JP2024517863A - 細胞を刺激し、形質導入する方法 - Google Patents

細胞を刺激し、形質導入する方法 Download PDF

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Abstract

Figure 2024517863000001
カラムクロマトグラフィーを使用して試料中の細胞を選択、刺激および形質導入し、ならびにカラムからの細胞の脱離を容易にするためのさらなる工程または試薬を使用せずにカラムから細胞を収集および／または溶出する方法が本明細書において提供される。一部の態様では、本明細書において提供される方法は、最終的に、既存の方法と比較して細胞療法にとって有用な、選択、刺激および形質導入された細胞の集団を生成するために必要とされる時間を低減する。また、その製造品および装置も提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、全ての目的のために参照により全体が組み込まれる、２０２１年５月６日に出願した米国仮出願第６３／１８５，２４０号の優先権を主張するものである。
配列表の参照による組込み
本出願は、電子的フォーマットの配列表と共に提出される。配列表は、２０２２年５月３日に作成された、７３５０４２０２５５４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴと題されたファイルとして提供され、そのサイズは９２．５キロバイトである。配列表の電子的フォーマットの情報は、参照により全体が組み込まれている。
本開示は、カラムクロマトグラフィーを使用して試料中の細胞を選択、刺激および操作し、ならびにカラムからの細胞の脱離を容易にするためのさらなる工程または試薬を使用せずにカラムから細胞を収集および／または溶出する方法を提供する。一部の態様では、本明細書において提供される方法は、最終的に、既存の方法と比較して細胞療法にとって有用な、選択、刺激および操作された細胞の集団を生成するために必要とされる時間を低減する。また、その製造品および装置も提供される。
種々の細胞療法法が疾患および状態を処置するために利用可能である。細胞療法法の中でも、組換え受容体、例えば、キメラ抗原受容体で遺伝子操作され得る免疫細胞、例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞）が関与する方法がある。例えば、細胞療法において使用するのに適した細胞集団を生成するための改善された方法が必要である。このような必要性を満たす方法、製造品および装置が提供される。
一部の実施形態では、Ｔ細胞のオンカラム形質導入の方法であって、（ａ）複数のＴ細胞をＴ細胞刺激試薬および組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むウイルスベクターと同時に接触させることであって、複数のＴ細胞は、クロマトグラフィーカラムの内部空洞中に含まれる固定相上に固定化されていること、（ｂ）複数のＴ細胞を、Ｔ細胞刺激試薬およびウイルスベクターの存在下でインキュベートすること、ならびに（ｃ）接触の２４時間以内にクロマトグラフィーカラムから複数のＴ細胞を収集し、それによって、組換えタンパク質で形質導入されたＴ細胞を含む組成物を生成することを含む、方法が本明細書において提供される。
任意の実施形態の一部では、固定相は、複数のＴ細胞の表面上に発現された選択マーカーに特異的に結合する選択剤を含み、選択マーカーへの選択剤の特異的結合は、固定相上での複数のＴ細胞の固定化を達成する。
また、一部の実施形態では、Ｔ細胞のオンカラム形質導入の方法であって、（ａ）複数のＴ細胞を含む試料を、クロマトグラフィーカラムの内部空洞に添加することであって、内部空洞は、複数のＴ細胞の表面上に発現された選択マーカーに特異的に結合する選択剤を含む固定相を含み、それによって、複数のＴ細胞を固定相上に固定化すること、（ｂ）クロマトグラフィーカラム上に固定化されている複数のＴ細胞を、Ｔ細胞刺激試薬および組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むウイルスベクターと同時に接触させること、（ｃ）複数のＴ細胞をＴ細胞刺激試薬およびウイルスベクターの存在下でインキュベートすること、ならびに（ｄ）接触の２４時間以内にクロマトグラフィーカラムから複数のＴ細胞を収集し、それによって、組換えタンパク質で形質導入されたＴ細胞を含む組成物を生成することを含む、方法が本明細書において提供される。
任意の実施形態の一部では、刺激試薬およびウイルスベクターは、別個の組成物として複数のＴ細胞と接触される。任意の実施形態の一部では、刺激試薬およびウイルスベクターは、同一組成物中の混合物として複数のＴ細胞と接触される。
一部の実施形態では、Ｔ細胞のオンカラム形質導入の方法であって、（ａ）Ｔ細胞刺激試薬およびウイルスベクター調製物を含む混合物を調製すること、（ｂ）クロマトグラフィーカラムで、複数のＴ細胞を混合物と接触させることであって、複数のＴ細胞は、クロマトグラフィーカラムの内部空洞中に含まれる固定相上に固定化されていること、（ｃ）複数のＴ細胞をＴ細胞刺激試薬およびウイルスベクターの存在下でインキュベートすること、ならびに（ｄ）接触の２４時間以内に、クロマトグラフィーカラムから複数のＴ細胞を収集し、それによって、組換えタンパク質で形質導入されたＴ細胞を含む組成物を生成することを含む、方法が本明細書において提供される。
任意の実施形態の一部では、固定相は、複数のＴ細胞の表面上に発現された選択マーカーに特異的に結合する選択剤を含み、選択マーカーへの選択剤の特異的結合は、固定相上での複数のＴ細胞の固定化を達成する。
また、一部の実施形態では、Ｔ細胞のオンカラム形質導入の方法であって、（ａ）複数のＴ細胞を含む試料を、クロマトグラフィーカラムの内部空洞に添加することであって、内部空洞は、複数のＴ細胞の表面上に発現された選択マーカーに特異的に結合する選択剤を含む固定相を含み、それによって、固定相上に複数のＴ細胞を固定化すること、（ｂ）クロマトグラフィーカラムの内部空洞に、Ｔ細胞刺激試薬およびウイルスベクターを含む混合物を添加することによって、複数のＴ細胞を、Ｔ細胞刺激剤、例えば、刺激試薬および組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むウイルスベクターと接触させること、（ｃ）Ｔ細胞刺激試薬およびウイルスベクターの存在下で複数のＴ細胞をインキュベートすること、ならびに（ｄ）混合物の添加の２４時間以内にクロマトグラフィーカラムから複数のＴ細胞を収集し、それによって、組換えタンパク質で形質導入されたＴ細胞を含む組成物を生成することを含む、方法が本明細書において提供される。
任意の実施形態の一部では、方法は、刺激試薬およびウイルスベクターを混合して、刺激試薬および組換え核酸分子、例えば、ウイルスベクターを含む混合物を形成することを含む。
任意の実施形態の一部では、接触させることは、内部空洞に試料を添加した後１０分以内もしくは約１０分以内に、２０分以内もしくは約２０分以内に、３０分以内もしくは約３０分以内に、４５分以内もしくは約４５分以内に、６０分以内もしくは約６０分以内に、９０分以内もしくは約９０分以内に、または１２０分以内もしくは約１２０分以内に開始される。任意の実施形態の一部では、接触されることは、内部空洞に試料を添加した後６０分以内もしくは約６０分以内に開始される。
任意の実施形態の一部では、インキュベートすることの少なくとも一部分は、約３５℃から約３９℃の間の温度で実行される。任意の実施形態の一部では、インキュベートすることの少なくとも一部分は、３７℃または約３７℃の温度で実行される。
任意の実施形態の一部では、固定相の温度は、固定相に熱を提供するように構成された１つまたは複数の加熱エレメントによって調節される。
任意の実施形態の一部では、Ｔ細胞刺激剤、例えば、刺激試薬およびウイルスベクターは、無血清培地中の複数のＴ細胞と接触され、インキュベーション、例えば、インキュベートすることは、無血清培地中で実行される。任意の実施形態の一部では、無血清培地は、１種または複数の組換えＴ細胞刺激性サイトカインを含む。
任意の実施形態の一部では、Ｔ細胞刺激剤、例えば、刺激試薬およびウイルスベクターは、１種または複数の組換えＴ細胞刺激性サイトカインを含む培地中の複数のＴ細胞と接触される。
任意の実施形態の一部では、混合物は、１種または複数の組換えＴ細胞刺激性サイトカインを含む培地である。
任意の実施形態の一部では、培地は無血清培地である。
任意の実施形態の一部では、１つまたは複数の組換えサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７から選択される。任意の実施形態の一部では、１つまたは複数の組換えサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７である。
任意の実施形態の一部では、Ｔ細胞刺激剤、例えば、刺激試薬は、各々、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、境界を含めて、０．１μｇから２０μｇの間もしくは約０．１μｇから約２０μｇの間、境界を含めて、０．４μｇから８μｇの間もしくは約０．４μｇから約８μｇの間、または境界を含めて、０．８μｇから４μｇの間もしくは約０．８μｇから約４μｇの間の量で複数のＴ細胞と接触される。任意の実施形態の一部では、Ｔ細胞刺激剤、例えば、刺激試薬は、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、境界を含めて、１μｇから２μｇの間または約１μｇから約２μｇの間の量で複数のＴ細胞と接触される。
任意の実施形態の一部では、混合物は、各々、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、境界を含めて、０．１μｇから２０μｇの間もしくは約０．１μｇから約２０μｇの間、境界を含めて、０．４μｇから８μｇの間もしくは約０．４μｇから約８μｇの間、または境界を含めて、０．８μｇから４μｇの間もしくは約０．８μｇから約４μｇの間のＴ細胞刺激剤、例えば、刺激試薬の量を含む。任意の実施形態の一部では、混合物は、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、境界を含めて、１μｇから２μｇの間または約１μｇから約２μｇの間のＴ細胞刺激剤、例えば、刺激試薬の量を含む。
任意の実施形態の一部では、ウイルスベクターは、複数のＴ細胞と、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、境界を含めて、０．１μＬから１００μＬの間もしくは約０．１μＬから約１００μＬの間、境界を含めて、０．５μＬから５０μＬの間もしくは約０．５μＬから約５０μＬの間または境界を含めて、１μＬから２５μＬの間もしくは約１μＬから約２５μＬの間の体積の各ウイルスベクターの調製物で接触される。任意の実施形態の一部では、ウイルスベクターは、複数のＴ細胞と、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、境界を含めて、２μＬから１０μＬの間もしくは約２μＬから約１０μＬの間の各ウイルスベクターの調製物の体積で、適宜、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、６μＬもしくは約６μＬの体積で接触される。任意の実施形態の一部では、ウイルスベクターは、複数のＴ細胞と、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、６μＬもしくは約６μＬの体積で接触される。
任意の実施形態の一部では、混合物は、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、境界を含めて、０．１μＬから１００μＬの間もしくは約０．１μＬから約１００μＬの間、境界を含めて、０．５μＬから５０μＬの間もしくは約０．５μＬから約５０μＬの間または境界を含めて、１μＬから２５μＬの間もしくは約１μＬから約２５μＬの間の体積の各ウイルスベクターの調製物を含む。任意の実施形態の一部では、混合物は、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、境界を含めて、２μＬから１０μＬの間もしくは約２μＬから約１０μＬの間の体積のウイルスベクター調製物、適宜、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、６μＬまたは約６μＬの体積のウイルスベクターの調製物を含む。任意の実施形態の一部では、混合物は、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、６μＬもしくは約６μＬの体積のウイルスベクターの調製物を含む。
任意の実施形態の一部では、ウイルスベクターの調製物は、１×１０６ＴＵ／ｍＬから１×１０９ＴＵ／ｍＬの間もしくは約１×１０６ＴＵ／ｍＬから約１×１０９ＴＵ／ｍＬの間、１×１０６ＴＵ／ｍＬから１×１０８ＴＵ／ｍＬの間もしくは約１×１０６ＴＵ／ｍＬから約１×１０８ＴＵ／ｍＬの間、１×１０６ＴＵ／ｍＬから１×１０７ＴＵ／ｍＬの間もしくは約１×１０６ＴＵ／ｍＬから約１×１０７ＴＵ／ｍＬの間、１×１０７ＴＵ／ｍＬから１×１０９ＴＵ／ｍＬの間もしくは約１×１０７ＴＵ／ｍＬから約１×１０９ＴＵ／ｍＬの間、１×１０７ＴＵ／ｍＬから１×１０８ＴＵ／ｍＬの間もしくは約１×１０７ＴＵ／ｍＬから約１×１０８ＴＵ／ｍＬの間または１×１０８ＴＵ／ｍＬから１×１０９ＴＵ／ｍＬの間もしくは約１×１０８ＴＵ／ｍＬから約１×１０９ＴＵ／ｍＬの間の力価を有する。
任意の実施形態の一部では、収集することは、接触することの２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、９時間、８時間、７時間、６時間または５時間後以内に実行される。任意の実施形態の一部では、収集することは、接触することの、各境界を含めて２時間から２４時間の間、２時間から２２時間、２時間から２０時間、２時間から１８時間、２時間から１６時間、２時間から１４時間、２時間から１２時間、２時間から１０時間、２時間から９時間、２時間から８時間、２時間から７時間、２時間から６時間、２時間から５時間、３時間から６時間、３時間から５時間、４時間から６時間もしくは４時間から５時間の間、または約２時間から約２４時間の間、約２時間から約２２時間、約２時間から約２０時間、約２時間から約１８時間、約２時間から約１６時間、約２時間から約１４時間、約２時間から約１２時間、約２時間から約１０時間、約２時間から約９時間、約２時間から約８時間、約２時間から約７時間、約２時間から約６時間、約２時間から約５時間、約３時間から約６時間、約３時間から約５時間、約４時間から約６時間もしくは約４時間から約５時間の間の後に実行される。任意の実施形態の一部では、収集することは、接触することの、４．５時間または約４．５時間後に実行される。
任意の実施形態の一部では、Ｔ細胞刺激試薬の存在下でインキュベートすることは、複数の固定化されたＴ細胞のうち１つまたは複数を固定相から放出する。
任意の実施形態の一部では、収集することは、カラムに洗浄緩衝液を添加して、インキュベーションの際に固定相への固定化から放出された１つまたは複数の細胞を収集することを含む。任意の実施形態の一部では、洗浄緩衝液は、細胞培地である。任意の実施形態の一部では、細胞培地は、１種または複数の組換えＴ細胞刺激性サイトカインを含み、組換えＴ細胞刺激性サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７から選択されてもよい。任意の実施形態の一部では、細胞培地は、無血清培地である。任意の実施形態の一部では、細胞培地は、Ｔ細胞を固定相から溶出するための競合剤または遊離結合剤を含まない。
任意の実施形態の一部では、細胞培地は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７から選択される１種または複数の組換えＴ細胞刺激性サイトカインを含む。任意の実施形態の一部では、細胞培地は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７である１種または複数の組換えＴ細胞刺激性サイトカインを含む。
任意の実施形態の一部では、収集することは、固定相から複数のＴ細胞を溶出するための競合剤または遊離結合剤を含む培地を固定相に添加することを含まない。
任意の実施形態の一部では、組換えタンパク質で形質導入されたＴ細胞を含む組成物は、競合剤または遊離結合剤を含まない。
任意の実施形態の一部では、競合剤または遊離結合剤は、ビオチンまたはビオチンアナログであるか、またはそれを含む。任意の実施形態の一部では、競合剤または遊離結合剤は、Ｄ－ビオチンであるか、またはそれを含む。任意の実施形態の一部では、ビオチンアナログはデスチオビオチンである。
任意の実施形態の一部では、方法は、形質導入されたＴ細胞を含む組成物を溶液中でインキュベートすることをさらに含む。任意の実施形態の一部では、さらにインキュベートすることは、３７℃±２℃または約３７℃±２℃の温度で実行される。任意の実施形態の一部では、さらにインキュベートすることは、１４日以下、１２日以下、１０日以下、８日以下、６日以下または５日以下の間実行される。
任意の実施形態の一部では、さらにインキュベートすることは、形質導入されたＴ細胞の増殖または拡大増殖を誘導するための条件下で実行され、インキュベートすること、例えば、さらにインキュベートすることは、１種または複数の組換えＴ細胞刺激性サイトカインを含む細胞培地中で実行されてもよく、組換えＴ細胞刺激性サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７から選択されてもよい。任意の実施形態の一部では、さらにインキュベートすることは、１種または複数の組換えＴ細胞刺激性サイトカインを含む細胞培地中で実行される。任意の実施形態の一部では、組換えＴ細胞刺激性サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７から選択される。任意の実施形態の一部では、組換えＴ細胞刺激性サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７である。
任意の実施形態の一部では、さらにインキュベートすることは、Ｔ細胞、例えば、形質導入されたＴ細胞の最小の拡大増殖もしくは増殖がある、またはさらなる拡大増殖もしくは増殖がない条件下で実行される。任意の実施形態の一部では、さらにインキュベートすることは、組換えＴ細胞刺激性サイトカインを全く含まない基本培地中で実行される。
任意の実施形態の一部では、Ｔ細胞刺激試薬は、刺激シグナルをＴ細胞に送達可能である１種または複数の刺激剤を含む。任意の実施形態の一部では、１種または複数の刺激剤のうち少なくとも１種は、Ｔ細胞のＴＣＲ／ＣＤ３複合体、Ｔ細胞のＣＤ３含有複合体および／またはＴ細胞のＩＴＡＭ含有分子を介して刺激シグナルを送達することができる。任意の実施形態の一部では、１種または複数の刺激剤のうち少なくとも１つは、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを送達することができる。
任意の実施形態の一部では、少なくとも１つの刺激剤は、第１の刺激剤であり、刺激試薬は、第１の刺激剤によって送達された刺激シグナルを増強することができる第２の刺激剤をさらに含む。任意の実施形態の一部では、第２の刺激剤は、Ｔ細胞の共刺激分子に結合する。任意の実施形態の一部では、共刺激分子は、ＣＤ２８、ＣＤ９０（Ｔｈｙ－１）、ＣＤ９５（Ａｐｏ－／Ｆａｓ）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＩＣＯＳ、ＬＡＴ、ＣＤ２７、ＯＸ４０およびＨＶＥＭの中から選択される。任意の実施形態の一部では、第２の刺激剤はＣＤ２８に結合する。
任意の実施形態の一部では、第１の刺激剤は、ＣＤ３に特異的に結合し、第２の刺激剤は、ＣＤ２８に特異的に結合する。
任意の実施形態の一部では、１種または複数の刺激剤は、一価抗体断片を独立に含む。
任意の実施形態の一部では、第１の刺激剤は、ＣＤ３に結合する一価抗体断片を含み、第２の刺激剤は、ＣＤ２８に結合する一価抗体断片を含む。
任意の実施形態の一部では、一価抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片および単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される。
任意の実施形態の一部では、第１の刺激剤は抗ＣＤ３ Ｆａｂであり、第２の刺激剤は抗ＣＤ２８ Ｆａｂである。
任意の実施形態の一部では、Ｔ細胞刺激試薬は、抗ＣＤ３Ｆａｂである第１の刺激剤および抗ＣＤ２８ Ｆａｂである第２の刺激剤を含む。
任意の実施形態の一部では、１種または複数の刺激剤は、適宜、第１の刺激剤および第２の刺激剤は、固体表面、適宜、ビーズ上に固定化されている。任意の実施形態の一部では、固体表面はビーズである。
任意の実施形態の一部では、１種または複数の刺激剤、適宜、第１の刺激剤および第２の刺激剤は、可溶性オリゴマー試薬に可逆的に結合、例えば、それに結合している。任意の実施形態の一部では、可溶性オリゴマー試薬は、複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン四量体を含む。任意の実施形態の一部では、可溶性オリゴマー試薬は、複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン四量体を含むオリゴマーである。
任意の実施形態の一部では、可溶性オリゴマー試薬は、複数のストレプトアビジンムテイン四量体を含む。任意の実施形態の一部では、可溶性オリゴマー試薬は、複数のストレプトアビジンムテイン四量体を含むオリゴマーを含む。
任意の実施形態の一部では、オリゴマー粒子試薬、例えば、オリゴマー試薬のサイズは、ｉ）５０ｎｍより大きい半径、ｉｉ）少なくとも５×１０６ｇ／ｍｏｌの分子量および／または（ｉｉｉ）少なくとも１００のストレプトアビジンもしくはストレプトアビジンムテイン四量体を含む。任意の実施形態の一部では、可溶性オリゴマー粒子試薬、例えば、オリゴマー試薬は、平均で、境界を含めて、１０００から３０００の間または約１０００から約３０００の間のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン四量体、適宜、境界を含めて、２０００から３０００の間または約２０００から約３０００の間のストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｔｉｖｉｎ）またはストレプトアビジンムテイン四量体、適宜、２５００または約２５００のストレプトアビジンムテイン四量体を含む。任意の実施形態の一部では、可溶性オリゴマー粒子試薬、例えば、オリゴマー試薬は、境界を含めて、２０００から３０００の間または約２０００から約３０００の間のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン四量体を含む。
任意の実施形態の一部では、可溶性オリゴマー粒子試薬、例えば、オリゴマー試薬は、境界を含めて、１０００から３０００の間または約１０００から約３０００の間のストレプトアビジンムテイン四量体を含む。任意の実施形態の一部では、可溶性オリゴマー粒子試薬、例えば、オリゴマー試薬は、境界を含めて、２０００から３０００の間または約２０００から約３０００の間のストレプトアビジンムテイン四量体を含む。任意の実施形態の一部では、可溶性オリゴマー粒子試薬、例えば、オリゴマー試薬は、２５００または約２５００のストレプトアビジンムテイン四量体を含む。
任意の実施形態の一部では、可溶性オリゴマー粒子試薬の分子は、互いに架橋している。任意の実施形態の一部では、可溶性オリゴマー粒子試薬の分子は、多糖によって互いに架橋している。任意の実施形態の一部では、可溶性オリゴマー粒子試薬の分子は、二機能性リンカーによって互いに架橋している。任意の実施形態の一部では、可溶性オリゴマー粒子試薬の分子は、ヘテロ二機能性リンカーによって互いに架橋している。任意の実施形態の一部では、可溶性オリゴマー粒子試薬の分子は、アミン対チオールクロスリンクによって互いに架橋している。
任意の実施形態の一部では、１種または複数の刺激剤の各々、適宜、第１の刺激剤および第２の刺激剤の両方は、可溶性オリゴマー試薬に可逆的に結合する結合パートナーを含む。任意の実施形態の一部では、結合パートナーは、ストレプトアビジン結合ペプチドである。任意の実施形態の一部では、ストレプトアビジン結合ペプチドは、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号８）、Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１５）、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１７）、ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１６）、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１８）およびＴｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１９）からなる群から選択される配列である、それを含む。任意の実施形態の一部では、ストレプトアビジン結合ペプチドは、配列ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１６）を有する。任意の実施形態の一部では、ストレプトアビジン結合ペプチドの配列は、配列番号７、８および１５～１９のいずれかに示されている。任意の実施形態の一部では、ストレプトアビジン結合ペプチドは、ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１６）である。
任意の実施形態の一部では、結合パートナーは、ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン四量体のビオチン結合部位に可逆的に結合する。任意の実施形態の一部では、結合パートナーは、ストレプトアビジンムテイン四量体のビオチン結合部位に可逆的に結合する。任意の実施形態の一部では、結合パートナーは、ビオチン、ビオチンアナログまたはストレプトアビジン結合ペプチドである。任意の実施形態の一部では、結合パートナーは、ストレプトアビジン結合ペプチドである。任意の実施形態の一部では、ストレプトアビジン結合ペプチドの配列は、配列番号７、８および１５～１９のいずれかに示されている。任意の実施形態の一部では、ストレプトアビジン結合ペプチドは、ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１６）である。
任意の実施形態の一部では、ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン四量体は、ビオチン、ビオチンアナログまたはストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する。任意の実施形態の一部では、ストレプトアビジン結合ペプチドは、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号８）、Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１５）、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１７）、ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１６）、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１８）およびＴｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１９）からなる群から選択される。任意の実施形態の一部では、ストレプトアビジン結合ペプチドの配列は、配列番号７、８および１５～１９のいずれかに示されている。任意の実施形態の一部では、ストレプトアビジン結合ペプチドは、ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１６）である。
任意の実施形態の一部では、ストレプトアビジン四量体は、ビオチンアナログまたはストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する。任意の実施形態の一部では、ストレプトアビジン四量体は、ストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する。任意の実施形態の一部では、ストレプトアビジン結合ペプチドは、ストレプトアビジン四量体のビオチン結合部位に可逆的に結合する。任意の実施形態の一部では、ストレプトアビジン結合ペプチドの配列は、配列番号７、８および１５～１９のいずれかに示されている。任意の実施形態の一部では、ストレプトアビジン結合ペプチドは、ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１６）である。
任意の実施形態の一部では、ストレプトアビジンムテイン四量体は、ビオチン、ビオチンアナログまたはストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する。任意の実施形態の一部では、ストレプトアビジンムテイン四量体は、ストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する。任意の実施形態の一部では、ストレプトアビジン結合ペプチドは、ストレプトアビジンムテイン四量体のビオチン結合部位に可逆的に結合する。任意の実施形態の一部では、ストレプトアビジン結合ペプチドの配列は、配列番号７、８および１５～１９のいずれかに示されている。任意の実施形態の一部では、ストレプトアビジン結合ペプチドは、ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１６）である。
任意の実施形態の一部では、ストレプトアビジンムテインは、配列番号１のアミノ酸位置１０～１６の領域においてＮ末端で始まり、配列番号１のアミノ酸位置１３３～１４２の領域においてＣ末端で終了する。
任意の実施形態の一部では、ストレプトアビジンムテインは、ストレプトアビジン中、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸の配列中の位置を参照して位置４４～４７に対応する配列位置にアミノ酸配列Ｉｌｅ４４－Ｇｌｙ４５－Ａｌａ４６－Ａｒｇ４７を含む、またはストレプトアビジンムテインは、ストレプトアビジン中、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸の配列中の位置を参照して位置４４～４７に対応する配列位置にアミノ酸配列Ｖａｌ４４－Ｔｈｒ４５－Ａｌａ４６－Ａｒｇ４７を含む。任意の実施形態の一部では、ストレプトアビジンムテインは、配列番号３～６、２７、２８、１０４および１０５のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む。任意の実施形態の一部では、ストレプトアビジンムテインは、配列番号６に示されるアミノ酸の配列を含む。
任意の実施形態の一部では、選択剤は、抗体断片、免疫グロブリン様機能を有するタンパク質性結合分子、Ｉｇドメインを含有する分子、サイトカイン、ケモカイン、アプタマー、ＭＨＣ分子、ＭＨＣ－ペプチド複合体、受容体リガンドおよび例えば、前述のもののいずれかの結合断片からなる群から選択される薬剤であるか、またはそれを含む。任意の実施形態の一部では、選択剤は、抗体または抗体断片を含む。任意の実施形態の一部では、選択剤は、抗体断片を含む。任意の実施形態の一部では、抗体断片は一価抗体断片である。
任意の実施形態の一部では、選択マーカーはＴ細胞共受容体である；選択マーカーは、Ｔ細胞抗原受容体複合体のメンバーであるか、もしくは、それを含む；選択マーカーは、ＣＤ３鎖であるか、もしくはそれを含む；選択マーカーは、ＣＤ３ゼータ鎖であるか、もしくはそれを含む；選択マーカーは、ＣＤ８であるか、もしくはそれを含む；選択マーカーは、ＣＤ４であるか、もしくはそれを含む；選択マーカーは、ＣＤ４５ＲＡであるか、もしくはそれを含む；選択マーカーは、ＣＤ２７であるか、もしくはそれを含む；選択マーカーは、ＣＤ２８であるか、もしくはそれを含む；および／または選択マーカーは、ＣＣＲ７であるか、もしくはそれを含む。任意の実施形態の一部では、選択マーカーは、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８からなる群から選択される。任意の実施形態の一部では、選択マーカーはＣＤ３である。
任意の実施形態の一部では、選択マーカーは、Ｔ細胞共受容体またはＴ細胞抗原受容体複合体のメンバーである。任意の実施形態の一部では、選択マーカーは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２７、ＣＤ２８およびＣＣＲ７からなる群から選択される。任意の実施形態の一部では、選択マーカーは、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８からなる群から選択される。任意の実施形態の一部では、選択マーカーはＣＤ３である。
任意の実施形態の一部では、選択剤は、直接的または間接的に固定相に結合される。任意の実施形態の一部では、選択剤は、選択剤が可逆的に結合する選択試薬を介して間接的に固定相に結合される。
任意の実施形態の一部では、固定相は、クロマトグラフィーマトリックスであるか、またはそれを含む。
任意の実施形態の一部では、固定相は、各境界を含めて、５億から５０億個の細胞、５億から４０億個の細胞、５億から３０億個の細胞、５億から２０億個の細胞、１０億から５０億個の細胞、１０億から４０億個の細胞、１０億から３０億個の細胞もしくは１０億から２０億個の細胞の間または約５億から約５０億個の細胞、約５億から約４０億個の細胞、約５億から約３０億個の細胞、約５億から約２０億個の細胞、約１０億から約５０億個の細胞、約１０億から約４０億個の細胞、約１０億から約３０億個の細胞もしくは約１０億から約２０億個の細胞の間の結合能力を有する。任意の実施形態の一部では、固定相は、各境界を含めて、１０億から２０億個の細胞または約１０億から約２０億個の細胞の間の結合能力を有する。
任意の実施形態の一部では、複数のＴ細胞は、抗原特異的Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞および／または制御性Ｔ細胞を含む。任意の実施形態の一部では、Ｔ細胞は、ＣＤ３＋Ｔ細胞を含むか、またはＣＤ４＋Ｔ細胞および／もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。
任意の実施形態の一部では、Ｔ細胞は、ヒト対象由来の一次Ｔ細胞であるか、または試料は、ヒト対象に由来する一次Ｔ細胞を含む。任意の実施形態の一部では、試料は、全血試料、バフィーコート試料、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料、未分画Ｔ細胞試料、リンパ球試料、白血球細胞試料、アフェレーシス生成物もしくは白血球アフェレーシス生成物であるか、またはそれを含む。任意の実施形態の一部では、試料は、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス生成物である。任意の実施形態の一部では、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス生成物は、事前にクライオ凍結されている。
任意の実施形態の一部では、組換えタンパク質は、抗原受容体である。任意の実施形態の一部では、組換えタンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。任意の実施形態の一部では、ＣＡＲは、標的抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインおよびＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。任意の実施形態の一部では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内ドメインを含む。任意の実施形態の一部では、ＣＡＲは、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結する膜貫通ドメインをさらに含む。任意の実施形態の一部では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通部分を含む。任意の実施形態の一部では、細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。任意の実施形態の一部では、Ｔ細胞共刺激分子は、ＣＤ２８および４１ＢＢからなる群から選択される。
任意の実施形態の一部では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。任意の実施形態の一部では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。任意の実施形態の一部では、ウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇを有する偽型である。
任意の実施形態の一部では、方法は、さらなるインキュベーション、例えば、インキュベートすることの後に形質導入されたＴ細胞を回収し、それによって形質導入されたＴ細胞のアウトプット組成物を生成することをさらに含む。
任意の実施形態の一部では、回収の時間で、アウトプット組成物中のナイーブ様細胞のパーセンテージは、アウトプット組成物中の総Ｔ細胞、総ＣＤ４＋Ｔ細胞、総ＣＤ８＋Ｔ細胞の中の、またはその組換えタンパク質発現細胞の、例えば、前述のもののいずれかの６０％または約６０％より多い。任意の実施形態の一部では、ナイーブ様Ｔ細胞は、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ２７＋ＣＣＲ７＋、またはＣＤ６２Ｌ－ＣＣＲ７＋Ｔ細胞を含む。任意の実施形態の一部では、ナイーブ様Ｔ細胞は、ＣＤ２７＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞を含む。任意の実施形態の一部では、ナイーブ様Ｔ細胞は、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞を含む。
任意の実施形態の一部では、方法は、凍結保存および／または対象への投与のためにアウトプット組成物の細胞を製剤化することをさらに含む。任意の実施形態の一部では、回収された細胞は、薬学的に許容される賦形剤または凍結保護剤の存在下で製剤化される。
任意の実施形態の一部では、方法の工程のうち少なくとも１つは、閉鎖されたシステム内で実施される。任意の実施形態の一部では、方法の工程の全てが、閉鎖されたシステム内で実施される。
任意の実施形態の一部では、方法の工程の少なくとも１つは、自動化される。任意の実施形態の一部では、方法の工程の全てが自動化される。
一部の実施形態では、Ｔ細胞のオンカラム形質導入のための製造品であって、（ａ）（ｉ）Ｔ細胞の表面上の第１の分子および第２の分子にそれぞれ特異的に結合可能な、Ｔ細胞を刺激するための第１の刺激剤および第２の刺激剤、ならびに（ｉｉ）Ｔ細胞を形質導入するための、組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む組成物、ならびに（ｂ）固定相にＴ細胞を固定化するためのＴ細胞上の選択マーカーに特異的に結合可能な選択剤を含む固定相を含む、製造品が本明細書において提供される。
任意の実施形態の一部では、第１および第２の刺激剤は、組成物中に含まれるＴ細胞刺激試薬に可逆的に結合される。任意の実施形態の一部では、選択剤は、選択試薬を介して間接的に固定相に結合される。任意の実施形態の一部では、固定相は、クロマトグラフィーマトリックスであるか、またはそれを含む。任意の実施形態の一部では、製造品は、クロマトグラフィーマトリックスの全てまたは一部が含有される容器をさらに含む。任意の実施形態の一部では、固定相は第１の固定相であり、選択剤は第１の選択剤であり、選択マーカーは第１の選択マーカーであり、製造品は、Ｔ細胞上の第２の選択マーカーに特異的に結合可能な第２の選択剤を含む第２の固定相をさらに含む。任意の実施形態の一部では、第１および第２の固定相は、並列に配置される。任意の実施形態の一部では、第１および第２の固定相は、連続して配置される。
一部の実施形態では、提供された実施形態のいずれかの製造品を含む装置が本明細書において提供される。
任意の実施形態の一部では、装置は、装置の１つもしくは複数の構成要素に流体接続された流体入口および／または装置の１つもしくは複数の構成要素に流体接続された流体出口をさらに含む。任意の実施形態の一部では、装置は、閉鎖されたシステムまたは無菌システム中にある。
任意の実施形態の一部では、製造品または装置は、提供された実施形態のいずれかの方法において使用するためのものである。任意の実施形態の一部では、方法は、自動化様式で実施される。
また、一部の実施形態では、提供された方法のいずれかによって形質導入されたＴ細胞の集団が本明細書において提供される。
図１Ａおよび１Ｂは、カラムクロマトグラフィーのための例示的ハウジングアセンブリの概略図を提供する。図１Ａは、外部温水供給のための導入口および導出口を有する加熱コイルとねじ込み式空気フィルターのための気体供給コネクターとを含む温度制御メンバーを含む例示的ハウジングアセンブリを示す。図１Ｂは、例示的カラムクロマトグラフィーシステムにおける例示的ハウジングアセンブリを示す。 同上。 図２は、標的細胞を刺激および選択するための例示的実施形態の概略図を提供し、刺激は、少なくとも一部は、ここでは固定相として描かれている支持体３６の存在下において行われる、細胞のインキュベーションによって行われ、固定相は、その上に固定化された細胞選択のための選択試薬３１の成分を有し（パネルＡ）、選択試薬３１は、選択剤３２のための結合部位を有し、選択剤３２は、標的細胞のいくらかまたは全てに上に存在する分子（選択マーカー）３４に結合することができる。選択剤３２は、例えば、結合部位を介して、選択試薬および選択剤が可逆的に結合するような条件下において、固定化された選択試薬３１を有する支持体に添加され、それによって、選択剤がその上に固定化されたオリゴマー性複合体を生じる（パネルＢ）。選択剤は、２種以上の薬剤を含むことができる。あるいは、可逆的に結合した選択剤および選択試薬の複合体が、固定のために複合体として固定相に添加され得る。図に示されるように、細胞３３、例えば標的細胞など、は、固定相および多量体化された選択剤複合体と組み合わされ、それによって、標的細胞は、選択剤３２および試薬（選択マーカー）３４を介して、支持体３６に可逆的に固定化される（パネルＣ）。必要に応じて、結合していない細胞は、刺激剤の追加の前かまたはその後に除去される。オリゴマー性刺激試薬３７に可逆的に結合した多量体化された刺激剤３５を含む複合体が、ある条件下において添加され、それによって、刺激剤３５は、標的細胞上のある分子に特異的に結合し、それによって、マーカーを発現する固定化された標的細胞においてシグナルを誘導するかまたは調節する（パネルＤ）。 図３Ａおよび３Ｂは、オリゴマー性試薬の異なるバッチにおいて多量体化された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８を用いてインキュベートされた３つの異なるドナーに由来するＴ細胞のＷＳＴメタボリックアッセイの結果を示す。図３Ａは、３６ｎｍまたは１０１ｎｍの平均流体力学半径を有するオリゴマー性骨格上で多量体化された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８を含む参照バッチと比較したときの、ＷＳＴ比率によって示される、全ての試験したバッチ（プールされた）に対するＷＳＴメタボリック活性をまとめたものである。個々の試験したバッチおよび参照試薬に対する、平均ＷＳＴ比率によって示される、異なるドナーに由来するＴ細胞における平均ＷＳＴメタボリック活性が、図３Ｂに示される。 同上。 図４は、例示的オンカラムＴ細胞選択および刺激プロセスの概略図を提供する。 図５は、発熱体を有する例示的熱／気体カラムを使用した溶出効率を示し、ガス供給素子は、参照カラムを使用するもののおよそ２培であった。推定（灰色のバー）は、１００％の効率を仮定した場合に溶出する捕捉された細胞の理論上の数値であった。 図６は、発熱体および気体供給素子を有する例示的カラムを使用したオンカラムＴ細胞選択および刺激の後の、出発材料、ネガティブ画分、またはポジティブ画分における細胞のフローサイトメトリー定量化を示す。細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、およびＣＤ１４を含む表面マーカーを認識する抗体によって染色した。 図７Ａおよび７Ｂは、発熱体および気体供給素子を有する例示的カラムを使用したオンカラム選択および刺激の後のＴ細胞の結果を示す。細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ならびに活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５を認識する抗体を用いて細胞を染色した後に、細胞数および細胞表面の発現に対して、その後のインキュベーションの間の１日目、２日目、および３日目にフローサイトメトリーによってモニターし、フローサイトメトリーの結果が、図７Ａに示される。後続のインキュベーションの後の細胞数および拡大倍率の評価は、選択および刺激されたＴ細胞は、図７Ｂに示されるように、細胞が増殖する能力に一致して、３日目に数が増加し始めたことを示した。 同上。 図８Ａ～８Ｃは、例示的熱／気体カラムにおいて開始試料として低温保存されたアフェレーシス試料を使用したオンカラムＴ細胞選択の結果を提供する。図８Ａは、低温保存されたアフェレーシス試料（ＣＡＰＨ）が、概して、新鮮なアフェレーシス試料（ＡＰＨ）と比較して、高い単核細胞含量（生存ＣＤ４５＋細胞の割合によって示される場合、２０％超）有することを示す。図８Ｂは、出発材料およびポジティブ画分におけるＣＤ３またはＣＤ１４に対してポジティブな細胞の割合を表す。カラムクロマトグラフィーを使用して選択されたＴ細胞の数が図８Ｃに示されており、この場合、ＣＤ３に対して、２つの逐次選択が実施された。 同上。 同上。 図９は、連続して配置された２つの同一の例示的熱／気体カラムを使用した選択および刺激の実施（Ｒｕｎ１）、ならびに、並列に配置された２つの同一の例示的熱／気体カラムを使用した選択および刺激（Ｒｕｎ２）の概略図を提供する。 図１０Ａおよび１０Ｂは、Ｒｕｎ１およびＲｕｎ２におけるＴ細胞の選択および刺激の結果の比較を提供する。図１０Ａは、出発材料、ネガティブ画分、およびポジティブ画分のフローサイトメトリー分析を示しており、この場合、細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ１４を含む表面マーカーを認識する抗体によって染色された。ポジティブ画分からの細胞は、収穫およびインキュベートされ、左側パネルである図１０Ｂは、インキュベーションの１日目における細胞での活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の発現を示している。インキュベーションの際のＲｕｎ１（□）およびＲｕｎ２（●）における細胞数の代表的な結果が、右側パネルの図１０Ｂに示される。 同上。 図１１Ａおよび１１Ｂは、並列に配置された２つの例示的熱／気体カラムでのＣＤ３選択および刺激による、出発試料として濃縮された血液試料を使用したオンカラムＴ細胞選択の結果を提供する。図１１Ａは、出発材料、ネガティブ画分、またはポジティブ画分のフローサイトメトリー分析を示し、この場合、細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ１４を含む表面マーカーを認識する抗体で染色した。ポジティブ画分からの細胞は、収穫およびインキュベートされ、インキュベートされた細胞のＣＤ４／ＣＤ８およびＣＤ２５／ＣＤ６９の発現は、図１１Ｂに示される。 同上。 図１２は、例示的熱／気体クロマトグラフィーカラムの樹脂としてＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ－５０を使用した、全血から直接得られたＴ細胞を選択する例示的プロセスの結果を提供する。出発材料、ＣＤ３＋Ｔ細胞選択からのネガティブ画分およびポジティブ画分を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）およびＣＤ３抗体で染色し、フローサイトメトリーによって定量化した。 図１３は、細胞をクロマトグラフィーカラムの固定相に固定化するためにそれぞれの分子が選択マーカーとして使用される場合の、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８表面発現（平均蛍光強度ＭＦＩとして評価した）に対する抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー性刺激試薬による２４時間オンカラム刺激の効果を示す。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー性刺激試薬によるオンカラム刺激を伴わない条件を制御するために、表面発現パターンが比較される。細胞は、固定相に適用されたアフェレーシス試料から単離した。 図１４は、カラム上に細胞を固定化するための選択マーカーとしてＣＤ３が使用される場合の、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー性刺激試薬によるオンカラム刺激におけるＴＣＲ／ＣＤ３複合体の下方制御および再発現の例示的キネティクスを示す。細胞は、固定相に適用されたアフェレーシス試料から単離した。ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を評価するために、αβＴＣＲ鎖に対する抗体を使用した。 図１５Ａ～１５Ｂは、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー性刺激試薬によってオンカラム刺激の際に自然に脱離した培養Ｔ細胞の表現型および機能的特性を示す。図１５Ａは、オンカラム刺激の２４時間後および５日後における、左から右に、Ｔ細胞サイズならびにＣＤ３、ＣＤ６９、およびＣＤ２５発現を示す。図１５Ｂは、細胞数および拡大倍率によって示される、自然発生的に脱離した培養Ｔ細胞の増殖能力を示す。固定相に適用されたアフェレーシス試料から細胞を単離し、洗浄工程を使用して収集した。 同上。 図１６Ａ～１６Ｄは、ｍＴｏｒシグナル伝達および生存率および増殖キネティクスに対する、化合物６３の存在下または不在下において抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー性刺激試薬を用いてＴ細胞をインキュベートすることの例示的効果を示す。図１６Ａは、メモリーサブセットによる生存ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるｐＳ６発現を示す。図１６Ｂは、示されるような処理による総ＣＤ８＋Ｔ細胞のｐＳ６発現の平均蛍光強度（ｍｆｉ）を示す。図１６Ｃ～１６Ｄは、刺激の開始（「インプット」）の後の培養における経時（日数によって示される；ｄ１など）でのそれぞれ生存率および総Ｔ細胞数を示す。図１６Ｃ～１６Ｄにおいて、黒線は、化合物６３の存在下においてインキュベートされたＴ細胞組成物に対応し、灰色線は、化合物６３の不在下においてインキュベートされたＴ細胞組成物に対応する。 同上。 同上。 同上。 図１７Ａ～１７Ｆは、化合物６３の存在下または不在下での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー性刺激試薬によるインキュベーションを採用する方法を使用して生成された、低温保存されたＣＡＲ－Ｔ細胞の例示的な機能的および表現型特性を示す。図１７Ａは、解凍時点でのカスパーゼの細胞内発現を示す。図１７Ｂおよび１７Ｄは、ＣＤ２７および／またはＣＣＲ７のサブセット発現による、それぞれ、ＣＤ８ ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＣＤ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型プロファイルを示す。図１７Ｃおよび１７Ｅは、抗原保持標的によって刺激された、それぞれＣＤ８ ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＣＤ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞における、細胞内ＩＬ２、ＩＦＮｇ、またはＴＮＦ（左側パネル）あるいはＩＬ２および／またはＩＦＮｇもしくはＴＮＦの組合せ（右側パネル）を示す。図１７Ｆは、抗ＣＡＲビーズによって刺激されたＣＡＲ－Ｔ細胞に対する、１２日間にわたる増大増殖および生存率（左側パネル）ならびに増殖曲線下面積（ＡＵＣ）によって計算された総拡大増殖量（右側パネル）を示す。 同上。 図１８Ａは、実施例１１において説明されるオン刺激プロセスまたは代替プロセスのどちらかを使用した、細胞選択後のＣＤ３＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の収量を示す。図１８Ｂ～１８Ｃは、実施例１１において説明されるオンカラム刺激または代替のプロセスの使用の後に回収された、細胞の総数（図１８Ｂ）および生存細胞の割合（図１８Ｃ）を示す。 同上。 同上。 図１９Ａ～１９Ｄは、実施例１１において説明されるオンカラム刺激または代替のプロセスに対する、培養の５日目における（プロセスの開始から８日目）、生存細胞の割合（例えば、純度；図１９Ａ）、例示的ＣＡＲを発現する生存細胞の割合（図１９Ｂ）、選択およびプロセスの８日目における、ＣＤ４を発現する生存細胞の割合（図１９Ｃ）、ならびに各ドナーに対するＴ細胞表現型分布（割合）（図１９Ｄ）を示す。 同上。 同上。 同上。 図２０は、実施例１１において説明されるオンカラム刺激または代替のプロセスを使用して操作された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞による培養の間における経時での、ならびに制御条件下での、ＣＤ１９＋ＨＥＫ細胞溶解を示す。 図２１Ａ～２１Ｃは、実施例１１において説明されるオンカラム刺激または代替のプロセスを使用して操作されたＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞に対する、抗原特異的ＣＡＲ Ｔ細胞ＩＦＮｇ（図２１Ａ）、ＩＬ－２（図２１Ｂ）、およびＴＮＦα（図２１Ｃ）産生を示す。 同上。 同上。 図２２Ａ～２２Ｃは、実施例１１において説明されるオンカラム刺激または代替のプロセスを使用して生成された、ＣＤ４：ＣＤ８比率（図２２Ａ）、操作されたＴ細胞の形質導入効率（ＣＤ４およびＣＤ８細胞混合；図２２Ｂ）、および生存細胞の割合（図２２Ｃ）を示す。それぞれのプロセスに対して、３つの製造実施が示されている。 同上。 同上。 図２３は、マウスにＢ細胞リンパ腫細胞株（Ｒａｊｉ）を注入（ｉ．ｖ．）した６日後の、ならびにマウスをＣＡＲ－Ｔ細胞組成物で治療する前の、治療グループにおける平均放射輝度による腫瘍サイズを示す。治療グループは、実施例１１において説明されるオンカラム刺激または代替のプロセスのそれぞれに対する、３つ製造実施によって生成されたＣＡＲ－Ｔ細胞組成物を意味する。 図２４は、各治療グループに対する、経時でのＢ細胞リンパ腫細胞株（Ｒａｊｉ）注入マウスにおける腫瘍負担を示す。ＣＡＲ Ｔ細胞治療の効果が、実施例１１において説明されるオンカラム刺激または代替のプロセス、ならびに３つの製造実施のそれぞれに対して示されている（図２２Ａ～２２Ｃ）。 図２５～２８は、カラムクロマトグラフィーのための例示的ハウジングアセンブリの概略図を提供する。この例のハウジングアセンブリは、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、側壁メンバー、ならびに、側壁メンバーならびに導入口ハウジングメンバーおよび導出口ハウジングメンバーの一部を囲むジャケットメンバーを含む。例示的ハウジングアセンブリのジャケットメンバーは、それぞれが外部温水供給のための導入口および導出口を有する加熱コイルを含む、２つのジャケット構成要素で作製される。２つのジャケット構成要素は一緒に、ジャケットメンバーを形成する。例示的ハウジングアセンブリは、ねじ込み式空気フィルターのための気体供給コネクター（図示されず）も含み、気体供給コネクターは、導入口ハウジングメンバーの導入口に接続される。図２５は、例示的ハウジングアセンブリの拡大図を示す。図２６Ａ～２６Ｃは、１つのジャケット構成要素の内側（図２６Ａ）、側面（図２６Ｂ）、および外側（図２６Ｃ）の構図を示す。図２７は、外部温水供給のための導入口および導入口ハウジングメンバーの導入口の一部が描かれている例示的ハウジングアセンブリの構図を示す。図２８は、外部温水供給のための導出口および導出口ハウジングメンバーの導入口の一部が描かれている例示的ハウジングアセンブリの構図を示す。この例示的ハウジングアセンブリのための選択肢の特徴（図示されず）は、固定相と内部空洞の導入口とを分離するように構成された第１の多孔性メンバー（例えば、織布ポリエステルメッシュ）、固定相と内部空洞の導出口とを分離するように構成された第２の多孔性メンバー（例えば、織布ポリエステルメッシュ）、およびチューブセットのコネクターを含む。 図２５～２８は、カラムクロマトグラフィーのための例示的ハウジングアセンブリの概略図を提供する。この例のハウジングアセンブリは、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、側壁メンバー、ならびに、側壁メンバーならびに導入口ハウジングメンバーおよび導出口ハウジングメンバーの一部を囲むジャケットメンバーを含む。例示的ハウジングアセンブリのジャケットメンバーは、それぞれが外部温水供給のための導入口および導出口を有する加熱コイルを含む、２つのジャケット構成要素で作製される。２つのジャケット構成要素は一緒に、ジャケットメンバーを形成する。例示的ハウジングアセンブリは、ねじ込み式空気フィルターのための気体供給コネクター（図示されず）も含み、気体供給コネクターは、導入口ハウジングメンバーの導入口に接続される。図２５は、例示的ハウジングアセンブリの拡大図を示す。図２６Ａ～２６Ｃは、１つのジャケット構成要素の内側（図２６Ａ）、側面（図２６Ｂ）、および外側（図２６Ｃ）の構図を示す。図２７は、外部温水供給のための導入口および導入口ハウジングメンバーの導入口の一部が描かれている例示的ハウジングアセンブリの構図を示す。図２８は、外部温水供給のための導出口および導出口ハウジングメンバーの導入口の一部が描かれている例示的ハウジングアセンブリの構図を示す。この例示的ハウジングアセンブリのための選択肢の特徴（図示されず）は、固定相と内部空洞の導入口とを分離するように構成された第１の多孔性メンバー（例えば、織布ポリエステルメッシュ）、固定相と内部空洞の導出口とを分離するように構成された第２の多孔性メンバー（例えば、織布ポリエステルメッシュ）、およびチューブセットのコネクターを含む。 同上。 同上。 図２５～２８は、カラムクロマトグラフィーのための例示的ハウジングアセンブリの概略図を提供する。この例のハウジングアセンブリは、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、側壁メンバー、ならびに、側壁メンバーならびに導入口ハウジングメンバーおよび導出口ハウジングメンバーの一部を囲むジャケットメンバーを含む。例示的ハウジングアセンブリのジャケットメンバーは、それぞれが外部温水供給のための導入口および導出口を有する加熱コイルを含む、２つのジャケット構成要素で作製される。２つのジャケット構成要素は一緒に、ジャケットメンバーを形成する。例示的ハウジングアセンブリは、ねじ込み式空気フィルターのための気体供給コネクター（図示されず）も含み、気体供給コネクターは、導入口ハウジングメンバーの導入口に接続される。図２５は、例示的ハウジングアセンブリの拡大図を示す。図２６Ａ～２６Ｃは、１つのジャケット構成要素の内側（図２６Ａ）、側面（図２６Ｂ）、および外側（図２６Ｃ）の構図を示す。図２７は、外部温水供給のための導入口および導入口ハウジングメンバーの導入口の一部が描かれている例示的ハウジングアセンブリの構図を示す。図２８は、外部温水供給のための導出口および導出口ハウジングメンバーの導入口の一部が描かれている例示的ハウジングアセンブリの構図を示す。この例示的ハウジングアセンブリのための選択肢の特徴（図示されず）は、固定相と内部空洞の導入口とを分離するように構成された第１の多孔性メンバー（例えば、織布ポリエステルメッシュ）、固定相と内部空洞の導出口とを分離するように構成された第２の多孔性メンバー（例えば、織布ポリエステルメッシュ）、およびチューブセットのコネクターを含む。 図２５～２８は、カラムクロマトグラフィーのための例示的ハウジングアセンブリの概略図を提供する。この例のハウジングアセンブリは、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、側壁メンバー、ならびに、側壁メンバーならびに導入口ハウジングメンバーおよび導出口ハウジングメンバーの一部を囲むジャケットメンバーを含む。例示的ハウジングアセンブリのジャケットメンバーは、それぞれが外部温水供給のための導入口および導出口を有する加熱コイルを含む、２つのジャケット構成要素で作製される。２つのジャケット構成要素は一緒に、ジャケットメンバーを形成する。例示的ハウジングアセンブリは、ねじ込み式空気フィルターのための気体供給コネクター（図示されず）も含み、気体供給コネクターは、導入口ハウジングメンバーの導入口に接続される。図２５は、例示的ハウジングアセンブリの拡大図を示す。図２６Ａ～２６Ｃは、１つのジャケット構成要素の内側（図２６Ａ）、側面（図２６Ｂ）、および外側（図２６Ｃ）の構図を示す。図２７は、外部温水供給のための導入口および導入口ハウジングメンバーの導入口の一部が描かれている例示的ハウジングアセンブリの構図を示す。図２８は、外部温水供給のための導出口および導出口ハウジングメンバーの導入口の一部が描かれている例示的ハウジングアセンブリの構図を示す。この例示的ハウジングアセンブリのための選択肢の特徴（図示されず）は、固定相と内部空洞の導入口とを分離するように構成された第１の多孔性メンバー（例えば、織布ポリエステルメッシュ）、固定相と内部空洞の導出口とを分離するように構成された第２の多孔性メンバー（例えば、織布ポリエステルメッシュ）、およびチューブセットのコネクターを含む。 図２９～３１は、カラムクロマトグラフィーのための例示的ハウジングアセンブリの概略図を提供する。この例示的ハウジングアセンブリは、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、側壁メンバー、ならびに、側壁メンバーならびに導入口ハウジングメンバーおよび導出口ハウジングメンバーの一部を囲むジャケットメンバーを含む。例示的ハウジングアセンブリのジャケットメンバーは、それぞれが金属プレートを含む電気式発熱体を含む３つのジャケット構成要素で作製される。３つのジャケット構成要素は一緒に、ジャケットメンバーを形成する。例示的ハウジングアセンブリは、ねじ込み式空気フィルター（図示されず）のための気体供給コネクターも含み、気体供給コネクターは、導入口ハウジングメンバーの導入口に接続される。図２９は、例示的ハウジングアセンブリの拡大図を示す。図３０Ａ～３０Ｃは、１つのジャケット構成要素の３つの構図を示す。図３０Ｄは、電気式発熱体を示す。図３１は、電気式発熱体の電気接続ならびに導出口ハウジングメンバーの導入口の一部が描かれている例示的ハウジングアセンブリの構図を示す。この例示的ハウジングアセンブリのためのオプションの特徴（図示されず）は、第１の多孔性メンバー（例えば、織布ポリエステルメッシュ）、第２の多孔性メンバー（例えば、織布ポリエステルメッシュ）、およびチューブセットのコネクターを含む。 図２９～３１は、カラムクロマトグラフィーのための例示的ハウジングアセンブリの概略図を提供する。この例示的ハウジングアセンブリは、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、側壁メンバー、ならびに、側壁メンバーならびに導入口ハウジングメンバーおよび導出口ハウジングメンバーの一部を囲むジャケットメンバーを含む。例示的ハウジングアセンブリのジャケットメンバーは、それぞれが金属プレートを含む電気式発熱体を含む３つのジャケット構成要素で作製される。３つのジャケット構成要素は一緒に、ジャケットメンバーを形成する。例示的ハウジングアセンブリは、ねじ込み式空気フィルター（図示されず）のための気体供給コネクターも含み、気体供給コネクターは、導入口ハウジングメンバーの導入口に接続される。図２９は、例示的ハウジングアセンブリの拡大図を示す。図３０Ａ～３０Ｃは、１つのジャケット構成要素の３つの構図を示す。図３０Ｄは、電気式発熱体を示す。図３１は、電気式発熱体の電気接続ならびに導出口ハウジングメンバーの導入口の一部が描かれている例示的ハウジングアセンブリの構図を示す。この例示的ハウジングアセンブリのためのオプションの特徴（図示されず）は、第１の多孔性メンバー（例えば、織布ポリエステルメッシュ）、第２の多孔性メンバー（例えば、織布ポリエステルメッシュ）、およびチューブセットのコネクターを含む。 同上。 同上。 同上。 図２９～３１は、カラムクロマトグラフィーのための例示的ハウジングアセンブリの概略図を提供する。この例示的ハウジングアセンブリは、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、側壁メンバー、ならびに、側壁メンバーならびに導入口ハウジングメンバーおよび導出口ハウジングメンバーの一部を囲むジャケットメンバーを含む。例示的ハウジングアセンブリのジャケットメンバーは、それぞれが金属プレートを含む電気式発熱体を含む３つのジャケット構成要素で作製される。３つのジャケット構成要素は一緒に、ジャケットメンバーを形成する。例示的ハウジングアセンブリは、ねじ込み式空気フィルター（図示されず）のための気体供給コネクターも含み、気体供給コネクターは、導入口ハウジングメンバーの導入口に接続される。図２９は、例示的ハウジングアセンブリの拡大図を示す。図３０Ａ～３０Ｃは、１つのジャケット構成要素の３つの構図を示す。図３０Ｄは、電気式発熱体を示す。図３１は、電気式発熱体の電気接続ならびに導出口ハウジングメンバーの導入口の一部が描かれている例示的ハウジングアセンブリの構図を示す。この例示的ハウジングアセンブリのためのオプションの特徴（図示されず）は、第１の多孔性メンバー（例えば、織布ポリエステルメッシュ）、第２の多孔性メンバー（例えば、織布ポリエステルメッシュ）、およびチューブセットのコネクターを含む。 図３２は、選択マーカーとしてＣＤ２７を使用して細胞が加熱されたカラムの固定相上に固定化され、ならびに抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー性刺激試薬を用いてオンカラムにおいて刺激された後の細胞のＣＤ２７表面発現を示す。それぞれが外部温水供給のための導入口および導出口を有する２つの加熱コイルを含むジャケットメンバーを使用して、カラムを加熱した。加熱されたカラムは、ねじ込み式空気フィルターのための気体供給コネクターも備えた。対照として、ＣＤ２７選択細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー性刺激試薬によるオンカラム刺激に供されなかった。細胞を、固定相に適用されたアフェレーシス試料から細胞を単離した。 図３３は、２つの分離カラムを使用してアフェレーシス試料から連続的に単離された細胞のＣＤ３およびＣＤ２７表面発現を示す。第１のカラムでは、選択マーカーとしてＣＤ２７が使用され、第１カラムのポジティブ画分は、ＣＤ３選択マーカーを有する第２カラムを通された。第２カラムに固定化された細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー性刺激試薬によって刺激された。第２カラムは、それぞれが外部温水供給のための導入口および導出口を有する２つの加熱コイルを含むジャケットメンバーを使用して加熱された。加熱されたカラムは、ねじ込み式空気フィルターのための気体供給コネクターも備えた。 図３４Ａ～３４Ｅは、異なる発熱体を使用して加熱されたクロマトグラフィーカラムでのオンカラム刺激の後の細胞のＣＤ３＋消耗（図３４Ａ）、ＣＤ４およびＣＤ８の発現（図３４Ｂ）、ＣＤ６９の発現（図３４Ｃ）、生存率（図３４Ｄ）、および生存細胞数（図３４Ｅ）を示す。カラムを、２つの加熱コイル（水）または電気式発熱体として３つの金属プレート（金属）を含むジャケットメンバーを使用して加熱した。カラムは、ねじ込み式空気フィルターのための気体供給コネクターも備えた。 同上。 同上。 同上。 同上。 図３５は、オンカラム刺激および形質導入を同時に受けた細胞（右側パネル）、ならびにネガティブおよびポジティブコントロールのための細胞（それぞれ、左側および中央パネル）のＣＤ８およびＣＡＲ発現を示す。示された結果は、生きた単一のＣＤ４５＋リンパ球においてプレゲートされた細胞に対するものである。
細胞のオンカラム形質導入の方法が、本明細書の一部の態様では提供される。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、方法は、細胞または細胞を含む試料を、刺激試薬、例えば、Ｔ細胞刺激試薬と接触させることを含む。一部の実施形態では、方法は、細胞または細胞を含む試料を、組換えタンパク質をコードする核酸配列を有するウイルスベクターと接触させ、それによって、形質導入された細胞を作製することを含む。一部の実施形態では、細胞または細胞を含む試料は、刺激試薬、例えば、Ｔ細胞刺激試薬およびウイルスベクターと同時に接触させられる。一部の実施形態では、細胞は、固定相、例えば、クロマトグラフィーカラムの内部空洞に収容された固定相、の上に固定化される。一部の実施形態では、細胞は、細胞または細胞を含む試料が、刺激試薬、例えば、Ｔ細胞刺激試薬およびウイルスベクターと接触させられる前およびその時に、固定化される。一部の実施形態では、細胞は、細胞によって発現される選択マーカーに結合する選択剤を介して固定化され、この場合、選択剤は、固定相上に直接的または間接的に固定化されている。
一部の実施形態では、方法は、さらに、細胞、または細胞、例えばＴ細胞、を含む試料を内部空洞に添加することを含む。一部の実施形態では、方法は、さらに、刺激試薬、例えば、Ｔ細胞刺激試薬とウイルスベクターと含む組成物を内部空洞に添加することを含む。一部の実施形態では、方法は、さらに、内部空洞の細胞または細胞を含む試料を、刺激試薬、例えば、Ｔ細胞刺激試薬、およびウイルスベクターの存在下においてインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、方法は、さらに、形質導入された細胞を、収集する工程、培養する工程、収穫する工程、および／または製剤化する工程を含む。提供された方法を実施するためのものを含む、製造の物品および機器も、本明細書において提供される。
細胞療法における使用にとって好適な細胞集団、例えば、選択された（濃縮された）、刺激された、および操作された細胞集団、を生成する方法は、多くの場合、別々の選択、刺激、および操作工程を必要とし、それらは、製造プロセスを長引かせ得る。さらに、選択技術は、選択された細胞に、選択試薬、例えば、Ｆａｂ断片などの選択剤、および競合試薬、ならびに／あるいはカラムクロマトグラフィーにおいて使用される固定相からの細胞の脱離を促進するために使用される遊離結合剤を混入させる工程を伴い得、結果として、アウトプット組成物を精製するために、追加の洗浄工程および／または培地交換工程を必要とする。複数の処理工程は、完了するのにかなりの時間を必要とすることに加え、川下の細胞処理、さらには細胞生物学にさえ影響を及ぼす可能性のある細胞ストレスを結果として生じ得る。細胞組成物を生成するための追加方法が必要とされる。
一部の態様では、標的細胞を含む試料から細胞を選択し（例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、またはＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴ細胞）、ならびに選択された細胞を刺激および／または操作する、例えば、形質導入するための方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、標的細胞は、選択の後に、同時に刺激および形質導入され、その際に、標的細胞は、選択のために使用されたクロマトグラフィーカラムの固定相に固定化される。したがって、一部の態様では、提供される方法は、細胞を刺激する工程と細胞を操作する工程とを組み合わせ、それによって、製造に必要な時間を短縮する。一部の態様では、この組合せは、結果として、他の方法と比べて、改善された形質導入効率をもたらし、この場合、形質導入は、細胞の活性化および／またはクロマトグラフィーカラムからの細胞の溶出の後に実施される。一部の態様では、形質導入効率は、早期の細胞の形質導入、例えば、活性化の開始と同じくらい早期の細胞の形質導入、によって改良される。一部の態様では、形質導入効率は、細胞がオンカラムにおいて形質導入されることによって改良されるが、それは、例えば、細胞が固定化されおよび／またはカラムから細胞が溶出することによってさらに処理されることがないためである。
さらに、一部の態様では、提供される方法は、活性化および／または形質導入の後の、固定相からの細胞の自然な脱離も結果として生じる。したがって、一部の態様では、提供される方法は、細胞を溶出させるための競合試薬の使用ならびに／あるいは溶出後に競合試薬および選択剤を除去するための追加の洗浄工程を必要としない。一部の態様では、本明細書において提供される方法は、固定相からの細胞の脱離を促進するための別々の工程を必要としない。一部の態様では、本明細書において提供される方法は、別々の精製工程、例えば、脱離を促進するために使用される薬剤（例えば、競合剤および／または遊離結合剤）を除去するための工程、を必要としない。したがって、一部の態様では、本明細書において提供される方法は、細胞の取り扱い、汚染、および製造プロセスにおける処理時間を減少および／または最小化する。さらに、提供される方法は、クロマトグラフィーカラムでの選択ならびに活性化および形質導入工程を実施することにより、細胞の選択、刺激、および遺伝子操作などのオンカラム操作を統一する、完全に閉じた系の使用を可能にする。一部の態様では、提供される方法の工程は、自動化することができ、または、方法は、完全に自動化することができる。一部の態様では、提供される方法は、細胞のより少ない操作によるより迅速な製造を可能にし、それによって、例えば、より広い細胞特性の維持、改善された細胞産生ターンアラウンド時間、ハンズオン不具合の減少、および細胞療法のための最終的製造コストの減少をもたらす。一部の態様では、提供される方法および他の実施形態は、それらが、複数の処理工程（例えば、選択、刺激、および形質導入）を圧縮し、ならびに／あるいは、処理工程（例えば、脱離を促進するために使用される選択試薬および／または選択剤を除去するための工程）を排除し、ならびに圧縮されたプロセスは、同じ容器および／または閉じた系内において行うことを可能にし、それは、効率の増加および無菌性を提供することができる、という点において有利である。
提供される方法は、固定相から細胞を脱離させて、選択され刺激された細胞のアウトプット組成物からの上記脱離を促進するために使用される薬剤を除去するための処理工程なしに、他の成分、例えば、試料中の他の細胞など、から細胞、例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋Ｔ細胞、を選択して、クロマトグラフィーカラムの固定相上にその細胞を固定化すること；固定相上に固定化された選択された細胞を刺激および形質導入すること；および細胞を収集すること、が可能である。特定の態様において、提供されるデバイスおよび方法は、別々の選択工程、刺激工程、および形質導入工程を含んで、さらに、固定相から細胞を脱離させて、脱離を促進するために使用された薬剤を除去するための追加の工程を必要とする方法と比較して、短縮された時間において、選択、刺激、および形質導入された細胞の集団を生成させることが可能である。ある特定の態様において、提供される方法は、カラムでの刺激および／または形質導入の開始から２４時間以内に、下流の処理（例えば、培養、拡大増殖、ならびに／あるいはその後のインキュベーション、刺激、選択、および／または形質導入の実施）にとって好適な、選択され、刺激され、および形質導入された細胞のアウトプット集団（また、組成物とも呼ばれる）を生成させることができる。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法は、細胞の表面上の分子に結合することができる刺激剤の使用と、それによって細胞に刺激シグナルを送達することを伴う。一部の実施形態では、刺激剤は、固定相に添加することができるオリゴマー性の刺激試薬に含まれる。一部の実施形態では、刺激は、結果として、選択された細胞の固定相からの自然発生的脱離を生じ、したがって、固定相から細胞を脱離させて、アウトプット細胞組成物からの上記脱離を促進するために使用された薬剤を除去する追加の処理工程なしに、選択され刺激された細胞の収集を可能にする。特定の態様において、方法は、オンカラムでの刺激および／または形質導入の開始から２４時間以内でのさらなる処理、例えば、培養、増殖、インキュベーション、あるいはその後の、刺激、選択、および／または形質導入の実施にとって好適な、汚染のない（例えば、脱離のために使用された薬剤、例えば、競合剤または遊離結合剤、ならびに／あるいは選択剤などを含まない）、選択され、刺激され、および形質導入された細胞の組成物を首尾よく生成する。
本出願において参照される特許文書、科学論文およびデータベースを含む全ての出版物は、それぞれ個々の出版物が個々に参照により組み込まれた場合と同程度に、あらゆる目的のために参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の定義が、参照により本明細書に組み込まれる特許、出願、公開された出願および他の出版物に記載の定義に反するか、または別の状況で矛盾する場合、参照により本明細書に組み込まれる定義より本明細書に記載の定義が優先される。
本明細書において使用される章の見出しは、単に系統化する目的のためであり、記載された主題を限定するものとして解釈されないものとする。
Ｉ．細胞を選択、刺激および／または操作する方法
細胞のアウトプット集団（アウトプット組成物とも呼ばれる）、例えば、選択され、刺激され、形質導入されたＣＤ３＋Ｔ、ＣＤ４＋Ｔおよび／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を作製する方法であって、細胞の選択、刺激、形質導入および／または収集のための工程を含む方法が本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において提供される方法は細胞療法を製造、作製または生成することに関連して使用される。一部の実施形態では、アウトプット組成物、例えば、選択され、刺激され、形質導入されたＴ細胞を作製または生成する方法は、対象から細胞を単離するための、刺激条件下で細胞をインキュベートするための、および細胞を遺伝子操作するための工程のうち１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、方法は、インプット細胞、例えば、一次ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞が、生体試料から単離される、例えば、選択または分離される、刺激条件下でインキュベートされる、形質導入またはトランスフェクション等によって組換え受容体をコードする組換えポリヌクレオチドを細胞中に導入するように遺伝子操作され、単一工程で収集され、次いで、アウトプット集団として収集され、回収され、または容器、例えば、バッグもしくはバイアル中に充填される順序で実行される処理工程を含む。一部の実施形態では、アウトプット集団の細胞は、適宜、細胞を凍結保存および保存した後に同一対象中に再導入される。一部の実施形態では、操作された細胞のアウトプット集団は、療法、例えば、自家細胞療法において使用するのに適している。
一部の実施形態では、選択され、固定相上に固定化されている細胞は、例えば、固定化された細胞を刺激剤または試薬と、操作のための粒子、例えば、ウイルスベクターと同時に接触させることによって同時に刺激され、操作される、例えば、形質導入される。用語「同時の」または「同時に」とは、本明細書で使用される場合、約１５分以内、例えば、約１０分、約５分または約１分以内の時間分離があることを意味する。例えば、細胞の刺激および形質導入を同時に開始することに関連して、刺激および形質導入は、互いに１５分、１０分、５分または１分内に開始される。細胞を刺激試薬およびウイルスベクターと同時に接触させることに関連して、細胞は、刺激試薬およびウイルスベクターと１５分、１０分、５分または１分以内離れて接触される。一部の実施形態では、刺激試薬およびウイルスベクターは、同一組成物（例えば、刺激試薬およびウイルスベクターの両方を含有する混合物）中に含有される。一部の実施形態では、刺激試薬およびウイルスベクターは、約１５分、約１０分、約５分または約１分以内の時間分離を伴って細胞に添加される別個の組成物（例えば、一方の組成物中の刺激試薬および別の組成物中のウイルスベクター）中に含有される。
標的細胞（例えば、Ｔ細胞、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を含む試料から細胞を選択する、およびクロマトグラフィーカラムの固定相上に前記標的細胞を固定化する、および固定相上の固定化された細胞を刺激および形質導入する（本明細書においてオンカラム刺激および／またはオンカラム形質導入とも呼ばれる）、および脱離を容易にするための競合剤または遊離結合剤の使用を伴わずに固定相から自発的に脱離する、選択され、刺激され、形質導入された細胞を収集する、および／または溶出するための方法が本明細書において提供される。提供された方法の中には、標的細胞（例えば、Ｔ細胞、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を含む試料から細胞を選択することおよびクロマトグラフィーカラムの固定相上に前記標的細胞を固定化すること、固定相上の固定化された細胞を刺激することおよび形質導入すること、ならびに選択され、刺激され、および形質導入された細胞を重力流によって収集することおよび／または溶出することが関わる方法がある。提供された実施形態では、クロマトグラフィーカラムの固定相上の標的細胞（例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞）を刺激することによって、細胞選択に使用される分子（すなわち、選択マーカー）の下方制御が促進され、その結果、固定相から細胞が自発的に脱離する、または放出される。細胞の放出または脱離は、追加の工程または試薬を全く伴うことなく生じ得る。一部の態様では、細胞は、重力流によって、例えば、クロマトグラフィーカラムに培地または他の溶液を添加することによって収集され得る。特定の実施形態では、添加される培地または他の溶液は、固定相からの細胞の脱離を促進するために競合剤または遊離結合剤を含有しない。
特定の実施形態では、提供された方法は、Ｔ細胞を選択し、刺激し、形質導入するために実行される。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、節Ｉ－Ｂ－１に記載されるように、試料の細胞を、Ｔ細胞またはそのサブセットに対して特異的な選択剤で固定化された、またはそれによって結合された親和性クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）に添加することによって生体試料、例えば、アフェレーシス試料から選択される。提供された実施形態では、方法は、固定相上に固定化されている細胞を１種または複数のＴ細胞の刺激剤の存在下で刺激することを含む。一部の実施形態では、１種または複数の刺激剤には、Ｔ細胞において刺激シグナルを送達するための薬剤が含まれる。一部の実施形態では、刺激シグナルは、Ｔ細胞中のＴＣＲ／ＣＤ３複合体、Ｔ細胞中のＣＤ３含有複合体および／またはＴ細胞中のＩＴＡＭ含有分子を介する。一部の実施形態では、刺激剤（例えば、第１の刺激剤）は、ＣＤ３に結合する薬剤、例えば、抗ＣＤ３抗体である。一部の実施形態では、１つまたは複数の刺激剤は、Ｔ細胞においてシグナルをさらに刺激または増強できる第２の刺激剤をさらに含む。一部の実施形態では、第２の刺激剤は、１つまたは複数のＴ細胞上の共刺激分子、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ９０（Ｔｈｙ－１）、ＣＤ９５（Ａｐｏ－／Ｆａｓ）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＩＣＯＳ、ＬＡＴ、ＣＤ２７、ＯＸ４０またはＨＶＥＭに特異的に結合可能である。一部の実施形態では、第２の刺激剤は、ＣＤ２８に結合する薬剤、例えば、抗ＣＤ２８抗体である。一部の実施形態では、１種または複数の刺激剤には、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体、例えば、抗ＣＤ３Ｆａｂおよび抗ＣＤ２８ Ｆａｂが含まれる。一部の実施形態では、１つまたは複数の刺激剤は、クロマトグラフィーカラムに添加される試薬（例えば、刺激試薬である）に固定化されるまたは結合される。特定の実施形態では、刺激試薬は、可溶性ポリマーまたはオリゴマー試薬である。例えば、１種または複数の刺激剤は、固体表面（例えば、ビーズ）ではなくオリゴマーまたはポリマータンパク質に官能基付与される。提供された方法において使用するための例示的なオリゴマー刺激試薬は、本明細書、例えば、節Ｉ－Ｂ－２に記載されている。一部の実施形態では、オリゴマー刺激試薬は、官能基付与されるか、または１種もしくは複数の刺激剤（例えば、抗ＣＤ３Ｆａｂおよび抗ＣＤ２８ Ｆａｂ）と多量体化されるオリゴマーストレプトアビジンムテインである。
一部の実施形態では、方法は、組換え核酸分子を固定化されたＴ細胞中に導入することをさらに含み、核酸分子は、組換えタンパク質をコードし、それによって、形質導入されたＴ細胞を含む組成物を生成する。一部の実施形態では、組換えタンパク質は抗原受容体である。一部の実施形態では、組換えタンパク質はキメラ抗原受容体である。一部の実施形態では、固定化されたＴ細胞は、固定化された細胞の刺激の際に組換え核酸分子と接触される。一部の実施形態では、固定化されたＴ細胞の形質導入および刺激は、同時に開始される。一部の実施形態では、固定化された細胞は、組換え核酸分子および１種または複数の刺激剤、例えば、刺激試薬中に含まれる刺激剤と同時に接触される。
一部の実施形態では、方法は、形質導入された細胞（例えば、形質導入されたＴ細胞）を含有する組成物をカラム内でさらにインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、インキュベーションは、３７℃±２℃または約３７℃±２℃で実行される。一部の実施形態では、インキュベーションは、細胞を拡大しないか、または実質的に拡大しない条件下で実施される。一部の実施形態では、インキュベーションは、Ｔ細胞にシグナルを送達することができるさらなる薬剤の存在下で実行される。一部の実施形態では、さらなる薬剤は、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増強または誘導することが可能である。一部の実施形態では、さらなる薬剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７の中から選択されるサイトカインである。一部の実施形態では、インキュベーションは、２４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間または５時間以内である時間の間実行される。一部の実施形態では、インキュベーションは、無血清培地中で実行される。
提供された方法では、選択され、刺激され、および形質導入されたＴ細胞は、重力流によって選択され、刺激され、および形質導入された細胞を溶出または洗浄することによって収集される。
一部の実施形態では、前記の収集することは、固定相を培地（例えば、無血清培地）、競合剤または遊離結合剤を含有しない培地で洗浄して、固定相から標的細胞（例えば、Ｔ細胞）を溶出することを含む。一部の実施形態では、重力流によって収集することは、固定相に培地、競合剤または遊離結合剤を含まない培地を添加して、固定相からＴ細胞を溶出することを含む。一部の実施形態では、刺激され、形質導入されたＴ細胞を含有する前記組成物は、競合剤または遊離結合剤を含有しない。一部の実施形態では、前記競合剤または遊離結合剤は、ビオチンまたはビオチンアナログ、例えば、Ｄ－ビオチンであるビオチンアナログであるか、またはそれを含有する。一部の実施形態では、競合剤または遊離結合剤は、Ｄ－ビオチンである。一部の実施形態では、重力流によってカラムを洗浄して、細胞を溶出するための培地は、組換えサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－７）を含有する無血清培地である。
一部の実施形態では、方法は、収集された形質導入された細胞（例えば、収集された形質導入されたＴ細胞）を含有する組成物をさらにインキュベートすること（例えば、培養すること）を含む。一部の実施形態では、さらなるインキュベーション（例えば、培養すること）は、３７℃±２℃または約３７℃±２℃で実行される。一部の実施形態では、さらなるインキュベーション（例えば、培養すること）は、細胞を拡大しないか、または実質的に拡大しない条件下で実行される。一部の実施形態では、さらなるインキュベーションは、細胞の拡大増殖（例えば、増殖）の条件下で実行される。一部の実施形態では、さらなるインキュベーション（例えば、培養すること）は、Ｔ細胞にシグナルを送達することができるさらなる薬剤の存在下で実行される。一部の実施形態では、さらなる薬剤は、固定相を洗浄するために使用される培地中で含有される。一部の実施形態では、さらなる薬剤は、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増強または誘導することができる。一部の実施形態では、さらなる薬剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７の中から選択されるサイトカインである。一部の実施形態では、さらなるインキュベーションは、１４日以内、１２日以内、１０日以内、８日以内、６日以内または５日以内である時間の間実行される。
特定の実施形態では、細胞の最初のまたはインプット集団から組換え受容体を発現する細胞のアウトプット集団を作製することに関連する方法が本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、インプット集団は、濃縮Ｔ細胞、濃縮ＣＤ４＋Ｔ細胞および／または濃縮ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する細胞の集団（本明細書で以下、それぞれ、濃縮Ｔ細胞の集団、濃縮ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団および濃縮ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団とも呼ばれる）からのものを含む細胞を組み合わせる、混合する、および／またはプールすることによって生成、作製、および／または製造される。一部の実施形態では、細胞のインプット集団は、組み合わされ、混合され、および／またはプールされたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の集団である。ある特定の実施形態では、方法は、生体試料（例えば、全血、アフェレーシス）から、例えば、対象から採取された、収集された、および／または得られた生体試料から選択された（ｓｅｌｅｃｔ）細胞を単離して、濃縮Ｔ細胞のインプット集団を生成するために使用され得る。一部の実施形態では、提供された方法は、細胞が刺激され、操作され、形質導入され、および／または培養された後に、濃縮Ｔ細胞の集団を回収すること、収集すること、および／または製剤化することに関連して使用され得る。
特定の実施形態では、細胞は、細胞を遺伝子操作する際またはその後に、例えば、組換えタンパク質をコードする異種もしくは組換えポリヌクレオチドの組込みを可能にする、または組換えタンパク質の発現を可能にするのに十分な時間量の間インキュベートされる。ある特定の実施形態では、細胞は、一定または固定時間量、例えば、１８時間より多いまたは４日より少ない時間量の間インキュベートされる。一部の実施形態では、操作工程は、細胞が刺激剤に曝露された時点から同時に出発または開始される。
一部の実施形態では、１つまたは複数のプロセス工程は、少なくとも幾分かは無血清培地において実行される。一部の実施形態では、無血清培地は、定義された、または十分に定義された細胞培養培地である。ある特定の実施形態では、無血清培地は、処理されている、例えば、阻害剤および／または増殖因子を除去するために濾過されている制御された培養培地である。一部の実施形態では、無血清培地は、タンパク質を含有する。ある特定の実施形態では、無血清培地は、血清アルブミン、加水分解物、増殖因子、ホルモン、担体タンパク質および／または接着因子を含有し得る。一部の実施形態では、無血清培地は、サイトカインを含む。一部の実施形態では、無血清培地は、サイトカインまたは組換えサイトカインを含む。一部の実施形態では、無血清培地は、組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－７を含む。一部の実施形態では、無血清培地は、グルタミンを含む。一部の実施形態では、無血清培地は、グルタミンならびに組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７を含む。
一部の実施形態では、臨床使用のための、例えば、養子細胞療法における細胞の調製における１つ、より多くの、全ての工程が、細胞を非無菌条件に曝露することなく実行されるように実行される方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、細胞は、全て閉鎖された無菌システムまたはデバイス内で選択され、刺激され、形質導入され、洗浄され、製剤化される。一部の実施形態では、工程のうち１つまたは複数は、閉鎖されたシステムまたはデバイスの外側で実行される。一部のこのような実施形態では、細胞は、別個の閉鎖されたシステムへの無菌移行などによって無菌条件下で、閉鎖されたシステムまたはデバイスから移行される。
一部の実施形態では、本明細書において提供される方法は、節ＩＩＩに記載されるデバイスのいずれかを使用して実施される。
特定の実施形態では、試料および／または試料の単離部分（例えば、バフィーコート、濃縮Ｔ細胞の集団）は、本明細書において提供されるような方法の任意の段階または工程の前、その間またはその後に、収集され、凍結保護のために製剤化され、凍結され（例えば、凍結保護され）、および／または０℃未満、－２０℃未満、もしくは－７０Ｃもしくは－８０℃で、もしくはそれ未満で保存され得る。一部の実施形態では、細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０日未満の時間量、または１、２、３、４、５、６、７、８週間未満の時間量の間、または少なくとも１、２、３、４、５、６、７もしくは８週間の時間量の間、または８週間より長い間保存され得る。保存後、試料または試料の単離部分は、解凍される場合があり、本方法に従う処理は、プロセス中の同一点から再開され得る。特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞の培養されたおよび／または製剤化された集団は、例えば、自家細胞療法として対象に投与される前に、凍結保護され、保存される。
特定の実施形態では、プロセス中の任意の段階または工程で、細胞の一部分がサンプリングされるか、または収集される場合がある、例えば、集団が閉鎖されたシステム中に残存しながら、細胞が、細胞の集団（例えば、Ｔ細胞の集団）から採取され得る。ある特定の実施形態では、このような細胞は、生存力、アポトーシス、活性化、刺激、成長、および／または消耗を含むがこれらに限定されないマーカー（ｍａｋｅｒｓ）、特徴または特性について分析され得る。一部の実施形態では、細胞は、自動化プロセスによってサンプリングまたは収集される。一部の実施形態では、サンプリングまたは収集された細胞の分析は、自動化されている。特定の実施形態では、分析は、無菌条件下閉鎖されたシステムにおいて実施される。
一部の実施形態では、提供された方法によって生成および／または処理される細胞または細胞の集団は、例示的および／または代替プロセスによって処理または生成された細胞または細胞の集団と比較され得る。ある特定の実施形態では、代替および／または例示的プロセスは、１つまたは複数の特定の態様において異なる場合があるが、そうでないものは、例示的なまたは代替プロセスと比較されるべき提供された方法の実施形態または態様の同様または同一の特徴、態様、工程、段階、試薬または条件を含有する。例えば、提供された方法によって生成された選択され、刺激され、および形質導入された細胞、例えば、細胞のアウトプット組成物は、別個の選択、刺激および形質導入工程を含んでいた、または固定相から選択された細胞を脱離するために競合剤もしくは遊離結合剤の使用を必要としたプロセスで生成された細胞と比較され得る。一部の実施形態では、特に断りのない限り、提供される方法および例示的なまたは代替プロセスは、選択、濃縮、刺激、操作、トランスフェクト、形質導入、培養および／または製剤化のための同様または同一の工程を有する等、その他の点では同様および／または同一であったであろう。一部の実施形態では、特に断りのない限り、提供される方法および代替プロセスは、同一または同様の種類の生体試料から細胞選択および／もしくは濃縮する、ならびに／または同一細胞種の細胞および／もしくはインプット細胞を処理する。
一部の実施形態では、選択され、刺激され、および形質導入された細胞は、刺激され、形質導入されたＴ細胞を含有する組成物であり、Ｔ細胞は、複数のＴ細胞を含有する生体試料（例えば、アフェレーシスまたは全血試料）から選択されている。一部の実施形態では、固定相から自発的に脱離する選択され、刺激され、形質導入された細胞の収集することおよび／または溶出することは、例えば、洗浄工程の際に重力流によって達成される。本明細書において提供される方法は、細胞選択、刺激、形質導入、収集および／または溶出工程を組み合わせ、選択され、刺激され、形質導入された細胞の固定相からの脱離を促進するための別個の工程ならびに脱離を促進するために使用された薬剤（例えば、競合剤および／または遊離結合剤）を除去するための精製工程を必要としない。そのようなものとして、方法は、下流の処理（例えば、培養、拡大増殖、その後のインキュベーション、刺激および／または選択（例えば、最初の選択および／またはポリッシング））に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞組成物を生成するために必要とされる処理工程数を低減し、それによって、製造時間を低減し、潜在的細胞ストレスを最小にし、汚染の可能性を減少させる。
特定の実施形態では、方法は、一定時間量以内に、例えば、２４時間以内に、下流の処理に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞のアウトプット組成物を生成する。特定の実施形態では、方法は、一定時間量以内に、例えば、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３もしくは２時間以内または約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３もしくは約２時間以内に、下流の処理に適した、選択され、刺激され、形質導入された細胞のアウトプット組成物を生成する。特定の実施形態では、方法は、６、５、４、３もしくは２時間以内または約６、約５、約４、約３もしくは約２時間以内に、下流の処理に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞のアウトプット組成物を生成する。一部の実施形態では、方法は、一定時間量以内に、例えば、６時間未満以内または約６時間未満以内に、下流の処理に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞のアウトプット組成物を生成する。一部の実施形態では、方法は、一定時間量以内に、例えば、５．５時間未満以内または約５．５時間未満以内に、下流の処理に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞のアウトプット組成物を生成する。一部の実施形態では、方法は、一定時間量以内に、例えば、５時間未満以内または約５時間未満以内に、下流の処理に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞のアウトプット組成物を生成する。一部の実施形態では、方法は、一定時間量以内に、例えば、４．５時間未満以内または約４．５時間未満以内に、下流の処理に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞のアウトプット組成物を生成する。一部の実施形態では、方法は、一定時間量以内に、例えば、４時間未満以内または約４時間未満以内に、下流の処理に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞のアウトプット組成物を生成する。一部の実施形態では、方法は、一定時間量以内に、例えば、３時間未満以内または約３時間未満以内に、下流の処理に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞のアウトプット組成物を生成する。一部の実施形態では、方法は、一定時間量以内に、例えば、３～６時間未満以内または約３～６時間未満以内に、下流の処理に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞のアウトプット組成物を生成する。一部の実施形態では、方法は、一定時間量以内に、例えば、４～６時間未満以内または約４～６時間未満以内に、下流の処理に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞のアウトプット組成物を生成する。一部の実施形態では、方法は、一定時間量以内に、例えば、５～６時間未満以内または約５～６時間未満以内に、下流の処理に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞のアウトプット組成物を生成する。一部の実施形態では、方法は、一定時間量以内に、例えば、４～５時間未満以内または約４～５時間未満以内に、下流の処理に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞のアウトプット組成物を生成する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法は、５日以内に、操作されたＴ細胞の組成物（例えば、治療用細胞組成物）を生成する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法は、４～５日で、または約４～５日で、操作されたＴ細胞の組成物（例えば、治療用細胞組成物）を生成する。一部の実施形態では、本明細書において提供される工程は、４もしくは５日の長さである、または約４もしくは約５日の長さである製造プロセスをもたらす。一部の実施形態では、本明細書において提供される工程は、４もしくは５日の長さである、または約４もしくは約５日の長さである製造プロセスをもたらす。一部の実施形態では、本明細書において提供される工程は、４日の長さもしくは９６±６時間の長さである、または約４日の長さもしくは９６±６時間の長さである製造プロセスをもたらす。
提供される方法は、他の構成要素から、例えば、試料中の他の細胞から、細胞、例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を選択し、細胞をクロマトグラフィーカラムの固定相上に固定化すること、固定相上に固定化されている選択された細胞を刺激および形質導入すること、ならびに選択され、刺激された細胞を、固定相から細胞を脱離するための、および選択され、刺激され、形質導入された細胞のアウトプット組成物からの前記脱離を促進するために使用された薬剤（例えば、競合剤または遊離結合剤）を除去するための処理工程の不在下で収集することのための方法を含む。特定の実施形態では、提供される方法は、他の構成要素から、例えば、試料中の他の細胞から、細胞、例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を選択し、細胞をクロマトグラフィーカラムの固定相上に固定化すること、固定相上に固定化されている選択された細胞を刺激および形質導入すること、ならびに選択され、刺激され、および形質導入された細胞を重力流によって溶出および／または収集することのための方法を含む。
特定の態様では、提供される方法は、細胞を刺激および形質導入することに先立って、細胞選択（例えば、免疫親和性ベースの選択）後に１つまたは複数の追加の工程を含む、例えば、細胞療法のための操作された細胞（例えば、Ｔ細胞）を生成するための多数の既存の方法に対して改善され、比較される。一部の実施形態では、既存の方法において存在する１つまたは複数の追加の工程は、溶出工程または選択された細胞を回収もしくは収集するために競合試薬もしくは遊離結合剤を用いる工程および／または選択において使用された試薬（例えば、磁気ビーズ試薬または抗体）を除去するための工程を含み得る。一部の実施形態では、このような追加の工程は、細胞療法のために細胞を操作するためのプロセスを延長し得る、および／またはその分化状態、生存力もしくは細胞数に影響を及ぼし得るプロセスの際に細胞のマニピュレーションをもたらし得る。特定の態様では、提供される方法は、別個の選択、刺激および形質導入工程を含み、固定相から細胞を脱離するため、および脱離を促進するために使用された薬剤を除去するために追加の工程を必要とする方法と比較してより短い時間量で、選択され、刺激され、および形質導入された細胞の集団を生成する。
ある特定の態様では、方法は、本明細書で、オンカラム刺激およびオンカラム形質導入とも呼ばれる、カラムでの刺激および形質導入の開始の２４時間以内に、下流の処理（例えば、培養、拡大増殖および／またはインキュベーション、刺激および／または選択（例えば、ポリッシング））のその後のラウンドに適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞アウトプット集団（アウトプット組成物とも呼ばれる）を生成する。一部の実施形態では、方法は、カラムでの刺激および形質導入の開始の１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３もしくは２時間以内または約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３もしくは約２時間以内に、下流の処理（例えば、培養、拡大増殖および／またはインキュベーション、刺激および／または選択（例えば、ポリッシング）のその後のラウンド）に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞アウトプット集団（例えば、アウトプット組成物）を生成する。一部の実施形態では、方法は、６、５、４、３もしくは２時間以内または約６、約５、約４、約３もしくは約２時間以内に、下流の処理（例えば、培養、拡大増殖および／またはインキュベーション、刺激および／または選択（例えば、ポリッシング）のその後のラウンド）に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞アウトプット集団を生成する。一部の実施形態では、方法は、３～６時間以内または約３～６時間以内に、下流の処理（例えば、培養、拡大増殖および／またはインキュベーションのその後のラウンド、刺激および／または選択（例えば、ポリッシング））に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞アウトプット集団を生成する。一部の実施形態では、方法は、４～６時間以内または約４～６時間以内に、下流の処理（例えば、培養、拡大増殖および／またはインキュベーションのその後のラウンド、刺激および／または選択（例えば、ポリッシング））に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞アウトプット集団を生成する。一部の実施形態では、方法は、５～６時間以内または約５～６時間以内に、下流の処理（例えば、培養、拡大増殖および／またはインキュベーションのその後のラウンド、刺激および／または選択（例えば、ポリッシング））に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞アウトプット集団を生成する。一部の実施形態では、４～５時間以内または約４～５時間以内に、下流の処理（例えば、培養、拡大増殖および／またはインキュベーションのその後のラウンド、刺激および／または選択（例えば、ポリッシング））に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞アウトプット集団を生成する。一部の実施形態では、６時間以内または約６時間以内に、下流の処理（例えば、培養、拡大増殖および／またはインキュベーションのその後のラウンド、刺激および／または選択（例えば、ポリッシング））に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞アウトプット集団を生成する。一部の実施形態では、５．５時間以内または約５．５時間以内に、下流の処理（例えば、培養、拡大増殖および／またはインキュベーションのその後のラウンド、刺激および／または選択（例えば、ポリッシング））に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞アウトプット集団を生成する。一部の実施形態では、５時間以内または約５時間以内に、下流の処理（例えば、培養、拡大増殖および／またはインキュベーションのその後のラウンド、刺激および／または選択（例えば、ポリッシング））に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞アウトプット集団を生成する。一部の実施形態では、４．５時間以内または約４．５時間以内に、下流の処理（例えば、培養、拡大増殖および／またはインキュベーションのその後のラウンド、刺激および／または選択（例えば、ポリッシング））に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞アウトプット集団を生成する。一部の実施形態では、４時間以内または約４時間以内に、下流の処理（例えば、培養、拡大増殖および／またはインキュベーションのその後のラウンド、刺激および／または選択（例えば、ポリッシング））に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞アウトプット集団を生成する。一部の実施形態では、３時間以内または約３時間以内に、下流の処理（例えば、培養、拡大増殖および／またはインキュベーションのその後のラウンド、刺激および／または選択（例えば、ポリッシング））に適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞アウトプット集団を生成する。
一部の実施形態では、方法は、細胞の表面上の分子に結合し、それによって、刺激シグナルを細胞に送達できる刺激剤の使用を含む。一部の実施形態では、刺激剤は、固定相に添加され得るオリゴマー刺激試薬（例えば、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ Ｆａｂにコンジュゲートされたストレプトアビジンムテインオリゴマー）中に含まれる。一部の実施形態では、刺激は、固定相からの選択された細胞の自発的脱離をもたらし、ひいては、固定相から細胞を脱離するための、およびアウトプット刺激細胞組成物からの前記脱離を促進するために使用された薬剤を除去するための追加の処理工程の不在下で、選択され、刺激され、および形質導入された細胞の収集および／または溶出を可能にする。一部の実施形態では、刺激は、固定相からの選択された細胞の自発的脱離または放出をもたらし、ひいては、重力流による選択され、刺激され、および形質導入された細胞の収集および／または溶出を可能にする。一部の実施形態では、カラム（例えば、固定相）から自発的に脱離した細胞を収集または溶出するために重力流に依存する。一部の実施形態では、例えば、自発的に脱離した細胞をカラム（例えば、固定相）から溶出するために、重力流と組み合わせた洗浄工程を使用できる。一部の実施形態では、洗浄工程は、固定相上に細胞を添加または固定化する前に、細胞培地（例えば、無血清培地）、例えば、細胞インプット組成物中に存在する同一培地をカラムに添加することを簡単に含み得る。特定の態様では、方法は、オンカラム刺激および形質導入の開始の２４時間以内に、さらなる処理、例えば、培養、拡大増殖、インキュベーションまたは刺激および／または選択（例えば、ポリッシング）のその後のランドに適した、選択され、刺激され、および形質導入された細胞の汚染されていない（例えば、脱離のためにしようされた薬剤（例えば、競合剤、遊離結合剤）および／または選択剤を含まない）組成物を成功裏に生成する。
ある特定の態様では、方法は、標的細胞（例えば、Ｔ細胞）へ刺激シグナルを送達可能である刺激剤を含むオリゴマー刺激試薬の使用を含む。例示的オリゴマー試薬は、標的細胞、例えば、Ｔ細胞に刺激シグナルを送達可能である１つまたは複数の抗体またはその断片に可逆的に結合またはコンジュゲートされたストレプトアビジンムテインオリゴマーを含む。一部の実施形態では、オリゴマー刺激試薬は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ Ｆａｂにコンジュゲートされたストレプトアビジンムテインオリゴマーである。外因性増殖因子の不在下または少量の外因性増殖因子など、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でのＴ細胞の刺激において使用するための既存の試薬が公知である（例えば、米国特許６，３５２，６９４Ｂ１および欧州特許ＥＰ０７００４３０Ｂ１を参照されたい）。一般に、このような試薬は、種々の結合剤（例えば、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体）が固定化される直径が１μｍより大きいビーズ、例えば、磁気ビーズを使用できる。しかし、一部の場合には、このような磁気ビーズは、例えば、臨床試験または治療目的のために必要とされる条件下で細胞を刺激する方法に組み込むことは、対象に操作されたＴ細胞を投与する前にこれらの磁気ビーズが実質的にまたは完全に除去されることを確実にしなくてはならないので困難である。一部の態様では、細胞を磁場に曝露すること等によるこのような除去は、細胞療法のために利用可能な生存細胞の収率を低下させ得る。ある特定の場合には、磁気ビーズを含有するこのような試薬、例えば、刺激試薬は、刺激試薬からのＴ細胞の脱離の十分な量を可能にする最小時間量の間、細胞と共にインキュベートされなければならない。さらに、ビーズなどの試薬は、物理的制約条件のためにカラムクロマトグラフィーと容易に適合可能ではない。
オリゴマー刺激試薬（例えば、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体、例えば、Ｆａｂにコンジュゲートされたストレプトアビジンムテインオリゴマー）を利用する提供される方法は、このような潜在的制限を克服する。例えば、一部の実施形態では、提供される方法は、刺激を開始するための、固定相への固相支持体（例えば、ビーズ）に結合されていない可溶性オリゴマー試薬の添加を含む。一部の実施形態では、提供される方法は、細胞療法のために細胞を操作するプロセス全体の最後に存在し得る残存するオリゴマー刺激試薬の量を低減または最小化する工程を含み得る。一部の実施形態では、方法によって作製または生成されたアウトプット細胞、例えば、操作された細胞における残存試薬のリスクは、競合試薬または遊離結合剤の添加を使用して、細胞を含有する組成物中の刺激剤からオリゴマー刺激試薬を解離する（例えば、結合を破壊する）ことができるので、オリゴマー試薬の使用によって低減されるまたは回避される。一部の実施形態では、オリゴマー刺激試薬は可溶性であるので、例えば、競合試薬または遊離結合剤を添加する必要なく、１つまたは複数の洗浄工程によって組成物中の細胞からオリゴマー刺激試薬を低減または除去することが十分である場合もある。一部の実施形態では、これはまた、ＧＭＰ基準に準拠するプロセスを、投与のための最終集団がビーズを含まないことを確実にするために追加の手段をとらなければならないものなどの他の方法と比較してより容易に確立することができることを意味する。したがって、一部の態様では、競合剤または遊離結合剤の添加等による、または１つもしくは複数の洗浄工程による細胞からのオリゴマー刺激試薬の除去または分離は、ビーズベースの刺激試薬の除去または分離と比較して、細胞喪失をほとんどまたは全くもたらさない。一部の態様では、刺激試薬またはオリゴマー刺激試薬低減、除去または分離のタイミングは、制限されないか、またはビーズベースの刺激試薬の除去または分離よりも制限されない。したがって、一部の態様では、刺激試薬またはオリゴマー刺激試薬は、提供される方法の際の任意の時間または工程で細胞から低減、除去または分離され得る。
また、方法を実行するための医薬品集団および製剤およびキット、システムおよびデバイスを含む、方法によって調製された細胞および集団が提供される。治療方法、例えば、養子細胞療法のための方法および対象への投与のための医薬品集団を含む、方法によって調製された細胞および集団の使用のための方法がさらに提供される。
Ａ．試料および細胞調製
特定の実施形態では、生体試料から細胞を選択および／または濃縮することを含む方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、提供される方法は、生体試料、例えば、対象、例えば、細胞療法を必要とするまたは細胞療法が投与される特定の疾患または状態を有するものから得られるものまたはそれに由来するものから細胞またはその集団を選択することを含む。一部の態様では、対象は、ヒト、例えば、細胞が単離、処理および／または操作されている、特定の治療的介入、例えば、養子細胞療法を必要とする患者である対象である。したがって、細胞は、一部の実施形態では、一次細胞、例えば、一次ヒト細胞である。試料は、対象から直接的に採取された組織、流体および他の試料を含む。生物学的試料は、生物学的供給源または処理される試料から直接的に取得された試料であり得る。生物学的試料として、それだけには限らないが、体液、例えば、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿および汗、組織および臓器試料が挙げられ、それらに由来する処理された試料を含む。
一部の態様では、試料は、血液または血液由来試料であるか、またはアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシス生成物であるか、もしくはそれに由来する。例示的試料として、全血、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、腸関連リンパ系組織、粘膜関連リンパ系組織、脾臓、他のリンパ系組織、肝臓、肺、胃、腸、結腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、子宮頸部、精巣、卵巣、扁桃腺または他の臓器および／またはそれらに由来する細胞が挙げられる。試料には、細胞療法、例えば、養子細胞療法の文脈において、自家および同種異系供給源からの試料が含まれる。
一部の例では、例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって対象の循環血液から細胞が得られる。試料は、一部の態様では、Ｔ細胞を含むリンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球および／または血小板を含有し、一部の態様では、赤血球および血小板以外の細胞を含有する。
一部の実施形態では、試料は、Ｔ細胞を含む試料である。一部の実施形態では、試料は、全血試料、バフィーコート試料、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料、非分画性Ｔ細胞試料、リンパ球試料、白血球試料、アフェレーシス生成物、または白血球アフェレーシス生成物である。一部の実施形態では、試料は、アフェレーシス試料である。一部の実施形態では、試料は、白血球アフェレーシス試料である。
一部の実施形態では、対象から収集された血液細胞を洗浄して、例えば、血漿画分を除去し、細胞をその後の処理工程のために適当な緩衝液または培地に入れる。一部の実施形態では、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。一部の実施形態では、洗浄溶液は、カルシウムおよび／またはマグネシウムおよび／または二価カチオンの多くもしくは全てを欠く。一部の態様では、洗浄工程は、半自動化「フロースルー」遠心機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１セルプロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ）によって製造元の説明書に従って達成される。一部の態様では、洗浄工程は、製造元の説明書に従って、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって達成される。一部の実施形態では、細胞は、洗浄後、様々な生体適合性の緩衝液、例えば、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋非含有のＰＢＳなどに再懸濁される。ある特定の実施形態では、血液細胞試料の成分は除去され、細胞は培養培地に直接再懸濁される。
一部の実施形態では、細胞を含む試料（例えば、アフェレーシス生成物または白血球アフェレーシス生成物）は、アフェレーシスまたは白血球分離の際に添加された１種または複数種の抗凝血剤、例えば、ヘパリンなど、を除去するために、洗浄される。
一部の実施形態では、細胞を含む試料（例えば、全血試料、バフィーコート試料、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料、非分画性Ｔ細胞試料、リンパ球試料、白血球試料、アフェレーシス生成物、または白血球アフェレーシス生成物）は、低温保存および／または凍結防止され（例えば、冷凍され）、次いで、分離、選択、活性化、刺激、操作、形質導入、トランスフェクト、インキュベート、培養、収穫、細胞の集団の製剤化、および／または対象への製剤化された細胞集団投与、のための任意の工程の前に解凍される。
特定の実施形態において、アフェレーシス生成物または白血球アフェレーシス生成物は、低温保存および／または凍結防止され（例えば、冷凍され）、次いで、下記において説明されるような細胞選択または単離工程（例えば、Ｔ細胞選択または単離工程）に供される前に解凍される。一部の実施形態では、解凍された細胞組成物は、希釈（例えば、無血清培地による）および／または洗浄（例えば、無血清培地による）に供され、それによって、一部の場合には、求めていないまたは望ましくない成分を除去または減少させることができる。一部の場合には、希釈および／または洗浄は、除去されない場合には、拡張された室温曝露の際の細胞生存性、収量、回収に悪影響を及ぼし得るような、解凍された試料に含まれる凍結防止剤、例えば、ＤＭＳＯの存在を除去または減少させる。一部の実施形態では、希釈および／または洗浄は、解凍された低温保存生成物の培地の、無血清培地、例えば、本明細書または国際出願第ＰＣＴで／ＵＳ２０１８／０６４６２７号に記載されるものなど、への交換を可能にし、なお、文献は、参照により本明細書に組み入れられる。
一部の実施形態では、無血清培地は、１種または複数種の補足物質を補った基礎培地（例えば、ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含む。一部の実施形態では、１種または複数種の補足物質は、無血清である。一部の実施形態では、無血清培地は、例えば、追加の補足物質（例えば、ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ））によって提供されるような、細胞（例えば、Ｔ細胞）の維持、増殖、および／または活性化のための１種または複数種の追加の成分を補った基礎培地を含む。一部の実施形態では、無血清培地は、血清代替補足物質、例えば、免疫細胞血清代替物、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃Ａ２５９６１０１、ｔｈｅ ＣＴＳ（商標） Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、または、described in Smith et al. Clin Transl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31に記載される免疫細胞血清代替物をさらに含む。一部の実施形態では、無血清培地は、アミノ酸の遊離形態、例えば、Ｌ－グルタミンなど、の遊離形態をさらに含む。一部の実施形態では、無血清培地は、Ｌ－グルタミンのジペプチド形態（例えば、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン）、例えば、Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）におけるジペプチドなど、をさらに含む。一部の実施形態では、無血清培地は、１種または複数種の組換えサイトカイン、例えば、組換えヒトＩＬ－２、組換えヒトＩＬ－７、および／または組換えヒトＩＬ－１５など、をさらに含む。
一部の実施形態では、低温保存および／または凍結防止されたアフェレーシス生成物または白血球アフェレーシス生成物が、Ｔ細胞選択または単離工程に供された後、追加の凍結保存および／または凍結防止工程は、後続の工程、例えば、活性化、刺激、操作、形質導入、トランスフェクト、インキュベート、培養、収穫、細胞の集団の製剤化、および／または対象への製剤化された細胞集団の投与など、のいずれかの際またはその間に実施されない。例えば、解凍された低温保存および／または凍結防止されたアフェレーシス生成物または白血球アフェレーシス生成物から選択されたＴ細胞は、下流のプロセス、例えば、形質導入など、のために解凍される前に再び、低温保存および／または凍結防止されることはない。
特定の実施形態において、低温保存および／または凍結防止されたアフェレーシス生成物または白血球アフェレーシス生成物は、バンクされ（例えば、試料を凍結する前に細胞選択なしに）、これは、一部の態様では、その後の製造工程のためのさらなる柔軟性を可能にする。一態様において、選択の前に細胞をバンクすることは、下流プロセスのための細胞収量を増加させ、ならびに、より早期に細胞をバンクすることは、それらの細胞がより健康であることを意味し得、ならびに、製造成功評価基準を満たすのがより容易であり得る。別の態様において、解凍された後、低温保存および／または凍結防止されたアフェレーシス生成物または白血球アフェレーシス生成物は、１つまたは複数の異なる選択方法に供され得る。このアプローチの利点は、とりわけ、例えば、試料のドナーおよび／または別のレシピエントなどにおける、対象の疾患または状態の治療のための細胞療法の細胞の有用性、効率、および／または他の側面を高めることである。
一部の実施形態では、試料（例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス試料）は、ドナーが疾患または状態と診断された後のある時点において、収集され、ならびに、前細胞選択の前またはそれなしに（例えば、前Ｔ細胞選択、例えば、クロマトグラフィーによる選択など、なしに）、低温保存および／または凍結防止される。一部の態様では、凍結保存のタイミングも、ドナーが以下：疾患または状態に対する任意の初期治療、任意の標的治療または疾患もしくは状態のための治療のために標識された任意の治療、あるいは放射線療法および／または化学療法以外の任意の治療、の１つまたは複数を受ける前である。一部の実施形態では、試料は、疾患の初期治療後の疾患の最初の再発の後、ならびにドナーまたは対象が疾患に対する後続の治療を受ける前、に収集される。初期および／または後続の治療は、細胞療法以外の療法であり得る。一部の実施形態では、収集された細胞は、初期治療および／または後続の治療の後の細胞療法において使用され得る。一態様において、前細胞選択なしで低温保存および／または凍結防止された試料は、初期コスト、例えば、後に治療をクロスオーバーし必要とし得る、ランダマイズされた臨床試験における非治療患者に関連するものなど、を減少させるのに役立ち得る。
