CN108884140B - 修饰的嵌合受体及相关组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供用于过继治疗的工程改造细胞的嵌合受体，包括T细胞和基因工程改造的细胞。在一些实施方式中，嵌合受体，例如嵌合抗原受体(CAR)在接合区域中通过一个或多个氨基酸修饰而被修饰，使得该区域的肽片段对人白细胞抗原(HLA)表现出较低的结合亲和性和/或该区域表现出降低的免疫原性，包括给予对象后。在一些方面，还提供了用于工程改造和产生表达该嵌合受体的细胞的方法和组合物、含有所述细胞的组合物、以及其给予对象的方法。在一些实施方式中，嵌合受体和含有嵌合受体的工程改造的细胞的特征产生方法，该方法用于增加或改善的活性、功效和/或持久性。

Description

修饰的嵌合受体及相关组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年6月9日提交的题为“修饰的嵌合受体及相关组合物和方法(Modified Chimeric Receptors and Related Compositions and Methods)”的美国临时申请号62/348,130和2015年12月3日提交的题为“修饰的嵌合受体及相关组合物和方法(Modified Chimeric Receptors and Related Compositions and Methods)”的美国临时申请号62/262,911的优先权，其各自内容通过引用其全文纳入本文。
通过引用纳入序列表
本申请与电子格式的序列表一同提交。所提供的序列表名称为735042004740SeqList.txt，创建于2016年11月30日，其文件大小为71,888字节。该序列表的电子格式的信息通过引用其全文纳入本文。
技术领域
本公开在一些方面涉及用于过继治疗的工程改造的细胞的嵌合受体，包括T细胞和基因工程改造的细胞。在一些实施方案中，嵌合受体，例如嵌合抗原受体(CAR)在结合区域中通过一个或多个氨基酸修饰而被修饰，使得该区域的肽片段对人白细胞抗原(HLA)表现出较低的结合亲和性和/或该区域表现出降低的免疫原性，包括给予受试者后。在一些方面，本文还涉及用于工程改造和产生表达该嵌合受体的细胞的方法和组合物、含有所述细胞的组合物、以及其给予对象的方法。在一些实施方案中，嵌合受体和含有嵌合受体的工程改造的细胞的特征产生方法，该方法用于增加或改善的活性、功效和/或持久性。
背景技术
各种方法可用于使用工程改造的表达重组受体，如嵌合抗原受体(CAR)的细胞的过继细胞治疗。此类方法可受益于所给予的细胞的增强的扩增和/或持久性、对细胞上表达的受体的免疫应答或其他不希望的结果的减少。提供满足此类需求的产品、组合物、方法和制品。
发明内容
本文提供了变体嵌合受体，其相比参考嵌合受体，在接合区域中通过一个或多个氨基酸序列的修饰而被修饰，所述接合区域是在两个结构域之间的接合的每一侧上含有连续氨基酸序列的区域，即跨越两个结构域的区域。在一些实施方式中，本文提供了变体嵌合受体，其包含与参考嵌合受体的接合区域相比具有一个或多个氨基酸序列修饰的经修饰的接合区域，所述参考嵌合受体包含第一结构域和第二结构域，在接合处以连续序列接合，其中参考嵌合受体的接合区域包含直接在所述接合的C-末端的多至15个连续氨基酸和/或直接在所述接合的N-末端的多至15个连续氨基酸；并且具有经修饰的接合区域的8-15个氨基酸部分的序列的肽片段对人白细胞抗原(HLA)分子的结合亲和性低于具有参考嵌合受体的接合区域的对应部分的序列的肽片段对相同HLA分子的结合亲和性。在一些实施方式中，所述参考嵌合受体的接合区域的对应部分的肽片段具有小于1000nM、小于500nM或小于50nM的结合亲和性。
一些实施方式中，本文提供了变体嵌合受体，其包含与参考嵌合受体的接合区域相比具有一个或多个氨基酸序列修饰的经修饰的接合区域，其中所述参考嵌合受体包含第一结构域和第二结构域，在接合处以连续序列接合，其中参考嵌合受体的接合区域包含直接在所述接合的C-末端的多至15个连续氨基酸和/或直接在所述接合的N-末端的多至15个连续氨基酸；和经修饰的接合区域中的全部8-15个氨基酸片段，或全部8、9、10、11、12、13、14，或15个氨基酸片段，对于人HLA分子的平均结合亲和性，低于参考嵌合受体的接合区域内的全部8-15个氨基酸片段或全部8、9、10、11、12、13、14，或15个氨基酸片段的平均结合亲和性。
在一些实施方式中，所述结合亲和性或平均结合亲和性低超过2倍、超过5倍、超过10倍、超过25倍、超过50倍或超过100倍。
一些实施方式中，本文提供了变体嵌合受体，其包含与参考嵌合受体的接合区域相比具有一个或多个氨基酸序列修饰的经修饰的接合区域，其中所述参考嵌合受体包含直接连接至第二结构域的第一结构域，在接合处以连续序列接合，其中参考嵌合受体的接合区域包含直接在所述接合的C-末端的多至15个连续氨基酸和/或直接在所述接合的N-末端的多至15个连续氨基酸；和对人白细胞抗原(HLA)具有小于1000nM的结合亲和性的经修饰的接合区域的8-15个氨基酸部分的序列的肽片段的数量小于具有对相同HLA具有相同结合亲和性的参考嵌合受体的接合区域的8-15个氨基酸部分的序列的肽片段的数量。
在一些实施方式中，对HLA具有小于500nM或小于50nM的结合亲和性的经修饰的接合区域内的肽片段的数量减少；或者，小于1000nM的结合亲和性是小于500nM或小于50nM的结合亲和性。在一些实施方式中，结合亲和性是IC50，并且经修饰的接合区域的肽片段与参考嵌合受体的接合区域的肽片段的结合的比较参考相同的标准肽。
在一些实施方式中，参考嵌合受体的第一结构域和/或第二结构域包括天然人蛋白质的结构域；和/或第一结构域和/或第二结构域包括细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域或胞内信号传导结构域，其中胞内信号传导结构域任选地是共刺激信号传导结构域或活化性胞质信号传导结构域。在一些实施方式中，参考嵌合受体的第一结构域和第二结构域不存在于人类对象体内的相同分子中。
在一些实施方式中，参考嵌合受体的第一结构域和第二结构域分别是胞外配体结合结构域和铰链结构域、铰链结构域和跨膜结构域、跨膜结构域和胞内共刺激信号传导结构域、以及胞内共刺激信号传导结构域和活化性胞质信号传导结构域，其可包括所述结构域的功能部分。在一些实施方式中，第一结构域是跨膜结构域或其功能部分，第二结构域是共刺激信号传导结构域或其功能部分。
在一些实施方式中，跨膜结构域是CD28跨膜结构域或其功能部分或变体，并且共刺激信号传导结构域是4-IBB信号传导结构域或其功能部分或变体。
在一些实施方式中，参考嵌合受体的接合区域包含直接在接合的C-末端的多至13个连续氨基酸和/或在接合的N-末端的多至15个连续氨基酸。在一些实施方式中，肽片段包括长度在8至15个或约8至15个氨基酸之间的氨基酸序列，或包括长度至少或至少约为或是或约是8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸的氨基酸序列。
在一些实施方式中，变体嵌合受体包括与第一结构域具有至少95％序列相同性的结构域和/或与第二结构域具有至少95％序列相同性的结构域，与第一结构域序列相同的结构域和与第二结构域具有至少95％序列相同性的结构域，或与第一结构域具有至少95％序列相同性的结构域和与第二结构域序列相同的结构域，其中，相比参考嵌合受体的第一结构域和/或第二结构域，存在于变体嵌合受体中的至少一个或两个结构域在包含修饰的接合区域的部分中经修饰。
在一些实施方式中，变体嵌合受体与参考嵌合受体具有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的序列相同性；和/或变体嵌合受体相比参考嵌合受体包括多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰。
在一些实施方式中，CD28跨膜结构域包括SEQ ID NO：2、103或104中所示的氨基酸序列或其功能部分或变体，该功能部分或变体包含与SEQ ID NO：2、103或104具有至少95％序列相同性的序列；并且，4-1BB共刺激信号传导结构域包括SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或其功能部分或变体，该功能部分或变体包括与SEQ ID NO：3具有至少95％序列相同性的序列。
在一些实施方式中，第一结构域和第二结构域一起包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或其功能部分或变体，所述功能部分或变体包含与SEQ ID NO:5显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一结构域和第二结构域一起包括SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述一个或多个修饰在残基13和42之间的部分内或氨基酸残基15和40之间的部分内，参考SEQ ID NO:5所示编号。在一些实施方式中，所述一个或多个修饰包括氨基酸插入、替代或缺失和/或其中所述一个或多个修饰中的每一种单独地包括氨基酸插入、替代或缺失。
在一些实施方式中，参考嵌合受体的第一和/或第二结构域包括跨膜结构域，其中变体嵌合受体的一个或多个修饰不是或不包含跨膜结构域(任选地是CD28跨膜结构域)中的疏水部分内的修饰或疏水性氨基酸残基处的修饰或疏水性氨基酸残基的修饰；或者，所述一个或多个修饰包括跨膜结构域(任选地是CD28跨膜结构域)内疏水性氨基酸残基的修饰，其中所述修饰是或包括疏水性氨基酸被另一不同的疏水性氨基酸残基取代；或者除了用另一疏水氨基酸残基的取代之外，一个或多个修饰不是或不包括跨膜结构域(任选地是CD28跨膜结构域)中的疏水部分内的修饰或疏水性氨基酸残基处的修饰或疏水性氨基酸残基的修饰。
在一些实施方式中，所述一个或多个修饰包括对应于残基28和42之间的氨基酸残基的氨基酸残基的修饰，参考SEQ ID NO：5中所示的编号。在一些实施方式中，氨基酸修饰是插入，并且变体嵌合受体包括在结构域之间的接合处附近的氨基酸残基之间的插入，其任选地对应于氨基酸残基27和28，参考SEQ ID NO:5所示的编号。在一些实施方式中，变体嵌合受体包括插入1、2、3、4或5个氨基酸残基。在一些实施方式中，插入是任何氨基酸残基，其任选地是天冬酰胺(N)。
在一些实施方式中，所述一个或多个修饰包括氨基酸替代，并且氨基酸替代是选自氨基酸残基28、31或34的一个或多个残基，参考SEQ ID NO：5中所示的编号。在一些实施方式中，所述氨基酸替代是针对任何其他氨基酸残基，其任选地选自：亮氨酸(L)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)或组氨酸(H)。在一些实施方式中，所述氨基酸替代选自：K28A、K28H、K28L、K28Q、K28S、R31A、R31H、R31L、R31N、L34A和L34S，参考SEQ ID NO:5所示编号。在一些实施方式中，氨基酸替代不包括对应于L34A或L34S的单个氨基酸替代，参考SEQ ID NO：5所示的编号。在一些实施方式中，所述氨基酸替代选自：K28Q/R31A、K28Q/R31N、K28Q/R31S、K28Q/L34A、K28Q/L34S、R31N/L34A、R31N/L34S、K28Q/R31N/L34A、K28Q/R31N/L34S。
在一些实施方式中，变体嵌合受体包括修饰的接合区域，其包含与SEQ ID NO：137的小于100％但与SEQ ID NO：137的大于85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％或96％的序列相同性并且包括修饰，例如本文所述的任何修饰；和/或变体嵌合受体包括与SEQ ID NO：5具有小于100％但与SEQ ID NO：5的大于85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％为93％，94％，95％或96％的序列相同性的序列并且包括修饰，例如本文所述的任何修饰。
在一些实施方式中，变体嵌合受体包括选自以下的经修饰的接合区域：i)SEQ IDNO：138-157和184中任一所示的氨基酸序列；ii)其功能变体，该功能变体包括与SEQ IDNO：138-157和184中任一所示氨基酸序列具有至少95％，96％，97％，98％或99％序列相同性的氨基酸序列并且包括修饰；或iii)i)或ii)的功能部分并包括修饰。
在一些实施方式中，变体嵌合受体包括i)SEQ ID NO：114-134和183中任一所示的氨基酸序列；ii)其功能变体，该功能变体包括与SEQ ID NO：114-134和183中任一所示氨基酸序列具有至少95％，96％，97％，98％或99％序列相同性的氨基酸序列并且包括修饰；或iii)i)或ii)的功能部分并包括修饰。
在一些实施方式中，与参考嵌合受体的接合区域相比，经修饰的接合区域包括不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
在一些实施方式中，第一结构域或第二结构域是跨膜结构域，并且变体嵌合受体中的对应结构域包括基本上疏水的亲水性概况和/或具有正的总平均亲水性(GRAVY)值。在一些实施方式中，GRAVY值大于0、0.25、0.5、0.75、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2或更大。
在一些实施方式中，第一结构域或第二结构域包括胞内信号传导结构域，并且变体嵌合受体中的对应结构域能够诱导TRAF的活化或细胞定位和/或能够诱导TRAF介导的信号传导。在一些实施方式中，胞内信号传导结构域是4-1BB共刺激信号传导结构域和/或TRAF选自TRAF1、TRAF2或TRAF3。在一些实施方式中，所述变体嵌合受体在对应于49-52的位置处包含氨基酸TTQE和/或在对应于残基60-63的位置处包含氨基酸PEEE，其各自参考SEQID NO:5所示编号。
在一些实施方式中，HLA是I类HLA和/或II类HLA。在一些实施方式中，I类HLA选自表1A中列出的HLA等位基因和/或II类HLA等位基因选自表1B中列出的HLA等位基因。在一些实施方式中，所述I类HLA等位基因选自：HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*11:01或HLA-B*08:01。
在一些实施方式中，HLA包括多个HLA分子，并且对多个HLA分子中的一个或多个的平均结合亲和性较低和/或与多个HLA分子中的一个或多个单独结合的肽片段的数量减少。在一些实施方式中，所述多个HLA分子选自：多个I类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于95％或大于99％的I类HLA分子；多个II类HLA分子，其代表其代表全世界人群或高加索人群中大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于95％或大于99％的II类HLA分子；或多个I类HLA分子和II类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于95％或大于99％的I类HLA分子和II类HLA分子。
在一些实施方式中，结合亲和性如体外测定。
在一些实施方式中，在给予人对象时，变体嵌合受体表现出比参考嵌合受体低的免疫原性，任选地，其中对象已接受给予参考嵌合受体。在一些实施方式中，降低的免疫原性包括降低的CD4+T细胞免疫应答和/或降低的CD8+T细胞免疫应答。
在一些实施方式中，参考嵌合受体还包括胞外配体结合结构域；和/或变体嵌合受体还包括胞外配体结合结构域。在一些实施方式中，变体嵌合受体是嵌合抗原受体(CAR)，其中配体结合结构域是抗原结合结构域。在一些实施方式中，抗原结合结构域是抗体或抗体片段。在一些实施方式中，抗原结合结构域是为单链片段的抗体片段。在一些实施方式中，片段包含通过柔性免疫球蛋白接头连接的抗体可变区。在一些实施方式中，所述抗体片段包括scFv。
在一些实施方式中，配体结合结构域特异性结合与疾病或病症相关的抗原。在一些实施方式中，所述疾病或病症是感染性疾病或病症，自身免疫性疾病，炎性疾病或肿瘤或癌症；配体结合结构域特异性结合至肿瘤抗原；和/或配体结合结构域特异性结合选自下述的抗原：ROR1，Her2，L1-CAM，CD19，CD20，CD22，间皮素，CEA，乙型肝炎表面抗原，抗叶酸受体，CD23，CD24，CD30，CD33，CD38，CD44，EGFR，EGP-2，EGP-4，EPHa2，ErbB2，ErbB3，ErbB4，FBP，胎儿乙酰胆碱e受体，GD2，GD3，HMW-MAA，IL-22R-α，IL-13R-α2，kdr，κ轻链，Lewis Y，L1-细胞粘附分子，MAGE-A1，间皮素，MUC1，MUC16，PSCA，NKG2D配体，NY-ESO-1，MART-1，gp100，癌胚(oncofetal)抗原，TAG72，VEGF-R2，癌胚抗原(CEA)，前列腺特异性抗原，PSMA，雌激素受体，孕酮受体，肝配蛋白B2，CD123，CS-1，c-Met，GD-2，MAGE A3，CE7，肾母细胞瘤1(WT-1)和细胞周期蛋白A1(CCNA1)
在一些实施方式中，参考嵌合受体还包括活化性胞质信号传导结构域；和/或变体嵌合受体还包括活化性胞质结构域。在一些实施方式中，活化性细胞质结构域包括T细胞受体(TCR)组分和/或包括基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。在一些实施方式中，活化性胞质信号传导结构域是或包含CD3-ζ(CD3ζ)链的ζ链或其功能变体或信号传导部分的胞质信号传导结构域。
在一些实施方式中，参考嵌合受体从其N至C末端依次包括：胞外配体结合结构域，第一结构域，第二结构域，第一结构域是跨膜结构域，第二结构域是胞内共刺激结构域和活化性胞质信号结构域；和/或变体嵌合受体从其N到C末端依次包括：胞外配体结合结构域，跨膜结构域，胞内共刺激结构域和活化性胞质信号传导结构域，其中跨膜结构域和胞内共刺激结构域在接合处以连续的序列接合以形成修饰的接合区域。
在一些实施方式中，本文提供了编码本文所述的任何变体嵌合受体的核酸分子。在一些实施方式中，本文提供了含有核酸分子的载体。在一些实施方式中，载体是病毒载体。在一些实施方式中，载体是逆转录病毒载体，其任选为慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
在一些实施方式中，本文提供了工程改造的细胞，其包括本文所述任何实施方式的核酸或载体，或表达本文所述的任何嵌合受体。在一些实施方式中，所述工程改造的细胞是T细胞。在一些实施方式中，工程改造的细胞是CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。
在一些实施方式中，本文提供了组合物，其包含本文所述任何实施方式的工程改造的细胞和任选的药学上可接受的缓冲剂。
在一些实施方式中，本文提供了治疗方法，包括将本文所述的任何实施方式的细胞或组合物给予患有疾病或病症的对象。在一些实施方式中，嵌合受体特异性结合与疾病或病症相关的配体或抗原。在一些实施方式中，疾病或病症是癌症、肿瘤、自身免疫性疾病或异常，或为感染性疾病。
在一些实施方式中，组合物中的基因工程改造的细胞在对象中表现出比在给予相同或约相同剂量的表达参考嵌合受体的参考细胞组合物的对象中增加或更长的扩增和/或持久性。在一些实施方式中，所述增加是至少1.2倍，1.5倍，2倍，3倍，4倍或5倍。在一些实施方式中，在给予细胞的一个月内，两个月内，六个月内或一年内观察到或存在增加。
附图说明
图1显示示例性铬释放试验的结果，所述试验检测在给予表达抗-CD19 CAR的细胞之后，人类对象中的CAR表达型细胞特异性的溶细胞免疫应答的存在。显示在存在表达CAR(“CD19-CAR”)和非表达CAR(“模拟”)的情况下，用所述表达CAR的细胞输注前(左图)和输注后(右图)，包含源自所述对象的外周血液单核细胞(PBMC)的混合淋巴细胞培养物的结果。“E/T”＝效应物与靶细胞之比。
图2显示来自示例性ELISpot分析的结果，该分析确认对于代表示例性人类对象中的CAR的特定区域的某些重叠的肽的免疫应答。以“pep”标记的数字代表沿CAR序列的长度的多种的重叠的肽，其中对应区域在该图表上方指示。
图3显示嵌合受体的示例性区域的肽结合至HLA-A2:01的预测的结合亲和性的表位亲和性的图，包括具有氨基酸序列CYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPF(SEQ ID NO:6)的示例性接合区域的一系列重叠8聚体-14聚体肽，其中残基1-15对应于示例性CD28跨膜结构域，而残基16-30对应于示例性4-1BB共刺激结构域。该图还描述具有氨基酸序列CYSLLVTVAFIIFWNNVKRGRKKLLYIFKQPF(SEQ ID NO:13)的变体接合区域的一系列重叠8聚体-14聚体肽的预测的结合亲和性，包含CD28跨膜结构域和4-1BB共刺激结构域之间的插入的天冬酰胺残基。
图4A和图4B描述分别对I类HLA和II类HLA等位基因的基于算法的T细胞表位预测，显示包括根据该群中个体HLA等位基因的频率加权的沿具有小于50nm的预测IC50的序列长度的各位置的数据集中的序列的总数。
图5描述对于一系列变体肽的I类HLA和II类HLA等位基因的基于算法的T细胞表位预测。评分如实施例2中所述确定并加权。三角形点虚线指示I类加权的评分。圆形实线指示II类加权的评分。
图6描述SEQ ID NO:5的示例性CD28-4-1BB序列的氨基酸序列。对应于CD28跨膜结构域的氨基酸由带箭头的实线指示，指示开始和终末位置；示例性4-1BB共刺激结构域的氨基酸由指示开始和终末位置的带箭头的短划线指示；示例性接合区域的氨基酸由指示开始和终末位置的带箭头的点虚线和短划线指示，并且以斜体显示。紧侧接接合位点的两个氨基酸由框指示。在一些实施方式中，靶向供于修饰的示例性氨基酸，包括K28、R31和L34，以粗体和下划线显示。4-1BB介导的TRAF-结合和信号传导中可能涉及的酸性残基区域以双下划线指示。
图7显示跨越CD28和4-1BB衍生序列(如SEQ ID NO：160所示；标准或“天然“序列”)之间的接合的区域的一部分内或在含有R31H、R31N或L34A取代的对应部分内(参考SEQ IDNO：5中所示的编号)的重叠15-聚体肽的各种MHC II类分子的相对结合。显示结合的
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评分。各II类HLA等位基因的评分用相应的字母单独标记如下：A:DPA1*01:03；DPB1*04:01；B:DRA*01:01；DRB1*03:01；C:DRA*01:01；DRB1*15:01；D:DRA*01:01；DRB1*11:01；E:DPA1*01:03；DPB1*04:02；F:DPA1*01:03；DPB1*03:01；G:DPA1*01:03；DPB1*01:01；H:DPA1*02:01；DPB1*01:01；I:DPA1*02:01；DPB1*04:02；J:DRA*01:01；DRB1*11:04；K:DRA*01:01；DRB1*01:02；和L:DPA1*02:01；DPB1*15:01。
图8显示来自CD28-4-1BB接合的15-聚体肽与MHC II类分子的计算机模拟预测的结合与体外确定的结合之间的比较。
图9A和图9B显示在工程改造的CD4+T细胞中分别在表面和细胞内含有修饰的接合区域的变体CAR的表达。Y轴通过用抗独特型抗体(表面ID)检测来描绘CAR的表面表达。X轴描绘使用抗EGFR抗体(Erb)的替代的EGFRt标志物的表面表达。
图10显示通过流式细胞术测定的CD4+和CD8+T细胞上CAR的表面表达的平均荧光强度(MFI)。
图11显示CD4+/CAR+细胞和CD8+/CAR+细胞中IL-2和IFN-γ的细胞内水平的流式细胞术图。
图12显示与表达具有天然接合区域的CAR的细胞相比，表达含有修饰接合区域的变体CAR的抗CD19 CAR-工程改造的细胞的连续再刺激测定中的扩增。
具体实施方式
除非另外定义，本文使用的所有专业术语、符号和其它技术和科学术语或专有词汇旨在具有本发明所属领域技术人员通常所理解的相同含义。在一些情况中，本文出于阐明和/或便于引用目的对具有常规理解含义的术语加以限定，本文中包括此类限定不应理解为表示与本领域常规理解的有显著差异。
本发明中提及的所有出版物，包括专利文件、学术论文和数据集，均以各个体出版物好似独立地通过引用纳入的相同程度通过引用其全文纳入本文用于所有目的。如果本文所示的定义与通过引用纳入本文的专利、公开申请和其它出版物中所示的定义不同或其它情况下不一致，则相对于通过引用纳入本文的文件中的定义，以本文所示的定义为主。
本文所用章节标题仅用于组织目的，而不应理解为限制所述客体。
I.概述
提供了重组受体，包括嵌合受体，例如嵌合抗原受体，其与参考嵌合受体相比显示出一个或多个氨基酸序列差异。在一些实施方式中，所提供的变体嵌合受体含有修饰的接合区域，该修饰的接合区域与参考嵌合受体的接合区域相比含有一个或多个修饰(例如氨基酸插入，缺失或氨基酸替代)，使得衍生自修饰的接合区域肽片段(例如长度为8至24个氨基酸，例如长度为8至15或8至13个氨基酸，例如长度为约或8,9,10,11,12,13,14或15个氨基酸)对人白细胞抗原(HLA)的结合亲和性低于衍生自参考接合区域的对应肽片段对HLA的结合。在一些实施方式中，在给予对象后，与参考嵌合受体相比，对变体嵌合受体的宿主免疫应答(例如体液或细胞介导的免疫应答)降低。在一些实施方式中，降低的免疫应答是针对含有修饰的接合区域的变体嵌合受体的区域的可检测降低的免疫应答。
在一些实施方式中，嵌合受体，例如嵌合抗原受体，含有一个或多个结构域，其组合配体结合结构域(例如抗体或抗体片段)和胞内信号传导结构域，配体结合结构域提供针对所需抗原(例如肿瘤抗原)的特异性。在一些实施方式中，胞内信号传导结构域是活化性胞内结构域部分，例如T细胞活化性结构域，提供主要活化信号。在一些实施方式中，胞内信号传导结构域含有或另外含有共刺激信号传导结构域以促进效应物功能。在一些实施方式中，当嵌合受体经基因工程改造入免疫细胞时可调节T细胞活性，并且在一些情况下可调节T细胞分化或体内平衡，从而导致基因工程改造的细胞的体内寿命、存活和/持久性改善，例如用于过继性细胞治疗方法。
过继性细胞疗法(包括涉及给予表达对感兴趣的疾病或病症特异性的嵌合受体如嵌合抗原受体(CAR)和/或其他重组抗原受体的细胞的疗法以及其他过继免疫细胞和过继性T细胞疗法)可以有效治疗癌症和其他疾病和病症。在某些情况下，过继性细胞治疗的可行方法可能并不总是令人满意。在一些情况下，最佳功效可取决于给予的细胞的下述能力：识别和结合靶标(例如靶标抗原)，运输、定位并成功进入对象、肿瘤及其环境内的适当位点，被激活、扩增，发挥各种效应功能，包括细胞毒性杀伤作用和各种因子如细胞因子的分泌，持久(包括长期)，分化、转换或参与重编程为某些表型状态(如效应物、长效记忆、弱分化和效应状态)，在清除和再次暴露于靶配体或抗原之后提供有效和强烈的回忆响应，并且避免或减少耗竭、无反应性、终末分化和/或分化成抑制状态。
在某些情况下，过继治疗方法在所有这些方面都不尽如人意。在一些方面，提供的实施方式基于以下发现：过继细胞治疗的功效可能会受所述对象中对于给予的细胞和/或构建体的免疫应答的限制。例如，在一些情况下，暴露于嵌合受体可能受到针对由给予的细胞表达的重组受体的宿主免疫应答的限制，这可能过早地消除细胞。观察到，甚至在具有B细胞恶性肿瘤的某些对象(其通常免疫力低下)中，仍能检测到对于过继细胞治疗中给予的细胞表达的受体的区域具有特异性的免疫应答。例如，如本文所示，给予用CAR基因工程改造的细胞的对象对嵌合区的免疫原性区域产生特异性免疫应答，所述嵌合区域含有CAR的跨膜和共刺激结构域之间的接合。
