CN114854790A - 病毒载体转导细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了制备基因工程化细胞的方法，还提供了用重组或异源基因转导的所获得细胞及其组合物，并且用于过继免疫疗法的方法。

Description

病毒载体转导细胞的方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及通过病毒转导重组核酸进入的方法。
背景技术
免疫效应细胞(如T细胞、NK细胞、NK T细胞等)在肿瘤免疫治疗中的作用日 益受到重视。近年来，人们对免疫效应细胞进行外源受体的修饰，获得特异性识别肿 瘤相关抗原的T细胞，进而进行肿瘤治疗，如嵌合抗原受体修饰的CAR T细胞、嵌合 TCR受体修饰的TCR T细胞等。
通常，识别肿瘤相关抗原的细胞的获得是将可以编码识别肿瘤相关抗原的外源受体的重组核酸导入病毒载体，再用携带重组核酸的病毒载体感染转导细胞。然而由于携 带重组核酸的病毒载体感染转导细胞通常需要的时间较长，如CAR T细胞的制备，在 病毒载体转导外源核酸进入T细胞常规的工艺中，转导之前将T细胞活化至少需要一 天(有时长达3天或更长时间)，病毒转导亦需要很长，使得特异性识别肿瘤相关抗原 的T细胞耗时长，不仅增加了细胞产品制备的的时间成本和试剂成本，还可能增加细 胞变异的风险，并且由于制备时间过程，再给予患者细胞治疗产品时，有些患者已经 发生了肿瘤进展，从而延误肿瘤治疗的时机，影响临床治疗的效果。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种病毒载体转导细胞的方法，可以显著缩短识别肿瘤相关抗原的细胞的制备时间，且不影响甚至还进一步增强细胞治疗的疗效。
在第一方面，本发明提供病毒载体转导细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤(1)、将待转导细胞或包含待转导细胞的输入组合物、待转导细胞刺激剂、和携带重组核酸的病毒载体颗粒共同孵育，孵育时间不超过72小时；
步骤(2)、进行收获，获得输出组合物，所述输出组合物含有转导有重组核酸的细胞；
优选的，所述孵育时间为1小时-72小时；
更优选的，所述孵育时间为2小时-48小时；
更优选的，所述孵育时间为2小时-36小时；
更优选的，所述孵育时间为12小时-36小时；
更优选的，所述孵育时间为12小时-24小时。
在另一方面，本发明提供病毒载体转导细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤(1)、将待转导细胞或包含待转导细胞的输入组合物和待转导细胞刺激剂，孵育时间不超过72小时；
步骤(2)、在加入重组核酸的病毒载体颗粒进行孵育，孵育时间不超过24小时；
步骤(3)、进行收获，进行收获，获得输出组合物，所述输出组合物含有转导有重组核酸的细胞；
优选的，所述(1)和(2)的总孵育时间不超过72小时。
在具体的实施方式中，所述步骤(1)的孵育时间为2-48小时；
优选的，所述步骤(1)的孵育时间为2-24小时；
更优选的，所述步骤(1)的孵育时间为3-24小时；
更优选的，所述步骤(1)的孵育时间为5-24小时；
更优选的，所述步骤(1)的孵育时间为10-24小时；
更优选的，所述步骤(1)的孵育时间为15-22小时。
在具体的实施方式中，所述步骤(2)的孵育时间为30分钟-24小时，优选的，所述步骤(2)的孵育时间为30分钟-5个小时；
更优选的，所述步骤(2)的孵育时间为30分钟-4个小时；
更优选的，所述步骤(2)的孵育时间为30分钟-3个小时；
更优选的，所述步骤(2)的孵育时间为1个小时-3个小时。
在具体的实施方式中，所述包含待转导细胞或包含待转导细胞的输入组合物从血液 样品中获得。
在具体的实施方式中，所述病毒载体颗粒源自逆转录病毒载体；优选的，所述病毒载体颗粒是慢病毒载体。
在具体的实施方式中，所述病毒载体颗粒的感染复数不高于20，优选为1-20。
在具体的实施方式中，所述包含待转导细胞的输入组合物中待转导细胞的数量不低 于1*105-1*1010；
优选的，所述包含待转导细胞的输入组合物中待转导细胞的数量不低于1*106；
更优选的，所述待转导细胞的数量为1*105-1*1010。
在具体的实施方式中，所述重组核酸能够编码识别特异性靶抗原的受体；
优选的，所述识别特异性靶抗原的受体是T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、嵌合T细胞受体、或T细胞抗原耦合器(TAC)。
在具体的实施方式中，所述特异性靶抗原是与疾病相关的抗原或通用标签；
优选的，所述疾病是癌症、自身免疫性疾病、或感染性疾病。
在具体的实施方式中，所述特异性靶抗原是肿瘤相关抗原；
优选的，所述肿瘤相关抗原选自：B细胞成熟抗原(BCMA)、碳酸酐酶9(CAIX)、tEGFR、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、CD23、 CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、 EPHa2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二聚体、EGFR vIII、叶酸结合蛋白(FBP)、FCRL5、 FCRH5、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、激酶 插入结构域受体(kdr)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、TAG72、 B7-H6、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGEA1、HLA-A2、PSCA、叶酸受体、CD44v6、CD44v7/8、avb6整合素、8H9、NCAM、 VEGF受体、5T4、胎儿AchR、NKG2D配体、CD44v6、间皮素、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、 PSCA、NKG2D、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、 ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、肝配蛋白B2、CD123、c-Met、GD-2、O-乙酰化GD2(OGD2)、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白、 CCL-1、CD138。
在具体的实施方式中，所述待转导细胞刺激剂能够激活待转导细胞。
在具体的实施方式中，所述待转导细胞是免疫效应细胞；优选的，所述待转导细胞是T细胞，NK细胞，NKT细胞，树突细胞、巨噬细胞、CIK细胞、以及干细胞衍生的免疫 效应细胞；更优选的，所述待转导细胞是T细胞。
在具体的实施方式中，所述待转导细胞刺激剂包含CD3结合分子；CD28结合分子；重组IL-2；重组IL-15；重组IL-7；或重组IL21；
优选的，所述待转导细胞刺激剂包含抗CD3抗体和/或抗CD28抗体。
在具体的实施方式中，在收获之前，所述待转导细胞刺激剂离心去除。
在具体的实施方式中，所述待转导细胞刺激剂为游离分子。
在具体的实施方式中，所述待转导细胞刺激剂固定在固体支持物上；
优选的，所述固体支持物是聚合物基质材料；
更优选的，所述聚合物基质材料为可降解的聚合物纳米基质或珠试剂。
在具体的实施方式中，所述聚合物基质材料为药用级。
在具体的实施方式中，所述珠试剂为磁珠或微珠。
在具体的实施方式中，所述可降解的聚合物纳米基质选自OKD3。
在具体的实施方式中，所述输出组合物中，转导有重组核酸的细胞的含量不低于30 ％、或不低于40％、或不低于50％、或不低于60％、或不低于70％、或不低于80％。
在具体的实施方式中，所述输入组合物包含重组IL-2，任选重组人IL-2，所述重组IL-2 的浓度为或为约10IU/mL至500IU/mL、50IU/mL至250IU/mL或100IU/mL至200IU/mL；或浓度为至少或至少约10IU/mL、50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL 或500IU/mL；和/或
所述输入组合物包含重组IL-15，任选重组人IL-15，所述重组IL-15的浓度为或为约 1IU/mL至100IU/mL、2IU/mL至50IU/mL或5IU/mL至10IU/mL，每个都包含端值；或浓度 为至少或至少约1IU/mL、2IU/mL、5IU/mL、10IU/mL、25IU/mL或50IU/mL；和/或
所述输入组合物包含重组IL-7，任选重组人IL-7，所述重组IL-7的浓度为或为约50IU/mL至1500IU/mL、100IU/mL至1000IU/mL至200IU/mL至600IU/mL，每个都包含端值； 或浓度为至少或至少约50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL、500IU/mL、600IU/mL、700IU/mL、800IU/mL、900IU/mL或1000IU/mL。
在具体的实施方式中，收获的所述输出组合物经洗涤获得转导有重组核酸的细胞。
在具体的实施方式中，将转导有重组核酸的细胞加入缓冲液中进行保存；
优选的，所述缓冲液中含有细胞冻存剂。
在第二方面，本发明提供通过第一方面所述的方法产生的转导有重组核酸的细胞。
在优选的实施方式中，所述细胞是免疫效应细胞；优选的，T细胞、NK细胞、NKT 细胞、树突细胞、巨噬细胞、CIK细胞、以及干细胞衍生的免疫效应细胞；更优选T细胞。
在优选的实施方式中，如果输入组合物中按以下比率包括病毒和细胞：为或约 为每个细胞1个感染单位(IU)至每个细胞10个IU，例如至少或为或约为每个细胞1个感 染单位(IU)，或至少或为或为约每个细胞2个IU，至少或为或为约每个细胞5个IU，或 者至少或为或为约每个细胞10个IU，那么输出组合物中至少10％、至少25％、至少30 ％、至少40％、至少50％或至少75％的细胞已经被重组病毒载体转导。
在优选的实施方式中，包含转导有重组核酸的细胞的输出组合物中含有的转导有重组核酸的细胞(例如CAR T细胞)的比例低于常规工艺的比例。
在优选的实施方式中，包含转导有重组核酸的细胞的输出组合物中的具有记忆细胞表型(如记忆T细胞)的含量高于常规工艺得到的含量；优选地，所述含量高至少 1.5倍、2倍、3倍、4倍或5倍。
在优选的实施方式中，记忆T细胞是具有T中枢细胞记忆(TCM)表型的细胞，例 如CD45RO+CCR7+CD62L+T细胞和/或CD45RO+CCR7+CD27+CD28+CD62L+T细胞。
在第三方面，本发明提供一种组合物，包含第二方面所述的转导有重组核酸的细胞 和药学上可接受的载体。
在第四方面，本发明提供一种过继细胞治疗的方法，包括给与有此需要的对象第三 方面所述的组合物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇 幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1.新工艺制备CAR T细胞与常规对照转导后不同时间转导效率变化。
图2.显示了各种活化转录条件下的，新工艺制备CAR T细胞与常规对照转导后 不同时间转导效率变化。
图3.显示了各种活化转录条件下的，新工艺制备CAR T细胞与常规对照转导后不同时间转导效率变化。
图4.显示了CAR-T细胞体内抗肿瘤实验。
图5显示了人T细胞在小鼠外周血的存活情况。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现T细胞制备中活化转导时间缩短不但不影响重组核酸的表达，反而提高T细胞在体内的增值能力及存活时间。在此基 础上完成了本发明。
本发明不仅缩短在暴露于逆转录病毒载体颗粒之前的激活和/或活化步骤，还进一步缩短转导后的孵育时间，将体外培养时间甚至缩短至1～2天。与活化转导同时进 行的T细胞相比，未进行活化直接进行转导的T细胞几乎未检出重组受体的表达，表 明未进行活化的T细胞很难直接被慢病毒载体转导。同样都进行活化的条件下，加入 慢病毒载体的时间越晚，转导效率有明显增高趋势，尽管实际转导持续时间是递减的。 表明T细胞的活化状态决定细胞被慢病毒转染的难易程度，在一定范围内，活化时间 越长，细胞越易转染，当细胞达到易转染状态后，慢病毒可迅速进入细胞，该过程可 能少至1小时。
I.概述
本发明提供了病毒载体转导到细胞(例如免疫效应细胞)中的方法，所述方法涉及待转导细胞的活化和转导，细胞的活化和转导可以同时进行，即将待转导细胞或包含 待转导细胞的输入组合物、待转导细胞刺激剂、和携带重组核酸的病毒载体颗粒共同孵育， 也可以先活化再转导，如将待转导细胞或包含待转导细胞的输入组合物，和待转导细胞 刺激剂共同孵育进行活化，再加入携带重组核酸的病毒载体颗粒孵育，进行重组核酸的转 导活化和转导总时间控制72小时之内完成，优选的，在24小时、或36小时、或48小时 内完成。在一些实施方案中，所提供的方法涉及将逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒 载体)与细胞(例如免疫细胞，例如T细胞)群一起孵育和/或接触，在将细胞与病毒颗粒 接触或孵育之前和/或同时和/或之后，使用用离体细胞激活试剂(例如抗CD3/抗CD28 试剂)激活和/或活化T细胞。优选先活化再转导的方法。
在一具体实施方式中，将待转导细胞或包含待转导细胞的输入组合物、待转导细胞 刺激剂、和携带重组核酸的病毒载体颗粒共同孵育时，孵育时间不超过72小时，优选的，可以为1小时-72小时；更优选的，所述孵育时间为2小时-48小时；更优选的，所述孵育时 间为2小时-36小时；更优选的，所述孵育时间为12小时-36小时；更优选的，所述孵育时 间为12小时-24小时。
在一具体实施方式中，病毒载体转导细胞的方法，将待转导细胞或包含待转导细胞 的输入组合物，和待转导细胞刺激剂共同孵育进行活化时，孵育时间不超过72h，优选的， 孵育时间为2-48小时；更优选的，孵育时间为2-24小时；更优选的，孵育时间为3-24小时； 更优选的，孵育时间为5-24小时；更优选的，孵育时间为10-24小时；更优选的，孵育时间为15-22小时。
在一具体实施方式中，进行活化后，再加入病毒载体颗粒孵育进行孵育的时间不超 过24小时，优选的，为30分钟-24小时，更优选的，为30分钟-5个小时；更优选的，为30 分钟-4个小时；更优选的，为30分钟-3个小时；更优选的，为1个小时-3个小时。
在一些实施方案中，重组核酸可以是编码识别特异性靶抗原的受体，如T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、嵌合T细胞受体、或T细胞抗原耦合器(TAC)。
在一些实施方案中，所述特异性靶抗原是与疾病相关的抗原或通用标签。
在一些实施方案中，所述疾病是癌症、自身免疫性疾病、或感染性疾病。
在一些实施方案中，所述特异性靶抗原是肿瘤相关抗原，如：B细胞成熟抗原(BCMA)、碳酸酐酶9(CAIX)、tEGFR、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、CD19、CD20、 CD22、间皮素、CEA、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、上皮糖蛋 白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、EPHa2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二聚体、EGFR vIII、叶酸结合蛋白(FBP)、FCRL5、FCRH5、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMW-MAA、 IL-22R-α、IL-13R-α2、激酶插入结构域受体(kdr)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素 瘤相关抗原(MAGE)、TAG72、B7-H6、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、CA9、GD3、HMW-MAA、 CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGEA1、HLA-A2、PSCA、叶酸受体、CD44v6、CD44v7/8、 avb6整合素、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿AchR、NKG2D配体、CD44v6、间皮 素、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、PSCA、NKG2D、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前 列腺特异性抗原、PSMA、肝配蛋白B2、CD123、c-Met、GD-2、O-乙酰化GD2(OGD2)、 CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白、CCL-1、CD138。
所得的转导有重组核酸的细胞可用于过继免疫疗法。在一些此类实施方案中， 所提供的方法可用于制备用于过继疗法的免疫细胞，例如T细胞，所述方法活化转导 总时间控制在24小时、或36小时、或48小时、或72小时内。在一些方面，所提供的方 法缩短了工程化和/或制备用于过继细胞疗法的细胞时间。
在一些实施方案中，输入组合物包含原代细胞群，所述原代细胞群已从受试者 的样品获得和/或针对特定的细胞子集(例如T细胞)富集。在一些实施方案中，细胞群 (例如输入组合物)可以是先前已经进行冷冻保存的细胞群。在一些实施方案中，在 从受试者获得含有原代细胞的样品(例如单采术样品)后不超过或不超过约1小时、3小 时、6小时、12小时、18小时或24小时开始孵育和/或接触。在一些实施方案中，所述 方法产生输出组合物，其中输出组合物中至少25％、至少30％、至少40％、至少50 ％或至少75％的总细胞(或特定靶细胞类型，例如T细胞)用所述病毒载体转导和/或表 达由其编码的重组基因产物。在一些实施方案中，细胞群(例如输出组合物)中至少5 ％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18 ％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70 ％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞(例如T细胞)是根据所提供的方法用逆转 录病毒载体颗粒转导。
用于评价T细胞激活标记的表达的方法是本领域已知的。用于检测此类标记的抗体和试剂是本领域熟知的，并且容易获得。用于检测此类标记的测定和方法包括但不 限于流式细胞术(包括细胞内流式细胞术)、ELISA、ELISPOT、细胞计数珠阵列或其 他多重方法、蛋白质印迹和其他基于免疫亲和力的方法。在一些实施方案中，所述方 法能够在某些条件下实现至少特定的转导效率。例如，在一些实施方案中，如果输入 组合物按以下比率包括病毒和细胞：为或为约每个细胞1个感染单位(IU)至每个细胞 10个IU，例如至少或为或为约每个细胞1个感染单位(IU)，或至少或为或为约每个细 胞2个IU，至少或为或为约每个细胞5个IU，或者至少或为或为约每个细胞10个IU，那 么所述方法能够产生输出组合物，其中通过所述方法产生的组合物中至少10％、至少 25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少75％的细胞例如已经用重组病毒载体转 导。在一些此类实施方案中，可以在转导或以其他形式将载体转移到细胞(例如非循 环宿主细胞)中后，通过测量由逆转录病毒载体基因组中所含核酸编码的重组分子或 蛋白质(例如异源分子或蛋白质)的表达水平，来监测和/或观察用逆转录病毒载体颗粒 转导细胞的效率。可以使用多种熟知方法来评价重组分子的表达水平，例如在细胞表 面蛋白的情况下，例如通过基于亲和力的方法(例如基于免疫亲和力的方法)来检测， 例如通过流式细胞术进行。在一些例子中，通过检测转导标记和/或报道基因构建体 来测量表达。在一些实施方案中，编码截短的表面蛋白的核酸包括在载体内并用作其 表达和/或增强的标记。
在一些实施方案中，所提供的方法还可以包括在用病毒颗粒孵育(例如转导)细胞之前或之后的冷冻保存步骤。在一些实施方案中，这个步骤可以提供细胞产品的保存， 如运输中的细胞保存，或制备完成后的细胞保存。
在一些实施方案中，激活或刺激可以离体进行或在体内进行。在一些实施方案中，在用病毒颗粒孵育(例如转导)细胞后，可以将细胞输注到患者体内以进行体内激 活和扩增。
在一些实施方案中，使用的待转导细胞激活剂可以是一种，也可以是两种，或 者多种的组合。
在一些实施方案中，在孵育期间或之后，所提供的方法可以还包括离体培养输 入组合物、输出组合物和/或转导的细胞，例如在活化细胞的条件下培养，以诱导其 增殖和/或激活。活化是在一种或多种激活剂的存在下进行。在一些实施方案中，激 活剂可以是CD3结合分子、CD28结合分子，或是细胞因子(如重组IL-2、重组IL-15、 重组IL-7、或重组IL-21)。在一些实施方案中，结合分子是抗体或抗原结合片段，例 如抗CD3抗体和/或抗CD28抗体。在一些实施方案中，进一步培养是在实现细胞扩增 的条件下进行，以产生治疗有效剂量的细胞用于通过过继细胞疗法给予至受试者。
在一些实施方案中，所提供的方法避免在用编码重组受体(例如CAR)的核酸引入、转移和/或转导T细胞的过程中离体地显著改变T细胞的分化状态和/或使T细胞分 化状态的变化最小化。在一些实施方案中，根据所提供的方法产生较少的耗竭型T细 胞。
在一些实施方案中，本发明包含转导有重组核酸的细胞的输出组合物含有的转导有重组核酸的细胞(例如CAR T细胞)的比例低于常规工艺的比例。
在一些实施方案中，本发明包含转导有重组核酸的细胞的输出组合物中的具有记忆细胞表型(如记忆T细胞)的含量高于常规工艺。在一些实施方案中，所述含量高 至少1.5倍、2倍、3倍、4倍或5倍。
在一些实施方案中，记忆T细胞是具有T中枢细胞记忆(TCM)表型的细胞，例如CD45RO+CCR7+CD62L+T细胞和/或CD45RO+CCR7+CD27+CD28+CD62L+T细胞。
在一些实施方案中，本发明用于临床用途(例如过继细胞疗法中)的细胞的制备中的一个、多个或所有步骤是在无菌条件下进行。在一些实施方案中，细胞被富集、活 化、转导、或洗涤、的一个或多个过程在封闭系统内进行。
在一些实施方案中，将细胞离体处理较短的时间，进一步缩短时间。
在一些实施方案中，所提供的方法产生的转导有重组核酸的细胞(如CAR T细胞)，在给予受试者时，展现出更久的持久性和/或降低的细胞消耗。
在一些实施方案中，所提供的方法产生的转导有重组核酸的细胞(如CAR T细胞)在给予受试者时，展现出更好的效力。
在一些实施方案中，所提供的方法降低了细胞治疗产品制备过程中细胞的变异性。
在一些实施方案中，消除细胞的离体激活和转导的时间，改善了制备用于过继 免疫疗法的转导有重组核酸的细胞的过程。
术语“转导”是指将外源核酸引入真核细胞。
术语“个体”是指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本发明的个体包括但不 限于人类、非人类灵长类动物(例如恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、 牛、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。
术语“外周血单个核细胞”(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)是指外周血 中具有单个核的细胞，包含淋巴细胞、单核细胞等。
术语“T细胞活化”或“T细胞激活”及其语法上的其他形式可以指被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖、细胞因子产生和/或可检测的效应物功能的T细胞的状态。
本文所用的术语“外源”指的是一个核酸分子或多肽、细胞、组织等没有在生物体自身内源性表达，或表达水平不足以实现过表达时具有的功能。
II.活化转导方法
本文提供了一种将输入组合物的细胞与逆转录病毒载体颗粒(例如，慢病毒载体颗粒)一起孵育或接触的方法。在一些方面，输入组合物是从受试者获得的原代细胞 的组合物，其中，在一些情况下，细胞的亚群或子集已经被选择和/或富集。提供输 入组合物的特征。
在一些实施方案中，细胞包括根据所提供的方法通过基因工程化引入的一种或多种核酸，从而表达此类核酸的重组或基因工程化产物。在一些实施方案中，核酸是 异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的 核酸，例如，所述核酸通常不在被工程化的细胞和/或这种细胞所来源的生物中发现。 在一些实施方案中，核酸不是天然存在的如自然界中未发现的核酸，包括编码来自多 种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
所述方法的处理步骤可包括多个细胞处理步骤中单独的或组合的任何一个或多个步骤。在特定实施方案中，处理步骤包括用含有逆转录病毒载体的病毒载体颗粒转 导细胞，例如编码用于在细胞中表达的重组产物的载体。所述方法可以进一步和/或 可替代地包括其他处理步骤，例如细胞的隔离、分离、选择、洗涤、悬浮、稀释、浓 缩和/或配制的步骤。在一些情况下，所述方法还可以包括离体培养步骤(例如，活化 细胞以例如诱导其增殖和/或激活)。在其他情况下，活化或激活细胞的步骤是在将细 胞给予至受试者后在体内进行，通过抗原识别进行和/或在给予一种或多种药剂以加 强或扩大细胞在受试者体内的扩增、激活和/或增殖后进行。在一些实施方案中，所 述方法包括从受试者分离细胞、制备、加工、培养和/或将它们工程化，并在冷冻保 存之前或之后将它们重新引入同一受试者中。
在一些实施方案中，所述方法包括按以下顺序进行的处理步骤，其中：首先从 生物样品中隔离(例如选择或分离)原代细胞；将所选择细胞在活化试剂的存在下进行 离体激活、扩增或增殖，再加入病毒载体颗粒一起孵育进行转导，活化转导时间总共 不超过或不超过约24或36或48小时内，其中转导时间至少或至少约1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时。
在一些情况下，例如通过在活化试剂的存在下的活化对转导的细胞进行离体激活、扩增或增殖。在一些实施方案中，所述方法可以包括来自洗涤、悬浮、稀释和/ 或浓缩细胞中的一个或多个处理步骤，其可以在隔离(例如分离或选择)、活化、转导 和/或配制步骤之前、期间或同时或之后进行。
在一些实施方案中，一个或多个或所有处理步骤(例如隔离、选择和/或富集、处理、活化、与转导和工程化结合的孵育)和配制步骤是使用集成或自含式系统中的系 统、装置或设备进行和/或以自动化或可编程方式进行。在一些方面，所述系统或设 备包括与所述系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，其允许用户对加工、分离、 工程化和配制步骤的各个方面进行编程、控制、评估其结果和/或调整。在一个例子 中，所述系统是如国际专利申请公开号WO 2009/072003或US 20110003380 A1中所述 的系统。在一个例子中，所述系统是如国际公开号WO 2016/073602中所述的系统。
在一些实施方案中，与结合所提供的转导方法的制备、处理和/或孵育细胞结合的一个或多个细胞处理步骤可以在培养袋或培养瓶中进行，这与其他可用的方法相比 可以提供某些优点。
在一些实施方案中，所述系统与其他仪器一起被包括和/或被放置与其他仪器联合，所述其他仪器包括用于操作、自动化、控制和/或监控所述系统中进行的各个处 理步骤的各个方面的仪器。在一些实施方案中，这种仪器容纳于机柜中。在一些实施 方案中，所述仪器包括机柜，其包括外壳，所述外壳含有控制电路、离心机、罩、电 机、泵、传感器、显示器和用户界面。示例性装置描述于美国专利号6,123,655、美 国专利号6,733,433和US 2008/0171951中。
在一些实施方案中，所述系统包含一系列容器，例如袋子、管路、旋塞、夹子、 连接器和离心室。在一些实施方案中，容器(例如培养袋或培养瓶)包括一个或多个容 器(例如培养袋或培养瓶)，其在同一容器或单独容器(例如同一培养袋或培养瓶；或单 独培养袋或培养瓶)中含有待转导的细胞和病毒载体颗粒。在一些实施方案中，所述 系统还包括一个或多个容器(例如培养袋或培养瓶)，所述容器含有介质，例如稀释剂 和/或洗涤溶液，在所述方法期间将所述介质抽入室和/或其他部件中以稀释、重悬和/ 或洗涤组分和/或组合物。所述容器可以连接在系统中的一个或多个位置，例如连接 在对应于输入管线、稀释剂管线、洗涤管线、废液管线和/或输出管线的位置。
在一些实施方案中，所述系统(例如封闭的系统)是无菌的。在一些实施方案中，使系统部件的所有连接(例如管路管线与容器通过连接器的连接)都处于无菌条件下。 在一些实施方案中，使连接处于层流下。在一些实施方案中，在管路与容器之间使用 产生无菌连接的无菌连接装置(例如无菌焊接)进行连接。在一些实施方案中，无菌连 接装置在足够高以维持无菌的热学条件下，例如在至少200℃、例如至少260℃或300 ℃的温度下实现连接。
在一些实施方案中，所述系统可以是可弃式的，例如一次性培养袋或培养瓶。 在一些实施方案中，一次性培养袋或培养瓶可以用于一个或多个过程的多个循环中， 例如至少2、3、4、5或更多次，例如，在以连续或半连续方式进行的过程中。在一些 实施方案中，所述系统(例如一次性试培养袋或培养瓶)用于处理来自单一患者的细 胞。
A.样品和细胞制备
细胞通常是真核细胞，例如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方 案中，所述细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天或适 应性免疫的细胞，例如骨髓或淋巴细胞，包括淋巴细胞，通常为T细胞和/或NK细胞。 其他示例性细胞包括干细胞，如多潜能干细胞和多能干细胞，包括诱导多能干细胞 (iPSC)。
细胞通常是原代细胞如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些原代细胞。在一些实施方案中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个亚组，如整 个T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，如由以下各项所定义的那些亚群：功 能、激活状态、成熟度、分化的可能性、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原 特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标记或细胞因子分泌特征和/ 或分化程度。关于待治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自体的。所述方法 包括现成的方法。在一些方面，如对于现有技术，所述细胞是多能和/或多潜能的， 如干细胞，如诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者分 离细胞、制备、加工、培养和/或将它们工程化，并在冷冻保存之前或之后将它们重 新引入同一受试者中。
在T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群中，有幼稚T(TN)细胞、效应T 细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型(如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)，效应 记忆T(TEM)或终末分化效应记忆T细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成 熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞、天然存在和适 应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞(如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9 细胞、TH22细胞、滤泡辅助细胞T细胞)、α/βT细胞和δ/γT细胞。
在一些实施方案中，所述细胞是天然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，所述 细胞是单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥 大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
在一些实施方案中，细胞源自于细胞系，例如，T细胞系。在一些实施方案中， 细胞获得自异种来源，例如获得自小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪。
在一些实施方案中，细胞可以从样品中分离，例如生物样品，例如从受试者获 得或源自受试者的样品。在一些实施方案中，分离出细胞的受试者是患有疾病或需要 细胞疗法或将对其给予细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，所述受试者是需要特 定治疗性干预(如过继细胞疗法，其中细胞被分离、加工和/或工程化)的人。
在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自受 试者的组织、流体和其他样品，以及来自一个或多个加工步骤(如分离、离心、基因 工程化(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)的样品。所述生物样品可以是直接从 生物来源获得的样品或经过加工的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、 血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括由其衍生的加工样品。
在一些方面，细胞从其中衍生或分离的样品是血液或血液衍生的样品，或者是 或源自单采术或白细胞分离术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、 白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、 粘膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、 骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或由其衍生的细胞。在细 胞疗法(例如过继细胞疗法)的背景下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些例子中，来自受试者的循环血液的细胞例如通过单采术或白细胞分离术获得。在一些方面，所述样品含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细 胞、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板 之外的细胞。