一部の実施形態では、試料（例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス試料）は、疾患に対する治療の第二選択療法後における疾患の第２の再発の後、ならびにドナーまたは対象が疾患の後続の治療を受ける前のタイミングに、収集され、ならびに、前細胞治療の前またはそれなしに（例えば、前Ｔ細胞選択、例えば、クロマトグラフィーによる選択など、なしに）、低温保存および／または凍結防止される。一部の実施形態では、患者は、例えば、特定のリスク因子を評価することによって、治療の第二選択療法後に再発する可能性が高いとして識別される。一部の実施形態では、リスク因子は、疾患のタイプおよび／または遺伝子学、例えば、二重適合リンパ腫、原発性難治性がん、または活性Ｂ細胞リンパ腫など、に基づいている。一部の実施形態では、リスク因子は、臨床所見、例えば、第一選択治療の後の早期再発、または治療の後の他の不十分な予後指標（例えば、ＩＰＩ（国際予後指標）＞２）など、に基づいている。
一部の実施形態では、試料（例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス試料）は、ドナーまたは対象が疾患であるとして診断される前のタイミングで、収集され、ならびに、前細胞治療の前またはそれなしに（例えば、前Ｔ細胞選択、例えば、クロマトグラフィーによる選択など、なしに）、低温保存および／または凍結防止される。一部の態様では、ドナーまたは対象は、疾患を発症するリスクがあると判定され得る。一部の態様では、ドナーまたは対象は、健康な対象であり得る。ある特定の場合において、人生の後の段階において細胞療法が必要であるような場合には、ドナーまたは対象は、疾患を発症するリスクにあると見なされることなく、または疾患であると診断されることなく、細胞をバンクまたは貯蔵することを選び得る。一部の実施形態では、ドナーまたは対象は、例えば、遺伝子変異、遺伝的異常、遺伝子破壊、家族歴、タンパク異常（例えば、タンパク質産生および／またはタンパク質プロセシングにおける不全）ならびに、疾患を発症するリスクを増加させ得る生活様式の選択などの因子に基づいて、疾患を発症するリスクがあると見なされ得る。一部の実施形態では、細胞は、予防薬として収集される。
一部の実施形態では、低温保存および／または凍結防止された細胞の試料（例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス試料）、例えば、前細胞選択に供されていない（例えば、前Ｔ細胞選択、例えば、クロマトグラフィーによる選択を行っていない）細胞の試料など、は、１２時間、２４時間、３６時間、または４８時間以上の期間にわたって、貯蔵されるかまたはバンクされる。一部の実施形態では、試料は、１週間、２週間、３週間、または４週間以上の期間にわたって、貯蔵されるかまたはバンクされる。一部の実施形態では、試料は、長期貯蔵または長期バンキングされる。一部の態様では、試料は、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１１年、１２年、１３年、１４年、１５年、１６年、１７年、１８年、１９年、２０年、２５年、３０年、３５年、４０年以上、またはそれ以上の期間にわたって、貯蔵される。
一部の実施形態では、ドナーから採取したアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス試料は、低温環境において、貯蔵または処理施設に輸送され、ならびに／あるいは、貯蔵施設において極低温で貯蔵されるか、または処理施設において処理される。一部の実施形態では、試料は、輸送の前に、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞など、を選択することによって処理される。一部の実施形態では、そのような処理は、試料を輸送した後かつ極低温で貯蔵する前に実施される。一部の実施形態では、処理は、極低温貯蔵の後に試料を解凍した後に実施される。
ドナー、したがってその細胞が、疾患に対する広範な治療を受けてない、ならびに／あるいは疾患または状態を罹患していないか、あるいはその診断を受けていない段階において、ドナーが自身の細胞を貯蔵することを可能にすることにより、そのような細胞は、１回または複数回の治療の後に収穫された細胞と比較して、細胞療法での使用に対してある特定の利点を有し得る。例えば、１回または複数回の治療の前に収穫された細胞は、より健康であり得、および／またはより高い、ある特定の細胞活性のレベルを示し得、および／またはより急速に成長し得、および／または複数回の治療を受けた細胞よりも遺伝子操作に対してより受容的であり得る。本明細書において説明される実施形態による利点の別の例としては、利便性が挙げられ得る。例えば、ドナーに細胞療法が必要となる前にドナーの細胞を収集、必要に応じて処理し、ならびに貯蔵することにより、レシピエントが後でそれらを必要とする場合またはその時に、細胞は、容易に利用可能であろう。これは、アフェレーシスに対するラボキャパシティを増加させることができ、それによって、アフェレーシス収集プロセスを計画するためのよりいっそうの柔軟性を有する技術を提供することができた。
試料、例えば、アフェレーシス試料など、からの細胞の極低温貯蔵および処理のための例示的方法およびシステムとしては、国際公開第２０１８１７０１８８号に記載されるものを挙げることができる。一部の実施形態では、方法およびシステムは、患者が細胞療法を必要とする前にアフェレーシスを収集し、次いで、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）によって細胞、例えば、Ｔ細胞を操作するためのプロセスにおける後の使用のためにアフェレーシス試料を凍結保存に供することを伴う。一部の場合には、そのようなプロセスとしては、本明細書において説明されるものを挙げることができる。一部の実施形態では、アフェレーシス試料は、対象から収集され、ならびに、後続のＴ細胞選択、活性化、刺激、操作、形質導入、トランスフェクション、インキュベーション、培養、収穫、細胞の集団の製剤化、および／または対象への製剤化された細胞集団の投与、の前に低温保存される。そのような実施例において、低温保存されたアフェレーシス試料は、１つまたは複数の選択工程、例えば、本明細書において説明されるもののいずれかなど、に供される前に解凍される。
一部の実施形態では、低温保存および／または凍結防止された細胞の試料（例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス試料）、例えば、前細胞選択に供されていない（例えば、前Ｔ細胞選択、例えば、クロマトグラフィーによる選択など、を行っていない）細胞の試料など、は、細胞療法のための細胞集団、例えば、ＣＡＲ＋Ｔ細胞を含むＴ細胞集団、の製造のための下流プロセスのためのその使用の前に解凍される。一部の実施形態では、そのような低温保存および／または凍結防止された細胞の試料（例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス試料）は、Ｔ細胞療法、例えば、ＣＡＲ＋Ｔ細胞療法など、を設計するために本明細書において提供されるプロセスと共に用いられる。特定の実施例において、収穫工程／製剤化工程の前またはその際に、凍結保存のさらなる工程は実施されない。
Ｂ．薬剤および試薬系
ある実施形態において、生物学的試料中に存在する細胞上の細胞表面マーカーに結合する薬剤（選択剤）を使用して生物学的試料から細胞（例えば、Ｔ細胞）を選択および／または濃縮することを含む方法が、本明細書において提供される。提供される実施形態において、生物学的試料は、節Ｉ－Ａに記載される任意のものである。一部の実施形態では、生物学的試料は、Ｔ細胞を含む試料である。提供される実施形態において、選択剤は、本明細書において提供されるデバイスのクロマトグラフィーカラムに収容されるクロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）に結合するかまたは固定化され、ならびに、節Ｉ－Ｃに記載されるような、目的の標的細胞（例えば、Ｔ細胞）の特定の選択を行い、それによって、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）に標的細胞（例えば、Ｔ細胞）を固定化する。一部の実施形態では、選択剤は、試薬、例えば、選択試薬、を介してクロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）に間接的に結合することができる。一部の実施形態では、選択試薬は、カラムの固定相に共有結合的または非共有結合的に結合する。一部の実施形態では、選択試薬は、クロマトグラフィー、マトリックス（例えば、固定相）上に選択剤を可逆的に固定化する試薬である。提供されるデバイスおよび方法に関連する使用のために選択剤が結合する例示的選択試薬は、節ＩＩ．Ｂ．２に記載される。
一部の実施形態では、選択剤が結合する選択試薬は、選択剤を試薬に可逆的に関連付ける可逆的システムを提供する。クロマトグラフィーによる細胞の選択のための例示的な可逆的システムとしては、国際公開第２０１３／１２４４７４号に記載されるものが挙げられる。本明細書においてさらに詳しく説明される一部の実施形態では、可逆的システムは、選択剤によって含まれるストレプトアビジン－結合ペプチド結合パートナーを介して選択剤に可逆的に結合するストレプトアビジンムテイン分子で構成された試薬を採用する。一部の実施形態では、遊離結合パートナーまたは競合剤（競合物質とも呼ばれる）を添加することは、選択剤と試薬との間の結合を崩壊させ、それによって試薬からの選択剤の結合を逆転させ、固定化された細胞を選択試薬から解放して放出させる。例えば、ストレプトアビジンムテイン／ストレプトアビジン結合ペプチドシステムの場合、例示的競合剤は、ビオチン（例えば、Ｄ－ビオチン）またはビオチンアナログである。
一部の実施形態では、本明細書において提供されるようなクロマトグラフィーマトリックス上に固定化された細胞のオンカラム刺激は、細胞選択のために使用される分子（すなわち、選択マーカー）の下方制御を促進し、その結果として、固定相からの細胞の自然発生的脱離または放出を生じるため、クロマトグラフィーマトリックス上の選択剤の結合の可逆性は必要ではない。したがって、細胞の放出または脱離は、いかなる追加の工程または試薬もなしに生じ得る。一部の態様では、細胞は、重力流動によって、例えば、クロマトグラフィーカラムに媒質または他の溶液を添加することによって、収集することができる。特定の実施形態において、添加された媒質または他の溶液は、固定相からの細胞の脱離を促進するための競合剤または遊離結合剤を含まない。例えば、ストレプトアビジンムテイン／ストレプトアビジン結合ペプチドシステムの場合、細胞の放出または脱離は、細胞が、洗浄液または媒質が遊離結合パートナーまたは競合剤、例えば、ビオチン（例えば、Ｄ－ビオチン）またはビオチンアナログを含んでいないカラムに、洗浄剤または媒質を添加した後に、重力流動によって、収集することができる。
ある実施形態において、例えば、選択剤または選択試薬などによる、クロマトグラフィーカラム上に固定化された細胞（例えば、Ｔ細胞）のオンカラム刺激を含む方法が、本明細書において提供される。提供される実施形態において、刺激は、シグナルを細胞に送達するために１種または複数種の受容体分子を細胞上に結合させるために、細胞を刺激するための１種または複数種の薬剤（１種または複数種の刺激剤）を使用して実施される。一部の実施形態では、１種または複数種の刺激剤は、Ｔ細胞を刺激するためのものであり、ならびに、Ｔ細胞に一次シグナルを（例えば、ＴＣＲ複合体シグナル伝達によって）、
およびＴ細胞に共刺激シグナルを（例えば、共刺激受容体からシグナル伝達することによって）提供する。一部の実施形態では、選択剤と、１種または複数種の刺激剤の少なくとも１種とは異なっている。一部の実施形態では、選択剤と、１種または複数種の刺激剤のそれぞれは、異なっている。一部の実施形態では、薬剤は、提供される方法と関連して、選択剤および、１種または複数種の刺激剤のうちの１種の両方として使用され得る。一部の実施形態では、１種または複数種の刺激剤は、刺激シグナルを細胞に送達する試薬（例えば、刺激試薬）に結合する。一部の実施形態では、試薬は、刺激剤が薬剤上において多量体化されるような、１種または複数種の刺激剤のそれぞれを結合させるための複数の結合部位を含む。特定の実施形態において、そのような刺激試薬は、複数の個々の分子、例えば、複数のタンパク質ユニットまたは複合体（例えば、四量体）など、で構成されたオリゴマー性またはポリマー性試薬である。１種または複数種の刺激剤が結合する例示的刺激試薬、例えば、提供されるデバイスおよび方法との関連における使用のためのオリゴマー性刺激試薬など、は、節Ｉ－Ｂ－２に記載される。特定の実施形態において、刺激試薬は、シグナルを細胞に送達するための好適な条件下において、固定化された細胞を収容するクロマトグラフィーカラムに添加される。例えば、オンカラム刺激は、本明細書において説明され提供されるデバイスを、細胞におけるシグナル伝達事象を可能にするために適切な生理的温度、例えば、３０℃または約３０℃から３９℃または約３９℃の間の温度、例えば、約３７℃±２℃、例えば、３７℃または約３７℃など、の温度、に加熱することによって、本明細書において説明されるような適切な温度において実施される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の刺激剤が結合する刺激試薬は、１種または複数種の刺激剤が試薬に可逆的に関連付けられる可逆的システムを提供する。細胞の刺激のための例示的な可逆的システムとしては、国際公開第２０１５／１５８８６８号、国際公開第２０１７０６８４２１号、または国際公開第２０１８／１９７９４９号に記載されるものが挙げられる。一部の実施形態では、可逆的システムは、１つまたは複数の刺激剤によって含まれたストレプトアビジン－結合ペプチド結合パートナーを介して１つまたは複数の刺激剤に可逆的に結合するストレプトアビジンムテインのオリゴマーまたはポリマーで構成された試薬を採用する。一部の実施形態では、遊離結合パートナーまたは競合剤（競合物質とも呼ばれる）を添加することは、１つまたは複数の刺激剤と試薬との間の結合を崩壊させ、それによって試薬からの１つまたは複数の刺激剤の結合を逆転させ、刺激試薬の１つまたは複数の刺激剤によって送達される刺激シグナルを終了させるかまたは妨げる。例えば、ストレプトアビジンムテイン／ストレプトアビジン結合ペプチドシステムの場合、例示的競合剤は、ビオチン（例えば、Ｄ－ビオチン）またはビオチンアナログである。
特定の態様において、細胞の表面上の分子（細胞表面分子）に結合することができる少なくとも１つの薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）が、試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬）に可逆的に関連付けられる可逆的システムを用いる方法が、本明細書において提供される。一部の場合には、試薬は、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）に可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む。一部の場合には、試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬）は、多量体化試薬である。一部の実施形態では、少なくとも１つの薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）は、分子のエピトープまたは領域に特異的に結合することができる少なくとも１つの結合部位Ｂを含み、ならびに、試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬）の少なくとも１つの結合部位Ｚに特異的に結合する結合パートナーＣも含む。一部の場合には、結合パートナーＣと少なくとも１つの結合部位Ｚとの間の結合相互作用は、非共有結合性相互作用である。一部の実施形態では、結合パートナーＣと少なくとも１つの結合部位Ｚとの間の結合相互作用、例えば、非共有結合性相互作用など、は、可逆性である。
一部の実施形態では、可逆的会合は、ある物質、例えば、競合剤または遊離結合剤、など、の存在下において媒介され得、したがって、または少なくとも１つの結合部Ｚに結合することもできる結合部位を含む。概して、物質（例えば、競合剤または遊離結合剤）は、試薬に存在する結合部位Ｚに対するより高い結合親和性により、および／または結合パートナーＣより高い濃度で存在することにより、競合相手として機能することができ、それによって試薬から結合パートナーＣを脱離および／または解離させることができる。一部の実施形態では、少なくとも１つの結合部位Ｚに対する物質（例えば、競合剤または遊離結合剤）の親和性は、少なくとも１つの結合部位Ｚに対する薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）の結合パートナーＣの親和性より高い。したがって、一部の場合には、試薬の結合部位Ｚと薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）の結合パートナーＣとの間の結合は、物質（例えば、競合剤または遊離結合剤）の添加によって崩壊させることができ、それによって、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）と試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬）との会合を可逆性にすることができる。
そのような可逆的システムにおいて使用することができる試薬は、当技術分野において説明され、および既知であり、例えば、米国特許第５，１６８，０４９号；同第５，５０６，１２１号；同第６，１０３，４９３号；同第７，７７６，５６２号；同第７，９８１，６３２号；同第８，２９８，７８２号；同第８，７３５，５４０号；同第９，０２３，６０４号；ならびに国際公開第２０１３／１２４４７４号および国際公開第２０１４／０７６２７７号を参照されたい。可逆的相互作用を形成することができる試薬および結合パートナー、ならびにそのような結合を逆転させることができる物質（例えば、競合剤または遊離結合剤）の非限定的な例は、下記において説明される。
１．薬剤
一部の実施形態では、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）は、細胞の表面上の分子、例えば、細胞表面分子、に結合するための１つまたは複数の結合部位Ｂを有する。したがって、一部の場合には、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）は、結合部位Ｂまたは複数の結合部位Ｂを含み、この場合、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）と標的細菌の表面上の分子との間の特異的な結合は、Ｂと分子との間の相互作用を含む。一部の実施形態では、薬剤は、単一の結合部位のみを含み、すなわち、一価である。一部の実施形態では、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）は、細胞表面分子に結合することができる少なくとも２つの、例えば、複数の結合部位Ｂ、例えば、３つ、４つ、または５つの結合部位Ｂ、を有する。いくつかのそのような態様において、少なくとも２つまたは複数の結合部位Ｂは、同一であり得る。一部の実施形態では、少なくとも２つまたは複数の結合部位Ｂのうちの１つまたは複数は、異なり得る（例えば、Ｂ１およびＢ２など）。
一部の実施形態では、１つまたは複数の異なる薬剤（例えば、１つまたは複数の異なる、例えば、選択剤または刺激剤または細胞上の分子に結合する他の薬剤）は、試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬）に可逆的に結合する。一部の実施形態では、少なくとも２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の異なる薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）が、同じ試薬に可逆的に結合する。一部の実施形態では、少なくとも２つの異なる薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）は、同じ試薬に可逆的に結合し、それによって、各薬剤は、薬剤と分子との間の特異的結合のための結合部位Ｂまたは複数の結合部位Ｂを含む。一部の実施形態では、少なくとも２つまたはそれ以上の薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）は、例えば、同じまたは実質的に同じ分子に結合するために、同じ結合部位Ｂを含む。一部の実施形態では、少なくとも２つまたはそれ以上の薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）は、例えば、異なる分子に結合するために、異なる結合部位Ｂを含む。一部の実施形態では、第１の薬剤（例えば、第１の選択剤または第１の刺激剤）は、結合部位Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４などを含み、ならびに第２の薬剤（例えば、第２の選択剤または第２の刺激剤）は、結合部位Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４などのうちの別の結合部位を含む。一部の実施形態では、第１の薬剤（例えば、第１の選択剤）は、結合部位Ｂ１を含み、ならびに、第２の薬剤（例えば、第２の選択剤）は、結合部位Ｂ３を含む。一部の実施形態では、第１の薬剤（例えば、第１の刺激剤）は、結合部位Ｂ２を含み、ならびに、第２の薬剤（例えば、第２の刺激剤）は、結合部位Ｂ４を含む。そのような実施形態のいずれかにおいて、第１薬剤および第２の薬剤は、結合パートナーＣ１またはＣ２を含むことができる。一部の実施形態では、Ｃ１およびＣ２は、同じであり得る。一部の実施形態では、Ｃ１およびＣ２は、異なっている。一部の実施形態では、第１薬剤および第２の薬剤は、同じ結合パートナーＣ１を含む。
一部の場合には、薬剤（例えば、結合部位Ｂを介した）と試薬の結合部位Ｚとの間の結合の解離定数（ＫＤ）は、約１０－２Ｍ～約１０－１３Ｍまたは約１０－３Ｍ～約１０－１２Ｍまたは約１０－４Ｍ～約１０－１１Ｍまたは約１０－５Ｍ～約１０－１０Ｍの範囲の値を有し得る。一部の実施形態では、結合剤と分子との間の結合に対する解離定数（ＫＤ）は、例えば、約１０－３～約１０－７ＭのＫＤの範囲の低親和性の解離定数である。一部の実施形態では、結合剤と分子との間の結合に対する解離定数（ＫＤ）は、例えば、約１０－７～約１×１０－１０ＭのＫＤ範囲の高親和性の解離定数である。
一部の実施形態では、結合部位Ｂを介した薬剤と分子との結合の解離は、十分速く生じるため、例えば、試薬と薬剤との間の可逆的な結合の崩壊の後に標的細胞が一時的のみにおいて染色されるかまたは薬剤と会合することを可能にする。一部の場合には、薬剤（結合部位Ｂを介した）と分子との間の結合に対するｋｏｆｆ速度（解離速度定数とも呼ばれる）において表現される場合、ｋｏｆｆ速度は、約０．５×１０－４ｓｅｃ－１またはそれ以上、約１×１０－４ｓｅｃ－１またはそれ以上、約２×１０－４ｓｅｃ－１またはそれ以上、約３×１０－４ｓｅｃ－１またはそれ以上、約４×１０－４ｓｅｃ－１またはそれ以上、約５×１０－４ｓｅｃ－１またはそれ以上、約１×１０－３ｓｅｃ－１またはそれ以上、約１．５×１０－３ｓｅｃ－１またはそれ以上、約２×１０－３ｓｅｃ－１またはそれ以上、約３×１０－３ｓｅｃ－１またはそれ以上、約４×１０－３ｓｅｃ－１、約５×１０－３ｓｅｃ－１またはそれ以上、約１×１０－２ｓｅｃ－１またはそれ以上、または約５×１０－１ｓｅｃ－１またはそれ以上である。特定の薬剤と細胞分子との相互作用に対して好適なｋｏｆｆ速度範囲を経験的に決定するのは、熟練者のレベル内である（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２９５４５８号を参照されたい）。例えば、結合複合体の崩壊の後に、薬剤のほとんどが１時間以内に除去または脱離できるように、例えば、４．０×１０－４ｓｅｃ－１を超えるような、かなり高いｋｏｆｆ速度の薬剤が使用され得る。他の場合において、結合複合体の崩壊の後に、薬剤のほとんどが３時間半以内に細胞から除去または脱離できるように、例えば、１．０×１０－４ｓｅｃ－１のようなより低いｋｏｆｆ速度の薬剤が使用され得る。
一部の実施形態では、この結合のＫＤ、ならびにＫＤ、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）の結合部位Ｂと細胞表面分子との間において形成された結合のｋｏｆｆおよびｋｏｎ速度は、任意の好適な手段、例えば、蛍光滴定、平衡透析、または表面プラズモン共鳴、によって特定することができる。
一部の態様では、細胞表面分子は、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）がその対象であり得る分子である。一部の実施形態では、細胞表面分子は、ペプチドまたはタンパク質、例えば、受容体、例えば、膜受容体タンパク質など、である。一部の実施形態では、受容体は、脂質、多糖、または核酸である。一部の実施形態では、タンパク質である細胞表面分子は、表在性膜タンパク質または内在性膜タンパクであり得る。細胞表面分子は、一部の実施形態では、膜を貫通する１つまたは複数のドメインを有し得る。いくつかの実例として、膜貫通ドメインを有する膜タンパク質は、Ｇタンパク質共役受容体、例えば、嗅覚受容体、ロドプシン受容体、ロドプシンフェロモン受容体、ペプチドホルモン受容体、味覚受容体、ＧＡＢＡ受容体、オピエート受容体、セロトニン受容体、Ｃａ２＋受容体、メラノプシン、神経伝達物質受容体、例えば、リガンド開口型受容体、電位開口型受容体、または機械刺激開口型受容体、例えば、アセチルコリン、ニコチン、アドレナリン作用薬、ノルエピネフリン、カテコールアミン、Ｌ－ＤＯＰＡ－、ドーパミン、およびセロトニン（生体アミン、エンドルフィン／エンケファリン）、神経ペプチド受容体、受容体キナーゼ、例えば、セリン／トレオニンキナーゼ、チロシンキナーゼ、ポリン／チャネル、例えば、塩素チャネル、カリウムチャネル、ナトリウムチャネル、ＯＭＰタンパク質、ＡＢＣ輸送体（ＡＴＰ結合カセット輸送体）、例えば、アミノ酸輸送体、Ｎａグルコース輸送体、Ｎａ／ヨウ化物輸送体、イオン輸送体、例えば、集光複合体、チトクロームｃオキシダーゼ、ＡＴＰａｓｅＮａ／Ｋ、Ｈ／Ｋ、Ｃａ、細胞接着受容体、例えば、金属プロテアーゼ、インテグリン、またはカドヘリンなど、であり得る。
一部の実施形態では、細胞表面分子は、所望の細胞集団またはサブ集団、例えば、血球の集団またはサブ集団、例えば、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞、例えば、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞、Ｂ細胞、またはナチュラルキラー細胞）、単核細胞、または幹細胞、例えば、ＣＤ３４陽性末梢血幹細胞またはＮａｎｏｇまたはＯｃｔ－４発現幹細胞、を定義する抗原であり得る。Ｔ細胞の例としては、ＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球、細胞障害性Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、および調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）などの細胞が挙げられる。Ｔｒｅｇの実例は、ＣＤ４ ＣＤ２５ ＣＤ４５ＲＡ Ｔｒｅｇ細胞であり、ならびに、記憶Ｔ細胞の実例は、ＣＤ６２Ｌ ＣＤ８＋特異的中央記憶Ｔ細胞である。細胞表面分子は、腫瘍細胞に対するマーカーでもあり得る。
上記において説明されるように、一部の実施形態では、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）は、細胞表面分子に結合することができる結合部位Ｂに加えて、結合パートナーＣを有する。一部の態様では、この結合パートナーＣは、試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬（例えば、オリゴマー性刺激試薬））の結合部位Ｚに結合することができ、この場合、試薬は、結合パートナーＣのための１つまたは複数の結合部位を有する。一部の実施形態では、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）に含まれる結合パートナーＣと、試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬（例えば、オリゴマー性刺激試薬））の結合部位（複数可）Ｚとの間において形成され得る非共有結合は、任意の所望の強度および親和性を有する結合であり得、ならびに、方法が実施される条件下において、崩壊性または可逆性であり得る。薬剤（例えば、受容体結合剤または選択剤）は、少なくとも１つの、例えば、２つ、３つ、またはそれ以上の、追加の結合パートナーＣを含み得、ならびに、試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬（例えば、オリゴマー性刺激試薬））は、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）に含まれる結合パートナーＣのための、少なくとも２つの、例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、またはそれ以上の結合部位Ｚを含み得る。米国特許第７，７７６，５６２号、米国特許第８，２９８，７８２号、または国際公開第２００２／０５４０６５号に記載されるように、結合パートナーＣと１つまたは複数の対応する結合部位Ｚを有する試薬との任意の組合せは、例えば、例えば、アビディティ効果（ａｖｉｄｉｔｙ ｅｆｆｅｃｔ）を引き起こすために、結合パートナーＣおよび結合部位Ｚが複合体において可逆的に結合することができるように、選択することができる。
薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）に含まれる結合パートナーＣは、例えば、炭化水素系であり得（ポリマー性を含む）、ならびに、例としては、窒素基、リン基、硫黄基、カルベン基、ハロゲン基、または擬ハロゲン基が挙げられる。一部の態様では、それは、アルコール、有機酸、無機酸、アミン、ホスフィン、チオール、ジスルフィド、アルカン、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、糖、オリゴ糖、または多糖であり得る。さらなる例として、それは、カチオン、アニオン、ポリカチオン、ポリアニオン、ポリカチオン、電解質、多価電解質、炭素ナノチューブ、または炭素ナノフォームでもあり得る。概して、そのような結合パートナーＣは、その他と比べて試薬の結合部位に対してより高い親和性を有する。それぞれの結合パートナーＣの実施例としては、これらに限定されるわけではないが、クラウンエーテル、免疫グロブリン、それらの断片、および抗体様機能を有するタンパク性結合性分子が挙げられる。
一部の実施形態では、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）に含まれる結合パートナーＣは、ビオチンを含み、ならびに、試薬は、ビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジンアナログまたはアビジンアナログを含む。一部の実施形態では、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）に含まれる結合パートナーＣは、ストレプトアビジンまたはアビジンに可逆的に結合するビオチンアナログを含み、ならびに、試薬は、それぞれのビオチンアナログに可逆的に結合する、ストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジンアナログ、またはアビジンアナログを含む。一部の実施形態では、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）に含まれる結合パートナーＣは、ストレプトアビジンまたはアビジン結合ペプチドを含み、ならびに、試薬は、それぞれのストレプトアビジンまたはアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、ストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジンアナログ、またはアビジンアナログを含む。本明細書の目的のために、アナログなる用語は、ストレプトアビジン（例えば、ストレプトアビジンアナログまたはストレプトアビジンムテイン）またはアビジン（例えば、アビジンアナログまたはアビジンムテイン）の変異体型に関して、ムテインなる用語と相互互換的に使用される。
一部の実施形態では、試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬）は、ストレプトアビジン、例えば、上記において説明される（例えば、配列番号３～６において説明される）任意のものを含む、ストレプトアビジンムテインなど、であるかまたはそれを含み、ならびに、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）に含まれる結合パートナーＣは、ストレプトアビジン－結合ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、ストレプトアビジン－結合ペプチドは、配列番号９に記載された一般式を有する配列を含み得、例えば、配列番号１０に記載された配列などを含む。一部の実施形態では、ストレプトアビジン－結合ペプチド配列は、配列番号１１に記載された一般式、例えば、配列番号１２などに記載されたもの、を有する。一実施例において、ストレプトアビジン－結合ペプチド配列は、Ｔｒｐ－Ａｒｇ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙである（Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）とも呼ばれ、配列番号７に記載される）。一実施例において、ストレプトアビジン－結合ペプチド配列は、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓである（Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）ＩＩとも呼ばれ、配列番号８に記載される）。一部の実施形態では、ストレプトアビジン－結合ペプチドリガンドは、少なくとも２つのストレプトアビジン－結合モジュールの連続配置を含み、この場合、２つのモジュールの間の距離は、０以上５０アミノ酸以下であり、この場合、１つの結合モジュールは、３～８のアミノ酸を有し、ならびに、少なくとも配列Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｘａａ（配列番号９）を含み、この場合、Ｘａａは、グルタミン、アスパラギン、またはメチオニンであり、ならびに、もう一方の結合モジュールは、例えば、配列番号１１に記載される、同じまたは異なるストレプトアビジンペプチドリガンドを有する（例えば、国際公開第０２／０７７０１８号；米国特許第７，９８１，６３２号を参照されたい）。一部の実施形態では、ストレプトアビジン－結合ペプチドリガンドは、配列番号１３または１４のいずれかに記載される式を有する配列を含む。一部の実施形態では、ストレプトアビジン－結合ペプチドリガンドは、配列番号１５～１９のいずれかに記載されるアミノ酸の配列を有する。ほとんどの場合、これらストレプトアビジン結合ペプチドの全ては、同じ結合部位、すなわち、ストレプトアビジンのビオチン結合部位に結合する。そのようなストレプトアビジン結合ペプチドの１つまたは複数が、結合パートナーＣ、例えば、Ｃ１およびＣ２として使用される場合、多量体化試薬は、典型的には、ストレプトアビジンムテインである。
一部の実施形態では、ストレプトアビジン－結合ペプチドは、さらに改変され得る。一部の実施形態では、ストレプトアビジン－結合ペプチドは、ニッケルチャージされたｔｒｉｓＮＴＡ（Ｈｉｓ－ＳＴＲＥＰＰＥＲまたはＨｉｓ／Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（Ｒ） ＩＩアダプターとも呼ばれる）とコンジュゲートした、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）ＩＩとも呼ばれ、配列番号８に記載される）であるペプチド配列を含み得る。
一部の実施形態では、薬剤（例えば、受容体結合剤または選択剤）の結合パートナーＣは、親和性タグとして熟練者に知られる部分を含む。そのような実施形態において、試薬は、親和性タグに結合することが知られている対応する結合パートナー、例えば、抗体または抗体断片、を含み得る。既知の親和性タグのいくつかの実例として、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）に含まれる結合パートナーＣは、ジニトロフェノールまたはジゴキシゲニン、オリゴヒスチジン、ポリヒスチジン、免疫グロブリンドメイン、マルトース結合タンパク質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）またはチオレドキシン、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ＦＬＡＧ’－ペプチド、ＨＡタグ（配列：Ｔｙｒ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ａｌａ）（配列番号２０）、ＶＳＶ－Ｇタグ（配列：Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ａｓｐ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｍｅｔ－Ａｓｎ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ）（配列番号２１）、ＨＳＶタグ（配列：Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ）（配列番号２２）、Ｔ７エピトープ（Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ｍｅｔ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｇｌｎ－Ｍｅｔ－Ｇｌｙ）（配列番号２３）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質の配列Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ（配列番号２４）のＨＳＶエピトープ、配列Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ（配列番号２５）の転写因子ｃ－ｍｙｃの「ｍｙｃ」エピトープ、Ｖ５タグ（配列：Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｓｎ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ）（配列番号２６）、またはグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含み得る。そのような実施形態において、抗体または抗体断片であり得る試薬の１つまたは複数の結合部位Ｚと、抗原との間で形成された複合体は、遊離抗原、すなわち、遊離ペプチド（エピトープタグ）または遊離タンパク質（例えば、ＭＢＰまたはＣＢＰなど）、を添加することにより、競争的に崩壊させることができる。一部の実施形態では、親和性タグは、オリゴヌクレオチドタグでもあり得る。一部の場合には、そのようなオリゴヌクレオチドタグは、例えば、試薬に連結されるかまたは含まれる、相補配列を有するオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするために使用され得る。
好適な結合パートナーＣのさらなる実施例としては、これらに限定されるわけではないが、レクチン、プロテインＡ、プロテインＧ、金属、金属イオン、ニトリロ三酢酸誘導体（ＮＴ Ａ）、ＲＧＤモチーフ、デキストラン、ポリエチレンミン（ＰＥＩ）、レドックスポリマー、糖タンパク質、アプタマー、色素、アミロース、マルトース、セルロース、キチン、グルタチオン、カルモジュリン、ゼラチン、ポリミキシン、ヘパリン、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、リジン、アルギニン、ベンズアミジン、ポリＵ、またはオリゴチミジンが挙げられる。コンカナバリンＡなどのレシチンは、多糖およびグリコシル化タンパク質に結合することが知られている。染料の例示的実施例は、トリアジン色素、例えば、シバクロンブルーＦ３Ｇ－Ａ（ＣＢ）またはレッドＨＥ－３Ｂなどであり、それらは、ＮＡＤＨ依存性酵素に特異的に結合する。典型的には、グリーンＡは、ＣｏＡタンパク質、ヒト血清アルブミン、およびデヒドロゲナーゼに結合する。一部の場合には、染料である７－アミノアクチノマイシンＤおよび４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドールは、ＤＮＡに結合する。概して、Ｎｉ、Ｃｄ、Ｚｎ、Ｃｏ、またはＣｕなどの金属のカチオンは、親和性タグ、例えば、オリゴヒスチジン含有配列、例えば、ヘキサヒスチジンまたはＨｉｓ－Ａｓｎ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｈｉｓ－Ｌｙｓ－Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓタグ（ＭＡＴタグ）（配列番号３５）、ならびにＮ－メタクリロイル－（Ｌ）－システインメチルエステルなど、に結合するために典型的に使用される。
一部の実施形態では、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）に含まれる結合パートナーＣと、試薬の１つまたは複数の結合部位Ｚとの間の結合は、二価、三価、または四価のカチオンの存在下において生じる。これに関して、一部の実施形態では、試薬は、二価、三価、または四価のカチオンを含み、典型的には、好適なキレート剤によって保持され、例えば、複合体化される。一部の実施形態では、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）に含まれる結合パートナーＣは、例えば、複合体、二価、三価、または四価のカチオンなどを含む部分を含み得る。それぞれの金属キレート剤の例としては、これらに限定されるわけではないが、エチレンジアミン、エチレン－ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリ－アミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｎ，Ｎ－ビス（カルボキシメチル）グリシン（ニトリロ三酢酸、ＮＴＡとも呼ばれる）、１，２－ビス（ｏ－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、２，３－二量体－カプト－１－プロパノール（ジメルカプロール）、ポルフィン、およびヘムが挙げられる。一例として、ＥＤＴＡは、ほとんどの一価、二価、三価、および四価の金属イオン、例えば、銀（Ａｇ＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）、マンガン（Ｍｎ２＋）、銅（Ｃｕ２＋）、鉄（Ｆｅ２＋）、コバルト（Ｃｏ＋）、およびジルコニウム（Ｚｒ４＋）など、と複合体を形成し、その一方で、ＢＡＰＴＡは、Ｃａ２＋に対して特異的である。例示的実施例として、当技術分野で使用される標準的方法は、オリゴヒスチジンタグと、銅（Ｃｕ２＋）イオン、ニッケル（Ｎｉ２＋）イオン、コバルト（Ｃｏ２＋）イオン、または亜鉛（Ｚｎ２＋）イオンとの間での複合体形成であり、それは、キレート剤のニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）によって提示される。
一部の実施形態では、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）に含まれる結合パートナーＣは、カルモジュリン結合ペプチドを含み、ならびに、試薬は、例えば、米国特許第５，９８５，６５８号に記載されるような、多量体カルモジュリンを含む。一部の実施形態では、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）に含まれる結合パートナーＣは、ＦＬＡＧペプチドを含み、ならびに、試薬は、ＦＬＡＧペプチド、例えば、米国特許第４，８５１，３４１号に記載されるモノクローナル抗体４Ｅ１１に結合するＦＬＡＧペプチド、に結合する抗体を含む。一実施形態において、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）に含まれる結合パートナーＣは、オリゴヒスチジンタグを含み、ならびに、試薬は、オリゴヒスチジンタグに結合する抗体または遷移金属イオンを含む。一部の場合には、これら全ての結合複合体の崩壊は、例えば、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡなどを添加することによる、金属イオンのキレート化、例えば、カルシウムキレート化、によって達成され得る。一部の実施形態では、カルモジュリン、抗体、例えば、４Ｅ１１またはキレート化金属イオンまたは遊離キレート剤など、は、従来の方法、例えば、ビオチン化およびストレプトアビジンもしくはアビジンもしくはそれらのオリゴマーとの複合体化によって、あるいは、第一段階において、本質的にNoguchi, A, et al. Bioconjugate Chemistry (1992) 3, 132-137に記載されるような、多糖、例えばデキストラン、へのカルボキシル残基の導入によって、ならびに、第二段階において、従来のカルボジイミド化学を使用して、カルモジュリンまたは抗体またはキレート化金属イオンまたは遊離キレート剤を第一アミノ基を介して多糖、例えば、デキストラン、の骨格におけるカルボキシル基に連結することによって、多量体化され得る。いくつかのそのような実施形態において、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）に含まれる結合パートナーＣと、試薬の１つまたは複数の結合部位Ｚとの間の結合は、金属イオンキレート化によって崩壊させることができる。金属キレート化は、例えば、ＥＧＴＡまたはＥＤＴＡの添加によって達成され得る。
一部の実施形態では、細胞表面分子に特異的に結合する薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）は、例えば、抗体、またはその断片、または抗体様機能を有するタンパク性結合性分子で構成され得る。一部の実施形態では、薬剤の結合部位Ｂは、抗体結合部位であり、例えば、抗体の１つまたは複数の相補性決定領域であるかまたはそれを含む。（組換え）抗体断片の例としては、これらに限定されるわけではないが、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、二価の抗体断片、例えば、（Ｆａｂ）２’－断片ダイアボディ、トリアボディ、（Iliades, P., et al, FEB S Lett (1997) 409, 437-441）、デカボディ（Ｄｅｃａｂｏｄｙ）（Stone, E., et al, Journal of Immunological Methods (2007) 318, 88-94）、および他のドメイン抗体（Holt, L.J., et al, Trends Biotechnol. (2003), 21, 11, 484-490）が挙げられる。一部の実施形態では、薬剤（例えば、受容体結合剤または選択剤）は、二価のタンパク質性人工結合分子、例えば、デュオカリン（Ｄｕｏｃａｌｉｎ）としても知られる二量体リポカリンムテインなど、を含み得る。
一部の実施形態では、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）は、単一の結合部位を有し得、すなわち、それは、一価であり得る。一価の薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）の例としては、これらに限定されるわけではないが、一価抗体断片、抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子抗体、またはＭＨＣ分子が挙げられる。一価抗体断片の例としては、これらに限定されるわけではないが、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、および単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、例えば、二価の単鎖Ｆｖ断片など、が挙げられる。
一部の実施形態では、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）は、抗体またはその抗原結合性断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、二価の抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２－断片など、である。一部の実施形態では、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）は、目的の細胞分子に結合することが知られている親抗体であるかまたはそれに由来する。細胞表面分子に対する様々な抗体分子またはそれの断片は、当技術分野において周知であり、ならびに、様々なそのようなもののいずれも、本明細書における方法において薬剤として使用することができる。一部の実施形態では、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）は、例えば、変更された親和性を有する抗体を生成するなどのために、親抗体または基準抗体の可変重鎖に１つまたは複数のアミノ酸置換を含むか、あるいは上記において説明されるような十分に速い解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）を示す、抗体またはその断片である。例えば、そのような変異の例は、抗ＣＤ４抗体１３Ｂ８．２の変異体との関連において知られており（例えば、米国特許第７，４８２，０００号、米国特許出願公開第２０１４／０２９５４５８号、または国際公開第２０１３／１２４４７４号を参照されたい）、ならびに、そのような変異のいずれも、別の親抗体または基準抗体において生成させることができる。
一部の態様では、一価であり得る薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）は、例えば、一価の抗体断片または一価の人工的結合分子（タンパク質性またはその他）、例えば、リポカリンファミリーのポリペプチドをベースとするムテイン（「Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）」としても知られる）など、あるいは二価の分子、例えば、抗体、または両方の結合部位が維持されている断片、例えばＦ（ａｂ’）２断片など、を含む。
抗体様機能を有するタンパク性結合性分子の例としては、リポカリンファミリーのポリペプチドをベースとするムテイン（例えば、国際公開第０３／０２９４６２号、Beste et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96, 1898-1903を参照されたい）が挙げられる。概して、リポカリン、例えば、ビリン結合タンパク質、ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ヒトＡｐｏリポタンパクＤ、またはヒト涙液リポカリンなど、は、所定の標的に結合するように改変することができる天然のリガンド結合部を有する。細胞表面分子に特異的に結合する薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）として使用することができる抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子抗体のさらなる例としては、これらに限定されるわけではないが、いわゆるグルボディ（ｇｌｕｂｏｄｙ）（例えば、国際公開第９６／２３８７９号を参照されたい）、アンキリン足場をベースとするタンパク質（Mosavi, L.K., et al, Protein Science (2004) 13, 6, 1435-1448）、または結晶性足場（例えば、国際公開第０１／０４１４４号）、Skerra, J. Mol. Recognit. (2000) 13, 167-187に記載されるタンパク質、アドネクチン、テトラネクチンおよびアビマーが挙げられる。概して、アビマー、例えば、ヒト受容体ドメインのファミリーのエキソンシャッフリングによって生じた多価のアビマータンパク質など、は細胞表面受容体において複数のドメインの鎖として生じる、いわゆるＡ－ドメインを含む（Silverman, J., et al, Nature Biotechnology (2005) 23, 1556-1561）。概してヒトフィブロネクチンのドメインに由来するアドネクチン、は、典型的には、標的に対する免疫グロブリン様結合のために操作することができる３つのループを含む（Gill, D.S. & Damle, N.K., Current Opinion in Biotechnology (2006) 17, 653-658）を含む。概してそれぞれのヒトホモ三量体タンパク質に由来するテトラネクチンは、同様に、典型的には、所望の結合のために操作することができるＣ型レクチンドメインにループ領域を含む。一部の場合にはタンパク質リガンドとして機能することができるペプトイドは、典型的には、側鎖が炭素原子ではなくアミド窒素に結合している点において、ペプチドとは異なるオリゴ（Ｎ－アルキル）グリシンである。ペプトイドは、典型的には、プロテアーゼおよび他の改変酵素に対して抵抗性であり、ならびに、ペプチドよりはるかに高い細胞透過性を有することができる（例えば、Kwon, Y.-U., and Kodadek, T., J. Am. Chem. Soc. (2007) 129, 1508-1509を参照されたい）。
好適なタンパク質性結合分子のさらなる例としては、これらに限定されるわけではないが、ＥＧＦ様ドメイン、クリングルドメイン、フィブロネクチンＩ型ドメイン、フィブロネクチンＩＩ型ドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、ＰＡＮドメイン、Ｇｌａドメイン、ＳＲＣＲドメイン、クニッツ／ウシすい臓トリプシン阻害ドメイン、テンダミスタット、Ｋａｚａｌ型セリンプロテアーゼ阻害ドメイン、トレフォイル（Ｐ型）ドメイン、フォンヴィルブランド因子Ｃ型ドメイン、アナフィラトキシン様ドメイン、ＣＵＢドメイン、チログロブリンＩ型リピート、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、Ｓｕｓｈｉドメイン、Ｌｉｎｋドメイン、トロンボスポンジンＩ型ドメイン、免疫グロブリンドメイン、または免疫グロブリン様ドメイン（例えば、ドメイン抗体またはラクダ重鎖抗体）、Ｃ型レクチンドメイン、ＭＡＭドメイン、フォンヴィルブランド因子Ａ型ドメイン、ソマトメジンＢドメイン、ＷＡＰ型４ジスルフィドコアドメイン、Ｆ５／８ Ｃ型ドメイン、ヘモペキシンドメイン、ＳＨ２ドメイン、ＳＨ３ドメイン、ラミニン型ＥＧＦ様ドメイン、Ｃ２ドメイン、「カッパボディ（Ｋａｐｐａｂｏｄｙ）」（Ill et al. Protein Eng (1997) 10, 949-57）、いわゆる「ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）」（Martin et al, EMBO J (1994) 13, 5303-5309）、ダイアボディ、（Holliger et al, PNAS USA (1993)90, 6444-6448）、いわゆる「Ｊａｎｕｓｉｓ」（Traunecker et al, EMBO J (1991) 10, 3655-3659, or Traunecker et al, Int J Cancer (1992) Suppl 7, 51-52）、ナノボディ、ミクロボディ、アフィリン、アフィボディ、ノッチン、ユビキチン、ジンクフィンガータンパク質、自己蛍光タンパク質、またはロイシンリッチリピートタンパク質が挙げられる。一部の実施形態では、抗体様機能を有する核酸分子は、アプタマーであり得る。概して、アプタマーは、定義された三次元モチーフに折り畳まれ、所定の標的構造に対する高い親和性を示す。
ａ．選択剤
ある特定の態様において、本明細書において提供される方法は、選択剤を用いる。一部の実施形態では、節Ｉ－Ｂに記載されるような薬剤は、選択剤である。一部の実施形態では、選択剤は、細胞の表面上の分子、例えば、細胞表面分子など、に結合する。一部の場合には、細胞表面分子は、選択マーカーである。一部の実施形態では、選択剤は、試料中の細胞の１つまたは複数によって発現される選択マーカーに特異的に結合することができる。一部の実施形態では、本開示全体を通して、分子への特異的結合に対する言及、例えば、細胞表面分子または細胞表面受容体など、は、薬剤がそのような分子のみに結合することを必ずしも意味しない。例えば、ある分子に特異的に結合する薬剤は、例えば、イムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＫｉｎＥｘＡ３０００機器（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ボイシ、ＩＤ）または他のアッセイによって判定されるような、概してはるかに低い親和性において他の分子に結合し得る。一部の場合には、特定の結合条件下において標的分子に結合する薬剤の能力は、その親和性またはアビディティが、十分な統計的サイズのランダムなペプチドまたはポリペプチドのサンプリングに対する同じ薬剤の平均的な親和性またはアビディティの少なくとも５倍高い、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２５０、または５００倍高い、またはさらに少なくとも１０００倍高い。
一部の実施形態では、細胞、例えば、標的細胞（例えば、Ｔ細胞）は、選択されるべき細胞が少なくとも１つの一般的な特定の分子（例えば、選択マーカー）の存在によって定義されるように、細胞の表面上の分子、例えば、選択マーカー、を有するかまたは発現する。一部の実施形態では、標的細胞を含む試料は、分子（例えば、選択マーカー）を欠く追加の細胞も含み得る。例えば、一部の実施形態では、Ｔ細胞は、複数の細胞タイプ、例えば、赤血球またはＢ細胞など、を含む試料から選択され得る。選択マーカーおよび受容体分子は、細胞表面分子を意味するために、本明細書において相互互換的に使用され得る。
一部の実施形態では、選択剤は、抗体断片、一価抗体断片、免疫グロブリン様機能を有するタンパク性結合分子、Ｉｇドメインを含む分子、サイトカイン、ケモカイン、アプタマー、ＭＨＣ分子、ＭＨＣペプチド複合体；受容体リガンド；およびそれらの結合断片からなる群から選択される薬剤であるかまたはそれを含み；および／または、選択剤は、抗体断片を含み；選択剤は、Ｆａｂ断片であるかまたはそれを含み；選択剤は、（Ｆａｂ）２’－断片および二価の単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片からなる二価の抗体断片からなる群から選択され；選択剤は、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、およびｓｃＦｖからなる群から選択される一価の抗体断片であり；ならびに／あるいは選択剤は、アプタマー、リポカリンファミリーのポリペプチドをベースとするムテイン、グルボディ（ｇｌｕｂｏｄｙ）、アンキリン足場をベースとするタンパク質、結晶性足場をベースとするタンパク質、アドネクチン、およびアビマーからなる群から選択される、抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子抗体である。
一部の実施形態では、選択剤は、試薬に結合するための結合パートナーＣをさらに含む。一部の実施形態では、選択剤は、ビオチン、ストレプトアビジンまたはアビジンに可逆的に結合するビオチンアナログ、以下：Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号８）、Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙ（配列番号１５）、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１７）、ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１６）、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１８）、およびＴｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１９）からなる群から選択されるストレプトアビジン－結合ペプチド、カルモジュリンに可逆的に結合するカルモジュリン結合ペプチド、ＦＬＡＧペプチドに結合する抗体に可逆的に結合するＦＬＡＧペプチド、ならびにオリゴヒスチジンタグに結合する抗体に可逆的に結合するオリゴヒスチジンタグをさらに含む。
一部の実施形態では、試薬は、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテイン、アビジン（ａｖｉｄｉｎｇ）、またはアビジンムテインであるかまたはそれを含み、ならびに、選択剤は、そのような試薬、例えば、ビオチン、ビオチンアナログ、またはストレプトアビジン－結合ペプチドなど、に結合することができる結合パートナーＣを含む。一部の実施形態では、選択剤は、ビオチン、ストレプトアビジンまたはアビジンに可逆的に結合するビオチンアナログ、以下：Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号８）、Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙ（配列番号１５）、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１７）、ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１６）、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１８）、およびＴｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１９）からなる群から選択されるストレプトアビジン－結合ペプチドをさらに含む。特定の実施形態において、試薬は、ストレプトアビジンムテイン（例えば、配列番号６に記載される）であるかまたはそれを含み、ならびに、結合パートナーＣは、ストレプトアビジン－結合ペプチド、例えば、配列番号８または１５～１９のいずれか１つに記載される任意のものなど、である。一部の実施形態では、選択剤は、配列ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１６）、を有するストレプトアビジン結合ペプチドをさらに含む。
一部の態様では、細胞表面分子、例えば、選択マーカーは、所望の細胞集団またはサブ集団、例えば、血球の集団またはサブ集団、例えば、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞、例えば、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞、Ｂ細胞、またはナチュラルキラー細胞）、単核細胞、または幹細胞、例えば、ＣＤ３４陽性末梢血幹細胞あるいはＮａｎｏｇまたはＯｃｔ－４発現幹細胞、を定義する抗原であり得る。一部の実施形態では、選択マーカーは、Ｔ細胞またはＴ細胞のサブセットの表面上において発現されるマーカー、例えば、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ１２７、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、および／またはＣＤ４５ＲＯなど、であり得る。Ｔ細胞の例としては、ＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球、細胞障害性Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、および調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）などの細胞が挙げられる。Ｔｒｅｇの実例としては、ＣＤ４ ＣＤ２５ ＣＤ４５ＲＡ Ｔｒｅｇ細胞が挙げられ、ならびに、記憶Ｔ細胞の実例としては、ＣＤ６２Ｌ ＣＤ８＋特異的中央記憶Ｔ細胞が挙げられる。
例えば、一部の態様では、Ｔ細胞、例えば、ポジティブな、または高レベルの１つまたは複数の表面マーカーを発現する細胞、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、および／またはＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞特定の亜集団が、ポジティブまたはネガティブ選択技術によって単離される。一部の実施形態では、そのような細胞は、そのようなマーカーに選択的に結合する１つまたは複数の選択剤によるインキュベーションによって選択される。選択剤は、任意の結合性分子、例えば、Ｔ細胞またはそのサブ集団のポジティブまたはネガティブ選択を行うためにそのような表面マーカーに結合する抗体または抗体断片など、であり得る。
一部の実施形態では、Ｔ細胞は、非Ｔ細胞、例えば、Ｂ細胞、単球または他の白血球、例えば、ＣＤ１４で発現されたマーカーのネガティブ選択によってＰＢＭＣ試料から分離される。一部の態様では、ＣＤ４＋ヘルパーおよびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を分離するために、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋選択工程が使用される。このようなＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団は、１つまたは複数のナイーブ様、記憶および／またはエフェクターＴ細胞亜集団で発現された、または相対的に高度に発現されたマーカーについてのポジティブまたはネガティブ選択によって亜集団にさらに選別され得る。
一部の実施形態では、ＣＤ８＋細胞は、それぞれの亜集団と関連する表面抗原に基づいたポジティブまたはネガティブ選択等によってナイーブ幹細胞、中枢記憶幹細胞、エフェクター記憶幹細胞および／または中枢記憶幹細胞がさらに濃縮または枯渇される。一部の実施形態では、中枢記憶Ｔ（ＴＣＭ）細胞の濃縮は、有効性を増大するため、例えば、投与後の長期間生存、拡大増殖および／または生着を改善するために実施され、これは一部の態様では、このような亜集団において特に頑強である。Terakura et al.、(2012) Blood.1:72-82；Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701を参照されたい。一部の実施形態では、ＴＣＭが濃縮されたＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を組み合わせることによって、有効性がさらに増強される。
ある実施形態において、記憶Ｔ細胞は、ＣＤ８＋末梢血液リンパ球のＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ６２Ｌ－サブセットの両方に存在する。ＰＢＭＣは、例えば、選択剤として抗ＣＤ８および抗ＣＤ６２Ｌ抗体を使用することによって、ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ８＋および／またはＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋画分を濃縮または消耗させることができる。
一部の実施形態では、中枢記憶Ｔ（ＴＣＭ）細胞の濃縮は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３および／またはＣＤ１２７のポジティブまたは高い表面発現に基づいており、一部の態様では、ＣＤ４５ＲＡおよび／またはグランザイムＢを発現する、または高度に発現する細胞についてのネガティブ選択に基づいている。一部の態様では、ＴＣＭ細胞について濃縮されたＣＤ８＋集団の単離は、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞の枯渇、ＣＤ６２Ｌを発現する細胞についてのポジティブ選択または濃縮によって実施される。一態様では、中枢記憶Ｔ（ＴＣＭ）細胞の濃縮は、ＣＤ４発現に基づいて選択された細胞のネガティブ画分を用いて出発して実施され、これは、ＣＤ１４およびＣＤ４５ＲＡの発現に基づくネガティブ選択およびＣＤ６２Ｌに基づくポジティブ選択に付される。このような選択は、一部の態様では、同時に実施され、他の態様では、いずれかの順序で逐次実施される。一部の態様では、ＣＤ８＋細胞集団または亜集団の調製において使用される同一ＣＤ４発現ベースの選択工程はまた、ＣＤ４＋細胞集団または亜集団を作製するために使用され、その結果、ＣＤ４ベースの分離から得られたポジティブおよびネガティブ画分の両方が保持され、方法のその後の工程、適宜、以下の１つまたは複数のさらなるポジティブまたはネガティブ選択工程において使用される。一部の実施形態では、ＣＤ４＋細胞集団の選択およびＣＤ８＋細胞集団の選択は、同時に実施される。一部の実施形態では、ＣＤ４＋細胞集団およびＣＤ８＋細胞集団の選択は、いずれかの順序で逐次実施される。一部の実施形態では、細胞を選択するための方法としては、公開された米国特許出願公開第２０１７００３７３６９号に記載されるものを挙げることができ、なお、特許は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
特定の実施形態では、生物学的試料、例えば、ＰＢＭＣまたは他の白血球の試料がＣＤ４＋Ｔ細胞の選択に付され、ネガティブおよびポジティブ画分の両方が保持される。ある特定の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ネガティブ画分から選択される。一部の実施形態では、生物学的試料は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の選択に付され、ネガティブおよびポジティブ画分の両方が保持される。ある特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ネガティブ画分から選択される。
一部の実施形態では、それぞれ、ＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮した集団およびＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮した集団を生成するために、ＣＤ４に特異的に結合する選択剤およびＣＤ８に特異的に結合する選択剤が使用される。
特定の例では、ＰＢＭＣの試料または他の白血球細胞試料がＣＤ４＋細胞の選択に付され、ネガティブおよびポジティブ画分の両方が保持される。ネガティブ画分は、次いで、ＣＤ１４およびＣＤ４５ＲＡまたはＣＤ１９の発現に基づくネガティブ選択および中枢記憶Ｔ細胞に特徴的なマーカー、例えば、ＣＤ６２ＬまたはＣＣＲ７に基づいたポジティブ選択に付され、ポジティブおよびネガティブ選択は、いずれかの順序で実施される。
ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することによってナイーブ、中枢記憶およびエフェクター細胞に選別される。ＣＤ４＋リンパ球は、標準方法によって得ることができる。一部の実施形態では、ナイーブＣＤ４＋Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、中枢記憶ＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４５ＲＯ＋である。一部の実施形態では、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ－およびＣＤ４５ＲＯ－である。
一部の実施形態では、選択マーカーは、Ｔ細胞共受容体である；選択マーカーは、Ｔ細胞抗原受容体複合体のメンバーであるか、もしくは、それを含有する；選択マーカーは、ＣＤ３鎖であるか、もしくはそれを含有する；選択マーカーは、ＣＤ３ゼータ鎖であるか、もしくはそれを含有する；選択マーカーは、ＣＤ８であるか、もしくはそれを含有する；選択マーカーは、ＣＤ４であるか、もしくはそれを含有する；選択マーカーは、ＣＤ４５ＲＡであるか、もしくはそれを含有する；選択マーカーは、ＣＤ２７であるか、もしくはそれを含有する；選択マーカーは、ＣＤ２８であるか、もしくはそれを含有する；および／または選択マーカーは、ＣＣＲ７であるか、もしくはそれを含有する。一部の実施形態では、選択マーカーは、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８からなる群から選択される。一部の実施形態では、選択マーカーはＣＤ３である。
一部の実施形態では、選択剤と選択マーカーの間の特異的結合は、シグナルを誘導しないか、またはＴ細胞に対する刺激性もしくは活性化もしくは増殖性シグナルを誘導しない。一部の実施形態では、選択剤は、ＣＤ３、ＣＤ８またはＣＤ４に結合する一価抗体断片を含む。一部の実施形態では、選択剤は、抗ＣＤ３ Ｆａｂ、抗ＣＤ８ Ｆａｂまたは抗ＣＤ４ Ｆａｂである。一部の実施形態では、選択剤は、抗ＣＤ３ Ｆａｂである。一部の実施形態では、抗ＣＤ３ Ｆａｂは、ＯＫＴ３抗体Ｆａｂ断片を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３ Ｆａｂは、配列番号３１によって示される配列を有する重鎖可変鎖および配列番号３２によって示される配列を有する軽鎖可変鎖を含む。
一部の実施形態では、選択マーカーは、ＣＤ４である場合があり、選択剤はＣＤ４に特異的に結合する。一部の態様では、ＣＤ４に特異的に結合する選択剤は、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ４抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ４抗体の一価抗体断片および抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ４結合分子からなる群から選択され得る。一部の実施形態では、抗ＣＤ４－抗体、例えば、二価抗体断片または一価抗体断片（例えば、ＣＤ４ Ｆａｂ断片）は、抗体１３Ｂ８．２またはＣＤ４に対する特異的結合を保持する１３Ｂ８．２の機能的に活性な突然変異体から導くことができる。例えば、抗体１３Ｂ８．２またはｍ１３Ｂ８．２の例示的突然変異体は、米国特許第７，４８２，０００号、米国特許出願番号ＵＳ２０１４／０２９５４５８または国際特許出願番号ＷＯ２０１３／１２４４７４およびBes, C, et al. J Biol Chem 278, 14265-14273 (2003)に記載されている。「ｍｌ３Ｂ８．２」と呼ばれる突然変異体Ｆａｂ断片は、米国特許第７，４８２，０００号に記載されるように、ＣＤ４結合性マウス抗体１３Ｂ８．２の可変ドメインならびに重鎖のガンマ型の定常ヒトＣＨ１ドメインおよびカッパ型の定常ヒト軽鎖ドメインを含有する定常ドメインを保持する。一部の実施形態では、抗ＣＤ４抗体、例えば、抗体１３Ｂ８．２の突然変異体は、各々Ｋａｂａｔ番号付けによる、軽鎖可変鎖中のアミノ酸置き換えＨ９１Ａ、軽鎖可変鎖中のアミノ酸置き換えＹ９２Ａ、重鎖可変鎖中のアミノ酸置き換えＨ３５Ａおよび／または重鎖可変鎖中のアミノ酸置き換えＲ５３Ａを含有する。一部の態様では、ｍｌ３Ｂ８．２中の１３Ｂ８．２ Ｆａｂ断片の可変ドメインと比較して、軽鎖の９１位のＨｉｓ残基（配列番号３０中の９３位）がＡｌａに突然変異され、重鎖の５３位のＡｒｇ残基（配列番号２９中の５５位）がＡｌａに突然変異される。一部の実施形態では、抗ＣＤ４またはその断片に可逆的に結合される試薬は、市販されているか、または市販されている試薬（例えば、カタログ番号６－８０００－２０６または６－８０００－２０５または６－８００２－１００；ＩＢＡ ＧｍｂＨ、ゲッティンゲン、ドイツ）に由来する。一部の実施形態では、選択剤は、抗ＣＤ４ Ｆａｂ断片を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ４ Ｆａｂ断片は、配列番号２９によって示される配列を有する重鎖可変鎖および配列番号３０によって示される配列を有する軽鎖可変鎖を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ４ Ｆａｂ断片は、配列番号２９によって示される配列を有する重鎖可変鎖のＣＤＲおよび配列番号３０によって示される配列を有する軽鎖可変鎖のＣＤＲを含む。
一部の実施形態では、選択マーカーは、ＣＤ８である場合があり、選択剤はＣＤ８に特異的に結合する。一部の態様では、ＣＤ８に特異的に結合する選択剤は、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ８抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ８抗体の一価抗体断片および抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ８結合分子からなる群から選択され得る。一部の実施形態では、抗ＣＤ８抗体、例えば、二価抗体断片または一価抗体断片（例えば、ＣＤ８ Ｆａｂ断片）は、抗体ＯＫＴ８（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－８０１４）またはＣＤ８に対する特異的結合を保持するその機能的に活性な突然変異体から導くことができる。一部の実施形態では、抗ＣＤ８またはその断片に可逆的に結合される試薬は、市販されているか、または市販されている試薬（例えば、カタログ番号６－８００３または６－８０００－２０１；ＩＢＡ ＧｍｂＨ、ゲッティンゲン、ドイツ）に由来する。一部の実施形態では、選択剤は、抗ＣＤ８ Ｆａｂ断片を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ８ Ｆａｂ断片は、配列番号３６によって示される配列を有する重鎖可変鎖および配列番号３７によって示される配列を有する軽鎖可変鎖を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ８ Ｆａｂ断片は、配列番号３６によって示される配列を有する重鎖可変鎖のＣＤＲおよび配列番号３７によって示される配列を有する軽鎖可変鎖のＣＤＲを含む。
一部の実施形態では、選択マーカーは、ＣＤ３である場合があり、選択剤はＣＤ３に特異的に結合する。一部の態様では、ＣＤ３に特異的に結合する選択剤は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ３抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ３抗体の一価抗体断片および抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ３結合分子からなる群から選択され得る。一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体、例えば、二価抗体断片または一価抗体断片（例えば、ＣＤ３ Ｆａｂ断片）は、抗体ＯＫＴ３（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－８００１；例えば、Stemberger et al. PLoS One. 2012; 7(4): e35798を参照されたい）またはＣＤ３に対する特異的結合を保持するその機能的に活性な突然変異体から導くことができる。一部の実施形態では、抗ＣＤ３またはその断片に可逆的に結合される試薬は、市販されているか、または市販されている試薬（例えば、カタログ番号６－８０００－２０１、６－８００１－１００； ＩＢＡ ＧｍｂＨ、ゲッティンゲン、ドイツ）に由来する。一部の実施形態では、選択剤は、抗ＣＤ３ Ｆａｂ断片を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３ Ｆａｂ断片は、配列番号３１によって示される配列を有する重鎖可変鎖および配列番号３２によって示される配列を有する軽鎖可変鎖を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３ Ｆａｂ断片は、配列番号３１によって示される配列を有する重鎖可変鎖のＣＤＲおよび配列番号３２によって示される配列を有する軽鎖可変鎖のＣＤＲを含む。
上記の例のいずれかにおいて、二価抗体断片は、（Ｆａｂ）２’－断片または二価単鎖Ｆｖ断片である場合があり、一方で、一価抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片および単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択され得る。上記の例のいずれかにおいて、抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子は、アプタマー、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、グルボディ（ｇｌｕｂｏｄｙ）、アンキリン足場に基づくタンパク質、結晶性足場に基づくタンパク質、アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）およびアビマー（ａｖｉｍｅｒ）であり得る。
一部の実施形態では、選択剤は、直接的または間接的に固定相に結合される。一部の実施形態では、選択剤は、選択剤が可逆的に結合する選択試薬を介して間接的に固定相に結合される。一部の実施形態では、選択試薬は、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチンに可逆的に結合するストレプトアビジンのムテイン、ビオチンアナログまたはその生物学的に活性な断片、ストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合するアビジンまたはストレプトアビジンのムテイン、少なくとも２つのキレート化基が遷移金属イオンに結合可能である少なくとも２つのキレート化基Ｋを含有する試薬、オリゴヒスチジン親和性タグに結合可能である薬剤、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼに結合可能である薬剤、カルモジュリンまたはそのアナログ、薬剤カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）に結合可能な薬剤、ＦＬＡＧ－ペプチドに結合可能な薬剤、ＨＡ－タグに結合可能な薬剤、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に結合可能な薬剤、ＨＳＶエピトープに結合可能な薬剤、ｍｙｃエピトープに結合可能な薬剤、またはビオチン化担体タンパク質に結合可能な薬剤であるか、またはそれを含む。
一部の実施形態では、選択試薬は、ビオチンまたは生物学的に活性な断片に可逆的に結合するストレプトアビジンムテインまたはアビジンムテインであるか、またはそれを含有する。一部の実施形態では、選択試薬は、ストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合するストレプトアビジンムテインまたはアビジンムテインであるか、またはそれを含有する。一部の実施形態では、ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子は、ビオチン、ビオチンアナログまたはストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合するか、または可逆的に結合可能である。
ｂ．刺激剤
ある特定の態様では、本明細書において提供される方法は、刺激剤を利用する。一部の実施形態では、節Ｉ－Ｂに記載されるような薬剤は、刺激剤である。一部の実施形態では、刺激剤は、細胞の表面上の分子に結合し、刺激剤と分子の間の結合は、細胞において刺激シグナルを誘導、送達またはモジュレートできる。場合によっては、細胞表面分子（例えば、受容体）は、シグナル伝達分子である。一部のこのような場合には、刺激剤は、１つまたは複数の標的細胞（例えば、Ｔ細胞）によって発現されたシグナル伝達分子に特異的に結合可能である。場合によっては、刺激剤は、細胞表面分子、例えば、受容体への結合の際に細胞（例えば、Ｔ細胞）において刺激シグナルを誘導または送達可能である任意の薬剤である。一部の実施形態では、刺激シグナルは、免疫賦活性である場合があり、その場合には、刺激剤は、免疫応答に関与するか、またはそれを刺激する、例えば、免疫細胞増殖もしくは拡大増殖、免疫細胞活性化、免疫細胞分化、サイトカイン分泌、細胞傷害活性または免疫細胞の１つもしくは複数の他の機能的活性を増大する、細胞（例えば、Ｔ細胞）におけるシグナルを誘導、送達またはモジュレート可能である。一部の実施形態では、刺激シグナルは、阻害性である場合があり、その場合には、刺激剤は、免疫応答に関与するか、またはそれを刺激する、例えば、免疫細胞増殖もしくは拡大増殖、免疫細胞活性化、免疫細胞分化、サイトカイン分泌、細胞傷害活性または免疫細胞の１つもしくは複数の他の機能的活性を阻害するか、または減少させる、細胞（例えば、Ｔ細胞）におけるシグナルを誘導、送達またはモジュレート可能である。
一部の実施形態では、刺激剤は第１の刺激剤である。一部の実施形態では、第１の刺激剤は試料の選択された細胞の表面上の受容体分子に結合する。したがって、一部の場合には、第１の刺激剤は、刺激シグナルを送達し、誘導し、またはモジュレートする。一部の態様では、第１の刺激剤によって刺激シグナルを送達すること、誘導することまたはモジュレートすることは、細胞の刺激を達成する。したがって、一部の場合には、第１の刺激剤は、刺激シグナルを細胞に送達し、それによって細胞を刺激する。一部の実施形態では、第１の刺激剤は、選択マーカーの下方制御をさらに誘導する。本明細書で使用される場合、下方制御は、より早い時点と比較した選択マーカーの発現の低減を包含し得る。
一部の実施形態では、標的細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体および共刺激分子、例えば、ＣＤ２８を含む。この場合には、第１の刺激剤は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体に結合し、それによって、Ｔ細胞において刺激シグナルを送達し、第２の刺激剤は、共刺激性ＣＤ２８分子に結合する。特定の態様では、第１の刺激剤および／または第２の刺激剤は、選択マーカー（例えば、標的細胞（例えば、Ｔ細胞）に固定化するために使用される選択マーカー）の下方制御をさらに誘導する。
一部の実施形態では、第１の刺激剤は、細胞、例えば、Ｔ細胞においてＴＣＲ／ＣＤ３複合体会合刺激シグナルを送達する。一部の実施形態では、第１の刺激剤は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭを含有する分子に特異的に結合する。一部の態様では、第１の刺激剤は、ＣＤ３に特異的に結合する。一部の場合には、ＣＤ３に特異的に結合する第１の刺激剤は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ３抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ３抗体の一価抗体断片および抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ３結合分子からなる群から選択され得る。二価抗体断片は、（Ｆａｂ）２’－断片または二価単鎖Ｆｖ断片である場合があり、一方で、一価抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片および単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択され得る。一部の場合には、抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ３結合分子は、アプタマー、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、グルボディ、アンキリン足場に基づくタンパク質、結晶性足場に基づくタンパク質、アドネクチンまたはアビマーであり得る。
一部の実施形態では、抗ＣＤ３ Ｆａｂ断片は、ハイブリドーマ細胞株ＯＫＴ３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－８００１（商標）；米国特許第４，３６１，５４９号も参照されたい）によって産生されたＣＤ３結合性モノクローナル抗体から導くことができる。抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３の重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインは、Arakawa et al J. Biochem. 120, 657-662 (1996)に記載されており、それぞれ配列番号３１および３２に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、刺激剤は第２の刺激剤である。一部の実施形態では、第２の刺激剤は、細胞の表面上の分子、例えば、細胞表面分子、例えば、受容体分子に結合する。一部の実施形態では、第２の刺激剤は、第１の刺激剤によって結合された分子を介して送達された刺激シグナルを増強する、弱めるまたは改変することができる。一部の実施形態では、第２の刺激剤は、刺激シグナル、例えば、第２の、または追加の刺激シグナルを送達、誘導またはモジュレートする。一部の態様では、第２の刺激剤は、第１の刺激剤によって誘導された刺激シグナルを増強または強化する。一部の実施形態では、第２の刺激剤は、細胞において補助分子に結合する、および／または補助的もしくは二次的刺激シグナルを刺激もしくは誘導できる。一部の態様では、第２の刺激剤は、共刺激分子に結合する、および／または共刺激シグナルを提供する。
一部の実施形態では、第２の刺激剤であり得る刺激剤は、共刺激分子、補助分子、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、免疫チェックポイント分子またはＴＮＦファミリーもしくはＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーであり得る第２の分子に結合する、例えば、特異的に結合する。
一部の実施形態では、細胞、例えば、Ｔ細胞上の分子は、ＣＤ２８である場合があり、刺激剤（例えば、第２の刺激剤であり得る）は、ＣＤ２８に特異的に結合する。一部の態様では、ＣＤ２８に特異的に結合する刺激剤（例えば、第２の刺激剤であり得る）は、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ２８抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ２８抗体の一価抗体断片および抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ２８結合分子からなる群から選択され得る。二価抗体断片は、（Ｆａｂ）２’－断片または二価単鎖Ｆｖ断片である場合があり、一方で、一価抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片および単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択され得る。抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ２８結合分子は、アプタマー、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、グルボディ、アンキリン足場に基づくタンパク質、結晶性足場に基づくタンパク質、アドネクチンおよびアビマーであり得る。
一部の実施形態では、抗ＣＤ２８ Ｆａｂ断片は、抗体ＣＤ２８．３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４５１９７４．１の下で合成単鎖Ｆｖコンストラクトとして寄託されている；Vanhove et al, BLOOD, 15 July 2003, Vol. 102, No. 2, pages 564-570も参照されたい）ならびにそれぞれ配列番号３３および３４を含む重鎖可変鎖および軽鎖から導くことができる。
一部の実施形態では、１つまたは複数の刺激剤は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合性断片である。一部の実施形態では、１つまたは複数の刺激剤は、抗ＣＤ３ Ｆａｂおよび抗ＣＤ２８Ｆａｂである。
一部の実施形態では、細胞、例えば、Ｔ細胞上の分子は、ＣＤ９０であり、刺激剤（例えば、第２の刺激剤であり得る）は、ＣＤ９０に特異的に結合する。一部の態様では、ＣＤ９０に特異的に結合する刺激剤（例えば、第２の刺激剤であり得る）は、抗ＣＤ９０－抗体、抗ＣＤ９０抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ９０抗体の一価抗体断片および抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ９０結合分子からなる群から選択され得る。抗体または抗原結合性断片は、任意の当技術分野で公知のものから導くことができる。例えば、抗ＣＤ９０抗体Ｇ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０５２０１）を参照されたい。
一部の実施形態では、細胞、例えば、Ｔ細胞上の分子はＣＤ９５であり、刺激剤（例えば、第２の刺激剤であり得る）は、ＣＤ９５に特異的に結合する。一部の態様では、ＣＤ９５に特異的に結合する刺激剤（例えば、第２の刺激剤であり得る）は、抗ＣＤ９５抗体、抗ＣＤ９５抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ９５抗体の一価抗体断片および抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ９５結合分子からなる群から選択され得る。抗体または抗原結合性断片は、任意の当技術分野で公知のものから導くことができる。例えば、一部の態様では、抗ＣＤ９０抗体は、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ９５ ＣＨ１１（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ニューヨーク州、レイク・プラシッド）である場合がある、またはPaulsen et al. Cell Death & Differentiation 18.4 (2011): 619-631に記載されるような、抗ＣＤ９５ ｍＡｂ ７Ｃ１１もしくは抗ＡＰＯ－１であり得る。
一部の実施形態では、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞上の分子は、ＣＤ１３７である場合があり、刺激剤（例えば、第２の刺激剤であり得る）は、ＣＤ１３７に特異的に結合する。一部の態様では、ＣＤ１３７に特異的に結合する刺激剤（例えば、第２の刺激剤であり得る）は、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ１３７抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ１３７抗体の一価抗体断片および抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ１３７結合分子からなる群から選択され得る。抗体または抗原結合性断片は、任意の当技術分野で公知のものから導くことができる。例えば、抗ＣＤ１３７抗体は、Taraban et al. Eur J Immunol. 2002 Dec;32(12):3617-27に記載されるように、ＬＯＢ１２、ＩｇＧ２ａまたはＬＯＢ１２．３、ＩｇＧ１であり得る。例えば、ＵＳ６５６９９９７、ＵＳ６３０３１２１、Mittler et al. Immunol Res. 2004;29(1-3):197-208も参照されたい。
一部の実施形態では、細胞、例えば、Ｂ細胞上の分子は、ＣＤ４０である場合があり、刺激剤、例えば、刺激剤（例えば、第２の刺激剤、例えば、第２の刺激剤であり得る）は、ＣＤ４０に特異的に結合する。一部の態様では、ＣＤ４０に特異的に結合する刺激剤（第２の刺激剤、例えば、第２の刺激剤であり得る）は、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４０抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ４０抗体の一価抗体断片および抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ４０結合分子からなる群から選択され得る。
一部の実施形態では、細胞、例えば、Ｔ細胞上の分子は、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）である場合があり、刺激剤（例えば、第２の刺激剤であり得る）は、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合する。一部の態様では、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合する刺激剤（例えば、第２の刺激剤であり得る）は、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ４０Ｌ抗体の一価抗体断片および抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ４０Ｌ結合分子からなる群から選択され得る。抗体または抗原結合性断片は、任意の当技術分野で公知のものから導くことができる。例えば、抗ＣＤ４０Ｌ抗体は、Blair et al. JEM vol. 191 no. 4 651-660に記載されるように、一部の態様では、Ｈｕ５Ｃ８であり得る。例えば、ＷＯ１９９９０６１０６５、ＵＳ２００１００２６９３２、ＵＳ７５４７４３８、ＷＯ２００１０５６６０３も参照されたい。
一部の実施形態では、細胞、例えば、Ｔ細胞上の分子は、誘導性Ｔ細胞共刺激分子（ＩＣＯＳ）である場合があり、刺激剤（例えば、第２の刺激剤であり得る）はＩＣＯＳに特異的に結合する。一部の態様では、ＩＣＯＳに特異的に結合する刺激剤（例えば、第２の刺激剤であり得る）は、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＩＣＯＳ抗体の二価抗体断片、抗ＩＣＯＳ抗体の一価抗体断片および抗体様結合特性を有するタンパク質性ＩＣＯＳ結合分子からなる群から選択され得る。抗体または抗原結合性断片は、任意の当技術分野で公知のものから導くことができる。例えば、ＵＳ２００８０２７９８５１およびDeng et al. Hybrid Hybridomics. 2004 Jun;23(3):176-82を参照されたい。
一部の実施形態では、細胞、例えば、Ｔ細胞上の分子は、Ｔ細胞の活性化のためのリンカー（ＬＡＴ）である場合があり、刺激剤（例えば、第２の刺激剤であり得る）は、ＬＡＴに特異的に結合する。一部の態様では、ＬＡＴに特異的に結合する刺激剤（例えば、第２の刺激剤であり得る）は、抗ＬＡＴ抗体、抗ＬＡＴ抗体の二価抗体断片、抗ＬＡＴ抗体の一価抗体断片および抗体様結合特性を有するタンパク質性ＬＡＴ結合分子からなる群から選択され得る。抗体または抗原結合性断片は、任意の当技術分野で公知のものから導くことができる。
一部の実施形態では、細胞、例えば、Ｔ細胞上の分子は、ＣＤ２７である場合があり、刺激剤（例えば、第２の刺激剤であり得る）は、ＣＤ２７に特異的に結合する。一部の態様では、ＣＤ２７に特異的に結合する刺激剤（例えば、第２の刺激剤であり得る）は、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ２７抗体の二価抗体断片、抗ＣＤ２７抗体の一価抗体断片および抗体様結合特性を有するタンパク質性ＣＤ２７結合分子からなる群から選択され得る。抗体または抗原結合性断片は、任意の当技術分野で公知のものから導くことができる。例えば、ＷＯ２００８０５１４２４を参照されたい。
一部の実施形態では、細胞、例えば、Ｔ細胞上の分子は、ＯＸ４０である場合があり、刺激剤（例えば、第２の刺激剤であり得る）は、ＯＸ４０に特異的に結合する。一部の態様では、ＯＸ４０に特異的に結合する刺激剤（例えば、第２の刺激剤であり得る）は、抗ＯＸ４０抗体、抗ＯＸ４０抗体の二価抗体断片、抗ＯＸ４０抗体の一価抗体断片および抗体様結合特性を有するタンパク質性ＯＸ４０結合分子からなる群から選択され得る。抗体または抗原結合性断片は、任意の当技術分野で公知のものから導くことができる。例えば、ＷＯ２０１３０３８１９１、Melero et al. Clin Cancer Res. 2013 Mar 1;19(5):1044-53を参照されたい。
一部の実施形態では、細胞、例えば、Ｔ細胞上の分子は、ＨＶＥＭである場合があり、刺激剤（例えば、第２の刺激剤であり得る）は、ＨＶＥＭに特異的に結合する。一部の態様では、ＨＶＥＭに特異的に結合する刺激剤（例えば、第２の刺激剤であり得る）は、抗ＨＶＥＭ抗体、抗ＨＶＥＭ抗体の二価抗体断片、抗ＨＶＥＭ抗体の一価抗体断片および抗体様結合特性を有するタンパク質性ＨＶＥＭ結合分子からなる群から選択され得る。抗体または抗原結合性断片は、任意の当技術分野で公知のものから導くことができる。例えば、ＷＯ２００６０５４９６１、ＷＯ２００７００１４５９、Park et al. Cancer Immunol Immunother. 2012 Feb;61(2):203-14を参照されたい。
上記の例のいずれかにおいて、二価抗体断片は、（Ｆａｂ）２’断片または二価単鎖Ｆｖ断片である場合があり、一方で、一価抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片および単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択され得る。上記の例のいずれかにおいて、抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子は、アプタマー、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、グルボディ、アンキリン足場に基づくタンパク質、結晶性足場に基づくタンパク質、アドネクチンおよびアビマーであり得る。
一部の態様では、刺激剤は、標的細胞の表面上に発現される分子を特異的に標的とし、これでは、分子は、ＴＣＲ、キメラ抗原受容体または免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフもしくはＩＴＡＭを含む分子である。例えば、標的細胞の表面上に発現される分子は、Ｔ細胞もしくはＢ細胞抗原受容体複合体、ＣＤ３鎖、ＣＤ３ゼータ、Ｔ細胞受容体もしくはＢ細胞受容体の抗原結合性部分またはキメラ抗原受容体から選択される。一部の場合には、刺激剤は、ペプチド：ＭＨＣクラスＩ複合体を標的とする。
一部の実施形態では、刺激剤は、標的細胞の表面上に発現される分子のＨｉｓタグ付き細胞外ドメインに結合する。一部の場合には、刺激剤は、ニッケル電荷を有するｔｒｉｓＮＴＡ（Ｈｉｓ－ＳＴＲＥＰＰＥＲまたはＨｉｓ／Ｓｔｒｅｐ－タグ（登録商標）ＩＩアダプターとも呼ばれる）とコンジュゲートされたペプチド配列Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（Ｓｔｒｅｐ－タグ（登録商標）ＩＩとも呼ばれる、配列番号８に示される）を含有する。一部の実施形態では、Ｈｉｓタグ付きである標的細胞の表面上に発現された分子は、ＣＤ１９である。
一部の実施形態では、刺激剤は、組換え受容体の抗体部分、例えば、ＣＡＲに特異的に結合する。一部の場合には、組換え受容体の抗体部分は、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分、例えば、ヒンジ領域、例えば、ＩｇＧ４ヒンジ領域および／またはＣＨ１／ＣＬおよび／またはＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、定常領域または部分は、ヒトＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１のものである。一部の場合には、試薬には、ＩｇＧ４スペーサーを認識するαＩｇＧが負荷されている。
一部の実施形態では、所望の標的は、Ｔ細胞受容体および／またはＴ細胞受容体の構成要素である。ある特定の実施形態では、所望の標的はＣＤ３である。ある特定の実施形態では、所望の標的は、Ｔ細胞共刺激分子、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１－ＢＢ）、ＯＸ４０またはＩＣＯＳである。
一部の実施形態では、例えば、刺激剤が刺激剤（例えば、オリゴマー刺激試薬）または選択試薬に結合していない場合は、刺激剤は、抗体、二価抗体断片、Ｆ（ａｂ）２または二価単鎖Ｆｖ断片である。
一部の実施形態では、刺激剤または１つもしくは複数の刺激剤のうち各々は、試薬への結合のための結合パートナーＣをさらに含有する。一部の実施形態では、刺激剤、１つまたは複数の刺激剤のうち各々は、ビオチン、ストレプトアビジンまたはアビジンに可逆的に結合するビオチンアナログ、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号８）、Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１５）、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１７）、ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１６）、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１８）およびＴｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１９）からなる群から選択されるストレプトアビジン結合ペプチド、カルモジュリンに可逆的に結合するカルモジュリン結合ペプチド、ＦＬＡＧペプチドに結合する抗体に可逆的に結合するＦＬＡＧペプチドおよびオリゴヒスチジンタグに結合する抗体に可逆的に結合するオリゴヒスチジンタグをさらに含有する。
一部の実施形態では、試薬は、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテイン、アビジン（ａｖｉｄｉｎｇ）またはアビジンムテインであるか、またはそれを含有し、刺激剤または１つもしくは複数の刺激剤の各々は、このような試薬に結合できる結合パートナーＣ、例えば、ビオチン、ビオチンアナログまたはストレプトアビジン結合ペプチドを含有する。一部の実施形態では、刺激剤または１つもしくは複数の刺激剤の各々は、ビオチン、ストレプトアビジンまたはアビジンに可逆的に結合するビオチンアナログ、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号８）、Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１５）、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１７）、ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１６）、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１８）およびＴｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１９）からなる群から選択されるストレプトアビジン結合ペプチドをさらに含む。特定の実施形態では、試薬は、ストレプトアビジンムテイン（例えば、配列番号６に示される）であるか、またはそれを含有し、結合パートナーＣは、ストレプトアビジン結合ペプチド、例えば、配列番号８または１５～１９のいずれか１つに示されるいずれかのものである。一部の実施形態では、刺激剤または１つもしくは複数の刺激剤の各々は、配列ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１６）を有するストレプトアビジン結合ペプチドをさらに含む。
２．試薬
一部の実施形態では、試薬（例えば、選択剤または刺激試薬）は、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）によって含まれる結合パートナーＣに可逆的に結合可能である１つまたは複数の結合部位Ｚを含有する。一部の実施形態では、試薬は、複数の結合部位Ｚを含有し、その各々は、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）中に含まれる結合パートナーＣに特異的に結合可能であり、その結果、試薬は、複数の薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）に可逆的に結合可能である、例えば、多量体化試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬）である。一部の実施形態では、試薬は、個々の分子（例えば、単量体）のオリゴマーまたはポリマーまたは個々の分子を構成する複合体（例えば、四量体）であり、各々、少なくとも１つの結合部位Ｚを含有する。一部の実施形態では、試薬は、少なくとも２つの結合部位Ｚ、少なくとも３つの結合部位Ｚ、少なくとも４つの結合部位Ｚ、例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２またはそれより多い結合部位Ｚを含有する。結合部位は全て、同一である場合があり、または複数の結合部位が１つもしくは複数の異なる結合部位（例えば、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３等）を含有する場合がある。
一部の実施形態では、２つまたはそれより多い薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）は、試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬）上に存在する１つまたは複数の結合部位Ｚを介して試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬）と会合する、例えば、可逆的に結合される。一部の場合には、これは、互いに近接して配置されている薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）をもたらし、その結果、（少なくとも２コピーの）細胞表面分子を有する標的細胞が、特定の分子に結合できる１つまたは複数の結合部位Ｂを有する薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）と接触される場合に、アビディティ効果が起こる場合がある。
一部の実施形態では、同一である、すなわち、同一の結合部位Ｂを含有する２つまたはそれより多い異なる薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）は、試薬に可逆的に結合され得る。一部の実施形態では、少なくとも２種の異なる（種類の）薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）、一部の場合には、３種または４種の異なる（種類の）薬剤、例えば、２種またはそれより多い異なる選択剤および／または刺激剤を使用すること可能である。例えば、一部の実施形態では、試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬）は、結合部位Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３またはＢ４等を含有する第１の薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）および別の結合部位、例えば、結合部位Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３またはＢ４のうち別のものを含有する第２の薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）に可逆的に結合され得る。一部の場合には、第１の薬剤および第２の薬剤の結合部位は、同一である場合がある。例えば、一部の態様では、少なくとも２種の薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）の各々は、同一分子に結合し得る。一部の場合には、第１の薬剤および第２の薬剤の結合部位は、異なる場合がある。一部の態様では、少なくとも２種の薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）の各々は、異なる分子、例えば、第１の分子、第２の分子等に結合し得る。一部の場合には、異なる分子、例えば、細胞表面分子は、同一標的細胞上に存在し得る。他の場合には、異なる分子、例えば、細胞表面分子は、細胞の同一集団中に存在する異なる標的細胞上に存在し得る。一部の場合には、第３、第４等の薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）は、各々がさらなる異なる結合部位を含有する同一試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬）と会合し得る。
一部の実施形態では、２つまたはそれより多い異なる（例えば、選択剤または刺激剤）は、同一結合パートナーＣを含有する。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い異なる薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）は、異なる結合パートナーを含有する。一部の態様では、第１の薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）は、試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬）上に存在する結合部位Ｚ１に特異的に結合し得る結合パートナーＣ１を有する場合があり、第２の薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）は、試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬）上に存在する結合部位Ｚ１もしくは結合部位Ｚ２に特異的に結合し得る結合パートナーＣ２に結合する場合がある。したがって、場合によっては、試薬によって含まれる複数の結合部位Ｚは、結合部位Ｚ１およびＺ２を含み、それらはそれぞれ、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）によって含まれる結合パートナーＣ１およびＣ２に可逆的に結合可能である。一部の実施形態では、Ｃ１およびＣ２は同一であり、ならびに／またはＺ１およびＺ２は同一である。他の態様では、複数の結合部位Ｚのうち１つまたは複数が異なっている場合がある。他の例では、複数の結合パートナーＣのうち１つまたは複数が異なっている場合がある。結合パートナーＣの各々が、結合部位Ｚのうち１つと相互作用できる、例えば、特異的に結合できる限り、結合部位Ｚを含有する試薬と適合する異なる結合パートナーＣのうちいずれかの組合せを選択することは当業者のレベル内である。
一部の実施形態では、試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬）は、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテインもしくはアナログ、アビジン、アビジンムテインもしくはアナログ（例えば、ニュートラアビジン）またはその混合物であり、このような試薬は、結合パートナーＣとの可逆的会合のために１つまたは複数の結合部位Ｚを含有する。一部の実施形態では、結合パートナーＣは、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテインもしくはアナログ、アビジンもしくはアビジンムテインもしくはアナログに特異的に結合できる、ビオチン、ビオチン誘導体もしくはアナログまたはストレプトアビジン結合ペプチドまたは他の分子であり得る。一部の実施形態では、試薬は、ビオチン、ビオチンアナログもしくはその生物学的に活性な断片に可逆的に結合する、ストレプトアビジン、アビジン、ストレプトアビジンのアナログもしくはムテインまたはアナログもしくはムテインもしくはアビジンであるか、またはそれを含有する。一部の実施形態では、試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬）は、ストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、ストレプトアビジンのアナログもしくはムテインまたはアビジンのアナログもしくはムテインであるか、またはそれを含有する。一部の実施形態では、物質（例えば、競合剤または遊離結合剤）は、１つもしくは複数の結合部位Ｚについて結合パートナーＣと結合について競合可能である、ビオチン、ビオチン誘導体もしくはアナログまたはストレプトアビジン結合ペプチドであり得る。一部の実施形態では、結合パートナーＣおよび物質（例えば、競合剤または遊離結合剤）は異なっており、物質（例えば、競合剤または遊離結合剤）は、結合パートナーの親和性と比較して１つまたは複数の結合部位Ｚについてより高い結合親和性を示す。
一部の実施形態では、ストレプトアビジンは、野生型ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテインまたはアナログ、例えば、ストレプトアビジン様ポリペプチドであり得る。同様に、アビジンには、一部の態様では、野生型アビジンまたはアビジンのムテインまたはアナログ、例えば、ニュートラアビジン、通常、より中性のｐｉを示し、天然アビジンの代替物として利用可能である改変アルギニンを有する脱グリコシル化アビジンが含まれる。一般に、アビジンの脱グリコシル化された中性形態には、市販の形態のもの、例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈを介して入手可能である「Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ」またはＴｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃもしくはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である「ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ」等が含まれる。
一部の実施形態では、試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬）は、ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテインまたはアナログである。一部の実施形態では、野生型ストレプトアビジン（ｗｔ－ストレプトアビジン）は、Argarana et al, Nucleic Acids Res. 14 (1986) 1871-1882（配列番号１）によって開示されるアミノ酸配列を有する。一般に、ストレプトアビジンは、４つの同一サブユニットの四量体として天然に生じる、すなわち、ホモ四量体であり、各サブユニットは、ビオチン、ビオチン誘導体またはアナログまたはビオチンミミックに対する単一の結合部位を含有する。ストレプトアビジンサブユニットの例示的配列は、配列番号１で示されるアミノ酸の配列であるが、このような配列はまた、他のストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の種からの相同体中に存在する配列も含む。特に、ストレプトアビジンの各サブユニットは、ビオチンに対して強力な結合親和性を示す場合があり、約１０－１４Ｍほどの平衡解離定数（ＫＤ）を有する。一部の場合には、ストレプトアビジンは、４つの結合部位のうち１つのみが機能的である一価四量体（Howarth et al. (2006) Nat. Methods、3:267-73； Zhang et al. (2015) Biochem. Biophys. Res. Commun.、463:1059-63)）、４つの結合部位のうち２つが機能的である二価四量体（Fairhead et al. (2013) J. Mol. Biol., 426:199-214）として存在する場合があり、または単量体もしくは二量体形態で存在する場合がある（Wu et al. (2005) J. Biol. Chem., 280:23225-31； Lim et al. (2010) Biochemistry, 50:8682-91）。
一部の実施形態では、ストレプトアビジンは、ビオチン、ビオチン誘導体もしくはアナログもしくはビオチンミミックに対する結合部位を含有する少なくとも１つの機能的サブユニットを含む、任意の形態、例えば、野生型または未改変ストレプトアビジン、例えば、ストレプトマイセス属の種に由来するストレプトアビジンまたはその機能的に活性な断片であり得る、例えば、一般に、配列番号１に示されるストレプトマイセス・アビジニー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ）由来の野生型ストレプトアビジンの少なくとも１つの機能的サブユニットまたはその機能的に活性な断片を含有する。例えば、一部の実施形態では、ストレプトアビジンは、Ｎ末端および／またはＣ末端で短縮されている、野生型ストレプトアビジンの断片を含む場合がある。このような最小のストレプトアビジンには、配列番号１のアミノ酸位置１０～１６の領域中でＮ末端で始まり、配列番号１のアミノ酸位置１３３～１４２の領域中でＣ末端で終結する任意のものを含まれる。一部の実施形態では、ストレプトアビジンの機能的に活性な断片は、配列番号２に示されるアミノ酸の配列を含有する。一部の実施形態では、配列番号２に示されるものなどのストレプトアビジンは、配列番号１に示された番号付けでＡｌａ１３に対応する位置にＮ末端メチオニンをさらに含有する場合がある。ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン中の残基の位置への言及は、配列番号１中の残基の番号付けに関連している。
一部の態様では、ストレプトアビジンムテインは、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失または付加によって未改変または野生型ストレプトアビジンの配列とは区別されるが、ビオチン、ビオチン誘導体またはアナログまたはストレプトアビジン結合ペプチドに対する結合部位を含有する少なくとも１つの機能的サブユニットを含むポリペプチドを含む。一部の態様では、ストレプトアビジン様ポリペプチドおよびストレプトアビジンムテインは、野生型ストレプトアビジンと本質的に免疫学的に同等であり、特に、ｗｔ－ストレプトアビジンと同一もしくは異なる親和性でビオチン、ビオチン誘導体またはビオチンアナログと結合可能であるポリペプチドであり得る。一部の場合には、ストレプトアビジン様ポリペプチドまたはストレプトアビジンムテインは、野生型ストレプトアビジンの一部ではないアミノ酸を含有する場合があるか、または野生型ストレプトアビジンの一部のみを含む場合がある。一部の実施形態では、宿主が宿主によって産生されたポリペプチドを野生型ストレプトアビジンの構造に変換するために必要である酵素を有さないので、ストレプトアビジン様ポリペプチドは、野生型ストレプトアビジンと同一ではないポリペプチドである。一部の実施形態では、ストレプトアビジンはまた、ストレプトアビジン四量体およびストレプトアビジンダイマー、特に、ストレプトアビジンホモ四量体、ストレプトアビジンホモダイマー、ストレプトアビジンヘテロ四量体およびストレプトアビジンヘテロダイマーとして存在する場合がある。一般に、各サブユニットは、普通、ビオチンまたはビオチンアナログに対する、またはストレプトアビジン結合ペプチドに対する結合部位を有する。ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテインの例は、例えば、ＷＯ８６／０２０７７、ＤＥ１９６４１８７６Ａｌ、ＵＳ６，０２２，９５１、ＷＯ９８／４０３９６またはＷＯ９６／２４６０６に記載されている。
一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、未改変または野生型ストレプトアビジンの一部ではないアミノ酸を含有する場合があり、または野生型または未改変ストレプトアビジンの一部のみを含む場合がある。一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、未改変または野生型ストレプトアビジンのサブユニットと比較して、例えば、配列番号１に示される野生型ストレプトアビジンサブユニットまたは例えば、配列番号２に示されるその機能的に活性な断片と比較して、もう１つのアミノ酸置換（置き換え）を有する場合がある少なくとも１つのサブユニットを含有する。一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインの少なくとも１つのサブユニットは、野生型もしくは未改変ストレプトアビジンと比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０のアミノ酸の相違を有する場合がある、および／または配列番号１もしくは２に示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより多い配列同一性を示すアミノ酸配列を含む少なくとも１つのサブユニットを含有し、このようなストレプトアビジンムテインは、ビオチン、ビオチン誘導体またはアナログまたはビオチンミミックに結合する機能活性を示す。一部の実施形態では、アミノ酸置き換え（置換）は、保存的突然変異である場合も非保存的突然変異である場合もある。ストレプトアビジンムテインの例は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第５，１６８，０４９号、同５，５０６，１２１号、同６，０２２，９５１号、同６，１５６，４９３号、同６，１６５，７５０号、同６，１０３，４９３号または同６，３６８，８１３号または国際公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１４／０７６２７７を参照されたい。
一部の実施形態では、ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテインは、ビオチン、ビオチン誘導体またはアナログまたはストレプトアビジン結合ペプチドに対する１つまたは複数の結合部位Ｚを含有する１つまたは１つより多い機能的サブユニット、例えば、２つもしくはそれより多い、３つもしくはそれより多い、４つもしくはそれより多い、および一部の場合には、５、６、７、８、９、１０、１１、１２もしくはそれより多い機能的サブユニットを含有するタンパク質を含む。一部の実施形態では、ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテインは、単量体、ヘテロ二量体もしくはホモ二量体を含む二量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体、一価四量体もしくは二価四量体を含む四量体を含み得る、またはそのより高次の多量体もしくはオリゴマーを含み得る。
一部の実施形態では、ペプチドリガンド結合パートナーに対するストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテインの結合親和性は、１×１０－４Ｍ、５×１０－４Ｍ、１×１０－５Ｍ、５×１０－５Ｍ、１×１０－６Ｍ、５×１０－６Ｍまたは１×１０－７Ｍ未満であるが、一般に、１×１０－１３Ｍ、１×１０－１２Ｍまたは１×１０－１１Ｍよりも大きい。例えば、米国特許第５，５０６，１２１号に開示されるもの等のペプチド配列（Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ）は、ビオチンミミックとして作用でき、ストレプトアビジンに対する結合親和性を実証し、例えば、およそ１０－４Ｍから１０－５Ｍの間のＫＤを有する。一部の場合には、結合親和性は、ストレプトアビジン分子内に突然変異を作製することによってさらに改善され得る、例えば、米国特許第６，１０３，４９３号または国際公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１４／０７６２７７を参照されたい。一部の実施形態では、結合親和性は、当技術分野で公知の方法、例えば、以下に記載される任意のものによって決定され得る。