在一些方面，免疫应答的发展可以在过继治疗方法的过程中减少表达嵌合受体的T细胞的暴露或持久性。然而，观察结果表明，在一些情况下，对象更多地暴露于给予的表达重组受体的细胞(例如，随时间的细胞数量增加或持续时间增加)可以改善过继细胞疗法的功效和治疗结果。在多个临床试验中向患有各种CD19表达型癌症的对象给予不同的CD19-靶向的表达CAR的T细胞之后进行的初步分析显示更高和/或更长的与表达CAR的细胞的暴露程度与治疗结果之间存在相关性。这些结果包括患者的生存和缓解，甚至在具有严重或显著肿瘤负荷的个体中。
此外，在一些情况中，一旦所述宿主免疫应答发展，不论是获得的还是先天的，通过给予表达相同重组受体的细胞的后续剂量来试图增加接触或向对象提供再治疗可能是不具可行性或无效的。一旦已针对所述受体发展所述免疫应答，表达相同受体或具有相似免疫原性表位的受体的细胞的第二或后施剂量的给予可能会导致所述细胞在它们有机会扩增和/或坚持到有效或显著程度之前就被快速消除。因此，最小化可能破坏或干扰过继细胞治疗方法中使用的工程改造的细胞活性(继而降低治疗的有效性)的不需要的免疫应答将是有利的。
通常，嵌合受体包括多个不同的结构域，例如存在于对象内源的分子中的多个结构域。例如，CAR是包括特异性结合至靶抗原的胞外抗原识别结构域和包含ITAM的胞内信号传导结构域(例如，CD3-ζ胞内信号传导结构域)的分子。在一些实施方式中，胞外抗原识别结构域包含抗体或抗原结合片段(例如scFv)。CAR还可以在胞外识别结构域和信号传导结构域之间含有跨膜结构域和/或内结构域，其可以包括共刺激分子(例如CD28或4-IBB共刺激分子)的跨膜和/或胞内信号传导结构域。在某些情况下，这些结构域可以通过接头连接。
在一些情况下，多个结构域通常不在对象的内源性分子中的序列中彼此相邻地存在。例如，在一些实施方式中，在接合处结合的嵌合受体的第一结构域和第二结构域可以产生可能不存在于对象中的连续氨基酸序列，特别是在这两个结构域不在相同蛋白质中天然相邻存在的情况下和/或通过合成接头分开的情况下。在某些情况下，这可能导致存在非天然序列，该序列与嵌合受体(例如CAR)的序列的部分中的宿主内源性分子中存在的序列不同，所述嵌合受体在两个结构域之间包含接合。
在一些情况中，包含跨越两个结构域的接合区域的潜在的肽表位的接合区域可以是免疫原性的，并且在将包含所述接合区域的嵌合受体给予对象之后能导致产生免疫应答。在一些实施方式中，所述接合区域可包括(例如，一旦与抗原呈递相关处理以在HLA分子上展示)多个个体重叠肽片段，所述肽片段具有约8-24个氨基酸(例如8-15个氨基酸或8-13个氨基酸，例如约或8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸)的连续序列，其直接在接合嵌合受体的第一结构域和第二结构域的接合部分的C末端，和/或具有约8-24个氨基酸(例如8-15个氨基酸或8-13个氨基酸，例如约或8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸)的连续序列，其直接在所述接合部分的N末端，所述肽片段各自可包含或跨越所述两个结构域的接合部分。因此，在一些情况中，该接合区域可包含多个潜在的肽表位，其可显示针对HLA分子的结合亲和性和/或能够诱导免疫应答。
在一些实施方式中，肽片段通过免疫应答识别以诱导或启动针对这种肽序列的可检测的免疫应答，例如，体液或细胞介导的免疫应答。在一些实施方式中，肽片段可以与细胞上表达的MHC分子关联或结合，用于由T细胞受体(TCR)识别。在一些实施方式中，肽表位在某些条件下可以在动物中引发免疫应答，例如T细胞应答。例如，在一些情况下，表达在MHC分子背景下识别T细胞表位的TCR的T细胞可以被刺激，从而导致T细胞应答，例如T细胞增殖，淋巴因子分泌，细胞毒性反应，局部炎症反应，其他免疫细胞的募集和/或B细胞的活化，导致产生针对含有肽表位的蛋白质，例如嵌合受体的抗体。鉴定任何嵌合受体的肽表位在本领域技术人员的水平内。
在一些实施方式中，与给予表达参考(未修饰的)嵌合受体(例如参考或未修饰的CAR)的细胞的对象中产生的免疫应答相比，所提供的方法减少或减轻给予表达变体嵌合受体(例如CAR)的细胞的对象的免疫应答。在一些实施方式中，对象对变体嵌合受体或嵌合受体的修饰的接合区域没有表现出或表现出降低的免疫应答或特定类型或程度的免疫应答，例如在给予表达该受体的细胞后。免疫应答的类型可以是可检测的免疫应答、体液免疫应答和/或细胞介导的免疫应答。
在一些实施方式中，当给予对象时，所提供的方法实现表达变体嵌合受体(例如变体CAR)的基因工程改造的T细胞的持久性增加。在一些实施方式中，具有增加的持久性的基因工程改造的细胞在给予它的对象中表现出更好的效力。在一些实施方式中，与通过替代方法(例如涉及给予表达参考或未修饰的嵌合受体的基因工程改造的细胞的方法)所实现的相比，在给予后的对象中，表达变体嵌合受体的基因工程改造的细胞(例如表达变体CAR的T细胞)的持久性更高。在一些方面，给予的细胞的持久性提高至少或至少约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多。
在一些实施方式中，细胞给予对象后，可以对给予的细胞的持久性的程度或范围进行检测或定量。例如，在一些方面，使用定量PCR(qPCR)来评价在对象的血液或血清或器官或组织(例如疾病部位)中表达嵌合受体的细胞(例如，表达CAR的细胞)的量。在一些方面，持久性被定量为每微克DNA中编码受体，例如CAR的DNA或质粒的拷贝，或作为每微升样品例如，血液或血清的受体表达，例如CAR表达细胞的数量，或每微升样品的外周血单核细胞(PBMC)或白细胞或T细胞的总数。在一些实施方式中，也可以进行通常使用对受体具有特异性的抗体来检测表达受体的细胞的流式细胞试验。还可以使用基于细胞的测定来检测功能细胞的数量或百分比，如能够结合和/或中和和/或诱导针对疾病或病症或表达被受体识别的抗原的细胞的应答(例如，细胞毒性应答)。在这些实施方式的任意一项中，可以使用与重组受体相关联的另一标志物(例如，表达CAR的细胞)的表达的水平或程度在对象中区分给予的细胞和内源性细胞。
还提供了含有变体嵌合受体或表达这种变体嵌合受体的工程改造的细胞的组合物。还提供了向对象给予此类变体嵌合受体和组合物的方法，包括向对象给予表达变体嵌合受体的细胞和这些细胞的组合物，例如用于过继细胞疗法。
II.变体嵌合受体
本文提供了变体嵌合受体，其含有与参考嵌合受体的接合区域相比经修饰的接合区域。在一些实施方式中，接合区域是在第一和第二结构域之间的接合的每一侧含有连续氨基酸序列的区域。在一些实施方式中，凭借修饰的接合区域中存在的一个或多个修饰，变体嵌合受体含有对应于参考嵌合受体的第一结构域的结构域和/或对应于参考嵌合受体的第二结构域的结构域，其通过一个或多个氨基酸差异(例如突变)而经修饰。
在一些实施方式中，变体嵌合受体包含相较于参考嵌合受体的接合区域而言经修饰的接合区域，其中直接位于接合(其接合参考嵌合受体的第一结构域和第二结构域)的C末端的位置8-24的氨基酸(例如8-15氨基酸或8-13氨基酸，例如约或8、9、10、11、12、13、14、15或更多氨基酸)的一个或多个氨基酸残基，和/或直接位于该接合的N末端的位置8-24氨基酸(例如8-15氨基酸或8-13氨基酸，例如约或8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸)的一个或多个氨基酸残基是经修饰的，例如通过插入、缺失或氨基酸替代修饰。在一些实施方式中，相较于所述参考嵌合受体中的接合区域，所述变体嵌合受体在经修饰的接合区域包含至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸差异或修饰。
在一些实施方式中，所述变体嵌合受体包含与所述参考嵌合受体的第一结构域具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的结构域，和/或包含与所述参考嵌合受体的第二结构域具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的结构域。在一些实施方式中，所述变体嵌合受体包含与所述参考嵌合受体的第一结构域序列相同的结构域，并且包含与所述参考嵌合受体的第二结构域具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的结构域。在一些实施方式中，所述变体嵌合受体包含与所述参考嵌合受体的第一结构域具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的结构域，并且包含与所述参考嵌合受体的第二结构域序列相同的结构域。在一些实施方式中，相较于所述参考嵌合受体的第一结构域和/或第二结构域，在包含经修饰的接合区域的部分中，所述变体嵌合受体中存在的结构域的至少之一或两者是经修饰的。
在一些实施方式中，所述变体嵌合受体与所述参考嵌合受体具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性。在一些实施方式中，相较于参考嵌合受体，所述变体嵌合受体包含多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸差异或修饰(例如氨基酸插入、缺失或替代)。
在一些实施方式中，所述参考嵌合受体(例如参考CAR)的第一和/或第二结构域是天然内源性人类蛋白质的结构域或与天然或内源性蛋白质的结构域或其功能部分具有100％相同性的结构域。在一些实施方式中，第一结构域和第二结构域不存在于人类对象体内的相同分子中。在一些实施方式中，第一结构域和第二结构域不存在于单一天然或内源性人类蛋白质或多肽中。
在一些实施方式中，第一和/或第二结构域是或包含胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域，或胞内信号传导结构域或其功能部分。在一些实施方式中，所述胞内信号传导结构域是或包含共刺激信号传导结构域，例如CD28、4-1BB，或ICOS共刺激信号传导结构域。在一些实施方式中，所述胞内信号传导结构域是或包含活化性胞质信号传导结构域，例如是或包括T细胞受体(TCR)组分的结构域和/或包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)的结构域。在一些情况中，活化性胞质结构域是或包含CD3-ζ(CD3ζ)链的ζ链的胞质信号传导结构域或其功能变体或信号传导部分。
在一些实施方式中，所述参考嵌合受体是CAR。在一些实施方式中，所述嵌合受体，例如CAR，包含(从其N末端至C末端的顺序)：胞外配体-结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，所述胞内信号传导结构域是或包括活化性信号传导结构域(例如TCR的组分和/或包含ITAM的组分，例如CD3-ζ信号传导结构域)。在一些实施方式中，所述胞内信号传导结构域是或包括共刺激信号传导结构域(例如CD28、4-1BB或ICOS信号传导结构域)。在一些实施方式中，所述胞内信号传导结构域仅包含共刺激信号传导结构域或活化性信号传导结构域之一，或以任意顺序同时包含这两个结构域。在一些实施方式中，所述胞内信号传导结构域同时包含共刺激信号传导结构域和活化性信号传导结构域。
在一些实施方式中，参考嵌合受体包含免疫原性的第一和第二结构域的接合区域(junction region)。在一些实施方式中，所述免疫原性的区域包括一个或多个肽表位(也称为T细胞表位)。在一些情况中，包含跨越两个结构域的接合区域的潜在的肽表位的接合区域可以是免疫原性的，并且在将包含所述接合区域的嵌合受体给予对象之后能导致产生免疫应答。在一些实施方式中，所述接合区域可包括(例如，一旦与抗原呈递相关处理以在HLA分子上展示)多个个体重叠肽片段，所述肽片段具有约8-24个氨基酸(例如8-15个氨基酸或8-13个氨基酸，例如约或8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸)的连续序列，其紧邻接合嵌合受体的第一结构域和第二结构域的接合部分的C末端，和/或具有约8-24个氨基酸(例如8-15个氨基酸或8-13个氨基酸，例如约或8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸)的连续序列，其紧邻所述接合部分的N末端，所述肽片段各自可包含或跨越所述两个结构域的接合部分。因此，在一些情况中，该接合区域可包含多个潜在的肽表位，其可显示针对HLA分子的结合亲和性和/或能够诱导免疫应答。
在一些实施方式中，能鉴定嵌合受体的免疫原性的区域，例如接合区域。在一些实施方式中，所述免疫原性的区域可通过其结合至MHC分子的能力或通过其在某些条件下引发免疫应答的能力来被鉴定。在一些实施方式中，可采用算法或通过计算机的其它方法(如下所述)来评估嵌合受体的重叠肽，例如重叠8聚体-20聚体肽，例如9聚体、10聚体、11聚体、12聚体、13聚体、14聚体或15聚体的MHC结合。在一些实施方式中，嵌合受体可经评估以确定其是否是免疫原性的，通过评估给予了该嵌合受体的对象中的免疫应答，例如给予了用所述嵌合受体(例如CAR)遗传工程改造的细胞的对象。评估免疫应答的示例性方法如下所述。
在一些实施方式中，所述至少一个肽表位能够结合至主要组织相容性复合物(MHC)分子，例如I类或II类蛋白，其为包含多态性肽结合位点或结合槽的分子，所述结合位点或结合槽在一些情况中能与多肽(包括由细胞机制加工的肽)的肽片段复合。在一些实施方式中，所述肽表位能够结合至MHC分子，该MHC分子是人MHC分子。在一些实施方式中，所述MHC分子是人白细胞抗原(HLA)分子。在一些实施方式中，所述至少一个肽表位显示对于HLA分子(例如I类HLA分子或II类HLA分子)的结合亲和性(例如IC50)。在一些实施方式中，参考嵌合受体的接合区域包含显示小于1000nM，小于500nM或小于50nM的结合亲和性的肽表位。
在一些实施方式中，参考嵌合受体的接合区域的至少一个或多个肽表位是MHC II类表位。在一些实施方式中，结合至MHC II类分子的肽的长度可以是8-20个氨基酸，包括10-17个氨基酸的长度，例如或至少约或至少或约10、11、12、13、14、15、16或17个氨基酸的长度，例如长度为约15个氨基酸。在一些实施方式中，结合至MHC II类分子的肽的长度可超过20个氨基酸。在一些实施方式中，所述肽处于沿MHC II肽-结合槽的伸长构象中。在一些实施方式中，所述MHC II肽-结合槽是两端开放的。在一些实施方式中，所述肽至少部分被与沿所述肽-结合槽的保守残基接触的主链原子原位固定。在一些实施方式中，所述MHC II类是αβ二聚体，其可为或包括已知存在于对象，例如人类对象中的任何MHC II类等位基因蛋白质。在一些实施方式中，所述MHC等位基因可以是但不限于，DR1、DR3、DR4、DR7、DR52、DQ1、DQ2、DQ4、DQ8和DP1。在一些实施方式中，MHC II类等位基因可以是表1B中所示的任何一种，包括同种型匹配的α和β关联，或组合不同等位基因的α链和β链的混合同种型异二聚体。在一些实施方式中，MHC II类可以是二聚体，其是或包括来自下述的α和/或β等位基因：HLA-DPA1*0103,HLA-DPA1*0201,HLA-DPB1*0101,HLA-DPB1*0301,HLA-DPB1*0401,HLA-DPB*0402,HLA-DPB1*1501,HLA-DRA*0101,HLA-DRB1*0101,HLA-DRB1*0102,HLA-DRB*0301,HLA-DRB*0701,HLA-DRB*0401,HLA-DRB1*1101,HLA-DRB1*1104,HLA-DRB*1501,和/或HLA-DQB1*0201。
在一些实施方式中，所述参考嵌合受体的接合区域的至少一个肽表位是MHC I类表位。在一些实施方式中，结合至MHC I类分子的肽的长度可以是7-15个氨基酸。在一些实施方式中，结合至MHC I类分子的肽的长度可以是8-13个氨基酸。在一些实施方式中，所述肽的结合在其两端通过该肽主链中的原子与所有MHC I类分子的肽-结合槽中的变体位点之间的接触而稳定。在一些实施方式中，在所述槽的两端同时存在变体位点，其结合所述肽的氨基和羧基末端。在一些实施方式中，肽长度的变化可通过肽主链中的扭结(kink)进行调整适应。在一些实施方式中，所述扭结包括脯氨酸或甘氨酸残基，其可允许柔性。在一些实施方式中，所述MHC I类等位基因可以是已知存在于对象，例如人类对象中的任何等位基因。在一些实施方式中，所述MHC I类等位基因是HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-A24、HLA-A28、HLA-A31、HLA-A33、HLA-A34、HLA-B7、HLA-B45或HLA-Cw8等位基因。在一些实施方式中，所述MHC I类等位基因可以是示于表1A的任何基因，其包括最常见的MHC I类等位基因(Solberg等，(2008)HumImmunol.2008年7月；69(7)：443-6)。在一些实施方式中，所述I类HLA等位基因是HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*11:01或HLA-B*08:01。
在一些实施方式中，所述MHC I类等位基因是HLA-A2等位基因，其在一些群体中由该群体的约50％表达。在一些实施方式中，所述HLA-A2等位基因可以是HLA-A*0201、*0202、*0203、*0206，或*0207基因产物。在一些情况中，不同群体之间的亚型的频率可能存在差异。例如，在一些实施方式中，HLA-A2阳性白种人群体中超过95％是HLA-A*0201，而在华人群体中，该频率据报道是约23％HLA-A*0201、45％HLA-A*0207、8％HLA-A*0206和23％HLA-A*0203。在一些实施方式中，所述MHC分子是HLA-A*0201。
在一些实施方式中，所述变体嵌合受体可包含(从其N末端到C末端的顺序)：胞外配体-结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其任选地可包括共刺激信号传导结构域(例如CD28、4-1BB或ICOS)和/或活化性信号传导结构域(例如TCR的组分和/或包含ITAM的组分，例如CD3-ζ信号传导结构域)，各自单独地或以任何顺序作为胞内信号传导结构域的部分，其中变体嵌合受体在所述接合部分的任一侧(N末端和/或C末端)的8-24个氨基酸(例如8-15个氨基酸或8-13个氨基酸，例如约或8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸)的连续的部分内的一个或多个氨基酸残基处包含修饰。
在一些实施方式中，参考嵌合受体的特征可以是下文第1分部中所描述的任一种。在一些实施方式中，变体嵌合受体的特征还可是如下文第1分部中描述的任一种，不同之处在于所述变体嵌合受体在所述的经修饰的接合区域中包含一个或多个修饰(例如插入、缺失或替代)。
1.嵌合受体
示例性的重组受体，包括CAR和重组TCR，以及用于工程改造和将受体导入细胞中的方法，包括例如，在国际专利申请公开号WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061，美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337，美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353、和8,479,118，和欧洲专利申请号EP2537416中所述的那些，和/或Sadelain等，Cancer Discov.2013年4月；3(4):388–398；Davila等，(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等，Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等，Cancer,2012年3月18(2):160-75中所述的那些。在一些实施方式中，基因工程改造的抗原受体包括美国专利号7,446,190中所述的CAR，和国际专利申请公开号WO/2014055668A1中所述的那些。在一些实施方式中，用于构建和引入或转移入免疫细胞的类似方法可用于所提供的嵌合受体。
在一些实施方式中，嵌合受体包括与抗原(或配体)结合(例如特异性结合)的配体结合结构域。由嵌合受体靶向的抗原包括在待通过过继细胞治疗靶向的疾病、病症、或细胞类型中表达的那些。疾病和病症包括增殖性、肿瘤性和恶性疾病和病症，包括癌症和肿瘤，包括血液癌症，免疫系统癌症，如淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤，如B、T和骨髓性白血病、淋巴瘤、和多发性骨髓瘤。在一些实施方式中，抗原(或配体)是多肽。在一些实施方式中，其是碳水化合物或其他分子。在一些实施方式中，与正常或非靶向的细胞或组织相比，抗原(或配体)在疾病或病症的细胞，例如，肿瘤或致病性细胞上选择性表达或过表达。在其他实施方式中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程改造的细胞上表达。在一些实施方式中，抗原(或配体)是肿瘤抗原或癌症标志物。在一些实施方式中，抗原(或配体)是或包括：孤儿酪氨酸激酶受体RORl、tEGFR、Her2、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、和肝炎B表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、3、或4、FBP、胎儿乙酰胆碱e受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、Lewis Y、L1-细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、酪氨酸蛋白激酶B2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2，和MAGE A3、CE7、维尔姆斯瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白如细胞周期蛋白A1(CCNA1)和/或生物素化分子，和/或由HIV、HCV、HBV或其它病原体表达的分子。在一些实施方式中，抗原是病原体特异性抗原。在一些实施方式中，抗原是病毒抗原(例如来自HIV，HCV，HBV等的病毒抗原)，细菌抗原和/或寄生虫抗原。
在一些实施方式中，构建嵌合受体以使其具有针对特定抗原(或标志物或配体)的特异性，如在待通过过继治疗靶向的特定细胞类型中表达的抗原，例如癌症标志物，和/或意图用以诱导减弱应答的抗原，如在正常或非疾病细胞类型上表达的抗原。因此，嵌合受体通常在其细胞外部分中包含一个或多个配体结合结构域。
在一些实施方式中，嵌合受体是CAR。在一些实施方式中，CAR一般在其胞外部分中包合一种或多种抗原结合分子，例如一种或多种抗原-结合片段、结构域或部分，或一种或多种抗体可变结构域，和/或抗体分子。在一些实施方式中，所述CAR包括抗体分子的一个或多个抗原-结合部分，例如源自单克隆抗体(mAb)的可变重(VH)链和可变轻(VL)链的单链抗体片段(scFv)。
本文术语“抗体”以最广义使用并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原-结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性结合抗原的可变重链(VH)区、单链抗体片段，包括单链可变片段(scFv)，和单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。该术语包括免疫球蛋白的基因工程改造和/或其他修饰的形式，如胞内抗体、肽抗体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体，和异源偶联抗体、多特异性例如，双特异性抗体、双抗体、三抗体，和四抗体、串联二-scFv、串联三-scFv。除非另外说明，术语“抗体”应理解为包括其功能性抗体片段。该术语也包括完整或全长抗体，包括任意类型或亚型的抗体，包括IgG及其亚型，IgM、IgE、IgA，和IgD。
在一些实施方式中，抗原结合蛋白、抗体及其抗原结合片段特异性识别全长抗体的抗原。在一些实施方式中，抗体的重链和轻链可以是全长的或者可以是抗原结合部分(Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv片段(scFv))。在其他实施方式中，抗体重链恒定区选自，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、和IgE，尤其选自，例如，IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4，更具体地，IgG1(例如，人IgG1)。在另一个实施方式中，抗体轻链恒定区选自，例如，κ或λ，尤其是κ。
提供的抗体包括抗体片段。“抗体片段”指除完整抗体以外的分子，所述分子包含完整抗体的部分，该部分结合与所述完整抗体结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于，Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；可变重链(VH)区、单链抗体分子(例如scFv)和单结构域VH单抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方式中，抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，如scFv。
术语“可变区”或“可变结构域”指涉及抗体与抗原结合的抗体重链或轻链结构域。原始抗体的重链和轻链(分别为VH和VL)的可变结构域一般具有相似结构，其中各结构域包含四个保守框架区(FR)和三个CDR。(参见，例如，Kindt等.《免疫学》(Kuby Immunology)，第6版，WHF公司，第91页(2007))。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可使用来自结合特定抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合该抗原的抗体以分别筛选互补VL或VH结构域文库。参见例如，Portolano等，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等，Nature352:624-628(1991)。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方式中，单结构域抗体是人单结构域抗体。在一些实施方式中，所述CAR包含特异性结合抗原，如待靶向的细胞或疾病，例如肿瘤细胞或癌细胞的细胞表面抗原或癌症标记物的抗体重链结构域，例如本文所述的或本领域已知的任何靶抗原。
可通过各种技术制备抗体片段，包括但不限于对完整抗体的蛋白酶水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方式中，抗体是重组产生的片段，如包含非天然产生的排列的片段，如具有两个或更多个通过合成接头，例如肽接头连接的抗体区域或链，和/或可能不通过对天然产生的完整抗体的酶促水解消化产生的那些。在一些实施方式中，抗体片段是scFv。
“人源化”抗体是其中全部或基本全部CDR氨基酸残基衍生自非人CDR并且全部或基本全部FR氨基酸参加衍生自人FR的抗体。人源化的抗体可任选地包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指经过人源化，一般为了降低针对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和性的非人抗体的变体。在一些实施方式中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所衍生自的抗体)的相应残基取代，例如，为了恢复或改善抗体特异性或亲和性。