在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞，例如以去除血浆级分并将细 胞置于适当的缓冲液或介质中以用于随后的加工步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐 缓冲盐水(PBS)洗涤所述细胞。在一些实施方案中，所述洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/ 或许多或所有二价阳离子。在一些方面，根据制造商的说明书，通过半自动“流通” 离心机(例如，Cobe2991细胞加工器，Baxter)完成洗涤步骤。在一些方面，根据制造 商的说明书，通过切向流过滤(TFF)完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将所 述细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(例如像不含Ca++/Mg++的PBS)中。在某些实施 方案中，去除血细胞样品的组分并将所述细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，在富集和/或选择细胞之前，使样品与血清或血浆(例如人血清或血浆)接触和/或含有所述血清或血浆。在一些实施方案中，血清或血浆对于从其 获得细胞的受试者是自体的。在一些实施方案中，血清或血浆在样品中按以下浓度存 在：至少或至少约10％(v/v)、至少或至少约15％(v/v)、至少或至少约20％(v/v)、至少 或至少约25％(v/v)、至少或至少约30％(v/v)、至少或至少约35％(v/v)或至少或至少约 40％(v/v)。在一些实施方案中，在选择和/或转导细胞之前，使含有原代细胞的样品 与抗凝血剂接触或含有抗凝血剂。在一些实施方案中，抗凝血剂是或含有游离柠檬酸 根离子，例如，抗凝血剂柠檬酸盐右旋糖溶液，溶液A(ACD-A)。
在一些实施方案中，在富集和/或选择细胞之前，将来自样品的细胞转移或悬浮于无血清培养基中。在一些实施方案中，无血清培养基是定义的和/或明确定义的细 胞培养基。在某些实施方案中，无血清培养基是受控培养基，其已经过处理，例如被 过滤以去除抑制剂和/或生长因子。在一些实施方案中，无血清培养基含有蛋白质。 在某些实施方案中，无血清培养基可含有血清白蛋白、水解产物、生长因子、激素、 载体蛋白和/或附着因子。在一些实施方案中，无血清培养基含有蛋白质，例如白蛋 白，例如牛血清白蛋白、人血清白蛋白和/或重组白蛋白。在一些实施方案中，无血 清培养基含有基础培养基，例如DMEM或RPMI1640，其含有氨基酸、维生素、无机 盐、缓冲剂、抗氧化剂和能量来源。在一些实施方案中，无血清培养基补充有例如但 不限于白蛋白、化学上定义的脂质、生长因子、胰岛素、细胞因子和/或抗氧化剂。 在一些实施方案中，配制无血清培养基以支持某种细胞类型(例如免疫细胞、T细胞和 /或CD4+和CD8+T细胞)的细胞的生长、增殖、健康、稳态。
在一些实施方案中，将样品维持在或保持在为或为约2℃至8℃的温度下长达48小时，例如长达12小时、24小时或36小时。
在一些实施方案中，制备方法在分离、选择和/或富集和/或用于转导和工程化的孵育之前或之后包括冷冻(例如冷冻保存)细胞的步骤。在一些实施方案中，所述冷冻 和后续解冻步骤去除所述细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一 些实施方案中，例如在洗涤步骤之后将所述细胞悬浮在冷冻溶液中以去除血浆和血小 板。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种。一个例子涉及 使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养 基。然后将其用培养基1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然 后通常将细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。
在一些实施方案中，细胞的分离包括一个或多个制备和/或基于非亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞在一种或多种试剂的存在下洗涤、离心和/或孵育， 例如以去除不需要的组分、针对所需组分进行富集、裂解或去除对特定试剂敏感的细 胞。在一些例子中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、尺寸、对特定组分的 敏感性和/或抗性)分离细胞。
在一些实施方案中，分离方法包括基于细胞中一种或多种特定分子(如表面标记，例如表面蛋白、细胞内标记或核酸)的表达或存在来分离不同细胞类型。在一些实施 方案中，可以使用任何已知的基于此类标记的用于分离的方法。在一些实施方案中， 所述分离是基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，所述分离包括基于 所述细胞的一种或多种标记(通常为细胞表面标记)的表达或表达水平来分离细胞和 细胞群，例如通过和与此类标记特异性结合的抗体或结合配偶体一起孵育，然后通常 是洗涤步骤和从那些未与所述抗体或结合配偶体结合的细胞中分离已结合所述抗体 或结合配偶体的细胞。
此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已经结合所述试剂的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留未与所述抗体或结合配偶体结合的细胞)。在一些例 子中，保留两种级分子以供进一步使用。在一些方面，在没有可用于特异性鉴定异质 群体中的细胞类型的抗体的情况下，阴性选择可能特别有用，使得最好基于由除所需 群体之外的细胞表达的标记进行分离。
所述分离不需要导致100％富集或去除特定细胞群或表达特定标记的细胞。例如，针对特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的 数量或百分比，但不需要导致不表达所述标记的细胞的完全不存在。同样地，特定类 型的细胞(如表达标记的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百 分比，但不需要导致所有此类细胞的完全去除。
在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中来自一个步骤的阳性或阴性选择的级 分经受另一个分离步骤，如随后的阳性或阴性选择。在一些例子中，单个分离步骤可 以同时耗尽表达多种标记的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(每种抗体 或结合配偶体对被靶向用于阴性选择的标记具特异性)一起孵育。同样地，通过将细 胞与在各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育，可以同时阳性选择多 种细胞类型。
例如，在一些方面，T细胞的特定亚群，如对一种或多种表面标记呈阳性或高水 平表达的细胞(例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、 CD45RA+和/或CD45RO+T细胞)通过阳性或阴性选择技术来分离。可以使用抗CD3/ 抗CD28缀合的磁珠(例如，M-450CD3/CD28T Cell Expander)阳性选择CD3+,CD28+T 细胞。
在一些实施方案中，通过阳性选择针对特定细胞群富集或者通过阴性选择针对特定细胞群耗尽来进行分离。在一些实施方案中，通过将细胞与一种或多种抗体或其 他结合剂一起孵育来完成阳性或阴性选择，所述一种或多种抗体或其他结合剂与分别 在阳性或阴性选择的细胞上表达或以相对较高水平(标记高)(标记+)的一种或多种表 面标记特异性结合。
在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞，如CD14)上表达的标记，将T细胞与PBMC样品分离。在一些方面，CD4+或CD8+选择 步骤用于分离CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过对在一种或多种幼稚、记 忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标记的阳性或阴性选择，可以 将此类CD4+和CD8+群体进一步分类成亚群。
在一些实施方案中，如通过基于与相应子群体相关的表面抗原进行阳性或阴性选择，将CD8+细胞针对幼稚、中枢记忆、效应子记忆和/或中枢记忆干细胞进一步富 集或耗尽。在一些实施方案中，针对中枢记忆T(TCM)细胞进行富集以增加功效，如 以改善给予后的长期存活、扩增和/或移植，这在一些方面在此类亚群中特别稳健。 参见Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；Wang等人。(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，组合富含TCM的CD8+T细胞与CD4+T 细胞进一步增强功效。
在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-两个 子集中。可以例如使用抗CD8和抗CD62L抗体将PBMC针对CD62L-CD8+和/或 CD62L+CD8+级分进行富集或耗尽。
在一些实施方案中，中枢记忆T(TCM)细胞的富集是基于CD45RO、CD62L、 CCR7、CD28、CD3和/或CD 127的阳性或高表面表达；在一些方面，它是基于对表达 或高度表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，通过表达CD4、 CD14、CD45RA的细胞的耗尽和表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来进行富含 TCM细胞的CD8+群体的分离。在一个方面，中枢记忆T(TCM)细胞的富集从基于CD4 表达所选择的阴性细胞级分开始进行，所述阴性细胞级分基于CD14和CD45RA的表达 进行阴性选择且基于CD62L进行阳性选择。在一些方面这种选择
是同时进行的，而在其他方面以任何顺序依次进行。在一些方面，用于制备CD8+细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于生成CD4+细胞群或亚群，使 得来自基于CD4的分离的阳性和阴性级分被保留并用于所述方法的后续步骤中，任选 地在一个或多个其他阳性或阴性选择步骤之后。
在特定例子中，PBMC样品或其他白细胞样品进行CD4+细胞的选择，其中保留 了阴性和阳性级分。然后所述阴性级分基于CD14和CD45RA或CD19的表达进行阴性 选择，并基于中枢记忆T细胞(如CD62L或CCR7)的标记特征进行阳性选择，其中以任 何顺序进行所述阳性和阴性选择。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将CD4+T辅助细胞分类为幼稚、中枢记 忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可通过标准方法获得。在一些实施方案中，幼稚CD4+T 淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T细胞。在一些实施方案中，中枢 记忆CD4+细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方案中，效应CD4+细胞是CD62L- 和CD45RO-。
在一个例子中，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合剂通常包括 针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，所 述抗体或结合配偶体与固体支持物或基质(如磁珠或顺磁珠)结合，以允许细胞分离以 用于阳性和/或阴性选择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分开 技术来分开或分离细胞和细胞群。
在一些方面，将待分离的细胞的样品或组合物与小的可磁化或磁响应材料(如磁响应颗粒或微粒，如顺磁珠(例如像Dynalbeads或MACS珠))一起孵育。磁响应材料(例 如，颗粒)通常直接或间接地附着于结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体与希望 分离(例如，希望阴性地或阳性地选择)的一个细胞、多个细胞或细胞群上存在的分子 (例如，表面标记)特异性结合。
在一些实施方案中，所述磁性颗粒或珠包含与特异性结合成员(如抗体或其他结合配偶体)结合的磁响应材料。有许多在磁分离方法中使用的熟知的磁响应材料。合 适的磁性颗粒包括在Molday,美国专利号4,452,773和在欧洲专利说明书EP 452342B(将其通过引用特此并入)中描述的那些。胶体大小的颗粒，如在Owen美国专 利号4,795,698以及Liberti等人,美国专利号5,200,084中描述的那些是其他例子。
所述孵育通常在这样的条件下进行，由此抗体或结合配偶体或者与附着于磁性颗粒或珠的此类抗体或结合配偶体特异性结合的分子(如二抗或其他试剂)与细胞表 面分子(如果存在于所述样品内的细胞上的话)特异性结合。
在一些方面，将所述样品置于磁场中，并且具有附着于其上的磁响应或可磁化 颗粒的那些细胞将被吸引到磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被磁铁 吸引的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在 同一选择步骤期间进行阳性和阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步加 工或经受另外的分离步骤。
在某些实施方案中，所述磁响应颗粒被包被在一抗或其他结合伴侣、二抗、凝 集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，所述磁性颗粒通过对一种或多种标记 具特异性的一抗的包被而附着于细胞。在某些实施方案中，用一抗或结合配偶体标记 所述细胞而不是珠，并且然后添加细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如链霉 亲和素)包被的磁性颗粒。在某些实施方案中，将链霉亲和素包被的磁性颗粒与生物 素化的一抗或二抗结合使用。
在一些实施方案中，所述磁响应颗粒保持附着于所述细胞，所述细胞随后被孵育，培养和/或工程化；在一些方面，所述颗粒保持附着于所述细胞以用于给予患者。 在一些实施方案中，从所述细胞中去除可磁化或磁响应颗粒。从细胞中去除可磁化颗 粒的方法是已知的，并且包括例如使用竞争的非标记抗体和与可切割接头缀合的可磁 化颗粒或抗体。在一些实施方案中，可磁化颗粒是可生物降解的。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择是经由磁激活的细胞分选(MAC S)(Miltenyi Biotech，Auburn，CA)进行的。磁激活细胞分选(MACS)系统能够高纯度 选择附着有磁化颗粒的细胞。在某些实施方案中，MACS以这样的模式操作，其中在 施加外部磁场之后依次洗脱非靶标和靶标种类。也就是说，附着于磁化颗粒的细胞保 持在适当的位置，而未附着的种类被洗脱。然后，在完成第一次洗脱步骤之后，以某 种方式释放被捕获在磁场中并被阻止洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某 些实施方案中，所述非靶细胞被标记并从异质细胞群中耗尽。
在某些实施方案中，使用这样的系统、装置或设备进行分离或分开，所述系统、 装置或设备进行所述方法的分离、细胞制备、分开、加工、孵育、培养和/或制备步 骤中的一种或多种。在一些方面，所述系统用于在封闭或无菌环境中进行这些步骤中 的每一个，例如以最小化错误、用户操作和/或污染。在一个例子中，所述系统是如 国际专利申请公开号WO2009/072003或US 20110003380 A1中所述的系统。在一个例 子中，所述系统是如国际公开号WO 2016/073602中所述的系统。
在一些实施方案中，所述方法包括选择细胞，其中全部或部分选择是在离心室 的内腔中进行，例如在离心旋转下进行。在一些实施方案中，将细胞与选择试剂(例 如基于免疫亲和力的选择试剂)一起孵育是在离心室中进行。例如，基于免疫亲和力 的选择可取决于所分离细胞与特异性地结合至细胞上的标记的分子(例如固体(例如 颗粒)上的抗体或其他结合配偶体)之间的有利的能量相互作用。在某些用于使用颗粒 (例如珠)的基于亲和力的分离的可用方法中，将颗粒和细胞在容器(例如管或袋)中孵 育，同时振荡或混合，且细胞密度与颗粒(例如，珠)的比率是恒定的，以帮助促进能 量上有利的相互作用。此类途径对于用于大规模生产可能不是理想的，例如，因为其 可能需要使用大体积以维持最佳或所需的细胞与颗粒的比率，同时维持所需的细胞数 量。因此，此类途径可能需要以分批模式或形式进行处理，这可能需要增加时间、步 骤数和操作，从而增加成本和用户错误的风险。
在一些实施方案中，通过在离心室的空腔中实施此类选择步骤或其部分(例如，与抗体涂覆的颗粒(例如磁珠)一起孵育)，用户能够控制某些参数，例如各种溶液的体 积、在处理期间溶液的添加及其定时，与其他可用方法相比，这可以提供多种优势。 例如，在孵育期间减少空腔中液体体积的能力可以增加选择中使用的颗粒(例如珠试 剂)的浓度，并由此增加溶液的化学势，而不影响空腔中的细胞总数。这又可以增强 正在处理的细胞与用于选择的颗粒之间的成对相互作用。在一些实施方案中，例如， 在与如本文所述的系统、电路和控制相关联时，在室中进行孵育步骤，允许用户在孵 育期间的一个或多个所需时间实现对溶液的搅动，这也可以改善相互作用。
在一些实施方案中，至少一部分选择步骤是在离心室中进行，其包括将细胞与 选择试剂一起孵育。在此类工艺的一些方面，将一定体积的细胞与一定量所需的基于 亲和力的选择试剂混合，所述体积和所述量显著少于在管或容器中根据制造商的说明 书进行类似选择以选择相同数量的细胞和/或相同体积的细胞时通常所用的体积和 量。在一些实施方案中，所采用的一种或多种选择试剂的量为根据制造商的说明针对 相同数量的细胞和/或相同体积的细胞在基于管或容器的孵育中用于选择细胞的相同 的一种或多种选择试剂的量的不超过5％、不超过10％、不超过15％、不超过20％、 不超过25％、不超过50％、不超过60％、不超过70％或不超过80％。
例如作为可以在室空腔中进行的选择方法的部分的与一种或多种选择试剂一起孵育包括使用一种或多种选择试剂，基于一种或多种特定分子(例如表面标记，例如 表面蛋白、细胞内标记或核酸)在细胞中或细胞上的表达或存在，选择一种或多种不 同的细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的方法，使用一种或多种选择 试剂，基于此类标记进行分离。在一些实施方案中，一种或多种选择试剂导致分离， 所述分离是基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，选择包括与一种或 多种试剂一起孵育，用于基于一种或多种标记(通常是细胞表面标记)的细胞表达或表 达水平来分离细胞和细胞群，例如通过与特异性地结合至此类标记的抗体或结合配偶 体一起孵育，之后通常进行洗涤步骤并分离已结合抗体或结合配偶体的细胞与未结合 至抗体或结合配偶体的那些细胞。
在一些实施方案中，对于细胞的选择，例如基于免疫亲和力的选择，将细胞在 室空腔中在组合物中孵育，所述组合物还含有具有选择试剂的选择缓冲液，所述选择 试剂例如特异性地结合至希望富集和/或耗尽的细胞上(而不是组合物中其他细胞上) 的表面标记的分子，例如抗体，其任选地偶联到支架(例如聚合物或表面，例如珠， 例如磁珠，例如与对CD4和CD8具有特异性的单克隆抗体偶联的磁珠)。在一些实施方 案中，如所描述的，将选择试剂添加至室空腔中的细胞，所添加的量与在振荡或旋转 的管中进行选择时，实现相同数量的细胞或相同体积的细胞的大致相同或类似的选择 效率通常使用或将需要的选择试剂的量相比显著较小(例如不大于所述量的5％、10 ％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)。在一些实施方案中，在向细胞 和选择试剂添加选择缓冲液的情况下进行孵育，以实现例如10mL至200mL试剂的孵 育的目标体积，例如至少或约至少或约10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、 70mL、80mL、90mL、100mL、150mL或200mL。在一些实施方案中，将选择缓冲液 和选择试剂在添加至细胞之前预先混合。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂单独添加至细胞。在一些实施方案中，选择孵育是在周期性温和混合条件下进行的， 这可有助于促进能量上有利的相互作用，从而允许在实现高选择效率的同时使用较少 的总选择试剂。
在一些实施方案中，与选择试剂一起孵育的总持续时间为或为约5分钟至6小时，例如30分钟至3小时，例如至少或约至少30分钟、60分钟、120分钟或180分钟。在一 些实施方案中，孵育通常在混合条件下进行，例如在旋转的存在下，通常以相对低的 力或速度旋转，例如速度低于用于使细胞沉淀的速度，例如为或为约600rpm至 1700rpm(例如，为或为约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)，例如在样 品或室壁或其他容器壁处的一定RCF下，所述RCF为或为约80g至100g(例如，为或为 约或至少80g、85g、90g、95g或100g)。在一些实施方案中，旋转是使用以这种低速 旋转和之后的休息时间离心，以便使用自动化程序在单一封闭系统中完成洗涤和结合 步骤。
在一些实施方案中，在孵育和/或混合细胞和一种和/或多种选择试剂后，将所孵育的细胞进行分离，以基于一种或多种特定试剂的存在或不存在来选择细胞。在一些 实施方案中，在离心室外部进行进一步选择。在一些实施方案中，在同一封闭系统中 进行分离，其中存在离心室并且其中将细胞与选择试剂一起进行孵育。在一些实施方 案中，在与选择试剂一起孵育后，将所孵育的细胞(包括其中已经结合选择试剂的细 胞)从离心室压出，例如从离心室转移到系统中，用于基于免疫亲和力来分离细胞。 在一些实施方案中，用于基于免疫亲和力的分离的系统是或含有磁分离柱。在一些实 施方案中，在分离之前，可以在室中进行一个或多个其他处理步骤，例如洗涤。
在一些方面，使用CliniMACS系统(Miltenyi Biotic)进行分离和/或其他步骤，例如用于在封闭和无菌系统中在临床规模水平上的细胞的自动化分离。部件可以包括集 成微计算机、磁分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。在一些方面，所述集成计算机控制 所述仪器的所有部件并指示所述系统以标准化顺序执行重复程序。在一些方面，所述 磁分离单元包括可移动的永磁体和用于选择柱的支架。所述蠕动泵控制整个管组的流 速，并与夹管阀一起确保缓冲液通过所述系统的受控流动和细胞的连续悬浮。
在一些方面，所述CliniMACS系统使用抗体偶联的可磁化颗粒，其在无菌，无热 原的溶液中提供。在一些实施方案中，在用磁性颗粒标记细胞后，洗涤所述细胞以去 除过量的颗粒。然后将细胞制备袋连接到管组，所述管组又连接到含有缓冲液的袋和 细胞收集袋。所述管组由预装配的无菌管(包括预柱和分离柱)组成，并且仅供一次性 使用。在启动分离程序后，所述系统自动将细胞样品施加到分离柱。标记的细胞保留 在柱内，而未标记的细胞通过一系列洗涤步骤去除。在一些实施方案中，用于与本文 描述的方法一起使用的细胞群是未标记的并且不保留在柱中。在一些实施方案中，用 于与本文描述的方法一起使用的细胞群被标记并保留在柱中。在一些实施方案中，用 于与本文描述的方法一起使用的细胞群在去除磁场后从柱中洗脱，并且收集在细胞收 集袋内。
在某些实施方案中，使用CliniMACS Prodigy系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/ 或其他步骤。在一些方面，CliniMACS Prodigy系统配备有细胞加工联合体，其允许 通过离心自动化洗涤和分级分离细胞。CliniMACS Prodigy系统还可以包括机载相机 和图像识别软件，其通过辨别源细胞产物的宏观层来确定最佳的细胞分级分离终点。 例如，外周血自动分离成红细胞、白细胞和血浆层。CliniMACS Prodigy系统还可以 包括集成细胞养殖室，其实现细胞培养方案例如细胞分化和扩增、抗原加载和长期细 胞培养。输入端口可允许无菌移除和补充培养基，并且可以使用集成显微镜监测细胞。 参见，例如，Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660,Terakura等人 (2012)Blood.1:72-82，以及Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。在 一些实施方案中，通过流式细胞术收集和富集(或耗尽)本文描述的细胞群，其中针对 多种细胞表面标记染色的细胞在流体流中载携。在一些实施方案中，通过制备规模 (FACS)分类收集和富集(或耗尽)本文描述的细胞群。在某些实施方案中，通过使用微 机电系统(MEMS)芯片结合基于FACS的检测系统来收集和富集(或耗尽)本文描述的 细胞群(参见例如，WO 2010/033140，Cho等人(2010)Lab Chip10,1567-1573；和Godin 等人(2008)J Biophoton.1(5):355-376)。在两种情况下，细胞可以用多种标记来标记， 允许以高纯度分离明确定义的T细胞子集。
在一些实施方案中，用一种或多种可检测标记来标记抗体或结合配偶体，以促 进分离供阳性和/或阴性选择。例如，分离可以基于与荧光标记的抗体的结合。在一 些例子中，基于对一种或多种细胞表面标记具特异性的抗体或其他结合配偶体的结合 来分离细胞在流体流中载携，如通过荧光激活细胞分选(FACS)，包括制备规模(FACS) 和/或微机电系统(MEMS)芯片，例如与流式细胞检测系统组合。此类方法允许基于多 种标记同时进行阳性和阴性选择。
1.细胞的转导前或转导同时的激活和/或扩增
在一些实施方案中，结合基因工程化，将经筛选后的细胞(例如输入组合物)进行孵育和/或培养。所述孵育步骤可以包括活化转导，以使病毒载体整合到一个或多个 细胞的宿主基因组中。孵育和/或工程化可以在培养容器中进行，所述培养容器是如 单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或其他用于培养或培育细胞的 容器。在一些实施方案中，在刺激条件或活化剂的存在下孵育所述组合物或细胞。这 些条件包括针对以下而设计的那些条件：用于诱导群体中细胞的增殖、扩增、激活和/或存活的条件，用于模拟抗原暴露和/或用于引发细胞进行基因工程化，如以引入重 组抗原受体。
在一些实施方案中，进一步孵育是在用于细胞的刺激和/或活化的条件下进行，所述条件可以包括以下各项中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳 含量、时间、药剂(例如营养素)、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(例如细胞因 子、趋化因子)、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他设计为 激活细胞的药剂。
在一些实施方案中，活化条件或药剂包括一种或多种能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的药剂(例如刺激性和/或辅助性药剂)，例如配体。在一些方面，所 述药剂开启或启动T细胞中的TCR/CD3细胞内信号传导级联，例如是适于递送初级信 号以例如启动ITAM诱导的信号(例如对TCR组分具有特异性的那些)的激活的药剂，和 /或促进共刺激信号(例如对T细胞共刺激受体具有特异性的共刺激信号)的药剂，例如 抗CD3、抗CD28或抗41-BB(例如，其任选地结合至固体支持物(例如珠))和/或一种或 多种细胞因子。所述刺激剂包括抗CD3/抗CD28珠(例如，M-450CD3/CD2 8T细胞扩增剂和/或珠)。任选地，扩增方法可以还包括向培养基中添加抗CD3和/或 抗CD28抗体的步骤。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2和/或IL-15，例如，IL-2浓 度为至少约10单位/mL。
在一些实施方案中，活化条件或药剂包括一种或多种药剂(例如配体)，其能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域。在一些方面，所述药剂在T细胞中开启或启 动TCR/CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可以包括例如结合至固体支持物(如珠)的 抗体，如对TCR组分和/或共刺激受体具有特异性的抗体(例如抗CD3、抗CD28)；和/ 或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法还可以包括向培养基中添加抗CD3和/或抗 CD28抗体(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)的步骤。在一些实施方案中，刺激剂包括 IL-2和/或IL-15，例如，IL-2浓度为至少约10单位/mL、至少约50单位/mL、至少约100 单位/mL或至少约200单位/mL。
在一些实施方案中，例如与活化剂一起孵育的总持续时间在或在约1小时与96小时之间、1小时与72小时之间、1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30 小时之间或12小时与24小时之间，例如至少或约至少6小时、12小时、18小时、24小 时、36小时或72小时。
在一些实施方案中，本文所提供的方法不包括进一步培养或孵育，例如，不包 括离体扩增步骤，或者包括显著更短的离体扩增步骤。
在一些实施方案中，使细胞工程化的整个过程(例如选择和/或富集、孵育与活化转导相结合和/或进一步培养或培育)是在从受试者获得样品后的以下时间段内进行： 超过9天、不超过8天、不超过7天、不超过6天、不超过5天、不超过4天、不超过3天、 不超过2天或不超过1天。应理解，这种定时不包括使细胞经历低温保存的任何时间段。
在本文所提供的方法的一些实施方案中，将工程化细胞(例如输出组合物或配制组合物)在转导后在不进行显著的离体扩增的情况下立即或不久给予至受试者。在一 些实施方案中，工程化细胞可以在转导步骤后立即给予。在一些实施方案中，工程化 细胞可以在活化转导步骤后不久，在例如与常规方法(这可能需要显著的体外激活、 扩增和/或富集)相比不进行显著的离体扩增或进行显著更短的离体扩增的情况下给 予。例如，在本文所提供的方法的一些实施方案中，工程化细胞可以在转导的三天、 两天或一天内给予。在一些实施方案中，工程化细胞可以在活化转导步骤的48小时、 36小时、24小时、20小时、16小时、12小时、8小时、4小时、2小时、1小时或更短时 间内给予。在一些实施方案中，与常规方法相比，使工程化细胞经历显著更短的体外 扩增，例如48小时、36小时、24小时、20小时、16小时、12小时、8小时、4小时、2 小时、1小时或更短时间。
在任何此类实施方案中，细胞的扩增和/或激活可以在暴露于抗原后在体内进行，例如，在给予细胞后在受试者体内进行工程化细胞的扩增。在一些实施方案中，体内 扩增的范围、程度或量值可以通过多种方法来扩大、加强或增强，所述方法能够调节 (例如增加)所给予细胞(例如表达重组受体的细胞)的扩增、增殖、存活和/或功效。
在一些实施方案中，此类方法包括涉及给予工程化细胞的方法，将所述细胞用 药剂(例如核酸)进一步修饰，以改变(例如增加或减少)分子的表达或活性，其中这种 改变的表达或活性扩大、加强或增强所给予细胞的扩增、增殖、存活和/或功效。在 一些实施方案中，药剂(例如核酸)的表达例如通过给予诱导物或其他调节分子是可诱 导的、可抑制的、可调节的和/或用户控制的。
在一些实施方案中，此类方法包括涉及与药物或药剂的组合给予(例如同时或依次给予)的方法，所述药物或药剂能够扩大、加强或增强所给予细胞(例如表达重组受 体的细胞)的扩增、增殖、存活和/或功效。
B.病毒载体颗粒
在一些实施方案中，病毒载体颗粒是逆转录病毒载体颗粒，例如慢病毒颗粒， 其在病毒载体的基因组中含有编码重组和/或异源分子(例如重组或异源蛋白，例如重 组和/或异源受体，例如嵌合抗原受体(CAR)或其他抗原受体)的核酸。病毒载体颗粒 的基因组通常包括除了编码重组分子的核酸以外的序列。此类序列可包括允许将基因 组包装到病毒颗粒中的序列和/或促进编码重组受体(例如CAR)的核酸表达的序列。
1.病毒载体
在一些实施方案中，病毒载体颗粒含有源自基于逆转录病毒基因组的载体(例如源自基于慢病毒基因组的载体)的基因组。在所提供的病毒载体的一些方面，编码重 组受体(例如抗原受体，例如CAR)的异源核酸含于和/或位于载体基因组的5'LTR与3 'LTR序列之间。
在一些实施方案中，病毒载体基因组是慢病毒基因组，例如HIV-1基因组或SIV 基因组。例如，已经通过多次减弱毒力基因产生慢病毒载体，例如，可以使基因env、 vif、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。在一些
实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用 于掺入外来核酸的基本序列，用于选择和用于将所述核酸转移到宿主细胞中。
慢病毒载体的非限制性例子包括源自慢病毒的那些，例如人免疫缺陷病毒 1(HIV-1)、HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人嗜T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)、HTLV-2 或马感染贫血病毒(E1AV)。例如，已经通过多次减弱HIV毒力基因产生慢病毒载体， 例如，使基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒 载体是本领域已知的，参见Naldini等人，(1996和1998)；Zufferey等人，(1997)；Dull 等人，1998，美国专利号6,013,516；以及5,994,136)。在一些实施方案中，这些病 毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸的基本序 列，用于选择和用于将所述核酸转移到宿主细胞中。已知的慢病毒可以容易地从保管 机构或保藏中心例如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；10801University Blvd.， Manassas，Va.20110-2209)获得，或使用常用技术从已知来源分离。
在一些实施方案中，病毒基因组载体可以含有逆转录病毒(例如慢病毒)的5'和3'LTR的序列。在一些方面，病毒基因组构建体可含有来自慢病毒的5'和3'LTR的序列， 并且具体而言可以含有来自慢病毒的5'LTR的R和U5序列以及来自慢病毒的失活或 自失活3'LTR。LTR序列可以是来自任何物种的任何慢病毒的LTR序列。例如，它们 可以是来自HIV、SIV、FIV或BIV的LTR序列。通常，LTR序列是HIV LTR序列。