一部の実施形態では、試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬）、例えば、ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテインは、ストレプトアビジン結合ペプチドに対する結合親和性を示し、ストレプトアビジン結合ペプチドは、薬剤（例えば、選択剤または刺激剤）中に存在する結合パートナーＣであり得る。一部の実施形態では、ストレプトアビジン結合ペプチドは、配列番号９に示される一般式を有する配列を含有する、例えば、配列番号１０に示される配列を含有する。一部の実施形態では、ストレプトアビジン結合ペプチドは、配列番号１１に示される一般式、例えば、配列番号１２に示されるものを有する。一例では、ストレプトアビジン結合ペプチドは、Ｔｒｐ－Ａｒｇ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）とも呼ばれる、配列番号７に示される）である。一例では、ストレプトアビジン結合ペプチドは、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）ＩＩとも呼ばれる、配列番号８に示される）である。一部の実施形態では、ストレプトアビジン結合ペプチドは、少なくとも２つのストレプトアビジン結合モジュールの連続配置を含有し、２つのモジュール間の距離は、少なくとも０であり、５０アミノ酸を超えず、１つの結合モジュールは３～８個のアミノ酸を有し、少なくとも配列Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｘａａ（配列番号９）を含有し、Ｘａａはグルタミン、アスパラギンまたはメチオニンであり、他の結合モジュールは、配列番号１１に示されるものなどの同一または異なるストレプトアビジンペプチドリガンドを有する（例えば、国際公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ０２／０７７０１８、米国特許第７，９８１，６３２号を参照されたい）。一部の実施形態では、ストレプトアビジン結合ペプチドは、配列番号１３または１４のいずれかに示される式を有する配列を含有する。一部の実施形態では、ストレプトアビジン結合ペプチドは、配列番号１５～１９のいずれかに示されるアミノ酸の配列を有する。
一部の実施形態では、試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬）は、ストレプトアビジンムテインであるか、またはそれを含有する。一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは配列番号１に示される野生型ストレプトアビジンまたはその生物学的に活性な部分と比較して１つまたは複数の突然変異（例えば、アミノ酸置き換え）を含有する。例えば、ストレプトアビジンの生物学的に活性な部分は、Ｎ末端および／またはＣ末端で短縮されており、一部の場合には、最小ストレプトアビジンと呼ばれるストレプトアビジン変異体を含む場合もある。一部の実施形態では、いずれかの突然変異を行うことができるＮ末端で短縮された最小ストレプトアビジンは、配列番号１に示される配列と比較して、アミノ酸位置１０～１６の領域中でＮ末端で始まり、アミノ酸位置１３３～１４２の領域中でＣ末端で終結する。一部の実施形態では、いずれかの突然変異を行うことができるＮ末端で短縮されたストレプトアビジンは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含有する。一部の実施形態では、最小ストレプトアビジンは、Ａｌａ１３～Ｓｅｒ１３９位のアミノ酸配列を含有し、Ａｌａ１３の代わりにＮ末端メチオニン残基を有してもよい。本明細書における目的のために、アミノ酸位置の番号付けは、配列番号１に示されるｗｔ－ストレプトアビジンの番号付けを全体を通して指す（例えば、Argarana et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986), 1871-1882、図３も参照されたい）。
一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、米国特許第６，１０３，４９３号に記載されるような突然変異体である。一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、配列番号１に示されるもの等の野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列に基づいて、アミノ酸位置４４～５３の領域内に少なくとも１つの突然変異を含有する。一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、１つまたは複数の残基４４、４５、４６および／または４７に突然変異を含有する。一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、野生型ストレプトアビジンの４４位のＧｌｕの疎水性脂肪族アミノ酸、例えば、Ｖａｌ、Ａｌａ、ＩｌｅまたはＬｅｕでの置き換え、４５位の任意のアミノ酸、４６位の脂肪族アミノ酸、例えば、疎水性脂肪族アミノ酸および／または４７位のＶａｌの塩基性アミノ酸、例えば、ＡｒｇもしくはＬｙｓ、例えば、一般に、Ａｒｇでの置き換えを含有する。一部の実施形態では、Ａｌａが４６位にあり、および／またはＡｒｇが４７位にあり、および／またはＶａｌもしくはＩｌｅが４４位にある。一部の実施形態では、ストレプトアビジン突然変異体は、配列番号３または配列番号４に示されるアミノ酸の配列を含有する例示的ストレプトアビジンムテイン（ストレプトアビジン突然変異体１、ＳＡＭ１としても知られる）に示されるもの等の残基Ｖａｌ４４－Ｔｈｒ４５－Ａｌａ４６－Ａｒｇ４７を含有する。一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、配列番号５または６に示されるアミノ酸の配列を含有する例示的ストレプトアビジンムテイン（ＳＡＭ２としても知られる）に示されるもの等の残基Ｉｌｅ４４－Ｇｌｙ４５－Ａｌａ４６－Ａｒｇ４７を含有する。一部の場合には、このようなストレプトアビジンムテインは、例えば、米国特許第６，１０３，４９３号に記載されており、商標Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）の下で市販されている。
一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、国際公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１４／０７６２７７に記載されるような突然変異体である。一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、配列番号１に示されるアミノ酸位置に関連してアミノ酸位置４４～５３の領域中に少なくとも２つのシステイン残基を含有する。一部の実施形態では、システイン残基は４５位および５２位に存在して、これらのアミノ酸をつなげるジスルフィド橋を作出する。このような一実施形態では、アミノ酸４４は通常グリシンまたはアラニンであり、アミノ酸４６は通常アラニンまたはグリシンであり、アミノ酸４７は通常アルギニンである。一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、配列番号１に示されるアミノ酸位置に関連してアミノ酸残基１１５～１２１の領域中に少なくとも１つの突然変異またはアミノ酸相違を含有する。一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、アミノ酸位置１１７、１２０および１２１に少なくとも１つの突然変異ならびに／またはアミノ酸１１８および１１９の欠失および少なくともアミノ酸位置１２１の置換を含有する。
一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、１１７位に対応する位置に突然変異を含有し、この突然変異は、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＰｈｅのような大きな疎水性残基へ、またはＧｌｕ、ＡｓｐもしくはＡｒｇのような荷電残基へ、またはＡｓｎもしくはＧｉｎのような親水性の残基へ、一部の場合には、疎水性残基Ｌｅｕ、ＭｅｔもしくはＡｌａへ、または極性残基Ｔｈｒ、ＳｅｒもしくはＨｉｓへであり得る。一部の実施形態では、１１７位での突然変異は、ＳｅｒもしくはＡｌａもしくはＧｌｙのような小さい残基へであり得る１２０位に対応する位置での突然変異および疎水性残基、例えば、Ｔｒｐ、ＴｙｒもしくはＰｈｅのような嵩高い疎水性残基へであり得る１２１位に対応する位置での突然変異と組み合わされる。一部の実施形態では、１１７位での突然変異は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＭｅｔもしくはＶａｌ等の疎水性残基または一般に、ＴｙｒもしくはＰｈｅであり得る、配列番号１に示される野生型ストレプトアビジンまたはその生物学的に活性な断片の１２０位に対応する位置での突然変異ならびにＧｌｙ、ＡｌａもしくはＳｅｒのような小さい残基へ、またはＧｌｎと、またはＬｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ＰｈｅもしくはＭｅｔのような疎水性残基とであり得る、配列番号１に示される野生型ストレプトアビジンまたはその生物学的に活性な断片と比較して１２１位に対応する位置での突然変異と組み合わされる。一部の実施形態では、このようなムテインはまた、残基Ｖａｌ４４－Ｔｈｒ４５－Ａｌａ４６－Ａｒｇ４７または残基Ｉｌｅ４４－Ｇｌｙ４５－Ａｌａ４６－Ａｒｇ４７を含有し得る。一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、残基Ｖａｌ４４、Ｔｈｒ４５、Ａｌａ４６、Ａｒｇ４７、Ｇｌｕ１１７、Ｇｌｙ１２０およびＴｙｒ１２１を含有する。一部の実施形態では、ムテインストレプトアビジンは、配列番号２７もしくは配列番号２８に示されるアミノ酸の配列または配列番号２７もしくは配列番号２８に示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより多い配列同一性を示すアミノ酸の配列を含有し、残基Ｖａｌ４４、Ｔｈｒ４５、Ａｌａ４６、Ａｒｇ４７、Ｇｌｕ１１７、Ｇｌｙ１２０およびＴｙｒ１２１を含有し、ビオチン、ビオチンアナログまたはストレプトアビジン結合ペプチドに結合する機能活性を示す。
一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、上記の突然変異のいずれかを任意の組合せで含有する場合があり、得られたストレプトアビジンムテインは、ペプチドリガンド（Ｔｒｐ－Ａｒｇ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）とも呼ばれる、配列番号７に示される）に対して２．７×１０－４Ｍ未満である、および／またはペプチドリガンド（Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ；Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）ＩＩとも呼ばれる、配列番号８に示される）に対して１．４×１０－４Ｍ未満である、および／または配列番号７～１９のいずれかに示されるペプチドリガンドのいずれかに対して１×１０－４Ｍ、５×１０－４Ｍ、１×１０－５Ｍ、５×１０－５Ｍ、１×１０－６Ｍ、５×１０－６Ｍもしくは１×１０－７Ｍ未満であるが、一般に、１×１０－１３Ｍ、１×１０－１２Ｍまたは１×１０－１１Ｍよりも大きい結合親和性を示し得る。
一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、配列番号３～６、２７もしくは２８のいずれかに示されるアミノ酸の配列または配列番号３～６、２７もしくは２８のいずれかに示されるアミノ酸の配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより大きい配列同一性を示すアミノ酸の配列を示し、ペプチドリガンド（Ｔｒｐ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）とも呼ばれる、配列番号７に示される）に対して２．７×１０－４Ｍ未満である、および／またはペプチドリガンド（Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ；Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）ＩＩとも呼ばれる、配列番号８に示される）に対して１．４×１０－４Ｍ未満である、および／または配列番号７～１９のいずれかに示されるペプチドリガンドのいずれかに対して１×１０－４Ｍ、５×１０－４Ｍ、１×１０－５Ｍ、５×１０－５Ｍ、１×１０－６Ｍ、５×１０－６Ｍもしくは１×１０－７Ｍ未満であるが、一般に、１×１０－１３Ｍ、１×１０－１２Ｍまたは１×１０－１１Ｍよりも大きい結合親和性を示す。
一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、配列番号３～６、２７もしくは２８のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含み、ストレプトアビジン結合ペプチドは、配列番号７～１９のいずれかに示されたアミノ酸の配列を含む。一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、配列番号６に示されたアミノ酸の配列を含み、ストレプトアビジン結合ペプチドは、配列番号７～１９のいずれかに示されたアミノ酸の配列を含む。一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、配列番号３～６、２７または２８のいずれかに示されたアミノ酸の配列を含み、ストレプトアビジン結合ペプチドは、配列番号１６に示されたアミノ酸の配列を含む。一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、配列番号６に示されたアミノ酸の配列を含み、ストレプトアビジン結合ペプチドは、配列番号１６に示されたアミノ酸の配列を含む。
一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインはまた、他のストレプトアビジンリガンド、例えば、それだけには限らないが、ビオチン、イミノビオチン、リポ酸、デスチオビオチン、ジアミノビオチン、ＨＡＢＡ（ヒドロキシアゾベンゼン－安息香酸）および／またはジメチル－ＨＡＢＡへの結合を示す。一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、ビオチンミミックペプチドリガンド、例えば、配列番号７～１９のいずれかに示されるものに対するストレプトアビジンムテインの結合親和性よりも大きい、別のストレプトアビジンリガンド、例えば、ビオチンまたはデスチオビオチンに対して結合親和性を示す。したがって、一部の実施形態では、ビオチンまたはビオチンアナログまたは誘導体（例えば、デスチオビオチン）は、提供された方法において競合剤として利用され得る。例えば、一例として、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｃｔｉｎ（登録商標）（例えば、配列番号４に示される配列を含有する）と名付けられたムテインストレプトアビジンの、Ｓｔｒｅｐ－タグ（登録商標）ＩＩと名付けられたペプチドリガンド（例えば、配列番号８に示される）との相互作用は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用のおよそ１０－１３Ｍと比較して、およそ１０－６ＭのＫＤの結合親和性を特徴とする。一部の場合には、約１０－１０から１０－１３Ｍの間のＫＤでＳｔｒｅｐ－ｔａｃｔｉｎ（登録商標）に高親和性で結合できるビオチンは、結合部位についてＳｔｒｅｐ－タグ（登録商標）ＩＩと競合し得る。
一部の場合には、試薬または（例えば、選択試薬または刺激試薬）は、遷移金属イオンへ結合可能であり得る少なくとも２つのキレート化基Ｋを含有する。一部の実施形態では、試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬）は、オリゴヒスチジン親和性タグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、カルモジュリンまたはそのアナログ、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ＦＬＡＧ－ペプチド、ＨＡ－タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＨＳＶエピトープ、ｍｙｃエピトープおよび／またはビオチン化担体タンパク質へ結合可能であり得る。
一部の実施形態では、試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬）は、オリゴマーまたはポリマーである。一部の実施形態では、オリゴマーまたはポリマーは、単量体の個々の分子または個々の分子を構成するサブユニットの複合体を直接的または間接的に連結すること（例えば、タンパク質の二量体、三量体、四量体等を天然に存在するように直接的または間接的に連結すること）によって、タンパク質の個々の分子をそれが天然に存在するように直接的または間接的に連結することによって生成することができる。例えば、ストレプトアビジンまたはアビジンの四量体のホモ二量体またはヘテロ二量体が、それぞれのオリゴマーまたはポリマーの個々の分子または最小ビルディングブロックと呼ばれる場合がある。一部の実施形態では、オリゴマーまたはポリマーは、少なくとも２つのタンパク質の個々の分子の連結を含有し得る（例えば、２マーである）、またはタンパク質の個々の分子（例えば、単量体、四量体）の少なくとも３マー、４マー、５マー、６マー、７マー、８マー、９マー、１０マー、１１マー、１２マー、１３マー、１４マー、１５マー、１６マー、１７マー、１８マー、１９マー、２０マー、２５マー、３０マー、３５マー、４０マー、４５マーもしくは５０マーであり得る。
オリゴマーは、公開された米国特許出願番号ＵＳ２００４／００８２０１２に記載される任意のものなどの当技術分野で公知の任意の方法を使用して生成できる。一部の実施形態では、オリゴマーまたはポリマーは、多糖または二機能性リンカー等によって架橋され得る２つまたはそれより多い個々の分子を含有する。
一部の実施形態では、オリゴマーまたはポリマーは、多糖の存在下で個々の分子または個々の分子を構成するサブユニットの複合体を架橋することによって得られる。一部の実施形態では、オリゴマーまたはポリマーは、カルボキシル残基を多糖、例えば、デキストラン中に導入することによって調製できる。一部の態様では、試薬の個々の分子（例えば、単量体、四量体）は、従来のカルボジイミド化学を使用してリシン残基の第１級アミノ基および／または遊離Ｎ末端を介してデキストラン骨格中のカルボキシル基にカップリングできる。一部の実施形態では、カップリング反応は、デキストランのモル当たり約６０モルの試薬の個々の分子（例えば、単量体、四量体）のモル比で実施される。
一部の実施形態では、試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬）は、１つまたは複数のストレプトアビジンもしくはアビジンの、またはストレプトアビジンの任意のアナログもしくはムテイン（例えば、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）またはＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ＸＴ）またはアビジンのアナログもしくはムテイン（例えば、ニュートラアビジン）のオリゴマーまたはポリマーである。一部の実施形態では、結合部位Ｚは、アビジンまたはストレプトアビジンの天然ビオチン結合部位であり、個々の分子中に最大４つの結合部位がある場合があり（例えば、四量体は、４つの結合部位Ｚを含有する）、それによって、ホモ四量体は、同一である最大４つの結合部位、すなわち、Ｚ１を含有する場合があり、一方でヘテロ四量体は、異なっている場合もある、例えば、Ｚ１およびＺ２を含有する最大４つの結合部位を含有し得る。一部の実施形態では、オリゴマーは、同一のストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテイン、アビジンまたはアビジンムテインの複数の個々の分子（例えば、複数のホモ四量体）から作製または生成され、この場合には、オリゴマーの各結合部位Ｚ、例えば、Ｚ１は同一である。例えば、一部の場合には、オリゴマーは、複数の結合部位Ｚ１、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０またはそれより多い結合部位Ｚ１を含有し得る。一部の実施形態では、オリゴマーは、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテイン、アビジンもしくはアビジンムテインのヘテロ四量体であり得る複数の個々の分子から、および／またはその結合部位Ｚが異なっている、例えば、Ｚ１およびＺ２であるストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテイン、アビジンもしくはアビジンムテインの複数の２つまたはそれより多い異なる個々の分子（例えば、異なるホモ四量体）から作製または生成され、この場合には複数の異なる結合部位Ｚ、例えば、Ｚ１およびＺ２、オリゴマー中に存在し得る。例えば、一部の場合には、オリゴマーは、複数の結合部位Ｚ１および複数の結合部位Ｚを含有する場合があり、それらは組み合わせて、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０またはそれより多い組み合わされた結合部位Ｚ１およびＺ２を含み得る。
一部の場合には、それぞれのオリゴマーまたはポリマーは、多糖によって架橋され得る。一実施形態では、ストレプトアビジンの、またはアビジンの、またはストレプトアビジンのアナログの、またはアビジンのアナログ（例えば、ニュートラアビジン）のオリゴマーまたはポリマーは、本質的に、第１の工程においてNoguchi, A, et al, Bioconjugate Chemistry (1992) 3,132-137に記載されるようにカルボキシル残基を、多糖、例えば、デキストラン中に導入することによって調製できる。一部のこのような態様では、ストレプトアビジンまたはアビジンまたはそのアナログを、次いで、第２の工程において従来のカルボジイミド化学を使用して、内部リシン残基の第１級アミノ基および／または遊離Ｎ末端を介してデキストラン骨格中のカルボキシル基に連結することができる。一部の場合には、ストレプトアビジンもしくはアビジンの、またはストレプトアビジンもしくはアビジンの任意のアナログの架橋されたオリゴマーまたはポリマーはまた、リンカーとして働く二機能性分子、例えば、グルタルジアルデヒドを介して架橋することによって、または当技術分野で記載されている他の方法によって得られる場合もある。
一部の実施形態では、オリゴマーまたはポリマーは、二機能性リンカーもしくは他の化学的リンカー、例えば、グルタルジアルデヒドを使用して個々の分子または個々の分子を構成するサブユニットの複合体を架橋することによって、または当技術分野で公知の他の方法によって得られる。一部の態様では、ストレプトアビジンもしくはアビジンの、またはストレプトアビジンもしくはアビジンの任意のムテインもしくはアナログの架橋されたオリゴマーまたはポリマーは、リンカーとして働く二機能性分子、例えば、グルタルジアルデヒドを介して個々のストレプトアビジンまたはアビジン分子を架橋することによって、または当技術分野で記載される他の方法によって得られる場合がある。例えば、チオール基をストレプトアビジンムテイン中に導入することによってストレプトアビジンムテインのオリゴマーを作製することが可能である（これは、例えば、ストレプトアビジンムテインを、２－イミノチオラン（Ｔｒａｕｔｓ試薬）と反応させることによって、および例えば、別個の反応において、ストレプトアビジンムテイン中の利用可能なアミノ基を活性化することによって行うことができる。一部の実施形態では、アミノ基のこの活性化は、ストレプトアビジンムテインの、市販のヘテロ二機能性架橋剤、例えば、スルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホＳＭＣＣ）またはスクシンイミジル－６－［（β－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）との反応によって達成され得る。一部のこのような実施形態では、そのように得られた２つの反応生成物が一緒に混合され、通常、改変ストレプトアビジンムテインのあるバッチ中に含有されるチオール基の、改変ストレプトアビジンムテインの他のバッチの活性化された（マレイミド機能等によって）アミノ酸との反応につながる。一部の場合には、この反応によって、ストレプトアビジンムテインの多量体／オリゴマーが形成される。これらのオリゴマーは、任意の適した数の個々の分子、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０またはそれより多くを有する場合があり、オリゴマー化度は反応条件に従って変わり得る。
一部の実施形態では、オリゴマーまたはポリマー試薬（例えば、選択試薬または刺激試薬）は、サイズ排除クロマトグラフィーを介して単離でき、任意の所望の画分を試薬として使用できる。例えば、一部の実施形態では、２－イミノチオランおよびヘテロ二機能性クロスリンカー、例えば、スルホＳＭＣＣの存在下で改変ストレプトアビジンムテインを反応させた後、オリゴマーまたはポリマー試薬を、サイズ排除クロマトグラフィーを介して単離でき、任意の所望の画分を試薬として使用できる。一部の実施形態では、オリゴマーは単一分子量を有さない（有する必要はない）が、ガウス分布などの統計的重量分布が観察され得る。一部の場合には、３つより多いストレプトアビジンまたはムテイン四量体、例えば、ホモ四量体またはヘテロ四量体を有する任意のオリゴマーを、可溶性試薬として使用できる、例えば、一般に３～５０の四量体、例えば、ホモ四量体もしくはヘテロ四量体、１０～４０の四量体、例えば、ホモ四量体もしくはヘテロ四量体または２５～３５の四量体、例えば、ホモ四量体もしくはヘテロ四量体。オリゴマーは、例えば、３～２５のストレプトアビジンムテイン四量体、例えば、ホモ四量体もしくはヘテロ四量体を有する可能性がある。一部の態様では、ストレプトアビジンムテインについて約５０ｋＤａの分子量を有する場合、可溶性オリゴマーは、約１５０ｋＤａ～約２０００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ～約１５００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ～約１２５０ｋＤａ、約１５０ｋＤａ～１０００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ～約５００ｋＤａまたは約１５０ｋＤａ～約３００ｋＤａ、約３００ｋＤａ～約２０００ｋＤａ、約３００ｋＤａ～約１５００ｋＤａ、約３００ｋＤａ～約１２５０ｋＤａ、約３００ｋＤａ～１０００ｋＤａ、約３００ｋＤａ～約５００ｋＤａ、約５００ｋＤａ～約２０００ｋＤａ、約５００ｋＤａ～約１５００ｋＤａ、約５００ｋＤａ～約１２５０ｋＤａ、約５００ｋＤａ～１０００ｋＤａ、約１０００ｋＤａ～約２０００ｋＤａ、約１０００ｋＤａ～約１５００ｋＤａ、約１０００ｋＤａ～約１２５０ｋＤａ、約１２５０ｋＤａ～約２０００ｋＤａまたは約１５００ｋＤａ～約２０００ｋＤａの分子量を有し得る。一般に、各ストレプトアビジン分子／ムテインは４つのビオチン結合部位を有するので、このような試薬は、１２～１６０の結合部位Ｚ、例えば、１２～１００の結合部位Ｚを提供し得る。
ａ．オリゴマー刺激試薬
特定の実施形態では、刺激試薬は、１つもしくは複数の刺激剤にコンジュゲートされた、それに連結された、またはそれに付着されたオリゴマー刺激試薬、例えば、ストレプトアビジンムテイン試薬を含有する。上記のように、一部の実施形態では、１種または複数の刺激剤は、特定の結合部位（例えば、結合部位Ｚ）でオリゴマー刺激試薬に結合可能である、結合ドメインまたは結合パートナー（例えば、結合パートナーＣ）が付着している。一部の実施形態では、複数の刺激剤は、オリゴマー刺激試薬に可逆的に結合される。種々の実施形態では、オリゴマー刺激試薬は、複数の特定の結合部位、Ｚを有し、ある特定の実施形態では、それは結合ドメイン（例えば、結合パートナーＣ）で複数の刺激剤に可逆的に結合される。一部の実施形態では、結合される薬剤の量は、競合剤、例えば、特定の結合部位（例えば、結合部位Ｚ）へ同様に結合可能である薬剤の存在下で低減または減少する。
一部の実施形態では、刺激試薬は、少なくとも１つの刺激剤（例えば、細胞、例えば、Ｔ細胞においてシグナルを生成可能である刺激剤）がオリゴマー刺激試薬と会合している、例えば、可逆的に会合している可逆性システムであるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、試薬は、刺激剤に結合、例えば、可逆的に結合可能である複数の結合部位を含有する。一部の場合には、試薬は、細胞、例えばＴ細胞においてシグナル（例えば、刺激シグナル）を生成可能な、少なくとも１つの薬剤が付着しているオリゴマー刺激試薬である。一部の実施形態では、刺激剤は、エピトープまたは分子の領域に特異的に結合できる、少なくとも１つの結合部位、例えば、結合部位Ｂを含有し、またオリゴマー刺激試薬の少なくとも１つの結合部位、試薬の結合部位Ｚに特異的に結合する、本明細書において結合パートナーＣとも呼ばれる結合パートナーも含有する。一部の実施形態では、結合パートナーＣと少なくとも１つの結合部位Ｚの間の結合相互作用は、非共有結合性相互作用である。一部の場合には、結合パートナーＣと少なくとも１つの結合部位Ｚの間の結合相互作用は、共有結合性相互作用である。一部の実施形態では、結合パートナーＣと少なくとも１つの結合部位Ｚの間の結合相互作用、例えば、非共有結合性相互作用は可逆性である。
このような可逆性システムにおいてオリゴマー刺激試薬として使用され得る物質は、公知である、例えば、米国特許第５，１６８，０４９号、同５，５０６，１２１号、同６，１０３，４９３号、同７，７７６，５６２号、同７，９８１，６３２号、同８，２９８，７８２号、同８，７３５，５４０号、同９，０２３，６０４号および国際公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１３／１２４４７４およびＷＯ２０１４／０７６２７７を参照されたい。可逆性相互作用を形成可能な試薬および結合パートナーの限定されない例ならびにこのような結合を逆転させることが可能な物質（例えば、競合剤）は以下に記載されている。
一部の実施形態では、オリゴマー刺激試薬は、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテインまたはアナログ、アビジン、アビジンムテインまたはアナログ（例えば、ニュートラアビジン）またはそれらの混合物のオリゴマーであり、このようなオリゴマー刺激試薬は、刺激剤の結合ドメイン（例えば、結合パートナーＣ）との可逆性会合のための１つまたは複数の結合部位を含有する。一部の実施形態では、刺激剤の結合ドメインは、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテインもしくはアナログ、アビジンまたはアビジンムテインもしくはアナログと特異的に結合できる、ビオチン、ビオチン誘導体もしくはアナログ、またはストレプトアビジン結合ペプチドまたは他の分子であり得る。
ある特定の実施形態では、１種または複数の刺激剤（例えば、細胞、例えば、Ｔ細胞においてシグナルを生成可能である薬剤）は、オリゴマー刺激試薬上に存在する複数の特定の結合部位（例えば、結合部位Ｚ）等を介してオリゴマー刺激試薬に会合する、例えば、可逆的に結合する。一部の場合には、これは、互いに近接して配置されている刺激剤をもたらし、その結果、刺激剤によって結合されるか、または認識される（少なくとも２コピーの）細胞表面分子を有する標的細胞が、薬剤と接触される場合に、アビディティ効果が起こる場合がある。
一部の実施形態では、オリゴマー刺激試薬は、ストレプトアビジンオリゴマー、ストレプトアビジンムテインオリゴマー、ストレプトアビジンアナログオリゴマー、アビジンオリゴマー、アビジンムテインまたはアビジンアナログ（例えば、ニュートラアビジン）から構成されるオリゴマーまたはそれらの混合物である。特定の実施形態では、オリゴマー刺激試薬は、刺激剤の結合ドメイン（例えば、結合パートナーＣ）に結合可能である特定の結合部位を含有する。一部の実施形態では、結合ドメインは、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテインもしくはアナログ、アビジンもしくはアビジンムテインもしくはアナログに特異的に結合できる、ビオチン、ビオチン誘導体もしくはアナログまたはストレプトアビジン結合ペプチドまたは他の分子であり得る。オリゴマー刺激試薬システムを構成すると企図される、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテイン、ストレプトアビジンアナログ、アビジン、アビジンムテインまたはアビジンアナログ（例えば、ニュートラアビジン）および結合ドメイン分子、例えば、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテインもしくはアナログ、アビジンもしくはアビジンムテインもしくはアナログに特異的に結合できる、ビオチン、ビオチン誘導体もしくはアナログ、またはストレプトアビジン結合ペプチドまたは他の分子の例は、節Ｉ－Ｂに記載されている。本明細書において提供される方法は、オリゴマー刺激試薬は、オリゴヒスチジン親和性タグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、カルモジュリンまたはそのアナログ、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ＦＬＡＧ－ペプチド、ＨＡ－タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＨＳＶエピトープ、ｍｙｃエピトープおよび／またはビオチン化担体タンパク質（節Ｉ－Ｂを参照されたい）に結合可能な分子を含み得ることをさらに企図する。
特定の実施形態では、複数のストレプトアビジンもしくはストレプトアビジンムテイン四量体から構成される、および／または含有するオリゴマー刺激試薬が本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるオリゴマー刺激試薬は、１種または複数の刺激剤に可逆的に結合する、または可逆的に結合可能である複数の結合部位を含有する。一部の実施形態では、オリゴマー刺激試薬は、境界を含めて７０ｎｍから１２５ｎｍの間の半径、例えば、平均半径、境界を含めて１×１０７ｇ／ｍｏｌから１×１０９ｇ／ｍｏｌの間の分子量および／または境界を含めて１，０００から５，０００の間のストレプトアビジンもしくはストレプトアビジンムテイン四量体を有する。一部の実施形態では、オリゴマー刺激試薬は、１種または複数の刺激剤、例えば、細胞の表面上の分子、例えば、受容体に結合する薬剤に結合される、例えば、可逆的に結合される。ある特定の実施形態では、１種または複数の刺激剤は、例えば、節Ｉ－Ｂにおいて本明細書に記載される薬剤である。一部の実施形態では、１種または複数の刺激剤は、一価の結合部位（例えば、結合部位Ｂ）を含有する。一部の実施形態では、一価の結合部位は、ＣＤ３に結合する。一部の実施形態では、一価の結合部位は、例えば、本明細書に記載されるような共刺激分子に結合する。一部の実施形態では、一価の結合部位は、ＣＤ２８に結合する。一部の実施形態では、１種または複数の刺激剤は、ＣＤ３および／またはＣＤ２８に結合可能な一価の結合部位を含有する。一部の実施形態では、刺激剤は、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体もしくはその抗原結合断片、例えば、結合パートナー、Ｃ、例えば、ストレプトアビジン結合ペプチド、例えば、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）ＩＩを含有する抗体もしくはその抗原断片である。特定の実施形態では、１種または複数の薬剤は、結合パートナー、例えば、ストレプトアビジン結合ペプチド、例えば、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）ＩＩを含有する抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８ Ｆａｂである。特定の実施形態では、１種または複数の薬剤は、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ３およびＳｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ２８ Ｆａｂにコンジュゲートされた、ストレプトアビジンベースのオリゴマー、例えば、ストレプトアビジンムテインオリゴマーを含む。一部の実施形態では、オリゴマー刺激試薬は、ＷＯ２０１５／１５８８６８またはＷＯ２０１８／１９７９４９に記載される任意のものである。
一部の実施形態では、複数のストレプトアビジンもしくはストレプトアビジンムテイン四量体から構成される、および／または含有するオリゴマー刺激試薬が本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるオリゴマー刺激試薬は、１種または複数の刺激剤可逆的に結合する、または可逆的に結合可能である複数の結合部位を含有する。一部の実施形態では、オリゴマー粒子は、境界を含めて８０ｎｍから１２０ｎｍの間の半径、例えば、平均半径、境界を含めて７．５×１０６ｇ／ｍｏｌから２×１０８ｇ／ｍｏｌの間の分子量および／または境界を含めて５００から１０，０００の間のストレプトアビジンもしくはストレプトアビジンムテイン四量体を有する。一部の実施形態では、オリゴマー刺激試薬は、１種または複数の刺激剤、例えば、細胞の表面上の分子、例えば、受容体に結合する薬剤に結合される、例えば、可逆的に結合される。ある特定の実施形態では、１種または複数の刺激剤は、例えば、節Ｉ－Ｂにおいて本明細書に記載される薬剤である。一部の実施形態では、刺激剤は、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体もしくはその抗原結合断片、例えば、結合パートナー、Ｃ、例えば、ストレプトアビジン結合ペプチド、例えば、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（登録商標）ＩＩを含有する抗体もしくはその抗原断片である。特定の実施形態では、１種または複数の薬剤は、結合パートナー、例えば、ストレプトアビジン結合ペプチド、例えば、Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ（例えば、配列番号１６）を含有する抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８ Ｆａｂである。
一部の実施形態では、提供された方法において使用されるオリゴマー刺激試薬は、本明細書で記載されるオリゴマー刺激試薬のいずれかである。
一部の実施形態では、細胞は、１０６個細胞当たり０．０１μｇ、０．０２μｇ、０．０３μｇ、０．０４μｇ、０．０５μｇ、０．１μｇ、０．２μｇ、０．３μｇ、０．４μｇ、０．５μｇ、０．７５μｇ、１μｇ、２μｇ、２．２μｇ、２．４μｇ、２．６μｇ、２．８μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇもしくは１０μｇの、約０．０１μｇ、０．０２μｇ、０．０３μｇ、０．０４μｇ、０．０５μｇ、０．１μｇ、０．２μｇ、０．３μｇ、０．４μｇ、０．５μｇ、０．７５μｇ、１μｇ、２μｇ、２．２μｇ、２．４μｇ、２．６μｇ、２．８μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇもしくは１０μｇの、または少なくとも０．０１μｇ、０．０２μｇ、０．０３μｇ、０．０４μｇ、０．０５μｇ、０．１μｇ、０．２μｇ、０．３μｇ、０．４μｇ、０．５μｇ、０．７５μｇ、１μｇ、２μｇ、２．２μｇ、２．４μｇ、２．６μｇ、２．８μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇもしくは１０μｇのオリゴマー刺激試薬（例えば、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ３およびＳｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ２８ Ｆａｂにコンジュゲートされた、ストレプトアビジンベースのオリゴマー、例えば、ストレプトアビジンムテインオリゴマー）の存在下で刺激される。一部の実施形態では、細胞は、１０６個細胞当たり４μｇの、または約４μｇの存在下で刺激される。特定の実施形態では、細胞は、１０６個細胞当たり０．８μｇの、または約０．８μｇの存在下で刺激される。ある特定の態様では、４μｇのオリゴマー刺激試薬は、３μｇのオリゴマー粒子および１μｇの付着された薬剤、例えば、０．５μｇの抗ＣＤ３ Ｆａｂおよび０．５μｇの抗ＣＤ２８ Ｆａｂであるか、またはそれを含む。
一部の実施形態では、細胞は、１０６個細胞当たり３μｇのまたは約３μｇのオリゴマー刺激試薬（例えば、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ３およびＳｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ２８ Ｆａｂにコンジュゲートされた、ストレプトアビジンベースのオリゴマー、例えば、ストレプトアビジンムテインオリゴマー）の存在下で刺激されるか、または刺激に付される。一部の実施形態では、細胞は、１０６個細胞当たり２．７５μｇのまたは約２．７５μｇのオリゴマー刺激試薬（例えば、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ３およびＳｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ２８ Ｆａｂにコンジュゲートされた、ストレプトアビジンベースのオリゴマー、例えば、ストレプトアビジンムテインオリゴマー）の存在下で刺激されるか、または刺激に付される。一部の実施形態では、細胞は、１０６個細胞当たり２．５μｇのまたは約２．５μｇのオリゴマー刺激試薬（例えば、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ３およびＳｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ２８ Ｆａｂにコンジュゲートされた、ストレプトアビジンベースのオリゴマー、例えば、ストレプトアビジンムテインオリゴマー）の存在下で刺激されるか、または刺激に付される。一部の実施形態では、細胞は、１０６個細胞当たり２．２５μｇのまたは約２．２５μｇのオリゴマー刺激試薬（例えば、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ３およびＳｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ２８ Ｆａｂにコンジュゲートされた、ストレプトアビジンベースのオリゴマー、例えば、ストレプトアビジンムテインオリゴマー）の存在下で刺激されるか、または刺激に付される。一部の実施形態では、細胞は、１０６個細胞当たり２μｇのまたは約２μｇのオリゴマー刺激試薬（例えば、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ３およびＳｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ２８ Ｆａｂにコンジュゲートされた、ストレプトアビジンベースのオリゴマー、例えば、ストレプトアビジンムテインオリゴマー）の存在下で刺激されるか、または刺激に付される。特定の実施形態では、細胞は、１０６個細胞当たり１．８μｇのまたは約１．８μｇのオリゴマー刺激試薬（例えば、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ３およびＳｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ２８ Ｆａｂにコンジュゲートされた、ストレプトアビジンベースのオリゴマー、例えば、ストレプトアビジンムテインオリゴマー）の存在下で刺激されるか、または刺激に付される。特定の実施形態では、細胞は、１０６個細胞当たり１．６μｇのまたは約１．６μｇのオリゴマー刺激試薬（例えば、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ３およびＳｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ２８ Ｆａｂにコンジュゲートされた、ストレプトアビジンベースのオリゴマー、例えば、ストレプトアビジンムテインオリゴマー）の存在下で刺激されるか、または刺激に付される。特定の実施形態では、細胞は、１０６個細胞当たり１．４μｇのまたは約１．４μｇのオリゴマー刺激試薬（例えば、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ３およびＳｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ２８ Ｆａｂにコンジュゲートされた、ストレプトアビジンベースのオリゴマー、例えば、ストレプトアビジンムテインオリゴマー）の存在下で刺激されるか、または刺激に付される。特定の実施形態では、細胞は、１０６個細胞当たり１．２μｇのまたは約１．２μｇのオリゴマー刺激試薬（例えば、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ３およびＳｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ２８ Ｆａｂにコンジュゲートされた、ストレプトアビジンベースのオリゴマー、例えば、ストレプトアビジンムテインオリゴマー）の存在下で刺激されるか、または刺激に付される。特定の実施形態では、細胞は、１０６個細胞当たり１μｇのまたは約１μｇのオリゴマー刺激試薬（例えば、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ３およびＳｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ２８ Ｆａｂにコンジュゲートされた、ストレプトアビジンベースのオリゴマー、例えば、ストレプトアビジンムテインオリゴマー）の存在下で刺激されるか、または刺激に付される。特定の実施形態では、細胞は、１０６個細胞当たり０．８μｇのまたは約０．８μｇのオリゴマー刺激試薬（例えば、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ３およびＳｔｒｅｐ－ｔａｇが付けられた抗ＣＤ２８ Ｆａｂにコンジュゲートされた、ストレプトアビジンベースのオリゴマー、例えば、ストレプトアビジンムテインオリゴマー）の存在下で刺激されるか、または刺激に付される。一部の実施形態では、細胞は、１０×１０８、９×１０８、８×１０８、７×１０８、６×１０８、５×１０８、４×１０８、３×１０８、２×１０８、１×１０８のまたは約１０×１０８、約９×１０８、約８×１０８、約７×１０８、約６×１０８、約５×１０８、約４×１０８、約３×１０８、約２×１０８、約１×１０８のオリゴマー刺激試薬の存在下で刺激されるか、または刺激に付される。一部の実施形態では、細胞は、７×１０８、６×１０８、５×１０８、４×１０８、３×１０８のまたは約７×１０８、約６×１０８、約５×１０８、約４×１０８、約３×１０８のオリゴマー刺激試薬の存在下で刺激されるか、または刺激に付される。一部の実施形態では、細胞は、７×１０８～３×１０８のまたは約７×１０８～３×１０８のオリゴマー刺激試薬の存在下で刺激されるか、または刺激に付される。一部の実施形態では、細胞は、６×１０８～４×１０８のまたは約６×１０８～４×１０８のオリゴマー刺激試薬の存在下で刺激されるか、または刺激に付される。一部の実施形態では、細胞は、６×１０８～５×１０８のまたは約６×１０８～５×１０８のオリゴマー刺激試薬の存在下で刺激されるか、または刺激に付される。一部の実施形態では、細胞は、５×１０８のまたは約５×１０８のオリゴマー刺激試薬の存在下で刺激されるか、または刺激に付される。
一部の実施形態では、細胞、例えば、試料の選択された細胞は、３：１、２．５：１、２：１、１．５：１、１．２５：１、１．２：１、１．１：１、１：１、０．９：１、０．８：１、０．７５：１、０．６７：１、０．５：１、０．３：１もしくは０．２：１または約３：１、約２．５：１、約２：１、約１．５：１、約１．２５：１、約１．２：１、約１．１：１、約１：１、約０．９：１、約０．８：１、約０．７５：１、約０．６７：１、約０．５：１、約０．３：１もしくは約０．２：１の、オリゴマー刺激試薬の細胞に対する比率の存在下で刺激されるか、または刺激に付される特定の実施形態では、オリゴマー刺激試薬の細胞に対する比率は、２．５：１から０．２：１の間、２：１から０．５：１の間、１．５：１から０．７５：１の間、１．２５：１から０．８：１の間、１．１：１から０．９：１の間である。特定の実施形態では、オリゴマー刺激試薬の細胞に対する比率は、約１：１であるか、または１：１である。特定の実施形態では、オリゴマー刺激試薬の細胞に対する比率は、約０．３：１であるか、または０．３：１である。特定の実施形態では、オリゴマー刺激試薬の細胞に対する比率は、約０．２：１であるか、または０．２：１である。
Ｃ．細胞選択、刺激および操作
カラムクロマトグラフィー工程による細胞選択を、刺激および／または操作、例えば、形質導入と組み合わせることを含む方法が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、試料の細胞は、節Ｉ－Ｂ－１に記載される例示的選択剤のいずれかを使用して選択される。したがって、ある特定の態様では、細胞がカラム上に固定化されている（例えば、選択剤によって）場合には、刺激および形質導入は、選択工程の際に実施される。一部の実施形態では、刺激条件は、細胞、例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞において刺激する、および／または刺激シグナルを送達可能である条件を含む。例えば、選択は、Ｔ細胞またはそのある特定のサブセットについて濃縮または選択することであり、刺激条件は、ＴＣＲ複合体の構成成分（例えば、ＣＤ３）および／または共刺激分子（例えば、ＣＤ２８）から生じたシグナルを刺激する条件を含む。一部の実施形態では、刺激条件は、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）上に固定化されている標的細胞（例えば、Ｔ細胞）を、刺激剤、例えば、刺激シグナルを送達する、または刺激シグナルを送達可能であり、それによって、選択された細胞を刺激する薬剤と共にインキュベートすることであるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、選択された細胞はＴ細胞またはそのサブセットであり、刺激剤は、ＴＣＲ複合体の構成成分（例えば、ＣＤ３）および／または共刺激分子（例えば、ＣＤ２８）に結合し、刺激し、および／または活性化する。ある特定の実施形態では、刺激条件下で細胞の集団を刺激することによって、選択され、刺激された細胞の集団（本明細書において、刺激された細胞の集団とも呼ばれる）を作製または生成される。
ある特定の実施形態では、刺激の際に異種または組換えポリヌクレオチドが細胞中に導入される。ある特定の実施形態では、異種または組換えポリヌクレオチドは、刺激の開始時に細胞中に導入される。
１．クロマトグラフィーによる細胞選択
試料の細胞、例えば、Ｔ細胞がクロマトグラフィーによる単離によって、例えば、親和性クロマトグラフィーまたはゲル浸透クロマトグラフィーを含むカラムクロマトグラフィーによって選択される方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、方法は、標的細胞、例えば、単離され、選択され、または濃縮されるべき細胞の表面に位置する選択マーカーに結合する選択剤を利用する。このような方法は、（跡のない）細胞親和性クロマトグラフィー技術（ＣＡＴＣＨ）として記載される場合もあり、これによりその全体で参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１３１２４４７４およびＷＯ２０１５１６４６７５に記載される方法または技術のいずれかを含む場合がある。例示的選択剤は、節Ｉ－Ｂ－１に記載されている。
前記の実施形態のいずれかでは、試料は、全血試料、バフィーコート試料、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料、未分画Ｔ細胞試料、リンパ球試料、白血球細胞試料、アフェレーシス生成物または白血球アフェレーシス生成物であり得るか、またはそれを含み得る。一部の実施形態では、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス生成物は、対象から新たに単離される。他の実施形態では、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス生成物は、低温保存アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス生成物から解凍される。一部の実施形態では、標的細胞はＴ細胞である。
一部の実施形態では、細胞、例えば、標的細胞は、本明細書で記載されるような選択マーカーを細胞表面上に有するか、または発現し、その結果、単離され、選択され、または濃縮されるべき細胞は、少なくとも１つの共通の特異的受容体分子の存在によって定義される。一部の実施形態では、標的細胞を含有する試料は、選択マーカーを欠くさらなる細胞を含有する場合もある。例えば、一部の実施形態では、Ｔ細胞は、複数の細胞種、例えば、赤血球またはＢ細胞を含有する試料から選択され、単離され、または濃縮される。
一部の実施形態では、選択剤は、クロマトグラフィーカラム中に含まれる、例えば、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）に直接的または間接的に結合される。一部の実施形態では、選択剤は、試料がカラムに添加される時点でクロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）上に存在する。一部の実施形態では、選択剤は、試薬、例えば、選択試薬を介してクロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）に間接的に結合されることができる。一部の実施形態では、選択試薬は、カラムの固定相に共有結合的または非共有結合的に結合される。一部の実施形態では、選択試薬は、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）上に可逆的に固定化されている。一部の場合には、選択試薬は、共有結合的結合を介してクロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）上に固定化されている。一部の態様では、選択試薬は、非共有結合的にクロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）上に可逆的に固定化されている。
一部の実施形態では、選択剤は、試料がクロマトグラフィーカラム（例えば、固定相）に添加される時点で、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）上に存在し得る、例えば、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）に直接的（例えば、共有結合的または非共有結合的に）または選択試薬を介して間接的に結合され得る。したがって、試料の添加の際、標的細胞は選択剤によって結合され、カラムのクロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）上に固定化され得る。あるいは、一部の実施形態では、選択剤は、試料に添加され得る。この場合には、選択剤は、試料中の標的細胞（例えば、Ｔ細胞）に結合し、次いで、試料を選択試薬を含むクロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）に添加することができ、ここですでに標的細胞に結合されている選択剤は選択試薬に結合し、それによって、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）に標的細胞を固定化する。一部の実施形態では、選択剤は、選択剤中に含まれる本明細書で記載されるような結合パートナーＣを介して本明細書で記載される選択試薬に結合する。
一部の実施形態では、２つまたはそれより多い選択剤が、例えば、選択試薬上に存在する１つまたは複数の結合部位Ｚを介して、選択試薬と会合する、例えば、選択試薬に可逆的にまたは不可逆的に結合される。一部の場合には、これは、互いに近接して配置されている選択剤をもたらし、その結果、（少なくとも２コピーの）細胞表面分子（例えば、選択マーカー）を有する標的細胞が、特定の分子（例えば、選択マーカー）に結合できる選択剤と接触される場合に、アビディティ効果が起こる場合がある。
一部の実施形態では、同一である、すなわち同一の選択マーカー結合特異性を有する、２つまたはそれより多い異なる選択剤は、選択試薬に可逆的に結合され得る。一部の実施形態では、異なる選択マーカーに結合する少なくとも２つの異なる選択剤、一部の場合には、３つまたは４つの異なる選択剤を使用することが可能である。一部の態様では、少なくとも２つの選択剤の各々は、異なる分子（例えば、選択マーカー）、例えば、第１の分子、第２の分子等に結合し得る。一部の場合には、異なる分子（例えば、選択剤）、例えば、細胞表面分子は、同一標的細胞上に存在し得る。他の場合には、異なる分子（例えば、選択マーカー）、例えば、細胞表面分子は、細胞の同一集団中に存在する異なる標的細胞上に存在し得る。一部の場合には、第３の、第４の等の選択剤は、各々さらなる異なる結合部位を含有する同一試薬と会合し得る。
一部の実施形態では、２つまたはそれより多い異なる選択剤は、同一の結合パートナーＣを含有する。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い異なる選択剤は、異なる結合パートナーを含有する。一部の態様では、第１の選択剤は、選択試薬上に存在する結合部位Ｚ１に特異的に結合し得る結合パートナーＣ１を有する場合があり、第２の選択剤は、選択試薬上に存在する結合部位Ｚ１に、または結合部位Ｚ２に特異的に結合し得る結合パートナーＣ２を有する場合がある。したがって、場合によっては、選択試薬によって含まれる複数の結合部位Ｚは、結合部位Ｚ１およびＺ２を含み、それらはそれぞれ、選択剤によって含まれる結合パートナーＣ１およびＣ２に可逆的に結合可能である。一部の実施形態では、Ｃ１およびＣ２は同一であり、ならびに／またはＺ１およびＺ２は同一である。他の態様では、複数の結合部位Ｚのうち１つまたは複数が異なっている場合がある。他の例では、複数の結合パートナーＣのうち１つまたは複数が異なっている場合がある。結合パートナーＣの各々が、結合部位Ｚのうちの１つと相互作用できる、例えば、特異的に結合できる限り、結合部位Ｚを含有する選択試薬と適合する異なる結合パートナーＣの任意の組合せを選択することは、当業者のレベル内である。
一部の実施形態では、結合パートナーＣと結合部位Ｚの間で形成された可逆的結合は、競合剤および／または遊離結合剤によって破壊され得る。一部の実施形態では、競合剤および／または遊離結合剤は、１つまたは複数の結合部位Ｚの結合パートナーＣとの結合について競合可能である、ビオチン、ビオチン誘導体またはアナログまたはストレプトアビジン結合ペプチドであり得る。一部の実施形態では、結合パートナーＣおよび競合剤および／または遊離結合剤は異なっており、競合剤および／または遊離結合剤は、結合パートナーの親和性と比較して１つまたは複数の結合部位Ｚに対してより高い結合親和性を示す。本明細書において提供される方法のいずれかの特定の態様では、選択試薬への選択剤の結合を破壊するためのクロマトグラフィーカラムの固定相への競合剤および／または遊離結合剤の添加は、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）から標的細胞（例えば、Ｔ細胞）を脱離するために必要ではない。
一部の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）から残存する試料をすすぐこと、放出することまたは洗浄することなどによって、試料の細胞、例えば、標的細胞を試料から枯渇させることができる。一部の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）から未結合細胞および細片を除去するために１つまたは複数の（例えば、２、３、４、５、６）洗浄工程が使用される。一部の実施形態では、試料は、少なくとも５、１０、１６、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００もしくは１２０分間または約５、約１０、約１６、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００もしくは約１２０分間マトリックスを浸透することが許可され、その後１つまたは複数の洗浄工程が実施される。
クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）として任意の材料が利用され得る。一般に、適したクロマトグラフィー材料は、所望の条件下で充填されたクロマトグラフィーカラム中で使用される場合等で本質的に無害である、すなわち、細胞生存力にとって有害ではない。一部の実施形態では、固定相は、所定の配置等の所定の位置のままであるが、試料の位置は変更されている。したがって、一部の実施形態では、固定相は、クロマトグラフィーシステムの一部であり、それを介して移動相が流れ（フロースルーによって、またはバッチ様式で）、相の間で液相中に含有される構成要素（溶解された、または分散された）の分布が生じる。
一部の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスは、固相または半固相の形態を有するが、単離／分離されるべき標的細胞を含有する試料は、流体相である。クロマトグラフィーマトリックスは、粒子状材料（任意のサイズおよび形状の）または紙物質もしくはメンブレンを含む一体化したクロマトグラフィー材料であり得る。したがって、一部の態様では、クロマトグラフィーは、カラムクロマトグラフィーならびに平面クロマトグラフィーの両方であり得る。一部の実施形態では、標準クロマトグラフィーカラムに加えて、双方向性流を可能にするカラム、例えば、ＰｈｙＮｅｘｕｓ、Ｉｎｃ．米国、カリフォルニア州、サンジョゼから入手可能なＰｈｙＴｉｐ（登録商標）カラムまたはピペットチップを、カラムベースの／フロースルー様式ベースの方法のために使用できる。したがって、一部の場合には、双方向性流を可能にするピペットチップまたはカラムも、本方法において有用なクロマトグラフィーカラムによって含まれる。一部の場合には、例えば、粒子状マトリックス材料が使用される場合は、粒子状マトリックス材料は、例えば、約５μｍ～約２００μｍまたは約５μｍ～約４００μｍまたは約５μｍ～約６００μｍの平均粒子サイズを有し得る。一部の態様では、クロマトグラフィーマトリックスは、例えば、ポリマー樹脂または酸化金属または酸化メタロイドであり得るか、またはそれを含み得る。一部の態様では、平面クロマトグラフィーが使用される場合は、マトリックス材料は、平面クロマトグラフィーに適した任意の材料、例えば、従来のセルロースベースのまたは有機ポリマーベースのメンブレン（例えば、ペーパーメンブレン、ニトロセルロースメンブレンまたはポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン）またはシリカコーティングされたガラスプレートであり得る。一実施形態では、クロマトグラフィーマトリックス／固定相は、非磁性材料または非磁化可能な材料である。
一部の実施形態では、本方法において適している非磁性または非磁化可能クロマトグラフィー固定相には、誘導体化シリカまたは架橋ゲルが含まれる。一部の態様では、架橋ゲルは、天然ポリマー、例えば、天然に生じるポリマークラスをベースとするものであり得る。例えば、クロマトグラフィー固定相がベースとする天然ポリマーは、多糖である。一部の場合には、それぞれの多糖は、一般に架橋されている。多糖マトリックスの例として、アガロースゲル（例えば、Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（商標）アガロースまたはＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）材料、例えば、異なるビーズおよび孔サイズで市販されているＳｕｐｅｒｆｌｏｗ（商標）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標））または架橋デキストラン（複数可）のゲルが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる例示的例として、デキストランが共有結合によって結合されている粒子状架橋アガロースマトリックスがあり、これは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）またはＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）として市販されており（種々のビーズサイズで、種々の孔サイズを有する）、両方ともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能である。このようなクロマトグラフィー材料の別の例示的例として、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）があり、同様に異なるビーズおよび孔サイズでＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能である。
一部の実施形態では、架橋ゲルはまた、合成ポリマー、例えば、天然に生じないポリマークラスをベースとするものであり得る。一部の態様では、クロマトグラフィー固定相がベースとするこのような合成ポリマーは、極性単量体ユニットを有し、従って、それ自身が極性であるポリマーである。したがって、一部の場合には、このような極性ポリマーは親水性である。親水性の分子はまた、疎油性とも呼ばれ、一部の態様では、水分子と双極子－双極子相互作用を形成し得る部分を含有する。一般に、疎水性分子はまた、親油性とも呼ばれ、水から分離する傾向を有する。
一般に、クロマトグラフィー法は、流体クロマトグラフィー、通常、液体クロマトグラフィーである。一部の態様では、クロマトグラフィーは、細胞、例えば、標的細胞を含有する流体試料が、例えば、クロマトグラフィーマトリックスを含有するカラムの一方の末端に重力流によって、またはポンプによって適用され、流体試料がカラムのもう一方末端にカラムに存在するフロースルー様式で実行され得る。さらに、クロマトグラフィーは、単離されるべき細胞を含有する流体試料が、例えば、ピペットチップ内に充填されたクロマトグラフィーマトリックスを含有するカラムの一方の末端でピペットによって適用され、流体試料がカラムのもう一方の末端でクロマトグラフィーマトリックス／ピペットチップに入り、存在する「上げ下げ」様式で実行され得る。あるいは、クロマトグラフィーはまた、クロマトグラフィー材料（固定相）が、細胞を含有する試料と共に、例えば、振盪、回転または例えば、ピペットの手段による反復接触および流体試料の除去下でインキュベートされるバッチ様式で実行され得る。
一部の態様では、材料がクロマトグラフィー単離、例えば、細胞の選択に適している限り、提供された実施形態に関連してクロマトグラフィーマトリックスとして任意の材料を利用できる。特定の態様では、適したクロマトグラフィー材料は、細胞単離および／または細胞分離のために所望の条件下で充填されたクロマトグラフィーカラム中で使用される場合、少なくとも無害または本質的に無害、例えば、細胞生存力にとって有害ではない。一部の態様では、クロマトグラフィーマトリックスは、通常、所定の配置で所定の位置のままであるが、分離されるべき試料の、およびそれに含まれる構成成分の位置は、変更されている。したがって、一部の態様では、クロマトグラフィーマトリックスは、「固定相」である。
通常、それぞれのクロマトグラフィーマトリックスは、固相または半固相の形態を有するが、単離／分離されるべき標的細胞を含有する試料は、流体相である。クロマトグラフィー分離を達成するために使用される移動相は、同様に流体相である。クロマトグラフィーマトリックスは、粒子状材料（任意の適したサイズおよび形状の）または紙物質もしくはメンブレンを含む一体化したクロマトグラフィー材料であり得る。したがって、クロマトグラフィーは、カラムクロマトグラフィーならびに平面クロマトグラフィーの両方であり得る。標準クロマトグラフィーカラムに加えて、双方向性流を可能にするカラムまたはピペットチップを、本明細書に記載されるような細胞のカラムベースの／フロースルー様式ベースのクロマトグラフィー分離のために使用できる。一部の態様では、粒子状マトリックス材料が使用され、粒子状マトリックス材料は、例えば、約５μｍ～約２００μｍまたは約５μｍ～約４００μｍまたは約５μｍ～約６００μｍの平均粒子サイズを有し得る。一部の態様では、平面クロマトグラフィーが使用され、マトリックス材料は、平面クロマトグラフィーに適した任意の材料、例えば、従来のセルロースベースのまたは有機ポリマーベースのメンブレン（例えば、ペーパーメンブレン、ニトロセルロースメンブレンまたはポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン）またはシリカコーティングされたガラスプレートであり得る。
一部の態様では、クロマトグラフィーマトリックス／固定相は、非磁性材料または非磁化可能材料である。このような材料には、誘導体化シリカまたは架橋ゲルが含まれ得る。架橋ゲル（通常、ビーズ形態で製造される）は、天然ポリマー、例えば、架橋多糖をベースとするものであり得る。適した例として、アガロースゲルまたは架橋デキストラン（複数可）のゲルが挙げられるが、これらに限定されない。架橋ゲルはまた、合成ポリマー、すなわち、天然に生じないポリマークラスをベースとするものであり得る。普通、細胞分離のためのクロマトグラフィー固定相がベースとするこのような合成ポリマーは、極性単量体ユニットを有し、従って、それ自身が極性であるポリマーである。
適した合成ポリマーの例示的例として、ポリアクリルアミド（複数可）、スチレン－ジビニルベンゼンゲルおよびアクリレートとジオールの、またはアクリルアミドとジオールの共重合体がある。例示的例として、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）として市販されているポリメタクリレートゲルがある。さらなる例として、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）として市販されているエチレングリコールとメタクリレートの共重合体がある。一部の実施形態では、クロマトグラフィー固定相はまた、天然および合成ポリマー構成成分、例えば、複合マトリックスまたは多糖とアガロースの複合体または共重合体、例えば、ポリアクリルアミド／アガロース複合体または多糖とＮ，Ｎ’－メチレンビスアシルアミドの複合体または共重合体を含み得る。デキストランとＮ，Ｎ’－メチレンビスアシルアミドの共重合体の例示的例として、上記のＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）シリーズの材料がある。誘導体化シリカは、合成または天然ポリマーにカップリングされたシリカ粒子を含み得る。このような実施形態の例として、多糖グラフト化シリカ、ポリビニルピロリドングラフト化シリカ、酸化ポリエチレングラフト化シリカ、ポリ（２－ヒドロキシエチルアスパルタミド）シリカおよびポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）グラフト化シリカが挙げられるが、これらに限定されない。
試料中に存在する他の構成成分、例えば、刺激剤および／または刺激試薬（例えば、オリゴマー刺激試薬）は、孔の排除限界未満であるサイズを有する場合があり、これは、サイズ排除クロマトグラフィーマトリックスの孔に入ることができる。孔体積に部分的または完全に入ることができるこのような構成成分のうち、孔体積へのアクセスが少ないより大きな分子は普通最初に溶出するが、最小分子は最後に溶出する。一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーマトリックスの排除限界は、標的細胞の最大幅未満であるように選択される。したがって、孔体積へアクセスする構成成分は普通、標的細胞よりもサイズ排除クロマトグラフィーマトリックス中／上でより長く留まる。したがって、標的細胞は、クロマトグラフィーカラムの溶出液中で試料の他のもの／構成要素から別個に収集され得る。したがって、刺激試薬などの構成成分は、ゲル濾過マトリックスから標的細胞よりも後の時点で溶出する。
提供された実施形態において利用されるクロマトグラフィーマトリックスはまた、磁気的に引き付けることができる物質、例えば、１つまたは複数の磁気的に引き付けることができる粒子または強磁性流体も含む。それぞれの磁気的に引き付けることができる粒子は、クロマトグラフィーマトリックス上の標的細胞に結合可能であり、固定化する結合部位（例えば、選択剤）を有する選択試薬を含み得る。磁気的に引き付けることができる粒子は、反磁性、強磁性、常磁性または超常磁性材料を含有し得る。超常磁性材料は、磁場に応答し、誘導された磁場は、永久磁化をもたらさない。酸化鉄をベースとする磁性粒子は、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）としてＤｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈから、磁性ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓとしてＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから、磁性多孔性ガラスビーズとしてＣＰＧ Ｉｎｃ．から、ならびにほんの数例を挙げるとＲｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＢＩＯＣＬＯＮ、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．、ｍｉｃｒｏｍｏｄ、ＡＭＢＩＯＮ、Ｍｅｒｃｋ、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓまたはＮｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．などの種々の他の供給源から市販されている。超常磁性ＣｏおよびＦｅＣｏをベースとする磁性ナノ粒子ならびに強磁性Ｃｏナノ結晶は、例えば、Huetten, A. et al. (J. Biotech. (2004),112, 47-63)によって記載されている。しかし、一部の実施形態では、提供された実施形態において利用されるクロマトグラフィーマトリックスは、磁気的に引き付けることができる物質を全く欠いている。
ＷＯ２０１３／０１１０１１（その全開示内容は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる）として公開された同時継続中の国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０６３９６９と一致して、選択剤と標的細胞上の選択マーカーの間の結合の強度は、標的細胞の、選択剤を介した選択試薬への結合の可逆性にとって極めて重要ではない場合がある。むしろ、選択剤と結合部位Ｂを介した選択マーカーの間の結合の解離定数（ＫＤ）が、低親和性のものである、例えば、約１０－３～約１０－７ＭのＫＤの範囲にあるか、または高親和性のものである、例えば、約１０－７～約１×１０－１０ＭのＫＤの範囲にあるか否かを意味する結合の強度に関わらず、結合部位Ｂを介した選択剤および受容体分子の結合の解離が十分に迅速に生じる限り、標的細胞は可逆的に染色され得る。この関連で、選択剤と結合部位Ｂを介した選択剤の間の結合の解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、約３×１０－５秒－１以上を有し得る（この解離速度定数は、一定であり、受容体結合試薬の結合部位Ｂと標的細胞の表面上の受容体分子の間で形成された複合体の解離反応を特徴付ける）。選択剤の結合部位Ｂと標的細胞の表面上の選択マーカーの間の会合反応の解離速度定数（ｋｏｎ）は、任意の値を有し得る。選択マーカーと選択剤の間の十分に可逆性の結合を確実にするために、結合平衡のｋｏｆｆ値を約３×１０－５秒－１以上の、約５×１０－５秒－１以上の、例えば、１×１０－４秒－１以上、５×１０－４秒－１以上、１×１０－３秒－１以上、５×１０－３秒－１以上、１×１０－２秒－１以上、１×１０－１秒－１以上もしくは５×１０－１秒－１以上または約１×１０－４秒－１以上、約５×１０－４秒－１以上、約１×１０－３秒－１以上、約５×１０－３秒－１以上、約１×１０－２秒－１以上、約１×１０－１秒－１以上もしくは約５×１０－１秒－１以上の値を有するように選択することが有利である。速度論定数および熱力学定数の値は、本明細書で使用される場合、大気圧、すなわち１．０１３バールおよび室温、すなわち２５℃の条件を指すことにここで留意されたい。
一部の実施形態では、複数ラウンドの細胞選択工程が実行され、ある工程からポジティブまたはネガティブに選択された画分が、別の選択工程、例えば、その後のポジティブまたはネガティブ選択に付される。ある特定の実施形態では、選択、単離および濃縮のための方法、技術および試薬は、例えば、これによりその全体で参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１５１６４６７５に記載されている。
一部の実施形態では、単一選択工程を使用して、試料から標的細胞（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞）を単離できる。一部の実施形態では、単一選択工程は、単一クロマトグラフィーカラムで実施できる。一部の例では、単一選択工程は、複数のマーカーを同時に発現する細胞を枯渇できる。同様に、複数の細胞種を同時にポジティブ選択できる。ある特定の実施形態では、選択工程は、１回よりも多く反復または実施され、ある工程からポジティブまたはネガティブに選択された画分が、同一選択工程、例えば、反復されたポジティブまたはネガティブ選択に付される。一部の例では、単一選択工程は、例えば、選択された細胞の純度を高めるために、ならびに／またはネガティブに選択された画分からネガティブに選択された細胞をさらに除去および／もしくは枯渇させるために１回よりも多く反復および／または実施される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の選択工程が、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回または１０回よりも多く実施される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の選択工程が、１から１０回の間、１から５回の間、または３から５回の間実施および／または反復される。一部の実施形態では、２つの選択工程が実施される。
細胞選択は、１つまたは複数のクロマトグラフィーカラムを使用して実施され得る。一部の実施形態では、１つまたは複数のクロマトグラフィーカラムが閉鎖システム中に含まれる。一部の実施形態では、閉鎖システムは、例えば、最小のユーザー（例えば、ヒト）インプットを必要とするまたはユーザー（例えば、ヒト）インプットを必要としない自動化閉鎖システムである。一部の実施形態では、細胞選択は連続して実施される（例えば、連続選択技術）。一部の実施形態では、１つまたは複数のクロマトグラフィーカラムは、連続して配置される。例えば、第１のカラムを、カラムのアウトプット（例えば、溶出剤）が、例えば、接続されたチューブを介して第２のクロマトグラフィーカラムに供給され得るように方向付けることができる。一部の実施形態では、複数のクロマトグラフィーカラムは連続して配置され得る。一部の実施形態では、細胞選択は、連続ポジティブおよびネガティブ選択工程を実行することによって達成でき、次の工程は、以前の工程からのネガティブおよび／またはポジティブ画分をさらなる選択に付し、全プロセスは、同一チューブまたはチューブセット中で実行される。一部の実施形態では、標的細胞を含有する試料は、連続選択に付され、第１の選択はＣＤ４＋またはＣＤ８＋集団の一方について濃縮するために達成され、第１の選択からの非選択細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋集団のもう一方について濃縮するために第２の選択のための細胞の供給源として使用される。一部の実施形態では、さらなる選択（単数または複数）を達成して、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋集団の一方または両方の亜集団、例えば、中枢記憶Ｔ（ＴＣＭ）細胞、ナイーブＴ細胞および／または１つもしくは複数の表面マーカーについてポジティブの細胞もしくは高レベルの１つもしくは複数の表面マーカーを発現する細胞、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋および／またはＣＤ４５ＲＯ＋について濃縮できる。一部の実施形態では、標的細胞を含有する試料は、第１の選択がＣＤ３＋集団について濃縮するために達成され、選択された細胞が、ＣＤ３＋集団について濃縮するために第２の選択のための細胞の供給源として使用される連続選択に付される。一部の実施形態では、標的細胞を含有する試料は、第１の選択が第１の固定相上（例えば、第１のクロマトグラフィーカラム中）でＣＤ３＋集団について濃縮するために達成され、未結合細胞を含有するフロースルーが、第２の固定相上（例えば、第２のクロマトグラフィーカラム中）でＣＤ３＋集団について濃縮するために第２の選択のための細胞の供給源として使用され、第１および第２の固定相が連続して配置される連続選択に付される。一部の実施形態では、さらなる選択（単数または複数）を達成して、ＣＤ３＋集団の亜集団、例えば、中枢記憶Ｔ（ＴＣＭ）細胞、ナイーブＴ細胞および／または１つもしくは複数の表面マーカーについてポジティブの細胞もしくは高レベルの１つもしくは複数の表面マーカーを発現する細胞、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋および／またはＣＤ４５ＲＯ＋について濃縮できる。一部の実施形態では、標的細胞を含有する試料は、第１の選択がＣＤ３＋集団について濃縮するために達成され、選択された細胞がＣＤ４＋集団について濃縮するために第２の選択のための細胞の供給源として使用される連続選択に付される。一部の実施形態では、さらなる選択（単数または複数）を達成して、ＣＤ３＋ＣＤ４＋集団の亜集団、例えば、中枢記憶（ＴＣＭ）細胞、ナイーブＴ細胞および／または１つもしくは複数の表面マーカーについてポジティブの細胞もしくは高レベルの１つもしくは複数の表面マーカーを発現する細胞、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋および／またはＣＤ４５ＲＯ＋について濃縮できる。一部の実施形態では、標的細胞を含有する試料は、第１の選択がＣＤ３＋集団について濃縮するために達成され、選択された細胞がＣＤ８＋集団について濃縮するために第２の選択のための細胞の供給源として使用される連続選択に付される。一部の実施形態では、さらなる選択（単数または複数）を達成して、ＣＤ３＋ＣＤ８＋集団の亜集団、例えば、中枢記憶Ｔ（ＴＣＭ）細胞、ナイーブＴ細胞および／または１つもしくは複数の表面マーカーについてポジティブの細胞もしくは高レベルの１つもしくは複数の表面マーカーを発現する細胞、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋および／またはＣＤ４５ＲＯ＋について濃縮できる。一部の態様では、Ｔ細胞の特定の亜集団（例えば、ＣＤ３＋細胞）、例えば、１つもしくは複数の表面マーカーについてポジティブの細胞もしくは高レベルの１つもしくは複数の表面マーカーを発現する細胞、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋および／またはＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞は、ポジティブまたはネガティブ連続選択技術によって選択されるということが企図される。連続選択の方法は、いずれかの順序で実行され得る。
一部の実施形態では、標的細胞を含有する試料は、第１の選択が第１の固定相上（例えば、第１のクロマトグラフィーカラム中）でＣＤ３＋集団について濃縮するために達成され、選択された細胞が第２の固定相上（例えば、第２のクロマトグラフィーカラム中）でＣＤ３＋集団の亜集団について濃縮するために第２の選択のための細胞の供給源として使用され、第１および第２の固定相が連続して配置される連続選択に付される。一部の実施形態では、さらなる選択（単数または複数）を達成して、ＣＤ３＋集団の亜集団、例えば、中枢記憶Ｔ（ＴＣＭ）細胞、ナイーブＴ細胞および／または１つもしくは複数の表面マーカーについてポジティブの細胞もしくは高レベルの１つもしくは複数の表面マーカーを発現する細胞、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋および／またはＣＤ４５ＲＯ＋を濃縮できる。
一部の実施形態では、標的細胞を含有する試料は、第１の選択が、第１の固定相上（例えば、第１のクロマトグラフィーカラム中）で記憶Ｔ（ＴＣＭ）細胞、ナイーブＴ細胞および／または１つもしくは複数の表面マーカーについてポジティブの細胞もしくは高レベルの１つもしくは複数の表面マーカーを発現する細胞、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋および／またはＣＤ４５ＲＯ＋のマーカーについて濃縮するために達成され、選択された細胞が、第２の固定相上（例えば、第２のクロマトグラフィーカラム中）でＣＤ３＋集団の亜集団について濃縮するために第２の選択のための細胞の供給源として使用され、第１および第２の固定相が連続して配置される連続選択に付される。
一部の実施形態では、細胞選択は、並列に実施される（例えば、並列選択技術）。一部の実施形態では、１つまたは複数のクロマトグラフィーカラムは、並列に配置される。例えば、２つまたはそれより多いカラムは、試料が、例えば、試料が第１のカラムを通ることを必要とせずに各カラムに添加されることを可能にするチューブを介して同時に２つまたはそれより多いカラム上にロードされるように配置され得る。例えば、並列選択技術を使用して、細胞選択は、例えば、全プロセスが同一チューブまたはチューブセットで実施される閉鎖システムにおいてポジティブおよび／またはネガティブ選択工程を同時に実行することによって達成され得る。一部の実施形態では、標的細胞を含有する試料は、試料が２つまたはそれより多いクロマトグラフィーカラム上にロードされ、各カラムが細胞集団の選択を達成する並列選択に付される。一部の実施形態では、２つまたはそれより多いクロマトグラフィーカラムは、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋集団の選択を個別に達成する。一部の実施形態では、親和性クロマトグラフィーまたはゲル浸透クロマトグラフィーを含む２つまたはそれより多いクロマトグラフィーカラムは、同一細胞集団の選択を独立に達成する。例えば、２つまたはそれより多いクロマトグラフィーカラムは、ＣＤ３＋細胞の選択を達成し得る。一部の実施形態では、親和性クロマトグラフィーまたはゲル浸透クロマトグラフィーを含む２つまたはそれより多いクロマトグラフィーカラムは、異なる細胞集団の選択を独立に達成する。例えば、２つまたはそれより多いクロマトグラフィーカラムは、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の選択を独立に達成し得る。一部の実施形態では、例えば、連続選択技術を使用するさらなる選択（単数または複数）を達成して、並列選択によって選択された１つまたは全ての細胞集団の亜集団について濃縮できる。例えば、選択された細胞は、中枢記憶（ＴＣＭ）細胞、ナイーブＴ細胞および／または１つもしくは複数の表面マーカーについてポジティブの細胞もしくは高レベルの１つもしくは複数の表面マーカーを発現する細胞、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋および／またはＣＤ４５ＲＯ＋についてさらに選択され得る。一部の実施形態では、標的細胞を含有する試料は、並列選択が２つまたはそれより多いカラムでＣＤ３＋集団について濃縮するために達成される並列選択に付される。一部の実施形態では、さらなる選択（単数または複数）を達成して、ＣＤ３＋集団の亜集団、例えば、中枢記憶（ＴＣＭ）細胞、ナイーブＴ細胞および／または１つもしくは複数の表面マーカーについてポジティブの細胞もしくは高レベルの１つもしくは複数の表面マーカーを発現する細胞、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋および／またはＣＤ４５ＲＯ＋について濃縮できる。一部の実施形態では、標的細胞を含有する試料は、選択が２つまたはそれより多いカラムで独立にＣＤ３＋集団およびＣＤ４＋集団について濃縮するために達成される並列選択に付される。一部の実施形態では、さらなる選択（単数または複数）を達成して、ＣＤ３＋およびＣＤ４＋集団の亜集団、例えば、中枢記憶（ＴＣＭ）細胞、ナイーブＴ細胞および／または１つもしくは複数の表面マーカーについてポジティブの細胞もしくは高レベルの１つもしくは複数の表面マーカーを発現する細胞、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋および／またはＣＤ４５ＲＯ＋について濃縮できる。一部の実施形態では、標的細胞を含有する試料は、並列選択がＣＤ３＋集団およびＣＤ８＋集団について濃縮するために達成される並列選択に付される。一部の実施形態では、さらなる選択（単数または複数）を達成して、ＣＤ３＋およびＣＤ８＋集団の亜集団、例えば、中枢記憶（ＴＣＭ）細胞、ナイーブＴ細胞および／または１つもしくは複数の表面マーカーについてポジティブの細胞もしくは高レベルの１つもしくは複数の表面マーカーを発現する細胞、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋および／またはＣＤ４５ＲＯ＋について濃縮できる。一部の実施形態では、標的細胞を含有する試料は、ＣＤ４＋集団およびＣＤ８＋集団について濃縮するために達成される並列選択に付される。一部の実施形態では、さらなる選択（単数または複数）を達成して、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団の亜集団、例えば、中枢記憶（ＴＣＭ）細胞、ナイーブＴ細胞および／または１つもしくは複数の表面マーカーについてポジティブの細胞もしくは高レベルの１つもしくは複数の表面マーカーを発現する細胞、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋および／またはＣＤ４５ＲＯ＋について濃縮できる。一部の態様では、Ｔ細胞の特定の亜集団（例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、例えば、１つもしくは複数の表面マーカーについてポジティブの細胞もしくは高レベルの１つもしくは複数の表面マーカーを発現する細胞、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋および／またはＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞は、ポジティブまたはネガティブ並列選択技術によって選択されるということが企図される。一部の実施形態では、連続および並列選択技術は、組み合わせて使用され得る。
一部の実施形態では、２つのカラムが並列選択のために使用される。一部の実施形態では、２つのカラムは同一細胞種（例えば、同一選択マーカー）を選択する。一部の実施形態では、２つのカラムは各々、ＣＤ３＋Ｔ細胞を選択する。
一部の実施形態では、細胞選択は、ＣＤ５７＋細胞を枯渇させ、Ｔ細胞について濃縮するためにポジティブまたはネガティブ選択によって実行される。ＣＤ５７＋細胞を枯渇させるための例示的方法は、ＷＯ２０２０／０９７１３２に記載されている。一部の実施形態では、Ｔ細胞の特定の亜集団、例えば、１つもしくは複数の表面マーカーについてポジティブの細胞もしくは高レベルの１つもしくは複数の表面マーカーを発現する細胞、例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋またはＣＤ５７＋Ｔ細胞は、ポジティブまたはネガティブ選択技術によって単離される。一部の実施形態では、このような細胞は、１つまたは複数の選択剤、例えば、このようなマーカーに特異的に結合する抗体または抗体断片ととものインキュベーションによって選択される。ある特定の実施形態では、ＣＤ５７＋細胞は、ＣＤ５７発現についてポジティブの細胞のネガティブ選択によって試料、例えば、ＰＢＭＣ試料から枯渇され、非選択細胞（ＣＤ５７－細胞）は、第２の固定相上（例えば、第２のクロマトグラフィーカラム中）でＴ細胞について濃縮するために第２の選択のための細胞の供給源として使用され、第１および第２の固定相は、連続して配置される。例えば、一部の実施形態では、ＣＤ５７＋細胞は、ＣＤ５７発現についてポジティブの細胞のネガティブ選択によって試料、例えば、ＰＢＭＣ試料から枯渇され、非選択細胞（ＣＤ５７－細胞）は、第２の固定相上（例えば、第２のクロマトグラフィーカラム中）でＣＤ３＋集団について濃縮するために第２の選択のための細胞の供給源として使用され、第１および第２の固定相は、連続して配置される。
例えば、連続選択において複数のカラム、例えば、第１のクロマトグラフィーカラムおよび第２のクロマトグラフィーカラムを使用する実施形態では、提供された方法は、１つまたは複数の刺激剤または刺激試薬が、細胞の亜集団を選択または濃縮する最終工程において使用される最後のクロマトグラフィーカラム（例えば、第２のクロマトグラフィーカラム）に添加されるように実行される。特定の実施形態では、１つまたは複数の刺激剤または刺激試薬が添加されるべきクロマトグラフィーカラムは、本明細書において提供されたデバイスを使用して加熱することに付される。例えば、温度制御メンバーは、細胞の亜集団を選択または濃縮するために使用され、１つまたは複数の刺激剤または試薬が添加されるべき最後のまたは最終クロマトグラフィーカラム（例えば、第２のクロマトグラフィーカラム）の室温を上回る標的温度に温度を調節するように構成される。一部の実施形態では、標的温度は、１つまたは複数のＴ細胞において刺激シグナルの効率的または効果的デリバリーを提供する細胞の健康および活性を最大化する生理学的温度である。
一般に、固定相（例えば、選択樹脂）の結合能力は、ある特定の数の標的部分、例えば、標的細胞、例えば、Ｔ細胞を選択するためにどれほどの固定相が必要とされるかに影響を及ぼすさ。結合能力、例えば、１ｍＬの固定相（例えば、選択樹脂）当たりの固定され得る標的細胞数を使用して、１つまたは複数のカラム上で捕捉される標的細胞数を決定または管理できる。本明細書で開示されるオンカラム細胞選択および刺激のために１つまたは複数のクロマトグラフィーカラムが使用され得る。複数のカラムが使用される場合には、それらは連続して、並列に、またはそれらの適した組合せで配置され得る。したがって、固定相（例えば、選択樹脂）の結合能力を使用して、単一カラムアプローチにおける試薬量または複数カラムアプローチにおいて各カラムの試薬量を標準化できる。一部の実施形態では、１ｍＬの固定相は、最大１億±０．２５億個の細胞に適応可能である。一部の実施形態では、固定相は、５ｍＬ、１０ｍＬ、１５ｍＬ、２０ｍＬ、２５ｍＬ、３０ｍＬ、３５ｍＬもしくは４０ｍＬまたは約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、約２５ｍＬ、約３０ｍＬ、約３５ｍＬもしくは約４０ｍＬである。一部の実施形態では、固定相は、１０ｍＬまたは約１０ｍＬであり、最大１０億個±２．５億個の細胞に適応可能である。一部の実施形態では、固定相は、２０ｍＬまたは約２０ｍＬであり、２０億個±５億個の細胞に適応可能である。一部の実施形態では、固定相は、４０ｍＬまたは約４０ｍＬであり、約３０億個から約５０億個の間の細胞に適応可能である。
一部の実施形態では、固定相は、５億から５０億個の間または約５億から約５０億個の間の細胞の結合能力を有する。一部の実施形態では、固定相は、５億から４０億個の間または約５億から約４０億個の間の細胞の結合能力を有する。一部の実施形態では、固定相は、５億から３０億個の間または約５億から約３０億個の間の細胞の結合能力を有する。一部の実施形態では、固定相は、５億から２０億個の間または約５億から約２０億個の間の細胞の結合能力を有する。一部の実施形態では、固定相は、１０億から５０億個の間または約１０億から約５０億個の間の細胞の結合能力を有する。一部の実施形態では、固定相は、１０億から４０億個の間または約１０億から約４０億個の間の細胞の結合能力を有する。一部の実施形態では、固定相は、１０億から３０億個の間または約１０億から約３０億個の間の細胞の結合能力を有する。一部の実施形態では、固定相は、１０億から２０億個の間または約１０億から約２０億個の間の細胞の結合能力を有する。
一部の実施形態では、本明細書で使用される固定相の結合能力は、過剰の標的細胞が固定相上にロードされた場合の、所与の溶媒および細胞濃度条件で固定相に結合された標的細胞（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞）の最大数である。一部の実施形態では、結合能力は、１ｍＬの固定相当たり１億±２５００万個または約１億±２５００万個の標的細胞（例えば、Ｔ細胞）である。一部の実施形態では、本明細書で開示される固定相（例えば、選択樹脂）の静的結合能力は、１ｍＬの固定相当たり約７５００万から約１億２５００万個の標的細胞の範囲である。一態様では、オンカラム細胞選択および刺激のために本明細書で使用される固定相の結合能力は、静的結合能力である。一部の実施形態では、静的結合能力は、例えば、ある特定の溶媒および細胞濃度条件で固定相上に固定化されることが可能な細胞の最大量である。一部の実施形態では、本明細書で開示される固定相（例えば、選択樹脂）の静的結合能力は、１ｍＬの固定相当たり約５０００万から約１億個の標的細胞の範囲である。一部の実施形態では、静的結合能力は、１ｍＬの固定相当たり１億±２５００万個または約１億±２５００万個の標的細胞（例えば、Ｔ細胞）である。一部の実施形態では、本明細書で開示される固定相（例えば、選択樹脂）の静的結合能力は、１ｍＬの固定相当たり約７５００万から約１億２５００万個の標的細胞の範囲である。一部の実施形態では、固定相（例えば、選択樹脂）の静的結合能力は、１ｍＬの固定相当たり約１０００万個から約２０００万個の間、約２０００万個から約３０００万個の間、約３０００万個から約４０００万個の間、約４０００万個から約５０００万個の間、約５０００万個から約６０００万個の間、約６０００万個から約７０００万個の間、約７０００万個から約８０００万個の間、約８０００万個から約９０００万個の間、約９０００万個から約１億個の間、約１億１０００万個から約１億２０００万個の間、約１億２０００万個から約１億３０００万個の間、約１億３０００万個から約１億４０００万個の間、約１億４０００万個から約１億５０００万個の間、約１億５０００万個から約１億６０００万個の間、約１億６０００万個から約１億７０００万個の間、約１億７０００万個から約１億８０００万個の間、約１億８０００万個から約１億９０００万個の間または約１億９０００万個から約２億個の間の標的細胞である。
一部の実施形態では、本明細書で使用される固定相の結合能力は、未結合標的細胞の著しいブレイクスルーが生じる前の、所与のフロー条件下で固定相に結合する標的細胞（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞）の数である。一態様では、オンカラム細胞選択および刺激のために本明細書で使用される固定相の結合能力は、動的結合能力、すなわち、試料適用の際の充填されたクロマトグラフィーカラムにおける操作条件下での結合能力である。一部の実施形態では、動的結合能力は、既知濃度の標的細胞を含有する試料をロードすることおよびフロースルーをモニタリングすることによって決定され、標的細胞は、ある特定の限界点まで固定相に結合し、その後、未結合標的細胞は、カラムを通って流れる。一部の実施形態では、動的結合能力は、１ｍＬの固定相当たり１億±２５００万個または約１億±２５００万個の標的細胞（例えば、Ｔ細胞）である。一部の実施形態では、本明細書で開示される固定相（例えば、選択樹脂）の動的結合能力は、１ｍＬの固定相当たり７５００万個から１億２５００万個の間または約７５００万個から約１億２５００万個の標的細胞である。一部の実施形態では、本明細書で開示される固定相（例えば、選択樹脂）の動的結合能力は、１ｍＬの固定相当たり約５０００万個から約１億個の標的細胞の範囲である。一部の実施形態では、固定相（例えば、選択樹脂）の動的結合能力は、１ｍＬの固定相当たり約１０００万個から約２０００万個の間、約２０００万個から約３０００万個の間、約３０００万個から約４０００万個の間、約４０００万個から約５０００万個の間、約５０００万個から約６０００万個の間、約６０００万個から約７０００万個の間、約７０００万個から約８０００万個の間、約８０００万個から約９０００万個の間、約９０００万個から約１億個の間、約１億１０００万個から約１億２０００万個の間、約１億２０００万個から約１億３０００万個の間、約１億３０００万個から約１億４０００万個の間、約１億４０００万個から約１億５０００万個の間、約１億５０００万個から約１億６０００万個の間、約１億６０００万個から約１億７０００万個の間、約１億７０００万個から約１億８０００万個の間、約１億８０００万個から約１億９０００万個の間または約１億９０００万個から約２億個の間の標的細胞である。
一部の実施形態では、固定相は２０ｍＬである。一部の実施形態では、固定相は、２０億±５億個の細胞の結合能力を有する。
一部の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）から未結合細胞および細片を除去するために１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６）の洗浄工程が使用され、その結果、クロマトグラフィーカラムのクロマトグラフィーマトリックス上に固定化されている選択された細胞の濃縮集団が得られる。ある特定の実施形態では、単離および／または選択は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％または１００％または約１００％のＴ細胞またはそのサブセットまたは亜集団を含む、カラムのクロマトグラフィーマトリックス上に固定化されている濃縮Ｔ細胞の１つまたは複数の集団をもたらす。ある特定の実施形態では、単離および／または選択は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％または１００％または約１００％のＣＤ３＋Ｔ細胞またはそのサブセットまたは亜集団を含む、カラムのクロマトグラフィーマトリックス上に固定化されている濃縮Ｔ細胞の１つまたは複数の集団をもたらす。
２．オンカラム刺激
特定の態様では、刺激の開始（本明細書ではインキュベーションの開始とも呼ばれる）は、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）上に固定化されている試料の標的細胞（例えば、Ｔ細胞）が、刺激剤に対して最初に接触される、また曝露される時点で生じる。提供された実施形態では、節Ｉ－Ｃに記載されるように、刺激の開始の前に、標的細胞（例えばＴ細胞）を含有する試料が、目的の標的細胞の特異的選択のために選択剤が結合される、または固定化されるクロマトグラフィーマトリックスを含有するカラムに添加され、細胞をクロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）上に標的細胞を固定化する条件下でインキュベートする。一部の実施形態では、細胞を、刺激試薬（例えば、オリゴマー刺激試薬）または刺激剤の添加の前に約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００または約１２０分間カラムに浸透させる。一部の実施形態では、カラムは、刺激試薬（例えば、オリゴマー刺激試薬）または刺激剤の添加の前に少なくとも１（１、２、３、４、５）回洗浄される。一部の実施形態では、試料がクロマトグラフィーカラム（例えば、固定相）に添加された３０、３５、４０、４５、５０、５５もしくは６０分後に、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５もしくは約６０分後に、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５もしくは６０分後に、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬（例えば、オリゴマー刺激試薬）が添加される。一部の実施形態では、試料がカラムに添加された後、約１５～約１２０分の間に、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬（例えば、オリゴマー刺激試薬）が添加される。一部の実施形態では、試料がカラムに添加された後、約１５～約１００分の間に、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬（例えば、オリゴマー刺激試薬）が添加される。一部の実施形態では、試料がカラムに添加された後、約１５～約９０分の間に、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬（例えば、オリゴマー刺激試薬）が添加される。一部の実施形態では、試料がカラムに添加された後、約１５～約８０分の間に、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬（例えば、オリゴマー刺激試薬）が添加される。一部の実施形態では、試料がカラムに添加された後、境界を含めて約１５～約７０分の間に、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬（例えば、オリゴマー刺激試薬）が添加される。一部の実施形態では、試料がカラムに添加された後、境界を含めて約１５～約６０分の間に、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬（例えば、オリゴマー刺激試薬）が添加される。一部の実施形態では、試料がカラムに添加された後、境界を含めて約１５～約５０分の間に、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬（例えば、オリゴマー刺激試薬）が添加される。一部の実施形態では、試料がカラムに添加された後、境界を含めて約１５～約４０分の間に、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬（例えば、オリゴマー刺激試薬）が添加される。一部の実施形態では、試料がカラムに添加された後、境界を含めて約１５～約３０分の間に、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬（例えば、オリゴマー刺激試薬）が添加される。一部の実施形態では、試料がカラムに添加された後、境界を含めて約３０～約１２０分の間に、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬（例えば、オリゴマー刺激試薬）が添加される。一部の実施形態では、試料がカラムに添加された後、境界を含めて約３０～約１００分の間に、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬（例えば、オリゴマー刺激試薬）が添加される。一部の実施形態では、試料がカラムに添加された後、境界を含めて約３０～約９０分の間に、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬（例えば、オリゴマー刺激試薬）が添加される。一部の実施形態では、試料がカラムに添加された後、境界を含めて約３０～約８０分の間に、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬（例えば、オリゴマー刺激試薬）が添加される。一部の実施形態では、試料がカラムに添加された後、境界を含めて約３０～約７０分の間に、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬（例えば、オリゴマー刺激試薬）が添加される。一部の実施形態では、試料がカラムに添加された後、境界を含めて約３０～約６０分の間に、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬（例えば、オリゴマー刺激試薬）が添加される。一部の実施形態では、試料がカラムに添加された後、境界を含めて約３０～約５０分の間に、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬（例えば、オリゴマー刺激試薬）が添加される。一部の実施形態では、試料がカラムに添加された後、境界を含めて約３０～約４０分の間に、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬（例えば、オリゴマー刺激試薬）が添加される。一部の実施形態では、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬（例えば、オリゴマー刺激試薬）をカラムに添加する前に少なくとも１つの洗浄工程が実施される。
特定の実施形態では、試料から選択された５０×１０６、１００×１０６、１５０×１０６、２００×１０６、２５０×１０６、３００×１０６、３５０×１０６、４００×１０６、４５０×１０６、５００×１０６、５５０×１０６、６００×１０６、７００×１０６、８００×１０６、９００×１０６、１，０００×１０６、１２５０×１０６、１５００×１０６、１７５０×１０６、２０００×１０６、２２５０×１０６、２５００×１０６、２７５０×１０６、３０００×１０６、３２５０×１０６、３５００×１０６、３７５０×１０６、４０００×１０６、４２５０×１０６、４５００×１０６、４７５０×１０６もしくは５０００×１０６個の、約５０×１０６、約１００×１０６、約１５０×１０６、約２００×１０６、約２５０×１０６、約３００×１０６、約３５０×１０６、約４００×１０６、約４５０×１０６、約５００×１０６、約５５０×１０６、約６００×１０６、約７００×１０６、約８００×１０６、約９００×１０６、約１，０００×１０６、約１２５０×１０６、約１５００×１０６、約１７５０×１０６、約２０００×１０６、約２２５０×１０６、約２５００×１０６、約２７５０×１０６、約３０００×１０６、約３２５０×１０６、約３５００×１０６、約３７５０×１０６、約４０００×１０６、約４２５０×１０６、約４５００×１０６、約４７５０×１０６もしくは約５０００×１０６個の、または少なくとも５０×１０６、１００×１０６、１５０×１０６、２００×１０６、２５０×１０６、３００×１０６、３５０×１０６、４００×１０６、４５０×１０６、５００×１０６、５５０×１０６、６００×１０６、７００×１０６、８００×１０６、９００×１０６、１，０００×１０６、１２５０×１０６、１５００×１０６、１７５０×１０６、２０００×１０６、２２５０×１０６、２５００×１０６、２７５０×１０６、３０００×１０６、３２５０×１０６、３５００×１０６、３７５０×１０６、４０００×１０６、４２５０×１０６、４５００×１０６、４７５０×１０６もしくは５０００×１０６個の量の細胞が刺激される、例えば、刺激条件下でインキュベートされる。一部の実施形態では、選択された細胞は、単一カラム（例えば、クロマトグラフィーマトリックスを含有する）上に固定化されている。例えば、試料から選択された細胞の総量は、単一カラム上に固定化されており、単一カラム上に固定化された細胞は、刺激条件下でインキュベートされる。一部の実施形態では、選択された細胞は、２つのカラム（例えば、各々クロマトグラフィーマトリックスを含有する）上に固定化されている。例えば、試料から選択された細胞の総量は、２つのカラム（例えば、各カラム（例えば、クロマトグラフィーマトリックス）は、それに固定化された細胞の総量の半分または約半分を含有する）上に固定化されており、２つのカラム上に固定化された細胞は、刺激条件下でインキュベートされる。ある特定の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）上に固定化されている細胞、例えば、選択された細胞（例えば、Ｔ細胞）は、刺激される、例えば、刺激条件下、例えば、刺激剤の存在下、０．０１×１０６細胞／ｍＬ、０．１×１０６個細胞／ｍＬ、０．５×１０６個細胞／ｍＬ、１．０×１０６個細胞／ｍＬ、１．５×１０６個細胞／ｍＬ、２．０×１０６個細胞／ｍＬ、２．５×１０６個細胞／ｍＬ、３．０×１０６個細胞／ｍＬ、４．０×１０６個細胞／ｍＬ、５．０×１０６個細胞／ｍＬ、１０×１０６個細胞／ｍＬ、５０×１０６個細胞／ｍＬ、７５×１０６個細胞／ｍＬ、１００×１０６個細胞／ｍＬ、１２５×１０６個細胞／ｍＬ、１５０×１０６個細胞／ｍＬもしくは２００×１０６個細胞／ｍＬの、約０．０１×１０６細胞／ｍＬ、約０．１×１０６個細胞／ｍＬ、約０．５×１０６個細胞／ｍＬ、約１．０×１０６個細胞／ｍＬ、約１．５×１０６個細胞／ｍＬ、約２．０×１０６個細胞／ｍＬ、約２．５×１０６個細胞／ｍＬ、約３．０×１０６個細胞／ｍＬ、約４．０×１０６個細胞／ｍＬ、約５．０×１０６個細胞／ｍＬ、約１０×１０６個細胞／ｍＬ、約５０×１０６個細胞／ｍＬ、約７５×１０６個細胞／ｍＬ、約１００×１０６個細胞／ｍＬ、約１２５×１０６個細胞／ｍＬ、約１５０×１０６個細胞／ｍＬもしくは約２００×１０６個細胞／ｍＬの、または少なくとも０．０１×１０６細胞／ｍＬ、０．１×１０６個細胞／ｍＬ、０．５×１０６個細胞／ｍＬ、１．０×１０６個細胞／ｍＬ、１．５×１０６個細胞／ｍＬ、２．０×１０６個細胞／ｍＬ、２．５×１０６個細胞／ｍＬ、３．０×１０６個細胞／ｍＬ、４．０×１０６個細胞／ｍＬ、５．０×１０６個細胞／ｍＬ、１０×１０６個細胞／ｍＬ、５０×１０６個細胞／ｍＬ、７５×１０６個細胞／ｍＬ、１００×１０６個細胞／ｍＬ、１２５×１０６個細胞／ｍＬ、１５０×１０６個細胞／ｍＬもしくは２００×１０６個細胞／ｍＬの密度でインキュベートされる。ある特定の実施形態では、固定相上に固定化されている細胞、例えば、選択された細胞（例えば、Ｔ細胞）は、刺激される、例えば、刺激条件下、例えば、刺激剤の存在下で、３．０×１０６個細胞／ｍＬの、約３．０×１０６個細胞／ｍＬの、または少なくとも３．０×１０６個細胞／ｍＬの密度でインキュベートされる。ある特定の実施形態では、固定相上に固定化されている細胞、例えば、選択された細胞（例えば、Ｔ細胞）は、刺激される、例えば、刺激条件下、例えば、刺激剤の存在下で、１億±２５００万個または約１億±２５００万個細胞／ｍＬの密度でインキュベートされる。ある特定の実施形態では、選択された細胞は生細胞である。
一部の実施形態では、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬は、１×１０６個細胞当たり０．２５、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３μｇの、約０．２５、約０．５、約０．７５、約１、約１．２５、約１．５、約１．７５、約２、約２．２５、約２．５、約２．７５、約３μｇの、または少なくとも０．２５、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３μｇの濃度でカラムに添加される。一部の実施形態では、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬は、１×１０６個細胞当たり０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５μｇの、約０．７５、約１、約１．２５、約１．５、約１．７５、約２、約２．２５μｇの、または少なくとも０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５μｇの濃度で固定化された細胞を含有するカラムに添加される。一部の実施形態では、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬は、１×１０６個細胞当たり１～２μｇまたは約１～２μｇの濃度でカラムに添加される。一部の実施形態では、刺激試薬は、節Ｉ－Ｂ－２に記載されるもの等のオリゴマー刺激試薬である。一部の実施形態では、オリゴマー刺激試薬は、１×１０６個細胞当たり１～２μｇの間または約１～２μｇの間の濃度で固定化された細胞を含有するカラムに添加される。一部の実施形態では、５×１０８のオリゴマー刺激試薬は、固定化された細胞を含有するカラムに添加される。２つまたはそれより多いカラムが、刺激のために固定化された細胞を含有する場合には、本明細書で記載される刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬（例えば、オリゴマー刺激試薬）の濃度または量が、各カラムに添加されるまたは適用される。
一部の実施形態では、刺激のための条件は、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、薬剤、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオンおよび／または刺激性因子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体および細胞を活性化するために設計される任意の他の薬剤のうち１つまたは複数を含み得る。一部の実施形態では、温度は３７℃または約３７℃である。一部の実施形態では、酸素および二酸化炭素含量は、ガス交換を使用して制御される。
特定の実施形態では、刺激条件には、試料の細胞、例えば、選択された細胞を１種もしくは複数のサイトカインの存在と共におよび／またはその存在下でインキュベートすることが含まれる。特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、組換えサイトカインである。一部の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、ヒト組換えサイトカインである。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、選択された細胞（例えば、Ｔ細胞）によって発現される、および／または選択された細胞（例えば、Ｔ細胞）にとって内因性である受容体に結合する、および／またはそれに結合可能である。特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、サイトカインの４－アルファ－ヘリックスバンドルファミリーのメンバーであるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、サイトカインの４－アルファ－ヘリックスバンドルファミリーのメンバーには、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、ＩＬ－１５であるか、またはこれを含む。特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、ＩＬ－７であるか、またはこれを含む。特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、ＩＬ－２であるか、またはこれを含む。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインの量または濃度は、国際単位（ＩＵ）を用いて測定および／または定量化される。国際単位は、ビタミン、ホルモン、サイトカイン、ワクチン、血液製品および同様の生物活性物質を定量化するために使用され得る。一部の実施形態では、ＩＵは、比重および強度の国際参照標準、例えば、ＷＨＯヒトＩＬ－２の第１国際標準、８６／５０４との比較による生物学的調製物の効力の測定単位であるか、またはこれを含む。国際単位は、公開されており、国際的な共同研究活動に由来する、生物活性単位を報告するための唯一の認識され、標準化された方法である。特定の実施形態では、サイトカインの集団、試料または供給源のＩＵは、類似のＷＨＯ標準製品を用いる製品比較試験によって得ることができる。例えば、一部の実施形態では、ヒト組換えＩＬ－２、ＩＬ－７またはＩＬ－１５の集団、試料または供給源のＩＵ／ｍｇは、それぞれ、ＷＨＯ標準ＩＬ－２製品（ＮＩＢＳＣコード：８６／５００）、ＷＨＯ標準ＩＬ－１７製品（ＮＩＢＳＣコード：９０／５３０）およびＷＨＯ標準ＩＬ－１５製品（ＮＩＢＳＣコード：９５／５５４）に対して比較される。
一部の実施形態では、ＩＵ／ｍｇでの生物活性は、（ｎｇ／ｍｌでのＥＤ５０）－１×１０６と同等である。特定の実施形態では、組換えヒトＩＬ－２またはＩＬ－１５のＥＤ５０は、ＣＴＬＬ－２細胞を用いた細胞増殖の最大半量の刺激（ＸＴＴ切断）に必要な濃度と同等である。ある特定の実施形態では、組換えヒトＩＬ－７のＥＤ５０は、ＰＨＡ活性化ヒト末梢血リンパ球の増殖の最大半量の刺激に必要な濃度と同等である。ＩＬ－２のアッセイおよびＩＵの算出に関連する詳細は、Wadhwa et al., Journal of Immunological Methods (2013), 379 (1-2): 1-7；およびGearing and Thorpe, Journal of Immunological Methods (1988), 114 (1-2): 3-9に論じられており、ＩＬ－１５のアッセイおよびＩＵの算出に関連する詳細は、Soman et al. Journal of Immunological Methods (2009) 348 (1-2): 83-94に論じられている。
一部の実施形態では、細胞、例えば、試料における選択された細胞は、１ＩＵ／ｍＬ～１，０００ＩＵ／ｍＬ、１０ＩＵ／ｍＬ～５０ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ～１００ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ～２００ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ、２５０ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ、または５００ＩＵ／ｍＬ～１，０００ＩＵ／ｍＬの濃度のサイトカイン、例えば、組換えヒトサイトカイン、の存在下において刺激される。
一部の実施形態では、細胞、例えば、試料の選択された細胞は、１ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ、１０ＩＵ／ｍＬ～２５０ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ～２００ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ～１５０ＩＵ／ｍＬ、７５ＩＵ／ｍＬ～１２５ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ～２００ＩＵ／ｍＬ、または１０ＩＵ／ｍＬ～１００ＩＵ／ｍＬの濃度のＩＬ－２、例えば、ヒト組換えＩＬ－２、の存在下において刺激される。特定の実施形態において、細胞、例えば、試料における選択された細胞は、５０ＩＵ／ｍＬ、６０ＩＵ／ｍＬ、７０ＩＵ／ｍＬ、８０ＩＵ／ｍＬ、９０ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ、１１０ＩＵ／ｍＬ、１２０ＩＵ／ｍＬ、１３０ＩＵ／ｍＬ、１４０ＩＵ／ｍＬ、１５０ＩＵ／ｍＬ、１６０ＩＵ／ｍＬ、１７０ＩＵ／ｍＬ、１８０ＩＵ／ｍＬ、１９０ＩＵ／ｍＬ、または１００ＩＵ／ｍＬの濃度、あるいは約５０ＩＵ／ｍＬ、６０ＩＵ／ｍＬ、７０ＩＵ／ｍＬ、８０ＩＵ／ｍＬ、９０ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ、１１０ＩＵ／ｍＬ、１２０ＩＵ／ｍＬ、１３０ＩＵ／ｍＬ、１４０ＩＵ／ｍＬ、１５０ＩＵ／ｍＬ、１６０ＩＵ／ｍＬ、１７０ＩＵ／ｍＬ、１８０ＩＵ／ｍＬ、１９０ＩＵ／ｍＬ、または１００ＩＵ／ｍＬの濃度の組換えＩＬ－２の存在下において刺激される。一部の実施形態では、細胞、例えば、試料の選択された細胞は、１００ＩＵ／ｍＬまたは約１００ＩＵ／ｍＬの組換えＩＬ－２、例えば、ヒト遺伝子組換えＩＬ－２、の存在下において刺激される。
一部の実施形態では、細胞、例えば、試料の選択された細胞は、１００ＩＵ／ｍＬ～２，０００ＩＵ／ｍＬ、５００ＩＵ／ｍＬ～１，０００ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ、５００ＩＵ／ｍＬ～７５０ＩＵ／ｍＬ、７５０ＩＵ／ｍＬ～１，０００ＩＵ／ｍＬ、または５５０ＩＵ／ｍＬ～６５０ＩＵ／ｍＬの濃度の組換えＩＬ－７、例えば、ヒト組換えＩＬ－７の存在下において刺激される。特定の実施形態において、細胞、例えば、インプット細胞は、５０ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ、１５０ＩＵ／ｍＬ、２００ＩＵ／ｍＬ、２５０ＩＵ／ｍＬ、３００ＩＵ／ｍＬ、３５０ＩＵ／ｍＬ、４００ＩＵ／ｍＬ、４５０ＩＵ／ｍＬ、５００ＩＵ／ｍＬ、５５０ＩＵ／ｍＬ、６００ＩＵ／ｍＬ、６５０ＩＵ／ｍＬ、７００ＩＵ／ｍＬ、７５０ＩＵ／ｍＬ、８００ＩＵ／ｍＬ、７５０ＩＵ／ｍＬ、７５０ＩＵ／ｍＬ、７５０ＩＵ／ｍＬ、または１，０００ＩＵ／ｍＬの濃度、あるいは約５０ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ、１５０ＩＵ／ｍＬ、２００ＩＵ／ｍＬ、２５０ＩＵ／ｍＬ、３００ＩＵ／ｍＬ、３５０ＩＵ／ｍＬ、４００ＩＵ／ｍＬ、４５０ＩＵ／ｍＬ、５００ＩＵ／ｍＬ、５５０ＩＵ／ｍＬ、６００ＩＵ／ｍＬ、６５０ＩＵ／ｍＬ、７００ＩＵ／ｍＬ、７５０ＩＵ／ｍＬ、８００ＩＵ／ｍＬ、７５０ＩＵ／ｍＬ、７５０ＩＵ／ｍＬ、７５０ＩＵ／ｍＬ、または１，０００ＩＵ／ｍＬの濃度のＩＬ－７の存在下において刺激される。特定の実施形態において、細胞、例えば、試料の選択された細胞は、６００ＩＵ／ｍＬまたは約６００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７の存在下において刺激される。
一部の実施形態では、細胞、例えば、試料の選択された細胞は、１ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ、１０ＩＵ／ｍＬ～２５０ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ～２００ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ～１５０ＩＵ／ｍＬ、７５ＩＵ／ｍＬ～１２５ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ～２００ＩＵ／ｍＬ、または１０ＩＵ／ｍＬ～１００ＩＵ／ｍＬの濃度の組換えＩＬ－１５、例えば、ヒト組換えＩＬ－１５、の存在下において刺激される。特定の実施形態において、細胞、例えば、インプット集団の細胞は、５０ＩＵ／ｍＬ、６０ＩＵ／ｍＬ、７０ＩＵ／ｍＬ、８０ＩＵ／ｍＬ、９０ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ、１１０ＩＵ／ｍＬ、１２０ＩＵ／ｍＬ、１３０ＩＵ／ｍＬ、１４０ＩＵ／ｍＬ、１５０ＩＵ／ｍＬ、１６０ＩＵ／ｍＬ、１７０ＩＵ／ｍＬ、１８０ＩＵ／ｍＬ、１９０ＩＵ／ｍＬ、または２００ＩＵ／ｍＬの濃度、あるいは約５０ＩＵ／ｍＬ、６０ＩＵ／ｍＬ、７０ＩＵ／ｍＬ、８０ＩＵ／ｍＬ、９０ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ、１１０ＩＵ／ｍＬ、１２０ＩＵ／ｍＬ、１３０ＩＵ／ｍＬ、１４０ＩＵ／ｍＬ、１５０ＩＵ／ｍＬ、１６０ＩＵ／ｍＬ、１７０ＩＵ／ｍＬ、１８０ＩＵ／ｍＬ、１９０ＩＵ／ｍＬ、または２００ＩＵ／ｍＬの濃度の組換えＩＬ－１５の存在下において刺激される。一部の実施形態では、細胞、例えば、試料の選択された細胞は、１００ＩＵ／ｍＬまたは約１００ＩＵ／ｍＬの組換えＩＬ－１５、例えば、ヒト遺伝子組換えＩＬ－２の存在下において刺激される。
特定の実施形態において、細胞、例えば、試料の選択された細胞は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５の存在下での刺激条件下において刺激される。一部の実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５は、組換え型である。ある特定の実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５は、ヒト型である。特定の実施形態において、１つまたは複数のサイトカインは、ヒト組換えＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５であるかまたはそれを含む。ある特定の実施形態では、細胞、例えば、試料の選択された細胞は、組換えＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５の存在下での刺激条件において刺激される。一部の実施形態では、刺激条件は、グルタミンをさらに含む。
