안 제 위치에 유지된다. 이어서, 이 첫 번째 용출 단계가 완료된 후, 자기장에 포획되어 용출되는 것을 방지한 종을 용리 및 회수할 수 있는 방법으로 자유롭게 한다. 일부 구현예에서, 비 표적 세포는 표적화되고 세포의 이종 집단으로부터 고갈된다.
일부 구현예에서, 추출 또는 분리는 세포 준비, 분리, 처리, 항온 배양, 배양 및/또는 방법의 제형 단계 중 하나 이상을 수행하는 시스템, 장치 또는 장치를 사용하여 수행된다. 일부 측면에서, 시스템은 폐쇄, 무균 환경, 예를 들어 에러, 사용자 취급 및/또는 오염을 최소화하기 위해 이들 단계 각각을 수행하는데 사용된다. 한 구체예에서, 시스템은 국제공개공보 제WO2009/072003호 또는 미국특허출원공보 제 20110003380호에 기재된 것과 같은 시스템이다.
일부 구현예에서, 시스템 또는 장치는 자동화된 또는 프로그래밍 가능한 방식으로, 하나 이상의, 예를 들어 모든 분리, 처리, 엔지니어링 및 제형 단계를 수행한다. 일부 측면에서, 시스템 또는 장치는 사용자가 처리, 격리, 엔지니어링 및 제형 단계의 결과를 프로그램, 제어, 평가 및/또는 조정할 수 있게 하는 시스템 및/또는 장치와 통신하는 컴퓨터 및/또는 컴퓨터 프로그램을 포함한다.
일부 측면에서, 분리 및/또는 다른 단계는 ClinMACS 시스템(Miltenyi Biotec)을 사용하여, 예를 들어 밀폐된 및 멸균 시스템에서 임상 규모의 세포의 자동화된 분리를 위해 수행된다. 구성 요소로는 통합 마이크로컴퓨터, 자기 분리 장치, 연동 펌프 및 다양한 핀치 밸브가 포함될 수 있다. 일부 측면에서 통합 컴퓨터는 계측기의 모든 구성요소를 제어하고 표준화된 순서로 반복적인 절차를 수행하도록 시스템에서 지시한다. 일부 측면에서 자기 분리 유닛은 이동 가능한 영구 자석 및 선택 칼럼용 홀더를 포함한다. 연동 펌프는 배관 세트 전체의 유속을 제어하며 핀치 밸브와 함께 시스템을 통한 완충액의 제어된 흐름과 세포의 지속적인 정지를 보장한다.
CliniMACS 시스템은 일부 측면에서 멸균 비 발열성 용액으로 공급되는 항체 결합 자성 입자를 사용한다. 일부 구현예에서, 자성 입자로 세포를 표지한 후, 세포를 세척하여 과량의 입자를 제거한다. 이어서 세포 준비 백을 튜빙 세트에 연결하고, 버퍼 세트 및 세포수집 백을 연결한다. 튜빙 세트는 프리-칼럼과 분리 칼럼을 포함하여 미리 조립된 무균 튜빙으로 구성되어 있으며 일회용으로만 사용된다. 분리 프로그램을 시작한 후, 상기 시스템은 세포 샘플을 자동으로 분리 칼럼에 적용한다. 표지된 세포는 칼럼 내에 보유되는 반면, 표지되지 않는 세포는 일련의 세척 단계에 의해 제거된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 지답은 표지되지 않고 칼럼에 보유되지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 표지되고 칼럼에 보유된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 자기장의 제거 후 칼럼으로부터 용리되어 세포수집 백 내에 수집된다.
특정 구현예에서, 분리 및/또는 다른 단계는 CliniMACS Prodigy 시스템(Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행된다. 상기 CliniMACS Prodigy 시스템은 원심 분리에 의한 세포의 자동화된 세척 및 분별을 가능하게 하는 세포 처리 단일체를 갖추고 있다. 상기 CliniMACS Prodigy 시스템에는 소스 세포 생성물의 거시적 층(macroscopic layer)을 식별하여 최적의 세포 분획 종말점을 결정하는 온보드 카메라 및 이미지 인식 소프트웨어가 포함될 수 있다. 예를 들어 말초 혈액은 적혈구, 백혈구 및 혈장 층으로 자동 분리된다. 상기 CliniMACS Prodigy 시스템은 또한 세포 분화 및 증폭, 항원 로딩 및 장기 세포 배양과 같은 세포 배양 프로토콜을 수행하는 일체형 세포 배양 챔버를 포함할 수 있다. 입력 포트는 멸균 제거 및 매체의 보충을 허용할 수 있으며, 통합 현미경을 사용하여 세포를 모니터할 수 있다[문헌 예를 들어 「Klebanoff 등, (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura 등, (2012) Blood.1:72-82, and Wang 등, (2012) J Immunother. 35(9):689-701」 참조].
일부 구현예에서, 본원에 기술된 세포 집단은 유세포 계측법을 통해 수집 및 농축(또는 고갈)되며, 여기서 복수의 세포 표면 마커로 염색된 세포는 유체 스트림으로 운반된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 세포 집단은 예비 스케일(FACS)-분류를 통해 수집 및 농축(또는 고갈)된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 세포 집단은 FACS-기반 검출 시스템과 조합된 마이크로 전자 기계 시스템(MEMS) 칩의 사용에 의해 수집 및 농축(또는 고갈)된다[예를 들어 국제공개공보 제WO2010/033140호, 문헌 「Cho 등, (2010) Lab Chip 10, 1567-1573」; 및 「Godin 등, (2008) J Biophoton. 1(5):355-376」 참조]. 두 경우 모두 세포를 여러 마커로 분류하여 잘 정의된 T 세포 하위 세트를 고순도로 분리 할 수 있다.
일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 하나 이상의 검출 가능한 카로 표지되어 양성 및/또는 음성 선택을 위한 분리를 용이하게 한다. 예를 들어 분리는 형광 표지된 항체와의 결합에 기초할 수 있다. 예를 들어 하나 이상의 세포 표면 마커에 특이적 항체 또는 다른 결합 파트너의 결합에 기초한 세포의 분리는 형광-활성 세포 분류(FACS)을 포함하는 분취용(FACS) 및/또는 미세 전자 기계 시스템(MEMS) 칩, 예를 들어 유세포 계측 탐지 시스템과 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 방법은 동시에 여러 마커를 기반으로 긍정적이고 부정적인 선택을 허용한다.
일부 구현예에서, 제조 방법은 분리, 항온 처리 및/또는 조작 전 또는 후에 세포를 동결, 예를 들어 냉동 보존하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 동결 및 후속 행동 단계는 과립구 및 어는 정도는 세포 집단 내의 단핵구를 제거한다. 일부 구현예에서, 세포는 예를 들어 혈장 및 혈소판을 제거하기 위한 세척 단계 후에 냉동 용액에 현탁된다. 임의의 다양한 공지된 동결 용액 및 파라미터가 사용될 수 있다. 일예로 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 다른 적합한 세포 동결 배지를 함유하는 PBS를 사용하는 것을 포함한다. 그런 다음 DMSO와 HSA의 최종 농도가 각각 10%와 4%가 되도록 배지로 1 : 1로 희석한다. 이어서, 세포를 일반적으로 분당 1℃의 속도로 -80℃로 동결시키고 액체 질소 저장 탱크의 증기 상에 저장한다.
일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작 전에 또는 유전자 조작과 관련하여 배양 및/또는 배양된다. 배양 단계는 배양(culture), 배양(cultivation), 자극, 활성화 및/또는 증식을 포함 할 수 있다. 배양 및/또는 조작은 배양 용기 또는 세포 배양을 위한 유닛, 챔버, 웰, 칼럼, 튜브, 튜빙 세트, 밸브, 바이알, 배양 접시, 백 또는 기타 용기와 같은 배양 용기에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 집단 또는 세포는 자극 조건 또는 자극제의 존재하에 배양된다. 그러한 조건은 집단 내에서 세포의 증식, 증폭, 활성화 및/또는 생존을 유도하고, 항원 노출을 모방하고/하거나 재조합 항원 수용체의 도입과 같은 유전자 조작을 위해 세포를 준비하는 것을 포함한다.
조건은 하나 이상의 특정 매질, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 영양제, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예를 들어 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 용해성 수용체, 및 세포를 활성화 시키도록 고안된 임의의 다른 제제를 포함한다.
일부 구현예에서, 자극 조건 또는 제제는 TCR 복합체의 세포내 신호 전달 영역을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 약제, 예를 들어 리간드를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 약제는 T 세포에서 TCR/CD3 세포내 신호 전달 계통을 작동시키거나 개시시킨다. 이러한 제제는 항체, 예를 들어 TCR에 특이적인 항체, 예를 들어 항-CD3을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 자극 조건은 하나 이상의 제제, 예를 들어 공자극 수용체를 자극할 수 있는 리간드, 예를 들어 항-CD28을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제제 및/또는 리간드는 고형 지지체 예를 들어 비드, 및/또는 하나 이상의 사이토카인에 결합될 수 있다. 선택적으로 상기 증폭 방법은 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 배양 배지에 (예를 들어 적어도 약 0.5ng/ml 농도로) 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극제는 IL-2, IL-15 및/또는 IL-7을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 IL-2 농도는 적어도 약 10 유닛/mL이다.
일부 측면에서, 배양은 미국특허 제6,040,177호, 문헌 「Klebanoff 등,(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura 등, (2012) Blood.1:72-82, and/or Wang 등, (2012) J Immunother. 35(9):689-701」에 기재된 기법에 따라 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 T 세포는 비분할 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 같은 배양-개시 집단(culture-initiating poupulation)에 피더 세포(feeder cell)를 (예를 들어 결과적인 세포 집단이 확대될 초기 집단에서 각 T 림프구에 대해 적어도 약 5, 10, 20 또는 40 이상의 PBMC 공급 세포를 포함하도록) 첨가하고; 상기 배양물을 (예를 들어 T 세포의 수를 증폭시키기에 충분한 시간동안) 배양함으로써 확대시킨다. 일부 측면에서는, 비분할 피더 세포는 감마-조사 PBMC 피더 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, PBMC는 세포 분열을 방지하기 위해 약 3000 내지 3600 rad 범위의 감마선으로 조사된다. 일부 측면에서, 피더 세포는 T 세포 집단을 첨가하기 전에 배양 배지에 첨가된다.
일부 측면에서, 자극 조건은 인간 T 림프구의 성장에 적합한 온도, 예를 들어 적어도 약 25℃, 일반적으로는 약 30℃, 일반적으로는 약 37℃의 온도를 포함한다. 선택적으로, 배양은 피더 세포로서 비분할 EBV-형질전환 림프구 세포(LCL)를 첨가하는 것을 더 포함 할 수 있다. LCL은 약 6000 내지 10,000 rad의 범위의 감마선으로 조사될 수 있다. 일부 측면에서, LCL 피더 세포는 적당한 양으로, 예를 들어 약 10:1의 LCL 피더 세포 대 초기 T 림프구 비율의 양으로 제공된다.
일부 구현예에서, 항원-특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포와 같은 항원 특이적 T 세포는 항원으로 순수 또는 항원 특이적 T 림프구를 자극함으로써 수득된다. 예를 들어 항원 특이적 T 세포주 또는 클론은 감염된 대상체로부터 T 세포를 분리하고 시험관내에서 동일한 항원으로 세포를 자극함으로써 사이토메갈로바이러스 항원(cytomegalovirus antigen)에 생성될 수 있다.
IⅤ. 약학 조성물 및 제형
일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 제조 공정에 의해 생성된 치료 조성물(예를 들어 치료용 T 세포 조성물), 예를 들어 CD57- T 세포에 대해 농축된 조작된 (재조합 수용체-발현) T 세포를 함유하는 산출 조성물이 여기서 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 제조 방법, 예를 들어 CD27+ T 세포에 대해 농축된 조작된 (재조합 수용체-발현) T 세포를 함유하는 산출 조성물에 의해 생성된 치료 조성물(예를 들어 치료학적 T 세포 조성물)이 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 치료 조성물은 개별 공여자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자로부터의 치료 조성물은 하나 이상의 다른 개별 공여자로부터의 치료 조성물과 조합되어 복수의 상이한 공여자로부터의 치료 조성물을 생성한다. 일부 구현예에서, 치료 조성물은 복수의 상이한 공여자로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 본원에서는 예를 들어 본원에 개시된 하나 이상의 임의의 특징을 갖는 치료 조성물(예를 들어 치료용 T 세포 조성물)이 제공된다. 일부 구현예에서, 재조합 항원 수용체, 예를 들어 CAR 또는 TCR로 조작된 세포를 포함하는 세포의 용량은 약학 조성물 또는 제형와 같은 조성물 또는 제형으로 제공된다. 상기 조성물은, 예를 들어 질환, 병태 및 장애의 예방 또는 치료에서 또는 검출, 진단 및 예후 방법에서 제공된 방법 및/또는 제공된 제조 물품 또는 조성물과 부합되게 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 치료학적 T 세포 조성물은 재조합 수용체를 발현하는 CD4+ T 세포 및 재조합 수용체를 발현하는 CD8+ T 세포를 함유하되, 상기 조성물 중의 총 수용체+/CD8+ 세포의 적어도 80%는 CD57-이고 상기 조성물 중의 총 수용체+/CD4+ 세포의 적어도 80%는 CD57-이다. 일부 구현예에서, 치료학적 T 세포 조성물은 재조합 수용체를 발현하는 CD4+ T 세포 및 재조합 수용체를 발현하는 CD8+ T 세포를 함유하며, 여기서 조성물 중의 총 수용체+/CD8+ 세포의 적어도 80%는 CD27+이고, 조성물 중의 총 수용체+/CD4+ 세포의 적어도 80%는 CD27+이다. 일부 구현예에서, 상기 치료학적 T 세포 조성물은 상기 조성물 중의 세포의 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 85%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 96%, 적어도 (약) 97%, 적어도 (약) 98%, 적어도 (약) 99%, 약 100%, 또는 100%가 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포인 것이다.
일부 구현예에서, 상기 치료학적 T 세포 조성물은 재조합 수용체를 발현하는 CD3+ T 세포를 포함하되, 상기 조성물 중의 총 수용체+/CD3+ 세포의 적어도 80%는 CD57-이다. 일부 구현예에서, 치료학적 T 세포 조성물은 재조합 수용체를 발현하는 CD3+ T 세포를 포함하며, 여기서 조성물 중의 총 수용체+/CD3+ 세포의 적어도 80%는 CD27+이다. 일부 구현예에서, 상기 치료학적 T 세포 조성물은 상기 조성물 중의 세포의 적어도 (약) 80%, 적어도 (약) 85%, 적어도 (약) 90%, 적어도 (약) 95%, 적어도 (약) 96%, 적어도 (약) 97%, 적어도 (약) 98%, 적어도 (약) 99%, 약 100%, 또는 100%가 CD3+ T 세포인 것이다.
일부 구현예에서, 상기 치료학적 T 세포 조성물은 상기 조성물 중의 수용체+/CD4+ T 세포 대 수용체+/CD8+ T 세포의 비율은 약 1:3 내지 약 3:1이고, 예를 들어 (약) 1:1이다.
일부 구현예에서, 상기 재조합 수용체는 섹션 IV.A에서 기술된 임의의 것이다. 일부 구현예에서, 상기 재조합 수용체는 질환, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련되고/되거나, 그에 특이적이고/이거나, 그 위에서 발현된 표적 단백질에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
일부 구현예에서, 제공된 치료학적 조성물 중의 T 세포의 수는 (약) 10×106 세포 내지 (약) 200×106 세포이다. 일부 구현예에서, 제공된 치료학적 조성물 중의 T 세포의 수는 (약) 10×106 세포 내지 (약) 100×106 세포이다. 일부 구현예에서, 제공된 치료학적 조성물 중의 T 세포의 수는 (약) 10×106 세포 내지 (약) 70×106 세포이다. 일부 구현예에서, 제공된 치료학적 조성물 중의 T 세포의 수는 (약) 10×106 세포 내지 (약) 50×106 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 치료학적 조성물 중의 T 세포의 수는 (약) 50×106 세포 내지 (약) 200×106 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 치료학적 조성물 중의 T 세포의 수는 (약) 50×106 세포 내지 (약) 100×106 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 치료학적 조성물 중의 T 세포의 수는 (약) 50×106 세포 내지 (약) 70×106 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 치료학적 조성물 중의 T 세포의 수는 (약) 70×106 세포 내지 (약) 200×106 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 치료학적 조성물 중의 T 세포의 수는 (약) 70×106 세포 내지 (약) 100×106 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 치료학적 조성물 중의 T 세포의 수는 (약) 100×106 세포 내지 (약) 200×106 세포이다. 일부 측면에서, 상기 조성물의 부피는 1.0 mL 내지 10 mL이다. 일부 구현예에서, 상기 부피는 (약) 2 mL, (약) 3 mL, (약) 4 mL, (약) 5 mL, (약) 6 mL, (약) 7 mL, (약) 8 mL, (약) 9 mL, 또는 (약) 10 mL, 또는 전술한 수치의 임의의 값이다.
상기 용어 "약학적 제형"은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 허용하는 형태이고, 상기 제형이 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성이 있는 부가 성분을 함유하지 않는 제형을 지칭한다.
"약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분 이외의 약학적 제형의 성분을 나타내며, 이는 대상체에게 무독성이다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충제, 부형제, 안정제 또는 보존제를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 조작된 T 세포(예를 들어 CAR T 세포)와 같은 세포 요법은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화된다. 일부 구현예에서, 담체의 선택은 부분적으로는, 특정 세포 또는 물질 및/또는 투여 방법에 의해 결정된다. 따라서, 다양한 적합한 제형이 존재한다. 예를 들어 약학 조성물은 보존제를 함유할 수 있다. 적합한 보존제는, 예를 들어 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산나트륨 및 염화벤잘코늄을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 2종 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 그의 혼합물은 통상적으로 총 조성물 중 약 0.0001 중량% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다. 담체는 예를 들어 문헌 「Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)」에 기술되어 있다. 담체는, 예를 들어 문헌 「Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A Ed (1980)」에 기재되어 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로, 사용되는 용량 및 농도에서 수용체에 유독하지 않은 것이며, 인산염, 시트르산염 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제(예를 들어 염화옥타데실디메틸벤질 암모늄; 염화헥사메토늄, 염화벤잘코늄; 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기)의 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 소수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염-형성 카운터-이온; 금속 복합체(예를 들어 Zn-단백질 복합체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 측면에서, 상기 조성물 중에 완충제가 포함된다. 적합한 완충제는, 예를 들어 시트르산, 시트르산나트륨, 인산, 인산칼륨 및 다양한 다른 산 및 염을 포함한다. 일부 측면에서, 2종 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 그의 혼합물은 통상적으로 총 조성물 중 약 0.001 중량% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약학 조성물의 제조 방법이 공지되어 있다. 예시적인 방법이, 예를 들어 문헌 「Remington: Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed(May 1, 2005)」에 더욱 상세히 기재되어 있다.
제형 또는 조성물은 또한, 각각의 활성이 상호 악영향을 미치지 않는 세포 또는 제제에 의해 예방 또는 치료되는 특정 지표, 질환 또는 병태에 유용한 하나 이상의 활성 성분을 함유할 수 있는데, 예를 들어 그 활성은 세포에 상보성이고 및/또는 각각의 활성은 서로 유해한 영향을 주지 않는 것인 하나 이상의 활성 성분이다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 유효한 양으로 조합물 중에 적절히 존재한다. 따라서, 일부 구현예에서, 약학 조성물은 화학치료제, 예를 들어 아스파라기나제, 부술판, 카르보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플로우로우라실, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 빈크리스틴 등과 같은 다른 약학적 활성 제제를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 제제 또는 세포는 염, 예를 들어 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 투여된다. 적합한 약학적으로 허용가능한 산 부가 염은 염산, 브롬화 수소산, 인산, 메타인산, 질산 및 황산과 같은 무기산 및 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 말산, 락트산, 푸마르산, 벤조산, 글리콜 산, 글루콘산, 숙신산 및 아릴술폰산, 예를 들어 p-톨루엔술폰산과 같은 유기산으로부터 유도된 것을 포함한다.
약학 조성물은 일부 구현예에서, 상기 질환 또는 병태의 치료 또는 예방에 유효한 양, 예를 들어 치료적 또는 예방적 유효량의 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 치료 대상체의 주기적 평가에 의해, 치료적 또는 예방적 효능을 모니터링한다. 수일 또는 그 이상에 걸친 반복 투여에 대하여, 질환 상태에 따라, 치료는 원하는 질환 예후에 대한 억제가 나타날 때까지 반복된다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있고 결정될 수 있다. 요망되는 용량은 조성물의 단일 볼루스 투여, 조성물의 다회 볼루스 투여 또는 조성물의 연속 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
세포 또는 제제는 볼루스 주입, 주사, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사, 안내 주사, 눈 주위 주사, 망막하 주사, 유리체내 주사, 경 중격 주사, 공막하 주사, 맥락막내 주사, 전방내 주사, 결막하 주사(subconjectval injection), 결막하 주사(subconjuntival injection), 안각건하 주사, 안구후 주사, 안구 주위 주사 또는 후 방 공막 부근 전달에 의한 임의의 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 그것들은 비경구, 폐내 및 비내, 및 국소 치료가 필요한 경우, 병변내 투여에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 주어진 용량은 세포 또는 제제의 단일 일시 투여에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 그것은 예를 들어 3일 이하의 기간에 걸쳐 세포 또는 제제의 다중 일시 투여에 의해, 또는 세포 또는 제제의 연속 주입 투여에 의해 투여된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투여량은 치료될 질환의 유형, 세포의 유형, 세포 또는 재조합 수용체의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 상기 제제 또는 세포가 예방적 혹은 치료적 목적으로 투여되는지의 여부, 이전 치료, 대상체의 임상 이력 및 상기 제제 또는 세포에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 의존할 수 있다. 조성물은 일부 구체 예에서 한번의 또는 일련의 치료에 걸쳐 대상체에게 적합하게 투여된다.
세포 또는 제제는 표준 투여 기법, 제형 및/또는 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 상기 조성물의 저장 및 투여를 위하여, 제형 및 시린지 및 바이알과 같은 장치가 제공된다. 세포에 관하여, 투여는 자가 또는 이종의 것일 수 있다. 예를 들어 면역반응 세포 또는 전구세포는 하나의 대상체로부터 얻어질 수 있으며, 동일한 대상체 또는 상용 가능한 상이한 대상체에 투여될 수 있다. 말초혈액 유도 면역반응 세포 또는 그의 전구세포(예를 들어 생체내, 생체외 또는 시험관내 유래)는 카테터 투여, 전신 주사, 국소 주사, 정맥내 주사 또는 비경구 투여를 포함하여, 국소 주사를 통해 투여될 수 있다. 치료 조성물(예를 들어 유전자 변형된 면역반응 세포를 함유하는 약학 조성물 또는 신경 독성 증상을 치료하거나 개선하는 제제)의 투여 시, 이는 일반적으로 단위 용량의 주사 가능한 형태(용액, 현탁액, 유제)로 제형화될 것이다.
제형은 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 협측, 설하 또는 좌제 투여용의 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제제 또는 세포 집단은 비경구로 투여된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질 및 복강내 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제 또는 세포 집단은 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의해, 말초 전신 전달을 사용하여, 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은, 일부 측면에서 선택된 pH로 완충될 수 있는 멸균 액체 제조물, 예를 들어 등장성 수용액, 현탁액, 유제, 분산액 또는 점성 조성물로서 제공된다. 액체 제조물은 일반적으로 겔, 다른 점성 조성물 및 고체 조성물보다 제조가 용이하다. 추가로, 액체 조성물은 특히 주사에 의해 투여하기에 다소 편리하다. 한편, 점성 조성물은 특정 조직과의 접촉 시간을 연장하기 위해 적절한 점성 범위 내에서 제형화될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은, 예를 들어 물, 염수, 인산염 완충 염수, 폴리올(예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.
용매, 예를 들어 적절한 담체, 희석제 또는 부형제, 예를 들어 멸균수, 생리 염수, 글루코스, 덱스트로스 등과의 혼합물에 상기 제제 또는 세포를 도입시킴으로써, 멸균 주사용 용액을 제조할 수 있다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균된 것이다. 멸균은, 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
V. 치료 방법
예를 들어 임의의 조작된 세포 또는 여기 기재된 조작된 세포를 함유하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 여기에 제공된다. 일부 측면에서, 임의의 조작된 세포 또는 여기에 기재된 조작된 세포를 함유하는 조성물을 대상체, 예를 들어 질환 또는 장애가 있는 대상체에 투여하는 방법이 또한 제공된다. 일부 측면에서, 질환 또는 장애의 치료를 위한 임의의 조작된 세포 또는 여기에 기재된 조작된 세포를 함유하는 조성물의 용도가 또한 제공된다. 일부 측면에서, 질환 또는 장애의 치료를 위해 약제의 제조를 위한 임의의 조작된 세포 또는 여기에 기재된 조작된 세포를 함유하는 조성물의 용도가 또한 제공된다. 일부 측면에서, 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 또는 질환 또는 장애가 있는 대상체에 투여하기 위한 임의의 조작된 세포 또는 여기에 기재된 조작된 세포를 함유하는 조성물이 또한 제공된다.
입양 세포 요법을 위한 세포의 투여 방법은 공지되어 있으며 제공된 방법 및 조성물과 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어 입양 T 세포 요법 방법은 예를 들어 문헌[미국 특허 출원 공개 번호 2003/0170238(Gruenberg 등); 미국특허 4,690,915(Rosenberg); Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85)]에 기재되어 있다. 예를 들어 문헌 「Themeli 등, (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara 등, (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila 등, (2013) PLoS ONE 8(4): e61338」을 참조한다.
일부 구현예에서, 상기 대상체, 예를 들어 질환 또는 장애를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체는 낮은 또는 감소된 양의 CD57+ T 세포를 갖는 세포 요법을 투여받는다. 특정 구현예에서, 상기 세포 요법 중의 CD57+ 세포의 양 또는 빈도는 투여 전에 측정된다. 특정 구현예에서, 상기 세포 요법은 (약) 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 미만의 CD57+ T 세포를 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 세포 요법 중의 CD57+ 세포의 양 또는 빈도가 측정되고, 상기 세포 요법은 상기 세포가 (약) 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 미만의 CD57+ T 세포를 갖는 경우 상기 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 세포 요법은 (약) 25% 미만의 CD57+ T 세포를 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 세포 요법은 (약) 10% 미만의 CD57+ T 세포를 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 세포 요법은 (약) 임계량 미만의 CD57+ T 세포를 갖는다.
특정 구현예에서, 상기 대상체, 예를 들어 질환 또는 장애를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체는 낮은 또는 감소된 양의 CD57 발현에 대해 양성인 T 세포 또는 대상체는 낮은 또는 감소된 양의 CD57 발현과 관련된 형질(trait)을 갖는 세포 요법을 투여받는다. 일부 구현예에서, 상기 CD57 발현과 관련된 형질은 상기 세포 요법을 대상체에 투여하기 전에 세포 요법의 세포에서 측정된다. 특정 구현예에서, 상기 CD57 발현과 관련된 형질은 상기 세포 요법에서 측정되고, 상기 세포 요법은 상기 세포가 상기 CD57 발현과 관련된 형질의 임계값 미만인 경우 상기 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서, 대상체, 예를 들어 질환 또는 장애를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 CD27- T 세포의 양이 낮거나 감소된 세포 요법이 투여된다. 특정 구현예에서, 세포 요법에서의 CD27- 세포의 양 또는 빈도는 투여 전에 측정된다. 특정 구현예에서, 세포 요법은 (약) 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 미만의 CD27- T 세포를 갖는다. 특정 구현예에서, 세포 요법에서의 CD27- 세포의 양 또는 빈도가 측정되고, 세포 요법은 (약) 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 미만의 CD27- T 세포를 갖는 경우에 세포 요법이 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 요법은 (약) 25% 미만의 CD27- T 세포를 갖는다. 특정 구현예에서, 세포 요법은 (약) 10% 미만의 CD27- T 세포를 갖는다. 특정 구현예에서, 세포 요법은 (약) CD27- T 세포의 임계 양 미만을 갖는다.
특정 구현예에서, 대상체, 예를 들어 질환 또는 장애를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 CD27 발현에 대해 음성인 T 세포의 양이 낮거나 감소된 세포 요법 또는 CD27 발현과 연관된 형질의 양이 높거나 증가된 세포 요법이 투여된다. 일부 구현예에서, CD27 발현과 연관된 형질은 세포 요법을 대상체에게 투여하기 전에 세포 요법의 세포에서 측정된다. 특정 구현예에서, CD27 발현과 연관된 형질은 세포 요법에서 측정되고, 세포 요법이 CD27 발현과 연관된 형질의 임계값 초과를 갖는 경우에 세포 요법은 대상체에게 투여된다.
특정 구현예에서, 상기 임계값은 예비결정된 값이다. 일부 구현예에서, 상기 임계값은 실험적으로 유도된다. 일부 구현예에서, 상기 임계값은 복수의 세포 요법에서 측정된 상기 형질의 평균, 중앙값, 또는 평균값이다. 일부 구현예에서, 상기 임계값은 복수의 세포 요법, 예를 들어 참조 세포 요법의 측정으로부터 실험적으로 유도된다. 일부 구현예에서, 상기 참조 세포 요법은 T 세포의 참조 조성물, 예를 들어 재조합 수용체를 발현하는 T 세포를 포함하는 T 세포 조성물이다. 특정 구현예에서, T 세포, 예를 들어 재조합 수용체를 발현하는 T 세포의 참조 조성물은 대상체에 투여하기 전에 측정된다.
특정 구현예에서, 상기 참조 세포 요법 또는 참조 T 세포 조성물은 동일한 질환, 장애 또는 병태를 치료하기 위해 세포 요법을 받은 대상체의 군으로부터, T 세포, 예를 들어 재조합 수용체를 발현하는 T 세포를 포함하는 상기 세포 요법의 조성물이다. 일부 구현예에서, 참조 세포 요법 또는 참조 T 세포 조성물은 부분 반응 또는 진행성 질환으로 발전하는 대상체에 투여되는 T 세포 조성물이다.
일부 구현예에서, 상기 CD57 발현과 관련된 형질은 총 T 세포, 총 CD4+ T 세포, 또는 총 CD8+ T 세포 중에 존재하는 수준 또는 양이다. 특정 구현예에서, 상기 형질은 상기 용량의 총 T 세포, 총 CD4+ T 세포, 또는 총 CD8+ T 세포 중에 존재하는 CD57 폴리펩티드의 수준 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 형질은 총 T 세포, 총 CD4+ T 세포, 또는 총 CD8+ T 세포의 표면상에 존재하는 CD57 폴리펩티드의 수준 또는 양이다. 다양한 구현예에서, 상기 형질은 총 CD57+ T 세포, 총 CD57+CD4+ T 세포, 또는 총 CD57+CD8+ T 세포의 빈도, 백분율, 또는 양이다. 특정 구현예에서, 상기 형질은 상기 용량의 상기 T 세포 중에 존재하는 CD57 mRNA의 수준 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 형질은 CD57을 암호화하는 유전자의 접근성(B3GAT1)의 수준 또는 양이다.
일부 구현예에서, 상기 CD57 발현과 관련된 형질은 총 CD3+ T 세포 중에 존재하는 수준 또는 양이다. 특정 구현예에서, 상기 형질은 상기 용량의 총 CD3+ T 세포 중에 존재하는 CD57 폴리펩티드의 수준 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 형질은 총 CD3+ T 세포의 표면상에 존재하는 CD57 폴리펩티드의 수준 또는 양이다. 다양한 구현예에서, 상기 형질은 총 CD57+CD3+ T 세포의 빈도, 백분율, 또는 양이다. 특정 구현예에서, 상기 형질은 상기 용량의 상기 T 세포 중에 존재하는 CD57 mRNA의 수준 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 형질은 CD57을 암호화하는 유전자의 접근성(B3GAT1)의 수준 또는 양이다.
특정 구현예에서, 상기 임계값은 복수의 참조 세포 요법 도는 참조 T 세포 조성물에서 CD57 발현과 관련된 형질의 평균, 평균값, 또는 중앙값 측정치, 약 그 측정치, 또는 그 측정치의 75%, 60%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% 이내, 또는 그 미만이다. 상기 양은 상기 형질의 평균, 평균값, 또는 중앙값 측정치 미만인 표준 편차의 1, 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/8, 또는 1/10이다. 특정 구현예에서, 상기 임계값은 복수의 참조 T 세포 조성물 또는 참조 세포 요법로부터의 조성물에서 CD57 발현과 관련된 형질의 최저 측정치 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 임계치는 상기 복수의 참조 T 세포 조성물 또는 참조 세포 요법 중에서 측정된 형질의 최저 측정치의 (약) 50%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% 이내, 또는 1% 미만이다. 특정 구현예에서, 상기 임계값은 상기 참조 T 세포 조성물 또는 참조 세포 요법 중의 빈도로부터 계산된 CD57 발현과 관련된 형질의 평균, 중앙값, 또는 평균값 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 임계값은 복수의 참조 T 세포 조성물로부터 취한 측정치들의 (약), 또는 적어도 25%, 33%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 평균, 중앙값, 또는 평균값 측정치이다.
일부 구현예에서, 상기 CD27 발현과 관련된 형질은 총 T 세포, 총 CD4+ T 세포, 또는 총 CD8+ T 세포 중에 존재하는 수준 또는 양이다. 특정 구현예에서, 상기 형질은 상기 용량의 총 T 세포, 총 CD4+ T 세포, 또는 총 CD8+ T 세포 중에 존재하는 CD27 폴리펩티드의 수준 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 형질은 총 T 세포, 총 CD4+ T 세포, 또는 총 CD8+ T 세포의 표면상에 존재하는 CD27 폴리펩티드의 수준 또는 양이다. 다양한 구현예에서, 상기 형질은 총 CD27- T 세포, 총 CD27-CD4+ T 세포, 또는 총 CD27-CD8+ T 세포의 빈도, 백분율, 또는 양이다. 특정 구현예에서, 상기 형질은 상기 용량의 상기 T 세포 중에 존재하는 CD27 mRNA의 수준 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 형질은 CD27을 암호화하는 유전자의 접근성(B3GAT1)의 수준 또는 양이다.
일부 구현예에서, 상기 CD27 발현과 연관된 형질은 총 CD3+ T 세포 중에 존재하는 수준 또는 양이다. 특정 구현예에서, 상기 형질은 상기 용량의 총 CD3+ T 세포 중에 존재하는 CD27 폴리펩티드의 수준 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 형질은 총 CD3+ T 세포의 표면상에 존재하는 CD27 폴리펩티드의 수준 또는 양이다. 다양한 구현예에서, 상기 형질은 총 CD27-CD3+ T 세포의 빈도, 백분율, 또는 양이다. 특정 구현예에서, 상기 형질은 상기 용량의 상기 T 세포 중에 존재하는 CD27 mRNA의 수준 또는 양이다. 일부 구현예에서, 상기 형질은 CD27을 암호화하는 유전자의 접근성의 수준 또는 양이다.
특정 구현예에서, 상기 임계값은 복수의 참조 세포 요법 도는 참조 T 세포 조성물에서 CD27 발현과 연관된 형질의 평균, 평균값, 또는 중앙값 측정치, 약 그 측정치, 또는 그 측정치의 75%, 60%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% 이상, 또는 그 초과이다. 상기 양은 상기 형질의 평균, 평균값, 또는 중앙값 측정치 초과인 표준 편차의 1, 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/8, 또는 1/10이다. 특정 구현예에서, 상기 임계값은 복수의 참조 T 세포 조성물 또는 참조 세포 요법로부터의 조성물에서 CD27 발현과 연관된 형질의 최저 측정치 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 임계치는 상기 복수의 참조 T 세포 조성물 또는 참조 세포 요법 중에서 측정된 형질의 최고 측정치의 (약) 50%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% 이상, 또는 1% 초과이다. 특정 구현예에서, 상기 임계값은 상기 참조 T 세포 조성물 또는 참조 세포 요법 중의 빈도로부터 계산된 CD27 발현과 연관된 형질의 평균, 중앙값, 또는 평균값 초과이다. 일부 구현예에서, 상기 임계값은 복수의 참조 T 세포 조성물로부터 취한 측정치들의 (약), 또는 적어도 25%, 33%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 평균, 중앙값, 또는 평균값 측정치이다.
특정 구현예에서, CD57 발현과 관련된 상기 형질은 상기 세포 요법을 대상체에 투여하기 전에 상기 세포 요법 중에서 측정된다. 일부 구현예에서, 상기 측정은 대상체가 완전 반응을 경험하지 않을 위험, 확률 또는 가능성을 평가하는데 사용된다. 특정 구현예에서, 상기 측정은 대상체가 세포 요법 투여 후 부분 반응 또는 진행성 질환 결과를 경험할 위험, 확률 또는 가능성을 평가하는데 사용된다. 특정 구현예에서, 상기 대상체는 상기 형질의 값이 상기 형질의 임계값을 초과하는 경우 상기 세포 요법의 투여에 따른 완전 반응을 경험하지 못할 위험, 가능성, 또는 확률이 증가된 것으로 결정된다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 상기 형질의 값이 상기 형질의 임계값을 초과하는 경우 상기 세포 요법의 투여에 따른 부분 반응 또는 진행성 질환을 경험할 증가된 위험, 가능성, 또는 확률을 갖는 것으로 결정된다. 일부 구현예에서, 상기 임계값은 본원에서 기술된 CD57과 관련된 형질의 임의의 임계값이다.