在一些实施方案中，病毒载体(例如HIV病毒载体)的核酸缺乏额外的转录单元。载体基因组可以含有失活或自失活的3'LTR(Zufferey等人J Virol 72：9873,1998；Miyoshi等人,J Virol 72:8150,1998)。例如，用于产生病毒载体RNA的核酸的3'LTR的 U3区中的缺失可用于产生自失活(SIN)载体。然后可以在逆转录期间将这种缺失转移 至原病毒DNA的5'LTR。自失活载体通常具有来自3'长末端重复序列(LTR)的增强子 和启动子序列的缺失，其在载体整合期间被复制到5'LTR中。在一些实施方案中，可 以消除足够的序列，包括去除TATA盒，以消除LTR的转录活性。这可以防止在转导 的细胞中产生全长载体RNA。在一些方面，3'LTR的U3元件含有其增强子序列、TATA 盒、Sp1和NF-κB位点的缺失。由于自失活3'LTR，在进入和逆转录后产生的原病毒 含有失活的5'LTR。这可以通过降低动员载体基因组的风险和LTR对附近细胞启动子 的影响来提高安全性。自失活3'LTR可以通过本领域已知的任何方法构建。在一些实 施方案中，这不会影响载体滴度或载体的体外或体内特性。
任选地，来自慢病毒5'LTR的U3序列可以在病毒构建体中用启动子序列(例如异源启动子序列)替代。这可以增加从包装细胞系回收的病毒的滴度。还可以包括增强 子序列。可以使用增加包装细胞系中病毒RNA基因组表达的任何增强子/启动子组合。 在一个例子中，使用CMV增强子/启动子序列(美国专利号5,385,839和美国专利号 5,168,062)。
在某些实施方案中，可以通过将逆转录病毒载体基因组(例如慢病毒载体基因组)构建为整合缺陷性来使插入诱变的风险降至最低。可以采用多种途径来产生非整合的 载体基因组。在一些实施方案中，可以将一种或多种突变工程化至pol基因的整合酶 组分中，使得其编码具有无活性整合酶的蛋白质。在一些实施方案中，可以修饰载体 基因组本身以通过例如使一个或两个附着位点突变或缺失来防止整合，或通过缺失或 修饰使3'LTR近端多嘌呤束(PPT)无功能。在一些实施方案中，可以使用非遗传途径； 这些途径包括抑制整合酶的一种或多种功能的药理学药剂。这些途径并不相互排斥； 也就是说，可以一次使用多于一种所述途径。例如，整合酶和附着位点二者可以都没 有功能，或者整合酶和PPT位点可以没有功能，或者附着位点和PPT位点可以没有功 能，或者其都可以没有功能。此类方法和病毒载体基因组是已知的并且是可获得的(参 见Philpott和Thrasher,Human GeneTherapy18:483,2007；Engelman等人J Virol 69:2729,1995；Brown等人J Virol 73:9011(1999)；
WO 2009/076524；McWilliams等人,J Virol 77:11150,2003；Powell和Levin JVirol 70:5288,1996)。
在一些实施方案中，载体含有用于在宿主细胞(例如原核宿主细胞)中繁殖的序列。在一些实施方案中，病毒载体的核酸含有一个或多个复制起点，用于在原核细胞 (例如细菌细胞)中繁殖。在一些实施方案中，包括原核复制起点的载体也可含有一种 如下基因，所述基因的表达赋予可检测或可选择的标记，例如抗药性。
2.编码异源蛋白质的核酸
在一些实施方案中，病毒载体含有编码异源重组蛋白的核酸。在一些实施方案中，异源重组分子是或包括重组受体(例如，抗原受体)、SB转座子(例如用于基因沉 默)、衣壳包封的转座子、同源双链核酸(例如，用于基因组重组)或报告基因(例如荧 光蛋白，例如GFP)或萤光素酶)。
在一些实施方案中，病毒载体含有编码重组受体和/或嵌合受体(例如异源受体蛋白)的核酸。重组受体(例如异源受体)可以包括抗原受体，例如功能性非TCR抗原受体， 包括嵌合抗原受体(CAR)和其他抗原结合受体，例如转基因T细胞受体(TCR)。受体还 可以包括其他受体，例如其他嵌合受体，例如与特定配体结合并具有与CAR中存在的 那些类似的跨膜和/或细胞内信号传导结构域的受体。
在任何此类例子中，将核酸插入或定位于病毒载体的区域中，例如通常在病毒 基因组的非必需区域中。在一些实施方案中，将核酸插入病毒基因组的某些病毒序列 的位置中以产生具有复制缺陷的病毒。
在一些实施方案中，所编码的重组抗原受体(例如CAR)是能够特异性地结合至要靶向的细胞或疾病上的一种或多种配体的受体，所述疾病例如为癌症、感染性疾病、 炎症或自身免疫性疾病或其他疾病。
在一些实施方案中，示例性抗原是或包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成 熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸 抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细 胞周期蛋白、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、 CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮 生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、III型表皮生长因子受体突 变(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋 白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、 胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、 O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶联受体 5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB 二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞 抗原A1(HLAA1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α 2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM 的CE7表位、含有富含亮氨酸的重复序列的8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素 瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGEA6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒 (CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤2族成员D(NKG2D)配体、黑色素 A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性靶抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特 异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称作5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、 血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性靶抗原或与通 用标签相关的抗原、和/或生物素化的分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体 表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原， 如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，抗原是或包括CD20、CD19、 CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，示例性抗原是孤儿酪氨酸激酶受体ROR1、tEGFR、Her2、 L1-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、 CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、0EPHa2、ErbB2、 3或4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、 kdr、κ轻链、路易斯Y、L1细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、 PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性靶抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、 孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2和MAGE A3、CE7、Wilms肿 瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白(例如细胞周期蛋白A1(CCNA1))，和/或生物素化的分子， 和/或由HIV、HCV、HBV、HPV和/或其他病原体表达的分子和/或具有HIV、HCV、 HBV、HPV和/或其他病原体的特征的分子或对HIV、HCV、HBV、HPV和/或其他病 原体具有特异性的分子，和/或其致癌形式。
在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特异性或病原体表达的抗原。在一些 实施方案中，抗原是病毒抗原(例如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原 和/或寄生虫抗原。
在一些实施方案中，抗原受体(包括CAR和重组TCR)及其产生和引入包括例如以下文献中所述的那些：国际专利申请公开号WO2015172339A1、WO2016008405A1、WO2016086813A1、WO2016150400、WO2017032293A1、WO2017041749A1、 WO2017080377A1、WO2018018958A1、WO2018108106A1、WO2018045811A1、WO 2018219299、WO2018/210279、WO2019/024933、WO2019/114751、WO2019/114762、 WO2019/149279、WO2019/170147A1、WO2019/210863、CN109385400A、 CN109468279A、CN109880803A、CN 110438082 A、CN110468105A、 WO2019/219029、WO 200014257、WO 2013126726、WO 2012/129514、WO2014031687、WO 2013/166321、WO 2013/071154、WO 2013/123061、美国专利申请 公开号US2002131960、US 2013287748、US 20130149337、美国专利号6,451,995、 7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、 7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，以及欧洲专利申请号 EP 2537416，和/或以下文献中所述的那些：Sadelain等人,Cancer Discov.2013年4月； 3(4):388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等 人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月18日 (2):160-75。
a.嵌合抗原受体
在一些实施方案中，病毒载体基因组中所含的核酸编码嵌合抗原受体(CAR)。 CAR通常是基因工程化受体，其具有细胞外配体结合结构域，例如含有抗体或其片段 的细胞外部分，所述细胞外配体结合结构域与一种或多种细胞内信号传导组分连接。 在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括连接细胞外结构域和细胞内信号传导结构域的 跨膜结构域和/或细胞内结构域。此类分子通常模拟或接近通过天然抗原受体发出的 信号和/或通过这种受体与共刺激受体的组合发出的信号。
在一些实施方案中，CAR被构建具有对特定标记的特异性，例如在过继疗法所 靶向的特定细胞类型中表达的标记，例如癌症标记和/或任何所述抗原。因此，CAR 通常包括抗体的一个或多个抗原结合片段、结构域或部分，或一个或多个抗体可变结 构域和/或抗体分子。在一些实施方案中，CAR包括抗体分子的一个或多个抗原结合 部分，例如可变重链(VH)或其抗原结合部分，或源自可变重链(VH)的单链抗体片段 (scFv)和单克隆抗体(mAb)的可变轻链(VL)。
在一些实施方案中，提供了工程化细胞，例如T细胞，其表达对特定抗原(或标 记或配体)具有特异性的CAR，所述特定抗原例如为在特定细胞类型的表面上表达的 抗原。在一些实施方案中，抗原是多肽。在一些实施方案中，它是碳水化合物或其他 分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原在疾病的细胞例如 肿瘤细胞或致病细胞上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上 表达和/或在工程化细胞上表达。
在特定实施方案中，重组受体(如嵌合受体)含有细胞内信号传导区域，所述细胞内信号传导区域包括细胞质信号传导结构域或区域(也可互换地称为细胞内信号传导 结构域或区域)，例如能够在T细胞中诱导初级激活信号的细胞质(细胞内)区域，例如， T细胞受体(TCR)组分的细胞质信号传导结构域或区域(例如，CD3-zeta(CD3ζ)链或其 功能变体或信号传导部分的ζ链的细胞质信号传导结构域或区域)；和/或所述细胞内 信号传导区域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的细胞质信号传导结构域 或区域。
在一些实施方案中，嵌合受体还含有特异性地结合至配体(例如抗原)抗原的细胞外配体结合结构域。在一些实施方案中，嵌合受体是CAR，其含有特异性地结合至抗 原的细胞外抗原识别结构域。在一些实施方案中，配体(如抗原)是在细胞表面上表达 的蛋白质。在一些实施方案中，CAR是TCR样CAR，并且抗原是加工过的肽抗原，如 细胞内蛋白的肽抗原，其与TCR一样在主要组织相容性复合物(MHC)分子的背景下在 细胞表面上被识别。
示例性抗原受体(包括CAR)以及将此类受体工程化并引入细胞的方法包括例如以下文献中所述的那些：国际专利申请公开号WO2015172339A1、WO2016008405A1、WO2016086813A1、WO2016150400、WO2017032293A1、WO2017041749A1、 WO2017080377A1、WO2018018958A1、WO2018108106A1、WO2018045811A1、WO 2018219299、WO2018/210279、WO2019/024933、WO2019/114751、WO2019/114762、 WO2019/149279、WO2019/170147A1、WO2019/210863、CN109385400A、 CN109468279A、CN109880803A、CN 110438082 A、CN110468105A、 WO2019/219029、WO 200014257、WO 2013126726、WO 2012/129514、WO2014031687、WO 2013/166321、WO 2013/071154、WO 2013/123061、美国专利申请 公开号US2002131960、US 2013287748、US 20130149337、美国专利号6,451,995、 7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、 7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，以及欧洲专利申请号 EP 2537416，和/或以下文献中所述的那些：Sadelain等人，Cancer Discov.2013年4月； 3(4):388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等 人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月18日 (2):160-75。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中所述的CAR，以及 国际专利申请公开号WO/2014055668A1中所述的那些。
CAR的实例包括如在任何下述出版物中披露的CAR，所述出版物例如WO2015172339A1、WO2016008405A1、WO2016086813A1、WO2016150400、 WO2017032293A1、WO2017041749A1、WO2017080377A1、WO2018018958A1、 WO2018108106A1、WO2018045811A1、WO 2018219299、WO2018/210279、 WO2019/024933、WO2019/114751、WO2019/114762、WO2019/149279、 WO2019/170147A1、WO 2019/210863、CN109385400A、CN109468279A、CN109880803A、CN 110438082 A、CN 110468105 A、WO2019/219029、WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190、 美国专利号8,389,282；Kochenderfer等人,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；和 Brentjens等人,Sci Transl Med.20135(177)。还参见WO 2014031687、US 8,339,645、 US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号：7,446,190和美国专利号：8,389,282。
在一些实施方案中，CAR被构建为具有对特定抗原(或标记或配体)的特异性，所述特定抗原例如为在过继疗法靶向的特定细胞类型中表达的抗原(例如癌症标记)和/ 或旨在诱导衰减应答的抗原(例如在正常或未患病细胞类型上表达的抗原)。因此， CAR通常在其细胞外部分中包括一种或多种抗原结合分子，例如一种或多种抗原结合 片段、结构域或部分，或一种或多种抗体可变结构域，和/或抗体分子。在一些实施 方案中，所述CAR包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，如源自单克隆抗体(mAb) 的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分作为重组受体(例如抗原受体)的部分在细胞上表达。所述抗原受体包括功能性非TCR抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。 通常，含有针对肽-MHC复合物表现出TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也 可以称为TCR样CAR。在一些实施方案中，在一些方面，对TCR样CAR的MHC-肽复 合物具有特异性的细胞外抗原结合结构域通过接头和/或一个或多个跨膜结构域与一 个或多个细胞内信号传导组分连接。在一些实施方案中，此类分子通常可以通过天然 抗原受体(如TCR)模拟或接近信号，并且任选地通过这种受体与共刺激受体组合模拟 或接近信号。
在一些实施方案中，重组受体(例如嵌合受体，例如CAR)包括与抗原(或配体)结合(例如特异性结合)的配体结合结构域。嵌合受体靶向的抗原包括在通过过继细胞疗 法靶向的疾病、病症或细胞类型的情况下表达的抗原。所述疾病和病症包括增殖性、 肿瘤性和恶性疾病和障碍，包括癌症和肿瘤，包括血液癌、免疫系统癌症，如淋巴瘤、 白血病和/或骨髓瘤，如B型白血病、T型白血病和骨髓性白血病、淋巴瘤和多发性骨 髓瘤。
在一些实施方案中，抗原(或配体)是多肽。在一些实施方案中，它是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，如与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原(或配体) 在疾病的细胞(例如肿瘤或致病细胞)上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗 原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
在一些实施方案中，CAR含有抗体或抗原结合片段(例如scFv)，其特异性识别在细胞表面上表达的抗原，例如完整抗原。在一些实施方案中，抗原(或配体)是肿瘤抗 原或癌症标记。在一些实施方案中，抗原(或配体)抗原是或包括αvβ6整合素(avb6 整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX 或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NYESO-1和LAGE-2)、 癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CC基序趋化因子配体1(CCL-1)、 CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、 CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白 (tEGFR)、III型表皮生长因子受体突变(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋 白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结 合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、 糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、 Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原 (HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原 A2(HLAA2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体 (kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富含亮氨酸的 重复序列的8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、 MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子 (NCAM)、癌胚胎抗原、优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异 性靶抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激 酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖 蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体 2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性靶抗原或与通用标签相关的抗原，和 /或生物素化分子，和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施 方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记 中的任何一种。在一些实施方案中，抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、 CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特异性或病原体表达的抗原。在一些 实施方案中，抗原是病毒抗原(例如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原 和/或寄生虫抗原。在一些实施方案中，CAR含有TCR样抗体，例如抗体或抗原结合 片段(例如scFv)，其特异性识别作为MHC-肽复合物存在于细胞表面上的细胞内抗原 (例如肿瘤相关抗原)。在一些实施方案中，识别MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合 部分可以作为重组受体的部分(例如抗原受体)在细胞上表达。所述抗原受体包括功能 性非TCR抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。通常，含有针对肽-MHC复合物表现出 TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以称为TCR样CAR。
示例性CAR所靶向的抗原为GPC3、BCMA、EGFR、EGFRvIII、Claudin18.2、， 靶向上述抗原的嵌合抗原受体氨基酸序列如SEQ ID NO:1-42所示。
提及“主要组织相容性复合物”(MHC)是指含有多态性肽结合位点或结合沟的蛋白质，通常是糖蛋白，在一些情况下，所述蛋白质可以与多肽的肽抗原(包括由细胞 机构处理的肽抗原)复合。在一些情况下，MHC分子可以在细胞表面上展示或表达， 包括作为与肽的复合物，即MHC-肽复合物，用于呈现具有T细胞上的抗原受体(例如 TCR或TCR样抗体)可识别的构象的抗原。通常，MHC I类分子是异二聚体，其具有跨 越α链的膜，在一些情况下具有三个α结构域和非共价缔合的β2微球蛋白。通常， MHC II类分子由两种跨膜糖蛋白α和β组成，两者通常都跨越膜。MHC分子可以包 括MHC的有效部分，其含有抗原结合位点或用于结合肽的位点以及由适当抗原受体 识别所需的序列。在一些实施方案中，MHC I类分子将源自胞质溶胶的肽递送至细胞 表面，其中MHC-肽复合物由T细胞(例如通常CD8+T细胞，但在一些情况下是CD4+T 细胞)识别。在一些实施方案中，MHC II类分子将源自囊泡系统的肽递送至细胞表面， 其中所述肽通常由CD4+T细胞识别。通常，MHC分子由一组连锁基因座编码，其在 小鼠中统称为H-2并且在人中统称为人白细胞抗原(HLA)。因此，通常人MHC也以可称为人白细胞抗原(HLA)。
术语“MHC-肽复合物”或“肽-MHC复合物”或其变体是指肽抗原与MHC分子 的复合物或缔合物，例如通常通过所述肽在MHC分子的结合沟或裂缝中的非共价相 互作用来形成。在一些实施方案中，MHC-肽复合物存在或展示于细胞表面上。在一 些实施方案中，MHC-肽复合物可由抗原受体(例如TCR、TCR样CAR或其抗原结合部 分)特异性地识别。
在一些实施方案中，多肽的肽(例如肽抗原或表位)可以与MHC分子缔合，例如 用于由抗原受体识别。通常，所述肽源自或基于较长生物分子(例如多肽或蛋白质)的 片段。在一些实施方案中，所述肽的长度通常为约8至约24个氨基酸。在一些实施方 案中，肽的长度为或为约9至22个氨基酸，用于在MHC II类复合物中识别。在一些实 施方案中，肽的长度为或为约8至13个氨基酸，用于在MHC I类复合物中识别。在一 些实施方案中，在识别MHC分子(例如MHC-肽复合物)背景中的肽后，抗原受体(例如 TCR或TCR样CAR)产生或触发激活信号至T细胞，诱导T细胞应答，如T细胞增殖、细 胞因子产生、细胞毒性T细胞应答或其他应答。
在一些实施方案中，TCR样抗体或抗原结合部分是已知的或可通过已知方法产生(参见例如美国公开申请号US 2002/0150914；US 2003/0223994；US 2004/0191260；US2006/0034850；US 2007/00992530；US 20090226474；US 20090304679；和国际PCT 公开号WO03/068201)。
在一些实施方案中，特异性地结合至MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以通过用有效量的含有特定MHC-肽复合物的免疫原对宿主进行免疫来产生。在一些 情况下，MHC-肽复合物的肽是能够结合至MHC的抗原的表位，例如肿瘤抗原，例如 通用肿瘤抗原、骨髓瘤抗原或如下文所述的其他抗原。在一些实施方案中，然后向宿 主给予有效量的免疫原以用于引发免疫应答，其中所述免疫原保持其三维形式持续一 段足以引发针对所述肽在所述MHC分子的结合沟中的三维呈递的免疫应答的时间。 然后测定从宿主收集的血清以确定是否产生了识别MHC分子结合沟中的肽的三维呈 现的所需抗体。在一些实施方案中，可以评估所产生的抗体以确认所述抗体可以区分 MHC-肽复合物与单独的MHC分子、单独的目标肽以及MHC与无关肽的复合物。然后 可以分离所需的抗体。
在一些实施方案中，特异性地结合至MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以通过采用抗体文库展示方法(例如噬菌体抗体文库)来产生。在一些实施方案中，可 以产生突变体Fab、scFv或其他抗体形式的噬菌体展示文库，例如，其中所述文库的 成员在一个或多个CDR的一个或多个残基处发生突变。参见例如美国公开申请号US 20020150914、US2014/0294841；和Cohen CJ.等人(2003)J Mol.Recogn.16:324-332。
本文中的术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括多克隆和单克隆抗体， 包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2 片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性结合抗原的可变重链(VH) 区、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、 纳米抗体)片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化的和/或以其他方式修饰的形 式，如胞内抗体、肽体(pepti bod y)、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体和异缀合 抗体(heteroconjugateantibody)、多特异性(例如，双特异性)抗体、双抗体、三 抗体和四抗体、串联二-scFv、串联三-scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应理 解为涵盖其功能性抗体片段。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类 (包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白、抗体及其抗原结合片段特异性地识别全长 抗体的抗原。在一些实施方案中，抗体的重链和轻链可以是全长的或者可以是抗原结 合部分(Fab、F(ab')2、Fv或单链Fv片段(scFv))。在其他实施方案中，所述抗体重链恒 定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE，特别是选自 例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，更特别是IgG1(例如，人IgG1)。在另一个实施方案中， 抗体轻链恒定区选自例如κ或λ，特别是κ。
所提供的抗体包括抗体片段。“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包 含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于 Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；可变重链(VH)区、单链抗 体分子(如scFv)和单一结构域VH单一抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在具 体实施方案中，所述抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，如 scFv。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原的结 合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的 结构，每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如，Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单个VH或VL结构域可以 足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分 离结合所述特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如， Portolano等人,J.Immunol.150:880-887__(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。在一些 实施方案中，CAR包含特异性地结合抗原的抗体重链结构域，所述抗原例如癌症标记 或待靶向的细胞或疾病(例如肿瘤细胞或癌细胞)的细胞表面抗原，例如本文所述或已 知的任何靶抗原。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，所述抗体是重组产生的片段，如包含天 然不存在的排列的片段(如具有通过合成接头(例如，肽接头)连接的两个或更多个抗体 区或链的那些)，和/或可不通过酶消化天然存在的完整抗体产生的片段。在一些实施 方案中，抗体片段是scFv。
“人源化”抗体是这样的抗体，其中所有或基本上所有CDR氨基酸残基源自非 人CDR并且所有或基本上所有FR氨基酸残基源自人FR。人源化抗体任选地可以包括 源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指所述非人抗 体的变体，其经历人源化以通常降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异 性和亲和力。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如， 衍生出CDR残基的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
因此，在一些实施方案中，嵌合抗原受体(包括TCR样CAR)包括含有抗体或抗体 片段的细胞外部分。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv。在一些方面，嵌合抗 原受体包括含有抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导区域。在一些实施方案 中，细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信 号传导结构域是或包含主要信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信 号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含基于免疫受体酪氨 酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。