条件には、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、剤、例えば、栄養分、アミノ酸、抗生物質、イオン、および／または刺激因子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、および細胞を活性化するように設計された任意の他の剤のうちの１つまたは複数を挙げることができる。
一部の態様では、刺激は、Riddell et al.の米国特許第6,040,1 77号、Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660、Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82、および／またはWang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701に記載されるもの等の技術に従って実施される。
一部の実施形態では、刺激剤は、クロマトグラフィーカラムのクロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）に直接的または間接的に結合する。一部の実施形態では、刺激剤は、例えば、上記において説明される選択試薬または本明細書において説明される刺激試薬によって、クロマトグラフィーカラムのクロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）に間接的に結合する。一部の実施形態では、刺激剤は、刺激試薬に含まれる。一部の実施形態では、刺激試薬は、クロマトグラフィーカラムのクロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）に結合する。一部の実施形態では、刺激試薬は、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）に共有結合する。一部の実施形態では、刺激剤は、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）に非共有結合する。
一部の実施形態では、刺激試薬は、固体担体、固定相、ビーズ、マイクロ粒子、磁性粒子、および／またはマトリックスに結合しないかまたは会合しない。一部の実施形態では、刺激試薬は、柔軟であり、金属または磁気コアを含まず、完全にまたは主に有機多量体で構成され、ならびに／あるいは剛性ではない。一部の実施形態では、刺激試薬は、可溶性である。一部の実施形態では、刺激試薬は、オリゴマー性刺激試薬である。一部の実施形態では、オリゴマー性刺激試薬は、可溶性である。したがって、一部の実施形態では、刺激試薬、例えば、オリゴマー性刺激試薬など、は、カラムと会合しない。一部の実施形態では、刺激試薬、例えば、オリゴマー性刺激試薬など、が、カラムに添加される。
ある特定の実施形態では、細胞が刺激剤によってインキュベートされるかまたは刺激剤と接触するとき、刺激の開始が生じる。したがって、刺激剤が、カラムのクロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）に、直接的に結合するかまたは、例えば、選択試薬または刺激試薬などを介して間接的に結合するような、一部の実施形態では、刺激の開始は、標的細胞を含む試料が、カラムのクロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）に添加されたときに生じる。一部の実施形態では、刺激剤が、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）に会合していない（例えば、結合していない）刺激試薬に含まれる場合、刺激の開始は、刺激試薬（例えば、オリゴマー性刺激試薬）が、試料の標的細胞が固定化されている固定相に添加されたときに生じる。一部の実施形態では、刺激剤が、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）に直接的または間接的に結合せず、ならびに、刺激試薬（例えば、オリゴマー性刺激試薬）に含まれない場合、刺激の開始は、刺激剤が、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）に添加されたときに生じる。
一部の実施形態では、刺激条件または刺激試薬（例えば、オリゴマー性刺激試薬）は、ＴＣＲ複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる１種または複数種の刺激剤を含む。一部の実施形態では、本明細書において想定される刺激試薬として、これらに限定されるわけではないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質（例えば、酵素）、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、炭水化物、脂質、レシチン、または所望の標的に対して親和性を有する任意の他のバイオ分子を挙げることができる。一部の実施形態では、所望の標的は、Ｔ細胞受容体および／またはＴ細胞受容体の構成要素である。ある特定の実施形態では、所望の標的はＣＤ３である。ある特定の実施形態では、所望の標的は、Ｔ細胞共刺激分子、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１－ＢＢ）、ＯＸ４０またはＩＣＯＳである。
一部の実施形態では、刺激試薬（例えば、オリゴマー性刺激試薬）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）上の以下の巨大分子：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ－１）、ＣＤ１２７、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＯＸ４０、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－１５Ｒ；ＩＦＮ－γＲ、ＴＮＦ－αＲ、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－１０Ｒ、ＣＤ１８／ＣＤｌｌａ（ＬＦＡ－１）、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）、ＣＤ２９／ＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ－４）、ノッチリガンド（例えば、デルタ様１／４、Ｊａｇｇｅｄ１／２など）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、およびＣＸＣＲ３、あるいはその断片（これらの巨大分子またはその断片に対する対応するリガンドを含む）の１つまたは複数に結合する１種または複数種の刺激剤を含む。一部の実施形態では、刺激剤は、細胞（例えば、Ｔ細胞）上の以下の高分子のうち１つまたは複数に特異的に結合する：ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ１２７、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡおよび／またはＣＤ４５ＲＯ。
一部の実施形態では、刺激剤は、Ｔ細胞受容体の１つまたは複数の成分に結合しおよび／またはそれを認識する抗体である。特定の実施形態において、刺激剤は、抗ＣＤ３抗体である。ある特定の実施形態では、刺激剤は、共刺激分子に結合しおよび／またはそれを認識する抗体である。ある特定の実施形態では、刺激剤は、抗ＣＤ２８抗体である。一部の実施形態では、刺激試薬は、抗ＣＤ２８抗体および抗ＣＤ３抗体（例えば、刺激剤）を含む。一部の実施形態では、第１の刺激剤は、例えば、本明細書において説明されるような、抗ＣＤ３ Ｆａｂであり、ならびに第２の刺激剤は、例えば、本明細書において説明されるような、抗ＣＤ２８ Ｆａｂである。
先行の実施形態のいずれにおいて、刺激試薬は、（ｉ）複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子と、（ｉｉ）１つまたは複数のＴ細胞において刺激シグナルを送達することができる１つまたは複数の刺激剤とを含むオリゴマー性刺激試薬を含み得るかまたはそれであり得、この場合、オリゴマー性刺激試薬のサイズは、ｉ）５０ｎｍ以上の半径、ｉｉ）少なくとも５×１０６ｇ／ｍｏｌの分子量；および／または（ｉｉｉ）オリゴマー性刺激試薬１つあたり少なくとも１００のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン四量体、を含む。例えば、ストレプトアビジンムテインは、配列番号１に記載されるアミノ酸の配列におけるストレプトアビジンの位置を基準にして位置４４～４７に対応する配列位置に、アミノ酸配列Ｖａ１４４－Ｔｈｒ４５－Ａｌａ４６－Ａｒｇ４７またはｌｌｅ４４－Ｇｌｙ４５－Ａｌａ４６－Ａｒｇ４７を含み得る。他の実施例において、ストレプトアビジンムテインは、配列番号１に記載されるアミノ酸の配列におけるストレプトアビジンの位置を基準にして位置４４～４７に対応する配列位置に、アミノ酸配列Ｖａ１４４－Ｔｈｒ４５－Ａｌａ４６－Ａｒｇ４７を含む。一部の実施形態では、刺激試薬は、抗ＣＤ２８抗体および抗ＣＤ３抗体（例えば、刺激剤）を含む。一部の実施形態では、第１の刺激剤は、例えば、本明細書において説明されるような、抗ＣＤ３ Ｆａｂであり、ならびに、第２の刺激剤は、例えば、本明細書において説明されるような、抗ＣＤ２８ Ｆａｂである。
一部の実施形態では、例えば、刺激剤が、刺激試薬（例えば、オリゴマー性刺激試薬）または選択試薬に結合しない場合、刺激剤は、抗体、二価の抗体断片、（Ｆａｂ）２、または二価の単鎖Ｆｖ断片である。
一部の実施形態では、細胞、例えば、試料の選択された細胞は、３：１、２．５：１、２：１、１．５：１、１．２５：１、１．２：１、１．１：１、１：１、０．９：１、０．８：１、０．７５：１、０．６７：１、０．５：１、０．３：１、または０．２：１、あるいは約３：１、２．５：１、２：１、１．５：１、１．２５：１、１．２：１、１．１：１、１：１、０．９：１、０．８：１、０．７５：１、０．６７：１、０．５：１、０．３：１、または０．２：１の、刺激試薬の細胞に対する比率の存在下において刺激される。特定の実施形態において、刺激試薬の細胞に対する比率は、２．５：１～０．２：１、２：１～０．５：１、１．５：１～０．７５：１、１．２５：１～０．８：１、１．１：１～０．９：１である。特定の実施形態において、刺激試薬の細胞に対する比率は、約１：１であるかまたは１：１である。特定の実施形態において、刺激試薬の細胞に対する比率は、約０．３：１であるかまたは０．３：１である。特定の実施形態において、刺激試薬の細胞に対する比率は、約０．２：１であるかまたは０．２：１である。
一部の実施形態では、細胞は、細胞１０６個あたり０．１μｇ～２０μｇまたは約０．１μｇ～２０μｇ（境界値を含む）の刺激試薬の存在下において刺激される。一部の実施形態では、細胞は、細胞１０６個あたり０．８μｇ～４μｇまたは約０．８μｇ～４μｇ（境界値を含む）の刺激試薬の存在下において刺激される。一部の実施形態では、細胞は、細胞１０６個あたり０．８μｇ～４μｇまたは約０．８μｇ～４μｇ（境界値を含む）の刺激試薬の存在下において刺激される。一部の実施形態では、細胞が、細胞１０６個あたり０．０１μｇ、０．０２μｇ、０．０３μｇ、０．０４μｇ、０．０５μｇ、０．１μｇ、０．２μｇ、０．３μｇ、０．４μｇ、０．５μｇ、０．７５μｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、または１０μｇ、あるいは約０．０１μｇ、０．０２μｇ、０．０３μｇ、０．０４μｇ、０．０５μｇ、０．１μｇ、０．２μｇ、０．３μｇ、０．４μｇ、０．５μｇ、０．７５μｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、または１０μｇ、あるいは少なくとも０．０１μｇ、０．０２μｇ、０．０３μｇ、０．０４μｇ、０．０５μｇ、０．１μｇ、０．２μｇ、０．３μｇ、０．４μｇ、０．５μｇ、０．７５μｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、または１０μｇの刺激試薬の存在下において刺激される。一部の実施形態では、細胞は、細胞１０６個あたり４μｇまたは約４μｇの刺激試薬の存在下において刺激される。特定の実施形態において、細胞は、細胞１０６個あたり０．８μｇまたは約０．８μｇの刺激試薬の存在下において刺激される。特定の実施形態において、細胞は、細胞１０６個あたり３μｇまたは約３μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。特定の実施形態において、細胞は、細胞１０６個あたり２．５μｇまたは約２．５μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。特定の実施形態において、細胞は、２μｇまたは約２μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。特定の実施形態において、細胞は、細胞１０６個あたり１．８μｇまたは約１．８μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。特定の実施形態において、細胞は、細胞１０６個あたり１．６μｇまたは約１．６μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。特定の実施形態において、細胞は、細胞１０６個あたり１．４μｇまたは約１．４μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。特定の実施形態において、細胞は、細胞１０６個あたり１．２μｇまたは約１．２μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。特定の実施形態において、細胞は、細胞１０６個あたり１μｇまたは約１μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。特定の実施形態において、細胞は、細胞１０６個あたり０．８μｇまたは約０．８μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。
一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定または予想される数１０６あたり０．１μｇ～２０μｇまたは約０．１μｇ～２０μｇ（境界値を含む）の刺激試薬の存在下において刺激される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定または予想される数１０６あたり０．８μｇ～４μｇまたは約０．８μｇ～４μｇ（境界値を含む）の刺激試薬の存在下において刺激される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定または予想される数１０６あたり０．８μｇ～４μｇまたは約０．８μｇ～４μｇ（境界値を含む）の刺激試薬の存在下において刺激される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定または予想される数１０６あたり０．０１μｇ、０．０２μｇ、０．０３μｇ、０．０４μｇ、０．０５μｇ、０．１μｇ、０．２μｇ、０．３μｇ、０．４μｇ、０．５μｇ、０．７５μｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、または１０μｇ、あるいは約０．０１μｇ、０．０２μｇ、０．０３μｇ、０．０４μｇ、０．０５μｇ、０．１μｇ、０．２μｇ、０．３μｇ、０．４μｇ、０．５μｇ、０．７５μｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、または１０μｇ、あるいは少なくとも０．０１μｇ、０．０２μｇ、０．０３μｇ、０．０４μｇ、０．０５μｇ、０．１μｇ、０．２μｇ、０．３μｇ、０．４μｇ、０．５μｇ、０．７５μｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、または１０μｇの刺激試薬存在下において刺激される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定または予想される数１０６あたり４μｇまたは約４μｇの刺激試薬存在下において刺激される。特定の実施形態において、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定または予想される数１０６あたり０．８μｇまたは約０．８μｇの刺激試薬存在下において刺激される。特定の実施形態において、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定または予想される数１０６あたり３μｇまたは約３μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。特定の実施形態において、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定または予想される数１０６あたり２．５μｇまたは約２．５μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。特定の実施形態において、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定または予想される数１０６あたり２μｇまたは約２μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。特定の実施形態において、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定または予想される数１０６あたり１．８μｇまたは約１．８μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。特定の実施形態において、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定または予想される数１０６あたり１．６μｇまたは約１．６μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。特定の実施形態において、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定または予想される数１０６あたり１．４μｇまたは約１．４μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。特定の実施形態において、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定または予想される数１０６あたり１．２μｇまたは約１．２μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。特定の実施形態において、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定または予想される数１０６あたり１μｇまたは約１μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。特定の実施形態において、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定または予想される数１０６あたり０．８μｇまたは約０．８μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。
一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定される数１０６あたり０．１μｇ～２０μｇまたは約０．１μｇ～２０μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定される数１０６あたり０．１μｇ～１６μｇまたは約０．１μｇ～１６μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定される数１０６あたり０．１μｇ～１２μｇまたは約０．１μｇ～１２μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定される数１０６あたり０．１μｇ～８μｇまたは約０．１μｇ～８μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定される数１０６あたり０．１μｇ～６μｇまたは約０．１μｇ～６μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定される数１０６あたり０．５μｇ～２０μｇまたは約０．５μｇ～２０μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定される数１０６あたり０．５μｇ～１６μｇまたは約０．５μｇ～１６μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定される数１０６あたり０．５μｇ～１２μｇまたは約０．５μｇ～１２μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定される数１０６あたり０．５μｇ～８μｇまたは約０．５μｇ～８μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定される数１０６あたり０．５μｇ～６μｇまたは約０．５μｇ～６μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定される数１０６あたり１μｇ～２０μｇまたは約１μｇ～２０μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定される数１０６あたり１μｇ～１６μｇまたは約１μｇ～１６μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定される数１０６あたり１μｇ～１２μｇまたは約１μｇ～１２μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定される数１０６あたり１μｇ～８μｇまたは約１μｇ～８μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定される数１０６あたり１μｇ～６μｇまたは約１μｇ～６μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定される数１０６あたり２μｇ～２０μｇまたは約２μｇ～２０μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定される数１０６あたり２μｇ～１６μｇまたは約２μｇ～１６μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定される数１０６あたり２μｇ～１２μｇまたは約２μｇ～１２μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定される数１０６あたり２μｇ～８μｇまたは約２μｇ～８μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定される数１０６あたり２μｇ～６μｇまたは約２μｇ～６μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定される数１０６あたり３μｇ～５μｇまたは約３μｇ～５μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定される数１０６あたり３．５μｇ～４．５μｇまたは約３．５μｇ～４．５μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。一部の実施形態では、細胞は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定される数１０６あたり約４μｇの刺激試薬の存在下において刺激されるかまたは刺激処理に供される。先行の実施形態のいずれにおいても、刺激試薬の量は、細胞１０６個あたりである。先行の実施形態のいずれにおいても、刺激試薬の量は、細胞１０６個あたりの、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定される数である。先行の実施形態のいずれにおいても、刺激試薬の量は、細胞１０６個あたりの固定相の結合能力である。
３．オンカラム遺伝子操作
節Ｉ－Ｃ－１に記載されるようなカラムクロマトグラフィー工程による細胞選択、節Ｉ－Ｃ－２に記載されるオンカラム刺激工程を、カラムに固定化された細胞のオンカラムエンジニアリング、例えば、形質導入、と組み合わせることを含む方法が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、試料の細胞は、節Ｉ－Ｂ－１に記載される例示的選択剤のいずれかを使用して選択される。したがって、ある特定の態様において、細胞がカラム上に固定化されている場合（例えば、選択剤によって）、形質導入は、選択工程の際に実施される。一部の実施形態では、形質導入は、組換えタンパク質をコードする異種または組換えポリペプチドを、本明細書において開示されるデバイスを使用して選択および刺激されている細胞に導入することを含む。そのような組換えタンパク質は、組換え受容体、例えば、節ＩＩに記載された任意のものなど、を含み得る。組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えば、異種または組換えポリヌクレオチド、の細胞内への導入は、いくつかの既知のベクターを使用して実施され得る。そのようなベクターとしては、ウイルス性の、例えば、レンチウイルスおよびガンマレトロウイルスなどのシステムが挙げられる。一部の実施形態では、形質導入された細胞の集団が産生され、カラムから収集される。
一部の実施形態では、細胞は、例えば、節Ｉ－Ｃ－２に記載されるように、細胞のオンカラム刺激の際に、遺伝子操作、形質転換、形質導入される。一部の実施形態では、細胞は、細胞のオンカラム刺激と同時に、遺伝子操作、形質転換、形質導入される。一部の実施形態では、細胞は、例えば、節Ｉ－Ｃ－２に記載されるタイミングのいずれかでの刺激の開始時に、遺伝子操作、形質転換、形質導入される。
ある特定の実施形態では、遺伝子操作のための方法は、１つまたは複数の固定化された細胞を、組換えタンパク質、例えば、組換え受容体をコードする核酸分子またはポリヌクレオチド、と接触させるかまたはそれに導入することによって実施される。ある特定の実施形態では、核酸分子またはポリヌクレオチドは、細胞に対して異種である。特定の実施形態において、異種核酸分子または異種ポリヌクレオチドは、細胞に対して天然ではない。ある特定の実施形態では、異種核酸分子または異種ポリヌクレオチドは、細胞によって天然には発現されないタンパク質、例えば、組換えタンパク質、をコードする。特定の実施形態において、異種核酸分子またはポリヌクレオチドは、接触または導入前に細胞において見出されない核酸配列であるかまたはそれを含む。
一部の実施形態では、固定化された細胞は、形質導入助剤の存在下において、操作、例えば、形質導入される。例示的形質導入助剤としては、これらに限定されるわけではないが、ポリカチオン、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン誘導断片もしくはバリアント、およびＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎが挙げられる。ある特定の実施形態では、細胞は、ポリカチオン、フィブロネクチンもしくはフィブロネクチン誘導断片またはバリアント、および／またはＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎの存在下において操作される。特定の実施形態において、細胞は、ポリブレン、ＤＥＡＥ－デキストラン、硫酸プロタミン、ポリ－Ｌ－リジン、またはカチオン性リポソーム、であるポリカチオンの存在下において操作される。特定の実施形態において、細胞は、硫酸プロタミンの存在下において操作される。
一部の実施形態では、提供される方法は、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを固定化された細胞に形質導入することに関連して使用される。一部の実施形態では、ウイルスベクター用量は、細胞１ｘ１０６個あたり０．１μＬ～１００μＬまたは約０．１μＬ～１００μＬ（境界値を含む）である。一部の実施形態では、ウイルスベクター用量は、細胞１×１０６個あたり０．５μＬ～５０μＬまたは約０．５μＬ～５０μＬ（境界値を含む）である。一部の実施形態では、ウイルスベクター用量は、細胞１×１０６個あたり１μＬ～２５μＬまたは約１μＬ～２５μＬ（境界値を含む）である。一部の実施形態では、ウイルスベクター用量は、細胞１×１０６個あたり２μＬ～１０μＬまたは約２μＬ～１０μＬ（境界値を含む）である。一部の実施形態では、ウイルスベクター用量は、細胞１×１０６個あたり１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１μＬ、あるいは約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１μＬである。一部の実施形態では、ウイルスベクター用量は、細胞１×１０６個あたり６～４μＬまたは約６～４μＬである。一部の実施形態では、ウイルスベクター用量は、細胞１×１０６個あたり５μＬまたは約５μＬである。一部の実施形態では、ウイルスベクター用量は、細胞１×１０６個あたり６μＬまたは約６μＬである。
一部の実施形態では、ウイルスベクター用量は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定または予想される数１×１０６あたり０．１μＬ～１００μＬまたは約０．１μＬ～１００μＬ（境界値を含む）である。一部の実施形態では、ウイルスベクター用量は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定または予想される数１×１０６あたり０．５μＬ～５０μＬまたは約０．５μＬ～５０μＬ（境界値を含む）である。一部の実施形態では、ウイルスベクター用量は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定または予想される数１×１０６あたり１μＬ～２５μＬまたは約１μＬ～２５μＬ（境界値を含む）である。一部の実施形態では、ウイルスベクター用量は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定または予想される数１×１０６あたり２μＬ～１０μＬまたは約２μＬ～１０μＬ（境界値を含む）である。一部の実施形態では、ウイルスベクター用量は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定または予想される数１×１０６あたり１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１μＬ、あるいは約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１μＬである。一部の実施形態では、ウイルスベクター用量は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定または予想される数１×１０６あたり６～４μＬまたは約６～４μＬである。一部の実施形態では、ウイルスベクター用量は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定または予想される数１×１０６あたり５μＬまたは約５μＬである。一部の実施形態では、ウイルスベクター用量は、固定化された細胞、例えば、Ｔ細胞、の推定または予想される数１×１０６あたり６μＬまたは約６μＬである。
一部の実施形態では、ウイルスベクターが、ある特定の力価において、ウイルスベクターを含む調製物に添加される。一部の実施形態では、ウイルスベクターの調製物は、１×１０６ＴＵ／ｍＬ～１×１０９ＴＵ／ｍＬ、または約１×１０６ＴＵ／ｍＬ～１×１０９ＴＵ／ｍＬの力価を有する。一部の実施形態では、ウイルスベクターの調製物は、１×１０６ＴＵ／ｍＬ～１×１０８ＴＵ／ｍＬ、または約１×１０６ＴＵ／ｍＬ～１×１０７ＴＵ／ｍＬの力価を有する。一部の実施形態では、ウイルスベクターの調製物は、１×１０６ＴＵ／ｍＬ～１×１０７ＴＵ／ｍＬ、または約１×１０６ＴＵ／ｍＬ～１×１０７ＴＵ／ｍＬの力価を有する。一部の実施形態では、ウイルスベクターの調製物は、１×１０７ＴＵ／ｍＬ～１×１０９ＴＵ／ｍＬ、または約１×１０７ＴＵ／ｍＬ～１×１０９ＴＵ／ｍＬの力価を有する。一部の実施形態では、ウイルスベクターの調製物は、１×１０７ＴＵ／ｍＬ～１×１０８ＴＵ／ｍＬ、または約１×１０７ＴＵ／ｍＬ～１×１０８ＴＵ／ｍＬの力価を有する。一部の実施形態では、ウイルスベクターの調製物は、１×１０８ＴＵ／ｍＬ～１×１０９ＴＵ／ｍＬ、または約１×１０８ＴＵ／ｍＬ～１×１０９ＴＵ／ｍＬの力価を有する。
一部の実施形態では、本明細書において提供される方法の形質導入に対して、組換え核酸は、組換え感染性ウイルス粒子、例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するベクターなど、を使用して細胞内へと移される。一部の実施形態では、組換え核酸は、組換えレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、例えば、γ－レトロウイルスベクターなど、を使用してＴ細胞内へと移される（例えば、Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557を参照されたい）。
一部の実施形態では、レトロウイルスベクターは、長末端反復配列（ＬＴＲ）、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）、マウス胚性幹細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するレトロウイルスベクターを有する。ほとんどのレトロウイルスベクターはマウスレトロウイルスに由来する。一部の実施形態では、レトロウイルスには、任意のトリまたは哺乳動物細胞源に由来するものが挙げられる。レトロウイルスは、典型的には両種指向性であり、両種指向性は、レトロウイルスがヒトを含むいくつかの種の宿主細胞に感染することができることを意味する。１つの実施形態では、発現される遺伝子は、レトロウイルスｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｅｎｖ配列を交換する。多くの例示的なレトロウイルスシステムが記載されている［例えば、米国特許第５，２１９，７４０号；第６，２０７，４５３号；第５，２１９，７４０号；Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990;Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5- 14;Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852;Bums et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037;およびBoris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109］。
ウイルスベクターゲノムは通常、パッケージングまたはプロデューサー細胞株中にトランスフェクトされ得るプラスミド形態で構築される。そのような実施例のいずれかにおいて、組換えタンパク質、例えば、組換え受容体など、をコードする核酸は、ウイルスベクターにおけるある領域、例えば、概してウイルスゲノムの非必須領域、に挿入または位置される。一部の実施形態では、核酸は、複製欠損のウイルスを生成するために、ある特定のウイルス配列の代わりに、ウイルスゲノム中に挿入される。
そのゲノムがウイルスベクターゲノムのＲＮＡコピーを含有するレトロウイルス粒子を生成するために、様々な公知の方法のいずれも使用できる。一部の実施形態では、ウイルスベースの遺伝子デリバリーシステムの作成には少なくとも２つの構成要素、第１には、構造タンパク質を包含するパッケージングプラスミドならびにウイルスベクター粒子を生成するのに必要な酵素、第２には、ウイルスベクター自体、すなわち、移動されるべき遺伝物質が関与している。バイオセイフティー保護は、これらの構成要素の一方または両方の設計に導入され得る。
一部の実施形態では、パッケージングプラスミドは、全てのレトロウイルス、例えば、ＨＩＶ－１、エンベロープタンパク質以外のタンパク質を含有し得る（Naldini et al., 1998）。他の実施形態では、ウイルスベクターは、追加のウイルス遺伝子、例えば病原性に関連するもの、例えば、ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕおよびｎｅｆ、ならびに／またはＨＩＶの主要なトランス活性化因子であるＴａｔを欠いていてもよい。一部の実施形態では、レンチウイルスベクター、例えば、ＨＩＶベースのレンチウイルスベクターは、組換えを介した野生型ウイルスの再構築の可能性を低減または排除する親ウイルスの３つの遺伝子のみ：ｇａｇ、ｐｏｌおよびｒｅｖを含む。
一部の実施形態では、ウイルスベクターゲノムは、ウイルスベクターゲノムから転写されたウイルスゲノムＲＮＡをウイルス粒子にパッケージングするのに必要な全ての成分を含有するパッケージング細胞株に導入される。あるいは、ウイルスベクターゲノムは、目的の１つまたは複数の配列、例えば組換え核酸に加えてウイルス成分をコードする１つまたは複数の遺伝子を含んでもよい。しかし、一部の態様では、標的細胞におけるゲノムの複製を防ぐために、複製に必要とされる内因性ウイルス遺伝子が除去され、パッケージング細胞株に別々に提供される。
一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、粒子を生成するのに必要な構成要素を含有する１つまたは複数のプラスミドベクターでトランスフェクトされる。一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、ＬＴＲ、シス作用性パッケージング配列および目的の配列、すなわち、抗原受容体、例えば、ＣＡＲをコードする核酸を含むウイルスベクターゲノムを含有するプラスミドならびにウイルスの酵素的および／または構造的構成要素、例えば、Ｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｒｅｖをコードする１つまたは複数のヘルパープラスミドでトランスフェクトされる。一部の実施形態では、レトロウイルスベクター粒子を生成する種々の遺伝子構成要素を分離するために複数のベクターが利用される。一部のこのような実施形態では、別個のベクターをパッケージング細胞に提供することによって、そうでなければ複製能力のあるウイルスを生成する可能性がある組換え事象の機会が低減される。一部の実施形態では、レトロウイルス構成要素の全てを有する単一プラスミドベクターが使用され得る。
一部の実施形態では、レトロウイルスベクター粒子、例えば、レンチウイルスベクター粒子は、宿主細胞の形質導入効率を増大するための偽型である。例えば、レトロウイルスベクター粒子、例えば、レンチウイルスベクター粒子は、一部の実施形態では、ＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質を有する偽型であり、これは、形質導入され得る細胞種に拡大する広い細胞宿主域を提供する。一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、異種指向性、多指向性または両種指向性エンベロープ、例えば、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルスエンベロープ、ＧＡＬＶまたはＶＳＶ－Ｇを含むようになど、非天然エンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミドまたはポリヌクレオチドでトランスフェクトされる。
一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、レンチウイルスベクター粒子へのウイルスゲノムＲＮＡのパッケージングにイントランスで（ｉｎ ｔｒａｎｓ）必要であるウイルス調節および構造タンパク質を含む構成要素を提供する。一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、レンチウイルスタンパク質を発現可能であり、機能的レンチウイルスベクター粒子を生成可能である任意の細胞株であり得る。一部の態様では、適したパッケージング細胞株として、２９３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ Ｘ）、２９３Ｔ、ＨｅＬＡ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｄ１７（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １８３）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１０）およびＣｆ２Ｔｈ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４３０）細胞が挙げられる。
一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、ウイルスタンパク質（複数可）を安定に発現する。例えば、一部の態様では、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖおよび／または他の構造遺伝子を含有するが、ＬＴＲおよびパッケージング構成要素を有さないパッケージング細胞株を構築できる。一部の実施形態では、パッケージング細胞株を、異種タンパク質をコードする核酸分子および／またはエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸を含有するウイルスベクターゲノムと共に、１つまたは複数のウイルスタンパク質をコードする核酸分子を用いて一過性にトランスフェクトできる。
一部の実施形態では、ウイルスベクターならびにパッケージングおよび／またはヘルパープラスミドは、パッケージング細胞株中にトランスフェクションまたは感染を介して導入される。パッケージング細胞株は、ウイルスベクターゲノムを含有するウイルスベクター粒子を産生する。トランスフェクションまたは感染の方法は周知である。限定されない例として、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストランおよびリポフェクション法、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションが挙げられる。
組換えプラスミドおよびレトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列が特別の細胞株中に導入される場合に（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって、例えば）、パッケージング配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物がウイルス粒子中にパッケージングされることを可能にでき、次いで、培養培地中に分泌され得る。組換えレトロウイルスを含有する培地は、一部の実施形態では、次いで、収集され、適宜、濃縮され、遺伝子導入のために使用される。例えば、一部の態様では、パッケージング細胞株へのパッケージングプラスミドおよびトランスファーベクターの同時トランスフェクション後に、当業者によって使用される標準方法によってウイルスベクター粒子が培養培地から回収され、力価測定される。
一部の実施形態では、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターは、レンチウイルス粒子の生成を可能にするプラスミドの導入によって、パッケージング細胞株、例えば、例示的なＨＥＫ ２９３Ｔ細胞株において生成され得る。一部の実施形態では、パッケージング細胞は、トランスフェクトされ、ならびに／またはｇａｇおよびｐｏｌをコードするポリヌクレオチドおよび組換え受容体、例えば、抗原受容体、例えば、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含有する。一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、適宜および／もしくはさらにトランスフェクトされる、ならびに／またはｒｅｖタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する。一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、適宜および／もしくはさらにトランスフェクトされる、ならびに／または非天然エンベロープ糖タンパク質、例えば、ＶＳＶ－Ｇをコードするポリヌクレオチドを含有する。一部のこのような実施形態では、細胞、例えば、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションのおよそ２日後、細胞上清は、組換えレンチウイルスベクターを含有し、これは回収され、力価測定され得る。
回収され、および／または生成されたレトロウイルスベクター粒子を使用して、記載されたような方法を使用して標的細胞に形質導入できる。ひとたび、標的細胞においてウイルスＲＮＡが逆転写されると、核中に移入され、宿主ゲノム中に安定に統合される。ウイルスＲＮＡの組込みの１日後または２日後に、組換えタンパク質、例えば、ＣＡＲなどの抗原受容体の発現が検出され得る。
４．カラムでのインキュベーション
一部の実施形態では、固定化された細胞のオンカラム刺激および形質導入の開始の後に、細胞は、オンカラムにおいてインキュベートされる。一部の実施形態では、インキュベーションは、１日、約１日、または１日未満において実施される。一部の実施形態では、インキュベーションは、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２時間、あるいは約２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２時間、あるいは２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２時間未満において実施される。一部の実施形態では、インキュベーションは、２～２４、３～２４、４～２４、５～２４、６～２４、７～２４、８～２４、９～２４、１０～２４、１１～２４、１２～２４、１３～２４、１４～２４、１５～２４、１６～２４、１７～２４、１８～２４、１９～２４、２０～２４、２１～２４、２２～２４、２３～２４、２～２３、２～２２、２～２１、２～２０、２～１９、２～１８、２～１７、２～１６、２～１５、２～１４、２～１３、２～１２、２～１１、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、または２～３時間、あるいは約２～２４、３～２４、４～２４、５～２４、６～２４、７～２４、８～２４、９～２４、１０～２４、１１～２４、１２～２４、１３～２４、１４～２４、１５～２４、１６～２４、１７～２４、１８～２４、１９～２４、２０～２４、２１～２４、２２～２４、２３～２４、２～２３、２～２２、２～２１、２～２０、２～１９、２～１８、２～１７、２～１６、２～１５、２～１４、２～１３、２～１２、２～１１、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、または２～３時間において実施される。一部の実施形態では、インキュベーションは、２４時間、約２４時間、または２４時間未満において実施される。一部の実施形態では、インキュベーションは、１２時間、約１２時間、または１２時間未満において実施される。一部の実施形態では、インキュベーションは、５時間、約５時間、または５時間未満において実施される。一部の実施形態では、インキュベーションは、４時間、約４時間、または４時間未満において実施される。一部の実施形態では、インキュベーションは、２時間、約２時間、または２時間未満において実施される。
一部の実施形態では、インキュベーションは、無血清培地において実施される。一部の実施形態では、無血清培地は、定義されたまたは明確に定義された細胞培養培地である。ある特定の実施形態では、無血清培地は、処理済みの、例えば、阻害剤および／または増殖因子を除去するために濾過されている、制御された培養培地である。一部の実施形態では、無血清培地は、タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、無血清培地は、血清アルブミン、加水分解物、成長因子、ホルモン、担体タンパク質、および／または接着因子を含み得る。一部の実施形態では、培地は、グルタミンを含む。
特定の実施形態において、インキュベーションは、１つまたは複数のサイトカインの存在下において行われる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、組換えサイトカインである。特定の実施形態において、１つまたは複数のサイトカインは、ヒト組換えサイトカインである。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、Ｔ細胞によって発現されるかまたはＴ細胞に対して内因性である受容体に結合し、および／または結合することができる。特定の実施形態において、１つまたは複数のサイトカインは、サイトカインの４α－ヘリックスバンドルファミリーのメンバーであるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、サイトカインの４α－ヘリックスバンドルファミリーのメンバーとしては、これらに限定されるわけではないが、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）が挙げられる。一部の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、ＩＬ－１５であるかまたはそれを含む。特定の実施形態において、１つまたは複数のサイトカインは、ＩＬ－７であるかまたはそれを含む。特定の実施形態において、１つまたは複数のサイトカインは、組換えＩＬ－２であるかまたはそれを含む。
特定の実施形態において、インキュベーションは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５の存在下において行われる。ある特定の実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５は、組換え型である。ある特定の実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５は、ヒト型である。特定の実施形態において、１つまたは複数のサイトカインは、ヒト組換えＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５であるかまたはそれを含む。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、組換えＩＬ－２、ＩＬ－７、およびＩＬ－１５の存在下において行われる。
一部の実施形態では、インキュベーションは、室温（例えば、２３℃または約２３℃）において実施される。一部の実施形態では、インキュベーションは、約３０℃～約３９℃、例えば、３７℃または約３７℃など、において実施される。特定の実施形態において、オンカラム刺激および／または形質導入の方法は、クロマトグラフィーカラムのクロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）に固定または結合された細胞が、刺激の際に、約３０℃～約３９℃、例えば、３７℃または約３７℃など、の温度に晒される。一部の実施形態では、本明細書において提供されるデバイスは、温度を、約３０℃～約３９℃、例えば、３７℃または約３７℃など、の標的温度に調節し、例えば、温度を、初期開始温度（例えば、室温）から標的温度へと高める。一部の実施形態では、本明細書において提供されるデバイスは、温度を、約３０℃～約３９℃、例えば、３７℃または約３７℃など、の標的温度に維持し、例えば、カラム上の細胞の刺激のタイミングの際に、一定またはほぼ一定の標的温度を提供する。
一部の実施形態では、本明細書において提供される方法は、３７℃または約３７℃において実施される。
一部の実施形態では、本明細書において開示されるデバイスを使用することにより、標的細胞（例えば、Ｔ細胞）のオンカラム選択、刺激、および形質導入の、本明細書において提供される方法は、本明細書において開示される熱／気体カラム（例えば、カラムクロマトグラフィーのためのハウジングアセンブリ）を使用して実施される。一部の実施形態では、本明細書において説明されるＴ細胞のオンカラム選択、刺激、および形質導入の方法のいずれも、本明細書において開示されるデバイスを使用して実施される。
一部の実施形態では、オンカラム選択、刺激、および形質導入は、クロマトグラフィーのためのハウジングアセンブリを含むクロマトグラフィーカラムまたはカラムセットを使用して実施され、この場合、クロマトグラフィーカラムの固定相は、標的細胞（例えば、Ｔ細胞）を選択または濃縮するために、選択剤によって官能化される。提供されるカラムクロマトグラフィーベースのオンカラム選択、刺激、および形質導入の方法のためのハウジングアセンブリは、カラムの内部空洞における固定相の温度を調節および／または維持するための、例えば、１つまたは複数の加熱素子などを含む温度制御メンバー、ならびに内部空洞を気体源に作動可能に連結するように構成されたコネクターも含み、それによって、内部空洞への気体の取り込みを可能にするかまたは実施する。一部の実施形態では、クロマトグラフィーカラムは、導入口ハウジングメンバーおよび導出口ハウジングメンバーを含み、この場合、少なくとも導入口ハウジングメンバーおよび導出口ハウジングメンバーは、カラムクロマトグラフィーのための固定相を収容するように構成された内部空洞を形成する。先行の実施形態のいずれかにおける使用のためのカラムクロマトグラフィーのための例示的ハウジングアセンブリは、節ＩＩＩ－Ａに記載される。先行の実施形態のいずれかにおける使用のための例示的クロマトグラフィーカラムおよびクロマトグラフィーカラムセットは、節ＩＩＩ－Ｂに記載される。
先行の実施形態のいずれにおいて、インキュベーションの少なくとも一部の間、温度制御メンバーは、固定相の温度を室温より高い標的温度に調節することができる。先行の実施形態のいずれにおいて、インキュベーションの少なくとも一部の間、温度制御メンバーは、固定相の温度を、１つまたは複数の刺激剤または刺激試薬によるインキュベーションの際に細胞へ生理的温度を提供する標的温度に調節することができる。先行の実施形態のいずれにおいて、インキュベーションの少なくとも一部の間、温度制御メンバーは、固定相の温度を約３０℃～約３９℃の標的温度に調節することができる。先行の実施形態のいずれにおいて、インキュベーションの少なくとも一部の間、温度制御メンバーは、固定相の温度を、約３５℃～約３９℃の標的温度に調節することができる。例えば、標的温度は、３７℃または約３７℃である。
先行の実施形態のいずれにおいて、インキュベーションの少なくとも一部の間、温度制御メンバーは、固定相の温度を室温より高い標的温度に維持することができる。先行の実施形態のいずれにおいて、インキュベーションの少なくとも一部の間、温度制御メンバーは、固定相の温度を、１種または複数種の刺激剤または刺激試薬によるインキュベーションの際に細胞へ生理的温度を提供する標的温度に維持することができる。先行の実施形態のいずれにおいて、インキュベーションの少なくとも一部の間、温度制御メンバーは、固定相の温度を約３０℃～約３９℃の標的温度に維持することができる。一部の態様では、インキュベーションの少なくとも一部の間、温度制御メンバーは、固定相の温度を約３５℃～約３９℃の標的温度を維持する。例えば、標的温度は、３７℃または約３７℃である。
先行の実施形態のいずれにおいて、インキュベーションの少なくとも一部の間、コネクターは、内部空洞への気体の取り込みを可能にすることができる。例えば、気体は、無菌であり、ならびに、空気であるかまたはそれを含み、ならびに、内部空洞への気体の取り込みは、インキュベーションの間、断続的または連続的であり得る。
Ｄ．溶出
先行の実施形態のいずれにおいて、方法は、インキュベーションの開始後に、固定相から１つまたは複数のＴ細胞を収集することをさらに含むことができる。一態様において、１つまたは複数のＴ細胞は、インキュベーションの開始の２４時間以内に、固定相から収集される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＴ細胞は、重力流動によって、固定相から収集される。
先行の実施形態のいずれにおいて、収集工程は、固定相から複数のＴ細胞を溶出するための競合剤または遊離結合剤の添加なしに、実施することができる。一部の実施形態では、溶出は、例えば、洗浄媒質を使用する、洗浄工程を含むか、またはそれから実質的になるか、またはそれからなる。
一部の実施形態では、刺激剤を用いたインキュベーションの間、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）上に選択剤を介して固定化された細胞は、選択剤から自然発生的に脱離する。一部の実施形態では、自然発生的な脱離は、刺激剤を用いたインキュベーションの開始から２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２時間以内に生じる。一部の実施形態では、自然発生的な脱離は、刺激剤を用いたインキュベーションの開始後、約２～２４、３～２４、４～２４、５、～２４、６～２４、７～２４、８～２４、９～２４、１０～２４、１１～２４、１２～２４、１３～２４、１４～２４、１５～２４、１６～２４、１７～２４、１８～２４、１９～２４、２０～２４、２１～２４、２２～２４、２３～２４、２～２３、２～２２、２～２１、２～２０、２～１９、２～１８、２～１７、２～１６、２～１５、２～１４、２～１３、２～１２、２～１１、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、または２～３時間以内に生じる。一部の実施形態では、カラムからの脱離は、刺激剤を用いたインキュベーションの開始後、４～５時間以内または約４～５時間以内、例えば、４．５時間以内に生じる。一部の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）上に選択剤を介して固定化された複数の標的細胞（例えば、Ｔ細胞）の大部分は、刺激剤を用いたインキュベーションの開始から２４時間未満において脱離する。一部の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）上に選択剤を介して固定化された複数の標的細胞（例えば、Ｔ細胞）の大部分は、刺激剤を用いたインキュベーションの開始から１２時間未満に脱離する。一部の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）上に選択剤を介して固定化された複数の標的細胞（例えば、Ｔ細胞）の大部分は、刺激剤を用いたインキュベーションの開始から５時間未満に脱離する。一部の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）上に選択剤を介して固定化された複数の標的細胞（例えば、Ｔ細胞）の大部分は、刺激剤を用いたインキュベーションの開始から４時間未満に脱離する。一部の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックス（例えば、固定相）上に選択剤を介して固定化された複数の標的細胞（例えば、Ｔ細胞）の大部分は、刺激剤を用いたインキュベーションの開始から２時間未満に脱離する。
一部の実施形態では、自然発生的に脱離した細胞は、重力流動によって、クロマトグラフィーカラムから溶出され、および／または収集される。一部の実施形態では、自然発生的に脱離した細胞は、洗浄工程を使用してクロマトグラフィーカラムから溶出される。一部の実施形態では、少なくとも１つの洗浄工程は、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬を用いたインキュベーションの開始後、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間、あるいは約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間、あるいは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間において実施される。一部の実施形態では、１つまたは複数の洗浄工程は、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬を用いたインキュベーションの開始後、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間、あるいは約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間、あるいは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間において実施される。一部の実施形態では、１つまたは複数の洗浄工程は、刺激剤または刺激剤を含む刺激試薬を用いたインキュベーションの開始後、約２～２４、３～２４、４～２４、５、～２４、６～２４、７～２４、８～２４、９～２４、１０～２４、１１～２４、１２～２４、１３～２４、１４～２４、１５～２４、１６～２４、１７～２４、１８～２４、１９～２４、２０～２４、２１～２４、２２～２４、２３～２４、２～２３、２～２２、２～２１、２～２０、２～１９、２～１８、２～１７、２～１６、２～１５、２～１４、２～１３、２～１２、２～１１、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、または２～３時間以内に実施される。
一部の実施形態では、選択およびオンカラム刺激および形質導入工程の後の溶出および／または収集工程は、試料がカラムクロマトグラフィー（例えば、固定相）に添加された後、２日以内または約２日以内に実施される。一部の実施形態では、選択およびオンカラム刺激および形質導入工程の後の溶出および／または収集工程は、試料がカラムクロマトグラフィー（例えば、固定相）に添加された後、１～２日以内または約１～２日以内に実施される。一部の実施形態では、選択およびオンカラム刺激および形質導入工程の後の溶出および／または収集工程は、試料がカラムクロマトグラフィー（例えば、固定相）に添加された後、１日以内または約１日以内に実施される。一部の実施形態では、選択およびオンカラム刺激および形質導入工程の後の溶出および／または収集工程は、試料がカラムクロマトグラフィー（例えば、固定相）に添加された後、１日未満においてに実施される。一部の実施形態では、選択およびオンカラム刺激および形質導入工程の後の溶出および／または収集工程は、試料がカラムクロマトグラフィー（例えば、固定相）に添加された後、４８、３６、２４、１２、６、４、または２時間以内、あるいは約４８、３６、２４、１２、６、４、または２時間（境界値を含む）に実施される。一部の実施形態では、選択およびオンカラム刺激および形質導入工程の後の収集または溶出収集工程は、試料がカラムクロマトグラフィー（例えば、固定相）に添加された後、２～４８、２～３６、２～２４、２～１２、２～６、２～４、４～４８、４～３６、４～２４、４～１２、４～６、６～４８、６～３６、６～２４、６～１２、１２～４８、１２～３６、１２～２４、２４～４８、２４～３６、または３６～４８時間以内、あるいは約２～４８、２～３６、２～２４、２～１２、２～６、２～４、４～４８、４～３６、４～２４、４～１２、４～６、６～４８、６～３６、６～２４、６～１２、１２～４８、１２～３６、１２～２４、２４～４８、２４～３６、または３６～４８時間以内に実施される。一部の実施形態では、オンカラム刺激および形質導入から溶出または収集までの工程を含むプロセスの持続期間は、４８、３６、２４、１２、６、４、または２時間未満である。一部の実施形態では、オンカラム刺激および形質導入から溶出または収集までの工程を含むプロセスの持続期間は、３６時間未満である。一部の実施形態では、オンカラム刺激および形質導入から溶出または収集までの工程を含むプロセスの持続期間は、２４時間未満である。一部の実施形態では、オンカラム刺激および形質導入から溶出または収集までの工程を含むプロセスの持続期間は、１２時間未満である。一部の実施形態では、オンカラム刺激および形質導入から溶出または収集までの工程を含むプロセスの持続期間は、７時間、約７時間、または７時間未満である。一部の実施形態では、オンカラム刺激および形質導入から溶出または収集までの工程を含むプロセスの持続期間は、６．５時間、約６．５時間、または６．５時間未満である。一部の実施形態では、オンカラム刺激および形質導入から溶出または収集までの工程を含むプロセスの持続期間は、６時間、約６時間、または６時間未満である。一部の実施形態では、オンカラム刺激および形質導入から溶出または収集までの工程を含むプロセスの持続期間は、５．５時間、約５．５時間、または５．５時間未満である。一部の実施形態では、オンカラム刺激および形質導入から溶出または収集までの工程を含むプロセスの持続期間は、５時間、約５時間、または５時間未満である。一部の実施形態では、オンカラム刺激および形質導入から溶出または収集までの工程を含むプロセスの持続期間は、４．５時間、約４．５時間、または４．５時間未満である。一部の実施形態では、オンカラム刺激および形質導入から溶出または収集までの工程を含むプロセスの持続期間は、４時間、約４時間、または４時間未満である。
一部の実施形態では、自然発生的に脱離した細胞は、重力流動によって、クロマトグラフィーカラムから収集される。一部の実施形態では、自然発生的に脱離した細胞は、洗浄工程を使用してクロマトグラフィーカラムから溶出される。一部の実施形態では、洗浄媒質は、培養培地である。したがって、一部の実施形態では、溶出された細胞は、下流処理（例えば、後続の選択工程、刺激工程、インキュベーション工程、遺伝子操作）へと直接進ませることができる。一部の実施形態では、洗浄媒質は、グルタミンならびに組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－７を含む無血清基礎培地を含む。
一部の実施形態では、溶出液は、刺激試薬（例えば、オリゴマー性刺激試薬）を含む。一部の実施形態では、収集された細胞は、刺激剤（例えば、オリゴマー性刺激試薬に結合した刺激剤）に依然として結合している。したがって、収集された細胞は、依然として刺激条件下にあると見なされ得る。一部の実施形態では、溶出液に含まれる刺激剤は、溶出された細胞および刺激試薬（例えば、オリゴマー性刺激試薬）に結合する。したがって、収集および／または溶出した細胞は、依然として刺激条件下にあると見なされ得る。一部の実施形態では、脱離し溶出した細胞は、刺激条件下にある（例えば、依然として刺激されている）。一部の実施形態では、溶出された細胞は、例えば、節Ｉ－Ｃ－２に記載されるように、刺激条件下であり続け得る。
一部の実施形態では、カラムおよび収集容器は、閉鎖されたシステムに接続される。一部の実施形態では、閉鎖されたシステムは、無菌である。一部の実施形態では、選択、刺激、および溶出工程は、最小限のまたは非手動の、例えば、人による、操作または干渉による自動化システムによって実施される。
Ｅ．細胞の培養または培養
一部の実施形態では、方法は、カラムからの細胞の溶出の後に、細胞をさらにインキュベートする（例えば、培養する）１つまたは複数の工程をさらに含み得る。一部の実施形態では、細胞は、溶出の後の細胞のさらなるプロセシングなしに、さらにインキュベートされる（例えば、培養する）。特定の実施形態において、さらなるインキュベーション（例えば、培養）の前に、細胞は、例えば、異種または組換えポリヌクレオチド、をコードする外因性のまたは残っているポリヌクレオチド、例えば、ウイルスベクター粒子、例えば、溶出の後に培地に残っているものなど、を除去するためにまたは実質的に除去するために、洗浄される。
一部のそのような実施形態では、さらなるインキュベーションは、１つまたは複数の細胞の宿主ゲノムへのウイルスベクターの組込みをもたらす条件下で行われる。インキュベーションが宿主ゲノムへのウイルスベクター粒子の組込みをもたらしたかどうかを評価または決定し、それ故にさらなるインキュベーションのための条件を経験的に決定することは、当業者のレベルの範囲内である。一部の実施形態では、宿主ゲノムへのウイルスベクターの組込みは、インキュベーション後にウイルスベクター粒子のゲノムに含有される核酸によってコードされる異種タンパク質などの組換えタンパク質の発現レベルを測定することによって評価することができる。組換え分子の発現レベルを評価するためのいくつかの周知の方法、例えば、親和性ベースの方法、例えば細胞表面タンパク質の関連では、フローサイトメトリーなどによる例えば免疫親和性ベースの方法による検出が使用されてもよい。一部の例では、発現は、形質導入マーカーおよび／またはレポーターコンストラクトの検出によって測定される。一部の実施形態では、切断された表面タンパク質をコードする核酸がベクター内に含められ、発現および／またはその増強のマーカーとして使用される。
ある特定の実施形態では、さらなるインキュベーション（例えば、培養）が、静的条件下、例えば、培地の遠心分離、振盪、回転、揺動、または灌流、例えば、連続または半連続灌流、を伴わない条件下において実施される。一部の実施形態では、さらなるインキュベーション（例えば、培養）の前または直後、例えば、５、１５、または３０分以内に、細胞は、容器、例えば、バッグまたはバイアル瓶など、に移され（例えば、静的条件下において移され）、ならびに、インキュベーターに入れられる。
一部の実施形態では、インキュベーションの少なくとも一部は、例えば、国際公開第２０１６／０７３６０２号に記載されるように、遠心分離チャンバーの内部空洞において実施される。
一部の実施形態では、細胞は、インキュベーションのための容器に移される。一部の実施形態では、容器は、バイアル瓶である。特定の実施形態において、容器は、バッグである。一部の実施形態では、細胞、および必要に応じて異種または組換えポリペプチドは、閉鎖条件下または無菌条件下において、容器に移される。一部の実施形態では、容器、例えば、バイアル瓶またはバッグ、は、次いで、インキュベーションの全てまたは一部において、インキュベーターに入れられる。特定の実施形態において、インキュベーターは、１６℃、２４℃、または３５℃、あるいは約１６℃、２４℃、または３５℃、あるいは少なくとも１６℃、２４℃、または３５℃に設定される。一部の実施形態では、インキュベーターは、３７℃、約３７℃、あるいは３７℃±２℃、±１℃、±０．５℃、または±０．１℃に設定される。
一部の態様では、インキュベーションのための条件は、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、薬剤、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、および／または刺激因子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、ならびに細胞を活性化するように設計された任意の他の薬剤、のうちの１つまたは複数を含み得る。
一部の実施形態では、インキュベーションは、無血清培地において実施される。一部の実施形態では、無血清培地は、定義されたおよび／または明確に定義された細胞培養培地である。ある特定の実施形態では、無血清培地は、処理済みの、例えば、阻害剤および／または増殖因子を除去するために濾過されている、制御された培養培地である。一部の実施形態では、無血清培地は、タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、無血清培地は、血清アルブミン加水分解物、成長因子、ホルモン、担体タンパク質、および／または接着因子を含み得る。
特定の実施形態では、細胞は、１つまたは複数のサイトカインの存在下でインキュベートされる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは組換えサイトカインである。特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインはヒト組換えサイトカインである。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、Ｔ細胞によって発現される、および／またはＴ細胞に対して内因性である受容体に結合する、および／または結合することができる。特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、サイトカインの４－アルファ－ヘリックスバンドルファミリーのメンバーであるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、サイトカインの４－アルファ－ヘリックスバンドルファミリーのメンバーには、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、ＩＬ－１５であるか、またはこれを含む。特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、ＩＬ－７であるか、またはこれを含む。特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、組換えＩＬ－２であるか、またはこれを含む。
特定の実施形態において、細胞は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５の存在下においてインキュベートされる。ある特定の実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５は、組換え型である。ある特定の実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５は、ヒト型である。特定の実施形態において、１つまたは複数のサイトカインは、ヒト組換えＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５であるかまたはそれを含む。ある特定の実施形態において、細胞は、組換えＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５の存在下においてインキュベートされる。
一部の実施形態では、細胞、例えば、形質転換された細胞は、１ＩＵ／ｍＬ～１，０００ＩＵ／ｍＬ、１０ＩＵ／ｍＬ～５０ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ～１００ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ～２００ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ、２５０ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ、または５００ＩＵ／ｍＬ～１，０００ＩＵ／ｍＬの濃度のサイトカイン、例えば、組換えヒトサイトカイン、を用いてインキュベートされる。
一部の実施形態では、細胞、例えば、形質転換された細胞は、１ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ、１０ＩＵ／ｍＬ～２５０ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ～２００ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ～１５０ＩＵ／ｍＬ、７５ＩＵ／ｍＬ～１２５ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ～２００ＩＵ／ｍＬ、または１０ＩＵ／ｍＬ～１００ＩＵ／ｍＬの濃度の、ＩＬ－２、例えば、ヒト組換えＩＬ－２、を用いてインキュベートされる。特定の実施形態において、細胞、例えば、形質転換された細胞は、５０ＩＵ／ｍＬ、６０ＩＵ／ｍＬ、７０ＩＵ／ｍＬ、８０ＩＵ／ｍＬ、９０ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ、１１０ＩＵ／ｍＬ、１２０ＩＵ／ｍＬ、１３０ＩＵ／ｍＬ、１４０ＩＵ／ｍＬ、１５０ＩＵ／ｍＬ、１６０ＩＵ／ｍＬ、１７０ＩＵ／ｍＬ、１８０ＩＵ／ｍＬ、１９０ＩＵ／ｍＬ、または１００ＩＵ／ｍＬ、あるいは約５０ＩＵ／ｍＬ、６０ＩＵ／ｍＬ、７０ＩＵ／ｍＬ、８０ＩＵ／ｍＬ、９０ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ、１１０ＩＵ／ｍＬ、１２０ＩＵ／ｍＬ、１３０ＩＵ／ｍＬ、１４０ＩＵ／ｍＬ、１５０ＩＵ／ｍＬ、１６０ＩＵ／ｍＬ、１７０ＩＵ／ｍＬ、１８０ＩＵ／ｍＬ、１９０ＩＵ／ｍＬ、または１００ＩＵ／ｍＬの濃度あるいは約５０ＩＵ／ｍＬ、６０ＩＵ／ｍＬ、７０ＩＵ／ｍＬ、８０ＩＵ／ｍＬ、９０ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ、１１０ＩＵ／ｍＬ、１２０ＩＵ／ｍＬ、１３０ＩＵ／ｍＬ、１４０ＩＵ／ｍＬ、１５０ＩＵ／ｍＬ、１６０ＩＵ／ｍＬ、１７０ＩＵ／ｍＬ、１８０ＩＵ／ｍＬ、１９０ＩＵ／ｍＬ、または１００ＩＵ／ｍＬの濃度の組換えＩＬ－２を用いてインキュベートされる。一部の実施形態では、細胞、例えば、形質転換された細胞は、１００ＩＵ／ｍＬまたは約１００ＩＵ／ｍＬの組換えＩＬ－２、例えば、ヒト遺伝子組換えＩＬ－２の存在下においてインキュベートされる。
一部の実施形態では、細胞、例えば、形質転換された細胞は、１００ＩＵ／ｍＬ～２，０００ＩＵ／ｍＬ、５００ＩＵ／ｍＬ～１，０００ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ、５００ＩＵ／ｍＬ～７５０ＩＵ／ｍＬ、７５０ＩＵ／ｍＬ～１，０００ＩＵ／ｍＬ、または５５０ＩＵ／ｍＬ～６５０ＩＵ／ｍＬの濃度の組換えＩＬ－７、例えば、ヒト組換えＩＬ－７、を用いてインキュベートされる。特定の実施形態において、細胞、例えば、形質転換された細胞は、５０ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ、１５０ＩＵ／ｍＬ、２００ＩＵ／ｍＬ、２５０ＩＵ／ｍＬ、３００ＩＵ／ｍＬ、３５０ＩＵ／ｍＬ、４００ＩＵ／ｍＬ、４５０ＩＵ／ｍＬ、５００ＩＵ／ｍＬ、５５０ＩＵ／ｍＬ、６００ＩＵ／ｍＬ、６５０ＩＵ／ｍＬ、７００ＩＵ／ｍＬ、７５０ＩＵ／ｍＬ、８００ＩＵ／ｍＬ、７５０ＩＵ／ｍＬ、７５０ＩＵ／ｍＬ、７５０ＩＵ／ｍＬ、または１，０００ＩＵ／ｍＬの濃度あるいは約５０ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ、１５０ＩＵ／ｍＬ、２００ＩＵ／ｍＬ、２５０ＩＵ／ｍＬ、３００ＩＵ／ｍＬ、３５０ＩＵ／ｍＬ、４００ＩＵ／ｍＬ、４５０ＩＵ／ｍＬ、５００ＩＵ／ｍＬ、５５０ＩＵ／ｍＬ、６００ＩＵ／ｍＬ、６５０ＩＵ／ｍＬ、７００ＩＵ／ｍＬ、７５０ＩＵ／ｍＬ、８００ＩＵ／ｍＬ、７５０ＩＵ／ｍＬ、７５０ＩＵ／ｍＬ、７５０ＩＵ／ｍＬ、または１，０００ＩＵ／ｍＬの濃度のＩＬ－７を用いてインキュベートされる。特定の実施形態において、細胞、例えば、形質転換された細胞は、６００ＩＵ／ｍＬまたは約６００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７の存在下においてインキュベートされる。
一部の実施形態では、細胞、例えば、形質転換された細胞は、１ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ、１０ＩＵ／ｍＬ～２５０ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ～２００ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ～１５０ＩＵ／ｍＬ、７５ＩＵ／ｍＬ～１２５ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ～２００ＩＵ／ｍＬ、または１０ＩＵ／ｍＬ～１００ＩＵ／ｍＬの濃度の組換えＩＬ－１５、例えば、ヒト組換えＩＬ－１５、を用いてインキュベートされる。特定の実施形態において、細胞、例えば、形質転換された細胞は、５０ＩＵ／ｍＬ、６０ＩＵ／ｍＬ、７０ＩＵ／ｍＬ、８０ＩＵ／ｍＬ、９０ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ、１１０ＩＵ／ｍＬ、１２０ＩＵ／ｍＬ、１３０ＩＵ／ｍＬ、１４０ＩＵ／ｍＬ、１５０ＩＵ／ｍＬ、１６０ＩＵ／ｍＬ、１７０ＩＵ／ｍＬ、１８０ＩＵ／ｍＬ、１９０ＩＵ／ｍＬ、または２００ＩＵ／ｍＬの濃度、あるいは約５０ＩＵ／ｍＬ、６０ＩＵ／ｍＬ、７０ＩＵ／ｍＬ、８０ＩＵ／ｍＬ、９０ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ、１１０ＩＵ／ｍＬ、１２０ＩＵ／ｍＬ、１３０ＩＵ／ｍＬ、１４０ＩＵ／ｍＬ、１５０ＩＵ／ｍＬ、１６０ＩＵ／ｍＬ、１７０ＩＵ／ｍＬ、１８０ＩＵ／ｍＬ、１９０ＩＵ／ｍＬ、または２００ＩＵ／ｍＬの濃度の組換えＩＬ－１５を用いてインキュベートされる。一部の実施形態では、細胞、例えば、形質転換された細胞は、１００ＩＵ／ｍＬまたは約１００ＩＵ／ｍＬの組換えＩＬ－１５、例えば、ヒト遺伝子組換えＩＬ－２の存在下においてインキュベートされる。
特定の実施形態において、細胞、例えば、形質転換された細胞は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５の存在下においてインキュベートされる。一部の実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５組換え型である。ある特定の実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５ヒト型である。特定の実施形態において、１つまたは複数のサイトカインは、ヒト組換えＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５であるかまたはそれを含む。ある特定の実施形態では、細胞は、組換えＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５の存在下においてインキュベートされる。
一部の実施形態では、細胞は、上記において説明されるような、細胞オンカラムの刺激および形質導入の際に存在したのと同じまたは同様の培地の存在下においてインキュベートされる。一部の実施形態では、細胞は、例えば、上記において説明される刺激および形質導入の方法またはプロセスとの関連において実施されるような、細胞の刺激および形質導入の際に存在した培地と同じサイトカインを有する培地においてインキュベートされる。ある特定の実施形態では、細胞が、例えば、上記において説明される刺激および形質導入の方法またはプロセスとの関連において実施されるような、細胞の刺激および形質導入の際に存在した培地と同じ濃度のサイトカインを有する培地においてインキュベートされる。
一部の実施形態では、細胞は、組換えサイトカインの不在下においてインキュベートされる。
一部の実施形態では、インキュベーションの全てまたは一部は、基礎培地において実施される。一部の実施形態では、基礎培地は、無機塩、糖、アミノ酸、および場合により、ビタミン、有機酸、および／または緩衝剤、あるいは他の周知の細胞培養栄養素の混合物を含む。培地は、栄養素に加えて、ｐＨおよびオスモル濃度を維持することに役立つ。一部の態様では、基礎培地の試薬は、細胞成長、増殖、および／または拡大増殖を支援する。様々な市販の基礎培地が、当業者に周知であり、その例としては、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ロズウェルパーク記念研究所培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍｅｄｉｕｍ：ＲＰＭＩ）、イスコフ改変ダルベッコ培地、およびハム培地が挙げられる。一部の実施形態では、基礎培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地、ＲＰＭＩ－１６４０、またはα－ＭＥＭである。
一部の実施形態では、基礎培地は、緩衝塩類溶液（例えば、ＰＢＳ、ＤＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＥＢＳＳ）である。一部の実施形態では、基礎培地は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、Ｆ－１０、Ｆ－１２、ＲＰＭＩ１６４０、グラスゴー最小必須培地（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ：ＧＭＥＭ）、アルファ最小必須培地（ａｌｐｈａ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ：αＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地、およびＭ１９９から選択される、一部の実施形態では、基礎培地は、複合培地（例えば、ＲＰＭＩ－１６４０、ＩＭＤＭ）である。一部の実施形態では、基礎培地は、ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標） ＣＴＳ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）である。
ある特定の実施形態では、基礎培地は、追加の添加剤を補われる。一部の実施形態では、基本培地は、いかなる追加の添加剤も補われない。細胞培養培地に対する添加剤としては、これらに限定されるわけではないが、栄養素、糖、例えば、グルコースなど、アミノ酸、ビタミン、あるいはＡＴＰおよびＮＡＤＨなどの添加剤が挙げられる。
一部の実施形態では、基本培地は、タンパク質を含有しない。一部の実施形態では、基本培地は、ヒトタンパク質（例えば、ヒト血清タンパク質）を含有しない。一部の実施形態では、基本培地は、無血清である。一部の実施形態では、基本培地は、ヒトに由来する血清を含有しない。一部の実施形態では、基本培地は、組換えタンパク質を含有しない。一部の実施形態では、基本培地は、ヒトタンパク質および組換えタンパク質を含有しない。一部の実施形態では、基本培地は、ヒトタンパク質および組換えタンパク質を含有しない。一部の実施形態では、基本培地は、本明細書において説明される１つまたは複数または全てのサイトカインを含有しない。
一部の実施形態では、インキュベーションの全てまたは一部は、いかなる追加の添加剤または組換えサイトカインを伴わない基礎培地において実施される。一部の実施形態では、基礎培地は、いかなる追加の添加剤または組換えサイトカインを伴わないＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ基礎培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）である。一部の実施形態では、インキュベーションの全てまたは一部は、基礎培地およびグルタミンを含む培地、例えば、グルタミンを伴うＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ基礎培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、において実施される。
一部の実施形態では、インキュベーションの全てまたは一部は、１種または複数種の組換えサイトカイン、例えば、組換えヒトＩＬ－２、組換えヒトＩＬ－７、および／または組換えヒトＩＬ－１５など、を伴わない基礎培地（例えば、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ基礎培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ））を含む培地において実施される。一部の実施形態では、培地は、１種または複数種の追加の非血清成分を補われる。一部の実施形態では、１種または複数種の補足物質は、無血清である。一部の実施形態では、無血清培地は、アミノ酸、例えば、Ｌ－グルタミンなど、の遊離形態をさらに含む。一部の実施形態では、無血清培地は、血清代替補足物質を含まない。一部の実施形態では、無血清培地は、Ｌ－グルタミン（例えば、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン）のジペプチド形態、を含まない。一部の実施形態では、無血清培地は、いかなる組換えサイトカインも含まない。一部の実施形態では、無血清培地は、Ｔ細胞補足物質およびＬ－グルタミンの遊離形態を補った基礎培地を含み、ならびに、いかなる免疫細胞血清代替物、Ｌ－グルタミンのいかなるジペプチド形態、またはいかなる組換えサイトカインも含まない。一部の実施形態では、無血清培地は、基礎培地（例えば、ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を補った）、Ｌ－グルタミン、ならびに、例えば、補足物質（例えば、ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）によって提供されるような、１種または複数種の追加の成分、を含む。
特定の実施形態において、細胞は、０．２５×１０６個の細胞／ｍＬ、０．５×１０６個の細胞／ｍＬ、０．７５×１０６個の細胞／ｍＬ、１．０×１０６個の細胞／ｍＬ、１．２５×１０６個の細胞／ｍＬ、１．５×１０６個の細胞／ｍＬ、１．７５×１０６個の細胞／ｍＬ、または２．０×１０６個の細胞／ｍＬ、あるいは約０．２５×１０６個の細胞／ｍＬ、０．５×１０６個の細胞／ｍＬ、０．７５×１０６個の細胞／ｍＬ、１．０×１０６個の細胞／ｍＬ、１．２５×１０６個の細胞／ｍＬ、１．５×１０６個の細胞／ｍＬ、１．７５×１０６個の細胞／ｍＬ、または２．０×１０６個の細胞／ｍＬの濃度において、無血清培地にてインキュベートされる。特定の実施形態において、細胞は、０．２５×１０６個の細胞／ｍＬ～１．０×１０６個の細胞／ｍＬ、または約０．２５×１０６個の細胞／ｍＬ～１．０×１０６個の細胞／ｍＬの濃度において、無血清培地にてインキュベートされる。特定の実施形態において、細胞は、０．２５×１０６個の細胞／ｍＬ～０．７５×１０６個の細胞／ｍＬ、または約０．２５×１０６個の細胞／ｍＬ～０．７５×１０６個の細胞／ｍＬの濃度において、無血清培地にてインキュベートされる。特定の実施形態において、細胞は、０．５×１０６個の細胞／ｍＬ～０．７５×１０６個の細胞／ｍＬ、または約０．５×１０６個の細胞／ｍＬ～０．７５×１０６個の細胞／ｍＬの濃度において、無血清培地にてインキュベートされる。特定の実施形態において、細胞は、０．２５×１０６個の細胞／ｍＬ～０．５×１０６個の細胞／ｍＬ、または約０．２５×１０６個の細胞／ｍＬ～０．５×１０６個の細胞／ｍＬの濃度において、無血清培地にてインキュベートされる。特定の実施形態において、細胞は、０．７５×１０６個の細胞／ｍＬまたは約０．７５×１０６個の細胞／ｍＬの濃度において、無血清培地にてインキュベートされる。特定の実施形態において、細胞は、０．５×１０６個の細胞／ｍＬまたは約０．５×１０６個の細胞／ｍＬの濃度において、無血清培地にてインキュベートされる。一部の実施形態では、インキュベーションは、１８時間から３０時間の間または約１８時間から３０時間の間においてである。特定の実施形態において、インキュベーションは、２４時間または約２４時間、あるいは１日間または約１日間である。
特定の実施形態において、細胞は、サイトカインの不在下においてインキュベートされる。特定の実施形態において、細胞は、いかなる組換えサイトカインも不在下においてインキュベートされる。特定の実施形態において、細胞は、１種または複数種の組換えサイトカイン、例えば、組換えＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５など、の不在下においてインキュベートされる。
一部の実施形態では、例えば、非増大プロセスの場合の、インキュベーションの全てまたは一部は、基礎培地、グルタミン、および１種または複数種の組換えサイトカイン、例えば、グルタミンおよび組換えＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５を伴うＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ基礎培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）など、を含む培地において実施される。一部の実施形態では、例えば、非拡大増殖プロセスの場合の、インキュベーションの全てまたは一部は、基礎培地、グルタミン、１種または複数種の組換えサイトカイン、ならびにＴ細胞補足物質を含む培地、例えば、グルタミン、組換えＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５、ならびにＯｐＴｍｉｚｅｒ（登録商標）補足物質（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を伴うＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ基礎培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、において実施される。一部の実施形態では、例えば、非拡大増殖プロセスの場合の、インキュベーションの全てまたは一部は、基礎培地、グルタミン、１種または複数種の組換えサイトカイン、Ｔ細胞補足物質、ならびに１種または複数種の血清代替タンパク質を含む培地、例えば、グルタミン、組換えＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５、ＯｐＴｍｉｚｅｒ（登録商標） 補足物質（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ならびに血清代替タンパク質、例えば、アルブミン、インスリン、またはトランスフェリンのうちの１つまたは複数など、を伴うＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ基礎培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、において実施される。
一部の実施形態では、基礎培地は、グルタミン、例えば、Ｌ－グルタミンなど、をさらに含む。一部の態様では、グルタミンは、グルタミン、例えば、Ｌ－グルタミンなど、の遊離形態である。一部の実施形態では、基礎培地におけるグルタミン、例えば、Ｌ－グルタミンなど、の濃度は、約０．５ｍＭ～１ｍＭ、０．５ｍＭ～１．５ｍＭ、０．５ｍＭ～２ｍＭ、０．５ｍＭ～２．５ｍＭ、０．５ｍＭ～３ｍＭ、０．５ｍＭ～３．５ｍＭ、０．５ｍＭ～４ｍＭ、０．５ｍＭ～４．５ｍＭ、０．５ｍＭ～５ｍＭ、１ｍＭ～１．５ｍＭ、１ｍＭ～２ｍＭ、１ｍＭ～２．５ｍＭ、１ｍＭ～３ｍＭ、１ｍＭ～３．５ｍＭ、１ｍＭ～４ｍＭ、１ｍＭ～４．５ｍＭ、１ｍＭ～５ｍＭ、１．５ｍＭ～２ｍＭ、１．５ｍＭ～２．５ｍＭ、１．５ｍＭ～３ｍＭ、１．５ｍＭ～３．５ｍＭ、１．５ｍＭ～４ｍＭ、１．５ｍＭ～４．５ｍＭ、１．５ｍＭ～５ｍＭ、２ｍＭ～２．５ｍＭ、２ｍＭ～３ｍＭ、２ｍＭ～３．５ｍＭ、２ｍＭ～４ｍＭ、２ｍＭ～４．５ｍＭ、２ｍＭ～５ｍＭ、２．５ｍＭ～３ｍＭ、２．５ｍＭ～３．５ｍＭ、２．５ｍＭ～４ｍＭ、２．５ｍＭ～４．５ｍＭ、２．５ｍＭ～５ｍＭ、３ｍＭ～３．５ｍＭ、３ｍＭ～４ｍＭ、３ｍＭ～４．５ｍＭ、３ｍＭ～５ｍＭ、３．５ｍＭ～４ｍＭ、３．５ｍＭ～４．５ｍＭ、３．５ｍＭ～５ｍＭ、４ｍＭ～４．５ｍＭ、４ｍＭ～５ｍＭ、または４．５ｍＭ～５ｍＭ、あるいは約０．５ｍＭ～１ｍＭ未満、０．５ｍＭ～１．５ｍＭ未満、０．５ｍＭ～２ｍＭ未満、０．５ｍＭ～２．５ｍＭ未満、０．５ｍＭ～３ｍＭ未満、０．５ｍＭ～３．５ｍＭ未満、０．５ｍＭ～４ｍＭ未満、０．５ｍＭ～４．５ｍＭ未満、０．５ｍＭ～５ｍＭ未満、１ｍＭ～１．５ｍＭ未満、１ｍＭ～２ｍＭ未満、１ｍＭ～２．５ｍＭ未満、１ｍＭ～３ｍＭ未満、１ｍＭ～３．５ｍＭ未満、１ｍＭ～４ｍＭ未満、１ｍＭ～４．５ｍＭ未満、１ｍＭ～５ｍＭ未満、１．５ｍＭ～２ｍＭ未満、１．５ｍＭ～２．５ｍＭ未満、１．５ｍＭ～３ｍＭ未満、１．５ｍＭ～３．５ｍＭ未満、１．５ｍＭ～４ｍＭ未満、１．５ｍＭ～４．５ｍＭ未満、１．５ｍＭ～５ｍＭ未満、２ｍＭ～２．５ｍＭ未満、２ｍＭ～３ｍＭ未満、２ｍＭ～３．５ｍＭ未満、２ｍＭ～４ｍＭ未満、２ｍＭ～４．５ｍＭ未満、２ｍＭ～５ｍＭ未満、２．５ｍＭ～３ｍＭ未満、２．５ｍＭ～３．５ｍＭ未満、２．５ｍＭ～４ｍＭ未満、２．５ｍＭ～４．５ｍＭ未満、２．５ｍＭ～５ｍＭ未満、３ｍＭ～３．５ｍＭ未満、３ｍＭ～４ｍＭ未満、３ｍＭ～４．５ｍＭ未満、３ｍＭ～５ｍＭ未満、３．５ｍＭ～４ｍＭ未満、３．５ｍＭ～４．５ｍＭ未満、３．５ｍＭ～５ｍＭ未満、４ｍＭ～４．５ｍＭ未満、４ｍＭ～５ｍＭ未満、または４．５ｍＭ～５ｍＭ未満（それぞれ境界値を含む）である。一部の実施形態では、基礎培地におけるグルタミン、例えば、Ｌ－グルタミンなど、の濃度は、少なくとも約０．５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、３．５ｍＭ、４ｍＭ、４．５ｍＭ、または５ｍＭである。一部の実施形態では、基礎培地におけるグルタミン、例えば、Ｌ－グルタミンなど、の濃度は、の濃度は、最大で約２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、３．５ｍＭ、４ｍＭ、４．５ｍＭ、５ｍＭである。一部の実施形態では、基礎培地におけるグルタミン、例えば、Ｌ－グルタミンなど、の濃度は、約２ｍＭである。
一部の実施形態では、基礎培地は、タンパク質またはペプチドをさらに含み得る。一部の実施形態では、少なくとも１種のタンパク質は、非哺乳動物起源のタンパク質ではない。一部の実施形態では、少なくとも１種のタンパク質は、ヒトタンパク質またはヒト由来のタンパク質である。一部の実施形態では、少なくとも１種のタンパク質は、組換え体である。一部の実施形態では、少なくとも１種のタンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、インスリン、フィブロネクチン、アプロチニン、またはフェチュインを含む。一部の実施形態では、タンパク質は、アルブミン、インスリン、またはトランスフェリンのうちの１つまたは複数、必要に応じて、ヒトまたは組換えアルブミン、インスリン、またはトランスフェリンのうちの１つまたは複数を含む。
一部の実施形態では、タンパク質は、アルブミンまたはアルブミン代替体である。一部の実施形態では、アルブミンは、ヒト由来アルブミンである。一部の実施形態では、アルブミンは、組換えアルブミンである。一部の実施形態では、アルブミンは、天然ヒト血清アルブミンである。一部の実施形態では、アルブミンは、組換えヒト血清アルブミンである。一部の実施形態では、アルブミンは、非ヒト源由来の組換えアルブミンである。アルブミン代替体は、任意のタンパク質またはポリペプチド源であり得る。そのようなタンパク質またはポリペプチド試料の例としては、これらに限定されるわけではないが、ウシ脳下垂体抽出物、植物加水分解物（例えば、米の加水分解物）、ウシ胎児アルブミン（フェチュイン）、卵アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、または別の動物由来のアルブミン、鶏雛抽出物、ウシ胚抽出物、ＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標） Ｉ、およびＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）ＩＩが挙げられる。一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、トランスフェリンを含む。一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、フィブロネクチンを含む。一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、アプロチニンを含む。一部の実施形態では、タンパク質は、フェチュインを含む。
一部の実施形態では、１種または複数の追加のタンパク質は、基礎培地に添加される血清代替補足物質の一部である。血清代替物補足物質の例としては、例えば、Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃Ａ２５９８１０１）、またはSmith et al. Clin Transl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31に記載されるものが挙げられる。
ある特定の実施形態では、細胞は、溶出後に、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４０時間、４８時間、５４時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、または９６時間以上、あるいは約１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４０時間、４８時間、５４時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、または９６時間以上、あるいは少なくとも１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４０時間、４８時間、５４時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、または９６時間以上、さらにインキュベートされる（例えば、培養される）。一部の実施形態では、さらなるインキュベートすること（例えば、培養すること）は、溶出後に、３０分～２時間、１時間～８時間、６時間～１２時間、１２時間～１８時間、１６時間～２４時間、１８時間～３０時間、２４時間～４８時間、２４時間～７２時間、４２時間～５４時間、６０時間～１２０時間、９６時間～１２０時間、ならびに１日間～７日間、３日間～８日間、１日間～３日間、４日間～６日間、または４日間～５日間、実施される。一部の実施形態では、インキュベートすることは、１８時間～３０時間または約１８時間～３０時間である。特定の実施形態において、インキュベートすることは、２４時間または約２４時間である。
ある特定の実施形態では、インキュベーションの総持続時間は、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間、または１２０時間、あるいは約１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間、または１２０時間、あるいは少なくとも１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間、または１２０時間である。特定の実施形態において、インキュベーションは、１２０時間、１０８時間、９６時間、８４時間、７２時間、６０時間、５４時間、４８時間、４２時間、３６時間、３０時間、２４時間、１８時間、または１２時間において、あるいは約１２０時間、１０８時間、９６時間、８４時間、７２時間、６０時間、５４時間、４８時間、４２時間、３６時間、３０時間、２４時間、１８時間、または１２時間において、あるいは１２０時間以内、１０８時間以内、９６時間以内、８４時間以内、７２時間以内、６０時間以内、５４時間以内、４８時間以内、４２時間以内、３６時間以内、３０時間以内、２４時間以内、１８時間以内、または１２時間以内において完了する。一部の実施形態では、インキュベーションの総持続時間は、１２時間～１２０時間、１８時間～９６時間、２４時間～７２時間、または２４時間～４８時間、あるいは約１２時間～１２０時間、１８時間～９６時間、２４時間～７２時間、または２４時間～４８時間（境界値を含む）である。一部の実施形態では、インキュベーションの総持続時間は、１時間～４８時間、４時間～３６時間、８時間～３０時間、または１２時間～２４時間、あるいは約１時間～４８時間、４時間～３６時間、８時間～３０時間、または１２時間～２４時間（境界値を含む）である。特定の実施形態において、インキュベーションは、２４時間、４８時間、または７２時間において、あるいは約２４時間、４８時間、または７２時間において実施される。特定の実施形態において、インキュベーションは、２４時間±６時間、４８時間±６時間、または７２時間±６時間において実施される。
特定の実施形態において、インキュベーションは、刺激の開始後、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間において、または約１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間において、あるいは少なくとも１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間において開始される。特定の実施形態において、インキュベーションは、刺激の開始の１２０時間、１０８時間、９６時間、８４時間、７２時間、６０時間、５４時間、４８時間、４２時間、３６時間、３０時間、２４時間、１８時間、または１２時間において、あるいは約１２０時間、約１０８時間、約９６時間、約８４時間、約７２時間、約６０時間、約５４時間、約４８時間、約４２時間、約３６時間、約３０時間、約２４時間、約１８時間、または約１２時間において、あるいは１２０時間以内、１０８時間以内、９６時間以内、８４時間以内、７２時間以内、６０時間以内、５４時間以内、４８時間以内、４２時間以内、３６時間以内、３０時間以内、２４時間以内、１８時間以内、または１２時間以内において開始される。
一部の実施形態では、インキュベーションは、刺激の開始後、２４時間～１２０時間、３６時間～１０８時間、４８時間～９６時間、または４８時間～７２時間において、あるいは約２４時間～１２０時間、約３６時間～１０８時間、約４８時間～９６時間、または約４８時間～７２時間において完了する。一部の実施形態では、インキュベーションは、刺激の開始から、１２０時間、１０８時間、９６時間、７２時間、４８時間、または３６時間において、あるいは約１２０時間、約１０８時間、約９６時間、約７２時間、約４８時間、または約３６時間において、あるいは１２０時間以内、１０８時間以内、９６時間以内、７２時間以内、４８時間以内、または３６時間以内において完了する。特定の実施形態において、インキュベーションは、２４時間±６時間後、４８時間±６時間後、または７２時間±６時間後に完了する。特定の実施形態において、インキュベーションは、７２時間または約７２時間、あるいは３日間または約３日間、実施される。一部の実施形態では、インキュベーションは、細胞のゲノムへの異種または組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドの統合を可能にするのに十分な期間において実施される。特定の実施形態において、インキュベーションは、刺激の開始後、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間において、あるいは約１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間において、あるいは少なくとも１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間において開始される。特定の実施形態において、インキュベーションは、刺激の開始後、０．５日、１日、１．５日、または２日において、あるいは約０．５日、１日、１．５日、または２日において、あるいは少なくとも０．５日、１日、１．５日、または２日において開始される。特定の実施形態において、インキュベーションは、刺激の開始の、１２０時間、１０８時間、９６時間、８４時間、７２時間、６０時間、５４時間、４８時間、４２時間、３６時間、３０時間、２４時間、１８時間、または１２時間において、あるいは約１２０時間、１０８時間、９６時間、８４時間、７２時間、６０時間、５４時間、４８時間、４２時間、３６時間、３０時間、２４時間、１８時間、または１２時間において、あるいは１２０時間、１０８時間、９６時間、８４時間、７２時間、６０時間、５４時間、４８時間、４２時間、３６時間、３０時間、２４時間、１８時間、または１２時間以内において開始される。特定の実施形態において、インキュベーションは、刺激の開始の、１１時間、１０時間、９時間、８時間、７時間、６時間、５時間、または４時間において、あるいは約１１時間、１０時間、９時間、８時間、７時間、６時間、５時間、または４時間において、あるいは１１時間、１０時間、９時間、８時間、７時間、６時間、５時間、または４時間以内において開始される。特定の実施形態において、インキュベーションは、刺激の開始の、５日、４日、３日、２日、１日、または０．５日において、あるいは約５日、４日、３日、２日、１日、または０．５日において、あるいは５日、４日、３日、２日、１日、または０．５日以内において開始される。
一部の実施形態では、インキュベーションは、刺激の開始後、２４時間～１２０時間、３６時間～１０８時間、４８時間～９６時間、または４８時間～７２時間において、あるいは約２４時間～１２０時間、３６時間～１０８時間、４８時間～９６時間、または４８時間～７２時間において（境界値を含む）完了する。一部の実施形態では、インキュベーションは、刺激の開始から、１２０時間、１０８時間、９６時間、７２時間、４８時間、または３６時間において、あるいは約１２０時間、１０８時間、９６時間、７２時間、４８時間、または３６時間において、あるいは１２０時間、１０８時間、９６時間、７２時間、４８時間、または３６時間以内において完了する。一部の実施形態では、インキュベーションは、刺激の開始から、５日、４．５日、４日、３日、２日、または１．５日において、あるいは約５日、４．５日、４日、３日、２日、または１．５日において、あるいは５日、４．５日、４日、３日、２日、または１．５日以内において完了する。特定の実施形態において、インキュベーションは、刺激の開始後、２４時間±６時間、４８時間±６時間、または７２時間±６時間後に完了する。一部の実施形態では、インキュベーションは、７２時間または約７２時間後、あるいは３日または約３日後に完了する。
上記の実施形態のいずれかのいくらかにおいて、溶出した操作された細胞は、細胞集団（例えば、生存Ｔ体細胞数）を拡大増殖する培養条件下においてインキュベートされない。いくらかの任意の上記実施形態において、細胞は、インキュベーションまたは培養の間の生存細胞の量を増加させる培養条件下においてインキュベートされない。例えば、一部の態様では、細胞は、インキュベーションの開始時における総生存細胞の数と比較して、インキュベーションの終了時における総生存細胞の量を増加させる条件（例えば、培養条件）下においてインキュベートされない。一部の実施形態では、細胞は、結果として拡大増殖を生じ得る条件下においてインキュベートされるが、インキュベートする条件は、細胞集団を拡大増殖する目的のためには行われない。一部の実施形態では、増大および増殖を促進しないまたは容易にしない条件下においてインキュベートされた細胞は、非拡大増殖細胞または最小限拡大増殖細胞と呼ばれ得る。
一部の実施形態では、形質導入または操作された細胞は、遺伝子操作工程、例えば、形質導入またはトランスフェクションによって組換えポリヌクレオチドを細胞に導入する工程、の後の増殖および／または拡大増殖を促進する培養条件下においてインキュベートされる。特定の実施形態において、細胞は、組換えポリヌクレオチド、例えば、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを用いて形質導入またはトランスフェクトされた後に培養される。一部の実施形態では、培養は、操作されたＴ細胞の１つまたは複数の培養された組成物を産生する。一部の実施形態では、そのような培養条件は、集団における細胞の増殖、拡大増殖、活性化、および／または生存を誘導するように設計され得る。特定の実施形態において、培養条件は、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、薬剤、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、および／または刺激因子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、ならびに細胞の増殖、分裂、および／または拡大増殖を促進するように設計された任意の他の薬剤など、のうちの１つまたは複数を含み得る。一部の実施形態では、増殖および／または拡大増殖を促進する条件下においてインキュベートされた細胞は、拡大増殖細胞と呼ばれ得る。
特定の実施形態において、細胞は、０．２５×１０６個の細胞／ｍＬ、０．５×１０６個の細胞／ｍＬ、０．７５×１０６個の細胞／ｍＬ、１．０×１０６個の細胞／ｍＬ、１．２５×１０６個の細胞／ｍＬ、１．５×１０６個の細胞／ｍＬ、１．７５×１０６個の細胞／ｍＬ、または２．０×１０６個の細胞／ｍＬ、あるいは約０．２５×１０６個の細胞／ｍＬ、０．５×１０６個の細胞／ｍＬ、０．７５×１０６個の細胞／ｍＬ、１．０×１０６個の細胞／ｍＬ、１．２５×１０６個の細胞／ｍＬ、１．５×１０６個の細胞／ｍＬ、１．７５×１０６個の細胞／ｍＬ、または２．０×１０６個の細胞／ｍＬの濃度において、培養条件下でインキュベートされる（例えば、培養される）。特定の実施形態において、細胞は、０．２５×１０６個の細胞／ｍＬ～１．０×１０６個の細胞／ｍＬ、または約０．２５×１０６個の細胞／ｍＬ～１．０×１０６個の細胞／ｍＬの濃度において、培養条件下でインキュベートされる。特定の実施形態において、細胞は、０．２５×１０６個の細胞／ｍＬ～０．７５×１０６個の細胞／ｍＬ、または約０．２５×１０６個の細胞／ｍＬ～０．７５×１０６個の細胞／ｍＬの濃度において、培養条件下でインキュベートされる。特定の実施形態において、細胞は、０．５×１０６個の細胞／ｍＬ～０．７５×１０６個の細胞／ｍＬ、または約０．５×１０６個の細胞／ｍＬ～０．７５×１０６個の細胞／ｍＬ、の濃度において、培養条件下でインキュベートされる。特定の実施形態において、細胞は、０．２５×１０６個の細胞／ｍＬ～０．５×１０６個の細胞／ｍＬ、または約０．２５×１０６個の細胞／ｍＬ～０．５×１０６個の細胞／ｍＬの濃度において、培養条件下でインキュベートされる。特定の実施形態において、細胞は、０．７５×１０６個の細胞／ｍＬまたは約０．７５×１０６個の細胞／ｍＬの濃度において、培養条件下でインキュベートされる。特定の実施形態において、細胞は、０．５×１０６個の細胞／ｍＬまたは約０．５×１０６個の細胞／ｍＬの濃度において、培養条件下でインキュベートされる。
一部の実施形態では、操作された細胞は、添加された細胞を培養するために、例えば、供給ポートによって、細胞培地および／または細胞で満たすことができる容器において、培養される（例えば、培養される）。細胞は、細胞の拡大増殖および／または増殖のために細胞の培養が設計された、任意の細胞源に由来し得る。
一部の態様では、培養培地は、細胞、例えば、Ｔ細胞など、の成長、拡大増殖、または増殖を支援する、適合された培養培地である。一部の態様では、培地は、塩、アミノ酸、ビタミン、糖、またはそれらの任意の組合せの混合物を含む液体であり得る。一部の実施形態では、培養培地は、例えば、インキュベーションの間に細胞の拡大増殖または増殖を刺激するような、１種または複数種の刺激条件または刺激剤をさらに含む。一部の実施形態では、刺激条件は、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７またはＩＬ－１５から選択されるような、１種または複数種のサイトカインであるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、サイトカインは、組換えサイトカインである。特定の実施形態において、１種または複数種のサイトカインは、ヒト組換えサイトカインである。ある特定の実施形態において、１種または複数種のサイトカインは、Ｔ細胞によって発現されるかまたはＴ細胞に対して内因性である受容体に結合するおよび／または結合することができる。特定の実施形態において、１種または複数種のサイトカインは、サイトカインの４α－ヘリックスバンドルファミリーのメンバーであるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、サイトカインの４α－ヘリックスバンドルファミリーのメンバーとしては、これらに限定されるわけではないが、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）が挙げられる。一部の実施形態では、１種または複数種のサイトカインは、ＩＬ－１５であるかまたはそれを含む。特定の実施形態において、１種または複数種のサイトカインは、ＩＬ－７であるかまたはそれを含む。特定の実施形態において、１種または複数種のサイトカインは、組換えＩＬ－２であるかまたはそれを含む。
一部の実施形態では、培養の間での培養培地における１種または複数種のサイトカインの濃度は、独立して、１ＩＵ／ｍＬ～１５００ＩＵ／ｍＬまたは約１ＩＵ／ｍＬ～１５００ＩＵ／ｍＬ、例えば、１ＩＵ／ｍＬ～１００ＩＵ／ｍＬ、２ＩＵ／ｍＬ～５０ＩＵ／ｍＬ、５ＩＵ／ｍＬ～１０ＩＵ／ｍＬ、１０ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ～２５０ＩＵ／ｍＬ、または１００ＩＵ／ｍＬ～２００ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ～１５００ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ～１０００ＩＵ／ｍＬ、または２００ＩＵ／ｍＬ～６００ＩＵ／ｍＬ、あるいは約１ＩＵ／ｍＬ～１００ＩＵ／ｍＬ、２ＩＵ／ｍＬ～５０ＩＵ／ｍＬ、５ＩＵ／ｍＬ～１０ＩＵ／ｍＬ、１０ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ～２５０ＩＵ／ｍＬ、または１００ＩＵ／ｍＬ～２００ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ～１５００ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ～１０００ＩＵ／ｍＬ、または２００ＩＵ／ｍＬ～６００ＩＵ／ｍＬなど、である。一部の実施形態では、１種または複数種のサイトカインの濃度は、独立して、少なくとも１ＩＵ／ｍＬ、５ＩＵ／ｍＬ、１０ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ、２００ＩＵ／ｍＬ、５００ＩＵ／ｍＬ、１０００ＩＵ／ｍＬ、または１５００ＩＵ／ｍＬ、あるいは少なくとも約１ＩＵ／ｍＬ、５ＩＵ／ｍＬ、１０ＩＵ／ｍＬ、５０ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ、２００ＩＵ／ｍＬ、５００ＩＵ／ｍＬ、１０００ＩＵ／ｍＬ、または１５００ＩＵ／ｍＬ、である。
一部の実施形態では、操作された細胞の組成物は、２５～３８℃、例えば、３０～３７℃など、の温度において、例えば、３７℃±２℃において培養される。一部の実施形態では、培養条件は、培養、例えば、培養または拡大増殖が、結果として、所望のまたは閾値の、密度、濃度、細胞の数、または細胞の用量を生じるまでの期間において行われる。一部の実施形態では、インキュベーションは、培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）、例えば培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）または拡大が、生細胞の所望のまたは閾値の密度、濃度、数または用量をもたらすまでの期間実施される。一部の実施形態では、インキュベーションは、２４時間超、４８時間超、７２時間超、９６時間超、５日間超、６日間超、７日間超、８日間超、９日間超もしくはそれ以上、または約２４時間超、約４８時間超、約７２時間超、約９６時間超、約５日間超、約６日間超、約７日間超、約８日間超、約９日間超もしくはそれ以上、または２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間もしくはそれ以上、または約２４時間、約４８時間、約７２時間、約９６時間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間もしくはそれ以上である。
一部の実施形態では、細胞は、細胞培養において二酸化炭素の目標量を維持する条件下において、インキュベートされるかまたは培養される。一部の態様では、これは、成長の際の最適な培養、拡大増殖、および増殖を確保する。一部の態様では、二酸化炭素（ＣＯ２）の量は、気体の１０％から０％（ｖ／ｖ）の間、例えば、気体の８％から２％（ｖ／ｖ）の間、例えば、５％（ｖ／ｖ）または約５％（ｖ／ｖ）のＣＯ２の量など、である。
特定の実施形態では、培養は閉鎖されたシステムで行われる。ある特定の実施形態では、培養は無菌条件下の閉鎖されたシステムで行われる。一部の実施形態では、操作された細胞の組成物は閉鎖されたシステムから取り出され、培養用のバイオリアクターに入れられ、および／または接続される。培養用の適切なバイオリアクターの例には、ＧＥ Ｘｕｒｉ Ｗ２５、ＧＥ Ｘｕｒｉ Ｗ５、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＢｉｏＳＴＡＴ ＲＭ ２０ ｜ ５０、Ｆｉｎｅｓｓｅ ＳｍａｒｔＲｏｃｋｅｒ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、およびＰａｌｌ ＸＲＳ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、バイオリアクターは、培養工程の少なくとも一部の間に、細胞を灌流および／または混合するのに使用される。
一部の実施形態では、閉じ込められ、接続されている間に培養された細胞、および／またはバイオリアクターの制御下で培養された細胞は、バイオリアクターなしで培養された細胞、例えば、混合、揺動、運動、および／または灌流なしなどの静的条件下で培養された細胞より迅速に培養中に拡大する。一部の実施形態では、閉じ込められ、接続されている間に培養された細胞、および／またはバイオリアクターの制御下で培養された細胞は、１４日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日、６０時間、４８時間、３６時間、２４時間、または１２時間以内に閾値の拡大、細胞計数、および／または密度に達するか、またはそれらを達成する。一部の実施形態では、閉じ込められ、接続されている間に培養された細胞、および／またはバイオリアクターの制御下で培養された細胞は、細胞が閉じ込められ、接続されている間に培養されない、および／またはバイオリアクターの制御下で培養されない例示的なおよび／または代替のプロセスで培養された細胞より、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、閾値の拡大、細胞計数、および／または密度に達するか、またはそれらを達成する。
一部の実施形態では、混合工程は、揺動および／またはモーショニングであるかまたはそれらを含む。一部の実施形態では、細胞は、バイオリアクターに関連して使用されるような容器、例えば、バッグなど、を使用してインキュベートされる。一部の例では、バイオリアクターは運動または揺動に供されてもよく、これは一部の態様では酸素移動を増加させることができる。バイオリアクターの運動は、水平軸に沿った回転、垂直軸に沿った回転、バイオリアクターの傾いたもしくは傾斜した水平軸に沿った揺動運動、またはそれらの任意の組合せが挙げられ得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、インキュベーションの少なくとも一部は揺動により実施される。揺動速度および揺動角度は、所望の撹拌を達成するように調整することができる。一部の実施形態では揺動角度は、２０°、１９°、１８°、１７°、１６°、１５°、１４°、１３°、１２°、１１°、１０°、９°、８°、７°、６°、５°、４°、３°、２°または１°であるか、または約２０°、約１９°、約１８°、約１７°、約１６°、約１５°、約１４°、約１３°、約１２°、約１１°、約１０°、約９°、約８°、約７°、約６°、約５°、約４°、約３°、約２°または約１°である。ある特定の実施形態では、揺動角度は６～１６°である。他の実施形態では、揺動角度は７～１６°である。他の実施形態では、揺動角度は８～１２°である。一部の実施形態では、揺動速度は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１ １２、１３、１４ １５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ｒｐｍである。一部の実施形態では、揺動速度は、４～１２ｒｐｍ、例えば４ｒｐｍ以上６ｒｐｍ以下である。細胞培養拡大の少なくとも一部は、揺動運動により、例えば５°～１０°、例えば６°の角度で、５～１５ｒｐｍ、例えば６ｒｍｐまたは１０ｒｐｍの速度などの一定の揺動速度で行われる。
一部の実施形態では、細胞、例えば、操作された細胞、例えば、操作されたＴ細胞、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞、または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞など、を含む組成物は、界面活性物質の存在下において培養される。特定の実施形態では、組成物の細胞を培養することは、培養中、例えば、混合、揺動、運動、および／または灌流により生じ得るせん断応力の量を低減する。特定の実施形態では、操作された細胞、例えば、操作されたＴ細胞、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞などの細胞の組成物は、界面活性剤と共に培養され、培養中または培養が完了した少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、または７日超後に、Ｔ細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％が生存し、例えば、生存可能であり、および／または壊死、プログラム細胞死、もしくはアポトーシスを起こさない。特定の実施形態では、操作されたＴ細胞、例えば、操作されたＣＤ３＋Ｔ細胞、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞などの細胞の組成物は、界面活性剤の存在下で培養され、細胞の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満または０．０１％未満が、せん断応力またはせん断誘発応力などによる細胞死、例えば、プログラム細胞死、アポトーシス、および／または壊死を起こす。
特定の実施形態では、操作されたＴ細胞、例えば、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞などの細胞の組成物は、０．１μｌ／ｍｌ～１０．０μｌ／ｍｌ、０．２μｌ／ｍｌ～２．５μｌ／ｍｌ、０．５μｌ／ｍｌ～５μｌ／ｍｌ、１μｌ／ｍｌ～３μｌ／ｍｌ、または２μｌ／ｍｌ～４μｌ／ｍｌの界面活性剤の存在下で培養される。一部の実施形態では、操作されたＴ細胞、例えば、操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞または操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞などの細胞の組成物は、０．１μｌ／ｍｌ、０．２μｌ／ｍｌ、０．４μｌ／ｍｌ、０．６μｌ／ｍｌ、０．８μｌ／ｍｌ、１μｌ／ｍｌ、１．５μｌ／ｍｌ、２．０μｌ／ｍｌ、２．５μｌ／ｍｌ、５．０μｌ／ｍｌ、１０μｌ／ｍｌ、２５μｌ／ｍｌ、もしくは５０μｌ／ｍｌ、約０．１μｌ／ｍｌ、約０．２μｌ／ｍｌ、約０．４μｌ／ｍｌ、約０．６μｌ／ｍｌ、約０．８μｌ／ｍｌ、約１μｌ／ｍｌ、約１．５μｌ／ｍｌ、約２μｌ／ｍｌ、約２．５μｌ／ｍｌ、約５μｌ／ｍｌ、約１０μｌ／ｍｌ、約２５μｌ／ｍｌ、もしくは約５０μｌ／ｍｌ、または少なくとも０．１μｌ／ｍｌ、少なくとも０．２μｌ／ｍｌ、少なくとも０．４μｌ／ｍｌ、少なくとも０．６μｌ／ｍｌ、少なくとも０．８μｌ／ｍｌ、少なくとも１μｌ／ｍｌ、少なくとも１．５μｌ／ｍｌ、少なくとも２μｌ／ｍｌ、少なくとも２．５μｌ／ｍｌ、少なくとも５μｌ／ｍｌ、少なくとも１０μｌ／ｍｌ、少なくとも２５μｌ／ｍｌ、もしくは少なくとも５０μｌ／ｍｌの界面活性剤の存在下で培養される。ある特定の実施形態では、細胞の組成物は、２μｌ／ｍｌまたは約２μｌ／ｍｌの界面活性剤の存在下で培養される。
一部の実施形態では、界面活性剤は、液体および／または固体の表面張力を低減する薬剤であるか、またはこれを含む。例えば、界面活性剤には、脂肪アルコール（例えば、ステリルアルコール）、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、またはポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル（例えば、ポリソルベート２０、４０、６０）が挙げられる。ある特定の実施形態では界面活性剤は、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）、ポリソルベート２０（ＰＳ２０）、ポロキサマー１８８（Ｐ１８８）からなる群から選択される。例示的な実施形態では、合成流加培地の界面活性剤の濃度は、ＰＳ８０約０．００２５％～約０．２５％（ｖ／ｖ）；ＰＳ２０約０．００２５％～約０．２５％（ｖ／ｖ）；またはＰ１８８約０．１％～約５．０％（ｗ／ｖ）である。