在一些实施方式中，CAR含有特异性识别在细胞表面上表达的抗原，如完整抗原的抗体或抗原结合片段(例如，scFv)。
在一些实施方式中，CAR含有TCR-状抗体，如特异性识别在细胞表面(如MHC-肽复合物)上呈递的胞内抗原，如肿瘤相关抗原的抗体或抗原结合片段(例如，scFv)。在一些实施方式中，可以重组受体，如抗原受体的部分的形式在细胞上表达识别MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分。抗原受体包括功能性非-TCR抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。一般而言，含有显示针对肽-MHC复合物的TCR-状特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可被称为TCR-样CAR。
在一些实施方式中，可通过用有效量的含有特异性MHC-肽复合物的免疫原免疫宿主来产生特异性结合至MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分。在一些情况中，MHC-肽复合物的肽是能够结合至MHC的抗原如肿瘤抗原，例如普遍肿瘤抗原、骨髓瘤抗原或下述的其他抗原的表位。在一些实施方式中，然后向宿主给予有效量的免疫原来引发免疫应答，其中免疫原保留其三维形式持续一段充足的时间以引发针对MHC分子的结合沟中肽的三维呈递的免疫应答。然后对从宿主收集的血清进行测试以确定是否产生识别MHC分子的结合沟中的肽的三维呈递的所需抗体。在一些实施方式中，可评价产生的抗体以确认，该抗体可区分MHC-肽复合物与仅MHC分子、仅感兴趣肽、和MHC与不相关肽的复合物。然后可分离所需的抗体。
在一些实施方式中，可通过采用抗体文库展示方法，如噬菌体抗体文库来产生特异性结合至MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方式中，可生成突变Fab、scFv或其他抗体形式的噬菌体展示文库，其中文库的成员在一种或多种CDR的一个或多个残基处突变。本领域已知这类方法的示例(参见，例如，美国公开申请号US20020150914，US2014/0294841；和Cohen CJ.等，(2003)J Mol.Recogn.16:324-332)。
某些实施方式中，CAR的胞外部分如抗体结合部分还包括间隔子，例如抗原识别组分(如scFv)与跨膜结构域之间的间隔区。间隔子可以是或包括免疫球蛋白恒区或其变体或其修饰形式的至少一部分，例如铰链区例(如IgG4铰链区)和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方式中，恒定区或部分是人IgG(如IgG4或IgG1)的。间隔子的长度可以是：与没有间隔子相比，该长度的间隔子提高抗原结合之后的细胞响应。在一些示例中，间隔子的长度是或约是12个氨基酸，或者不超过12个氨基酸。示例性的间隔子包括具有如下长度的那些：至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸、约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸或约10至15个氨基酸，并且包括上述所列范围的任何端点之间的整数。在一些实施方式中，间隔子区具有约12个氨基酸或更短，约119个氨基酸或更短或约229个氨基酸或更短。示例性间隔子包括单IgG4铰链，IgG4铰链连CH2和CH3结构域，或IgG4铰链连CH3结构域。示例性的间隔物包括但不限于，描述于如下文献的那些：Hudecek等.(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153,国际专利申请公开号WO2014031687，或美国专利号8,822,647或公开申请号US2014/0271635。
在一些实施方式中，恒定区或部分是人IgG(如IgG4或IgG1)的。在一些实施方式中，所述间隔子具有序列ESKYGPPCPPCP(示于SEQ ID NO:1)，并且由示于SEQ ID NO:158的序列编码。在一些实施方式中，所述间隔子具有示于SEQ ID NO:107的序列。在一些实施方式中，所述间隔子具有示于SEQ ID NO:108的序列。在一些实施方式中，所述恒定区或部分是IgD的。在一些实施方式中，所述间隔子具有示于SEQ ID NO:109的序列。在一些实施方式中，所述间隔物具有与SEQ ID NO:1、107、108或109显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。
胞外配体结合，例如抗原识别结构域一般连接至一个或多个胞内信号传导组分，例如模拟通过抗原受体复合物(就CAR而言是TCR复合物)和/或其他细胞表面来活化的信号传导组分。某些实施方式中，跨膜结构域连接胞外配体结合结构域和胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，CAR包括与胞外结构域融合的跨膜结构域。实施方式之一中，采用天然关联受体(例如CAR)内结构域之一的跨膜结构域。在一些情况中，跨膜结构域经氨基酸取代修饰或选择，以避免这类结构域结合相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域，尽可能减少与受体复合物其它成员的相互作用。
在一些实施方式中，所述跨膜结构域源自天然或合成来源。当所述来源是天然来源时，某些方面，所述结构域源自任何膜结合或跨膜蛋白。跨膜区包括源自T-细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD 16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD 154，和/或跨膜区包含其功能变体(例如基本保留其结构部分(例如，跨膜结构部分)、性质的那些)的那些(即包含至少它们的跨膜区域)。在一些实施方式中，所述跨膜结构域是源自CD4、CD28或CD8的跨膜结构域，例如，CD8α或其功能变体。或者，在一些实施方式中，所述跨膜结构域是合成的。某些方面，合成跨膜结构域以疏水残基为主，例如亮氨酸和缬氨酸。某些方面，合成跨膜结构域的各末端会有苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方式中，连接是通过接头、间隔子和/或跨膜结构域。
胞内信号传导结构域包括模拟或近似通过天然抗原受体的信号、通过此类受体联合共刺激受体的信号，和/或仅通过共刺激受体的信号的那些。在一些实施方式中，存在短的寡肽或多肽接头，例如，长度为2至10个氨基酸的接头，例如包含甘氨酸和丝氨酸(例如，甘氨酸-丝氨酸二联体)的接头，并在CAR的胞质信号传导结构域和跨膜结构域之间形成连接。
受体如CAR一般包括至少一种或一个胞内信号传导组分。在一些实施方式中，受体包括TCR复合物的胞内组分，例如介导T-细胞活化和细胞毒性的TCR CD3链，例如，CD3ζ链。因此，某些方面，抗原-结合部分连接一个或多个细胞信号传导模块。在一些实施方式中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3胞内信号传导结构域，和/或其它CD跨膜结构域。在一些实施方式中，所述受体，例如，CAR，还包括一种或多种其它分子的部分，例如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16。例如，在一些方面，CAR或其它嵌合受体包括CD3ζ(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16的嵌合分子。
在一些实施方式中，在CAR或其它嵌合受体结合时，受体的胞质结构域或胞内信号传导结构域活化免疫细胞(如经改造表达CAR的T细胞)至少一项正常效应功能或应答。例如，在一些情况中，CAR诱导T细胞诸如溶细胞活性或辅助性T细胞活性等功能，如分泌细胞因子或其它因子。在一些实施方式中，采用抗原受体部分或共刺激分子的胞内信号传导结构域的截短部分来替代完整免疫刺激链，例如，如果其转导效应物功能信号的话。在一些实施方式中，一个或多个胞内信号传导结构域包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面中，还包括天然情况下存在与这些受体一致作用以在抗原受体接合后启动信号传导的共受体。
就天然TCR而言，完全活化一般不仅需要通过TCR的信号传导，而且还需要共刺激信号。因此，在一些实施方式中，为了促进完全活化，CAR还包括用于产生次或共刺激信号的组分。在其他实施方式中，CAR不包括用于产生共刺激信号的组分。某些方面，同一细胞表达另一CAR来提供用于产生次或共刺激信号的组分。
某些方面，T细胞活化被认为通过两类胞质信号传导序列介导：引发通过TCR的抗原依赖性主活化的那些(主胞质信号传导序列)和以非抗原依赖性方式作用提供次或共刺激信号的那些(次胞质信号传导序列)。某些方面，CAR包括这些信号传导组分之一或两者。
某些方面，CAR包括主胞质信号传导序列，其调控TCR复合物的主活化。以刺激方式作用的初级胞质信号传导序列可包含信号传导基序，这些基序又称基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。ITAM的示例包括主要胞质信号传导序列，其包括源自如下的那些：TCRζ，FcRγ，CD3γ，CD3δ和CD3ε。在一些实施方式中，CAR中的胞质信号传导分子包含胞质信号传导结构域，其部分，或源自CD3ζ的序列。
在一些实施方式中，CAR包括共刺激受体(例如CD28、4-1BB、OX40、DAP10，和ICOS)的跨膜部分和/或信号传导结构域。某些方面，同一CAR既包含活化组分又包含共刺激组分。
在一些实施方式中，活化结构域包括在一个CAR内，而共刺激组分由识别另一种抗原的另一CAR提供。在一些实施方式中，CAR包括活化或刺激性CAR、共刺激CAR，其均表达在相同细胞上(参见WO2014/055668)。在一些方面，细胞包括一种或多种刺激或活化CAR和/或共刺激CAR。在一些实施方式中，细胞还包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等，Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月))，如识别除了与疾病或病症相关和/或特异性的CAR，由此通过所述疾病靶向CAR递送的激活信号通过抑制性CAR与其配体结合而减少或抑制，例如减少脱靶效应。
在一些实施方式中，所述重组受体的胞内信号传导部分，例如CAR，包含CD3ζ胞内结构域和共刺激信号传导区。在某些实施方式中，所述胞内信号传导结构域包含CD28跨膜和信号传导结构域，其连接至CD3(例如，CD3-ζ)胞内结构域。在一些实施方式中，胞内信号传导结构域包括了嵌合CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域，其连接CD3ζ胞内结构域。
在一些实施方式中，CAR的胞质部分包含一个或多个例如两个或更多共刺激结构域和活化结构域如主要活化结构域。示例性的CAR含有CD3-ζ、CD28和4-1BB的胞内部分。
在一些实施方式中，CAR或其它抗原受体还包括标志物，例如细胞表面标志物，其可用于确定使细胞表达受体(例如细胞表面受体的截短形式，例如截短的EGFR(tEGFR))的转导或工程改造。在一些方面，标志物包括CD34、NGFR或表皮生长因子受体(例如tEGFR)的全部或部分(例如截短形式)。在一些实施方式中，编码标志物的核酸可操作性地连接编码接头序列(例如可切割接头序列，例如，T2A)的多核苷酸。例如，标志物，和任选地，接头序列，可以是公开的专利申请号WO2014031687中描述的任一种。例如，所述标志物可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，例如T2A可切割接头序列。用于截短的EGFR(例如tEGFR)的示例性的多肽包含示于SEQ ID NO:111的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:111显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。示例性T2A接头序列包含SEQ ID NO:110所示的氨基酸序列或显示出与SEQ ID NO:110有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，标志物是分子，例如，非天然可见于T细胞或T细胞表面的细胞表面蛋白或其组成部分。
在一些实施方式中，所述分子是非自体分子，例如非自体蛋白质，即不被待接受该细胞过继转移的宿主的免疫系统识别为“自身”的蛋白质。
在一些实施方式中，所述标志物无治疗性功能和/或除了用作遗传改造的标志物(例如，用于选择成功被改造的细胞)之外没有任何作用。在其它实施方式中，标志物可以是治疗性分子或发挥一些所需效果的分子，如待在体内遇到的细胞的配体，如共刺激或免疫检查点分子，以增强和/或减弱细胞在过继转移和遇到配体之后的应答。
在一些情况中，CAR被称为第一、第二和/或第三代CAR。在一些方面中，第一代CAR是在抗原结合时仅提供CD3链诱导信号的CAR；在一些方面中，第二代CAR是提供此信号和共刺激信号的CAR，如包括来自共刺激受体(例如CD28或CD137)的胞内信号传导结构域的CAR；在一些方面中，第三代CAR是包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
在一些实施方式中，嵌合抗原受体包括包含抗体或抗体片段的胞外部分。在一些方面，嵌合抗原受体包括包含抗体或片段的胞外部分和胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，抗体或片段包括scFv，且胞内结构域包含ITAM。在一些方面中，所述胞内信号传导结构域包括CD3-ζ链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方式中，嵌合抗原受体包括跨膜结构域，其连接胞外结构域和胞内信号传导结构域。在一些方面中，所述跨膜结构域包含CD28的跨膜部分。某些实施方式中，受体(如CAR)的跨膜结构域是人CD28或其变体的跨膜结构域，例如人CD28(登录号：P10747.1)的27氨基酸跨膜结构域。在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含T细胞共刺激分子的细胞内结构域。胞外结构域和跨膜结构域可直接或间接相连。在一些实施方式中，胞外结构域和跨膜通过间隔子，例如本文所述的任何间隔子连接。在一些实施方式中，所述受体包含作为跨膜结构域的衍生来源的分子的胞外部分，例如CD28胞外部分。在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含源自T细胞共刺激分子或其功能变体的胞内结构域，例如在跨膜结构域和胞内信号传导结构域之间。某些方面，T细胞共刺激分子是CD28或41BB。
例如，在一些实施方式中，CAR含有抗体，例如抗体片段，是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域，以及含有CD28的信号传导部分或功能性变体的胞内信号传导结构域，和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体。在一些实施方式中，CAR含有抗体，例如抗体片段，是包含或含有CD28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域，以及含有4-1BB的信号传导部分或功能变体的胞内信号传导结构域，以及CD3ζ的信号传导部分或其功能变体。在一些所述实施方式中，所述受体还包括间隔物，其包含Ig分子(例如人Ig分子)的部分，例如Ig铰链，例如IgG4铰链，例如仅铰链间隔物。
在一些实施方式中，所述重组受体(例如，CAR)的跨膜结构域是或包括人CD28(例如登录号P01747.1)或其变体的跨膜结构域，例如包含示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列的跨膜结构域，或与SEQ ID NO:2显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列；在一些实施方式中，包含重组受体的部分的跨膜-结构域包含示于SEQ ID NO:104的氨基酸序列，或与其具有至少是或约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含T细胞共刺激分子的细胞内结构域。某些方面，T细胞共刺激分子是CD28或41BB。
在一些实施方式中，所述重组受体(例如CAR)的胞内信号传导部分包含人CD28或其功能变体或部分的胞内共刺激信号传导结构域，例如在原始CD28蛋白的位置186-187处具有LL-GG取代的结构域。例如，胞内信号传导结构域可包含示于SEQ ID NO:112或113的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:112或113显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述胞内结构域包含4-1BB(例如(登录号Q07011.1)或功能变体或其部分的胞内共刺激信号传导结构域，例如示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述重组受体(例如CAR)的胞内信号传导结构域包含人CD3ζ刺激信号传导结构域或其功能变体，例如人CD3ζ(登录号:P20963.2)同种型3的112AA胞质结构域，或CD3ζ信号传导结构域，其描述于美国专利号:7,446,190或美国专利号8,911,993。例如，在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含如SEQ ID NO:4、105或159所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO:4、105或159有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性的氨基酸序列。
在一些方面中，所述间隔物仅包含IgG的铰链区，例如仅IgG4或IgG1的铰链，例如仅示于SEQ ID NO:1的间隔物铰链。在其它实施方式中，所述间隔物是或包含Ig铰链，例如，IgG4源性的铰链，其任选地连接至CH2和/或CH3结构域。在一些实施方式中，所述间隔物是Ig铰链，例如，IgG4铰链，其连接至CH2和CH3结构域，例如示于SEQ ID NO:108。在一些实施方式中，所述间隔物是Ig铰链，例如，IgG4铰链，其仅连接至CH3结构域，例如示于SEQ IDNO:107。在一些实施方式中，间隔子是或含富甘氨酸-丝氨酸序列或其它柔性接头，例如已知柔性接头。
例如，在一些实施方式中，CAR包括抗体，例如抗体片段，包括scFv，间隔物，例如含有免疫球蛋白分子的一部分的间隔物，例如铰链区和/或一个或多个重链分子恒定区，例如含有Ig-铰链的间隔物，含有全部或部分CD28衍生的跨膜结构域的跨膜结构域，CD28衍生的胞内信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。某些实施方式中，CAR包含：胞外配体结合部分，如特异性结合某抗原(如本文所述抗原)的抗原结合部分，如抗体或其片段(包括sdAb和scFv)；间隔子，例如含各种Ig铰链区的间隔子；跨膜结构域，是CD28的组成部分或其变体；胞内信号传导结构域，含有4-1BB的信号传导部分或其功能性变体；和CD3ζ的信号传导部分或其功能性变体。
在一些实施方式中，编码所述CAR构建体的核酸分子还包括编码T2A核糖体跳跃元件和/或tEGFR序列的序列，例如，在编码CAR的序列的下游。在一些实施方式中，所述序列分别编码SEQ ID NO:110和/或111所示的T2A核糖体跳跃元件和/或tEGFR序列，或与SEQ IDNO:110和/或111显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，还可产生表达抗原受体(例如CAR)的T细胞以表达截短EGFR(EGFRt)作为非免疫原性的选择表位(例如通过引入编码被T2A核糖体开关隔开的CAR和EGFRt的构建体，以从相同构建体表达两种蛋白质)，其随后可被用作标志物以检测所述细胞(参见例如美国专利号8,802,374)。
2.嵌合受体的示例性修饰
在一些实施方式中，所述变体嵌合受体包含经修饰的接合区域，该经修饰的接合区域在所述参考嵌合受体的接合区域中包含一个或多个修饰(例如插入、缺失或替代)，其中，所述参考嵌合受体包含第一结构域和第二结构域，其中，该第一结构域是或包含胞外配体结合结构域或其部分，该第二结构域是或包含铰链结构域或其部分，它们在接合部分处以连续的序列接合。
在一些实施方式中，所述变体嵌合受体包含经修饰的接合区域，所述经修饰的接合区域在所述参考嵌合受体的接合区域中包含一个或多个修饰(例如插入、缺失或替代)，其中，所述参考嵌合受体包含第一结构域和第二结构域，其中，该第一结构域是或包含铰链结构域或其部分，而第二结构域是或包含跨膜结构域或其部分，它们在接合部分处以连续的序列接合。
在一些实施方式中，所述变体嵌合受体包含经修饰的接合区域，所述经修饰的接合区域在所述参考嵌合受体的接合区域中包含一个或多个修饰(例如插入、缺失或替代)，其中，所述参考嵌合受体包含第一结构域和第二结构域，其中，该第一结构域是或包含跨膜结构域或其部分，而第二结构域是或包含共刺激信号传导结构域或其部分，它们在接合部分处以连续的序列接合。
在一些实施方式中，所述变体嵌合受体包含经修饰的接合区域，所述经修饰的接合区域在所述参考嵌合受体的接合区域中包含一个或多个修饰(例如插入、缺失或替代)，其中，所述参考嵌合受体包含第一结构域和第二结构域，其中，该第一结构域是或包含共刺激信号传导结构域或其部分，而第二结构域是或包含活化性胞质信号传导结构域或其部分，它们在接合部分处以连续的序列接合。
在一些实施方式中，所述参考嵌合受体的第一结构域是或包含跨膜结构域或其部分。在一些实施方式中，所述跨膜结构域包括源自下述部分的那些(即包含下述部分的至少跨膜区域)：T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD 154和/或包含其功能变体(例如基本保留其结构(例如跨膜)性质的部分的那些)的跨膜区域。在一些实施方式中，所述跨膜结构域是源自CD4、CD28或CD8的跨膜结构域，例如，CD8α或其功能变体。在一些实施方式中，跨膜结构域源自人蛋白质或是人的。在一些实施方式中，所述参考嵌合受体的第二结构域是或包含共刺激信号传导结构域，其直接连接或接合至所述跨膜结构域。在一些实施方式中，所述共刺激信号传导结构域是或包含CD28、4-1BB、OX40、DAP10和ICOS的信号传导结构域。在一些实施方式中，共刺激结构域源自人蛋白质或是人的。
在一些实施方式中，所述变体嵌合受体包含经修饰的接合区域，所述经修饰的接合区域在所述参考嵌合受体的接合区域中包含一个或多个修饰(例如插入、缺失或替代)，其中，所述参考嵌合受体包含第一结构域和第二结构域，其中，该第一结构域是或包含CD28跨膜结构域或其部分，而第二结构域是或包含4-1BB共刺激信号传导结构域或其部分，它们在接合部分处以连续的序列接合。在一些实施方式中，所述CD28跨膜结构域是或包含示于SEQ ID NO:2、103或104的氨基酸序列，或是其功能部分或变体，所述功能部分或变体包含与SEQ ID NO:2、103或104显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的序列。在一些实施方式中，所述4-1BB信号传导结构域是或包含示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或是其功能部分或变体，所述功能部分或变体包含与SEQ ID NO:3显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列相同性的序列。在一些实施方式中，第一结构域和第二结构域一起包含或具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或其功能部分或变体，所述功能部分或变体包含与SEQ ID NO:5显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述参考嵌合受体的第一结构域和第二结构域一起具有或包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述变体嵌合受体包含经修饰的接合区域，该经修饰的接合区域与SEQ ID NO:137具有小于100％序列相同性，但与SEQ ID NO:137具有大于85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或96％序列相同性且包括修饰，例如如上所述的任一种。在一些实施方式中，所述变体嵌合受体具有或包含与SEQ ID NO:5具有小于100％序列相同性，但与SEQ ID NO:5具有大于85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或96％的序列相同性的氨基酸序列，且包括修饰，例如如上所述的任一种。在一些实施方式中，所述变体嵌合受体具有或包含与SEQ ID NO:160具有小于100％序列相同性，但与SEQ ID NO:160具有大于85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或96％的序列相同性的氨基酸序列，且包括修饰，例如如上所述的任一种。在一些实施方式中，所述变体嵌合受体具有或包含经修饰的接合区域，所述经修饰的接合区域包含示于SEQ ID NO:138-157和184中任一项的氨基酸序列，包含与SEQ ID NO:138-157和184中所示任一项氨基酸序列显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或96％序列相同性的氨基酸序列的其功能变体，或其功能部分，各自包括一个或多个修饰，例如如上所述的任一种。
在一些实施方式中，所述变体嵌合受体在所述跨膜结构域(例如所述CD28跨膜结构域)中的疏水氨基酸残基处或位置或疏水部分中不包含修饰。在一些实施方式中，所述变体嵌合受体在所述跨膜结构域(例如所述CD28跨膜结构域)中的疏水氨基酸残基处或位置或疏水部分中包含一个或多个修饰。在一些实施方式中，所述一个或多个修饰是或包含所述疏水氨基酸被另一不同疏水氨基酸残基取代的修饰。在一些实施方式中，所述一个或多个修饰不是或不包含位于所述跨膜结构域中的疏水氨基酸残基处或位置或疏水部分内的，不是被另一疏水氨基酸残基取代，的修饰。
在一些情况中，跨膜结构域包含与膜的脂双层相互作用的一个或多个色氨酸残基。在一些情况中，所述一个或多个色氨酸残基可位于脂-水界面附近。在一些情况中，所述一个或多个色氨酸残基锚着或有助于锚着跨膜结构域至所述膜内。参见例如de Jesus和Allen,Biochim Biophys Acta.2013年2月；1828(2):864-76。在一些实施方式中，所述变体嵌合受体在所述跨膜结构域(例如所述CD28跨膜结构域)中的色氨酸之一或两者处不包含修饰。在一些实施方式中，所述嵌合受体在参考SEQ ID NO:5编号的对应于位置2和/或位置26处的氨基酸位置(其各自对应于所述参考嵌合受体中的色氨酸)不包含修饰。