在一些实施方案中，CAR的细胞外部分(例如其抗体部分)还包括间隔子，例如抗原识别组分(例如scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区域。间隔子可以是或包括免疫球 蛋白恒定区或其变体或经修饰形式的至少一部分，例如铰链区，例如IgG4铰链区，和 /或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，重组受体还包含间隔子和/或铰链区。在 一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG如IgG4或IgG1的。在一些方面，所述恒定区 的部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区。
在一些实施方案中，间隔子可以是或包括免疫球蛋白恒定区或其变体或经修饰形式的至少一部分，例如铰链区(例如IgG4铰链区)、和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些 实施方案中，重组受体还包含间隔子和/或铰链区。在一些实施方案中，恒定区或部 分是人IgG如IgG4或IgG1的。在一些方面，所述恒定区的部分用作抗原识别组分(例如， scFv)与跨膜结构域之__间的间隔子区。与不存在间隔子的情况下相比，间隔子的长 度可以提供抗原结合后增强的细胞反应性。在一些例子中，所述间隔子的长度为或约 12个氨基酸或者长度不超过12个氨基酸。示例性间隔子包括具有至少约10至229个氨 基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125 个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸，约10至40 个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸或约10至15个氨基酸(并且包括任 何列出的范围的端点之间的任何整数)的那些。在一些实施方案中，间隔子区具有约 12个或更少的氨基酸、约119个或更少的氨基酸或约229个或更少的氨基酸。示例性间 隔子包括单独的IgG4铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链或与CH3结构域连接 的IgG4铰链。示例性间隔子包括但不限于在Hudecek等人(2013)Cancer Res.,19:3153 或国际专利申请公开号WO 2014/031687中描述的那些。
细胞外配体结合结构域(例如抗原识别结构域)通常与一个或多个细胞内信号传导组分连接，所述一个或多个细胞内信号传导组分例如为在CAR的情况下通过抗原受 体复合物(例如TCR复合物)模拟激活的信号传导组分和/或通过另一细胞表面受体传 导的信号。在一些实施方案中，跨膜结构域连接细胞外配体结合结构域与细胞内信号 传导结构域。在一些实施方案中，抗原结合组分(例如，抗体)与一个或多个跨膜和细 胞内信号传导区域连接。在一些实施方案中，CAR包括与细胞外结构域融合的跨膜结 构域。在一个实施方案中，使用天然地与受体(例如CAR)中的结构域之一相关的跨膜 结构域。在一些情形中，通过氨基酸取代选择或修饰所述跨膜结构域以避免此类结构 域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以最小化与所述受体复合物的其他成 员的相互作用。
在一些实施方案中，所述跨膜结构域源自天然或合成来源。当来源是天然的时，在一些方面，所述结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括源自以下 项的那些跨膜区(即，包括以下项的至少一个或多个跨膜区)：T细胞受体的α、β或 ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37， CD64，CD80，CD86，CD134，CD137或CD154。可替代地，在一些实施方案中，跨 膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，例如亮氨酸 和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬 氨酸的三联体。在一些实施方案中，连接是通过接头、间隔子和/或一个或多个跨膜 结构域。
在一些实施方案中，短的寡肽或多肽接头(例如，长度在2与10个之间的氨基酸的接头，如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体)存在并形成CAR的 跨膜结构域与细胞质信号传导结构域之间的连接。
重组受体(例如CAR)通常包括至少一种或多种细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，受体包括TCR复合物的细胞内组分，如介导T细胞激活和细胞毒性的TCR CD3 链，例如，CD3ζ链。因此，在一些方面，所述抗原结合部分与一个或多个细胞信号 传导模块连接。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细 胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，受体(例如CAR) 还包括一种或多种另外的分子(例如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。 例如，在一些方面，CAR或其他嵌合受体包括CD3-ζ(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、 CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方案中，在连接CAR或其他嵌合受体后，受体的细胞质结构域和/或 区域或细胞内信号传导结构域和/或区域激活免疫细胞(例如，工程化以表达CAR的T 细胞)的正常效应子功能或应答中的至少一种。例如，在一些情况下，CAR诱导T细胞 的功能，例如细胞溶解活性或T辅助活性，例如细胞因子或其他因子的分泌。在一些 实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导结构域的截短部分 (例如如果其转导效应子功能信号的话)代替完整的免疫刺激链。在一些实施方案中， 细胞内信号传导区域(例如包含一个或多个细胞内信号传导结构域)包括T细胞受体 (TCR)的胞质序列，并且在一些方面还包括共受体(其在天然背景下与这种受体并行起 作用以在抗原受体接合后启动信号转导)和/或此类分子的任何衍生物或变体的那些， 和/或具有相同功能能力的任何合成序列。
在天然TCR的情况下，完全激活通常不仅需要通过TCR进行信号传导，还需要共 刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，用于生成次级或共刺激信 号的组分也被包括在所述CAR中。在其他实施方案中，所述CAR不包括用于生成共刺 激信号的组分。在一些方面，另外的CAR在同一细胞中表达，并且提供用于生成次级 或共刺激信号的组分。
T细胞激活在一些方面被描述为由至少如下两类细胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些(初级细胞质信号传导序列)，以及以非抗原依赖 性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级细胞质信号传导序列)。在一些方 面，CAR包括此类信号传导组分中的一种或两种。
在一些方面，所述CAR包括调节所述TCR复合物的初级激活的初级胞质信号传 导序列。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可以含有信号传导基序(其被称 为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM)。含有初级细胞质信号传导序列的ITAM 的例子包括源自以下项的那些：TCR或CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3 ε、CD8、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。在某些实施方案中，含有初级细胞质信 号传导序列的ITAM包括源自TCR或CD3ζ、FcRγ或FcRβ的那些。在一些实施方案 中，所述CAR中的胞质信号传导分子含有源自CD3ζ的胞质信号传导结构域、其部分 或序列。
在一些实施方案中，CAR包括共刺激受体(例如CD28、4-1BB、OX40、CD27、 DAP10和ICOS)的信号传导结构域和/或跨膜部分。在一些方面，相同的CAR包括激活 或信号传导区域和共刺激组分。
在一些实施方案中，激活结构域包括于一个CAR内，而共刺激组分是由识别另 一种抗原的另一种CAR提供。在一些实施方案中，所述CAR包括在同一细胞上表达的 激活或刺激CAR和共刺激CAR(参见WO 2014/055668)。在一些方面，CAR是刺激性或 激活性CAR；在其他方面，其是共刺激性CAR。在一些实施方案中，细胞还包括抑制 性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)，例如识别 不同抗原的CAR，其中通过识别第一抗原的CAR递送的激活信号通过抑制性CAR与其 配体的结合而被减少或抑制，例如，以减少脱靶效应。
在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含与CD3细胞内结构域连接的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含与CD3 细胞内结构域连接的嵌合CD28和CD137共刺激结构域。
在一些实施方案中，CD8+细胞毒性T细胞的细胞内信号传导结构域与CD4+辅助 性T细胞的细胞内信号传导结构域相同。在一些实施方案中，CD8+细胞毒性T细胞的 细胞内信号传导结构域不同于CD4+辅助性T细胞的细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，CAR在细胞质部分中涵盖一个或多个(例如，两个或更多个)共刺激结构域以及激活结构域(例如，初级激活结构域)。示例性CAR包含CD3-ζ、 CD28和4-1BB的细胞内组分。
在一些实施方案中，由所提供的病毒载体内的一个或多个核酸编码的一种或多种重组受体(例如CAR)还包括一种或多种标记，例如，用于确认要表达受体的细胞的 转导或工程化和/或对表达由多核苷酸编码的一种或多种分子的细胞的选择和/或靶向 的目的。在一些方面，这种标记可以由不同的核酸或多核苷酸编码，所述核酸或多核 苷酸也可以在基因工程化过程期间被引入，通常通过相同的方法(例如通过本文所提 供的任何方法转导，例如通过相同的载体或相同类型的载体转导)被引入。
在一些方面，所述标记(例如转导标记)是蛋白质和/或是细胞表面分子。示例性标记是天然存在的(例如内源性)标记(例如天然存在的细胞表面分子)的截短的变体。
在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第 一代CAR是在抗原结合后仅提供CD3链诱导的信号的CAR；在一些方面，第二代CAR 是提供这种信号和共刺激信号的CAR，例如包括来自共刺激受体(如CD28或CD137) 的细胞内信号传导结构域的CAR；在一些方面，第三代CAR在一些方面是包括不同共 刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括细胞外配体结合部分(例如抗原结合部分，例如抗体或其片段)和细胞内结构域。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv或单 一结构域VH抗体，并且细胞内结构域含有ITAM。在一些方面，所述细胞内信号传导 结构域包括CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合 抗原受体包括连接和/或设置在细胞外结构域与细胞内信号传导区域或结构域之间的 跨膜结构域。
在一些方面，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。所述细胞外结构域和跨膜可以 直接或间接连接。在一些实施方案中，所述细胞外结构域和跨膜通过间隔子(如本文 描述的任何间隔子)连接。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分 子的细胞内结构域，如在所述跨膜结构域和细胞内信号传导结构域之间。在一些方面， 所述T细胞共刺激分子是CD28或4-1BB。
在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如抗体片段)、是或含有CD28或其功能变 体的跨膜部分的跨膜结构域，以及含有CD28或其功能变体的信号传导部分和CD3ζ 或其功能变体的信号传导部分的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR 含有抗体例如抗体片段，跨膜结构域(其是CD28的跨膜部分或其功能变体或含有CD28 的跨膜部分或其功能变体)以及含有4-1BB的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的 信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些此类实施方案中，受体 进一步包括含有Ig分子(如人Ig分子，如Ig铰链，例如IgG4铰链)的一部分的间隔子如 仅含铰链的间隔子。
在一些实施方案中，受体(例如CAR)的跨膜结构域是人CD28或其变体的跨膜结 构域，例如人CD28(登录号：P10747.1)的27个氨基酸的跨膜结构域，或者是包含SEQ ID NO:43中所示氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:43至少或至少约85％、86％、87％、 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更 高序列同一性的氨基酸序列的跨膜结构域。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。在一些方面，所述T细胞共刺激分子是CD28或4-1BB。
在一些实施方案中，细胞内结构域包含人CD28或其功能变体或部分的细胞内共刺激信号传导结构域，例如其41个氨基酸的结构域，和/或在天然CD28蛋白的位置 186-187处具有LL至GG取代的这种结构域。
在一些实施方案中，细胞内信号传导区域和/或结构域包含人CD3链、任选地CD3 ζ刺激性信号传导结构域或其功能变体，例如人CD3ζ(登录号：P20963.2)的同种型3 的112个AA的细胞质结构域或如美国专利号7,446,190或美国专利号8,911,993中所 述的CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，CAR包括：细胞外配体结合部分，例如抗原结合部分，例 如抗体或其片段，包括sdAb和scFv，其特异性结合抗原，例如本文所述的抗原；间隔 子，例如任何含有Ig铰链的间隔子；跨膜结构域，其是CD28或其变体的一部分；细 胞内信号传导结构域，其含有CD28或其功能变体的信号传导部分；以及CD3ζ信号 传导结构域或其功能变体的信号传导部分。在一些实施方案中，CAR包括：细胞外配 体结合部分，例如抗原结合部分，例如抗体或其片段，包括sdAb和scFv，其特异性结 合抗原，例如本文所述的抗原；间隔子，例如任何含有Ig铰链的间隔子；跨膜结构域， 其是CD28或其变体的一部分；细胞内信号传导结构域，其含有4-1BB或其功能变体的 信号传导部分；以及CD3ζ信号传导结构域或其功能变体的信号传导部分。
b.T细胞受体(TCR)
在一些实施方案中，由一种或多种核酸编码的一种或多种重组分子是或包括重组T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，重组TCR对抗原具有特异性，所述抗原通常 是存在于靶细胞上的抗原，例如肿瘤特异性靶抗原，在与自身免疫或炎性疾病相关的 特定细胞类型上表达的抗原，或源自病毒病原体或细菌病原体的抗原。在一些实施方 案中，提供了工程化细胞，例如T细胞，其表达识别靶多肽(例如肿瘤、病毒或自身免 疫蛋白的抗原)的肽表位或T细胞表位的TCR或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，“T细胞受体”或“TCR”是含有可变α和β链(也分别称为 TCRα和TCRβ)或可变γ和δ链(也分别称为TCRα和TCRβ)的分子或其抗原结合 部分，并且其能够特异性结合至与MHC分子结合的肽。在一些实施方案中，所述TCR 呈αβ形式。通常，以αβ和γδ形式存在的TCR一般在结构上相似，但是表达它们 的T细胞可以具有不同的解剖位置或功能。TCR
可以在细胞的表面上发现或以可溶形式发现。通常，发现TCR在T细胞(或T淋巴 细胞)的表面上，在此处它通常负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的 抗原。
除非另有说明，否则术语“TCR”应理解为涵盖完整的TCR以及其抗原结合部分 或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述TCR是完整或全长TCR，包括呈αβ形 式或γδ形式的TCR。在一些实施方案中，所述TCR是这样的抗原结合部分，其少于 全长TCR但与在MHC分子中结合的特定肽结合(如与MHC-肽复合物结合)。在一些情 况下，TCR的抗原结合部分或片段可以仅含有全长或完整TCR的结构性结构域的一部 分，但是仍能够结合与完整TCR结合的肽表位(如MHC-肽复合物)。在一些情况下， 抗原结合部分含有TCR的可变结构域(如TCR的可变α链和可变β链)，足以形成用于 与特定MHC-肽复合物结合的结合位点。通常，TCR的可变链含有参与肽、MHC和/ 或MHC-肽复合物的识别的互补决定区。
在一些实施方案中，TCR的可变结构域含有超变环或互补决定区(CDR)，其通常 是抗原识别和结合能力和特异性的主要贡献者。在一些实施方案中，TCR的CDR或其 组合形成给定TCR分子的全部或基本上全部的抗原结合位点。TCR链的可变区内的各 个CDR通常由框架区(FR)隔开，与CDR相比，所述框架区通常在TCR分子之间展示较 低可变性(参见，例如，Jores等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.87:9138,1990；Chothia 等人,EMBO J.7:3745,1988；还参见Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。 在一些实施方案中，CDR3是负责抗原结合或特异性的主要CDR，或者是在给定TCR 可变区的用于所述肽-MHC复合物的加工肽部分的抗原识别和/或用于与其相互作用 的三个CDR中最重要的CDR。在一些情境下，所述α链的CDR1可以与某些抗原肽的 N-末端部分相互作用。在一些情境下，所述β链的CDR1可以与所述肽的C-末端部分 相互作用。在一些情境下，CDR2对与所述MHC-肽复合物的MHC部分的相互作用或 识别具有最强的作用或者是主要的负责CDR。在一些实施方案中，所述β-链的可变 区可以含有另外的高变区(CDR4或HVR4)，其通常参与超抗原结合而非抗原识别 (Kotb(1995)Clinical Microbiology Reviews,8:411-426)。
在一些实施方案中，TCR还可以含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短细胞质尾(参见，例如，Janeway等人,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease,第3版,Current Biology Publications,第4页:33,1997)。在一些方面，TCR的每条链可以具有一个N末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和位于 C末端的短细胞质尾。在一些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的 不变蛋白质缔合。
在一些实施方案中，TCR链含有一个或多个恒定结构域。例如，给定TCR链的细 胞外部分(例如，α链或β链)可以含有与细胞膜相邻的两个免疫球蛋白样结构域，例 如可变结构域(例如，Vα或Vβ；通常基于Ka ba t编号的氨基酸1至116，Ka ba t等人, “Seq uencesof Proteins of Immunological Interest”,US Dept.Health and Human Services,Public Health Service National Institutes of Health,1991,第5版)和恒定结构域(例如，α-链恒定域或Cα，通常基于Kabat编号的位置117至259，或β链恒定结构域 或Cβ，通常基于Kabat的链的位置117至295)。例如，在一些情况下，由两条链形成 的TCR的细胞外部分含有两个膜近端恒定结构域和两个膜远端可变结构域，其中可变 结构域各自含有CDR。TCR的恒定结构域可含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成 二硫键，由此连接TCR的两条链。在一些实施方案中，TCR可在每条α和β链中具有 另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。
在一些实施方案中，所述TCR链含有跨膜结构域。在一些实施方案中，所述跨膜 结构域带正电荷。在一些情况下，所述TCR链含有胞质尾。在一些情况下，结构允许 TCR与其他分子(如CD3和其亚基)缔合。例如，含有恒定结构域与跨膜区的TCR可以 将所述蛋白质锚定在细胞膜中并与所述CD3信号传导装置或复合物的不变亚基缔合。 CD3信号传导亚基(例如，CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ链)的细胞内尾含有TCR复 合物的信号传导能力中所涉及的一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序或 ITAM。
在一些实施方案中，TCR可以是两条链α和β(或者任选地γ和δ)的异二聚体， 或者其可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，TCR是含有两条单独链(α和β 链或γ和δ链)的异二聚体，所述链是通过例如一个或多个二硫键连接。
在一些实施方案中，TCR可以从一个或多个已知的TCR序列(如Vα,β链的序列) 产生，所述一个或多个已知的TCR序列的基本上全长的编码序列是易于获得的。用于 从细胞来源获得全长TCR序列(包括V链序列)的方法是熟知的。在一些实施方案中， 编码TCR的核酸可以从多种来源获得，如通过一种或多种给定细胞内的或从所述一种 或多种给定细胞分离的编码TCR的核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增获得，或者通过 公众可获得的TCR DNA序列的合成获得。
在一些实施方案中，TCR是从生物来源获得，如来自细胞(如来自T细胞，例如细 胞毒性T细胞)、T细胞杂交瘤或其他公众可获得的来源。在一些实施方案中，T细胞可 以从体内分离的细胞获得。在一些实施方案中，TCR是胸腺选择的TCR。在一些实施 方案中，TCR是新表位限制性TCR。在一些实施方案中，T细胞可以是培养的T细胞杂 交瘤或克隆。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分或其抗原结合片段可以根据 对TCR序列的了解以合成方式产生。
在一些实施方案中，TCR是从通过针对靶多肽抗原或其靶T细胞表位筛选候选 TCR文库而鉴定或选择的TCR产生的。TCR文库可以通过扩增来自T细胞的Vα和Vβ 库来产生，所述T细胞是从受试者分离，包括存在于PBMC、脾或其他淋巴器官中的 细胞。在一些情况下，T细胞可以从肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增。在一些实施方案 中，可以从CD4+或CD8+细胞产生TCR文库。在一些实施方案中，所述TCR可以从正 常或健康受试者的T细胞来源扩增，即正常TCR文库。在一些实施方案中，所述TCR 可以从患病受试者的T细胞来源扩增，即患病TCR文库。在一些实施方案中，使用简 并引物扩增Vα和Vβ的基因库，如通过在从人获得的样品(如T细胞)中进行RT-PCR。 在一些实施方案中，scTv文库可以从天然Vα和Vβ文库组装，其中扩增的产物被克 隆或组装以通过接头分开。取决于受试者和细胞的来源，所述文库可以是HLA等位基 因特异性的。可替代地，在一些实施方案中，TCR文库可以通过亲本或支架TCR分子 的诱变或多样化产生。在一些方面，所述TCR经受定向进化，如通过诱变例如所述α 或β链。在一些方面，所述TCR的CDR内的特定残基被改变。在一些实施方案中，可 以通过亲和力成熟来修饰选择的TCR。在一些实施方案中，可以选择抗原特异性T细 胞，如通过筛选以评估针对所述肽的CTL活性。在一些方面，可以选择例如存在于抗 原特异性T细胞上的TCR，如通过结合活性，例如对所述抗原的特定亲和力或亲合力。
在一些实施方案中，基因工程化的抗原受体包括从天然存在的T细胞克隆的重组T细胞受体(TCR)和/或TCR。在一些实施方案中，TCR是从天然存在的T细胞克隆的 TCR。在一些实施方案中，从患者鉴定并分离靶抗原(例如，癌抗原)的高亲和力T细 胞克隆，并将其引入细胞中。在一些实施方案中，已经在用人免疫系统基因(例如， 人白细胞抗原系统或HLA)工程化的转基因小鼠中产生针对靶抗原的TCR克隆。参见， 例如，肿瘤抗原(参见，例如，Parkhurst等人(2009)Clin Cancer Res.15:169-180and Cohen 等人(2005)JImmunol.175:5799-5808。在一些实施方案中，使用噬菌体展示来分离针 对靶抗原的TCR(参见，例如，Varela-Rohena等人(2008)Nat Med.14:1390-1395和 Li(2005)NatBiotechnol.23:349-354。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分是已 经修饰或工程化的。在一些实施方案中，使用定向进化方法来产生具有改变的特性如 具有较高的对特定MHC-肽复合物的亲和力的TCR。在一些实施方案中，定向进化是 通过展示方法实现的，所述展示方法包括但不限于酵母展示(Holler等人(2003)Nat Immunol,4,55-62；Holler等人(2000)Proc Natl Acad Sci U S A,97,5387-92)、噬菌体展 示(Li等人(2005)NatBiotechnol,23,349-54)或T细胞__展示(Chervin等人(2008)J Immunol Methods,339,175-84)。在一些实施方案中，展示途径
涉及工程化或修饰已知的亲本或参考TCR。例如，在一些情况下，野生型TCR 可以用作模板以用于产生诱变的TCR，其中CDR的一个或多个残基被突变，并且选择 具有所需改变的特性(如对所需靶抗原具有更高的亲和力)的突变体。
在一些实施方案中，用于产生或生成目标TCR的靶多肽的肽是已知的或可以由熟练技术人员容易地鉴定。在一些实施方案中，适用于产生TCR或抗原结合部分的肽可 以基于目标靶多肽(如下文所述的靶多肽)中HLA限制性基序的存在来确定。在一些实 施方案中，使用可用的计算机预测模型来鉴定肽。在一些实施方案中，对于预测MHC I类结合位点，此类模型包括但不限于ProPred1(Singh和Raghava(2001)Bioinformatics 17(12):1236-1237)
和SYFPEITHI(参见Schuler等人(2007)Immunoinformatics Methods inMolecular Biology,409(1):75-93 2007)。在一些实施方案中，MHC限制性表位是HLA-A0201，其 在所有高加索人的约39％-46％中表达，并因此代表用于制备TCR或其他MHC-肽结合 分子的MHC抗原的合适选择。
已知使用计算机预测模型的HLA-A0201结合基序和蛋白酶体和免疫蛋白酶体的切割位点。用于预测MHC I类结合位点的此类模型包括但不限于ProPred1(更详细地描 述于Singh和Raghava,ProPred:prediction of HLA-DR binding sites.BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237 2001)和SYFPEITHI(参见Schuler等人SYFPEITHI,Da ta baseforSearching and T-Cell Epitope Prediction.，Immunoinformatics MethodsinMolecular Biology,第409(1)卷:75-93 2007)中。
在一些实施方案中，所述TCR或其抗原结合部分可以是重组产生的天然蛋白质或其突变形式(其中一种或多种特性(如结合特征)已经被改变)。在一些实施方案中，TCR 可以来源于各种动物物种之一，如人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物。TCR可以是细胞 结合的或呈可溶形式。在一些实施方案中，出于所提供的方法的目的，所述TCR呈在 细胞的表面上表达的细胞结合形式。
在一些实施方案中，所述TCR是全长TCR。在一些实施方案中，所述TCR是抗原 结合部分。在一些实施方案中，所述TCR是二聚体TCR(dTCR)。在一些实施方案中， 所述TCR是单链TCR(sc-TCR)。在一些实施方案中，dTCR或scTCR具有如WO 03/020763、WO 04/033685、WO2011/044186中所述的结构。
在一些实施方案中，TCR含有对应于跨膜序列的序列。在一些实施方案中，所述TCR确实含有对应于胞质序列的序列。在一些实施方案中，所述TCR能够与CD3形成 TCR复合物。在一些实施方案中，任何TCR(包括dTCR或scTCR)可以与在T细胞的表 面上产生活性TCR的信号传导结构域连接。在一些实施方案中，所述TCR在细胞的表 面上表达。
在一些实施方案中，dTCR含有第一多肽(其中对应于TCRα链可变区序列的序列 与对应于TCRα链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)和第二多肽(其中对应于 TCRβ链可变区序列的序列与对应于TCRβ链恒定区细胞外序列的序列的N末端融 合)，所述第一和第二多肽通过二硫键连接。在一些实施方案中，所述键可以对应于 天然二聚αβTCR中存在的天然链间二硫键。在一些实施方案中，所述链间二硫键不 存在于天然TCR中。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入dTCR 多肽对的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键。在一 些实施方案中，所述TCR含有跨膜序列以锚定至膜。
在一些实施方案中，dTCR含有TCRα链(含有可变α结构域、恒定α结构域和附 接至恒定α结构域C末端的第一二聚化基序)和TCRβ链(包含可变β结构域、恒定β 结构域和附接至恒定β结构域C末端的第一二聚化基序)，其中所述第一和第二二聚化 基序易于相互作用以在第一二聚化基序的氨基酸与第二二聚化基序的氨基酸之间形 成共价键，从而将TCRα链与TCRβ链连接在一起。
在一些实施方案中，TCR是scTCR。通常，可以使用已知的方法产生scTCR，参 见例如SooHoo,W.F.等人PNAS(USA)89,4759(1992)；Wülfing,C. 和Plückthun,A.,J.Mol.Biol.242,655(1994)；Kurucz,I.等人 PNAS(USA)903830(1993)；国际公开PCT号WO96/13593、WO 96/18105、WO 99/60120、 WO 99/18129、WO 03/020763、WO 2011/044186；和Schlueter,C.J.等人 J.Mol.Biol.256,859(1996)。在一些实施方案中，scTCR含有引入的非天然链间二硫 键以促进TCR链的缔合(参见，例如，国际公开PCT号WO 03/020763)。在一些实施方 案中，scTCR是非二硫键连接的截短的TCR，其中与其C-末端融合的异源亮氨酸拉链 促进链缔合(参见例如国际公开的PCT号WO 99/60120)。在一些实施方案中，scTCR含有经由肽接头与TCRβ可变结构域共价连接的TCRα可变结构域(参见例如，国际公 开的PCT号WO 99/18129)。
在一些实施方案中，scTCR含有由对应于TCRα链可变区的氨基酸序列构成的第 一区段、由对应于TCRβ链可变区序列的氨基酸序列构成的第二区段(融合至对应于 TCRβ链恒定结构域细胞外序列的氨基酸序列的N末端)和将第一区段的C末端连接至 第二区段的N末端的接头序列。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由与α链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的α链可变区序列构成)和第二区段(其由与序列β链细胞外恒定和跨膜序 列的N末端融合的β链可变区序列构成)以及任选地接头序列(其将所述第一区段的C 末端连接至所述第二区段的N末端)。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由与β链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的TCRβ链可变区序列构成)和第二区段(其由与序列α链细胞外恒定和跨膜 序列的N末端融合的α链可变区序列构成)以及任选地接头序列(其将所述第一区段的 C末端连接至所述第二区段的N末端)。
在一些实施方案中，scTCR的连接所述第一和第二TCR区段的接头可以是能够形成单多肽链同时保留TCR结合特异性的任何接头。在一些实施方案中，接头序列可例 如具有式-P-AA-P-，其中P是脯氨酸并且AA代表氨基酸序列，其中所述氨基酸是甘氨 酸和丝氨酸。在一些实施方案中，所述第一和第二区段配对，使得其可变区序列定向 用于这种结合。因此，在一些情况下，所述接头具有足够的长度以跨越所述第一区段 的C末端与所述第二区段的N末端之间的距离，或反之亦然，但是不能太长以阻断或 减少所述scTCR与所述靶配体的
结合。在一些实施方案中，所述接头可以含有为或为约10至45个氨基酸，如10 至30个氨基酸或26至41个氨基酸残基，例如29、30、31或32个氨基酸。
在一些实施方案中，scTCR含有共价二硫键，其将α链的恒定结构域的免疫球蛋 白区域的残基连接至β链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基。在一些实施方案 中，天然TCR中不存在链间二硫键。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半 胱氨酸掺入scTCR多肽的第一和第二区段的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可 能需要天然和非天然二硫键。