一部の実施形態では、界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、またはそれらに添加される非イオン性界面活性剤であるか、またはこれらを含む。適切なアニオン性界面活性剤には、スルホン酸アルキル、リン酸アルキル、ホスホン酸アルキル、ラウリン酸カリウム、ステアリン酸トリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン硫酸アルキル、アルギン酸ナトリウム、ジオクチルソジウムスルホサクシネート、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸およびそれらの塩、カルボキシメチルセルロースナトリウム、コール酸および他の胆汁酸（例えば、デオキシコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、グリコデオキシコール酸）およびそれらの塩（例えば、デオキシコール酸ナトリウム）が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、適切な非イオン性界面活性剤には：グリセリルエステル、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート）、ポリオキシエレチン脂肪酸エステル、ソルビタンエステル、モノステアリン酸グリセロール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、セチルアルコール、セトステアリルアルコール、ステアリルアルコール、アリールアルキルポリエーテルアルコール、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマー（ポロキサマー）、ポラキサミン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、非結晶性セルロース、デンプンおよびヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）などのデンプン誘導体を含む多糖類、ポリビニルアルコール、およびポリビニルピロリドンが挙げられる。ある特定の実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンコポリマー、好ましくはプロピレングリコールとエチレングリコールのブロックコポリマーである。そのようなポリマーは、商標ＰＯＬＯＸＡＭＥＲの下に販売されている［ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ６８またはＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８とも呼ばれる場合がある］。ポリオキシエチレン脂肪酸エステルの中には、短いアルキル鎖を有するものが含まれる。そのような界面活性剤の１つの例は、ＳＯＬＵＴＯＬ（登録商標）ＨＳ １５、ポリエチレン－６６０－ヒドロキシステアレートである。
一部の実施形態では、適切なカチオン性界面活性剤には、天然のリン脂質、合成リン脂質、第４級アンモニウム化合物、塩化ベンザルコニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、キトサン、塩化ラウリルジメチルベンジルアンモニウム、塩酸アシルカルニチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジミリストイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジメチルアミノエタンカルバモイルコレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、１，２－ジアシルグリセロ－３－（Ｏ－アルキル）ホスホコリン、Ｏ－アルキルホスファチジルコリン、アルキルピリジニウムハライド、または例えばｎ－オクチルアミンおよびオレイルアミンなどの長鎖アルキルアミンが挙げられ得るが、これらに限定されない。
双性イオン性界面活性剤は電気的に中性であるが、同じ分子内に局所正電荷および負電荷を有する。適切な双性イオン性界面活性剤には、双性イオン性リン脂質が挙げられるが、これに限定されない。適切なリン脂質には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジアシル－グリセロ－ホスホエタノールアミン［ジミリストイル－グリセロ－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイル－グリセロ－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイル－グリセロ－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、およびジオレオリル（ｄｉｏｌｅｏｌｙｌ）－グリセロ－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）など］が挙げられるが、これらに限定されない。アニオン性リン脂質および双性イオン性リン脂質を含むリン脂質の混合物が、本発明では使用され得る。そのような混合物には、リゾリン脂質、卵リン脂質もしくは大豆リン脂質、またはそれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。リン脂質は、アニオン性、双性イオン性、またはリン脂質の混合物であるかにかかわらず、塩化もしくは脱塩化、水素化もしくは部分的水素化されてもよいか、または天然半合成もしくは合成であってもよい。
ある特定の実施形態では、界面活性剤は、ポロキサマー、例えばポロキサマー１８８である。一部の実施形態では、細胞の組成物は、０．１μｌ／ｍｌ～１０．０μｌ／ｍｌ、０．２μｌ／ｍｌ～２．５μｌ／ｍｌ、０．５μｌ／ｍｌ～５μｌ／ｍｌ、１μｌ／ｍｌ～３μｌ／ｍｌ、または２μｌ／ｍｌ～４μｌ／ｍｌのポロキサマーの存在下で培養される。一部の実施形態では、細胞の組成物は、０．１μｌ／ｍｌ、０．２μｌ／ｍｌ、０．４μｌ／ｍｌ、０．６μｌ／ｍｌ、０．８μｌ／ｍｌ、１μｌ／ｍｌ、１．５μｌ／ｍｌ、２．０μｌ／ｍｌ、２．５μｌ／ｍｌ、５．０μｌ／ｍｌ、１０μｌ／ｍｌ、２５μｌ／ｍｌ、もしくは５０μｌ／ｍｌ、約０．１μｌ／ｍｌ、約０．２μｌ／ｍｌ、約０．４μｌ／ｍｌ、約０．６μｌ／ｍｌ、約０．８μｌ／ｍｌ、約１μｌ／ｍｌ、約１．５μｌ／ｍｌ、約２．０μｌ／ｍｌ、約２．５μｌ／ｍｌ、約５．０μｌ／ｍｌ、約１０μｌ／ｍｌ、約２５μｌ／ｍｌ、もしくは約５０μｌ／ｍｌ、または少なくとも０．１μｌ／ｍｌ、少なくとも０．２μｌ／ｍｌ、少なくとも０．４μｌ／ｍｌ、少なくとも０．６μｌ／ｍｌ、少なくとも０．８μｌ／ｍｌ、少なくとも１μｌ／ｍｌ、少なくとも１．５μｌ／ｍｌ、少なくとも２．０μｌ／ｍｌ、少なくとも２．５μｌ／ｍｌ、少なくとも５．０μｌ／ｍｌ、少なくとも１０μｌ／ｍｌ、少なくとも２５μｌ／ｍｌ、もしくは少なくとも５０μｌ／ｍｌの界面活性剤の存在下で培養される。ある特定の実施形態では、細胞の組成物は、２μｌ／ｍｌまたは約２μｌ／ｍｌのポロキサマーの存在下で培養される。
一部の態様では、操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８）は、それぞれが量または細胞密度の閾値に達するまで、別々に拡大増殖され得るかまたは一緒に拡大増殖され得る。特定の実施形態では、細胞が閾値の量、濃度、および／または拡大を達成すると、細胞の収集などによって培養は終了する。特定の実施形態では、細胞が、例えば培養の始まりまたは開始時点の細胞の密度の量の観点でおよび／または該量に関して、１．５倍の拡大、２倍の拡大、２．５倍の拡大、３倍の拡大、３．５倍の拡大、４倍の拡大、４．５倍の拡大、５倍の拡大、６倍の拡大、７倍の拡大、８倍の拡大、９倍の拡大、１０倍の拡大、もしくは１０倍超の拡大を達成するか、または約もしくは少なくとも１．５倍の拡大、２倍の拡大、２．５倍の拡大、３倍の拡大、３．５倍の拡大、４倍の拡大、４．５倍の拡大、５倍の拡大、６倍の拡大、７倍の拡大、８倍の拡大、９倍の拡大、１０倍の拡大、もしくは１０倍超の拡大を達成すると、培養は終了する。一部の実施形態では、閾値拡大は、例えば培養の始まりまたは開始時点の細胞の密度の量の観点でおよび／または該量に関して、４倍の拡大である。一部の実施形態では、細胞が細胞の閾値総量、例えば閾値細胞計数を達成すると、細胞の収集などによって培養は終了する。一部の実施形態では、細胞が閾値総有核細胞（ＴＮＣ）数を達成すると、培養は終了する。一部の実施形態では、細胞が細胞の閾値生存量、例えば閾値生細胞計数を達成すると、培養は終了する。一部の実施形態では、閾値細胞計数は、５０×１０６細胞、１００×１０６細胞、２００×１０６細胞、３００×１０６細胞、４００×１０６細胞、６００×１０６細胞、８００×１０６細胞、１０００×１０６細胞、１２００×１０６細胞、１４００×１０６細胞、１６００×１０６細胞、１８００×１０６細胞、２０００×１０６細胞、２５００×１０６細胞、３０００×１０６細胞、４０００×１０６細胞、５０００×１０６細胞、１０，０００×１０６細胞、１２，０００×１０６細胞、１５，０００×１０６細胞もしくは２０，０００×１０６細胞であるか、または約５０×１０６細胞、約１００×１０６細胞、約２００×１０６細胞、約３００×１０６細胞、約４００×１０６細胞、約６００×１０６細胞、約８００×１０６細胞、約１０００×１０６細胞、約１２００×１０６細胞、約１４００×１０６細胞、約１６００×１０６細胞、約１８００×１０６細胞、約２０００×１０６細胞、約２５００×１０６細胞、約３０００×１０６細胞、約４０００×１０６細胞、約５０００×１０６細胞、約１０，０００×１０６細胞、約１２，０００×１０６細胞、約１５，０００×１０６細胞もしくは約２０，０００×１０６細胞であるか、または少なくとも５０×１０６細胞、少なくとも１００×１０６細胞、少なくとも２００×１０６細胞、少なくとも３００×１０６細胞、少なくとも４００×１０６細胞、少なくとも６００×１０６細胞、少なくとも８００×１０６細胞、少なくとも１０００×１０６細胞、少なくとも１２００×１０６細胞、少なくとも１４００×１０６細胞、少なくとも１６００×１０６細胞、少なくとも１８００×１０６細胞、少なくとも２０００×１０６細胞、少なくとも２５００×１０６細胞、少なくとも３０００×１０６細胞、少なくとも４０００×１０６細胞、少なくとも５０００×１０６細胞、少なくとも１０，０００×１０６細胞、少なくとも１２，０００×１０６細胞、少なくとも１５，０００×１０６細胞もしくは少なくとも２０，０００×１０６細胞であるか、または生細胞の前述の閾のいずれかである。
特定の実施形態では、細胞が閾値細胞計数を達成すると、培養は終了する。一部の実施形態では、閾値細胞計数が達成された後、６時間時点、１２時間時点、２４時間時点、３６時間時点、１日時点、２日時点、３日時点、４日時点、５日時点、６日時点、もしくは７日以上の時点、約６時間時点、約１２時間時点、約２４時間時点、約３６時間時点、約１日時点、約２日時点、約３日時点、約４日時点、約５日時点、約６日時点、もしくは約７日以上の時点、または６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、３６時間以内、１日以内、２日以内、３日以内、４日以内、５日以内、６日以内、もしくは７日以上以内で培養は終了する。特定の実施形態では、閾値細胞計数が達成された後、１日または約１日時点で培養は終了される。ある特定の実施形態では、閾値密度は、０．１×１０６細胞／ｍｌ、０．５×１０６細胞／ｍｌ、１×１０６細胞／ｍｌ、１．２×１０６細胞／ｍｌ、１．５×１０６細胞／ｍｌ、１．６×１０６細胞／ｍｌ、１．８×１０６細胞／ｍｌ、２．０×１０６細胞／ｍｌ、２．５×１０６細胞／ｍｌ、３．０×１０６細胞／ｍｌ、３．５×１０６細胞／ｍｌ、４．０×１０６細胞／ｍｌ、４．５×１０６細胞／ｍｌ、５．０×１０６細胞／ｍｌ、６×１０６細胞／ｍｌ、８×１０６細胞／ｍｌ、もしくは１０×１０６細胞／ｍｌである、約０．１×１０６細胞／ｍｌ、約０．５×１０６細胞／ｍｌ、約１×１０６細胞／ｍｌ、約１．２×１０６細胞／ｍｌ、約１．５×１０６細胞／ｍｌ、約１．６×１０６細胞／ｍｌ、約１．８×１０６細胞／ｍｌ、約２．０×１０６細胞／ｍｌ、約２．５×１０６細胞／ｍｌ、約３．０×１０６細胞／ｍｌ、約３．５×１０６細胞／ｍｌ、約４．０×１０６細胞／ｍｌ、約４．５×１０６細胞／ｍｌ、約５．０×１０６細胞／ｍｌ、約６×１０６細胞／ｍｌ、約８×１０６細胞／ｍｌ、もしくは約１０×１０６細胞／ｍｌである、または少なくとも０．１×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも０．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．２×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．６×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１．８×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも２．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも２．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも３．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも３．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも４．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも４．５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも５．０×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０６細胞／ｍｌ、もしくは少なくとも１０×１０６細胞／ｍｌであるか、または生細胞の前述の閾値のいずれかである。特定の実施形態では、細胞が閾値密度を達成すると、培養は終了する。一部の実施形態では、閾値密度が達成された後、６時間時点、１２時間時点、２４時間時点、３６時間時点、１日時点、２日時点、３日時点、４日時点、５日時点、６日時点、もしくは７日以上の時点、約６時間時点、約１２時間時点、約２４時間時点、約３６時間時点、約１日時点、約２日時点、約３日時点、約４日時点、約５日時点、約６日時点、もしくは約７日以上の時点、または６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、３６時間以内、１日以内、２日以内、３日以内、４日以内、５日以内、６日以内、もしくは７日以上以内で培養は終了する。特定の実施形態では、閾値密度が達成された後、１日または約１日時点で培養は終了される。
一部の実施形態では、培養の少なくとも一部は、静的条件下において行われる。一部の実施形態では、培養の少なくとも一部は、灌流、例えば、培養の際に使用済み培地を流出させ、ならびに新鮮な培地を流入させること、によって行われる。一部の実施形態では、方法は、例えば、供給ポートなどを介して、細胞培養に新鮮な培養培地を流入させる工程を含む。一部の実施形態では、灌流の際に添加される培養培地は、１種または複数種の刺激剤、例えば、１種または複数種の組換えサイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－１５など、を含有する。一部の実施形態では、灌流の際に添加される培養培地は、静的インキュベーションの際に使用されるのと同じ培養培地である。
一部の実施形態では、インキュベーションの後に、容器、例えば、バッグなど、は、細胞療法を製造する、生成する、または生産するための１つまたは複数の他の処理工程を実施するために、システム、例えば、遠心分離チャンバーを含むシステム、に再接続される。一部の態様では、培養された細胞は、培養された細胞の製剤化のために、バッグからチャンバーの内部空洞へと移される。
一部の実施形態では、細胞は、インキュベーション工程の間、例えば、拡大増殖（例えば、培養）または最小限の拡大増殖／非拡大増殖（例えば、インキュベーション）下において、モニターされる。モニタリングは、例えば、細胞形態、細胞表現型、細胞生存能、細胞死、および／または細胞濃度（例えば、生細胞濃度）を確かめる（例えば、測定する、定量化する）ために行われ得る。一部の実施形態では、モニタリングは、人間のオペレーターなどによって手動で行われる。一部の実施形態では、モニタリングは、自動化システムによって行われる。自動化システムは、培養細胞をモニタリングするために最小限の手動入力を必要としてもよく、または手動入力を必要としなくてもよい。一部の実施形態では、モニタリングは、手動および自動化システムの両方によって行われる。
Ｆ．細胞の収穫および収集
一部の実施形態では、細胞は、収穫および収集される。特定の実施形態において、細胞は、節Ｉ－Ｅに記載されるように、インキュベーションの完了後に、収集および収穫される。ある特定の実施形態において、収集または収穫された細胞は、アウトプット集団の細胞である。一部の実施形態では、アウトプット集団は、生存可能な細胞、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、および／または組換え受容体、例えば、ＣＡＲ＋、に対して陽性な細胞を含む。特定の実施形態において、収穫されたＣＤ４＋Ｔ細胞および製剤化されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、アウトプットＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞である。特定の実施形態において、製剤化された細胞集団、例えば、製剤化された、濃縮されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の集団は、アウトプット細胞集団、例えば、濃縮されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞のアウトプット集団である。
一部の実施形態では、収穫、収集、または製剤化される細胞または細胞集団は、任意の拡大増殖、例えば、細胞が、インキュベーションまたは培養の間の生存細胞の量を増加させる条件下においてインキュベートされるかまたは培養されるような任意の条件、を受けていない。例えば、一部の態様では、収穫された細胞は、総生存細胞の量が、インキュベーションまたは培養の開始時における総生存細胞の数と比較して、インキュベーションまたは培養の終了時に増加されるような、任意のインキュベーションまたは培養を受けていない。一部の実施形態では、収集、収穫、または製剤化された細胞は、バイオリアクターにおいて、あるいは、インキュベーションまたは培養の全てまたは一部において細胞が揺動、振盪、または灌流される条件下において実施されたインキュベーションまたは培養を以前に受けていない。
一部の実施形態では、細胞の選択、単離、分離、濃縮、および／または精製工程は、細胞または細胞集団が収穫、収集、または製剤化される前に実施される。一部の実施形態では、細胞の選択、単離、分離、濃縮、および／または精製工程は、本明細書において開示されるクロマトグラフィーを使用して実施される。一部の実施形態では、クロマトグラフィーによるＴ細胞選択工程は、Ｔ細胞の形質導入の後だが、細胞を収穫する前、収集する前、および／または製剤化する前に実施される。一部の実施形態では、クロマトグラフィーによるＴ細胞選択工程は、細胞を収穫する直前に実施される。
ある特定の実施形態において、刺激（オンカラム刺激の開始から細胞を収集、収穫、または製剤化するまでの時間は、２４時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間、または１２０時間、あるいは約２４時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間、または１２０時間、あるいは２４時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１０８時間、または１２０時間未満である。一部の実施形態では、刺激の開始から操作された細胞を生成するために細胞を収集、収穫、または製剤化するまでの時間、刺激の開始から細胞を収集、収穫、または製剤化するまでの時間は、１２時間～２４時間、３６時間～１２０時間、４８時間～９６時間、または４８時間～７２時間、あるいは約１２時間～２４時間、３６時間～１２０時間、４８時間～９６時間、または４８時間～７２時間である。特定の実施形態において、インキュベーションの開始から細胞を収穫、収集、または製剤化するまでの時間は、４８時間、７２時間、または９６時間、あるいは約４８時間、７２時間、または９６時間、あるいは４８時間、７２時間、または９６時間未満である。特定の実施形態において、インキュベーションの開始から細胞を収穫、収集、または製剤化するまでの時間は、４８時間±６時間、７２時間±６時間、または９６時間±６時間である。
ある特定の実施形態において、濃縮されたＴ細胞の１つまたは複数の集団は、製剤化される。特定の実施形態において、濃縮されたＴ細胞の１つまたは複数の集団は、１つまたは複数の集団が操作および／または培養された後に製剤化される。特定の実施形態において、１つまたは複数の集団は、インプット集団またはアウトプット組成物である。一部の実施形態では、１つまたは複数のインプット集団またはアウトプット組成物は、以前に凍結防止されて貯蔵されており、ならびに、インキュベーション（例えば、節Ｉ－Ｅに記載されるインキュベーション）の前に解凍される。
ある特定の実施形態において、細胞は、１、２、３、４、５、６、８、１０、２０、またはそれ以上、あるいは約１、２、３、４、５、６、８、１０、２０、またはそれ以上、あるいは少なくとも１、２、３、４、５、６、８、１０、２０、またはそれ以上の細胞集団の細胞倍増、例えば、インキュベーションの際に生じる倍増、の前に収穫される。
特定の実施形態において、細胞は、細胞の総数、例えば、インキュベートされた細胞またはインキュベーション（例えば、節Ｉ－Ｅに記載されるインキュベーション）を受けている細胞の総数が、インプット集団の細胞の数、例えば、刺激試薬と接触した細胞の総数、の１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、１０倍、２０倍、または２０倍以上、あるいは約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、１０倍、２０倍、または２０倍以上になる前のタイミングで収穫および収集される。一部の実施形態では、細胞は、インキュベートされた細胞の総数が、形質転換、形質導入、またはスピノキュレートされた細胞の総数、例えば、ウイルスベクターと接触した細胞の総数、の１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、１０倍、２０倍、または２０倍以上、あるいは約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、１０倍、２０倍、または２０倍以上になる前のタイミングで収穫および収集される。ある特定の実施形態において、細胞は、Ｔ細胞、生存Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＡＲ発現性Ｔ細胞、または上記のいずれの組合せである。特定の実施形態において、細胞は、細胞の総数がインプット集団の細胞の総数より多くなる前のタイミングで収穫および収集される。様々な実施形態において、細胞は、生存ＣＤ３＋Ｔ細胞の総数がインプット集団の生存ＣＤ３＋細胞の総数より多くなる前のタイミングで収穫および収集される。特定の実施形態において、細胞は、細胞の総数が形質転換、形質導入、またはスピノキュレートされた細胞の細胞の総数より多くなる前のタイミングで収穫および収集される。様々な実施形態において、細胞は、生存ＣＤ３＋Ｔ細胞の総数が形質転換、形質導入、またはスピノキュレートされた細胞の生存ＣＤ３＋の総数より多くなる前のタイミングで収穫および収集される。
ある特定の実施形態において、製剤化された細胞は、アウトプット細胞である。一部の実施形態では、製剤化された、濃縮されたＴ細胞の集団は、濃縮されたＴ細胞のアウトプット集団である。特定の実施形態において、製剤化されたＣＤ４＋Ｔ細胞および製剤化されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、アウトプットＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞である。特定の実施形態において、製剤化された細胞集団、例えば、製剤化された、濃縮されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の集団は、アウトプット集団、例えば、濃縮されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞のアウトプット集団である。
一部の実施形態では、細胞は、容器内、例えば、バッグまたはバイアル内など、へと製剤化することができる。
一部の実施形態では、細胞は、一部の態様では、薬学的に許容される担体または賦形剤を含み得る薬学的に許容される緩衝液で製剤化される。一部の実施形態では、処理は、対象への投与のために薬学的に許容されるかまたは望ましい培地または製剤緩衝液への培地の交換を含む。一部の実施形態では、処理工程は、形質導入および／または拡大された細胞を洗浄して、１つまたは複数の適宜の薬学的に許容される担体または賦形剤を含み得る薬学的に許容される緩衝液中の細胞を交換することを含み得る。薬学的に許容される担体または賦形剤を含むそのような薬学的形態の例は、細胞および組成物を対象に投与するのに許容される形態と併せて以下に記載されるいずれかであり得る。医薬組成物は一部の実施形態では、疾患または状態を処置または予防するのに有効な量、例えば、治療有効量または予防有効量で細胞を含有する。
「薬学的に許容される担体」は、対象に対して無毒である、有効成分以外の、医薬製剤中の成分を意味する。薬学的に許容される担体としては、これらに限定されるわけではないが、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、または保存料が挙げられる。
一部の態様では、担体の選択は、一部には特定の細胞および／または投与の方法によって決定される。したがって、様々な適切な製剤がある。例えば、医薬組成物は保存料を含んでもよい。適切な保存料には、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、および塩化ベンザルコニウムが挙げられ得る。一部の態様では、２つまたはそれより多い保存料の混合物が使用される。保存料またはその混合物は、典型的には、組成物全体の約０．０００１重量％～約２重量％の量で存在する。担体は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に記載されている。薬学的に許容される担体は、一般に、使用される投与量および濃度ではレシピエントにとって非毒性であり、以下が挙げられるが、これらに限定されない：リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ならびに／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤。
一部の態様では緩衝剤が組成物に含まれる。適切な緩衝剤には、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、および様々な他の酸および塩が挙げられる。一部の態様では、２つまたはそれより多い緩衝剤の混合物が使用される。緩衝剤またはその混合物は、典型的には組成物全体の約０．００１％～約４重量％の量で存在する。投与可能な医薬組成物を調製する方法は公知である。例示的な方法は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)により詳細に記載されている。
製剤は、水溶液を含み得る。製剤または組成物は、細胞によって治療される特定の適応症、疾患、または状態にとって有用な２種以上の有効成分、好ましくは細胞に対して相補的な活性を有するもの、も含み得、この場合、それぞれの活性は、お互いに悪影響を及ぼさない。そのような有効成分は、意図される目的に対して有効な量において、一緒に好適に存在する。したがって、一部の実施形態では、医薬組成物は、他の薬学的に活性な薬剤または薬物、例えば、化学療法薬、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、および／またはビンクリスチンなど、をさらに含む。
一部の実施形態における組成物は、無菌液体調製物、例えば、等張水溶液、懸濁液、エマルジョン、分散液、または粘性組成物として提供され、該調製物は、一部の態様では選択されたｐＨに緩衝され得る。液体組成物は担体を含むことができ、担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であってもよい。無菌注射用溶液は、無菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロース等などの適切な担体、希釈液、または賦形剤との混合物などの溶媒に、細胞を組み込むことによって調製することができる組成物は、所望の投与経路および調製物に応じて、湿潤剤、分散剤、もしくは乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化もしくは粘性増強添加物、保存料、香味剤、および／または着色料などの補助物質を含有することができる。一部の態様では、適切な調製物を調製するのに標準的なテキストが調べられてもよい。
抗菌保存料、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝液を含む、組成物の安定性および無菌性を増強する様々な添加物が添加され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、およびソルビン酸によって確保することができる。注射可能な薬学的形態の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。
一部の実施形態では、製剤緩衝液は凍結保存料を含有する。一部の実施形態では、細胞は、１．０％～３０％ＤＭＳＯ溶液、例えば５％～２０％ＤＭＳＯ溶液または５％～１０％ＤＭＳＯ溶液を含有する凍結保存料溶液を用いて製剤化される。一部の実施形態では、凍結保存溶液は、例えば、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有するＰＢＳ、または他の適切な細胞凍結培地であるか、またはこれを含有する。一部の実施形態では、凍結保存料溶液は、例えば、少なくともまたは約７．５％ＤＭＳＯであるか、またはこれを含有する。一部の実施形態では、処理工程は、形質導入および／または拡大された細胞を洗浄して、凍結保存料溶液中の細胞を交換することを含み得る。一部の実施形態では、細胞は、１２．５％、１２．０％、１１．５％、１１．０％、１０．５％、１０．０％、９．５％、９．０％、８．５％、８．０％、７．５％、７．０％、６．５％、６．０％、５．５％、もしくは５．０％ＤＭＳＯ、または約１２．５％、約１２．０％、約１１．５％、約１１．０％、約１０．５％、約１０．０％、約９．５％、約９．０％、約８．５％、約８．０％、約７．５％、約７．０％、約６．５％、約６．０％、約５．５％、もしくは約５．０％ＤＭＳＯ、または１％～１５％、６％～１２％、５％～１０％、もしくは６％～８％ＤＭＳＯの最終濃度を含む培地および／または溶液に凍結され、例えば、凍結保護または凍結保存される。特定の実施形態では、細胞は、５．０％、４．５％、４．０％、３．５％、３．０％、２．５％、２．０％、１．５％、１．２５％、１．０％、０．７５％、０．５％、もしくは０．２５％ＨＳＡ、または約５．０％、約４．５％、約４．０％、約３．５％、約３．０％、約２．５％、約２．０％、約１．５％、約１．２５％、約１．０％、約０．７５％、約０．５％、もしくは約０．２５％ＨＳＡ、または０．１％～－５％、０．２５％～４％、０．５％～２％、もしくは１％～２％ＨＳＡの最終濃度を含む培地および／または溶液に凍結され、例えば、凍結保護または凍結保存される。
特定の実施形態では、濃縮Ｔ細胞、例えば、刺激され、操作され、および／または培養されたＴ細胞の組成物は、製剤化され、凍結保護され、次いで一定量の時間保管される。ある特定の実施形態では、製剤化され、凍結保護された細胞は、注入のために細胞が放出されるまで保管される。特定の実施形態では、製剤化された凍結保護細胞は、１日～６カ月間、１カ月～３カ月間、１日～１４日間、１日～７日間、３日～６日間、６カ月～１２カ月間、または１２カ月より長く保管される。一部の実施形態では、細胞は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、もしくは７日間、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、もしくは約７日間、または１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、もしくは７日間、または１日未満、２日未満、３日未満、４日未満、５日未満、６日未満、もしくは７日未満にわたって凍結保護され、保管される。ある特定の実施形態では、細胞は、保管後に解凍され、対象に投与される。ある特定の実施形態では、細胞は、５日間または約５日間保管される。
一部の実施形態では、製剤は、細胞、例えば、培養または拡大増殖された細胞など、を洗浄すること、希釈すること、または濃縮することを含む、１つまたは複数の処理工程を使用して行われる。一部の実施形態では、処理工程は、所望の濃度または数値への細胞の希釈物または濃縮物、例えば、所定の用量またはその一部での投与のための細胞数を含む単位用量形態の組成物など、を含み得る。一部の実施形態では、処理工程は、所望に応じて細胞の濃度を増加させるための減量を含み得る。一部の実施形態では、処理工程は、所望に応じて細胞の濃度を減少させるための増量を含み得る。一部の実施形態では、処理は、ある量の製剤緩衝液を形質導入および／または拡大増殖された細胞に添加することを含む。一部の実施形態では、製剤緩衝液の量は、１０ｍＬ～１０００ｍＬまたは約１０ｍＬ～１０００ｍＬ、例えば、少なくとも５０ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ、３００ｍＬ、４００ｍＬ、５００ｍＬ、６００ｍＬ、７００ｍＬ、８００ｍＬ、９００ｍＬ、または１０００ｍＬ、あるいは少なくとも約５０ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ、３００ｍＬ、４００ｍＬ、５００ｍＬ、６００ｍＬ、７００ｍＬ、８００ｍＬ、９００ｍＬ、または１０００ｍＬ、あるいは約５０ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ、３００ｍＬ、４００ｍＬ、５００ｍＬ、６００ｍＬ、７００ｍＬ、８００ｍＬ、９００ｍＬ、または１０００ｍＬ、など、である。
一部の実施形態では、細胞組成物を製剤化するためのそのような処理工程は、閉鎖されたシステムにおいて行われる。そのような処理工程の例は、細胞処理システムに関連する１つまたは複数のシステムまたはキットと連動する遠心分離チャンバー、例えば、Ｓｅｐａｘ（登録商標）またはＳｅｐａｘ ２（登録商標）細胞処理システムと共に使用するためのものを含む、Ｂｉｏｓａｆｅ ＳＡによって製造および販売される遠心分離チャンバーなど、を使用して実施することができる。例示的システムおよびプロセスは、国際公開第２０１６／０７３６０２号に記載されている。一部の実施形態では、方法は、説明されるような上記の実施形態のいずれかにおいて、製剤化緩衝液、例えば、薬学的に許容される緩衝液など、において製剤化された細胞の組成物である、製剤化された組成物の発現を遠心分離チャンバーの内部空洞で生じさせることを含む。一部の実施形態では、製剤化された組成物の発現は、容器、例えば、閉鎖されたシステムの一部として遠心分離チャンバーと作動可能に連結されたバッグなど、においてである。一部の実施形態では、バッグなどの容器は、アウトプットラインまたはアウトプット位置においてシステムに接続される。
一部の実施形態では、例えば、遠心分離チャンバーまたは細胞処理システムに関連するような、閉鎖されたシステムは、製剤化された組成物の発現のために１つまたは複数の容器を接続することができるポートを備えるチューブの各末端部に関連付けられた多方向多岐管を収容するマルチポートアウトプットキットを含む。一部の態様では、所望の数または複数のアウトプット容器、例えば、バッグ、は、マルチポートアウトプットの１つまたは複数、概して２つ以上、例えば、少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、またはそれ以上のポートに無菌接続される。例えば、一部の実施形態では、１つまたは複数の容器、例えば、バッグなどは、ポートに、または全てより少ない数のポートに取り付けることができる。したがって、一部の実施形態では、システムは、複数のアウトプットバッグにおいてアウトプット組成物の発現を生じさせることができる。
一部の態様では、細胞は、投薬量投与のための、例えば、単一単位投薬量投与または複数投薬量投与など、のための量において、複数のアウトプットバッグのうちの１つまたは複数において発現させることができる。例えば、一部の実施形態では、アウトプットバッグは、それぞれが、所定の用量またはその一部の投与のための細胞数を含み得る。したがって、各バッグは、一部の態様では、投与のための単一単位用量を含み得るか、あるいは、複数のアウトプットバッグのうちの２つ以上、例えば、アウトプットバッグのうちの２つ、またはアウトプットバッグのうちの３つなど、が一緒に投与のための用量を構成するような所望の量の一部を含み得る。
したがって、容器、例えば、アウトプットバッグは、概して、投与される細胞、例えば、その１回または複数回の単位用量を含有する。単位用量は、対象に投与される細胞の量もしくは数、または投与される細胞の２倍（またはそれ以上）の数であってもよい。単位用量は、対象に投与されることになる細胞の最低用量または最も低い可能性のある用量であってもよい。
一部の実施形態では、容器、例えばバッグの各々は、個々に単位用量の細胞を含む。故に、一部の実施形態では、各容器は、同じ、またはほぼ同じ、または実質的に同じ数の細胞を含む。一部の実施形態では、各単位用量は、少なくともまたは約少なくとも１×１０６、２×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、または１×１０８個の操作された細胞、全細胞、Ｔ細胞、またはＰＢＭＣを含む。一部の実施形態では、各バッグ中の製剤化された細胞組成物の体積は、１０ｍＬ～１００ｍＬ、例えば、少なくともまたは約少なくとも２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、６０ｍＬ、７０ｍＬ、８０ｍＬ、９０ｍＬまたは１００ｍＬである。
一部の実施形態では、方法によって作製されたそのような細胞、またはそのような細胞を含む組成物は、疾患または状態を治療するために対象に投与される。
Ｇ．刺激試薬の除去
一部の実施形態では、刺激試薬（例えば、オリゴマー性刺激試薬）は、細胞を収集、収穫、または製剤化した後で、収集された細胞または細胞集団から除去されるかまたは分離される。一部の実施形態では、刺激試薬は、クロマトグラフィーカラムからの収集の後、例えば、節Ｉ－Ｄに記載される溶出および細胞収集の工程の後に、細胞または細胞集団から除去されるかまたは分離される。一部の実施形態では、刺激試薬は、インキュベーション、例えば、節Ｉ－Ｅなどに記載されるインキュベーションの後またはその際に、細胞または細胞集団から除去されるかまたは分離される。ある特定の実施形態において、細胞または細胞集団は、インキュベーションの後だが細胞を収集、収穫、または製剤化する工程の前に、刺激試薬（例えば、オリゴマー性刺激試薬）を除去するための、プロセス、手順、工程、または技術を受ける。特定の実施形態において、細胞または細胞集団は、インキュベーションの後に、刺激試薬（例えば、オリゴマー性刺激試薬）を除去するための、プロセス、手順、工程、または技術を受ける。一部の態様では、刺激試薬（例えば、オリゴマー性刺激試薬）が、インキュベーションの際に、細胞から分離または除去される場合、細胞は、インキュベーションの残り時間の間に分離または除去の前と同じインキュベーション条件に戻される。
ある特定の実施形態において、刺激試薬（例えば、オリゴマー性刺激試薬）は、細胞から除去および／または分離される。理論に束縛されることを望むわけではないが、特定の実施形態は、刺激試薬（例えば、オリゴマー性刺激試薬）と細胞との間の結合および／または会合は、いくつかの状況において、インキュベーションの間に時間と共に減少し得る。ある特定の実施形態において、１種または複数種の薬剤が、刺激試薬と細胞との間の結合および／または会合を減少させるために添加され得る。特定の実施形態において、細胞培養条件における変化、例えば、薬剤（例えば、競合剤または遊離結合剤などの物質）の添加は、刺激試薬と細胞との間の結合および／または会合を減少させ得る。したがって、一部の実施形態では、刺激試薬（例えば、オリゴマー性刺激試薬）は、細胞とは別々に、例えば、インキュベーション、細胞培養システム、および／または溶液から細胞を除去することなく、インキュベーション、細胞培養システム、および／または溶液から除去され得る。
ある特定の実施形態において、刺激試薬（例えば、オリゴマー性刺激試薬）は、ある期間の後に、細胞から分離または除去される。特定の実施形態において、この期間は、刺激の開始からの期間である。特定の実施形態において、インキュベーションの開始は、細胞が刺激試薬ならびに／あるいは刺激試薬を含有する培地または溶液を接触するタイミングまたはおよそそのタイミングと見なされる。特定の実施形態において、刺激試薬は、刺激の開始の１２０時間、１０８時間、９６時間、８４時間、７２時間、６０時間、４８時間、３６時間、２４時間、１２時間、６、時間、５時間、４時間、３時間、または２時間以内、あるいは約１２０時間、１０８時間、９６時間、８４時間、７２時間、６０時間、４８時間、３６時間、２４時間、１２時間、６、時間、５時間、４時間、３時間、または２時間以内（境界値を含む）に、細胞から除去または分離される。特定の実施形態において、刺激試薬（例えば、オリゴマー性刺激試薬）は、刺激が開始されてから４８時間後または約４８時間後に、細胞から除去または分離される。ある特定の実施形態において、刺激試薬は、刺激が開始されてから７２時間後または約７２時間後に、細胞から除去または分離される。一部の実施形態では、刺激試薬は、刺激が開始されてから９６時間後または約９６時間後に、細胞から除去または分離される。
１．オリゴマー性試薬の除去
一部の実施形態では、本明細書において提供される方法のいずれかに従って製造または生成された、刺激され形質導入された細胞（すなわち、本明細書において説明されるカラムクロマトグラフィーおよびオンカラム刺激および形質導入による選択を受けている細胞）の集団は、オリゴマー性刺激試薬を除去するため、および／または、細胞においてシグナルを送達する、オリゴマー性刺激試薬の能力を減じるために処理される。例えば、１種または複数種の薬剤のストレプトアビジン－結合ペプチドを介して試薬に結合する１種または複数種の刺激剤の、試薬のＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎムテインに対する可逆性は、相互作用を崩壊させるための競合剤または遊離結合パートナーの使用によって行うことができる。結果として、試薬上において多量体化されている１つまたは複数の刺激剤は、試薬の骨格から放出され、刺激シグナルを送達するそれらの能力は減じられるかまたは失われる。
ある特定の実施形態において、１つまたは複数の刺激剤（例えば、ＴＣＲおよび／または共刺激分子を刺激または活性化する薬剤）は、例えば、オリゴマー性試薬上に存在する複数の特定の結合部位（例えば、結合部位Ｚ）などを介して、オリゴマー性試薬と会合する、例えば、可逆的に結合する。一部の場合には、これは、結果として、刺激剤によって結合されるかまたは認識される細胞表面分子（の少なくとも２つのコピー）を有する標的細胞が、薬剤と接触する場合に、アビディティが生じることができるように、お互いに密接して配置された刺激剤を生じる。一部の態様では、刺激剤は、受容体結合試薬が競合試薬の存在下で細胞から脱離するように、結合部位Ｂにおける細胞に対して低い親和性を有する。したがって、一部の実施形態では、刺激剤は、競合試薬の存在下で細胞から除去される。
一部の実施形態では、オリゴマー性刺激試薬は、可逆的に結合した抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ Ｆａｂを有するストレプトアビジンムテインオリゴマーである。一部の実施形態では、結合したＦａｂは、例えば、ストレプトアビジンムテインオリゴマーへの可逆的な取付を可能にする、ストレプトアビジン結合ドメインを含む。一部の場合には、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ Ｆａｂは、ＣＤおよび／またはＣＤ２８を発現するＴ細胞が、可逆的に取り付けられたＦａｂを有するオリゴマー性刺激試薬と接触する場合にアビディティ効果が生じ得るように、お互いに密接して配置される。一部の態様では、Ｆａｂは、Ｆａｂが競合試薬、例えば、ビオチンまたはビオチンのバリアントもしくはアナログの存在下において細胞から解離するような、ＣＤ３およびＣＤ２８に対する低い親和性を有する。したがって、一部の実施形態では、Ｆａｂは、競合試薬、例えば、Ｄ－ビオチンの存在下において細胞から除去されるかまたは解離する。
一部の実施形態では、例えば、刺激剤のシグナル伝達を減少および／または終了させるために、刺激され形質導入された細胞（すなわち、本明細書において説明されるカラムクロマトグラフィーおよびオンカラム刺激および形質導入による選択を受けている細胞）の集団に、物質、例えば、競合剤または遊離結合剤が提供されるかまたは添加される。一部の実施形態では、競合剤または遊離結合剤の添加は、本明細書において説明される（節Ｉ－Ｄを参照されたい）溶出工程の後に行われる。一部の実施形態では、競合剤または遊離結合剤の添加は、本明細書において説明される遺伝子操作工程の後に行われる。一部の実施形態では、競合剤または遊離結合剤の添加は、本明細書において説明される収穫工程の後に行われる。
したがって、一部の実施形態では、刺激された細胞の集団は、物質、例えば、競合剤など、例えば、ビオチン、例えば、Ｄ－ビオチン、またはビオチンアナログ、の存在を含む。一部の実施形態では、物質、例えば、競合剤など、例えば、ビオチン、例えば、Ｄ－ビオチン、またはビオチンアナログ、は、物質が前述の工程の１つの間に外因的に添加されていない、培養された細胞（例えば、Ｔ細胞）の参照集団または調製物中の物質の量の少なくとも１．５倍以上、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、またはそれ以上の量において存在する。一部の実施形態では、刺激された細胞の集団中の、物質、例えば、競合剤など、例えば、ビオチン、例えば、Ｄ－ビオチン、またはビオチンアナログ、の量は、１０μΜ～１００μΜ、１００μΜ～１ｍＭ、１００μΜ～５００μΜ、または１０μΜ～１００μΜ、あるいは約１０μΜ～１００μΜ、１００μΜ～１ｍＭ、１００μΜ～５００μΜ、または１０μΜ～１００μΜである。一部の実施形態では、細胞または細胞集団からオリゴマー性刺激試薬を分離または除去するために、１０μΜまたは約１０μΜのビオチン、例えば、Ｄ－ビオチン、またはビオチンアナログが、細胞または細胞集団に添加される。
一部の実施形態では、オリゴマー性刺激試薬、例えば、オリゴマー性刺激ストレプトアビジンムテイン試薬、は、細胞を収穫する前または製剤化する前に細胞または細胞集団から除去されるかまたは分離される。一部の実施形態では、オリゴマー性刺激試薬、例えば、オリゴマー性刺激ストレプトアビジンムテイン試薬、は、インキュベーション、例えば、節Ｉ－Ｅなど、本明細書において説明されるインキュベーション、の後または間に、競合試薬、例えば、ビオチンまたはビオチンアナログへの接触または曝露によって、細胞または細胞集団から除去されるかまたは分離される。ある特定の実施形態において、細胞または細胞集団は、インキュベーションの後だが細胞を遺伝子操作、収穫、または製剤化する工程の前に、オリゴマー性刺激試薬、例えば、刺激オリゴマー性ストレプトアビジンムテイン試薬、を除去するために、競合試薬、例えば、ビオチン、例えば、Ｄ－ビオチンまたはビオチンアナログなど、に接触または曝露される。特定の実施形態において、細胞または細胞集団は、インキュベーションの後に、オリゴマー性刺激試薬、例えば、オリゴマー性刺激ストレプトアビジンムテイン試薬、を除去するために、競合試薬、例えば、ビオチン、例えば、Ｄ－ビオチンまたはビオチンアナログなど、に接触または曝露される。一部の態様では、オリゴマー性刺激試薬、例えば、オリゴマー性刺激ストレプトアビジンムテイン試薬、が、インキュベーションの際に、例えば、競合試薬、例えば、ビオチン、例えば、Ｄ－ビオチンまたはビオチンアナログなど、への接触または曝露によって、細胞から分離または除去される場合、細胞は、インキュベーションの残り時間の間に、分離または除去の前と同じインキュベーション条件に戻される。
一部の実施形態では、細胞は、細胞からオリゴマー性刺激試薬を除去または分離するために、０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、１０μＭ、１００μＭ、５００μＭ、０．０１μＭ、１ｍＭ、または１０ｍＭ、あるいは約０．０１μＭ、約０．０５μＭ、約０．１μＭ、約０．５μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約１０μＭ、約１００μＭ、約５００μＭ、約０．０１μＭ、約１ｍＭ、または約１０ｍＭ、あるいは少なくとも０．０１μＭ、少なくとも０．０５μＭ、少なくとも０．１μＭ、少なくとも０．５μＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも２μＭ、少なくとも３μＭ、少なくとも４μＭ、少なくとも５μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも５００μＭ、少なくとも０．０１μＭ、少なくとも１ｍＭ、または少なくとも１０ｍＭの、競合試薬と接触させられる。様々な実施形態において、細胞は、可逆的に取り付けられた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ Ｆａｂを有する刺激ストレプトアビジンムテインオリゴマーを細胞から除去または分離するために、０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、１０μＭ、１００μＭ、５００μＭ、０．０１μＭ、１ｍＭ、または１０ｍＭ、あるいは約０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、１０μＭ、１００μＭ、５００μＭ、０．０１μＭ、１ｍＭ、または１０ｍＭ、あるいは少なくとも０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、１０μＭ、１００μＭ、５００μＭ、０．０１μＭ、１ｍＭ、または１０ｍＭのビオチンまたはビオチンアナログ、例えば、Ｄ－ビオチンなど、と接触させられる。
特定の実施形態において、オリゴマー性刺激試薬、例えば、オリゴマー性刺激ストレプトアビジンムテイン試薬、は、刺激の開始の１２０時間、１０８時間、９６時間、８４時間、７２時間、６０時間、４８時間、３６時間、２４時間、または１２時間以内、あるいは約１２０時間、約１０８時間、約９６時間、約８４時間、約７２時間、約６０時間、約４８時間、約３６時間、約２４時間、または１２時間以内（境界値を含む）に、細胞から除去または分離される。特定の実施形態において、オリゴマー性刺激試薬、例えば、オリゴマー性刺激ストレプトアビジンムテイン試薬、刺激が開始された後、４８時間または約４８時間において、細胞から除去または分離される。ある特定の実施形態において、オリゴマー性刺激試薬、例えば、オリゴマー性刺激ストレプトアビジンムテイン試薬、刺激が開始されてから７２時間後または約７２時間後に、細胞から除去または分離される。一部の実施形態では、オリゴマー性刺激試薬、例えば、オリゴマー性刺激ストレプトアビジンムテイン試薬、刺激が開始されてから９６時間後または約９６時間後に、細胞から除去または分離される。
一部の実施形態では、細胞は、細胞組成物から、１つまたは複数の刺激剤（例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ Ｆａｂ）、試薬（例えば、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎムテイン）、および／または競合剤を除去または希釈するために、例えば、培地によって洗浄することができる。
Ｈ．連続選択およびポリシング
本明細書において提供される方法は、標的細胞集団（例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞など）を単離および／または濃縮するための、例えば、カラムクロマトグラフィーによる、複数の選択工程を可能にする。一部の実施形態では、１つまたは複数の選択工程は、アウトプット治療細胞組成物を作り出すためのプロセス、例えば、上記の節に記載されるプロセス、の１つまたは複数の時点、あるいはそのプロセスのある特定の工程の後に実施される。一部の実施形態では、例えば節Ｉ－Ｃに記載される初期細胞選択の後に行われる選択工程は、ポリシング（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）工程と呼ばれる。ポリシング工程は、様々な目的のため、例えば、これらに限定されるわけではないが、細胞組成物のさらなる精製、特定の細胞サブタイプ（例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、および／またはＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞）の選択、死細胞の除去（例えば、生存細胞の選択）、操作に成功した細胞（例えば、導入遺伝子（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）など）を発現する細胞）の選択など、あるいは、特定の細胞タイプの比率、総数、または濃度（例えば、ＣＤ４＋とＣＤ８＋細胞、ＣＡＲ＋またはＴＣＲ＋細胞とＣＡＲ－またはＴＣＲ－細胞の比率、あるいは、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＡＲ＋、ＴＣＲ＋、および／または生存細胞の総数または濃度）を調節するために、好ましくあり得る。一部の実施形態では、選択工程（例えば、ポリシング工程）は、製造制御を増加させるため、および／または患者間での変動を減少させるために有用である。
一部の実施形態では、選択工程（例えば、初期選択工程および／またはポリシング工程）は、例えば、細胞組成物のさらなる精製、特定の細胞サブタイプの選択、生存細胞の選択、操作された細胞の選択、ならびに／あるいは細胞の比率、総数、または濃度の調節のための複数の選択工程を含む。
本明細書において提供される方法は、標的細胞集団（例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞など）を単離および／または濃縮するために、例えば、カラムクロマトグラフィーによる、複数の選択工程（例えば、初期選択および／またはポリシング工程）を可能にする。一部の態様では、そのような方法は、本明細書において提供されるような、試料からの複数の異なる細胞集団が濃縮または単離される連続選択を採用することにより、例えば、閉鎖されたシステムなどにおける、単一のプロセスストリームによって達成される。一部の態様では、同じ導管または導管のセット、例えば、チューブセットなど、における分離または単離の実施は、連続したポジティブおよびネガティブ選択工程を行うことによって達成され、後続の工程は、前の工程からのネガティブおよび／またはポジティブ画分をさらなる選択へと供し、この場合、プロセス全体は、同じチューブまたはチューブセットにおいて実施される。一実施形態において、標的細胞（例えば、刺激されたおよび／または操作された細胞、例えば、形質導入された細胞など、の組成物）を含む試料は、連続選択に供さ、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋集団のうちの一方を濃縮するに第１の選択が行われ、ならびに、第１の選択で選択されなかった細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋集団の他方を濃縮するための第２の選択のための細胞の供給源として使用される。一部の実施形態では、さらなる選択は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋集団の一方または両方のサブ集団、例えば、中央記憶Ｔ（ＴＣＭ）細胞またはナイーブＴ細胞、の濃縮を達成することができる。一実施形態において、標的細胞（例えば、刺激されたおよび／または操作された細胞、例えば、形質導入された細胞など、の組成物）を含む試料は、第１の選択がＣＤ３＋集団を濃縮する連続選択に供される。一部の実施形態では、さらなる選択は、ＣＤ３＋集団のサブ集団、例えば、ＣＤ４＋細胞の濃縮を達成することができる。一部の実施形態では、さらなる選択は、ＣＤ３＋集団のサブ集団、例えば、ＣＤ８＋細胞の濃縮を達成することができる。一部の実施形態では、Ｔ細胞の特定のサブ集団（例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、例えば、高レベルの１つまたは複数の表面マーカーに対してポジティブな細胞またはそれを発現する細胞、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、および／またはＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞、は、選択工程（例えば、初期選択工程および／またはポリシング工程）の際のポジティブまたはネガティブ選択技術によって選択される。一部の実施形態では、標的細胞を含む細胞集団（例えば、刺激されたおよび／または操作された細胞、例えば、形質導入された細胞など、の組成物）は、ポリシング工程が生存細胞を選択する連続選択に供される。一部の実施形態では、生存細胞を選択することは、細胞集団（例えば、刺激されたおよび／または操作された細胞またはそれらのサブ集団、のアウトプット組成物）から死細胞を除去することを含むかまたはそれらからなる。一部の実施形態では、ポリシング工程は、細胞組成物中の細胞の比率または総数の制御または調節を可能にする。
一部の実施形態では、第１の選択工程は、本明細書において説明される選択剤で標識されたビーズを使用して実施することができ、ならびに第１の選択工程からのポジティブおよびネガティブ画分を保持することができ、その後に、第２の選択マーカーを濃縮するために、例えば、第２の選択剤によって標識されたビーズを使用することによって、またはポジティブ画分を上記において説明されるカラムクロマトグラフィーに供することによって、ポジティブ画分のさらなるポジティブ選択を行うことができる。
本明細書において提供される方法は、さらに、首尾よく刺激され、操作または形質導入された細胞の選択および濃縮を可能にする。例えば、一部の実施形態では、上記において説明される連続選択、並行選択、または単一選択手順は、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ、ＴＣＲ）によって操作された（例えば、形質導入された）細胞を識別または濃縮するために使用され得る。任意の選択剤を含む、操作された細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ操作された細胞）を選択または濃縮するための選択剤は、操作された細胞の代理マーカーまたは組換え受容体に結合することができる。一部の実施形態では、細胞に導入された組換え受容体をコードする核酸が、組換え受容体を有する操作された細胞上において共発現されるであろう代理マーカーを共発現するように、作製される。一部の実施形態では、代理マーカーは、例えば、本明細書において説明されるような、トランケートされた受容体である。特定の実施形態において、トランケートされた受容体は、トランケートされたＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）である。一部の実施形態では、操作された細胞（例えば、ＣＡＲ）を選択または濃縮するための選択剤は、ＣＡＲの抗原結合性ドメインに対する抗イディオタイプの抗体である。様々な抗イディオタイプ抗体が知られている。抗ＣＤ１９結合性ドメイン、例えば、ＦＭＣ６３またはＳＪ２５Ｃ１など、に対する例示的抗イディオタイプの抗体は、国際公開第２０１８／０２３１００号に記載される。一部の実施形態では、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）を発現する細胞は、さらに、サブ集団の細胞、例えば、ＣＤ４＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞、および／または生存細胞、を濃縮（例えば、ポリシング）することができる。一部の実施形態では、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）を発現する細胞は、さらに、ＣＤ５７＋を消耗させる（例えば、ポリシングする）ことができる。一部の実施形態では、選択工程（例えば、初期選択および／またはポリシング工程）は、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ、ＴＣＲ）および／またはそのサブ集団を発現する細胞の比率、濃度、または総数の制御または調節を可能にする。一部の実施形態では、濃縮（例えば、ポリシング）された集団は、細胞療法のための使用（例えば、投与）のために製剤化することができる。
一部の態様では、単一または同じ単離または分離容器または容器のセット、例えば、単一のカラムまたはカラムのセット、ならびに／あるいは同じチューブまたはチューブセットにおいて、複数の集団を単離することあるいは、同じ分離マトリックスまたは培地または試薬、例えば、同じ磁性マトリックス、アフィニティー標識された固体担体、または抗体もしくは他の結合パートナーを使用することは、単離を能率化する特徴、例えば、結果として、コスト、時間、複雑さ、試料の取り扱いの必要性、あるいはリソース、試薬、または設備の使用の減少をもたらす特徴、を含む。一部の態様では、そのような特徴は、それらが方法に関連するコスト、効率、時間、および／または複雑さを最小化し、ならびに／あるいは、細胞産物に対する潜在的な害、例えば、感染、夾雑、および／または温度変化によって引き起こされる害など、を避ける点において有利である。本明細書において提供される方法は、オンカラム刺激と組み合わされた細胞選択の前および後の両方において標的集団を濃縮するための複数の選択工程を可能にする。
本明細書において提供される方法は、さらに、首尾よく刺激および操作された細胞の選択および濃縮を可能にする。例えば、一部の実施形態では、上記において説明された連続選択手順は、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）を発現する刺激された細胞を識別するために使用され得る。一部の実施形態では、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）を発現する細胞は、サブ集団の細胞、例えば、ＣＤ４＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞のために濃縮することができる。一部の実施形態では、濃縮された集団は、細胞療法のための使用（例えば、投与）のために製剤化することができる。
ＩＩ．組換えタンパク質
一部の実施形態では、提供される方法によって処置、処理、操作、および／または製造される細胞は、組換えタンパク質、例えば、組換え受容体、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）など、を含むかまたは発現するか、あるいは含むかまたは発現するように操作される。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、組換えタンパク質を発現または含有するように操作される細胞または、細胞を含有するおよび／もしくは細胞が濃縮された集団もしくは組成物を作製する、および／または作製することができる。
Ａ．組換え受容体
一部の実施形態では、１つまたは複数の組換え受容体を発現する免疫細胞、例えばＴ細胞などの操作された細胞が提供される。受容体の中には、抗原受容体および１つまたは複数のその成分を含有する受容体が含まれる。組換え受容体には、キメラ受容体、例えば、そのリガンド結合ドメインまたは結合性断片および細胞内シグナル伝達ドメインまたは領域を含有するもの、機能性非ＴＣＲ抗原受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば組換えまたはトランスジェニックＴＣＲ、キメラ自己抗体受容体（ＣＡＡＲ）および前述のいずれかのうちの成分が挙げられ得る。ＣＡＲなどの組換え受容体は、一般に、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達成分に連結された細胞外抗原（またはリガンド）結合ドメインを、一部の態様ではリンカーおよび／または膜貫通ドメインを介して含む。一部の実施形態では、操作された細胞は、異なる成分、ドメインまたは領域を含有する２つまたはそれより多い受容体を発現する。一部の態様では、２つまたはそれより多い受容体は、組換え受容体の特異性、活性、抗原（またはリガンド）結合、機能および／または発現を空間的または時間的に調節または制御できる。
１．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
提供される方法の一部の実施形態では、キメラ抗原受容体などのキメラ受容体は、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する特異性をもたらすリガンド結合ドメイン（例えば、抗体または抗体断片）を細胞内シグナル伝達ドメインと結び付ける１つまたは複数のドメインを含有する。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次活性化シグナルをもたらす、Ｔ細胞活性化ドメインなどの活性化細胞内ドメイン部分である。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能を促進する共刺激シグナル伝達ドメインを含有するか、またはさらに含有する。一部の実施形態では、キメラ受容体は免疫細胞の中に遺伝子操作される場合、Ｔ細胞活性をモジュレートすることができ、一部の例では、Ｔ細胞分化または恒常性をモジュレートすることができ、それによって、養子細胞療法方法などで使用するための、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）での寿命、生存および／または持続性が改善された遺伝子操作された細胞をもたらす。
ＣＡＲを含む例示的な抗原受容体、ならびにそのような受容体を細胞の中に操作および導入するための方法には、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０００１４２５７、ＷＯ２０１３１２６７２６、ＷＯ２０１２／１２９５１４、ＷＯ２０１４０３１６８７、ＷＯ２０１３／１６６３２１、ＷＯ２０１３／０７１１５４、ＷＯ２０１３／１２３０６１、ＷＯ２０１６／００４６７２４、ＷＯ２０１６／０１４７８９、ＷＯ２０１６／０９０３２０、ＷＯ２０１６／０９４３０４、ＷＯ２０１７／０２５０３８、ＷＯ２０１７／１７３２５６、米国特許出願公開第ＵＳ２００２１３１９６０号、ＵＳ２０１３２８７７４８号、ＵＳ２０１３０１４９３３７号、米国特許第６，４５１，９９５号、７，４４６，１９０号、８，２５２，５９２号、８，３３９，６４５号、８，３９８，２８２号、７，４４６，１７９号、６，４１０，３１９号、７，０７０，９９５号、７，２６５，２０９号、７，３５４，７６２号、７，４４６，１９１号、８，３２４，３５３号、８，４７９，１１８号、および９，７６５，３４２号および欧州特許出願番号ＥＰ２５３７４１６に記載されているもの、ならびに／またはSadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398;Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 63339;Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75によって記載されているものが挙げられる。一部の態様では、抗原受容体には、米国特許第７，４４６，１９０号に記載のＣＡＲ、および国際特許出願公開番号ＷＯ／２０１４０５５６６８ Ａ１に記載されているものが挙げられる。ＣＡＲの例には、ＷＯ２０１４０３１６８７、ＵＳ ８，３３９，６４５、ＵＳ ７，４４６，１７９、ＵＳ ２０１３／０１４９３３７、米国特許第７，４４６，１９０号、米国特許第８，３８９，２８２号、Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013);Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701；およびBrentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177)などの上述の刊行物のいずれかに開示のＣＡＲが挙げられる。ＷＯ２０１４０３１６８７、ＵＳ ８，３３９，６４５、ＵＳ ７，４４６，１７９、ＵＳ ２０１３／０１４９３３７、米国特許第７，４４６，１９０号、および米国特許第８，３８９，２８２号も参照のこと。
例示的抗原受容体、例えば、ＣＡＲは、Marofi et al., Stem Cell Res Ther 12: 81 (2021); Townsend et al., J Exp Clin Cancer Res 37: 163 (2018); Ma et al., Int J Biol Sci 15(12): 2548-2560 (2019); Zhao and Cao, Front Immunol 10: 2250 (2019); Han et al., J Cancer 12(2): 326-334 (2021); Specht et al., Cancer Res 79: 4 Supplement, Abstract P2-09-13; Byers et al., Journal of Clinical Oncology 37, no. 15_suppl (2019); Panowski et al., Cancer Res 79 (13 Supplement) 2326 (2019);および Sauer et al., Blood 134 (Supplement_1): 1932 (2019)に記載される全ても含み、あるいは、米国特許第８，１５３，７６５号；同第８，６０３４７７号；同第８，００８，４５０号；米国特許出願公開第２０１２０１８９６２２号、または米国特許出願公開第２０１００２６０７４８号；および国際公開第２００６０９９８７５号、国際公開第２００９０８０８２９号、国際公開第２０１２０９２６１２号、国際公開第２０１４２１００６４号に記載される抗体または抗原結合性断片の全てを含み得る。
さらなる例示的抗原受容体、例えば、ＣＡＲ、例えば、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲなど、は、イデカブタゲンビクルユーセル（ｉｄｅｃａｂｔａｇｅｎｅ ｖｉｃｌｅｕｃｅｌ）、ＡＢＥＣＭＡ（登録商標）、ＢＣＭＡ０２、ＪＣＡＲＨ１２５、ＪＮＪ－６８２８４５２８（ＬＣＡＲ－Ｂ３８Ｍ；シルタカブタジンオートルーセル（ｃｉｌｔａｃａｂｔａｇｅｎｅ ａｕｔｏｌｅｕｃｅｌ）；ＣＡＲＶＹＫＴＩ（登録商標）（Ｊａｎｓｓｅｎ／Ｌｅｇｅｎｄ）、Ｐ－ＢＣＭＡ－１０１（Ｐｏｓｅｉｄａ）、ＰＢＣＡＲ２６９Ａ（Ｐｏｓｅｉｄａ）、Ｐ－ＢＣＭＡ－Ａｌｌｏ１（Ｐｏｓｅｉｄａ）、Ａｌｌｏ－７１５（Ｐｆｉｚｅｒ／Ａｌｌｏｇｅｎｅ）、ＣＴ０５３（Ｃａｒｓｇｅｎ）、デカルト－０８（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ）、ＰＨＥ８８５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＡＲＩ－００２（Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｌｉｎｉｃ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ， ＩＤＩＢＡＰＳ）、およびＣＴＸ１２０（ＣＲＩＳＰＲ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）のＣＡＲを含む。特定の実施形態において、ＣＡＲは、イデカブタゲンビクルユーセル細胞のＣＡＲである。特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＡＢＥＣＭＡ（登録商標）細胞（ＡＢＥＣＭＡ（登録商標）免疫療法に使用される細胞）のＣＡＲである。特定の実施形態において、ＣＡＲは、シルタカブタジンオートルーセル細胞のＣＡＲである。特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲＶＹＫＴＩ（商標）細胞（ＣＡＲＶＹＫＴＩ（商標）免疫療法に使用される細胞）のＣＡＲである。
例示的抗原受容体、例えば、ＣＡＲ、は、ＦＤＡ承認製品のＢＲＥＹＡＮＺＩ（登録商標）（リソカブタゲンマラルユーセル（ｌｉｓｏｃａｂｔａｇｅｎｅ ｍａｒａｌｅｕｃｅｌ））のＣＡＲ、ＴＥＣＡＲＴＵＳ（商標）（ブレクスカブタジェンアウトルーセル（ｂｒｅｘｕｃａｂｔａｇｅｎｅ ａｕｔｏｌｅｕｃｅｌ））、ＫＹＭＲＩＡＨ（商標）（チサゲンレクルユーセル（ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ））、およびＹＥＳＣＡＲＴＡ（商標）（アキシカブタゲンシロルユーセル（ａｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅ ｃｉｌｏｌｅｕｃｅｌ））、ＡＢＥＣＭＡ（登録商標）（イデカブタゲンビクルユーセル）、およびＣＡＲＶＹＫＴＩ（商標）（シルタカブタジンオートルーセル）も含む。提供される実施形態のいずれかのいくらかにおいて、ＣＡＲは、ＢＲＥＹＡＮＺＩ（登録商標）（リソカブタゲンマラルユーセル）のＣＡＲ、ＴＥＣＡＲＴＵＳ（商標）（ブレクスカブタジェンアウトルーセル）、ＫＹＭＲＩＡＨ（商標）（チサゲンレクルユーセル）、ＹＥＳＣＡＲＴＡ（商標）（アキシカブタゲンシロルユーセル）、ＡＢＥＣＭＡ（登録商標）（イデカブタゲンビクルユーセル）、またはＣＡＲＶＹＫＴＩ（商標）（シルタカブタジンオートルーセル）である。提供される実施形態のいずれかのいくらかにおいて、ＣＡＲは、ＢＲＥＹＡＮＺＩ（登録商標）（リソカブタゲンマラルユーセル、Sehgal et al., 2020, Journal of Clinical Oncology 38:15_suppl, 8040; Teoh et al., 2019, Blood 134(Supplement_1):593; and Abramson et al., 2020, The Lancet 396(10254): 839-852を参照されたい）のＣＡＲである。提供される実施形態のいずれかのいくらかにおいて、ＣＡＲは、ＴＥＣＡＲＴＵＳ（商標）（ブレクスカブタジェンアウトルーセル、Mian and Hill, 2021, Expert Opin Biol Ther; 21(4):435-441; and Wang et al., 2021, Blood 138(Supplement 1):744を参照されたい）のＣＡＲである。提供される実施形態のいずれかのいくらかにおいて、ＣＡＲは、ＫＹＭＲＩＡＨ（商標）（チサゲンレクルユーセル、Bishop et al., 2022, N Engl J Med 386:629:639; Schuster et al., 2019, N Engl J Med 380:45-56; Halford et al., 2021, Ann Pharmacother 55(4):466-479; Mueller et al., 2021, Blood Adv. 5(23):4980-4991; and Fowler et al., 2022, Nature Medicine 28:325-332を参照されたい）のＣＡＲである。提供される実施形態のいずれかのいくらかにおいて、ＣＡＲは、ＹＥＳＣＡＲＴＡ（商標）（アキシカブタゲンシロルユーセル、Neelapu et al., 2017, N Engl J Med 377(26):2531-2544; Jacobson et al., 2021, The Lancet 23(1):P91-103; and Locke et al., 2022, N Engl J Med 386:640-654を参照されたい）のＣＡＲである。提供される実施形態のいずれかのいくらかにおいて、ＣＡＲは、ＡＢＥＣＭＡ（登録商標）（イデカブタゲンビクルユーセル、Raje et al., 2019, N Engl J Med 380:1726-1737; and Munshi et al., 2021, N Engl J Med 384:705-716を参照されたい）のＣＡＲである。提供される実施形態のいずれかのいくらかにおいて、ＣＡＲは、ＣＡＲＶＹＫＴＩ（商標）（シルタカブタジンオートルーセル、Berdeja et al., Lancet. 2021 Jul 24;398(10297):314-324; and Martin, Abstract #549 [Oral], presented at 2021 American Society of Hematology (ASH) Annual Meeting & Exposition)を参照されたい）のＣＡＲである。
キメラ受容体、例えば、ＣＡＲなど、は、概して、細胞外抗原結合ドメイン、例えば、抗体分子の一部など、概して、抗体の可変重鎖（ＶＨ）領域および／または可変軽鎖（ＶＬ）領域、例えば、ｓｃＦｖ抗体断片、を含む。
一部の実施形態では、受容体によって標的化される抗原はポリペプチドである。一部の実施形態では、それは炭水化物または他の分子である。一部の実施形態では、抗原は、正常な、または標的化されていない細胞または組織と比較して、疾患または状態を有する細胞で、例えば、腫瘍または病原性の細胞で、選択的に発現または過剰発現される。他の実施形態では、抗原は、正常細胞で発現され、および／または操作された細胞で発現される。
一部の実施形態では、抗原は、αｖβ６インテグリン（ａｖｂ６インテグリン）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、炭酸脱水酵素９（ＣＡ９、またＣＡＩＸまたはＧ２５０としても公知）、がん精巣抗原、がん／精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ、またＮＹ－ＥＳＯ－１およびＬＡＧＥ－２としても公知）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、サイクリン、サイクリンＡ２、Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＣＬ－１）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、上皮増殖因子タンパク質（ＥＧＦＲ）、ＩＩＩ型上皮増殖因子受容体突然変異（ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ）、上皮糖タンパク質２（ＥＰＧ－２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＰＧ－４０）、エフリンＢ２、エフリン受容体Ａ２（ＥＰＨａ２）、エストロゲン受容体、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５；またＦｃ受容体ホモログ５またはＦＣＲＨ５としても公知）、胎児アセチルコリン受容体（胎児ＡｃｈＲ）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドＧＤ２、Ｏ－アセチル化ＧＤ２（ＯＧＤ２）、ガングリオシドＧＤ３、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、Ｇタンパク質共役受容体５Ｄ（ＧＰＲＣ５Ｄ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（受容体チロシンキナーゼｅｒｂ－Ｂ２）、Ｈｅｒ３（ｅｒｂ－Ｂ３）、Ｈｅｒ４（ｅｒｂ－Ｂ４）、ｅｒｂＢ二量体、ヒト高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、Ｂ型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原Ａ１（ＨＬＡ－Ａ１）、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）、ＩＬ－２２受容体アルファ（ＩＬ－２２Ｒα）、ＩＬ－１３受容体アルファ２（ＩＬ－１３Ｒα２）、キナーゼインサートドメイン受容体（ｋｄｒ）、カッパ軽鎖、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、Ｌ１－ＣＡＭのＣＥ７エピトープ、ロイシンリッチリピート含有８ファミリーメンバーＡ（ＬＲＲＣ８Ａ）、ルイスＹ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ１０、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ｃ－Ｍｅｔ、マウスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ１６、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）リガンド、メランＡ（ＭＡＲＴ－１）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、腫瘍胎児性抗原、黒色腫優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（ＴＰＢＧ、また５Ｔ４としても公知）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ１、またＴＹＲＰ１またはｇｐ７５としても公知）、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２、またドパクロムトートメラーゼ、ドパクロムデルタイソメラーゼまたはＤＣＴとしても公知）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）、病原体特異的な、もしくは病原体によって発現される抗原、またはユニバーサルタグと会合した抗原、および／またはビオチン化分子、および／またはＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶもしくは他の病原体によって発現される分子であるかまたはそれらを含む。一部の実施形態では受容体により標的化される抗原は、Ｂ細胞悪性腫瘍に関連する抗原、例えばいくつかの公知のＢ細胞マーカーのいずれかを含む。一部の実施形態では、抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＣＤ４５、ＣＤ２１、ＣＤ５、ＣＤ３３、Ｉｇカッパ、Ｉｇラムダ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂまたはＣＤ３０である、またはそれを含む。一部の実施形態では、抗原は、病原体特異的または病原体発現抗原であるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、抗原は、ウイルス抗原（ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ等由来のウイルス抗原など）、細菌抗原、および／または寄生虫抗原である。
一部の実施形態では受容体によって標的にされる抗原としては、Ｂ細胞悪性腫瘍に関連する抗原、例えば、いくつかの既知のＢ細胞マーカーのいずれかなど、が挙げられる。一部の実施形態では、受容体によって標的化される抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＣＤ４５、ＣＤ２１、ＣＤ５、ＣＤ３３、Ｉｇカッパ、Ｉｇラムダ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂまたはＣＤ３０である。
一部の実施形態では、抗原または抗原結合ドメインはＣＤ１９である。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＣＤ１９に対して特異的な抗体または抗体断片に由来するＶＨおよびＶＬを含有する。一部の実施形態では、ＣＤ１９と結合する抗体または抗体断片は、マウス由来の抗体、例えばＦＭＣ６３およびＳＪ２５Ｃ１である。一部の実施形態では、抗体または抗体断片は、例えば、米国特許出願公開第２０１６／０１５２７２３号に記載されるような、ヒト抗体である。ＣＤ１９に結合する例示的抗体または抗体断片は、国際公開第２０１４／０３１６８７号、米国特許第２０１６／０１５２７２３号、および国際公開第２０１６／０３３５７０号にも記載される。
本明細書において用語「抗体」は最も広い意味で使用され、インタクトな抗体ならびに、抗原結合性（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）断片、抗原を特異的に結合することができる重鎖可変（ＶＨ）領域、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む一本鎖抗体断片、および単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）断片を含む機能性（抗原結合性）抗体断片を含む、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含む。該用語は、遺伝子操作されたおよび／またはさもなければ改変された形態の免疫グロブリン、例えばイントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性抗体、例えば二重特異性または三重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ、タンデムｄｉ－ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ－ｓｃＦｖを包含する。特に明記しない限り、用語「抗体」は、本明細書において「抗原結合性断片」とも呼ばれるその機能性抗体断片を包含すると理解されるべきである。この用語はまた、あらゆるクラスまたはサブクラスの抗体を含む無傷または全長抗体、例えば、ＩｇＧおよびそのサブクラス、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＤなども包含する。
「超可変領域」または「ＨＶＲ」と同義の用語「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」は、抗原特異性および／または結合親和性を与える抗体可変領域内のアミノ酸の非連続配列を指すことが当技術分野で公知である。一般に、各重鎖可変領域（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）に３つのＣＤＲがあり、各軽鎖可変領域（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）に３つのＣＤＲがある。「フレームワーク領域」および「ＦＲ」は、重鎖および軽鎖の可変領域の非ＣＤＲ部分を指すことが当技術分野で公知である。一般に、各完全長重鎖可変領域に４つのＦＲ（ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、およびＦＲ－Ｈ４）、および各完全長軽鎖可変領域に４つのＦＲ（ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３、およびＦＲ－Ｌ４）がある。
所与のＣＤＲまたはＦＲの正確なアミノ酸配列の境界は、Kabat et al. ( 1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（「Ｋａｂａｔ」の番号付けスキーム）；Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948（「Ｃｈｏｔｈｉａ」の番号付けスキーム）；MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), “Antibody-antigen 相互作用s: Contact analysis and binding site topography,” J. Mol. Biol. 262, 732-745.（「Ｃｏｎｔａｃｔ」番号付けスキーム）；Lefranc MP et al., “IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and lg superfamily V-like domains,” Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27( 1):55-77（「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）；Honegger A and Pliickthun A, “Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool,” J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3):65770（「Ａｈｏ」番号付けスキーム）；およびMartin et al., “Modeling antibody hypervariable loops: a combined algorithm,” PNAS, 1989, 86(23):9268-9272（「ＡｂＭ」番号付けスキーム）によって記載されているものを含む多くの周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定することができる。
所与のＣＤＲまたはＦＲの境界は、同定に使用されるスキームに応じて異なり得る。例えば、Ｋａｂａｔスキームは構造的アライメントに基づくが、Ｃｈｏｔｈｉａスキームは構造情報に基づく。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａスキームの両方の番号付けは、挿入文字、例えば「３０ａ」によって調節される挿入および一部の抗体で現れる欠失を用いる、最も一般的な抗体領域配列長に基づく。２つのスキームは、ある特定の挿入および欠失（「インデル」）を異なる位置に配置し、異なる番号付けをもたらす。Ｃｏｎｔａｃｔスキームは複合な結晶構造の解析に基づいており、Ｃｈｏｔｈｉａの番号付けスキームと多くの点で類似している。ＡｂＭスキームは、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されるものに基づくＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの定義の妥協案である。
以下の表１は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、およびＣｏｎｔａｃｔスキームによってそれぞれ同定されたＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３およびＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３の例示的な境界位置をリストしている。ＣＤＲ－Ｈ１に関して、残基番号付けはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームの両方を使用してリストされる。ＦＲはＣＤＲ間に位置し、例えば、ＦＲ－Ｌ１はＣＤＲ－Ｌ１の前に位置し、ＦＲ－Ｌ２はＣＤＲ－Ｌ１とＣＤＲ－Ｌ２の間に位置し、ＦＲ－Ｌ３はＣＤＲ－Ｌ２とＣＤＲ－Ｌ３の間に位置する、などである。なお、示されたＫａｂａｔの番号付けスキームは、挿入をＨ３５ＡおよびＨ３５Ｂに配置するため、示されたＫａｂａｔの番号付けの規定を使用して付番される場合、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ１ループの末端はループの長さに応じてＨ３２～Ｈ３４で異なる。
表1. 様々な番号付けスキームに従ったCDRの境界


1 - Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD
2 - Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948
故に、特に指定のない限り、所与の抗体またはその領域、例えばその可変領域の「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」または個々の指定されたＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）は、上述のスキームまたは他の公知のスキームのいずれかによって定義される、ある（または特定の）相補性決定領域を包含すると理解されるべきである。例えば、特定のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ－Ｈ３）が、所与のＶＨまたはＶＬ領域アミノ酸配列中の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を含有すると述べられている場合、そのようなＣＤＲは、上述のスキームまたは他の公知のスキームのいずれかによって定義される可変領域内の対応するＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ－Ｈ３）の配列を有することが理解される。一部の実施形態では、特定のＣＤＲ配列が指定される。提供された抗体の例示的なＣＤＲ配列は、様々な番号付けスキームを使用して記載されるが、提供された抗体は、他の上述の番号付けスキームまたは当業者に公知の他の番号付けスキームのいずれかに従って記載されるＣＤＲを含み得ることが理解される。
同様に、特に指定のない限り、所与の抗体またはその領域、例えばその可変領域のＦＲまたは個々の指定されたＦＲ（例えば、ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、ＦＲ－Ｈ４）は、公知のスキームのいずれかによって定義される、ある（または特定の）フレームワーク領域を包含すると理解されるべきである。一部の例では、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭもしくはＣｏｎｔａｃｔ方法、または他の公知のスキームによって定義されるＣＤＲなどの、特定のＣＤＲ、ＦＲ、またはＦＲｓもしくはＣＤＲｓを同定するためのスキームが指定される。他の場合では、ＣＤＲまたはＦＲの特定のアミノ酸配列が示される。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗原への抗体の結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖および軽鎖の可変領域（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）は、一般に、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つのＣＤＲを含む各ドメインを含む、類似した構造を有する［例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照］。単一のＶＨまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体が、該抗原に結合する抗体由来のＶＨまたはＶＬドメインを使用して単離されて、それぞれ相補的なＶＬまたはＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照のこと。
提供されたＣＡＲに含まれる抗体の中には抗体断片が含まれる。「抗体断片」または「抗原結合性断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する該インタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖抗体；重鎖可変（ＶＨ）領域、一本鎖抗体分子、例えばｓｃＦｖ、およびＶＨ領域のみを含む単一ドメイン抗体；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、提供されたＣＡＲの抗原結合性ドメインは、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）領域を含む抗体断片であるか、またはこれを含む。特定の実施形態では、抗体は、重鎖可変（ＶＨ）領域および／または軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む一本鎖抗体断片、例えばｓｃＦｖである。
一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＦＭＣ６３から誘導される。ＦＭＣ６３は、一般的に、ヒト起源のＣＤ１９を発現するＮａｌｍ－１および－１６細胞に対して生じたマウスモノクローナルＩｇＧ１抗体を指す（Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302）。一部の実施形態では、ＦＭＣ６３抗体は、配列番号５１および５２にそれぞれ記載されたＣＤＲＨ１およびＨ２、ならびに配列番号５３または５４に記載されたＣＤＲＨ３、ならびに配列番号５５に記載されたＣＤＲＬ１、ならびに配列番号５５または５７に記載されたＣＤＲ Ｌ２、ならびに配列番号５８または５９に記載されたＣＤＲ Ｌ３を含む。一部の実施形態では、ＦＭＣ６３抗体は、配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号５５のＣＤＲＬ１配列、配列番号５６のＣＤＲＬ２配列、および配列番号５８のＣＤＲＬ３配列を含有する可変軽鎖、ならびに／または配列番号５１のＣＤＲＨ１配列、配列番号５２のＣＤＲＨ２配列、および配列番号５３のＣＤＲＨ３配列を含有する可変重鎖を含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号６０に記載された可変重鎖領域および配列番号６１に記載された可変軽鎖領域を含む。一部の実施形態では、可変重鎖および可変軽鎖はリンカーによって連結される。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号６２に記載される。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、順に、ＶＨ、リンカー、およびＶＬを含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、順に、ＶＬ、リンカー、およびＶＨを含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号６３に記載されたヌクレオチドの配列、または配列番号６３に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示す配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号６４に記載されたアミノ酸の配列、または配列番号６４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示す配列を含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＢＲＥＹＡＮＺＩ（登録商標）（リソカブタゲンマラルユーセル）のｓｃＦｖである。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＲＥＹＡＮＺＩ（登録商標）（リソカブタゲンマラルユーセル）のｓｃＦｖである。
一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＳＪ２５Ｃ１から誘導される。ＳＪ２５Ｃ１は、ヒト起源のＣＤ１９を発現するＮａｌｍ－１および－１６細胞に対して生じたマウスモノクローナルＩｇＧ１抗体である（Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302）。一部の実施形態では、ＳＪ２５Ｃ１抗体は、配列番号６５～６７にそれぞれ記載されたＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３、ならびに配列番号６８～７０にそれぞれ記載されたＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３配列を含む。一部の実施形態では、ＳＪ２５Ｃ１抗体は、配列番号７１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号７２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７３のＣＤＲＬ１配列、配列番号７４のＣＤＲＬ２配列、および配列番号７５のＣＤＲＬ３配列を含有する可変軽鎖、ならびに／または配列番号７６のＣＤＲＨ１配列、配列番号７７のＣＤＲＨ２配列、および配列番号７８のＣＤＲＨ３配列を含有する可変重鎖を含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号７１に記載された可変重鎖領域および配列番号７２に記載された可変軽鎖領域を含む。一部の実施形態では、可変重鎖および可変軽鎖は、リンカーによって連結される。一部の実施形態では、リンカーは配列番号７９に記載される。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、順に、ＶＨ、リンカー、およびＶＬを含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、順に、ＶＬ、リンカー、およびＶＨを含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号８０に記載されたアミノ酸の配列、または配列番号８０に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示す配列を含む。
一部の実施形態では、抗原または抗原結合ドメインはＢＣＭＡである。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＢＣＭＡに特異的な抗体または抗体断片に由来するＶＨおよびＶＬを含有する。一部の実施形態では、ＢＣＭＡに結合する抗体または抗体断片は、国際特許出願公開番号ＷＯ ２０１６／０９０３２７およびＷＯ ２０１６／０９０３２０に記載された抗体または抗体断片由来のＶＨおよびＶＬであるか、またはこれを含有する。
一部の実施形態では、ＢＣＭＡに結合する抗体または抗体断片は、説明される任意の抗ＢＣＭＡ抗体であり得るか、または、説明される任意の抗ＢＣＭＡ抗体に由来し得る。例えば、Carpenter et al., Clin Cancer Res., 2013, 19(8):2048-2060；米国特許第９，０３４，３２４号、米国特許第９，７６５，３４２号；米国特許出願公開第２０１６／００４６７２４号、米国特許出願公開第２０１７０１８３４１８号；および国際公開第２０１６０９０３２０号、国際公開第２０１６０９０３２７号、国際公開第２０１６０９４３０４号、国際公開第２０１６０１４５６５号、国際公開第１０６０１４７８９号、国際公開第２０１０１０４９４９号、国際公開第２０１７／０２５０３８号、または国際公開第２０１７１７３２５６号を参照されたい。そのような抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合性断片のいずれも、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲにおいて使用することができる。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）領域を含むｓｃＦｖである抗原結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、可変重鎖（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）領域を含むｓｃＦｖは、国際公開第２０１６０９０３２０号または国際公開第２０１６０９０３２７号に記載される抗体に由来する。一部の実施形態では、抗原または抗原結合ドメインは、ＧＰＲＣ５Ｄである。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的な抗体または抗体断片由来のＶＨおよびＶＬを含有する。一部の実施形態では、ＧＰＲＣ５Ｄと結合する抗体または抗体断片は、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１６／０９０３２９、ＷＯ２０１６／０９０３１２およびＷＯ２０２０／０９２８５４に記載の抗体または抗体断片からのＶＨおよびＶＬであるかまたはそれを含有する。
一部の実施形態では、ＢＣＭＡに結合する抗体または抗体断片は、ＶＨおよびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号１１３に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１４に示されるＣＤＲ－Ｈ２および配列番号１１５に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含み、ＶＬ領域は、配列番号１１６に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１１７に示されるＣＤＲ－Ｌ２および配列番号１１８に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含む。一部の実施形態では、ＢＣＭＡに結合する抗体または抗体断片は、配列番号１１９に示されるアミノ酸の配列または配列番号１１９に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％を示すアミノ酸の配列を有するＶＨ領域、ならびに配列番号１２０に示されるアミノ酸の配列または配列番号１２０に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％を示すアミノ酸の配列を有するＶＬ領域を含む。一部の実施形態では、ＢＣＭＡに結合する抗体または抗体断片は、配列番号１１９に示されるアミノ酸の配列を有するＶＨ領域および配列番号１２０に示されるアミノ酸の配列を有するＶＬ領域を含む。一部の実施形態では、ＢＣＭＡに結合する抗体または抗体断片は、配列番号１２１に示されるアミノ酸の配列１２１または配列番号１２１に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％を示すアミノ酸の配列を有するｓｃＦｖである。一部の実施形態では、ＢＣＭＡに結合する抗体または抗体断片は、配列番号１２１に示されるようなｓｃＦｖである。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＡＢＥＣＭＡ（登録商標）（イデカブタゲンビクルユーセル）のものである。一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１２２に示されるアミノ酸の配列または配列番号１２２に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する。一部の実施形態では、ＣＡＲはＡＢＥＣＭＡ（登録商標）（イデカブタゲンビクルユーセル）のものである。
一部の実施形態では、ＢＣＭＡに結合する抗体または抗体断片は、ＶＨおよびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号１２３に示されるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１２４に示されるＣＤＲ－Ｈ２および配列番号１２５に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含み、ＶＬ領域は、配列番号１２６に示されるＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１２７に示されるＣＤＲ－Ｌ２および配列番号１２８に示されるＣＤＲ－Ｈ３を含む。一部の実施形態では、ＢＣＭＡに結合する抗体または抗体断片は、配列番号１２９に示されるアミノ酸の配列または配列番号１２９に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％を示すアミノ酸の配列を有するＶＨ領域ならびに配列番号１３０に示されるアミノ酸の配列または配列番号１３０に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％を示すアミノ酸の配列を有するＶＬ領域を含む。一部の実施形態では、ＢＣＭＡに結合する抗体または抗体断片は、配列番号１２９に示されるアミノ酸の配列を有するＶＨ領域および配列番号１３０に示されるアミノ酸の配列を有するＶＬ領域を含む。一部の実施形態では、ＢＣＭＡに結合する抗体または抗体断片は、配列番号１３１に示されるアミノ酸の配列または配列番号１３１に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％を示すアミノ酸の配列を有するｓｃＦｖである。一部の実施形態では、ＢＣＭＡに結合する抗体または抗体断片は、配列番号１３１に示されるようなｓｃＦｖである。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、オルヴァカブタゲンオートロイセル（ｏｒｖａｃａｂｔａｇｅｎｅ ａｕｔｏｌｅｕｃｅｌ）のものである。一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１３２に示されるアミノ酸の配列または配列番号１３２に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、オルヴァカブタゲンオートロイセルのものである。
一部の実施形態では、抗原はＣＤ２０である。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＣＤ２０に特異的な抗体または抗体断片に由来するＶＨおよびＶＬを含有する。一部の実施形態では、ＣＤ２０に結合する抗体または抗体断片は、リツキシマブである抗体、またはリツキシマブに由来する抗体であり、例えばリツキシマブｓｃＦｖである。
一部の実施形態では、抗原はＣＤ２２である。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＣＤ２２に特異的な抗体または抗体断片に由来するＶＨおよびＶＬを含有する。一部の実施形態では、ＣＤ２２に結合する抗体または抗体断片は、ｍ９７１である抗体、またはｍ９７１に由来する抗体であり、例えばｍ９７１ ｓｃＦｖである。
一部の実施形態では、抗原はＲＯＲ１である。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＲＯＲ１に対して特異的な抗体または抗体断片に由来するＶＨおよびＶＬを含有する。一部の実施形態では、ＲＯＲ１に結合する抗体または抗体断片は、各々の開示内容が、参照によりその全体で組み込まれる、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１４／０３１６８７、ＷＯ２０１６／１１５５５９およびＷＯ２０２０／１６００５０に示される抗体または抗体断片からのＶＨおよびＶＬであるか、またはそれを含有する。
一部の実施形態では、抗原はＦｃＲＬ５である。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＦｃＲＬ５に対して特異的な抗体または抗体断片に由来するＶＨおよびＶＬを含有する。一部の実施形態では、ＦｃＲＬ５に結合する抗体または抗体断片は、各々の開示内容が、参照によりその全体で組み込まれる、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１６／０９０３３７およびＷＯ２０１７／０９６１２０に示される抗体または抗体断片からのＶＨおよびＶＬであるか、またはそれを含有する。
一部の実施形態では、抗原はメソテリンである。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、メソテリンに対して特異的な抗体または抗体断片に由来するＶＨおよびＶＬを含有する。一部の実施形態では、メソテリンに結合する抗体または抗体断片は、その開示内容が、参照によりその全体で組み込まれるＵＳ２０１８／０２３０４２９に示される抗体または抗体断片からのＶＨおよびＶＬであるか、またはそれを含有する。
一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、抗体または抗体断片を含有する細胞外部分を含む。一部の態様では、キメラ抗原受容体は、抗体または断片および細胞内シグナル伝達ドメインを含有する細胞外部分を含む。一部の実施形態では、抗体または断片はｓｃＦｖを含む。
一部の実施形態では、組換え受容体、例えばＣＡＲの抗体部分は、ヒンジ領域、例えばＩｇＧ４ヒンジ領域、および／またはＣＨ１／ＣＬおよび／またはＦｃ領域などの免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部をさらに含む。一部の実施形態では、定常領域または位置は、ヒトＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１のものである。一部の態様では、定常領域の部分は、抗原認識構成要素、例えば、ｓｃＦｖと膜貫通ドメインの間でスペーサー領域として働く。スペーサーは、スペーサーの不在下と比較して、抗原結合後に細胞の増大された反応性を提供する長さのものであり得る。例示的なスペーサーには、Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１４０３１６８７、米国特許第８，８２２，６４７号または公開出願番号ＵＳ２０１４／０２７１６３５に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、定常領域または部分は、ヒトＩｇＧ、例えばＩｇＧ４またはＩｇＧ１の定常領域または部分である。一部の実施形態では、スペーサーは、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号８１に記載された）を有し、配列番号８２に記載された配列によってコードされる。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号８３に記載された配列を有する。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号８４に記載された配列を有する。一部の実施形態では、定常領域または部分はＩｇＤの定常領域または部分である。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号８５に記載された配列を有する。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号８１、８３、８４、または８５のいずれかに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号８６～９４に記載された配列を有する。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号８６～９４のいずれかに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する。
一部の実施形態では、抗原受容体は、細胞外ドメインに直接または間接的に連結された細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結する膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインはＩＴＡＭを含む。例えば、一部の態様では、抗原認識ドメイン（例えば、細胞外ドメイン）は、一般に、１つもしくは複数の細胞内シグナル伝達成分、例えば、抗原受容体複合体、例えばＣＡＲの場合ではＴＣＲ複合体を通じた活性化を模倣するシグナル伝達成分、および／または別の細胞表面受容体を介したシグナルに連結される。一部の実施形態では、キメラ受容体は、細胞外ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）と細胞内シグナル伝達ドメインの間で連結または融合された膜貫通ドメインを含む。故に、一部の実施形態では、抗原結合成分（例えば、抗体）は、１つまたは複数の膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。
一実施形態では、受容体、例えば、ＣＡＲ中のドメインの１つと天然に関連する膜貫通ドメインが使用される。一部の場合には、膜貫通ドメインは、同一または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのこのようなドメインの結合を避けて、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するためにアミノ酸置換によって選択または改変される。
膜貫通ドメインは、一部の実施形態では、天然供給源に、または合成供給源に由来する。供給源が天然である場合には、ドメインは、一部の態様では、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４に由来するものを含む（すなわち、少なくともこれらの膜貫通領域を含む）。あるいは、一部の実施形態における膜貫通ドメインは合成である。一部の態様では、合成膜貫通ドメインは、主に疎水性の残基、例えば、ロイシンおよびバリンを含む。一部の態様では、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットは、合成膜貫通ドメインの各末端に見出される。一部の実施形態では、連結は、リンカー、スペーサー、および／または膜貫通ドメインによる。一部の態様では、膜貫通ドメインはＣＤ２８の膜貫通部分を含有する。
一部の実施形態では、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインは、直接または間接的に連結することができる。一部の実施形態では、細胞外ドメインおよび膜貫通は、本明細書に記載されたいずれかなどのスペーサーによって連結される。一部の実施形態では、受容体は、膜貫通ドメインが由来する分子の細胞外部分、例えばＣＤ２８細胞外部分を含有する。
細胞内シグナル伝達ドメインの中には、天然の抗原受容体を通じたシグナル、共刺激受容体と組み合わせたそのような受容体を通じたシグナル、および／または共刺激受容体単独を通じたシグナルを模倣または近似するものが含まれる。一部の実施形態では、短いオリゴリンカーまたはポリペプチドリンカー、例えば、２から１０個のアミノ酸長のリンカー、例えば、グリシンおよびセリンを含有するもの、例えば、グリシン－セリンダブレットが存在し、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインの間の連結を形成する。
Ｔ細胞活性化は、一部の態様では、２つのクラスの細胞質シグナル伝達配列：ＴＣＲを通じて抗原依存的一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）、および抗原非依存的に作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルをもたらすもの（二次細胞質シグナル伝達配列）によって媒介されると説明される。一部の態様では、ＣＡＲは、そのようなシグナル伝達成分の一方または両方を含む。
受容体、例えばＣＡＲは、一般に、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達成分（複数可）を含む。一部の態様では、ＣＡＲは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する一次細胞質シグナル伝達配列を含む。刺激的方法で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含有し得る。一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例には、ＣＤ３ゼータ鎖、ＦｃＲガンマ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタおよびＣＤ３イプシロンに由来するものが挙げられる。一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞質シグナル伝達分子は、細胞質シグナル伝達ドメイン、その部分、またはＣＤ３ゼータに由来する配列を含有する。
一部の実施形態では、受容体は、ＴＣＲ複合体の細胞内構成要素、例えば、Ｔ細胞活性化および細胞毒性を媒介するＴＣＲ ＣＤ３鎖、例えば、ＣＤ３ゼータ鎖を含む。したがって、一部の態様では、抗原結合部分は、１つまたは複数の細胞シグナル伝達モジュールに連結される。一部の実施形態では、細胞シグナル伝達モジュールは、ＣＤ３膜貫通ドメイン、ＣＤ３細胞内シグナル伝達ドメイン、および／または他のＣＤ３膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、受容体、例えばＣＡＲは、Ｆｃ受容体γ、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５、またはＣＤ１６などの１つまたは複数の追加の分子の一部をさらに含む。例えば、一部の態様では、ＣＡＲまたは他のキメラ受容体は、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３－ζ）またはＦｃ受容体γとＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５またはＣＤ１６の間のキメラ分子を含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲまたは他のキメラ受容体が連結すると、受容体の細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現するように操作された免疫細胞、例えばＴ細胞の正常なエフェクター機能または応答の少なくとも１つを活性化する。例えば、一部の文脈では、ＣＡＲは、Ｔ細胞の機能、例えば、細胞溶解活性またはＴヘルパー活性、例えば、サイトカインまたは他の因子の分泌を誘導する。一部の実施形態では、無傷の免疫賦活性鎖の代わりに、抗原受容体構成要素または共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインの末端切断型部分が、例えば、それがエフェクター機能シグナルを伝達する場合には使用される。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質配列を含み、一部の態様では、天然の状況でそのような受容体と協調作用して抗原受容体との結合後にシグナル伝達を開始する共受容体の細胞質配列も含む。
天然ＴＣＲの文脈において、完全活性化は、一般に、ＴＣＲを介したシグナル伝達だけでなく、共刺激シグナルも必要とする。したがって、一部の実施形態では、完全活性化を促進するために、二次または共刺激シグナルを生成するための構成要素もＣＡＲ中に含まれる。他の実施形態では、ＣＡＲは、共刺激シグナルを生成するための構成要素を含まない。一部の態様では、さらなるＣＡＲは、同一細胞において発現され、二次または共刺激シグナルを生成するための構成要素を提供する。
一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内ドメインを含有する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、共刺激受容体のシグナル伝達ドメインおよび／または膜貫通部分、例えばＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、およびＩＣＯＳを含む。一部の態様では、同じＣＡＲが活性化成分および共刺激成分の両方を含む。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞共刺激分子またはその機能性変異体に由来する細胞内ドメインを、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインの間などに含有する。一部の態様では、Ｔ細胞共刺激分子はＣＤ２８または４１ＢＢである。
一部の実施形態では、活性化ドメインは１つのＣＡＲの中に含まれるのに対し、共刺激成分は別の抗原を認識する別のＣＡＲによって提供される。一部の実施形態では、ＣＡＲは、両方とも同じ細胞で発現される活性化ＣＡＲまたは刺激ＣＡＲ、共刺激ＣＡＲを含む（ＷＯ２０１４／０５５６６８を参照）。一部の態様では、細胞は、１つまたは複数の刺激ＣＡＲもしくは活性化ＣＡＲおよび／または共刺激ＣＡＲを含む。一部の実施形態では、細胞は、疾患もしくは状態に関連するおよび／または特異的な抗原以外の抗原を認識するＣＡＲなどの抑制性ＣＡＲ［ｉＣＡＲ、Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December, 2013)を参照］をさらに含み、それにより、抑制性ＣＡＲがそのリガンドに結合することによって、疾患標的化ＣＡＲを通じてデリバリーされる活性化シグナルは減少または抑制されて、例えばオフターゲット効果を低減する。
一部の実施形態では、２つ受容体は、受容体のうちの１つのその抗原への連結は細胞を活性化するかまたは応答を誘導するが、第２の抑制性受容体のその抗原への連結はその応答を抑制するまたは弱めるように、それぞれ活性化シグナルおよび抑制性シグナルを細胞に誘導する。例は、活性化ＣＡＲおよび抑制性ＣＡＲ（ｉＣＡＲｓ）の組合せである。そのような戦略は、例えば、疾患または状態で発現されるが、正常な細胞でも発現される抗原に活性化ＣＡＲが結合し、正常な細胞で発現されるが、疾患または状態の細胞では発現されない別々の抗原に抑制性受容体が結合する状況においてオフターゲット効果の可能性を低減するのに使用され得る。
一部の態様では、キメラ受容体は、抑制性ＣＡＲ（例えば、ｉＣＡＲ）であるか、またはこれを含み、細胞におけるＩＴＡＭ促進応答および／または共刺激促進応答などの免疫応答を弱めるまたは抑制する細胞内成分を含む。そのような細胞内シグナル伝達成分の例は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、ＯＸ２Ｒ、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ－１、ＰＧＥ２受容体、Ａ２ＡＲを含むＥＰ２／４アデノシン受容体を含む、免疫チェックポイント分子で見出されるものである。一部の態様では、操作された細胞は、抑制性ＣＡＲが細胞の応答（例えば、活性化ＣＡＲおよび／または共刺激ＣＡＲによって誘導される）を弱める役割を果たすように、そのような抑制性分子の、またはそのような抑制性分子に由来するシグナル伝達ドメインを含む抑制性ＣＡＲを含む。
ある特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３（例えば、ＣＤ３ゼータ）細胞内ドメインに連結されたＣＤ２８膜貫通およびシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインに連結されたキメラＣＤ２８およびＣＤ１３７（４－１ＢＢ、ＴＮＦＲＳＦ９）共刺激ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、１つまたは複数の、例えば２つ以上の共刺激ドメインおよび活性化ドメイン、例えば一次活性化ドメインを細胞質部分に包含する。例示的なＣＡＲには、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、および４－１ＢＢの細胞内成分が挙げられる。
一部の実施形態では、抗原受容体は、マーカーおよび／またはＣＡＲもしくは他の抗原受容体を発現する細胞をさらに含み、受容体を発現させるための細胞の形質導入または操作を確認するのに使用され得る細胞表面マーカーなどのサロゲートマーカーをさらに含む。一部の態様では、マーカーは、ＣＤ３４、ＮＧＦＲ、または上皮成長因子受容体の全体または部分（例えば、切断型）、例えばそのような細胞表面受容体の切断バージョン（例えば、ｔＥＧＦＲ）を含む。一部の実施形態では、マーカーをコードする核酸は、切断可能なリンカー配列、例えばＴ２Ａなどのリンカー配列をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結される。例えば、マーカー、および適宜リンカー配列は、公開特許出願番号ＷＯ２０１４０３１６８７に開示されているいずれかであってもよい。例えば、マーカーは、Ｔ２Ａ切断可能リンカー配列などのリンカー配列に適宜連結された切断型ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）であってもよい。