在一些方面，评估嵌合受体或其部分的疏水特征。在一些实施方式中，诸如总平均亲水性值(GRAVY)的程序用于评估嵌合受体(例如变体嵌合受体)或其部分的总体疏水性。在一些实施方式中，使用程序，例如通过ExPASy(瑞士)可获得的程序，以确定嵌合受体或其部分的总体疏水性评分。在一些方面，嵌合受体包含跨膜结构域，其可具有表明该结构域的总体特征是疏水的疏水性评分。在一些方面，嵌合受体包含除跨膜结构域之外的一个或多个结构域，其可具有疏水性评分，表明一个或多个其他结构域是总体亲水的。在一些方面，给定蛋白质序列(例如嵌合受体或其部分)的每个单独氨基酸残基的疏水性基于疏水性标度计算。示例性的氨基酸疏水性标度包括但不限于Kyte和Doolittle(1982)，Engelman等(1986)，Nozaki和Tanford(1971)，Miyazawa和Jernigan(1996)，Miyazawa和Jernigan(1999)，以及Black和Mold(1991)所计算和/或报道的那些。在一些实施方式中，报告或标准化疏水性标度，使得亲水性残基或肽的评分低于0，疏水性残基或肽的评分高于0。因此，在一些方面，跨膜结构域可具有高于0的总体疏水性评分，或可包含疏水性评分高于0的个体残基。在一些实施方式中，对于未修饰的残基或肽的疏水性评分而言，对残基、肽、嵌合受体或其部分的突变或修饰是保守的。
在一些实施方式中，变体嵌合受体或其部分，例如，含有修饰的接合区域的部分和/或含有变体嵌合受体中对应于参考嵌合受体的跨膜结构域的结构域的部分，具有基本上疏水的亲水性概况和/或具有正的总平均亲水性(GRAVY)值。在一些实施方式中，GRAVY值大于0、0.25、0.5、0.75、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2或更大。
在一些实施方式中，所述变体嵌合受体在所述共刺激信号传导结构域的信号传导相关或必需的氨基酸残基处或位置，例如，在4-1BB信号传导相关或必需的氨基酸残基处或位置，不包含修饰。一般而言，共刺激信号传导涉及与TRAF分子的相互作用。在一些实施方式中，所述变体嵌合受体在与用于结合至TRAF分子的结合基序相互作用或是该结合基序的部分的氨基酸残基处或位置不包含修饰。在一些实施方式中，所述变体嵌合受体在包含基序(P/S/A/T)X(Q/E)E的参考嵌合受体的共刺激信号传导结构域中的氨基酸残基处或位置不包含修饰。在一些实施方式中，所述TRAF分子是TRAF 1、TRAF2和/或TRAF3。在一些实施方式中，与参考嵌合受体的共刺激信号传导结构域相对应的变体嵌合受体中的结构域能够诱导TRAF的活化或细胞定位和/或能够诱导TRAF介导的信号传导。在一些实施方式中，所述变体嵌合受体在对应于49-52的位置处包含氨基酸TTQE和/或在对应于残基60-63的位置处包含氨基酸PEEE，其各自参考SEQ ID NO:5所示编号。
在一些实施方式中，所述变体嵌合受体在残基13和42之间或氨基酸残基15和40之间的部分内包含一个或多个氨基酸修饰，参考SEQ ID NO:5所示编号。
在一些实施方式中，所述修饰是或包括一个或多个氨基酸残基的插入。在一些实施方式中，所述一个或多个插入位于毗邻所述结构域之间的接合部分的氨基酸残基之间。在一些实施方式中，所述一个或多个氨基酸插入位于氨基酸残基27和28之间，参考SEQ IDNO:5所示编号。在一些实施方式中，一个或多个插入可包括插入多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基。在一些实施方式中，插入是1、2、3、4或5个氨基酸残基。在一些实施方式中，所述插入是对任何氨基酸残基的插入。在一些实施方式中，所述插入是天冬酰胺(N)的插入。
在一些实施方式中，所述修饰是或包括对应于残基28、31或34的残基处的一个或多个氨基酸替代，参考SEQ ID NO:5所示编号。在一些实施方式中，所述氨基酸替代可以是针对任何其它氨基酸的替代。在一些实施方式中，所述氨基酸替代是针对如下氨基酸残基的替代：亮氨酸(L)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)或组氨酸(H)。在一些实施方式中，所述氨基酸替代是或对应于如下一个或多个：K28A、K28H、K28L、K28Q、K28S、R31A、R31H、R31L、R31N、R31S、L34A和L34S，参考SEQ ID NO:5所示编号。
在一些实施方式中，所述变体嵌合受体包含经修饰的接合区域，其相较于参考嵌合受体的接合区域具有两个或更多个，例如多至2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸修饰。在一些实施方式中，所述氨基酸修饰包括对应于如下两个或更多个的氨基酸替代：K28A、K28H、K28L、K28Q、K28S、R31A、R31H、R31L、R31N、R31S、L34A和L34S，参考SEQ ID NO:5所示编号。在一些实施方式中，所述氨基酸替代是或对应于选自下组的氨基酸替代：K28Q/R31A、K28Q/R31N、K28Q/R31S、K28Q/L34A、K28Q/L34S、R31N/L34A、R31N/L34S、K28Q/R31N/L34A、K28Q/R31N/L34S。
在一些实施方式中，所述变体嵌合受体具有或包含经修饰的接合区域，所述经修饰的接合区域具有示于SEQ ID NO:138-157和184中任一项的氨基酸序列，包含与SEQ IDNO:138-157和184中所示任一项氨基酸序列显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或96％序列相同性的氨基酸序列的其功能变体，或其功能部分，各自包括一个或多个修饰。
在一些实施方式中，所述变体嵌合受体具有或包含SEQ ID NO:114-134和183中任一项所示的氨基酸，包含与SEQ ID NO:114-134和183中所示任一项氨基酸序列显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或96％序列相同性的氨基酸序列的其功能变体，或其功能部分，各自包括一个或多个修饰。
3.变体嵌合受体的特征
在一些实施方式中，所述变体嵌合受体包含经修饰的接合区域，从而所述区域的或源自所述区域的肽片段显示对于人白细胞抗原(HLA)的较低结合亲和性和/或所述区域显示减少的免疫原性，包括在给予对象之后。
在一些实施方式中，具有经修饰的接合区域的8-15个氨基酸部分的序列的肽片段具有对人白细胞抗原(HLA)分子具有的结合亲和性低于具有参考嵌合受体的接合区域的对应部分的序列的肽片段对于相同HLA分子的结合亲和性。在一些实施方式中，所述参考嵌合受体的接合区域的对应部分的肽片段具有小于1000nM、小于500nM或小于50nM的结合亲和性。
在一些实施方式中，经修饰的接合区域中的全部8-15个氨基酸片段，或全部8、9、10、11、12、13、14，或15个氨基酸片段，对于人HLA分子的平均结合亲和性，低于参考嵌合受体的接合区域内的全部8-15个氨基酸片段或全部8、9、10、11、12、13、14，或15个氨基酸片段的平均结合亲和性。在一些实施方式中，所述结合亲和性或平均结合亲和性低超过2倍、超过5倍、超过10倍、超过25倍、超过50倍或超过100倍。
在一些实施方式中，对人白细胞抗原(HLA)具有小于1000nM的结合亲和性的经修饰的接合区域的8-15个氨基酸部分的序列的肽片段的数量，相较于具有对相同HLA具有相同接合亲和性的参考嵌合受体的接合区域的8-15个氨基酸部分的序列的肽片段的数量，是减少的。在一些实施方式中，对人白细胞抗原(HLA)具有小于500nM的结合亲和性的经修饰的接合区域的8-15个氨基酸部分的序列的肽片段的数量，相较于具有对相同HLA具有相同接合亲和性的参考嵌合受体的接合区域的8-15个氨基酸部分的序列的肽片段的数量，是减少的。在一些实施方式中，对人白细胞抗原(HLA)具有小于50nM的结合亲和性的经修饰的接合区域的8-15个氨基酸部分的序列的肽片段的数量，相较于具有对相同HLA具有相同接合亲和性的参考嵌合受体的接合区域的8-15个氨基酸部分的序列的肽片段的数量，是减少的。
在一些实施方式中，所述结合亲和性可通过实验或通过算法确定。在一些实施方式中，对于MHC的肽结合亲和性可通过计算，例如通过采用基于定量结合亲和性模型(Lafuente和Reche(2009)Current Pharmaceutical Design,15:3209-3220)的算法来确定。在一些实施方式中，所述结合亲和性可在体外试验中确定。
在一些实施方式中，确定肽对MHC分子的结合亲和性涉及放射性或荧光竞争结合试验。参见例如Ettinger等，J.Immunol.160:2365(1998)。在一些实施方式中，所述竞争试验产生不同肽的结合亲和性的比较。一些MHC结合研究采用来自EBV转化的细胞系的去污剂稳定的I类分子(参见，例如Sette,A.等，MolImmunol,31(11):813-22(1994)。在一些实施方式中，所述竞争性试验涉及天然加载的MHC，并且感兴趣的MHC分子可从去污剂裂解物中的其它MHC分子纯化出来或可用于与其它MHC分子混合。在一些实施方式中，可鉴定带放射性标记的肽，其具有对于在研MHC分子的高亲和性。在一些实施方式中，随后通过额外的“测试”肽与该高亲和性的带放射性标记的肽竞争的能力来确定它们对于在研MHC分子的亲和性。
在一些实施方式中，确定肽亲和性可涉及重建试验，例如采用“T2”细胞，其中表达合适MHC等位基因的细胞通过在pH 2-3孵育一段较短时间被“剥离”原始结合肽。在一些实施方式中，为了确定推定的MHC-结合肽对于相同MHC等位基因的结合亲和性，剥离的MHC单体可与推定的MHC-结合肽、β2-微球蛋白和构象依赖性单克隆抗体在溶液中合并。在一些实施方式中，用或不用的标记(例如，直接用带标记的单克隆抗体标记或用荧光标记的二抗标记)后的测试结合肽孵育的细胞之间测定的荧光强度差异可用于确定测试肽的结合。
在一些实施方式中，对于MHC(例如HLA)分子的结合亲和性用IC50代表，其为结合试验中的肽浓度，在该浓度下观察到参考肽的结合的50％抑制。在一些情况中，此类试验可在其中IC50值约为KD值(即，限制HLA蛋白和带标记的肽浓度)的条件下进行。在一些实施方式中，结合可相对于参考肽表示。
在一些实施方式中，可以使用计算机模拟方法预测结合亲和性。使用算法或其他计算方法预测MHC结合的结合亲和性的示例性计算机模拟方法是本领域已知的，参见，例如，Marsh等，《HLA概况》(The HLA Factsbook)(学院出版社(Academic Press)，2000)。在一些实施方式中，算法可用于预测感兴趣的肽是否应该结合至给定的MHC分子。参见例如，Southwood等，J.Immunol.160:3363(1998)；Honeyman等，Nat.Biotechnol.16:966-969(1998)；Breisie等，Bioinformatics 14:121-131(1998)，以及“SYFPEITHI”算法(Hans-Georg Rammensee等，Immunogenetics(1999)50:213-219)，Zhang等，PLoS ONE7(2):e30483.doi:10.1371/journal.pone.0030483，免疫表位和分析资源(IEDB)(Peters B等，PLoS Biology 3:379(2005))，和“BIMAS”算法(Parker,K.C.，M.A.Bednarek和J.E.Coligan.J.Immunol.152:163(1994)。
在一些实施方式中，算法预测工具，包括可获自IEDB的那些，采用利用ANN的一种或多种预测法(Nielsen等.(2003)Protein Sci.,12:1007-1017和Lundegaard等.(2008)NAR,36:W509-512)，SMM(Peters和Sette(2005)BMC Bioinformatics,6:132)和comblib(Sidney等.(2008)Immunome Res.4:2)，或Consensus工具(参见Kim等(2012)，免疫表位数据库分析资源，NAR，联合任何前述的预测法)。
在一些实施方式中，抗原处理的预测可采用变幻虫切割的算法(PaProC)来完成。参见Kuttler等，J.Mol.Biol.298(2000),417-429和Nussbaum等，Immunogenetics 53(2001),87-94。
在一些实施方式中，可评估嵌合受体(例如CAR)，包括变体嵌合受体(例如变体CAR)，以确定在给予对象后是否诱导对分子的可检测的免疫应答。在一些实施方式中，可以用嵌合受体(例如CAR)治疗对象，例如，通过给予用嵌合受体或CAR基因工程改造的细胞。可以评估体液或细胞介导的人应答的存在。在一些实施方式中，可通过诸如ELISpot，胞内细胞因子染色，ELISA(例如细胞因子)或基于细胞的抗体检测方法，例如通过流式细胞术，对来自对象的血清鉴定是否存在特异性结合至和/或中和嵌合受体(例如，CAR)的结合表位的抗体。在一些实施方式中，可以使用细胞毒性T淋巴细胞(CTL)测定来评估针对嵌合受体(例如在工程改造的细胞上表达的嵌合受体)的细胞介导的免疫应答，该测定用于检测特异性结合至并诱导细胞毒性和/或混合淋巴细胞反应的CD8+T细胞，使用表达嵌合受体的细胞(例如受照射的细胞)作为刺激细胞。
在一些实施方式中，可以用重叠并跨越特定抗原长度的肽的合成文库刺激来自给予嵌合受体(例如，受体)的对象的分离的免疫细胞(例如，PBMC)，从而在体外测定中评估免疫应答。可以使用包括但不限于ELISpot，胞内细胞因子染色，细胞毒性T淋巴细胞测定和/或混合淋巴细胞反应的方法评估刺激细胞中的免疫应答。在一些实施方式中，通过T细胞增殖(例如使用3H-胸苷掺入)或细胞因子产生来测量T细胞活化。TH1型CD4+T细胞的活化可以例如通过IFNγ产生来检测，其可以通过标准技术检测，例如ELISPOT测定。
在一些实施方式中，酶联免疫斑点(ELISpot)测定法可用于评估对嵌合受体的免疫应答。在一些方面，ELISpot可以适于检测分泌特定细胞因子或其他效应分子的单个细胞，这通过在微板上附着对细胞因子或效应分子特异的单克隆抗体实现。可以使抗原刺激的细胞与固定化抗体接触。在洗去细胞和任何未结合的物质后，可以向孔中加入对相同细胞因子或其他效应分子特异的标记的多克隆抗体或更常见的为单克隆抗体。洗涤后，可加入与标记的抗体结合的着色剂，使得在细胞因子定位位点形成蓝黑色沉淀(或斑点)。可手动计数斑点或使用自动ELISpot读数器系统对斑点进行计数以定量应答。
在一些实施方式中，CD8+T细胞介导的细胞毒性活性可用于评估对嵌合受体的免疫应答。在一些实施方式中，可以通过铬释放测定法分析用抗原(例如脾细胞)刺激的细胞对51Cr标记的细胞的细胞毒性。该测定可以测量由于杀伤细胞活性引起的(生物)放射性铬从细胞中的释放。可以以各种效应物-靶标(E/T)比例在体外用抗原再刺激细胞，例如用嵌合受体再刺激基因工程改造的细胞(例如表达CAR的细胞)，包括T细胞，载有肽的T细胞和/或非转导(“模拟”)T细胞(靶标)。共同孵育之后，可定量铬的释放，并且确定各样品中最大可达裂解的百分比。未检测到溶细胞活性特异性的条件表明，与致耐受性肽共同给药后，对嵌合受体的特异性免疫应答未发生。该结果可能表明在能够诱导对嵌合受体的免疫原性耐受的条件下给予特定肽的潜在影响(hit)。
在一些实施方式中，胞内细胞因子染色用于评估对嵌合受体的免疫应答，例如在存在或不存在与致耐受性肽共同给药的情况下。可以从小鼠中分离免疫细胞，例如脾细胞，并用抗体染色以检测CD8和CD4表面表达和细胞因子(包括例如IFNγ)的细胞内表达。胞内细胞因子染色表明T细胞不产生对嵌合受体的特异性免疫应答的情况可能表明在能够诱导对嵌合受体的免疫原性耐受的条件下给予特定肽的潜在影响。
在一些实施方式中，使用克隆测序来评估对嵌合受体的免疫应答。可以对来自受攻击小鼠或患者的T细胞的T细胞受体进行测序(参见Arstila等(1999)Science 286,958-961；WO2012/083069)。没有克隆TCR扩增表明T细胞不会对嵌合受体产生特异性免疫应答。这可能表明在能够诱导对嵌合受体的免疫原性耐受的条件下给予特定肽的潜在影响。
在一些实施方式中，与对参考嵌合受体产生的免疫应答相比，变体嵌合受体表现出降低的可检测免疫应答。在一些实施方式中，所述免疫应答是体液免疫应答。在一些实施方式中，所述免疫应答是细胞介导的免疫应答。在一些实施方式中，所述免疫应答减少大于1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、50倍、100倍或更多。
在一些实施方式中，在给予人对象时，变体嵌合受体表现出与参考嵌合受体(例如未修饰的或亲本嵌合受体)相比降低的免疫原性，任选地其中对象已接受参考嵌合受体的给予。在一些实施方式中，降低的免疫原性包括降低的CD4+T细胞免疫应答和/或降低的CD8+T细胞免疫应答。在一些实施方式中，免疫原性减少大于1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、50倍、100倍或更多。
在一些实施方式中，在给予表达变体嵌合受体(例如CAR)的细胞后，表达变体嵌合受体的细胞的最大数目、表达变体嵌合受体的细胞随时间的曲线下面积(AUC)、和/或对象中可检测的变体嵌合受体表达细胞的持续时间与通过包括给予表达参考嵌合受体的细胞的方法所实现的相比更大/长。在一些实施方式中，所述方法导致所述对象的血液中表达变体嵌合受体的细胞的最大浓度或数量为至少等于或约10个表达嵌合受体的细胞/微升，至少50％的外周血单核细胞(PBMC)的总数，至少约1x 105个表达嵌合受体的细胞，或至少1000或至少2000或至少3000或至少4000或至少5000个拷贝的编码CAR的DNA/微克DNA。在一些实施方式中，在开始给予表达变体嵌合体受体的细胞后第30天、第60天或第90天，可在对象的血液或血清中检测到表达变体嵌合受体的细胞。
在一些实施方式中，与参考嵌合受体(不含氨基酸替代的未修饰的或亲本嵌合受体)相比，变体嵌合受体表现出降低的如上所述的免疫原性，同时也保留了生物活性或功能，例如细胞毒性活性。在一些实施方式中，生物活性，例如细胞毒性活性，以抗原特异性方式存在。在一些实施方式中，变体嵌合受体的生物学或功能活性(例如细胞毒性活性)为不含氨基酸替代的未修饰或亲本嵌合受体的生物活性或功能活性(例如细胞毒性活性)的至少40％，50％，60％，70％，例如通常至少75％，80％，85％，90％，95％。
在一些实施方式中，嵌合受体的生物活性或功能活性，例如细胞毒性活性，可以使用许多已知方法中的任何一种来测量。可以在体外或体内评估或确定活性。在一些实施方式中，一旦将细胞给予对象(例如人)，就可以评估活性。用以评估的参数包括：工程改造的或天然T细胞或其它免疫细胞与抗原的特异性结合，体内方式(例如，通过成像)或离体方式(例如，通过ELISA或流式细胞术)。在某些实施方式中，工程改造的细胞破坏靶细胞的能力可采用本领域已知的任何合适的方法来检测，例如描述于如下文献的细胞毒性试验，例如，Kochenderfer等，J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和Herman等.J.ImmunologicalMethods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方式中，也可通过测定某些细胞因子，例如CD107a，IFNγ，IL-2和TNF的表达和/或分泌，来测量细胞的生物活性。某些方面，生物活性通过评估临床效果来检测，例如肿瘤负荷或负载的减少。
III.核酸、载体和工程改造的细胞
还提供了用于产生基因工程改造的细胞的方法、核酸、组合物和试剂盒。基因工程改造一般涉及将编码嵌合受体的核酸导入含有经培养细胞的组合物中，例如，通过逆转录病毒转导、转染或转化进行。
在一些实施方式中，核酸分子编码重组受体，例如嵌合受体，例如上述的任何一种。还提供了含有这种核酸分子的载体或构建体。在一些实施方式中，载体或构建体含有与编码受体的核苷酸可操作地连接以驱动其表达的一个或多个启动子。在一些实施方式中，启动子可操作地连接至一个或多个核酸分子。
在一些实施方式中，载体或构建体可含有驱动一种或多种核酸分子表达的单一启动子。在一些实施方式中，此类启动子可以是多顺反子(双顺反子或三顺反子，参见例如美国专利号6,060,273)。例如，在一些实施方式中，转录单元可以经工程改造为含有IRES(内部核糖体进入位点)的双顺反子单元，其允许通过来自单一启动子的信息共表达基因产物(例如编码第一和第二嵌合受体)。或者，在一些情况下，单一启动子可指导在单一开放阅读框(ORF)中含有由编码自切割肽(例如T2A)或蛋白酶识别位点(例如弗林蛋白酶)的序列彼此分离的两个或三个基因(例如编码第一和第二嵌合受体)的RNA的表达。因此ORF编码单一多蛋白，其在翻译期间(在T2A的情况下)或翻译后被切割成单独蛋白。在某些情况下，肽如T2A可引起核糖体跳过(核糖体跳跃)2A元件的C-末端的肽键的合成，导致2A序列末端与下一个肽下游之间分离。2A切割肽(包括可诱导核糖体跳跃的那些)的示例是T2A，P2A，E2A和F2A。
还提供了细胞，例如含有工程改造的嵌合受体的细胞，如本文所述。还提供了这类细胞的群，含有这类细胞或富集这类细胞的组合物，如其中表达嵌合受体的细胞占组合物中的总细胞或某些类型的细胞如T细胞或CD8+或CD4+细胞的至少50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更高百分比。组合物包括用于给药的药物组合物和制剂，如用于过继细胞治疗。还提供治疗方法，例如，将所述细胞和组合物给予对象(例如患者)的治疗方法。
因此还提供了表达嵌合受体的基因工程改造的细胞，例如含有CAR的细胞。所述细胞一般是真核细胞，例如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方式中，细胞衍生自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天或适应性免疫的细胞，例如，骨髓或淋巴样细胞，包括淋巴细胞，一般是T细胞和/或NK细胞。其他示例性的细胞包括干细胞，如多能(multipotent)和多潜能(pluripotent)干细胞，包括诱导性多潜能干细胞(iPSC)。细胞一般是原代细胞，如直接从对象分离和/或从对象分离并冷冻的那些细胞。在一些实施方式中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个亚组，如全T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，如由功能、活化状态、成熟、分化潜力、扩增、再循环、定位，和/或持续能力、抗原特异性、抗原受体类型、特定器官或区室中的存在、标志物或细胞因子分泌概况，和/或分化程度限定的那些。关于待治疗的对象，细胞可以是同种异体和/或自体的。方法包括现成的方法。某些方面，如对于现成的技术，细胞是多潜能和/或多能的，如干细胞，如诱导性多潜能干细胞(iPSC)。在一些实施方式中，该方法包括从对象分离细胞，对其进行制备、处理、培养和/或工程改造，如本文所述，并且在冷冻保存前或后将其回输给同一患者。
T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群包括：原初T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型，如干细胞记忆T(TSCM)、中心记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)、或终末分化的效应记忆T细胞、肿瘤-浸润性淋巴细胞(TIL)、不成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关的非变体T(MAIT)细胞、天然产生的和过继性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞，如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞、α/βT细胞，和δ/γT细胞。
在一些实施方式中，细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方式中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如，骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞，和/或嗜碱性粒细胞。
在一些实施方式中，所述细胞包括通过基因工程改造导入的一种或多种核酸，并，由此表达所述核酸的重组或经基因工程改造的产物。在一些实施方式中，核酸是异源性的，即，通常不存在于细胞或从该细胞获得的样品中，如从另一个生物体或细胞获得的样品，其例如通常不在工程改造中的细胞和/或这类细胞来源的生物体中发现。在一些实施方式中，核酸不是天然存在的，如核酸不是自然中发现的，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合。
用于工程改造的细胞的制备
在一些实施方式中，经工程改造的细胞的制备包括一种或多种培养和/或一个或多个制备步骤。用于导入嵌合受体(例如，CAR)的细胞可从样品(例如生物样品，例如获自或源自对象的样品)分离。在一些实施方式中，从中分离细胞的对象是患有一定疾病或病症或需要细胞治疗或将给予细胞治疗的对象。在一些实施方式中，对象是需要特定治疗性介入的人，如过继细胞疗法，用于该疗法的细胞是经分离、加工和/或经工程改造的。
因此，在一些实施方式中，所述细胞是原代细胞，例如，原代人细胞。所述样品包括直接取自对象的组织、体液和其它样品，以及获自一个或多个处理步骤，例如分离、离心、基因工程改造(例如采用病毒载体的转导)、清洗和/或孵育的样品。所述生物样品可以是直接获自生物来源的样品或经处理的样品。生物样品包括但不限于，体液，例如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑膜液、尿液和汗液，组织和器官样品，包括源自它们的经处理的样品。
某些方面，作为衍生或分离细胞来源的样品是血液或血液源性的样品，或者为或衍生自血浆分离置换法或白细胞去除术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检物、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关的淋巴样组织、粘膜相关的淋巴样组织、脾、其它淋巴样组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳腺、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其它器官，和/或源自其中的细胞。在细胞治疗(如过继细胞治疗)中，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些实施方式中，所述细胞源自细胞系，例如，T细胞系。在一些实施方式中，细胞获自异种异体来源，例如，获自小鼠、大鼠、非人灵长类或猪。
在一些实施方式中，细胞的分离包括一个或多个制备和/或非基于亲和性的细胞分离步骤。在一些实施例中，细胞在一种或多种反应剂的存在下经清洗、离心和/或孵育，例如，以去除不需要的组分，富集所需组分，裂解或去除对某些反应剂敏感的细胞。在一些实施例中，细胞基于一种或多种特性如封闭、粘附性质、尺寸、对某些组分的敏感性和/或抗性来分离。
在一些实施例中，通过例如单采或白细胞去除术获取对象循环血液的细胞。某些方面，所述样品包括淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核血液白细胞、血红细胞和/或血小板，某些方面包括血红细胞和血小板之外的细胞。