특정 구현예에서, CD27 발현과 관련된 상기 형질은 상기 세포 요법을 대상체에 투여하기 전에 상기 세포 요법 중에서 측정된다. 일부 구현예에서, 상기 측정은 대상체가 완전 반응을 경험하지 않을 위험, 확률 또는 가능성을 평가하는데 사용된다. 특정 구현예에서, 상기 측정은 대상체가 세포 요법 투여 후 부분 반응 또는 진행성 질환 결과를 경험할 위험, 확률 또는 가능성을 평가하는데 사용된다. 특정 구현예에서, 상기 대상체는 상기 형질의 값이 상기 형질의 임계값을 하회하는 경우 상기 세포 요법의 투여에 따른 완전 반응을 경험하지 못할 위험, 가능성, 또는 확률이 증가된 것으로 결정된다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 상기 형질의 값이 상기 형질의 임계값을 하회하는 경우 상기 세포 요법의 투여에 따른 부분 반응 또는 진행성 질환을 경험할 증가된 위험, 가능성, 또는 확률을 갖는 것으로 결정된다. 일부 구현예에서, 상기 임계값은 본원에서 기술된 CD27과 관련된 형질의 임의의 임계값이다.
일부 구현예에서, 상기 세포 요법의 투여 후 완전 반응을 달성하지 못할 위험이 증가된 것으로 간주되는 대상체는 상기 세포 요법의 용량의 투여 후 (약) 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15% 10% 미만, 또는 10% 미만의 빈도를 갖는 완전 반응을 달성하게 된다. 일부 구현예에서, 완전 반응을 달성하지 못할 위험이 증가된 것으로 간주되는 대상체는 상기 세포 요법의 용량의 투여 후 (약) 20% 미만의 빈도를 갖는 완전 반응을 달성하게 된다. 다양한 구현예에서, 완전 반응을 달성하지 못할 위험이 증가된 것으로 간주되는 대상체는 상기 세포 요법의 용량의 투여 후 (약) 0%의 빈도를 갖는 완전 반응을 달성하게 된다.
특정 구현예에서, 상기 세포 요법의 투여 후 부분 반응 또는 진행성 질환 결과를 달성할 위험이 증가된 것으로 간주되는 대상체는 상기 세포 요법의 용량의 투여 후 (약) 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 미만, 또는 10% 미만의 빈도를 갖는 완전 반응을 달성하게 된다. 다양한 구현예에서, 상기 세포 요법의 투여 후 부분 반응 또는 진행성 질환 결과를 달성할 위험이 증가된 것으로 간주되는 대상체는 상기 세포 요법의 용량의 투여 후 20% 미만의 빈도를 갖는 완전 반응을 달성하게 된다. 다양한 구현예에서, 상기 세포 요법의 투여 후 부분 반응 또는 진행성 질환 결과 반응을 달성할 위험이 증가된 것으로 간주되는 대상체는 상기 세포 요법의 용량의 투여 후 (약) 0%의 빈도를 갖는 완전 반응을 달성하게 된다.
특정 구현예에서, 완전 반응을 달성하지 못할 위험이 증가된 것으로 간주되는 대상체는 예를 들어 대상체가 완전 반응을 달성하기 위해 계속할 가능성 또는 확률을 개선하기 위해 증가된 용량의 세포 요법을 받는다. 일부 구현예에서, 부분 반응 또는 진행성 질환 결과를 달성할 위험이 증가된 것으로 간주되는 대상체는 예를 들어 대상체가 완전 반응을 달성하기 위해 계속 진행할 가능성 또는 확률을 개선하기 위해 증가된 용량의 세포 요법을 받는다.
치료되는 질환 또는 병태는 항원의 발현이 질환 상태 또는 장애의 병인과 관련되고 및/또는 이를 수반하고, 예를 들어 그러한 질환, 병태, 또는 장애를 일으키거나, 악화시키거나, 그렇지 않으면 수반한다. 예시적인 질환 및 상태는 세포의 악성종양 또는 형질전환(예를 들어 암), 자가 면역 또는 염증성 질환, 또는 감염성 질환과 연관된 질환 또는 병태를 포함할 수 있고, 예를 들어 박테리아, 바이러스, 또는 다른 병원체에 의해 발생한다. 치료될 수 있는 다양한 질환 및 상태와 관련된 항원을 포함하는 예시적인 항원은 앞서 서술된다. 특정 구현예에서, 키메릭 항원 수용체 또는 트랜스제닉 TCR은 질환 또는 병태와 관련된 항원에 특이적으로 결합한다. 질환 중에, 상태 및 장애는 고형 종양, 혈액 악성 종양 및 흑색종을 포함하는 종양 및 국소 및 전이성 종양을 포함하고, 전이성 종양, 바이러스 또는 다른 병원체, 예를 들어 HIV, HCV, HBV, CMV, HPV, 및 기생충 질환으로 감염된 것과 같은 감염성 질환, 및 자가면역 및 염증성 질환을 포함하는 종양이다.
일부 구현예에서, 상기 질환, 장애 또는 상태는 종양, 암, 악성 종양, 신생물, 또는 다른 증식성 질환 또는 장애이다. 그러한 질환은 백혈병, 림프종, 예를 들어 급성 골수(또는 골수성) 백혈병(AML), 만성 골수(또는 골수성) 백혈병(CML), 급성 림프구(또는 림프구성) 백혈병(ALL), 만성 림프구 백혈병(CLL), 털세포 백혈병(HCL), 작은 림프구 림프종(SLL), 맨틀 세포 림프종(MCL), 한계 영역 림프종, 버킷 림프종, 호지킨 림프종(HL), 비-호지킨 림프종(NHL), 퇴행성 거대세포 림프종(ALCL), 여포성 림프종, 불응성 여포성 림프종, 확산성 거대 B- 세포 림프종(DLBCL) 및 다발성 골수종(MM)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 상기 질환 또는 병태는 급성 림프모구 백혈병(ALL), 성인 ALL, 만성 림프모구 백혈병 (CLL), 비-호지킨 림프종(NHL) 및 확산성 거대 B-세포 림프종(DLBCL) 중으로부터 선택된 B 세포 악성 종양이다. 일부 구현예에서, 상기 질환 또는 병태는 NHL이고, NHL은 공격적인 NHL, 확산성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), NOS(무통으로부터 de novo 및 형질전환된), 1차 종격동 거대 B 세포 림프종(PMBCL), T 세포/조직세포-농축 거대 B 세포 림프종(TCHRBCL), 버킷 림프종, 맨틀 세포 림프종(MCL) 및/또는 여포성 림프종(FL), 선택적으로, 여포성 림프종 3B(FL3B)로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 질환 또는 병태는 바이러스성, 레트로바이러스성, 박테리아성, 및 원생동물 감염, 면역 결핍, 사이토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 아데노바이러스, BK 폴리오마바이러스와 같은 감염성 질환 또는 병태이다. 일부 구현예에서, 상기 질환 또는 병태는 자가 면역 또는 염증성 질환 또는 병태, 예를 들어 관절염, 예를 들어 류마티스 관절염(RA), 제 1형 당뇨병, 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 염증성 장 질환, 건선, 경피증, 자가면역 갑상선 질환, 그레이브병, 크론병, 다발성 경화증, 천식 및/또는 이식과 관련된 질환 또는 병태이다.
일부 구현예에서, 상기 질환 또는 장애와 관련된 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 인테그린), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산탈수효소 9(CA9, 또한 CAIX 또는 G250로 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2로 공지됨), 암태아성 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 절단된 표피 성장 인자 단백질(tEGFR), III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5, 또한 Fc 수용체 유사 5 또는 FCRH5로 공지됨), 태아성 아세틸콜린 수용체(태아성 AchR), 폴레이트 결합 단백질(FBP), 폴레이트 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화된 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 커플링된 수용체 5D(GPCR5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-멜라노마-연관 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복 함유 8 패밀리 멤버 A(LRRC8A), 루이스 Y, 멜라노마-연관 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 온코페탈 항원, 멜라노마의 우선 발현된 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 세포영양막 당단백(TPBG, 또한 5T4로 공지됨), 종양-연관 당단백 72(TAG72), 티로시나제 관련된 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75라고도 알려짐), 티로시나제 관련된 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토머라제(dopachrome tautomerase), 도파크롬 델타-이소머라제(dopachrome delta-isomerase) 또는 DCT라고도 알려짐), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 윌름스 종양 1(WT- 1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원, 또는 유니버설 태그로 연관된 항원, 및/또는 비오틴화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자이거나 또는 그들을 포함한다. 일부 구현예에서 수용체에 의해 표적화된 항원은 다수의 공지된 B 세포 마커의 하나와 같은 B 세포 악성 종양과 연관된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나 또는 그를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항원은 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원, 예를 들어 바이러스성 항원(예를 들어 HIV, HCV, HBV 등으로부터 바이러스성 항원), 박테리아성 항원, 및/또는 기생충 항원이이거나 또는 그를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어 scFv 또는 VH 도메인)은 CD19와 같은 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 CD19에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에서 유래하거나 이의 변이체이다. 일부 구현예에서, 세포 치료, 예를 들어 입양 T 세포 치료는 자가 전달에 의해 수행되고, 여기서 세포는 세포 치료를 받을 대상체, 또는 그러한 대상체로부터 유래된 샘플로부터 분리 및/또는 그렇지 않으면 준비된다. 따라서, 일부 측면에서, 세포는 치료를 필요로 하는 대상체, 예를 들어 환자로부터 유래되고, 분리 및 처리 후 동일한 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서, 세포 요법, 예를 들어 입양 T 세포 요법은 동종이계 이식에 의해 수행되고, 여기서 세포는 세포 요법을 받을 대상체 또는 궁극적으로 받은 대상체 이외의 적어도 1명의 공여자, 예를 들어 개별 공여자 또는 복수의 공여자로부터 분리되고/되거나 달리 제조된다. 이러한 구현예에서, 세포는 이어서 동일한 종의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 개별 공여자 또는 복수의 공여자 및 대상체는 유전적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 개별 공여자 또는 복수의 공여자 및 대상체는 유전적으로 유사하다. 일부 구현예에서, 대상체는 개별 공여자 또는 복수의 공여자와 동일한 HLA 클래스 또는 슈퍼타입을 발현한다.
일부 구현예에서, 세포 요법, 예를 들어 입양 T 세포 요법은 동종이계 이식에 의해 수행되고, 여기서 세포는 세포 요법을 받을 대상체 또는 궁극적으로 받은 대상체 이외의 적어도 1명의 공여자, 예를 들어 개별 공여자 또는 복수의 상이한 공여자로부터 분리되고/되거나 달리 제조된다. 이러한 구현예에서, 세포는 이어서 개별 공여자 또는 복수의 공여자와 동일한 종의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체에게 투여된 세포는 대상체로부터 유래되지 않는다. 일부 구현예에서, 대상체에게 투여된 세포의 적어도 일부는 대상체로부터 유래되지 않는다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자 중 적어도 2개는 서로 유전적으로 동일하지 않다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자 중 적어도 2개는 서로 유전적으로 유사하지 않다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자 중 적어도 2개는 서로 동일한 HLA 클래스 또는 슈퍼타입을 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자 중 적어도 하나는 대상체와 유전적으로 동일하지 않다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자 중 적어도 하나는 대상체와 유전적으로 유사하지 않다. 일부 구현예에서, 복수의 상이한 공여자 중 적어도 하나는 대상체와 동일한 HLA 부류 또는 슈퍼타입을 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 개별 공여자는 대상체와 유전적으로 동일하지 않다. 일부 구현예에서, 개별 공여자는 대상체와 유전적으로 유사하지 않다. 일부 구현예에서, 개별 공여자는 대상체와 동일한 HLA 부류 또는 슈퍼타입을 발현하지 않는다.
세포는 볼루스 주입, 주사, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사, 안구내 주사, 눈주위(periocular) 주사, 망막하 주사, 유리체내 주사, 트랜스-경막 주사, 공막하 주사, 맥락막내 주사, 전방내 주사, 결막하(subconjectval, subconjuntival) 주사, 서브-테논 주사, 안구후 주사, 안구주위(peribulbar) 주사, 또는 후배엽 전달에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 그들은 비경구, 폐내 및 비강 내, 및 국소 치료를 위해 필요한 경우, 병변내 투여에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 주어진 용량은 세포의 단일 일시 투여에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 그것은 예를 들어 3 일 이하의 기간에 걸쳐 세포의 다중 일시 투여에 의해, 또는 세포의 연속 주입 투여에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 용량의 투여 또는 임의의 추가 치료, 예를 들어 림프구 마비 치료, 중재 치료 및/또는 병용 치료는 외래 환자 전달을 통해 수행된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투여량은 치료될 질환의 유형, 세포 또는 재조합 수용체의 타입, 질환의 중증도 및 과정, 세포가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 치료, 대상체의 임상 이력 및 세포에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 의존할 수 있다. 조성물 및 세포는 일부 구체 예에서 한번의 또는 일련의 치료에 걸쳐 대상체에게 적합하게 투여된다.
일부 구현예에서, 세포는 조합 치료의 일부로서, 예를 들어 동시에 또는 순차적으로, 임의의 순서로, 다른 치료적 개입, 예를 들어 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 제제, 예를 들어 세포독성 또는 치료제가 투여된다. 일부 구현예에서 세포는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 또는 다른 치료적 개입과 관련하여 동시에 또는 임의의 순서로 동시에 투여된다. 일부 상황에서, 세포는 세포 집단이 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 향상시키도록 또는 그 반대의 시간에 충분히 근접한 다른 치료와 공동-투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 제제는 예를 들어 지속성을 향상시키기 위해, IL-2와 같은 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 화학요법 제제의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 예를 들어 투여 전에 종양 부담을 감소시키기 위해, 화학요법 제제, 예를 들어 처리 화학요법 제제의 투여를 포함한다.
일부 측면에서 면역결핍(예를 들어 림프구결핍) 치료를 가진 전처리 대상체는 입양 세포 치료(ACT)의 효과를 개선시킬 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 치료의 개시 전에 대상체에 전처리 제제, 예를 들어 림프구 마비 또는 화학요법 제제, 예를 들어 사이클로포스파마이드, 플루다라빈, 또는 그의 조합을 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어 대상체는 세포 치료의의 개시 적어도 2일 전, 예를 들어 적어도 3, 4, 5, 6 또는 7 일 전 전처리 제제를 투여받는다. 일부 구현예에서, 대상체는 세포 치료의 개시 7 일 이하 전, 예를 들어 6, 5, 4, 3 또는 2일 이하 이전에 전처리 제제를 투여받는다.
일부 구현예에서, 대상체는 20 mg/kg 내지 100 mg/kg 또는 약 20 mg/kg 내지 100 mg/kg, 예를 들어 40 mg/kg 내지 80 mg/kg 또는 약 40 mg/kg 내지 80 mg/kg의 용량으로 사이클로포스파마이드로 전처리된다. 일부 측면에서, 대상체는 60 mg/kg 또는 약 60 mg/kg의 사이클로포스파마이드로 전처리된다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파마이드는 단일 용량으로 투여될 수 있거나, 매일, 격일로 또는 3 일 마다 주어진 것과 같은 복수의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파마이드는 1일 또는 2일 동안 1일 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 림프구 마비 제제가 사이클로포스파마이드를 포함하는 경우, 대상체는 사이클로포스파마이드를 100 mg/m2내지 500 mg/m2또는 약 100 mg/m2내지 500 mg/m2, 예를 들어 200 mg/m2 내지 400 mg/m2 또는 250 mg/m2 내지 350 mg/m2 또는 약 200 mg/m2 내지 400 mg/m2 또는 약 250 mg/m2 내지 350 mg/m2의 용량으로 투여된다. 일부 예시에서, 대상체는 약 300 mg/m2 의 사이클로포스파마이드로 투여된다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파마이드는 단일 용량으로 투여될 수 있거나, 매일, 격일로 또는 3 일 마다 주어진 것과 같은 복수의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파마이드는 1일 내지 5 일 동안, 예를 들어 3 일 내지 5 일 동안과 같이, 매일 투여된다. 일부 경우에, 대상체는 세포 치료의 개시 전에 3 일 동안 매일 약 300 mg/m2의 사이클로포스파마이드를 투여받는다.
일부 구현예에서, 림프구 마비 제제가 플루다라빈을 포함하는 경우, 대상체는 1 mg/m2 내지 100 mg/m2 또는 약 1 mg/m2 and 100 mg/m2, 예를 들어 10 mg/m2 내지 75 mg/m2, 15 mg/m2 내지 50 mg/m2, 20 mg/m2 내지 40 mg/m2, 또는 24 mg/m2 내지 35 mg/m2, 또는 약 10 mg/m2 내지 75 mg/m2, 15 mg/m2 내지 50 mg/m2, 20 mg/m2 내지 40 mg/m2, 또는 24 mg/m2 내지 35 mg/m2의 용량으로 플루다라빈을 투여받는다. 일부 예시에서, 대상체는 약 30 mg/m2의 플루다라빈을 투여받을 수 있다. 일부 구현예에서, 플루다라빈은 단일 용량으로 투여될 수 있거나, 매일, 격일로 또는 3 일 마다 주어진 것과 같은 복수의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 플루다라빈은 1일 내지 5 일 동안, 예를 들어 3 일 내지 5 일 동안과 같이, 매일 투여된다. 일부 경우에, 대상체는 세포 치료의 개시 전에 3 일 동안 매일 약 30 mg/m2의 플루다라빈을 투여받는다.
일부 구현예에서, 림프구 마비 제제는 제제의 조합, 예를 들어 사이클로포스파마이드 및 플루다 라빈의 조합을 포함한다. 따라서, 제제의 조합은 앞서 기재된 바와 같은 임의의 용량 또는 투여 스케쥴에서 사이클로포스파마이드 및 앞서 기재된 바와 같은 임의의 용량 또는 투여 스케쥴에서 플루다라빈을 포함할 수 있다. 예를 들어 일부 측면에서, 대상체는 1차 또는 후속 용량 전에 60 mg/kg (~ 2 g/m2)의 사이클로포스파마이드 및 3회 내지 5 회 용량의 25 mg/m2 플루다라빈을 투여받는다.
세포의 투여 후, 일부 구현예에서 조작된 세포 집단의 생물학적 활성은 예를 들어 임의의 다수의 공지 된 방법에 의해 측정된다. 평가하는 파라미터는 생체 내, 예를 들어 영상화, 또는 생체 외, 예를 들어 ELISA 또는 유세포 분석에 의해 조작된 또는 천연 T 세포 또는 다른 면역 세포의 항원에 대한 특이 적 결합을 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 세포가 표적 세포를 파괴하는 능력은 예를 들어 Kochenderfer 등, J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), 및 Herman 등, J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004) 에서 서술된 세포독성 분석과 같은 적합한 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포의 생물학적 활성은 CD107a, IFNγ, IL-2 및 TNF와 같은 하나 이상의 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 분석함으로써 측정된다. 일부 측면에서, 생물학적 활성은 종양 부담 또는 부하 감소와 같은 임상 결과를 평가함으로써 측정된다.
특정 구현예에서, 조작된 세포는 임의의 수의 방식으로 추가로 변형되어, 그의 치료 또는 예방 효능이 증가된다. 예를 들어 집단에 의해 발현된 조작된 CAR 또는 TCR은 링커를 통해 표적 부분에 직접 또는 간접적으로 컨쥬게이션될 수 있다. 표적 부분에 대한 적화합물, 예를 들어 CAR 또는 TCR을 컨쥬게이션시키는 관행은 공지되어 있다. 예를 들어 Wadwa 등, J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995), 및 미국특허 5,087,616 참고.
일부 구현예에서, 세포는 조합 치료의 일부로서, 예를 들어 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 시약, 예를 들어 세포 독성제 또는 치료제와 같은 다른 치료적 개입과 동시에 또는 순차적으로 임의의 순서로와 같이 조합 치료의 일부로서 투여된다. 일부 구현예에서 세포는 하나 이상의 추가 치료제 또는 다른 치료 개입과 관련하여 어떤 순서로든 동시에 또는 순차적으로 공동-투여된다. 일부 상황에서, 상기 세포들은, 충분히 가까운 시간에 또 다른 요법과 공동-투여되어, 세포 집단은 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 향상시키거나 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 제제는 예를 들어 지속성을 향상시키기 위해 IL-2와 같은 사이토카인을 포함한다.
A. 투여
일부 구현예에서, 세포의 용량은 제공된 방법, 및/또는 제조 또는 조성물의 제공된 물품에 따라 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 용량의 크기 또는 시기는 대상체에서 특정 질환 또는 병태의 함수로서 결정된다. 일부 경우에, 제공된 설명의 관점에서 특정 질환에 대한 용량의 크기 또는 시기는 경험적으로 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 항원 수용체, 예를 들어 CAR 또는 TCR로 조작된 세포를 포함하는 세포의 용량은 조성물 또는 제제, 예를 들어 제약 조성물 또는 제제로서 제공된다. 이러한 조성물은 제공된 방법에 따라, 및/또는 질환, 병태, 및 장애의 예방 또는 치료에서, 또는 검출, 진단, 및 예후 방법에서와 같이 제공된 제조품 또는 조성물과 함께 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포의 용량은 2×105 개의 세포/kg 내지 2×106 개의 세포/kg 또는 약 2×105 개의 세포/kg 내지 2×106 개의 세포/kg, 예를 들어 4×105 개의 세포/kg 내지 1×106 개의 세포/kg 또는 약 4×105 개의 세포/kg 내지 1×106 개의 세포/kg 또는 6×105 개의 세포/kg 내지 8×105 개의 세포/kg 또는 약 6×105 개의 세포/kg 내지 8×105 개의 세포/kg를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 2×105 대상체의 킬로그램 체중 당 세포(예를 들어 항원-발현, 예를 들어 CAR- 발현 세포)(세포/kg) 이하, 예를 들어 3×105 개의 세포/kg 또는 약 3×105 개의 세포/kg 이하, 4×105 개의 세포/kg 또는 약 4×105 개의 세포/kg 이하, 5×105 개의 세포/kg 또는 약 5×105 개의 세포/kg 이하, 6×105 개의 세포/kg 또는 약 6×105 개의 세포/kg 이하, 7×105 개의 세포/kg 또는 약 7×105 개의 세포/kg 이하, 8×105 개의 세포/kg 또는 약 8×105 개의 세포/kg 이하, 9×105 개의 세포/kg 또는 약 9×105 개의 세포/kg 이하, 1×106 개의 세포/kg 또는 약 1×106 개의 세포/kg 이하, 또는 2×106 개의 세포/kg 또는 약 2×106 개의 세포/kg 이하를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 적어도 2×105 대상체의 킬로그램 체중 당 세포(예를 들어 항원-발현, 예를 들어 CAR- 발현 세포)(세포/kg) 또는 적어도 약 2×105 개의 세포/kg 또는 2×105 개의 세포/kg 또는 2×105 개의 세포/kg, 예를 들어 적어도 3×105 개의 세포/kg 또는 적어도 약 3×105 개의 세포/kg 또는 3×105 개의 세포/kg 또는 3×105 개의 세포/kg, 적어도 4×105 개의 세포/kg 또는 적어도 약 4×105 개의 세포/kg 또는 4×105 개의 세포/kg 또는 4×105 개의 세포/kg, 적어도 5×105 개의 세포/kg 또는 적어도 약 5×105 개의 세포/kg 또는 5×105 개의 세포/kg 또는 5×105 개의 세포/kg, 적어도 6×105 개의 세포/kg 또는 적어도 약 6×105 개의 세포/kg 또는 6×105 개의 세포/kg 또는 6×105 개의 세포/kg, 적어도 7×105 개의 세포/kg 또는 적어도 약 7×105 개의 세포/kg 또는 7×105 개의 세포/kg 또는 7×105 개의 세포/kg, 적어도 8×105 개의 세포/kg 또는 적어도 약 8×105 개의 세포/kg 또는 8×105 개의 세포/kg 또는 8×105 개의 세포/kg, 적어도 9×105 개의 세포/kg 또는 적어도 약 9×105 개의 세포/kg 또는 9×105 개의 세포/kg 또는 9×105 개의 세포/kg, 적어도 1×106 개의 세포/kg 또는 적어도 약 1×106 개의 세포/kg 또는 1×106 개의 세포/kg 또는 1×106 개의 세포/kg, 또는 적어도 2×106 개의 세포/kg 또는 적어도 약 2×106 개의 세포/kg 또는 2×106 개의 세포/kg 또는 2×106 개의 세포/kg를 포함한다.
특정 구현예에서, 세포, 또는 세포의 서브-타입의 개별 집단은 약 100만 내지 약 1000억개의 세포의 범위 및/또는 체중의 킬로그램 당 세포의 양, 예를 들어 100만 내지 약 500억개의 세포(예를 들어 약 500만개의 세포, 약 1000만개의 세포, 약 1500만개의 세포, 약 2000만개의 세포, 약 2500만개의 세포, 약 5억개의 세포, 약 10억개의 세포, 약 50억개의 세포, 약 200억개의 세포, 약 300억개의 세포, 약 400억개의 세포, 또는 2개의 앞선 값 중 하나에 의해 정의된 범위), 예를 들어 약 1000만 내지 1000억개의 세포(예를 들어 약 2000만개의 세포, 약 3000만개의 세포, 약 4000만개의 세포, 약 6000만개의 세포, 약 7000만개의 세포, 약 8000만개의 세포, 약 9000만개의 세포, 약 100억개의 세포, 약 250억개의 세포, 약 500억개의 세포, 약 750억 개의개의 세포, 약 900억개의 세포, 또는 2개의 앞선 값 중 하나에 의해 정의된 범위), 및 일부 경우에, 약 1억 내지 약 500억개의 세포(예를 들어 약 1억 2000만개의 세포, 약 2억 5000만개의 세포, 약 3억 5000만개의 세포, 약 4억 5000만개의 세포, 약 6억 5000만개의 세포, 약 8억개의 세포, 약 9억개의 세포, 약 30억개의 세포, 약 300억개의 세포, 약 450억개의 세포, 또는 2개의 앞선 값 중 하나에 의해 정의된 범위) 또는 그들 범위 사이 및/또는 체중의 킬로그램 당에서 임의의 값으로 대상체에 투여된다. 투여량은 질환 또는 장애 및/또는 환자 및/또는 다른 치료에 특이적인 속성에 의존하여 다양할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포의 용량은 세포의 용량이 대상체의 신체 표면적 또는 중량에 결속되지 않거나 이를 기반으로 하지 않도록 세포의 일정한 용량 또는 세포의 고정된 용량이다.
일부 구현예에서, 예를 들어 대상체가 인간인 경우, 용량은 약 5×108 개 미만 총 재조합 수용체(예를 들어 CAR)-발현 세포, T 세포, 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMs), 예를 들어 2×106, 5×106, 1×107, 5×107, 또는 1×108 개 또는 총 그러한 세포와 같은, 약 1×106 내지 1×108 개 세포의 범위, 또는 상기 중 임의의 2개 사이 범위에서 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 조작 세포의 용량은 (약) 1×105 내지 5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×105 내지 2.5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×105 내지 1×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×105 내지 5×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×105 내지 2.5×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×105 내지 1×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×105 내지 5×106 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×105 내지 2.5×106 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×105 내지 1×106 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×106 내지 5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×106 내지 2.5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×106 내지 1×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×106 내지 5×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×106 내지 2.5×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×106 내지 1×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×106 내지 5×106 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×106 내지 2.5×106 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5×106 내지 5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5×106 내지 2.5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5×106 내지 1×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5×106 내지 5×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5×106 내지 2.5×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5×106 내지 1×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5×106 내지 5×106 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5×106 내지 5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5×106 내지 2.5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5×106 내지 1×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5×106 내지 5×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5×106 내지 2.5×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5×106 내지 1×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×107 내지 5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×107 내지 2.5×108개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×107 내지 1×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×107 내지 5×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×107 내지 2.5×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5×107 내지 5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5×107 내지 2.5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5×107 내지 1×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5×107 내지 5×107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5×107 내지 5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5×107 내지 2.5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5×107 내지 1×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×108 내지 5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1×108 내지 2.5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 또는 2.5×108 내지 5×108 개의 전체 CAR-발현 T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 조작 세포의 용량은 적어도 (약) 1×105 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 2.5×105 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 5×105 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 1×106 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 2.5×106 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 5×106 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 1×107 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 2.5×107 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 5×107 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 1×108 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 2.5×108 개의 CAR-발현 세포, 또는 적어도 (약) 5×108 개의 CAR-발현 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 요법은 (약) 1×105 내지 5×108 개의 전체 재조합 수용체-발현 세포, 전체 T 세포, 또는 전체 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 수, (약) 5×105 내지 1×107 개의 전체 재조합 수용체-발현 세포, 전체 T 세포, 또는 전체 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 수, 또는 (약) 1×106 내지 1×107 개의 전체 재조합 수용체-발현 세포, 전체 T 세포, 또는 전체 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 수를 포함하는 용량의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포 요법은 적어도 (약) 1×105 개의 전체 재조합 수용체-발현 세포, 전체 T 세포, 또는 전체 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 수를 포함하는 세포 용량의 투여를 포함하는데, 예를 들어 적어도 (약) 1×106 개, 적어도 (약) 1×107 개, 적어도 (약) 1×108 개의 그러한 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 수는 CD3+ 또는 CD8+의 전체 수에 관한 것이며, 일부 경우, 재조합 수용체-발현 (예를 들어 CAR+) 세포에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 세포 요법은 (약) 1×105 내지 5×108 개의 CD3+ 또는 CD8+ 전체 T 세포 또는 CD3+ 또는 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포, (약) 5×105 내지 1×107 개의 CD3+ 또는 CD8+ 전체 T 세포 또는 CD3+ 또는 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포, 또는 (약) 1×106 내지 1×107 개의 CD3+ 또는 CD8+ 전체 T 세포 또는 CD3+ 또는 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포수를 포함하는 용량의 투여를 포함한다. 일 부 구현예에서, 상기 세포 요법은, (약) 1×105 내지 5×108 개의 전체 CD3+/CAR+ 또는 CD8+/CAR+ 세포, (약) 5×105 내지 1×107 개의 전체 CD3+/CAR+ 또는 CD8+/CAR+ 세포, 또는 (약) 1×106 내지 1×107 개의 전체 CD3+/CAR+ 또는 CD8+/CAR+ 세포수를 포함하는 용량의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 용량의 T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어 대상체가 인간인 경우, 용량은 약 1×106 내지 5×108 개의 총 재조합 수용체(예를 들어 CAR)-발현 CD8+ T 세포, 예를 들어 1×107, 2.5×107, 5×107, 7.5×107, 1×108, 또는 5×108 개의 총 그러한 세포와 같은, 약 5×106 내지 1×108 그러한 세포의 범위, 또는 2개 앞선 값 중 임의의 사이 범위에서 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 다중 용량으로 투여되고, 각각의 용량 또는 총 용량은 앞선 값 중 임의의 범위 내에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 각각 포함하여, 1×107 내지 0.75×108 또는 약 1×107 내지 0.75×108의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포, 1×107 내지 2.5×107 또는 약 1×107 내지 2.5×107 의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포, 1×107 내지 0.75×108개 또는 약 1×107 내지 0.75×108의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 1×107, 2.5×107, 5×107 7.5×107 또는 1×108 또는 약 1×107, 2.5×107, 5×107 7.5×107, 1×108, 또는 5×108 개의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 재조합 수용체-발현 T 세포의 용량은 단일 용량으로서 대상체에 투여되거나 2주, 1달, 3달, 6달, 1년 이상의 기간 내에 오직 1회 투여된다.
입양 세포 치료의 경우, 주어진 "용량"의 투여는 단일 조성물로서 세포의 주어진 양 또는 수의 투여 및/또는 단일 중단없는 투여, 예를 들어 단일 주사 또는 연속 주입으로서를 포함하고, 또한, 특정된 기간, 예를 들어 3일 이하에 걸쳐, 다중 개별 조성물 또는 주입으로 제공된, 분할 용량 또는 복수의 조성물로서 세포의 주어진 양 또는 수의 투여를 포함한다. 따라서, 일부 상황에서, 용량은 단일 시점에 제공되거나 개시되는 세포의 특정 수의 단일 또는 연속 투여이다. 그러나, 일부 상황에서, 용량은 3 일 이하, 예를 들어 3 일 동안 또는 2 일 동안 하루에 한번에 걸쳐 다중 주사 또는 주입으로, 또는 단일 기간에 걸쳐 다중 주입에 의해 투여된다.
따라서, 일부 측면에서, 용량의 세포는 단일 약학적 조성물에서 투여된다. 일부 구현예에서, 용량의 세포는 용량의 세포를 총괄적으로 함유하는, 복수의 조성물에서 투여된다.
일부 구현예에서, 용어 "분할 용량"은 1 일 초과에 걸쳐 투여되도록 분할된 용량을 가리킨다. 용량의 이러한 타입은 본 방법에 포함되고 단일 용량으로 간주된다.
따라서, 세포의 용량은 분할 용량, 예를 들어 시간에 걸쳐 투여되는 분할 용량으로서 투여될 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, 용량은 2 일에 걸쳐 또는 3 일에 걸쳐 대상체에 투여될 수있다. 분할 투여를 위한 예시적인 방법은 첫째날에 용량의 25%를 투여하고 둘째날에 용량의 나머지 75%를 투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 용량의 33%는 첫째날에 투여될 수 있고 나머지 67%는 둘째날에 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 용량의 10%는 첫째날에 투여되고, 용량의 30%는 둘째 날에 투여되고, 용량의 60%는 셋째날에 투여된다. 일부 구현예에서, 분할 용량은 3 일 초과에 걸쳐 퍼지지 않는다.
일부 구현예에서, 용량의 세포는 용량의 일부 세포를 각각 함유하는, 선택적으로 보다 많은, 제 1 및 제 2와 같은, 복수의 조성물 또는 용액의 투여에 의해 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 상이한 집단 및/또는 세포의 서브-타입을 각각 함유하는, 복수의 조성물은 선택적으로, 특정 기간 내에, 별도로 또는 독립적으로 투여된다. 예를 들어 세포의 집단 또는 서브-타입은 각각 CD8+ 및 CD4+ T 세포, 및/또는 각각 CD8+ 및 CD4+ 농축된 집단, 예를 들어 재조합 수용체를 발현시키기 위해 유전자 조작된 세포를 각각 개별적으로 포함하는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 용량의 투여는 CD8+ T 세포의 용량 또는 CD4+ T 세포의 용량을 포함하는 제 1 조성물의 투여 및 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 다른 용량을 포함하는 제 2 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 조성물 또는 용량의 투여, 예를 들어 복수의 세포 조성물의 투여는 별도로 세포 조성물의 투여를 포함한다. 일부 측면에서, 별도 투여는 임의의 순서로, 동시에, 또는 순차적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 용량은 제 1 조성물 및 제 2 조성물을 포함하고, 제 1 조성물 및 제 2 조성물은 0 내지 12 시간 간격, 0 내지 6 시간 간격 또는 0 내지 2 시간 간격으로 투여된다. 일부 구현예에서, 제 1 조성물의 투여의 개시 및 제 2 조성물의 투여의 개시는 2 시간 이하, 1 시간 이하, 또는 30 분 이하 간격, 15 분 이하, 10 분 이하 또는 5 분 이하 간격으로 수행된다. 일부 구현예에서, 제 1 조성물의 투여 개시 및/또는 완료 및 제 2 조성물의 투여 완료 및/또는 개시는 2 시간 이하, 1 시간 이하, 또는 30 분 이하 간격, 15 분 이하, 10 분 이하 또는 5 분 이하 간격으로 수행된다.
일부 구현예에서, 제 1 조성물, 예를 들어 용량의 제 1 조성물은 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 조성물에서, 제 1 조성물, 예를 들어 용량의 제 1 조성물은 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 조성물은 제 2 조성물 이전에 투여된다.
일부 구현예에서, 세포의 용량 또는 조성물은 재조합 수용체를 발현하는 CD4+ 세포 대 재조합 수용체를 발현하는 CD8+ 세포 및/또는 CD4+ 세포 대 CD8+ 세포의 정의된 또는 표적 비율을 포함하고, 이러한 비는 선택적으로, 약 1:1 또는 약 1:3 내지 약 3:1, 예를 들어 약 1:1이다. 일부 측면에서, 상이한 세포 집단의 표적 또는 원하는 비(예를 들어 CD4+:CD8+ 비 또는 CAR+CD4+:CAR+CD8+ 비, 예를 들어 1:1)로 조성물 또는 용량의 투여는 하나의 집단을 함유하는 세포 조성물의 투여 후 다른 집단을 포함하는 별도 세포 조성물의 투여를 포함하고, 여기서, 투여는 표적 또는 원하는 비로 또는 약 표적 또는 원하는 비로 있다. 일부 측면에서, 한정된 비율로 세포의 용량 또는 조성물의 투여는 T 세포 치료의 증폭, 지속성 및/또는 항종양 활성을 개선시킨다.