切断型ＥＧＦＲ（例えば、ｔＥＧＦＲ）の例示的なポリペプチドは、配列番号４３もしくは１６に記載されたアミノ酸の配列、または配列番号４３もしくは４４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。例示的なＴ２リンカー配列は、配列番号４７もしくは４８に記載されたアミノ酸の配列、または配列番号４７もしくは４８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。
一部の実施形態では、マーカーは、Ｔ細胞で天然に見出されない、またはＴ細胞の表面で天然に見出されない分子、例えば細胞表面タンパク質、またはその部分である。一部の実施形態では、分子は、非自己分子、例えば非自己タンパク質、すなわち、細胞が養子移入される宿主の免疫系によって「自己」として認識されない分子である。
一部の実施形態では、マーカーは、治療機能を提供せず、かつ／または遺伝子操作についてのマーカーとして使用されること、例えば操作に成功した細胞を選択するため以外の効果を生産しない。他の実施形態では、マーカーは、治療用分子または別の方法で一部の所望の効果を発揮する分子、例えばインビボにおいて遭遇される細胞のリガンド、例えば養子移入およびリガンドとの遭遇に際して細胞の応答を向上および／または減弱する共刺激分子または免疫チェックポイント分子であってもよい。
一部の例では、ＣＡＲは、第１、第２、および／または第３世代ＣＡＲと呼ばれる。一部の態様では、第１世代ＣＡＲは、抗原結合時にＣＤ３鎖誘導シグナルだけをもたらすものであり；一部の態様では、第２世代ＣＡＲは、そのようなシグナルおよび共刺激シグナルをもたらすもの、例えば、ＣＤ２８またはＣＤ１３７などの共刺激受容体由来の細胞内シグナル伝達ドメインを含むものであり；一部の態様では、第３世代ＣＡＲは、異なる共刺激受容体の複数の共刺激ドメインを含むものである。
例えば、一部の実施形態では、ＣＡＲは、記載されているいずれかを含む抗原に特異的な抗体、例えば、ｓｃＦｖなどの抗体断片、ＣＤ２８の膜貫通部分である膜貫通ドメインもしくはＣＤ２８の膜貫通部分を含有する膜貫通ドメインまたはその機能性変異体、およびＣＤ２８のシグナル伝達部分を含有する細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能性変異体、およびＣＤ３ゼータのシグナル伝達部分またはその機能性変異体を含有する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、記載されているいずれかを含む抗原に特異的な抗体、例えば、ｓｃＦｖなどの抗体断片、ＣＤ２８の膜貫通部分である膜貫通ドメインもしくはＣＤ２８の膜貫通部分を含有する膜貫通ドメインまたはその機能性変異体、および４－１ＢＢのシグナル伝達部分を含有する細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能性変異体、およびＣＤ３ゼータのシグナル伝達部分またはその機能性変異体を含有する。一部のそのような実施形態では、受容体は、ヒトＩｇ分子などのＩｇ分子の一部、例えばＩｇヒンジ、例えばＩｇＧ４ヒンジを含有するスペーサー、例えばヒンジのみのスペーサーをさらに含む。
一部の実施形態では、組換え受容体、例えばＣＡＲの膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメイン（例えば、アクセッション番号Ｐ０１７４７．１）もしくはその変異体、例えば、配列番号９５に記載されたアミノ酸の配列、または配列番号９５に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を示アミノ酸の配列を含む膜貫通ドメインであるか、またはこれを含む；一部の実施形態では、組換え受容体の一部を含有する膜貫通ドメインは、配列番号９６に記載されたアミノ酸の配列、またはそれに対して少なくとももしくは約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。
一部の実施形態では、組換え受容体、例えばＣＡＲの細胞内シグナル伝達成分は、ヒトＣＤ２８の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能性変異体もしくは部分、例えば、天然のＣＤ２８タンパク質の１８６～１８７位にＬＬからＧＧへの置換を有するドメインを含有する。例えば、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号９７もしくは９８に記載されたアミノ酸の配列、または配列番号９７もしくは９８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を含むことができる。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、４－１ＢＢの細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、アクセッション番号Ｑ０７０１１．１）またはその機能性変異体もしくは部分、例えば、配列番号９９に記載されたアミノ酸の配列、または配列番号９９に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。
一部の実施形態では、組換え受容体、例えばＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ゼータ刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能性変異体、例えば、ヒトＣＤ３ζのアイソフォーム３の１１２ ＡＡ細胞質ドメイン（アクセッション番号：Ｐ２０９６３．２）、または米国特許第７，４４６，１９０号もしくは米国特許第８，９１１，９９３号に記載のＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。例えば、一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１００、１０１もしくは１０２に記載されるアミノ酸の配列、または配列番号１００、１０１もしくは１０２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。
一部の態様では、スペーサーは、ＩｇＧのヒンジ領域のみ、例えば、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１のヒンジのみ、例えば、配列番号８１に記載されたヒンジのみのスペーサーを含有する。他の実施形態では、スペーサーは、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインに適宜連結されたＩｇヒンジ、例えばＩｇＧ４由来ヒンジであるか、またはこれを含有する。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号８４に記載されたような、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに連結されたＩｇヒンジ、例えばＩｇＧ４ヒンジである。一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号８３に記載されたような、ＣＨ３ドメインのみに連結されたＩｇヒンジ、例えばＩｇＧ４ヒンジである。一部の実施形態では、スペーサーは、グリシン－セリンリッチ配列または公知のフレキシブルリンカーなどの他のフレキシブルリンカーであるか、またはこれを含む。
例えば、一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗体、例えば、ｓｃＦｖを含む抗体断片、スペーサー、例えば、重鎖分子のヒンジ領域および／または１つまたは複数の定常領域などの免疫グロブリン分子の一部を含有するスペーサー、例えばＩｇヒンジ含有スペーサー、ＣＤ２８由来膜貫通ドメインの全体または部分を含有する膜貫通ドメイン、ＣＤ２８由来細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗体またはｓｃＦｖなどの断片、Ｉｇヒンジ含有スペーサーのいずれかなどのスペーサー、ＣＤ２８由来膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ由来細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ゼータ由来シグナル伝達ドメインを含む。
例示的なサロゲートマーカーは、細胞表面ポリペプチドの切断型、例えば、非機能性であり、シグナルもしくは通常は細胞表面ポリペプチドの完全長型によって形質導入されるシグナルを形質導入しないもしくはすることができない、および／または内在化しないもしくはすることができない切断型を挙げることができる。例示的な切断型細胞表面ポリペプチドには、増殖因子または他の受容体の切断型、例えば、切断型ヒト上皮成長因子受容体２（ｔＨＥＲ２）、切断型上皮成長因子受容体（ｔＥＧＦＲ、配列番号４３または４４に記載された例示的なｔＥＧＦＲ配列）、または前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）もしくはその改変型が挙げられる。ｔＥＧＦＲは、抗体セツキシマブ［Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）］または他の治療用抗ＥＧＦＲ抗体もしくは結合分子によって認識されるエピトープを含有してもよく、該抗体または結合分子は、ｔＥＧＦＲコンストラクトおよびコードされた外因性タンパク質を発現するように操作された細胞を同定もしくは選択する、ならびに／またはコードされた外因性タンパク質を発現する別々の細胞を排除するのに使用され得る。［米国特許第８，８０２，３７４号およびLiu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434を参照］。一部の態様では、マーカー、例えばサロゲートマーカーは、ＣＤ３４、ＮＧＦＲ、ＣＤ１９もしくは切断ＣＤ１９、例えば切断型非ヒトＣＤ１９、または上皮成長因子受容体（例えば、ｔＥＧＦＲ）の全体または部分（例えば、切断型）を含む。一部の実施形態では、マーカーは、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、例えばスーパーフォールドＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、例えば、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄまたはＤｓＲｅｄ２、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、高感度青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ならびに蛍光タンパク質の種変異体、単量体変異体、およびコドン最適化および／または増強された変異体を含むそれらの変異体であるか、またはこれらを含む。一部の実施形態では、マーカーは、ルシフェラーゼ、大腸菌由来のｌａｃＺ遺伝子、アルカリホスファターゼ、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの酵素であるか、またはこれらを含む。例示的な発光レポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）またはそれらの変異体が挙げられる。
一部の実施形態では、マーカーは、耐性マーカーまたは選択マーカーである。一部の実施形態では、耐性マーカーまたは選択マーカーは、外因性薬剤または薬物に対する耐性を与えるポリペプチドであるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、耐性マーカーまたは選択マーカーは抗生物質耐性遺伝子である。一部の実施形態では、耐性マーカーまたは選択マーカーは、哺乳動物細胞に抗生物質耐性を与える抗生物質耐性遺伝子である。一部の実施形態では、耐性マーカーまたは選択マーカーは、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジェネティシン耐性遺伝子、もしくはゼオシン耐性遺伝子、またはそれらの改変型であるか、またはこれらを含む。
一部の実施形態では、マーカーをコードする核酸は、切断可能なリンカー配列、例えばＴ２Ａなどのリンカー配列をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結される。例えば、マーカー、および適宜リンカー配列は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１４０３１６８７に開示されているいずれかであってもよい。
一部の実施形態では、そのようなＣＡＲコンストラクトをコードする核酸分子は、例えばＣＡＲをコードする配列の下流に、Ｔ２Ａリボソームスキップエレメントおよび／またはｔＥＧＦＲ配列をコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、該配列は、配列番号４７もしくは４８に記載されたＴ２Ａリボソームスキップエレメント、または配列番号４７もしくは４８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列をコードする。
一部の実施形態では、抗原受容体（例えば、ＣＡＲ）を発現するＴ細胞は、非免疫原性選択エピトープとして切断型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）を発現するように生成することもでき（例えば、同じコンストラクトから２つのタンパク質を発現するようにＴ２Ａリボソームスイッチによって隔てられたＣＡＲおよびＥＧＦＲｔをコードするコンストラクトの導入によって）、次いでｔＥＧＦＲは、そのような細胞を検出するマーカーとして使用することができる（例えば、米国特許第８，８０２，３７４号を参照）。一部の実施形態では、配列は、配列番号４３もしくは４４に記載されたｔＥＧＦＲ配列、または配列番号４３もしくは４４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列をコードする。一部の場合には、ペプチド、例えば、Ｔ２Ａは、リボソームが２ＡエレメントのＣ末端におけるペプチド結合の合成をスキップ（リボソームスキッピング）することをもたらし、２Ａ配列の末端と下流の次のペプチドとの分離をもたらし得る（例えば、de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004)およびdeFelipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)を参照されたい）。多数の２Ａエレメントが公知である。本明細書に開示された方法および核酸において使用することができる２Ａ配列の例には、米国特許公開第２００７０１１６６９０号に記載の口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ、例えば、配列番号４５）、Ａ型ウマ鼻炎ウイルス（Ｅ２Ａ、例えば、配列番号４６）、トセア・アシグナウイルス（Ｔ２Ａ、例えば、配列番号４７または４８）、およびブタテッショウウイルス－１（Ｐ２Ａ、例えば、配列番号４９または５０）由来の２Ａ配列が挙げられるが、これらに限定されない。
対象に投与される細胞によって発現された組換え受容体、例えば、ＣＡＲは一般に、処置されている疾患または状態またはその細胞において発現される、それと関連している、および／またはそれに対して特異的である分子を認識する、または特異的に結合する。受容体は、分子、例えば、抗原へ特異的に結合すると、一般に、免疫賦活性シグナル、例えば、ＩＴＡＭが形質導入されたシグナルを細胞中に送達し、それによって、疾患または状態に標的化された免疫応答を促進する。例えば、一部の実施形態では、細胞は、疾患もしくは状態の、または疾患もしくは状態と関連する細胞または組織によって発現された抗原に特異的に結合するＣＡＲを発現する。
２．キメラ自己抗体受容体（ＣＡＡＲ）
一部の実施形態では、組換え受容体はキメラ自己抗体受容体（ＣＡＡＲ）である。一部の実施形態では、ＣＡＡＲは、自己抗体に結合する、例えば特異的結合するか、または認識する。一部の実施形態では、ＣＡＡＲを発現する細胞、例えば、ＣＡＡＲを発現するように操作されたＴ細胞は、正常な抗体発現細胞ではなく自己抗体発現細胞に結合し、これを死滅させるのに使用することができる。一部の実施形態では、ＣＡＡＲ発現細胞は、自己免疫疾患などの、自己抗原の発現に関連する自己免疫疾患を処置するのに使用することができる。一部の実施形態では、ＣＡＡＲ発現細胞は、最終的に自己抗体を生成しおよびその細胞表面に自己抗体を提示するＢ細胞を標的化し、治療介入のための疾患特異的標的としてこれらのＢ細胞をマークすることができる。一部の実施形態では、ＣＡＡＲ発現細胞は、抗原特異的キメラ自己抗体受容体を使用して疾患を引き起こすＢ細胞を標的化することによって、自己免疫疾患における病原性Ｂ細胞を効率的に標的化し、死滅させるのに使用することができる。一部の実施形態では、組換え受容体は、米国特許出願公開番号ＵＳ ２０１７／００５１０３５に記載されているいずれかなどのＣＡＡＲである。
一部の実施形態では、ＣＡＡＲは、自己抗体結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および１つまたは複数の細胞内シグナル伝達領域またはドメイン（互換的に細胞質シグナル伝達ドメインまたは領域とも呼ばれる）を含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達領域は細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、Ｔ細胞において一次活性化シグナルを刺激および／または誘導することができるシグナル伝達ドメイン、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）成分のシグナル伝達ドメイン［例えば、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内シグナル伝達ドメインもしくは領域、またはその機能性変異体もしくはシグナル伝達部分］、および／または免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含むシグナル伝達ドメインであるか、またはこれらを含む。
一部の実施形態では、自己抗体結合ドメインは自己抗原またはその断片を含む。自己抗原の選択は、標的化される自己抗体のタイプに依存し得る。例えば、自己抗原は、特定の疾患状態、例えば、自己抗体媒介自己免疫疾患などの自己免疫疾患に関連する、Ｂ細胞などの標的細胞上の自己抗体を認識することができるため、自己抗原が選択され得る。一部の実施形態では、自己免疫疾患は尋常性天疱瘡（ＰＶ）を含む。例示的な自己抗原には、デスモグレイン１（Ｄｓｇ１）およびＤｓｇ３が挙げられる。
３．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
一部の実施形態では、標的ポリペプチド、例えば、腫瘍タンパク質、ウイルスタンパク質または自己免疫タンパク質の抗原のペプチドエピトープまたはＴ細胞エピトープを認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその抗原結合部分を発現する、Ｔ細胞などの操作された細胞が提供される。一部の実施形態では、操作された細胞は、開示される方法のいずれかに従って生成される。一部の実施形態では、例えば、細胞のオンカラム形質導入を含む開示される方法は、細胞、例えば、Ｔ細胞を、標的ポリペプチド、例えば、腫瘍タンパク質、ウイルスタンパク質または自己免疫タンパク質の抗原のペプチドエピトープまたはＴ細胞エピトープを認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその抗原結合性部分を発現するように操作することを含む。
一部の実施形態では、「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」は、可変αおよびβ鎖（それぞれ、ＴＣＲαおよびＴＣＲβとしても知られる）もしくは可変γおよびδ鎖（それぞれ、ＴＣＲαおよびＴＣＲβとしても知られる）、またはそれらの抗原結合部分を含有し、ＭＨＣ分子に結合したペプチドに特異的に結合することができる分子である。一部の実施形態では、ＴＣＲはαβ型である。典型的には、αβ型およびγδ型で存在するＴＣＲは概ね構造的に類似しているが、それらを発現するＴ細胞は異なる解剖学的位置または機能を有し得る。ＴＣＲは、細胞の表面でまたは可溶型で見出され得る。一般に、ＴＣＲは、Ｔ細胞（またはＴリンパ球）の表面で見出され、一般に、そこで主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に関与している。
特に明記しない限り、用語「ＴＣＲ」は、完全なＴＣＲおよびその抗原結合部分または抗原結合性断片を包含すると理解されるべきである。一部の実施形態では、ＴＣＲは、αβ型またはγδ型のＴＣＲを含むインタクトなまたは完全長のＴＣＲである。一部の実施形態では、ＴＣＲは、完全長ＴＣＲに満たないが、ＭＨＣ分子中の結合した特定のペプチドに結合する、例えばＭＨＣ－ペプチド複合体に結合する、抗原結合部分である。一部の例では、ＴＣＲの抗原結合部分または断片は、完全長またはインタクトなＴＣＲの構造ドメインの一部のみを含有し得るが、完全なＴＣＲが結合するＭＨＣ－ペプチド複合体などのペプチドエピトープに依然として結合することができる。一部の例では、抗原結合部分は、特異的ＭＨＣ－ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するのに十分なＴＣＲの可変ドメイン、例えば、ＴＣＲの可変α鎖および可変β鎖を含有する。一般に、ＴＣＲの可変鎖は、ペプチド、ＭＨＣおよび／またはＭＨＣ－ペプチド複合体の認識に関与する相補性決定領域を含有する。
一部の実施形態では、ＴＣＲの可変ドメインは、一般に抗原認識および結合能および特異性に対する主要な寄与因子である、超可変ループまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。一部の実施形態では、ＴＣＲのＣＤＲまたはその組合せは、所与のＴＣＲ分子の抗原結合部位の全てまたは実質的に全てを形成する。ＴＣＲ鎖の可変領域内の様々なＣＤＲは、一般にフレームワーク領域（ＦＲ）によって隔てられ、ＣＤＲと比較してＦＲは、ＴＣＲ分子間でより少ない可変性を一般に示す（例えば、Jares et al., Proc. Nat’ l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990;Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988を参照；また、Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003も参照のこと）。一部の実施形態では、ＣＤＲ３は、抗原結合もしくは特異性に関与する主なＣＤＲであるか、または抗原認識、および／もしくはペプチド－ＭＨＣ複合体の処理されたペプチド部分との相互作用にとって、所与のＴＣＲ可変領域の３つのＣＤＲの中で最も重要である。一部の状況では、アルファ鎖のＣＤＲ１は、ある特定の抗原ペプチドのＮ末端部分と相互作用することができる。一部の状況では、ベータ鎖のＣＤＲ１は、ペプチドのＣ末端部分と相互作用することができる。一部の状況では、ＣＤＲ２は、ＭＨＣ－ペプチド複合体のＭＨＣ部分との相互作用もしくは該部分の認識に最も強く寄与するかまたは関与する主要なＣＤＲである。一部の実施形態では、β鎖の可変領域は、一般にスーパー抗原結合に関与し、抗原認識に関与しない、さらなる超可変領域（ＣＤＲ４またはＨＶＲ４）を含有することができる［Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426］。
一部の実施形態では、ＴＣＲは、定常ドメイン、膜貫通ドメインおよび／または短い細胞質テイルも含有することができる（例えば、Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997を参照）。一部の態様では、ＴＣＲの各鎖は、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびＣ末端の短い細胞質テイルを有することができる。一部の実施形態では、ＴＣＲは、シグナル伝達の媒介に関与するＤ３複合体のインバリアントタンパク質と会合する。
一部の実施形態では、ＴＣＲ鎖は１つまたは複数の定常ドメインを含有する。例えば、所与のＴＣＲ鎖（例えば、α鎖またはβ鎖）の細胞外部分は、細胞膜に隣接する２つの免疫グロブリン様ドメイン、例えば、可変ドメイン（例えば、ＶαまたはＶβ；典型的にはＫａｂａｔ番号付けに基づくアミノ酸１～１１６ Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.）および定常ドメイン（例えば、α鎖定常ドメインまたはＣα、典型的にはＫａｂａｔ番号付けに基づくα鎖の１１７～２５９位、またはβ鎖定常ドメインまたはＣβ、典型的にはＫａｂａｔに基づくβ鎖の１１７～２９５位）を含有する。例えば、一部の例では、２つの鎖によって形成されるＴＣＲの細胞外部分は２つの膜近位定常ドメイン、および２つの膜遠位可変ドメインを含有し、可変ドメインは各々ＣＤＲを含有する。ＴＣＲの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、それによってＴＣＲの２つの鎖を連結する短い連結配列を含有してもよい。一部の実施形態では、ＴＣＲが定常ドメインに２つのジスルフィド結合を有するように、ＴＣＲはαおよびβ鎖の各々に追加のシステイン残基を有してもよい。
一部の実施形態では、ＴＣＲ鎖は膜貫通ドメインを含有する。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは正に荷電される。一部の例では、ＴＣＲ鎖は細胞質テイルを含有する。一部の例では、構造がＴＣＲをＣＤ３およびそのサブユニットのような他の分子と会合させる。例えば、膜貫通領域を有する定常ドメインを含有するＴＣＲは、細胞膜にタンパク質を固定し、ＣＤ３シグナル伝達装置または複合体のインバリアントサブユニットと会合し得る。ＣＤシグナル伝達サブユニット（例えば、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３εおよびＣＤ３ζ鎖）の細胞内テイルは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能力に関与する１つまたは複数の免疫受容体チロシン活性化モチーフまたはＩＴＡＭを含有する。
一部の実施形態では、ＴＣＲは、２つの鎖αおよびβ（または適宜γおよびδ）のヘテロ二量体であってもよく、または一本鎖ＴＣＲコンストラクトであってもよい。一部の実施形態では、ＴＣＲは、ジスルフィド結合（複数可）などによって連結された２つの別々の鎖（αおよびβ鎖またはγおよびδ鎖）を含有するヘテロ二量体である。
一部の実施形態では、ＴＣＲは、実質的に完全長のコード配列が容易に利用可能なＶα、β鎖の配列などの公知のＴＣＲ配列から生成することができる。細胞源からＶ鎖配列を含む完全長ＴＣＲ配列を得る方法は周知である。一部の実施形態では、ＴＣＲをコードする核酸は、所与の細胞内のもしくは所与の細胞から単離されたＴＣＲコード核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、または市販のＴＣＲ ＤＮＡ配列の合成などによって様々な供給源から得ることができる。
一部の実施形態では、ＴＣＲは、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｔ細胞ハイブリドーマなどの細胞などの生物学的供給源、または他の市販の供給源から得られる。一部の実施形態では、Ｔ細胞はインビボで単離された細胞から得ることができる。一部の実施形態では、ＴＣＲは胸腺で選択されたＴＣＲである。一部の実施形態では、ＴＣＲはネオエピトープ拘束性ＴＣＲである。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、培養されたＴ細胞ハイブリドーマまたはクローンであってもよい。一部の実施形態では、ＴＣＲまたはその抗原結合部分もしくは抗原結合性断片は、ＴＣＲの配列の知識から合成で生成されてもよい。
一部の実施形態では、ＴＣＲは、標的ポリペプチド抗原、またはその標的Ｔ細胞エピトープに対する候補ＴＣＲのライブラリーのスクリーニングから同定または選択されたＴＣＲから生成される。ＴＣＲライブラリーは、ＰＢＭＣ、脾臓または他のリンパ器官に存在する細胞を含む対象から単離されたＴ細胞由来のＶαおよびＶβのレパートリーの増幅によって生成することができる。一部の例では、Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から増幅され得る。一部の実施形態では、ＴＣＲライブラリーがＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞から生成され得る。一部の実施形態では、ＴＣＲは健康な対象の正常なＴ細胞源から増幅され得る（すなわち、正常なＴＣＲライブラリー）。一部の実施形態では、ＴＣＲは疾患を有する対象のＴ細胞源から増幅され得る（すなわち、疾患ＴＣＲライブラリー）。一部の実施形態では、ヒトから得られたＴ細胞などの試料でのＲＴ－ＰＣＲなどによってＶαおよびＶβの遺伝子レパートリーを増幅するのに縮重プライマーが使用されてもよい。一部の実施形態では、増幅産物がリンカーによって隔てられるようにクローニングされるかまたは組み立てられるナイーブＶαおよびＶβライブラリーから、ｓｃＴｖライブラリーが組み立てられてもよい。対象および細胞供給源に応じて、ライブラリーはＨＬＡ対立遺伝子特異的であり得る。あるいは、一部の実施形態では、ＴＣＲライブラリーは、親または足場ＴＣＲ分子の変異誘発または多様化によって生成することができる。一部の態様では、ＴＣＲは、例えばαまたはＶβ鎖の変異誘発などによって定向進化に供される。一部の態様では、ＴＣＲのＣＤＲ内の特定の残基が変更される。一部の実施形態では、選択されたＴＣＲが親和性成熟によって改変され得る。一部の実施形態では、ペプチドに対するＣＴＬ活性を評価するためにスクリーニングなどによって抗原特異的Ｔ細胞が選択され得る。一部の態様では、例えば抗原特異的Ｔ細胞に存在するＴＣＲが、結合活性、例えば、抗原に対する特定の親和性またはアビディティなどによって選択され得る。
一部の実施形態では、ＴＣＲまたはその抗原結合部分は、改変または操作されたものである。一部の実施形態では、特異的ＭＨＣ－ペプチド複合体に対する親和性がより高いなど、特性が変更されたＴＣＲを生成するのに定向進化方法が使用される。一部の実施形態では、定向進化は、酵母ディスプレイ［Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92］、ファージディスプレイ［Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54］、またはＴ細胞ディスプレイ［Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84］を含むがこれらに限定されないディスプレイ方法によって達成される。一部の実施形態では、ディスプレイアプローチは、既知の親または参照ＴＣＲの操作または改変を必要とする。例えば、一部の例では、ＣＤＲの１つまたは複数の残基が変異され、所望の変更された特性、例えば、所望の標的抗原に対するより高い親和性を有する変異体が選択される変異誘発ＴＣＲを作製するための鋳型として、野生型ＴＣＲが使用され得る。
一部の実施形態では、目的のＴＣＲの作製または生成において使用するための標的ポリペプチドのペプチドは既知であるか、または容易に同定することができる。一部の実施形態では、ＴＣＲまたは抗原結合部分の生成における使用に適したペプチドは、以下に記載される標的ポリペプチドなどの目的の標的ポリペプチド中のＨＬＡ拘束性モチーフの存在に基づき決定することができる。一部の実施形態では、ペプチドは、利用可能なコンピューター予測モデルを使用して同定される。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ結合部位の予測に関するそのようなモデルには、ＰｒｏＰｒｅｄ１［Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17(12): 1236- 1237］、およびＳＹＦＰＥＩＴＨＩ［Schuler et al. (2007) 226 Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007を参照］が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＭＨＣ拘束性エピトープは、全白人の約３９～４６％で発現され、それ故に、ＴＣＲまたは他のＭＨＣ－ペプチド結合分子の調製において使用するためのＭＨＣ抗原の適切な選択となるＨＬＡ－Ａ０２０１である。
コンピューター予測モデルを使用したＨＬＡ－Ａ０２０１結合モチーフならびにプロテアソームおよび免疫プロテアソームの切断部位は公知である。ＭＨＣクラスＩ 結合部位の予測に関するそのようなモデルには、ＰｒｏＰｒｅｄ１［Singh and Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12): 1236-1237 2001により詳細に記載されている］、およびＳＹＦＰＥＩＴＨＩ［Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-93 2007を参照］挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、ＴＣＲまたはその抗原結合部分は、結合特性などの１つまたは複数の特性が変更されている組換えにより作製された天然のタンパク質またはその変異型であってもよい。一部の実施形態では、ＴＣＲは様々な動物種、例えば、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物の１つに由来してもよい。ＴＣＲは細胞結合型または可溶型であってもよい。一部の実施形態では、提供される方法の目的のために、ＴＣＲは細胞の表面で発現される細胞結合型である。
一部の実施形態では、ＴＣＲは完全長ＴＣＲである。一部の実施形態では、ＴＣＲは抗原結合部分である。一部の実施形態では、ＴＣＲは二量体ＴＣＲ（ｄＴＣＲ）である。一部の実施形態では、ＴＣＲは一本鎖ＴＣＲ（ｓｃ－ＴＣＲ）である。一部の実施形態では、ｄＴＣＲまたはｓｃＴＣＲは、ＷＯ ０３／０２０７６３、ＷＯ ０４／０３３６８５、ＷＯ２０１１／０４４１８６に記載の構造を有する。
一部の実施形態では、ＴＣＲは膜貫通配列に対応する配列を含有する。一部の実施形態では、ＴＣＲは細胞質配列に対応する配列を含有する。一部の実施形態では、ＴＣＲはＣＤ３とＴＣＲ複合体を形成することができる。一部の実施形態では、ｄＴＣＲまたはｓｃＴＣＲを含むＴＣＲのいずれかが、Ｔ細胞の表面で活性ＴＣＲを生成するシグナル伝達ドメインに連結されてもよい。一部の実施形態では、ＴＣＲは細胞の表面で発現される。
一部の実施形態ではｄＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変領域配列に対応する配列がＴＣＲα鎖定常領域細胞外配列に対応する配列のＮ末端に融合される第１のポリペプチド、およびＴＣＲβ鎖可変領域配列に対応する配列がＴＣＲβ鎖定常領域細胞外配列に対応する配列のＮ末端に融合される第２のポリペプチドを含有し、第１および第２のポリペプチドはジスルフィド結合によって連結される。一部の実施形態では、結合は、天然の二量体αβＴＣＲに存在する天然の鎖間ジスルフィド結合に対応し得る。一部の実施形態では、鎖間ジスルフィド結合は天然のＴＣＲに存在しない。例えば、一部の実施形態では、１つまたは複数のシステインがｄＴＣＲポリペプチド対の定常領域細胞外配列に組み込まれてもよい。一部の例では、天然および非天然ジスルフィド結合の両方が望ましい場合がある。一部の実施形態では、ＴＣＲは、膜に固定するための膜貫通配列を含有する。
一部の実施形態では、ｄＴＣＲは、可変αドメイン、定常αドメイン、および定常αドメインのＣ末端に結合した第１の二量体化モチーフを含有するＴＣＲα鎖、ならびに可変βドメイン、定常βドメイン、および定常βドメインのＣ末端に結合した第１の二量体化モチーフを含むＴＣＲβ鎖を含有し、第１および第２の二量体化モチーフは容易に相互作用して、第１の二量体化モチーフ中のアミノ酸と第２の二量体化モチーフ中のアミノ酸の間に共有結合を形成し、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖を連結する。
一部の実施形態では、ＴＣＲはｓｃＴＣＲである。典型的には、ｓｃＴＣＲは、公知の方法を使用して生成することができ、例えば、Soo Hoo, W. F. et al. PNAS (USA) 89, 4759 (1992);Wuelfing, C. and Plueckthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994);Kurucz, I. et al. PNAS (USA) 90 3830 (1993)；国際公開ＰＣＴ第ＷＯ９６／１３５９３号、ＷＯ９６／１８１０５号、ＷＯ９９／６０１２０号、ＷＯ９９／１８１２９号、ＷＯ０３／０２０７６３号、ＷＯ２０１１／０４４１８６号；およびSchlueter, C. J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996)を参照のこと。一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、ＴＣＲ鎖の会合を容易にするための導入された非天然ジスルフィド鎖間結合を含有する（例えば、国際公開ＰＣＴ第ＷＯ０３／０２０７６３を参照）。一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、そのＣ末端に融合された異種ロイシンジッパーが鎖の会合を容易にする非ジスルフィド連結切断型ＴＣＲである（例えば、国際公開ＰＣＴ第ＷＯ９９／６０１２０号を参照）。一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、ペプチドリンカーを介してＴＣＲβ可変ドメインに共有結合されたＴＣＲα可変ドメインを含有する（例えば、国際公開ＰＣＴ第ＷＯ９９／１８１２９号を参照）。
一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変領域に対応するアミノ酸配列によって構成される第１のセグメント、ＴＣＲβ鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合した、ＴＣＲβ鎖可変領域配列に対応するアミノ酸配列によって構成される第２のセグメント、および第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列を含有する。
一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、α鎖細胞外定常ドメイン配列のＮ末端に融合したα鎖可変領域配列によって構成される第１のセグメント、ならびに配列β鎖細胞外定常および膜貫通配列のＮ末端に融合したβ鎖可変領域配列によって構成される第２のセグメント、ならびに適宜、第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列を含有する。
一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、β鎖細胞外定常ドメイン配列のＮ末端に融合したＴＣＲβ鎖可変領域配列によって構成される第１のセグメント、ならびに配列α鎖細胞外定常および膜貫通配列のＮ末端に融合したα鎖可変領域配列によって構成される第２のセグメント、ならびに適宜、第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列を含有する。
一部の実施形態では、第１および第２のＴＣＲセグメントを連結するｓｃＴＣＲのリンカーは、ＴＣＲ結合特異性を保持しながら、単一ポリペプチド鎖を形成することができる任意のリンカーであってもよい。一部の実施形態では、リンカー配列は、例えば、式－Ｐ－ＡＡ－Ｐ－（式中、Ｐはプロリンであり、ＡＡはアミノ酸配列を表し、アミノ酸はグリシンおよびセリンである）を有し得る。一部の実施形態では、第１および第２のセグメントは対合され、その結果、それらの可変領域配列はそのような結合のために配向される。それ故に、一部の例では、リンカーは、第１のセグメントのＣ末端と第２のセグメントのＮ末端の間の距離に及ぶ十分な長さを有するか、またはその逆も同様であるが、標的リガンドへのｓｃＴＣＲの結合をブロックまたは低減するほど長くはない。一部の実施形態では、リンカーは、１０～４５個のアミノ酸または約１０～約４５個のアミノ酸、例えば１０～３０個のアミノ酸または２６～４１個のアミノ酸残基、例えば２９、３０、３１または３２個アミノ酸を含有することができる。一部の実施形態では、リンカーは、式－ＰＧＧＧ－（ＳＧＧＧＧ）５－Ｐ－（式中、Ｐはプロリンであり、Ｇはグリシンであり、Ｓはセリンである）（配列番号３８）を有する。一部の実施形態では、リンカーは、配列ＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＧＫＳ（配列番号３９）を有する。
一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、α鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基を、β鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基に連結する共有ジスルフィド結合を含有する。一部の実施形態では、天然のＴＣＲの鎖間ジスルフィド結合は存在しない。例えば、一部の実施形態では、１つまたは複数のシステインがｓｃＴＣＲポリペプチドの第１および第２のセグメントの定常領域細胞外配列に組み込まれ得る。一部の例では、天然および非天然ジスルフィド結合の両方が望ましい場合がある。
導入された鎖間ジスルフィド結合を含有するｄＴＣＲまたはｓｃＴＣＲの一部の実施形態では、天然ジスルフィド結合は存在しない。一部の実施形態では、天然の鎖間ジスルフィド結合を形成する１つまたは複数の天然システインは、別の残基、例えばセリンまたはアラニンに置換される。一部の実施形態では、導入されたジスルフィド結合は、第１および第２のセグメントの非システイン残基をシステインに変異させることによって形成されてもよい。ＴＣＲの例示的な非天然ジスルフィド結合は、公開国際ＰＣＴ番号ＷＯ２００６／０００８３０に記載されている。
一部の実施形態では、ＴＣＲまたはその抗原結合性断片は、標的抗原に対する平衡結合定常が、１０－５～１０－１２Ｍまたは約１０－５～約１０－１２Ｍおよびその中の全ての個々の値および範囲の親和性を示す。一部の実施形態では、標的抗原は、ＭＨＣ－ペプチド複合体またはリガンドである。
一部の実施形態では、αおよびβ鎖などのＴＣＲをコードする核酸は、ＰＣＲ、クローニングまたは他の適切な手段によって増幅され、適切な発現ベクターにクローニングされ得る。発現ベクターは、任意の適切な組換え発現ベクターであってもよく、任意の適切な宿主を形質転換またはトランスフェクトするのに使用することができる。適切なベクターには、増殖および拡大、もしくは発現または両方のために設計されたベクター、例えばプラスミドおよびウイルスが挙げられる。
一部の実施形態では、ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラホヤ、カリフォルニア）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ、マジソン、ウィスコンシン）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ウプサラ、スウェーデン）、またはｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、カリフォルニア）のベクターであってもよい。一部の例では、λＧ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４、およびλＮＭ１１４９などのバクテリオファージベクターも使用することができる。一部の実施形態では、植物発現ベクターが使用されてもよく、これはｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１およびｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む。一部の実施形態では、動物発現ベクターは、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭおよびｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む。一部の実施形態では、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターが使用される。
一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、標準的な組換えＤＮＡ法を使用して調製され得る。一部の実施形態では、ベクターは、必要に応じて、およびベクターがＤＮＡベースかまたはＲＮＡベースかを考慮しながら、ベクターが導入される宿主のタイプ（例えば、細菌、真菌、植物、または動物）に固有の転写および翻訳の開始および終止コドンなどの調節配列を含有することができる。一部の実施形態では、ベクターは、ＴＣＲまたは抗原結合部分（または他のＭＨＣ－ペプチド結合分子）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された非天然プロモーターを含有することができる。一部の実施形態では、プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、およびマウス幹細胞ウイルスの長末端反復で見出されるプロモーターであってもよい。他の既知のプロモーターも企図される。
一部の実施形態では、ＴＣＲをコードするベクターを生成するために、目的のＴＣＲを発現するＴ細胞クローンから単離された全ｃＤＮＡからαおよびβ鎖がＰＣＲ増幅され、発現ベクターにクローニングされる。一部の実施形態では、αおよびβ鎖は同じベクターにクローニングされる。一部の実施形態では、αおよびβ鎖は異なるベクタークローニングされる。一部の実施形態では、生成されたαおよびβ鎖は、レトロウイルス、例えばレンチウイルスのベクターに組み込まれる。
Ｂ．遺伝子工学のための核酸、ベクターおよび方法
提供された方法の一部の実施形態では、操作すること、例えば、形質導入することは、組換えタンパク質、例えば、組換え受容体またはその部分もしくは構成成分をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを導入することによって実行される。組換え受容体をコードするポリヌクレオチド、ならびにそのような核酸および／またはポリヌクレオチドを含有するベクターまたはコンストラクトも提供される。
一部の実施形態では、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドは、組換え受容体の発現を制御するように作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含有する。一部の例では、ポリヌクレオチドは、組換え受容体の発現を制御するように作動可能に連結された２つ、３つ、またはそれより多いプロモーターを含有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、適宜およびポリヌクレオチドがＤＮＡベースであるかまたはＲＮＡベースであるかを考慮して、ポリヌクレオチドが導入される宿主のタイプ（例えば、細菌、真菌、植物、または動物）に特異的な、転写および翻訳開始および終止コドンなどの調節配列を含有することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、２Ａ配列、およびスプライスアクセプターまたはドナーなどの調節／制御エレメントを含有することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、組換え受容体および／または１つもしくは複数の追加のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した非天然プロモーターを含有することができる。一部の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡ ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの中から選択される。一部の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０初期領域またはアデノウイルス主要後期プロモーター）によって認識される。別の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（例えば、Ｕ６またはＨ１プロモーター）によって認識される。一部の実施形態では、プロモーターは、非ウイルスプロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーターなどのウイルスプロモーター、およびマウス幹細胞ウイルスの長末端反復で見出されるプロモーターであってもよい。他の既知のプロモーターも企図される。
一部の実施形態では、プロモーターは、恒常性プロモーターであるか、またはこれを含む。例示的な恒常性プロモーターには、例えば、サルウイルス４０初期プロモーター（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ）、ヒトユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ヒト伸長因子１αプロモーター（ＥＦ１α）、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーター（ＰＧＫ）、およびＣＭＶ初期エンハンサー（ＣＡＧＧ）と結合したニワトリβ－アクチンプロモーターが挙げられる。一部の実施形態では、恒常性プロモーターは合成または改変プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを有する改変ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲのＵ３領域を含有する合成プロモーターであるＭＮＤプロモーター［Challita et al. (1995) J. Virol. 69(2) :748-755を参照］であるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、プロモーターは組織特異的プロモーターである。別の実施形態では、プロモーターはウイルスプロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは非ウイルスプロモーターである。一部の実施形態では、例示的なプロモーターには、ヒト伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーターもしくはその改変型、またはＭＮＤプロモーターを挙げることができるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、プロモーターは調節されたプロモーター（例えば、誘導性プロモーター）である。一部の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、Ｌａｃオペレーター配列、テトラサイクリンオペレーター配列、ガラクトースオペレーター配列もしくはドキシサイクリンオペレーター配列を含むか、もしくはそのアナログであるか、またはＬａｃリプレッサーもしくはテトラサイクリンリプレッサー、もしくはそのアナログによって結合もしくは認識されることができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、調節エレメント、例えばプロモーターを含まない。
一部の場合には、組換え受容体をコードする核酸配列は、シグナルペプチドをコードするシグナル配列を含有する。一部の態様では、シグナル配列は、天然ポリペプチドに由来するシグナルペプチドをコードする場合がある。他の態様では、シグナル配列は、異種または非天然シグナルペプチド、例えば、配列番号４０に示され、配列番号４１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＧＭＣＳＦＲアルファ鎖の例示的シグナルペプチドをコードする場合がある。一部の場合には、組換え受容体、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列は、シグナルペプチドをコードするシグナル配列を含有する。限定されない例示的シグナルペプチドには、例えば、配列番号４０に示され、配列番号４０に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＧＭＣＳＦＲアルファ鎖シグナルペプチドまたは配列番号４２に示されるＣＤ８アルファシグナルペプチドが挙げられる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つもしくは複数の追加のポリペプチド、例えば、１つもしくは複数のマーカーおよび／または１つもしくは複数のエフェクター分子をコードする核酸配列を含有する。一部の実施形態では、１つまたは複数のマーカーには、形質導入マーカー、サロゲートマーカーおよび／または耐性マーカーまたは選択マーカーが挙げられる。例えば１つまたは複数の追加のポリペプチドをコードする、導入される追加の核酸配列の中には、移入された細胞の生存能および／または機能の促進などによって治療の有効性を改善することができる核酸配列；細胞の選択および／または評価のための遺伝子マーカーを提供するための、例えば、インビボ生存または局在化を評価するための核酸配列；Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991);およびRiddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)によって記載される（ドミナントポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーとの融合から得られる二機能性選択融合遺伝子の使用を記載するＷＯ１９９２００８７９６およびＷＯ１９９４０２８１４３、ならびに米国特許第６，０４０，１７７号も参照）、例えばインビボでのネガティブ選択に対して細胞を感受性にすることによる、安全性を改善するための核酸配列が挙げられる。
一部の実施形態では、マーカーは、形質導入マーカーまたはサロゲートマーカーである。形質導入マーカーまたはサロゲートマーカーは、ポリヌクレオチド、例えば、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを導入された細胞を検出するのに使用することができる。一部の実施形態では、形質導入マーカーは、細胞の改変を示すまたは確認することができる。一部の実施形態では、サロゲートマーカーは、細胞表面で組換え受容体、例えばＣＡＲと共発現されるように作られるタンパク質である。特定の実施形態では、そのようなサロゲートマーカーは、活性をほとんどまたは全く有さないように改変された表面タンパク質である。ある特定の実施形態では、サロゲートマーカーは組換え受容体をコードする同じポリヌクレオチドにコードされる。一部の実施形態では、組換え受容体をコードする核酸配列は、マーカーをコードする核酸配列に作動可能に連結され、適宜、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチド、例えば２Ａ配列をコードする核酸によって隔てられる。外因性マーカー遺伝子は、一部の例では細胞の検出または選択を可能にするために、ならびに一部の例では、細胞排除および／または細胞自殺も促進するために、操作された細胞に関連して利用され得る。
例示的サロゲートマーカーには、細胞表面ポリペプチドの切断型、例えば、非機能性であり、シグナルもしくは通常は細胞表面ポリペプチドの完全長型によって形質導入されるシグナルを形質導入しないもしくはすることができない、および／または内在化しないもしくはすることができない切断型を挙げることができる。例示的な切断型細胞表面ポリペプチドには、増殖因子または他の受容体の切断型、例えば、切断型ヒト上皮増殖因子受容体２（ｔＨＥＲ２）、切断型上皮増殖因子受容体（ｔＥＧＦＲ、配列番号４３または４４に記載された例示的なｔＥＧＦＲ配列）、または前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）もしくはその改変型、例えば切断型ＰＳＭＡ（ｔＰＳＭＡ）が挙げられる。一部の態様では、ｔＥＧＦＲは、抗体セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））または他の治療用抗ＥＧＦＲ抗体もしくは結合分子によって認識されるエピトープを含有してもよく、該抗体または結合分子は、ｔＥＧＦＲコンストラクトおよびコードされた外因性タンパク質で操作された細胞を同定もしくは選択する、ならびに／またはコードされた外因性タンパク質を発現する細胞を排除もしくは分離するのに使用され得る。米国特許第８，８０２，３７４号およびLiu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434を参照）。一部の態様では、マーカー、例えばサロゲートマーカーは、ＣＤ３４、ＮＧＦＲ、ＣＤ１９もしくは切断ＣＤ１９、例えば切断型非ヒトＣＤ１９の全体または部分（例えば、切断型）を含む。切断型ＥＧＦＲ（例えば、ｔＥＧＦＲ）の例示的なポリペプチドは、配列番号４３もしくは４４に記載されたアミノ酸の配列、または配列番号４３もしくは４４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。
一部の実施形態では、マーカーは、検出可能なタンパク質、例えば蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、例えばスーパーフォールドＧＦＰ（ｓｕｐｅｒ－ｆｏｌｄ ＧＦＰ）（ｓｆＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、例えば、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄまたはＤｓＲｅｄ２、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、高感度青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ならびに蛍光タンパク質の種変異体、単量体変異体、コドン最適化され、安定化され、および／または増強された変異体を含むそれらの変異体であるか、またはこれらを含む。一部の実施形態では、マーカーは、ルシフェラーゼ、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）由来のｌａｃＺ遺伝子、アルカリホスファターゼ、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの酵素であるか、またはこれらを含む。例示的な発光レポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）またはそれらの変異体が挙げられる。一部の態様では、酵素の発現は、発現時に検出され得る基質の添加および酵素の機能的活性によって検出することができる。
一部の実施形態では、マーカーは、耐性マーカーまたは選択マーカーである。一部の実施形態では、耐性マーカーまたは選択マーカーは、外因性の薬剤または薬物に対する耐性を与えるポリペプチドであるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、耐性マーカーまたは選択マーカーは抗生物質耐性遺伝子である。一部の実施形態では、耐性マーカーまたは選択マーカーは、哺乳動物細胞に抗生物質耐性を与える抗生物質耐性遺伝子である。一部の実施形態では、耐性マーカーまたは選択マーカーは、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジェネティシン耐性遺伝子、もしくはゼオシン耐性遺伝子、またはそれらの改変型であるか、またはこれらを含む。
本明細書に記載されたいずれの組換え受容体および／または追加のポリペプチドも、組換え受容体をコードする１つまたは複数の核酸配列を任意の組み合わせ、配向または配置で含有する１つまたは複数のポリヌクレオチドによってコードされ得る。例えば、１つ、２つ、３つまたはそれより多いポリヌクレオチドが、１つ、２つ、３つもしくはそれより多い異なるポリペプチド、例えば、組換え受容体もしくはその部分もしくは成分、ならびに／または１つもしくは複数の追加のポリペプチド、例えば、マーカーおよび／もしくはエフェクター分子をコードしてもよい。一部の実施形態では、１つのポリヌクレオチドが、組換え受容体、例えばＣＡＲ、またはその部分もしくは成分をコードする核酸配列、および１つまたは複数の追加のポリペプチドをコードする核酸配列を含有する。一部の実施形態では、１つのベクターまたはコンストラクトが、組換え受容体、例えばＣＡＲ、またはその部分もしくは成分をコードする核酸配列を含有し、別々のベクターまたはコンストラクトが、１つまたは複数の追加のポリペプチドをコードする核酸配列を含有する。一部の実施形態では、組換え受容体をコードする核酸配列および１つまたは複数の追加のポリペプチドをコードする核酸配列は、２つの異なるプロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、組換え受容体をコードする核酸は、１つまたは複数の追加のポリペプチドをコードする核酸の上流に存在する。一部の実施形態では、組換え受容体をコードする核酸は、１つまたは複数の追加のポリペプチドをコードする核酸の下流に存在する。
ある特定の場合において、１つのポリヌクレオチドが、２つまたはそれより多い異なるポリペプチド鎖、例えば、組換え受容体および１つまたは複数の追加のポリペプチド、例えば、マーカーおよび／またはエフェクター分子をコードする核酸配列を含有する。一部の実施形態では、２つまたはそれより多い異なるポリペプチド鎖、例えば、組換え受容体および１つまたは複数の追加のポリペプチドをコードする核酸配列は、２つの別々のポリヌクレオチドに存在する。例えば、２つの別々のポリヌクレオチドが提供され、それぞれは、細胞での発現のために個々に細胞に移入または導入され得る。一部の実施形態では、マーカーをコードする核酸および組換え受容体をコードする核酸は、細胞のゲノム内の異なる位置に存在するか、または挿入される。一部の実施形態では、マーカーをコードする核酸および組換え受容体をコードする核酸は、２つの異なるプロモーターに作動可能に連結される。
一部の実施形態、例えば、ポリヌクレオチドが第１および第２の核酸配列を含有する実施形態では、異なるポリペプチド鎖の各々をコードするコード配列は、同じであってもまたは異なっていてもよいプロモーターに作動可能に連結され得る。一部の実施形態では、核酸分子は、２つまたはそれより多い異なるポリペプチド鎖の発現を駆動するプロモーターを含有することができる。一部の実施形態では、そのような核酸分子は、マルチシストロニック（バイシストロニックまたはトリシストロニック、例えば、米国特許第６，０６０，２７３号を参照）であり得る。一部の実施形態では、組換え受容体をコードする核酸および１つまたは複数の追加のポリペプチドをコードする核酸配列は、同じプロモーターに作動可能に連結され、適宜、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、または自己切断ペプチドもしくはリボソームスキッピングを引き起こすペプチド、例えば２Ａエレメントをコードする核酸によって隔てられる。例えば、例示的なマーカー、および適宜リボソームスキッピング配列は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１４０３１６８７に開示されるいずれかであってもよい。
一部の実施形態では、転写ユニットは、単一のプロモーターからのメッセージによる遺伝子産物（例えば、組換え受容体および追加のポリペプチドをコードする）の共発現を可能にするＩＲＥＳを含有する、バイシストロニックユニットとして操作することができる。あるいは、一部の例では、単一のプロモーターが、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中に、自己切断ペプチド（例えば、２Ａ配列）またはプロテアーゼ認識部位（例えば、フューリン）をコードする配列によって互いに隔てられた２つまたは３つの遺伝子（例えば、マーカーをコードする、および組換え受容体をコードする）を含有するＲＮＡの発現を指示してもよい。ＯＲＦは故に、翻訳中（２Ａの場合）または翻訳後のどちらかに、個々のタンパク質にプロセシングされる単一ポリペプチドをコードする。一部の例では、Ｔ２Ａなどのペプチドは、２ＡエレメントのＣ末端におけるペプチド結合の合成をリボソームにスキップさせ（リボソームスキッピング）、２Ａ配列の末端と下流の次のペプチドの間に分離をもたらすことができる［例えば、de Felipe,遺伝子 Vaccines and Ther. 2:13 (2004)およびde Felipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)を参照］。様々な２Ａエレメントが知られている。本明細書に開示された方法およびシステムにおいて使用することができる２Ａ配列の例には、米国特許公開第２００７０１１６６９０号に記載の口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ、例えば配列番号４５）、Ａ型ウマ鼻炎ウイルス（Ｅ２Ａ、例えば配列番号４６）、トセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（Ｔ２Ａ、例えば、配列番号４７または４８）、およびブタテッショウウイルス－１（Ｐ２Ａ、例えば、配列番号４９または５０）由来の２Ａ配列が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、組換え受容体および／または追加のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ベクターに含有されるか、または１つもしくは複数のベクターにクローニングすることができる。一部の実施形態では、１つまたは複数のベクターは、宿主細胞、例えば、操作用の細胞を形質転換またはトランスフェクトするのに使用することができる。例示的なベクターには、導入、増殖および拡大のため、もしくは発現のため、またはその両方のために設計されたベクター、例えば、プラスミドおよびウイルスベクターが挙げられる。一部の態様では、ベクターは、発現ベクター、例えば組換え発現ベクターである。一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、標準的な組換えＤＮＡ法を使用して調製することができる。
一部の実施形態では、ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラホヤ、カリフォルニア）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ、マジソン、ウィスコンシン）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ウプサラ、スウェーデン）、またはｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、カリフォルニア）のベクターであってもよい。一部の例では、λＧ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４、およびλＮＭ１１４９などのバクテリオファージベクターも使用され得る。一部の実施形態では、植物発現ベクターが使用されてもよく、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１およびｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。一部の実施形態では、動物発現ベクターには、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭおよびｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。
一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターである。一部の実施形態では、組換え受容体および／または追加のポリペプチド（複数可）をコードするポリヌクレオチドは、レトロウイルスもしくはレンチウイルスベクターを介して、またはトランスポゾンを介して細胞に導入される［例えば、Baum et al. (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13:1050-1063；Frecha et al. (2010) Molecular Therapy 18:1748-1757;およびHackett et al. (2010) Molecular Therapy 18:674-683を参照］。
一部の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する例えばベクターなどの組換え感染性ウイルス粒子を使用して細胞に導入される。一部の実施形態では、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、組換えレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、例えばガンマ－レトロウイルスベクターを使用してＴ細胞に導入される（例えば、Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10. 1038/gt.2014.25;Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28( 10): 1137-46;Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93;Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557を参照）。
一部の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクターである。一部の態様では、レトロウイルスベクターは、長鎖末端リピート配列（ＬＴＲ）、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）、マウス胚性幹細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するレトロウイルスベクターを有する。ほとんどのレトロウイルスベクターは、マウスレトロウイルスに由来する。一部の実施形態では、レトロウイルスは、任意のトリまたは哺乳動物細胞源から得られたものを含む。レトロウイルスは、典型的には、広宿主性であり、それは、それらが、人間を含むいくつかの種の宿主細胞を感染させることができることを意味する。一実施形態において、発現される遺伝子は、レトロウイルスのｇａｇ、ｐｏｌ、および／またはｅｎｖ配列を置き換える。多くの例示的レトロウイルスシステムが、記載されている（例えば、U.S. Pat. Nos. 5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; and Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109）。
一部の実施形態では、組換え受容体および／または追加のポリペプチド（複数可）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド（複数可）またはベクター（複数可）は、溶出、培養、および／または拡大増殖の前に、細胞、例えば、Ｔ細胞に導入される。ポリヌクレオチド（複数可またはベクター（複数可）の導入は、任意の好適なレトロウイルスベクターを用いて実施することができる。一部の実施形態では、操作の後で、結果として得られる遺伝子操作された細胞は、初期刺激（例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激）、またはその後に、第２のタイプの刺激（例えば、デ・ノボ導入組換え受容体を介する）の存在下において刺激され得る。この第２のタイプの刺激は、ペプチド／ＭＨＣ分子、遺伝的に導入された受容体の同族（交差連結）リガンド（例えば、ＣＡＲの天然抗原および／またはリガンド）、あるいは、新しい受容体のフレームワーク内において直接結合する（例えば、受容体内の定常領域を認識することによって）任意のリガンド（例えば、抗体など）の形態の抗原刺激を含み得る。例えば、Cheadle et al, "Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy" Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 or Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014)を参照されたい。
一部の場合には、細胞、例えば、Ｔ細胞が活性化されることを必要としないベクターが使用され得る。いくつかのそのような例において、細胞は、活性化の前に、選択および／または形質導入され得る。
ＩＩＩ．細胞選択、刺激、および／または操作のためのデバイスおよびキット
カラムクロマトグラフィーの固定相上において標的細胞（例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、またはＣＤ８＋Ｔ細胞）を選択、刺激、および／または形質導入する方法、例えば、提供される方法など、における使用のためのデバイスおよびキットであって、刺激が、細胞選択のために使用される分子（すなわち、選択マーカー）の下方制御を促進し、結果として、固定相からの細胞の自然発生的脱離を生じる、方法およびキットも、本明細書において提供される。一部の実施形態では、クロマトグラフィーカラムの固定相は、標的細胞表面上の分子（例えば、選択マーカー）に特異的に結合することができる薬剤（例えば、選択剤）によって機能化される。この方式において、選択マーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８）を含有する標的細胞を含む試料を固定相と組み合わせた場合、標的細胞（例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞）は、固定相に間接的に固定化される。例示的選択剤および選択試薬は、節Ｉ－Ｂ－１およびＩ－Ｂ－２に記載される。特定の態様において、標的細胞（例えば、Ｔ細胞）は、例えば、刺激剤、および／または刺激剤を含む刺激試薬の添加によって、ならびに／あるいは固定相上に直接的または間接的に結合した刺激剤によって、固定相上に固定化されたまま、刺激される（例えば、オンカラム刺激）。例示的刺激剤および刺激剤を含む刺激試薬（例えば、オリゴマー性刺激試薬）は、節Ｉ－Ｂ－１およびＩ－Ｂ－２に記載される。特定の態様において、標的細胞（例えば、Ｔ細胞）は、例えば、ウイルスベクター粒子の添加によって、固定相上に固定化されたまま、形質導入され、例えば、同時に活性化および形質導入される（例えば、オンカラム刺激）。例示的ウイルスベクター粒子は、節Ｉ－Ｃ－３に記載される。したがって、一部の態様では、提供される方法および他の実施形態は、それらが、複数の処理工程（例えば、選択、刺激、および形質導入）を圧縮し、ならびに、圧縮されたプロセスを、増加した効率および無菌性を提供することができる同じ容器および／または閉鎖されたシステム内において行うことを可能にする点において有利である。
ある特定の態様において、提供されるデバイスおよび方法は、標的細胞（例えば、Ｔ細胞）に刺激シグナルを送達することができる刺激剤を含むオリゴマー性刺激試薬の使用を伴う。例えば、外因性増殖因子の不存在下または少量の外因性増殖因子の存在下で、インビトロにおいてＴ細胞を刺激する際に使用するための既存の試薬は既知である（例えば、米国特許第６，３５２，６９４号Ｂ１および欧州特許第０７００４３０号Ｂ１を参照されたい）。概して、そのような試薬は、様々な結合剤（例えば、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体）が固定化された、１μｍ超の直径のビーズ、例えば、磁性ビーズ、を採用し得る。しかしながら、一部の場合には、そのような磁性ビーズは、例えば、臨床試験または治療目的のために必要とされる条件下において細胞を刺激するための方法に統合することが困難であり、その理由は、これらの磁性ビーズが拡大増殖されたＴ細胞を対象に投与する前に、完全に除去されることを確実にしなければならないためである。一部の態様では、例えば、細胞を磁場に曝露させるなどによる、そのような除去は、細胞療法に利用可能な生存細胞の収量を減少させ得る。ある特定の場合において、そのような試薬、例えば、磁性ビーズを含有する刺激試薬は、刺激試薬からのＴ細胞の十分な量の脱離を可能にする最小限の時間において、細胞と共にインキュベートされなければならない。さらに、そのようなビーズなどの試薬は、物理的制限によりカラムクロマトグラフィーと、容易には適合しない。
オリゴマー性刺激試薬を用いる本明細書において提供されるデバイスおよび方法は、そのような潜在的制限を克服する。例えば、一部の実施形態では、提供される方法は、刺激を開始するために、固体支持体（例えば、ビーズ）に結合していない可溶性のオリゴマー性試薬の、固定相への添加を含む。一部の実施形態では、方法によって生成または製造された残留試薬アウトプット細胞のリスクは、オリゴマー性試薬の使用よって低減または回避され、その理由は、競合試薬または遊離結合剤の添加を使用することにより、細胞から刺激剤を含むオリゴマー性刺激試薬を解離（例えば、結合を破壊）させることができるためである。一部の実施形態では、これは、ＧＭＰ規格に準拠するプロセスは、他の方法、例えば、投与のための最終集団がビーズを含有しないことを確実にするために、追加の手順が追加されなければならないような手段と比較して、より容易に確立することができることも意味する。したがって、一部の態様では、例えば、競合剤または遊離結合剤の添加などによる、細胞からのオリゴマー性刺激試薬の除去または分離は、結果として、ビーズベースの刺激剤の除去または分離と比較して、細胞ロスをわずかにしか生じないかまたは全く生じない。一部の態様では、刺激試薬またはオリゴマー性刺激の除去または分離のタイミングは、ビーズベースの刺激試薬の除去または分離と比較して、全く制限されないかまたはわずかにしか制限されない。したがって、一部の態様では、刺激試薬またはオリゴマー性刺激試薬は、提供される方法の際の任意のタイミングまたは工程において、細胞から除去または分離され得る。
一部の態様では、提供されるデバイスは、固定相に固定化された標的細胞の単離、処理、または操作を伴う方法、例えば、細胞のオンカラム選択および／または刺激の方法、ための改良されたデバイスである。一部の態様では、提供されるデバイスは、温度の調節、例えば、固定相上に固定化された細胞の加熱を可能にする。一部の態様では、提供されるデバイスは、例えば、３７℃または約３７℃または３７℃±約５℃での、固定化された細胞の温度の維持を可能にする。一部の態様では、提供されるデバイスによる細胞の温度の調整および維持は、例えば、オンカラム刺激の際の固定化された細胞の健康全般、フィットネス、または状態を改善することによって、固定化された細胞のオンカラム刺激を向上させる。一部の態様では、提供されるデバイスは、気体の交換、例えば、固定相における空気の存在、も可能にする。一部の態様では、提供されるデバイスによって許容されるような気体の交換は、オンカラム刺激の際の固定化された細胞の健康全般、フィットネス、または状態を改善する。したがって、一部の態様では、提供されるデバイスとの併用における使用のための、オンカラム選択および／または刺激の提供される方法は、療法、例えば、自己細胞療法、における使用のための後続の操作のための、改良された、例えば、より健康な、細胞を提供する。
一部の実施形態では、本明細書において提供されるデバイスは、節Ｉに記載される方法のいずれかを実施するために使用することができる。一部の実施形態では、提供される方法は、本明細書において説明されるデバイスのいずれかを使用して実施される。
特定の態様において、提供される方法の継続期間は、インプット細胞集団または試料の細胞、例えばＴ細胞が刺激条件（例えば、節Ｉ－Ｃなど、本明細書において説明されるような）に最初に接触または曝露された時、あるいは本明細書において、刺激剤を用いたまたは刺激条件下でのインキュベーションの開始、例えば、刺激試薬への曝露が開始された時、と称される時から測定することができる。一部の実施形態では、刺激された標的細胞（例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を含むアウトプット集団（本明細書においてアウトプット組成物とも呼ばれる）を収集するために必要な継続期間は、インキュベーションの開始（例えば、刺激試薬の添加または刺激試薬への曝露）から測定される。特定の実施形態において、インキュベーションの継続期間は、２４時間、２３時間、２２時間、２１時間、２０時間、１９時間、１８時間、１７時間、１６時間、１５時間、１４時間、１３時間、１２時間、１１時間、１０時間、９時間、８時間、７時間、６時間、５時間、４時間、３時間、または２時間、あるいは約２４時間、２３時間、２２時間、２１時間、２０時間、１９時間、１８時間、１７時間、１６時間、１５時間、１４時間、１３時間、１２時間、１１時間、１０時間、９時間、８時間、７時間、６時間、５時間、４時間、３時間、または２時間、あるいは２４時間、２３時間、２２時間、２１時間、２０時間、１９時間、１８時間、１７時間、１６時間、１５時間、１４時間、１３時間、１２時間、１１時間、１０時間、９時間、８時間、７時間、６時間、５時間、４時間、３時間、または２時間未満である。一部の実施形態では、提供されるインキュベーションの継続期間は、代替のまたは既存のプロセスの、７５％、６０％、５０％、４０％、３０％、２５％、１５％、または１０％、あるいは約７５％、６０％、５０％、４０％、３０％、２５％、１５％、または１０％、あるいは７５％、６０％、５０％、４０％、３０％、２５％、１５％、または１０％未満である。
選択および刺激された細胞のアウトプット組成物は、さらに処理され得ることが本明細書において想到される。例えば、アウトプット細胞は、組換えタンパク質、例えば、キメラ抗原受容体を発現するように遺伝子操作され得、ならびに／あるいは、アウトプット細胞は、さらなるインキュベーション、刺激、拡大増殖、選択（例えば、ポリシング）、および／または製剤化を受け得る。
ある特定の実施形態において、提供されるデバイスを使用する方法は、試料、例えば、アフェレーシス、バフィーコート、または全血に対して実施される。一部の実施形態では、試料は、生物学的試料である。一部の実施形態では、生物学的試料は、ヒト対象から収集される。一部の実施形態では、生物学的試料は、ある疾患または状態を患う患者から収集される。一部の実施形態では、方法は、前に試料から単離、濃縮、または選択された細胞、例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、の集団に対して実施される。一部の実施形態では、試料または試料から単離された細胞は、低温保存されたものであり得る。
一部の実施形態では、細胞の選択、刺激、および／または操作のためのデバイス、キット、システム、および／または製造物品が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、クロマトグラフィーのための固定相の配置が提供される。一部の実施形態では、配置は、バイオリアクターをさらに含む。バイオリアクターは、細胞の拡大増殖にとって好適であり、ならびに、固定相は、細胞の分離およびオンカラム刺激にとって好適である。ある実施形態において、固定相は、ゲル濾過マトリックスおよび／またはアフィニティークロマトグラフィーマトリックスであり、この場合、ゲル濾過および／または、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、選択試薬を含み、選択試薬は、選択剤に含まれる結合パートナーＣ１に特異的に結合する結合部位Ｚ１を含み、および／または、選択試薬は、第２の選択剤に含まれる結合パートナーＣ２に特異的に結合する結合部位Ｚ２を含む。したがって、固定相は、その上への第１の選択剤および／または第２の選択剤、第１の結合パートナーＣ１および／または第２の結合パートナーＣ２、の固定相にとって好適である。さらに、バイオリアクターおよび固定相は、流体接続される。この配置は、連続拡大増殖において使用することができ、ならびに、既知の細胞拡大増殖システム、例えば、Ｑｕａｎｔｕｍ（登録商標）細胞拡大増殖システムまたはＸｕｒｉ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｗ２５など、に統合することができる。
一部の実施形態では、固定相は、クロマトグラフィーカラムに含まれる。配置は、さらに、第１の固定相に流体接続された第２の固定相を含み得る。第２の固定相は、ゲル濾過マトリックスおよび／またはアフィニティークロマトグラフィーマトリックスであり得、この場合、ゲル濾過および／またはアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、選択試薬を含み、それによって、固定相上への多量体化試薬の固定にとって好適である。このタイプの配置は、標的細胞（例えば、Ｔ細胞、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ８Ｔ細胞）の連続選択を容易にし得、この場合、カラムのうちの１つは、本明細書において説明されるようなオンカラム刺激にとっても好適である。
一部の態様では提供される実施形態は、細胞の精製（例えば、選択）および培養、例えば、刺激または拡大増殖など、のためのデバイスを対象とし、この場合、デバイスは、バイオリアクターならびに上記において定義されるようなクロマトグラフィーのための第１の固定相もしくは第２の固定相による少なくとも１つの配置を含む。
デバイスは、バイオリアクターおよび連続的に流体接続された固定相による複数の配置をさらに含み得る。
デバイスは、クロマトグラフィーのための固定相に流体接続された試料導入口を含み得る。デバイスは、精製および刺激された標的細胞のための試料導出口も含み得、試料導出口は、バイオリアクターとクロマトグラフィーのための固定相とによる最後の少なくとも１つの配置の固定相に流体接続される。
一部の実施形態では、デバイスは、機能的閉鎖されたシステムとして設計され得る。
Ａ．クロマトグラフィーハウジングアセンブリ
一部の実施形態では、本明細書において開示されるカラムクロマトグラフィーベースの細胞選択および／または刺激方法、例えば、本明細書において開示されるようなクロマトグラフィーベースの細胞形質導入、例えば、本明細書において開示されるようなオンカラム刺激と同時に実施することができる、オンカラム形質導入、を伴う方法など、にとって好適なクロマトグラフィーハウジングアセンブリ（本明細書において、カラムクロマトグラフィーのためのハウジングアセンブリまたはハウジングアセンブリとも呼ばれる）が、本明細書において提供される。クロマトグラフィーハウジングアセンブリは、クロマトグラフィーのための固定相の有無において提供され得る。
一態様において、導入口ハウジングメンバーおよび導出口ハウジングメンバーを含むカラムクロマトグラフィーのためのハウジングアセンブリであって、少なくとも導入口ハウジングメンバーおよび導出口ハウジングメンバーは、カラムクロマトグラフィーのための固定相を収容するように構成された内部空洞；内部空洞における固定相に熱を提供するように構成された温度制御メンバー；および内部空洞を気体源に作動可能に連結し、それによって、内部空洞への気体の取り込みを許容または実施するように構成されたコネクター、を形成する、カラムクロマトグラフィーのためのハウジングアセンブリが、本明細書において提供される。一態様において、カラムクロマトグラフィーのためのハウジングアセンブリは、側壁メンバーをさらに含み、この場合、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、および側壁メンバーは、内部空洞を形成する。コネクターは、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、および／または側壁メンバー上に配置することができる。コネクターは、ボンドコネクター、スクリューコネクター、ルアーコネクター（例えば、ルアーロックコネクターまたはルアースリップコネクター）、バーブコネクター、またはそれらの任意の組合せであり得る。先行の実施形態のいずれにおいて、コネクターは、気体源と流体連通されたチューブと封止係合するように構成することができる。先行の実施形態のいずれにおいて、コネクターは、１つまたは複数のフィルターを含み得、および／または、コネクターは、１つまたは複数のフィルターを含むチューブに作動可能に接続することができる。１つまたは複数のフィルターは、ガスフィルター、例えば、エアフィルターである。１つまたは複数のフィルターは、濾過による無菌化のための無菌フィルターおよび／または無菌化フィルターであり得る。一態様において、気体は、クロマトグラフィーカラムの固定相上に固定化された標的細胞の刺激の少なくとも一部の間、内部空洞内に存する。一部の態様では、気体は、空気を含む。一態様において、気体（例えば、空気）の存在下での細胞（例えば、リンパ球、例えば、Ｔ細胞など）の刺激は、細胞の活性化および細胞の下流処理、例えば、固定相からの細胞の脱離または溶出ならびに／あるいは細胞の遺伝子操作、を促進する。
一部の実施形態では、ハウジングアセンブリの内部空洞は、１ｍＬ～４０ｍＬまたは約１ｍＬ～４０ｍＬ、例えば、１～３５ｍＬ、１～３０ｍＬ、１～２５ｍＬ、１～２０ｍＬ、１～１５ｍＬ、１～１０ｍＬ、１～５ｍＬ、５～４０ｍＬ、５～３５ｍＬ、５～３０ｍＬ、５～２５ｍＬ、５～２０ｍＬ、５～１５ｍＬ、５～１０ｍＬ、１０～４０ｍＬ、１０～３５ｍＬ、１０～３０ｍＬ、１０～２５ｍＬ、１０～２０ｍＬ、１０～１５ｍＬ、１５～４０ｍＬ、１５～３５ｍＬ、１５～３０ｍＬ、１５～２５ｍＬ、１５～２０ｍＬ、２０～４０ｍＬ、２０～３５ｍＬ、２０～３０ｍＬ、２０～２５ｍＬ、２５～４０ｍＬ、２５～３５ｍＬ、２５～３０ｍＬ、３０～４０ｍＬ、３０～３５ｍＬ、または３５～４０ｍＬ、あるいは約１～３５ｍＬ、１～３０ｍＬ、１～２５ｍＬ、１～２０ｍＬ、１～１５ｍＬ、１～１０ｍＬ、１～５ｍＬ、５～４０ｍＬ、５～３５ｍＬ、５～３０ｍＬ、５～２５ｍＬ、５～２０ｍＬ、５～１５ｍＬ、５～１０ｍＬ、１０～４０ｍＬ、１０～３５ｍＬ、１０～３０ｍＬ、１０～２５ｍＬ、１０～２０ｍＬ、１０～１５ｍＬ、１５～４０ｍＬ、１５～３５ｍＬ、１５～３０ｍＬ、１５～２５ｍＬ、１５～２０ｍＬ、２０～４０ｍＬ、２０～３５ｍＬ、２０～３０ｍＬ、２０～２５ｍＬ、２５～４０ｍＬ、２５～３５ｍＬ、２５～３０ｍＬ、３０～４０ｍＬ、３０～３５ｍＬ、または３５～４０ｍＬなど、の体積の固定相を収容することができる。一部の実施形態では、ハウジングアセンブリの内部空洞は、１５～２５ｍＬまたは約１５～２５ｍＬの体積の固定相を収容することができる。一部の実施形態では、ハウジングアセンブリの内部空洞は、１５～２０ｍＬまたは約１５～２０ｍＬ体積の固定相を収容することができる。一部の実施形態では、ハウジングアセンブリの内部空洞は、１８～２０ｍＬまたは約１８～２０ｍＬの体積の固定相を収容することができる。
一部の実施形態では、カラムクロマトグラフィーのためのハウジングアセンブリは、１つまたは複数のコネクター、例えば、２つ以上のコネクター、を含む。一部の実施形態では、カラムクロマトグラフィーのためのハウジングアセンブリは、２つのコネクターを含む。一部の実施形態では、２つ以上のコネクターは、少なくとも導入口ハウジングメンバーに配置される。一部の実施形態では、２つ以上のコネクターは、少なくとも導出口ハウジングメンバーに配置される。一部の実施形態では、コネクターは、少なくとも導入口ハウジングメンバーおよび導出口ハウジングメンバーのそれぞれに配置される。一部の実施形態では、導入口ハウジングメンバーおよび導出口ハウジングメンバーの両方は、それらに配置されたコネクターを有する。
先行の実施形態のいずれにおいて、温度制御メンバーは、内部空洞における固定相の温度を調節または維持するように構成することができる。先行の実施形態のいずれにおいて、温度制御メンバーは、開始温度（例えば、室温）から、約３５℃～約３９℃の標的温度（例えば、３７℃または約３７℃において）まで、内部空洞内の固定相を加熱するように構成することができる。一部の実施形態では、温度制御メンバーは、固定相を約３０℃～約３９℃の標的温度に加熱するように構成することができる。一部の実施形態では、開始温度は、約２℃、約４℃、約８℃、約１２℃、約１６℃、約２０℃、約２４℃、約２８℃、約３２℃、約３６℃、または約３６℃以上である。一部の実施形態では、刺激のための温度は、３７℃または約３７℃である。一部の実施形態では、標的温度（例えば、細胞刺激のための最適温度）は、約２℃超、約４℃以上、約８℃以上、約１２℃以上、約１６℃以上、約２０℃以上、約２４℃以上、約２８℃以上、約３２℃以上、約３６℃以上、約３７℃以上、約３８℃以上、約３９℃以上、約４０℃以上である。一部の実施形態では、固定相上に固定化された標的細胞の温度は、刺激の少なくとも一部における間、一定温度（例えば、最適温度）に維持される。一部の実施形態では、固定相上に固定化された標的細胞の温度は、刺激の少なくとも一部における間、選択された温度（例えば、最適温度）±約５℃、±約４℃、±約３℃、±約２℃、±約１℃、または±約０．５℃に維持される。一部の実施形態では、固定相上に固定化された標的細胞の温度は、刺激の少なくとも一部における間、３７℃±約５℃、±約４℃、±約３℃、±約２℃、±約１℃、または±約０．５℃に維持される。一部の態様では、最適温度（例えば、３７℃または３７℃±約５℃）での細胞（例えば、リンパ球、例えば、Ｔ細胞など）の刺激は、細胞の活性化および細胞の下流処理、例えば、固定相からの細胞の脱離または溶出ならびに／あるいは細胞の遺伝子操作、を促進する。一部の態様では、最適温度（例えば、３７℃または３７℃±約５℃）での細胞（例えば、リンパ球、例えば、Ｔ細胞など）の刺激は、オンカラム刺激の際の細胞の健康を保存または維持する。
一部の態様では、最適温度（例えば、３７℃または３７℃±約５℃）での、およびカラムの空気（例えば、空気）の存在下での、細胞（例えば、リンパ球、例えば、Ｔ細胞など）の刺激は、細胞の活性化および細胞の下流処理、例えば、固定相からの細胞の脱離または溶出ならびに／あるいは細胞の遺伝子操作、を促進する。
図１Ａ～１Ｂは、カラムクロマトグラフィーのための例示的ハウジングアセンブリを提供する。一部の態様では、ハウジングアセンブリ１は、導入口ハウジングメンバー２および導出口ハウジングメンバー３を含み、ならびに、少なくとも導入口ハウジングメンバーおよび導出口ハウジングメンバーは、カラムクロマトグラフィーのための固定相、例えば、樹脂４など、を収容するように構成された内部空洞を形成する。一部の態様では、ハウジングアセンブリは、温度制御メンバー、例えば、内部空洞内の固定相に熱を提供するように構成された、加熱コイル５を含む温度制御メンバー、をさらに含む。一部の態様では、ハウジングアセンブリは、内部空洞を気体源に作動可能に接続するように構成され、それによって、内部空洞への気体の取り込みを可能にするかまたは実施する、コネクター、例えば、気体交換コネクター６、をさらに含む。一部の実施形態では、コネクターは、導入口ハウジングメンバー上に配置される。一部の実施形態では、コネクターは、導出口ハウジングメンバー上に配置される。一部の実施形態では、導入口ハウジングメンバーおよび導出口ハウジングメンバーの両方は、例えば、図１Ａに示されるように、その上に配置されたコネクターを有し、導入口ハウジングメンバー２および導出口ハウジングメンバー３の両方は、その上に配置された気体交換コネクター６を有する。
一部の実施形態では、ハウジングアセンブリは、側壁メンバーをさらに含む。例えば、図１Ａに示されるように、導入口ハウジングメンバー２、導出口ハウジングメンバー３、および側壁メンバー７は、一緒に内部空洞を形成する。
一部の実施形態では、コネクターは、導入口ハウジングメンバー上に配置される。一部の実施形態では、コネクターは、導出口ハウジングメンバー上に配置される。一部の実施形態では、コネクターは、側壁メンバー上に配置される。一部の実施形態では、導入口ハウジングメンバーおよび側壁メンバーの両方は、その上に配置されたコネクターを有する。一部の実施形態では、導出口ハウジングメンバーおよび側壁メンバーの両方は、その上に配置されたコネクターを有する。一部の実施形態では、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、および側壁メンバーのそれぞれは、その上に配置されたコネクターを有する。一部の実施形態では、導入口ハウジングメンバーは、その上に配置された少なくとも２つのコネクターを有する。一部の実施形態では、導出口ハウジングメンバーは、その上に配置された少なくとも２つのコネクターを有する。一部の実施形態では、側壁メンバーは、その上に配置された少なくとも２つのコネクターを有する。
一部の実施形態では、コネクターは、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、および側壁メンバーの任意の２つの間または３つ全ての間に形成される。一部の態様では、コネクターは、導入口ハウジングメンバーと導出口ハウジングメンバーとの間に形成される。一部の態様では、コネクターは、導入口ハウジングメンバーと側壁メンバーとの間に形成される。一部の態様では、コネクターは、導出口ハウジングメンバーと側壁メンバーとの間に形成される。一部の態様では、少なくとも１つのコネクターは、導入口ハウジングメンバーと側壁メンバーとの間に形成され、ならびに、少なくとも１つのコネクターは、導出口ハウジングメンバーと側壁メンバーとの間に形成される。
先行の実施形態のいずれにおいて、ハウジングアセンブリは、複数のコネクター、例えば、内部空洞を気体源に作動可能に接続し、それによって、内部空洞への気体の取り込みを可能にするかまたは実施するように構成された気体交換コネクター６、を含み得る。一部の実施形態では、コネクターのうちの少なくとも１つは、気体源に作動可能に接続され（直接的に、あるいは必要に応じて１つまたは複数のフィルターならびに／あるいは１つまたは複数のバルブを含むチューブを介して間接的に）、その一方で、少なくとも１つの他のコネクターは、通気するように構成される。
先行の実施形態のいずれにおいて、コネクターは、ボンドコネクター、スクリューコネクター、ルアーコネクター（例えば、ルアーロックコネクターまたはルアースリップコネクター）、バーブコネクター、またはそれらの任意の組合せであり得る。先行の実施形態のいずれにおいて、コネクターは、雄型嵌合または雌型嵌合を含み得る。先行の実施形態のいずれにおいて、コネクターは、気体源と流体連通されたチューブと封止係合するように構成することができる。先行の実施形態のいずれにおいて、コネクターは、１つまたは複数のバルブを含み得る。先行の実施形態のいずれにおいて、コネクターは、１つまたは複数のバルブを含むチューブに作動可能に接続することができる。先行の実施形態のいずれにおいて、コネクターは、１つまたは複数のフィルターを含み得る。先行の実施形態のいずれにおいて、コネクターは、１つまたは複数のフィルターを含むチューブに作動可能に接続することができる。先行の実施形態のいずれにおいて、１つまたは複数のフィルターは、ガスフィルター、例えば、エアフィルターであり得る。先行の実施形態のいずれにおいて、１つまたは複数のフィルターは、濾過による無菌化のための無菌フィルターおよび／または無菌化フィルターであり得る。
一部の態様では、ハウジングアセンブリは、上蓋を含む導入口ハウジングメンバーを含む。一部の実施形態では、上蓋は、導入口ハウジングメンバーまたは側壁メンバーに取り外し可能に取り付けられる。一部の実施形態では、上蓋は、導入口ハウジングメンバーまたは側壁メンバーと一体的に形成される。一部の実施形態では、コネクターは、上蓋上に配置される。
先行の実施形態のいずれにおいて、導入口ハウジングメンバーは、内部空洞へのインプット組成物の取り込みを可能にするために、内部空洞に作動可能に接続された１つまたは複数の導入口を含み得る。例えば、図１Ａに示されるように、導入口ハウジングメンバー２は、上蓋上に配置された導入口、例えば、チューブセットコネクター８、を含む。一部の実施形態では、コネクターと１つまたは複数の導入口は、例えば、図１Ａ（下側パネル）および図１Ｂに示されるように、異なる位置において、上蓋上に配置される。一部の実施形態では、コネクターと１つまたは複数の導入口は、同じ位置において上蓋上に配置される。例えば、１つまたは複数の導入口は、それによって、内部空洞への気体の取り込みを可能にするかまたは実施するように構成され得、それと同時に、内部空洞へのインプット組成物の取り込みを可能にするために、内部空洞に作動可能に接続するようにも構成され得る。１つまたは複数の導入口は、クロマトグラフィーの際のある特定の時点において、気体の取り込みのために、制御可能に開閉され得、ならびに、クロマトグラフィーの際の他の時点において、インプット組成物の取り込みのために、制御可能に開閉され得る。
一部の実施形態では、１つまたは複数の導入口を通る流体経路は、上蓋に対して約９０度の角度であり、それと同時に、コネクターを通る流体経路は、上蓋に対して約４５度の角度である。
先行の実施形態のいずれにおいて、導出口ハウジングメンバーは、ハウジングアセンブリの下蓋を含み得る。一部の態様では、下側の蓋は、導出口ハウジングメンバーまたは側壁メンバーに取り外し可能に取り付けられる。他の態様において、下蓋は、導出口ハウジングメンバーおよび側壁メンバーと一体的に形成される。
先行の実施形態のいずれにおいて、導出口ハウジングメンバーは、内部空洞からのアウトプット組成物の放出を可能にするかまたは実施するために、内部空洞に作動可能に接続された１つまたは複数の導出口を含み得る。一部の態様では、１つまたは複数の導出口は、下蓋上に配置される。一部の実施形態では、コネクターおよび１つまたは複数の導出口は、例えば、図１Ａ（下側パネル）に示されるように、異なる位置において、下蓋上に配置される。一部の実施形態では、コネクターおよび１つまたは複数の導出口は、同じ位置において下蓋上に配置される。例えば、１つまたは複数の導出口は、内部空洞を気体源に作動可能に接続し、それによって、内部空洞への気体の取り込みを可能にするかまたは実施するように構成され得、それと同時に、内部空洞からのアウトプット組成物の放出を可能にするかまたは実施するために、内部空洞に作動可能に接続するようにも構成され得る。１つまたは複数の導出口は、クロマトグラフィーの際のある特定の時点において、気体の取り込みのために、制御可能に開閉され得、ならびに、クロマトグラフィーの際の他の時点において、内部空洞からのアウトプット組成物のために、制御可能に開閉され得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の導出口を通る流体経路は、下蓋に対して約９０度の角度である。
先行の実施形態のいずれにおいて、気体源は、気体リザーバーまたは外部環境であり得るかまたはそれを含み得る。先行の実施形態のいずれにおいて、気体源の気体は、無菌であり得る。先行の実施形態のいずれにおいて、気体は、空気であり得るかまたはそれを含み得る。
先行の実施形態のいずれにおいて、ハウジングアセンブリは、気体源に作動可能に接続されたチューブをさらに含むことができる。一部の実施形態では、チューブは、内部空洞を気体源に無菌接続するように構成される。先行の実施形態のいずれにおいて、チューブは、１つまたは複数のバルブを含み得る。先行の実施形態のいずれにおいて、チューブは、１つまたは複数のフィルターを含み得る。
先行の実施形態のいずれにおいて、ハウジングアセンブリは、１つまたは複数の多孔性メンバー、例えば、細胞ストレーナーまたは細胞ふるいをさらに含むことができる。例えば、図１Ａ（上側パネル）に示されるように、ハウジングアセンブリ１は、織布ポリエステルメッシュ９を含む。一部の実施形態では、ハウジングアセンブリは、固定相と内部空洞の導入口とを分離するように構成された第１の多孔性メンバー、例えば、導入口ハウジングメンバー２と側壁メンバー７との間の織布ポリエステルメッシュ９、を含む。一部の実施形態では、ハウジングアセンブリは、固定相と内部空洞の導出口とを分離するように構成された第２の多孔性メンバー、例えば、導出口ハウジングメンバー３と側壁メンバー７との間の織布ポリエステルメッシュ９、をさらに含む。
先行の実施形態のいずれにおいて、１つまたは複数の多孔性メンバーは、約２０μｍの平均孔径を有することができる。先行の実施形態のいずれにおいて、１つまたは複数の多孔性メンバーは、約２０μｍのメッシュサイズを有するメッシュを含み得る。
先行の実施形態のいずれにおいて、温度制御メンバーは、内部空洞における固定相の温度を調節または維持するように構成することができる。一部の態様では、温度制御メンバーは、クロマトグラフィー実施の間に、内部空洞内の固定相を開始温度（例えば、室温）から約３５℃から約３９℃の間の標的温度（例えば、（約）３７℃において）まで加熱するように構成される。一部の態様では、温度制御メンバーは、さらに、固定相を標的温度に維持するように構成される。
先行の実施形態のいずれにおいて、ハウジングアセンブリは、内部空洞の固定相の温度を測定するように構成された温度センサーをさらに含むことができる。一態様において、温度センサーは、モニタリング／ディスプレイユニットに接続するように構成される。一部の実施形態では、温度センサーは、電源に電気的に接続するように構成される。一部の実施形態では、電源は、ハウジングアセンブリの外部に存する。一部の実施形態では、ハウジングアセンブリは、電源をさらに含む。
先行の実施形態のいずれにおいて、温度制御メンバーは、熱源を含み得る。あるいは、先行の実施形態のいずれにおいて、温度制御メンバーは、ハウジングアセンブリの外部にある熱源に作動可能に接続するように構成することができる。
一部の実施形態では、温度制御メンバーは、発熱体を含む。一部の実施形態では、発熱体は、固定相を一様に加熱するように構成される。
先行の実施形態のいずれにおいて、温度制御メンバーは、電気式発熱体、電磁誘導式発熱体、非電気式発熱体、およびそれらの任意の組み合せからなる群から選択される発熱体を含み得る。一態様において、発熱体は、電気式発熱体である。一部の実施形態では、電気式発熱体は、金属プレート、金属ロッド、金属ワイヤー、またはその組み合せを含む。一態様において、発熱体は、電磁誘導式発熱体である。一部の実施形態では、電磁誘導式発熱体は、内部空洞内の固定相に熱を提供するように構成された、帯磁性コアを囲む誘導加熱コイルを含む。一態様において、発熱体は、非電気式発熱体である。
一部の実施形態では、非電気式発熱体は、加熱された流体、例えば、加熱された液体または気体、のための導入口および導出口を含む加熱チャネルを含む。一部の実施形態では、加熱チャネルは、加熱コイルであり、ならびに、加熱された流体は、加熱された水である。例えば、図１Ａに示されるように、ハウジングアセンブリは、加熱コイル導入口１０および加熱コイル導出口１１を含む。一部の実施形態では、加熱された水のための導入口は、加熱された水の外部リザーバーに接続するように構成される。
一部の実施形態では、発熱体は、電気式発熱体である。一部の実施形態では、電気式発熱体は、電源に電気的に接続するように構成される。一部の実施形態では、電源は、ハウジングアセンブリの外部に存する。一部の実施形態では、ハウジングアセンブリは、電源をさらに含む。
一部の実施形態では、電気式発熱体は、金属プレートを含む。一部の実施形態では、金属プレートは、少なくとも一部が熱伝導性金属、例えば、アルミニウムまたは銅、で作製される。一部の実施形態では、金属プレートは、少なくとも一部は、アルミニウム、例えば、全体がアルミニウムで作製される。一部の実施形態では、電気式発熱体は、電気的絶縁層をさらに含む。一部の実施形態では、電気的絶縁層は、金属プレートの少なくとも一部と電気式発熱体の他の構成要素の少なくとも一部との間に存する。一部の実施形態では、電気的絶縁層は、金属プレートの一面の少なくとも一部の裏面を覆い、例えば、金属プレートの一面全体の裏面を覆う。
一部の実施形態では、発熱体の少なくとも一部は、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部、および／または側壁メンバーの少なくとも一部と接触しており、例えば、直接接触している。一部の実施形態では、発熱体の少なくとも一部は、側壁メンバーの少なくとも一部と接触しており、例えば、直接接触している。一部の実施形態では、発熱体の少なくとも一部は、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部と接触しており、例えば、直接接触している。一部の実施形態では、発熱体の少なくとも一部は、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部と接触しており、例えば、直接接触している。
一部の実施形態では、発熱体は、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部、および／または側壁メンバーと接触しており、例えば、直接接触している。一部の実施形態では、発熱体は、側壁メンバーの少なくとも一部と接触しており、例えば、直接接触している。一部の実施形態では、発熱体は、側壁メンバーと接触しており、例えば、直接接触している。
一部の実施形態では、発熱体の少なくとも一部は、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部、および／または側壁メンバーの少なくとも一部と接触していない。一部の実施形態では、発熱体は、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部、および／または側壁メンバーの少なくとも一部と接触していない。一部の実施形態では、発熱体は、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、または側壁メンバーと接触していない。
先行の実施形態のいずれにおいて、発熱体は、内部空洞の中心軸に沿っておよび／または中心軸の周りに配置することができる。一部の態様では、発熱体は、内部空洞の内側、内部空洞の外側、あるいは内部空洞の部分的に内側および部分的に外側に配置される。一部の態様では、発熱体は、側壁メンバーの内側、側壁メンバーの外側、あるいは側壁メンバーの部分的に内側および部分的に外側に配置される。
一部の実施形態では、発熱体は、内部空洞の内側に配置される。一部の実施形態では、発熱体は、内部空洞の内側に配置された非電気式発熱体を含む。一部の実施形態では、発熱体は、内部空洞の内側に配置された加熱チャネルを含む。一部の実施形態では、加熱チャネルは、加熱された流体、例えば、加熱された水、のための導入口および導出口を含む。一部の実施形態では、加熱された水のための導入口は、加熱された水の外部リザーバーに接続するように構成される。
一部の実施形態では、発熱体は、内部空洞の外側に配置される。一部の実施形態では、発熱体は、側壁メンバーの外側に配置される。一部の実施形態では、発熱体は、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部、および／または側壁メンバーの少なくとも一部を囲む。一部の実施形態では、発熱体は、側壁メンバー側壁メンバーを囲む、例えば、完全に囲む。一部の実施形態では、発熱体は、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部を囲む。一部の実施形態では、導入口ハウジングメンバーの１つまたは複数の導入口、例えば、内部空洞へのインプット組成物の取り込みを可能にするために内部空洞に作動可能に接続された１つまたは複数の導入口、のうちの１つの少なくとも一部は、発熱体に晒される。一部の実施形態では、内部空洞へのインプット組成物の取り込みを可能にするために内部空洞に作動可能に接続された導入口ハウジングメンバーの１つまたは複数の導入口の少なくとも一部は、発熱体に晒される。一部の実施形態では、導入口ハウジングメンバーの１つまたは複数の導入口のうちの１つの少なくとも一部は、発熱体の外側に存する。一部の実施形態では、発熱体は、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部を囲む。一部の実施形態では、導出口ハウジングメンバーの１つまたは複数の導出口、例えば、内部空洞からのアウトプット組成物の放出を可能にするかまたは実施するために、内部空洞に作動可能に接続された１つまたは複数の導出口、のうちの１つの少なくとも一部は、発熱体に晒される。一部の実施形態では、内部空洞からのアウトプット組成物の放出を可能にするかまたは実施するために、内部空洞に作動可能に接続された１つまたは複数の導出口の少なくとも一部は、発熱体に晒される。一部の実施形態では、導出口ハウジングメンバーの１つまたは複数の導出口のうちの１つの少なくとも一部は、発熱体の外側に存する。
一部の実施形態では、発熱体は、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、および／または側壁メンバーの少なくとも一部を囲む加熱チャネルを含む。
先行の実施形態のいずれにおいて、発熱体は、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、および／または側壁メンバーを囲むコイルを含み得る。先行の実施形態のいずれにおいて、発熱体は、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、および／または側壁メンバーを囲む加熱チャネルを含み得る。先行の実施形態のいずれにおいて、発熱体は、側壁メンバーを囲む加熱チャネルを含み得る。
一部の実施形態では、発熱体は、側壁メンバーの少なくとも一部、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部、および／または導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部を囲み、ならびに、ハウジングアセンブリは、さらに、発熱体と、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部、および／または側壁メンバーの少なくとも一部との間に断熱層を含む。一部の実施形態では、断熱層は、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部、および／または側壁メンバーの少なくとも一部を囲む。一部の実施形態では、断熱層は、側壁メンバーの少なくとも一部を囲み、例えば、側壁メンバーを完全に囲む。一部の実施形態では、断熱層は、固体層である。一部の実施形態では、断熱層は、液体層である。一部の実施形態では、断熱層は、気体層である。一部の実施形態では、断熱層は、空気層である。
一部の実施形態では、温度制御メンバーは、複数の発熱体を含む。一部の実施形態では、温度制御メンバーは、２～１０または約２～１０の発熱体、２～８または約２～８の発熱体、２～６または約２～６の発熱体、あるいは２～４または約２～４の発熱体（それぞれ境界値を含む）を含む。一部の実施形態では、温度制御メンバーは、２つ発熱体を含む。一部の実施形態では、温度制御メンバーは、３つ発熱体を含む。一部の実施形態では、温度制御メンバーは、４つ発熱体を含む。
一部の実施形態では、複数の発熱体が、固定相を一様に加熱するように構成される。一部の実施形態では、複数の発熱体が、固定相を一様に加熱するように配置される。
一部の実施形態では、複数の発熱体は、それぞれ、電気式発熱体、電磁誘導式発熱体、非電気式発熱体、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、複数の発熱体は、同一である。一部の実施形態では、複数の発熱体は、異なる発熱体の組合せである。
一部の実施形態では、複数の発熱体は、複数の非電気式発熱体を含む。一部の実施形態では、複数の発熱体は、複数の加熱チャネルを含む。一部の実施形態では、複数の加熱チャネルのそれぞれは、加熱された流体、例えば、加熱された水、のための導入口および導出口を有する。一部の実施形態では、複数の加熱チャネルの少なくとも２つは、お互いに流体結合される。一部の実施形態では、複数の加熱チャネルは、お互いに流体結合される。一部の実施形態では、複数の加熱チャネルの少なくとも１つの導入口は、加熱された流体、例えば、加熱された水、の外部リザーバーに接続するように構成される。一部の実施形態では、複数の加熱チャネルのそれぞれの導入口は、加熱された流体の外部リザーバーに接続するように構成される。
一部の実施形態では、複数の発熱体は、複数の電気式発熱体、例えば、金属プレートを含む電気式発熱体を含む。一部の実施形態では、複数の電気式発熱体の少なくとも２つは、お互いに電気的に結合される。一部の実施形態では、複数の電気式発熱体は、お互いに電気的に結合される。一部の実施形態では、複数の電気式発熱体の少なくとも１つは、電源、例えば、ハウジングアセンブリの外部に存するかまたはハウジングアセンブリに含まれる電源、に電気的に接続するように構成される。一部の実施形態では、複数の電気式発熱体のそれぞれは、電源、例えば、ハウジングアセンブリの外部に存するかまたはハウジングアセンブリに含まれる電源、に電気的に接続するように構成される。
一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つの少なくとも一部は、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部、および／または側壁メンバーの少なくとも一部と接触しており、例えば、直接接触している。一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つの少なくとも一部は、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部と接触しており、例えば、直接接触している。一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つの少なくとも一部は、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部と接触しており、例えば、直接接触している。一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つの少なくとも一部は、側壁メンバーの少なくとも一部と接触しており、例えば、直接接触している。
一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つの少なくとも一部は、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部、および／または側壁メンバーの少なくとも一部と接触しており、例えば、直接接触している。一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つは、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部、および／または側壁メンバーの少なくとも一部と接触しており、例えば、直接接触している。一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つは、側壁メンバーの少なくとも一部と接触しており、例えば、直接接触している。一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つは、側壁メンバーと接触しており、例えば、直接接触している。
一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つの少なくとも一部は、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部、または側壁メンバーの少なくとも一部と接触していない。一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つの少なくとも一部は、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、または側壁メンバーと接触していない。一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つは、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、または側壁メンバーと接触していない。一部の実施形態では、複数の発熱体は、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、または側壁メンバーと接触していない。
一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つは、内部空洞の中心軸に沿っておよび／または中心軸の周りに配置される。一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つは、内部空洞の内部、内部空洞の外部、あるいは内部空洞の部分的に内部および部分的に外部に配置される。一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つは、側壁メンバーの内部、側壁メンバーの外部、あるいは側壁メンバーの部分的に内部および部分的に外部に配置される。一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つは、内部空洞の内部に配置され、ならびに、複数の発熱体の少なくとも１つは、内部空洞の外部に配置される。一部の実施形態では、複数の発熱体は、内部空洞の内部に配置される。一部の実施形態では、複数の発熱体は、内部空洞の外部に配置される。一部の実施形態では、複数の発熱体は、側壁メンバーの外部に配置される。
一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つは、内部空洞の外部に配置される。一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つは、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部、および／または側壁メンバーの少なくとも一部を囲む。一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つは、側壁メンバーの少なくとも一部を囲み、例えば、側壁メンバーを完全に囲む。一部の実施形態では、複数の発熱体は、側壁メンバーの少なくとも一部を囲み、例えば、側壁メンバーを完全に囲む。一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つは、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部を囲む。一部の実施形態では、複数の発熱体は、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部を囲む。一部の実施形態では、導入口ハウジングメンバーの１つまたは複数の導入口の少なくとも一部は、複数の発熱体に晒される。一部の実施形態では、導入口ハウジングメンバーの１つまたは複数の導入口の少なくとも一部は、複数の発熱体の外側に存する。一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つは、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部を囲む。一部の実施形態では、複数の発熱体は、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部を囲む。一部の実施形態では、導出口ハウジングメンバーの１つまたは複数の導出口の少なくとも一部は、複数の発熱体に晒される。一部の実施形態では、導出口ハウジングメンバーの１つまたは複数の導出口の少なくとも一部は、複数の発熱体の外側に存する。
一部の実施形態では、複数の発熱体は、側壁メンバーの周りに一様にまたはおよそ一様に分配される。一部の実施形態では、複数の発熱体は、側壁メンバーの周囲の周りに一様にまたはおよそ一様に分配される。
一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つは、側壁メンバーの少なくとも一部、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部、および／または導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部を囲み、ならびに、ハウジングアセンブリは、複数の発熱体の少なくとも１つは、と、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部、および／または側壁メンバーの少なくとも一部との間に断熱層を含む。一部の実施形態では、断熱層は、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部、および／または側壁メンバーの少なくとも一部を囲む。一部の実施形態では、断熱層は、側壁メンバーの少なくとも一部を囲み、例えば、側壁メンバーを完全に囲む。一部の実施形態では、断熱層は、液体層である。一部の実施形態では、断熱層は、気体層である。一部の実施形態では、断熱層は、空気層である。
一部の実施形態では、発熱体は、側壁メンバーの外側に配置され、ならびに、ハウジングアセンブリは、さらに、発熱体を含むジャケットメンバー（本明細書においてジャケットとも呼ばれる）を含む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、側壁メンバーの外側に配置された発熱体を含む温度制御メンバーを含む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、節ＩＩＩ－Ｃに記載されるような任意のメンバーである。
一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つは、側壁メンバーの外部に配置され、ならびに、ハウジングアセンブリは、さらに、複数の発熱体の少なくとも１つを含むジャケットメンバーを含む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、複数の発熱体の少なくとも１つを含む温度制御メンバーを含む。一部の実施形態では、複数の発熱体は、側壁メンバーの外部に配置され、ならびに、ハウジングアセンブリは、さらに、複数の発熱体を含むジャケットメンバーを含む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、複数の発熱体を含む温度制御メンバーを含む。
一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部、および／または側壁メンバーの少なくとも一部を囲むように構成される。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部、および／または側壁メンバーの少なくとも一部を囲む。
一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部、および／または側壁メンバーの少なくとも一部を囲むように一緒に解放可能に接続される。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、一緒に解放可能に接続されない。
一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、側壁メンバーの少なくとも一部を囲むように構成される。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、側壁メンバーを完全に囲むように構成される。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、側壁メンバーの少なくとも一部を囲み、例えば、側壁メンバーを完全に囲む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、側壁メンバーを完全に囲む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部を囲む。一部の実施形態では、導入口ハウジングメンバーの１つまたは複数の導入口は、ジャケットメンバーに晒される。一部の実施形態では、内部空洞へのインプット組成物の取り込みを可能にするために内部空洞に作動可能に接続された導入口ハウジングメンバーの１つまたは複数の導入口は、ジャケットメンバーに晒される。一部の実施形態では、導入口ハウジングメンバーの１つまたは複数の導入口は、ジャケットメンバーの外側に存する。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部を囲む。一部の実施形態では、導出口ハウジングメンバーの１つまたは複数の導出口は、ジャケットメンバーに晒される。一部の実施形態では、内部空洞からのアウトプット組成物の放出を可能にするかまたは実施するために内部空洞に作動可能に接続された導出口ハウジングメンバーの１つまたは複数の導出口は、内部空洞からのアウトプット組成物の放出を可能にするかまたは実施するために、ジャケットメンバーに晒される。一部の実施形態では、導出口ハウジングメンバーの１つまたは複数の導出口は、ジャケットメンバーの外側に存する。