在一些实施方式中，采自对象的血液细胞经清洗如去除血浆部分，然后将其置于合适的缓冲液或培养基中留待后用。在一些实施方式中，所述细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗。在一些实施方式中，清洗溶液不含钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面中，清洗步骤按照生产商说明，通过半自动化的“流通”离心法(例如，Cobe 2991细胞处理器，百特公司(BaXter))完成。在一些方面中，清洗步骤按照生产商说明，通过内切流过滤(TFF)完成。在一些实施方式中，在清洗后，所述细胞在多种生物相容缓冲液中重悬，例如，无Ca++/Mg++PBS。在某些实施方式中，血液细胞样品中的组分去除后细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方式中，所述方法包括基于封闭的细胞分离方法，如通过裂解血红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心来从外周血制备血液白细胞。
在一些实施方式中，所述分离方法包括，基于细胞中一种或多种特定分子，例如表面标志物，例如，表面蛋白质、胞内标志物或核酸的表达或存在来分离不同的细胞类型。在一些实施方式中，可采用任何基于此类标志物进行分离的已知方法。在一些实施方式中，所述分离是基于亲和性或基于免疫亲和性的分离。例如，某些方面，所述分离包括基于细胞的一种或多种标志物(通常是细胞表面标志物)的表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如，通过与特异性地结合此类标志物的抗体或结合伴侣孵育，随后通常是清洗步骤，将已结合所述抗体或结合伴侣的细胞与从未结合至所述抗体或结合伴侣的那些细胞分离。
此类分离步骤可基于正选择，保留已结合所述反应剂的细胞被用于后续应用，和/或负选择，保留未结合至所述抗体或结合伴侣的细胞。在一些实施例中，两种级份均保留用于后续应用。某些方面，当没有可用于在异质群中特异性地鉴定细胞类型的抗体时，负选择可能是特别有用的，这样，分离最好是基于细胞表达的标志物而不是基于想要的细胞群。
所述分离的结果必需是特定细胞群或表达特定标志物的细胞的100％的富集或去除。例如，特定类型细胞(如表达某标志物的细胞)的正选择或富集指的是提高此类型细胞的数量或百分数，其结果不必是不表达该标志物的细胞完全消失。同样地，特定类型细胞(如表达某标志物的细胞)的负选择、去除或消除指的是减少此类细胞的数量或百分数，其结果不必是此类细胞的完全清除。
在一些实施例中，进行多轮分离步骤，其中，对来自一个步骤的正或负选择的级份进行另一分离步骤，例如后续的正或负选择。在一些实施例中，单个分离步骤同时消除表达多种标志物的细胞，例如通过将细胞与分别对负选择目标标志物具有特异性的多种抗体或结合伴侣一同孵育。同样地，可同时正选择多种细胞类型，通过将细胞与不同类型细胞上表达的多种抗体或结合伴侣一同孵育。
例如，某些方面，通过正或负选择技术分离特定T细胞亚群，例如一种或多种表面标志物阳性细胞或高表达T细胞，例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞。
例如，CD3+、CD28+T细胞可以采用CD3/CD28磁珠(例如，
Figure BDA0001745960710000441
M-450CD3/CD28T细胞扩增仪)来正选择。
在一些实施方式中，分离通过如下方式进行：通过正选择富集特定细胞群，或通过负选择消除特定细胞群。在一些实施方式中，正或负选择通过将细胞与特异性地结合一种或多种表面标志物的一种或多种抗体或其它结合剂一同孵育来完成，所述一种或多种表面标志物分别在正选择或负选择的细胞上表达(标志物+)或高表达(标志物高)。
在一些实施方式中，通过对非T细胞(例如B细胞、单核细胞或其它血液白细胞)上表达的标志物(例如CD14)进行负选择来从PBMC样品分离T细胞。某些方面，使用CD4+或CD8+选择步骤来分离CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过针对一种或多种原初、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对高表达的标志物进行正或负选择，可将此类CD4+和CD8+群进一步分选成亚群。
在一些实施方式中，在CD8+细胞中进一步富集或消除原初、中心记忆、效应记忆和/或中心记忆干细胞，例如通过基于相应亚群相关表面抗原的正选择或负选择。在一些实施方式中，富集中心记忆T(TCM)细胞以提高功效，如以改善长期存活、扩增和/或给予后的植入，某些方面，其在此类亚群中特别强势。参见Terakura等.(2012)Blood.1:72–82；Wang等(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方式中，将TCM-富集的CD8+T细胞与CD4+T细胞合并进一步增强功效。
在实施方式中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-亚组。可在PBMC中富集或消除CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+部分，例如采用抗CD8和抗CD62L抗体。
在一些实施方式中，中心记忆T(TCM)细胞的富集是基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3、和/或CD127阳性或高表面表达；在一些方面中，是基于对CD45RA和/或粒酶B表达或高度表达细胞的负选择。在一些方面中，分离CD8+TCM细胞富集群是通过如下方式进行：消除CD4、CD14、CD45RA表达细胞，并正选择或富集CD62L表达细胞。某一方面，富集中心记忆T(TCM)细胞从基于CD4表达的负选择细胞级份开始，对该级份进行基于CD14和CD45RA表达的负选择和基于CD62L的正选择。某些方面，这些选择同时进行，而在其它方面的内容中，这些选择按任意顺序依次进行。某些方面，将用于制备CD8+细胞群或亚群的基于CD4表达的相同选择步骤用于产生CD4+细胞群或亚群，这样，基于CD4分离的阳性和阴性级份均被保留用于后续步骤，可以是任选地继以一种或多种进一步的正选择或负选择步骤之后。
在某具体实施例中，对PBMC样品或其它血液白细胞样品进行CD4+细胞选择，负选和正选级份都保留。然后，基于CD14和CD45RA或ROR1的表达对阴性部分进行负选择，并基于中心记忆T细胞特征性标志物，例如CD62L或CCR7、进行正选择，其中，所述正和负选择以某一顺序进行。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将辅助CD4+T细胞分选成原初、中心记忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可通过标准方法获得。在一些实施方式中，原初CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T细胞。在一些实施方式中，中心记忆CD4+细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方式中，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO-。
在某一实施例中，为了通过负选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物(cocktail)通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方式中，使所述抗体或结合伴侣结合至固体支持物或基质如磁珠或顺磁珠，从而能够分离正选择和/或负选择的细胞。例如，在一些实施方式中，所述细胞和细胞群采用免疫磁性(或亲和性磁性)分离技术分开(separated)或分离(isolated)(综述参见《分子医学方法》(Methods inMolecular Medicine)，第58卷：代谢研究方法(Metastasis Research Protocols)，第2卷：细胞体外和体内性能(Cell Behavior In Vitro and In Vivo)，第17-25页，S.A.Brooks和U.Schumacher编
Figure BDA0001745960710000451
新泽西州托托华的胡玛纳出版社(Humana Press Inc.))。
在一些方面中，待分离的样品或细胞组合物与较小的可磁化或磁响应性材料(如磁响应性颗粒或微粒，例如顺磁珠(例如，Dynalbeads珠或MACS珠))孵育。所述磁响应性材料(例如，颗粒)一般直接或间接连接结合伴侣(例如，抗体)，其特异性地结合某一分子，例如，需要分离(例如，需要进行负或正选择)的一种或多种细胞或细胞群上存在的表面标志物。
在一些实施方式中，所述磁性颗粒或珠包括磁响应性材料，其结合特异性的结合部分，例如抗体或其它结合伴侣。有多种熟知的磁响应性材料用于磁性分离方法。合适的磁性颗粒包括描述于Molday，美国专利号4,452,773和欧洲专利说明书EP 452342B中的那些，其通过引用纳入本文。胶体定形的颗粒，例如描述于Owen美国专利号4,795,698的那些，而Liberti等，美国专利号5,200,084是其它实例。
孵育一般在一定条件下进行，所述条件下所述抗体或结合伴侣或分子(如二抗或其它反应剂，其特异性地结合所述抗体或结合伴侣)连接所述磁性颗粒或珠，特异性地结合所述样品中的细胞上的细胞表面分子(如果存在)。
某些方面，将所述样品置于磁场中，并且，具有与其连接的磁性响应或可磁化颗粒的那些细胞将被磁体吸引，并与未标记的细胞分离。对于正选择而言，保留被磁体吸引的细胞；对于负选择而言，保留不被吸引的细胞(未标记的细胞)。某些方面，在同一选择步骤过程中进行正和负选择的组合，其中，保留阳性和阴性部分，并进一步处理或进行进一步分离步骤。
在某些实施方式中，磁响应性颗粒外包被一抗或其它结合伴侣、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素。在某些实施方式中，磁性颗粒通过一抗覆层连接细胞，所述一抗对一种或多种标志物具有特异性。在某些实施方式中，所述细胞，而非珠，用一抗或结合伴侣标记，然后，添加细胞类型特异性的二抗或其它结合伴侣(例如，链霉亲和素)包被的磁性颗粒。在某些实施方式中，链霉亲和素包被的磁性颗粒与生物素化一抗或二抗联用。
在一些实施方式中，使所述磁响应性颗粒连接和留在待后续孵育、培养和/或工程改造的细胞；某些方面，使所述颗粒连接留在用于给予患者的细胞。在一些实施方式中，从所述细胞去除可磁化的或磁响应性颗粒。用于从细胞去除可磁化颗粒的方法是已知的，包括例如采用竞争性非标记的抗体、可磁化颗粒或与可切割接头相连的抗体等。在一些实施方式中，可磁化颗粒是生物可降解的。
在一些实施方式中，基于亲和性的选择通过磁性活化细胞分选(MACS)(加利福尼亚奥本的美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotech))进行。磁性活化细胞分选(MACS)系统能够高纯度选择其上连接有磁化颗粒的细胞。在某些实施方式中，MACS以如下模式操作：在施加外部磁场之后，依次洗脱非目标和目标物质。即，使连接磁化颗粒的细胞保持在原位，而洗脱未连接的物质。然后，在该第一洗脱步骤完成后，将滞留在磁场中且防止被洗脱的物质以使得它们可被洗脱和回收的某种方式释放。在某些实施方式中，标记非靶细胞并将其从异质细胞群中消除。
在某些实施方式中，分离(isolation)或分开(separation)采用系统、器械或设备来进行，它们实施所述方法分离、细胞制备、分开、处理、孵育、培养和/或配制步骤中的一个或多个步骤。某些方面，系统用以在封闭或无菌环境中进行这些步骤中的每一步骤，为的是例如尽可能减少误差、用户操作和/或污染。在某一实施例中，所述系统是国际专利申请公开号WO2009/072003或US 20110003380 A1中描述的系统。
在一些实施方式中，所述系统或设备在集成或独立系统中，和/或以自动化的或可编程的形式，进行分离、处理、工程改造和配制步骤中的一个或多个，例如全部。某些方面，所述系统或设备包括与所述系统或设备信息连通的计算机和/或计算机程序，其允许用户编程、控制、评估所述处理、分离、工程改造和配制步骤的结果，和/或调节所述处理、分离、工程改造和配制步骤的各方面。
某些方面，进行所述分离和/或其它步骤使用CliniMACS系统(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotic))进行，例如，以供在封闭和无菌系统中进行临床级别水平的细胞的自动化分离。组件可包括集成微型计算机、磁性分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。某些方面，集成计算机控制仪器的所有组件，并指示所述系统以标准化的顺序进行重复操作。某些方面，磁性分离单元包括可移动的永久磁体和用于选择柱的握持装置(holder)。蠕动泵控制贯穿通过管组的流速，并且与夹管阀一起确保通过所述系统的缓冲液和连续细胞悬液的受控流速。
某些方面，CliniMACS系统使用以无菌、无热源溶液的形式提供的抗体-偶联的可磁化颗粒。在一些实施方式中，在用磁性颗粒标记细胞之后，清洗细胞以去除过量的颗粒。然后，将细胞制备袋连与管组相连，管组再连接含缓冲液的袋和细胞收集袋。所述管组由预组装的无菌管道组成，包括前置柱和分离柱，并且仅用于单次使用。在分离程序启动之后，系统自动将细胞样品上样到分离柱。带标记的细胞留在柱中，而未标记细胞则经一系列清洗步骤去除。在一些实施方式中，用于本文所述方法的细胞群是未标记的，不留在柱中。在一些实施方式中，用于本文所述方法的细胞群是经标记的，并且留在柱中。在一些实施方式中，撤去磁场之后从柱上洗脱用于本文所述方法的细胞群，并将其收集在细胞收集袋中。
在某些实施方式中，分离和/或其它步骤采用CliniMACS Prodigy系统(美天旎生物技术公司)进行。某些方面，CliniMACS Prodigy系统装配有细胞处理单元，所述细胞处理单元允许自动化清洗和离心分级分离细胞。CliniMACS Prodigy系统还可包括内置相机和图像识别软件，通过辨别来源细胞产物的肉眼可见层来确定最优选细胞分级分离终点。例如，外周血可被自动分离成红细胞、血液白细胞和血浆层。CliniMACS Prodigy系统还可包括集成化的细胞培育腔室，其完成细胞培养测序，例如细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可允许无菌排出和补充培养基，细胞可采用整合显微镜来监测。参见例如Klebanoff等.(2012)J Immunother.35(9):651–660,Terakura等.(2012)Blood.1:72–82,和Wang等.(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方式中，本文所述细胞群通过流式细胞术收集和富集(或消除)，其中细胞经多种表面标志物染色并携载于流体流中。在一些实施方式中，本文所述的细胞群通过制备规模(FACS)-分选法收集和富集(或消除)。在某些实施方式中，本文所述的细胞群通过采用微电机系统(MEMS)芯片联合基于FACS的检测系统来收集和富集(或消耗)(参见例如，WO 2010/033140，Cho等(2010)Lab Chip 10，1567-1573；和Godin等(2008)JBiophoton.1(5):355–376。在这两种情况中，细胞都可用多种标志物标记，以允许以高纯度分离明确的T细胞亚组。
在一些实施方式中，抗体或结合伴侣用一种或多种可检测标志物标记，以利于正选择和/或负选择的分离。例如，分离可基于与荧光标记抗体的结合。在一些实施例中，将基于抗体或对一种或多种细胞表面标志物具有特异性的其它结合伴侣的结合所进行的细胞分离携载于流体流中，例如通过荧光活化的细胞分选(FACS)(其包括制备规模(FACS)和/或微机电系统(MEMS)芯片)，例如与流式细胞术检测系统联合。此类方法允许进行基于多种标志物的同时正选择和负选择。
在一些实施方式中，制备方法包括冷冻例如冻存所述细胞的步骤，在分离、孵育和/或工程改造之前或之后。在一些实施方式中，所述冷冻和后续融化步骤去除细胞群中的粒细胞，并且一定程度去除细胞群中的单核细胞。在一些实施方式中，将所述细胞悬浮于冷冻溶液中，例如在清洗去除血浆和血小板之后。可采用各种已知冷冻溶液和某些方面的参数。例子质疑用到包含20％DMSO和8％人血清白蛋白(HAS)的PBS，或是其它合适的细胞冷冻培养基。然后，用培养基1:1将其稀释，使得DMSO和HSA的终浓度分别是10％和4％。然后，以1℃/分钟的速率将细胞冷冻至-80℃，并贮存在液氮储罐的汽相中。
在一些实施方式中，提供的方法包括培育、孵育、培养，和/或基因工程改造步骤。例如，在一些实施方式中，提供了用于对消耗的细胞群和培养起始组合物进行孵育和/或工程改造的方法。
因此，在一些实施方式中，所述细胞群在培养起始组合物中孵育。孵育和/或工程改造可以在培养容器中进行，如单元、腔室、孔、柱、管、管组、阀，小瓶，培养皿，袋或其他培养或培养细胞的容器。
在一些实施方式中，在基因工程改造之前或与基因工程改造一起孵育和/或培养细胞。孵育步骤可包括培养、孵育、刺激、活化、和/或增殖。在一些实施方式中，在刺激条件或刺激剂存在下孵育细胞或组合物。这类条件包括设计成诱导群中细胞增殖、繁殖、活化，和/或存活，模拟抗原接触，和/或细胞预备以备基因改造如导入重组抗原受体的那些条件。
所述条件可包括如下一项或多项：特定培养基、温度、含氧量、二氧化碳含量、时间、用剂如营养物、氨基酸、抗生素、离子，和/或刺激因子，例如细胞因子、趋化因子、抗原、结合伴侣、融合蛋白、重组可溶性受体，和设计用来活化细胞的任何其它物质。
在一些实施方式中，刺激条件或用剂包括一种或多种物质如配体，它能够活化TCR复合物的胞内信号传导结构域。某些方面，所述物质打开或启动T细胞中的TCR/CD3胞内信号传导级联。这样的物质可包括抗体如对TCR组分和/或共刺激受体具有特异性的那些，例如抗-CD3、抗-CD28，所述抗体可以例如结合在固体支持物如珠上，和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法还可包括如下步骤：向培养基(如以至少约0.5ng/ml的浓度)添加抗CD3和/或抗CD28抗体。在一些实施方式中，刺激型反应剂包括1L-2和/或IL-15，例如，至少约10单位/mL浓度的IL-2。
某些方面，进行孵育的技术例如授予Riddell等的美国专利号6,040,1 77，Klebanoff等.(2012)J Immunother.35(9):651–660,Terakura等.(2012)Blood.1:72–82和/或Wang等.(2012)J Immunother.35(9):689-701中所述的那些。
在一些实施方式中，T细胞群通过如下方式扩增：在培养启动组合物在添加饲养层细胞，如非分裂型外周血单核细胞(PBMC)，(例如令所得细胞群中初始待扩增群中的各T淋巴细胞有至少约5、10、20或40或更多PBMC饲养层细胞)；并孵育所述培养物(例如孵育足以扩增所述数量的T细胞的时间)。某些方面，所述非分裂型饲养细胞可包括经γ-辐照的PBMC饲养细胞。在一些实施方式中，所述PBMC用约3000-3600拉德范围内的γ射线辐照以防止细胞分裂。某些方面，所述饲养细胞在添加T细胞群之前添加至培养基。
在一些实施方式中，刺激条件包括适于人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，一般至少约30度，且一般是或约是37摄氏度。可选地，孵育还可包括添加非分裂型EBV-转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养层细胞。LCL可以用约6000-10000拉德范围内的γ射线辐照。某些方面，LCL饲养细胞以任何合适的量提供，例如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率是至少约10:1。
某些实施方式中，通过用抗原刺激原初或抗原特异性T淋巴细胞来获得抗原特异性T细胞，如抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞。例如，可如下产生对巨细胞病毒抗原的抗原特异性T细胞系或克隆：从感染对象分离T细胞并采用巨细胞病毒抗原体外刺激细胞。
用于基因工程改造的方法和载体
用于引入基因工程改造的组分(例如，抗原受体，例如，CAR或TCR)的各种方法是熟知的，并可用于本文提供的方法和组合物。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的方法，包括经由病毒载体，例如逆转录病毒或慢病毒，非病毒载体或转座子，例如睡美人(Sleeping Beauty)转座子系统。基因转移的方法可以包括转导，电穿孔或导致基因转移到细胞中的其他方法。
在一些实施方式中，基因转移通过如下方式进行：首先，刺激细胞，例如，通过将其与刺激物合并，所述刺激物诱导响应，例如增殖、存活和/或活化，例如，通过细胞因子或活化标志物的表达来检测，然后转导该活化的细胞，并且在培养物中扩增至足以供于临床应用的数量。
在一些情况中，刺激因子(例如，淋巴因子或细胞因子)的过表达可能对对象具有毒性。因此，在一些情况中，工程改造的细胞包括，例如在过继免疫治疗中给予之后，使细胞对体内负选择易感的基因区段。例如在一些方面中，所述细胞经工程改造，从而它们可因它们所给予的患者的体内状况的变化而被消除。可负选择的表型可通过插入赋予对所给予物质(例如，化合物)敏感性的基因来产生。可负选择的基因包括：单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等，Cell II:223，I977)，其提供更昔洛韦敏感性；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因，细胞腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)基因，细菌胞嘧啶脱氨酶(Mullen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:33(1992))。
在一些实施方式中，采用重组感染性病毒颗粒将重组核酸转移进入细胞，例如，源自猿病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体。在一些实施方式中，采用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体，例如γ-逆转录病毒载体，将重组核酸转移进入T细胞(参见例如，Koste等，(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等，(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等，(2013)Mol Ther Nucl Acids 2,e93；Park等，Trends Biotechnol.2011年11月；29(11):550–557)。
在一些实施方式中，所述逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如，源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)，骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)，鼠胚胎干细胞病毒(MESV)，鼠干细胞病毒(MSCV)，脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方式中，逆转录病毒包括源自任何禽或哺乳动物细胞来源的那些。逆转录病毒通常是兼嗜性的，这意味着它们能够感染数种物种(包括人类)的宿主细胞。在一个实施方式中，用待表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已描述许多示例性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740；6,207,453；5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller，A.D.(1990)HumanGene Therapy1:5-14；Scarpa等(1991)Virology 180:849-852；Burns等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；和Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。
慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于，例如，Wang等，(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等，(2003)Blood.101:1637–1644；Verhoeyen等，(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；和Cavalieri等，(2003)Blood.102(2):497-505。
在一些实施方式中，通过电穿孔将重组核酸转移进入T细胞(参见例如，Chicaybam等，(2013)PLoS ONE 8(3):e60298和Van Tedeloo等.(2000)GeneTherapy7(16):1431-1437)。在一些实施方式中，通过转位将重组核酸转移进入T细胞(参见例如，Manuri等(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等，(2013)Molec Ther Nucl Acids 2,e74；和Huang等，(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其它方法包括磷酸钙转染(例如，描述于《分子生物学方案新编》(Current Protocols inMolecular Biology)，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)，纽约州纽约)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(Johnston，Nature,346:776-777(1990))；和磷酸锶DNA共沉淀(Brash等，Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是描述于，例如，国际专利申请公开号WO2014055668和美国专利号7,446,190的那些。
在一些实施方式中，可在扩增期间或之后，用T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)转染细胞(例如T细胞)。用于引入所需受体基因的该转染可用任何合适的逆转录病毒载体进行(例如)。然后，可从起始刺激物(例如CD3/CD28刺激物)释放基因修饰的细胞群，随后用第二类刺激物(例如通过从头诱导的受体(de novo introduced receptor))刺激。该第二类刺激物可包括：肽/MHC分子形式的抗原性刺激物，遗传引入受体的同源(交联)配体(例如CAR的天然配体)或任何直接结合新受体框架内的任何配体(如抗体)(例如同识别受体内的恒定区)。参见，例如，Cheadle等，“Chimeric antigen receptors for T-cell basedtherapy”(“用于基于T细胞的治疗的嵌合抗原受体”)2012；907:645-66或Barrett等，Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer(“癌症的嵌合抗原受体治疗”)AnnualReview of Medicine卷65:333-347(2014).