일부 구현예에서, 대상체는 세포의 다중 용량, 예를 들어 2 회 이상 용량 또는 다중 연속 용량을 받는다. 일부 구현예에서, 2 가지 용량이 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체는 제 1 용량 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일 후 투여되는, 연속 용량, 예를 들어 제 2 용량을 받는다. 일부 구현예에서, 다중 연속 용량은 추가 용량 또는 용량이 연속 용량의 투여 후 투여되도록, 제 1 용량 후에 투여된다. 일부 측면에서, 추가 용량으로 대상체에 투여되는 세포의 수는 제 1 용량 및/또는 연속 용량과 동일하거나 유사하다. 일부 구현예에서, 추가 용량 또는 용량들은 이전 용량 보다 더 크다.
일부 측면에서, 제 1 및/또는 연속 용량의 크기는 이전 치료, 예를 들어 화학요법에 대한 대상체의 반응, 종양 부하, 벌크, 크기, 또는 정도, 범위, 또는 전이의 타입, 단계와 같은 대상체에서 질환 부담, 및/또는 독성 결과를 발생시키는 대상체의 가능성 또는 발생률, 예를 들어 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경독성 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응과 같은, 하나 이상의 기준에 기반하여 결정된다.
일부 측면에서, 제 1 용량의 투여 및 연속 용량의 투여 사이의 시간은 약 9 내지 약 35 일, 약 14 내지 약 28 일, 또는 15 내지 27 일이다. 일부 구현예에서, 연속 용량의 투여는 제 1 용량의 투여 후 약 14 일 초과 및 약 28 일 미만의 시점에 있다. 일부 측면에서, 제 1및 연속 용량 사이의 시간은 약 21일이다. 일부 구현예에서, 추가 용량 또는 용량들, 예를 들어 연속 용량은 연속 용량의 투여 후 투여된다. 일부 측면에서, 추가 연속 용량 또는 용량들은 이전 용량의 투여 후 적어도 약 14 일 및 약 28 일 미만에 투여된다. 일부 구현예에서, 추가 용량은 이전 용량 후 약 14 일 미만, 예를 들어 이전 용량 후 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13 일에 투여된다. 일부 구현예에서, 용량은 이전 용량 후 약 14 일 미만으로 투여되지 않고 및/또는 용량은 이전 용량 후 약 28 일 초과로 투여되지 않는다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 재조합 수용체-발현 세포의 용량은 T 세포의 제 1 용량 및 T 세포의 연속 용량을 포함하는 2 가지 용량(예를 들어 이중 용량)을 포함하고, 여기서 제 1 용량 및 제 2 용량 중 하나 또는 둘다는 T 세포의 분할 용량의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포의 용량은 질환 부담을 감소시키는데 효과적일 정도로 충분히 일반적으로 크다.
일부 구현예에서, 세포는 원하는 용량으로 투여되는데, 이는 일부 측면에서 세포 또는 세포 타입(들)의 원하는 용량 또는 수 세포 타입(들)의 원하는 비율을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서 세포의 용량은 세포의 총 수(또는 체중 kg 당 수) 및 개별 집단 또는 서브-타입의 원하는 비, 예를 들어 CD4+ 대 CD8+ 비율을 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 개별 집단 또는 개별 세포 타입에서 세포의 원하는 총 수(또는 체중 kg 당 수)를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 투여 량은 개별 집단에서 총 세포의 원하는 수, 원하는 비, 및 세포의 원하는 총 수와 같은, 그러한 특징의 조합에 기반한다.
일부 구현예에서, CD8+ 및 CD4+ T 세포와 같은 세포의 집단 또는 서브-타입은 T 세포의 원하는 용량과 같은, 총 세포의 원하는 용량의 허용된 차이로 또는 그의 내에 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 세포의 원하는 수 또는 세포가 투여되는 대상체의 체중의 단위 당 세포의 원하는 수, 예를 들어 cells/kg이다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 최소 세포수 또는 체중의 단위 당 세포의 최소 수이거나 그 이상이다. 일부 측면에서, 원하는 용량으로 투여된 총 세포 중에서, 개별 집단 또는 서브-타입은 원하는 산출 비(예를 들어 CD4+ 대 CD8+ 비), 예를 들어 그러한 비의 특정 허용된 차이 또는 오차 범위 내에 있거나 그 근처이다.
일부 구현예에서, 세포는 CD4+ 세포의 원하는 용량 및/또는 CD8+ 세포의 원하는 용량과 같은, 세포의 하나 이상의 개별 집단 또는 서브-타입의 원하는 용량의 허용된 차이에서 또는 그 내에서 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 서브-타입 또는 집단의 세포의 원하는 수, 또는 세포가 투여되는 대상체의 체중의 단위당 그러한 세포의 원하는 수, 예를 들어 세포/kg이다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 집단 또는 서브-타입의 세포의 최소 수 또는 체중의 단위 당 집단 또는 서브-타입의 세포의 최소 수이거나 그 이상이다.
따라서, 일부 구현예에서, 투여량은 총 세포의 원하는 고정된 용량 및 원하는 비에 기반하고/하거나 하나 이상, 예를 들어 개별 서브-타입 또는 서브-집단 각각의 원하는 고정된 용량에 기반한다. 따라서, 일부 구현예에서, 투여량은 T 세포의 원하는 고정된 또는 최소 투여 및 CD4+ 대 CD8+ 세포의 원하는 비에 기반하고/하거나 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포의 원하는 고정된 또는 최소 투여에 기반한다.
일부 구현예에서, 세포는 복수의 세포 집단 또는 서브-타입, 예를 들어 CD4+ 및 CD8+ T 세포 또는 서브-타입의 원하는 산출 비의 허용 범위 내에서 또는 그 범위 내에서 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 비는 특정 비일 수 있거나 비의 범위일 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, 원하는 비(예를 들어 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비)는 5:1 또는 약 5:1 또는 5:1 또는 약 5:1 사이(또는 약 1:5 초과 및 약 5:1 미만)이고, 또는 1:3 또는 약 1:3 또는 3:1 또는 약 3:1 사이(또는 약 1:3 초과 및 약 3:1 미만), 예를 들어 2:1 또는 약 2:1 또는 1:5 또는 약 1:5 사이(또는 약 1:5 초과 및 약 2:1 미만), 예를 들어 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9: 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, 또는 1:5, 또는 약 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9: 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, 또는 1:5이다. 일부 측면에서, 허용되는 차이는 원하는 비의 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50% 이내이고, 이들 범위 사이의 임의의 값을 포함한다.
특정 구현예에서, 세포의 수 및/또는 농도는 재조합 수용체(예를 들어 CAR)-발현 세포의 수를 가리킨다. 다른 구현예에서, 세포의 수 및/또는 농도는 투여되는 모든 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 수 또는 농도를 가리킨다.
일부 측면에서, 용량의 크기는 이전 치료, 예를 들어 화학요법에 대한 대상체의 반응, 종양 부하, 벌크, 크기, 또는 정도, 범위, 또는 전이의 타입, 단계와 같은 대상체에서 질환 부담, 및/또는 독성 결과를 발생시키는 대상체의 가능성 또는 발생률, 예를 들어 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경독성 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응과 같은, 하나 이상의 기준에 기반하여 결정된다.
일부 구현예에서, 또한, 방법은 키메릭 항원 수용체(CAR) 및/또는 림프구 마비 치료를 발현하는 하나 이상의 추가 용량의 세포를 투여하는 단계를 포함하고 /하거나 상기 방법의 하나 이상의 단계가 반복된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 용량은 초기 용량과 동일하다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 용량은 초기 용량과 상이하며, 예를 들어 초기 용량에 비해 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 이상 보다 높은 것과 같이, 보다 높거나, 예를 들어 초기 용량에 비해, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 이하 보다 낮은 것과 같이, 보다 낮다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 용량의 투여는 초기 치료 또는 임의이 이전 치료에 대한 대상체의 반응, 종양 부하, 벌크, 크기, 또는 정도, 범위, 또는 전이의 타입, 단계와 같은 대상체에서 질환 부담, 및/또는 독성 결과를 발생시키는 대상체의 가능성 또는 발생률, 예를 들어 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경독성 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응에 기반하여 결정된다.
VI. 제조 물품 및
키트
또한 상기 제공된 방법을 수행하는 데 유용한 제조 물품, 시스템, 장치, 및 키트가 제공된다. 또한, (i) CD57, CD3, CD4 및/또는 CD8에 특이적인 세포의 면역 친화도-기반 선택을 위한 하나 이상의 시약; 및 (ii) 본원에서 기술된 임의의 방법을 수행하기 위한 상기 하나 이상의 시약의 사용을 위한 지침;을 포함하는 제조 물품이 제공된다.
또한, (i) CD57, CD3, CD4 및/또는 CD8에 특이적인 세포의 면역친화도-기반 선택을 위한 하나 이상의 시약; (ii) TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 자극 시약; 및 (iii) 본원에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위한 하나 이상의 시약의 사용에 대한 지침을 포함하는 제조 물품이 제공된다.
임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 면역친화도-기반 선택을 위한 시약은 CD57, CD3, CD4 또는 CD8에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이거나 이를 포함한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 면역친화도-기반 선택을 위한 시약은 CD57에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이거나 이를 포함한다. 임의의 이러한 구현예 중 일부에서, 항체는 자기 입자 상에 고정화되거나 친화도 크로마토그래피 매트릭스 상에 고정화되거나 이에 부착된다.
또한, (i) CD27, CD3, CD4 및/또는 CD8에 특이적인 세포의 면역친화도-기반 선택을 위한 하나 이상의 시약; 및 (ii) 본원에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위한 하나 이상의 시약의 사용에 대한 지침을 포함하는 제조 물품이 제공된다.
또한, (i) CD27, CD3, CD4 및/또는 CD8에 특이적인 세포의 면역친화도-기반 선택을 위한 하나 이상의 시약; (ii) TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 자극 시약; 및 (iii) 본원에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위한 하나 이상의 시약의 사용에 대한 지침을 포함하는 제조 물품이 제공된다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 면역 친화도-기반 선택을 위한 상기 시약은 CD27, CD3, CD4 및/또는 CD8에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이거나 또는 그를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 면역 친화도-기반 선택을 위한 상기 시약은 CD27에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이거나 또는 그를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 항체는 자성 입자 위에 고정되거나 또는 친화도 크로마토그래피 매트릭스 위에 고정되거나 또는 거기에 부착된다.
임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 자극 시약은, (i) TCR 복합체의 멤버에 특이적으로 결합하고, 선택적으로 CD3에 특이적으로 결합하는 1차 제제 및 (ii) T 세포 공자극 분자에 특이적으로 결합하는 2차 제제를 함유하며, 선택적으로 상기 공자극 분자는 CD28, CD137(4-1-BB), OX40 또는 ICOS로부터 선택된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 1차 및 2차 제제 중의 하나 또는 둘 다는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 1차 및 2차 제제 중의 하나 또는 둘 다는 항체를 포함하되, 선택적으로 상기 자극 시약은 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 사용한 인큐베이션을 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 1차 제제 및 2차 제제는 고체 지지체의 표면에 존재하거나 또는 부착된다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 고체 지지체는 비드, 선택적으로 상자성 비드이거나 또는 그를 포함한다. 임의의 상기 구현예들 중의 일부에서, 상기 1차 제제 및 2차 제제는 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하는 올리고머 입자 시약의 표면에 가역적으로 결합된다.
또한 (i) 본원에서 기술된 임의의 조성물; 및 (ii) 상기 조성물을 대상체에 투여하기 위한 지침;을 포함하는 제조 물품이 제공된다.
일부 구현예에서, 제조 물품 또는 키트는 하나 이상의 용기, 전형적으로 복수의 용기, 패킹 재료(packaging material), 및 상기 용기(들) 및/또는 패키징 상의 또는 그와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함하되, 일반적으로는 사용을 위한 지침, 예를 들어 특정 세포의 면역 친화도-기반 선택, 예를 들어 CD57, CD3, CD4 및/또는 CD8을 발현하는 세포의 양성 또는 음성 선택을 위한 지침, 및 본원에서 제공된 임의의 방법을 수행하는, 예를 들어 T 세포를 조작하여 조성물, 예를 들어 세포 요법용 치료학적 조성물을 생성하기 위한 지침을 포함한다. 일부 구현예에서, 제조 물품 또는 키트는 하나 이상의 용기, 전형적으로 복수의 용기, 패킹 재료, 및 상기 용기(들) 및/또는 패키징 상의 또는 그와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함하되, 일반적으로는 사용을 위한 지침, 예를 들어 특정 세포의 면역 친화도-기반 선택, 예를 들어 CD27, CD3, CD4 및/또는 CD8을 발현하는 세포의 양성 또는 음성 선택을 위한 지침, 및 본원에서 제공된 임의의 방법을 수행하는, 예를 들어 T 세포를 조작하여 조성물, 예를 들어 세포 요법용 치료학적 조성물을 생성하기 위한 지침을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 제공된 제조 물품은 예를 들어 제조 공정의 하나 이상의 단계에서 세포의 자극 및/또는 배양을 위한 시약, 예를 들어 섹션 II 및 섹션 III의 임의의 단계에서 기술된 임의의 시약을 함유한다.
또한 재조합 수용체를 발현하는 조작된 세포 또는 그의 조성물, 예를 들어 본원에서 제공된 방법을 사용하여 생성되는 것, 및 선택적으로 사용을 위한 지침, 예를 들어 투여를 위한 지침을 함유하는 제조 물품 및 키트가 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 지침은 세포 요법을 받기 전에 대상체가 반응할 가능성이 있거나 의심되는 경우 및/또는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 재조합 수용체를 발현하는 조작된 세포의 투여 후 반응의 정도 또는 수준을 평가하기 위한 지침을 제공하거나 방법을 특정한다. 일부 측면에서, 상기 제조 물품은 조작된 세포의 용량 똔느 조성물을 함유할 수 있다.
본원에서 제공된 제조 물품은 패키징 물질을 함유한다. 제공된 재료를 패키징하는데 사용되는 패키징 물질은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어 그 내용 전체가 본원에 인용된 미국특허 제5,323,907호, 제5,052,558호 및 제5,033,252호를 참조한다. 패키징 물질의 예에는 블리스터 팩, 병, 튜브, 흡입기, 펌프, 백, 바이알, 컨테이너, 주사기, 일회용 실험실 용품, 예를 들어 피펫 팁 및/또는 플라스틱 플레이트 또는 병이 포함되나 이에 국한되지 않는다. 제조 물품 또는 키트는 재료의 분배를 용이하게 하거나 고처리량 또는 대규모 방식으로 사용을 용이하게 하기 위한, 예를 들어 로봇 장비에서의 사용을 용이하게 하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 전형적으로, 패키징은 그 안에 함유된 조성물과 반응하지 않는다.
일부 구현예에서, 세포 조성물은 별도로 포장된다. 일부 구현예에서, 각 컨테이너는 단일 구획을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 제조 물품 또는 키트의 다른 성분은 개별적으로 또는 단일 구획에 함께 포장된다.
VII. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용되는 분야의 모든 용어, 표기 및 다른 기술적 및 과학적 용어 또는 전문용어는 청구 대상이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에서, 일반적으로 이해되는 의미의 용어는 본 명세서에서 명확성 및/또는 용이한 참조를 위해 정의되며, 본 명세서에 이러한 정의가 포함된 경우에는 반드시, 당업계에서 일반적으로 이해되는 것 이상의 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명에서 사용되는바, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 분명히 다르게 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 예를 들어 "a" 또는 "an"은 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미한다. 본 발명에서 기술된 측면 및 변형은 측면들 및 변형들"로 이루어지는" 및/또는 "필수적으로 그로 이루어지는"을 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서에 걸쳐, 청구된 주제의 다양한 측면이 범위 형식으로 제시된다. 범위 형식에서의 설명은 편의상 및 간략화를 위한 것이며 청구된 주제의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안됨을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 설명은 가능한 모든 하위 범위 및 그 범위 내의 개별적인 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어 값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 개재된 값 및 언급된 범위 내 임의의 언급된 또는 개재된 값이 청구된 주제 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이들과 같은 보다 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로보다 더욱 작은 범위에 포함될 수 있으며, 기술된 범위 내에서 특별히 배제된 한계에 따라 청구된 대상 내에 포함된다. 명시된 범위가 하나의 한계 또는 두 한계를 포함하는 경우, 포함된 한계들 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위는 청구 대상에 포함된다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
본 발명에서 사용되는 "약"이라는 용어는 쉽게 알려진 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 나타낸다. 본 발명에서 어떠한 값 또는 파라미터와 관련한 "약"의 언급은 그 값 또는 매개 변수 자체에 대한 구현예를 포함(및 설명)한다. 예를 들어 "약 X"을 언급하는 설명은 "X"에 대한 설명을 포함한다. 특정 구현예에서, "약 X"는 상기 X의 ±25%, ±10%, ±5%, ±2%, ±1%, ±0.1%, 또는 ±0.01%의 값을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는바, 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치가, 기재된 서열, 예를 들어 서열 목록에 기재된 서열 내 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치"에 대응한다"는 것은, 표준 정렬 알고리즘, 예를 들어 GAP 알고리즘을 사용하여 상기 기재된 서열과 상동성을 최대화하는 정렬시 확인된 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치를 말한다. 서열을 정렬시킴으로써, 상응하는 잔기는 예를 들어 보존된 아미노산 잔기 및 동일한 아미노산 잔기를 가이드로서 사용하여 확인될 수 있다. 일반적으로, 대응하는 위치를 확인하기 위해, 가장 높은 정도의 매치가 얻어지도록 아미노산 서열을 정렬한다[예를 들어 문헌 「Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New.Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo 등, (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073」 참조].
본 발명에 사용되는바, 용어 "벡터"는 그것이 연결된 다른 핵산을 전파시킬 수 있는 핵산 분자를 말한다. 상기 용어는 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈에 혼입된 벡터뿐만 아니라 자기 복제 핵산 구조로서의 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그들이 작동적으로 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터를 본 발명에서는 "발현 벡터"라 지칭한다. 벡터 중에는 레트로바이러스, 예를 들어 감마레트로바이러스 및 렌티 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터가 있다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양체"는 상호교환적으로 사용되며, 이러한 세포의 자손을 포함하여 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하는데, 여기에는 최초의 형질전환된 세포 및 계대의 수에 관계없이 그로부터 유도된 자손이 포함된다. 자손은 핵산 함량이 부모 세포와 완전히 동일하지는 않을 수 있고, 돌연변이를 포함할 수 있다. 본래의 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본 발명에 포함된다.
본 발명에서 사용되는 바, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "양성"이라는 설명은 특정 마커, 통상 표면 마커의, 세포 상의 또는 세포내의 검출 가능한 존재를 말한다. 표면 마커를 언급할 때, 이 용어는 유세포 분석에 의하여 검출되는, 예를 들어 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 검출되는 표면 발현의 존재를 말하는데, 여기서 상기 염색은, 다른 것은 동일한 조건 하에 이소형-매치된 대조군으로 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색을 실질적으로 초과하는 수준에서, 및/또는 상기 마커에 대하여 양성이라고 알려진 세포에 대한 것과 실질적으로 유사한 수준에서, 및/또는 상기 마커에 대하여 음성이라고 알려진 세포에 대한 것보다 실질적으로 더 높은 수준에서 유세포 분석에 의하여 검출 가능하다.
본 발명에서 사용되는 바, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "음성"이라는 설명은 특정 마커, 통상 표면 마커의, 세포 상에 또는 세포내의 실질적인 검출 가능한 존재의 부재를 말한다. 표면 마커를 언급할 때, 이 용어는 유세포 분석에 의하여 검출되는, 예를 들어 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 검출되는 표면 발현의 부재를 말하는데, 여기서 상기 염색은, 다른 것은 동일한 조건 하에 이소형-매치된 대조군으로 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색을 실질적으로 초과하는 수준에서 유세포 분석에 의하여 검출되지 않고, 및/또는 상기 마커에 대하여 양성이라고 알려진 세포에 대한 것보다 실질적으로 낮은 수준에서, 및/또는 상기 마커에 대하여 음성이라고 알려진 세포에 대한 것과 실질적으로 유사한 수준에서 유세포 분석에 의하여 검출된다.
본 발명에서 사용되는바, 아미노산 서열(레퍼런스 폴리펩티드 서열)에 대해 사용되는 경우, "백분율(%) 아미노산 서열 상동성" 및 "백분율 상동성"은, 서열들과, 최대치의 백분율 서열 상동성을 얻기 위하여 필요하다면 도입되는 갭을 정렬한 후, 상기 기준 폴리펩티드 서열 내 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열(예를 들어 대상 항체 또는 단편) 내 아미노산 잔기의 백분율로서 정의되며, 상기 서열 상동성의 일부로서 어떠한 보존적 치환은 고려하지 않는다. 백분율 아미노산 서열 상동성을 결정하는 목적을 위한 서열정렬은 다양한 방식, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈리안(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공중이 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 적절히 결정할 수 있다.
아미노산 치환은 폴리펩티드에서 하나의 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비보존적 아미노산 치환일 수 있다. 아미노산 치환은 관심있는 결합 분자, 예를 들어 항체에 도입될 수 있고, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
아미노산은 일반적으로 하기의 통상적인 측쇄 형질에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe
일부 구현예에서, 보존적 치환은 상기 클래스 중 하나의 구성원을 같은 클래스의 다른 구성원으로 교환하는 것을 수반할 수 있다. 일부 구현예에서, 비보존적 아미노산 치환은 상기 클래스 중 하나의 구성원을 다른 클래스로 교환하는 것을 수반할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 '조성물'은 세포를 포함한, 둘 이상의 생성물, 물질, 또는 화합물의 임의의 혼합물을 지칭한다. 그것은 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비-수성 또는 그들의 임의의 조합물일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 '대상체'는 포유동물, 인간 또는 기타 동물, 전형적으로는 인간이다.
VIII. 예시적인
구현예
상기 제공된 구현예 중에는 하기의 것들이 있다:
1. 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은:
(a) 복수의 상이한 공여자들로부터 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 수득하는 단계, 각각의 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 포함하되, 상기 T 세포는 재조합 수용체로 유전자 조작된 T 세포를 포함함; 및
(b) 상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 조합하여 공여자 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 단계;
를 포함하는, 방법.
2. 구현예 1에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은:
(i) 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계; 및
(ii) 상기 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산을 CD57 고갈된 세포 집단 내로 도입하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 단계;
를 포함하는 방법에 의해 생성되는, 방법.
3. 구현예 2에 있어서,
상기 단계 (ii) 전에, 상기 방법은 CD57 고갈된 T 세포 집단을 상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극하는 것을 포함하는, 방법.
4. 구현예 2 또는 3에 있어서,
상기 방법은 (iii) 상기 조작된 T 세포 조성물의 세포를 상기 도입 후 최대 96시간 동안, 선택적으로 (약) 37℃±2℃의 온도에서, 인큐베이션하는 단계를 더 포함하는, 방법.
5. 구현예 4에 있어서,
상기 인큐베이션은, 상기 인큐베이션 개시시의 세포의 수와 비교하여, 상기 세포가 증폭되지 않거나 실질적으로 증폭되지 않는 조건 하에 수행되는, 방법.
6. 구현예 2 또는 3에 있어서,
상기 방법은 (iii) 상기 조작된 T 세포 조성물의 세포를 상기 조성물 내의 T 세포의 증폭을 위한 조건 하에 배양하는 단계를 더 포함하는, 방법.
7. 구현예 2 내지 6 중의 어느 하나에 있어서,
CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하는 단계는:
(1) (a) T 세포 마커(들)에 대해 표면 양성인 세포 및 (b) 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 세포 중의 하나를 선택하고, 그에 의해서 농축된 세포 집단을 생성하는 단계; 및
(2) 상기 농축된 세포 집단으로부터, (a) T 세포 마커(들)에 대해 표면 양성인 세포 및 (b) CD57- 세포 중의 다른 것에 대해 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
를 포함하는, 방법.
8. 구현예 7에 있어서,
상기 T 세포 마커(들)는 CD3인, 방법.
9. 구현예 7 또는 8에 있어서,
상기 T 세포 마커(들)는 CD4인, 방법.
10. 구현예 7 내지 9 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포 마커(들)는 CD8인, 방법.
11. 구현예 7 내지 10 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포 표면 마커(들)는 CD4 및 CD8인, 방법.
12. 구현예 1 내지 11 중의 어느 하나에 있어서,
상기 방법은, 상기 방법의 단계들 중의 하나 이상 전에 또는 동안에 상기 CD57 고갈된 집단 및/또는 상기 조작된 T 세포 조성물의 T 세포에서, (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex; MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(T cell receptor; TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(T cell receptor alpha constant; TRAC);의 발현을 녹아웃(knocking out)시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
13. 구현예 1 내지 12 중의 어느 하나에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물의 T 세포는 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC)의 발현에 대해 녹아웃(K0)된, 방법.
14. 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은,
(a) 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
(b) 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단을 유전자 조작하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 단계, 상기 유전자 조작은,
(1) 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포에서, (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(T cell receptor alpha constant; TRAC);의 발현을 녹아웃(knocking out)하는 단계; 및
(2) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산을 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 내로 도입하는 단계, 선택적으로 상기 이종 핵산은 내인성 MHC 또는 그의 성분 및/또는 내인성 TCR 또는 그의 성분에 대해 암호화하는 유전자의 유전자 좌 내로 삽입되고;
를 포함하며, 상기 단계 (1)에서의 녹아웃 및 상기 단계 (2)에서의 도입은 어느 순서로든 동시에 또는 연속적으로 수행됨;
(c) 복수의 상이한 공여자들에 대해 상기 단계 (a) 및 (b)를 반복하여 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 생산하는 단계, 각각의 공여자 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 세포로부터 생성됨; 및
(d) 상기 복수의 상이한 개별 공여자로부터 상기 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 조합하여 공여자 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 단계;
를 포함하는, 방법.
15. 구현예 1 내지 14 중의 어느 하나에 있어서,
상기 방법은 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 중 각각에 대해 반복되는, 방법.
16. 구현예 1 내지 15 중의 어느 하나에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 상기 조합 전에 동결 보존되고 해동되는, 방법.
17. 구현예 1 내지 16 중의 어느 하나에 있어서,
상기 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 75% 초과의 CD3+/CD57- 세포, (약) 80% 초과의 CD3+/CD57- 세포, (약) 85% 초과의 CD3+/CD57- 세포, (약) 90% 초과의 CD3+/CD57- 세포, 또는 (약) 95% 초과의 CD3+/CD57- 세포를 포함하는, 방법.
18. 구현예 1 내지 17 중의 어느 하나에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 독립적으로 (약) 40% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포, (약) 45% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포, (약) 50% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포, (약) 55% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포, (약) 55% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포, (약) 60% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포, (약) 65% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포 또는 (약) 70% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포, 선택적으로 (약) 40% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포, (약) 45% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포, (약) 50% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포, (약) 55% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포, (약) 55% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포, (약) 60% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포, (약) 65% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포 또는 (약) 70% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 포함하는, 방법.
19. 구현예 1 내지 18 중의 어느 하나에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
20. 구현예 19에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 (약) 1:5 내지 (약) 5:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
21. 구현예 19에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 (약) 1:3 내지 (약) 3:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
22. 구현예 12 내지 21 중의 어느 하나에 있어서,
상기 녹아웃 전에, 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단을 상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극하는 단계를 더 포함하는, 방법.
23. 구현예 12 내지 22 중의 어느 하나에 있어서,
상기 녹아웃 및 상기 이종 핵산의 도입은 동시에 수행되는, 방법.
24. 구현예 12 내지 22 중의 어느 하나에 있어서,
상기 녹아웃 및 상기 이종 핵산의 도입은 어느 순서로든 연속적으로 수행되는, 방법.
25. 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은:
(1) 복수의 상이한 공여자들 유래 공여자 샘플로부터 (a) T 세포 마커(들)에 대해 표면 양성인 세포 및 (b) CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 세포 중의 하나에 대해 선택하고, 그에 의해서 농축된 세포 집단을 생성하는 단계; 및
(2) 상기 농축된 세포 집단으로부터, (a) 상기 T 세포 마커(들)에 대해 표면 양성인 세포 및 (b) CD57- 세포 중의 다른 하나를 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
를 포함하는, 방법.
26. 구현예 25에 있어서,
상기 공여자 샘플은 상기 복수의 상이한 공여자들 유래 세포를 포함하는 풀링된 샘플이고, 그에 의해서 상기 방법은 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생산하는, 방법.
27. 구현예 25에 있어서,
상기 공여자 샘플은 개별 공여자 유래 샘플이고, 상기 단계 (1) 및 (2)는 상기 복수의 상이한 공여자들 유래 공여자 샘플 각각에 대해 별도로 반복되고, 그에 의해서 상기 방법은 각각의 개별 공여자에 대해 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생산하는, 방법.
28. 구현예 27에 있어서,
상기 방법은 각각의 개별 공여자에 대한 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단을 함께 조합하여 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생산하는 단계를 더 포함하는, 방법.
29. 구현예 25 내지 28 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포 마커(들)는 CD3인, 방법.
30. 구현예 25 내지 29 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포 마커(들)는 CD4인, 방법.
31. 구현예 25 내지 30 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포 마커(들)는 CD8인, 방법.
32. 구현예 25 내지 31 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포 표면 마커(들)는 CD4 및 CD8인, 방법.
33. 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은 공여자 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 선택하는 단계, 여기서 상기 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자들 유래 인간 T 세포에 대해 농축된 풀링된 세포 집단임, 그에 의해서 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
34. 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은:
(a) 공여자 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 선택하는 단계, 여기서 상기 공여자 샘플은 공여자 샘플로부터의 인간 T 세포에 대해 농축됨, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
(b) 복수의 상이한 개별 공여자들에 대해 상기 단계 (a)를 반복하는 단계; 및
(c) 각각의 개별 공여자로부터의 각각의 CD57 고갈된 T 세포 집단을 조합하여, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
를 포함하는, 방법.
35. 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은 공여자 샘플로부터 T 세포에 대해 선택하는 단계, 여기서 상기 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자들 유래 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포에 대해 농축된 풀링된 세포 집단임, 그에 의해서 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
36. 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은:
(a) 공여자 샘플로부터 T 세포에 대해 선택하는 단계, 여기서 상기 공여자 샘플은 개별 공여자 유래 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포에 대해 농축됨, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
(b) 복수의 상이한 공여자들에 대해 상기 단계 (a)를 반복하는 단계; 및
(c) 각각의 개별 공여자로부터의 각각의 CD57 고갈된 T 세포 집단을 조합하여, 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
를 포함하는, 방법.
37. 구현예 33 내지 36 중의 어느 하나에 있어서,
인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 CD3+ T 세포에 대해 선택함으로써 수득되는, 방법.
38. 구현예 33 내지 37 중의 어느 하나에 있어서,
인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포에 대해 선택함으로써 수득되는, 방법.
39. 구현예 33 내지 38 중의 어느 하나에 있어서,
인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 (약) 85% 초과의 CD3+ T 세포를 포함하는, 방법.
40. 구현예 33 내지 39 중의 어느 하나에 있어서,
인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 (약) 90% 초과의 CD3+ T 세포를 포함하는, 방법.
41. 구현예 33 내지 40 중의 어느 하나에 있어서,
인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 (약) 95% 초과의 CD3+ T 세포를 포함하는, 방법.
42. 구현예 33 내지 41 중의 어느 하나에 있어서,
인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
43. 구현예 42에 있어서,
인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 (약) 1:5 내지 (약) 5:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
44. 구현예 42에 있어서,
인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 (약) 1:3 내지 (약) 3:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
45. 구현예 33 내지 44 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포에 대해 선택하는 단계는 CD3+ T 세포에 대해 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
46. 구현예 33 내지 45 중의 어느 하나에 있어서,
상기 세포에 대해 선택하는 단계는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포에 대해 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
47. 구현예 33 내지 46 중의 어느 하나에 있어서,
CD57- 인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 CD57- T 세포에 대해 선택함으로써 수득되는, 방법.
48. 구현예 27 내지 32, 34 및 36 내지 47 중의 어느 하나에 있어서,
(a) 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포는 (i) 내인성 주요 조직적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC);의 발현을 위해 녹아웃(KO)되고/되거나;
(b) 상기 방법은 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포에서 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 TRAC;의 발현을 녹아웃시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
49. 구현예 26 및 28 내지 47 중의 어느 하나에 있어서,
(a) 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포는 (i) 내인성 주요 조직적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC);의 발현을 위해 녹아웃(KO)되고/되거나;
(b) 상기 방법은 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포에서 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC);의 발현을 녹아웃시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
50. 구현예 27 내지 32, 34 및 36 내지 48 중의 어느 하나에 있어서,
(a) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드는 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 내로 도입되고/되거나;
(b) 상기 방법은 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 내로 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 더 포함하고,
그에 의해서 상기 방법은 조작된 T 세포 조성물을 생성하는, 방법.
51. 구현예 26, 28 내지 47 및 49 중의 어느 하나에 있어서,
(a) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드는 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 내로 도입되고/되거나;
(b) 상기 방법은 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 내로 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 더 포함하고,
그에 의해서 상기 방법은 조작된 T 세포 조성물을 생성하는, 방법.
52. 구현예 50 또는 51에 있어서,
상기 녹아웃 및 상기 이종 핵산의 도입은 동시에 수행되는, 방법.
53. 구현예 50 또는 51에 있어서,
상기 녹아웃 및 상기 이종 핵산의 도입은 어느 순서로든 연속적으로 수행되는, 방법.
54. 구현예 48 내지 53 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조합은, 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포가 녹아웃되고/되거나 상기 이종 핵산에 도입되기 전에 수행되는, 방법.
55. 구현예 48 내지 53 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조합은, 상기 CD57 고갈된 T 세포의 세포가 녹아웃되고/되거나 상기 이종 핵산에 도입된 후에 수행되는, 방법.
56. 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은,
(i) 공여자 샘플로부터 (a) CD3에 대해 표면 양성(CD3+)이거나, 또는 CD4 및/또는 CD8에 대해 표면 양성(CD4+ 및/또는 CD8+)인 세포 및 (b) CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 세포 중의 하나에 대해 선택하고, 그에 의해서 농축된 세포 집단을 생성하는 단계;
(ii) 상기 농축된 세포 집단으로부터, (a) CD3+, 또는 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포 및 (b) CD57- 세포 중의 다른 것을 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
(iii) 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포를 상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극하는 단계;
(iv) 상기 자극된 세포를 유전자 조작하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 단계, 상기 유전자 조작은:
(1) 상기 자극된 세포에서, (a) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (b) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC),의 발현을 녹아웃시키는 단계; 및
(2) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 자극된 세포 내로, 선택적으로 TRAC를 암호화하는 유전자의 유전자 좌 내로 도입하는 단계;를 포함하며,
상기 단계 (1)에서의 녹아웃 및 상기 단계 (2)에서의 도입은 어느 순서로든 동시에 또는 연속적으로 수행될 수 있음;
(v) 상기 조작된 T 세포 조성물을 최대 96 시간 동안, 선택적으로 (약) 37℃±2℃의 온도에서 인큐베이션하는 단계, 선택적으로 상기 인큐베이션은 증식 또는 증폭을 촉진시키는 조건하에 상기 세포를 배양하는 단계를 더 포함함;
(vi) 복수의 상이한 공여자들에 대해 상기 단계 (i) 내지 (v)를 반복하여 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 생산하는 단계, 여기서 각각의 공여자 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 세포로부터 생성됨; 및
(vii) 상기 복수의 상이한 공여자들 유래 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 조합하는 단계;
를 포함하는 방법.
57. 구현예 2 내지 56 중의 어느 하나에 있어서,
상기 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단에서 CD57+ T 세포의 빈도는 상기 공여자 샘플에서 CD57+ T 세포의 빈도의 (약) 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만인, 방법.
58. 구현예 2 내지 57 중의 어느 하나에 있어서,
상기 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단에서 CD57+ T 세포의 빈도는 상기 공여자 샘플에서 CD57+ T 세포의 빈도의 약 20% 미만인, 방법.
59. 구현예 2 내지 58 중의 어느 하나에 있어서,
상기 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 약 20% 미만의 CD57+ T 세포, 약 15% 미만의 CD57+ T 세포, 약 10% 미만의 CD57+ T 세포, 약 5% 미만의 CD57+ T 세포, 약 1% 미만의 CD57+ T 세포, 또는 약 0.1% 미만의 CD57+ T 세포를 포함하는, 방법.
60. 구현예 2 내지 59 중의 어느 하나에 있어서,
상기 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 약 5% 미만의 CD57+ T 세포를 포함하는, 방법.
61. 구현예 2 내지 60 중의 어느 하나에 있어서,
상기 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 CD57+ T 세포가 없거나 또는 본질적으로 없는, 방법.
62. 구현예 2 내지 61 중의 어느 하나에 있어서,
상기 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포는 상기 공여자 샘플의 세포의 것과 비교하여 하나 이상의 분자의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타내는, 방법.
63. 구현예 62에 있어서,
상기 하나 이상의 분자는 나이브 T 세포의 마커, 선택적으로 CD27, Ki67, CD25, CD28, CCR7, 및/또는 CD45RA를 포함하는, 방법.
64. 구현예 2 내지 63 중의 어느 하나에 있어서,
상기 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포는 상기 공여자 샘플의 세포의 것과 비교하여 CD27 및/또는 Ki67의 발현에서 더 낮은 CV를 나타내는, 방법.
65. 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은:
(a) 복수의 상이한 공여자들로부터 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 수득하는 단계, 각각의 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 재조합 수용체로 유전자 조작된 T 세포를 포함함; 및
(b) 상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 조합하여 공여자 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 단계;
를 포함하는, 방법.