一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部、および／または側壁メンバーの少なくとも一部と接触しており、例えば、直接接触している。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、側壁メンバーの少なくとも一部と接触しており、例えば、直接接触している。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、側壁メンバーと接触しており、例えば、直接接触している。
一部の実施形態では、ジャケットメンバーの少なくとも一部は、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部、または側壁メンバーの少なくとも一部と接触していない。一部の実施形態では、ジャケットメンバーの少なくとも一部は、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、または側壁メンバーと接触していない。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、または側壁メンバーと接触していない。
一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、非電気式発熱体例えば、加熱された流体のための導入口および導出口を含む加熱チャネルを含む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、複数の非電気式発熱体を含む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、加熱された流体のための導入口のための少なくとも１つの開口部を含む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、加熱された流体のための導出口のための少なくとも１つの開口部を含む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、加熱された流体のための１つまたは複数の導入口のための少なくとも２つの開口部を含む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、加熱された流体、例えば、加熱された水、のための１つまたは複数の導出口のための少なくとも２つの開口部を含む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、電源、例えば、ハウジングアセンブリの外部に存するかまたはハウジングアセンブリに含まれる電源、に電気的に接続するように構成される。
一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、電気式発熱体、例えば、金属プレートを含む電気式発熱体、を含む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、複数の電気式発熱体を含む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、電気式発熱体または複数の電気式発熱体が電源に電気的に接続するように構成されるように配置される。
一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、内部空洞の固定相の温度を測定するように構成された少なくとも１つの温度センサーを含む。一部の実施形態では、温度センサーは、電源、例えば、ハウジングアセンブリの外部に存するかまたはハウジングアセンブリに含まれる電源、に電気的に接続するように構成される。
一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、１つまたは複数のジャケット構成要素を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のジャケット構成要素は、ジャケットメンバーを形成するように一緒に構成される。一部の実施形態では、１つまたは複数のジャケット構成要素は、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部、および／または側壁メンバーの少なくとも一部を囲むように構成される。一部の実施形態では、１つまたは複数のジャケット構成要素は、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部、および／または側壁メンバーの少なくとも一部を囲むように一緒に解放可能に接続されるように構成される。
一部の実施形態では、１つまたは複数のジャケット構成要素は、側壁メンバーの少なくとも一部を囲むように、例えば、側壁メンバーを完全に囲むように構成される。一部の実施形態では、１つまたは複数のジャケット構成要素は、側壁メンバーの全体を囲むように構成される。一部の実施形態では、１つまたは複数のジャケット構成要素は、導入口ハウジングメンバーの少なくとも一部を囲むように構成される。一部の実施形態では、導入口ハウジングメンバーの１つまたは複数の導入口は、１つまたは複数のジャケット構成要素に晒される。一部の実施形態では、導入口ハウジングメンバーの１つまたは複数の導入口は、１つまたは複数のジャケット構成要素の外側に存する。一部の実施形態では、１つまたは複数のジャケット構成要素は、導出口ハウジングメンバーの少なくとも一部、を囲むように構成される。一部の実施形態では、導出口ハウジングメンバーの１つまたは複数の導出口は、１つまたは複数のジャケット構成要素に晒される。一部の実施形態では、導出口ハウジングメンバーの１つまたは複数の導出口は、１つまたは複数のジャケット構成要素の外側に存する。
一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、２つ以上のジャケット構成要素、例えば、約２～１０のジャケット構成要素、２～８のジャケット構成要素、２～６のジャケット構成要素、または２～４のジャケット構成要素（それぞれ境界値を含む）、を含む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、２つのジャケット構成要素を含む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、３つのジャケット構成要素を含む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、４つのジャケット構成要素を含む。
一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素の少なくとも２つはそれぞれ、発熱体を含む。一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素はそれぞれ、発熱体を含む。
一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素の少なくとも２つはそれぞれ、温度センサーを含む。一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素はそれぞれ、温度センサーを含む。
一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素の少なくとも２つはそれぞれ、非電気式発熱体を含む。一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素の少なくとも２つはそれぞれ、加熱された流体、例えば、加熱された水、のための導入口および導出口を有する加熱チャネルを含む。一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素はそれぞれ、加熱された流体、例えば、加熱された水、のための導入口および導出口を有する加熱チャネルを含む。
一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素の少なくとも２つの加熱チャネルは、お互いに流体結合される。一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素の加熱チャネルは、お互いに流体結合される。
一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素の少なくとも１つは、加熱された流体、例えば、加熱された水、のための導入口のための開口部を含む。一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素はそれぞれ、流体、例えば、加熱された水、のための導入口のための開口部を含む。
一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素の加熱チャネルの少なくとも１つの導入口は、加熱された流体の外部リザーバーに接続するように構成される。一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素の加熱チャネルのそれぞれの導入口は、加熱された流体の外部リザーバーに接続するように構成される。
一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素の少なくとも１つは、加熱された流体、例えば、加熱された水、のための導出口のための開口部を含む。一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素はそれぞれ、流体、例えば、加熱された水、のための導出口のための開口部を含む。
図２５～２８は、カラムクロマトグラフィーのための例示的ハウジングアセンブリの概略図を提供する。図２５に示される例示的ハウジングアセンブリ１は、導入口ハウジングメンバー２、導出口ハウジングメンバー３、および側壁メンバー７を含み、それらは、固定相を収容するように構成された内部空洞を形成する。ハウジングアセンブリ１は、ねじ込み式空気フィルター（図示されず）のための気体供給コネクターおよび、図２６Ａ～２６Ｃに示されるような、加熱コイル５を含む温度制御メンバーも含む。加熱コイル５は、２つのジャケット構成要素１２で作製されたジャケットメンバーに収容される。ジャケット構成要素１２は、一緒に側壁メンバー７全体を囲むように、ならびに導入口ハウジングメンバー２および導出口ハウジングメンバー３のそれぞれの少なくとも一部を囲むように、構成される。各ジャケット構成要素１２は、ジャケットメンバーが導入口ハウジングメンバー２の導入口を露出させるような導入口溝１３を含む。各ジャケット構成要素１２は、ジャケットメンバーが導出口ハウジングメンバー３の導出口を露出させるような導出口溝１４を含む。
図２６Ａ～２６Ｃは、ジャケット構成要素１２の内側、側面、および外側の外観を示す。図２６Ａ～２６Ｃに示されるように、各ジャケット構成要素１２は、加熱された流体、例えば、加熱された水、のための加熱コイル５を含む。ジャケットメンバーの２つの加熱コイル５は、一緒に側壁メンバー７全体を囲むように、および、導入口ハウジングメンバー２および導出口ハウジングメンバー３のそれぞれの少なくとも一部を囲むように、構成される。各ジャケット構成要素１２は、加熱コイル導入口１０および加熱コイルの加熱コイル導出口のための開口部も含む。図２７に示されるように、加熱コイル導入口１０は、導入口ハウジングメンバー２の導入口に対して平行である。図２８に示されるように、加熱コイル導出口１は、導出口ハウジングメンバー３の導出口に対して平行である。
一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素の少なくとも２つはそれぞれ、電気式発熱体、例えば、金属プレートを含む電気式発熱体、を含む。一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素の少なくとも２つはそれぞれ、電気式発熱体を含む。一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素はそれぞれ、電気式発熱体を含む。
一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素の少なくとも２つの電気式発熱体は、お互いに電気的に結合される。一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素の電気式発熱体は、お互いに電気的に結合される。
一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素の少なくとも１つは、電源、例えば、ハウジングアセンブリの外部に存するかまたはハウジングアセンブリに含まれる電源、に電気的に接続するように構成される。一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素のそれぞれは、電源、例えば、ハウジングアセンブリの外部に存するかまたはハウジングアセンブリに含まれる電源、に電気的に接続するように構成される。
一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素の少なくとも２つにおける少なくとも１つの電気式発熱体は、電源、例えば、ハウジングアセンブリの外部に存するかまたはハウジングアセンブリに含まれる電源、に電気的に接続するように構成される。一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素のそれぞれの電気式発熱体は、電源、例えば、ハウジングアセンブリの外部に存するかまたはハウジングアセンブリに含まれる電源、に電気的に接続するように構成される。
図２９～３１は、カラムクロマトグラフィーのための例示的ハウジングアセンブリの概略図を提供する。図２９に示される例示的ハウジングアセンブリ１は、導入口ハウジングメンバー２、導出口ハウジングメンバー３、および側壁メンバー７を含み、それらは、固定相を収容するように構成された内部空洞を形成する。ハウジングアセンブリ１は、ねじ込み式空気フィルター（図示されず）のための気体供給コネクターおよび、金属プレートを含む電気式発熱体１７を含む温度制御メンバーも含む。電気式発熱体１７は、３つのジャケット構成要素１２で構成されたジャケットメンバーの一部である。ジャケット構成要素１２は、一緒に側壁メンバー７全体を囲むように、および、導入口ハウジングメンバー２および導出口ハウジングメンバー３のそれぞれの少なくとも一部を囲むように、構成される。各ジャケット構成要素１２は、ジャケットメンバーが導入口ハウジングメンバー２の導入口を露出させるような導入口溝１３を含む。各ジャケット構成要素１２は、ジャケットメンバーが導出口ハウジングメンバー３の導出口を露出させるような導出口溝１４も含む。
図３０Ａ～３０Ｃは、ジャケット構成要素１２の３つの構図を示す。各ジャケット構成要素１２は、電気式発熱体１７および温度センサー１８を含む。各電気式発熱体１７は、発熱体電気接続１６を介して電源に電気的に接続するように構成され、ならびに、各温度センサーは、温度センサー電気接続２０を介して電源に電気的に接続するように構成される。図３０Ｄに示されるように、電気式発熱体１７は、電気絶縁層１９およびアルミニウムプロファイル２１も含む。各電気式発熱体１７は、取付位置１５においてジャケット構成要素１２内に搭載される。電気式発熱体１７およびジャケット構成要素１２は、電気式発熱体１７が側壁メンバー７の周囲に一様に分配されるように構成される。図２９に示されるように、発熱体電気接続１６および温度センサー電気接続２０は、ジャケットメンバーにおける導出口ハウジングメンバー３の導出口と同じ面において露出される。
一態様において、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、および側壁メンバーを含む、カラムクロマトグラフィーのためのハウジングアセンブリであって、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、および側壁メンバーは、カラムクロマトグラフィーのための固定相を収容するように構成された内部空洞；内部空洞の中心軸に沿っておよび／または中心軸の周りに配置された発熱体を含む温度制御メンバー、内部空洞内の固定相に熱を提供するように構成された発熱体；ならびに、内部空洞を気体源に作動可能におよび無菌的に接続するように構成され、それによって、内部空洞への無菌気体の取り込みを可能にするかまたは実施する、コネクター、を形成する、ハウジングアセンブリが、本明細書において開示される。
一態様において、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、および側壁メンバーを含む、カラムクロマトグラフィーのためのハウジングアセンブリであって、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、および側壁メンバーが、カラムクロマトグラフィーのための固定相を収容するように構成された内部空洞；固定相の温度を調節または維持するように構成され、内部空洞の中心軸に沿っておよび／または中心軸の周りに配置された発熱体を含む、温度制御メンバー、内部空洞内の固定相に熱を提供するように構成された発熱体；ならびに、内部空洞を気体源に作動可能におよび無菌的に接続するように構成され、それによって、内部空洞への無菌気体の取り込みを可能にするかまたは実施する、コネクター、を形成する、ハウジングアセンブリが、本明細書において開示される。
別の態様において、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、および、側壁メンバーを含む、カラムクロマトグラフィーのためのハウジングアセンブリであって、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、および側壁メンバーは、カラムクロマトグラフィーのための固定相を収容するように構成された内部空洞；内部空洞内の固定相に熱を提供するように構成された金属プレートを含む発熱体を含む温度制御メンバー；ならびに、内部空洞を気体源に作動可能におよび無菌的に接続するように構成され、それによって、内部空洞への無菌気体の取り込みを可能にするかまたは実施する、コネクター、を形成する、ハウジングアセンブリが、本明細書において開示される。
別の態様において、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、および側壁メンバーを含む、カラムクロマトグラフィーのためのハウジングアセンブリであって、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、および側壁メンバーが、カラムクロマトグラフィーのための固定相を収容するように構成された内部空洞；固定相の温度を調節または維持するように構成され、固定相に熱を提供するように構成された２つの加熱コイルを含む、温度制御メンバー；２つの加熱コイルを含む温度制御メンバーを含み、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、および、側壁メンバー、の少なくとも一部を囲むように一緒に解放可能に接続される、ジャケットメンバーであって、２つの加熱コイルが側壁メンバーを完全に囲む、ジャケットメンバー；ならびに、内部空洞を気体フィルターに作動可能におよび無菌的に接続するように構成され、それによって、内部空洞への無菌気体の取り込みを可能にするかまたは実施する、コネクター、を形成する、ハウジングアセンブリが、本明細書において開示される。
別の態様において、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、および側壁メンバーを含む、カラムクロマトグラフィーのためのハウジングアセンブリであって、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、および側壁メンバーが、カラムクロマトグラフィーのための固定相を収容するように構成された内部空洞；固定相の温度を調節または維持するように構成され、それぞれが金属プレートを含み、ならびに固定相に対して熱を提供するように構成される、３つの電気式発熱体、を含む温度制御メンバー；３つの電気式発熱体を含む温度制御メンバーを含み、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、および側壁メンバーの少なくとも一部を囲むように一緒に解放可能に接続される、ジャケットメンバーであって、２つの加熱コイルが側壁メンバーを完全に囲む、ジャケットメンバー；ならびに、内部空洞を気体フィルターに作動可能におよび無菌的に接続するように構成され、それによって、内部空洞への無菌気体の取り込みを可能にするかまたは実施する、コネクター、を形成する、ハウジングアセンブリが、本明細書において開示される。
さらなる別の態様において、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、および、側壁メンバーを含む、カラムクロマトグラフィーのためのハウジングアセンブリであって、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、および、側壁メンバーが、カラムクロマトグラフィーのための固定相を収容するように構成された内部空洞；内部空洞内の固定相に熱を提供するように構成された加熱コイルを含む発熱体を含む温度制御メンバー；ならびに、内部空洞を気体源に作動可能におよび無菌的に接続するように構成され、それによって、内部空洞への無菌気体の取り込みを可能にするかまたは実施する、コネクター、を形成する、ハウジングアセンブリが、本明細書において開示される。一部の実施形態では、加熱コイルは、加熱された水のための導入口および導出口を含む。一部の態様では、加熱コイルは、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、および、側壁メンバー、を囲む。
一態様において、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、および、側壁メンバーを含む、カラムクロマトグラフィーのためのハウジングアセンブリであって、導入口ハウジングメンバー、導出口ハウジングメンバー、および側壁メンバーが、カラムクロマトグラフィーのための固定相を収容するように構成された内部空洞；内部空洞内の固定相に熱を提供するように構成された発熱体を含む温度制御メンバー；ならびに、内部空洞を気体フィルターに作動可能におよび無菌的に接続するように構成され、それによって、内部空洞への無菌気体の取り込みを可能にするかまたは実施する、コネクター、を形成する、ハウジングアセンブリが、本明細書において開示される。
先行の実施形態のいずれにおいて、ガスフィルターは、エアフィルターであり得、ならびに、無菌ガスは、無菌空気であり得る。先行の実施形態のいずれにおいて、ハウジングアセンブリは、さらに、ガスフィルターを含むことができる。
本明細書において開示される複数のハウジングアセンブリを含むハウジングアセンブリセットも、本明細書において開示される。ハウジングアセンブリセットは、連続して配置された複数のハウジングアセンブリの少なくとも２つを含み得る。ハウジングアセンブリセットは、並列して配置された複数のハウジングアセンブリの少なくとも２つを含み得る。
本明細書において開示されるハウジングアセンブリのいずれかおよび少なくとも１つの追加クロマトグラフィーカラムを含む、クロマトグラフィーシステムも、本明細書において開示される。一部の実施形態では、少なくとも１つの追加クロマトグラフィーカラムは、温度制御メンバーを含まない。一部の実施形態では、少なくとも１つの追加クロマトグラフィーカラムは、少なくとも１つの追加クロマトグラフィーカラムの内部空洞を気体源に作動可能に接続するように構成されたコネクターを含まない。
Ｂ．クロマトグラフィーキット、カラム、およびカラムセット
一部の実施形態では、本明細書において開示されるハウジングアセンブリまたはハウジングアセンブリセットと、カラムクロマトグラフィーのための固定相とを含むクロマトグラフィーキットも、本明細書において開示される。一部の実施形態では、ハウジングアセンブリまたはハウジングアセンブリセットは、節ＩＩＩ－Ａに記載されるいずれかである。一部の実施形態では、クロマトグラフィーキットは、１種または複数種の刺激剤または刺激試薬をさらに含む。一部の実施形態では、１種または複数種の刺激剤または刺激試薬は、節Ｉ－Ｂ－１およびＩ－Ｂ－２に記載されるいずれかである。
一部の実施形態では、本明細書において開示されるハウジングアセンブリまたはハウジングアセンブリセットと、ハウジングアセンブリの１つまたは複数の内部空洞におけるカラムクロマトグラフィーのための固定相とを含むクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィーカラムセットも、本明細書において開示される。一部の実施形態では、ハウジングアセンブリまたはハウジングアセンブリセットは、節ＩＩＩ－Ａに記載されるいずれかである。
一部の実施形態では、ジャケットメンバーとクロマトグラフィーカラムとを含むクロマトグラフィーカラムも、本明細書において開示される。一部の実施形態では、クロマトグラフィーカラムの内部空洞は、カラムクロマトグラフィーのための固定相を含む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、節ＩＩＩ－Ｃに記載されるいずれかである。
一部の実施形態では、少なくとも１つのジャケットメンバーおよび複数のクロマトグラフィーカラムを含む、クロマトグラフィーカラムセットも、本明細書において開示される。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、節ＩＩＩ－Ｃに記載されるいずれかである。一部の実施形態では、複数のクロマトグラフィーカラムのそれぞれの内部空洞は、カラムクロマトグラフィーのための固定相を含む。一部の実施形態では、複数のクロマトグラフィーカラムは、連続して配置される。一部の実施形態では、複数のクロマトグラフィーカラムは、並列に配置される。一部の実施形態では、複数のクロマトグラフィーカラムは、作動可能に接続される。
一部の実施形態では、複数のクロマトグラフィーカラムは、第１のクロマトグラフィーカラムを含む。一部の実施形態では、複数のクロマトグラフィーカラムは、第２のクロマトグラフィーカラムを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのジャケットメンバーは、第２のクロマトグラフィーカラムを囲むように構成される。
先行の実施形態のいずれにおいて、固定相は、ゲル濾過マトリックスおよび／またはアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを含み得る。固定相は、非磁性材料、非強磁性材料、または非常磁性材料を含み得る。他の態様において、固定相は、セルロース膜、可塑性膜、多糖ゲル、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル、多糖グラフト化シリカ、ポリビニルピロリドングラフト化シリカ、ポリエチレンオキシドグラフト化シリカ、ポリ（２－ヒドロキシエチルアスパルトアミド）シリカ、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）グラフト化シリカ、スチレン－ジビニルベンゼンゲル、アクリレートまたはアクリルアミドとジオールとのコポリマー、多糖とＮ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミドとのコポリマー、およびそれらの組合せからなる群から選択される。固定相は、モノリシックマトリックス、粒子状マトリックス、および／または平面状マトリックスを含み得るかまたはそれらである。
先行の実施形態のいずれにおいて、粒子状マトリックスは、約５μｍ～約２００μｍの、約５μｍ～約６００μｍの、または約５μｍ～約１５００μｍの平均粒径を有し得る。先行の実施形態のいずれにおいて、固定相は、約１ｎｍ～約５００ｎｍの平均孔径を有し得る。
先行の実施形態のいずれにおいて、固定相は、その上に固定化された、節Ｉ－Ｂ－１に記載される薬剤のいずれかを含み得る。一部の実施形態では、薬剤は、固定相上に直接固定化される。一部の実施形態では、薬剤は、固定相上に間接的に固定化される。一部の実施形態では、薬剤は、固定相上に不可逆的に固定化される。一部の実施形態では、薬剤は、固定相上に可逆的に固定化される。一部の実施形態では、薬剤は、固定相上に可逆的に固定化される。ストレプトアビジン－結合ペプチドに可逆的に結合するストレプトアビジンのムテインを介して、固定相上に可逆的に固定化される。一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインおよび／またはストレプトアビジン－結合ペプチドは、節Ｉ－Ｂ－２に記載されるいずれかである。
先行の実施形態のいずれにおいて、固定相は、その上に固定化された選択剤を含み得る。一部の態様では、選択剤は、１つまたは複数の細胞の表面上の選択マーカーに特異的に結合することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の細胞は、免疫細胞である。一部の態様では、１つまたは複数の細胞は、Ｔ細胞である。
ハウジングアセンブリ、ハウジングアセンブリセット、あるいはクロマトグラフィーキット、クロマトグラフィーカラム、またはクロマトグラフィーカラムセットを含む機器であって、さらに、導入口ハウジングメンバーの導入口を介して内部空洞に作動可能に接続されたインプット組成物リザーバーを含む、機器も、本明細書において開示される。一部の実施形態では、インプット組成物は、血液または血液由来試料を含むかまたはそれらである。一部の実施形態では、インプット組成物は、全血試料、バフィーコート試料、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料、非分画性Ｔ細胞試料、リンパ球試料、白血球試料、アフェレーシス生成物、または白血球アフェレーシス生成物を含むかまたはそれらである。一部の実施形態では、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス生成物は、対象から新鮮に単離されるか、または低温保存されアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス生成物から解凍される。一部の実施形態では、機器は，導出口ハウジングメンバーの導出口を介して内部空洞に作動可能に接続されたアウトプット組成物リザーバーをさらに含む。一部の態様では、アウトプット組成物は、濃縮されたＴ細胞を含むかまたはそれらである。他の態様において、濃縮されたＴ細胞は、クロマトグラフィーカラムでのクロマトグラフィーの際に刺激を受けている。先行の実施形態のいずれにおいて、機器は、閉鎖されたシステムまたは無菌システムであり得る。例示的ハウジングアセンブリ１を含む例示的機器は、図１Ｂに示される。
クロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィーカラムセットを調製する方法であって、固定相を本明細書において開示されるハウジングアセンブリまたはハウジングアセンブリセットに導入する工程を含む方法も、本明細書において開示される。さらに、クロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィーカラムセットを調製する方法であって、クロマトグラフィーキットの固定相をクロマトグラフィーキットのハウジングアセンブリまたはハウジングアセンブリセットに導入する工程を含む方法が、本明細書において開示される。
Ｃ．クロマトグラフィーのためのジャケットメンバー
本明細書において提供されるデバイスは、カラムクロマトグラフィーのためのジャケットメンバーも含む。一部の態様では、提供されるジャケットメンバーは、クロマトグラフィーカラムの固定相上に固定化された標的細胞の単離、処理、または操作を伴う改良された方法、例えば、細胞のオンカラム選択および／または刺激の方法、を可能にするデバイスである。一部の態様では、提供されるジャケットメンバーは、温度の調節、例えば、固定化された細胞の加熱、を可能にする。一部の態様では、提供されるジャケットメンバーは、例えば、３７℃または約３７℃あるいは３７℃±約５℃での、固定化された細胞の温度の維持を可能にする。一部の態様では、提供されるデバイスによる細胞の温度の調整および維持は、オンカラム操作、例えば、オンカラム操作の際の固定化された細胞の健康全般、フィットネス、または状態を改善することによる、固定化された細胞の刺激、を向上させる。
一態様において、ジャケットメンバーは、クロマトグラフィーカラムの少なくとも一部を囲むように構成された１つまたは複数のジャケット構成要素を含む。一部の態様では、クロマトグラフィーカラムは、固定相を収容するように構成される。一部の態様では、クロマトグラフィーカラムは、固定相を含む。一部の態様では、ジャケットメンバーは、さらに、１つまたは複数の発熱体を含む。一部の態様では、１つまたは複数の発熱体は、固定相に熱を提供するように構成される。一部の実施形態では、１つまたは複数の発熱体は、温度制御メンバーの少なくとも一部であるように構成される。一部の態様では、温度制御メンバーは、固定相の温度を調節または維持するように構成される。一部の実施形態では、１つまたは複数の発熱体は、節ＩＩＩ－Ａに記載されるいずれかである。一部の実施形態では、温度制御メンバーは、節ＩＩＩ－Ａに記載されるいずれかである。
一部の態様では、１つまたは複数のジャケット構成要素は、クロマトグラフィーカラムの少なくとも一部を囲むように一緒に解放可能に接続されるように構成される。他の実施形態では、１つまたは複数のジャケット構成要素は、放出可能に一緒に接続されないように構成される。
一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、約１～４０ｍＬ、例えば、１～３５ｍＬ、１～３０ｍＬ、１～２５ｍＬ、１～２０ｍＬ、１～１５ｍＬ、１～１０ｍＬ、１～５ｍＬ、５～４０ｍＬ、５～３５ｍＬ、５～３０ｍＬ、５～２５ｍＬ、５～２０ｍＬ、５～１５ｍＬ、５～１０ｍＬ、１０～４０ｍＬ、１０～３５ｍＬ、１０～３０ｍＬ、１０～２５ｍＬ、１０～２０ｍＬ、１０～１５ｍＬ、１５～４０ｍＬ、１５～３５ｍＬ、１５～３０ｍＬ、１５～２５ｍＬ、１５～２０ｍＬ、２０～４０ｍＬ、２０～３５ｍＬ、２０～３０ｍＬ、２０～２５ｍＬ、２５～４０ｍＬ、２５～３５ｍＬ、２５～３０ｍＬ、３０～４０ｍＬ、３０～３５ｍＬ、または３５～４０ｍＬ、あるいは約１～３５ｍＬ、１～３０ｍＬ、１～２５ｍＬ、１～２０ｍＬ、１～１５ｍＬ、１～１０ｍＬ、１～５ｍＬ、５～４０ｍＬ、５～３５ｍＬ、５～３０ｍＬ、５～２５ｍＬ、５～２０ｍＬ、５～１５ｍＬ、５～１０ｍＬ、１０～４０ｍＬ、１０～３５ｍＬ、１０～３０ｍＬ、１０～２５ｍＬ、１０～２０ｍＬ、１０～１５ｍＬ、１５～４０ｍＬ、１５～３５ｍＬ、１５～３０ｍＬ、１５～２５ｍＬ、１５～２０ｍＬ、２０～４０ｍＬ、２０～３５ｍＬ、２０～３０ｍＬ、２０～２５ｍＬ、２５～４０ｍＬ、２５～３５ｍＬ、２５～３０ｍＬ、３０～４０ｍＬ、３０～３５ｍＬ、または３５～４０ｍＬの体積の固定相を収容することができるクロマトグラフィーカラムの少なくとも一部を囲むように構成される。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、１５～２５ｍＬまたは約１５～２５ｍＬの体積の固定相を収容することができるクロマトグラフィーカラムの少なくとも一部を囲むように構成される。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、１５～２０ｍＬまたは約１５～２０ｍＬの体積の固定相を収容することができるクロマトグラフィーカラムの少なくとも一部を囲むように構成される。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、１８～２０ｍＬまたは約１８～２０ｍＬの体積の固定相を収容することができるクロマトグラフィーカラムの少なくとも一部を囲むように構成される。
一部の実施形態では、ジャケットメンバーの少なくとも一部は、クロマトグラフィーカラムの少なくとも一部と接触するように、例えば、直接接触するように構成される。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、クロマトグラフィーカラムの少なくとも一部と接触するように、例えば、直接接触するように構成される。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、クロマトグラフィーカラムと接触するように、例えば、直接接触するように構成される。
一部の実施形態では、ジャケットメンバーの少なくとも一部は、クロマトグラフィーカラムの少なくとも一部に接触しないように構成される。一部の実施形態では、ジャケットメンバーの少なくとも一部は、クロマトグラフィーカラムに接触しないように構成される。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、クロマトグラフィーカラムに接触しないように構成される。
一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、断熱層を１つまたは複数のジャケット構成要素とクロマトグラフィーカラムとの間に配置することができるように構成される。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、さらに、断熱層を含む。一部の実施形態では、断熱層は、１つまたは複数のジャケット構成要素とクロマトグラフィーカラムの少なくとも一部との間に配置されるように構成される。一部の実施形態では、断熱層は、１つまたは複数のジャケット構成要素とクロマトグラフィーカラムとの間に配置されるように構成される。一部の実施形態では、断熱層は、クロマトグラフィーカラムの少なくとも一部を囲むように構成される。
一部の実施形態では、断熱層は、気体層、例えば、空気層を含む。一部の実施形態では、断熱層は、液体層を含む。一部の実施形態では、断熱層は、固体層を含む。
一部の実施形態では、温度制御メンバーは、クロマトグラフィーカラムに収容される固定相を約３０℃～約３９℃（例えば、３７℃または約３７℃）の標的温度まで加熱するように構成することができる。一部の実施形態では、開始温度は、約２℃、約４℃、約８℃、約１２℃、約１６℃、約２０℃、約２４℃、約２８℃、約３２℃、約３６℃、または約３６℃以上である。一部の実施形態では、温度制御メンバーは、固定相を３７℃または約３７℃に加熱するように構成することができる。一部の実施形態では、温度制御メンバー固定相を約２℃以上、約４℃以上、約８℃以上、約１２℃以上、約１６℃以上、約２０℃以上、約２４℃以上、約２８℃以上、約３２℃以上、約３６℃以上、約３７℃以上、約３８℃以上、約３９℃以上、または約４０℃に加熱するように構成することができる。一部の実施形態では、温度制御メンバーは、固定相を標的温度に維持するように構成することができる。一部の実施形態では、温度制御メンバーは、固定相を標的温度±約５℃、±約４℃、±約３℃、±約２℃、±約１℃、または±約０．５℃に維持するように構成することができる。一部の実施形態では、温度制御メンバーは、固定相を３７℃±約５℃、±約４℃、±約３℃、±約２℃、±約１℃、または±約０．５℃に維持するように構成することができる。
一部の実施形態では、温度制御メンバーは、クロマトグラフィーカラムに収容される固定相の温度を調節または維持するように構成することができる。一部の態様では、温度制御メンバーは、固定相を開始温度（例えば、室温）から約３０℃～約３９℃（例えば、３７℃または約３７℃）の標的温度まで加熱する、例えば、一様に加熱するように構成される。一部の態様では、温度制御メンバーは、さらに、固定相を標的温度に維持するように構成される。
一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、さらに、内部空洞の固定相の温度を測定するように構成された温度センサーを含むことができる。一態様において、温度センサーは、モニタリング／ディスプレイユニットに接続するように構成される。一部の実施形態では、温度センサーは、電源に電気的に接続するように構成される。一部の実施形態では、電源は、ジャケットメンバーの外側に存する。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、さらに、電源を含む。
先行の実施形態のいずれにおいて、温度制御メンバーは、熱源を含むことができる。あるいは、先行の実施形態のいずれにおいて、温度制御メンバーは、ハウジングアセンブリの外部にある熱源に作動可能に接続するように構成することができる。
一部の実施形態では、温度制御メンバーは、発熱体を含む。一部の実施形態では、発熱体は、固定相を一様に加熱するように構成される。
先行の実施形態のいずれにおいて、温度制御メンバーは、電気式発熱体、電磁誘導式発熱体、非電気式発熱体およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される発熱体を含み得る。一態様において、発熱体電気式発熱体である。一部の実施形態では、電気式発熱体は、金属プレート、金属ロッド、金属ワイヤー、またはその組み合せを含む。一態様において、発熱体は、電磁誘導式発熱体である。一部の実施形態では、電磁誘導式発熱体は、内部空洞内の固定相に熱を提供するように構成された帯磁性コアを囲む誘導加熱コイルを含む。一態様において、発熱体は、非電気式発熱体である。
一部の実施形態では、非電気式発熱体は、加熱された流体、例えば、加熱された液体または気体、のための導入口および導出口を含む加熱チャネルを含む。一部の実施形態では、加熱チャネルは、加熱コイルである。一部の実施形態では、加熱された流体は、加熱された水である。一部の実施形態では、加熱された水のための導入口は、加熱された水の外部リザーバーに接続するように構成される。
一部の実施形態では、発熱体は、電気式発熱体である。一部の実施形態では、電気式発熱体は、電源に電気的に接続するように構成される。一部の実施形態では、電源は、ジャケットメンバーの外側に存する。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、さらに電源を含む。
一部の実施形態では、電気式発熱体は、金属プレートを含む。一部の実施形態では、金属プレートは、少なくとも一部が熱伝導性金属、例えば、アルミニウムまたは銅、で作製される。一部の実施形態では、金属プレートは、少なくとも一部がアルミニウムで作製され、例えば、全体がアルミニウムで作製される。一部の実施形態では、電気式発熱体は、さらに、例えば、金属プレートの少なくとも一部と電気式発熱体の他の構成要素の少なくとも一部との間に、電気的絶縁層を含む。一部の実施形態では、電気的絶縁層は、金属プレートの片面の少なくとも一部の、例えば、金属プレートの一面全体の裏面を覆う。
一部の実施形態では、発熱体の少なくとも一部は、クロマトグラフィーカラムの少なくとも一部と接触するように、例えば、直接接触するように構成される。一部の実施形態では、発熱体は、クロマトグラフィーカラムの少なくとも一部と接触するように、例えば、直接接触するように構成される。一部の実施形態では、発熱体は、クロマトグラフィーカラムと接触するように、例えば、直接接触するように構成される。
一部の実施形態では、発熱体の少なくとも一部は、クロマトグラフィーカラムの少なくとも一部に接触しないように構成される。一部の実施形態では、発熱体は、クロマトグラフィーカラムの少なくとも一部に接触しないように構成される。一部の実施形態では、発熱体は、クロマトグラフィーカラムに接触しないように構成される。
一部の実施形態では、発熱体は、クロマトグラフィーカラムの少なくとも一部を囲むように構成される。
一部の実施形態では、温度制御メンバーは、複数の発熱体を含む。一部の実施形態では、温度制御メンバーは、２～１０または約２～１０の発熱体、２～８または約２～８の発熱体、２～６または約２～６の発熱体、あるいは２～４または約２～４の発熱体（それぞれ境界値を含む）を含む。一部の実施形態では、温度制御メンバーは、２つ発熱体を含む。一部の実施形態では、温度制御メンバーは、３つ発熱体を含む。
一部の実施形態では、複数の発熱体は、固定相を一様に加熱するように構成される。
一部の実施形態では、複数の発熱体は、それぞれ、電気式発熱体、電磁誘導式発熱体、非電気式発熱体、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、複数の発熱体は、同一である。一部の実施形態では、複数の発熱体は、異なる発熱体の組合せである。
一部の実施形態では、複数の発熱体は、複数の非電気式発熱体を含む。一部の実施形態では、複数の発熱体は、複数の加熱チャネルを含む。一部の実施形態では、複数の加熱チャネルのそれぞれは、加熱された流体、例えば、加熱された水、のための導入口および導出口を有する。一部の実施形態では、複数の加熱チャネルの少なくとも２つは、お互いに流体結合される。一部の実施形態では、複数の加熱チャネルは、お互いに流体結合される。一部の実施形態では、複数の加熱チャネルの少なくとも１つの導入口は、加熱された液体の外部リザーバーに接続するように構成される。一部の実施形態では、複数の加熱チャネルのそれぞれの導入口は、加熱された液体の外部リザーバーに接続するように構成される。
一部の実施形態では、複数の発熱体は、複数の電気式発熱体、例えば、金属プレートを含む電気式発熱体を含む。一部の実施形態では、複数の電気式発熱体の少なくとも２つは、お互いに電気的に結合される。一部の実施形態では、複数の電気式発熱体お互いに電気的に結合される。一部の実施形態では、複数の電気式発熱体の少なくとも１つは、電源、例えば、ハウジングアセンブリの外部に存するかまたはハウジングアセンブリに含まれる電源、に電気的に接続するように構成される。一部の実施形態では、複数の電気式発熱体のそれぞれは、電源、例えば、ハウジングアセンブリの外部に存するかまたはハウジングアセンブリに含まれる電源、に電気的に接続するように構成される。
一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つの少なくとも一部は、クロマトグラフィーカラムの少なくとも一部と接触するように、例えば、直接接触するように構成される。一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つは、クロマトグラフィーカラムの少なくとも一部と接触するように、例えば、直接接触するように構成される。一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つは、クロマトグラフィーカラムと接触するように、例えば、直接接触するように構成される。一部の実施形態では、複数の発熱体は、クロマトグラフィーカラムと接触するように、例えば、直接接触するように構成される。
一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つの少なくとも一部は、クロマトグラフィーカラムの少なくとも一部に接触しないように構成される。一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つの少なくとも一部は、クロマトグラフィーカラムに接触しないように構成される。一部の実施形態では、複数の発熱体の少なくとも１つは、クロマトグラフィーカラムに接触しないように構成される。一部の実施形態では、複数の発熱体は、クロマトグラフィーカラムに接触しないように構成される。
一部の実施形態では、複数の発熱体は、クロマトグラフィーカラムの周りに、例えば、クロマトグラフィーカラムの周囲の周りに、一様にまたはおよそ一様に分配されるように構成される。
一部の実施形態では、温度制御メンバーは、非電気式発熱体、例えば、加熱された流体のための加熱チャネル、を含む。一部の実施形態では、温度制御メンバーは、複数の非電気式発熱体を含む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、加熱された流体、例えば、加熱された水、のための１つの導入口のための少なくとも開口部および１つの導出口のための少なくとも１つの開口部を含む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、加熱された流体、例えば、加熱された水、のための導入口のための少なくとも２つの開口部および／または導出口のための少なくとも２つの開口部を含む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、電源、例えば、ハウジングアセンブリの外部に存するかまたはハウジングアセンブリに含まれる電源、に電気的に接続するように構成される。
一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、電気式発熱体、例えば、金属プレートを含む電気式発熱体、を含む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、複数の電気式発熱体、を含む。一部の実施形態では、電気式発熱体は、電源に電気的に接続するように構成される。一部の実施形態では、複数の電気式発熱体の少なくとも１つは、電源に電気的に接続するように構成される。一部の実施形態では、複数の電気式発熱体のそれぞれは、電源に電気的に接続するように構成される。
一部の実施形態では、複数の電気式発熱体の少なくとも２つは、お互いに電気的に結合される。一部の実施形態では、複数の電気式発熱体お互いに電気的に結合される。
一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、２つ以上のジャケット構成要素、例えば、約２～１０のジャケット構成要素、２～８のジャケット構成要素、２～６のジャケット構成要素、または２～４のジャケット構成要素（それぞれ境界値を含む）、を含む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、２つのジャケット構成要素を含む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、３つのジャケット構成要素を含む。一部の実施形態では、ジャケットメンバーは、４つのジャケット構成要素を含む。
一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素の少なくとも２つはそれぞれ、発熱体を含む。一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素はそれぞれ、発熱体を含む。
一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素の少なくとも２つはそれぞれ、温度センサーを含む。一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素はそれぞれ、温度センサーを含む。
一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素の少なくとも２つはそれぞれ、非電気式発熱体を含む。一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素の少なくとも２つはそれぞれ、加熱された流体、例えば、加熱された水、のための導入口および導出口を有する加熱チャネルを含む。一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素はそれぞれ、加熱された流体、例えば、加熱された水、のための導入口および導出口を有する加熱チャネルを含む。
一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素の少なくとも２つの加熱チャネルは、お互いに流体結合される。一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素の加熱チャネルは、お互いに流体結合される。
一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素の少なくとも１つは、加熱された流体、例えば、加熱された水、のための導入口のための開口部を含む。一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素はそれぞれ、流体、例えば、加熱された水、のための導入口のための開口部を含む。
一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素の少なくとも１つは、加熱された流体、例えば、加熱された水、のための導出口のための開口部を含む。一部の実施形態では、２つ以上のジャケット構成要素はそれぞれ、流体、例えば、加熱された水、のための導出口のための開口部を含む。
一部の態様では、クロマトグラフィーカラムの少なくとも一部を囲むように放出可能に接続されるように構成された１つまたは複数のジャケット構成要素を含む、カラムクロマトグラフィーのためのジャケットメンバーであって、クロマトグラフィーカラムが、固定相；および１つまたは複数の発熱体を含む温度制御メンバー、を収容するように構成され、１つまたは複数の発熱体が、固定相に熱を提供するように構成され；ならびに、温度制御メンバーが、固定相の温度を調節または維持するように構成される、ジャケットメンバーが、本明細書において提供される。
一部の態様では、クロマトグラフィーカラムの少なくとも一部を囲むように放出可能に接続されるように構成された２つ以上のジャケット構成要素を含む、カラムクロマトグラフィーのためのジャケットメンバーであって、クロマトグラフィーカラムが、固定相；ならびに１つまたは複数の発熱体を含む温度制御メンバーを収容するように構成され、１つまたは複数の発熱体が、固定相に熱を提供するように構成され；ならびに、温度制御メンバーが、固定相の温度を調節または維持するように構成される、ジャケットメンバーが、本明細書において提供される。
一部の態様では、クロマトグラフィーカラムの少なくとも一部を囲むように放出可能に接続されるように構成された２つのジャケット構成要素を含む、カラムクロマトグラフィーのためのジャケットメンバーであって、クロマトグラフィーカラムが、固定相；および加熱コイルである２つの発熱体を含む温度制御メンバーを収容するように構成され。１つまたは複数の発熱体が、固定相に熱を提供するように構成され；ならびに温度制御メンバーが、固定相の温度を調節または維持するように構成される、ジャケットメンバーが、本明細書において提供される。
一部の態様では、クロマトグラフィーカラムの少なくとも一部を囲むように放出可能に接続されるように構成された３つのジャケット構成要素を含む、カラムクロマトグラフィーのためのジャケットメンバーであって、クロマトグラフィーカラムが、固定相；および電気式発熱体である３つの発熱体を含む温度制御メンバーを収容するように構成され、１つまたは複数の発熱体が、固定相に熱を提供するように構成され；ならびに、温度制御メンバーが、固定相の温度を調節または維持するように構成される、ジャケットメンバーが、本明細書において提供される。
ＩＶ．組成物、製剤、および投与方法
選択され、刺激され、および形質導入された細胞、例えば、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞、を含有する組成物、例えば、医薬組成物および製剤など、も提供される。例えば、抗原、例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲによって標的にされる抗原、が発現される、疾患、状態、および障害の治療において、あるいは、検出、診断、および予後予測の方法において、組成物を使用する方法およびその使用も提供される。
Ａ．組成物および製剤
用語「医薬製剤」は、中に含まれる有効成分の生物学的活性を有効にすることができ、ならびに製剤が投与される対象に対して容認できないほどの毒性の追加の成分を含有しないような形態の調製物を意味する。
「薬学的に許容される担体」とは、対象にとって非毒性の、有効成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤、または保存料が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の態様では、担体の選択は、一部には特定の細胞もしくは薬剤によって、および／または投与の方法によって決定される。したがって、様々な適切な製剤がある。例えば、医薬組成物は保存料を含んでもよい。適切な保存料には、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、および塩化ベンザルコニウムが挙げられ得る。一部の態様では、２つまたはそれより多い保存料の混合物が使用される。保存料またはその混合物は、典型的には、組成物全体の約０．０００１重量％～約２重量％の量で存在する。担体は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に記載されている。薬学的に許容される担体は、一般に、使用される投与量および濃度ではレシピエントにとって非毒性であり、以下が挙げられるが、これらに限定されない：リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ならびに／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤。
一部の態様では、緩衝剤が組成物に含まれる。適切な緩衝剤には、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、および様々な他の酸および塩が挙げられる。一部の態様では、２つまたはそれより多い緩衝剤の混合物が使用される。緩衝剤またはその混合物は、典型的には組成物全体の約０．００１％～約４重量％の量で存在する。投与可能な医薬組成物を調製する方法は公知である。例示的な方法は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)により詳細に記載されている。
製剤または組成物はまた、細胞または薬剤を用いて予防または処置されている特定の適応症、疾患または状態にとって有用な１種より多い有効成分を含有する場合があり、それぞれの活性は、互いに悪影響を及ぼさない。このような有効成分は、適宜、意図される目的のために有効である量で組み合わせて存在する。したがって、一部の実施形態では、医薬組成物は、他の薬学的に活性な薬剤または薬物、例えば、化学療法剤、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン等をさらに含む。一部の実施形態では、薬剤または細胞は、塩、例えば、薬学的に許容される塩の形態で投与される。適切な薬学的に許容される酸付加塩として、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸および硫酸ならびに有機酸、例えば、酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸およびアリルスルホン酸、例えば、ｐ－トルエンスルホン酸に由来するものが挙げられる。
医薬組成物は、一部の実施形態では、薬剤または細胞を疾患または状態を処置または予防するのに有効な量、例えば、治療上有効または予防上有効量で含有する。治療的有効性または予防的有効性は一部の実施形態では、処置された対象の定期的な評価によってモニタリングされる。状態に応じた数日間またはそれより長い反復投与については、疾患症状の所望の抑制が生じるまで処置が反復される。しかし、他の投与量レジメンが有用であることがあり、決定することができる。所望の投与量は、組成物の単回ボーラス投与、組成物の複数回ボーラス投与、または組成物の連続注入投与によってデリバリーすることができる。
薬剤または細胞は、任意の適切な手段によって、例えば、ボーラス注入によって、注射、例えば、静脈内もしくは皮下注射、眼球内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、胸膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、サブコンジェクトバル（ｓｕｂｃｏｎｊｅｃｔｖａｌ）注射、結膜下注射、テノン嚢下注射、眼球後注射、眼球周囲注射または後部強膜近傍（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｊｕｘｔａｓｃｌｅｒａｌ）デリバリーによって投与することができる。一部の実施形態では、それらは非経口、肺内および鼻腔内によっておよび必要に応じて局所処置のために病巣内投与によって投与される。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与が含まれる。一部の実施形態では、細胞または薬剤の単回ボーラス投与によって所与の用量が投与される。一部の実施形態では、例えば、３日以下の期間にわたる細胞もしくは薬剤の複数回ボーラス投与によって、または細胞もしくは薬剤の連続注入投与によって投与される。
疾患の予防または処置のために、適当な投与量は、処置されるべき疾患の種類、薬剤（単数または複数）の種類、細胞または組換え受容体の種類、疾患の重症度および経過、薬剤または細胞が予防的または治療的目的のために投与されるか否か、以前の療法、対象の臨床歴および薬剤または細胞に対する応答ならびに主治医の裁量に応じて変わり得る。組成物は、一部の実施形態では、１回で、または一連の処置にわたって対象に適宜投与される。
細胞または薬剤は、標準投与技術、製剤および／またはデバイスを使用して投与され得る。組成物の保存および投与のための製剤およびデバイス、例えば、シリンジおよびバイアルが提供される。細胞に関して、投与は自己である場合も、異種である場合もある。例えば、免疫応答性細胞または前駆体が１つの対象から得られ、同じ対象または異なる適合する対象に投与されてもよい。末梢血由来免疫応答性細胞またはそれらの子孫（例えば、インビボ、エクスビボまたはインビトロ由来）が、カテーテル投与、全身注射、局所注射、静脈内注射、または非経口投与を含む局所注射を介して投与されてもよい。治療用組成物（例えば、遺伝子改変された免疫応答性細胞または神経毒性の症状を処置もしくは寛解させる薬剤を含有する医薬組成物）を投与する場合、治療用組成物は、一般に、単位投与量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）で製剤化される。
製剤は、経口、静脈内、腹腔内、皮下、肺内、経皮、筋肉内、鼻腔内、頬側、舌下、または坐薬投与用のものを含む。一部の実施形態では、薬剤または細胞集団は非経口投与される。用語「非経口」は本明細書で使用される場合、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣内、および腹腔内投与を含む。一部の実施形態では、薬剤または細胞集団は、静脈内、腹腔内、または皮下注射による末梢全身デリバリーを使用して対象に投与される。
組成物は、一部の実施形態では、無菌液体調製物、例えば、等張水溶液、懸濁液、エマルジョン、分散液、または粘性組成物として提供され、該調製物は、一部の態様では選択されたｐＨに緩衝され得る。液体調製物は通常、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物より調製するのが容易である。さらに、液体組成物は、特に注射によって投与するのに幾分より便利である。一方、粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間をもたらす適切な粘度範囲内で製剤化され得る。液体組成物または粘性組成物は担体を含むことができ、担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であってもよい。
無菌注射用溶液は、無菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロース等などの適切な担体、希釈液、または賦形剤との混合物などの溶媒に、薬剤または細胞を組み込むことによって調製することができる。
インビボ投与に使用される製剤は、一般に無菌である。無菌性は、例えば、無菌濾過膜を通じた濾過によって容易に達成され得る。
Ｂ．処置および使用方法
また、例えば、本明細書で記載される、操作された細胞（例えば、ＣＡＲ発現細胞）または操作された細胞（例えば、ＣＡＲ発現細胞）を含有する組成物のいずれかを投与することを含む処置の方法も本明細書において提供される。一部の態様ではまた、本明細書で記載される、操作された細胞（例えば、ＣＡＲ発現細胞）または操作された細胞（例えば、ＣＡＲ発現細胞）を含有する組成物のいずれかを、対象、例えば、疾患または障害を有する対象に投与する方法も提供される。一部の態様ではまた、疾患または障害の処置のための、本明細書で記載される、操作された細胞（例えば、ＣＡＲ発現細胞）または操作された細胞（例えば、ＣＡＲ発現細胞）を含有する組成物のいずれかの使用も提供される。一部の態様ではまた、疾患または障害の処置のための医薬の製造のための、本明細書で記載される、操作された細胞（例えば、ＣＡＲ発現細胞）または操作された細胞（例えば、ＣＡＲ発現細胞）を含有する組成物のいずれかの使用も提供される。一部の態様ではまた、疾患もしくは障害の処置における使用のための、または疾患もしくは障害を有する対象への投与のための、本明細書で記載される、操作された細胞（例えば、ＣＡＲ発現細胞）または操作された細胞（例えば、ＣＡＲ発現細胞）を含有する組成物のいずれかも提供される。
養子細胞療法のための細胞の投与方法は公知であり、提供される方法および組成物と関連付けて使用することができる。例えば、養子Ｔ細胞療法方法は、例えば、Gruenberg et alの米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号；Rosenbergの米国特許第４，６９０，９１５号；Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oneal. 8(10):577-85に記載されている。例えば、Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933；Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9；Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338を参照のこと。
処置される疾患または状態は、抗原の発現が、疾患、状態または障害の病因に関連するおよび／または関与する、例えば、そのような疾患、状態、または障害を引き起こす、増悪させる、またはさもなければ関与する任意の疾患または状態であり得る。例示的な疾患および状態には、悪性腫瘍または細胞の形質転換（例えば、がん）、自己免疫疾患もしくは炎症性疾患、または例えば、細菌、ウイルスもしくは他の病原体に起因する感染症に関連する疾患または状態を挙げることができる。処置され得る様々な疾患および状態に関連する抗原を含む例示的な抗原は、上に記載されている。特定の実施形態では、キメラ抗原受容体またはトランスジェニックＴＣＲは、疾患または状態に関連する抗原に特異的に結合する。
疾患、状態および障害の中には、固形腫瘍、血液悪性腫瘍および黒色腫を含む、ならびに限局性および転移性腫瘍を含む腫瘍、感染性疾患、例えば、ウイルスまたは他の病原体による感染、例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶおよび寄生虫症ならびに自己免疫疾患および炎症性疾患がある。一部の実施形態では、疾患、障害または状態は、腫瘍、がん、悪性腫瘍、新生物または他の増殖性疾患または障害である。このような疾患として、白血病、リンパ腫、例えば、急性骨髄球性（または骨髄性） 白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄球性（または骨髄性）白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性（またはリンパ芽球性）白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、へアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、小リンパ性リンパ腫（ＳＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、濾胞性リンパ腫、治療抵抗性濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、疾患または状態は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、成人ＡＬＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の中から選択されるＢ細胞悪性腫瘍である。一部の実施形態では、疾患または状態はＮＨＬであり、該ＮＨＬは、侵襲性ＮＨＬ、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ＮＯＳ（新規のおよび低悪性度から形質転換されたもの）、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（Ｔ ｃｅｌｌ／ｈｉｓｔｏｃｙｔｅ－ｒｉｃｈ ｌａｒｇｅ Ｂ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）（ＴＣＨＲＢＣＬ）、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）および／または濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、適宜、濾胞性リンパ腫グレード３Ｂ（ＦＬ３Ｂ）からなる群から選択される。
一部の実施形態では、疾患または状態は、感染性の疾患または状態、例えば、それだけには限らないが、ウイルス性、レトロウイルス性、細菌性および原生動物性感染症、免疫不全、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、ＢＫポリオーマウイルスである。一部の実施形態では、疾患または状態は、自己免疫性または炎症性疾患または状態、例えば、関節炎、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患、乾癬、強皮症、自己免疫甲状腺疾患、グレーブス病、クローン病、多発性硬化症、喘息および／または移植と関連する疾患もしくは状態である。
一部の実施形態では、疾患または障害と関連する抗原は、αｖβ６インテグリン（ａｖｂ６インテグリン）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、炭酸脱水酵素９（ＣＡ９、ＣＡＩＸまたはＧ２５０としても知られる）、がん精巣抗原、がん／精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ、ＮＹ－ＥＳＯ－１およびＬＡＧＥ－２としても知られる）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、サイクリン、サイクリンＡ２、Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＣＬ－１）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、上皮増殖因子タンパク質（ＥＧＦＲ）、切断型上皮増殖因子タンパク質（ｔＥＧＦＲ）、ＩＩＩ型上皮増殖因子受容体突然変異（ＥＧＦＲ ｖＩＩＩ）、上皮糖タンパク質２（ＥＰＧ－２）、上皮糖タンパク質４０（ＥＰＧ－４０）、エフリンＢ２、エフリン受容体Ａ２（ＥＰＨａ２）、エストロゲン受容体、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５；Ｆｃ受容体相同体５またはＦＣＲＨ５としても知られる）、胎児アセチルコリン受容体（胎児ＡｃｈＲ）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、葉酸受容体アルフ、ガングリオシドＧＤ２、Ｏアセチル化ＧＤ２（ＯＧＤ２）、ガングリオシドＧＤ３、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、Ｇタンパク質共役受容体５Ｄ（ＧＰＣＲ５Ｄ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（受容体チロシンキナーゼｅｒｂ－Ｂ２）、Ｈｅｒ３（ｅｒｂ－Ｂ３）、Ｈｅｒ４（ｅｒｂ－Ｂ４）、ｅｒｂＢ二量体、ヒト高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、Ｂ型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原Ａ１（ＨＬＡ－Ａ１）、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）、ＩＬ－２２受容体アルファ（ＩＬ－２２Ｒα）、ＩＬ－１３受容体アルファ２（ＩＬ－１３Ｒα２）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ｋｄｒ）、カッパ軽鎖、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、Ｌ１－ＣＡＭのＣＥ７エピトープ、ロイシンリッチリピート含有８ファミリーメンバーＡ（ＬＲＲＣ８Ａ）、ルイスＹ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ１０、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ｃ－Ｍｅｔ、マウスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ１６、ナチュラルキラー群２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）リガンド、メランＡ（ＭＡＲＴ－１）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、がん胎児性抗原、黒色腫の選択的に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、サバイビン、トロホプラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ、５Ｔ４としても知られる）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ１、ＴＹＲＰ１またはｇｐ７５としても知られる）、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２、ドパクロムトートメラーゼとしても知られる、ドパクロムデルタ－イソメラーゼまたはＤＣＴ）血管上皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血管上皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）、病原体特異的または病原体によって発現された抗原またはユニバーサルタグと関連する抗原および／または ビオチン化分子および／またはＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶもしくは他の病原体によって発現される分子であるか、またはそれを含む。一部の実施形態において受容体によって標的化される抗原は、Ｂ細胞悪性腫瘍に関連する抗原、例えば多くの公知のＢ細胞マーカーのいずれかを含む。一部の実施形態では、抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＣＤ４５、ＣＤ２１、ＣＤ５、ＣＤ３３、Ｉｇカッパ、Ｉｇラムダ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂまたはＣＤ３０であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、抗原は、病原体特異的または病原体によって発現された抗原、例えば、ウイルス抗原（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶに由来するウイルス抗原）、細菌抗原および／または寄生虫抗原であるか、またはそれを含む。
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片（例えば、ｓｃＦｖまたはＶＨドメイン）は、抗原、例えば、ＣＤ１９を特異的に認識する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体または抗原結合性断片に由来するか、またはその変異体である。一部の実施形態では、細胞療法、例えば養子Ｔ細胞療法は自家移植によって実施される。自家移植では、細胞は、細胞療法を受けることになっている対象から、またはそのような対象に由来する試料から単離および／またはさもなければ調製される。故に、一部の態様では、細胞は、処置および細胞を必要とする対象、例えば患者に由来し、単離および処理後に同じ対象に投与される。
細胞は、任意の適切な手段によって、例えば、ボーラス注入によって、注射、例えば、静脈内もしくは皮下注射、眼球内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、胸膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、サブコンジェクトバル（ｓｕｂｃｏｎｊｅｃｔｖａｌ）注射、結膜下注射、テノン嚢下注射、眼球後注射、眼球周囲注射または後部強膜近傍デリバリーによって投与することができる。一部の実施形態では、それらは、非経口、肺内および鼻腔内によって、必要に応じて局所処置のために、病巣内投与によって投与される。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与が含まれる。一部の実施形態では、細胞の単回ボーラス投与によって所与の用量が投与される。一部の実施形態では、例えば、３日以下の期間にわたる細胞の複数回ボーラス投与によって、または細胞の連続注入投与によって投与される。一部の実施形態では、細胞用量または任意の追加の療法、例えば、リンパ球枯渇療法、介入療法および／または併用療法の投与は、外来患者送達によって実行される。
疾患の予防または処置のために、適当な投与量は、処置されるべき疾患の種類、細胞または組換え受容体の種類、疾患の重症度および経過、細胞が予防的または治療的目的のために投与されるか否か、以前の療法、対象の臨床歴および細胞に対する応答ならびに主治医の裁量に応じて変わり得る。組成物および細胞は、一部の実施形態では、１回で、または一連の処置にわたって対象に適宜投与される。
一部の実施形態では、細胞の用量は、提供された方法に従って、および／または提供される製造品もしくは組成物を用いて対象に投与される。一部の実施形態では、用量のサイズまたはタイミングは、対象における特定の疾患または状態の関数として決定される。一部の場合には、特定の疾患のための用量のサイズまたはタイミングは、提供される記載を考慮して。経験的に決定することができる。
一部の実施形態では、細胞の用量は、２×１０５もしくは約２×１０５個の細胞／ｋｇから２×１０６もしくは約２×１０６個の細胞／ｋｇの間、例えば、４×１０５もしくは約４×１０５個の細胞／ｋｇから１×１０６もしくは約１×１０６個の細胞／ｋｇの間または６×１０５もしくは約６×１０５個の細胞／ｋｇから８×１０５もしくは約８×１０５個の細胞／ｋｇの間を含む。一部の実施形態では、細胞の用量は、対象の体重１ｋｇ当たり（細胞／ｋｇ）、２×１０５個以下の細胞（例えば、抗原発現性、例えば、ＣＡＲ発現細胞）、例えば、３×１０５もしくは約３×１０５個細胞／ｋｇ以下、４×１０５もしくは約４×１０５個細胞／ｋｇ以下、５×１０５もしくは約５×１０５個細胞／ｋｇ以下、６×１０５もしくは約６×１０５個細胞／ｋｇ以下、７×１０５もしくは約７×１０５個細胞／ｋｇ以下、８×１０５もしくは約８×１０５個細胞／ｋｇ以下、９×１０５もしくは約９×１０５個細胞／ｋｇ以下、１×１０６もしくは約１×１０６個細胞／ｋｇ以下または２×１０６もしくは約２×１０６個細胞／ｋｇ以下を含む。一部の実施形態では、細胞の用量は、対象の体重１ｋｇ当たり（細胞／ｋｇ）、少なくとも２×１０５または少なくとも約２×１０５または２×１０５または約２×１０５個の細胞（例えば抗原発現性、例えば、ＣＡＲ発現細胞）、例えば、少なくとも３×１０５または少なくとも約３×１０５または３×１０５または約３×１０５個の細胞／ｋｇ、少なくとも４×１０５または少なくとも約４×１０５または４×１０５または約４×１０５個の細胞／ｋｇ、少なくとも５×１０５または少なくとも約５×１０５または５×１０５または約５×１０５個の細胞／ｋｇ、少なくとも６×１０５または少なくとも約６×１０５または６×１０５または約６×１０５個の細胞／ｋｇ、少なくとも７×１０５または少なくとも約７×１０５または７×１０５または約７×１０５個の細胞／ｋｇ、少なくとも８×１０５または少なくとも約８×１０５または８×１０５または約８×１０５個の細胞／ｋｇ、少なくとも９×１０５または少なくとも約９×１０５または９×１０５または約９×１０５個の細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０６または少なくとも約１×１０６または１×１０６または約１×１０６個の細胞／ｋｇまたは少なくとも２×１０６または少なくとも約２×１０６または２×１０６または約２×１０６個の細胞／ｋｇを含む。
一部の実施形態では、細胞の用量は、細胞の均一用量または細胞の固定用量であり、その結果、細胞の用量は、対象の体表面積または体重に縛られない、またはそれをベースとしない。
一部の実施形態では、例えば、対象がヒトである場合には、用量は、約５×１０８個より少ない総組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）発現細胞、Ｔ細胞または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、例えば、約１×１０６～５×１０８個の範囲のこのような細胞、例えば、２×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８または５×１０８個のこのような細胞全体または前記の値のうちいずれか２つの間の範囲を含む。
一部の実施形態では、遺伝子操作された細胞の用量は、１×１０５～５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、１×１０５～２．５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、１×１０５～１×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、１×１０５～５×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、１×１０５～２．５×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、１×１０５～１×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、１×１０５～５×１０６個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、１×１０５～２．５×１０６個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、１×１０５～１×１０６個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、１×１０６～５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、１×１０６～２．５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、１×１０６～１×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、１×１０６～５×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、１×１０６～２．５×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、１×１０６～１×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、１×１０６～５×１０６個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、１×１０６～２．５×１０６個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、２．５×１０６～５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、２．５×１０６～２．５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、２．５×１０６～１×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、２．５×１０６～５×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、２．５×１０６～２．５×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、２．５×１０６～１×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、２．５×１０６～５×１０６個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、５×１０６～５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、５×１０６～２．５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、５×１０６～１×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、５×１０６～５×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、５×１０６～２．５×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、５×１０６～１×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、１×１０７～５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、１×１０７～２．５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、１×１０７～１×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、１×１０７～５×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、１×１０７～２．５×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、２．５×１０７～５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、２．５×１０７～２．５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、２．５×１０７～１×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、２．５×１０７～５×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、５×１０７～５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、５×１０７～２．５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、５×１０７～１×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、１×１０８～５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、１×１０８～２．５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞もしくは２．５×１０８～５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞または約１×１０５～５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約１×１０５～２．５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約１×１０５～１×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約１×１０５～５×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約１×１０５～２．５×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約１×１０５～１×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約１×１０５～５×１０６個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約１×１０５～２．５×１０６個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約１×１０５～１×１０６個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約１×１０６～５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約１×１０６～２．５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約１×１０６～１×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約１×１０６～５×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約１×１０６～２．５×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約１×１０６～１×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約１×１０６～５×１０６個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約１×１０６～２．５×１０６個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約２．５×１０６～５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約２．５×１０６～２．５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約２．５×１０６～１×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約２．５×１０６～５×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約２．５×１０６～２．５×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約２．５×１０６～１×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約２．５×１０６～５×１０６個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約５×１０６～５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約５×１０６～２．５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約５×１０６～１×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約５×１０６～５×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約５×１０６～２．５×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約５×１０６～１×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約１×１０７～５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約１×１０７～２．５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約１×１０７～１×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約１×１０７～５×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約１×１０７～２．５×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約２．５×１０７～５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約２．５×１０７～２．５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約２．５×１０７～１×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約２．５×１０７～５×１０７個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約５×１０７～５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約５×１０７～２．５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約５×１０７～１×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約１×１０８～５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞、約１×１０８～２．５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞もしくは約２．５×１０８～５×１０８個の総ＣＡＲ発現Ｔ細胞を含む。
一部の実施形態では、細胞は、組合せ処置の一部として、例えば、別の治療介入、例えば抗体または操作された細胞または受容体または剤（細胞傷害性薬剤または治療剤など）と同時に、または任意の順で連続的に投与される。一部の実施形態において細胞は、１つもしくは複数の追加の治療剤と共に、または別の治療介入に関連して、同時にまたは任意の順で連続的に共投与される。一部の状況では、細胞集団が１つもしくは複数の追加の治療剤の効果を増強するように、またはその逆となるように、細胞は十分に近い時間内に別の治療と共投与される。一部の実施形態では、細胞は、１つまたは複数の追加の治療剤の前に投与される。一部の実施形態では、細胞は、１つまたは複数の追加の治療剤の後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加の薬剤は、例えば持続性を増強するＩＬ－２などのサイトカインを含む。一部の実施形態では、方法は化学療法剤の投与を含む。
一部の実施形態では、方法は、例えば、投与の前に腫瘍負荷を低減するための化学療法剤、例えば、コンディショニング化学療法剤の投与を含む。
免疫枯渇（例えば、リンパ球枯渇）療法で対象をプレコンディショニングすることは、一部の態様では、養子細胞療法（ＡＣＴ）の効果を改善し得る。
したがって、一部の実施形態では、方法は、細胞療法の開始の前に、プレコンディショニング剤、例えば、リンパ球枯渇剤または化学療法剤、例えば、シクロホスファミド、フルダラビンまたはそれらの組合せを対象に投与することを含む。例えば、対象は、プレコンディショニング剤を、細胞療法の開始の少なくとも２日前、例えば、少なくとも３、４、５、６または７日前に投与され得る。一部の実施形態では、対象は、細胞療法の開始前７日以内、例えば、６、５、４、３または２日以内にプレコンディショニング剤を投与される。
一部の実施形態では、対象は、２０ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの間または約２０ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの間、例えば、４０ｍｇ／ｋｇから８０ｍｇ／ｋｇの間または約４０ｍｇ／ｋｇから８０ｍｇ／ｋｇの間の用量のシクロホスファミドでプレコンディショニングされる。一部の態様では、対象は、６０ｍｇ／ｋｇまたは約６０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドでプレコンディショニングされる。一部の実施形態では、シクロホスファミドは、単回用量で投与される場合があり、例えば、毎日、隔日で、３日毎に与えられる複数の用量で投与される場合もある。一部の実施形態では、シクロホスファミドは、１日１回、１または２日間投与される。リンパ球枯渇剤がシクロホスファミドを含む一部の実施形態では、対象には、１００ｍｇ／ｍ２から５００ｍｇ／ｍ２もしくは約１００ｍｇ／ｍ２から５００ｍｇ／ｍ２の間、例えば、２００ｍｇ／ｍ２から４００ｍｇ／ｍ２もしくは約２００ｍｇ／ｍ２から４００ｍｇ／ｍ２の間または境界を含めて２５０ｍｇ／ｍ２から３５０ｍｇ／ｍ２の用量でシクロホスファミドが投与される。場合によっては、対象には、約３００ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミドが投与される。一部の実施形態では、シクロホスファミドは、単回用量で投与される場合があり、例えば、毎日、隔日で、３日毎に与えられる複数の用量で投与される場合もある。一部の実施形態では、シクロホスファミドは、毎日、例えば、１～５日間、例えば、３～５日間投与される。場合によっては、対象には細胞療法の開始前に約３００ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミドが毎日３日間投与される。
リンパ球枯渇剤がフルダラビンを含む一部の実施形態では、対象には１ｍｇ／ｍ２から１００ｍｇ／ｍ２もしくは約１ｍｇ／ｍ２から１００ｍｇ／ｍ２の間、例えば、境界を含めて１０ｍｇ／ｍ２から７５ｍｇ／ｍ２、１５ｍｇ／ｍ２から５０ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２から４０ｍｇ／ｍ２または２４ｍｇ／ｍ２から３５ｍｇ／ｍ２の間または約１０ｍｇ／ｍ２から７５ｍｇ／ｍ２、１５ｍｇ／ｍ２から５０ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２から４０ｍｇ／ｍ２または２４ｍｇ／ｍ２から３５ｍｇ／ｍ２の間の用量のフルダラビンが投与される。場合によっては、対象には、約３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビンが投与される。一部の実施形態では、フルダラビンは、単回用量で投与される場合があり、例えば、毎日、隔日で、３日毎に与えられる複数の用量で投与される場合もある。一部の実施形態では、フルダラビンは、毎日、例えば、１～５日間、例えば、３～５日間投与される。場合によっては、対象には、細胞療法の開始前に約３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビンが毎日３日間投与される。
一部の実施形態では、リンパ球枯渇剤は、薬剤の組合せ、例えば、シクロホスファミドとフルダラビンの組合せを含む。したがって、薬剤の組合せは、シクロホスファミドを任意の用量または投与スケジュール、例えば、上記のもので、およびフルダラビンを任意の用量または投与スケジュール、例えば、上記のもので含み得る。例えば、一部の態様では、対象には、第１のまたはその後の用量の前に、６０ｍｇ／ｋｇ（約２ｇ／ｍ２）のシクロホスファミドおよび３～５用量の２５ｍｇ／ｍ２のフルダラビンが投与される。
細胞の投与後、一部の実施形態では操作された細胞集団の生物活性が、例えばいくつかの公知の方法のいずれかによって測定される。評価するパラメーターには、インビボでは、例えばイメージングによる、またはエクスビボでは、例えばＥＬＩＳＡもしくはフローサイトメトリーによる、抗原への操作されたまたは天然のＴ細胞または他の免疫細胞の特異的結合が挙げられる。ある特定の実施形態では、標的細胞を破壊する操作された細胞の能力は、例えば、Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009)、およびHerman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)に記載された細胞傷害性アッセイなどの、公知の任意の適切な方法を使用して測定することができる。ある特定の実施形態では、細胞の生物活性は、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、およびＴＮＦなどの１つまたは複数のサイトカインの発現および／または分泌をアッセイすることによって測定される。一部の態様では生物活性は、腫瘍負荷または腫瘍量の低下などの臨床転帰を評価することによって測定される。
ある特定の実施形態では、操作された細胞は、それらの治療的または予防的有効性が向上するようにいくつもの方法でさらに改変される。例えば、集団によって発現される操作されたＣＡＲまたはＴＣＲは、標的化部分に直接、またはリンカーを通じて間接的にコンジュゲートされ得る。化合物、例えばＣＡＲまたはＴＣＲを標的化部分にコンジュゲートする行為は、公知である。例えば、Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995)、および米国特許第５，０８７，６１６号を参照のこと。
一部の実施形態では、細胞は、併用処置の一部として、例えば、別の治療介入、例えば、抗体または操作された細胞または受容体または薬剤、例えば、細胞傷害性薬剤もしくは治療剤と同時に、または任意の順序でそれと連続して投与される。細胞は、一部の実施形態では、１つもしくは複数の追加の治療剤と共に、または別の治療介入に関連して、同時に、または任意の順序で連続して共投与される。一部の状況では、細胞集団が１つもしくは複数の追加の治療剤の効果を増強するように、またはその逆となるように、細胞は十分に近い時間内に別の治療と共投与される。一部の実施形態では、細胞は、１つまたは複数の追加の治療剤の前に投与される。一部の実施形態では、細胞は、１つまたは複数の追加の治療剤の後に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加の薬剤は、例えば持続性を増強するためにＩＬ－２などのサイトカインを含む。
Ｖ．定義
別に定義されない限り、本明細書において使用される、本分野の全ての用語、表記法ならびに他の技術および科学用語または用語法は、特許請求の範囲の主題が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有することが意図される。一部の場合、通常理解される意味を有する用語は、明確にするためにおよび／または参照を容易にするために本明細書において定義され、本明細書におけるそのような定義の包含は、必ずしも、当該技術分野において一般的に理解されている定義との実質的な相違を表すとは解釈すべきでない。
本明細書において、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、別に明確に示されない限り、複数の言及を含む。例えば、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」とは、「少なくとも１つの」または「１つまたは複数の」を含む。本明細書において説明される態様および変形は、態様および変形「からなること」および／または「から本質的になること」を含むことが理解される。
本開示を通じて、特許請求される主題の様々な態様が範囲形式で提示される。範囲形式における説明は、単に便利および簡潔さのためであり、特許請求の範囲の主題の範囲に対する変更不能な限定として解釈すべきでないことを理解すべきである。したがって、範囲の記載は、特に開示される全ての可能な下位範囲およびその範囲内の個々の数値を有すると考えるべきである。例えば、値の範囲が提供される場合には、その範囲の上限と下限の間の介在する各値と、その記載された範囲中の任意の他の記載された値または介在する値の間のより小さい範囲は、特許請求される主題内に包含されるということは理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は独立して、より小さい範囲に含まれてもよく、また、特許請求の範囲の主題の範囲内に包含され、示される範囲内の任意の特に除外される限定を受ける。示される範囲が限定のうちの１つまたは両方を含む場合、また、それらの含まれる限定のいずれかまたは両方を除外する範囲は、特許請求の範囲の主題に含まれる。これは範囲の広さに関係なく適用される。
用語「約」とは、本明細書で使用される「約」という用語は、容易に知られるそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書中の「約」を伴う値またはパラメーターについての言及は、その値またはパラメーターそれ自体を対象とする実施形態を含み（かつ説明する）。例えば、「約Ｘ」に言及する説明は、「Ｘ」の説明を含む。
本明細書で使用する場合、細胞または細胞の集団が、特定のマーカーについて「陽性」であるという記載は、特定のマーカー、通常、表面マーカーの細胞上または細胞中での検出可能な存在を指す。表面マーカーについて言及する場合、この用語は、フローサイトメトリーによって、例えばマーカーに特異的に結合する抗体により染色し、前記抗体を検出することによって検出される表面発現の存在を指し、ここで、染色は、他は同一の条件下においてアイソタイプ適合対照について同じ手順を行って検出される染色を実質的に超えるレベルにおいて、かつ／またはそのマーカーについて陽性であることが公知の細胞についてのレベルと実質的に同様のレベルにおいて、かつ／またはそのマーカーについて陰性であることが公知の細胞についてのレベルよりも実質的に高いレベルにおいて、フローサイトメトリーによって検出可能である。
本明細書で使用される場合、細胞または細胞集団が特定のマーカーに対して「陰性」であるという記述は、特定のマーカー、典型的には表面マーカーの、細胞上または細胞内の実質的な検出可能な存在がないことを指す。表面マーカーに関して、該用語は、フローサイトメトリーによって、例えば、マーカーに特異的に結合する抗体で染色し、前記抗体を検出することによって検出されるような表面発現がないことを指し、他は同一の条件下のアイソタイプ適合対照を用いて同じ手順を行って検出される染色を実質的に上回るレベル、および／またはマーカーに対して陽性であることが公知の細胞より実質的に低いレベル、および／またはマーカーに対して陰性であることが公知の細胞と比較して実質的に同様のレベルでは、染色はフローサイトメトリーによって検出されない。
本明細書において使用される場合、組成物は、２つまたはそれより多い、細胞を含む生成物、物質または化合物の任意の混合物を指す。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはそれらの任意の組合せであり得る。
本明細書で使用される場合、「対象」は、ヒトまたは他の動物などの哺乳動物であり、典型的にはヒトである。
ＶＩ．例示的な実施形態
提供される実施形態の中には以下がある：
１．Ｔ細胞のオンカラム形質導入の方法であって、
（ａ）複数のＴ細胞をＴ細胞刺激試薬および組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含むウイルスベクターと同時に接触させることであって、複数のＴ細胞は、クロマトグラフィーカラムの内部空洞中に含まれる固定相上に固定化されていること、
（ｂ）複数のＴ細胞を、Ｔ細胞刺激試薬およびウイルスベクターの存在下でインキュベートすること、ならびに
（ｃ）接触の２４時間以内にクロマトグラフィーカラムから複数のＴ細胞を収集し、それによって、組換えタンパク質で形質導入されたＴ細胞を含む組成物を生成すること
を含む、方法。
２．固定相が、複数のＴ細胞の表面上に発現された選択マーカーに特異的に結合する選択剤を含み、選択マーカーへの選択剤の特異的結合が、固定相上での複数のＴ細胞の固定化を達成する、実施形態１に記載の方法。
３．Ｔ細胞のオンカラム形質導入の方法であって、
（ａ）複数のＴ細胞を含む試料を、クロマトグラフィーカラムの内部空洞に添加することであって、内部空洞は、複数のＴ細胞の表面上に発現された選択マーカーに特異的に結合する選択剤を含む固定相を含み、それによって、複数のＴ細胞を固定相上に固定化すること、
（ｂ）クロマトグラフィーカラム上に固定化されている複数のＴ細胞を、Ｔ細胞刺激試薬および組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むウイルスベクターと同時に接触させること、
（ｃ）複数のＴ細胞をＴ細胞刺激試薬およびウイルスベクターの存在下でインキュベートすること、ならびに
（ｄ）接触の２４時間以内にクロマトグラフィーカラムから複数のＴ細胞を収集し、それによって、組換えタンパク質で形質導入されたＴ細胞を含む組成物を生成すること
を含む、方法。
４．刺激試薬およびウイルスベクターが、別個の組成物として複数のＴ細胞と接触される、実施形態１～３のいずれかに記載の方法。
５．刺激試薬およびウイルスベクターが、同一組成物中の混合物として複数のＴ細胞と接触される、実施形態１～５のいずれかに記載の方法。
６．Ｔ細胞のオンカラム形質導入の方法であって、
（ａ）Ｔ細胞刺激試薬およびウイルスベクター調製物を含む混合物を調製すること、
（ｂ）クロマトグラフィーカラムで、複数のＴ細胞を混合物と接触させることであって、複数のＴ細胞は、クロマトグラフィーカラムの内部空洞中に含まれる固定相上に固定化されていること、
（ｃ）複数のＴ細胞をＴ細胞刺激試薬およびウイルスベクターの存在下でインキュベートすること、ならびに
（ｄ）接触の２４時間以内に、クロマトグラフィーカラムから複数のＴ細胞を収集し、それによって、組換えタンパク質で形質導入されたＴ細胞を含む組成物を生成すること
を含む、方法。
７．Ｔ細胞のオンカラム形質導入の方法であって、
（ａ）複数のＴ細胞を含む試料を、クロマトグラフィーカラムの内部空洞に添加することであって、内部空洞は、複数のＴ細胞の表面上に発現された選択マーカーに特異的に結合する選択剤を含む固定相を含み、それによって、固定相上に複数のＴ細胞を固定化すること、
（ｂ）クロマトグラフィーカラムの内部空洞に、Ｔ細胞刺激試薬およびウイルスベクターを含む混合物を添加することによって、複数のＴ細胞を、Ｔ細胞刺激剤および組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むウイルスベクターと接触させること、
（ｃ）Ｔ細胞刺激試薬およびウイルスベクターの存在下で複数のＴ細胞をインキュベートすること、ならびに
（ｄ）混合物の添加の２４時間以内にクロマトグラフィーカラムから複数のＴ細胞を収集し、それによって、組換えタンパク質で形質導入されたＴ細胞を含む組成物を生成すること
を含む、方法。
８．刺激試薬およびウイルスベクターを混合して、刺激試薬および組換え核酸分子を含む混合物を形成することを含む、実施形態６または実施形態７に記載の方法。
９．接触させることが、内部空洞に試料を添加した後１０分以内もしくは約１０分以内に、２０分以内もしくは約２０分以内に、３０分以内もしくは約３０分以内に、４５分以内もしくは約４５分以内に、６０分以内もしくは約６０分以内に、９０分以内もしくは約９０分以内に、または１２０分以内もしくは約１２０分以内に開始される、実施形態１～８のいずれかに記載の方法。
１０．接触されることが、内部空洞に試料を添加した後６０分以内または約６０分以内に開始される、実施形態４～９のいずれかに記載の方法。
１１．インキュベートすることの少なくとも一部分が、約３５℃から約３９℃の間の温度で実行される、実施形態１～１０のいずれかに記載の方法。
１２．インキュベートすることの少なくとも一部分が、３７℃または約３７℃の温度で実行される、実施形態１～１１のいずれかに記載の方法。
１３．固定相の温度が、固定相に熱を提供するように構成された１つまたは複数の加熱エレメントによって調節される、実施形態１１または実施形態１２に記載の方法。
１４．Ｔ細胞刺激剤およびウイルスベクターが、無血清培地中の複数のＴ細胞と接触され、インキュベーションが、無血清培地中で実行される、実施形態１～１３のいずれかに記載の方法。
１５．無血清培地が、１種または複数の組換えＴ細胞刺激性サイトカインを含む、実施形態１４に記載の方法。
１６．Ｔ細胞刺激剤およびウイルスベクターが、１種または複数の組換えＴ細胞刺激性サイトカインを含む培地中の複数のＴ細胞と接触される、実施形態１～１５のいずれかに記載の方法。
１７．混合物が、１種または複数の組換えＴ細胞刺激性サイトカインを含む培地である、実施形態６～１６のいずれかに記載の方法。
１８．培地が無血清培地である、実施形態１７に記載の方法。
１９．１つまたは複数の組換えサイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７から選択される、実施形態１５～１８のいずれかに記載の方法。
２０．１つまたは複数の組換えサイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７である、実施形態１５～１９のいずれかに記載の方法。
２１．Ｔ細胞刺激剤が、各々、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、境界を含めて、０．１μｇから２０μｇの間もしくは約０．１μｇから約２０μｇの間、境界を含めて、０．４μｇから８μｇの間もしくは約０．４μｇから約８μｇの間、境界を含めて、０．８μｇから４μｇの間もしくは約０．８μｇから約４μｇの間の量で複数のＴ細胞と接触される、実施形態１～２０のいずれかに記載の方法。
２２．Ｔ細胞刺激剤が、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、境界を含めて、１μｇから２μｇの間もしくは約１μｇから約２μｇの間の量で複数のＴ細胞と接触される、実施形態１～２１のいずれかに記載の方法。
２３．混合物が、各々、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、境界を含めて、０．１μｇから２０μｇの間もしくは約０．１μｇから約２０μｇの間、境界を含めて、０．４μｇから８μｇの間もしくは約０．４μｇから約８μｇの間、または境界を含めて、０．８μｇから４μｇの間もしくは約０．８μｇから約４μｇの間のＴ細胞刺激剤の量を含む、実施形態６～２３のいずれかに記載の方法。
２４．混合物が、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、境界を含めて、１μｇから２μｇの間または約１μｇから約２μｇの間のＴ細胞刺激剤の量を含む、実施形態１～２３のいずれかに記載の方法。
２５．ウイルスベクターが、複数のＴ細胞と、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、境界を含めて、０．１μＬから１００μＬの間もしくは約０．１μＬから約１００μＬの間、境界を含めて、０．５μＬから５０μＬの間もしくは約０．５μＬから５０μＬの間または境界を含めて、１μＬから２５μＬの間もしくは約１μＬから約２５μＬの間の体積の各ウイルスベクターの調製物で接触される、実施形態１～２４のいずれかに記載の方法。
２６．ウイルスベクターが、複数のＴ細胞と、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、境界を含めて、２μＬから１０μＬの間または約２μＬから約１０μＬの間のウイルスベクターの調製物の体積で、適宜、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、６μＬまたは約６μＬの体積で接触される、実施形態１～２５のいずれかに記載の方法。
２７．混合物が、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、境界を含めて、０．１μＬから１００μＬの間もしくは約０．１μＬから約１００μＬの間、境界を含めて、０．５μＬから５０μＬの間もしくは約０．５μＬから約５０μＬの間または境界を含めて、１μＬから２５μＬの間もしくは約１μＬから約２５μＬの間の体積の各ウイルスベクターの調製物を含む、実施形態６～２５のいずれかに記載の方法。
２８．混合物が、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、境界を含めて、２μＬから１０μＬの間または約２μＬから約１０μＬの間の体積のウイルスベクター調製物、適宜、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、６μＬまたは約６μＬの体積のウイルスベクターの調製物を含む、実施形態６～２７のいずれかに記載の方法。
２９．ウイルスベクターの調製物が、１×１０６ＴＵ／ｍＬから１×１０９ＴＵ／ｍＬの間もしくは約１×１０６ＴＵ／ｍＬから約１×１０９ＴＵ／ｍＬの間、１×１０６ＴＵ／ｍＬから１×１０８ＴＵ／ｍＬの間もしくは約１×１０６ＴＵ／ｍＬから約１×１０８ＴＵ／ｍＬの間、１×１０６ＴＵ／ｍＬから１×１０７ＴＵ／ｍＬの間もしくは約１×１０６ＴＵ／ｍＬから約１×１０７ＴＵ／ｍＬの間、１×１０７ＴＵ／ｍＬから１×１０９ＴＵ／ｍＬの間もしくは約１×１０７ＴＵ／ｍＬから約１×１０９ＴＵ／ｍＬの間、１×１０７ＴＵ／ｍＬから１×１０８ＴＵ／ｍＬの間もしくは約１×１０７ＴＵ／ｍＬから約１×１０８ＴＵ／ｍＬの間または１×１０８ＴＵ／ｍＬから１×１０９ＴＵ／ｍＬの間もしくは約１×１０８ＴＵ／ｍＬから約１×１０９ＴＵ／ｍＬの間の力価を有する、実施形態１～２７のいずれかに記載の方法。
３０．収集することが、接触することの２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、９時間、８時間、７時間、６時間または５時間後以内に実行される、実施形態１～２９のいずれかに記載の方法。
３１．収集することが、接触することの、各境界を含めて２時間から２４時間、２時間から２２時間、２時間から２０時間、２時間から１８時間、２時間から１６時間、２時間から１４時間、２時間から１２時間、２時間から１０時間、２時間から９時間、２時間から８時間、２時間から７時間、２時間から６時間、２時間から５時間、３時間から６時間、３時間から５時間、４時間から６時間もしくは４時間から５時間の間、または約２時間から約２４時間、約２時間から約２２時間、約２時間から約２０時間、約２時間から約１８時間、約２時間から約１６時間、約２時間から約１４時間、約２時間から約１２時間、約２時間から約１０時間、約２時間から約９時間、約２時間から約８時間、約２時間から約７時間、約２時間から約６時間、約２時間から約５時間、約３時間から約６時間、約３時間から約５時間、約４時間から約６時間もしくは約４時間から約５時間の間の後に実行される、実施形態１～３０のいずれかに記載の方法。
３２．収集することが、接触することの、４．５時間または約４．５時間後に実行される、実施形態１～３１のいずれかに記載の方法。
３３．Ｔ細胞刺激試薬の存在下でインキュベートすることが、複数の固定化されたＴ細胞のうち１つまたは複数を固定相から放出する、実施形態１～３２のいずれかに記載の方法。
３４．収集することが、カラムに洗浄緩衝液を添加して、インキュベーションの際に固定相への固定化から放出された１個または複数の細胞を収集することを含む、実施形態１～３３のいずれかに記載の方法。
３５．洗浄緩衝液が細胞培地である、実施形態１～３３のいずれかに記載の方法。
３６．細胞培地が、１種または複数の組換えＴ細胞刺激性サイトカインを含み、組換えＴ細胞刺激性サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７から選択されてもよい、実施形態３５に記載の方法。
３７．細胞培地が無血清培地である、実施形態３５または実施形態３６に記載の方法。
３８．細胞培地が、Ｔ細胞を固定相から溶出するための競合剤または遊離結合剤を含まない、実施形態３５～３７のいずれかに記載の方法。
３９．収集することが、固定相から複数のＴ細胞を溶出するための競合剤または遊離結合剤を含む培地を固定相に添加することを含まない、実施形態１～３８のいずれかに記載の方法。
４０．組換えタンパク質で形質導入されたＴ細胞を含む組成物が、競合剤または遊離結合剤を含まない、実施形態１～３９のいずれかに記載の方法。
４１．競合剤または遊離結合剤が、ビオチンまたはビオチンアナログであるか、またはそれを含む、実施形態３７～４０のいずれかに記載の方法。
４２．競合剤または遊離結合剤が、Ｄ－ビオチンであるか、またはそれを含む、実施形態３７～４１のいずれかに記載の方法。
４３．形質導入されたＴ細胞を含む組成物を溶液中でインキュベートすることをさらに含む、実施形態１～４２のいずれかに記載の方法。
４４．さらにインキュベートすることが、３７℃±２℃または約３７℃±２℃の温度で実行される、実施形態４３に記載の方法。
４５．さらにインキュベートすることが、１４日以下、１２日以下、１０日以下、８日以下、６日以下または５日以下の間実行される、実施形態４３または実施形態４４に記載の方法。
４６．さらにインキュベートすることが、形質導入されたＴ細胞の増殖または拡大増殖を誘導するための条件下で実行され、インキュベートすることが、１種または複数の組換えＴ細胞刺激性サイトカインを含む細胞培地中で実行されてもよく、組換えＴ細胞刺激性サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７から選択されてもよい、実施形態４３～４５のいずれかに記載の方法。
４７．さらにインキュベートすることが、Ｔ細胞の最小の拡大増殖もしくは増殖がある、またはさらなる拡大増殖もしくは増殖がない条件下で実行される、実施形態４３～４６のいずれかに記載の方法。
４８．さらにインキュベートすることが、組換えＴ細胞刺激性サイトカインを全く含まない基本培地中で実行される、実施形態４７に記載の方法。
４９．Ｔ細胞刺激試薬が、刺激シグナルをＴ細胞に送達可能である１種または複数の刺激剤を含む、実施形態１～４８のいずれかに記載の方法。
５０．１種または複数の刺激剤のうち少なくとも１種が、Ｔ細胞のＴＣＲ／ＣＤ３複合体、Ｔ細胞のＣＤ３含有複合体および／またはＴ細胞のＩＴＡＭ含有分子を介して刺激シグナルを送達することができる、実施形態４９に記載の方法。
５１．少なくとも１つの刺激剤が、第１の刺激剤であり、刺激試薬が、第１の刺激剤によって送達された刺激シグナルを増強することができる第２の刺激剤をさらに含む、実施形態５０に記載の方法。
５２．第２の刺激剤が、Ｔ細胞の共刺激分子に結合する、実施形態５１に記載の方法。
５３．共刺激分子が、ＣＤ２８、ＣＤ９０（Ｔｈｙ－１）、ＣＤ９５（Ａｐｏ－／Ｆａｓ）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＩＣＯＳ、ＬＡＴ、ＣＤ２７、ＯＸ４０およびＨＶＥＭの中から選択される、５２に記載の方法。
５４．第２の刺激剤がＣＤ２８に結合する、実施形態５２または実施形態５３に記載の方法。
５５．第１の刺激剤が、ＣＤ３に特異的に結合し、第２の刺激剤が、ＣＤ２８に特異的に結合する、実施形態５１～５４のいずれかに記載の方法。
５６．１種または複数の刺激剤が、一価抗体断片を独立に含む、実施形態４９～５５のいずれかに記載の方法。
５７．第１の刺激剤が、ＣＤ３に結合する一価抗体断片を含み、第２の刺激剤が、ＣＤ２８に結合する一価抗体断片を含み、第１の刺激剤が抗ＣＤ３ Ｆａｂであってもよく、第２の刺激剤が抗ＣＤ２８ Ｆａｂであってもよい、実施形態５１～５６のいずれかに記載の方法。
５８．一価抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片および単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される、実施形態５６または実施形態５７に記載の方法。
５９．Ｔ細胞刺激剤が、抗ＣＤ３ Ｆａｂである第１の刺激剤および抗ＣＤ２８ Ｆａｂである第２の刺激剤を含む、実施形態１～５８のいずれかに記載の方法。
６０．１種または複数のＴ細胞刺激剤が、適宜、第１の刺激剤および第２の刺激剤が、固体表面、適宜、ビーズ上に固定化されている、実施形態５１～５９のいずれかに記載の方法。
６１．１種または複数のＴ細胞刺激剤、適宜、第１の刺激剤および第２の刺激剤が、可溶性オリゴマー試薬に可逆的に結合される、実施形態５１～５９のいずれかに記載の方法。
６２．可溶性オリゴマー試薬が、複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン四量体を含む、実施形態６１に記載の方法。
６３．オリゴマー粒子試薬のサイズが、ｉ）５０ｎｍより大きい半径、ｉｉ）少なくとも５×１０６ｇ／ｍｏｌの分子量および／または（ｉｉｉ）少なくとも１００のストレプトアビジンもしくはストレプトアビジンムテイン四量体を含む、実施形態６２に記載の方法。
６４．可溶性オリゴマー粒子試薬が、平均で、境界を含めて、１０００から３０００の間または約１０００から約３０００の間のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン四量体、適宜、境界を含めて、２０００から３０００の間または約２０００から約３０００の間のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン四量体、適宜、２５００または約２５００のストレプトアビジンムテイン四量体を含む、実施形態６２または実施形態６３に記載の方法。
６５．１種または複数のＴ細胞刺激剤の各々、適宜、第１の刺激剤および第２の刺激剤の両方が、可溶性オリゴマー試薬に可逆的に結合する結合パートナーを含む、実施形態６１～６４のいずれかに記載の方法。
６６．結合パートナーがストレプトアビジン結合ペプチドである、実施形態６５に記載の方法。
６７．ストレプトアビジン結合ペプチドが、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号８）、Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１５）、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１７）、ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１６）、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１８）およびＴｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１９）からなる群から選択される配列である、それを含む、実施形態６６に記載の方法。
６８．ストレプトアビジン結合ペプチドが、配列ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１６）を有する、実施形態６６または実施形態６７に記載の方法。
６９．ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン四量体が、ビオチン、ビオチンアナログまたはストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、実施形態６２～６８のいずれかに記載の方法。
７０．ストレプトアビジン結合ペプチドが、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号８）、Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１５）、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１７）、ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１６）、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１８）およびＴｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（配列番号１９）からなる群から選択される、実施形態６９に記載の方法。
７１．ストレプトアビジンムテインが、配列番号１に示されるアミノ酸の配列中のストレプトアビジン中の位置を参照して位置４４～４７に対応する配列位置にアミノ酸配列Ｉｌｅ４４－Ｇｌｙ４５－Ａｌａ４６－Ａｒｇ４７を含む、または
ストレプトアビジンムテインが、配列番号１に示されるアミノ酸の配列中のストレプトアビジン中の位置を参照して位置４４～４７に対応する配列位置にアミノ酸配列Ｖａｌ４４－Ｔｈｒ４５－Ａｌａ４６－Ａｒｇ４７を含む、実施形態６２～７０のいずれかに記載の方法。
７２．ストレプトアビジンムテインが、配列番号３～６、２７、２８、１０４および１０５のいずれかに示されるアミノ酸の配列を含む、実施形態６２～７１のいずれかに記載の方法。
７３．ストレプトアビジンムテインが、配列番号６に示されるアミノ酸の配列を含む、実施形態６２～７２のいずれかに記載の方法。
７４．選択剤が、抗体断片、免疫グロブリン様機能を有するタンパク質性結合分子、Ｉｇドメインを含有する分子、サイトカイン、ケモカイン、アプタマー、ＭＨＣ分子、ＭＨＣ－ペプチド複合体、受容体リガンドおよびそれらの結合断片からなる群から選択される薬剤であるか、またはそれを含む、実施形態２～７３のいずれかに記載の方法。