用于引入的其他核酸(例如基因)包括用以例如通过促进转移的细胞的活力和/或功能改善治疗功效的那些；用以提供遗传标志物以供选择和/或评价细胞的基因，例如以评估体内存活或定位；用以改善安全性的基因，例如，通过使细胞对体内负选择易感，如Lupton S.D.等，Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等，Human Gene Therapy 3:319-338(1992)所述；也参见Lupton的公开号PCT/US91/08442和PCT/US94/05601等，其描述显性阳性可选择的标志物与阴性可选择的标志物的融合衍生的双功能可选择的融合基因的应用。参见例如Riddell等，美国专利号6,040,177，第14-17栏。
IV.组合物、制剂和给药方法
还提供了含有嵌合受体(例如CAR)的组合物和含有工程改造的细胞的组合物，包括药物组合物和制剂。本文还提供了使用这些组合物的方法以及这些组合物的用途，如在表达该抗原的疾病、病症和异常的治疗中的使用和用途，以及在检测、诊断和预防方法中的应用。
1.组合物/制剂
术语“药物制剂”指此类形式的制剂：所述其中所含活性成分的生物学活性有效，并且不含对待接受该制剂的对象具有不可接受的毒性的其他成分。
“药学上可接受的运载体”指药物制剂中的一种成分，其不是活性成分，其对对象无毒。药学上可接受的运载体包括但是不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
某些方面，运载体的选择部分决定于具体的细胞和/或给药方法。因此，存在多种合适的配方。例如，所述药物组合物可包含防腐剂。合适的防腐剂可包括，例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。某些方面，采用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物的存在量通常是约0.0001％至约2％(以组合物总重量计)。运载体描述于，例如，《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第16版，Osol,A.编(1980)。在所用剂量和浓度下，药学上可接受的运载体通常是对受者无毒的，包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸缓冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子，如钠；金属络合物(如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。
某些方面，所述组合物包含缓冲剂。合适的缓冲剂包括，例如，柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和多种其他酸和盐。某些方面，采用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物的存在量通常是约0.001％至约4％(以组合物总重量计)。用于制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法具体描述于，例如，《雷明顿：药物科学与实践》(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)，LWW公司(Lippincott Williams&Wilkins)；第21版(2005年5月1日)。
所述制剂或组合物还可包含超过一种对于待接受细胞治疗的具体适应症、疾病或病症有用的活性成分，优选活性与所用细胞互补的那些，这些活性成分各自的活性剂不会对彼此产生不利影响。这类活性成分适合以有效用于所需目的的用量联合存在。因此，在一些实施方式中，所述药物组合物还包含其它药学活性物质或药物，例如化疗剂，例如，天冬酰胺酶，白消安，卡铂，顺铂，柔红霉素，多柔比星，氟尿嘧啶，吉西他滨，羟基脲，甲氨蝶呤，紫杉醇，利妥昔单抗，长春碱，长春新碱等。
在一些实施方式中，药物组合物包含有效治疗或预防疾病或病症的量如治疗有效或预防有效量的细胞。在一些实施方式中，通过定期评估治疗的对象来监测治疗或预防功效。对于数天或更长时间的重复给药，可根据所述病症重复治疗直至疾病症状得到所需阻遏。然而，其它剂量方案可能是有用的并且可以确定。所需剂量的递送可以通过单次推注(bolus)给予所述组合物，通过多次推注给予所述组合物或通过连续输注给予组合物。
可采用标准给药技术、制剂和/或器械给予细胞。本文提供了用于储存和给予组合物的制剂和装置，如注射器和瓶。所述细胞的给予可以是自体同源或是异源的。例如，可以从一个对象获取免疫抑制细胞或祖细胞，给予同一对象或不同的相容对象。外周血衍生的免疫抑制细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可通过局部注射给予，包括导管给药、全身注射、局部注射、静脉注射、或胃肠外给药。当给予治疗性组合物(例如含有遗传修饰免疫抑制细胞的药物组合物)时，其通常被配制成单位剂型的可注射形式(溶液、悬液、乳液)。
制剂包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺、透皮、肌肉内、鼻内、粘膜、舌下或栓剂给药的那些。在一些实施方式中，所述细胞群胃肠外给予。本文所用的术语“胃肠外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内给予。在一些实施方式中，所述细胞群通过静脉内、腹膜内或皮下注射采用外围全身递送给予对象。
在一些实施方式中，组合物是无菌液体制剂，例如等渗水性溶液、悬液、乳液、分散系或粘性组合物，其某些方面可缓冲至选定pH。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物一定程度上多少更便于给药，尤其是通过注射给药。在另一方面，粘性组合物可配制在合适的粘度范围以延长与特定组织的接触时间。液体或粘性组合物可包括运载体，其可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多羟基化合物(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及以上合适的混合物。
可通过将所述细胞纳入溶剂中，例如与合适的运载体、稀释剂、或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等活化，来制备无菌可注射溶液。也可将该组合物冻干。组合物可含有辅助性物质，如润湿、分散、或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、风味剂、色素等，这取决于所需的给药和制备途径。某些方面，可查阅标准文件来制备合适制备物。
可添加增强组合物稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。也可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)确保避免微生物作用。可通过使用延迟吸收的物质(如单硬脂酸铝和明胶)延长可注射药物形式的吸收。
用于体内给药的制剂一般为无菌的。例如，可通过无菌滤膜过滤方便地地做到无菌。
2.给药方法
本文提供给予所述细胞、群和组合物的方法，所述细胞、群和组合物用于治疗或防止疾病、病症和紊乱，包括癌症的应用。在一些实施方式中，将细胞、群和组合物给予具有具体待治疗(例如通过过继细胞治疗(例如过继T细胞治疗))的疾病或病症的对象或患者。在一些实施方式中，向对象，如具有疾病或病症或者处于疾病或病症风险中的对象给予提供的细胞和组合物。某些方面，所述方法由此治疗例如减轻所述疾病或病症的一种或多种症状，例如减小癌症的肿瘤负荷，该癌症表达经改造T细胞识别的抗原。
给予过继细胞治疗所用细胞的方法是已知的，可与本文方法和组合物联用。例如，过继T细胞治疗方法描述于，例如，Gruenberg等的美国专利申请公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev Clin Oncol.8(10):577-85)。参见例如Themeli等.(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等.(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等.(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。
本文中所用的“对象”是哺乳动物，例如人或其它动物，并且通常是人。在一些实施方式中，向接受所述细胞、细胞群或组合物给予的对象(例如，患者)是哺乳动物，通常是灵长类，例如人。在一些实施方式中，所述灵长类是猴子或猿。所述对象可以是男性或女性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿，少年，青少年，成人和老年对象。在一些实施方式中，所述对象是非灵长类哺乳动物，例如啮齿类。
本文中所用的术语“治疗”(及其语法变化形式例如“治疗的”和“治疗性”)指完全或部分减轻或减少疾病或病症或紊乱或与其相关的症状、不利作用或后果或表型。所需的治疗效果包括但不限于，预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理学结果、防止转移、减缓疾病进展速度、改善或减轻疾病状态和减轻或改善预后。该术语不表示完全治愈疾病或完全消除任一症状或作用或所有症状或后果。
本文中所用的“延迟疾病的发展”表示推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定、遏制和/或拖延所述疾病(例如癌症)的发展。延缓可有不同的时间长度，这取决于疾病的病史和/或待治疗的个体。如本领域技术人员所知，实际上，充分或显著的延缓可涵盖预防(对于未发展成所述疾病的个体而言)。例如，晚期癌症(例如转移的发展)可被延缓。
本文中所用的“预防”包括对于在倾向于发展成某疾病但尚未被诊断为该病的对象中对疾病发生或复发的预防。在一些实施方式中，所提供的细胞和组合物用于延缓疾病发展或减缓疾病进展。
本文中，“阻抑”某功能或活性指相比其他相同仅目标条件或参数不同的情况或者相比另一情况，功能或活性降低。例如，与没有细胞条件下的肿瘤生长速率相比，阻抑肿瘤生长的细胞降低了肿瘤的生长速度。
用剂(如药物制剂、细胞或组合物)就给药而言的“有效量”指某一个量，按一定数量的剂量/用量且作用必要的时间长度，能够有效实现所需效果，例如治疗或预防性效果。
反应剂(如药物制剂或细胞)的“治疗有效量”指某一个量，其按照一定数量的剂量和必需时程，能够有效实现所需治疗效果，例如疾病、病症或紊乱的治疗，和/或该治疗的药物动力学或药代动力学效果。治疗有效量可根据多种因素而不同，例如疾病状态、年龄、性别，和对象体重，以及给予的细胞群。在一些实施方式中，本文方法涉及给予有效量(例如治疗有效量)的所述细胞和/或组合物。
“预防有效量”指某一个量，其按照一定数量的剂量和必要时程，能够有效实现所需预防效果。通常但非一定，由于预防剂量在疾病的早期或之前用于对象，预防有效量将小于治疗有效量。
所治疗的疾病或病症可以是如下所述任何疾病或病症：其中抗原的表达与疾病状况或紊乱的病因相关和/或参与疾病状况或紊乱的病因，例如抗原表达造成、加剧或者涉及该疾病、病症或紊乱。示例性的疾病和病症可包括与细胞恶性化或转化相关的疾病或病症(例如肿癌症)、自身免疫性或炎性疾病或感染性疾病(例如细菌、病毒或其他病原体所致感染)。示例性的抗原，包括与可接受治疗的各自疾病和病症关联的抗原，如前文所描述。某些具体实施方式中，嵌合抗原受体或转基因TCR特异性结合与疾病或病症相关抗原。
在一些实施方式中，疾病或病症是肿瘤，例如实体瘤，淋巴瘤，白血病，血液肿瘤，转移性肿瘤或其他癌症或肿瘤类型。
在一些实施方式中，所述疾病或病症是感染性疾病或病症，例如但不限于，病毒、逆转录病毒、细菌和原生动物感染、免疫缺陷、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。在一些实施方式中，所述疾病或病症是自体免疫或炎性疾病或病症，例如关节炎，例如类风湿性关节炎(RA)，I型糖尿病，系统性红斑狼疮(SLE)，炎性肠病，牛皮癣，硬皮病，自身免疫性甲状腺疾病，格雷夫斯病，克罗恩病多发性硬化，哮喘和/与移植相关的疾病或病症。
在一些实施方式中，与所述疾病或紊乱相关的抗原选择自下组：孤儿酪氨酸激酶受体RORl、tEGFR、Her2、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、和肝炎B表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、0EPHa2、ErbB2、3、或4、FBP、胎儿乙酰胆碱e受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、Lewis Y、L1-细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、酪氨酸蛋白激酶B2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2，和MAGE A3、CE7、维尔姆斯瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白如细胞周期蛋白A1(CCNA1)和/或生物素化分子，和/或由HIV、HCV、HBV或其它病原体表达的分子。
因此，本文方法和应用包括用于过继细胞疗法的方法和应用。在一些实施方式中，该方法包括向对象、组织或细胞(如患有、易患或疑患某疾病、病症或紊乱的对象、组织或细胞)给予细胞或含有该细胞的组合物。在一些实施方式中，将所述细胞、群和组合物给予患有具体待治疗(例如通过过继细胞治疗(如过继T细胞治疗))的疾病或病症的对象。在一些实施方式中，给予对象(如患有、易患或疑患疾病或病症的对象)细胞或组合物以缓解疾病或病症的一种或多种症状。
在一些实施方式中，所述细胞治疗(如过继T细胞治疗)通过自体移植进行，其中，自接受细胞治疗的对象分离和/或以其他方法制得细胞，或者从该对象的样品获得细胞。因此，某些方面，细胞源自需要治疗的对象(例如，患者)，并在分离和处理后回输给同一对象。
在一些实施方式中，细胞治疗(如过继T细胞治疗)通过同种异体移植进行，其中，作为分离和/或以其他方法制备细胞的来源的对象(如第一对象)不是待接受或最终接受细胞治疗的对象。此类实施方式中，然后将所述细胞给予相同物种的不同对象，例如第二对象。在一些实施方式中，所述第一和第二对象遗传相同。在一些实施方式中，所述第一和第二对象遗传学相似。在一些实施方式中，所述第二对象表达与第一对象病毒相同的HLA类或超型。可用任何合适的手段给予细胞。给药和给予可部分取决于该给予是短期还是长期的。不同给药方案包括但不限于在不同时间点单次或多次给予、推注给予和脉冲输注。
在某些实施方式中，所述细胞或各细胞亚型群按照约1000亿细胞和/或每公斤体重该数量的细胞给予对象，例如100万至约500亿细胞(如约500万细胞、约2500万细胞、约5亿细胞、约10亿细胞、约50亿细胞、约200亿细胞、约300亿细胞、约400亿细胞，或以上任意两个值构成的范围)，例如约1000万至约1000亿细胞(如约2000万细胞、约3000万细胞、约4000万细胞、约6000万细胞、约7000万细胞、约8000万细胞、约9000万细胞、约100亿细胞、约250亿细胞、约500亿细胞、约750亿细胞、约900亿细胞，或以上任意两个值构成的范围)，有时是约1亿细胞至约500亿细胞(如约1.2亿细胞、约2.5亿细胞、约3.5亿细胞、约4.5亿细胞、约6.5亿细胞、约8亿细胞、约9亿细胞、约30亿细胞、约300亿细胞、约450亿细胞)，或以上任一范围内任一数值，和/或每公斤体重以上所述数量的细胞。同样，剂量可根据疾病或紊乱和/或患者和/或其它治疗的具体属性而不同。
在一些实施方式中，细胞作为联合治疗的一部分给予，例如与另一治疗性干预(如抗体或经工程改造的细胞或受体或药剂(如细胞毒性或治疗行药剂))同时或以任何顺序依次给予。在一些实施方式中，细胞与一种或多种其它治疗剂共同给予或与另一治疗干预联合给予，或者同时或者以任何顺序依次进行。在一些情况中，所述细胞与其他治疗共同给予，时间上足够接近从而细胞群增强一种或多种其它治疗剂的作用，反之亦然。在一些实施方式中，细胞在一种或多种其它治疗剂之前给予。在一些实施方式中，细胞在一种或多种其它治疗剂之后给予。在一些实施方式中，一种或多种其他治疗剂包括细胞因子如IL-2，例如用于以增强持久性。在一些实施方式中，百万方法包括给予化疗剂。
在给予细胞之后，在一些实施方式中，检测经工程改造细胞群的生物活性，例如采用任意已知方法。用以评估的参数包括：工程改造的或天然T细胞或其它免疫细胞与抗原的特异性结合，体内方式(例如，通过成像)或离体方式(例如，通过ELISA或流式细胞术)。在某些实施方式中，工程改造的细胞破坏靶细胞的能力可采用本领域已知的任何合适的方法来检测，例如描述于如下文献的细胞毒性试验，例如，Kochenderfer等，J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和Herman等.J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在某些实施方式中，通过测定一种或多种细胞因子例如CD 107a、IFNγ、IL-2和TNF的表达和/或分泌来检测细胞的生物活性。某些方面，生物活性通过评估临床效果来检测，例如肿瘤负荷或负载的减少。
在某些实施方式中，所述工程改造的细胞以各种方式进一步修饰，从而增加其治疗或预防功效。例如，通过细胞群表达的工程改造的CAR或TCR可通过接头直接或间接地偶联靶向部分。与化合物偶联是本领域已知的，例如将CAR或TCR连接至靶向部分。参见例如，Wadwa等,J.Drug Targeting 3:1 1 1(1995)，和美国专利5,087,616。
V.示例性实施方式
提供的实施方式包括：
1.一种变体嵌合受体，其包含与参考嵌合受体的接合区域相比具有一个或多个氨基酸序列修饰的经修饰的接合区域，其中：
所述参考嵌合受体包含第一结构域和第二结构域，在接合处以连续序列接合，其中参考嵌合受体的接合区域包含直接在所述接合的C-末端的多至15个连续氨基酸和/或直接在所述接合的N-末端的多至15个连续氨基酸；和
具有经修饰的接合区域的8-15个氨基酸部分的序列的肽片段对人白细胞抗原(HLA)分子的结合亲和性低于具有参考嵌合受体的接合区域的对应部分的序列的肽片段对相同HLA分子的结合亲和性。
2.如实施方式1所述的变体嵌合受体，其中参考嵌合受体的接合区域的对应部分的肽片段具有小于1000nM，小于500nM或小于50nM的结合亲和性。3.
一种变体嵌合受体，其包含与参考嵌合受体的接合区域相比具有一个或多个氨基酸序列修饰的经修饰的接合区域，其中：
所述参考嵌合受体包含第一结构域和第二结构域，在接合处以连续序列接合，其中参考嵌合受体的接合区域包含直接在所述接合的C-末端的多至15个连续氨基酸和/或直接在所述接合的N-末端的多至15个连续氨基酸；和
经修饰的接合区域中的全部8-15个氨基酸片段，或全部8、9、10、11、12、13、14，或15个氨基酸片段，对于人HLA分子的平均结合亲和性低于参考嵌合受体的接合区域内的全部8-15个氨基酸片段或全部8、9、10、11、12、13、14，或15个氨基酸片段的平均结合亲和性。
4.如实施方式1-3中任一项所述的变体嵌合受体，其中所述结合亲和性或平均结合亲和性低超过2倍、超过5倍、超过10倍、超过25倍、超过50倍或超过100倍。
5.一种变体嵌合受体，其包含与参考嵌合受体的接合区域相比具有一个或多个氨基酸序列修饰的经修饰的接合区域，其中：
所述参考嵌合受体包含直接连接至第二结构域的第一结构域，在接合处以连续序列接合，其中；
所述参考嵌合受体的接合区域包含直接在所述接合的C-末端的多至15个连续氨基酸和/或直接在所述接合的N-末端的多至15个连续氨基酸；和
具有对人白细胞抗原(HLA)具有小于1000nM的结合亲和性的经修饰的接合区域的8-15个氨基酸部分的序列的肽片段的数量小于具有对相同HLA具有相同接合亲和性的参考嵌合受体的接合区域的8-15个氨基酸部分的序列的肽片段的数量。
6.如实施方式5所述的变体嵌合受体，其中：
对HLA具有小于500nM或小于50nM的结合亲和性的经修饰的接合区域内的肽片段的数量减少；或者
小于1000nM的结合亲和性是小于500nM或小于50nM的结合亲和性。
7.如实施方式1-6中任一项所述的变体嵌合受体，其中结合亲和性是IC50，并且经修饰的接合区域的肽片段与参考嵌合受体的接合区域的肽片段的结合的比较参考相同的标准肽。
8.如实施方式1-7中任一项所述的变体嵌合受体，其中：
第一结构域和/或第二结构域包括天然人蛋白质的结构域；和/或
第一结构域和/或第二结构域包括细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域或胞内信号传导结构域，其中胞内信号传导结构域任选地是共刺激信号传导结构域或活化性胞质信号传导结构域。
9.如实施方式1-8中任一项所述的变体嵌合受体，其中第一结构域和第二结构域不存在于人对象体内的相同分子中。
10.如实施方式1-9中任一项所述的变体嵌合受体，其中，第一结构域和第二结构域分别是胞外配体结合结构域和铰链结构域、铰链结构域和跨膜结构域、跨膜结构域和胞内共刺激信号传导结构域、以及胞内共刺激信号传导结构域和活化性胞质信号传导结构域，其可包括所述结构域的功能部分。
11.如实施方式1-10中任一项所述的变体嵌合受体，其中，第一结构域是跨膜结构域或其功能部分，且第二结构域是共刺激信号传导结构域或其功能部分。
12.如实施方式11所述的变体嵌合受体，其中，所述跨膜结构域是CD28跨膜结构域或其功能部分或变体，并且，所述共刺激信号传导结构域是4-1BB信号传导结构域或其功能部分或变体。
13.如实施方式1-12中任一项所述的变体嵌合受体，其中参考嵌合受体的接合区域包含直接在所述接合的C-末端的多至13个连续氨基酸和/或直接在所述接合的N-末端的多至15个连续氨基酸。
14.如实施方式1-13中任一项所述的变体嵌合受体，其中所述肽片段包括长度在8至15个或约8至15个氨基酸之间的氨基酸序列，或包括长度至少或至少约为或是或约是8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸的氨基酸序列。
15.如实施方式1-14中任一项所述的变体嵌合受体，其包含：
与第一结构域具有至少95％序列相同性的结构域和/或与第二结构域具有至少95％序列相同性的结构域；
与第一结构域序列相同的结构域，和与第二结构域具有至少95％序列相同性的结构域；或
与第一结构域具有至少95％序列相同性的结构域和与第二结构域序列相同的结构域，
其中，相较于所述参考嵌合受体的第一结构域和/或第二结构域，在包含经修饰的接合区域的部分中，所述变体嵌合受体中存在的结构域的至少之一或两者是经修饰的。
16.如实施方式1-15中任一项所述的变体嵌合受体，其中：
所述变体嵌合受体与所述参考嵌合受体具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性；和/或
与参考嵌合受体相比，变体嵌合受体包含多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰。
17.如实施方式12-16中任一项所述的变体嵌合受体，其中：
CD28跨膜结构域包括SEQ ID NO：2、103或104中所示的氨基酸序列或其功能部分或变体，该功能部分或变体包含与SEQ ID NO：2、103或104具有至少95％序列相同性的序列；并且
4-1BB共刺激信号传导结构域包括SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或其功能部分或变体，该功能部分或变体包括与SEQ ID NO：3具有至少95％序列相同性的序列。
18.如实施方式12-17中任一项所述的变体嵌合受体，其中第一结构域和第二结构域一起包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或其功能部分或变体，所述功能部分或变体包含与SEQ ID NO:5显示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列。
19.如实施方式12-18中任一项所述的变体嵌合受体，其中所述第一结构域和第二结构域一起包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。
20.如实施方式12-19中任一项所述的变体嵌合受体，其中所述一个或多个修饰位于残基13和42之间的部分内或氨基酸残基15和40之间的部分内，参考SEQ ID NO：5中所示的编号。
21.如实施方式1-20中任一项所述的变体嵌合受体，其中所述一个或多个修饰包括氨基酸插入、替代或缺失和/或其中所述一个或多个修饰中的每一个单独地包含氨基酸插入、替代或缺失。
22.如实施方式1-21中任一项所述的变体嵌合受体，其中所述第一和/或第二结构域包含跨膜结构域，其中
所述一个或多个修饰不是或不包含跨膜结构域中的疏水部分内的修饰或疏水氨基酸残基处的修饰或疏水氨基酸残基的修饰，所述跨膜结构域任选地是CD28跨膜结构域；或者
所述一个或多个修饰包括跨膜结构域内疏水性氨基酸残基的修饰，所述跨膜结构域任选地是CD28跨膜结构域，其中所述修饰是或包括疏水性氨基酸被另一不同的疏水性氨基酸残基取代；或者
所述一个或多个修饰不是或不包括跨膜结构域中的疏水部分内的修饰或疏水氨基酸残基处的修饰或疏水氨基酸残基的修饰，除非是用另一疏水氨基酸残基的取代，所述跨膜结构域任选地是CD28跨膜结构域。
23.如实施方式12-22中任一项所述的变体嵌合受体，其中所述一个或多个修饰包含对应于残基28和42之间的氨基酸残基的氨基酸残基处的修饰，参考SEQ ID NO：5所示的编号。
24.如实施方式1-23中任一项所述的变体嵌合受体，其中氨基酸修饰是插入，并且变体嵌合受体包括在结构域之间的接合处附近的氨基酸残基之间的插入，其任选地对应于氨基酸残基27和28，参考SEQ ID NO:5所示的编号。
25.如实施方式24的变体嵌合受体，包括插入1、2、3、4或5个氨基酸残基。
26.如实施方式24或25所述的变体嵌合受体，其中所述插入是任何氨基酸残基，其任选地是天冬酰胺(N)。
27.如实施方式12-26中任一项所述的变体嵌合受体，其中所述一个或多个修饰包含氨基酸替代，并且所述氨基酸替代位于对应于选自28、31或34的残基的一个或多个残基处，参考SEQ ID NO：5中所示的编号。
28.如实施方式27所述的变体嵌合受体，其中氨基酸替代是针对任何其他氨基酸残基，其任选地选自：亮氨酸(L)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)或组氨酸(H)。
29.如实施方式27或28所述的变体嵌合受体，其中所述氨基酸替代对应于或是选自下述的替代：K28A、K28H、K28L、K28Q、K28S、R31A、R31H、R31L、R31N、R31S、L34A和L34S，参考SEQ ID NO:5所示编号。
30.如实施方式27-29中任一项所述的变体嵌合受体，其中所述氨基酸替代不包含对应于L34A或L34S的单个氨基酸替代，参考SEQ ID NO：5中所示的编号。
31.如实施方式27-30中任一项所述的变体嵌合受体，其中所述氨基酸替代是或对应于选自下述的氨基酸替代：K28Q/R31A、K28Q/R31N、K28Q/R31S、K28Q/L34A、K28Q/L34S、R31N/L34A、R31N/L34S、K28Q/R31N/L34A、K28Q/R31N/L34S。
32.如实施方式1-31中任一项所述的变体嵌合受体，其中：
所述变体嵌合受体包含经修饰的接合区域，该经修饰的接合区域与SEQ ID NO:137具有小于100％序列相同性，但与SEQ ID NO:137具有大于85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或96％序列相同性且包括修饰；和/或
所述变体嵌合受体包含序列，该序列与SEQ ID NO:5具有小于100％序列相同性，但与SEQ ID NO:5具有大于85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或96％序列相同性且包括修饰。
33.如实施方式1-32中任一项所述的变体嵌合受体，其中所述变体嵌合受体包含选自以下的经修饰的接合区域：
i)SEQ ID NO:138-157和184中任一项所示的氨基酸序列；
ii)其功能变体，该功能变体包括与SEQ ID NO：138-157和184中任一所示氨基酸序列具有至少95％序列相同性的氨基酸序列并且包括所述修饰；或
iii)i)或ii)的功能部分并包括所述修饰。
34.如实施方式1-33中任一项所述的变体嵌合受体，其中所述变体嵌合受体包含：
i)SEQ ID NO:114-134和183中任一项所示的氨基酸序列；
ii)其功能变体，该功能变体包括与SEQ ID NO：114-134和183中任一所示氨基酸序列具有至少95％序列相同性的氨基酸序列并且包括所述修饰；
ii)或者，i)或ii)的功能部分并包括所述修饰。
35.如实施方式1-34中任一项所述的变体嵌合受体，其中与所述参考嵌合受体的接合区域相比，所述经修饰的接合区域包含不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
36.如实施方式1-35中任一项所述的变体嵌合受体，其中所述第一结构域或第二结构域是跨膜结构域，并且所述变体嵌合受体中的对应结构域包含基本上疏水的亲水性概况和/或包含大于0、0.25、0.5、0.75、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2或更大的总平均亲水性(GRAVY)值。
37.如实施方式1-36中任一项所述的变体嵌合受体，其中所述第一结构域或第二结构域包含胞内信号传导结构域，并且所述变体嵌合受体中的对应结构域能够诱导TRAF的活化或细胞定位和/或能够诱导TRAF介导的信号传导。
38.如实施方式37所述的变体嵌合受体，其中所述胞内信号传导结构域是4-IBB共刺激信号传导结构域和/或所述TRAF选自TRAF1、TRAF2或TRAF3。
39.如实施方式12-38中任一项所述的变体嵌合受体，其中所述变体嵌合受体包含在对应于49-52的位置处的氨基酸TTQE和/或在对应于残基60-63的位置处的氨基酸PEEE，各自参考SEQ ID NO：5所述的编号。
40.如实施方式1-39中任一项所述的变体嵌合受体，其中HLA是I类HLA和/或II类HLA。
41.如实施方式1-40中任一项所述的变体嵌合受体，其中I类HLA选自表1A中所示的HLA等位基因和/或II类HLA等位基因选自表1B中所示的HLA等位基因。
42.如实施方式1-41中任一项所述的变体嵌合受体，其中I类HLA等位基因选自HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*11:01和HLA-B*08:01。
43.如实施方式3-42中任一项所述的变体嵌合受体，其中HLA包括多个HLA分子，并且对多个HLA分子中的一个或多个的平均结合亲和性较低和/或与多个HLA分子中的一个或多个单独结合的肽片段的数量减少。
44.如实施方式43所述的变体嵌合受体，其中所述多个HLA分子选自：
多个I类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于95％或大于99％的I类HLA分子；
多个II类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于95％或大于99％的II类HLA分子；或
多个I类HLA分子和II类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于95％或大于99％的I类HLA分子和II类HLA分子。
45.如实施方式1-44中任一项所述的变体嵌合受体，其中结合亲和性是体外测定的。
46.如实施方式1-45中任一项所述的变体嵌合受体，其在给予人对象后表现出比参考嵌合受体低的免疫原性，任选地其中对象已接受参考嵌合受体的给药。
47.如实施方式46的变体嵌合受体，其中降低的免疫原性包括降低的CD4+T细胞免疫应答和/或降低的CD8+T细胞免疫应答。
48.如实施方式11-47中任一项所述的变体嵌合受体，其中：
所述参考嵌合受体还包括胞外配体结合结构域；和/或
所述变体嵌合受体还包括胞外配体结合结构域。
49.如实施方式48所述的变体嵌合受体，其是嵌合抗原受体(CAR)，其中所述配体结合结构域是抗原结合结构域。