在含有引入的链间二硫键的dTCR或scTCR的一些实施方案中，不存在天然二硫键。在一些实施方案中，用形成天然链间二硫键的一个或多个天然半胱氨酸取代另一 残基，如取代丝氨酸或丙氨酸。在一些实施方案中，可以通过使第一和第二区段上的 非半胱氨酸残基突变为半胱氨酸来形成引入的二硫键。TCR的示例性非天然二硫键描 述于已公开的国际PCT号WO2006/000830中。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段对靶抗原以平衡结合常数展现出亲和力，所述平衡结合常数是在或在约10-5与10-12M之间以及其中的所有单独值和范围。 在一些实施方案中，靶抗原是MHC-肽复合物或配体。
在一些实施方案中，编码TCR(如α和β链)的一种或多种核酸可以通过PCR、克 隆或其他合适的方法扩增，并且克隆到合适的表达载体中。所述表达载体可以是任何 合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设 计用于繁殖和扩增或用于表达或用于两者的那些，如质粒和病毒。
在一些实施方案中，载体可以是以下系列的载体：pUC系列(Fermentas LifeSciences)、pBluescript系列(Stratagene，加利福尼亚州拉霍亚)、pET系列(Novagen，威斯康星州麦迪逊)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，瑞典乌普萨拉)或pEX系列(Clontech，加利福尼亚州帕罗奥图)。在一些情况下，也可以使用噬菌体载体，如λG10、λGT11、 λZa pII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。在一些实施方案中，可以使用植物表 达载体，并且包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。在一些 实施方案中，动物表达载体包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。在一些实 施方案中，使用病毒载体，如逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，可以使用标准重组DNA技术来制备所述重组表达载体。在 一些实施方案中，载体可以含有调节序列，如转录和翻译起始和终止密码子，其对引 入载体的宿主(例如，细菌、真菌，植物或动物)的类型具特异性，酌情并考虑所述载 体是基于DNA还是基于RNA。在一些实施方案中，载体可以含有非天然启动子，其 可操作地连接至编码TCR或抗原结合部分(或其他MHC-肽结合分子)的核苷酸序列。 在一些实施方案中，所述启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，如巨细胞病毒 (CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中发现 的启动子。还设想其他已知的启动子。
在一些实施方案中，在获得T细胞克隆后，将TCRα和β链分离并克隆到基因表 达载体中。在一些实施方案中，TCRα和β基因经由小核糖核酸病毒2A核糖体跳跃肽 连接，使得两条链共表达。在一些实施方案中，编码TCR的核酸还包括标记以确认细 胞经转导或工程化而表达受体。在一些实施方案中，TCR的遗传转移是通过逆转录病 毒或慢病毒载体或通过转座子完成(参见例如Baum等人(2006)Molecular Therapy:The Journal of theAmerican Society of Gene Therapy.13:1050-1063；Frecha等人 (2010)MolecularTherapy:The
Journal of the American Society of Gene Therapy.18:1748-1757；和Hackett等人 (201 0)Molecula r The ra py:The J ourna l of the Ame rica n Society of GeneTherapy.18:674-683。
在一些实施方案中，为了产生编码TCR的载体，将α和β链从表达目标TCR的T 细胞克隆分离的总cDNA进行PCR扩增，并将其克隆到表达载体中。在一些实施方案 中，将所述α和β链克隆到同一载体中。在一些实施方案中，将所述α和β链克隆到 不同的载体中。在一些实施方案中，将所产生的α和β链掺入逆转录病毒(例如慢病 毒)载体中。
c.嵌合自身抗体受体(CAAR)
在一些实施方案中，重组受体是嵌合自身抗体受体(CAAR)。在一些实施方案中，CAAR对自身抗体具有特异性。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞(例如工程化以 表达CAAR的T细胞)可以用于特异性地结合至并杀伤表达自身抗体的细胞，而不是表 达正常抗体的细胞。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞可以用于治疗与自身抗原 的表达相关的自身免疫性疾病，例如自身免疫性疾病。在一些实施方案中，表达CAAR 的细胞可以靶向最终产生自身抗体并在其细胞表面上展示所述自身抗体的B细胞，将 这些B细胞标记为治疗干预的疾病特异性靶标。在一些实施方案中，CAAR表达细胞 可以用于通过使用抗原特异性嵌合自身抗体受体靶向引起疾病的B细胞，有效靶向和 杀伤自身免疫性疾病中的致病性B细胞。在一些实施方案中，重组受体是CAAR，例 如美国专利申请公开号US 2017/0051035中所述的任何一种。
在一些实施方案中，CAAR包含自身抗体结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号 传导区域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。在 一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是或包含主要信号传导结构域、能够在T细 胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域 和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。在一些实施方 案中，细胞内信号传导区域包含次级或共刺激信号传导区域(次级细胞内信号传导区 域)。
在一些实施方案中，自身抗体结合结构域包含自身抗原或其片段。自身抗原的 选择可以取决于所靶向的自身抗体的类型。例如，所述自身抗原的选择可能是由于其 识别与特定疾病状态(例如自身免疫性疾病，例如自身抗体介导的自身免疫性疾病)相 关的靶细胞(例如B细胞)上的自身抗体。在一些实施方案中，自身免疫性疾病包括寻 常型天疱疮(PV)。示例性自身抗原包括桥粒芯糖蛋白1(Dsg1)和Dsg3。
d.多靶向
在一些实施方案中，细胞和方法包括多靶向策略，例如在细胞上表达两种或更 多种基因工程化受体，每种受体识别相同或不同的抗原，并且通常各自包括不同的细 胞内信号传导组分。此类多靶向策略描述于例如以下文献中：国际专利申请公开号WO2014055668A1(描述激活和共刺激CAR的组合，例如，靶向单独存在于脱靶(例如正 常细胞)上，但仅一起存在于待治疗疾病的细胞上的两种不同抗原)和Fedorov等 人，Sci.Transl.Medicine，5(215)(2013年12月)(描述表达激活和抑制性CAR的细胞， 例如其中激活CAR结合至同时在正常或非患病细胞和待治疗疾病的细胞上表达的一 种抗原，并且抑制性CAR结合至仅在正常细胞或不希望治疗的细胞上表达的另一种抗 原的那些细胞)。
例如，在一些实施方案中，所述细胞包括表达第一基因工程化抗原受体(例如，CAR或TCR)的受体，其通常在特异性结合至由第一受体识别的抗原(例如第一抗原) 后，能够诱导激活或刺激信号至所述细胞。在一些实施方案中，细胞还包括第二基因 工程化抗原受体(例如，CAR或TCR)，例如嵌合共刺激受体，所述受体通常在特异性 结合至由第二受体识别的第二抗原后，能够将共刺激信号诱导至免疫细胞。在一些实 施方案中，第一抗原与第二抗原是相同的。在一些实施方案中，第一抗原与第二抗原 是不同的。
在一些实施方案中，第一和/或第二基因工程化抗原受体(例如CAR或TCR)能够诱导激活或刺激信号至所述细胞。在一些实施方案中，受体包括含有ITAM或ITAM样基 序的细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，由第一受体诱导的激活涉及信号转导 或细胞中蛋白质表达的变化，导致启动免疫应答(例如ITAM磷酸化)和/或启动ITAM介 导的信号转导级联、形成免疫突触和/或所结合受体(例如CD4或CD8等)附近的分子的 聚簇、激活一种或多种转录因子(例如NF-κB和/或AP-1)、和/或诱导因子(例如细胞因 子)的基因表达、增殖和/或存活。
在一些实施方案中，第一和/或第二受体包括共刺激受体的细胞内信号传导结构域，所述共刺激受体例如CD28、CD137(4-1BB)、OX40和/或ICOS。在一些实施方案 中，第一和第二受体包括不同的共刺激受体的细胞内信号传导结构域。在一个实施方 案中，第一受体含有CD28共刺激信号传导区域，并且第二受体含有4-1BB共刺激信号 传导区域，或反之亦然。
在一些实施方案中，第一和/或第二受体包括含有ITAM或ITAM样基序的细胞内 信号传导结构域和共刺激受体的细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，第一受体含有包含ITAM或ITAM样基序的细胞内信号传导 结构域，并且第二受体含有共刺激受体的细胞内信号传导结构域。与在相同细胞中诱 导的激活或刺激信号组合的共刺激信号是导致免疫应答的共刺激信号，所述免疫应答 例如为稳健且持续的免疫应答，例如增加的基因表达，细胞因子和其他因子的分泌， 以及T细胞介导的效子功能(如细胞杀伤)。
在一些实施方案中，单独的第一受体的连接和单独的第二受体的连接都不会诱导稳健的免疫应答。在一些方面，如果仅连接一个受体，则细胞变得耐受抗原或对抗 原无应答，或被抑制，和/或不被诱导增殖或分泌因子或实现效应子功能。然而，在 一些此类实施方案中，在连接多个受体时，如在遇到表达第一和第二抗原的细胞时， 实现所需应答，如完全免疫激活或刺激，例如如通过一种或多种细胞因子的分泌、增 殖、持久性和/或执行免疫效应子功能(如靶细胞的细胞毒性杀伤)所指示的。
在一些实施方案中，两种受体分别将激活和抑制信号诱导至细胞，使得一种受 体与其抗原的结合激活细胞或诱导应答，但是第二抑制性受体与其抗原的结合诱导了 抑制或减弱所述应答的信号。例子是激活CAR与抑制性CAR或iCAR的组合。例如， 可以使用这种策略，其中激活CAR结合在疾病中表达但也在正常细胞上表达的抗原， 并且抑制性受体结合至在正常细胞上表达但不在疾病的细胞上表达的单独抗原。
在一些实施方案中，多靶向策略用于以下情况：其中与特定疾病相关的抗原在 未患病细胞上表达和/或在工程化细胞本身上表达，所述表达为瞬时表达(例如，在与 基因工程化相关的刺激后)或永久表达。在此类情况下，通过需要连接两个分开的和 单独特异性靶抗原受体，可以改善特异性、选择性和/或功效。
在一些实施方案中，多种抗原(例如第一和第二抗原)在所靶向的细胞、组织或疾病上(例如在癌细胞上)表达。在一些方面，细胞、组织、疾病是多发性骨髓瘤或多发 性骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，多种抗原中的一种或多种通常也在不需要用细胞 疗法靶向的细胞(例如正常或未患病细胞或组织，和/或工程化细胞本身)上表达。在此 类实施方案中，通过需要连接多个受体以实现细胞的应答，实现特异性和/或功效。
e.其他调节元件
在本文提供的方法和组合物的一些实施方案中，病毒载体基因组中所含的编码重组受体(例如抗原受体，例如CAR)的核酸序列与其他遗传元件(例如转录调节序列， 包括启动子或增强子)以功能关系可操作地连接，以特定方式调节目标序列的表达。 在某些情况下，此类转录调节序列是在活性方面在时间上和/或空间上受调节的那些。 可用于调节组分表达的表达控制元件是已知的，并且包括但不限于诱导型启动子、组 成型启动子、分泌信号、增强子和其他调节元件。在一些实施方案中，病毒载体基因 组中所含的核酸序列含有多个表达控制元件，其控制所编码的不同组分，例如不同的 受体组分和/或信号传导组分，使得重组受体和/或工程化细胞(例如表达工程化受体的 细胞)的表达、功能和/或活性可以被调节，例如是可诱导的、可抑制的、可调节的和/ 或用户控制的。在一些实施方案中，一种或多种载体可含有一种或多种核酸序列，所 述核酸序列含有一种或多种表达控制元件和/或一种或多种所编码组分，使得核酸序 列一起可调节所编码组分(例如重组受体)或工程化细胞的表达、活性和/或功能。
在一些实施方案中，编码重组受体(例如抗原受体，例如CAR)的核酸序列与内部启动子/增强子调节序列可操作地连接。所用的启动子可以是组成型的、组织特异性 的、诱导型的和/或在适当条件下可用于引导所引入DNA区段的高水平表达。启动子 可以是异源的或内源的。在一些实施方案中，启动子和/或增强子是以合成方式产生。 在一些实施方案中，启动子和/或增强子是使用重组克隆和/或核酸扩增技术产生。
在一些情况下，编码重组受体的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。在一些 方面，信号序列可以编码源自天然多肽的信号肽。在其他方面，信号序列可以编码异 源或非天然信号肽。在一些情况下，编码重组受体(例如嵌合抗原受体(CAR))的核酸 序列含有编码信号肽的信号序列。
在一些实施方案中，编码重组受体的多核苷酸含有至少一个启动子，所述启动 子可操作连接以控制重组受体的表达。在一些例子中，多核苷酸含有两个、三个或更 多个启动子，所述启动子可操作地连接以控制重组受体的表达。
在核酸分子编码两种或更多种不同多肽链(例如重组受体和标记)的某些情况下，每条多肽链可以由单独的核酸分子编码。例如，提供了两个单独的核酸，并且每一个 可以单独转移到或引入细胞中以在细胞中表达。在一些实施方案中，编码重组受体的 核酸和编码标记的核酸与相同的启动子可操作地连接，并且任选地通过内部核糖体进 入位点(IRES)或编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽(其任选地是T2A、P2A、E2A或 F2A)的核酸分开。在一些实施方案中，编码标记的核酸和编码重组受体的核酸可操作 地连接至两个不同的启动子。在一些实施方案中，编码标记的核酸和编码重组受体的 核酸存在或插入于细胞基因组内的不同位置。在一些实施方案中，例如通过逆转录病 毒转导、转染或转化将编码重组受体的多__核苷酸引入含有培养细胞的组合物中。
在一些实施方案中，标记是转导标记或替代标记。转导标记或替代标记可用于 检测已经引入多核苷酸(例如编码重组受体的多核苷酸)的细胞。在一些实施方案中， 转导标记可以指示或确认对细胞的修饰。在一些实施方案中，替代标记是经制备在细 胞表面上与重组受体(例如，CAR)共表达的蛋白质。在特定实施方案中，这种替代标 记是已经修饰以具有极少或无活性的表面蛋白。在一些实施方案中，替代标记是由编 码重组受体的相同多核苷酸编码。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸序列与编 码标记的核酸序列可操作地连接，任选地通过内部核糖体进入位点(IRES)或编码自切 割肽或引起核糖体跳跃的肽(例如2A序列，例如T2A、P2A、E2A或F2A)的核酸分开。 在一些情况下，外在标记基因可以结合工程化细胞用于允许检测或选择细胞，并且在 一些情况下还可以用于促进细胞自杀。
另外的用于引入的核酸(例如基因)包括如通过促进所转移细胞的活力和/或功能改善疗法功效的那些；提供用于选择和/或评估细胞的遗传标记如以在体内评价存活 或定位的基因；例如通过使细胞对体内阴性选择易感来提高安全性的基因，如以下文 献中所述：Lupton S.D.等人,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等人,Human GeneTherapy 3:319-338(1992)；还参见Lupton等人的PCT/US 91/08442和PCT/US 94/05601的公开案，所述公开案描述了使用源自融合显性的阳性选择标记与阴性选择 标记的双功能可选融合基因。参见例如，Riddell等人,美国专利号6,040,177,第14-17 栏。
在一些实施方案中，启动子和/或增强子可以是与核酸序列天然相关的启动子和/或增强子，如可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5'非编码序列而获得。 可替代地，在一些实施方案中，编码核酸区段可以位于重组和/或异源启动子和/或增 强子的控制下，所述启动子和/或增强子通常不与天然环境中的编码核酸序列相关。 例如，用于重组DNA构建的示例性启动子包括但不限于β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖、 色氨酸(trp)、RNA聚合酶(pol)III启动子(包括人和鼠类U6pol III启动子以及人和鼠类 H1RNA pol III启动子)；
RNA聚合酶(pol)II启动子；巨细胞病毒即时早期启动子(pCMV)、延伸因子-1α(EF-1α)和劳氏肉瘤病毒长末端重复序列启动子(pRSV)启动子系统。在一些实施方案 中，启动子可以例如从病毒基因组获得，所述病毒例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒、 牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒 40(SV40)。启动子也可以是，例如，异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免 疫球蛋白启动子、热激启动子或通常与天然序列相关的启动子，条件是此类启动子与 靶细胞相容。在一个实施方案中，启动子是病毒表达系统中天然存在的病毒启动子。
在一些实施方案中，启动子可以是组成型活性的。可以使用的组成型启动子的 非限制性例子包括用于以下各项的启动子：泛素(美国专利号5,510,474；WO 98/32869)、CMV(Thomsen等人,PNAS 81:659,1984；美国专利号5,168,062)、β肌动 蛋白(Gunning等人1989Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4831-4835)和pgk(参见，例如， Adra等人1987Gene 60:65-74；Singer-Sam等人1984Gene 32:409-417；和Dobson等人 1982Nucleic AcidsRes.10:2635-2637)。
在一些实施方案中，启动子可以是组织特异性启动子和/或靶细胞特异性启动子。在一些实施方案中，可以选择启动子以允许目标序列的诱导型表达。许多用于诱导型 表达的系统是已知的，包括四环素反应系统、lac操纵基因-阻遏物系统，以及响应各 种环境或生理变化的启动子，所述环境或生理变化包括热休克、金属离子(如金属硫 蛋白启动子)、干扰素、缺氧、类固醇(如孕酮或糖皮质激素受体启动子)、辐射，如 VEGF启动子。在一些实施方案中，基于大肠杆菌(Escherichia coli)的tet抑制(tetr)对tet 操纵基因序列(TECO)的抑制作用的四环素-(tet)可调节系统可以被修饰用于哺乳动物 系统并用作表达盒的可调节元件。这些系统是熟知的。(参见Goshen和Badgered， Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547-51(1992)；Shockett等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6522-26(1996)；Lindemann等人,Mol.Med.3:466-76(1997))。
还可使用启动子组合来获得目标基因的所需表达。普通技术人员将能够基于目标生物体或靶细胞中基因的所需表达模式选择启动子。
在一些实施方案中，增强子也可以存在于病毒构建体中以增加目标基因的表达。增强子通常是顺式作用核酸元件，通常长约10至300个by，其作用于启动子以增加其 转录。已知病毒基因组(例如HIV或CMV)中的许多增强子。例如，可以使用CMV增强 子(Boshart等人Cell，41:521,1985)。其他例子包括，例如，复制起点(bp 100-270)后侧 上的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子和腺 病毒增强子。在一些情况下，增强子来自哺乳动物基因，例如来自球蛋白、弹性蛋白 酶、白蛋白、甲胎蛋白或胰岛素的增强子。增强子可以与异源启动子组合使用。可以 将增强子剪接到载体中，在编码目标基因的多核苷酸序列的5'或3'位置，但通常位于 启动子的5'位点。本领域普通技术人员将能够基于所需的表达模式选择合适的增强 子。
病毒载体基因组还可含有另外的遗传元件。可以包括在构建体中的元件类型不以任何方式受限制，并且可以由本领域技术人员来选择。例如，可以包括促进靶细胞 中病毒基因组的核进入的信号。这种信号的例子是HIV-1拍动信号(flap signal)(在一些 情况下称为拍动序列)。另外，载体基因组可含有一种或多种设计用于增强目标基因 表达的遗传元件。在一些实施方案中，基因组含有转录后调节元件(PRE)或其展现转 录后活性的经修饰形式。例如，在一些实施方案中，可以将土拨鼠肝炎病毒转录后响 应元件(WPRE)置入构建体中(Zufferey等人1999.J.Virol.74:3668-3681；Deglon等人 2000.Hum.GeneTher.11:179-190)。在一些实施方案中，载体基因组缺乏__拍动序列 和/或缺乏WPRE。在一些实施方案中，载体基因组含有突变或缺陷的拍动序列和/或 WPRE。
在一些情况下，可以包括编码分开的异源蛋白质的多于一个开放阅读框。例如，在一些实施方案中，如果表达构建体中包括报道基因和/或可检测和/或可选择的基因， 那么可以包括内部核糖体进入位点(IRES)序列。通常，另外的遗传元件与独立的启动 子/增强子可操作地连接并受其控制。另外的遗传元件可以是报道基因、可选择标记 或其他所需基因。
在一些实施方案中，其他各种调节元件可以包括转录起始区和/或终止区。表达载体还可含有用于终止转录和用于稳定mRNA的序列。此类序列是已知的并且通常天 然存在于真核或病毒DNA或cDNA的5'和偶尔3'非翻译区中。转录终止区的例子包括 但不限于聚腺苷酸化信号序列。聚腺苷酸化信号序列的例子包括但不限于牛生长激素 (BGH)聚(A)、SV40晚期聚(A)、兔β球蛋白(RBG)聚(A)、胸苷激酶(TK)聚(A)序列及 其任何变体。
在一些实施方案中，调节元件可以包括允许重组受体(例如CAR)的可调节表达和/或活性的调节元件和/或系统。在一些实施方案中，可调节的表达和/或活性是通过将 重组受体配置成含有特定调节元件和/或系统或受所述调节元件和/或系统控制来实 现。在一些实施方案中，一种或多种另外的受体可以用于表达调节系统中。在一些实 施方案中，表达调节系统可以包括需要暴露于特定配体或结合特定配体的系统，所述 配体可以调节重组受体的表达和/或活性。在一些实施方案中，重组受体(例如CAR) 的受调节表达是通过可调节的转录因子释放系统(例如，经修饰的Notch信号传导系统) 来实现(参见，例如，Roybal等人,Cell(2016)164:770-779；Morsut等 人,Cell(2016)164:780-791)。在一些实施方案中，对重组受体活性的调节是通过给予另 外的药剂来实现，所述另外的药剂可以诱导多肽(例如重组受体)的构象变化和/或多聚 化。在一些实施方案中，另外的药剂是化学诱导剂(参见，例如，美国专利公开号 2016/0046700；Clackson等人(1998)Proc Natl AcadSci USA.95(18):10437-42；Spencer 等人(1993)Science 262(5136):1019-24；Farrar等人(1996)Nature 383(6596):178-81； Miyamoto等人(2012)Nature Chemical Biology 8(5):465-70；Erhart等人(2013)Chemistry and Biology 20(4):549-57)。
4.病毒载体颗粒的制备
病毒载体基因组通常以质粒形式构建，其可以转染到包装细胞系或生产细胞系中。可以使用多种已知方法中的任何一种来产生逆转录病毒颗粒，其基因组含有病毒 载体基因组的RNA拷贝。在一些实施方案中，至少两种组分参与制备基于病毒的基因 传递系统：第一，包装质粒，包括结构蛋白以及产生病毒载体颗粒所必需的酶，第二， 病毒载体本身，即，要转移的遗传物质。可以在设计这些组分中的一个或两个时引入 生物安全保护措施。
在一些实施方案中，包装质粒可以含有除了包膜蛋白以外的所有逆转录病毒(如HIV-1)蛋白(Naldini等人，1998)。在其他实施方案中，病毒载体可能缺乏另外的病毒 基因(例如与毒力有关的那些，例如vpr、vif、vpu和nef)和/或Tat(HIV的主要反式激活 因子)。在一些实施方案中，慢病毒载体(例如基于HIV的慢病毒载体)仅包含三种亲本 病毒的基因：gag、pol和rev，这减少或消除了野生型病毒通过重组而重构的可能性。
在一些实施方案中，将病毒载体基因组引入包装细胞系中，所述细胞系含有将 从病毒载体基因组转录的病毒基因组RNA包装至病毒颗粒中所需的所有组分。可替代 地，除了一种或多种目标序列(例如重组核酸)以外，病毒载体基因组可包含一种或多 种编码病毒组分的基因。然而，在一些方面，为了防止基因组在靶细胞中复制，将复 制所需的内源病毒基因去除，并在包装细胞系中单独提供。
在一些实施方案中，用一种或多种含有产生所述颗粒所需组分的质粒载体转染包装细胞系。在一些实施方案中，用含有病毒载体基因组(包括LTR、顺式作用包装 序列和目标序列，即编码抗原受体(例如CAR)的核酸)的质粒；以及编码病毒酶和/或 结构组分(例如Gag、pol和/或rev)的一种或多种辅助质粒转染包装细胞系。在一些实 施方案中，利用多种载体分离产生逆转录病毒载体颗粒的各种遗传组分。在一些此类 实施方案中，向包装细胞提供单独的载体减少了重组事件的可能性，否则可能产生有 复制能力的病毒。在一些实施方案中，可以使用具有所有逆转录病毒组分的单一质粒 载体。
在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)假型化以增加宿主细胞的转导效率。例如，在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(例如慢病 毒载体颗粒)用VSV-G糖蛋白假型化，其提供宽细胞宿主范围，从而扩展可以转导的 细胞类型。在一些实施方案中，用编码非天然包膜糖蛋白的质粒或多核苷酸转染包装 细胞系，以例如包括嗜异性，多嗜性或双嗜性包膜，例如辛德毕斯病毒(Sindbis virus) 包膜、GALV或VSV-G。
在一些实施方案中，包装细胞系提供将病毒基因组RNA包装至慢病毒载体颗粒 中反式作用所需的组分，包括病毒调节蛋白和结构蛋白。在一些实施方案中，包装细 胞系可以是能够表达慢病毒蛋白并产生功能性慢病毒载体颗粒的任何细胞系。在一些 方面，合适的包装细胞系包括293(ATCC CCL X)、293T、HeLA(ATCC CCL 2)、 D17(ATCC CCL 183)、MDCK(ATCC CCL34)、BHK(ATCC CCL-10)和Cf2Th(ATCC CRL 1430)细胞。
在一些实施方案中，包装细胞系稳定地表达一种或多种病毒蛋白质。例如，在 一些方面，可以构建含有gag、pol、rev和/或其他结构基因但不含LTR和包装组分的 包装细胞系。一些实施方案中，可以用编码一种或多种病毒蛋白的核酸分子以及含有 编码异源蛋白的核酸分子的病毒载体基因组和/或编码包膜糖蛋白的核酸对包装细胞 系进行瞬时转染。
在一些实施方案中，将病毒载体和包装质粒和/或辅助质粒通过转染或感染引入包装细胞系中。包装细胞系产生含有病毒载体基因组的病毒载体颗粒。用于转染或感 染的方法是熟知的。非限制性例子包括磷酸钙、DEAE-葡聚糖和脂质转染方法、电穿 孔和显微注射。
在将重组质粒和逆转录病毒LTR和包装序列引入特殊细胞系(例如，通过磷酸钙沉淀)中时，包装序列可以允许待包装至病毒颗粒中的重组质粒的RNA转录，然后所 述病毒粒子可能会被分泌到培养基中。在一些实施方案中，随后收集含有重组逆转录 病毒的培养基，任选地将其浓缩，并用于基因转移。例如，在一些方面，在将包装质 粒和转移载体共转染至包装细胞系后，从培养基回收病毒载体颗粒，并通过本领域技 术人员使用的标准方法进行滴定。
在一些实施方案中，可以通过引入质粒以允许产生慢病毒颗粒，而在包装细胞 系(例如示例性HEK 293T细胞系)中产生逆转录病毒载体，例如慢病毒载体。在一些实 施方案中，包装细胞被转染和/或含有编码gag和pol的多核苷酸，以及编码重组受体(例 如抗原受体，例如CAR)的多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系被任选地和/或 另外用编码rev蛋白的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些实施方案中，包 装细胞系被任选地和/或另外用编码非天然包膜糖蛋白(例如VSV-G)的多核苷酸转染 和/或含有所述多核苷酸。在一些此类实施方案中，在转染细胞(例如，HEK 293T细胞) 后大约两天，细胞上清液含有可以回收并滴定的重组慢病毒载体。
所回收和/或产生的逆转录病毒载体颗粒可以用于使用如所述的方法转导靶细胞。一旦进入靶细胞中，病毒RNA就被逆转录，进入细胞核中并稳定整合到宿主基因 组中。在病毒RNA整合后一天或两天，可以检测到重组蛋白(例如抗原受体，例如CAR) 的表达。
C.孵育
在一些实施方案中，所提供的方法涉及通过使包含多个细胞的细胞组合物(下文中也称为“输入组合物”)与(1)病毒颗粒接触(例如孵育)来转导细胞的方法。在一些 实施方案中，输入组合物是或包含从受试者获得的原代细胞，例如从受试者富集和/ 或选择的细胞。
在一些实施方案中，输入组合物包含从受试者获得的原代细胞。在一些方面， 样品是全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、 淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞分离术产物。
在一些实施方案中，在细胞的选择和/或转导之前，使含有原代细胞的样品与以下浓度的血清或血浆离体接触或含有所述血清或血浆：至少或至少约10％(v/v)、至少 或至少约15％(v/v)、至少或至少约20％(v/v)、至少或至少约25％(v/v)、至少或至少约 30％(v/v)、至少或至少约35％(v/v)、至少或至少约40％(v/v)、或者至少或至少约50％。 在一些实施方案中，样品含有血清或血浆，所述血清或血浆的浓度为或大致为约或至 少约25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％(v/v)。 在一些实施方案中，血清或血浆是人的。在一些实施方案中，血清或血浆对于受试者 是自体的。在一些实施方案中，在选择和/或转导细胞之前，使含有原代细胞的样品 与抗凝血剂接触或含有抗凝血剂。在一些实施方案中，抗凝血剂是或含有游离柠檬酸 根离子，例如，抗凝血剂柠檬酸盐右旋糖溶液，溶液A(ACD-A)。
在一些实施方案中，在细胞的选择和/或转导之前，将样品维持在为或为约2℃至8℃的温度下长达48小时，例如长达12小时、24小时或36小时。
在一些实施方案中，输入组合物包含和/或富含T细胞，所述T细胞包括CD4+和 /或CD8+T细胞。在一些方面，富集可以通过基于亲和力的选择，通过将原代细胞与 一种或多种选择或亲和试剂一起孵育来进行，所述选择或亲和试剂特异性地结合至原 代细胞亚群上表达的细胞表面分子，从而基于与选择试剂的结合来富集原代细胞。在 一些实施方案中，富集可以通过将细胞与抗体包被的颗粒(例如微珠、聚合纳米基质) 一起孵育来进行。
在一些实施方案中，输入组合物包含大于或大于约75％、80％、85％、90％、 95％或更多的从受试者的样品获得的T细胞。在一些方面，在孵育之前，输入组合物 中不超过5％、10％、20％、30％或40％的T细胞是激活细胞，表达选自HLA-DR、CD25、 CD69、CD71、CD40L和4-1BB的表面标记；包含选自IL-2、IFN-γ、TNF-α的细胞 因子的细胞内表达，处于细胞周期的G1期或较后期，和/或能够增殖。
在一些实施方案中，含有此类细胞(例如在孵育和/或接触之前未经历用一种或多种刺激剂离体刺激的细胞)的输入组合物是其中大于20％、30％、40％、50％、60％、 70％或更多的细胞表达低密度脂质受体(LDL-R)的输入组合物。在一些实施方案中， 将输入组合物针对T细胞(例如CD4+和/或CD8+T细胞)进行富集和/或选择，并且在所 述孵育之前，大于20％、30％、40％、50％，60％、70％或更多的T细胞表达低密度 脂质受体(LDL-R)。
在一些实施方案中，在孵育和/或接触期间或在孵育和/或接触的至少一部分期间，输入组合物可以包含一种或多种细胞因子。在一些实施方案中，所述细胞因子选 自IL-2、IL-7或IL-15。在一些实施方案中，所述细胞因子是重组细胞因子。在一些实 施方案中，输入组合物中细胞因子的浓度独立地为或为约1IU/mL至1500IU/mL，例如 为或为约1IU/mL至100IU/mL、2IU/mL至50IU/mL、5IU/mL至10IU/mL、10IU/mL至 500IU/mL、50IU/mL至250IU/mL或100IU/mL至200IU/mL、50IU/mL至1500IU/mL、 100IU/mL至1000IU/mL或200IU/mL至600IU/mL。在一些实施方案中，输入组合物中 细胞因子的浓度独立地为至少或至少约1IU/mL、5IU/mL、10IU/mL、50IU/mL、 100IU/mL、200IU/mL、500IU/mL、1000IU/mL或1500IU/mL。在一些方面，也可以在 孵育期间或在孵育的至少一部分期间或在孵育之后，包括能够激活TCR复合物的细胞 内信号传导结构域的药剂(例如抗CD3和/或抗CD28抗体)。
在一些实施方案中，在孵育和/或接触期间或在孵育和/或接触的至少一部分期间，输入组合物可以包含血清。在一些实施方案中，所述血清是胎牛血清。在一些实 施方案中，所述血清是人血清。在一些实施方案中，所述血清是以为或为约0.5％至 25％(v/v)、1.0％至10％(v/v)或2.5％至5.0％(v/v)的浓度存于输入组合物中，每个都 包含端值。在一些实施方案中，所述血清是以至少或至少约0.5％(v/v)、1.0％(v/v)、 2.5％(v/v)、5％(v/v)或10％(v/v)的浓度存于输入组合物中。
在一些实施方案中，在孵育和/或接触期间或在孵育和/或接触的至少一部分期间，输入组合物不含和/或基本上不含血清。在一些实施方案中，在孵育和/或接触期 间或在孵育和/或接触的至少一部分期间，输入组合物是在血清不存在下进行孵育和/ 或接触。在特定实施方案中，在孵育和/或接触期间或在孵育和/或接触的至少一部分 期间，输入组合物是在无血清培养基中进行孵育和/或接触。在一些实施方案中，无 血清培养基是定义的和/或明确定义的细胞培养基。在某些实施方案中，无血清培养 基是受控培养基，其已经过处理，例如被过滤以去除抑制剂和/或生长因子。在一些 实施方案中，无血清培养基含有蛋白质。在某些实施方案中，无血清培养基可含有血 清白蛋白、水解产物、生长因子、激素、载体蛋白和/或附着因子。在一些实施方案 中，无血清培养基含有蛋白质，例如白蛋白，例如牛血清白蛋白、人血清白蛋白和/ 或重组白蛋白。在一些实施方案中，无血清培养基含有基础培养基，例如DMEM或 RPMI 1640，其含有氨基酸、维生素、无机盐、缓冲剂、抗氧化剂和能量来源。在一 些实施方案中，无血清培养基补充有例如但不限于白蛋白、化学上定义的脂质、生长 因子、胰岛素、细胞因子和/或抗氧化剂。在一些实施方案中，配制无血清培养基以 支持某种细胞类型(例如免疫细胞、T细胞和/或CD4+和CD8+T细胞)的细胞的生长、增殖、健康、稳态。