７５．選択マーカーがＴ細胞共受容体である、
選択マーカーが、Ｔ細胞抗原受容体複合体のメンバーであるか、もしくはそれを含む、
選択マーカーが、ＣＤ３鎖であるか、もしくはそれを含む、
選択マーカーが、ＣＤ３ゼータ鎖であるか、もしくはそれを含む、
選択マーカーが、ＣＤ８であるか、もしくはそれを含む、
選択マーカーが、ＣＤ４であるか、もしくはそれを含む、
選択マーカーが、ＣＤ４５ＲＡであるか、もしくはそれを含む、
選択マーカーが、ＣＤ２７であるか、もしくはそれを含む、
選択マーカーが、ＣＤ２８であるか、もしくはそれを含む、および／または
選択マーカーが、ＣＣＲ７であるか、もしくはそれを含む、実施形態２～７４のいずれかに記載の方法。
７６．選択マーカーが、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８からなる群から選択される、実施形態２～７５のいずれかに記載の方法。
７７．選択マーカーがＣＤ３である、実施形態２～７６のいずれかに記載の方法。
７８．選択剤が、直接的または間接的に固定相に結合される、実施形態２～７７のいずれかに記載の方法。
７９．選択剤が、選択剤が可逆的に結合する選択試薬を介して間接的に固定相に結合される、実施形態１～７８のいずれかに記載の方法。
８０．固定相が、クロマトグラフィーマトリックスであるか、またはそれを含む、実施形態１～７９のいずれかに記載の方法。
８１．固定相が、各境界を含めて、５億から５０億個の細胞、５億から４０億個の細胞、５億から３０億個の細胞、５億から２０億個の細胞、１０億から５０億個の細胞、１０億から４０億個の細胞、１０億から３０億個の細胞もしくは１０億から２０億個の細胞の間または約５億から約５０億個の細胞、約５億から約４０億個の細胞、約５億から約３０億個の細胞、約５億から約２０億個の細胞、約１０億から約５０億個の細胞、約１０億から約４０億個の細胞、約１０億から約３０億個の細胞もしくは約１０億から約２０億個の細胞の間の結合能力を有する、実施形態１～８０のいずれかに記載の方法。
８２．固定相が、各境界を含めて、１０億から２０億個の細胞または約１０億から約２０億個の細胞の間の結合能力を有する、実施形態１～８１のいずれかに記載の方法。
８３．複数のＴ細胞が、抗原特異的Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞および／または制御性Ｔ細胞を含む、実施形態１～８２のいずれかに記載の方法。
８４．Ｔ細胞が、ＣＤ３＋Ｔ細胞を含むか、またはＣＤ４＋Ｔ細胞および／もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、実施形態１～８３のいずれかに記載の方法。
８５．Ｔ細胞が、ヒト対象由来の一次Ｔ細胞であるか、または試料が、ヒト対象に由来する一次Ｔ細胞を含む、実施形態１～８４のいずれかに記載の方法。
８６．試料が、全血試料、バフィーコート試料、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料、未分画Ｔ細胞試料、リンパ球試料、白血球細胞試料、アフェレーシス生成物または白血球アフェレーシス生成物であるか、またはそれを含む、実施形態１～８５のいずれかに記載の方法。
８７．試料が、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス生成物である、実施形態２～８６のいずれかに記載の方法。
８８．アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス生成物が、事前にクライオ凍結されている、実施形態８７のいずれかに記載の方法。
８９．組換えタンパク質が抗原受容体である、実施形態１～８８のいずれかに記載の方法。
９０．組換えタンパク質が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、実施形態１～８９のいずれかに記載の方法。
９１．ＣＡＲが、標的抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインおよびＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、実施形態９０に記載の方法。
９２．細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内ドメインを含む、実施形態９１に記載の方法。
９３．ＣＡＲが、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結する膜貫通ドメインをさらに含む、実施形態９１または実施形態９２に記載の方法。
９４．膜貫通ドメインが、ＣＤ２８の膜貫通部分を含む、実施形態９３に記載の方法。
９５．細胞内シグナル伝達ドメインが、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、実施形態９１～９４のいずれかに記載の方法。
９６．Ｔ細胞共刺激分子が、ＣＤ２８および４１ＢＢからなる群から選択される、実施形態９５に記載の方法。
９７．ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、実施形態１～９６のいずれかに記載の方法。
９８．ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、実施形態１～９７のいずれかに記載の方法。
９９．ウイルスベクターが、ＶＳＶ－Ｇを有する偽型である、実施形態１～９８のいずれかに記載の方法。
１００．さらなるインキュベーションの後に形質導入されたＴ細胞を回収し、それによって形質導入されたＴ細胞のアウトプット組成物を生成することをさらに含む、実施形態４３～９９のいずれかに記載の方法。
１０１．回収の時間で、アウトプット組成物中のナイーブ様細胞のパーセンテージが、アウトプット組成物中の総Ｔ細胞、総ＣＤ４＋Ｔ細胞、総ＣＤ８＋Ｔ細胞の中の、またはその組換えタンパク質発現細胞の６０％または約６０％より多い、実施形態１００に記載の方法。
１０２．ナイーブ様Ｔ細胞が、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ２７＋ＣＣＲ７＋、またはＣＤ６２Ｌ－ＣＣＲ７＋Ｔ細胞を含む、実施形態１０１に記載の方法。
１０３．ナイーブ様Ｔ細胞が、ＣＤ２７＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞を含む、実施形態１０１または実施形態１０２に記載の方法。
１０４．ナイーブ様Ｔ細胞が、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞を含む、実施形態１０１または実施形態１０２に記載の方法。
１０５．凍結保存および／または対象への投与のためにアウトプット組成物の細胞を製剤化することをさらに含む、実施形態１０１～１０４のいずれかに記載の方法。
１０６．回収された細胞が、薬学的に許容される賦形剤または凍結保護剤の存在下で製剤化される、実施形態１０１～１０５のいずれかに記載の方法。
１０７．方法の工程のうち少なくとも１つが、閉鎖されたシステム内で実施される、実施形態１～１０６のいずれかに記載の方法。
１０８．方法の工程の全てが、閉鎖されたシステム内で実施される、実施形態１～１０７のいずれかに記載の方法。
１０９．方法の工程の少なくとも１つが、自動化される、実施形態１～１０８のいずれかに記載の方法。
１１０．方法の工程の全てが自動化される、実施形態１～１０９のいずれかに記載の方法。
１１１．Ｔ細胞のオンカラム形質導入のための製造品であって、
（ａ）（ｉ）Ｔ細胞の表面上の第１の分子および第２の分子にそれぞれ特異的に結合可能な、Ｔ細胞を刺激するための第１の刺激剤および第２の刺激剤、ならびに
（ｉｉ）Ｔ細胞を形質導入するための、組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むウイルスベクター
を含む組成物、ならびに
（ｂ）固定相上にＴ細胞を固定化するためのＴ細胞上の選択マーカーに特異的に結合可能な選択剤を含む固定相
を含む、製造品。
１１２．第１および第２の刺激剤が、組成物中に含まれるＴ細胞刺激試薬に可逆的に結合される、実施形態１１１に記載の製造品。
１１３．選択剤が、選択試薬を介して間接的に固定相に結合される、実施形態１１１または実施形態１１２に記載の製造品。
１１４．固定相が、クロマトグラフィーマトリックスであるか、またはそれを含む、実施形態１１１～１１３のいずれかに記載の製造品。
１１５．クロマトグラフィーマトリックスの全てまたは一部が含有される容器をさらに含む、実施形態１１１～１１４のいずれかに記載の製造品。
１１６．固定相が第１の固定相であり、選択剤が第１の選択剤であり、選択マーカーが第１の選択マーカーであり、製造品が、Ｔ細胞上の第２の選択マーカーに特異的に結合可能な第２の選択剤を含む第２の固定相をさらに含む、実施形態１１１～１１５に記載の製造品。
１１７．第１および第２の固定相が、並列に配置される、実施形態１１６のいずれかに記載の製造品。
１１８．第１および第２の固定相が、連続して配置される、実施形態１１７のいずれかに記載の製造品。
１１９．実施形態１１１～１１８のいずれかに記載の製造品を含む装置。
１２０．装置の１つもしくは複数の構成要素に流体接続された流体入口および／または装置の１つもしくは複数の構成要素に流体接続された流体出口をさらに含む、実施形態１１９に記載の装置。
１２１．閉鎖されたシステムまたは無菌システム中にある、実施形態１１９または実施形態１２０のいずれかに記載の装置。
１２２．実施形態１～１１０のいずれかに記載の方法において使用するための、実施形態１１１～１１８のいずれかに記載の製造品または実施形態１１９～１２１のいずれかに記載の装置。
１２３．方法が、自動化様式で実行される、実施形態１１１～１１８のいずれかに記載の製造品または実施形態１１９～１２１のいずれかに記載の装置。
ＶＩＩ．実施例
以下の実施例は、説明的な目的のためにのみ含まれ、本発明の範囲を限定することを意図しない。
［実施例１］
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ Ｆａｂがコンジュゲートされた、ストレプトアビジンムテインを含むオリゴマー試薬を調製する方法
オリゴマー試薬を、ＳＴＲＥＰ－ＴＡＣＴＩＮ（登録商標）Ｍ２と名付けられた例示的ストレプトアビジンムテインを重合することによって調製した（配列番号６に示されるアミノ酸のムテイン配列を含有するストレプトアビジンホモ四量体、例えば、米国特許第６，１０３，４９３号ならびにVoss and Skerra (1997) Protein Eng., 1:975-982、およびArgarana et al. (1986) Nucleic Acids Research, 1871-1882を参照されたい）。オリゴマー化のためにストレプトアビジンムテインを調製するために、１つまたは複数の反応性チオール基を含有するストレプトアビジンムテインを、マレイミド活性化ストレプトアビジンムテインと共にインキュベートした。チオール化ストレプトアビジンムテインを調製するために、１：１００のモル比で２－イミノチオランヒドロクロリドと共に、２．６ｍＬの総体積で１００ｍＭのホウ酸緩衝液中、約８．５のｐＨ、２４℃で１時間インキュベートすることによって、約１００ｍｇのストレプトアビジンムテインをチオール化した。活性化反応のために、約４００ｍｇのストレプトアビジンムテインを１：２のモル比でスクシンイミジル－６－［（β－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）と共に、リン酸ナトリウム緩衝液中、約１０．４ｍＬの総体積で、約７．２のｐＨ、２４℃で１時間インキュベートした。チオール化および活性化反応をほぼ同時に開始するように調整し、反応期間を制御した。
反応後、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる試料のゲル濾過を個別に実行することによって、試料から２－イミノチオランヒドロクロリドおよびＳＭＰＨを除去した。試料の各２．５ｍＬの体積のために、１ｍＬのＰＤ－１０カラムを平衡化し、チオール化ムテインストレプトアビジンまたはマレイミドムテインストレプトアビジンのいずれかをロードし、３．５ｍＬのカップリング緩衝液（１００ｍＭ ＮａＨ２Ｐ）４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）を添加することによって溶出を実行した。＞１０ｍＬの体積を構成する４カラムでマレイミドムテインストレプトアビジンのゲル濾過を実行し、溶出物をプールした。活性化およびチオール化反応のタイミングならびに活性化およびチオール化反応の終了とオリゴマー化反応の開始の間のタイミングを注意深く制御した。一般に、ゲル濾過の開始、すなわち、活性化およびチオール化反応の終了からオリゴマー化反応が開始されるまで、１０分以下が経過することが許可された。
オリゴマー化のために、次いで、マレイミドストレプトアビジンムテインおよびチオール化ストレプトアビジンムテイン試料を組み合わせて約１７．５ｍＬの全体積とし、７．２のｐＨ、２４℃で約６００ｒｐｍの撹拌条件下で１時間インキュベートした。２－イミノチオランヒドロクロリドと共によりも４倍多くストレプトアビジンムテインをＳＭＰＨと共にインキュベートしたので、オリゴマー化反応の際、チオール化ストレプトアビジンムテインとマレイミドストレプトアビジンムテインのモル比は１：４であった。反応後、オリゴマー化ストレプトアビジンムテイン試薬の残存するＳＨ基を、撹拌（約６００ｒｐｍ）しながら２４℃で１５分間のＮ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）と共にインキュベーションし、続いて４℃でさらに１６～２０時間のインキュベーションによって飽和させた。
ＮＥＭと共にインキュベーション後、オリゴマー化ストレプトアビジンムテインを含有する試料を遠心分離し、上清を０．４５μｍのメンブレン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ製のＭｉｌｌｅｘ－ＨＰ ０．４５μｍ）を通して濾過した。濾過された溶液を、次いで、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒクロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）のためのカラム（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲ ＨｉＰｒｅｐ ２６／６０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中にロードした。１５００ｍＡＵ以上のミリ吸光度単位（ｍＡＵ）を有する画分をプールした。
オリゴマーストレプトアビジンムテインを含有するプールした試料を、１００ｍＭのヒドロキシルアミンを用い、６．３５のｐＨ、室温で１５分間処理した。処理後ヒドロキシルアミンを除去するために、試料をＰＤ１０カラム上にロードし（カラム当たり２．５ｍＬ）、３．５ｍＬの、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２を含有する緩衝液を用いて溶出した。ＰＤ１０溶出液をプールし、０．４５μｍのフィルター、続いて０．２２μｍのフィルターを用いて無菌濾過し、次いで、試料を－８０℃で凍結し、保存した。凍結前に、オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬の最終濃度を測定し、動的光散乱（ＤＬＳ）によってオリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬のサイズを決定した。
オリゴマー化プロセスの一貫性を評価するために、ストレプトアビジンムテイン（ＳＡＭ）の５つの異なるロットから上記の方法を使用して１０のオリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬を調製した。オリゴマーの平均サイズ、収率パーセント（ベースライン補正を行わずに２８０ｎｍで吸光度を測定することによって決定される）、および活性（ビオチン結合）を評価し、結果は、表Ｅ１に示されている。結果は、得られたオリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬は、これらのパラメータにおいて一致しており、９７ｎｍ±１０ｎｍの平均半径および４０ｎｍｏｌ／ｍｇ±３ｎｍｏｌ／ｍｇのビオチン結合を有していたことを示した。
表E1: 異なるバッチからのオリゴマー化STREP-TACTINの比較


上記のように作製した３つのオリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬の平均分子量（ＭＷ）を、ＵＶ検出（ＭＡＬＬＳ ＤＡＷＮ ＨＥＬＥＯＳ（Ｗｙａｔｔ）と連結したＡｇｉｌｅｎｔ ＵＶ検出器）を備えたＨＰＬＣシステム（ＡＧＩＬＥＮＴ １１００およびＷｙａｔｔ ＥＣＬＩＰＳＥ ＤＵＡＬＴＥＣ）で実施した非対称フローフィールドフロー分別（ＡＦ４）によって測定した。ＡＦ４による測定によって、５２，５００ｇ／ｍｏｌ（５２．５ｋＤａ）のストレプトアビジンムテイン四量体の平均分子量を仮定して、各オリゴマー試薬中のストレプトアビジンムテイン四量体の平均数の算出が可能となった（表Ｅ２）。
表E2: オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬のサイズおよび分子量


刺激剤（抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ Ｆａｂ断片）を、上記のように作製したオリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬への可逆性結合によって多量体化した。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ Ｆａｂ断片を、各Ｆａｂ断片に融合されたストレプトアビジンペプチド結合パートナーを介してストレプトアビジンムテインオリゴマーに可逆的に結合した。抗ＣＤ３ Ｆａｂ断片は、ハイブリドーマ細胞株ＯＫＴ３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－８００１（商標）；米国特許第４，３６１，５４９号も参照されたい）によって生成されたＣＤ３結合性モノクローナル抗体に由来し、Arakawa et al J. Biochem. 120, 657-662 (1996)に記載された抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含有していた。これらの配列は、それぞれ配列番号３１および３２に示されている。抗ＣＤ２８ Ｆａｂ断片は、抗体ＣＤ２８．３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４５１９７４．１の下で合成単鎖Ｆｖコンストラクトとして寄託されている；Vanhove et al., BLOOD, 15 July 2003, Vol. 102, No. 2, pages 564-570も参照されたい）に由来し、それぞれ配列番号３３および３４に示される抗ＣＤ２８抗体ＣＤ２８．３の重鎖および軽鎖可変ドメインを含有していた。Ｆａｂ断片をその重鎖のカルボキシ末端でアミノ酸ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１６）の配列を有する２つのストレプトアビジン結合モジュールの連続配置を含有するストレプトアビジンペプチド結合配列に個別に融合した。ペプチドタグを付けたＦａｂ断片を組換えによって生成した（国際特許出願公開番号ＷＯ２０１３／０１１０１１およびＷＯ２０１３／１２４４７４を参照されたい）。
可逆性結合を達成するために、ペプチドタグを付けた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ Ｆａｂ断片を、およそ室温でオリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬と混合し、それによって、試薬上の結合部位に可逆的に結合可能な結合パートナーであるＦａｂ断片上のｔｗｉｎ－ｓｔｒｅｐ－ｔａｇの間の相互作用を介してそれらを試薬に可逆的に結合した。一部の場合には、オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬上への固定化の前に、ペプチドタグを付けたＦａｂ断片を事前混合し、これは、場合によっては、異なるＦａｂ分子のより均一な分布をもたらし得る。ペプチドタグを付けた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８のオリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬への結合は、Ｄ－ビオチンの添加によって破壊、逆転され得る。Ｄ－ビオチンは、ストレプトアビジンムテイン上の結合パートナーへの結合について薬剤上のｓｔｒｅｐ－ｔａｇと競合し、それによって、結合を破壊する。
［実施例２］
ストレプトアビジンムテインオリゴマーに可逆的に結合されたオリゴマー化抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ Ｆａｂ断片の活性評価
実施例１に記載されたプロセスによる表Ｅ１に記載されるバッチの各々からの、種々のオリゴマーストレプトアビジン試薬に可逆的に結合された抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ Ｆａｂ断片を、Ｔ細胞を刺激する能力について評価した。これらのオリゴマーストレプトアビジン試薬は、約９５ｎｍの平均半径を有していた。細胞増殖の指標として細胞の代謝活性を、安定なテトラゾリウム塩ＷＳＴ－１の可溶性ホルマザン色素複合体への切断の比色モニタリングによって評価した。
３人の異なるドナーからのＴ細胞を、オリゴマーストレプトアビジン試薬に可逆的に結合した抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８多量体化Ｆａｂ断片と共にインキュベートした。細胞をまた、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ Ｆａｂ断片に可逆的に結合した、１０１（内部参照）または３６ｎｍのいずれかの平均半径を有する対照オリゴマー試薬と共にインキュベートした。
インキュベーション後、ＷＳＴ－１試薬を細胞に適用し、読み取り値として４５０ｎｍでの吸光度を測定することによって代謝活性のレベルを評価した。結果を、アッセイされ、細胞数当たりのＷＳＴ－１の比率として表される培養物中の細胞数に対して正規化した。
図３Ｂに示されるように、試験された試薬の各々で刺激されたＴ細胞の平均ＷＳＴ－１活性（ＷＳＴ比率）は同等であった。さらに、刺激の程度は、全ての試験された試薬について同様であり、同様のサイズの内部参照試薬（一般に±２標準偏差内で変化する）に対して同等であった。図３Ａは、各試薬の別個のデータ点として表されるＷＳＴ－１活性（ＷＳＴ比率）を示す。図３Ａおよび図３Ｂは、ＷＳＴ－１活性によって観察されるようなＴ細胞の刺激は、より小さい３６ｎｍのオリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬骨格で多量体化された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ Ｆａｂを使用すると、より低かったことを示す。
［実施例３］
カラムクロマトグラフィーによるＴ細胞の選択および刺激
以下に詳述されるように、オンカラムＴ細胞選択および刺激をカラムクロマトグラフィーによって実施し、選択され、刺激されたＴ細胞を収集した。オンカラムＴ細胞選択および刺激の例示的プロセスは、図４に示されている。
Ａ．カラム調製
Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ－５０（Ｓｉｇｍａ）を固定相として使用し、カラム活性化のために臭化シアン（ＣＮＢｒ）法を使用してＳｔｒｅｐ－ｔａｃｔｉｎ（登録商標）Ｍ２（配列番号６）と共有結合によってカップリングした。Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ－５０樹脂の５０％懸濁液は、樹脂ビーズ懸濁液１ｍＬ当たり、およそ７０μｇの共有結合によってカップリングされたＳｔｒｅｐ－ｔａｃｔｉｎ（登録商標）を含有していた。
Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ－５０樹脂上へのＳｔｒｅｐ－ｔａｃｔｉｎ（登録商標）の固定化後、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｃｔｉｎ（登録商標）が固定化されたＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ－５０の２ｍＬの懸濁液を、Ｔ細胞表面選択マーカーに対して特異的な１０μｇの選択剤と共に４℃で２０分間インキュベートした。選択剤は、抗ＣＤ３ Ｆａｂ断片を含んでいた。ＣＤ３結合Ｆａｂ断片は、ハイブリドーマ細胞株ＯＫＴ３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－８００１（商標）；米国特許第４，３６１，５４９号も参照されたい）によって産生されたＣＤ３結合性モノクローナル抗体に由来し、Arakawa et al., J. Biochem. 120, 657-662 (1996)に記載される抗ＣＤ３抗体 ＯＫＴ３の重鎖可変ドメイン（配列番号３１）および軽鎖可変ドメイン（配列番号３２）を含有していた。この例では、ＣＤ３結合Ｆａｂ断片の重鎖は、２つのストレプトアビジン結合モジュールの連続配置を含有するＴｗｉｎ Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ（登録商標）（ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（ＧＧＧＳ）２ＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ、配列番号１６）とカルボキシ末端で融合され、これは、樹脂上の固定化されたＳｔｒｅｐ－ｔａｃｔｉｎ（登録商標）へのＣＤ３結合Ｆａｂ断片の結合を促進した。
次いで、樹脂懸濁液を、底に９０マイクロメートルフリットを有する加熱／ガスカラム中に充填した。この実施例において使用される加熱／ガスカラムは、加熱／ガスカラムが加熱エレメントおよびガス供給エレメントを含んでいた点で参照カラムと異なっていた。加熱エレメントは、外部温水供給用の入口および出口を備えた加熱コイルで構成され、ガス供給エレメントは、ネジ式エアフィルター用のガス供給コネクタで構成されていた（例えば、図１Ａおよび図１Ｂを参照されたい）。加熱／ガスカラムを０．５％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）（ＰＢＳＡ緩衝液）を用いて平衡化して、１ｍＬの総体積を得た。以下に記載されるように、加熱／ガスカラムをＴ細胞選択および刺激のために使用し、その後、それらをカラムから収集した。
Ｂ．オンカラム選択および刺激
ヒトドナーからのアフェレーシス試料を親和性カラム上にロードし、試料中のＣＤ３＋Ｔ細胞を樹脂上に固定化されているＣＤ３結合Ｆａｂ断片と相互作用させた。カラムをＰＢＳＡ緩衝液で２回洗浄して、固定化されたＣＤ３結合Ｆａｂ断片と相互作用しなかった細胞を除去した。カラム上に試料をロードした時間からおよそ１５分後に、３ｍＬのグルタミンならびに組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７を含有する無血清基本培地中の、上記の実施例１および２に記載された、少なくとも４００μｇの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー試薬（オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬に可逆的に結合された多量体化抗ＣＤ３ Ｆａｂ断片および抗ＣＤ２８ Ｆａｂ断片刺激剤）をカラム上にロードすることによって、カラムに刺激試薬を添加し、細胞を刺激する条件下で細胞をカラム上でインキュベートした。インキュベーションの間、カラムの加熱エレメントによって、加熱コイルを通る水の温度を約３７℃の温度に維持し、ガス交換エレメントは、インキュベーションの際に接続された解放無菌フィルターの制御下で空気を供給した。
カラムにオリゴマー試薬を添加した後、カラム内容物を３７℃まで加熱し、全活性化プロセスの間、温度を維持した。カラム内の温度は、温度センサーによって一定にモニタリングした。ガス交換は、受動的要素として無菌（ｓｅｒｉｌｅ）フィルターを使用して完全選択手順によって継続した。
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー試薬と共にインキュベーションした際、選択されたＣＤ３＋Ｔ細胞は、細胞と樹脂の間の結合を破壊する競合試薬を添加する必要なく、活性化誘導脱離（ＡＩＤ）によって、カラムから自発的に脱離した。刺激試薬を添加した後およそ４．５時間以内に、およそ８０ｍＬのグルタミンならびに組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７を含有する無血基本培地をカラムに通すことによって、単一工程でカラムから自発的に脱離した細胞を収集し、細胞を重力流によって収集した。重力流による収集の前にカラム上の細胞の結合を破壊するためにさらなる競合物質は添加しなかった。
熱／ガスカラムを使用するオンカラム選択および刺激後に、収集したＣＤ３＋Ｔ細胞数を決定し、理論的推定値、対照群および同様のプロセスであるが、加熱エレメントおよびガス供給エレメントを含有しなかった参照カラムを使用して収集された（すなわち、細胞を、細胞と外部環境（ｉｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）の間の空気交換を行わず、参照カラム中、室温でインキュベートした）ものと比較した。対照群では、ＣＤ３＋Ｔ細胞の選択のためにアフェレーシス試料を標準抗ＣＤ３親和性カラム上にロードしたが、細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー刺激試薬の存在下でインキュベートせず、４．５時間後、Ｄ－ビオチンを添加して、抗ＣＤ３ ＦａｂのＴｗｉｎ Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ（登録商標）と樹脂上のＳｔｒｅｐ－ｔａｃｔｉｎ（登録商標）の間の結合を破壊し、それによって、カラム樹脂から選択されたＣＤ３＋Ｔ細胞を放出した。
結果は図５に示されており、推定値（灰色バー）は、１００％の効率を仮定して溶出され得る理論上の捕捉細胞数とした。図５に示されるように、加熱エレメントおよびガス供給エレメントを有する熱／ガスカラムを使用する溶出効率は、参照カラムを使用するもののおよそ２倍であった。図５における結果は、加熱エレメントおよびガス供給エレメントを備えた熱／ガスカラムが、オンカラムＴ細胞選択および樹脂からの刺激されたＴ細胞の参照カラムと比較して実質的により効率的な収集を支持することを示す。さらに、熱／ガスカラムは、対照群と比較して同様のＴ細胞回収を達成するが、結合を破壊するために追加の競合物質を必要としない。したがって、熱／ガスカラムを使用すると、選択され、刺激されたＴ細胞の高い回収率を維持しながら、Ｔ細胞選択および／または刺激に必要な時間を有意に低減できる。
［実施例４］
カラムクロマトグラフィーを介した選択および刺激の間およびその後のＴ細胞の分析
オンカラムＴ細胞選択および刺激を、加熱エレメントおよびガス供給エレメントを有するカラムを使用して実施例３に記載されたように実施した（ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ）。出発材料としてヒトドナーからのアフェレーシス試料を、ＣＤ３ Ｆａｂが負荷された樹脂を有する親和性カラム上にロードし、その後、実質的に実施例３に記載されるように抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー刺激試薬を添加した。選択され、実施例３に記載されるように競合剤を添加せず重力流下で刺激された細胞を培養バッグ中に収集した。
出発材料、ネガティブ画分（刺激試薬を負荷する前に洗浄された未結合細胞）またはポジティブ画分（実施例３に記載されたプロセスによって収集された細胞）中の細胞を分析した。細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５およびＣＤ１４を含む表面マーカーを認識する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって定量化した。残屑を排除し、試料はＣＤ４５＋生細胞に関して事前ゲーティングされた。
フローサイトメトリー結果は、図６に示されており、出発試料中の全てのＣＤ３＋細胞の約６４％が濃縮され、ポジティブ画分中に存在しており、残りの細胞は、ネガティブ画分中にあった。ポジティブ画分中の細胞のうち、細胞の９４％より多くが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞であった。
培養バッグ中に収集された細胞を、グルタミンならびに組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７を含有する無血清基本培地中、３７℃で最大３日間さらにインキュベートした。インキュベーションの際、オリゴマー刺激試薬を除去しなかったが、追加の刺激試薬を添加しなかった。
細胞を１日目、３日目およびその後のインキュベーションの際の３日目に、細胞をＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８ならびに活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５を認識する抗体で染色した後にフローサイトメトリーによって細胞数および細胞表面発現についてモニタリングした。図７Ａに示されるように、３日目に培養された細胞の９８．８％はＣＤ３＋であり、活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の表面発現もＴ細胞の大部分で観察された。ＣＤ３＋細胞の純度は、カラムからの回収時と比較して３日目で増大したが、ＣＤ４：ＣＤ８Ｔ細胞の比率は維持された。その後のインキュベーション後の細胞数および拡大増殖倍数の評価は、３日目に、選択され、刺激されたＴ細胞が、活性化マーカーを発現し、細胞の増殖する能力と一致して数が増加し始めたことを示した（図７Ｂ）。これらの結果は、実施例３に記載されたオンカラムプロセスによる選択および刺激後にカラムから直接収集されたＴ細胞が、培養での継続的な増殖を支持する特徴を示すことを実証する。
［実施例５］
凍結保存アフェレーシス出発材料からのＴ細胞のオンカラム選択
オンカラムＴ細胞選択を、出発試料として凍結保存アフェレーシス試料を使用することを除いて本質的に実施例３に記載されるように実施した。凍結保存アフェレーシス試料は、一般に、高い単球含量（２０％より多い）を有する。結果を、新鮮なアフェレーシス試料で実行されたプロセスと比較した。複数の異なるドナーについて、凍結保存アフェレーシス試料および新鮮なアフェレーシス試料の単球含量（生存ＣＤ４５＋細胞の％）が図８Ａに示されている。
出発材料およびカラムから収集されたポジティブ画分中の濃縮された細胞を、ＣＤ３およびＣＤ１４（単球マーカー）を認識する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって定量化した。図８Ｂは、出発材料およびポジティブ画分中のＣＤ３またはＣＤ１４についてポジティブの細胞のパーセンテージを表す。示されるように、出発材料中の単球含量は高かったが、ポジティブ画分は、９４％純度のＣＤ３＋Ｔ細胞をもたらし、１％のみのＣＤ１４＋単球が検出され、０．３３から０．０１への単球：Ｔ細胞比率の低下を表す。クロマトグラフィーカラムを使用して選択されたＴ細胞数は、図８Ｃに示されている。
［実施例６］
連続または並列カラムを使用するＴ細胞の選択および刺激
オンカラムＴ細胞選択および刺激を、加熱エレメントおよびガス供給エレメントを有し、細胞の選択のために抗ＣＤ３ Ｆａｂ断片が固定化されたカラムを使用して本質的に実施例３に記載されるように実施した。ある研究では、選択および刺激を連続して配置された２つの同一カラムを含むシステムにおいて実行し、一方で別の研究では、選択および刺激を、並列して配置された２つの同一カラムを備えたシステムで実行した（図９を参照されたい）。各研究において、同一ドナーからのアフェレーシス試料のおよそ１／５を、出発材料としてカラムの各システムにロードした。
出発材料、ネガティブ画分およびポジティブ画分を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ１４を含む表面マーカーを認識する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって定量化した。フローサイトメトリー結果は、図１０Ａに示されている。示されるように、ＣＤ３＋Ｔ細胞の同様の濃縮がいずれかの戦略によって達成された。
ポジティブ画分からの細胞（並列または連続カラムを使用することを除いて実施例３に記載されたプロセスによって収集された細胞）を培養バッグ中に回収し、各研究から収集した細胞をグルタミンならびに組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７を含有する無血清基本培地中、３７℃で最大６日間インキュベートした。インキュベーションの際、オリゴマー刺激試薬を除去しなかったが、追加の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激試薬を添加しなかった。
細胞を、インキュベーションの際０日目、１日目、２日目、３日目および６日目に、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８ならびに活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５を認識する抗体で細胞を染色した後にフローサイトメトリーによって細胞数および細胞表面発現についてモニタリングした。図１０Ｂに示されるように、左パネル、各クロマトグラフィー研究からの細胞は、インキュベーションの際に１日目に活性化マーカーの同様の発現を示し、細胞数は同様に増加し始めた。実行１（□）および実行２（●）における細胞数の代表的な結果が、図１０Ｂ、右パネルに示されている。
これらの結果は、Ｔ細胞のオンカラム選択および刺激のために連続または並列カラムクロマトグラフィーを使用できることを示す。
［実施例７］
濃縮血液からのＴ細胞のオンカラム選択および刺激
オンカラムＴ細胞選択および刺激を、出発試料として濃縮血液試料を使用することを除いて本質的に実施例３に記載されるように実施した。さらに、並列ＣＤ３選択および刺激を、実質的に実施例６に記載されるようなシステムを使用して実行した。血小板の含量が低減された軽度に濃縮された全血および血清をＰＢＳＡ緩衝液で１：１に事前希釈した。赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｕｔｅ）溶解は実施しなかった。１６０ｍＬ（カラム当たり８０ｍＬ）の希釈試料を、各々４ｍＬのＣＤ３ Ｆａｂ負荷樹脂を含有する２つの並列カラム上にロードし、カラムを洗浄し、次いで、各カラムに抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー刺激試薬を添加した。
出発材料、ＣＤ３＋Ｔ細胞選択からのネガティブ画分およびポジティブ画分中の細胞を、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ１４を含む表面マーカーを認識する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって定量化した。フローサイトメトリー結果は、図１１Ａに示されている。示されるように、ポジティブ画分（２つの並列カラムを使用して実施例３に記載されるプロセスによって収集された細胞）中の細胞は、高濃縮のＣＤ３＋Ｔ細胞を示し、ＣＤ３＋Ｔ細胞の純度は９３％より高かった。
ポジティブ画分からの細胞（並列カラムを使用することを除いて実施例３に記載されるプロセスによって収集された細胞）を培養バッグ中に回収し、グルタミンならびに組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７を含有する無血清基本培地中、３７℃で最大６日間インキュベートした。インキュベーションの際、オリゴマー刺激試薬を除去しなかったが、追加の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激試薬を添加しなかった。細胞を、その後のインキュベーションの開始後７２時間で、ＣＤ４およびＣＤ８ならびに活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の細胞表面発現についてモニタリングした。図１１Ａに示されるように、得られた細胞は、その後のインキュベーションの前にポジティブ画分中に存在するＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の比率を維持し（図１１Ａおよび図１１Ｂ、左パネルのポジティブ画分を比較されたい）、細胞の大部分は、活性化マーカーＣＤ２５および／またはＣＤ６９についてポジティブであった（図１１Ｂ、右パネル）。
［実施例８］
全血からの直接的なＴ細胞の選択
Ｔｗｉｎ Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ（登録商標）（ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（ＧＧＧＳ）２ＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ、配列番号１６）とカルボキシ末端で融合された抗ＣＤ３ Ｆａｂ断片の固定化のために、樹脂としてＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ－５０を使用して実施例３に記載されるものと同様のプロセスによってアガロース樹脂（１００μｌ樹脂）に官能基付与した。１ｍＬの新鮮な未希釈採血をカラムにロードした。赤血球溶解は実施しなかった。カラムを洗浄し、ネガティブ画分を収集した。Ｄ－ビオチンを添加して、抗ＣＤ３ ＦａｂのＴｗｉｎ Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ（登録商標）と樹脂上のＳｔｒｅｐ－ｔａｃｔｉｎ（登録商標）間の結合を破壊し、それによって、ポジティブ画分中のカラム樹脂から選択されたＣＤ３＋Ｔ細胞を放出した。
出発材料、ＣＤ３＋Ｔ細胞選択からのネガティブ画分およびポジティブ画分をプロピジウムヨウ素（ＰＩ）およびＣＤ３抗体で染色し、フローサイトメトリーによって定量化した。フローサイトメトリー結果は、図１２に示されている。ポジティブ画分は、新鮮な未希釈全血における０．１８２％のＣＤ３＋細胞と比較して＞８０％のＣＤ３＋細胞を含有していた。この結果は、新鮮な血液からの直接的なオンカラムＴ細胞選択の実現可能性を支持する。
結果は、オンカラムＴ細胞選択が全血試料を用いた場合に上手く機能することを示す。
［実施例９］
カラムクロマトグラフィーを介したＴ細胞の選択および刺激
研究は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー刺激剤の存在下でオンカラム刺激を用い、カラムベースの親和性クロマトグラフィーによってＴ細胞を濃縮するために実行された。
この研究では、固定相としてＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０（Ｓｉｇｍａ）を使用し、臭化シアン（ＣＮＢｒ）活性化樹脂を使用し、ＳＴＲＥＰ－ＴＡＣＴＩＮ（登録商標）Ｍ２（配列番号６）を共有結合によってカップリングした。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０の５０％懸濁液は、およそ７０μｇの共有結合によってカップリングされた７Ｓｔｒｅｐ－ｔａｃｔｉｎ（登録商標）／ビーズ懸濁液１ｍＬを含有していた。固定相上へのＳＴＲＥＰ－ＴＡＣＴＩＮ（登録商標）の固定化後、２ｍＬの、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｃｔｉｎ（登録商標）を有するＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０の懸濁液を、１０μｇのＴ細胞表面選択マーカーに対して特異的な選択剤と共に４℃で２０分間インキュベートして、固定化されたＳｔｒｅｐ－ｔａｃｔｉｎ（登録商標）試薬へのＦａｂ断片の結合を可能にした。次いで、懸濁液を底に９０マイクロメートルフリットを有するプラスチック製ミニカラム中に充填した。カラムを０．５％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）（ＰＢＳＡ緩衝液）を用いて平衡化して、１ｍＬのベッド体積を得た。
これらの研究では、選択剤として、抗ＣＤ３結合Ｆａｂ断片、抗ＣＤ４結合Ｆａｂ断片のいずれか、または選択剤として抗ＣＤ８結合Ｆａｂ断片を使用して実験を実行した。ＣＤ３結合Ｆａｂ断片は、ハイブリドーマ細胞株ＯＫＴ３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－８００１（商標）；米国特許第４，３６１，５４９号も参照されたい）によって産生されたＣＤ３結合性モノクローナル抗体に由来し、Arakawa et al J. Biochem. 120, 657-662 (1996)に記載される抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３の重鎖可変ドメイン（配列番号３１）および軽鎖可変ドメイン（配列番号３２）を含有していた。ＣＤ４結合Ｆａｂ断片は、ｍ１３Ｂ８．２（例えば、米国特許第７，４８２，０００号）から得られ、抗ＣＤ４抗体ｍ１３Ｂ８．２の重鎖可変ドメイン（配列番号２９）および軽鎖可変ドメイン（配列番号３０）を含有していた。ＣＤ８結合Ｆａｂ断片は、ＯＫＴ８（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－８０１４）から得られ、抗ＣＤ８抗体ＯＫＴ８の重鎖可変ドメイン（配列番号９）および軽鎖可変ドメイン（配列番号１０）を含有していた。各Ｆａｂ断片の重鎖は、２つのストレプトアビジン結合モジュールの連続配置を含有するＴｗｉｎ Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ（登録商標）（配列番号１６）とカルボキシ末端で融合された。
ヒトドナーからのアフェレーシス試料を親和性カラム上にロードし、２つの洗浄工程を実施した。試料をロードした時点から３０分よりも長く経過した後、実施例１に記載されたように作製された、オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー試薬）に可逆的に結合された、４０μｇの多量体化抗ＣＤ３抗ＣＤ２８ Ｆａｂ断片を、３ｍＬのグルタミンならびに組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７を含有する無血清基本培地中でカラム上にロードし、３７℃でインキュベートした。およそ２４時間後、結合を破壊するためのさらなる競合物質を添加することなく、およそ８０ｍＬのグルタミンおよび組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７を含有する無血清基本培地をカラムに通すことによって、単一工程でカラムから細胞を収集した。対照として、アフェレーシス試料を抗ＣＤ３親和性カラム上にロードしたが、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー刺激試薬の存在下でのインキュベーションは行わなかった。対照条件については、抗ＣＤ３ ＦａｂのＴｗｉｎ Ｓｔｒｅｐ－タグ（登録商標）とＳＴＲＥＰ－ＴＡＣＴＩＮ（登録商標）の間の結合を破壊するためにＤ－ビオチンを添加した２４時間後に、放出された細胞を重力流によって収集した。
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー試薬での刺激の開始のおよそ２４時間後、収集した細胞を選択マーカーの表面発現について分析した。図１３に示されるように、選択マーカーに対して特異的なそれぞれの選択剤を使用するオンカラム選択および刺激試薬ととものインキュベーションの２４時間後に、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８の下方制御が観察された。対照的に、細胞がオリゴマー刺激試薬と共にインキュベートされなかった対照条件については、選択マーカーの受容体下方制御は観察されなかった。これらの結果は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ８刺激試薬を用いるＴ細胞の刺激が受容体の表面発現の下方制御をもたらし、それによって、競合試薬を添加することを必要としないカラムからの細胞の自発的脱離が可能となったという観察結果と一致する。
上記のように、Ｔ細胞が抗ＣＤ３ＳＴＲＥＰ－ＴＡＣＴＩＮ（登録商標）親和性カラムで選択され、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー刺激試薬を用いるオンカラム刺激に付される同様の研究を実行した。オリゴマー刺激試薬の添加後種々の時点で重力流によって細胞を収集した。収集した細胞を、アルファ－ベータＴＣＲ鎖に対する抗体で直ちに染色し、フローサイトメトリーによってモニタリングして、ＣＤ３の表面発現を検出した。図１４は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー刺激試薬の存在下での刺激の開始後の、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体下方制御および再発現の例示的動態を例示する。示されるように、刺激の最初の２４時間の間にＣＤ３／ＴＣＲ複合体表面発現の迅速な下方制御が観察され、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体表面発現の最大低減が、わずか１２時間後に観察された。３６時間より長いオリゴマー刺激試薬の存在下でのインキュベーションは、表面ＣＤ３／ＴＣＲ複合体の再発現をもたらし、最大ＣＤ３／ＴＣＲ複合体表面再発現は、刺激試薬での刺激の開始後約７２時間以内に達成された。これらの結果は、実質的なオンカラム刺激媒介性自発的Ｔ細胞脱離は、４～６時間以内に生じる場合があり、最大放出は、刺激試薬ととものオンカラムインキュベーションの開始後１２時間またはおよそ１２時間で生じることを支持する。
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー刺激試薬を添加した後約２４時間で自発的に脱離した細胞を、グルタミンならびに組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７を含有する無血清基本培地中、３７℃で最大９日間培養した。インキュベーションの際、オリゴマー刺激試薬を除去しなかったが、インキュベーションの間、細胞が拡大増殖し続けたのでそれらは希釈された。その後のインキュベーションの間、２４時間で、および５日で細胞を、ＣＤ３ならびに活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５のサイズおよび発現についてモニタリングした。図１５Ａに示されるように、最大５日間のさらなるインキュベーションは、２４時間で観察されたＣＤ３初期下方制御後のＣＤ３の再発現をもたらした。さらに、２４時間の時点と比較して５日で、活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の細胞サイズ（図１５Ａの左パネル）および表面発現の増大も観察された。最大９日間のその後のインキュベーション後の細胞数および拡大増殖倍数の評価は、自発的に脱離した細胞は、高い増殖能力を実証することを示した（図１５Ｂ）。これらの結果は、オンカラム選択および短期間刺激を受けたＴ細胞をさらにインキュベートして、所望の刺激、活性化および／または拡大増殖を得ることができるという観察結果と一致している。
これらの結果は、操作されたＴ細胞組成物を生成するための下流プロセス（例えば、形質導入）の前に、またはそれと関連して、標的細胞を単離および刺激する迅速な手段（例えば、２４時間未満）としてのオンカラム選択および刺激の使用を支持する。
［実施例１０］
小分子ｍＴＯＲキナーゼ阻害剤の存在下で生成された操作されたＴ細胞におけるＴ細胞表現型および機能の評価
ヒトドナー対象からの白血球アフェレーシス試料からの免疫親和性に基づく濃縮によって、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。１日目に、単離したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を１：１混合し、１μＭの２－（３－ヒドロキシフェニル）－９－（２－イソプロピルフェニル）－８－オキソ－８，９－ジヒドロ－７Ｈ－プリン－６－カルボキサミド（化合物６３）と共に、または伴わずに、組換えＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍＬ）、組換えＩＬ－７（６００ＩＵ／ｍＬ）および組換えＩＬ－１５（１００ＩＵ／ｍＬ）を補給した無血清培地中の、実施例１に記載されるように作製した抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー刺激試薬を用いて刺激した。化合物６３と共にまたは伴わずに培養したＴ細胞を、３７℃で一晩（およそ２４時間）インキュベートし、次いで、化合物６３（１ｍＭ）を含むまたは含まない無血清培養培地中で抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを形質導入した。ＣＡＲは、ＣＤ１９に対して特異的なｓｃＦｖ抗原結合ドメイン（ＦＭＣ６３に由来する）、ＣＤ２８膜貫通領域、４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域およびＣＤ３ゼータ由来細胞内シグナル伝達ドメインを含有していた。形質導入後、細胞を組換えサイトカインを含まない（基礎培地）、化合物６３（１ｍＭ）を含むまたは含まない無血清培地中でインキュベートし、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー刺激試薬を用いる刺激の開始後、インキュベーター中、約３７℃で最大９６時間インキュベートすることを可能にした（プロセスの５日目まで）。インキュベーションの開始後およそ２４時間（プロセスの３日目）で、１ｍＭのビオチンを添加した。インキュベーション後、各ドナーからＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を回収し、製剤化し、クライオ凍結した。
クライオ凍結した操作されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を解凍し、Ｔ細胞を細胞内Ｓ６リン酸化、リボソームタンパク質およびｍＴＯＲ阻害のマーカーについて評価し、ＣＤ４またはＣＤ８の表面発現について、ならびに記憶サブセットのマーカーとしてＣＣＲ７およびＣＤ４５ＲＡについて共染色した。記憶サブセットによる生存ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるｐＳ６発現は、１６Ａに示されるようにＣＣＲ７およびＣＤ４５ＲＡの発現によって示される。示されるように、化合物６３と共のインキュベーションは、刺激された記憶Ｔ細胞サブセット、Ｔｅｍｒａ、ＴｅｍおよびＴｃｍ細胞の平均蛍光強度を低下させ、これは、ｍＴＯＲの阻害を示し、一方で、経時的な生存細胞のパーセンテージまたは総数に対して有意な効果はなかった。ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＰＳ６の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、図１６Ｂに示されている。図１６Ｃおよび図１６Ｄに示されるように、化合物６３の存在（黒色線）または不在（灰色線）はそれぞれ、作製された組成物において生存細胞パーセントまたは総生存細胞に影響を及ぼさなかった。
記載されたプロセスによって作製された解凍された細胞を、アポトーシスのマーカー（例えば、カスパーゼポジティブＣＡＲ－Ｔ細胞のパーセンテージ）、表現型プロファイルならびにＰＭＡ／イオノマイシンおよびＧｏｌｇｉ阻害剤での刺激後細胞内サイトカインを生成する能力について評価した。図１７Ａに示されるように、化合物６３と共にインキュベートされた試料からのＴ細胞は、化合物６３と共にインキュベートされなかったものよりも、少ない細胞内カスパーゼ発現を示し、これは、操作された細胞を作製するプロセスの間の化合物６３の存在が、Ｔ細胞組成物の全体的な細胞の健康を改善したことを示す。解凍された細胞をまた、フローサイトメトリーによるＣＤ２７およびＣＣＲ７の表面発現のために染色した。図１７Ｂ（ＣＤ８＋Ｔ細胞）および図１７Ｄ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）に示されるように、化合物６３と共のインキュベーションは、ＣＤ２７および／またはＣＣＲ７の発現によって評価されるように、細胞の表現型サブセットプロファイルを実質的に変更しなかった。化合物６３の存在下で生成されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の機能活性は、細胞内サイトカインＩＬ２、ＩＦＮｇまたはＴＮＦのレベルによって証明されるように、化合物６３の存在下で生成されている操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞（図１７Ｃ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（図１７Ｅ）の両方において実質的に改善された。
細胞の機能活性をさらに評価するために、作製されたＴ細胞組成物を、抗ＣＤ１９ ＣＡＲに対する抗イディオタイプ（ＩＤ）抗体がコンジュゲートされたビーズを用いて１２日にわたって長期間刺激し、細胞の拡大増殖および生存（図１７Ｆ、左パネル）、増殖曲線下面積によって算出された総拡大増殖計量（図１７Ｆ、右パネル、ＡＵＣ）をモニタリングした。示されるように、化合物６３の不在下での細胞の刺激は、ＣＡＲの慢性刺激と一致した経時的な細胞の拡大増殖の減少および長期刺激後の持続的な機能の喪失をもたらした。結果は、化合物６３の存在下で生成されている操作された細胞において長期ＣＡＲ特異的刺激後にＴ細胞の改善された機能が観察されたことを示す。
［実施例１１］
組み合わせた選択およびオンカラム刺激プロセスを使用して操作されたＴ細胞の表現型特性および機能特性の評価
クロマトグラフィーカラムにおいて選択および刺激工程を組み合わせるプロセス（オンカラム選択および刺激）を、実質的に実施例９に記載されるとおりであるが大規模で実施した。オンカラム選択および刺激プロセスを、実質的に同様であるが、刺激工程が選択とは別個に、溶液中で実行される代替プロセスと比較した。
Ａ．オンカラム選択および刺激
０日目に、ヒトドナーからのアフェレーシス試料を、臭化シアン（ＣＮＢｒ）活性化樹脂を使用してＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ（登録商標）（配列番号６）に共有結合によってカップリングされたＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０（Ｓｉｇｍａ）固定相を含有する親和性カラム上にロードした。２０ｍＬの固定相は、最大２０億±５億個細胞を収容可能であった。選択剤、実施例３に記載されるような抗ＣＤ３結合Ｆａｂ断片を、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎに結合可能な重鎖カルボキシ末端で融合されたストレプトアビジン結合ペプチド（Ｔｗｉｎ Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ（登録商標）；配列番号１６）を介して固定相上に固定化した。
試料をロードした時点からおよそ６０分後、実施例１に記載されたように作製された、オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー試薬）に可逆的に結合された、多量体化抗ＣＤ３抗ＣＤ２８ Ｆａｂ断片を、組換えＩＬ－２（例えば、１００ＩＵ／ｍＬ）、ＩＬ－１５（例えば、１００ＩＵ／ｍＬ）およびＩＬ－７（例えば、６００ＩＵ／ｍＬ）を含有する無血清培地中の０．２～０．３×（１～２μｇ／１００万個細胞）の固定用量でカラム上にロードし、カラム中、３７℃でおよそ４．５時間インキュベートした。インキュベーションの際、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー試薬を用いる刺激は、カラム上の選択剤からの固定化された細胞の脱離または放出をもたらした。放出された細胞を、同一無血清培地を用い重力流によってカラムから溶出した。培地は、固定相上のＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ（登録商標）と、カラムの固定相上に細胞を固定化するために使用された抗ＣＤ３抗体に融合されたストレプトアビジン結合ペプチドの間の結合を破壊するビオチンまたは任意の競合物質を含まなかった。
次いで、放出され、収集された細胞を、例示的抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターと共の同一無血清培地中で１時間のインキュベーションによってキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように形質導入した。例示的ＣＡＲは、マウス抗体ＦＭＣ６３由来の抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、免疫グロブリンスペーサー、ＣＤ２８由来の膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ由来の共刺激性領域およびＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含有していた。形質導入のために、培養体積を１×１０６個細胞／ｍＬに調整した。
形質導入された細胞を洗浄し、次いで、３７℃でさらにインキュベートした。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー試薬でのオンカラム刺激の開始の約４８時間後、１．０ｍＭのＤ－ビオチンを添加し、細胞と混合して、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ Ｆａｂを可溶性オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬から解離させた。
ビオチンの添加後、細胞を３７℃でさらに約２４時間さらにインキュベートした。次いで、細胞を２つのサブセットに分けた。第１のサブセットでは、細胞を凍結保護剤を用いて直接的に製剤化した。第２のサブセットでは、細胞の体積を、インキュベーションおよび形質導入工程の際に使用されるものの２倍の濃度のＩＬ－２、ＩＬ－７およびＩＬ－１５を含有する無血清培地で０．５×１０６個細胞／ｍＬに調整した。この第２のサブセットの細胞を、静置培養で培地交換を行って３７℃でさらに５日間培養することによる拡大増殖のためにさらにインキュベートし、次いで、凍結保護剤を用いて製剤化した。
Ｂ．代替プロセス：別個の選択および刺激（溶液中）
代替プロセスは全般的には上記のように進行したが、選択および刺激の工程はカラム中で組み合わせられなかった。同一ヒトドナーからのアフェレーシス試料を、ＣＤ３＋Ｔ細胞の選択のために、上記のような抗ＣＤ３選択試薬を含有する親和性カラムにロードした。選択された細胞を溶出するために、１．０ｍＭのＤ－ビオチンをカラムに添加し、溶出された細胞を収集した。Ｄ－ビオチンは、抗ＣＤ３ Ｆａｂに融合されたストレプトアビジン結合ペプチドと、固定相上のＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ（登録商標）の間の結合を破壊してカラムおよび抗ＣＤ３ Ｆａｂから細胞を放出するための競合物質として作用した。
代替プロセスの０日目に、選択された細胞を洗浄し、１×１０６／ｍＬに希釈し、固定用量（０．３×、およそ２μｇ／１００万個細胞）の、実施例１に記載されたように作製された、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ Ｆａｂがコンジュゲートしたオリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬と共のインキュベーションによって刺激した。刺激を組換えＩＬ－２（例えば、１００ＩＵ／ｍＬ）、組換えＩＬ－７（例えば、６００ＩＵ／ｍＬ）および組換えＩＬ－１５（例えば、１００ＩＵ／ｍＬ）を含有する無血清培地中で約１８～３０時間（２４±６時間）実行した。
刺激後、細胞を上記のような同一の例示的抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを用いる同一無血清培地中での３０分間のスピノキュレーションによって形質導入した。
スピノキュレーション後、細胞を洗浄し、次いで、３７℃でさらにインキュベートした。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー試薬での刺激の開始の約４８±６時間後、１．０ｍＭのＤ－ビオチンを添加し、細胞と混合して、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ Ｆａｂをオリゴマーストレプトアビジン試薬から解離させた。
ビオチンの添加後、細胞を３７℃でさらに約２４時間さらにインキュベートした。次いで、細胞を上記と同様の２つのサブセットに分けた。第１のサブセットでは、細胞を凍結保護剤を用いて直接的に製剤化した。第２のサブセットでは、細胞を静置培養で培地交換を行って３７℃でさらに５日間培養することによる拡大増殖のためにさらにインキュベートし、次いで、凍結保護剤を用いて製剤化した。
Ｃ．細胞回収率および表現型の評価
オンカラム選択および刺激後にカラムから放出されているＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の収率を、選択のみがカラムで実行され、細胞を放出するためにビオチンが添加された代替プロセスでカラムから放出されている細胞に対して比較した。図１８Ａに示されるように、ＣＤ３＋Ｔ細胞収率ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞収率は、両プロセスにおいて同様であった。オンカラム選択および刺激後にカラムから放出されている細胞の中での刺激後の生細胞の総細胞計数およびパーセンテージを、代替プロセスにおける選択された細胞の別個の刺激後の細胞に対して比較した。図１８Ｂおよび図１８Ｃは、それぞれ、両プロセスの刺激後の生細胞の総細胞計数およびパーセンテージを示す。この実験では、細胞回収率は、オンカラム刺激を使用するプロセスについて高かった。
さらに５日の培養を含んでいたプロセスについては、各プロセスによって操作された細胞集団の品質および表現型を、培養の５日目（プロセスの開始から８日目）に評価した。図１９Ａおよび図１９Ｂは、それぞれ、回収された生存Ｔ細胞のパーセンテージおよび例示的ＣＡＲを発現する生細胞（ＣＡＲ＋）のパーセンテージを示す。５日間のさらなる培養後（プロセスの開始から８日目）の両プロセスから作製された組成物からの試料を、フローサイトメトリーによって、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７およびＣＣＲ７を含むマーカーの表面発現について評価した。図１９Ｃは、さらなる培養後の培養の最終日（５日目）での細胞組成物中の生存ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージに対する、選択工程（代替プロセス）または組み合わされた選択および刺激工程（オンカラム刺激）から得られたＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージの比較を提供する。
図１９Ｄは、オンカラム刺激プロセスによって作製された組成物中のＣＤ２７－ＣＣＲ７－、ＣＤ２７＋ＣＣＲ７－、ＣＤ２７＋ＣＣＲ７＋およびＣＤ２７－ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のパーセンテージが、代替プロセスによって生成された細胞組成物中に存在するパーセンテージと同様であったことを示す。
Ｄ．オンカラム刺激を使用して製造された操作されたＴ細胞の機能の評価
オンカラム刺激を含むプロセスを使用して製造された操作されたＴ細胞の機能的能力をインビトロおよびインビボの両方で評価した。結果を、代替プロセスを使用して製造された操作されたＴ細胞に対して比較した。
１．インビトロ機能分析
細胞溶解活性を、操作された抗ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞をＣＤ１９を発現するＨＥＫ細胞（ＨＥＫ ＣＤ１９）と５：１のエフェクター対標的比率で共培養することによって評価した。細胞溶解は、培養の間の複数時点でとられたインピーダンス測定値によって決定した。対照条件は、異なる標的（ＢＣＭＡ）に対して向けられた代替ＣＡＲを発現するＴ細胞（ＨＥＫ ＣＤ１９＋ＢＣＭＡ ＣＡＲ）、標的細胞のみ（ＨＥＫ ＣＤ１９＋のみ）または抗ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞とインキュベートされた非標的細胞（ＨＥＫ ＣＤ１９－ ＆ ＣＤ１９ ＣＡＲ）のインキュベーションを含んでいた。図２０に示されるように、細胞溶解活性（ＨＥＫ細胞溶解によって示されるような）は、標的細胞に対して特異的であり、オンカラム刺激プロセスによって製造されたＣＡＲＴ細胞は、強力な細胞溶解活性を示し、これは代替プロセスによって操作された細胞と同様であった。これらのデータは、オンカラム刺激を使用して製造された操作されたＴ細胞は、代替プロセスを使用して製造された操作されたＴ細胞と同等の効力を有することを実証する。
Ｇｏｌｇｉ阻害剤の存在下での標的細胞株（ＣＤ１９＋ＨＥＫ細胞）での抗原特異的刺激後のサイトカイン蓄積をモニタリングすることによって、操作されたＴ細胞のサイトカイン活性を評価した。サイトカイン生成を、表面ＣＤ４、ＣＤ８または抗ＣＤ１９ ＣＡＲについても共染色された細胞におけるＩＦＮｇ、ＩＬ－２およびＴＮＦ－アルファについての細胞内サイトカイン染色後にフローサイトメトリーによって評価した。図２１Ａ～２１Ｃは、それぞれＩＦＮｇ、ＩＬ－２およびＴＮＦ－アルファを発現した、各製造プロセスに由来するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットのパーセンテージを示す。２つの方法に従って製造されたが、ＣＡＲ発現を欠くＴ細胞を対照として使用した。これらのデータは、ＣＡＲＴ細胞抗原特異的サイトカイン生成が、製造プロセスの間で生成された細胞において同等であることを実証する。
２．インビボ機能分析
オンカラム刺激および代替操作プロセスから作製された抗ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞を含有するＴ細胞組成物の抗腫瘍活性をインビボで比較した。
０日目に免疫不全のＮＳＧマウスに５×１０５個のＢ細胞リンパ腫細胞株（Ｒａｊｉ）を注射した（ｉ．ｖ．）。７日目にマウスに、オンカラム刺激または代替プロセスのいずれかによって生成されたＣＡＲ＋操作された組成物からの０．７５×１０６個のＣＡＲ＋Ｔ細胞を注射した。３人の異なるドナーから各プロセスについて３回の製造実行を完了し、各々生成された操作されたＣＡＲ＋Ｔ治療用細胞組成物を試験した。図２２Ａ～２２Ｃはそれぞれ、注射前の操作された治療用組成物各々のＣＤ４：ＣＤ８比率、形質導入効率および生細胞のパーセンテージを示す。示されるように、両プロセスからの細胞は、各ドナーについて、幾分かのドナー変動性が観察されたが同等の操作された細胞を生成した。
腫瘍負荷を、ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与後４１日までの種々の時点での生存中発光イメージングによってインビボで測定した。腫瘍注射の６日後、全ての処置群の動物が、同様の腫瘍負荷を示した（図２３）。図２４に示されるように、腫瘍負荷は、全ての処置群にわたって経時的に実質的に低減された。これらの結果は、製造プロセスによって生成されたＣＡＲ＋操作された治療用Ｔ細胞の間での同等の抗腫瘍有効性を実証する。
Ｅ．結論
総合すると、これらのデータは、オンカラム選択および刺激を、選択されたＴ細胞が、形質導入を含むプロセスのその後の工程において使用するために抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー試薬での刺激の開始後４．５時間以内にカラムから収集されるプロセスにおいてなど、操作されたＴ細胞（例えば、ＣＡＲ＋Ｔ細胞）を生成するプロセスにおいて使用できることを示す。結果は、オンカラム選択および刺激プロセスが、代替プロセスと同等であるが、単一工程に選択および刺激を組み合わせる能力のためにより効率的に、より短時間で実行できる表現型特徴および機能性特徴を示す、操作された（例えば、ＣＡＲ＋細胞）細胞組成物をもたらすことを実証する。
［実施例１２］
カラムクロマトグラフィーを介したＴ細胞の選択および刺激
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー刺激剤の存在下でのオンカラム刺激を伴うカラムベースの親和性クロマトグラフィーによってＴ細胞を濃縮する研究を実行した。この研究は、さらなる例示的細胞表面マーカーＣＤ２７を使用する選択が、オンカラム刺激によって誘導されるような自発的細胞脱離を許与するか否かを調べた。この研究はまた、クロマトグラフィーカラムの外側に構成された加熱エレメントによって加熱されたクロマトグラフィーカラムを使用するオンカラムＴ細胞選択および刺激によって、選択され、刺激されたＴ細胞の能力を調べた。
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）緩衝液中、１０ｍｇの多量体化ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｔｉｖｉｎ）ムテイン（例えば、ＳＴＲＥＰ－ＴＡＣＴＩＮ（登録商標）Ｍ２、配列番号６）を、溶媒に曝露された第一級アミン基を介して８ｇ（初期乾重に関して）のエポキシ活性化ポリスチレン樹脂（ＣＹ１７０３０；Ｃｙｔｏｓｏｒｂｅｎｔｓ）にカップリングした。その後、１．８ｍｇの、Ｆａｂ断片の重鎖にカルボキシル末端で融合したストレプトアビジン結合ペプチド（例えば、Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ（登録商標）、配列番号１６）を含む抗ＣＤ２７ Ｆａｂ選択剤を、ＳＴＲＥＰ－ＴＡＣＴＩＮ（登録商標）コーティングされた樹脂の５０％懸濁液（総体積に対する樹脂ベッド体積）に添加した。懸濁液を穏やかな振盪の下、室温で１時間インキュベートして、Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ（登録商標）を介した、Ｆａｂ断片の固定化されたＳＴＲＥＰ－ＴＡＣＴＩＮ（登録商標）Ｍ２多量体試薬への可逆性結合を可能にした。次いで、抗ＣＤ２７ Ｆａｂ断片が官能基付与された樹脂をプラスチック製フルスケールカラムに添加して、１８～２０ｍＬのベッド体積を得た。使用前に、カラムを０．５％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ（ＰＢＳＡ緩衝液）を用いて平衡化した。カラムはまた、カラム中の空気の存在を可能にするために、ガス供給エレメント、具体的には、ネジ式エアフィルター用のガス供給コネクタを含んでいた。
カラムの加熱エレメントは、カラムを囲むように設計されたジャケット部材の一部であった。ジャケット部材は、カラムを囲むように一緒に接続された２つのジャケット構成成分を含んでおり、各ジャケット構成成分は、その内表面に沿って配置された加熱コイルを含有していた。各加熱コイルは、外部温水供給用の入口および出口を有していた。加熱コイルを備えた各ジャケット構成成分は、カラムの外周の半分を上から下に囲むように設計され、ジャケット構成成分内の加熱コイルも同様にカラムの半分を囲んだ。まとめると、ジャケット構成成分、従って、加熱コイルは、細胞および試薬のカラムへの入口およびカラムからの出口を可能にする開口部を除いてカラムを取り囲んだ。例えば、例示的概略図について図２５～２８を参照されたい。
ヒトドナーからのアフェレーシス試料を親和性カラム上にロードし、２つの洗浄工程を実施した。試料をロードした時点から３０分よりも長く経過した後、実施例１に記載されたように作製された、オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー試薬）に可逆的に結合された、２０００μｇの多量体化抗ＣＤ３ Ｆａｂ断片および抗ＣＤ２８ Ｆａｂ断片を、２０ｍＬのグルタミンならびに組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７を含有する無血清基本培地中でカラムにロードし、ジャケット部材中に含有された加熱コイルを介して３７℃でインキュベートした。およそ４時間後、およそ８０ｍＬのグルタミンならびに組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７を含有する無血清基本培地をカラムに通すことによって単一工程でカラムから細胞を収集した。ストレプトアビジンムテイン（例えば、ＳＴＲＥＰ－ＴＡＣＴＩＮ（登録商標））でコーティングされた固定相樹脂への抗ＣＤ２７ Ｆａｂ選択剤のストレプトアビジン結合ペプチド（例えば、Ｔｗｉｎ Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ（登録商標））の結合を破壊するためのさらなる競合物質を添加することなく（例えば、Ｄ－ビオチンを添加することなく）、細胞を収集した。対照として、アフェレーシス試料を抗ＣＤ２７親和性カラム上にロードしたが、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー刺激試薬の存在下でのインキュベーションは行わなかった。対照条件については、選択工程後、抗ＣＤ３ ＦａｂのＴｗｉｎ Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ（登録商標）とＳＴＲＥＰ－ＴＡＣＴＩＮ（登録商標）の間の結合を破壊するための競合物質としてＤ－ビオチンを添加し、放出された細胞を重力流によって収集した。
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー試薬でのオンカラム刺激の開始のおよそ４時間後、収集した細胞をＣＤ２７の表面発現について分析した。図３２に示されるように、抗ＣＤ２７選択剤を使用して親和性カラムに固定化されているＴ細胞のオンカラム刺激の４時間後に生存ＣＤ４５＋細胞においてＣＤ２７の下方制御が観察された。対照的に、抗ＣＤ２７親和性カラム上に固定化された細胞がオリゴマー刺激試薬と共にインキュベートされなかった対照条件については、対照試料における収集されたＴ細胞の高パーセンテージがＣＤ２７のポジティブ発現を保持することによって証明されるように、Ｄ－ビオチンを用いる溶出によって収集された細胞は、ＣＤ２７下方制御を示さなかった。これらの結果は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激試薬でのＴ細胞の刺激が、受容体のために選択されたものの表面発現の下方制御をもたらし、それによって、脱離するための、または親和性カラムへの細胞の結合を破壊するための競合試薬を添加することを必要としない、カラムからの細胞の自発的脱離を可能にしたという観察結果と一致する。
これらの結果は、細胞を選択するために使用された細胞表面マーカーは、細胞表面マーカーを介して親和性カラムに固定化されながら、細胞のオンカラム刺激によって下方制御される場合があり、それによって、細胞収集のために細胞を放出する競合物質を使用することのないカラムからの細胞の放出が可能になることをさらに支持する。これらの結果はまた、加熱エレメントを含有し、加熱のためにカラムを囲むように構成され、細胞のオンカラム刺激の間にカラム温度を維持するジャケット部材の有用性を示す。
［実施例１３］
複数の選択マーカーを用いる連続カラムクロマトグラフィーを介したＴ細胞の選択および刺激
２つの別個のカラムを使用してオンカラムＴ細胞選択および刺激を実施した。異なる例示的選択剤を使用して各カラムを調製し、カラム温度を約３７℃に維持するように加熱デバイスが構成されたオンカラム刺激を、第２のカラムにおいてのみ実施した。第２のカラムは、実施例１２に記載されるように、ガス供給エレメントを含んでおり、２つの加熱コイルを含有するジャケット部材を用いて加熱した。
実施例１２に記載されるように抗ＣＤ２７ Ｆａｂを使用して第１のカラムを調製した。ヒトドナーからのアフェレーシス試料をカラムにロードし、カラムを洗浄した。試料をロードした時点から３０分よりも長く経過した後、Ｄ－ビオチンを添加して、抗ＣＤ２７ ＦａｂのＴｗｉｎ Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ（登録商標）とＳＴＲＥＰ－ＴＡＣＴＩＮ（登録商標）の間の結合を破壊して、第１のカラムから細胞を放出した。放出された細胞を重力流によって収集し、洗浄して残存するＤ－ビオチン混入を除去し、実施例１２におけるようにであるが選択剤として抗ＣＤ３ Ｆａｂを使用して調製された第２のカラムに通した。ＣＤ３結合Ｆａｂ断片は、ハイブリドーマ細胞株ＯＫＴ３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－８００１（商標）；米国特許第４，３６１，５４９号も参照されたい）によって産生されたＣＤ３結合性モノクローナル抗体に由来し、Arakawa et al J. Biochem. 120, 657-662 (1996)に記載された抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３の重鎖可変ドメイン（配列番号３１）および軽鎖可変ドメイン（配列番号３２）を含有していた。放出された細胞を第２のカラム中にロードした時点から３０分よりも長く経過した後、実施例１に記載されたように作製された、オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー試薬）に可逆的に結合された、２０００μｇの多量体化抗ＣＤ３ Ｆａｂ断片および抗ＣＤ２８ Ｆａｂ断片を、２０ｍＬのグルタミンならびに組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７を含有する無血清基本培地中で第２のカラム上にロードし、ジャケット部材中に含有された加熱コイルを介して３７℃でインキュベートした。およそ４時間後、およそ８０ｍＬのグルタミンならびに組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７を含有する無血清基本培地を第２のカラムに通すことによって単一工程で第２のカラムから選択された細胞を収集した。ストレプトアビジンムテイン（例えば、ＳＴＲＥＰ－ＴＡＣＴＩＮ（登録商標））でコーティングされた固定相樹脂への抗ＣＤ３ Ｆａｂ選択剤のストレプトアビジン結合ペプチド（例えば、Ｔｗｉｎ Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ（登録商標））の結合を破壊するためのさらなる競合物質を添加することなく（例えば、Ｄ－ビオチンを添加することなく）細胞を収集した。
アフェレーシス試料および各カラムのポジティブ画分からの細胞を、表面ＣＤ３およびＣＤ２７を認識する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって定量化した。フローサイトメトリー結果は、図３３に示されている。アフェレーシス試料では、細胞の３２．３％がＣＤ３＋ＣＤ２７＋であった。ＣＤ２７およびＣＤ３選択は、ＣＤ３＋ＣＤ２７＋細胞の高濃縮につながり、ＣＤ２７選択後の８７．５％の純度およびＣＤ３選択後の９６．２％の純度となった。第２のカラムにおけるオンカラム刺激は、ＣＤ３表面発現の下方制御につながり、ＣＤ２７表面発現は、相対的に保存された。これらの結果は、表面受容体発現の刺激によって誘導される下方制御が、オンカラム刺激の際に選択された細胞が結合される受容体に対して特異的であるという観察結果と一致する。
［実施例１４］
異なる加熱配置を使用するＴ細胞の選択および刺激
クロマトグラフィーカラムエレメントの外側に配置された加熱エレメントの異なる配置によって加熱されたクロマトグラフィーカラムを使用するオンカラムＴ細胞選択および刺激による選択され、刺激されたＴ細胞の能力を評価した。各カラムを、実施例１３に記載されるようにＴ細胞の選択のために抗ＣＤ３ Ｆａｂを用いて調製し、各カラムはガス供給エレメント、具体的には、ネジ式エアフィルター用のガス供給コネクタを含んでいた。
各カラムの加熱エレメントは、カラムを囲むように設計されたジャケット部材の一部であった。ある配置では、ジャケット部材は、実施例１２に記載されるとおりであった。例えば、例示的概略図について図２５～２８を参照されたい。
第２の配置については、ジャケット部材は、３つのジャケット構成成分を含んでおり、各々はカラムの外周の３分の１を上から下に囲むように設計され、ジャケット構成成分は一緒に、カラムを囲むように接続された。各ジャケット構成成分には、電気温度センサーおよび電気加熱エレメントとしての金属プレートが含まれていた。各金属プレートは、アルミニウムプロファイルを有し、電気絶縁層が各金属プレートとそのアルミニウムプロファイルの間に配置された。各金属プレートはそのジャケット構成成分の内表面に取り付けられ、各ジャケット構成成分は、その温度センサーおよび金属プレートの電気接続点を有していた。ジャケット構成成分は一緒になって、３つの金属プレートがカラムの外周の周りに等間隔に配置され、ジャケットの内側がカラムと直接接触するように、細胞および試薬のカラムへの入口およびカラムからの出口を可能にする開口部を除いてカラムを取り囲んだ。例えば、例示的概略図については図２９～３１を参照されたい。
上記のジャケット構成成分の各々が、カラムの内部空洞を加熱する条件下でカラムの周りに構成された、カラムベースの親和性クロマトグラフィーを使用してオンカラムＴ細胞選択および刺激を実施した。各構成されたカラムについて、ヒトドナーからのアフェレーシス試料を親和性カラム上にロードし、試料中のＣＤ３＋Ｔ細胞を、樹脂上に固定化されているＣＤ３結合Ｆａｂ断片と相互作用させた。カラムをＰＢＳＡ緩衝液で２回洗浄して、固定されたＣＤ３結合Ｆａｂ断片と相互作用しなかった細胞を除去した。カラム上に試料をロードした時点からおよそ１５分後、上記の実施例１および２に記載された、少なくとも２０００μｇの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー試薬（オリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬に可逆的に結合された多量体化抗ＣＤ３ Ｆａｂ断片および抗ＣＤ２８ Ｆａｂ断片刺激剤）を、２０ｍＬのグルタミンならびに組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７を含有する無血清基本培地中でカラム上にロードすることによって刺激試薬をカラムに添加し、細胞を細胞を刺激する条件下でカラムでインキュベートした。インキュベーションの際、金属ベースの加熱エレメントを使用して加熱したカラムを、３０℃、３５℃または３７℃の温度で維持した。参照のために、加熱コイル（例えば、水ベースの加熱エレメント）を使用して加熱したカラムを３７℃で一定に維持した。ガス供給エレメントは、インキュベーションの際に接続された開いた無菌フィルターの制御下で空気を供給した。
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー試薬を用いたオンカラム刺激の際に、選択されたＣＤ３＋Ｔ細胞は、細胞と樹脂の間の結合を破壊するために競合試薬を添加することを必要とせずにカラムから自発的に脱離した。試薬を添加した後およそ４．５時間以内に、およそ８０ｍＬのグルタミンならびに組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７を含有する無血清基本培地をカラムを通すことによって単一工程でカラムから自発的に脱離した細胞を収集し、細胞を重力流によって収集した。重力流によるその収集の前に、ストレプトアビジンムテイン（例えば、ＳＴＲＥＰ－ＴＡＣＴＩＮ（登録商標））でコーティングされた固定相樹脂への抗ＣＤ３ Ｆａｂ選択剤のストレプトアビジン結合ペプチド（例えば、Ｔｗｉｎ Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ（登録商標））の相互作用を介したカラム上の細胞の結合を破壊するために、さらなる競合物質（例えば、Ｄ－ビオチンを添加しない）をカラムに添加しなかった。次いで、収集された細胞を染色し、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ６９表面発現について、ならびに生細胞の数およびパーセンテージについて定量化した。
図３４Ａ～３４Ｅに示されるように、細胞のオンカラム選択および刺激後にカラムから収集された細胞のＣＤ３＋枯渇効率（図３４Ａ）、ＣＤ４およびＣＤ８発現（図３４Ｂ）ならびにＣＤ６９発現（図３４Ｃ）は、ジャケット部材（水－および金属－ベースの加熱エレメント）を備えたカラムのいずれかを使用して同様であった。結果はまた、３０℃から３７℃の間のインキュベーション温度にわたって一致していた。図３４Ｄおよび図３４Ｅに示されるように、インキュベーション温度にわたって金蔵ベースの加熱エレメントを備えたカラムを使用して収集された生細胞のパーセンテージ（図３４Ｄ）および数（図３４Ｅ）において、より変動性があった。
上記の実施例の結果と一緒にすると、これらの結果は、細胞のオンカラム刺激の間の加熱およびカラム温度の維持のための種々の種類の加熱エレメントおよび配置の有用性を示す。
［実施例１５］
Ｔ細胞の同時オンカラム刺激および形質導入
親和性クロマトグラフィーカラム上に固定化されているＴ細胞を同時に刺激し、形質導入する研究を実行した。そうするために、カラムに固定されたＴ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー刺激剤および例示的組換えタンパク質、この場合には、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするレンチウイルスベクターの存在下で同時にインキュベートした。
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）緩衝液中で、１０ｍｇの多量体化ストレプトアビジンムテイン（ＳＴＲＥＰ－ＴＡＣＴＩＮ（登録商標）Ｍ２、配列番号６）を、溶媒に曝露された第一級アミン基を介して８ｇ（初期乾重に関して）のエポキシ活性化ポリスチレン樹脂（ＣＹ１７０３０；Ｃｙｔｏｓｏｒｂｅｎｔｓ）にカップリングした。その後、１．８ｍｇの、Ｆａｂ断片の重鎖にカルボキシル末端で融合したストレプトアビジン結合ペプチド（例えば、Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ（登録商標）、配列番号１６）を含む抗ＣＤ３ Ｆａｂ断片選択剤を、ＳＴＲＥＰ－ＴＡＣＴＩＮ（登録商標）コーティングされた樹脂の５０％懸濁液（総体積に対する樹脂ベッド体積）に添加した。ＣＤ３結合Ｆａｂ断片は、ハイブリドーマ細胞株ＯＫＴ３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－８００１（商標）；米国特許第４，３６１，５４９号も参照されたい）によって産生されたＣＤ３結合性モノクローナル抗体に由来し、Arakawa et al J. Biochem. 120, 657-662 (1996)に記載された抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３の重鎖可変ドメイン（配列番号３１）および軽鎖可変ドメイン（配列番号３２）を含有していた。懸濁液を穏やかな振盪の下、室温で１時間インキュベートして、Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ（登録商標）を介した、Ｆａｂ断片の固定化されたＳＴＲＥＰ－ＴＡＣＴＩＮ（登録商標）Ｍ２多量体試薬への可逆性結合を可能にした。次いで、抗ＣＤ３ Ｆａｂ断片が官能基付与された樹脂をプラスチック製フルスケールカラムに添加して、１８～２０ｍＬのベッド体積を得た。使用前に、カラムを０．５％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ（ＰＢＳＡ緩衝液）を用いて平衡化した。
ヒトドナーからのアフェレーシス試料を親和性カラム上にロードし、ロードし、洗浄した後に、カラム空隙容量を活性化－形質導入緩衝液に完全に交換した。活性化－形質導入緩衝液は、以下を含有する無血清基本培地を含んでいた：組換えＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７；２ｍｇの固定量（例えば、フルスケールカラム当たり１～２×１０９細胞が捕捉されると仮定して、約１～２μｇ／１×１０６個細胞）の、実施例１に記載されるように作製された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー試薬；ならびに固定量の抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするレンチウイルス粒子（例えば、５００×１０６個細胞について６μＬ／１×１０６個細胞に対応する固定量）。次いで、親和性カラムを加熱し、３７℃でインキュベートした。インキュベーションの際、細胞は、親和性カラムから自発的に脱離し、活性化－形質導入緩衝液の添加の４．５時間後、追加の活性化－形質導入緩衝液を使用して細胞を溶出した（固定化された細胞を放出するためのビオチンまたは他の競合物質を添加することを必要とせずに）。溶出後、細胞を洗浄し、次いで、インキュベーター中３７℃でさらなる培養を行った。５日の培養後、ＣＡＲに対する抗イディオタイプ抗体を使用するフローサイトメトリーによってＣＡＲ発現を評価して、形質導入有効性を決定した。
ネガティブ対照として、カラムに固定化された細胞を、組換えサイトカインを含有する活性化のみの緩衝液および抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８オリゴマー試薬の存在下であるが、レンチウイルス粒子の不在下で３７℃でインキュベートした。活性化のみの緩衝液を用いる溶出後、オンカラム刺激の開始の４．５時間後に、ネガティブ対照の細胞を、形質導入を行わずにさらに培養した。ポジティブ対照として、カラムに固定化された細胞を、活性化のみの緩衝液の存在下で３７℃でインキュベートした。活性化のみの緩衝液を用いる溶出後、オンカラム刺激の開始の４．５時間後に、次いで、ポジティブ対照の収集した細胞を、初期活性化の２４時間後、６μＬ／１×１０６個細胞の比率のレンチウイルスベクターの存在下でスピノキュレートした。通常５００×１０６細胞より多くがカラムから放出されたので、多くの場合、この量はオンカラム形質導入に使用したウイルスベクターの固定量よりもより多かった。スピノキュレーション後、次いで、細胞を、インキュベーター中３７℃で５日間のさらなる培養に付し、その時点で、ＣＡＲ発現を上記のように評価した。
図３５は、同時オンカラム刺激および形質導入を行った細胞（右パネル）、ならびにネガティブおよびポジティブ対照の細胞（それぞれ左および中央パネル）のＣＤ８およびＣＡＲ発現を示す。示された結果は、生存している、単一のＣＤ４５＋リンパ球で事前ゲーティングされた細胞についてである。図３５に示されるように、同時オンカラム刺激および形質導入を行った細胞は、オンカラム刺激後に形質導入された細胞が有するよりも（ポジティブ対照、３５．３％）より高いＣＡＲ発現（４３．９％）を有していた。ネガティブ対照の細胞は、ＣＡＲの無視できる標識化しか示さなかった（０．７３％）。
これらの結果は、細胞を親和性クロマトグラフィーを使用してポジティブ選択によって固定化しながら、細胞を活性化および形質導入する工程をオンカラムで実施できることを示す。これらの結果はまた、例えば、カラムに固定化された細胞に刺激試薬および形質導入試薬を同時に添加することによって、オンカラム活性化および形質導入を同時に実施できることを示す。驚くべきことに、これらの結果は、形質導入がオフカラムで、および／または刺激の開始の後に開始される方法と比較して、高度に効率的な、改善された形質導入有効性を実証する。さらに、クロマトグラフィーカラムで選択ならびに活性化および形質導入工程を実施することによって、このプラットフォームは、細胞の選択、刺激および遺伝子工学などのオンカラム操作を統合する完全閉鎖システムを可能にする。これにより、より広い細胞特性を保持し、細胞生成 所要時間を改善し、直接関与の失敗を最小にし、最終的に細胞療法の製造コストを低減するために、製造することをより迅速に、細胞のマニピュレーションのより少ないものに変換する可能性がもたらされる。
本発明は、例えば本発明の種々の態様を説明するために提供される特定の開示される実施形態に、範囲が限定されることを意図しない。記載される組成物および方法の種々の改変は、本明細書の記載および教示から明らかになるであろう。そのような変形形態は、本開示の真の範囲および趣旨から逸脱することなく実施することができ、本開示の範囲内にあることが意図される。

Claims (124)

  1. Ｔ細胞のオンカラム形質導入の方法であって、
    （ａ）複数のＴ細胞をＴ細胞刺激試薬および組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むウイルスベクターと同時に接触させることであって、複数のＴ細胞は、クロマトグラフィーカラムの内部空洞中に含まれる固定相上に固定化されていること、
    （ｂ）複数のＴ細胞を、Ｔ細胞刺激試薬およびウイルスベクターの存在下でインキュベートすること、ならびに
    （ｃ）接触の２４時間以内にクロマトグラフィーカラムから複数のＴ細胞を収集し、それによって、組換えタンパク質で形質導入されたＴ細胞を含む組成物を生成すること
    を含む、方法。
  2. 固定相が、複数のＴ細胞の表面上に発現された選択マーカーに特異的に結合する選択剤を含み、選択マーカーへの選択剤の特異的結合が、固定相上での複数のＴ細胞の固定化を達成する、請求項１に記載方法。
  3. Ｔ細胞のオンカラム形質導入の方法であって、
    （ａ）複数のＴ細胞を含む試料を、クロマトグラフィーカラムの内部空洞に添加することであって、内部空洞は、複数のＴ細胞の表面上に発現された選択マーカーに特異的に結合する選択剤を含む固定相を含み、それによって、複数のＴ細胞を固定相上に固定化すること、
    （ｂ）クロマトグラフィーカラム上に固定化されている複数のＴ細胞を、Ｔ細胞刺激試薬および組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むウイルスベクターと同時に接触させること、
    （ｃ）複数のＴ細胞をＴ細胞刺激試薬およびウイルスベクターの存在下でインキュベートすること、ならびに
    （ｄ）接触の２４時間以内にクロマトグラフィーカラムから複数のＴ細胞を収集し、それによって、組換えタンパク質で形質導入されたＴ細胞を含む組成物を生成すること
    を含む、方法。
  4. Ｔ細胞刺激試薬およびウイルスベクターが、別個の組成物として複数のＴ細胞と接触される、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  5. Ｔ細胞刺激試薬およびウイルスベクターが、同一組成物中の混合物として複数のＴ細胞と接触される、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  6. Ｔ細胞のオンカラム形質導入の方法であって、
    （ａ）Ｔ細胞刺激試薬およびウイルスベクター調製物を含む混合物を調製すること、
    （ｂ）クロマトグラフィーカラムで、複数のＴ細胞を混合物と接触させることであって、複数のＴ細胞は、クロマトグラフィーカラムの内部空洞中に含まれる固定相上に固定化されていること、
    （ｃ）複数のＴ細胞をＴ細胞刺激試薬およびウイルスベクターの存在下でインキュベートすること、ならびに
    （ｄ）接触の２４時間以内に、クロマトグラフィーカラムから複数のＴ細胞を収集し、それによって、組換えタンパク質で形質導入されたＴ細胞を含む組成物を生成すること
    を含む、方法。
  7. 固定相が、複数のＴ細胞の表面上に発現された選択マーカーに特異的に結合する選択剤を含み、選択マーカーへの選択剤の特異的結合が、固定相上での複数のＴ細胞の固定化を達成する、請求項６に記載の方法。
  8. Ｔ細胞のオンカラム形質導入の方法であって、
    （ａ）複数のＴ細胞を含む試料を、クロマトグラフィーカラムの内部空洞に添加することであって、内部空洞は、複数のＴ細胞の表面上に発現された選択マーカーに特異的に結合する選択剤を含む固定相を含み、それによって、固定相上に複数のＴ細胞を固定化すること、
    （ｂ）クロマトグラフィーカラムの内部空洞に、Ｔ細胞刺激試薬およびウイルスベクターを含む混合物を添加することによって、複数のＴ細胞を、Ｔ細胞刺激試薬および組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むウイルスベクターと接触させること、
    （ｃ）Ｔ細胞刺激試薬およびウイルスベクターの存在下で複数のＴ細胞をインキュベートすること、ならびに
    （ｄ）混合物の添加の２４時間以内にクロマトグラフィーカラムから複数のＴ細胞を収集し、それによって、組換えタンパク質で形質導入されたＴ細胞を含む組成物を生成すること
    を含む、方法。
  9. Ｔ細胞刺激試薬およびウイルスベクターを混合して、Ｔ細胞刺激試薬およびウイルスベクターを含む混合物を形成することを含む、請求項６から８のいずれかに記載の方法。
  10. 接触させることが、内部空洞に試料を添加した後１０分以内もしくは約１０分以内に、２０分以内もしくは約２０分以内に、３０分以内もしくは約３０分以内に、４５分以内もしくは約４５分以内に、６０分以内もしくは約６０分以内に、９０分以内もしくは約９０分以内に、または１２０分以内もしくは約１２０分以内に開始される、請求項３から５、８および９のいずれかに記載の方法。
  11. インキュベートすることの少なくとも一部分が、約３５℃から約３９℃の間の温度で実行される、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
  12. インキュベートすることの少なくとも一部分が、３７℃または約３７℃の温度で実行される、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
  13. 固定相の温度が、固定相に熱を提供するように構成された１つまたは複数の加熱エレメントによって調節される、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
  14. Ｔ細胞刺激試薬およびウイルスベクターが、無血清培地中の複数のＴ細胞と接触され、インキュベーションが、無血清培地中で実行される、請求項１～１３のいずれかに記載の方法。
  15. 無血清培地が、１種または複数の組換えＴ細胞刺激性サイトカインを含む、請求項１４に記載の方法。
  16. Ｔ細胞刺激試薬およびウイルスベクターが、１種または複数の組換えＴ細胞刺激性サイトカインを含む培地中の複数のＴ細胞と接触される、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
  17. 混合物が、１種または複数の組換えＴ細胞刺激性サイトカインを含む培地である、請求項６から１６のいずれかに記載の方法。
  18. 培地が無血清培地である、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
  19. １つまたは複数の組換えサイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７から選択される、請求項１５から１８のいずれかに記載の方法。
  20. １つまたは複数の組換えサイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７である、請求項１５から１９のいずれかに記載の方法。
  21. Ｔ細胞刺激試薬が、各々、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、境界を含めて、０．１μｇから２０μｇの間もしくは約０．１μｇから約２０μｇの間、境界を含めて、０．４μｇから８μｇの間もしくは約０．４μｇから約８μｇの間、または境界を含めて、０．８μｇから４μｇの間もしくは約０．８μｇから約４μｇの間の量で複数のＴ細胞と接触される、請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
  22. Ｔ細胞刺激試薬が、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、境界を含めて、１μｇから２μｇの間または約１μｇから約２μｇの間の量で複数のＴ細胞と接触される、請求項１から２１のいずれかに記載の方法。
  23. 混合物が、各々、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、境界を含めて、０．１μｇから２０μｇの間もしくは約０．１μｇから約２０μｇの間、境界を含めて、０．４μｇから８μｇの間もしくは約０．４μｇから約８μｇの間、または境界を含めて、０．８μｇから４μｇの間もしくは約０．８μｇから約４μｇの間のＴ細胞刺激試薬の量を含む、請求項６から２３のいずれかに記載の方法。
  24. 混合物が、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、境界を含めて、１μｇから２μｇの間または約１μｇから約２μｇの間のＴ細胞刺激試薬の量を含む、請求項６から２３のいずれかに記載の方法。
  25. ウイルスベクターが、複数のＴ細胞と、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、境界を含めて、０．１μＬから１００μＬの間もしくは約０．１μＬから約１００μＬの間、境界を含めて、０．５μＬから５０μＬの間もしくは約０．５μＬから約５０μＬの間または境界を含めて、１μＬから２５μＬの間もしくは約１μＬから約２５μＬの間の体積の各ウイルスベクターの調製物で接触される、請求項１から２４のいずれかに記載の方法。
  26. ウイルスベクターが、複数のＴ細胞と、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、境界を含めて、２μＬから１０μＬの間もしくは約２μＬから約１０μＬの間のウイルスベクターの調製物の体積で、適宜、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、６μＬまたは約６μＬの体積で接触される、請求項１から２５のいずれかに記載の方法。
  27. 混合物が、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、境界を含めて、０．１μＬから１００μＬの間もしくは約０．１μＬから約１００μＬの間、境界を含めて、０．５μＬから５０μＬの間もしくは約０．５μＬから約５０μＬの間または境界を含めて、１μＬから２５μＬの間もしくは約１μＬから約２５μＬの間の体積の各ウイルスベクターの調製物を含む、請求項６から２５のいずれかに記載の方法。
  28. 混合物が、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、境界を含めて、２μＬから１０μＬの間または約２μＬから約１０μＬの間の体積のウイルスベクター調製物、適宜、１０６個の細胞の固定相上に固定化されている複数のＴ細胞または固定相上に固定化されている推定される複数のＴ細胞当たり、６μＬまたは約６μＬの体積のウイルスベクターの調製物を含む、請求項６から２７のいずれかに記載の方法。
  29. ウイルスベクターの調製物が、１×１０６ＴＵ／ｍＬから１×１０９ＴＵ／ｍＬの間もしくは約１×１０６ＴＵ／ｍＬから約１×１０９ＴＵ／ｍＬの間、１×１０６ＴＵ／ｍＬから１×１０８ＴＵ／ｍＬの間もしくは約１×１０６ＴＵ／ｍＬから約１×１０８ＴＵ／ｍＬの間、１×１０６ＴＵ／ｍＬから１×１０７ＴＵ／ｍＬの間もしくは約１×１０６ＴＵ／ｍＬから約１×１０７ＴＵ／ｍＬの間、１×１０７ＴＵ／ｍＬから１×１０９ＴＵ／ｍＬの間もしくは約１×１０７ＴＵ／ｍＬから約１×１０９ＴＵ／ｍＬの間、１×１０７ＴＵ／ｍＬから１×１０８ＴＵ／ｍＬの間もしくは約１×１０７ＴＵ／ｍＬから約１×１０８ＴＵ／ｍＬの間または１×１０８ＴＵ／ｍＬから１×１０９ＴＵ／ｍＬの間もしくは約１×１０８ＴＵ／ｍＬから約１×１０９ＴＵ／ｍＬの間の力価を有する、請求項６、７および９から２８のいずれかに記載の方法。
  30. 収集することが、接触することの２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、９時間、８時間、７時間、６時間または５時間後以内に実行される、請求項１から２９のいずれかに記載の方法。
  31. 収集することが、接触することの、各境界を含めて２時間から２４時間、２時間から２２時間、２時間から２０時間、２時間から１８時間、２時間から１６時間、２時間から１４時間、２時間から１２時間、２時間から１０時間、２時間から９時間、２時間から８時間、２時間から７時間、２時間から６時間、２時間から５時間、３時間から６時間、３時間から５時間、４時間から６時間もしくは４時間から５時間の間、または約２時間から約２４時間、約２時間から約２２時間、約２時間から約２０時間、約２時間から約１８時間、約２時間から約１６時間、約２時間から約１４時間、約２時間から約１２時間、約２時間から約１０時間、約２時間から約９時間、約２時間から約８時間、約２時間から約７時間、約２時間から約６時間、約２時間から約５時間、約３時間から約６時間、約３時間から約５時間、約４時間から約６時間もしくは約４時間から約５時間の間の後に実行される、請求項１から３０のいずれかに記載の方法。
  32. 収集することが、接触することの、４．５時間または約４．５時間後に実行される、請求項１から３１のいずれかに記載の方法。
  33. Ｔ細胞刺激試薬の存在下でインキュベートすることが、複数の固定化されたＴ細胞のうち１つまたは複数を固定相から放出する、請求項１から３２のいずれかに記載の方法。
  34. 収集することが、カラムに洗浄緩衝液を添加して、インキュベーションの際に固定相への固定化から放出された１つまたは複数の細胞を収集することを含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 洗浄緩衝液が細胞培地である、請求項３４に記載の方法。
  36. 細胞培地が、１種または複数の組換えＴ細胞刺激性サイトカインを含み、組換えＴ細胞刺激性サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７から選択されてもよい、請求項３５に記載の方法。
  37. 細胞培地が無血清培地である、請求項３５または請求項３６に記載の方法。
  38. 細胞培地が、Ｔ細胞を固定相から溶出するための競合剤を含まない、請求項３５から３７のいずれかに記載の方法。
  39. 収集することが、固定相から複数のＴ細胞を溶出するための競合剤を含む培地を固定相に添加することを含まない、請求項１から３８のいずれかに記載の方法。
  40. 組換えタンパク質で形質導入されたＴ細胞を含む組成物が、競合剤を含まない、請求項１から３９のいずれかに記載の方法。
  41. 競合剤が、ビオチンまたはビオチンアナログを含み、ビオチンアナログがデスチオビオチンであってもよい、請求項３８から４０のいずれかに記載の方法。
  42. 競合剤が、Ｄ－ビオチンを含む、請求項３８から４１のいずれかに記載の方法。
  43. 形質導入されたＴ細胞を含む組成物を溶液中でインキュベートすることをさらに含む、請求項１から４２のいずれかに記載の方法。
  44. さらにインキュベートすることが、３７℃±２℃または約３７℃±２℃の温度で実行される、請求項４３に記載の方法。
  45. さらにインキュベートすることが、１４日以下、１２日以下、１０日以下、８日以下、６日以下または５日以下の間実行される、請求項４３または請求項４４に記載の方法。
  46. さらにインキュベートすることが、形質導入されたＴ細胞の拡大増殖を誘導するための条件下で実行され、さらにインキュベートすることが、１種または複数の組換えＴ細胞刺激性サイトカインを含む細胞培地中で実行されてもよく、組換えＴ細胞刺激性サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７から選択されてもよい、請求項４３から４５のいずれかに記載の方法。
  47. さらにインキュベートすることが、形質導入されたＴ細胞の最小の拡大増殖がある、またはさらなる拡大増殖がない条件下で実行される、請求項４３から４５のいずれかに記載の方法。
  48. さらにインキュベートすることが、組換えＴ細胞刺激性サイトカインを全く含まない基本培地中で実行される、請求項４７に記載の方法。
  49. Ｔ細胞刺激試薬が、刺激シグナルをＴ細胞に送達可能である１種または複数の刺激剤を含む、請求項１から４８のいずれかに記載の方法。
  50. １種または複数の刺激剤のうち少なくとも１つが、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを送達することができ、適宜、Ｔ細胞のＴＣＲ／ＣＤ３複合体、Ｔ細胞のＣＤ３含有複合体および／またはＴ細胞のＩＴＡＭ含有分子を介して刺激シグナルを送達することができる、請求項４９に記載の方法。
  51. 少なくとも１つの刺激剤が、第１の刺激剤であり、刺激試薬が、第１の刺激剤によって送達された刺激シグナルを増強することができる第２の刺激剤をさらに含む、請求項５０に記載の方法。
  52. 第２の刺激剤が、Ｔ細胞の共刺激分子に結合する、請求項５１に記載の方法。
  53. 共刺激分子が、ＣＤ２８、ＣＤ９０（Ｔｈｙ－１）、ＣＤ９５（Ａｐｏ－／Ｆａｓ）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＩＣＯＳ、ＬＡＴ、ＣＤ２７、ＯＸ４０およびＨＶＥＭの中から選択される、請求項５２に記載の方法。
  54. 第２の刺激剤がＣＤ２８に結合する、請求項５２または請求項５３に記載の方法。
  55. 第１の刺激剤が、ＣＤ３に特異的に結合し、第２の刺激剤が、ＣＤ２８に特異的に結合する、請求項５１から５４のいずれかに記載の方法。
  56. １種または複数の刺激剤、適宜、第１の刺激剤および第２の刺激剤が各々、一価抗体断片を含む、請求項４９から５５のいずれかに記載の方法。
  57. 第１の刺激剤が、ＣＤ３に結合する一価抗体断片を含み、第２の刺激剤が、ＣＤ２８に結合する一価抗体断片を含む、請求項５１から５６のいずれかに記載の方法。
  58. 一価抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片および単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される、請求項５６または請求項５７に記載の方法。
  59. Ｔ細胞刺激試薬が、抗ＣＤ３ Ｆａｂである第１の刺激剤および抗ＣＤ２８ Ｆａｂである第２の刺激剤を含む、請求項１から５８のいずれかに記載の方法。
  60. １種または複数の刺激剤、適宜、第１の刺激剤および第２の刺激剤が、固体表面、適宜、ビーズ上に固定化されている、請求項４９から５９のいずれかに記載の方法。
  61. １種または複数の刺激剤、適宜、第１の刺激剤および第２の刺激剤が、可溶性オリゴマー試薬に可逆的に結合される、請求項４９から５９のいずれかに記載の方法。
  62. 可溶性オリゴマー試薬が、複数のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン四量体を含むオリゴマーである、請求項６１に記載の方法。
  63. 可溶性オリゴマー試薬が、境界を含めて、１０００から３０００の間または約１０００から約３０００の間のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン四量体を含む、請求項６１または請求項６２に記載の方法。
  64. 可溶性オリゴマー試薬が、境界を含めて、２０００から３０００の間または約２０００から約３０００の間のストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン四量体、適宜、２５００または約２５００のストレプトアビジンムテイン四量体を含む、請求項６１から６３のいずれかに記載の方法。
  65. １種または複数の刺激剤の各々、適宜、第１の刺激剤および第２の刺激剤の両方が、可溶性オリゴマー試薬に可逆的に結合する結合パートナーを含み、結合パートナーが、ストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン四量体のビオチン結合部位に可逆的に結合してもよい、請求項６１から６４のいずれかに記載の方法。
  66. 結合パートナーが、ビオチン、ビオチンアナログまたはストレプトアビジン結合ペプチドである、請求項６５に記載の方法。
  67. ストレプトアビジン結合ペプチドの配列が、配列番号７、８および１５から１９のいずれかに示される、請求項６６に記載の方法。
  68. ストレプトアビジン結合ペプチドが、ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１６）である、請求項６６または請求項６７に記載の方法。
  69. ストレプトアビジンムテイン四量体が、ビオチン、ビオチンアナログまたはストレプトアビジン結合ペプチドに可逆的に結合する、請求項６２から６８のいずれかに記載の方法。
  70. ストレプトアビジン結合ペプチドの配列が、配列番号７、８および１５から１９のいずれかに示される、請求項６９に記載の方法。
  71. ストレプトアビジンムテインが、配列番号１に示されるアミノ酸の配列中の位置を参照して位置４４～４７に対応する配列位置にアミノ酸配列Ｉｌｅ４４－Ｇｌｙ４５－Ａｌａ４６－Ａｒｇ４７を含む、または
    ストレプトアビジンムテインが、配列番号１に示されるアミノ酸の配列中の位置を参照して位置４４～４７に対応する配列位置にアミノ酸配列Ｖａｌ４４－Ｔｈｒ４５－Ａｌａ４６－Ａｒｇ４７を含む、請求項６２から７０のいずれかに記載の方法。
  72. ストレプトアビジンムテインが、配列番号１のアミノ酸位置１０～１６の領域においてＮ末端で始まり、配列番号１のアミノ酸位置１３３～１４２の領域においてＣ末端で終了する、請求項６２から７１のいずれかに記載の方法。
  73. ストレプトアビジンムテインが、配列番号３～６、２７、２８、１０４および１０５のいずれかに示されるアミノ酸の配列、適宜、配列番号６に示されるアミノ酸の配列を含む、請求項６２から７２のいずれかに記載の方法。
  74. 選択剤が、抗体、抗体断片、免疫グロブリン様機能を有するタンパク質性結合分子、Ｉｇドメインを含有する分子、サイトカイン、ケモカイン、アプタマー、ＭＨＣ分子、ＭＨＣ－ペプチド複合体、受容体リガンドおよび前述のもののいずれかの結合断片からなる群から選択される薬剤を含み、抗体または抗体断片を含んでもよく、抗体断片が一価抗体断片であってもよい、請求項２から７３のいずれかに記載の方法。
  75. 選択マーカーがＴ細胞共受容体またはＴ細胞抗原受容体複合体のメンバーである、請求項２から５および７から７４のいずれかに記載の方法。
  76. 選択マーカーが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２７、ＣＤ２８およびＣＣＲ７からなる群から選択される、請求項２から５および７から７５のいずれかに記載の方法。
  77. 選択マーカーがＣＤ３である、請求項２から５および７から７６のいずれかに記載の方法。
  78. 選択剤が直接的または間接的に固定相に結合される、請求項２から５および７から７７のいずれかに記載の方法。
  79. 選択剤が、選択剤が可逆的に結合する選択試薬を介して間接的に固定相に結合される、請求項２から５および７から７８のいずれかに記載の方法。
  80. 固定相が、クロマトグラフィーマトリックスを含む、請求項１から７９のいずれかに記載の方法。
  81. 固定相が、各境界を含めて、５億から５０億個の間の細胞、５億から４０億個の細胞、５億から３０億個の細胞、５億から２０億個の細胞、１０億から５０億個の細胞、１０億から４０億個の細胞、１０億から３０億個の細胞もしくは１０億から２０億個の細胞の間または約５億から約５０億個の細胞、約５億から約４０億個の細胞、約５億から約３０億個の細胞、約５億から約２０億個の細胞、約１０億から約５０億個の細胞、約１０億から約４０億個の細胞、約１０億から約３０億個の細胞もしくは約１０億から約２０億個の細胞の間の結合能力を有する、請求項１から８０のいずれかに記載の方法。
  82. 固定相が、境界を含めて、１０億から２０億個の細胞または約１０億から約２０億個の細胞の間の結合能力を有する、請求項１から８１のいずれかに記載の方法。
  83. 複数のＴ細胞が、抗原特異的Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞および／または制御性Ｔ細胞を含む、請求項１から８２のいずれかに記載の方法。
  84. Ｔ細胞が、ＣＤ３＋Ｔ細胞を含むか、またはＣＤ４＋Ｔ細胞および／もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項１から８３のいずれかに記載の方法。
  85. Ｔ細胞が、ヒト対象由来の一次Ｔ細胞である、請求項１から８４のいずれかに記載の方法。
  86. 試料がヒト対象に由来する一次Ｔ細胞を含む、および／または
    試料が、全血試料、バフィーコート試料、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料、未分画Ｔ細胞試料、リンパ球試料、白血球細胞試料、アフェレーシス生成物もしくは白血球アフェレーシス生成物である、請求項３から５および８から８５のいずれかに記載の方法。
  87. 試料がアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス生成物である、請求項３から５および８から８６のいずれかに記載の方法。
  88. アフェレーシスまたは白血球アフェレーシス生成物が、事前にクライオ凍結されている、請求項８７に記載の方法。
  89. 組換えタンパク質が抗原受容体である、請求項１から８８のいずれかに記載の方法。
  90. 組換えタンパク質がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１から８９のいずれかに記載の方法。
  91. ＣＡＲが、標的抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインおよびＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項９０に記載の方法。
  92. 細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内ドメインを含む、請求項９１に記載の方法。
  93. ＣＡＲが、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結する膜貫通ドメインをさらに含む、請求項９１または請求項９２に記載の方法。
  94. 膜貫通ドメインが、ＣＤ２８の膜貫通部分を含む、請求項９３に記載の方法。
  95. 細胞内シグナル伝達ドメインが、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項９１から９４のいずれかに記載の方法。
  96. Ｔ細胞共刺激分子が、ＣＤ２８および４１ＢＢからなる群から選択される、請求項９５に記載の方法。
  97. ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求項１から９６のいずれかに記載の方法。
  98. ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１から９７のいずれかに記載の方法。
  99. ウイルスベクターが、ＶＳＶ－Ｇを有する偽型である、請求項１から９８のいずれかに記載の方法。
  100. さらにインキュベートすることの後に形質導入されたＴ細胞を回収し、それによって形質導入されたＴ細胞のアウトプット組成物を生成することをさらに含む、請求項４３から９９のいずれかに記載の方法。
  101. 回収の時間で、アウトプット組成物中のナイーブ様細胞のパーセンテージが、アウトプット組成物中の総Ｔ細胞、総ＣＤ４＋Ｔ細胞、総ＣＤ８＋Ｔ細胞の中の、または前述のもののいずれかの組換えタンパク質発現細胞の６０％または約６０％より多い、請求項１００に記載の方法。
  102. ナイーブ様Ｔ細胞が、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ２７＋ＣＣＲ７＋、またはＣＤ６２Ｌ－ＣＣＲ７＋Ｔ細胞を含む、請求項１０１に記載の方法。
  103. ナイーブ様Ｔ細胞が、ＣＤ２７＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞を含む、請求項１０１または請求項１０２に記載の方法。
  104. ナイーブ様Ｔ細胞が、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞を含む、請求項１０１または請求項１０２に記載の方法。
  105. 凍結保存および／または対象への投与のためにアウトプット組成物の細胞を製剤化することをさらに含む、請求項１００から１０４のいずれかに記載の方法。
  106. 回収された細胞が、薬学的に許容される賦形剤または凍結保護剤の存在下で製剤化される、請求項１００から１０５のいずれかに記載の方法。
  107. 方法の工程のうち少なくとも１つが、閉鎖されたシステム内で実施される、請求項１から１０６のいずれかに記載の方法。
  108. 方法の工程の全てが、閉鎖されたシステム内で実施される、請求項１から１０７のいずれかに記載の方法。
  109. 方法の工程のうち少なくとも１つが、自動化される、請求項１から１０８のいずれかに記載の方法。
  110. 方法の工程の全てが自動化される、請求項１から１０９のいずれかに記載の方法。
  111. Ｔ細胞のオンカラム形質導入のための製造品であって、
    （ａ）（ｉ）Ｔ細胞の表面上の第１の分子および第２の分子にそれぞれ特異的に結合可能な、Ｔ細胞を刺激するための第１の刺激剤および第２の刺激剤、ならびに
    （ｉｉ）Ｔ細胞を形質導入するための、組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むウイルスベクター
    を含む組成物、ならびに
    （ｂ）固定相上にＴ細胞を固定化するためのＴ細胞上の選択マーカーに特異的に結合可能な選択剤を含む固定相
    を含む、製造品。
  112. 第１および第２の刺激剤が、組成物中に含まれるＴ細胞刺激試薬に可逆的に結合される、請求項１１１に記載の製造品。
  113. 選択剤が、選択試薬を介して間接的に固定相に結合される、請求項１１１または請求項１１２に記載の製造品。
  114. 固定相が、クロマトグラフィーマトリックスを含む、請求項１１１から１１３のいずれかに記載の製造品。
  115. クロマトグラフィーマトリックスの全てまたは一部が含有される容器をさらに含む、請求項１１１から１１４のいずれかに記載の製造品。
  116. 固定相が第１の固定相であり、選択剤が第１の選択剤であり、選択マーカーが第１の選択マーカーであり、製造品が、Ｔ細胞上の第２の選択マーカーに特異的に結合可能な第２の選択剤を含む第２の固定相をさらに含む、請求項１１１から１１５のいずれかに記載の製造品。
  117. 第１および第２の固定相が、並列に配置される、請求項１１６に記載の製造品。
  118. 第１および第２の固定相が、連続して配置される、請求項１１６に記載の製造品。
  119. 請求項１１１から１１８のいずれかに記載の製造品を含む装置。
  120. 装置の１つもしくは複数の構成要素に流体接続された流体入口および／または装置の１つもしくは複数の構成要素に流体接続された流体出口をさらに含む、請求項１１９に記載の装置。
  121. 閉鎖されたシステムまたは無菌システム中にある、請求項１１９または請求項１２０のいずれかに記載の装置。
  122. 請求項１から１１０のいずれかに記載の方法において使用するための、請求項１１１から１１８のいずれかに記載の製造品または請求項１１９から１２１のいずれかに記載の装置。
  123. 方法が、自動化様式で実行される、請求項１２２に記載の製造品または請求項１２２に記載の装置。
  124. 請求項１から１１０のいずれかに記載の方法によって形質導入されたＴ細胞の集団。
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