66. 구현예 65에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은:
(i) 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하고, 그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계; 및
(ii) 상기 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산을 CD27 농축된 세포 집단 내로 도입하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 단계;
를 포함하는 방법에 의해 생성되는, 방법.
67. 구현예 66에 있어서,
상기 단계 (ii) 전에, 상기 방법은 CD27 농축된 T 세포 집단을 상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극하는 것을 포함하는, 방법.
68. 구현예 66 또는 67에 있어서,
상기 방법은 (iii) 상기 조작된 T 세포 조성물의 세포를 상기 도입 후 최대 96시간 동안, 선택적으로 (약) 37℃±2℃의 온도에서, 인큐베이션하는 단계를 더 포함하는, 방법.
69. 구현예 68에 있어서,
상기 인큐베이션은, 상기 인큐베이션 개시시의 세포의 수와 비교하여, 상기 세포가 증폭되지 않거나 실질적으로 증폭되지 않는 조건 하에 수행되는, 방법.
70. 구현예 66 또는 67에 있어서,
상기 방법은 (iii) 상기 조작된 T 세포 조성물의 세포를 상기 조성물 내의 T 세포의 증폭을 위한 조건 하에 배양하는 단계를 더 포함하는, 방법.
71. 구현예 66 내지 70 중의 어느 하나에 있어서,
CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하는 단계는:
(1) (a) T 세포 마커(들)에 대해 표면 양성인 세포 및 (b) 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 세포 중의 하나를 선택하고, 그에 의해서 농축된 세포 집단을 생성하는 단계; 및
(2) 상기 농축된 세포 집단으로부터, (a) T 세포 마커(들)에 대해 표면 양성인 세포 및 (b) CD27+ 세포 중의 다른 것에 대해 선택하고, 그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
를 포함하는, 방법.
72. 구현예 71에 있어서,
상기 T 세포 마커(들)는 CD3인, 방법.
73. 구현예 71 또는 72에 있어서,
상기 T 세포 마커(들)는 CD4인, 방법.
74. 구현예 71 내지 73 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포 마커(들)는 CD8인, 방법.
75. 구현예 71 내지 74 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포 표면 마커(들)는 CD4 및 CD8인, 방법.
76. 구현예 65 내지 75 중의 어느 하나에 있어서,
상기 방법은, 상기 방법의 단계들 중의 하나 이상 전에 또는 동안에 상기 CD27 농축된 집단 및/또는 상기 조작된 T 세포 조성물의 T 세포에서, (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC);의 발현을 녹아웃(knocking out)시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
77. 구현예 65 내지 76 중의 어느 하나에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물의 T 세포는 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC)의 발현에 대해 녹아웃(K0)된, 방법.
78. 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은,
(a) 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하고, 그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
(b) 상기 CD27 농축된 T 세포 집단을 유전자 조작하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 단계, 상기 유전자 조작은,
(1) 상기 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포에서, (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC);의 발현을 녹아웃시키는 단계; 및
(2) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산을 상기 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포 내로 도입하는 단계; 선택적으로 상기 이종 핵산은 내인성 MHC 또는 그의 성분 및/또는 내인성 TCR 또는 그의 성분에 대해 암호화하는 유전자의 유전자 좌 내로 삽입됨;
를 포함하며, 상기 단계 (1)에서의 녹아웃 및 상기 단계 (2)에서의 도입은 어느 순서로든 동시에 또는 연속적으로 수행됨;
(c) 복수의 상이한 공여자들에 대해 상기 단계 (a) 및 (b)를 반복하여 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 생산하는 단계, 각각의 공여자 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 세포로부터 생성됨; 및
(d) 상기 복수의 상이한 개별 공여자로부터 상기 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 조합하여 공여자 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 단계;를 포함하는, 방법.
79. 구현예 65 내지 78 중의 어느 하나에 있어서,
상기 방법은 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 중 각각에 대해 반복되는, 방법.
80. 구현예 65 내지 79 중의 어느 하나에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 상기 조합 전에 동결 보존되고 해동되는, 방법.
81. 구현예 65 내지 80 중의 어느 하나에 있어서,
상기 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 75% 초과의 CD3+/CD27+ 세포, (약) 80% 초과의 CD3+/CD27+ 세포, (약) 85% 초과의 CD3+/CD27+ 세포, (약) 90% 초과의 CD3+/CD27+ 세포, 또는 (약) 95% 초과의 CD3+/CD27+ 세포를 포함하는, 방법.
82. 구현예 65 내지 81 중의 어느 하나에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 독립적으로 (약) 40% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포, (약) 45% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포, (약) 50% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포, (약) 55% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포, (약) 55% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포, (약) 60% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포, (약) 65% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포 또는 (약) 70% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포, 선택적으로 (약) 40% 초과의 CD3+/CD27+/재조합 수용체+ 세포, (약) 45% 초과의 CD3+/CD27+/재조합 수용체+ 세포, (약) 50% 초과의 CD3+/CD27+/재조합 수용체+ 세포, (약) 55% 초과의 CD3+/CD27+/재조합 수용체+ 세포, (약) 55% 초과의 CD3+/CD27+/재조합 수용체+ 세포, (약) 60% 초과의 CD3+/CD27+/재조합 수용체+ 세포, (약) 65% 초과의 CD3+/CD27+/재조합 수용체+ 세포 또는 (약) 70% 초과의 CD3+/CD27+/재조합 수용체+ 세포를 포함하는, 방법.
83. 구현예 65 내지 82 중의 어느 하나에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
84. 구현예 83에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 (약) 1:5 내지 (약) 5:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
85. 구현예 84에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 (약) 1:3 내지 (약) 3:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
86. 구현예 76 내지 85 중의 어느 하나에 있어서,
상기 녹아웃 전에, 상기 CD27 농축된 T 세포 집단을 상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극하는 단계를 더 포함하는, 방법.
87. 구현예 76 내지 86 중의 어느 하나에 있어서,
상기 녹아웃 및 상기 이종 핵산의 도입은 동시에 수행되는, 방법.
88. 구현예 76 내지 86 중의 어느 하나에 있어서,
상기 녹아웃 및 상기 이종 핵산의 도입은 어느 순서로든 연속적으로 수행되는, 방법.
89. 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은:
(i) 복수의 상이한 공여자들 유래 공여자 샘플로부터 (a) T 세포 마커(들)에 대해 표면 양성인 세포 및 (b) CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 세포 중의 하나에 대해 선택하고, 그에 의해서 농축된 세포 집단을 생성하는 단계; 및
(ii) 상기 농축된 세포 집단으로부터, (a) 상기 T 세포 마커(들)에 대해 표면 양성인 세포 및 (b) CD27+ 세포 중의 다른 하나를 선택하고, 그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
를 포함하는, 방법.
90. 구현예 89에 있어서,
상기 공여자 샘플은 상기 복수의 상이한 공여자들 유래 세포를 포함하는 풀링된 샘플이고, 그에 의해서 상기 방법은 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생산하는, 방법.
91. 구현예 89에 있어서,
상기 공여자 샘플은 개별 공여자 유래 샘플이고, 상기 단계 (a) 및 (b)는 상기 복수의 상이한 공여자들 유래 공여자 샘플 각각에 대해 별도로 반복되고, 그에 의해서 상기 방법은 각각의 개별 공여자에 대해 CD27 농축된 T 세포 집단을 생산하는, 방법.
92. 구현예 91에 있어서,
상기 방법은 각각의 개별 공여자에 대한 상기 CD27 농축된 T 세포 집단을 함께 조합하여 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생산하는 단계를 더 포함하는, 방법.
93. 구현예 89 내지 92 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포 마커(들)는 CD3인, 방법.
94. 구현예 89 내지 93 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포 마커(들)는 CD4인, 방법.
95. 구현예 89 내지 94 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포 마커(들)는 CD8인, 방법.
96. 구현예 89 내지 95 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포 표면 마커(들)는 CD4 및 CD8인, 방법.
97. 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은 공여자 샘플로부터 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 T 세포에 대해 선택하는 단계, 여기서 상기 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자들 유래 인간 T 세포에 대해 농축된 풀링된 세포 집단임, 그에 의해서 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
98. 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은:
(a) 공여자 샘플로부터 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 T 세포에 대해 선택하는 단계, 여기서 상기 공여자 샘플은 공여자 샘플로부터의 인간 T 세포에 대해 농축됨, 그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
(b) 복수의 상이한 개별 공여자들에 대해 상기 단계 (a)를 반복하는 단계; 및
(c) 각각의 개별 공여자로부터의 각각의 CD27 농축된 T 세포 집단을 조합하여, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
를 포함하는, 방법.
99. 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은 공여자 샘플로부터 T 세포에 대해 선택하는 단계, 여기서 상기 공여자 샘플은 복수의 상이한 공여자로부터의 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에 대해 농축된 풀링된 세포 집단임, 그에 의해서 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
100. 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은:
(a) 공여자 샘플로부터 T 세포에 대해 선택하는 단계, 여기서 상기 공여자 샘플은 개별 공여자로부터의 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에 대해 농축됨, 그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
(b) 복수의 상이한 공여자들에 대해 상기 단계 (a)를 반복하는 단계; 및
(c) 각각의 개별 공여자로부터의 각각의 CD27 농축된 T 세포 집단을 조합하여, 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
를 포함하는, 방법.
101. 구현예 97 내지 100 중의 어느 하나에 있어서,
인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 CD3+ T 세포에 대해 선택함으로써 수득되는, 방법.
102. 구현예 97 내지 101 중의 어느 하나에 있어서,
인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포에 대해 선택함으로써 수득되는, 방법.
103. 구현예 97 내지 102 중의 어느 하나에 있어서,
인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 (약) 85% 초과의 CD3+ T 세포를 포함하는, 방법.
104. 구현예 97 내지 103 중의 어느 하나에 있어서,
인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 (약) 90% 초과의 CD3+ T 세포를 포함하는, 방법.
105. 구현예 97 내지 104 중의 어느 하나에 있어서,
인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 (약) 95% 초과의 CD3+ T 세포를 포함하는, 방법.
106. 구현예 97 내지 105 중의 어느 하나에 있어서,
인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
107. 구현예 106에 있어서,
인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 (약) 1:5 내지 (약) 5:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
108. 구현예 106 또는 107에 있어서,
인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 (약) 1:3 내지 (약) 3:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
109. 구현예 97 내지 108 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포에 대해 선택하는 단계는 CD3+ T 세포에 대해 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
110. 구현예 97 내지 109 중의 어느 하나에 있어서,
상기 세포에 대해 선택하는 단계는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포에 대해 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
111. 구현예 97 내지 110 중의 어느 하나에 있어서,
CD27+ 인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 CD27+ T 세포에 대해 선택함으로써 수득되는, 방법.
112. 구현예 91 내지 96, 98 및 110 내지 111 중의 어느 하나에 있어서,
(a) 상기 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포는 (i) 내인성 주요 조직적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC);의 발현을 위해 녹아웃(KO)되고/되거나;
(b) 상기 방법은 상기 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포에서 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 TRAC;의 발현을 녹아웃시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
113. 구현예 90 및 92 내지 111 중의 어느 하나에 있어서,
(a) 상기 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포는 (i) 내인성 주요 조직적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC);의 발현을 위해 녹아웃(KO)되고/되거나;
(b) 상기 방법은 상기 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포에서 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC);의 발현을 녹아웃시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
114. 구현예 91 내지 96, 98 및 100 내지 112 중의 어느 하나에 있어서,
(a) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드는 상기 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포 내로 도입되고/되거나;
(b) 상기 방법은 상기 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포 내로 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 더 포함하고,
그에 의해서 상기 방법은 조작된 T 세포 조성물을 생성하는, 방법.
115. 구현예 90, 92 내지 111 및 113 중의 어느 하나에 있어서,
(a) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드는 상기 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포 내로 도입되고/되거나;
(b) 상기 방법은 상기 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포 내로 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 더 포함하고,
그에 의해서 상기 방법은 조작된 T 세포 조성물을 생성하는, 방법.
116. 구현예 114 또는 115에 있어서,
상기 녹아웃 및 상기 이종 핵산의 도입은 동시에 수행되는, 방법.
117. 구현예 114 또는 115에 있어서,
상기 녹아웃 및 상기 이종 핵산의 도입은 어느 순서로든 연속적으로 수행되는, 방법.
118. 구현예 112 내지 117 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조합은, 상기 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포가 녹아웃되고/되거나 상기 이종 핵산에 도입되기 전에 수행되는, 방법.
119. 구현예 112 내지 117 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조합은, 상기 CD27 농축된 T 세포의 세포가 녹아웃되고/되거나 상기 이종 핵산에 도입된 후에 수행되는, 방법.
120. 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은,
(i) 공여자 샘플로부터 (a) CD3에 대해 표면 양성(CD3+)이거나, 또는 CD4 및/또는 CD8에 대해 표면 양성(CD4+ 및/또는 CD8+)인 세포 및 (b) CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 세포 중의 하나에 대해 선택하고, 그에 의해서 농축된 세포 집단을 생성하는 단계;
(ii) 상기 농축된 세포 집단으로부터, (a) CD3+, 또는 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포 및 (b) CD27+ 세포 중의 다른 것을 선택하고, 그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
(iii) CD27 농축된 T 세포 집단의 세포를 상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극하는 단계;
(iv) 상기 자극된 세포를 유전자 조작하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 단계, 상기 유전자 조작은:
(1) 상기 자극된 세포에서, (a) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (b) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC),의 발현을 녹아웃시키는 단계; 및
(2) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 자극된 세포 내로, 선택적으로 TRAC를 암호화하는 유전자의 유전자 좌 내로 도입하는 단계;를 포함하며,
상기 단계 (1)에서의 녹아웃 및 상기 단계 (2)에서의 도입은 어느 순서로든 동시에 또는 연속적으로 수행될 수 있음;
(v) 상기 조작된 T 세포 조성물을 최대 96 시간 동안, 선택적으로 (약) 37℃±2℃의 온도에서 인큐베이션하는 단계, 선택적으로 상기 인큐베이션은 증식 또는 증폭을 촉진시키는 조건하에 상기 세포를 배양하는 단계를 더 포함함;
(vi) 복수의 상이한 공여자들에 대해 상기 단계 (i) 내지 (v)를 반복하여 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 생산하는 단계, 여기서 각각의 공여자 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 세포로부터 생성됨; 및
(vii) 상기 복수의 상이한 공여자들 유래 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 조합하는 단계;
를 포함하는 방법.
121. 구현예 66 내지 120 중의 어느 하나에 있어서,
상기 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단에서 CD27- T 세포의 빈도는 상기 공여자 샘플에서 CD27- T 세포의 빈도의 (약) 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만인, 방법.
122. 구현예 66 내지 121 중의 어느 하나에 있어서,
상기 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단에서 CD27- T 세포의 빈도는 상기 공여자 샘플에서 CD27- T 세포의 빈도의 약 20% 미만인, 방법.
123. 구현예 66 내지 122 중의 어느 하나에 있어서,
상기 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 약 20% 미만의 CD27- T 세포, 약 15% 미만의 CD27- T 세포, 약 10% 미만의 CD27- T 세포, 약 5% 미만의 CD27- T 세포, 약 1% 미만의 CD27- T 세포, 또는 약 0.1% 미만의 CD27- T 세포를 포함하는, 방법.
124. 구현예 66 내지 123 중의 어느 하나에 있어서,
상기 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 약 5% 미만의 CD27- T 세포를 포함하는, 방법.
125. 구현예 66 내지 124 중의 어느 하나에 있어서,
상기 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 CD27- T 세포가 없거나 또는 본질적으로 없는, 방법.
126. 구현예 66 내지 125 중의 어느 하나에 있어서,
상기 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포는 상기 공여자 샘플의 세포의 것과 비교하여 하나 이상의 분자의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타내는, 방법.
127. 구현예 126에 있어서,
상기 하나 이상의 분자는 나이브 T 세포의 마커, 선택적으로 CD57, Ki67, CD25, CD28, CCR7, 및/또는 CD45RA를 포함하는, 방법.
128. 구현예 66 내지 127 중의 어느 하나에 있어서,
상기 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포는 상기 공여자 샘플의 세포의 것과 비교하여 CD27 및/또는 Ki67의 발현에서 더 낮은 CV를 나타내는, 방법.
128. 구현예 66 내지 127 중의 어느 하나에 있어서,
상기 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포는 상기 공여자 샘플의 세포의 것과 비교하여, CD57 및/또는 Ki67의 발현에서 더 낮은 CV를 나타내는, 방법.
129. 구현예 1 내지 128 중의 어느 하나에 있어서,
상기 공여자 샘플은 성분채집술 생성물 또는 백혈구성분채집술 생성물을 포함하는, 방법.
130. 구현예 1 내지 129 중의 어느 하나에 있어서,
상기 복수의 상이한 공여자들은 적어도 약 또는 약 2명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 5명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 10명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 15명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 20명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 25명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 50명의 상이한 공여자, 또는 적어도 약 또는 약 100명의 상이한 공여자, 또는 상기 중의 어느 것들 사이의 임의의 범위를 포함하는, 방법.
131. 구현예 1 내지 130 중의 어느 하나에 있어서,
상기 복수의 상이한 공여자들은 5 내지 25명의 공여자를 포함하는, 방법.
132. 구현예 1 내지 131 중의 어느 하나에 있어서,
상기 복수의 상이한 공여자들은 100% 미만의 인간 백혈구 항원(HLA) 매칭된, 약 90% 미만의 HLA 매칭된, 약 80% 미만의 HLA 매칭된, 약 70% 미만의 HLA 매칭된, 약 60% 미만의 HLA 매칭된, 또는 약 50% 미만의 HLA 매칭된 2명 이상의 공여자를 포함하는, 방법.
133. 구현예 1 내지 132 중의 어느 하나에 있어서,
상기 복수의 상이한 공여자들은 100% HLA 매칭되지 않은 적어도 2개의 공여자를 포함하는, 방법.
134. 구현예 1 내지 24, 27 내지 34, 36 내지 88, 91 내지 98 및 100 내지 133 중의 어느 하나에 있어서,
상기 개별 공여자는 공여자 샘플이 개별 공여자로부터 수득되는 시점에 건강하거나 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되지 않는 것인, 방법.
135. 구현예 1 내지 24, 27 내지 34, 36 내지 88, 91 내지 98 및 100 내지 133 중의 어느 하나에 있어서,
상기 개별 공여자는 공여자 샘플이 개별 공여자로부터 수득되는 시점에 질환 또는 병태를 갖는 것인, 방법.
136. 구현예 1 내지 135 중의 어느 하나에 있어서,
상기 복수의 상이한 공여자들은 공여자 샘플이 적어도 1명의 공여자로부터 수득되는 시점에 건강하거나 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되지 않는 적어도 1명의 공여자를 포함하는, 방법.
137. 구현예 1 내지 136 중의 어느 하나에 있어서,
상기 복수의 상이한 공여자들은 공여자 샘플이 적어도 1명의 공여자로부터 수득되는 시점에 질환 또는 병태를 갖는 적어도 1명의 공여자를 포함하는, 방법.
138. 구현예 1 내지 136 중의 어느 하나에 있어서,
상기 복수의 상이한 공여자 중 공여자 각각은 공여자 샘플이 각각의 상이한 공여자로부터 수득되는 시점에 건강하거나 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되지 않는 것인, 방법.
139. 구현예 2 내지 64 및 66 내지 138 중의 어느 하나에 있어서,
상기 선택은 면역친화도-기반 선택(immunoaffinity-based selection)을 포함하는, 방법.
140. 구현예 139에 있어서,
상기 면역친화도-기반 선택은 T 세포를 CD57에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계 및 상기 항체에 결합되지 않은 세포를 회수하고, 그에 의해서 음성 선택을 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
141. 구현예 139 또는 140에 있어서,
상기 선택은 면역친화도-기반 선택을 포함하되, 선택적으로 상기 면역친화도-기반 선택은 T 세포를 CD3, CD4, 또는 CD8에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계 및 상기 항체에 결합된 세포를 회수하고, 그에 의해서 양성 선택을 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
142. 구현예 140 또는 141에 있어서,
상기 항체는 고체 표면 상에 고정되고, 선택적으로 상기 고체 표면은 자성 입자인, 방법.
143. 구현예 140 또는 141에 있어서,
상기 항체는 친화도 크로마토그래피 매트릭스(affinity chromatography matrix) 상에 고정되거나 부착되는, 방법.
144. 구현예 143에 있어서,
상기 항체는 상기 매트릭스 상에 고정된 결합 시약과 가역적 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 결합 파트너(binding partners)를 더 포함하고, 그에 의해서 상기 항체는 상기 접촉 동안 상기 크로마토그래피 매트릭스에 가역적으로 결합되는, 방법.
145. 구현예 144에 있어서,
상기 결합 시약은 상기 결합 파트너에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 뮤테인인, 방법.
146. 구현예 2 내지 64 및 129 내지 145 중의 어느 하나에 있어서,
(a) 상기 방법은 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 동결 보존하는 것을 더 포함하되, 선택적으로 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 후속 단계 전에 해동되고/되거나;
(b) 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 동결 보호제와 함께 제형화되고, 선택적으로 후속 단계 전에 해동되는,
방법.
147. 구현예 66 내지 145 중의 어느 하나에 있어서,
(a) 상기 방법은 상기 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 동결 보존하는 것을 더 포함하되, 선택적으로 상기 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 후속 단계 전에 해동되고/되거나;
(b) 상기 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 동결 보호제와 함께 제형화되고, 선택적으로 후속 단계 전에 해동되는,
방법.
148. 구현예 12 내지 24, 48 내지 64, 76 내지 88, 및 112 내지 147 중의 어느 하나에 있어서,
상기 내인성 MHC 또는 그의 성분은 MHC 부류 I 단백질 또는 그의 성분을 포함하는, 방법.
149. 구현예 12 내지 24, 48 내지 64, 76 내지 88 및 112 내지 148 중의 어느 하나에 있어서,
상기 내인성 MHC 또는 그의 성분은 β2M을 포함하는 방법.
150. 구현예 12 내지 24, 48 내지 64, 76 내지 88, 및 112 내지 149 중의 어느 하나에 있어서,
상기 내인성 TCR 또는 그의 성분은 TRAC 및/또는 T 세포 수용체 베타 불변(T cell receptor beta constant; TRBC)를 포함하는, 방법.
151. 구현예 12 내지 24, 48 내지 64, 76 내지 88, 및 112 내지 150 중의 어느 하나에 있어서,
상기 내인성 TCR 또는 그의 성분은 TRAC를 포함하는, 방법.
152. 구현예 12 내지 24, 48 내지 64, 76 내지 88 및 112 내지 151 중의 어느 하나에 있어서,
상기 녹아웃은 내인성 β2M 유전자 및/또는 내인성 TRAC 유전자에 의해 암호화되는 생성물의 발현을 감소시키거나 파괴하는 제제를 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 방법.
153. 구현예 12 내지 24, 48 내지 64, 76 내지 88 및 112 내지 152 중의 어느 하나에 있어서,
상기 녹아웃은 β2M 및/또는 TRAC의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 제제를 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 방법.
154. 구현예 12 내지 24, 48 내지 64, 76 내지 88 및 112 내지 153 중의 어느 하나에 있어서,
상기 녹아웃(knocking out)은 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), TAL-이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 CRISPR-Cas9 조합을 상기 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
155. CD57 고갈된 T 세포 집단을 유전자 조작하는 방법으로서,
재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 구현예 24 내지 49, 57 내지 64 및 129 내지 146 중의 어느 하나의 세포 내로 도입하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
156. 구현예 2 내지 24, 50 내지 64 및 121 내지 155 중의 어느 하나에 있어서,
상기 유전자 조작은 세포를 선택하는 단계 중의 하나 이상 전에 수행되는, 방법.
157. 구현예 1 내지 24, 50 내지 64 및 121 내지 156 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조작된 T 세포는, 상기 조작된 T 세포가 CD57+ T 세포 고갈되지 않는 방법과 비교하여, 상기 재조합 수용체의 발현에서 더 낮은 CV를 나타내는, 방법.
158. CD27 농축된 T 세포 집단을 유전자 조작하는 방법으로서,
재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 구현예 88 내지 113, 121 내지 145 및 147 중의 어느 하나의 세포 내로 도입하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
159. 구현예 66 내지 88 및 114 내지 158 중의 어느 하나에 있어서,
상기 유전자 조작은 세포를 선택하는 단계 중 하나 이상 전에 수행되는, 방법.
160. 구현예 65 내지 88, 114 내지 154, 158 및 159 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조작된 T 세포는, 상기 조작된 T 세포가 CD27+ T 세포 농축되지 않는 방법과 비교하여, 상기 재조합 수용체의 발현에서 더 낮은 CV를 나타내는, 방법.
161. 구현예 2 내지 24, 50 내지 64 및 66 내지 160 중의 어느 하나에 있어서,
상기 도입은 상기 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터로 상기 이종 폴리뉴클레오티드의 표적화된 삽입을 포함하는, 방법.
162. 구현예 161에 있어서,
상기 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터인, 방법.
163. 구현예 2 내지 24, 50 내지 64 및 66 내지 162 중의 어느 하나에 있어서,
상기 이종 폴리뉴클레오티드는 상기 β2M 유전자 또는 상기 TRAC 유전자의 유전자 좌 내로 삽입되는, 방법.
164. 구현예 2 내지 24 및 50 내지 95 중의 어느 하나에 있어서,
상기 이종 폴리뉴클레오티드는 상기 TRAC 유전자의 유전자 좌 내로 삽입되는, 방법.
165. 구현예 2, 3, 6 내지 24, 50 내지 55, 57 내지 64, 66, 67, 70 내지 88, 114 내지 119 및 121 내지 164 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조작된 세포를 상기 도입 후 최대 96시간 동안, 선택적으로 (약) 37℃±2℃의 온도에서, 인큐베이션하는 단계를 더 포함하는, 방법.
166. 구현예 56, 120 및 165 중의 어느 하나에 있어서,
상기 인큐베이션은 상기 도입 후 최대 72시간 동안 수행되는, 방법.
167. 구현예 56, 120 및 165 중의 어느 하나에 있어서,
상기 인큐베이션은 상기 도입 후 최대 48시간 동안 수행되는, 방법.
168. 구현예 56, 120 및 165 중의 어느 하나에 있어서,
상기 인큐베이션은 상기 도입 후 최대 24시간 동안 수행되는, 방법.
169. 구현예 4 내지 13, 56 내지 64, 121 내지 154 및 165 내지 168 중의 어느 하나에 있어서,
상기 인큐베이션은 바이러스 벡터를 CD57 고갈된 T 세포 및/또는 풀링된 CD57 고갈된 T 세포의 게놈 내로 통합시키는 것인, 방법.
170. 구현예 68 내지 77, 120 내지 154 및 165 내지 169 중의 어느 하나에 있어서,
상기 인큐베이션은 바이러스 벡터를 CD27 농축된 T 세포 및/또는 풀링된 CD27 농축된 T 세포의 게놈 내로 통합시키는 것인, 방법.
171. 구현예 14 내지 24, 50 내지 56, 57 내지 64, 68 내지 88 및 121 내지 171 중의 어느 하나에 있어서,
증식 또는 증폭을 촉진하는 조건 하에 세포를 배양하는 것을 더 포함하는, 방법.
172. 구현예 171에 있어서,
상기 배양은 선택적으로 IL-2, IL-7 및 IL-15 중의 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재 하에 수행되는, 방법.
173. 구현예 2 내지 172 중의 어느 하나에 있어서,
상기 방법에 의해 생산된 세포를 수확 또는 수집하는 것을 더 포함하는, 방법.
174. 구현예 173에 있어서,
상기 수확 또는 수집은 상기 방법에 의해 임계 수의 세포가 생산된 시점에 수행되는, 방법.
175. 실시예 174에 있어서,
상기 임계 수에 도달하는 시간은 CD57+ T 세포를 고갈시키는 것을 포함하지 않는 방법보다 적은 시간인, 방법.
176. 구현예 173 내지 175 중 어느 하나에 있어서,
(a) 상기 방법은 동결 보호제의 존재 하에 동결 보존을 위해 수확된 또는 수집된 세포를 제형화하는 것을 더 포함하고/하거나;
(b) 상기 수확된 또는 수집된 세포를 약학적으로 허용가능한 부형제의 존재 하에 제형화되는, 방법.
177. 구현예 1 내지 24, 50 내지 88 및 114 내지 176 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는 질환 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련되거나, 그에 특이적이고/이거나 그 상에서 발현되는 표적 항원과 결합할 수 있는, 방법.
178. 구현예 177에 있어서,
상기 질환 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 종양 또는 암인 방법.
179. 구현예 177 또는 178에 있어서,
상기 표적 항원은 종양 항원인, 방법.
180. 구현예 177 내지 179 중의 어느 하나에 있어서,
상기 표적 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 표피 당단백질 2(EPG-2), 표피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; FC 수용체 상동물 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 클래스 5D(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 2량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 패밀리 8 멤버 A를 함유하는 루신 리치 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스트론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나제 유사 고아 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토머라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원 또는 보편적 태그(universal tag) 및/또는 비오티닐화된 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체(pathogen)에 의해 발현된 분자와 연관된 항원 중에서 선택되는, 방법.
181. 구현예 1 내지 24, 50 내지 88 및 114 내지 180 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는 기능성 비-TCR 항원 수용체 또는 TCR 또는 그의 항원-결합 단편이거나 또는 그를 포함하는, 방법.
182. 구현예 1 내지 24, 50 내지 88 및 114 내지 181 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인, 방법.
183. 구현예 1 내지 24, 50 내지 88 및 114 내지 182 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는 항원-결합 도메인, 스페이서(spacer) 및/또는 힌지 영역(hinge region)을 포함하는 세포외 도메인(extracellular domain), 막관통 도메인(transmembrane domain) 및 공자극 신호전달 영역(costimulatory signaling region)을 포함하는 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain)을 포함하는, 방법.
184. 구현예 183에 있어서,
상기 세포외 도메인은 scFv를 포함하는 항원-결합 도메인을 포함하는, 방법.
185. 구현예 183 또는 184에 있어서,
상기 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 도메인(primary signaling domain), T 세포에서 1차 활성화 신호(primary activation signal)를 유도할 수 있는 신호전달 도메인, T 세포 수용체(TCR) 성분의 신호전달 도메인 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif; ITAM)를 포함하는 신호전달 도메인이거나 또는 그들을 포함하는, 방법.
186. 구현예 183 내지 185 중의 어느 하나에 있어서,
상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3 사슬, 선택적으로 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 신호전달 도메인 또는 그의 신호전달 부분이거나 또는 그들을 포함하는, 방법.
187. 구현예 183 내지 186 중의 어느 하나에 있어서,
상기 공자극 신호전달 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 세포내 신호전달 도메인 또는 그들의 신호전달 부분을 포함하는, 방법.
188. 구현예 1 내지 187 중의 어느 하나에 있어서,
상기 방법에 의해 생산된 T 세포는 질환 또는 병태를 갖는 적어도 하나의 대상체에게 투여하기 위한 것이되, 선택적으로 상기 T 세포의 적어도 일부는 적어도 하나의 대상체에 대해 동종이계(allogeneic)인, 방법.
189. 구현예 188에 있어서,
상기 질환 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 종양 또는 암인 방법.
190. 구현예 188 또는 189에 있어서,
상기 질환 또는 병태는 종양 또는 암인, 방법.
191. 구현예 188 내지 190 중의 어느 하나에 있어서,
상기 방법에 의해 생산된 T 세포는 하나 이상의 단위 용량으로서 투여를 위해 제형화되고, 상기 세포는 적어도 약 100개 단위 용량의 세포, 적어도 약 200개 단위 용량의 세포, 적어도 약 300개 단위 용량의 세포, 적어도 약 400개 단위 용량의 세포, 적어도 약 500개 단위 용량의 세포, 적어도 약 600개 단위 용량, 적어도 약 또는 적어도 약 1,000개 단위 용량의 세포를 포함하는, 방법.
192. 구현예 188 내지 191 중의 어느 하나에 있어서,
상기 방법에 의해 생산된 T 세포는 적어도 2명의 대상체, 적어도 5명의 대상체, 적어도 10명의 대상체, 적어도 25명의 대상체, 적어도 50명의 대상체, 적어도 100명의 대상체, 적어도 200명의 대상체, 적어도 500명의 대상체, 또는 적어도 1,000명의 대상체에게 투여하기 위한 것인, 방법.
193. 구현예 191 또는 192에 있어서,
상기 단위 용량은 약 1천만개 내지 7천5백만개의 세포/세포의 mL 수/세포의 농도를 포함하는, 방법.
194. 구현예 191 내지 193 중의 어느 하나에 있어서,
상기 단위 용량은 (약) 5.0×106 내지 1×109, 5.0×106 내지 5.0×108, 5.0×106 내지 2.5×108, 5.0×106 내지 1.0×108, 5.0×106 내지 7.5×107, 1×107 내지 1×109, 1×107 내지 5.0×108, 1×107 내지 2.5×108, 1×107 내지 1.0×108, 1.0×107 내지 7.5×107, 1.0×107 내지 5.0×107, 1.0×107 내지 2.5×107, 1.5×107 내지 2.25×107, 2.5×107 내지 1.0×109, 또는 2.5×107 내지 7.5×108개의 세포, 선택적으로 (약) 5.0×106 내지 1×109, 1.0×107 내지 1.0×109, 2.5×107 내지 1×109, 5.0×107 내지 1.0×109, 7.5×107 내지 1.0×109, 1.0×108 내지 1.0×109, 5.0×107 내지 7.5×108, 5×107 내지 5.0×108, 5×107 내지 2.5×108, 5.0×107 내지 1.0×108, 또는 5.0×107 내지 7.5×107개의 재조합 수용체-발현 세포를 포함하는, 방법.
195. 구현예 2, 4 내지 21, 23 내지 55, 57 내지 64 및 121 내지 194 중의 어느 하나에 있어서,
상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포를 자극하고, 그에 의해서 자극된 T 세포 집단을 생성하는 것을 더 포함하는, 방법.
197. 구현예 66, 68 내지 85, 87 내지 119 및 121 내지 194 중의 어느 하나에 있어서,
상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 상기 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포를 자극하고, 그에 의해서 자극된 T 세포 집단을 생성하는 것을 더 포함하는, 방법.
198. 구현예 3 내지 13, 22 내지 24, 56 내지 64, 67 내지 77, 86 내지 88 및 120-196 중의 어느 하나에 있어서,
상기 자극 조건은 자극 시약의 존재를 포함하고, 상기 자극 시약은 TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있는, 방법.
199. 구현예 198에 있어서,
상기 자극 시약은 (i) TCR 복합체의 구성원에 특이적으로 결합하는, 선택적으로 CD3에 특이적으로 결합하는 1차 제제 및 (ii) T 세포 공자극 분자에 특이적으로 결합하는 2차 제제를 포함하되, 선택적으로 상기 공자극 분자는 CD28, CD137 (4-1-BB), OX40 또는 ICOS로부터 선택되는, 방법.
200. 구현예 199에 있어서,
상기 1차 및 2차 제제 중의 적어도 하나는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 방법.
201. 구현예 199 또는 200에 있어서,
상기 1차 제제는 항-CD3 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고, 상기 2차 제제는 항-CD28 항체 또는 그의 항원-결합 단편인, 방법.
202. 구현예 200 또는 201에 있어서,
상기 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fv 단편 및 단일쇄 Fv 단편(scFv)으로 구성된 군으로부터 선택된 1가 항체 단편인, 방법.
203. 구현예 199 내지 202 중의 어느 하나에 있어서,
1차 제제 및 2차 제제는 복수의 스트렙타비딘 분자 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하는 올리고머 입자 시약의 표면 상에 가역적으로 결합되는 것인, 방법.
204. 구현예 203에 있어서,
상기 스트렙타비딘 분자 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 비오틴, 아비딘, 비오틴 유사체 또는 비오틴 뮤테인, 아비딘 유사체 또는 아비딘 뮤테인 및/또는 그들의 생물학적 활성 단편에 결합하거나 결합할 수 있는 것인, 방법.
205. 구현예 199 내지 204 중의 어느 하나에 있어서,
상기 1차 제제는 항-CD3 Fab를 포함하고, 상기 2차 제제는 항-CD28 Fab를 포함하는, 방법.
206. 구현예 198 내지 205 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포로부터 자극 시약을 분리하는 것을 더 포함하며, 상기 분리는 T 세포를 물질과 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 물질은 1차 및 2차 제제제와 올리고머 입자 시약 사이의 결합을 역전시킬 수 있는 것인, 방법.
207. 구현예 206에 있어서,
상기 물질은 자유 결합 파트너이고/이거나 경쟁 제제인, 방법.
208. 구현예 206 또는 207에 있어서,
상기 물질은 스트렙타비딘-결합 펩티드, 비오틴 또는 그의 생물학적 활성 단편, 또는 비오틴 유사체 또는 그의 생물학적 활성 단편이거나 또는 그를 포함하는, 방법.
209. 구현예 208에 있어서,
상기 물질은 비오틴 또는 비오틴 유사체이거나 또는 그를 포함하는, 방법.
210. 구현예 195 내지 209 중의 어느 하나에 있어서,
상기 자극 조건은 하나 이상의 재조합 시토카인의 존재를 포함하는, 방법.