在一些实施方案中，在孵育和/或接触期间或在孵育和/或接触的至少一部分期间，输入组合物包含N-乙酰半胱氨酸。在一些实施方案中，输入组合物中的N-乙酰半 胱氨酸的浓度为或为约0.4mg/mL至4mg/mL、0.8mg/mL至3.6mg/mL或1.6mg/mL至 2.4mg/mL，每个都包含端值。在一些实施方案中，输入组合物中的N-乙酰半胱氨酸 的浓度为至少或至少约或约0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL、 2.0mg/mL、2.4mg/mL、2.8mg/mL、3.2mg/mL、3.6mg/mL或4.0mg/mL。
在一些实施方案中，输入组合物的细胞浓度为或为约1.0x105个细胞/mL至1.0x1010滴度在一些实施方案中，转导可以按小于100、例如通常小于60、50、40、 30、20、10、5、4、3、2、1或更小的感染复数(MOI)实现。
在一些实施方案中，所述方法涉及使细胞与病毒颗粒接触或孵育，例如混合。 在一些实施方案中，接触进行30分钟至72小时，例如30分钟至48小时、30分钟至24 小时或1小时至24小时，例如至少或约至少30分钟、1小时、2小时、6小时、12小时、 24小时、36小时或更长时间。
在一些实施方案中，接触是在溶液中进行。在一些实施方案中，使细胞和病毒 颗粒以为或为约0.5mL至500mL的体积接触，所述体积例如为或为约0.5mL至200mL、 0.5mL至100mL、0.5mL至50mL、0.5mL至10mL、0.5mL至5mL、5mL至500mL、5mL 至200mL、5mL至100mL、5mL至50mL、5mL至10mL、10mL至500mL、10mL至200mL、 10mL至100mL、10mL至50mL、50mL至500mL、50mL至200mL、50mL至100mL、100mL 至500mL、100mL至200mL或200mL至500mL。
在一些实施方案中，接触可以通过离心、例如旋转接种(例如离心接种)来实现。在一些实施方案中，可以使含有细胞、病毒颗粒和试剂的组合物旋转，通常以相对较 低的力或速度旋转，例如速度低于用于沉淀细胞的速度，例如为或为约600rpm至 1700rpm(例如，为或为约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)。在一些实 施方案中，旋转是以为或为约100g至3200g(例如，为或为约或至少为或为约100g、 200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000g或3200g)的力(例如， 相对离心力)来进行，如例如在室或空腔的内壁或外壁处所测量。术语“相对离心力” 或RCF通常被理解为在如与旋转轴相比在空间的特定点处，相对于地球的重力，施加 在物体或物质(例如细胞、样品或团粒和/或所旋转的室或其他容器中的点)上的有效 力。所述值可以使用熟知的公式来确定，所述公式考虑到重力、旋转速度和旋转半径 (与旋转轴的距离以及测量RCF的物体、物质或颗粒)。
在一些实施方案中，细胞与病毒载体颗粒的孵育导致或产生包含用病毒载体颗粒转导的细胞的输出组合物。
D.其他处理步骤
在一些实施方案中，用于转导(例如与细胞工程化结合)的处理步骤可以另外包括细胞的培养、培育、刺激、激活、繁殖和/或配制。在一些实施方案中，将输出组合 物或细胞在刺激条件或刺激剂的存在下孵育。此类条件包括设计用于诱导群体中的细 胞的增殖、扩增、激活和/或存活和/或模拟抗原暴露的条件。刺激可以在给予至受试 者后离体或在体内进行。
2.配制
在一些实施方案中，在进一步孵育之后，制备细胞的过程可以还包括洗涤或配 制细胞。因此，处理步骤中可包括配制此类组合物。
还提供了用于此类方法中的药物组合物或配制品，其在一些实施方案中结合所提供的处理方法一起配制，例如在进行其他处理步骤的封闭系统中进行，例如以自动 化或部分自动化方式进行。
在一些实施方案中，将细胞和组合物以药物组合物或配制品的形式(例如包含细胞或细胞群和药学上可接受的载体或赋形剂的组合物)给予至受试者。
术语“药物配制品”是指这样的制剂，其处于使得其中所含活性成分的生物活 性有效的形式，并且不含对给予配制品的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。
在一些实施方案中，药物组合物另外包含其他药学活性药剂或药物，例如化学 治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、 吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等。在一些 实施方案中，所述药剂是以盐形式例如药学上可接受的盐给予。合适的药学上可接受 的酸加成盐包括源自无机酸的那些，所述无机酸是如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、 硝酸和硫酸，以及源自有机酸的那些，所述有机酸是如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果 酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸和芳基磺酸(例如，对甲苯 磺酸)。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分以外的对受试者无毒 的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面，载体的选择部分取决于特定细胞和/或给予方法。因此，存在多种 合适的配制品。例如，所述药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两 种或更多种防腐__剂的混合物。所述防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约 0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences第 16版,Osol,A.编辑(1980)。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者 无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂， 包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎 氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或 对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少 于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物， 如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖 氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA； 糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例 如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，缓冲剂被包括在所述组合物中。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、 柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂 的混合物。所述缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量 存在。用于制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例 如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；21st ed.(2005年5月1日)中。
配制品可以包括水溶液。所述配制品或组合物还可含有可用于用细胞治疗的特定适应症、疾病的多于一种活性成分，优选具有与所述细胞互补的活性的那些成分， 其中各自的活性不会相互产生不利影响。此类活性成分以有效用于既定目的的量以合 适的方式组合存在。因此，在一些实施方案中，药物组合物还包括其他药物活性药剂 或药物，例如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔 比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱和/ 或长春新碱。
在一些实施方案中，药物组合物包含有效治疗或预防疾病的量(例如治疗有效量或预防有效量)的细胞。在一些实施方案中，通过定期评估所治疗的受试者来监测治 疗或预防功效。所需剂量可以通过细胞的单次推注给予、通过细胞的多次推注给予或 通过细胞的连续输注给予来递送。
在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂(例如，等渗水溶液、悬浮液、乳 液、分散体或粘性组合物，其在一些方面可以缓冲至所选pH)提供。液体制剂一般比 凝胶、其他粘性组合物和固体组合物制备起来更容易。另外地，液体组合物稍微更方 便给予，特别是通过注射。在另一方面，粘性组合物可以配制在适当的粘度范围内， 以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，其可以是溶 剂或分散介质，其含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二 醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
无菌可注射溶液可以通过将细胞掺入溶剂中来制备，例如与合适的载体、稀释 剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。所述组合物可以含有辅 助物质，例__如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度 增强添加剂、防腐剂、调味剂和/或颜料，这取决于给予途径和所需的制剂。在一些 方面，可以参考标准文本来制备合适的制剂。
可以添加各种增强所述组合物的稳定性和无菌性的添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲 酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸)来确保防止微生物的作用。通过使用延迟吸收的药剂(例 如单硬脂酸铝和明胶)可以实现可注射药物形式的延长吸收。用于体内给予的配制品 通常是无菌的。可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌。
III.用于给予的治疗方法和组合物
在一些方面，所述方法的产物用于治疗方法，例如，治疗性方法，例如用于在 过继细胞疗法中将细胞和组合物给予至受试者。还提供了此类方法和通过所述方法处 理和产生的细胞的用途，以及用于其中的药物组合物和配制品。所提供的方法通常涉 及将细胞或组合物(例如输出组合物和/或配制的组合物)给予至受试者。
在一些实施方案中，所述细胞表达重组受体(例如CAR)或其他抗原受体(例如转基因TCR，例如在本文所提供的转导方法中转移的那些)。通常将此类细胞给予至患 有与由所述受体特异性识别的配体相关的疾病的受试者。在一个实施方案中，所述细 胞表达重组受体或嵌合受体(例如抗原受体，例如CAR或TCR)，所述受体特异性地结 合至与疾病相关或由其细胞或组织表达的配体。例如，在一些实施方案中，所述受体 是抗原受体，并且所述配体是疾病特有的和/或与所述疾病相关的抗原。给予通常实 现疾病的一种或多种症状的改善和/或治疗或预防疾病或其症状。
疾病、病症和障碍包括肿瘤，包括实体瘤、血液学恶性肿瘤和黑色素瘤，并且 包括局部和转移性肿瘤；感染性疾病，如病毒或其他病原体的感染，例如HIV、HCV、 HBV、CMV和寄生虫病；以及自身免疫和炎性疾病。在一些实施方案中，疾病是肿 瘤、癌症、恶性肿瘤、肿疡或其他增殖性疾病或障碍。此类疾病包括但不限于白血病、 淋巴瘤(例如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、ALL、非霍奇金淋巴瘤、急性髓样白血病、 多发性骨髓瘤、难治性滤泡性淋
巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性B细胞淋巴瘤、B细胞恶性肿瘤)、结肠癌、肺癌、肝 癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌、黑色素瘤、骨癌和脑癌、卵巢癌、上皮癌、 肾细胞癌、胰腺腺癌、霍奇金淋巴瘤、宫颈癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、神经母细 胞瘤、尤因肉瘤、髓母细胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤和/或间皮瘤。
在一些实施方案中，此类疾病包括但不限于白血病、淋巴瘤，例如急性髓样(或 髓性)白血病(AML)、慢性髓样(或髓性)白血病(CML)、急性淋巴细胞(或成淋巴细胞) 白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)、小淋巴细胞淋巴瘤 (SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、 非霍奇金淋巴瘤(NHL))、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、滤泡性淋巴瘤、难治性滤泡 性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中， 疾病是选自以下各项的B细胞恶性肿瘤：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、成人ALL、 慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤 (DLBCL)。在一些实施方案中，疾病是NHL，并且NHL选自侵袭性NHL、弥漫性大B 细胞淋巴瘤(DLBCL)、NOS(从头的和从惰性转化的)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤 (PMBCL)、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤(TCHRBCL)、伯基特淋巴瘤、套细 胞淋巴瘤(MCL)和/或滤泡性淋巴瘤(FL)，任选地，3B级滤泡性淋巴瘤(FL3B)。
在一些实施方案中，疾病是感染性疾病，例如但不限于病毒、逆转录病毒、细 菌和原生动物感染、免疫缺陷、巨细胞病毒(CMV)、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrvirus， EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。在一些实施方案中，所述疾病是自身免疫性或炎性疾 病，如关节炎(例如类风湿性关节炎(RA))、I型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎性 肠病、银屑病、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病、克罗恩病、多发性硬 化症、哮喘和/或与移植相关的疾病。
在一些实施方案中，与疾病或障碍相关的抗原包括αvβ6整合素(avb6整合素)、 B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、 癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原 (CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CC基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、 CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白 (tEGFR)、III型表皮生长因子受体突变(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋 白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结 合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、 糖蛋白100(gp100)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、 Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原 (HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原 A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受 体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富含亮氨酸 的重复序列的8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、 MAGEA3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、天然杀伤组2成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子 (NCAM)、癌胚胎抗原、优先表达抗原黑色素瘤(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性 靶抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶 像孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白 72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、 Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性靶抗原或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化 分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受 体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一 种。在一些实施方案中，抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、 CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，与细胞或组合物所靶向的疾病或障碍相关的抗原选自孤儿酪氨酸激酶受体ROR1、tEGFR、Her2、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、 CEA、和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、 EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、3或4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、 GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、路易斯Y、L1细胞粘附 分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、 gp100、癌胚胎抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性靶 抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、CS-1、c-Met、 GD-2和MAGEA3、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白(如细胞周期蛋白A1(CCNA1))和/或生物素化分子，和/或由HIV、HCV、HBV表达的分子或其他病原体。
在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特异性或病原体表达的抗原。在一些 实施方案中，抗原是病毒抗原(例如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原 和/或寄生虫抗原。
如本文所用，“治疗”是指疾病或障碍、或者与之相关的症状、不良效果或结 果或表型的完全或部分改善或减轻。理想的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或 复发、症状的缓解、疾病的任何直接或间接病理后果的减少、预防转移、降低疾病进 展的速度、改善或缓解疾病状态以及缓解或改善预后。所述术语并不暗示完全治愈疾 病或完全消除任何症状或对所有症状或结果的影响。
如本文所用，“延迟疾病的发展”意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定、抑制 和/或延期疾病(例如癌症)的发展。此延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和 /或所治疗的个体。对于本领域技术人员显而易见的是，足够或显著的延迟实际上可 以涵盖预防，因为个体不会患上疾病。例如，可能延迟晚期癌症，如转移的发展。
如本文所用，“预防”包括提供关于受试者的疾病的发生或复发的预防，所述 受试者可能易患所述疾病但尚未被诊断患有所述疾病。在一些实施方案中，所提供的 细胞和组合物用于延迟疾病的发展或延缓疾病的进展。
如本文所用，“抑制”功能或活性是当与除了感兴趣的条件或参数以外的原本 相同的条件相比时，或者与另一种条件相比时，减少功能或活性。例如，与不存在所 述细胞的情况下的肿瘤生长速率相比，抑制肿瘤生长的细胞降低了肿瘤的生长速率。
用于过继细胞疗法的细胞的给予方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物一起使用。例如，过继T细胞治疗方法描述于例如Gruenberg等人的美国专利申请 公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat RevClinOncol.8(10):577-85。参见例如Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933； Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
所治疗的疾病可以是任何疾病，其中抗原的表达与疾病状况或障碍的病因学相关和/或参与其中，例如导致、加剧这种疾病、病症或障碍或以其他方式参与其中。 示例性疾病和病症可以包括与恶性肿瘤或细胞转化(例如癌症)、自身免疫性疾病或炎 性疾病或例如由细菌、病毒或其他病原体引起的感染性疾病相关的疾病。上文描述了 示例性抗原，其包括与可以治疗的各种疾病和病症相关的抗原。在具体实施方案中， 所述嵌合抗原受体或转基因TCR与和所述疾病相关的抗原特异性结合。
细胞和组合物可以使用标准给予技术、配制品和/或装置来给予。细胞给予可以是自体的或异源的，例如同种异体的。例如，免疫应答细胞或祖细胞可以获得自一名 受试者，并且给予至同一受试者或不同的相容受试者。外周血源免疫应答细胞或其后 代(例如，体内、离体或体外衍生的)可以通过局部注射给予，包括导管给予、全身注 射、局部注射、静脉内注射或肠胃外给予。在给予治疗性组合物(例如，含有遗传修 饰的免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬 浮液、乳液)。
在一些实施方案中，细胞疗法(例如过继细胞疗法，例如过继T细胞疗法)是通过自体转移来进行，其中从要接受细胞疗法的受试者或从源自这个受试者的样品分离和 /或以其他方式制备细胞。因此，在一些方面，细胞源自需要治疗的受试者(例如，患 者)和细胞，并且在分离和处理后，将细胞给予至同一受试者。
所述细胞可以通过任何合适的方式给予，例如通过推注输注，通过注射例如静 脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、 巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下 (subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下(sub-Tenon)注射、球后注射、球周注射或 后近巩膜(posteriorjuxtascleral)递送。在一些实施方案中，它们通过肠胃外、肺内 和鼻内给予以及(如果需要用于局部治疗的话)病灶内给予。肠胃外输注包括肌内、静 脉内、动脉内、腹膜内或皮下给予。在一些实施方案中，给定剂量是通过细胞的单次 推注给予、通过细胞的多次推注给予(例如，在不超过3天的时间段内)、或通过细胞 的连续输注给予来给予。
A.剂量和给药
细胞或组合物是以一定剂量给予，以在体内产生治疗有效量的表达重组受体(例如CAR)的细胞，用于治疗疾病。对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可能取决于待 治疗的疾病类型、细胞或重组受体的类型、组合中其他药物或药剂的给予(如加强、 扩大或增强细胞扩增的那些)、疾病的严重程度和病程、给予细胞用于预防性目的还 是或治疗性目的、先前的治疗、受试者的临床病史和对细胞的反应以及主治医师的决 断。在一些实施方案中，所述组合物和细胞适合一次或在一系列治疗中给予受试者。
在给药的情况下，药剂(例如药物配制品、细胞或组合物)的“有效量”是指在必 要的剂量/量下和必要的时间段内有效实现所需结果(例如治疗或预防结果)的量。
药剂(例如药物配制品或细胞)的“治疗有效量”是指在必要的剂量下和必要的时间段内有效实现所需治疗结果(如针对治疗疾病、病症或障碍)和/或治疗的药代动力学 或药效动力学作用的量。治疗有效量可以根据多种因素而变，所述因素例如受试者的 疾病状态、年龄、性别和体重，以及所给予的细胞群，和组合(例如同时)给予的其他 药物或药剂。
“预防有效量”是指在必要的剂量下和必要的时间段内有效实现所需预防结果 的量。通常但不是必要地，因为在疾病之前或疾病的早期阶段在受试者中使用预防剂 量，所以预防有效量将小于治疗有效量。
在一些实施方案中，细胞或组合物是以有效治疗或预防疾病的量例如治疗有效量或预防有效量来给予。因此，在一些实施方案中，给予方法包括以有效量给予细胞 和组合物。在一些实施方案中，通过定期评估所治疗的受试者来监测治疗或预防功效。 对于数天或更长时间的重复给予，取决于病症，重复所述治疗直至出现所需疾病症状 的抑制。然而，其他剂量方案可能是有用的并且可以被确定。
在一些实施方案中，将治疗有效量的细胞给予至受试者。在一些实施方案中， 例如在其中在用于细胞的体内扩增的条件下给予细胞的某些情况下，将次最佳剂量的 细胞给予至受试者。
在过继细胞疗法的背景下，给定“剂量”的细胞的给予包括以单一组合物和/或 单次不间断给药的方式(例如以单次注射或连续输注的方式)给予给定量或数量的细 胞，并且还包括在例如不超过3天的指定时间段内以在多个单独组合物或输注中提供 的分割剂量或多个组合物的方式给予给定量或数量的细胞。因此，在一些情况下，剂 量是指定数量的细胞的单次或连续给药，在单个时间点给予或开始。然而，在一些情 况下，剂量在不超过三天的时间段内以多次注射或输注的方式给予，如每天一次持续 三天或两天或者通过在一天的时间内多次输注。
因此，在一些方面，所述剂量的细胞以单一药物组合物给予。在一些实施方案 中，所述剂量的细胞以共同含有所述剂量的细胞的多种组合物给予。
术语“分割剂量”是指分割的剂量，使其在超过一天的时间内给予。这种类型 的给药包括在本方法中并且被认为是单一剂量。在一些实施方案中，分割剂量的细胞 在不超过三天的时间段内以共同包含剂量的细胞的多种组合物来给予。
因此，细胞的剂量可以作为分割剂量给予，例如随时间给予的分割剂量。例如， 在一些实施方案中，剂量可以在2天或3天内给予受试者。用于分割给药的示例性方法 包括在第一天给予25％的剂量并在第二天给予剩余的75％的剂量。在其他实施方案 中，可以在第一天给予33％的剂量，并且在第二天给予剩余的67％。在一些方面，在 第一天给予10％的剂__量，在第二天给予30％的剂量，并且在第三天给予60％的剂量。 在一些实施方案中，分割剂量不超过3天。
在一些实施方案中，所述剂量的细胞可以通过给予多个组合物或溶液(例如第一和第二，任选地更多)来给予，各自含有所述剂量的一些细胞。在一些方面，任选地 在一定时间段内，分开地或独立地给予多个组合物，每个组合物含有不同细胞群和/ 或细胞亚型。例如，细胞群或细胞亚型可以分别包括CD8+和CD4+T细胞，和/或分别 包含富集CD8+和CD4+的群体，例如CD4+和/或CD8+T细胞，其各自单独地包括基因 工程化以表达重组受体的细胞。在一些实施方案中，所述剂量的给予包括给予第一组 合物，其包含一定剂量的CD8+T细胞或一定剂量的CD4+T细胞，以及给予第二组合物， 其包含另一剂量的CD4+T细胞和CD8+T细胞。
在一些实施方案中，组合物或剂量的给予(例如多个细胞组合物的给予)涉及分开给予所述细胞组合物。在一些方面，分开给予是同时或以任何顺序依次进行。在一些 实施方案中，所述剂量包括第一组合物和第二组合物，并且所述第一组合物和第二组 合物的给予相隔0至12小时，相隔0至6小时或相隔0至2小时。在一些实施方案中，第 一组合物的给予的启动和第二组合物的给予的启动相隔不超过2小时、不超过1小时或 不超过30分钟，相隔不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟。在一些实施方案 中，第一组合物的给予的启动和/或完成以及第二组合物的给予的完成和/或启动相隔 不超过2小时、不超过1小时或不超过30分钟，相隔不超过15分钟、不超过10分钟或不 超过5分钟。
在一些组合物中，第一组合物(例如所述剂量的第一组合物)包含CD4+T细胞。在一些组合物中，第一组合物(例如所述剂量的第一组合物)包含CD8+T细胞。在一些实 施方案中，第一组合物是在第二组合物之前给予。
在一些实施方案中，细胞的剂量或组合物包括表达重组受体的CD4+细胞与表达重组受体的CD8+细胞和/或CD4+细胞与CD8+细胞的定义的或目标比率，所述比率任 选地为约1:1，或者在大约1:3与大约3:1之间，例如大约1:1。在一些方面，具有目标或 所需比率的不同细胞群(例如CD4+:CD8+比率或CAR+CD4+:CAR+CD8+比率，例如1:1) 的组合物或剂量的给予涉及给予含有一个所述群体的细胞组合物，和随后给予包含另 一所述群体的单独细胞组合物，其中所述给予是以或大约以目标或所需比率来进行。 在一些方面，定义比率的细胞的剂量或组合物的给予导致改善T细胞疗法的扩增、持 久性和/或抗肿瘤活性。
在一些实施方案中，受试者接受细胞的多个剂量，例如，两个或更多个剂量或 多个连续剂量。在一些实施方案中，向受试者给予两个剂量。在一些实施方案中，受 试者接受连续剂量，例如，第二剂量是在第一剂量后约4天、5天、6天、7天、8天、9 天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或21 天给予。在一些实施方案中，在第一剂量后给予多个连续剂量，使得在给予所述连续 剂量后给予另外一个或多个剂量。在一些方面，在另外的剂量中给予至受试者的细胞 数量与第一剂量和/或连续剂量相同或相似。在一些实施方案中，另外一个或多个剂 量大于先前剂量。
在一些方面，第一和/或连续剂量的大小是基于一个或多个标准来确定，例如受试者对先前治疗(例如，化疗)的反应、受试者的疾病负担(例如肿瘤负担、主体、大小 或程度)、转移的程度或类型、阶段和/或受试者发生毒性结果(例如CRS、巨噬细胞激 活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所给予的细胞和/或重组受体的宿主 免疫应答)的可能性或发生率。在一些方面，使用第一剂量与使用连续剂量之间的时 间为约9至约35天、约14至约28天或15至27天。在一些实施方案中，给予连续剂量是 在使用第一剂量后大于约14天且小于约28天的时间点。在一些方面，第一剂量与连续 剂量之间的时间为约21天。在一些实施方案中，在给予连续剂量后给予另外一个或多 个剂量(例如连续剂量)。在一些方面，在给予先前剂量后至少约14天且小于约28天给 予另外一个或多个连续剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后少于约14天(例如在 先前剂量后4、5、6、7、8、9、10、11、12或13天)给予另外的剂量。在一些实施方 案中，在先前剂量后小于约14天不给予剂量，和/或在先前剂量后超过约28天不给予 剂量。
在一些实施方案中，细胞(例如重组受体表达细胞)的剂量包含两个剂量(例如，双倍剂量)，包含T细胞的第一剂量和T细胞的连续剂量，其中第一剂量和第二剂量中 的一个或两个包含给予T细胞的分割剂量。
在一些实施方案中，所述剂细胞通常足够大以有效减轻疾病负荷。
在一些实施方案中，细胞以所需剂量给予，所述所需剂量在一些方面包括所需 剂量或数量的细胞或一种或多种细胞类型和/或所需比率的细胞类型。因此，在一些 实施方案中，细胞剂量基于细胞总数(或每kg体重的细胞数量)和所需的单独群体或亚 型的比率，如CD4+与CD8+的比率。在一些实施方案中，细胞剂量基于所需的单独群 体中的细胞或单独细胞类型的总数(或每kg体重的细胞数量)。在一些实施方案中，剂 量基于这种特征的组合，如所需的总细胞数量、所需比率和所需的单独群体中的细胞 总数。
在一些实施方案中，以所需剂量的总细胞(如期望剂量的T细胞)的耐受差异或在所述耐受差异之内给予细胞的群体或亚型如CD8+和CD4+T细胞。在一些方面，所需 剂量是所需细胞数量或被给予所述细胞的受试者的每单位体重的所需细胞数量(例 如，细胞/kg)。在一些方面，所需剂量等于或高于最小细胞数量或每单位体重的最小 细胞数量。在一些方面，在以所需剂量给予的总细胞中，单独群体或亚型以等于或接 近所需输出比率(如CD4+与CD8+比率)存在，例如在这种比率的一定耐受差异或误差 内。
在一些实施方案中，细胞以所需剂量的一种或多种单独细胞群体或亚型的耐受差异或在所述耐受差异之内给予，如所需剂量的CD4+细胞和/或所需剂量的CD8+细 胞。在一些方面，所需剂量是所需的亚型或群体的细胞数量或所需的被给予所述细胞 的受试者的每单位体重的此类细胞数量(例如，细胞/kg)。在一些方面，所需剂量等于 或高于最小的群体或亚型的细胞数量或每单位体重的最小的群体或亚型的细胞数量。
因此，在一些实施方案中，剂量基于所需的总细胞的固定剂量和所需比率，和 /或基于所需的一种或多种单独亚型或亚群(例如，各自)的固定剂量。因此，在一些实 施方案中，剂量基于所需的T细胞的固定或最小剂量和所需的CD4+与CD8+细胞的比 率，和/或基于所需的CD4+和/或CD8+细胞的固定或最小剂量。