50.如实施方式49所述的变体嵌合受体，其中所述抗原结合结构域是抗体或抗体片段。
51.如实施方式50所述的变体嵌合受体，其中抗原结合结构域是抗体片段，其为单链片段。
52.如实施方式50或51所述的变体嵌合受体，其中所述片段包含通过柔性免疫球蛋白接头连接的抗体可变区。
53.如实施方式50-52中任一项所述的变体嵌合受体，其中所述抗体片段包含scFv。
54.如实施方式48-52中任一项所述的变体嵌合受体，其中所述配体结合结构域特异性结合与疾病或病症相关的抗原。
55.如实施方式54所述的变体嵌合受体，其中：
所述疾病或病症是感染性疾病或病症，自身免疫性疾病，炎性疾病或肿瘤或癌症；
配体结合结构域特异性结合至肿瘤抗原；和/或
配体结合结构域特异性结合选自下述的抗原：ROR1，Her2，L1-CAM，CD19，CD20，CD22，间皮素，CEA，乙型肝炎表面抗原，抗叶酸受体，CD23，CD24，CD30，CD33，CD38，CD44，EGFR，EGP-2，EGP-4，EPHa2，ErbB2，ErbB3，ErbB4，FBP，胎儿乙酰胆碱e受体，GD2，GD3，HMW-MAA，IL-22R-α，IL-13R-α2，kdr，κ轻链，Lewis Y，L1-细胞粘附分子，MAGE-A1，间皮素，MUC1，MUC16，PSCA，NKG2D配体，NY-ESO-1，MART-1，gp100，癌胚抗原，TAG72，VEGF-R2，癌胚抗原(CEA)，前列腺特异性抗原，PSMA，雌激素受体，孕酮受体，肝配蛋白B2，CD123，CS-1，c-Met，GD-2，MAGE A3，CE7，肾母细胞瘤1(WT-1)和细胞周期蛋白A1(CCNA1)。
56.如实施方式11-55中任一项所述的变体嵌合受体，其中：
所述参考嵌合受体还包括活化性胞质信号传导结构域；和/或
所述变体嵌合受体还包含活化性胞质结构域。
57.如实施方式56所述的变体嵌合受体，其中所述活化性胞质结构域包含T细胞受体(TCR)组分和/或包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。
58.如实施方式56或57所述的变体嵌合受体，其中所述活化性胞质信号传导结构域是或包含CD3-ζ(CD3ζ)链的ζ链的胞质信号传导结构域或其功能变体或信号传导部分。
59.如实施方式11-58中任一项所述的变体嵌合受体，其中：
参考嵌合受体从其N至C末端依次包括：胞外配体结合结构域，第一结构域，第二结构域，第一结构域是跨膜结构域，第二结构域是胞内共刺激结构域和活化性胞质信号传导结构域；和/或
变体嵌合受体从其N到C末端依次包括：胞外配体结合结构域，跨膜结构域，胞内共刺激结构域和活化性胞质信号传导结构域，其中跨膜结构域和胞内共刺激结构域在接合处以连续的序列接合以形成修饰的接合区域。
60.编码实施方式1-59中任一项所述的变体嵌合受体的核酸分子。
61.一种包含实施方式60所述核酸分子的载体。
62.如实施方式61所述的载体，其是病毒载体。
63.如实施方式61或62所述的载体，其为逆转录病毒载体，其任选为慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
64.一种工程改造的细胞，其包含实施方式60所述的核酸或实施方式61-63中任一项所述的载体或者，其表达实施方式1-59中任一项所述的嵌合受体。
65.如实施方式64所述的工程改造的细胞，其是T细胞。
66.如实施方式64或65所述的工程改造的细胞，其是CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。
67.包含实施方式64-66中任一项所述的工程改造的细胞和任选药学上可接受的缓冲剂的组合物。
68.一种治疗方法，其包括将实施方式64-66中任一项所述的细胞或实施方式67所述的组合物给予患有疾病或病症的对象。
69.如实施方式68所述的方法，其中所述嵌合受体特异性结合至与所述疾病或病症相关的配体或抗原。
70.如实施方式68或69所述的方法，其中，所述疾病或病症是癌症、肿瘤、自身免疫性疾病或病症，或感染性疾病。
71.如实施方式68-70中任一项所述的方法，其中所述基因工程改造的T细胞在所述对象中表现出比在给予相同或约相同剂量的表达参考嵌合受体的参考细胞组合物的对象中增加或更长的扩增和/或持久性。
72.如实施方式71所述的方法，其中所述增加是至少1.2倍，1.5倍，2倍，3倍，4倍或5倍。
73.如实施方式71或72所述的方法，其中在给予所述细胞的一个月内，两个月内，六个月内或一年内观察到或存在所述增加。
VI.定义
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，表示氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。包括提供的受体和其他多肽(例如接头或肽)的多肽可以包括氨基酸残基，包括天然和/或非天然氨基酸残基。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化和磷酸化。在一些方面中，所述多肽可包含对原始或天然序列进行的修饰，只要该蛋白质保留所需活性即可。这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变，或者可以是偶然的，例如通过产生蛋白质的宿主突变或PCR扩增所致的误差。
当本文中针对核苷酸序列(参考核苷酸序列)使用“序列相同性百分率(％)”和“相同性百分率”时，定义为候选序列(对象嵌合受体，如变体嵌合受体)中与参考序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分率，在比对序列和引入间隙，如果需要，以实现最大百分比序列相同性之后。以测定序列相同性百分率为目的比对可以本领域技术范围内的不同方式实现，例如，使用公共渠道可获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能够确定用于比对序列的合适参数，包括使比较的序列实现全长最大对齐所需的任何算法。
本文中所用的，涉及区域的位置时的“对应于”，例如“在对应于……的位置”或述及区域或氨基酸位置“对应于”公开(例如示于序列表中)的序列中的区域或氨基酸位置，是指在含有采用标准比对算法(例如GAP算法)与该公开序列比对以最大化相同性时鉴定的氨基酸的位置。示例性描述的对应残基可以通过序列与SEQ ID NO：5中所示的示例性参考接合区域序列进行比对来鉴定。通过比对序列，本领域技术人员能够鉴定对应的残基或区域，例如，采用保守的和相同的氨基酸残基作为导向来鉴定。一般而言，为了鉴定对应位置或区域，将氨基酸序列比对，从而得到最高程度的匹配(参见，例如：《计算机分子生物学》(Computational Molecular Biology)，Lesk,A.M.编，纽约，牛津大学出版社，1988；《生物运算：信息学和基因组工程》(Biocomputing:Informatics and Genome Projects)，Smith,D.W.编，学术出版社，纽约，1993；《序列数据的计算机分析》(Computer Analysis ofSequence Data)，部分I，Griffin,A.M.，和Griffin,H.G.编，新泽西州胡马纳出版公司，1994；《分子生物学的序列分析》(Sequence Analysis in Molecular Biology)，vonHeinje,G.，学术出版社，1987；和，《序列分析引物》(Sequence Analysis Primer)，Gribskov,M.和DevereuX,J.编，M斯托克顿出版社，纽约，1991；Carrillo等.(1988)SIAM JApplied Math 48:1073)。
本文所用术语“载体”指能够扩增与之相连的另一核酸的一种核酸分子。该术语包括自复制核酸结构形式的载体，已经进入宿主细胞(载体引入其中的细胞)基因组的载体。某些载体能够引导与之操作性连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。载体包括病毒载体，如慢病毒载体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化株”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞及其衍生的子代，不计传代次数。子代的核酸含量与亲本细胞未必完全相同，并可包含突变。本文包括功能或生物活性与在原代转化细胞中筛选或选择的功能或生物活性相同的突变子代。
如本文所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代对象，除非文本中另有明确说明。例如，“一种”或“一个”指“至少一种或一个”或“一种(个)或多种(个)”。应理解本文中所述的方面和变化形式包括：“由(这些方面和变化形式)组成”和/或“基本由(这些方面和变化形式)组成”。
本公开内容中，请求保护的主题的各个方面均以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所要求保护的主题的范围的硬性限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在所述范围内的任何其他所述的或中间的值均被包括在要求保护的主题内。所述较小范围内可独立地包含这些较小范围的上下限，它们也属于请求保护的主题的范围，除非明确地排除所述范围的上下限。设定范围包含一个或两个限值时，请求保护的主题也包括排除所述限值之一个或两个的范围。这普遍适用，与范围宽度无关。
本文使用的术语“约”是指本技术领域技术人员容易知晓的各值的通常误差范围。提及值或参数时的“约”包括(并公开)涉及该值或参数本身的实施方式。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
本文中所用的组合物指，两种或更多种产物、物质或化合物，包括细胞，的任何混合物。组合物可以是溶液、悬液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任意组合。
VII.实施例
下面的实施例仅是为了阐述，而不是用来限制本发明的范围。
实施例1:转基因产物特异性宿主免疫应答的分析
治疗前和治疗后外周血液单核细胞(PBMC)样品获自患有B细胞恶性肿瘤的、用表达CD19特异性CAR的自体同源T细胞治疗的四个(4)对象。CAR包括源自鼠抗体的抗CD19scFv、铰链结构域、CD28跨膜结构域、4-1BB胞内信号传导结构域和CD3-ζ胞内信号传导结构域。表达CAR的T细胞还通过用含有编码CAR的核酸和编码EGFRt替代标志物的核酸(被T2A核糖体开关结构域分开)的慢病毒载体转导细胞来表达截短的EGFR(EGFRt)作为替代标志物。
评估获自所述对象的输注前和输注后(第42天)PBMC，以检测特异性抗CAR免疫应答的存在或不存在，该检测基本如下列文献所述，Berger等.Blood.2006年3月；107(6):2294-2302，Berger等.J Virol.2001年1月75(2):799-808，Riddell等.NatureMedicine.1996年2月2(2):216-223，Berger等.Blood.2005年2月105(4):1640-1647。简言之，PBMC(响应物)用自体同源γ辐照的细胞体外刺激，所述细胞转导有由给予的细胞表达的CAR(刺激物处于1:1或2:1的响应物-刺激物比例)。然后，在铬释放试验中评估，培养物的针对自体同源51Cr标记的CAR-转导的(“CD19 CAR”)和非转导的(“模拟”)T细胞(靶标)的细胞毒性，采用多种不同的效应物-靶标(E/T)比。共同孵育之后，定量铬的释放，并且确定各样品中最大可达裂解的百分比。
源自一名示例性患者的样品的结果示于图1，其说明了PBMC输注前和输注后第42天的溶细胞活性。在任何输注前PBMC-源性的培养物中没有检测到针对CAR转导的靶细胞具有特异性的溶细胞活性，但在评估的四个对象的两个中，在源自输注后PBMC样品的培养物中检测到了CAR特异性裂解活性。这些结果指示，CAR特异性免疫应答可在表达CAR的T细胞的单一输注之后发展。
可进行表位作图以评估由特异性免疫应答识别的CAR的一个或多个区域。输注前和输注后PBMC样品在多重15聚体肽的个体池的存在下被刺激，其具有代表由给予的细胞表达的CAR的约500个氨基酸序列的全长的重叠部分(11个氨基酸重叠)的序列。细胞用抗体染色以检测CD8和CD4表面表达以及细胞因子的胞内表达。评估了二十三(23)个池，其各自包含十(10)个肽，各自并统共地包括125个个体重叠肽，其中各肽由所述池中的至少两个代表。
该设计允许产生分析表格，以评估对个体肽具有特异性的应答，由此，在该试验中存在于多于一个被检测为命中结果的池中的肽被视为具有潜在免疫原性肽的命中。对于其中已检测到CAR特异性免疫应答的两名患者，分别鉴定了六个和三个肽命中。
进行了数个单独ELISpot试验，其采用抗细胞因子捕获抗体以评估针对这些个体命中物中每一个的特异性免疫应答的存在或不存在(参见Berger等.(2006)；Berger等.(2001)；Riddell等.(1996)；和Berger等.(2005)，同上)。一名患者的示例性试验的结果示于图2。在评估的两名患者中均检测到针对具有所述CAR的scFv的VH部分中的序列的肽的特异性免疫应答(一名患者中包括FR1、CDR1和FR2区域中的区域，而另一名患者中包括FR3中的区域)。对于第一名患者，还检测到针对两个重叠15聚体肽的特异性免疫应答，所述肽各自包含CAR的跨膜结构域和共刺激结构域之间的接合部分(图2中带标记的“融合位点”)。这两个重叠15聚体肽分别具有氨基酸序列AFIIFWVKRGRKKLL(SEQ ID NO:8)和FWVKRGRKKLLYIFK(SEQ ID NO:9)。在给予具有鼠scFv、CD28跨膜和共刺激结构域和CD3ζ结构域的不同CAR之后的另一研究中，采用相似方法，对于一名对象检测针对包含抗CD19scFv的VH部分的池的免疫应答，且对于另一名对象检测包含接合部分的池中的免疫应答。
通过该试验，没有检测到所述患者针对其它区域中的肽的特异性免疫应答。例如，在该试验中，没有检测到针对具有scFv的框架区或其它CDR中的序列的肽、处于共刺激或跨膜结构域的区域内但不跨越两者的接合部分的肽，或处于CAR的CD3-ζ区域或EGFRt内的肽，的特异性应答。没有检测到针对内源性序列的特异性免疫应答。
实施例2：计算机模拟分析源自CAR的接合区域的肽与I类HLA和II类HLA的结合。
采用可获自免疫表位数据库(Immune Epitope Databas)和分析资源(IEDB)的T细胞表位预测工具，进行计算机模拟分析，以预测MHC-结合亲和性和与针对示例性CAR序列的部分内的各一系列重叠肽序列的潜在的免疫原性相关的其它性质。该部分包括间隔物，其具有免疫球蛋白源性的铰链结构域、人CD28跨膜结构域、人4-1BB共刺激结构域，和人CD3ζ信号传导结构域。在评估的部分中，所述铰链结构域是人IgG4铰链结构域，所述CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:2所示的序列，并且所述4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:3所示的序列。该部分因此包含源自人序列的不同结构域之间的三个接合部分(所述接合部分可在给予人类对象之后具有针对CAR具有潜在免疫原性的代表性的位点)：所述间隔物区域和跨膜结构域之间的接合部分，所述跨膜结构域和共刺激结构域之间的接合部分，和所述共刺激结构域和胞内信号传导结构域之间的接合部分(参见图3A和3B)。
为鉴定可能具有使它们更可能被呈递给T细胞的具体性质的序列的部分，预测沿所述部分的长度、长度为8-14个氨基酸和长度为15个氨基酸(包含9聚体结合中心)的重叠肽的结合至27个个体I类HLA等位基因和56个个体II类HLA等位基因的亲和性。这些等位基因，统共地代表存在于世界群体的大于99％中的HLA等位基因，并且它们在美国群体中的大致频率列于表1A和1B中。
Figure BDA0001745960710000721
Figure BDA0001745960710000731
Figure BDA0001745960710000732
Figure BDA0001745960710000741
采用可获自IEDB的基于算法的T细胞表位预测工具，来预测数据集中的各8-14氨基酸肽对于I类HLA分子结合的IC50值，采用ANN(Nielsen等.(2003)Protein Sci.,12:1007-1017和Lundegaard等.(2008)NAR,36:W509-512)，和，在一些情况中，一个或多个额外的预测，采用SMM(Peters和Sette(2005)BMC Bioinformatics,6:132)和Comblib(Sidney等.(2008)Immunome Res.4:2，或Consensus工具(参见Kim等(2012)免疫表位数据库分析资源(Immune epitope database analysis resource)，NAR(组合来自任何前述的预测)。对于所述数据集中的各15氨基酸肽结合至II类HLA的IC50值的预测采用NetMHCIIpan方法进行(Karosiene等.(2013)Immunogenetics 65(10):711；Nielsen等.(2008)PLoS ComputBiol.4(7)e1000107)。对于CAR氨基酸序列的部分中的各个个体位置，确定包括所述位置并预测以低于50nm的预计IC50结合至I类或II类等位基因中的任一种的数据集中的序列的总数。图4A(I类HLA)和4B(II类HLA)，分别描述针对I类和II类等位基因的结果，显示沿所述序列长度的位置覆盖，基于确定的总数量，根据群体中个体HLA等位基因的频率进行加权。贯穿整个评估的区域的曲线下面积(AUC)对于I类HLA结合是约1321且对于II类HLA结合是2943。对于跨膜-共刺激结构域区域的AUC对于I类HLA结合是约931且对于II类HLA结合是2212。
如图4A和4B中所示，通过该方法预测所述序列的某些部分包含更可能在MHC复合物中良好结合从而以表位形式呈递供于T细胞的可能的识别。对于单独HLA等位基因的结合亲和性不一定预测免疫原性。鉴于该示例性CAR中的个体结构域(例如，跨膜、共刺激)是人源性的，在给予人类对象之后，不太可能发展针对这些个体区域的单独任何一种内的表位的免疫原性应答(这与跨越彼此一般不相关联的多个区域的表位和/或包含此类区域之间的接合部分的表位相反)。例如，甚至对于预测在MHC分子的情况下结合良好并被呈递肽而言，如果该肽整个源自内源性蛋白质，那么它可被识别为“自己”，从而可能无法诱导富有成效的免疫应答。例如，尽管某些区域完全处于在HLA-结合亲和性预测上得到高分的单一跨膜或胞质结构域之内，在实施例1中描述的结果中，没有检测到针对仅处于相似CAR序列的这些结构域之一的肽序列的免疫应答。因此，尽管关于预测的HLA-结合亲和性观察到多种不同的“热点”，但后续评估和改变着眼于不仅具有较高预测IC50值，而且还包括跨越源自两种不同蛋白质的不同结构域之间的接合部分的潜在表位的那些区域。
具体地，进一步评估包括跨越示例性CAR的CD28跨膜结构域和4-1BB信号传导结构域的接合部分的一个或多个潜在的肽表位的接合区域。关于SEQ ID NO:5所示序列，其包括示例性人CD28跨膜结构域(SEQ ID NO:2)和示例性人4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO:3)，该评估的接合区域在跨越CD28跨膜和4-1BB共刺激结构域的接合部分的任一侧包含13个氨基酸，如下：
Figure BDA0001745960710000751
Figure BDA0001745960710000761
其中26个氨基酸的接合区域以粗体指示，且所述结构域之间的接合部分的C’和N’的两个氨基酸以下划线表示。评估的26氨基酸接合区域如SEQ ID NO:137所示，并且对应于SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的氨基酸残基15至40。
进行计算机模拟建模，以鉴定如SEQ ID NO:137所示的26氨基酸接合区域中的一个或多个氨基酸修饰(突变)，其导致肽片段被预测以高IC50值结合至I类和II类等位基因，并因此可能减小诱导针对包含该区域的CAR的免疫原性的潜力。具体地，对于对应于位置14、17和20的氨基酸残基位置处包含一个或多个突变的接合区域的变体肽片段进行预测，其编号参考SEQ ID NO:137(其对应于：对应于位置28、31和34的氨基酸位置处的一个或多个突变，其编号参考SEQ ID NO:5)。在该示例性研究中，选择这些残基用于对于全部高亲和性表位的计算机模拟诱变和结合预测之后的进一步分析，其中，研究贯穿所述表位的全部可能的单一氨基酸替代对于预期的IC50值的影响。鉴定导致较大IC50预测结果的残基(结合下降)，其鉴定上述残基是对替代敏感的。
评估一系列不同变体接合区域，其各自在评估的一个或多个位置处包含一个或多个氨基酸替代，相较于示例性CAR序列中的非突变的接合区域。选择可能对于共刺激信号传导结构域的各跨膜区域的结构或功能破坏性较小的、所述鉴定的位置处的氨基酸替代的示例性子集。并且，由于表位重叠，选择可能能够一次影响多于一个表位的替代。具体地，个体变体接合区域包含如下修饰(氨基酸替代)：K28A、K28H、K28L、K28Q、K28S、R32A、R31H、R31L、R31N、L34A、L34S、K28Q/R31A、K28Q/R31N、K28Q/R31S、K28Q/L34A、K28Q/L34S、R31N/L34A、R31N/L34S、K28Q/R31N/L34A、K28Q/R31N/L34S，其编号参考SEQ ID NO:5。
对于非变体和变体接合区域，采用可获自IEDB的T细胞表位预测工具，对I类和II类等位基因获得经加权的免疫原性评分。采用对于相应的(变体或非变体)26-氨基酸接合区域中的一系列8聚体-14聚体重叠肽(单独地对于27个I类HLA等位基因的每一个)和一系列15聚体重叠肽(单独地对于56个II类HLA等位基因的每一个)的各自的预测的IC50值来衍生评分，并基于个体I类HLA和II类等位基因的群体中相应的频率进行加权。较高的相对评分指示较高的预测结合程度。
结果如图5所示。结果显示通过修饰CAR接合区域中的氨基酸，降低该区域内的总体预测I类HLA免疫原性评分的能力。结果还证实，减小预测I类HLA结合亲和性(并因此减少预测免疫原性评分)而不导致实质上增加的针对II类HLA结合的预期免疫原性评分的能力。因此，一般而言，结果显示，可以制造跨越CAR的CD28跨膜结构域和4-1BB共刺激结构域之间的接合部分的区域中的一个或多个氨基酸修饰，并实现对于人HLA结合的预测亲和性的总体减小，这将与在给予人类对象与具有该区域的受体等同但在该区域中包含所述修饰或修饰的组合的嵌合受体之后的免疫原性的可能性减小相一致。
实施例3:源自CAR的接合区域的肽结合至I类HLA的计算机模拟分析和体外结合的比较。
对某I类HLA等位基因(A*02:01，A*03:01，A*11:01和B*08:01)对于跨越CD28和4-1BB接合部分的26氨基酸的接合区域的部分内的示例性重叠9氨基酸肽序列的实际结合亲和性进行体外评估。具体地，评估源自序列VAFIIFWVKRGRKKLL(示于SEQ ID NO:7)的一系列重叠9聚体肽，所述序列包含跨越所述结构域之间的接合部分的4-1BB共刺激结构域和CD28跨膜结构域的部分(键接合以下划线所示的两个氨基酸)。此外，还评估该部分的多个不同变体的各自的一系列重叠9聚体肽，各变体在该区域中包含一个或多个突变，如实施例2中所述。
合成多种9聚体重叠肽，并通过MALDI-TOF质谱测试它们的纯度。然后，合成肽与重组MHC分子孵育，以采用REVEAL表位发现系统(REVEAL Epitope Discovery System)评估结合性质，这是高通量结合试验，其检测各肽能够使三元MHC-肽复合物稳定的程度(ProImmune，英国牛津)。分开测试各肽对于各I类HLA等位基因的所述能力，针对阳性对照(已知的针对相关等位基因的T细胞表位)观察到的程度标准化。结果以评分形式报告，其中，结合对于设为100％的阳性对照肽进行标准化。在该分析中，一般认为大于50的评分代表良好或高亲和性结合。
结果与采用如实施例2中所述的计算机模拟预测方法对于相同肽:MHC复合物的结合获得的预测的结合(IC50)值做比较。因为预测的最大IC50值是约50000，所以将IC50值进行对数(log)转化，从LOG(50000)减去，并除以LOG(50000)，以获得标准化的计算机模拟评分((Log(50000)–logIC50)/Log(50000))。在该分析中，一般认为大于2.0的计算机模拟结合预测评分代表预测的良好或高亲和性结合。
结果示于表2A(HLA-A*02:01和HLA-A*03:01)和表2B(HLA-A*11:01和HLA-B*08:01)。一般而言，计算机模拟结合预测对于实际体外结合结果具有预测性。在一些情况中，计算机模拟预测具有相对较高的结合，但在体外试验并没有观察到这样的情况。
结果也与体外试验中检测的对于亲和性具有一般预测性的预测的结合亲和性一致。并且，结果显示通过接合区域内的修饰成功地减小了对于HLA的结合亲和性，并且，能够以某一方式修饰该序列，该方式导致重叠的潜在表位之一的较低的预期或实际结合亲和性或评分，而不增加(或同时也降低)对于包含相同残基的重叠表位中的另一个的结合亲和性或评分。在一些实施方式中，所述突变或修饰可具有特定的益处。作为结果的一个非限制性示例，修饰K28L、R31H、L34S和/或L34A，参考SEQ ID NO:5所示编号，一般导致对于至少一个HLA等位基因和/或对于所评估的区域中的至少一个肽的预测或实际结合亲和性或评分的减少，而不导致对于另一HLA等位基因的较高结合亲和性和/或不导致对于另一肽的较高结合亲和性。
Figure BDA0001745960710000781
Figure BDA0001745960710000791
Figure BDA0001745960710000801
Figure BDA0001745960710000802
Figure BDA0001745960710000811
Figure BDA0001745960710000821
实施例4:源自CAR的接合区域的肽与HLA-A2:01的结合的分析
为了鉴定可能能够诱导免疫原性应答的CAR源性肽，通过计算机模拟评估包含CAR的CD28跨膜结构域和4-1BB共刺激结构域之间的接合部分的非变体(参考)序列中的一系列重叠肽。使用算法来预测对于常见人MHC I类分子(HLA-A2:01)的肽槽的结合亲和性，采用计算机模拟分析来预测结合亲和性。如图3所示，CAR的评估的部分具有序列CYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPF(示于SEQ ID NO:6)，其包含CD28跨膜结构域(示于SEQID NO:2)的部分和4-1BB共刺激结构域(示于SEQ ID NO:3)的部分，其中跨越所述结构域的接合部分的残基以下划线显示。计算机模拟评估SEQ ID NO:6所示序列的8-14个氨基酸的一系列140个重叠肽的预测的HLA-A2:01结合亲和性。35个所述肽仅包含来自跨膜结构域部分的序列；35个所述肽仅包含来自共刺激结构域部分的序列，而70个所述肽具有接合或融合区域序列，其包含桥接所述结构域之间的接合部分的氨基酸残基。对于该评估，认为预测以0nM-50nM的解离常数结合至HLA-A2:01的肽片段是预测以高亲和性结合的。认为预测以51nM-1000nM的解离常数结合的肽片段是预测以低亲和性结合的。认为预测以1000nM-5000nM的预测的亲和性结合的肽片段是预期以极低亲和性结合的。结果如图3所示。
如图3中所示，源自该区域中的参考序列的两个肽，其各自包含具有跨越所述结构域之间的接合部分的重叠区域的序列，被预测为显示与HLA-A2:01的低结合亲和性。具体地，具有序列FIIFWVKRGRKKLL(SEQ ID NO:10)的14聚体肽被预测以294nM的解离常数结合，而具有序列FIIFWVKRGRKKL(SEQ ID NO:11)的13聚体肽被预测以618nM的解离常数结合。这些肽各自包括实施例8中鉴定的且如SEQ ID NO:1所示的15聚体肽的部分。该序列中的较短的8聚体至12聚体肽未被预测显示结合至HLA-A2:01。预测包含氨基酸序列IIFWVKRGRKKLL(SEQ ID NO:12)的另一13聚体肽具有以预测的约3000nM解离常数的极低结合亲和性。桥接这两个结构域的接合部分的剩余的片段均未被该试验预测为显示对于HLA-A2:01的结合亲和性(全部具有远大于5000nM的预测解离常数，并且在大多数情况中高于14000nm或20000nM或更大)。在预测结合至HLA-A2:01的各肽中，两个跨越接合部分的残基(VK)本身均不被预测为锚着残基；而是，所述肽在非侧接位置包含这些残基。
包含仅源自跨膜结构域的肽中有大致15个被预测为对HLA-A2:01具有小于5000nM的解离常数。预测包含仅来自共刺激结构域的序列的两个肽对HLA-A2:01结合具有小于5000nM的解离常数。评估的序列中的共刺激结构域和跨膜结构域源自内源性人序列，其对于人类对象一般不太可能是免疫原性的。例如，在实施例1中描述的研究中，没有检测到针对仅处于CAR的这些结构域之一中的肽序列的特异性免疫应答。因此，评估包含跨越所述接合区域的序列的肽的变体。
为了产生预测具有针对HLA-A2:01的减少的结合亲和性和/或在具有该HLA等位基因的人类对象中的减少的免疫原性的变体肽，通过计算机模拟方式产生变体序列，其相较于SEQ ID NO:6所示的序列在接合区域中包含突变。鉴于预测包含跨越接合部分的“VK”残基(在非锚着位置)的肽将显示对于HLA-A2:01的高结合亲和性，将两个天冬酰胺残基插入CD28跨膜结构域和4-1BB共刺激结构域之间的接合部分。该变体包含序列CYSLLVTVAFIIFWVNNKRGRKKLLYIFKQPF(示于SEQ ID NO:13，该序列侧接通过插入以下划线显示的天冬酰胺残基而产生的接合部分)。通过相同预测方法评估SEQ ID NO:13示例性变体序列。为了评估该变体序列的预测的结合亲和性，通过如上所述的计算机模拟分析评估SEQ ID NO:13所示序列的8-14个氨基酸的一系列154个重叠片段，由此，35个肽具有仅处于跨膜部分中的序列，35个肽具有仅处于共刺激结构域部分中的序列，且84个肽包含含有桥接所述结构域的氨基酸的接合区域序列，包括所插入的天冬酰胺残基之一或两者。
结果见图3。可见，总体上，包含所述接合部分的变体区域内的重叠肽的HLA-A2:01结合亲和性，统共地，相较于非变体序列而言，实质上减少。具体地，先前预测为免疫原性的接合区域的部分中的肽结合至HLA-A2:01的预测解离常数显著降低了。例如，相较于分别如SEQ ID NO:10和11所示鉴定的肽而言，包括侧接接合处的改变区域中的天冬酰胺残基的肽变体IIFWVNNKRGRKKL(SEQ ID NO:14)和IIFWVNNKRGRKK(SEQ ID NO:15)被预测将对HLA-A2:01不会显示可检测的结合亲和性。两个14聚体肽，FIIFWVNNKRGRKK(SEQ ID NO:96)和IFWVNNKRGRKKLL(SEQ ID NO:97)，被预测将对与该HLA的结合显示指示极低结合亲和性的解离常数，在1000nM-5000nM范围内。包含该经修饰的接合区域序列的全部其它肽均被预测显示大于5000nM的解离常数，并且在大多数情况中，高于14000nM或20000nM或更大，因此被该评估不会预测显示对于HLA-A2:01的结合亲和性。并且，所述接合区域序列的修饰不产生预测将在共刺激或跨膜结构域区域中对HLA-A2:01具有较高结合亲和性的任何新肽。
实施例5:抗-CD22 CAR表达型细胞向先前用抗-CD19 CAR治疗的对象的给予
向具有复发/难治CD22+B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)的六名对象给予表达抗-CD22嵌合抗原受体(CAR)的自体T细胞。所述CAR包括人抗-CD22 scFv抗体、CD8á跨膜结构域、4-1BB胞内信号传导结构域，和CD3ζ胞内信号传导结构域。
所有对象先前均经历过至少一种前施同种异体造血干细胞移植物，并且接受过采用多种不同的CD19导向的CAR-T细胞疗法之一的治疗。所述对象中有五名具有ALL复发，对其未检测到CD19(“CD19阴性”)，并且一名对象在其它情况中是对于前施的CD19 CAR治疗的非响应者。
表3汇总了经治疗患者的特点。
Figure BDA0001745960710000851
HCT：造血细胞移植。