211. 구현예 195 내지 210 중의 어느 하나에 있어서,
상기 자극 조건은 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15 중의 하나 이상의 존재를 포함하는, 방법.
212. 구현예 195 내지 244 중의 어느 하나에 있어서,
(a) 상기 방법은 동결 보호제(cryoprotectant)의 존재 하에 동결 보존을 위해 자극된 T 세포를 제형화하는 것을 더 포함하고/하거나;
(b) 상기 자극된 T 세포는 동결 보호제의 존재 하에 제형화되는 것;
인, 방법.
213. 구현예 1 내지 212 중의 어느 하나의 방법에 의해 생산된 T 세포 집단을 포함하는 조성물.
214. 공여자 풀 유래 T 세포를 포함하는 조성물로서,
CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포에 대해 농축된 T 세포 집단을 포함하되, 여기서 상기 세포 집단은 복수의 상이한 공여자들 유래이고, 상기 복수의 상이한 공여자들은 100% 인간 백혈구 항원(HLA) 매칭되지 않은 적어도 2명의 공여자를 포함하는, 조성물.
215. 구현예 214에 있어서,
상기 T 세포는 재조합 수용체로 유전자 조작된 T 세포를 포함하는, 조성물.
216. 구현예 213 내지 215 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물 중 CD57+ T 세포의 빈도는 상기 조성물 중 총 T 세포의 (약) 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만인, 조성물.
217. 구현예 213 내지 216 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물 중 CD57+ T 세포의 빈도는 상기 조성물 중 총 T 세포의 약 20% 미만인, 조성물.
218. 구현예 213 내지 217 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 약 20% 미만의 CD57+ T 세포, 약 15% 미만의 CD57+ T 세포, 약 10% 미만의 CD57+ T 세포, 약 5% 미만의 CD57+ T 세포, 약 1% 미만의 CD57+ T 세포, 또는 약 0.1% 미만의 CD57+ T 세포를 포함하는, 조성물.
219. 구현예 213 내지 218 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 약 5% 미만의 CD57+ T 세포를 포함하는, 조성물.
220. 구현예 213 내지 219 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 CD57+ T 세포가 없거나 또는 본질적으로 없는, 조성물.
221. 구현예 213 내지 220 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 75% 초과의 CD3+/CD57- 세포를 포함하는, 조성물.
222. 구현예 213 내지 220 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 80% 초과의 CD3+/CD57- 세포를 포함하는, 조성물.
223. 구현예 213 내지 220 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 85% 초과의 CD3+/CD57- 세포를 포함하는, 조성물.
224. 구현예 213 내지 220 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 90% 초과의 CD3+/CD57- 세포를 포함하는, 조성물.
225. 구현예 213 내지 220 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 95% 초과의 CD3+/CD57- 세포를 포함하는, 조성물.
226. 구현예 213 내지 225 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 40% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 포함하는, 조성물.
227. 구현예 213 내지 225 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 45% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 포함하는, 조성물.
228. 구현예 213 내지 225 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 50% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 포함하는, 조성물.
229. 구현예 213 내지 225 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 55% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 포함하는, 조성물.
230. 구현예 213 내지 225 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 55% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 포함하는, 조성물.
231. 구현예 213 내지 225 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 60% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 포함하는, 조성물.
232. 구현예 213 내지 225 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 65% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 포함하는, 조성물.
233. 구현예 213 내지 225 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 70% 초과의 CD3+/CD57-/재조합 수용체+ 세포를 포함하는, 조성물.
234. 구현예 213 내지 233 중의 어느 하나에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는, 조성물.
235. 구현예 234에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 (약) 1:5 내지 약 5:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함하는, 조성물.
236. 구현예 234에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 (약) 1:3 내지 (약) 3:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함하는, 조성물.
237. 구현예 213 내지 236 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물의 세포는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것과 비교하여, 하나 이상의 분자의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타내는, 조성물.
238. 구현예 237에 있어서,
상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것보다 적어도 20% 더 낮거나, 적어도 40% 더 낮거나, 적어도 60% 더 낮거나, 또는 적어도 80% 더 낮고/낮은, 조성물.
239. 구현예 237 또는 238에 있어서,
상기 하나 이상의 분자는 나이브 T 세포의 마커, 선택적으로 CD27, Ki67, CD25, CD28, CCR7, 및/또는 CD45RA을 포함하는, 조성물.
240. 구현예 213 내지 239 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물의 세포는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것과 비교하여, CD27 및/또는 Ki67의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타내는, 조성물.
241. 구현예 240에 있어서,
상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것보다 적어도 20% 더 낮거나, 적어도 40% 더 낮거나, 적어도 60% 더 낮거나, 또는 적어도 80% 더 낮은, 조성물.
242. 공여자 풀 유래 T 세포를 포함하는 조성물로서,
CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에 대해 농축된 T 세포 집단을 포함하되, 여기서 상기 세포 집단은 복수의 상이한 공여자들 유래이고, 상기 복수의 상이한 공여자들은 100% 인간 백혈구 항원(HLA) 매칭되지 않은 적어도 2명의 공여자를 포함하는, 조성물.
243. 구현예 242에 있어서,
상기 T 세포는 재조합 수용체로 유전자 조작된 T 세포를 포함하는, 조성물.
244. 구현예 213, 242 및 243 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물 중 CD27- T 세포의 빈도는 상기 조성물 중 총 T 세포의 (약) 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만인, 조성물.
245. 구현예 213 및 242 내지 244 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물 중 CD27- T 세포의 빈도는 상기 조성물 중 총 T 세포의 약 20% 미만인, 조성물.
246. 구현예 213 및 242 내지 245 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 약 20% 미만의 CD27- T 세포, 약 15% 미만의 CD27- T 세포, 약 10% 미만의 CD27- T 세포, 약 5% 미만의 CD27- T 세포, 약 1% 미만의 CD27- T 세포, 또는 약 0.1% 미만의 CD27- T 세포를 포함하는, 조성물.
247. 구현예 213 및 242 내지 246 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 약 5% 미만의 CD27- T 세포를 포함하는, 조성물.
248. 구현예 213 및 242 내지 247 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 CD27- T 세포가 없거나 또는 본질적으로 없는, 조성물.
249. 구현예 213 및 242 내지 248 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 75% 초과의 CD3+/CD27+ 세포를 포함하는, 조성물.
250. 구현예 213 및 242 내지 248 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 80% 초과의 CD3+/CD27+ 세포를 포함하는, 조성물.
251. 구현예 213 및 242 내지 248 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 85% 초과의 CD3+/CD27+ 세포를 포함하는, 조성물.
252. 구현예 213 및 242 내지 248 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 90% 초과의 CD3+/CD27+ 세포를 포함하는, 조성물.
253. 구현예 213 및 242 내지 248 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 95% 초과의 CD3+/CD27+ 세포를 포함하는, 조성물.
254. 구현예 213 및 242 내지 253 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 40% 초과의 CD3+/CD27+/재조합 수용체+ 세포를 포함하는, 조성물.
255. 구현예 213 및 242 내지 253 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 45% 초과의 CD3+/CD27+/재조합 수용체+ 세포를 포함하는, 조성물.
256. 구현예 213 및 242 내지 253 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 50% 초과의 CD3+/CD27+/재조합 수용체+ 세포를 포함하는, 조성물.
257. 구현예 213 및 242 내지 253 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 55% 초과의 CD3+/CD27+/재조합 수용체+ 세포를 포함하는, 조성물.
258. 구현예 213 및 242 내지 253 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 55% 초과의 CD3+/CD27+/재조합 수용체+ 세포를 포함하는, 조성물.
259. 구현예 213 및 242 내지 253 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 60% 초과의 CD3+/CD27+/재조합 수용체+ 세포를 포함하는, 조성물.
260. 구현예 213 및 242 내지 253 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 65% 초과의 CD3+/CD27+/재조합 수용체+ 세포를 포함하는, 조성물.
261. 구현예 213 및 242 내지 253 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 (약) 70% 초과의 CD3+/CD27+/재조합 수용체+ 세포를 포함하는, 조성물.
262. 구현예 213 및 242 내지 261 중의 어느 하나에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는, 조성물.
263. 구현예 262에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 (약) 1:5 내지 약 5:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함하는, 조성물.
264. 구현예 262에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 (약) 1:3 내지 (약) 3:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함하는, 조성물.
265. 구현예 213 및 242 내지 264 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물의 세포는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에 대해 농축되지 않은 세포 집단의 변동 계수(CV)와 비교하여 하나 이상의 분자의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타내는, 조성물.
266. 구현예 265에 있어서,
상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것보다 적어도 20% 더 낮거나, 적어도 40% 더 낮거나, 적어도 60% 더 낮거나, 또는 적어도 80% 더 낮은, 조성물.
267. 구현예 265 또는 266에 있어서,
상기 하나 이상의 분자는 나이브 T 세포의 마커, 선택적으로 CD27, Ki67, CD25, CD28, CCR7, 및/또는 CD45RA를 포함하는, 조성물.
268. 구현예 213 및 242 내지 267 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물의 세포는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에 대해 농축되지 않은 세포 집단의 변동 계수(CV)와 비교하여 Ki67의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타내는, 조성물.
269. 구현예 268에 있어서,
상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것보다 적어도 20% 더 낮거나, 적어도 40% 더 낮거나, 적어도 60% 더 낮거나, 또는 적어도 80% 더 낮은, 조성물.
270. 구현예 214 내지 269 중의 어느 하나에 있어서,
상기 복수의 상이한 공여자들은 적어도 약 또는 약 2명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 5명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 10명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 15명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 20명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 25명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 50명의 상이한 공여자, 또는 적어도 약 또는 약 100명의 상이한 공여자를 포함하는, 조성물.
271. 구현예 214 내지 270 중의 어느 하나에 있어서,
상기 복수의 상이한 공여자들은 (약) 25명 미만의 공여자를 포함하는, 조성물.
272. 구현예 214 내지 271 중의 어느 하나에 있어서,
상기 복수의 상이한 공여자들은 100% 미만의 인간 백혈구 항원(HLA) 매칭된, 약 90% 미만의 HLA 매칭된, 약 80% 미만의 HLA 매칭된, 약 70% 미만의 HLA 매칭된, 약 60% 미만의 HLA 매칭된, 또는 약 50% 미만의 HLA 매칭된 2명 이상의 공여자를 포함하는, 조성물.
273. 구현예 214 내지 272 중의 어느 하나에 있어서,
상기 복수의 상이한 공여자들은 100% HLA 매칭되지 않은 적어도 2명의 공여자를 포함하는, 조성물.
274. 구현예 214 내지 273 중의 어느 하나에 있어서,
상기 복수의 상이한 공여자들은 상기 세포가 각각의 상이한 공여자로부터 수득되는 시점에 건강하거나 또는 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되지 않는 적어도 1명의 공여자인, 조성물.
275. 구현예 214 내지 274 중의 어느 하나에 있어서,
상기 복수의 상이한 공여자들은 상기 세포가 상기 적어도 1명의 공여자로부터 수득되는 시점에 질환 또는 병태를 갖는 적어도 1명의 공여자인, 조성물.
276. 구현예 214 내지 274 중의 어느 하나에 있어서,
상기 복수의 상이한 공여자 중 공여자 각각은 상기 세포가 각각의 상이한 공여자로부터 수득되는 시점에 건강하거나 또는 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되지 않는 것인, 조성물.
277. 구현예 214 내지 276 중의 어느 하나에 있어서,
상기 T 세포는 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC)의 발현에 대해 녹아웃된 T 세포를 포함하는, 조성물.
278. 구현예 277에 있어서,
상기 내인성 MHC는 MHC 부류 I 단백질 또는 그의 성분을 포함하는, 조성물.
279. 구현예 277 또는 278에 있어서,
상기 내인성 MHC는 베타-2-마이크로글로불린(β2M)을 포함하는, 조성물.
280. 구현예 277 내지 279 중의 어느 하나에 있어서,
상기 내인성 TCR 또는 그의 성분은 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 및/또는 T 세포 수용체 베타 불변(TRBC)을 포함하는, 조성물.
281. 구현예 277 내지 280 중의 어느 하나에 있어서,
상기 내인성 TCR 또는 그의 성분은 T-세포 수용체 알파 불변(TRAC)을 포함하는, 조성물.
282. 구현예 277 내지 281 중의 어느 하나에 있어서,
상기 이종 폴리뉴클레오티드는 β2M 유전자 또는 TRAC 유전자의 유전자 좌 내로 삽입되는, 조성물.
283. 구현예 277 내지 282 중의 어느 하나에 있어서,
상기 이종 폴리뉴클레오티드는 TRAC 유전자의 유전자 좌 내로 삽입되는, 조성물.
284. 구현예 213 내지 283 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 동결 보호제(cryprotectant)를 포함하는, 조성물.
285. 구현예 213 내지 284 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 조성물.
286. 구현예 214 내지 241 및 243 내지 285 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는 질환 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련되거나, 그에 특이적이고/이거나 그 상에서 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있는, 조성물.
287. 구현예 286에 있어서,
상기 질환 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 종양 또는 암인, 조성물.
288. 구현예 286 또는 287에 있어서,
상기 표적 항원은 종양 항원인, 조성물.
289.
구현예 286 내지 288 중의 어느 하나에 있어서,
상기 표적 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 표피 당단백질 2(EPG-2), 표피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; FC 수용체 상동물 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 클래스 5D(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 2량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 패밀리 8 멤버 A를 함유하는 루신 리치 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스트론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나제 유사 고아 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토머라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원 또는 보편적 태그(universal tag) 및/또는 비오티닐화된 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체(pathogen)에 의해 발현된 분자와 연관된 항원 중에서 선택되는, 조성물.
290. 구현예 214 내지 241 및 243 내지 289 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는 기능성 비-TCR 항원 수용체 또는 TCR 또는 그의 항원-결합 단편이거나 또는 그를 포함하는, 조성물.
291. 구현예 214 내지 241 및 243 내지 290 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인, 조성물.
292. 구현예 214 내지 241 및 243 내지 291 중의 어느 하나에 있어서,
상기 재조합 수용체는 항원-결합 도메인, 스페이서 및/또는 힌지 영역을 포함하는 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 공자극 신호전달 영역을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 조성물.
293. 구현예 292에 있어서,
상기 세포외 도메인은 scFv를 포함하는 항원-결합 도메인을 포함하는, 조성물.
294. 구현예 292 또는 293에 있어서,
상기 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호전달 도메인, T 세포 수용체(TCR) 성분의 신호전달 도메인 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 신호전달 도메인이거나 또는 그들을 포함하는, 조성물.
295. 구현예 292 내지 294 중의 어느 하나에 있어서,
상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3 사슬, 선택적으로 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 신호전달 도메인 또는 그의 신호전달 부분이거나 또는 그들을 포함하는, 조성물.
296. 구현예 292 내지 295 중의 어느 하나에 있어서,
상기 공자극 신호전달 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 세포내 신호전달 도메인 또는 그들의 신호전달 부분을 포함하는, 조성물.
297. 구현예 212 내지 296 중의 어느 하나에 있어서,
질환 또는 병태를 갖는 대상체의 치료를 위한 것인, 조성물.
298. 구현예 297에 있어서,
상기 질환 또는 병태는 암 또는 종양인, 조성물.
299. 구현예 212 내지 298 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물의 세포는 하나 이상의 단위 용량으로서 투여를 위해 제형화되고, 상기 세포는 적어도 약 100개 단위 용량의 세포, 적어도 약 200개 단위 용량의 세포, 적어도 약 300개 단위 용량의 세포, 적어도 약 400개 단위 용량의 세포, 적어도 약 500개 단위 용량의 세포, 적어도 약 600개 단위 용량, 적어도 약 또는 적어도 약 1,000개 단위 용량의 세포를 포함하는, 조성물.
300. 구현예 212 내지 299 중의 어느 하나에 있어서,
상기 조성물의 세포는 적어도 2명의 대상체, 적어도 5명의 대상체, 적어도 10명의 대상체, 적어도 25명의 대상체, 적어도 50명의 대상체, 적어도 100명의 대상체, 적어도 200명의 대상체, 적어도 500명의 대상체, 또는 적어도 1,000명의 대상체에게 투여하기 위한 것인, 조성물.
301. 구현예 299 또는 300에 있어서,
상기 단위 용량은 약 1천만개 내지 7천5백만개의 세포/mL를 포함하는, 조성물.
302. 구현예 299 내지 301 중의 어느 하나에 있어서,
상기 단위 용량은 (약) 5.0×106 내지 1×109, 5.0×106 내지 5.0×108, 5.0×106 내지 2.5×108, 5.0×106 내지 1.0×108, 5.0×106 내지 7.5×107, 1×107 내지 1×109, 1×107 내지 5.0×108, 1×107 내지 2.5×108, 1×107 내지 1.0×108, 1.0×107 내지 7.5×107, 1.0×107 내지 5.0×107, 1.0×107 내지 2.5×107, 1.5×107 내지 2.25×107, 2.5×107 내지 1.0×109, 또는 2.5×107 내지 7.5×108개의 세포, 선택적으로 (약) 5.0×106 내지 1×109, 1.0×107 내지 1.0×109, 2.5×107 내지 1×109, 5.0×107 내지 1.0×109, 7.5×107 내지 1.0×109, 1.0×108 내지 1.0×109, 5.0×107 내지 7.5×108, 5×107 내지 5.0×108, 5×107 내지 2.5×108, 5.0×107 내지 1.0×108, 또는 5.0×107 내지 7.5×107개의 재조합 수용체-발현 세포를 포함하는, 조성물.
303. 구현예 212 내지 302 중의 어느 하나의 조성물을 포함하는 용기.
304. 구현예 303에 있어서,
상기 용기는 백(bag), 선택적으로 냉동 백이고,
상기 용기는:
(약) 15 mL 내지 150 mL, 20 mL 내지 100 mL, 20 mL 내지 80 mL, 20 mL 내지 60 mL, 20 mL 내지 40 mL, 40 mL 내지 100 mL, 40 mL 내지 80 mL, 40 mL 내지 60 mL, 60 mL 내지 100 mL, 60 mL 내지 80 mL 또는 80 mL 내지 100 mL(각각의 경계 포함); 또는 적어도 또는 적어도 약 15 mL, 적어도 또는 적어도 약 20 mL, 적어도 또는 적어도 약 30 mL, 적어도 또는 적어도 약 40 mL, 적어도 또는 적어도 약 50 mL, 적어도 또는 적어도 약 60 mL, 적어도 또는 적어도 약 70 mL, 적어도 또는 적어도 약 80 mL 또는 적어도 또는 적어도 약 90 mL; 및/또는
100 mL 이하의
부피의 조성물로 충전되는, 용기.
305. 구현예 303 또는 304에 있어서,
상기 용기는:
(약) 0.1 cm-1 내지 100 cm-1; 1 cm-1 내지 50 cm-1, 1 cm-1 내지 20 cm-1, 1 cm-1 내지 10 cm-1, 1 cm-1 내지 7 cm-1, 1 cm-1 내지 6 cm-1, 1 cm-1 내지 3 cm-1, 1 cm-1 내지 2 cm-1, 2 cm-1 내지 20 cm-1, 2 cm-1 내지 10 cm-1, 2 cm-1 내지 7 cm-1, 2 cm-1 내지 6 cm-1, 2 cm-1 내지 3 cm-1, 3 cm-1 내지 20 cm-1, 3 cm-1 내지 10 cm-1, 3 cm-1 내지 7 cm-1, 3 cm-1 내지 6 cm-1, 6 cm-1 내지 20 cm-1, 6 cm-1 내지 10 cm-1, 6 cm-1 내지 7 cm-1, 7 cm-1 내지 20 cm-1, 7 cm-1 내지 10 cm-1, 또는 7 cm-1 내지 20 cm-1(각각의 경계 포함); 또는
약, 또는 적어도 3 cm-1, 4 cm-1, 5 cm-1, 6 cm-1, 7 cm-1, 10 cm-1, 15 cm-1, 또는 20 cm-1;
인 표면적 대 부피 비의 조성물로 충전되는, 용기.
306. 구현예 212 내지 302 중의 어느 하나의 조성물을 질환 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법으로서,
상기 조성물의 T 세포는 상기 대상체로부터 유래되지 않는 것인, 방법.
307. 치료 방법으로서,
구현예 212 내지 302 중의 어느 하나의 조성물을 질환 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, 상기 조성물의 T 세포의 적어도 일부는 대상체로부터 유래되지 않는 것인, 방법.
308. 구현예 306 또는 307에 있어서,
상기 조성물의 T 세포의 100% 미만은 상기 대상체의 T 세포와 HLA-동일한 것인, 방법.
309. 구현예 306 내지 308 중의 어느 하나에 있어서,
상기 질환 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 종양 또는 암인, 방법.
310. 구현예 306 내지 309 중의 어느 하나에 있어서,
상기 질환 또는 병태는 암인, 방법.
311. 질환 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 질환 또는 장애의 치료용 의약의 제조를 위한 구현예 212 내지 302 중의 어느 하나의 조성물의 용도로서,
상기 조성물의 T 세포는 대상체로부터 유래되지 않거나, 또는 T 세포의 적어도 일부는 대상체로부터 유래되지 않는 것인, 용도.
312. 구현예 311에 있어서,
상기 질환 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 종양 또는 암인, 용도.
313. 구현예 311 또는 312에 있어서,
상기 질환 또는 병태는 암 또는 종양인, 용도.
314. 질환 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 구현예 112 내지 302 중 어느 하나의 조성물로서,
상기 조성물의 T 세포는 상기 대상체로부터 유래되지 않거나 상기 T 세포의 적어도 일부는 상기 대상체로부터 유래되지 않는 것인, 조성물.
315. 구현예 314에 있어서,
상기 질환 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 종양 또는 암인, 조성물.
316. 구현예 314 또는 315에 있어서,
상기 질환 또는 병태는 암 또는 종양인, 조성물.
IX.
실시예
하기 실시예는 설명할 목적으로만 포함된 것으로 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되어서는 아니된다.
실시예
1: T 세포를 조작하는 공정 동안 상이한 공여자로부터
유래된
세포 집단 중에서 T 세포 증폭, 세포 생존력 및 세포 주기 엔트리의 평가
CD8+ T 세포는 7명의 상이한 예시적인 공여자(공여자 A-G)로부터 얻어졌으며, 자극, CAR 구조체(construct)을 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 사용한 형질도입 및 증폭을 위한 배양에 의해서 키메라 항원 수용체(CAR)가 조작되었거나, 또는 자극 및 배양을 위한 유사한 공정에 적용되었다. 세포 증폭, 세포 생존력, 및 자극되고 배양된 세포에서 세포 주기 엔트리가 평가되었다.
상기 조작된 세포 조성물을 생성하기 위해서, 인간 공여자 백혈구 성분채집술 샘플로부터 면역 친화도-기반 농축에 의해서 CD8+ 세포를 분리시키고 동결 보존하였다. 이어서 상기 동결 보존된 조성물을 해동시키고 항-CD3/항-CD28 항체 접합된 상자성 비드 및 재조합 사이토카인(예를 들어 IL-2, IL-7 및 IL-15)의 존재하에 자극 조건하에서 세포를 대략 24시간 동안 인큐베이션함으로써 자극하였다. 이어서 공여자 중 4명(공여자 D-G)으로부터의 세포에 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 함유하는 바이러스 제제를 사용하여 형질도입하였다. 형질도입 후, 37℃에서 인큐베이터에서 재조합 사이토카인(예를 들어 IL-2, IL-7 및 IL-15)의 존재하에 세포를 배양하였고 매일 배지를 보충하였다. 공여자 중 3명(공여자 A-C)으로부터 세포는 형질도입하지 않았으며 자극 후 재조합 사이토카인의 존재하에 배양되었다.
상기 자극을 시작한 후 최대 대략 240시간 동안 총 세포수에 대해 공여자 세포를 모니터하고, 시간에 따른 폴드 증폭(fold expansion)을 결정하였다. 생존력을 평가하고 세포를 세포 분열을 나타내는 마커(Ki67)에 대해 염색하고 자극 시작 후 72 시간에 유세포 분석으로 분석하였다.
도 1a 내지 도 1d에 나타낸 바와 같이, T 세포 증폭에서의 생존력(도 1a 및 1b), 세포 생존력(도 1c) 및 Ki67 발현(세포 주기 엔트리와 연관된 마커; 도 1d)이 상이한 공여자로부터의 CD8+ 세포 중에서 관측되었다.
실시예
2: 세포 제조 동안 공여자-
유래된
세포의 자극에 따른 CD57+ 및 CD57- 집단의 특성화
CD57+ 및 CD57- 세포의 표현형은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 세포를 조작하기 위한 예시적인 세포 제조 공정 동안 특성화되었다.
3명의 상이한 예시적인 공여자(공여자 A-C)로부터의 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 실시예 1에 기술된 것과 유사하지만 세포의 형질도입없이 예시적인 공정을 거쳤다. 세포 샘플은 자극 시작 직전 및 자극 동안 다양한 시점에 자극 시작 후 최대 약 216 시간 동안 수집되었다. 세포는, 유세포 분석에 의한 분석을 위해, 활성화(CD25 및 CD69), 증식 능력(CD57), 세포 분열(Ki67)과 관련된 마커를 포함한 다양한 마커, 및 T 세포 분화 표현형(예를 들어 나이브-유사 T 세포, 이펙터 T(TEFF) 세포, 기억 T 세포, 중앙 기억 T(TCM) 세포, 이펙터 기억 RA T(TEMRA) 세포)와 관련된 다양한 표면 마커로 염색되었다. CD57 발현, Ki67 발현 및 T 세포 분화 표현형 간의 연관성을 평가하기 위해 계층적 클러스터링 분석(hierarchical clustering analysis)을 수행하였다.
도 2a 내지 2c에서 나타낸 바와 같이, CD57+ T 세포는 자극 시작시에 상기 공여자 세포 집단 중에 존재하였으며, CD57+ T 세포의 백분율은 자극 및 배양 동안 상기 집단 중에서 감소되었다[도 2a 및 2b 참조]. CD57+ T 세포의 빈도는 자극 시작 후 대략 48시간 감소하였으며, 이것은 일반적으로 T 세포 증폭 및 생존력 증가와 일치하였다. 자극 후, Ki67의 발현에 기반하여 CD8+ T 세포의 서브세트만이 세포 주기에 진입하였다. Ki67의 발현은 자극 후 CD57+ 세포에서 실질적으로 증가하지 않았다. 대조적으로, Ki67+ 세포의 백분율은 CD57- 세포 사이에서 실질적으로 증가하였다(도 2a 및 2c 참조). CD8+ 세포 구획(CD8+ cell compartment)과 대조적으로, CD4+ 세포 중 CD57+ 세포는 자극 시작시 낮은 수준으로 존재하였으며, CD57+ 세포의 비율은 자극 및 배양 공정의 종료시에 증가하였다(도 2d). 이 결과는 CD8+ 세포 구획이 CD4+ 세포 구획보다 더 균질할 수 있다는 관찰과 일치한다.
특히, 공여자-유래 조성물은 수확을 위한 예시적인 임계 세포수(수확 기준)에 도달하는 데 필요한 시간에서 가변성을 나타냈으며, 이는 다양한 면역 표현형 마커의 발현에서 생존력에 상응하였다. 1명의 공여자 유래 조성물은 수확 기준에 도달하는데 7일의 배양 시간만 필요하였다. 대조적으로, 또 다른 공여자-유래 조성물은 수확 기준에 도달하기 위해 8일의 배양 시간이 필요하였다. 2명의 공여자 조성물 사이의 CD57, Ki67, CD45RA 및 CD27 발현(유세포 분석에 의해 결정됨)의 분석은 도 2e 및 도 2f에 도시된다. 발현은 자극 직전 시간을 나타내는 시점 t = 0에서 시작하여 분석되었다. 도 2e에 도시된 바와 같이, 모든 평가 시점에, 실질적으로 보다 높은 CD57 발현은, 수확 기준("수확까지 7일"; 하단 열로 나타냄)에 도달하는데 7일이 필요한 공여자 세포 조성물과 비교하여, 수확 기준("수확까지 8일"; 하단 열로 나타냄)에 도달하는데 8일이 필요한 공여자 세포 조성물에서 관찰되었다. 도 2f에 나타낸 바와 같이, 모든 평가 시점에, 7일이 필요한 조성물의 세포는 8일이 필요한 조성물의 세포에 비해 CD27+ CD45RA+의 더 높은 빈도를 나타냈다. 8일이 필요한 조성물로부터의 세포는 평가된 모든 시점에 실질적으로 더 낮은 빈도의 CD27+ 세포를 나타냈다. 이러한 관찰은 출발 물질에서 더 높은 빈도의 CD27+ 세포를 나타내는 세포 조성물이 배양 공정 말기에 더 나은 증폭 및 더 높은 빈도의 그러한 세포를 나타낸다는 발견과 일치한다.
도 3a에 나타낸 바와 같이, CD57+ T 세포는 자극 후 활성화를 나타내는 마커(CD69 및 CD25)를 발현하는 것으로 관찰되었다. CD57+ 세포는 활성화와 관련된 표현형을 나타냈으며 초기 공정 단계 내내 지속되었다. 계층적 클러스터링 분석은 CD57+ 및 Ki67- T 세포가 CD57- 및 Ki67+ 세포(도 3c)와 비교하여 더 분화된 이펙터 세포 집단과 관련된 표현형 특징을 나타내는 것을 보여 주었다(도 3b). Ki67+ 집단은 주로 CD27+CD28+인 세포를 포함하고, Ki67- 집단은 CD57+ 세포에 대해 농축되고 CD27-CD28- 표현형과 일치하였다.
상기 결과는 CD57+ T 세포가 자극을 받을 수 있는 반면, 보다 말기에 분화된 세포와 관련된 표현형 및 감소된 증식 능력을 나타내는 관찰과 일치하였다. 일부 측면에서, CD27+ T 세포는 CAR T 세포 제조 공정 동안 대부분의 증폭된 세포에 기여하는 것으로 관찰되었다. 대조적으로, CD57+ T 세포는 증폭되지 않았으며 최종적으로 제조된 CAR T 세포 조성물의 세포에 최소한으로 기여하였다. 일부 측면에서, 감소된 증식 능력을 나타낼 수 있는 세포 집단에서 CD57+ 세포의 존재는 T 세포 제조 공정을 거치는 세포 집단의 변이 및 이종성에 기여할 수 있다.
실시예
3: 투입 조성물 중의 공여자 CD57+ 세포의 빈도 및 세포 증폭, 생존력, 자극 시약 및 사이토카인에 관한 효과
공여자-매칭된 CD57+ 및 CD57- 세포를 함유하는 투입 조성물을 특정 비율로 혼합하고 상기 세포의 생존력을 분석하였다.
면역 친화도-기반 농축에 의해서 CD57+ 세포의 양성 선택에 의해 공여자 대상체로부터 얻어진 CD8+ T 세포의 조성물로부터 CD57+CD8+ T 세포 및 CD57-CD8+ T 세포를 분리시켰다. 분리된 집단의 순도는 유세포 분석에 의해 결정되었다. 다양한 빈도의 CD57+ T 세포가 제조 공정에 미치는 영향을 평가하기 위해, 자극 전에 분리된 CD57+ 및 CD57- 집단을 혼합하여 (1) 100% CD57+ 세포; (2) 75% CD57+ 세포; (3) 25% CD57+ 세포; 및 (4) 0% CD57+ 세포의 빈도의 CD57+ 세포를 함유하는 투입 조성물을 생성하였다. 상이한 적정된 투입 조성물(titrated input composition)을, 항-CD3/항-CD28 항체-접합된 비드 및 재조합 사이토카인을 사용한 인큐베이션에 의한 자극, 및 CAR을 암호화하는 핵산을 함유하는 바이러스 제제를 사용한 형질도입을 포함하는, 실시예 1에 기재된 바와 유사한 CAR-발현 세포에 대한 예시적인 제조 공정에 적용하였다. 자극 시작 후 최대 약 288 시간 동안 시간에 따른 총 세포수 및 생존력에 대해 세포를 모니터링하였다. 자극 시작 후 48 시간에 세포 배양 플레이트의 웰 이미지를 얻었고, 자극 시약의 존재하에 세포 클러스터링에 대해 평가하였다. 자극 시작 24 시간 및 48 시간 후에 배양 배지 내 IL-2의 농도를 평가하였다.
도 4a에 나타낸 바와 같이, 더 높은 빈도의 CD57+ 세포를 함유하는 투입 조성물은 더 느린 세포 증폭을 나타내었고, 수확을 위한 예시적인 임계 세포수(수확 기준; 좌측 패널 상의 선으로 표시됨)에 도달하기 위해 더 긴 배양 시간을 필요로 하며, 더 낮은 빈도의 CD57+ 세포를 함유하는 투입 조성물에 비해 더 낮은 세포 생존력을 나타냈다. 100% CD57+ 세포를 함유하는 조성물에서 매우 낮거나 증폭이 전혀 관찰되지 않았다. 일반적으로 투입 조성물에서 CD57+ 세포의 빈도는 수확 기준을 달성하는데 필요한 배양 기간과 관련이 있는 것으로 관찰되었다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, 더 높은 빈도의 CD57+ 세포를 함유하는 투입 조성물은 또한 48 시간에 자극 시약(항-CD3/항-CD28 항체 접합된 상자성 비드)의 존재하에 세포 클러스터를 형성하여, 세포가 자극에 반응함을 입증하였다. 자극 시작 24 시간 및 48 시간 후, 더 낮은 빈도의 CD57+ 세포를 함유하는 투입 조성물의 배양에 비해 더 높은 빈도의 CD57+ 세포를 함유하는 투입 조성물의 배양에서 배양 배지 내 IL-2의 농도가 더 낮다는 것이 관찰되었다(도 4c).
결과는 투입 조성물에서 CD57+ 세포의 빈도가 전체 세포 증폭 및 세포 생존력에 영향을 미칠 수 있다는 관찰과 일치하였다. CD57+ 세포의 빈도가 더 높은 투입 조성물은 수확 기준에 도달하기 위해 더 긴 배양 시간이 필요하였다. 일부 측면에서, 자극 및 점유 또는 자극 시약을 사용할 수 있는 CD57+ 세포는 배양 조건 중에 존재하는 IL-2를 소비하고 배양 세포 카운트 수에 기여하는 것으로 관찰되었다. 이는 CD57+ 세포의 존재가 제조 공정 동안 집단 내의 다른 세포에 영향을 미칠 수 있어서, 상이한 공여자로부터 유래된 세포 집단에서 CD57+ 세포를 고갈시키는 것이 상이한 공여자로부터의 세포 집단 내에서 및 그 사이에서 요구되는 배양 시간의 변동을 감소시키고 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예
4: 공여자 세포 조성물에서 CD57+ 세포의 고갈 및 배양 기간에 관한 효과
CD57+ 세포가 고갈된 투입 조성물을 예시적인 제조 공정에 적용하고, 수확 기준에 도달하기 전에 세포 표현형 및 배양 기간을 평가하였다.
CD8+ 세포는 4명의 다른 대상체로부터 얻어졌고 각각 두 개의 아암(arm)으로 분리되었다. 하나의 아암에서, CD57+ 세포는 투입 조성물을 생성하기 위해 세포 조성물(고갈됨)에서 고갈되었고, 순도는 유세포 분석에 의해 평가되었다. 다른 쪽에서는 CD57+ 세포(고갈되지 않음)가 고갈되지 않고 CD8+ 세포가 투입 조성물로 사용되었다. 상기 고갈된 및 고갈되지 않은 투입 조성물을, 항-CD3/항-CD28 항체-접합된 비드 및 재조합 사이토카인을 사용한 인큐베이션에 의한 자극, CAR을 암호화하는 핵산을 함유하는 바이러스 제제를 사용한 형질도입, 및 증폭을 위한 조건하의 배양을 포함하는, 실시예 1에 기재된 바와 유사한 바이러스 형질도입에 의한 CAR-발현 세포에 대한 예시적인 제조 공정에 적용하였다. 자극 시작 직전에 세포 조성물의 샘플을 Ki67, CD3, CD57, CD27 및 CD28에 대해 염색하였다. 고갈되고 고갈되지 않은 배양이 예시적인 수확 기준에 도달하는 기간을 평가하였다. 수확 기준은 세포의 약 10배 증폭을 나타내었다.
도 5a에 나타낸 바와 같이, 고갈되지 않은 투입 조성물은 다양한 빈도의 CD57 세포를 나타냈다. 도 5b에 나타낸 바와 같이, CD27+ CD28+ 세포의 빈도는 고갈되지 않은 투입 조성물에 비해 고갈된 투입 조성물 중에서 보다 높고 많은 일관성이 있다. 4명의 상이한 공여자의 고갈되지 않은 그리고 고갈된 투입 조성물로부터의 CD27 발현에 대한 플로우 플롯이 도 5c에 도시되어 있다. 도 5c의 좌측 패널은 4 명의 공여자로부터의 고갈되지 않은 샘플로부터 CD8+ T 세포가 다양한 정도의 CD27 발현을 나타내는 것을 보여준다. 대조적으로, 도 5c의 우측 패널에서 나타낸 바와 같이, 유사하게 일관된 CD27 발현에 의해 입증된 바와 같이, 투입 조성물로부터 CD8+CD57+ 세포의 고갈은 공여자 전반에 걸쳐 출발 물질 일관성을 개선시켰다. 아울러, 이러한 결과는 시작 공여자 백혈구 성분채집술 샘플에서 상이한 공여자 세포 내에서 및 중에서 나이브-유사 또는 중앙 기억 세포의 가변성(variability)이 CD57+ 세포를 고갈시켜서 개선될 수 있음을 입증한다.