在一些实施方案中，细胞在多种细胞群或亚型(如CD4+和CD8+细胞或亚型)的所需输出比率的耐受范围下或耐受范围内给予。在一些方面，所需比率可以是特定比率 或可以是一系列比率。例如，在一些实施方案中，CD4+与CD8+细胞的比率在1:5和 5:1之间，或在1:3和3:1之间，如在2:1和1:5之间在一些方面，耐受差异在所需比率的 约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、 约35％、约40％、约45％、约50％，包括这些范围之间的任何值。
在具体实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指表达重组受体(例如，CAR)的细 胞的数量。在其他实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指给予的所有细胞、T细胞或 外周血单核细胞(PBMC)的数量或浓度。
在一些方面，剂量的大小基于一个或多个标准来确定，如受试者对现有治疗例 如化学疗法的反应、受试者的疾病负荷如肿瘤负担、体积、尺寸或程度、转移的程度 或类型、分期和/或受试者发生毒性结果的可能性或发生率，例如CRS、巨噬细胞激活 综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所给予的细胞和/或重组受体的宿主免 疫应答。
在一些实施方案中，所述方法还包括给予一个或多个另外的剂量的表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞和/或淋巴细胞清除疗法，和/或重复所述方法的一个或多个步骤。 在一些实施方案中，所述一个或多个另外的剂量与初始剂量相同。在一些实施方案中， 所述一个或多个另外的剂量不同于初始剂量，例如更高如比初始剂量高2倍、3倍、4 倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多倍，或者更低如比初始剂量低2倍、3倍、 4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多倍。在一些实施方案中，一个或多个另 外的剂量的给予基于以下各项来确定，如受试者对初始治疗或任何现有治疗的反应、 受试者的疾病负荷如肿瘤负担、体积、尺寸或程度、转移的程度或类型、分期和/或 受试者发生毒性结果的可能性或发生率，例如CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解 综合征、神经毒性和/或针对所给予的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答。
在一些实施方案中，可以给予相对较低剂量的细胞，例如次最佳剂量的细胞或 低于治疗有效量的剂量的细胞，其在体内刺激(例如通过内源性抗原或外源性药剂)时 可以导致受试者中存在的工程化细胞的数量的加强(例如增加或扩增)。在任何此类实 施方案中，细胞的扩增和/或激活可以与在体内暴露于抗原一起发生，例如，在给予 细胞后，受试者体内工程化细胞的扩增。在一些实施方案中，体内扩增的范围、程度 或量值可以通过多种方法来扩大、加强或增强，所述方法能够调节(例如增加)所给予 细胞(例如表达重组受体的细胞)的扩增、增殖、存活和/或功效。
一旦将细胞给予至受试者(例如人)，在一些方面通过许多已知方法中的任何一种来测量细胞群的生物活性。要评价的参数包括细胞与抗原的特异性结合，在体内例如 通过成像来评价，或离体例如通过ELISA或流式细胞术来评价。在某些实施方案中， 细胞破坏靶细胞的能力可以使用本领域已知的任何合适的方法来测量，所述方法例如 描述于例如以下文献中的细胞毒性测定：Kochenderfer等 人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方案中，还可以通过测定某些细胞因子如 CD107a、IFNγ、IL-2和TNF的表达和/或分泌来测量细胞的生物活性。在一些方面， 通过评估临床结果(如肿瘤负荷或负担的减少)来测量生物活性。在一些方面，评估毒 性结果、细胞的持久性和/或扩增和/或宿主免疫应答的存在或不存在。
B.组合物和配制品
在一些实施方案中，以组合物或配制品例如药物组合物或配制品的方式提供包含用重组抗原受体例如CAR或TCR工程化的细胞的所述剂细胞。此类组合物可以根据 所提供的方法和/或与所提供的制品或组合物一起使用，例如用于预防或治疗疾病、 病症和障碍，或用于检测、诊断和预后方法。
术语“药物配制品”是指这样的制剂，其处于使得其中所含活性成分的生物活 性有效的形式，并且不含对给予配制品的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分以外的对受试者无毒 的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面，载体的选择部分地由特定细胞或药剂和/或通过给药方法确定。因此，存在多种合适的配制品。例如，所述药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂 可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些 方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。所述防腐剂或其混合物通常以按总组合物 的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)中。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通 常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸； 抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲 氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯 甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)； 低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水 性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、 精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合 剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠； 金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，缓冲剂被包括在所述组合物中。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、 柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂 的混合物。所述缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量 存在。用于制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例 如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；21st ed.(2005年5月1日)中。
配制品或组合物还可含有多于一种活性成分，其可用于用细胞或药剂预防或治疗的特定适应症、疾病，其中各自的活性不会相互产生不利影响。此类活性成分以有 效用于既定目的的量以合适的方式组合存在。因此，在一些实施方案中，药物组合物 进一步包含其他药物活性剂或药物如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、 顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利 妥昔单抗、长春碱、长春新碱等。在一些实施方案中，所述药剂或细胞以盐(例如药 学上可接受的盐)的形式给予。合适的药学上可接受的酸加成盐包括源自无机酸(如盐 酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸，硝酸和硫酸)和有机酸(如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果 酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸和芳基磺酸，例如对甲苯磺 酸)的那些盐。
在一些实施方案中，药物组合物含有有效治疗或预防疾病的量(如治疗有效量或预防有效量)的药剂或细胞。在一些实施方案中，通过定期评估所治疗的受试者来监 测治疗或预防功效。对于数天或更长时间的重复给予，取决于病症，重复所述治疗直 至出现所需疾病症状的抑制。然而，其他剂量方案可能是有用的并且可以被确定。所 需剂量可以通过单次推注给予所述组合物、通过多次推注给予所述组合物或通过连续 输注给予所述组合物来递送。
所述药剂或细胞可以通过任何合适的方式给予，例如通过推注输注，通过注射 例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中 隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下注射、眼球筋膜囊下注射、 球后注射、球周注射或后近巩膜递送。在一些实施方案中，它们通过肠胃外、肺内和 鼻内给予以及(如果需要用于局部治疗的话)病灶内给予。肠胃外输注包括肌内、静脉 内、动脉内、腹膜内或皮下给予。在一些实施方案中，给定剂量通过细胞或药剂的单 次推注给药来给予。在一些实施方案中，给定剂量是通过例如在不超过3天的时间段 内对细胞或药剂的多次推注给予或通过细胞或药剂的连续输注给予来给予。
对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可取决于待治疗的疾病类型、一种或多种 药剂的类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、给予药剂或细胞用于 预防性目的还是治疗性目的、先前疗法、受试者的临床病史和对药剂或细胞的反应、 以及主治医师的决断。在一些实施方案中，所述组合物适合一次或在一系列治疗中给 予受试者。
可以使用标准给药技术、配制品和/或设备给予细胞或药剂。提供了用于储存和给予所述组合物的配制品和装置(如注射器和小瓶)。关于细胞，给药可以是自体的或 异源的。例如，免疫应答细胞或祖细胞可以获得自一名受试者，并且给予至同一受试 者或不同的相容受试者。外周血衍生的免疫应答细胞或其后代(例如，体内、离体或 体外衍生的)可以经由局部注射给予，包括导管给药、全身注射、局部注射、静脉内 注射或肠胃外给药。当给予治疗性组合物(例如，含有基因修饰的免疫应答细胞或治 疗或改善神经毒性症状的药剂的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形 式(溶液、悬浮液、乳液)。
配制品包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、透皮、肌内、鼻内、经 颊、舌下或栓剂给予的那些。在一些实施方案中，肠胃外给予药剂或细胞群。如本文 所用术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内给予。在一些实 施方案中，使用通过静脉内、腹膜内或皮下注射的外周全身递送向受试者给予药剂或 细胞群。
在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、 乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面可以缓冲至选择的pH。液体制剂一般比 凝胶、其他粘性组合物和固体组合物制备起来更容易。另外地，液体组合物稍微更方 便给予，特别是通过注射。在另一方面，粘性组合物可以配制在适当的粘度范围内， 以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，其可以是溶 剂或分散介质，其含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二 醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
无菌可注射溶液可以通过将所述药剂或细胞掺入溶剂中来制备，如具有合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)的混合物中。
用于体内给予的配制品通常是无菌的。可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌。能够扩大、加强或增强所给予细胞(例如重组受体表达细胞)的扩增、增殖、 存活和/或功效的药物或药剂组合给予(例如同时或依次给予)的方法。在一些实施方案 中，此类药剂是与另一药剂(例如药物)同时或以任何顺序依次给予。在一些实施方案 中，所述药剂是在给予细胞(例如表达重组受体(例如CAR)的细胞)之前、期间、在过 程中或之后给予。在一些实施方案中，此类药剂包括由于特异性调节转基因(例如编 码重组受体的转基因)而特异性扩大、加强或增强工程化细胞的扩增、增殖、存活和/ 或功效的药剂。在一些实施方案中，此类药剂包括调节所给予细胞(例如免疫细胞， 例如T细胞)的细胞扩增和/或活性的药剂。
在一些实施方案中，所给予的细胞(例如工程化以表达重组受体的细胞)被修饰以扩大、加强或增强所给予细胞的扩增、增殖、存活和/或功效。在一些实施方案中， 所给予的细胞(例如，工程化以表达重组受体的细胞)被修饰，使得可以例如通过给予 药剂来调节和/或控制工程化细胞的扩增、增殖、存活和/或功效。
在一些实施方案中，所述方法包括减少、抑制和/或最小化抑制因子在体内抑制工程化细胞的增殖、扩增和/或存活的效应的体内步骤。在一些实施方案中，所述方 法包括促进、支持和/或增强工程化细胞在体内的增殖、扩增和/或存活的体内步骤。
在一些实施方案中，另外的药剂是小分子、肽、多肽、抗体或其抗原结合片段、 抗体模拟物、适体或核酸分子(例如siRNA)、脂质、多糖或其任一组合。在一些实施 方案中，另外的药剂是特定因子、分子、受体、功能和/或酶的抑制剂或激活剂。在 一些实施方案中，另外的药剂是特定因子、分子、受体、功能和/或酶的激动剂或拮 抗剂。在一些实施方案中，另外的药剂是一种或多种因子和/或代谢物的类似物或衍 生物。在一些实施方案中，另外的药剂是蛋白质或多肽。在一些实施方案中，另外的 药剂是细胞，例如工程化细胞。
1.用于转基因特异性扩增的药剂
在一些实施方案中，所述方法包括例如在组合疗法中给予除了所给予细胞(例如工程化以表达重组受体的细胞)以外的药剂。在一些实施方案中，所述药剂由于特异 性调节转基因(例如编码重组受体的转基因)而特异性扩大、加强或增强工程化细胞的 扩增、增殖、存活和/或功效。在一些实施方案中，所述药剂特异性靶向转基因，例 如重组受体。在一些实施方案中，所述药剂特异性结合、激活和/或增强重组受体的 活性和/或由转基因编码的全部或部分重组分子的其他功能。在一些实施方案中，将 药剂与重组细胞组合给予可以增强、加强或扩大所给予细胞的增殖、扩增和/或存活， 例如，增强细胞的体内扩增。
在一些实施方案中，用于转基因特异性扩增的示例性方法或药剂包括内源性抗原暴露、疫苗接种、抗独特型抗体或其抗原结合片段和/或可调节的重组受体。例如， 在一些实施方案中，用于转基因特异性扩增的方法包括疫苗接种方法。在一些实施方 案中，所述药剂是肽疫苗或基于细胞的疫苗，例如，工程化以表达由重组受体识别的 特定抗原的细胞(参见，例如，WO 2016/069647、WO 2011/066048、US 2016/0304624、 美国专利号9,476,028以及Hailemichael和Overwijk，Int J Biochem Cell Biol.(2014)53:46-50)。在一些实施方案中，用于转基因特异性扩增的方法包括给予抗 独特型抗体。抗独特型抗体(包括其抗原结合片段)特异性地识别、特异性地靶向和/ 或特异性地结合至抗体或其抗原结合片段(例如重组受体(如嵌合抗原受体(CAR))的 抗原结合结构域)的独特位。独特位是抗体可变部分内的任何单一抗原决定簇或表位。 在一些实施方案中，抗独特型抗体或其抗原结合片段是激动剂和/或展现刺激细胞表 达特定抗体的特异性活性，所述特定抗体包括含有所述抗体或其抗原结合片段的缀合 物或重组受体(参见，例如，美国专利公开号US 2016/0096902；US2016/0068601；US 2014/0322183；US 2015/0175711；US 2015/283178；美国专利号9,102,760；Jena等 人PloS one(2013)8(3):e57838；Long等人,Nature Medicine(2015)21(6):581-590；Lee等 人,The Lancet(2015)385(9967):517-528；Zhao等人,PloSOne(2014)9
(5):e96697；Leung等人,MAbs.(2015)7(1):66-76)。
2.调节细胞扩增或活性的药剂
在一些实施方案中，所述方法包括对免疫细胞或免疫功能(通常包括所给予的工程化细胞)的扩增、增殖、存活和/或活性的调节。在一些实施方案中，所述方法包括 通常是免疫刺激性或通常促进、增强、扩大和/或加强免疫细胞(包括所给予的细胞) 在体内(例如在受试者体内)的扩增、增殖、存活和/或活性的步骤。在一些实施方案中， 所述药剂可以减少、抑制和/或最小化抑制因子在体内抑制免疫细胞(例如所给予细胞) 的增殖、扩增和/或存活的效应。
a.负调节物的抑制
在一些实施方案中，所述方法包括调节工程化细胞的扩增，例如，通过抑制所 给予细胞(例如工程化免疫细胞)的增殖、扩增和/或激活的负调节物。在受试者体内的 特定环境中，所给予的表达重组受体的细胞可能遇到压抑或抑制细胞生长、增殖、扩 增和/或存活的环境，例如免疫抑制环境。例如，免疫抑制环境可以含有免疫抑制性 细胞因子、调节性调节剂和共抑制受体。在一些实施方案中，另外的药剂可以用于调 节所给予细胞的扩增，例如克服抑制环境。
在一些实施方案中，另外的药剂包括免疫调节剂、免疫检查点抑制剂、代谢途 径调节剂、腺苷途径或腺苷受体拮抗剂或激动剂以及信号传导途径的调节剂(例如激 酶抑制剂)。
在一些实施方案中，另外的药剂是免疫调节剂，例如免疫检查点抑制剂。在一 些实例中，另外的药剂增加、增强或扩大所给予细胞的扩增和/或增殖，从而通过阻 断免疫检查点蛋白(即免疫检查点抑制剂)来增加、增强或扩大免疫应答。在一些实施 方案中，另外的药剂是增强工程化细胞(例如重组受体表达细胞)的活性的药剂，是抑 制免疫抑制分子或免疫检查点分子的分子。免疫抑制分子的例子包括PD-1、PD-L1、 CTLA4、TEVI3、CEACAM(例如、CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、 VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂可以是针对免疫检查点蛋白的抗体，例 如针对细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4或CD152)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程 序性细胞死亡蛋白1配体1(PD-L1)的抗体(参见，例如，Pardoll,Nat Rev Cancer.2012 年3月22日；12(4):252-264)。
在一些实施方案中，所述方法包括使表达重组受体的细胞与抑制抑制性细胞表面受体(例如转化生长因子β受体(TGFβR))的药剂接触。在一些实施方案中，所给予 的细胞(例如重组受体表达细胞)可以被工程化以抵抗可以抑制其效应子功能的免疫 抑制性细胞因子的效应(参见，例如，Foster等人,J Immunother.(2008)31:500-505； Bollard等人,Molecular Therapy.(2012)20:S22；Bendle等 人,J.Immunol.(2013)191(6):3232-3239)。在一些实施方案中，另外的药剂是抗TGFβ 抗体或抗TGFβR抗体(参见，例如，WO 2011/109789)。
在一些实施方案中，另外的药剂调节免疫抑制因子(例如腺苷)的代谢、信号传导和/或转运。在一些实施方案中，另外的药剂是细胞外腺苷或腺苷受体的抑制剂，或 引起细胞外腺苷水平降低或减小的药剂，例如防止细胞外腺苷形成、降解细胞外腺苷， 使细胞外腺苷失活和/或减少细胞外腺苷的药剂。在一些实施方案中，另外的药剂是 腺苷受体拮抗剂，例如A2a、A2b和/或A3受体。
在一些实施方案中，另外的药剂是腺苷水平和/或腺苷途径组分的调节剂。腺苷可以在体内起免疫调节剂的功能。例如，腺苷和一些非选择性激活腺苷受体亚型的腺 苷类似物减少炎症氧化产物的嗜中性粒细胞产生(Cronstein等 人,Ann.N.Y.Acad.Sci.451:291,1985；Roberts等人,Biochem.J.,227:669,1985；Schrier 等人,J.Immunol.137:3284,1986；Cronstein等人,Clinical Immunol.Immunopath.42:76,1987)。在一些情况下，细胞外腺苷或腺苷类似物的浓度 可以在特定环境(例如肿瘤微环境(TME))中增加。在一些情况下，腺苷或腺苷类似物 信号传导取决于缺氧或在缺氧或其调节中所涉及的因子，例如缺氧诱导型因子(HIF)。 在一些实施方案中，腺苷信号传导的增加可以增加细胞内cAMP和cAMP依赖性蛋白激 酶，其导致抑制促炎性细胞因子产生，并且可以导致免疫抑制分子的合成和Treg的发 展(Sitkovsky等人,Cancer Immunol Res(2014)2(7):598-605)。在一些实施方案中，另外 的药剂可以降低或逆转腺苷、腺苷类似物和/或腺苷信号传导的免疫抑制效应。在一 些实施方案中，另外的药剂可以减少或逆转缺氧驱动的A2-腺苷酸能T细胞免疫抑制。在一些实施方案中，另外的药剂选自腺苷受体的拮抗剂、细胞外腺苷降解剂、 CD39/CD73胞外酶产生腺苷的抑制剂和缺氧-HIF-1α信号传导的抑制剂。在一些实施 方案中，另外的药剂是腺苷受体拮抗剂或激动剂。
通过细胞外腺苷的抑制剂(例如防止细胞外腺苷形成、降解细胞外腺苷、使细胞外腺苷失活和/或减少细胞外腺苷的药剂)和/或腺苷受体抑制剂(例如腺苷受体拮抗剂)可以增强免疫应答，如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、树突细胞，T细胞和/或B 细胞介导的应答。此外，Gs蛋白介导的cAMP依赖性细胞内途径的抑制剂和腺苷受体 触发的Gi蛋白介导的细胞内途径的抑制剂也可以增加急性和慢性炎症。
在一些实施方案中，另外的药剂是腺苷受体拮抗剂或激动剂，例如腺苷受体A2a、A2b、A1和A3中的一种或多种的拮抗剂或激动剂。分别地，A1和A3抑制腺苷酸环化 酶活性，并且A2a和A2b刺激腺苷酸环化酶活性。某些腺苷受体(如A2a、A2b和A3)可 以在炎症期间抑制或降低免疫应答。因此，拮抗免疫抑制性腺苷受体可以扩大、加强 或增强免疫应答，例如来自所给予细胞(例如表达CAR的T细胞)的免疫应答。在一些 实施方案中，另外的药剂抑制细胞外腺苷的产生和腺苷通过腺苷受体触发的信号传 导。例如，通过抑制或减少产生腺苷的局部组织缺氧；通过降解(或使其失活)所积累 的细胞外腺苷；通过防止或减少免疫细胞上腺苷受体的表达；和/或通过抑制/拮抗腺 苷配体通过腺苷受体的信号传导，可以增强免疫应答、局部组织炎症和靶向组织破坏 的增强。
拮抗剂是倾向于消除另一种物质的作用的任何物质，其作为结合至细胞受体而不引发生物学反应的药剂。在一些实施方案中，拮抗剂是化学化合物，其是腺苷受体 (如A2a、A2b或A3受体)的拮抗剂。在一些实施方案中，拮抗剂是肽或拟肽，其结合 腺苷受体，但不会触发G1蛋白依赖性细胞内途径。示例性腺苷受体拮抗剂描述于以 下文献中：美国专利号5,565,566；5,545,627、5,981,524；5861405；6066642；6326390； 5670501；6117998；6,232,
297；5786360；5424297；6,313,131；5,504,090；和6,322,771；以及Jacobson 和Gao,Nat RevDrug Discov.(2006)5(3):247-264。
b.免疫刺激的促进
在一些实施方案中，所述方法包括给予具有免疫刺激性的另外的药剂。在一些 实施方案中，另外的药剂通常可以促进免疫细胞的增殖、扩增、存活和/或功效。在 一些实施方案中，另外的药剂可以特异性地促进所给予细胞，例如重组受体表达细胞。 在一些实施方案中，另外的药剂是细胞因子。在一些实施方案中，另外的药剂是配体。
在一些实施方案中，另外的药剂是免疫刺激性配体，例如CD40L。在一些实施 方案中，另外的药剂是细胞因子，例如IL-2、IL-3、IL-6、IL-11、IL-7、IL-12、IL-15、 IL-21、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、α、β或γ干扰素(IFN)和促红细胞 生成素(EPO)。
3.淋巴细胞清除疗法
在一些方面，所提供的方法可以还包括，例如在启动细胞(例如重组受体表达细胞)的给予之前或同时，给予一种或多种淋巴细胞清除疗法。在一些实施方案中，淋 巴细胞清除疗法包括给予磷酰胺，如环磷酰胺。在一些实施方案中，淋巴细胞清除疗 法可以包括给予氟达拉滨。在一些实施方案中，淋巴细胞清除疗法中不包括氟达拉滨。 在一些实施方案中，不给予淋巴细胞清除疗法。
用免疫清除(例如，淋巴细胞清除)疗法预处理受试者可以改善过继细胞疗法(ACT)的效果。用淋巴细胞清除剂(包括环孢霉素和氟达拉滨的组合)预处理已经有效 地改善转移的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在细胞疗法中的功效，包括改善转移细胞的应 答和/或持久性。参见例如Dudley等人,Science,298,850-54(2002)；Rosenberg等人,ClinCancerRes,17(13):4550-4557(2011)。同样，在CAR+T细胞的背景下，若干研究已经结 合淋巴细胞清除剂，最常见地为环磷酰胺、氟达拉滨、苯达莫司汀、或其组合，有时 伴有低剂量放射。参见Han等人Journal of Hematology&Oncology,6:47(2013)； Kochenderfer等人,Blood,119:2709-2720(2012)；Kalos等人,Sci Transl Med,3(95):95ra73(2011)；临床试验研究记录号：NCT02315612；NCT01822652。
可以进行这种预处理，目的是降低可能抑制所述疗法的功效的各种结果中的一种或多种的风险。这些结果包括被称为“细胞因子吸收”的现象，通过所述现象，T 细胞、B细胞、NK细胞与TIL竞争稳态的和激活的细胞因子，如IL-2、IL-7和/或IL-15； 通过调节性T细胞、NK细胞或免疫系统的其他细胞抑制TIL；负调节物对肿瘤微环境 的影响。Muranski等人,NatClin Pract Oncol.12月；3(12):668-681(2006)。
因此，在一些实施方案中，提供的方法还涉及向受试者给予淋巴细胞清除疗法。在一些实施方案中，所述方法涉及在给予细胞剂量之前，向受试者给予淋巴细胞清除 疗法。在一些实施方案中，淋巴细胞清除疗法含有化学治疗剂，如氟达拉滨和/或环 磷酰胺。在一些实施方案中，所述细胞和/或淋巴细胞清除疗法的给予经由门诊递送 进行。
在一些实施方案中，所述方法包括在给予细胞剂量之前向受试者给予预处理剂如淋巴细胞清除剂或化学治疗剂，如环磷酰胺、氟达拉滨或其组合。例如，可以在第 一或后续剂量之前至少2天如至少3、4、5、6或7天向所述受试者给予预处理剂。在一 些实施方案中，在给予细胞剂量之前不超过7天如不超过6天、5天、4天、3天或2天向 受试者给予预处理剂。
在一些实施方案中，将所述受试者用在或在约20mg/kg与100mg/kg之间、如在或在约40mg/kg与80mg/kg之间的剂量的环磷酰胺进行预处理。在一些方面，将所述受试 者用60mg/kg或约60mg/kg的环磷酰胺进行预处理。在一些实施方案中，可以将环磷酰 胺以单一剂量给予或者可以按多个剂量给予，如每天给药、每隔一天给药或每三天给 药。在一些实施方案中，环磷酰胺每天给予一次，持续一天或两天。在一些实施方案 中，如果淋巴细胞清除剂包含环磷酰胺，那么按以下剂量向受试者给予环磷酰胺：在 或在约100mg/m2与500mg/m2之间，例如在或在约200mg/m2与400mg/m2之间，或者 250mg/m2与350mg/m2之间，包含端值。在一些情况下，向所述受试者给予约300mg/m2 的环磷酰胺。在一些实施方案中，可以将环磷酰胺以单一剂量给予或者可以按多个剂 量给予，如每天给药、每隔一天给药或每三天给药。在一些实施方案中，每天给予环 磷酰胺，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情况下，在开始细胞疗法之前每天 向所述受试者给予约300mg/m2的环磷酰胺，持续3天。
在一些实施方案中，氟达拉滨可以按单一剂量给予或者可以按多个剂量给予， 如每天给药、每隔一天给药或每三天给药。在一些实施方案中，每天给予氟达拉滨， 如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情况下，在开始细胞疗法之前每天向所述受 试者给予约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。在一些实施方案中，环磷酰胺每天给予 一次，持续一天或两天。
在一些实施方案中，当淋巴细胞清除剂包含氟达拉滨时，向所述受试者给予剂 量在或在约1mg/m2与100mg/m2之间、如在或在约10mg/m2与75mg/m2之间、15mg/m2 与50mg/m2之间、20mg/m2与30mg/m2之间、或24mg/m2与26mg/m2之间的氟达拉滨。 在一些情况下，向所述受试者给予25mg/m2的氟达拉滨。在一些实施方案中，氟达拉 滨可以按单一剂量给予或者可以按多个剂量给予，如每天给药、每隔一天给药或每三 天给药。在一些实施方案中，每天给予氟达拉滨，如持续1-5天，例如持续3至5天。
在一些实施方案中，淋巴细胞清除剂包含药剂的组合，如环磷酰胺和氟达拉滨 的组合。因此，药剂的组合可包括任何剂量或给药时间表(如上述那些剂量或给药时 间表)下的环磷酰胺以及任何剂量或给药时间表(如上述那些剂量或给药时间表)下的 氟达拉滨。例如，在一些方面，在给予所述细胞剂量之前向所述受试者给予60mg/kg(约 2g/m2)的环磷酰胺和3至5剂量的25mg/m2氟达拉滨。
在一个示例性剂量方案中，在接受第一剂量之前，受试者接受环磷酰胺和氟达 拉滨(cy/flu)的淋巴细胞清除预处理化疗，其是在第一剂量的表达CAR的细胞之前至少 两天且通常在给予细胞之前不超过7天给予。在预处理治疗后，对受试者给予如上所 述的表达CAR的T细胞的剂量。
在一些实施方案中，在输注细胞剂量之前给予预处理剂改进了治疗的结果。例如，在一些方面，预处理改进了用剂量治疗的功效或增加了表达重组受体的细胞(例 如表达CAR的细胞，如表达CAR的T细胞)在受试者中的持久性。在一些实施方案中， 预处理治疗增加了无病生存率，例如存活的受试者的百分比，并在细胞剂量之后的给 定时间段后未展现出最小残留的或分子可检测的疾病。在一些实施方案中，增加了到 中值无病生存率的时间。
在将所述细胞给予受试者(例如人)后，在一些方面工程化细胞群的生物活性通过许多已知方法中的任何一种来测量。待评估的参数包括工程化或天然T细胞或其他免 疫细胞与抗原的特异性结合，其在体内例如通过成像进行评估，或离体例如通过 ELISA或流式细胞术进行评估。在某些实施方案中，可以使用本领域中已知的任何适 宜方法测量工程化细胞破坏靶细胞的能力，所述方法如以下文献中所述的细胞毒性测 定：例如，Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和Herman等 人,J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方案中，还可以通过测 定某些细胞因子如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF的表达和/或分泌来测量细胞的生物活 性。在一些方面，通过评估临床结果(如肿瘤负荷或负担的减少)来测量生物活性。在 一些方面，评估毒性结果、细胞的持久性和/或扩增和/或宿主免疫应答的存在或不存 在。
在一些实施方案中，在输注细胞剂量之前给予预处理剂改进了治疗的结果(例如通过改进用剂量治疗的功效)，或增加了表达重组受体的细胞(例如表达CAR的细胞， 如表达CAR的T细胞)在受试者中的持久性。
D.细胞的修饰
在某些实施方案中，细胞以任何数量的方式被修饰，使得增加其治疗或预防功 效和/或可以调节扩增、增殖、存活和/或功效。在一些实施方案中，细胞被修饰使得 在给予至受试者后可以在调节(例如增强、加强和/或扩大)扩增、增殖、存活和/或功 效。在一些实施方案中，细胞被修饰使得可以调节和/或控制转基因和/或免疫调节因 子的表达。在一些实施方案中，细胞被修饰以调节重组受体的特定组分的表达和/或 活性。在一些实施方案中，细胞被修饰以增加或减少药剂(例如，核酸，例如抑制性 核酸)的表达。在一些实施方案中，细胞被修饰以表达和/或分泌药剂。
在一些实施方案中，工程化细胞表达的工程化重组受体(例如CAR)可以直接或者通过接头间接缀合至靶向部分。将化合物如重组受体缀合至靶向部分的实践是本领域 中已知的。参见例如Wadwa等人,J.Drug Targeting 3:111(1995)、和美国专利 5,087,616。
1.抑制性核酸和基因改变
在一些实施方案中，所述方法包括通过使细胞与药剂接触来调节所给予的细胞，所述药剂减少所给予细胞(例如表达重组受体的工程化T细胞)的负调节物的表达或能 够实现所述表达减少。细胞的负调节物包括本文所述的任一种，例如免疫检查点抑制 剂、抑制性受体和/或腺苷调节剂。在一些实施方案中，减少负调节物的表达或能够 实现所述表达减少的药剂包括是或包含抑制性核酸分子(例如与编码负调节物的基因 或核酸互补、靶向、抑制和/或结合所述基因或核酸的核酸分子)的药剂。在一些实施 方案中，所述药剂是或包含复合物，所述复合物包含核糖核蛋白(RNP)复合物，所述 核糖核蛋白(RNP)复合物包括Cas9(例如在一些情况下酶促失活的Cas9)和靶向编码负 调节物的基因的gRNA。
在一些任何此类实施方案中，抑制性核酸分子包括RNA干扰剂。在一些任何此 类实施方案中，抑制性核酸是或含有或编码小干扰RNA(siRNA)、微小RNA适应的 shRNA、短发夹RNA(shRNA)、发夹siRNA、前体微小RNA(前miRNA)或微小 RNA(miRNA)。设计抑制性核酸和修饰细胞以表达抑制性核酸的方法是本领域已知的 (参见例如WO 2004/0455543和WO2004/048566)。
在一些实施方案中，使工程化细胞经历基因改变或基因编辑，其靶向编码参与 免疫调节、免疫细胞的负调节和/或免疫抑制的基因的基因座。在一些实施方案中， 基因编辑导致所靶向基因座处的插入或缺失，或所靶向基因座的“敲除”以及所编码 蛋白质的表达的消除。在一些实施方案中，基因编辑是通过使用CRISPR/Cas9系统进 行非同源末端接合(NHEJ)来实现的。在一些实施方案中，一种或多种引导RNA(gRNA) 分子可以与一种或多种Cas9核酸酶、Cas9切口酶、酶促失活的Cas9或其变体或工程化 的锌指或TALE系统一起使用。基因改变的方法是本领域已知的(参见，例如，WO 2015/161276；美国专利号6,140,081号；6,453,242；和6,534,261；WO 98/53058； WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536；WO03/016496和美国公开号 2011/0301073)。
2.修饰以表达另外的药剂