T 세포 증식 및 성장의 마커인 Ki67의 발현은 자극 시작 72 시간 후 공여자 투입 조성물에서 총 CD3+ T 세포 중에서 평가되었다. 도 5d에서 나타낸 바와 같이, Ki67 발현은 고갈되지 않은 공여자 투입 조성물에 비해 고갈된 공여자 투입 조성물 중에서 더 높고 덜 가변적이었다.
도 5e에서 나타낸 바와 같이, 수확까지의 배양 기간(자극 시작부터 수확 기준에 도달한 시간까지)은 일반적으로 고갈되지 않은 공여자 투입 조성물과 비교하여 고갈된 공여자 투입 조성물 중에서 더 짧고 일관성이 있었다. 자극 후 다양한 날에 총 T 세포에 의해 평가된 하나의 예시적인 공여자로부터의 세포 증폭이 도 5f에 도시되어 있다. 결과는 고갈된 공여자 투입 조성물로부터 증폭된 총 세포수가 자극 후 여러 시점에 고갈되지 않은 공여자 투입 조성물로부터 증폭된 총 세포수보다 더 높은 것으로 관찰되었음을 보여준다(도 5f). 이러한 발견은 고갈된 공여자 집단이 더 많은 수의 분열 및 총 세포로 인해 수확 기준에 더 짧은 기간을 나타낼 수 있다는 관찰과 일치한다.
예시적인 키메라 항원 수용체(CAR)를 사용하여 고갈된 그리고 고갈되지 않은 공여자 세포의 형질도입 후, CAR을 발현하는 세포의 백분율을 평가하였다. 도 5g에 나타낸 바와 같이, 고갈된 공여자 조성물 중 CAR을 발현하는 세포의 백분율은 고갈되지 않은 공여자 조성물 중 항-CD19 CAR을 발현하는 세포의 백분율보다 더 일관성이 있었다. 이 결과는 상이한 공여자로부터 유래된 것들을 비롯하여 CD57+ 세포의 고갈이 T 세포에 의한 CAR 발현의 일관성을 향상시킬 수 있다는 관찰과 일치한다.
아울러, 결과는 CD57+ 세포의 선택된 고갈이 공여자 세포 집단의 증폭을 개선하고 수확 기준에 도달하는데 필요한 배양 기간을 감소시켰다는 관찰과 일치하였다. 또한, 이러한 발견은 CD57+ 세포의 고갈이 상이한 공여자로부터의 출발 물질(예를 들어 CD27+ 세포) 중에서 세포 표현형의 가변성을 감소시킬 수 있음을 나타낸다. 일부 측면에서, 다중 공여자로부터의 투입 조성물 중 CD57+ T 세포의 존재 및 빈도에서의 가변성은 CAR T 세포 제조 공정에 영향을 미칠 수 있으며, 배양 기간 및 세포 조성 속성의 가변성을 초래할 수 있다. 일부 측면에서, 다중 공여자로부터 유래된 투입 조성물에서 CD57+ T 세포의 고갈은 제조된 CAR T 세포 조성물의 공정 제어 및 일관성을 개선시킬 수 있다.
실시예
5:
비호지킨
림프종(NHL) 환자의 말초 혈액에서 57+CD8+ T 세포 빈도
비호지킨 림프종(NHL) 환자의 말초 혈액 세포를 CD57+ 발현 및 T 세포 분화 표현형과 관련된 다양한 표면 마커에 대해 평가하였다.
임상 연구에서 NHL 환자의 백혈구 성분 채집술 샘플에서 CD4+ 및 CD8+ 세포의 개별 조성물을 면역 친화도-기반 농축에 의해 분리하고 동결 보존하였다. 각각의 분리된 세포 조성물로부터의 세포를 후속적으로 해동하고 항-CD3/항-CD28 항체-접합된 상자성 비드 및 재조합 사이토카인(예를 들어 IL-2, IL-7 및 IL-15)의 존재하에 자극 조건하에서 48시간 동안 세포를 개별적으로 인큐베이션함으로써 자극하였다. 자극 시작 48 시간 후, 세포 조성물의 샘플은 유세포 분석에 의한 분석을 위해, 리니지(lineage)(CD4 및 CD8), 증식 능력(CD57), 세포 분열(Ki67) 및 T 세포 분화 표현형(나이브-유사 T 세포, 이펙터 T(TEFF) 세포, 기억 T 세포, 중앙 기억 T(TEMRA) 세포)과 관련된 마커를 포함하는 다양한 마커로 염색되었다. CD57+ 발현 및 T 세포 분화 표현형과 관련된 다양한 마커 사이의 연관성을 평가하기 위해 계층적 클러스터링을 수행하였다.
도 6a에 나타낸 바와 같이, 투입 조성물 중의 CD57+ 세포의 빈도는 다른 NHL 환자의 CD8+ 세포 집단 중에서 변화하였다. 도 6b에 나타낸 바와 같이, CD57 + CD8 + 세포의 백분율 및 Ki67+ 세포의 백분율 사이의 일반적인 역관계는 자극 시작 후 48 시간에 관찰되었다. 도 6c에 나타낸 바와 같이, 계층적 클러스터링은 기억 및 이펙터 T 세포 분화 표현형으로 구별되는 클러스터를 보여 주며, 이러한 표현형 클러스터는 CD57+ T 세포의 높거나 낮은 빈도로 샘플을 더 클러스터링하였다.
상이한 공여자 투입 조성물로부터의 CD57+ 세포의 분석은 Ki67 발현이 상이한 T 세포 분화 면역 표현형을 갖는 세포 중에서 변한다는 것을 밝혀졌다. 도 6d에 도시 된 바와 같이, Ki67을 발현하는 생존 CD57+ 세포의 백분율은 CD27-CD45RA+ 세포에서 가장 낮았고, CD27-CD45RA- 세포, CD27+CD45RA+ 및 CD27+CD45RA- 세포에서 더 높았다.
별도의 CD4+ 및 CD8+ 공여자 세포 조성물을 Ki67, CD27, CD45RA 및 CD57의 발현에 대해 분석하였다. 도 6e에 나타낸 바와 같이, 많은 백분율의 CD8+CD57+ 세포가 CD27-CD45RA+였으며, 이는 이들 T 세포가 말단 분화 이펙터 기억 RA(TEMRA) T 세포임을 나타낸다. 이러한 발견은 CD57+ T 세포가 다양한 면역 표현형의 분화된 이펙터 T 세포임을 입증한다.
결과는 NHL 대상체 중 말초 순환에서 CD57+ T 세포의 가변 주파수 관찰과 일치하였다. 상이한 공여자로부터 생성된 세포 조성물을 사용한 발견과 유사하게 (이전 실시예에서 기술된 바와 같이), 높은 CD57 발현은 감소된 증식 능력을 갖는 보다 분화된 세포를 나타내는 표현형과 연관되는 것으로 관찰되었다.
실시예
6:
이배
수(Number of Doublings) 및 세포 분화 내지 환자 반응의 관계
CD19에 특이적인 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 자가 T 세포를 함유하는 예시적인 치료용 T 세포 조성물이 생성되었다. 상기 항-CD19 CAR은 뮤린 항체(FMC63으로부터 유래된 가변 영역)로부터 유래된 항-CD19 scFv, 면역글로불린 유래 스페이서, CD28로부터 유래된 막 관통 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공자극 영역 및 CD3-제타 세포 내 신호 전달 도메인을 함유했다.
재발 및 불응성 비호지킨 림프종(NHL)이 있는 대상체에 투여하기 위한 세포 조성물의 생성을 위해, 자가 세포가 백혈구 성분 채집술을 통해 대상체에서 분리되었다. 백혈구 성분 채집술 샘플은 CAR 발현 세포의 생성을 위한 공정를 거쳤다. 공정는 자동 세척 및 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 정제를 위한 면역 친화도 기반 선택을 이용한 세포의 세척을 포함했고, CD8+(세포의 중앙값의 99%, 사분위 간 범위(IQR) 98-100%가 CD8+임) 및 CD4+(중앙값의 99%, IQR 99-100% 세포가 CD4+임) 세포로 각각 농축된 2개의 조성물을 초래했다.
농축된 CD4+ 및 CD8+ 조성물의 세포는 항-CD3/항-CD28 항체-접합된 상자성 비드로 별도로 활성화되었고, 이어서 4-1BB 공자극 도메인을 갖는 항-CD19 CAR을 암호화하는 벡터로 렌티바이러스 형질도입에 별개로 노출되었다. 상기 CAR은 뮤린 항체에서 유래된 항-CD19 scFv, 면역 글로불린 스페이서, CD28에서 유래된 막 관통 도메인, 4-1BB에서 유래된 공자극 영역 및 CD3-제타 세포내 신호 전달 도메인을 함유하였다. 이어서 형질도입된 집단을 세포 증폭을 위해 재조합 IL-2 및 IL-15 사이토 카인(및 추가적으로 CD4+ T 세포 조성물을 위한 재조합 IL-7)의 존재하에 개별적으로 인큐베이션하였다. 증폭을 위한 조건하에서의 배양은 약 4 배 증폭의 역치에 도달할 때까지 락킹 모션 바이오리엑터(rocking motion bioreactor)에서 수행되었다. 증폭된 CD8+ 및 CD4+ 세포는 제형화되었고, 투여 전에 별도로 동결 보존 및 저장되었다. 세포의 건강을 나타내는 파라미터에서 상이한 환자 특성을 갖는 것과 같은 상이한 환자 유래 로트 및/또는 세포 조성물 사이의 변이를 최소화하기 위해, 세포를 로트에 걸쳐 일정한 부피로 유지했다. 세포 생성물은 좁은 범위의 생존 가능한 세포 농도(일 군의 대상체에 대한 세포 조성물의 분석에 기초함, CD8+: 중앙값 31×106 세포/mL, IQR 28-40×106 세포/mL, N=38; CD4+: 중앙값 35×106 세포/mL, IQR 31-40×106, N=36)를 나타냈다.
생성된 T 세포 조성물이 하기 기재된 바와 같이 재발 및 불응성 비호지킨 림프종(NHL)이 있는 대상체에 투여하기 위해 사용되었다.
A. 치료용 T 세포 조성물의 예시적인 특성
하기 기재된 재발 및 불응성 비호지킨 림프종(NHL)이 있는 대상체에 투여하기 위해 사용된 생성된 치료용 T 세포 조성물을 유세포 분석을 이용하여 CCR7 및 CD27에 대해 분석하였다. CD4의 표면 발현 수준 및 대리 마커로 사용된 절단형 수용체도 분석되었다.
각각의 생성된 치료 조성물에 대해, 생성된 세포 조성물의 배가 수를 아크리딘 오렌지(AO) 및 프로프리둠 요오드화물(propridum iodide, PI) 또는 DAPI로 이중 형광 염색에 의해 세포의 총 핵수(total nuclear count, TNC)에 기초하여 하기 공식을 이용하여 또한 결정하였다:
1) 세포 배가 = ln(수확시 TNC/활성화 후 3일의 TNC)/ln 2
도 7은 치료 조성물 생성 공정에서 배가 수와 CD4+CAR+ 세포 중의 CD27+ 세포의 백분율 사이 연관성을 도시한다. CD8+ T 세포에 대해 유사한 결과가 관찰되었다. 결과는, 일반적으로, 치료용 T 세포 조성물을 생성하는 과정 중 보다 작은 수의 배가가 CD27+ 세포의 증가된 수준과 연관됨을 나타낸다. 이론에 구속되기를 원하지 않고, 상기 결과는, 상기 실시예에 기재된 바와 같이 조작된 T 세포를 생성하기 위한 공정에서 CD27+ 세포의 증가된 백분율이 상기 공정에서 제한된 배가에 의해 영향을 받을 수 있다는 관찰과 일치한다.
상기 기재된 바와 같이 실질적으로 동일한 공정에서 증폭 단계 중 공정 내 시드 밀도 모델링 연구는, 상대적으로 보다 높은 시드 밀도(예를 들어 0.35×106 세포/mL 이상)가 보다 낮은 시드 밀도(예를 들어 0.05×106 세포/mL 이하)에 비해 수확 기준을 달성하기 위한 집단 배가 수를 감소시킬 것이란 예상을 실증했다(도 8a). 모델링은 또한 상대적으로 보다 높은 시드 밀도(도 8b) 또는 보다 짧은 공정 지속 기간(도 8c)이, 보다 낮은 시드 밀도 또는 보다 긴 공정 지속 기간에 비해 각각 산출 치료용 T 세포 조성물(예를 들어 약물 제품)에서 CD27에 대해 양성인 CD8+CAR+ T 세포의 백분율 증가를 또한 초래할 것이란 예상을 드러냈다. 상기 데이터는, 증폭 단계 초기에 세포의 보다 높은 시드 밀도 또는 보다 짧은 공정 지속 기간이 조작된 치료용 T 세포 조성물에서 중앙 기억 세포 비율의 증가를 초래할 수 있다는 발견과 일치한다.
B. 항-CD19 CAR
+
T 세포 조성물의 투여
상기 기술된 치료적 CAR+ T 세포 조성물은 임상 연구에서 재발 또는 불응성(relapsed or refractory, R/R) 공격성 비-호지킨 림프종(NHL)을 가진 대상체에게 투여되었다. 구체적으로, 확산성 거대 B 세포 림프종(DLBCL) 데 노보(de novo) 또는 지연성 림프종(NOS), 고-등급(high-grade) B 세포 림프종(더블/트리플 히트(hit) 포함)로부터 형질전환된 DLBCL, 만성 림프구성 백혈병(CLL) 또는 한계 영역 림프종(MZL)으로부터 형질전환된 DLBCL, 원발 종격동 거대 b-세포 림프종(primary mediastinal large b-cell lymphoma, PMBCL), 및 여포성 림프종 3b 등급(FLG3B)을 비롯하여, R/R NHL을 갖는 성인 인간 대상체의 코호트는 항-CD19 CAR-발현 T 세포 조성물로 투여되었다. 전체 코호트 내 대상체의 코어 서브세트에 대하여 결과를 개별적으로 평가하였다(불량한 전신 활동도(ECOG 2)를 갖는 대상체들을 제외한, 한계 영역 림프종(MZL) 및/또는 만성 림프구성 백혈병(CLL, Richter's)으로부터 형질전환된 DLBCL, 및 원발성 종격동 거대 b-세포 림프종(PMBCL)이 있는 대상체들을 제외한 외), 여포성 림프종 등급 3b(FLG3B)(코어 코호트)). 코어 코호트에는 DLBCL, NOS 및 형질전환된 여포성 림프종(tFL) 또는 고등급 B-세포 림프종(더블/트리플 히트) 또는 고-등급 B-세포 림프종이 있는 대상체, MYB 및 BCL2 및/또는 DLBCL 조직학을 사용한 BCL6 재배열(더블/트리플 히트)이 있는 대상체 및 ECOG PS(Eastern Cooperative Oncology Group performance status)가 0 또는 1인 대상체가 포함되었다. 이 실시예에서 제시된 시점에의 분석은 항-CD19 CAR-발현 세포가 투여된 전체 코호트(88 명(코어 코호트로부터의 65 명)은 반응을 평가했으며 91 명(코어 코호트로부터의 67 명)은 안전성을 평가하였음)에서 총 91 명의 대상체에 대한 평가를 기반으로 한다.
항-CD19 CAR-발현 세포를 함유하는 동결 보존된 세포 조성물을 정맥 내 투여 전에 해동시켰다. 치료적 T 세포 용량은 대략 1 : 1의 목표 비율로 별도로 투여된 제제화된 CD8+ CAR+ 집단 및 제제화된 CD4+ CAR+ 세포 집단을 투여하는 것에 의해 정해진 세포 조성물로서 투여되었다. 대상체에게 다음과 같이 단일 또는 이중 용량의 CAR-발현 T 세포(각 단일 용량은 각각 CD4+ CAR-발현 T 세포 및 CD8+ CAR-발현 T 세포의 개별 주입을 통해)가 투여되었다: 5×107 개의 총 CAR-발현 T 세포를 함유하는 단일 용량의 용량 수준 1(DL1), 또는 1×108 개의 총 CAR-발현 T 세포를 함유하는 단일 용량의 용량 수준 2(DL2). 일부 경우에, 투약 오류(dosing error)로 인하여, 대상체에게 2 회 용량 스케줄을 통해 2 회 DL2 용량을 부주의하게 받은 1 명의 대상체를 포함하여, 각 용량이 대략 14 일 간격으로 1 일 및 14 일에 투여되는 DL1의 이중 용량이 대상체에게 투여되었다. DL1 및 DL2에서 투여된 조성물에 대한 T 세포 서브세트의 용량 수준 및 목표 수(target numbers)는 표 E1에 제시되어 있다. 코어 코호트에서, 34 명의 대상체에게 DL1이 투여되었고, 27 명의 대상체에게 DL2로 투여되었다.
표 E2는 두 용량 수준에서 전체 코호트 및 코어 코호트에 대한 전체 반응 및 안전성 결과를 보여준다. 완전 반응(CR)을 보이는 52%의 대상을 포함하여 객관적 반응률(ORR)은 74%였다. 임의의 등급의 사이토카인 방출 증후군(CRS)의 발생률은 35%였으며 1%는 중증 CRS였고; 및 임의의 등급의 신경 독성(NT)의 발병률은 19%였으며, 1%는 중증 NT였다.
a 유사한 결과를 갖는 DL1D(용량 수준 1, 2회 용량 스케줄)로 치료받은 4 명의 환자.
b PD, 사망 또는 28-일 재병기설정 스캔(restaging scans)의 이벤트를 갖는 환자를 포함한다. 한 환자는 이용 가능한 재병기설정 스캔이 없었다.
c 데이터 스냅 샷 날짜 28 일 이전에 적어도 1 회 용량의 순응(conforming) CAR-발현 세포 생성물을 받았거나 사망한 모든 대상체를 포함한다.
C. 항-CD19 CAR-발현 T 세포의 세포 속성과 반응 사이의 관련성
치료 조성물에서 CAR+ T 세포의 특정 표현적 속성과 임상 반응 결과와 관련된 파라미터와의 관계를 평가하였다. 조성물에서의 기억 표현형과 기능 사이의 상관 관계는 중앙 기억 서브세트와 CAR+ 세포의 피크 생체 내(in vivo) 증폭(ρ=0.42, P=0.002), 및 관찰된 무진행 생존 (PFS) (카플란-마이어 생존 추정치, P=0.0164) 간의 양의 상관 관계로 해석되었다. 도 9a-9d는 특정 임계값 이상 또는 이하인 CD8+ CAR+ 세포 중에서 (무진행 생존에 대한 도 9a, 반응 지속 기간에 대한 도 9c) 또는 CD4+ CAR+ T 세포 중에서(무진행 생존에 대한 도 9e, 반응 지속 기간에 대한 도 9d) CCR7+CD27+ CAR+ T 세포의 빈도를 함유하는 조성물이 투여된 그룹으로 나눈, CAR+ T 세포 조성물이 투여된 대상체에 대한 카플란-마이어 생존 곡선을 보여준다. 조성물 중 더 높은 빈도의 CCR7+CD27+ 기억 세포는 더 긴 무진행 생존과 상관 관계가 있는 것으로 관찰되었다.
단변량 분석으로 치료용 T 세포 조성물을 생성하는 공정 중 T 세포 집단 배가(population doubling, PDL)와 비호지킨 림프종(NHL) 환자의 무 진행 생존 확률(probability of progression free survival, PFS) 사이의 역 상관 관계가 밝혀졌다. 도 10은 CD8+/CAR+ T 세포에서 "높은(high)"(>6 PDL) 또는 "낮은(low)"(<6 PDL) PDL 수를 갖는 환자에 대한 최적 분할 로그 순위 테스트에 기초한 PFS 곡선을 나타낸다. 상기 결과는 치료용 T 세포 조성물을 생성하는 공정에서 T 세포 집단의 배가 수를 제한할 수 있는 요인이 지속적인 무 진행 생존을 나타낼 대상체의 가능성을 개선할 수 있다는 발견과 일치한다.
실시예
7: 치료학적 세포 조성물을 생성하는 공정에서 선택된 (입력) 세포 조성물의 특징들의 평가
실시예 6에 기술된 과정에 의해 항-CD19 CAR로 조작하기 전에 재발 및 불응성 비호 지킨 림프종(NHL)을 앓는 대상체로부터 선택된 T 세포의 표현형 속성을 평가하였다. CD4+ 및 CD8+ T 세포는 다수의 대상체로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 백혈구성분채집술로부터의 면역친화도-기반 강화(immunoaffinity-based enrichment)에 의해 선택되었다. 이러한 선택된 T 세포의 조성물(유전적 조작 전에, "전-조작 조성물"로 지정됨)은 C-C 케모카인 수용체 타입 7 (CCR7), CD27 및 CD45RA를 비롯한 이펙터 기억 또는 중앙 기억세포 서브타입과 같은 특정 T 세포 서브타입을 나타내는 세포 표면 마커의 발현을 비롯하여 다양한 속성에 대하여 평가되었다.
농축된 CD4+ 및 CD8+ 조성물(예를 들어 투입 조성물)의 분석은 중앙 기억 T 세포 서브 세트에 존재하는 것과 같은 나이브 유사 마커(예를 들어 CD27+CD28+ T 세포)에 대해 양성인 T 세포의 백분율이 NHL 환자 중에서 매우 가변적임을 나타냈다(도 11). 이들 데이터는 중심 기억 T 세포 서브 세트의 환자 간 T 세포 이종성이 CAR+ T 세포 치료용 T 세포 조성물을 생성하는 데 사용된 선택된 (입력) T 세포 조성물에 존재함을 나타낸다.
선택된 (입력) T 세포 조성물을 사용하여 실질적으로 실시예 6에 기재된 바와 같이 CD4+ 및 CD8+ 치료용 T 세포 조성물을 생성하였다. 생성된 세포 조성물의 배가 수는 또한 실시예 6에 기재된 바와 같이 세포의 총 핵 수(TNC)를 기반으로 결정되었다. 치료 조성물 생성하는 공정에서 배가 수와 선택된 (입력) T 세포 조성물에서 세포의 표현형 특성 사이 연관성이 결정되었다. 도 12에 도시된 바와 같이, 농축된 CD4+ (입력) 조성물에서 CD45RA 및 CCR7에 대해 음성 염색으로 확인된(CD45RA-CCR7-) 이펙터 기억 CD4+ T 세포의 보다 높은 비율은, 치료용 T 세포 조성물의 생성 중 집단 배가의 수와 양의 상관 관계가 있었다. CD8+ T 세포에 대해 유사한 결과가 관찰되었다.
상기 결과는, 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 공정에서 사용된 투입 조성물에서 나이브 유사 또는 중앙 기억 세포 서브 세트에 양성인 T 세포를 농축하고/거나 이펙터 기억 T 세포의 백분율을 감소시키는 것을 포함하는 접근법을 지지한다. 상기 결과와 일관되게, 상기 접근법은 조작된 치료용 T 세포 조성물의 하나 이상의 특징, 예를 들어 환자 대 환자 가변성의 감소, 조작된 치료용 T 세포 조성물을 생성하는 공정에서 집단 배가 수의 감소 및/또는 대상체가 지속적인 PFS를 나타낼 수 있는 가능성의 증가를 개선할 수 있다.
실시예
8: 비-증폭된 및 증폭된 조작 공장의
키네틱스
인간 T 세포(CD4+ 및 CD8+)는, 증폭을 위한 배양 단계(비-증폭 코호트)를 포함하지 않은 공정 및 증폭을 위한 재배 단계를 포함하는 공정(증폭 코호트)를 포함하는 다양한 제조 공정을 통해 키메라 항원 수용체(CAR)로 조작되었다. 다양한 공정에 의해 제조 공정 중 및 제조 후에 생산된 세포의 복합 분석이 수행되었다. 조작된 T 세포 조성물을 생산하기 위한 제조 수행은 실시예 8에 기술된 규모의 수행뿐만 아니라하기 기술된 공정을 포함한다. 제조 수행에는 또한 제조 수행과 실질적으로 동일하게 수행되었지만 세포를 조작하는 과정에서 더 적은 수의 T 세포가 사용된 축소 모델(scale-down model; SDM)이 포함되었다. 일반적으로, 축소 제조 수행은 표 E3에 설명된 공정 활동을 공유하였다.
상기 분석된 공정에서, T 세포는 항-CD19 CAR 또는 항-BCMA CAR로 조작되었다. 예시적인 항-CD19 CAR은 뮤린 항체 FMC63, 면역 글로불린 스페이서, CD28로부터 유래된 막 관통 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공자극 영역 및 CD3-제타 세포 내 신호 전달 도메인으로부터 유래된 항-CD19 scFv를 함유하였다. 벡터는 또한 T2A 서열에 의해 CAR 구조체로부터 분리된 CAR 발현에 대한 대리 마커 역할을 하는 절단된 수용체 분자를 암호화하였다. 예시적인 항-BCMA CAR은 BCMA에 특이적인 scFv 항원 결합 도메인, CD28 막 관통 영역, 4-1BB 공자극 신호 전달 영역, 및 CD3-제타 유래 세포 내 신호 전달 도메인을 함유하였다. 벡터는 또한 T2A 서열에 의해 CAR 구조체로부터 분리된 CAR 발현에 대한 대리 마커 역할을 하는 절단된 수용체 분자를 암호화하였다.
상기 공정은 항-CD3/항-CD28 상자성 비드 또는 항-CD3/항-CD28 Fab 접합된 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약을 사용한 T 세포의 자극을 포함하였다. 올리고머 시약에는 STREP-TACTIN® M2로 지정된 스트렙타비딘 뮤테인 중합체를 함유하였다[서열번호 73에 제시된 아미노산의 뮤테인 서열을 함유하는 스트렙타비딘 호모-테트라머(국제공개공보 제WO2018/197949호)]. 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 또한 미국특허 제6,103,493호 및 문헌 「Voss and Skerra (1997) Protein Eng., 1:975-982, and Argarana 등, (1986) Nucleic Acids Research, 1871-1882」에 기술된다. 자극제(항-CD3 및 항-CD28 Fab 단편)는 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약에 가역적인 결합에 의해 다량체화되었다. 항-CD3 및 항-CD28 Fab 단편은 각 Fab 단편에 융합된 스트렙타비딘 펩티드 결합 파트너를 통해 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머에 가역적으로 결합되었다. 항-CD3 Fab 단편은 하이브리도마 세포주 OKT3(ATCC® CRL-8001™; 또한 미국특허 제4,361,549호 참조)에 의해 생성된 CD3 결합 단클론 항체에서 유래되었고, 문헌 「Arakawa 등, J. Biochem. 120, 657-662 (1996)」에 기재된 항-CD3 항체 OKT3의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 함유했다. 상기 서열은 서열번호 89 및 90에 각각 제시된다. 항-CD28 Fab 단편은 항체 CD28.3(GenBank 수탁 번호 AF451974.1 하에 합성 단일 사슬 Fv 작제물로 기탁됨; 또한 문헌 「Vanhove 등, BLOOD, 15 July 2003, Vol. 102, No. 2, 564-570 페이지」에서 유래되었고, 서열번호 93 및 94에 각각 제시된 항-CD28 항체 CD28.3의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유했다. Fab 단편은 중쇄의 카복시-말단에 아미노산 서열 SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK(서열번호 79)을 갖는 2개의 스트렙타비딘 결합 모듈의 순차적 배열을 함유하는 스트렙타비딘 펩티드 결합 서열이 개별적으로 융합되었다. 펩티드 태그 Fab 단편은 재조합으로 생성되었다(국제공개공보 제WO 2013/011011호 및 제WO 2013/124474호 참조). 올리고머 스트레타비딘 뮤테인 시약에 대한 펩티드-태그된 항-CD3 및 항-CD28의 결합은 D-비오틴의 첨가에 의해 파괴되거나 역전될 수 있다. D-비오틴은 스트렙타비딘 뮤테인의 결합 파트너에 대한 결합을 위해 제제의 스트렙-태그와 경쟁하여 결합을 방해한다.
세포는 제조 수행 동안 및 종료 시에 다양한 시간에 수집하고 계수하고 CD4, CD8, CCR7, CD27 및 CD45RA를 포함한 표면 마커를 인식하는 항체로 염색한 후 생존력 및 유세포 분석법에 의해 평가되었다.
A. T 세포 조작 공정
세포의 출발원(동결 보존된 성분 채집술 또는 신선한 성분 채집술), 올리고머 자극 시약의 농도 및 자극에 사용된 세포의 수를 포함한 다양한 특징에서 차이가 나는 상이한 비증폭 공정를 이용하여 생성된 T 세포 조성물을 비교하였다. 또한 세포가 증폭을 위해 배양된 T 세포 조성물이 생성되었다. 공정는 건강한 공여자 또는 환자 공여자에서 수행되었다.
1. 비-증폭된 공정
백혈구 성분 채집술 샘플이 인간 공여자에서 수집되었고 세척되었다. CD4+ 및 CD8+ 세포는 동결 보존되지 않은 백혈구 성분 채집술 샘플에서 면역 친화도 기반 선택에 의해 직접 선택되었다. 선택 후, 별도의 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물이 동결 보존된 다음 해동되었고, 이어서 선택된 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 생존 가능한 CD4+ T 세포 대 생존 가능한 CD8+ T 세포의 1:1 비율로 혼합되어 투입 조성물이 생성되었다. 혼합된 입력 세포 조성물 유래 약 600×106 세포(약 300×106 CD4+ 및 300×106 CD8+)가 이 실시예에서 위에서 기재된 바와 같이 생성된 1x106 세포 당 0.8 ㎍의 항-CD3/항-CD28 Fab 접합 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약과 함께 인큐베이션하여 자극되었다. 자극은, 기본 배지(예를 들어 CTS™ OpTmizer 기본 배지, Thermo Fisher), T 세포 보충물(예를 들어 2.6% OpTmizer® T-세포 증폭 보충물, Thermo Fisher), 면역 세포 혈청 대체제(예를 들어 2.5% CTS™ 면역 세포 혈청 대체제), 2 mM L-글루타민, 디펩티드 형태의 L-글루타민(예를 들어 1.0% Glutamax™, Thermo Fisher), 100 IU/mL의 재조합 IL-2, 600 IU/mL의 재조합 IL-7 및 100 IU/mL의 재조합 IL-15를 함유하는 무혈청 완전 배지에서 18-30 시간(24±6 시간) 동안 수행되었다. 자극 후, 최대 300×106 세포가 예시적인 항-BCMA CAR 또는 예시적인 항-CD19 CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 회전 접종에 의해 형질도입되었다.
회전 접종 후에, 세포를 세척하고, 2 mM 글루타민은 있으나 재조합 사이토카인은 첨가되지 않은 기본 배지(예를 들어 CTS™ OpTmizer 기본 배지, Thermo Fisher)에서 최대 약 0.75×106 세포/mL의 밀도로 재현탁하고, 약 37℃에서 인큐베이터로 인큐베이션했다. 자극 개시 후 약 48 시간±6 시간(인큐베이션 시작 후 약 24시간)후에, 1.0 mM D-비오틴을 첨가하고 세포와 혼합하여 항-CD3 및 항-CD28 Fab 시약을 올리고머 스트렙타비딘 시약에서 해리시켰다. 세포를 추가 약 48 시간(자극 개시 후 96 시간±6 시간 또는 공정의 5 일까지) 동안 더 인큐베이션한 다음, 동결 보호제로 제형화하였다.
또다른 공정 B에서, 백혈구 성분 채집술 샘플이 인간 공여자에서 수집되었고 세척 및 동결 보존되었다. 동결 보존된 백혈구 성분 채집술 샘플이 해동되었고, 별도의 CD4+ 및 CD8+ 세포 조성물이 면역 친화도 기반 선택에 의해 각 샘플에서 선택되었고, 이어서 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 목표와 혼합되어 최대 약 900×106개의 생존 가능한 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 투입 조성물이 생성되었고, 여기서 생존 가능한 CD4+ T 세포 대 생존 가능한 CD8+ T 세포의 비율은 다를 수 있다. 혼합된 입력 세포 조성물을 이 실시예에서 위에서 기재된 바와 같이 생성된 1×106 세포 당 1.2 ㎍의 항-CD3/항-CD28 Fab 접합 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약과 인큐베이션함으로써 자극하였다(여기서 1.2 ㎍의 올리고머 자극 시약은 0.9 ㎍의 올리고머 입자 및 0.15 ㎍의 항-CD3 Fab 및 0.15 ㎍의 항-CD28 Fab를 포함한다). 자극은 위에서 기재된 동일한 무혈청 완전 배지에서 16-24시간(20±4시간) 동안 수행되었다. 자극 후, 최대 약 600×106 세포가, CAR, 위에서 기재된 동일한 예시적인 항-BCMA CAR 또는 예시적인 항-CD19 CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 회전 접종에 의해 형질도입되었다. 본 연구에서, 보다 높은 농도의 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약과 함께 인큐베이션된 세포는 형질도입 효율의 개선을 나타냈다(데이터는 도시되지 않음). 이러한 공정에서 회전 접종 후에, 세포를 세척하고, 2 mM 글루타민 및 2.6% T 세포 보충물(예를 들어 2.6% OpTmizer® 보충물, Thermofisher)은 있으나 재조합 사이토카인은 첨가되지 않은 기본 배지(예를 들어 CTS™ OpTmizer 기본 배지, Thermo Fisher)에서 0.75×106 세포/mL의 밀도로 재현탁하고, 약 37℃에서 인큐베이터로 인큐베이션했다. 자극 개시 후 약 48 시간±6 시간(인큐베이션 시작 후 약 24시간)후에, 1.0 mM D-비오틴을 첨가하고 세포와 혼합하여 항-CD3 및 항-CD28 Fab 시약을 올리고머 스트렙타비딘 시약에서 해리시켰다. 세포를 추가 약 48 시간(자극 개시 후 96 시간±6 시간 또는 공정의 5 일까지) 동안 더 인큐베이션한 다음, 동결 보호제로 제형화하였다.
2. 증폭 공정
하나의 프로스세에서, 항-CD19 CAR T 세포는 위에서 기술한 비-증폭 공정에 의해서 조작되었다.
또다른 증폭 공정에서, CD4+ 및 CD8+ 세포의 별도 조성물이 인간 백혈구 성분 채집술 샘플에서 선택되고 동결되었다. 선택된 세포 조성물이 후속적으로 해동되었으며, 생존 가능한 CD4+ T 세포 대 생존 가능한 CD8+ T 세포의 비율, 1:1로 혼합되었다. 혼합 조성물 중 대략 300×106개의 T 세포(150×106 CD4+ 및 150×106 CD8+ T 세포)가, 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15를 함유하는 무혈청 배지에서 18 내지 30 시간 동안 비드 대 세포의 비율, 1:1로 항-CD3 및 항-CD28 항체가 부착된 상자성 폴리스티렌 코팅 비드의 존재 하에 자극되었다. 인큐베이션 후에, 자극 세포 조성물에서 대략 100 x106개의 생존 가능한 세포가 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15를 함유하는 무혈청 배지로 농축되었다. 세포는, 대략 1600 g에서 60 분 동안 회전 접종에 의해 예시적인 CAR, 위에서 기재된 바와 같은 예시적인 항-BCMA CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다. 회전 접종 후에, 세포를 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15를 함유하는 무혈청 배지로 재현탁하고, 약 37℃에서 약 18 내지 30 시간 동안 인큐베이션했다. 이어서 세포는, 인큐베이션 및 형질도입 단계 중 사용된 바와 같은 IL-2, IL-7 및 IL-15의 2배 농도를 함유하는 예시적인 무혈청 배지 약 500mL의 생물반응기(예를 들어 흔들리는 동작 생물반응기)로 전달되어 증폭을 위해 배양되었다. 설정된 생존 가능한 세포 농도를 달성한 경우, 관류가 개시되었고, 여기에서 배지는 연속 혼합되는 반연속 관류에 의해 교체되었다. 세포는, 전형적으로 6-7 일의 증폭을 수반하는 공정에서 발생하는 약 3×16 세포/ml의 임계 세포 밀도를 달성할 때까지 생물 반응기에서 다음날까지 배양되었다. 항-CD3 및 항-CD28 항체 접합 상자기 비드가 자기장에 노출됨으로써 세포 조성물에서 제거되었다. 이어서 세포는 수집, 제형화 및 동결 보호되었다.
B. 공정
메트릭스
살아있는 총 세포(도 13a) 및 생존 능력(도 13b)과 같은 공정 메트릭스가 제조 실행 중에 모니터링되었다. 도 13a에 도시된 바와 같이, 최소한의 세포 증폭이 5 일 시점에 관찰되었고, 강력한 증폭이 5 일 후에 시작되었다. 도 13b는 공정의 5 일 후에 세포가 증폭을 시작함에 따라 증가하기 시작한 세조 실행에서 세포 생존 능력의 초기 감소를 나타낸다.