在一些实施方案中，所述细胞(例如，重组受体表达细胞)被进一步修饰以表达和/或分泌另外的药剂，所述另外的药剂促进、增强、加强和/或扩大所给予的细胞的增 殖、扩增、存活和/或功效。例如，重组受体表达细胞(例如表达CAR的细胞)可以进一 步工程化以表达和/或分泌另外的药剂，所述另外的药剂克服免疫抑制效应和/或增强 T细胞和重组受体的扩增和/或功能。在一些实施方案中，所述细胞可以工程化以表达 促进所给予细胞的扩增的细胞因子。在一些实施方案中，此类另外的药剂可以与诱导 型表达系统(例如诱导型启动子)可操作地连接。
在一些实施方案中，所给予的细胞可以被修饰以表达和/或分泌药剂，所述药剂抑制免疫抑制因子(例如本文所述的任一种)和/或刺激免疫刺激因子。在一些实施方案中，由给予的细胞表达的另外的药剂减少或防止所述细胞在肿瘤微环境中的免疫抑制 (参见，例如，美国专利公开号US 2016/0045551)。在一些实施方案中，由所给予的细 胞编码和/或分泌的另外的药剂可以包括本文所述的任何另外的药剂。
在一些实施方案中，由所给予的细胞编码的另外的药剂是可溶的并且被分泌。 在一些实施方案中，另外的药剂是可溶性scFv。在一些实施方案中，另外的药剂是细 胞因子。
3.重组受体的表达和/或活性的调节
在一些实施方案中，所述方法包括修饰细胞以允许重组受体(例如CAR)的可调节的表达和/或活性，从而通过重组受体调节信号。在一些实施方案中，可调节的表达 和/或活性是通过将重组受体配置成含有特定调节元件和/或系统(例如本文所述的任 一种)或受其控制来实现。在一些实施方案中，将工程化细胞给予至受试者体内和/或 暴露于特定配体可以调节重组受体(例如CAR)的表达和/或活性。在一些实施方案中， 重组受体的表达和/或活性的调节是通过给予可以调节重组受体(例如CAR)的表达的 另外的药剂来实现。在一些实施方案中，重组受体(例如CAR)的受调节的表达是通过 可调节的转录因子释放系统，或通过给予另外的药剂来实现，所述另外的药剂可以诱 导多肽(例如重组受体)的构象变化和/或多聚化。在一些实施方案中，另外的药剂是化 学诱导剂。
除非另外定义，否则本文使用的所有领域术语、符号和其他技术和科学术语或 命名旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的 含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的 含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域通常理解的实质 性差异。
如本文所用术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误 差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)针对所述值或参数本身的实 施方案。
如本文所用，受试者包括任何活的生物体，如人和其他哺乳动物。哺乳动物包 括但不限于人和非人动物，包括农场动物、运动动物、啮齿动物和宠物。
如本文所用，当提及一种或多种特定细胞类型或细胞群时，“耗尽”是指例如 与组合物中的细胞总数或组合物体积相比或者相对于其他细胞类型，如通过基于所述 群体或细胞表达的标记的阴性选择，或通过基于不存在于待耗尽的所述细胞群或细胞 上的标记的阳性选择来降低所述细胞类型或群体的数量或百分比。所述术语不要求从 组合物完全去除细胞、细胞类型或群体。
如本文所用，当提及一种或多种特定细胞类型或细胞群时，“富集”是指例如 与组合物中的细胞总数或组合物体积相比或者相对于其他细胞类型，如通过基于所述 群体或细胞表达的标记的阳性选择，或通过基于不存在于待耗尽的所述细胞群或细胞 上的标记的阴性选择来增加所述细胞类型或群体的数量或百分比。所述术语不需要从 组合物中完全去除其他细胞、细胞类型或群体，并且不需要如此富集的细胞在富集的 组合物中以等于或甚至接近100％存在。
如本文所用，细胞或细胞群针对特定标记是“阳性”或“+”的陈述是指，特定 标记(通常是表面标记)在细胞上或细胞中的可检测存在。当提及表面标记时，所述术 语是指如在一些实施方案中通过流式细胞术检测到的，表面表达的存在，例如通过用 与所述标记特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞 术以如下水平是可检测的，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹 配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上与已知对所述标记呈阳性 的细胞的水平相似，和/或所述水平基本上高于已知对所述标记呈阴性的细胞的水平。
如本文所用，细胞或细胞群对特定标记呈“阴性”的陈述是指特定标记(通常为 表面标记)在细胞上或细胞中不存在实质上可检测的存在。当提及表面标记时，所述 术语是指在一些实施方案中，如通过流式细胞术(例如通过用特异性地结合至所述标 记的抗体染色并检测所述抗体)检测到的表面表达的不存在，其中所述染色未通过流 式细胞术按以下水平检测到：显著高于在其他方面都相同的条件下用同种型匹配的对 照进行相同程序检测到的染色的水平，和/或显著低于已知对所述标记呈阳性的细胞 的水平，和/或如与已知对所
述标记呈阴性的细胞相比基本上类似的水平。
如本文所用，在关于氨基酸序列(参考多肽序列)使用时，“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同一性百分比”定义为，在比对序列并在必要时引入空位以实现最大 序列同一性百分比并且不将任何保守取代视作序列同一性的一部分之后，候选序列 (例如，Vpx或Vpr蛋白)中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分 比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域熟知的多种方式来实现， 例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或 Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包 括在所比较序列的全长中实现最大比对所需的任何算法。
氨基酸取代可以包括用另一种氨基酸替代多肽中的一个氨基酸。氨基酸通常可以根据以下常见的侧链特性进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守氨基酸取代将涉及将这些类别之一的成员与另一个类别交换。
如本文所用的术语“载体”是指能传播其所连接的另一核酸分子的核酸分子。 所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞基因组中 的载体。某些载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为 “表达载体”。载体包括病毒载体，例如逆转录病毒载体，例如慢病毒或γ逆转录病 毒载体，其具有携带另一种核酸并且能够插入宿主基因组中以供其繁殖的基因组。
如本文所用的，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。
如本文所用，术语“治疗”是指疾病，或与其相关的症状、不良反应或结果、 或表型的完全或部分减轻或减少。在某些实施方案中，效果是治疗性的，使得其部分 或完全治愈疾病或归因于其的不良症状。
如本文所用，化合物或组合物或组合的“治疗有效量”是指在必要的剂量下和 必要的时间段内有效实现所需治疗结果(如针对治疗疾病、病症或障碍)和/或治疗的药 代动力学或药效动力学作用的量。所述治疗有效量可以根据诸如疾病状态、受试者的 年龄、性别和体重以及给予的细胞群等因素而变化。
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本发明的优点：
本发明的目的在于提供一种制备CAR-T细胞的新方法，该方法CAR-T制备的时 间仅需1天左右，较CAR T细胞常规制备方法(约2周)，极大地缩短了体外培养时间 的同时，将能够更好地维持CAR-T细胞的memory表型，增强了CAR T细胞对肿瘤的 杀伤功能及其在体内的存活时间。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按 照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.慢病毒转导效率的评价
使用白细胞分离术从受试者采集富含白细胞的样品，使用Ficoll密度梯度离心法收集白膜层，获得纯度较高的外周血单个核细胞(PBMC)。
洗涤PBMC并重悬于缓冲液中，缓冲液含有磷酸盐缓冲盐水(PBS)、EDTA和人血 清白蛋白，将分选缓冲液中的经洗涤的细胞与偶联至单克隆抗体的市售磁珠试剂一起 在室温下孵育30分钟，并使用磁分离柱进行分选，得到富集的T细胞群。将所得的富 集的T细胞群重悬于X-VIVO 15培养基(购自Lonza)中，加入T细胞激活剂和慢病毒 载体颗粒，T细胞激活剂是(偶联有抗CD3和/或抗CD28和/或抗41-BB单克隆抗体的固 体支持物(例如，珠，包括磁珠和/或微珠；聚合物基质，包括聚合物纳米基质))慢病 毒载体颗粒含有编码嵌合抗原受体(CAR-BCMA，氨基酸序列见SEQ ID NO：2)的核 酸(核酸序列见SEQ ID NO：1)，慢病毒载体颗粒按病毒感染复数(MOI)为3进行 添加，培养24小时后，将培养液离心换液，以生理盐水洗涤后加入冻存液进行冷冻保 存，该制备工艺称为新工艺。
SEQ ID NO：1
Figure BDA0002907757760000851
SEQ ID NO：2
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggslrlscaasgftfggnamswvrqapgkglewvsaisgnggst fyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakvrpfwgtfdywgqgtlvtvssggggsggggsggggseivltqs pgtlslspgeratlscrasqsvsssylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycq qyfnppeytfgqgtkveikrtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllsl vitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvl dkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
作为对照，经白细胞分离术获得的单个核细胞在常规工艺下活化48小时,然后按病毒感染复数(MOI)为1加入慢病毒载体，培养24小时进行收获。
使用流式细胞术测定CAR的阳性表达率。本方法以及常规对照转导后不同时间 点CAR阳性细胞比例结果见下表1及图1。如表1及图1所示，新工艺培养24小时收获的 CAR T的转导效率较低，仅为16.0％，将其冷冻保存后解冻，用添加了2％AB血清、 300IU/mL IL-2的AIM-V培养基培养发现，前期检测的转导效率显著低于常规对照， 但随着培养时间的延长，检测的转导效率不断增高，培养至144小时后趋于平稳，且 与常规对照基本一致。该结果提示新工艺在收获时由于CAR尚未完全表达至细胞表 面，检测的转染效率很低，但当回输至人体内或体外持续培养一定时间后，CAR能 完全表达至细胞表面，阳性率水平达到常规对照水平。
表1.新工艺与常规对照转导后不同时间转导效率变化(单位：％)
Figure BDA0002907757760000861
为了进一步验证上述结果，选择靶向GPC3的CAR T细胞进行细胞转导研究，转 导方法与前述方法相同，将富集的T细胞群、T细胞激活剂和慢病毒载体颗粒共同孵 育24h进行收获，MOI是3，收获后检测CAR的转导效率几乎检测不到，仅为0.2％，将 细胞继续用添加了2％AB血清、300IU/mL IL-2的AIM-V培养基培养，发现随着后续体 外培养时间的延长，检测的转导效率不断增高(如表2所示)
此结果与上述BCMA-CAR T一致。
表2.新工艺转导后不同时间转导效率变化(单位：％)
Figure BDA0002907757760000862
靶向GPC3的CAR T细胞的CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
Malpvtalllplalllhaarpevqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytfsdyemhwvrqapgqglewmgaihpg sgdtaynqrfkgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycarfysyaywgqgtlvtvsaggggsggggsggggsdivmtqt plslpvtpgepasiscrssqslvhsngntylqwylqkpgqspqlliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyy csqsiyvpytfgqgtkleikrtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdfwvlvvvggvlacysllvtv afiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvl dkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
实施例2：原代T细胞活化转导培养24-48小时的转导效率评价
使用白细胞分离术从受试者采集富含白细胞的样品，使用Ficoll密度梯度离心法收集白膜层，获得纯度较高的外周血单个核细胞(PBMC)。
将所获得的PBMC无菌转移到转移包中。洗涤PBMC并重悬于选择缓冲液中用于 基于亲和力的选择，所述缓冲液含有PBS、EDTA和人血清白蛋白。洗涤是在Biosafe SA 销售的用于再生医学的无菌一次性可弃式试剂盒中进行，所述试剂盒包括离心处理室 (A-200F)。将含有细胞的转移包和含有缓冲液的袋子无菌连接到试剂盒，将所述试剂 盒放置与Sepax2处理单元相连。进行两(2)次洗涤循环，每次在空腔内壁处以约200g 的RCF进行180秒，然后将细胞最终重悬于20mL中。在方案结束时将细胞保留在离心 室的处理空腔中，以供随后与试剂一起孵育用于基于亲和力的选择。
使用偶联至单克隆抗体的珠试剂，分选富集CD4+和CD8+的T细胞，将其添加至 离心室内的经洗涤白细胞分离术中。将珠混合于上述分选缓冲液中，然后将其与设备 无菌连接。在Sepax 2单元上运行程序，将珠混合物和分选缓冲液吸入含有经洗涤细 胞的室中，并将所述室的内容物混合30分钟。
在程序结束时，Sepax 2单元引起细胞沉淀并排出多余的缓冲液/珠，洗涤沉淀的细胞，并重悬于分选缓冲液中。所述程序将经洗涤细胞收集至转移袋中。
然后使用标准方法在磁场的存在下使细胞从转移袋通过封闭的管路管线和分离柱的无菌系统，以分离结合至CD4特异性试剂和/或CD8特异性试剂的细胞。然后将这 些磁性标记的细胞收集于转移袋中用于进一步处理。
将富集的T细胞重悬于培养基中，加入T细胞激活剂先进行孵育，孵育不同时间 后加入包含编码GPC3 CAR的重组核酸的慢病毒载体进行转导。GPC3 CAR的氨基酸 序列如SEQID NO：3所示。
活化转导是在T225培养瓶/PL240培养袋中进行。大致流程为：将约2x108个T细 胞重悬至X-VIVOTM15培养基，总体积为140mL,接种至培养瓶/袋，加入抗CD3和/或 CD28和/或4-1BB试剂活化，然后在活化不同时间按病毒感染复数(MOI)为3加入慢 病毒载体进行转导,活化和转导的总培养时间为24h，结束后进行收获，将培养液离心 换液以生理盐水洗涤后重悬至冻存液进行冷冻保存。
在37℃，5％CO2下培养细胞，不同方案活化的孵育时间和转导的孵育时间如下：
方案一(Tx_No_Act)：未进行活化，直接转导，培养24小时后收获。
方案二(Act_Tx_0)：细胞活化与转导同时进行，培养24小时后收获。
方案三(Act 0_Tx 3)：在细胞活化3小时后转导21小时，于总培养时间为24小 时时收获。
方案四(Act 0_Tx 7)：在细胞活化7小时后转导17小时，于总培养时间为24小 时时收获。
方案五(Act 0_Tx 16)：在细胞活化16小时后转导8小时，于总培养时间为24小 时时收获。
方案六(Act 0_Tx 20)：在细胞活化20小时后转导4小时，于总培养时间为24小 时时收获。
方案七(Act 0_Tx 22)：在细胞活化22小时后转导2小时，于总培养时间为24小 时时收获。
方案八(Act 0_Tx 48；对照)：对照细胞为常规工艺，先活化48h，按MOI为1.5 加入慢病毒载体转导24h,离心换液去除游离载体，继续将细胞扩大培养并在第8天收 获。
我们将方案一～方案七收获的细胞冻存复苏后接种至培养基中继续培养至144h后进行转导效率的检测，相关结果见图2。如图1所示，与活化转导同时进行的T细胞 相比，未进行活化直接进行转导的T细胞几乎未检出CAR的表面表达，表明未进行活 化的T细胞很难直接被慢病毒载体转导。另外，同样都进行活化的条件下，加入慢病 毒载体的时间越晚，转导效率有明显增高趋势，尽管实际转导持续时间是递减的。该 结果表明T细胞的活化状态决定细胞被慢病毒转染的难易程度，在一定范围内，活化 时间越长，细胞越易转染，当细胞达到易转染状态后，慢病毒可迅速进入细胞，该过 程可能少于2小时，而转导效率水平与常规对照水平基本一致。
制备靶向CD19的CAR T细胞(CD19 CAR)，CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO： 4所示。
SEQ ID NO：4：
Malpvtalllplalllhaarpqvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgytfssywmnwvrqapgqglewmgqiwp gdgdtnyngkfkgrvtitadeststaymelsslrsedtavyycarretttvgryyyamdywgqgttvtvssggggsggggsgg ggsdivltqspaslavspgqratitckasqsvdydgdsylnwyqqkpgqppklliydasnlvsgvparfsgsgsgtdftltinp veandtanyycqqstedpwtfgqgtkveikrtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplag tcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrr eeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqal ppr
CD19 CAR的制备过程按照以下方案进行活化和转导，在37℃，5％CO2下培养 细胞。方案一-方案五使用MOI均为3：
方案一(Act_Tx_0)：细胞活化与转导同时进行，培养24小时后收获。
方案二(Act 0_Tx 16)：在细胞活化16小时后转导8小时，于总培养时间为24小 时时收获。
方案三(Act 0_Tx 20)：在细胞活化20小时后转导4小时，于总培养时间为24小 时时收获。
方案四(Act 0_Tx 22)：在细胞活化22小时后转导2小时，于总培养时间为24小 时时收获。
方案五(Act 0_Tx 23)：在细胞活化23小时后转导1小时，于总培养时间为24小 时时收获。
方案六(Act 0_Tx 48；对照)：对照细胞为常规工艺，先活化48h，按MOI为2加入 慢病毒载体转导24h,离心换液去除游离载体，继续将细胞扩大培养并在第8天收获。
方案一～方案五收获的细胞冻存复苏后接种至培养基中继续培养至144h后进行转导效率的检测，结果如图3所示。。另外，活化16小时至23小时范围内加入慢病毒 载体进行转导，总培养时间在24小时，T细胞的转导效率差异不大，略高于常规对照， 表明在T细胞活化至一定状态后，慢病毒进入细胞的时间最短仅需要1小时。
实施例3：体内抗肿瘤疗效评估
为评估新工艺制备的CAR T细胞的抗肿瘤活性，我们以常规工艺的CAR T细胞作为对照，对比考察不同剂量新工艺制备的CAR-BCMA T细胞在荷瘤小鼠体内的抗肿瘤 疗效。常规工艺制备的CAR-BCMA T细胞分别于D7和D11收样，新工艺制备的 CAR-BCMA的T细胞活化转导同时进行，按MOI为3进行转导，于培养24h收样，相关 表型见表5以及阳性率见表6。
表5.动物实验用细胞T细胞比例以及CAR T细胞阳性率
Figure BDA0002907757760000891
表6.动物实验用细胞CAR T细胞阳性率
Figure BDA0002907757760000892
Figure BDA0002907757760000901
表型结果显示，以新工艺制备获得的BCMA-CART细胞表型与制备前的PBMC相 比，TN的比例由25.4％降低至检测不到，TSCM的比例由5.3％升高至17.7％，提示
Figure BDA0002907757760000903
T细胞(TN)在活化24h后向Tscm转化。常规工艺培养至D7和D11的TSCM的比例随 培养时间明显下降，分别为12.3％和3.1％，提示TSCM随着培养时间的延长会向Tcm 转化。因此，为了尽可能减少CAR T细胞的终末分化，维持效应功能，我们应该尽可 能缩短CAR T细胞的培养时间，而新工艺制备正是将培养时间缩短至1～2天。另外， 阳性率结果显示，新工艺制备的CAR T细胞阳性率可达到常规CAR T水平。
将上述新工艺制备的CART细胞用于评估其在荷人多发性骨髓瘤细胞 RPMI-8226皮下移植瘤的NPG小鼠中的抗肿瘤疗效，以及其在小鼠外周血中的存活情 况，肿瘤细胞接种当天记为D0，具体剂量及实验设计见表7。
表7.动物实验剂量设计表
Figure BDA0002907757760000902
肿瘤接种后D12进行CAR T细胞输注，至肿瘤接种后D39，溶媒对照组肿瘤体积 超过2000mm3。与溶媒对照组相比，各组肿瘤体积移植瘤及肿瘤消退情况如下：
a)常规工艺1组，肿瘤体积抑制率100％，5只小鼠肿瘤全部消退，肿瘤消退率100％。
b)常规工艺2组，肿瘤体积抑制率为100％，5只小鼠肿瘤全部消退肿瘤消退率100％。
c)新工艺1组，肿瘤体积抑制率为100％，5只小鼠肿瘤全部消退，肿瘤消退率100％。
d)新工艺2组，肿瘤体积抑制率为100％，5只小鼠肿瘤全部消退，肿瘤消退率100％。
e)新工艺3组，肿瘤体积抑制率为56.05％，无小鼠肿瘤消退。
上述各组小鼠肿瘤体积见图4及小鼠体重随时间变化趋势。从起效时间看，新工艺1组略晚于常规工艺1和常规工艺2，新工艺2组和新工艺3组的起效时间更晚，新工 艺组中不同剂量的CART与起效时间存在剂量相关性。从最终疗效看，新工艺1组和新 工艺2组在观察期内(肿瘤接种后D39天)全部达到肿瘤完全清除。同时，新工艺3组， 我们也观察到从D32至D35肿瘤体积接近平稳，至D39开始出现减小，考虑溶媒对照组 肿瘤体积按照动物福利要求已达人道主义终点，因此保留新工艺3组组动物以继续观 察持续疗效。与预期一致，新工艺3组组的小鼠肿瘤体积在随后的观察时间里持续减 小，在肿瘤接种后D68天，该剂量组肿瘤体积抑制率接100％，5只小鼠的肿瘤几乎全 部消退，显示了让人备受鼓舞的抗肿瘤疗效。毒性方面，实验期间，排除肿瘤的影响 因素外，小鼠体重变化不大，提示CART对小鼠没有明显的毒副作用。
基于上述动物实验中新工艺制备的CAR-T巨大的抗肿瘤潜力，我们推测，细胞 输注剂量减少至常规工艺细胞用量的1/25，在肿瘤体积增至大于1000mm3条件下仍能 将肿瘤细胞快速清除，提示新工艺制备较常规工艺具有明显的优越性。
另外，我们分别在CAR T细胞输注后的D14和D21检测了各组小鼠外周血中人T 细胞的存活情况，相关结果见图5。结果显示，在D21，新工艺不同剂量组外周血中 CD3+T细胞的数目均值显著高于常规工艺组，且与CAR T注射D14天相比，CD3+T细 胞数目均有所增加，提示新工艺制备的CART细胞在体内的增殖能力显著优于常规工 艺组。此外，新工艺3组从肿瘤接种后D12给药，至肿瘤接种后D68几乎清除肿瘤，该 过程持续时间长达56天，也提示新工艺制备的CAR-T细胞在体内的存活持久性更强。
实施例4.不同T细胞激活剂及浓度对慢病毒转导的评价
使用白细胞分离术从受试者采集富含白细胞的样品，使用Ficoll密度梯度离心法收集白膜层，获得纯度较高的外周血单个核细胞(PBMC)。
洗涤PBMC并重悬于缓冲液中，基于免疫亲和力进行分选，所述缓冲液含有磷酸 盐缓冲盐水(PBS)、EDTA和人血清白蛋白。对于基于免疫亲和力进行的T细胞分选， 将分选缓冲液中的经洗涤的细胞与偶联至单克隆抗体的珠试剂一起在室温下孵育30 分钟，并使用磁分离柱进行分选。
将富集的T细胞重悬于X-VIVOTM15培养基中，加入不同的T细胞激活剂进行活 化，同时将含有编码嵌合抗原受体(CAR-CD19)核酸的慢病毒载体按病毒感染复数 (MOI)为3进行添加。培养24h后替换为添加了2％AB血清、300IU/mL IL-2的AIM-V 培养基，延长培养时间至144h，以此时转导效率作为评价活化条件的度量依据。
按以下试剂条件及浓度活化22小时后转导2小时，制备CD19 CAR，转导方案一～四的MOI均为3，培养条件是37℃，5％CO2下培养。
方案一：细胞活化采用偶联有抗CD3和抗CD28的磁珠/微珠(聚合物基质，包括聚合物纳米基质)活化。
方案二：细胞活化采用抗CD3抗体，使用终浓度为500ng/mL。
方案三：细胞活化采用抗CD3抗体，使用终浓度为1000ng/mL。
方案四：细胞活化采用抗CD3抗体，使用终浓度为2000ng/mL。
将方案一～方案四的细胞在转导2小时后离心换液，继续培养至144h，检测转导效率， 结果如表8所示，采用上述两种T细胞激活剂以及三种不同浓度条件下均能有效制备CAR T细胞，尽管采用抗CD3抗体制备的CAR T细胞转导效率低于采用偶联有抗CD3和抗CD28的磁珠/微珠来制备。采用抗CD3抗体活化可制备CAR T细胞，只是转导效率会随着使用 终浓度的增加有降低趋势。
表8转导效率(单位：％)
不同条件 转导效率
方案一 58.1
方案二 41.1
方案三 38.7
方案四 36.8
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引 用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。

Claims (27)

1.病毒载体转导细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤(1)、将待转导细胞或包含待转导细胞的输入组合物、待转导细胞刺激剂、和携带重组核酸的病毒载体颗粒共同孵育，孵育时间不超过72小时；
步骤(2)、进行收获，获得输出组合物，所述输出组合物含有转导有重组核酸的细胞；
优选的，所述孵育时间为1小时-72小时；
更优选的，所述孵育时间为2小时-48小时；
更优选的，所述孵育时间为2小时-36小时；
更优选的，所述孵育时间为12小时-36小时；
更优选的，所述孵育时间为12小时-24小时。
2.病毒载体转导细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤(1)、将待转导细胞或包含待转导细胞的输入组合物和待转导细胞刺激剂，孵育时间不超过72小时；
步骤(2)、在加入重组核酸的病毒载体颗粒进行孵育，孵育时间不超过24小时；
步骤(3)、进行收获，进行收获，获得输出组合物，所述输出组合物含有转导有重组核酸的细胞；
优选的，所述(1)和(2)的总孵育时间不超过72小时。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)的孵育时间为2-48小时；
优选的，所述步骤(1)的孵育时间为2-24小时；
更优选的，所述步骤(1)的孵育时间为3-24小时；
更优选的，所述步骤(1)的孵育时间为5-24小时；
更优选的，所述步骤(1)的孵育时间为10-24小时；
更优选的，所述步骤(1)的孵育时间为15-22小时。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的孵育时间为30分钟-24小时，优选的，所述步骤(2)的孵育时间为30分钟-5个小时；
更优选的，所述步骤(2)的孵育时间为30分钟-4个小时；
更优选的，所述步骤(2)的孵育时间为30分钟-3个小时；
更优选的，所述步骤(2)的孵育时间为1个小时-3个小时。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述包含待转导细胞或包含待转导细胞的输入组合物从血液样品中获得。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述病毒载体颗粒源自逆转录病毒载体；优选的，所述病毒载体颗粒是慢病毒载体。
7.如权利要求1-6中任一所述方法，其特征在于，所述病毒载体颗粒的感染复数不高于20，优选为1-20。
8.如权利要求1-6中任一所述方法，其特征在于，所述包含待转导细胞的输入组合物中待转导细胞的数量不低于1*105-1*1010；
优选的，所述包含待转导细胞的输入组合物中待转导细胞的数量不低于1*106；
更优选的，所述待转导细胞的数量为1*105-1*1010。
9.如权利要求1-7中任一所述方法，其特征在于，所述重组核酸能够编码识别特异性靶抗原的受体；
优选的，所述识别特异性靶抗原的受体是T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、嵌合T细胞受体、或T细胞抗原耦合器(TAC)。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述特异性靶抗原是与疾病相关的抗原或通用标签；
优选的，所述疾病是癌症、自身免疫性疾病、或感染性疾病。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述特异性靶抗原是肿瘤相关抗原；
优选的，所述肿瘤相关抗原选自：B细胞成熟抗原(BCMA)、碳酸酐酶9(CAIX)、tEGFR、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、EPHa2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二聚体、EGFR vIII、叶酸结合蛋白(FBP)、FCRL5、FCRH5、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、激酶插入结构域受体(kdr)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、TAG72、B7-H6、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AIMAGEA1、HLA-A2、PSCA、叶酸受体、CD44v6、CD44v7/8、avb6整合素、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿AchR、NKG2D配体、CD44v6、间皮素、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、PSCA、NKG2D、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、肝配蛋白B2、CD123、c-Met、GD-2、O-乙酰化GD2(OGD2)、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白、CCL-1、CD138。
12.如权利要求1-11任一所述的方法，其特征在于，所述待转导细胞刺激剂能够激活待转导细胞。
13.如权利要求1-12任一所述的方法，其特征在于，所述待转导细胞是免疫效应细胞；优选的，所述待转导细胞是T细胞，NK细胞，NKT细胞，树突细胞、巨噬细胞、CIK细胞、以及干细胞衍生的免疫效应细胞；更优选的，所述待转导细胞是T细胞。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述待转导细胞刺激剂包含CD3结合分子；CD28结合分子；重组IL-2；重组IL-15；重组IL-7；或重组IL21；
优选的，所述待转导细胞刺激剂包含抗CD3抗体和/或抗CD28抗体。
15.如权利要求1-14任一所述的方法，其特征在于，在收获之前，所述待转导细胞刺激剂离心去除。
16.如权利要求1-15任一所述的方法，其特征在于，所述待转导细胞刺激剂为游离分子。
17.如权利要求1-15任一所述的方法，其特征在于，所述待转导细胞刺激剂固定在固体支持物上；
优选的，所述固体支持物是聚合物基质材料；
更优选的，所述聚合物基质材料为可降解的聚合物纳米基质或珠试剂。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述聚合物基质材料为药用级。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述珠试剂为磁珠或微珠。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述可降解的聚合物纳米基质选自OKD3。
21.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述输出组合物中，转导有重组核酸的细胞的含量不低于30％、或不低于40％、或不低于50％、或不低于60％、或不低于70％、或不低于80％。
22.如权利要求1-21中任一所述的方法，其特征在于，
所述输入组合物包含重组IL-2，任选重组人IL-2，所述重组IL-2的浓度为或为约10IU/mL至500IU/mL、50IU/mL至250IU/mL或100IU/mL至200IU/mL；或浓度为至少或至少约10IU/mL、50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL或500IU/mL；和/或
所述输入组合物包含重组IL-15，任选重组人IL-15，所述重组IL-15的浓度为或为约1IU/mL至100IU/mL、2IU/mL至50IU/mL或5IU/mL至10IU/mL，每个都包含端值；或浓度为至少或至少约1IU/mL、2IU/mL、5IU/mL、10IU/mL、25IU/mL或50IU/mL；和/或
所述输入组合物包含重组IL-7，任选重组人IL-7，所述重组IL-7的浓度为或为约50IU/mL至1500IU/mL、100IU/mL至1000IU/mL至200IU/mL至600IU/mL，每个都包含端值；或浓度为至少或至少约50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL、500IU/mL、600IU/mL、700IU/mL、800IU/mL、900IU/mL或1000IU/mL。
23.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，收获的所述输出组合物经洗涤获得转导有重组核酸的细胞。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，将转导有重组核酸的细胞加入缓冲液中进行保存；
优选的，所述缓冲液中含有细胞冻存剂。
25.通过权利要求1-24中任一所述的方法产生的转导有重组核酸的细胞。
26.一种组合物，包含权利要求25所述的转导有重组核酸的细胞和药学上可接受的载体。
27.一种过继细胞治疗的方法，包括给与有此需要的对象权利要求26所述的组合物。
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