제조 수행의 상이한 시점에 기억/분화 표현형의 비교 결과가 도 13c(CD5RA 및 CCR7 발현에 의한) 및 도 13d(CD27 및 CCR7 발현에 의한)에 도시되어 있다. 표시된 바와 같이, 제조 수행 중 초기에 세포를 평가하면, 공정의 초기 시간(예를 들어 1일 또는 2일차) 또는 공정의 이후 시간(예를 들어 9일차)에 세포와 비교하여 약 5일차에 세포가 덜 분화된 세포 유형, 예를 들어 CCR7+CD45RA- 또는 CCR7+CD27+ 세포에 대해 실질적으로 더 농축되는 것을 보여준다. CD57+ 세포의 수가 제조 공정 기간 동안 분석되었다. 도 14에 나타낸 바와 같이, CD8+CD57+ 세포의 수는 제조 공정에서 감소한 반면, CD4+CD57+ 세포의 수는 전체적으로 낮게 유지되었다.
이론에 구애됨이 없이, 결과는 예시적인 제조 공정이 공여자 세포 조성물에서 CD57+ 세포의 수를 감소시킬 수 있고, 그에 의해서 상이한 공여자로부터 유래된 세포 조성물 내에서 및 이들 중에서 가변성을 감소시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예
9: 공여자 투입 조성물 중 CD57+ 또는 CD27+ 빈도 세포의 적정 및 형질도입, 면역표현형 및 유전자 편집에 대한 효과
건강한 인간 공여자로부터 수득한 백혈구성분채집술 샘플을 CD4(CD4+) 또는 CD8(CD8+)에 대해 표면 양성인 세포에 대한 면역친화도-기반 선택에 적용하여 CD4+ 및 CD8+ 세포를 함유하는 T 세포 조성물을 생성하였다. 일부 경우에, 선택된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 조성물을 리간드-결합된 비드에 의해 CD57(CD57+) 또는 CD27(CD27+)에 대해 표면 양성인 세포에 대해 추가의 면역친화도-기반 선택에 적용하여 CD57+ 또는 CD27+ 세포의 농축된 집단을 수득하였다. 이어서, CD4+ 및 CD8+ 세포를 함유하는 T 세포 조성물을 CD57+ 또는 CD27+ 세포의 농축된 집단으로 적정하여 한정된 백분율의 CD57+ 또는 CD27+ 세포를 함유하는 최종 투입 조성물을 수득하고, 형질도입, 면역표현형 및 유전자 편집에 대한 CD57+ 또는 CD27+ 빈도의 효과를 평가하였다. CD4+ 및 CD8+ 선택만을 거친 투입 조성물(No titration; NT)은 대조군으로서 작용하였다.
A. CD57+ 주파수의 적정
선택된 CD8+ 2개의 건강한 인간 공여자(공여자 1 및 공여자 2)로부터의 T 세포 조성물을 상기 기재된 바와 같이 다양한 양의 CD57+ 세포의 농축된 집단으로 적정하여 공여자 CD8+ T 세포 조성물을 생산하였으며, 여기서 CD8+ T 세포의 0%, 25%, 50%, 75%, 또는 100%는 CD57+였다. 선택된 CD4+ 각 공여자로부터의 T 세포 조성물은 CD57+ 세포를 완전히 고갈시켰다. 이어서, 공여자로부터의 CD57 적정된 CD8+ T 세포 조성물 각각을 동일한 공여자로부터의 CD57 고갈된 CD4+ T 세포 조성물과 조합하여 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는 각각의 공여자에 대한 투입 조성물을 생산하였으며, 여기서 CD8+ T 세포의 0%, 25%, 50%, 75%, 또는 100%는 CD57+였다. CD57+ 세포의 적정은 유세포 분석에 의해 확인되었다. 상기 기재된 바와 같이, CD4+ 및 CD8+ 세포를 함유하도록 생성된 투입 조성물은, CD4+ 또는 CD8+ T 세포 조성물 중 어느 것도 CD57+ 선택 또는 적정("NT")에 적용되지 않았고, 대조군으로서 제공되었다.
CD4+ 및 CD8+ 세포를 함유하는 투입 조성물을 항-CD3/항-CD28 시약으로 자극하고, 항-CD19 CAR을 암호화하는 핵산을 함유하는 바이러스 제제로 형질도입하였다. 일부 경우에, 항-CD3/항-CD28 시약으로 자극(활성화)한 후, 세포에 또한 유전자 편집을 수행하였다. 세포의 증폭을 위해 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15 사이토카인과 추가로 인큐베이션한 후, 공여자 조성물을 면역표현형, CD4:CD8 비, CAR 발현, 및 자극 및/또는 형질도입 후의 유전자 편집 효율에 대해 평가하였다.
공여자 둘 다로부터의 조성물의 면역표현형을 자극 직전("활성화후") 및 CAR에 의한 형질도입 후("형질도입 후") 평가하였다. 자극 직전의 공여자 조성물 중 CD8+CD27+ 세포의 백분율은 동일한 시점에 적정된 CD57+ 세포의 백분율과 역상관관계가 있는 것으로 밝혀졌지만, 이러한 효과는 형질도입된 조성물에서 정규화되었다(도 15; NT: CD57 적정 없음; 좌측 칼럼은 CD4+ 세포를 나타내고, 우측 칼럼은 CD8+ 세포를 나타낸다). 또한, CD4+ 및 CD8+ 세포 구획에서 CD45RA/CCR7, CD27/CD28, 및 CD57/CD27 면역표현형의 빈도를 자극 직전 및 형질도입 후의 공여자 둘 다에서 평가하였다(도 16-21; Aph: 성분채집술 샘플; %: CD57+ 적정된 세포의 백분율; NT: CD57 적정 없음). 투입 조성물에서의 변동에도 불구하고, 기억 T 세포와 연관된 면역표현형을 형질도입된 세포 조성물에서 증가하는 CD57+ 세포 고갈에 의해 정규화하였음이 관찰되었다. 추가로, CD57 적정된 조성물에서의 CD57 빈도는 CAR에 의해 형질도입된 CD3+의 백분율에 영향을 미치지 않았다.
공여자 1로부터의 형질도입된 세포 조성물 중 CD4+ 대 CD8+ 세포의 비를 분석하였다. 도 22에 제시된 바와 같이(NT: CD57 적정 없음), 투입 조성물 중 더 낮은 백분율의 CD57+ 세포를 갖는 형질도입된 집단은 CD4+ 및 CD8+ 세포의 비를 1:1에 더 가깝게 유지하는 것으로 관찰된 반면, CD4:CD8 비는 CD57+ 세포의 빈도 증가에 따라 왜곡되었다.
결과는 또한 건강한 공여자 사이의 또는 CD57 적정된 조성물 중에서의 자극 후 성공적으로 유전자 편집된 CD3+ 세포의 백분율에서 실질적인 차이를 나타내지 않았다.
본원에 기재된 발견은 공여자 세포 조성물의 CD57+ 빈도의 감소, 예를 들어 공여자 투입 조성물에서 CD57- 세포를 농축시킴으로써 또는 더 낮은 CD57+ 빈도를 갖는 공여자를 선택함으로써, 형질도입 또는 유전자 편집의 효율을 손상시키지 않으면서 형질도입된 CAR T 세포 조성물의 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 면역표현형 및 1:1 표적 비를 개선시킴을 나타낸다.
B. CD27+ 빈도의 적정
2개의 건강한 공여자(공여자 1 및 공여자 2)로부터의 선택된 CD8+ 및 CD4+ T 세포 조성물을 상기 기재된 바와 같이 다양한 양의 CD27+ 세포의 농축된 집단에 의해 개별적으로 적정하여 별명의 공여자 CD8+ 및 CD4+ T 세포 조성물을 생성하였으며, 여기서 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 0%, 25%, 50%, 75%, 또는 100%는 CD27+였다. 이어서, 동일한 공여자로부터의 CD27 적정된 CD8+ T 세포 조성물 및 CD27 적정된 CD4+ T 세포 조성물을 조합하여 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는 각각의 공여자에 대한 투입 조성물을 생산하였으며, 여기서 총 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 30%, 80%, 또는 100%(공여자 1), 또는 25%, 50%, 75%, 또는 100%(공여자 2)는 CD27+였다. 적정을 유세포 분석에 의해 확인하였다. 상기 기재된 바와 같이, CD4+ 및 CD8+ 세포를 함유하도록 생성된 투입 조성물은 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 조성물 중 어느 것도 CD27+ 선택 또는 적정("NT")에 적용되지 않고, 대조군으로서 제공되지 않았다.
CD4+ 및 CD8+ 세포를 함유하는 투입 조성물을 항-CD3/항-CD28 시약으로 자극하고, 항-CD19 CAR을 암호화하는 핵산을 함유하는 바이러스 제제로 형질도입하였다. 일부 경우에, 항-CD3/항-CD28 시약으로의 자극(활성화) 후에, 세포는 또한 유전자 편집에 적용되었다. 세포의 증폭을 위한 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15 사이토카인과의 추가 인큐베이션 후에, 공여자 조성물을 자극 및/또는 형질도입 후의 면역표현형, CD4:CD8 비, CAR 발현, 및 유전자 편집 효율에 대해 평가하였다.
공여자 둘 다로부터의 조성물의 면역표현형을 자극 직전("활성화 후") 및 CAR로의 형질도입 후에 평가하였다. 자극 직전의 공여자 조성물 중 CD27+ 세포의 백분율은 동일한 시점에 CD57+ 세포의 백분율과 반비례하는 것으로 밝혀졌지만, 이러한 효과는 형질도입된 조성물에서 정규화되었다(도 23; NT: CD27 적정 없음; 좌측 칼럼은 CD4+ 세포를 나타내고, 우측 칼럼은 CD8+ 세포를 나타낸다). 또한, CD4+ 및 CD8+ 세포 구획에서 CD45RA/CCR7, CD27/CD28, 및 CD57/CD27 면역표현형의 빈도를 자극 직전 및 형질도입 후에 둘 다의 공여자에서 평가하였다(도 24-29; Aph: 성분채집술 샘플; %: CD27+ 적정된 세포의 백분율; NT: CD27 적정 없음). 투입 조성물에서의 변동에도 불구하고, 기억 T 세포와 연관된 면역표현형을 형질도입된 세포 조성물에서 증가하는 CD27+ 빈도로 정규화하였음이 관찰되었다. 추가로, CD27 적정된 조성물에서의 CD27 빈도는 CAR로 형질도입된 CD3+의 백분율에 영향을 미치지 않았다. 공여자 둘 다로부터의 형질도입된 세포 조성물 중 CD4+ 대 CD8+ 세포의 비를 또한 분석하였다(도 3; C: 대조군).
결과는 또한 공여자 사이의 또는 CD27 적정된 조성물 중에서의 자극 후에 성공적으로 유전자 편집된 CD3+ 세포의 백분율에서 실질적인 차이를 나타내지 않았다.
본원에 기재된 발견은 공여자 세포 조성물의 CD27+ 빈도의 증가가, 예를 들어 공여자 투입 조성물에서 CD27+ 세포를 농축시킴으로써 또는 더 높은 CD27+ 빈도로 공여자를 선택하는 것에 의해, 형질도입 또는 하류 유전자 편집의 효율을 손상시키지 않으면서 형질도입된 CAR T 세포 조성물의 면역표현형을 개선시킨다는 것을 나타낸다.
실시예
10: CD57+ 세포
고갈 대
CD27+ 세포 선택의 비교
건강한 인간 공여자로부터 수득된 성분채집술 샘플을 CD4(CD4+) 또는 CD8(CD8+)에 대해 표면 양성인 세포에 대한 면역친화도-기반 선택에 적용하여 CD4+ 및 CD8+ 세포를 함유하는 T 세포 조성물을 생성하였다. 별도로 선택된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물을 추가의 면역친화도-기반 선택에 적용하여 CD57(CD57+; 음성 선택을 통해)에 대해 표면 양성인 세포를 고갈시키거나 또는 CD27(CD27+)에 대해 표면 양성인 세포를 농축시켰다. 형질도입, 면역표현형, 및 유전자 편집에 대한 CD57 고갈 또는 CD27 농축의 효과를 평가하였다. CD4+ 및 CD8+ 선택만을 겪은 투입 조성물(선택 없음; NS)은 대조군으로서 작용하였다.
3개의 상이한 건강한 인간 공여자로부터의 백혈구성분채집술 샘플에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 내인성 CD27+ 및 CD57+ 빈도를 CD57 고갈 또는 CD27 농축 전에 분석하였다(표 E4).
각각의 공여자로부터의 별개의 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물의 CD57 고갈 또는 CD27 농축 후에, 동일한 공여자로부터 유래된 CD4+ 및 CD8+ 조성물을 조합하고, 항-CD3/항-CD28 시약으로 자극하고, 항-CD19 CAR을 암호화하는 핵산을 함유하는 바이러스 제제로 형질도입하였다. 세포의 증폭을 위해 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15 시토카인과 추가로 인큐베이션한 후에, 공여자 조성물을 자극 및/또는 형질도입 후에 면역표현형, CD4:CD8 비율, CAR 발현, 및 유전자 편집 효율에 대해 평가하였다.
공여자 둘 다로부터의 조성물의 면역표현형을 자극("활성화" 직전) 및 CAR로의 형질도입 후에 평가하였다. CD27 농축(도 31a) 및 CD57 고갈(도 31b) 둘 다는 자극 직전에 투입 조성물에서 CD27+ 세포의 빈도를 증가시키고 CD57+ 세포의 빈도를 감소시키는 것으로 관찰되었고, 일부 경우에, 또한 형질도입 후에 CD27+ 세포의 빈도를 증가시키는 것으로 나타났다. 또한, CD4+ 및 CD8+ 세포 구획에서의 CD45RA/CCR7 면역표현형의 빈도를 자극 직전 및 형질도입 후에 모든 3명의 공여자에서 평가하였다(도 32a 및 32b). B: 선택 전에; NS: CD27 또는 CD57 선택 없음. CD57 고갈 및/또는 CD27 농축이 형질도입된 세포 조성물, 특히 백혈구성분채집술 샘플이 더 낮은 빈도의 CD27+ 세포 및 더 높은 빈도의 CD57+ 세포를 갖는 공여자 1 및 2에서 기억 T 세포 면역표현형(CCR7+ 및 CCR7+CD45RA+)을 나타내는 세포의 백분율을 증가시켰음이 관찰되었다. 추가로, 항-CD19 CAR로 형질도입된 CD3+ 세포의 백분율에 영향을 미치는 CD27 농축 또는 CD57 고갈이 관찰되지 않았다.
일부 경우에, CD57 고갈 및 CD27 농축된 조성물을 또한 유전자 편집에 적용하였다. 결과는 또한 공여자 사이에서 또는 CD27 농축된 조성물과 CD57 고갈된 조성물 사이에서 유전자 편집된 CD3+ 세포의 백분율에서 실질적인 차이를 나타내지 않았다.
본원에 기재된 발견은 CD27+ 세포에 대한 농축 및 CD27+ 세포의 고갈 둘 다가 CAR 형질도입 및 유전자 편집과 상용성인 것으로 관찰되었음을 나타낸다.
실시예
11: 비-자기 면역친화도 칼럼 크로마토그래피-기반 세포 선택
건강한 인간 공여자로부터 수득된 백혈구성분채집술 샘플을 CD57+ 세포의 고갈, 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 CD27+ 및/또는 CD3+ 세포의 농축에 적용하고, 생성된 조성물의 순도, 고갈, 및 수율을 평가하였다.
A.
백혈구성분채집술
샘플로부터의 CD57-, CD27+, 및/또는 CD3+ 세포의 선택
(음성 선택을 통해) CD57- 세포, (양성 선택을 통해) CD27+ 세포, 및/또는 (양성 선택을 통해) CD3+ 세포를 선택하기 위해 친화도 크로마토그래피 시스템을 사용하였다. 시스템은 크기-정의 폴리스티렌 비드("선택 매트릭스") 상에 공유적으로 고정된 스트렙타비딘 뮤테인 다량체 백본 분자(Strep-Tactin® M2; 서열번호 73)를 포함하였다. CD57, CD27 또는 CD3을 표적화하는 Fab 단편은 그들의 중쇄의 카복시-말단에서 Twin Strep-Tag®(서열번호 79)에 개별적으로 융합되었다. 펩티드-태그된 Fab 단편은 펩티드 태그를 통해 선택 매트릭스에 결합되었다. 각각의 선별을 위해, 인간 공여자 유래 샘플을 선별 매트릭스로 채워진 칼럼 상에 로딩하고, 결합되지 않은 세포(즉, 표적 분자를 발현하지 않는 세포)를 결합 없이 통과시켰다. 선택 매트릭스를 세척하여 잔류 포획된 비-표적 세포를 제거하였다. 선별 매트릭스에 결합된 세포 집단(즉, 표적 분자를 발현하는 세포)을 D-비오틴-함유 완충액으로 칼럼을 플러싱함으로써 용출시키고, 이는 결합된 세포가 방출되도록 스트렙트아비딘 뮤테인 멀티머 상의 비오틴 결합 부위에 결합하기 위한 Fab 단편을 능가하였다. 용리된 세포의 표면 상에 남아있는 잔류 Fab 단편을 세척으로 제거하였다.
CD57-표적화 펩티드-태그된 Fab 단편을 갖는 선택 매트릭스를 함유하는 칼럼 상에 백혈구성분채집술 샘플을 로딩하고 칼럼을 통해 유동하는 미결합 세포(즉, CD57-세포)를 수집함으로써 음성 선택에 의해 CD57 고갈된 세포 집단을 수득하였다. 도 1에 도시된 바와 같이. 33A, 백혈구성분채집술 샘플로부터의 대략 90%의 CD57+를 대략 0.5 내지 1%의 CD57+ 세포를 함유하는 생성된 CD57 고갈된 세포 집단에서 포획하였다.
유사하게, CD27-표적화 펩티드-태그된 Fab 단편을 갖는 선별 매트릭스를 함유하는 컬럼 상에 백혈구성분채집술 샘플을 로딩함으로써 양성 선별에 의해 CD27 농축된 세포 집단을 수득하였다. 칼럼을 통해 유동된 세포를 폐기물로서 폐기하고, 결합된 세포(즉, CD27+ 세포)를 D-비오틴-함유 완충제로 용리시켰다. 용출된 CD27 농축된 세포 집단은 95%의 순도, 90%의 고갈, 및 65%의 수율을 초래하였다(도 33b).
면역친화도-기반 선택을 또한 2개의 상이한 마커에 대해 양성인 세포의 연속 선택에 대해 평가하였다. 백혈구성분채집술 샘플을 CD27-표적화 펩티드-태그된 Fab 단편을 갖는 선택 매트릭스를 함유하는 제1 컬럼 상에 로딩하고, CD27+ 세포를 양성 선택에 의해 CD27 농축된 집단으로서 수집하였다. 이어서, CD27 농축된 집단을 CD3-표적화 펩티드-태그된 Fab 단편을 갖는 선택 매트릭스를 함유하는 제 2 칼럼 상에 로딩하고, CD27+CD3+ 세포를 양성 선택에 의해 수집하였다. 수집된 CD27+CD3+ 집단은 95% 순도를 갖는 것으로 밝혀졌다(도 33c).
실시예
12: 유전자 편집된 세포의 CD3 고갈
T 세포를 인간 공여자로부터의 백혈구성분채집술 샘플로부터 분리하고, (예를 들어 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 영역의 녹아웃에 의해) 세포 표면에서 내인성 TCR 수용체를 파괴하기 위해 CRISPR/CAR 접근법을 사용하여 유전자 편집하였다. 완전한 녹아웃을 겪은 세포에서, TCR 복합체 형성 및 CD3의 세포 표면 발현이 파괴된다. 완전한 녹아웃을 겪지 않은 임의의 세포를 제거하기 위해, 유전자 편집된 세포 집단을 실시예 11에 기재된 친화도 크로마토그래피 시스템을 사용하여 CD3 고갈에 적용하였다.
CD3에 대해 음성 선택에 의해 TCR-CD3- 세포를 분리하였다. 유전자 편집된 세포를 CD3-표적화 펩티드-태그부착된 Fab 단편을 갖는 선택 매트릭스를 함유하는 칼럼 상에 로딩하고, 칼럼을 통해 유동된 비결합된 세포(즉, TCR-CD3- 세포)를 TCR에 대해 완전히 녹아웃된 세포의 집단으로서 수집하였다. 도 34에 제시된 바와 같이, 수집된 세포는 99% TCR-CD3- 세포의 순도에 도달하는 것으로 관찰되었다. 일부 측면에서, CD3 고갈은 동종이계 공여자로부터의 세포가 대상체에게 제공되는 공정에서 수행되며, 이는 예를 들어 치료 목적을 위해 세포 표면에서 내인성 TCR 수용체의 발현이 파괴된 세포를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 다양한 측면을 설명하기 위해, 예를 들어 제공되는 특정 개시된 구현예로 범위를 제한하려는 것이 아니다. 기재된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형은 여기의 기재 및 교시에서 명백해질 것이다. 상기 변형은 공개의 진정한 범위와 개념에서 벗어나지 않고 실천될 수 있으며, 본 개시의 범위에 속하도록 의도된다.
서 열
SEQUENCE LISTING
<110> Juno Therapeutics, Inc.
<120> PROCESS FOR PRODUCING DONOR-BATCHED
CELLS EXPRESSING A RECOMBINANT RECEPTOR
<130> 735042023840
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> 63024505
<151> 2020-05-13
<160> 98
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> spacer (IgG4hinge)
<400> 1
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> spacer (IgG4hinge)
<400> 2
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge-CH3 spacer
<400> 3
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 4
<211> 229
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge-CH2-CH3 spacer
<400> 4
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 5
<211> 282
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgD-hinge-Fc
<400> 5
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A
<400> 6
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 7
<211> 357
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tEGFR
<400> 7
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28 (amino acids 153-179 of Accession No. P10747)
<400> 8
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 9
<211> 66
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28 (amino acids 114-179 of Accession No. P10747)
<400> 9
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 10
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28 (amino acids 180-220 of P10747)
<400> 10
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 11
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28 (LL to GG)
<400> 11
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 12
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4-1BB (amino acids 214-255 of Q07011.1)
<400> 12
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3 zeta
<400> 13
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3 zeta
<400> 14
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3 zeta
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 16
<211> 335
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tEGFR
<400> 16
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 17
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A
<400> 17
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 18
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2A
<400> 18
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2A
<400> 19
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 20
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E2A
<400> 20
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 21
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F2A
<400> 21
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 22
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 22
Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro
20 25 30
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 23
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 24
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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atccca 66
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<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GMCSFR alpha chain signal sequence
<400> 25
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
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20
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<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD8 alpha signal peptide
<400> 26
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala
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<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 27
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 28
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 29
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
1 5 10 15
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20 25 30
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro
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Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
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<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 30
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
<221> VARIANT
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<223> Xaa is cysteine or threonine
<220>
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<400> 31
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 32
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 33
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 34
Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
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<400> 36
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR L3
<400> 37
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<400> 39
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH
<400> 41
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Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
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100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105
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<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scFv
<400> 43
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1 5 10 15
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20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
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145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
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195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR L1
<400> 44
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR L2
<400> 45
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR L3
<400> 46
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR H1
<400> 47
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1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR H2
<400> 48
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 49
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR H3
<400> 49
Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 50
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH
<400> 50
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL
<400> 51
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 52
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 53
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scFv
<400> 53
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HC-CDR3
<400> 54
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LC-CDR2
<400> 55
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LC-CDR3
<400> 56
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 57
<211> 735
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence encoding scFv
<400> 57
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc 735
<210> 58
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 58
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 59
<211> 326
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human IgG2 Fc (Uniprot P01859)
<400> 59
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 60
<211> 327
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human IgG4 Fc (Uniprot P01861)
<400> 60
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 61
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FKBP
<400> 61
Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro
1 5 10 15
Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp
20 25 30
Gly Lys Lys Met Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe
35 40 45
Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala
50 55 60
Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr
65 70 75 80
Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr
85 90 95
Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu
100 105
<210> 62
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FKBP12v36
<400> 62
Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro
1 5 10 15
Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp
20 25 30
Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe
35 40 45
Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala
50 55 60
Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr
65 70 75 80
Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr
85 90 95
Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu
100 105
<210> 63
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> acylation motif
<400> 63
Met Gly Ser Asn Lys Ser Lys Pro Lys Asp Ala Ser Gln Arg Arg Arg
1 5 10 15
<210> 64
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)...(4)
<223> Xaa can be any amino acid
<220>
<223> dual acylation region
<400> 64
Met Gly Cys Xaa Cys
1 5
<210> 65
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)...(4)
<223> Xaa can be any amino acid
<220>
<223> CAAX box
<400> 65
Cys Ala Ala Xaa
1
<210> 66
<211> 159
<212> PRT
<213> Streptomyces avidinii
<220>
<223> UniProt No. P22629
<400> 66
Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly
1 5 10 15
Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr
20 25 30
Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly
35 40 45
Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro
50 55 60
Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys
65 70 75 80
Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr
85 90 95
Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser
100 105 110
Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp
115 120 125
Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys
130 135 140
Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln
145 150 155
<210> 67
<211> 126
<212> PRT
<213> Streptomyces avidinii
<220>
<223> Minimal streptavidin
i
<400> 67
Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe
1 5 10 15
Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser
20 25 30
Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp
35 40 45
Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val
50 55 60
Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser
65 70 75 80
Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu
85 90 95
Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val
100 105 110
Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
115 120 125
<210> 68
<211> 126
<212> PRT
<213> Streptomyces avidinii
<220>
<223> Minimal mutein Streptavidin
Ile44-Gly45-Ala46-Arg47
<400> 68
Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe
1 5 10 15
Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Ile Gly
20 25 30
Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp
35 40 45
Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val
50 55 60
Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser
65 70 75 80
Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu
85 90 95
Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val
100 105 110
Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
115 120 125
<210> 69
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Strep-tag II
<400> 69
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 70
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Twin-Strep-tag
<400> 70
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20 25
<210> 71
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Twin-Strep-tag
<400> 71
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20
<210> 72
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Twin-Strep-tag
<400> 72
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20 25
<210> 73
<211> 127
<212> PRT
<213> Streptomyces avidinii
<220>
<223> Minimal mutein Streptavidin
Ile44-Gly45-Ala46-Arg47
<400> 73
Met Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Ile
20 25 30
Gly Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr
35 40 45
Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr
50 55 60
Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp
65 70 75 80
Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp
85 90 95
Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu
100 105 110
Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
115 120 125
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)...(2)
<223> Xaa is any amino acid
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)...(7)
<223> Xaa is Gly or Glu
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)...(8)
<223> Xaa is Gly, Lys or Arg
<220>
<223> Streptavidin-binding peptide
<400> 74
Trp Xaa His Pro Gln Phe Xaa Xaa
1 5
<210> 75
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Streptavidin binding peptide, Strep-tag
<400> 75
Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly
1 5
<210> 76
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)...(9)
<223> Xaa is any amino acid
<220>
<221> REPEAT
<222> (9)...(9)
<223> Repeat either 8 or 12 times
<220>
<223> Sequential modules of streptavidin-binding peptide
<400> 76
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Xaa Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
1 5 10 15
Lys
<210> 77
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> REPEAT
<222> (9)...(12)
<223> Repeat either 2 or 3 times
<220>
<223> Sequential modules of streptavidin-binding peptide
<400> 77
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro
1 5 10 15
Gln Phe Glu Lys
20
<210> 78
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Twin-Strep-tag
<400> 78
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20 25 30
<210> 79
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Twin-Strep-tag
<400> 79
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20 25 30
<210> 80
<211> 159
<212> PRT
<213> Streptomyces avidinii
<220>
<223> Mutein Streptavidin Val44-Thr45-Ala46-Arg47
<400> 80
Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly
1 5 10 15
Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr
20 25 30
Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr Ala Arg Gly
35 40 45
Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro
50 55 60
Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys
65 70 75 80
Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr
85 90 95
Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser
100 105 110
Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp
115 120 125
Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys
130 135 140
Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln
145 150 155
<210> 81
<211> 126
<212> PRT
<213> Streptomyces avidinii
<220>
<223> Minimal mutein Streptavidin
Val44-Thr45-Ala46-Arg47
<400> 81
Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe
1 5 10 15
Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr
20 25 30
Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp
35 40 45
Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val
50 55 60
Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser
65 70 75 80
Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu
85 90 95
Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val
100 105 110
Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
115 120 125
<210> 82
<211> 127
<212> PRT
<213> Streptomyces avidinii
<220>
<223> Minimal mutein Streptavidin
Val44-Thr45-Ala46-Arg47
<400> 82
Met Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val
20 25 30
Thr Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr
35 40 45
Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr
50 55 60
Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp
65 70 75 80
Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp
85 90 95
Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu
100 105 110
Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
115 120 125
<210> 83
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Streptavidin-binding peptide
<400> 83
His Pro Gln Phe
1
<210> 84
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(1)
<223> Xaa is Trp, Lys or Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)...(2)
<223> Xaa is any amino acid
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)...(7)
<223> Xaa is Gly or Glu
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)...(8)
<223> Xaa is Gly, Lys or Arg
<220>
<223> Streptavidin-binding peptide
<400> 84
Xaa Xaa His Pro Gln Phe Xaa Xaa
1 5
<210> 85
<211> 159
<212> PRT
<213> Streptomyces avidinii
<220>
<223> Mutein Streptavidin Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47
<400> 85
Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly
1 5 10 15
Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr
20 25 30
Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Ile Gly Ala Arg Gly
35 40 45
Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro
50 55 60
Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys
65 70 75 80
Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr
85 90 95
Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser
100 105 110
Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp
115 120 125
Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys
130 135 140
Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln
145 150 155
<210> 86
<211> 126
<212> PRT
<213> Streptomyces avidinii
<220>
<223> Minimal mutein Streptavidin
Val44-Thr45-Ala46-Arg47 and Glu117, Gly120, Tyr121
(mutein m1-9)
<400> 86
Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe
1 5 10 15
Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr
20 25 30
Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp
35 40 45
Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val
50 55 60
Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser
65 70 75 80
Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu
85 90 95
Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Glu Asn Ala Gly Tyr Ser Thr Leu Val
100 105 110
Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
115 120 125
<210> 87
<211> 139
<212> PRT
<213> Streptomyces avidinii
<220>
<223> Mutein Streptavidin Val44-Thr45-Ala-46-Arg47 and
Glu117, Gly120, Tyr121 (mutein m1-9)
<400> 87
Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly
1 5 10 15
Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr
20 25 30
Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr Ala Arg Gly
35 40 45
Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro
50 55 60
Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys
65 70 75 80
Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr
85 90 95
Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser
100 105 110
Gly Thr Thr Glu Glu Asn Ala Gly Tyr Ser Thr Leu Val Gly His Asp
115 120 125
Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
130 135
<210> 88
<211> 127
<212> PRT
<213> Streptomyces avidinii
<220>
<223> Minimal streptavidin
<400> 88
Met Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu
20 25 30
Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr
35 40 45
Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr
50 55 60
Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp
65 70 75 80
Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp
85 90 95
Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu
100 105 110
Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser
115 120 125
<210> 89
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutein Streptavidin
<400> 89
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20 25
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Strep-tag
<400> 90
Ala Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly
1 5
<210> 91
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH anti-CD28 antibody CD28.3
<400> 91
Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Arg
1 5 10 15
Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Ile His
20 25 30
Trp Ile Lys Leu Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Phe
35 40 45
Tyr Pro Gly Ser Asn Asp Ile Gln Tyr Asn Ala Lys Phe Lys Gly Lys
50 55 60
Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu
65 70 75 80
Thr Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg
85 90 95
Asp Asp Phe Ser Gly Tyr Asp Ala Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val
115
<210> 92
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL anti-CD28 antibody CD28.3
<400> 92
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr His Leu Val Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Thr Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Cys
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 93
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH anti-CD3 antibody OKT3
<400> 93
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 94
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL anti-CD3 antibody OKT3
<400> 94
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn
100 105
<210> 95
<211> 248
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variable Heavy chain of Fab fragment m13B8.2
<400> 95
Ala Met Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr
20 25 30
Thr Phe Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Ser Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Val Pro
50 55 60
Phe Met Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
65 70 75 80
Phe Phe Lys Leu Asn Ser Leu Gln Pro Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Lys Asn Asp Pro Gly Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Ser Ala Trp Ser His Pro
210 215 220
Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala
225 230 235 240
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
245
<210> 96
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variable Light chain of Fab Fragment m13B8.2
<400> 96
Ala Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Glu Thr Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Glu Met Ile Tyr
20 25 30
Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu
35 40 45
Leu Val His Asp Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Thr Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala His Tyr Gly Asn
85 90 95
Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ile
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Ser
210 215
<210> 97
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variable Heavy chain of huOKT8
<400> 97
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Leu Tyr Ala Ser Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 98
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variable Light chain of huOKT8
<400> 98
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser Gln Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
Claims (132)
- 공여자 풀 유래(from a donor pool) T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은:
(a) 복수의 상이한 공여자들로부터 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 수득하는 단계, 각각의 조작된 T 세포 조성물은 상기 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 포함하되, 상기 T 세포는 재조합 수용체로 유전자 조작된 T 세포를 포함함; 및
(b) 상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 조합하여 공여자 풀링된(donor pooled) 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 단계;
를 포함하는, 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은:
(i) 상기 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계; 및
(ii) 상기 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산을 상기 CD57 고갈된 세포 집단 내로 도입하고, 그에 의해서 상기 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 단계;
를 포함하는 방법에 의해 생성되는, 방법. - 제 2 항에 있어서,
상기 단계 (ii) 전에, 상기 방법은 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단을 상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극하는 것을 포함하는, 방법. - 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
상기 방법은 (iii) 상기 조작된 T 세포 조성물의 세포를 상기 도입 후 최대 96 시간 동안, 선택적으로 (약) 37℃±2℃의 온도에서, 인큐베이션하는 단계를 더 포함하는, 방법. - 제 4 항에 있어서,
상기 인큐베이션은, 상기 인큐베이션 개시시의 상기 조작된 T 세포 조성물의 세포의 수와 비교하여, 상기 조작된 T 세포 조성물의 세포가 증폭되지 않거나 실질적으로 증폭되지 않는 조건 하에 수행되는, 방법. - 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
상기 방법은 (iii) 상기 조작된 T 세포 조성물의 세포를 상기 조성물 내의 T 세포의 증폭을 위한 조건 하에 배양하는 단계를 더 포함하는, 방법. - 제 2 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 있어서,
CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하는 단계는:
(1) (a) T 세포 마커(들)에 대해 표면 양성인 세포 및 (b) 상기 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 세포 중의 하나를 선택하고, 그에 의해서 농축된 세포 집단을 생성하는 단계; 및
(2) 상기 농축된 세포 집단으로부터, (a) 상기 T 세포 마커(들)에 대해 표면 양성인 세포 및 (b) CD57- 세포 중의 다른 것에 대해 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
를 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 7 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은, 상기 방법의 단계들 중의 하나 이상 전에 또는 동안에, 상기 CD57 고갈된 집단 및/또는 상기 조작된 T 세포 조성물의 T 세포에서, (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex; MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(T cell receptor; TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(T cell receptor alpha constant; TRAC);의 발현을 녹아웃(knocking out)시키는 단계를 더 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 8 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물의 T 세포는 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC)의 발현에 대해 녹아웃(K0)된, 방법. - 제 1 항 내지 제 9 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 상기 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 각각에 대해 반복되는, 방법. - 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은:
(a) 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
(b) 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단을 유전자 조작하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 단계, 상기 유전자 조작은:
(1) 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포에서, (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분;의 발현을 녹아웃시키는 단계; 및
(2) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산을 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 내로 도입하는 단계, 선택적으로 상기 이종 핵산은 내인성 MHC 또는 그의 성분 및/또는 내인성 TCR 또는 그의 성분에 대해 암호화하는 유전자의 유전자 좌(locus) 내로 삽입됨;
를 포함하되, 선택적으로 상기 내인성 TCR 또는 그의 성분은 T 세포 수용체 알파 불변(T cell receptor alpha constant; TRAC)이고; 상기 단계 (1)에서의 녹아웃 및 상기 단계 (2)에서의 도입은 어느 순서로든 동시에 또는 연속적으로 수행됨;
(c) 복수의 상이한 공여자들에 대해 상기 단계 (a) 및 (b)를 반복하여 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 생산하는 단계, 상기 각각의 공여자 조작된 T 세포 조성물은 상기 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 세포로부터 생성됨; 및
(d) 상기 복수의 상이한 개별 공여자들 유래 상기 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 조합하여 공여자 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 단계;
를 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 11 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 상기 조합 전에 동결 보존되고 해동되는, 방법. - 제 2 항 내지 제 12 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 CD57 고갈된 T 세포 집단은 (약) 75% 초과의 CD3+/CD57- 세포, (약) 80% 초과의 CD3+/CD57- 세포, (약) 85% 초과의 CD3+/CD57- 세포, (약) 90% 초과의 CD3+/CD57- 세포, 또는 (약) 95% 초과의 CD3+/CD57- 세포를 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 13 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 독립적으로 (약) 40% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포, (약) 45% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포, (약) 50% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포, (약) 55% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포, (약) 55% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포, (약) 60% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포, (약) 65% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포 또는 (약) 70% 초과의 CD57-/재조합 수용체+ 세포를 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 14 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하되, 선택적으로 상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 (약) 1:5 내지 (약) 5:1 또는 (약) 1:3 내지 (약) 3:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법. - 제 8 항 내지 제 15 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 녹아웃 전에, 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단을 상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극하는 단계를 더 포함하는, 방법. - 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은:
(i) 복수의 상이한 공여자들 유래 공여자 샘플로부터 (a) T 세포 마커(들)에 대해 표면 양성인 세포 및 (b) CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 세포 중의 하나에 대해 선택하고, 그에 의해서 농축된 세포 집단을 생성하는 단계; 및
(ii) 상기 농축된 세포 집단으로부터, (a) 상기 T 세포 마커(들)에 대해 표면 양성인 세포 및 (b) CD57- 세포 중의 다른 하나를 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
를 포함하되, 여기서:
(1) 상기 공여자 샘플은 상기 복수의 상이한 공여자들 유래 세포를 포함하는 풀링된 샘플이고, 그에 의해서 상기 방법은 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생산하거나; 또는
(2) 상기 공여자 샘플은 개별 공여자 유래 샘플이고, 상기 단계 (i) 및 (ii)는 상기 복수의 상이한 공여자들 유래 공여자 샘플 각각에 대해 별도로 반복되고, 그에 의해서 상기 방법은 각각의 개별 공여자에 대해 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생산하는, 방법. - 제 17 항에 있어서,
상기 (2)의 방법은 각각의 개별 공여자에 대한 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단들을 함께 조합하여 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생산하는 단계를 더 포함하는, 방법. - 제 7 항 내지 제 10 항, 제 17 항 및 제 18 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포 마커(들)는 CD3인, 방법. - 제 7 항 내지 제 10 항 및 제 17 항 내지 제 19 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포 마커(들)는 CD4 및/또는 CD8인, 방법. - 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은:
(a) (i) 공여자 샘플로부터 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 T 세포에 대해 선택하는 단계, 여기서 상기 공여자 샘플은 개별 공여자 유래 인간 T 세포에 대해 농축됨; 또는 (ii) 공여자 샘플로부터 T 세포에 대해 선택하는 단계, 여기서 상기 공여자 샘플은 개별 공여자 유래 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포에 대해 농축됨;
그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
(b) 복수의 상이한 개별 공여자들에 대해 상기 단계 (a)를 반복하는 단계; 및
(c) 각각의 개별 공여자로부터의 각각의 CD57 고갈된 T 세포 집단을 조합하여, 그에 의해서 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
를 포함하는, 방법. - 제 21 항에 있어서,
인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 CD3+ T 세포에 대해 선택하는 것에 의해 수득되고, 선택적으로 인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 (약) 85% 초과의 CD3+ T 세포, (약) 90% 초과의 CD3+ T 세포, 또는 (약) 95% 초과의 CD3+ T 세포를 포함하는, 방법. - 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서,
인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포에 대해 선택하는 것에 의해 수득되고/되거나; 인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법. - 제 21 항 내지 제 23 항 중의 어느 한 항에 있어서,
인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 (약) 1:5 내지 (약) 5:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함하되, 선택적으로, 인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 (약) 1:3 내지 (약) 3:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법. - 제 17 항 내지 제 24 항 중의 어느 한 항에 있어서,
(a) 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 또는 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포는 (i) 내인성 주요 조직적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC);의 발현을 위해 녹아웃(KO)되고/되거나;
(b) 상기 방법은 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 또는 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포에서 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 TRAC;의 발현을 녹아웃시키는 단계를 더 포함하는, 방법. - 제 17 항 내지 제 25 항 중의 어느 한 항에 있어서,
(a) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드는 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 또는 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 내로 도입되고/되거나;
(b) 상기 방법은 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 또는 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포 내로 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 더 포함하고,
그에 의해서 상기 방법은 조작된 T 세포 조성물을 생성하는, 방법. - 제 26 항에 있어서,
상기 녹아웃 및 상기 이종 핵산의 도입은 어느 순서로든 동시에 또는 연속적으로 수행되는, 방법. - 제 25 항 내지 제 27 항의 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 조합은:
상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포가 녹아웃되고/되거나 상기 이종 핵산에 도입되기 전; 또는
상기 CD57 고갈된 T 세포의 세포가 녹아웃되고/되거나 상기 이종 핵산에 도입된 후;
에 수행되는, 방법. - 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은,
(i) 공여자 샘플로부터 (a) CD3에 대해 표면 양성(CD3+)이거나, 또는 CD4 및/또는 CD8에 대해 표면 양성(CD4+ 및/또는 CD8+)인 세포 및 (b) CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 세포 중의 하나에 대해 선택하고, 그에 의해서 농축된 세포 집단을 생성하는 단계;
(ii) 상기 농축된 세포 집단으로부터, (a) CD3+, 또는 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포 및 (b) CD57- 세포 중의 다른 것을 선택하고, 그에 의해서 CD57 고갈된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
(iii) 상기 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포를 상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극하는 단계;
(iv) 상기 자극된 세포를 유전자 조작하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 단계, 상기 유전자 조작은:
(1) 상기 자극된 세포에서, (a) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (b) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC),의 발현을 녹아웃시키는 단계; 및
(2) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 자극된 세포 내로, 선택적으로 TRAC를 암호화하는 유전자의 유전자 좌 내로 도입하는 단계;를 포함하며,
상기 단계 (1)에서의 녹아웃 및 상기 단계 (2)에서의 도입은 어느 순서로든 동시에 또는 연속적으로 수행될 수 있음;
(v) 상기 조작된 T 세포 조성물을 최대 96 시간 동안, 선택적으로 (약) 37℃±2℃의 온도에서 인큐베이션하는 단계, 선택적으로 상기 인큐베이션은 증식 또는 증폭을 촉진시키는 조건하에 상기 세포를 배양하는 단계를 더 포함함;
(vi) 복수의 상이한 공여자들에 대해 상기 단계 (i) 내지 (v)를 반복하여 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 생산하는 단계, 여기서 각각의 공여자 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 세포로부터 생성됨; 및
(vii) 상기 복수의 상이한 공여자들 유래 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 조합하는 단계;
를 포함하는, 방법. - 제 2 항 내지 제 29 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단에서 CD57+ T 세포의 빈도는 상기 공여자 샘플에서 CD57+ T 세포의 빈도의 (약) 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만인, 방법. - 제 2 항 내지 제 30 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단은 약 20% 미만의 CD57+ T 세포, 약 15% 미만의 CD57+ T 세포, 약 10% 미만의 CD57+ T 세포, 약 5% 미만의 CD57+ T 세포, 약 1% 미만의 CD57+ T 세포, 또는 약 0.1% 미만의 CD57+ T 세포를 포함하는, 방법. - 제 2 항 내지 제 31 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 CD57 고갈된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD57 고갈된 T 세포 집단의 세포는 상기 공여자 샘플의 세포의 것과 비교하여 하나 이상의 분자의 발현에서 더 낮은 변동 계수(coefficient of variation, CV)를 나타내고; 상기 하나 이상의 분자는 나이브 T 세포의 마커, 선택적으로 CD27, Ki67, CD25, CD28, CCR7, 및/또는 CD45RA를 포함하는, 방법. - 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은:
(a) 복수의 상이한 공여자들로부터 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 수득하는 단계, 각각의 조작된 T 세포 조성물은 상기 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 포함하고, 상기 T 세포는 재조합 수용체로 유전자 조작된 T 세포를 포함함; 및
(b) 상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들을 조합하여 공여자 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 단계;
를 포함하는, 방법. - 제 33 항에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은:
(i) 상기 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하고, 그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계; 및
(ii) 상기 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산을 상기 CD27 농축된 세포 집단 내로 도입하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 단계;
를 포함하는 방법에 의해 생성되는, 방법. - 제 34 항에 있어서,
상기 단계 (ii) 전에, 상기 방법은 상기 CD27 농축된 T 세포 집단을 상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극하는 것을 포함하는, 방법. - 제 34 항 또는 제 35 항에 있어서,
상기 방법은 (iii) 상기 조작된 T 세포 조성물의 세포를 상기 도입 후 최대 96 시간 동안, 선택적으로 (약) 37℃±2℃의 온도에서, 인큐베이션하는 단계를 더 포함하는, 방법. - 제 36 항에 있어서,
상기 인큐베이션은, 상기 인큐베이션 개시시의 상기 조작된 T 세포 조성물의 세포의 수와 비교하여, 상기 조작된 T 세포 조성물의 세포가 증폭되지 않거나 실질적으로 증폭되지 않는 조건 하에 수행되는, 방법. - 제 34 항 또는 제 35 항에 있어서,
상기 방법은 (iii) 상기 조작된 T 세포 조성물의 세포를 상기 조성물 내의 T 세포의 증폭을 위한 조건 하에 배양하는 단계를 더 포함하는, 방법. - 제 34 항 내지 제 38 항 중의 어느 한 항에 있어서,
CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하는 단계는:
(1) (a) T 세포 마커(들)에 대해 표면 양성인 세포 및 (b) 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 세포 중의 하나를 선택하고, 그에 의해서 농축된 세포 집단을 생성하는 단계; 및
(2) 상기 농축된 세포 집단으로부터, (a) 상기 T 세포 마커(들)에 대해 표면 양성인 세포 및 (b) CD27+ 세포 중의 다른 것에 대해 선택하고, 그에 의해서 상기 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
를 포함하는, 방법. - 제 33 항 내지 제 39 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은, 상기 방법의 단계들 중의 하나 이상 전에 또는 동안에 상기 CD27 농축된 집단 및/또는 상기 조작된 T 세포 조성물의 T 세포에서, (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC);의 발현을 녹아웃(knocking out)시키는 단계를 더 포함하는, 방법. - 제 33 항 내지 제 40 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물의 T 세포는 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC)의 발현에 대해 녹아웃(K0)된, 방법. - 제 33 항 내지 제 41 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 상기 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 각각에 대해 반복되는, 방법. - 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은:
(a) 개별 공여자 유래 공여자 샘플로부터 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 T 세포에 대해 농축된 T 세포를 선택하고, 그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
(b) 상기 CD27 농축된 T 세포 집단을 유전자 조작하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 단계, 상기 유전자 조작은:
(1) 상기 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포에서, (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분;의 발현을 녹아웃시키는 단계; 및
(2) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 핵산을 상기 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포 내로 도입하는 단계; 선택적으로 상기 이종 핵산은 내인성 MHC 또는 그의 성분 및/또는 내인성 TCR 또는 그의 성분에 대해 암호화하는 유전자의 유전자 좌 내로 삽입됨;
를 포함하되,
선택적으로 상기 내인성 TCR 또는 그의 성분은 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC)이고; 상기 단계 (1)에서의 녹아웃 및 상기 단계 (2)에서의 도입은 어느 순서로든 동시에 또는 연속적으로 수행됨;
(c) 복수의 상이한 공여자들에 대해 상기 단계 (a) 및 (b)를 반복하여 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 생산하는 단계, 상기 각각의 공여자 조작된 T 세포 조성물은 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 세포로부터 생성됨; 및
(d) 상기 복수의 상이한 개별 공여자들로부터 상기 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 조합하여 공여자 풀링된 조작된 T 세포 조성물을 생산하는 단계;
를 포함하는, 방법. - 제 33 항 내지 제 43 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 상기 조합 전에 동결 보존되고 해동되는, 방법. - 제 33 항 내지 제 44 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 CD27 농축된 T 세포 집단은 (약) 75% 초과의 CD3+/CD27+ 세포, (약) 80% 초과의 CD3+/CD27+ 세포, (약) 85% 초과의 CD3+/CD27+ 세포, (약) 90% 초과의 CD3+/CD27+ 세포, 또는 (약) 95% 초과의 CD3+/CD27+ 세포를 포함하는, 방법. - 제 33 항 내지 제 45 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 독립적으로 (약) 40% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포, (약) 45% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포, (약) 50% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포, (약) 55% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포, (약) 55% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포, (약) 60% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포, (약) 65% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포 또는 (약) 70% 초과의 CD27+/재조합 수용체+ 세포를 포함하는, 방법. - 제 33 항 내지 제 46 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하되, 선택적으로 상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 (약) 1:5 내지 (약) 5:1 또는 (약) 1:3 내지 (약) 3:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법. - 제 40 항 내지 제 47 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 녹아웃 전에, 상기 CD27 농축된 T 세포 집단을 상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극하는 단계를 더 포함하는, 방법. - 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은:
(i) 복수의 상이한 공여자들 유래 공여자 샘플로부터 (a) T 세포 마커(들)에 대해 표면 양성인 세포 및 (b) CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 세포 중의 하나에 대해 선택하고, 그에 의해서 농축된 세포 집단을 생성하는 단계; 및
(ii) 상기 농축된 세포 집단으로부터, (a) 상기 T 세포 마커(들)에 대해 표면 양성인 세포 및 (b) CD27+ 세포 중의 다른 하나를 선택하고, 그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
를 포함하되, 여기서:
(1) 상기 공여자 샘플은 상기 복수의 상이한 공여자들 유래 세포를 포함하는 풀링된 샘플이고, 그에 의해서 상기 방법은 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생산하거나, 또는
(2) 상기 공여자 샘플은 개별 공여자 유래 샘플이고, 상기 단계 (i) 및 (ii)는 상기 복수의 상이한 공여자들 유래 공여자 샘플 각각에 대해 별도로 반복되고, 그에 의해서 상기 방법은 각각의 개별 공여자에 대해 CD27 농축된 T 세포 집단을 생산하는, 방법. - 제 49 항에 있어서,
상기 방법의 (2)는 각각의 개별 공여자 유래 상기 CD27 농축된 T 세포 집단들을 함께 조합하여 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생산하는 것을 더 포함하는, 방법. - 제 39 항 내지 제 43 항, 제 49 항 및 제 50 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포 마커(들)는 CD3인, 방법. - 제 39 항 내지 제 43 항 및 제 49 항 내지 제 51 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포 마커(들)는 CD4 및/또는 CD8인, 방법. - 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은:
(a) (i) 공여자 샘플로부터 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 T 세포에 대해 선택하는 단계, 여기서 상기 공여자 샘플은 개별 공여자 유래 인간 T 세포에 대해 농축됨; 또는 (ii) 공여자 샘플로부터 T 세포에 대해 선택하는 단계, 여기서 상기 공여자 샘플은 개별 공여자로부터의 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에 대해 농축됨;
그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
(b) 복수의 상이한 개별 공여자들에 대해 상기 단계 (a)를 반복하는 단계; 및
(c) 각각의 개별 공여자로부터의 각각의 CD27 농축된 T 세포 집단들을 조합하여, 그에 의해서 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
를 포함하는, 방법. - 제 53 항에 있어서,
인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 CD3+ T 세포에 대해 선택하는 것에 의해 수득되고, 선택적으로 인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 (약) 85% 초과의 CD3+ T 세포, (약) 90% 초과의 CD3+ T 세포, 또는 (약) 95% 초과의 CD3+ T 세포를 포함하는, 방법. - 제 53 항 또는 제 54 항에 있어서,
인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포에 대해 선택하는 것에 의해 수득되고/되거나; 인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법. - 제 53 항 내지 제 55 항 중의 어느 한 항에 있어서,
인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 (약) 1:5 내지 (약) 5:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함하되, 선택적으로, 인간 T 세포에 대해 농축된 상기 공여자 샘플은 (약) 1:3 내지 (약) 3:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법. - 제 49 항 내지 제 56 항 중의 어느 한 항에 있어서,
(a) (i) 상기 CD27 농축된 T 세포 집단 또는 (ii) 상기 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포는 (i) 내인성 주요 조직적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC);의 발현을 위해 녹아웃(KO)되고/되거나;
(b) 상기 방법은, (i) 상기 CD27 농축된 T 세포 집단 또는 (ii) 상기 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포에서, (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 TRAC;의 발현을 녹아웃시키는 단계;를 더 포함하는, 방법. - 제 49 항 내지 제 57 항 중의 어느 한 항에 있어서,
(a) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드는 상기 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포 또는 상기 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포 내로 도입되고/되거나;
(b) 상기 방법은 상기 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포 또는 상기 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포 내로 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 더 포함하고,
그에 의해서 상기 방법은 조작된 T 세포 조성물을 생성하는, 방법. - 제 58 항에 있어서,
상기 녹아웃 및 상기 이종 핵산의 도입은 어느 순서로든 동시에 또는 연속적으로 수행되는, 방법. - 제 57 항 내지 제 59 항의 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조합은:
상기 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포가 녹아웃되고/되거나 상기 이종 핵산에 도입되기 전; 또는
상기 CD27 농축된 T 세포의 세포가 녹아웃되고/되거나 상기 이종 핵산에 도입된 후;
에 수행되는, 방법. - 공여자 풀 유래 T 세포 조성물을 제조하는 방법으로서,
상기 방법은:
(i) 공여자 샘플로부터 (a) CD3에 대해 표면 양성(CD3+)이거나, 또는 CD4 및/또는 CD8에 대해 표면 양성(CD4+ 및/또는 CD8+)인 세포 및 (b) CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 세포 중의 하나에 대해 선택하고, 그에 의해서 농축된 세포 집단을 생성하는 단계;
(ii) 상기 농축된 세포 집단으로부터, (a) CD3+, 또는 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포 및 (b) CD27+ 세포 중의 다른 것을 선택하고, 그에 의해서 CD27 농축된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
(iii) 상기 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포를 상기 집단 내의 T 세포를 활성화시키는 조건 하에 자극하는 단계;
(iv) 상기 자극된 세포를 유전자 조작하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 단계, 상기 유전자 조작은:
(1) 상기 자극된 세포에서, (a) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (b) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC),의 발현을 녹아웃시키는 단계; 및
(2) 재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 상기 자극된 세포 내로, 선택적으로 TRAC를 암호화하는 유전자의 유전자 좌 내로 도입하는 단계;
를 포함하며, 상기 단계 (1)에서의 녹아웃 및 상기 단계 (2)에서의 도입은 어느 순서로든 동시에 또는 연속적으로 수행될 수 있음;
(v) 상기 조작된 T 세포 조성물을 최대 96 시간 동안, 선택적으로 (약) 37℃±2℃의 온도에서 인큐베이션하는 단계, 선택적으로 상기 인큐베이션은 증식 또는 증폭을 촉진시키는 조건하에 상기 세포를 배양하는 단계를 더 포함함;
(vi) 복수의 상이한 공여자들에 대해 상기 단계 (i) 내지 (v)를 반복하여 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 생산하는 단계, 여기서 각각의 공여자 조작된 T 세포 조성물은 상기 복수의 상이한 공여자들 중 개별 공여자 유래 세포로부터 생성됨; 및
(vii) 상기 복수의 상이한 공여자들 유래 복수의 공여자 조작된 T 세포 조성물들을 조합하는 단계;
를 포함하는, 방법. - 제 34 항 내지 제 61 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단에서 CD27- T 세포의 빈도는 상기 공여자 샘플에서 CD27- T 세포의 빈도의 (약) 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만인, 방법. - 제 34 항 내지 제 62 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단은 약 20% 미만의 CD27- T 세포, 약 15% 미만의 CD27- T 세포, 약 10% 미만의 CD27- T 세포, 약 5% 미만의 CD27- T 세포, 약 1% 미만의 CD27- T 세포, 또는 약 0.1% 미만의 CD27- T 세포를 포함하는, 방법. - 제 33 항 내지 제 63 항 중의 어느 한 항에 있어서,
(i) 상기 CD27 농축된 T 세포 집단 및/또는 상기 풀링된 CD27 농축된 T 세포 집단의 세포는 상기 공여자 샘플의 세포의 것과 비교하여 하나 이상의 분자의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타내고; (ii) 상기 하나 이상의 분자는 나이브 T 세포의 마커, 선택적으로 CD57, Ki67, CD25, CD28, CCR7, 및/또는 CD45RA를 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 64 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 공여자 샘플은 성분채집술 생성물(apheresis product) 또는 백혈구성분채집술 생성물(leukapheresis product)을 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 65 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 상이한 공여자들은 적어도 약 또는 약 2명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 5명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 10명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 15명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 20명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 25명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 50명의 상이한 공여자, 또는 적어도 약 또는 약 100명의 상이한 공여자, 또는 상기 중의 어느 것들 사이의 임의의 범위를 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 66 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 상이한 공여자들은 5 내지 25명의 공여자를 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 67 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 상이한 공여자들은 100% 미만의 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen, HLA) 매칭된, 약 90% 미만의 HLA 매칭된, 약 80% 미만의 HLA 매칭된, 약 70% 미만의 HLA 매칭된, 약 60% 미만의 HLA 매칭된, 또는 약 50% 미만의 HLA 매칭된 2명 이상의 공여자를 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 68 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 개별 공여자는 공여자 샘플이 개별 공여자로부터 수득되는 시점에 건강하거나 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되지 않는 것이고/이거나,
상기 복수의 상이한 공여자들 중 공여자 각각은 공여자 샘플이 각각의 상이한 공여자로부터 수득되는 시점에 건강하거나 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되지 않는 것인, 방법. - 제 2 항 내지 제 32 항 및 제 65 항 내지 제 69 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 선택은 면역친화도-기반 선택(immunoaffinity-based selection)을 포함하고, 선택적으로 상기 면역친화도-기반 선택은 T 세포를 CD57에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계 및 상기 항체에 결합되지 않은 세포를 회수하고, 그에 의해서 음성 선택을 수행하는 단계를 포함하는, 방법. - 제 34 항 내지 제 69 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 선택은 면역친화도-기반 선택을 포함하고, 선택적으로 상기 면역친화도-기반 선택은 T 세포를 CD27에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계 및 상기 항체에 결합된 세포를 회수하고, 그에 의해서 양성 선택을 수행하는 단계를 포함하는, 방법. - 제 70 항 또는 제 71 항에 있어서,
상기 면역친화도-기반 선택은 T 세포를 CD3, CD4, 또는 CD8에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계 및 상기 항체에 결합된 세포를 회수하고, 그에 의해서 양성 선택을 수행하는 단계를 포함하는, 방법. - 제 8 항 내지 제 16 항, 제 25 항 내지 제 32 항, 제 40 항 내지 제 48 항 및 제 57 항 내지 제 72 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 녹아웃(knocking out)은 징크 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease, ZFN), TAL-이펙터 뉴클레아제(TAL-effector nuclease, TALEN), 또는 CRISPR-Cas 조합을 상기 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 방법. - CD57 고갈된 T 세포 집단을 유전자 조작하는 방법으로서,
재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 제 16 항 내지 제 25 항, 제 30 항 내지 제 32 항, 제 48 항 내지 제 57 항 및 제 62 항 내지 제 72 항 중의 어느 한 항의 세포 내로 도입하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 단계를 더 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 16 항, 제 26 항 내지 제 32 항 및 제 65 항 내지 제 74 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 T 세포는, 상기 조작된 T 세포가 CD57+ T 세포 고갈되지 않는 방법과 비교하여, 상기 재조합 수용체의 발현에서 더 낮은 CV를 나타내는, 방법. - CD27 농축된 T 세포 집단을 유전자 조작하는 방법으로서,
재조합 수용체를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 제 48 항 내지 제 57 항 및 제 62 항 내지 제 72 항 중의 어느 한 항의 세포 내로 도입하고, 그에 의해서 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 단계를 더 포함하는, 방법. - 제 33 항 내지 제 48 항, 제 58 항 내지 제 73 항 및 제 76 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 T 세포는, 상기 조작된 T 세포가 CD27+ T 세포 농축되지 않는 방법과 비교하여, 상기 재조합 수용체의 발현에서 더 낮은 CV를 나타내는, 방법. - 제 2 항 내지 제 16 항, 제 26 항 내지 제 32 항, 제 34 항 내지 제 48 항 및 제 58 항 내지 제 77 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 도입은 상기 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터로 상기 이종 폴리뉴클레오티드의 표적화된 삽입을 포함하고, 선택적으로 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(adeno-associated viral, AAV) 벡터인, 방법. - 제 2 항 내지 제 16 항, 제 26 항 내지 제 32 항, 제 34 항 내지 제 48 항 및 제 58 항 내지 제 78 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 이종 폴리뉴클레오티드는 상기 β2M 유전자 또는 상기 TRAC 유전자의 유전자 좌 내로 삽입되고, 선택적으로 상기 이종 폴리뉴클레오티드는 상기 TRAC 유전자의 유전자 좌 내로 삽입되는, 방법. - 제 1 항 내지 제 16 항, 제 26 항 내지 제 48 항 및 제 58 항 내지 제 79 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 수용체는 질환 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련되거나, 그에 특이적이고/이거나 그 상에서 발현되는 표적 항원과 결합할 수 있는, 방법. - 제 80 항에 있어서,
상기 표적 항원은 종양 항원인, 방법. - 제 80 항 또는 제 81 항에 있어서,
상기 표적 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 표피 당단백질 2(EPG-2), 표피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; FC 수용체 상동물 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 클래스 5D(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 2량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 패밀리 8 멤버 A를 함유하는 루신 리치 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스트론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나제 유사 고아 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토머라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원 또는 보편적 태그(universal tag) 및/또는 비오티닐화된 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체(pathogen)에 의해 발현된 분자와 연관된 항원 중에서 선택되는, 방법. - 제 1 항 내지 제 16 항, 제 26 항 내지 제 48 항 및 제 58 항 내지 제 82 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인, 방법. - 제 1 항 내지 제 16 항, 제 26 항 내지 제 48 항 및 제 58 항 내지 제 83 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 수용체는 항원-결합 도메인, 스페이서(spacer) 및/또는 힌지 영역(hinge region)을 포함하는 세포외 도메인(extracellular domain), 막관통 도메인(transmembrane domain) 및 공자극 신호전달 영역(costimulatory signaling region)을 포함하는 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain)을 포함하는, 방법. - 제 84 항에 있어서,
상기 세포외 도메인은 scFv를 포함하는 항원-결합 도메인을 포함하는, 방법. - 제 84 항 또는 제 85 항에 있어서,
상기 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 도메인(primary signaling domain), T 세포에서 1차 활성화 신호(primary activation signal)를 유도할 수 있는 신호전달 도메인, T 세포 수용체(TCR) 성분의 신호전달 도메인 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif; ITAM)를 포함하는 신호전달 도메인이거나 또는 그들을 포함하는, 방법. - 제 84 항 내지 제 86 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 신호전달 도메인 또는 그의 신호전달 부분이거나 또는 그들을 포함하는, 방법. - 제 84 항 내지 제 87 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 공자극 신호전달 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 세포내 신호전달 도메인 또는 그들의 신호전달 부분을 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 88 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 방법에 의해 생산된 T 세포는 질환 또는 병태를 갖는 적어도 하나의 대상체에게 투여하기 위한 것이되, 선택적으로 상기 T 세포의 적어도 일부는 적어도 하나의 대상체에 대해 동종이계(allogeneic)인, 방법. - 제 89 항에 있어서,
상기 질환 또는 병태는 종양 또는 암인, 방법. - 제 89 항 또는 제 90 항에 있어서,
상기 방법에 의해 생산된 T 세포는 하나 이상의 단위 용량으로서 투여를 위해 제형화되고, 상기 세포는 적어도 약 100개 단위 용량의 세포, 적어도 약 200개 단위 용량의 세포, 적어도 약 300개 단위 용량의 세포, 적어도 약 400개 단위 용량의 세포, 적어도 약 500개 단위 용량의 세포, 적어도 약 600개 단위 용량, 적어도 약 또는 적어도 약 1,000개 단위 용량의 세포를 포함하는, 방법. - 제 89 항 내지 제 91 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 방법에 의해 생산된 T 세포는 적어도 2명의 대상체, 적어도 5명의 대상체, 적어도 10명의 대상체, 적어도 25명의 대상체, 적어도 50명의 대상체, 적어도 100명의 대상체, 적어도 200명의 대상체, 적어도 500명의 대상체, 또는 적어도 1,000명의 대상체에게 투여하기 위한 것인, 방법. - 제 1 항 내지 제 92 항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 T 세포 집단을 포함하는 조성물.
- 공여자 풀 유래 T 세포를 포함하는 조성물로서,
CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포에 대해 농축된 T 세포 집단을 포함하되, 여기서 상기 세포 집단은 복수의 상이한 공여자들 유래이고, 상기 복수의 상이한 공여자들은 100% 인간 백혈구 항원(HLA) 매칭되지 않은 적어도 2명의 공여자를 포함하는, 조성물. - 공여자 풀로 유래 T 세포를 포함하는 조성물로서,
CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에 대해 농축된 T 세포 집단을 포함하되, 여기서 상기 세포 집단은 복수의 상이한 공여자들 유래이고, 상기 복수의 상이한 공여자들은 100% 인간 백혈구 항원(HLA) 매칭되지 않은 적어도 2명의 공여자를 포함하는, 조성물. - 제 94 항 또는 제 95 항에 있어서,
상기 T 세포는 재조합 수용체로 유전자 조작된 T 세포를 포함하는, 조성물. - 제 93 항, 제 94 항 및 제 96 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 약 20% 미만의 CD57+ T 세포, 약 15% 미만의 CD57+ T 세포, 약 10% 미만의 CD57+ T 세포, 약 5% 미만의 CD57+ T 세포, 약 1% 미만의 CD57+ T 세포, 또는 약 0.1% 미만의 CD57+ T 세포를 포함하거나, 또는 CD57+ T 세포가 없거나 본질적으로 없는 것인, 조성물. - 제 93 항, 제 95 항 및 제 96 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 약 20% 미만의 CD27- T 세포, 약 15% 미만의 CD27- T 세포, 약 10% 미만의 CD27- T 세포, 약 5% 미만의 CD27- T 세포, 약 1% 미만의 CD27- T 세포, 또는 약 0.1% 미만의 CD27- T 세포를 포함하거나, 또는 CD27- T 세포가 없거나 본질적으로 없는 것인, 조성물. - 제 93 항 내지 제 98 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는, 조성물. - 제 99 항에 있어서,
상기 복수의 조작된 T 세포 조성물들 각각은 (약) 1:5 내지 약 5:1, 선택적으로 (약) 1:3 내지 (약) 3:1 비율의 CD4+ 대 CD8+ T 세포를 포함하는, 조성물. - 제 93 항, 제 94 항 및 제 96 항 내지 제 100 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물의 세포는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것과 비교하여, 하나 이상의 분자의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타내고, 선택적으로 (a) 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것보다 적어도 20% 더 낮거나, 적어도 40% 더 낮거나, 적어도 60% 더 낮거나, 또는 적어도 80% 더 낮고/낮거나, (b) 상기 하나 이상의 분자는 나이브 T 세포의 마커, 선택적으로 CD27, Ki67, CD25, CD28, CCR7, 및/또는 CD45RA를 포함하는, 조성물. - 제 93 항, 제 94 항 및 제 96 항 내지 제 101 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물의 세포는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것과 비교하여, CD27 및/또는 Ki67의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타내고, 선택적으로 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD57에 대해 표면 음성(CD57-)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것보다 적어도 20% 더 낮거나, 적어도 40% 더 낮거나, 적어도 60% 더 낮거나, 또는 적어도 80% 더 낮은, 조성물. - 제 93 항 및 제 95 항 내지 제 100 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물의 세포는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것과 비교하여, 하나 이상의 분자의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타내고, 선택적으로 (a) 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것보다 적어도 20% 더 낮거나, 적어도 40% 더 낮거나, 적어도 60% 더 낮거나, 또는 적어도 80% 더 낮고/낮거나, (b) 상기 하나 이상의 분자는 나이브 T 세포의 마커, 선택적으로 Ki67, CD25, CD28, CCR7, 및/또는 CD45RA를 포함하는, 조성물. - 제 93 항, 제 95 항 내지 제 100 항 및 제 103 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물의 세포는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포에 대해 농축되지 않은 세포 집단의 변동 계수(CV)와 비교하여 Ki67의 발현에서 더 낮은 변동 계수(CV)를 나타내고, 선택적으로 상기 조성물의 세포의 변동 계수(CV)는 CD27에 대해 표면 양성(CD27+)인 인간 T 세포가 농축되지 않은 세포 집단의 것보다 적어도 20% 더 낮거나, 적어도 40% 더 낮거나, 적어도 60% 더 낮거나, 또는 적어도 80% 더 낮은, 조성물. - 제 94항 내지 제 104항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 상이한 공여자들은 적어도 약 또는 약 2명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 5명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 10명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 15명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 20명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 25명의 상이한 공여자, 적어도 약 또는 약 50명의 상이한 공여자, 또는 적어도 약 또는 약 100명의 상이한 공여자를 포함하는, 조성물. - 제 94 항 내지 제 105 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 상이한 공여자들은 (약) 25명 미만의 공여자를 포함하는, 조성물. - 제 94 항 내지 제 106 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 상이한 공여자들은 100% HLA 매칭되지 않은 적어도 2명의 공여자를 포함하는, 조성물. - 제 94 항 내지 제 107 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 복수의 상이한 공여자들 중 공여자 각각은 상기 세포가 각각의 상이한 공여자로부터 수득되는 시점에 건강하거나 또는 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되지 않는 것인, 조성물. - 제 94 항 내지 제 108 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T 세포는 (i) 내인성 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 또는 그의 성분, 선택적으로 베타-2-마이크로글로불린(β2M); 및/또는 (ii) 내인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 성분, 선택적으로 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC);의 발현에 대해 녹아웃된 T 세포를 포함하는, 조성물. - 제 109 항에 있어서,
상기 이종 폴리뉴클레오티드는 상기 TRAC 유전자의 유전자 좌 내로 삽입되는, 조성물. - 제 93 항 내지 제 110 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 조성물. - 제 96 항 내지 제 111 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 수용체는 질환 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련되거나, 그에 특이적이고/이거나 그 상에서 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있는 것인, 조성물. - 제 112 항에 있어서,
상기 질환 또는 병태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 종양 또는 암인, 조성물. - 제 112 항 또는 제 113 항에 있어서,
상기 표적 항원은 종양 항원인 조성물. - 제 112 항 내지 제 114 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 표적 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 표피 당단백질 2(EPG-2), 표피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; FC 수용체 상동물 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 클래스 5D(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 2량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 패밀리 8 멤버 A를 함유하는 루신 리치 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스트론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나제 유사 고아 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토머라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원 또는 보편적 태그(universal tag) 및/또는 비오티닐화된 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체(pathogen)에 의해 발현된 분자와 연관된 항원 중에서 선택되는, 조성물. - 제 96 항 내지 제 115 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인, 조성물. - 제 96 항 내지 제 116 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 수용체는 항원-결합 도메인, 스페이서 및/또는 힌지 영역을 포함하는 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 공자극 신호전달 영역을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 조성물. - 제 117 항에 있어서,
상기 세포외 도메인은 scFv를 포함하는 항원-결합 도메인을 포함하는, 조성물. - 제 117 항 또는 제 118 항에 있어서,
상기 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호전달 도메인, T 세포 수용체(TCR) 성분의 신호전달 도메인 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 신호전달 도메인이거나 또는 그들을 포함하는, 조성물. - 제 117 항 내지 제 119 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 신호전달 도메인 또는 그의 신호전달 부분이거나 또는 그들을 포함하는, 조성물. - 제 117 항 내지 제 120 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 공자극 신호전달 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 세포내 신호전달 도메인 또는 그들의 신호전달 부분을 포함하는, 조성물. - 제 93 항 내지 제 121 항 중의 어느 한 항에 있어서,
질환 또는 병태를 갖는 대상체의 치료를 위한 것이되, 선택적으로 상기 질환 또는 병태는 암 또는 종양인, 조성물. - 제 93 항 내지 제 122 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물의 세포는 하나 이상의 단위 용량으로서 투여를 위해 제형화되고, 상기 세포는 적어도 약 100개 단위 용량의 세포, 적어도 약 200개 단위 용량의 세포, 적어도 약 300개 단위 용량의 세포, 적어도 약 400개 단위 용량의 세포, 적어도 약 500개 단위 용량의 세포, 적어도 약 600개 단위 용량, 적어도 약 또는 적어도 약 1,000개 단위 용량의 세포를 포함하는, 조성물. - 제 93 항 내지 제 123 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물의 세포는 적어도 2명의 대상체, 적어도 5명의 대상체, 적어도 10명의 대상체, 적어도 25명의 대상체, 적어도 50명의 대상체, 적어도 100명의 대상체, 적어도 200명의 대상체, 적어도 500명의 대상체, 또는 적어도 1,000명의 대상체에게 투여하기 위한 것인, 조성물. - 제 93 항 내지 제 124 항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 동결 보호제를 포함하는, 조성물. - 제 93 항 내지 제 125 항 중의 어느 한 항의 조성물을 포함하는 용기.
- 치료 방법으로서,
질환 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 제 93 항 내지 제 125 항 중의 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하되, 상기 조성물의 T 세포는 대상체로부터 유래되지 않거나 상기 조성물의 T 세포의 적어도 일부는 상기 대상체로부터 유래되지 않는 것인, 방법. - 제 127 항에 있어서,
상기 조성물의 T 세포의 100% 미만이 상기 대상체의 T 세포와 HLA-동일한 것인, 방법. - 제 127 항 또는 제 128 항에 있어서,
상기 질환 또는 병태는 암인, 방법. - 질환 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 질환 또는 장애의 치료용 의약의 제조를 위한 제 93 항 내지 제 125 항 중의 어느 한 항의 조성물의 용도로서,
상기 조성물의 T 세포는 상기 대상체로부터 유래되지 않거나 상기 조성물의 T 세포의 적어도 일부는 상기 대상체로부터 유래되지 않는 것인, 용도. - 제 130 항에 있어서,
상기 질환 또는 병태는 암 또는 종양인, 용도. - 질환 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한 제 93 항 내지 제 125 항 중의 어느 한 항의 조성물로서,
상기 조성물의 T 세포는 상기 대상체로부터 유래되지 않거나 상기 조성물의 T 세포의 적어도 일부는 상기 대상체로부터 유래되지 않고, 선택적으로 상기 질환 또는 병태는 암 또는 종양인, 조성물.
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