在给予所述细胞之前，患者经历自体同源白细胞除去法，以收获外周血液单核细胞(PBMC)。T细胞通过针对CD3表达的基于免疫亲和性的富集法从收获的PBMC分离，并在抗-CD3/-CD28珠的存在下培养，随后用编码抗-CD22 CAR的慢病毒载体转导。细胞培养7-10天。对象在第-4、-3和-2天接受采用25mg/m2氟达拉滨的诱导化疗，并在第-2天接受900mg/m2的环磷酰胺(在第0天细胞输注)。各患者通过静脉内输注接受3x 105转导的T-细胞/受者体重(kg)的初始CAR T细胞剂量。加入的第二对象发生了3级腹泻，这符合剂量限制毒性(DLT)的标准，这导致第一剂量水平的剂量扩增以治疗总计6名对象。在该剂量中未见后施DLT。两名对象发生1级细胞因子释放综合征(CRS)，一名对象发生2级CRS，并且在两名对象中不存在CRS。
在治疗后某时间点通过用CD22-Fc孵育细胞来测定外周血液、骨髓或脑脊液中的CAR-T细胞数量。对于其中观察到增殖的患者，在约第7天开始看到在外周血液、骨髓和脑脊液中观察到CAR-T细胞增殖的证据。最大或峰值CAR-T细胞增殖一般在输注后约第12天和约第15天之间观察到。表7列出了在该评估阶段观察到的抗-CD22 CAR-T细胞的最大或峰值百分比，以经治疗对象的各样品中的总T细胞的百分比的形式显示。临床应答在输注后第28天(+/-4天)评估。
如表4所示，结果与一般与CAR-T细胞增殖的程度相关的应答相一致。对于显示无或低CAR-T细胞增殖的三名对象也显示了疾病进展的证据。两名其它对象具有稳定疾病，并且观察到一名完全缓解且无MRD。检测到在该对象中，流式细胞CAR持久性持续超过输注后47天，其中在输注后3个月持续缓解。结果显示在经历了先前抗-CD19 CAR治疗(并且已变得对该治疗非响应性，例如，归因于表位/抗原流失)的对象中的安全、可行且具有临床有效的抗-CD22 CAR T-细胞治疗。
Figure BDA0001745960710000861
PB：外周血；CSF：脑脊液；CRS：细胞因子释放综合征；PD：进展性疾病：MRD：最小残余疾病；CR：完全缓解；SD：稳定疾病。
实施例6:源自CAR的接合区域的肽结合至II类HLA的计算机模拟分析和体外结合的比较。
如实施例4所述，对某II类HLA等位基因(DPA1*01:03；DPB1*04:01,DRA*01:01；DRB1*03:01,DRA*01:01,DRB1*15:01,DRA*01:01；DRB1*11:01,DPA1*01:03；DPB1*04:02,DPA1*01:03；DPB1*03:01,DPA1*01:03；DPB1*01:01,DPA1*02:01；DPB1*01:01,DPA1*02:01；DPB1*04:02,DRA*01:01,DRB1*11:04,DRA*01:01,DRB1*01:02,和DPA1*02:01；DPB1*15:01)对于跨越接合部分的区域的部分内的示例性重叠15氨基酸肽序列的实际结合亲和性进行体外评估，所述接合部分是CAR的CD28和4-1BB衍生的序列之间的接合部分。具体地，评估源自序列
Figure BDA0001745960710000862
(示于SEQ ID NO:160)的一系列重叠15聚体肽，所述序列包含4-1BB衍生的共刺激结构域和CD28衍生的跨膜结构域的部分并跨越所述结构域之间的接合部分(接合以下划线所示的两个氨基酸的键)。此外，还评估该部分的多个不同变体的各自的一系列重叠15聚体肽，各变体在该区域中包含一个或多个突变，如实施例2中所述。
合成多种15聚体重叠肽，并通过MALDI-TOF质谱测试它们的纯度。然后，合成肽与重组MHC分子孵育，以采用REVEAL表位发现系统(REVEAL Epitope Discovery System)评估结合性质，如实施例3所述。分开测试各肽对于各II类HLA等位基因的所述能力，针对阳性对照(已知的针对相关等位基因的T细胞表位)观察到的程度标准化。针对各等位基因计算评分，其中，结合对于设为100％的阳性对照肽进行标准化。基于这些评分的对群体的潜在影响计算为各肽的个体等位基因评分的总和。
结果如图7所示。如图所示，结果证明接合区域内的修饰导致该区域内至少一种肽的II类HLA结合的成功减少。
对于存在于天然接合区域内的重叠15-聚体肽，将结果与采用如实施例2中所述的计算机模拟预测方法对于相同肽:MHC复合物的结合获得的预测的结合(IC50)值做比较。因为预测的最大IC50值是约50000，所以将IC50值进行对数(log)转化，从LOG(50000)减去，并除以LOG(50000)，以获得标准化的计算机模拟评分((Log(50000)–logIC50)/Log(50000))。对于标准化的计算机模拟和实际结合亲和性，获得免疫原性评分(基于个体II类HLA等位基因的群体中的相对频率加权)。结果如图8所示。通常，计算机模拟结合预测可预测实际的体外结合结果，并且在某些情况下过度预测实际的体外结合结果。
实施例7:用具有修饰的接合区域的CAR转导的T细胞的工程改造和表征
通过用慢病毒载体转导原代T细胞产生CAR工程改造的T细胞，所述慢病毒载体编码(1)如实施例1中所述的原始嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗CD19scFv、铰链结构域、如SEQID NO：5所示的接合区域(包括衍生自天然CD28的跨膜结构域和衍生自天然4-IBB的胞内信号传导结构域)(被认为是“天然”接合区域)和CD3-ζ胞内信号传导结构域，或(2)其许多特定变体之一，各自含有修饰的接合区域，其中在跨越CD28跨膜结构域和4-IBB共刺激信号传导结构域之间的接合处的接合区域中引入一个或多个突变。各具体变体CAR含有具有突变的修饰的接合区域(参考SEQ ID NO：5)，所述突变选自：K28Q/R31N/L34S、K28Q/R31N/L34A、R31N/L34S、R31N/L34A、K28Q/L34A、K28Q/R31S、K28Q/R31N、K28Q/R31A、L34S、L34A、R31S、R31N、R31A、K28S、K28Q、K28L、K28H和K28A。
通过基于免疫亲和性的选择从获自健康供体的人PBMC样品中分离原代人CD4+和CD8+T细胞。在用相应的CAR工程改造之前，通过用抗CD3/抗CD28试剂培养来刺激所得细胞。使用含有编码CAR的核酸分子和编码截短的EGFR(EGFRt)的核酸(用作转导的替代标志物，由编码T2A核糖体开关的序列分开)的慢病毒载体转导细胞。模拟转导用作阴性对照。将转导的细胞用于表达分析和细胞溶解活性测定。
A.CAR表达
在用编码天然CAR或各修饰的CAR的核酸转导后第17天评估细胞表面CAR表达(如通过替代标志物所示)。用抗EGFR抗体染色细胞以检测作为替代物的EGFRt，从而验证CAR表达，并通过流式细胞术评估细胞。CAR表达在经转导以表达含有修饰的接合区域的各种变体CAR的细胞中相似，并且与含有天然接合区域的CAR的表达相当。
B.溶细胞活性
评估经工程改造以表达天然或变体CAR的细胞对表达CD19抗原的K562靶细胞(K562-CD19)的溶细胞活性。将T细胞与靶细胞(K562-CD19)以各种效应物:靶标比例(CAR:靶标比例1:1、2:1和4:1)在培养板的孔中温育。通过测量每孔的胱天蛋白酶阳性靶细胞的数量来评估工程改造的T细胞的裂解活性。结果显示，在该研究中，表达含有修饰的接合区域的各种变体CAR的T细胞能够以靶特异性方式杀死表达CD19的靶细胞，达到与表达含有“天然”接合区域的CAR的T细胞相似的程度。
实施例8:具有经修饰的接合区域的CAR的表面表达和功能的评估
通过用核酸转导原代T细胞产生CAR工程改造的T细胞，所述核酸编码(1)实施例1中描述的原始嵌合抗原受体(CAR)，其含有抗CD19scFv、铰链结构域、SEQ ID NO：5所示的天然接合区域(包括衍生自天然CD28的跨膜结构域和衍生自天然4-IBB的胞内信号传导结构域)，或(2)含有具有突变的经修饰的接合区域的变体，所述突变选自：K28L，R31H，L34A或L34S，参考SEQ ID NO：5。评估了用含有经修饰的接合区域的CAR工程改造的T细胞的细胞表面CAR表达和功能特性。
A.表面表达
为了直接评估CAR的表面表达，将CAR工程改造的T细胞用对CAR中包含的抗CD19scFv特异的抗独特型抗体染色。还使用抗EGFR抗体评估工程改造的细胞的替代标志物EGFRt的表面表达。为了检测CAR的细胞内表达，首先使细胞透化，然后使用抗独特型抗体和抗EGFR抗体在类似条件下染色。通过流式细胞术在CD4+或CD8+亚组中分析CAR和替代标志物的表达。
图9A和9B显示在工程改造的CD4+ T细胞中分别在表面和细胞内表达的含有修饰的接合区域的变体CAR。变体CAR的表面表达水平类似于或大于含有天然接合区域的未修饰CAR的表面表达。与CAR共转导的替代标志物在所有工程改造的细胞中表达相似。
使用CAR特异性抗独特型抗体测定的CAR表面表达的平均荧光强度(MFI)在门控CD4+和CD8+细胞的工程改造的T细胞中定量。如图10所示，CAR的表面表达在CD4+和CD8+T细胞上相似。与具有天然接合区域的CAR相比，含有具有L34A和L34S突变的修饰的接合区域的变体CAR表现出增加的表面表达。
B.细胞因子表达
评估了表达含有天然接合区域或各种修饰的接合区域的CAR的抗CD19 CAR T细胞的细胞因子的生产。在高尔基体抑制剂存在下，将经工程改造的T细胞与经辐射的CD19-转导的K562靶细胞(K562-CD19)或不表达CD19抗原的亲本K562细胞共培养。刺激后，将细胞固定、透化、并在CD4+/CAR+细胞中和CD8+/CAR+细胞中通过流式细胞术评估细胞内IL-2和IFN-γ细胞因子水平。
图11示出示例性流式细胞术图，显示CD4+/CAR+细胞和CD8+/CAR+细胞中IL-2和IFN-γ的细胞内水平。如图所示，与用未修饰的CAR工程改造的细胞相比，在抗原刺激后，有更高百分比的表达L34A和L34S变体CAR的CD4+/CAR+T细胞和CD8+/CAR+T细胞表现出IL-2的细胞内表达。与用未修饰的CAR工程改造的细胞相比，在抗原刺激后，有更高百分比的表达R31H和L34A CAR变体的CD8+/CAR+ T细胞具有增加的IFN-γ细胞因子表达。不希望受理论束缚，细胞因子表达水平的增加可能与观察到的R31H和L34A变体CAR的较高表面表达大致相关。
C.CAR T细胞扩增
在一些方面中，在重复刺激之后细胞体外扩增的能力可以指示CAR-T细胞持续存在的能力(例如，在初始激活之后)和/或是体内功能的指示(Zhao等(2015)Cancer Cell，28：415-28)。如上所述产生CAR-T细胞，并用经照射的靶细胞(K562-CD19)培养。刺激细胞，每3-4天收获并计数，在每轮将细胞数重设为初始接种密度后，使用相同的培养条件用新的靶细胞再刺激。在17天的培养期间进行总共5轮刺激。对于每轮刺激，确定细胞数。
如图12所示，与表达具有天然接合区域的CAR的细胞相比，对于表达含有修饰的接合区域的变体CAR的细胞来说，观察到抗CD19 CAR工程改造的细胞的相当的初始生长。在再刺激的第7天后，细胞扩增程度在表达含有天然接合区域的CAR的细胞中下降，而变体CAR显示持续或类似的扩增直至再刺激的至少第10天。
本发明不局限于本文所述实施方式的范围，这些实施方式仅旨在说明本发明的单独方面，任何功能等同形式也在本发明范围内。本文所述以外的对发明模型和方法的各种改良通过以上描述和教导对本领域技术人员显而易见，所述改良同样旨在落入本发明的范围内。可以实施此类改良或其它实施方式而不偏离本发明的真实范围和精神。
序列
表5:序列
Figure BDA0001745960710000901
Figure BDA0001745960710000911
Figure BDA0001745960710000921
Figure BDA0001745960710000931
Figure BDA0001745960710000941
Figure BDA0001745960710000951
Figure BDA0001745960710000961
Figure BDA0001745960710000971
序列表
<110> 朱诺治疗学股份有限公司（Juno Therapeutics, Inc.）
<120> 修饰的嵌合受体及相关组合物和方法
<130> 735042004740
<140> 未指定
<141> 共同提交
<150> 62/262,911
<151> 2015-12-03
<150> 62/348,130
<151> 2016-06-09
<160> 184
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> IgG4 铰链
<400> 1
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 2
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> CD28跨膜结构域
<400> 2
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 3
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 4-1BB共刺激结构域
<400> 3
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> CD3-ζ胞内信号传导结构域
<400> 4
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 5
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> CD28-4-1BB
<400> 5
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys
20 25 30
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
35 40 45
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
50 55 60
Gly Gly Cys Glu Leu
65
<210> 6
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys
1 5 10 15
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
20 25 30
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
1 5 10 15
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
1 5 10 15
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
1 5 10 15
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
1 5 10
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
1 5 10
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
1 5 10
<210> 13
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 变体接合区域
<400> 13
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Asn
1 5 10 15
Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
20 25 30
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 变体肽
<400> 14
Ile Ile Phe Trp Val Asn Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
1 5 10
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 变体肽
<400> 15
Ile Ile Phe Trp Val Asn Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys
1 5 10
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly
1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 20
Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28S
<400> 23
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Ser
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28S
<400> 24
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Ser Arg
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28S
<400> 25
Phe Ile Ile Phe Trp Val Ser Arg Gly
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28S
<400> 26
Ile Ile Phe Trp Val Ser Arg Gly Arg
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28S
<400> 27
Ile Phe Trp Val Ser Arg Gly Arg Lys
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28S
<400> 28
Phe Trp Val Ser Arg Gly Arg Lys Lys
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28S
<400> 29
Trp Val Ser Arg Gly Arg Lys Lys Leu
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28L
<400> 30
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Leu
1 5
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28L
<400> 31
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Leu Arg
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28L
<400> 32
Phe Ile Ile Phe Trp Val Leu Arg Gly
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28L
<400> 33
Ile Ile Phe Trp Val Leu Arg Gly Arg
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28L
<400> 34
Ile Phe Trp Val Leu Arg Gly Arg Lys
1 5
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28L
<400> 35
Phe Trp Val Leu Arg Gly Arg Lys Lys
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28L
<400> 36
Trp Val Leu Arg Gly Arg Lys Lys Leu
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28H
<400> 37
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val His
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28H
<400> 38
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val His Arg
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28H
<400> 39
Phe Ile Ile Phe Trp Val His Arg Gly
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28H
<400> 40
Ile Ile Phe Trp Val His Arg Gly Arg
1 5
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28H
<400> 41
Ile Phe Trp Val His Arg Gly Arg Lys
1 5
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28H
<400> 42
Phe Trp Val His Arg Gly Arg Lys Lys
1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28H
<400> 43
Trp Val His Arg Gly Arg Lys Lys Leu
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28A
<400> 44
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Ala
1 5
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28A
<400> 45
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Ala Arg
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28A
<400> 46
Ile Ile Phe Trp Val Ala Arg Gly Arg
1 5
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28A
<400> 47
Ile Phe Trp Val Ala Arg Gly Arg Lys
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28A
<400> 48
Phe Trp Val Ala Arg Gly Arg Lys Lys
1 5
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28A
<400> 49
Trp Val Ala Arg Gly Arg Lys Lys Leu
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28Q
<400> 50
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Gln
1 5
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28Q
<400> 51
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Gln Arg
1 5
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28Q
<400> 52
Phe Ile Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly
1 5
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28Q
<400> 53
Ile Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly Arg
1 5
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28Q
<400> 54
Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly Arg Lys
1 5
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28Q
<400> 55
Phe Trp Val Gln Arg Gly Arg Lys Lys
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28Q
<400> 56
Trp Val Gln Arg Gly Arg Lys Lys Leu
1 5
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31S
<400> 57
Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Ser
1 5
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31S
<400> 58
Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Ser Lys
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31S
<400> 59
Phe Trp Val Lys Arg Gly Ser Lys Lys
1 5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31S
<400> 60
Trp Val Lys Arg Gly Ser Lys Lys Leu
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31L
<400> 61
Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Leu
1 5
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31L
<400> 62
Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Leu Lys
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31L
<400> 63
Phe Trp Val Lys Arg Gly Leu Lys Lys
1 5
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31L
<400> 64
Trp Val Lys Arg Gly Leu Lys Lys Leu
1 5
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31H
<400> 65
Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly His
1 5
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31H
<400> 66
Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly His Lys
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31H
<400> 67
Phe Trp Val Lys Arg Gly His Lys Lys
1 5
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31H
<400> 68
Trp Val Lys Arg Gly His Lys Lys Leu
1 5
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31A
<400> 69
Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Ala
1 5
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31A
<400> 70
Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Ala Lys
1 5
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31A
<400> 71
Phe Trp Val Lys Arg Gly Ala Lys Lys
1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31A
<400> 72
Trp Val Lys Arg Gly Ala Lys Lys Leu
1 5
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31N
<400> 73
Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Asn
1 5
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31N
<400> 74
Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Asn Lys
1 5
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31N
<400> 75
Phe Trp Val Lys Arg Gly Asn Lys Lys
1 5
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31N
<400> 76
Trp Val Lys Arg Gly Asn Lys Lys Leu
1 5
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28Q/R31S
<400> 77
Ile Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly Ser
1 5
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28Q/R31S
<400> 78
Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly Ser Lys
1 5
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28Q/R31S
<400> 79
Phe Trp Val Gln Arg Gly Ser Lys Lys
1 5
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28Q/R31S
<400> 80
Trp Val Gln Arg Gly Ser Lys Lys Leu
1 5
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28Q/R31A
<400> 81
Ile Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly Ala
1 5
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28Q/R31A
<400> 82
Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly Ala Lys
1 5
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28Q/R31A
<400> 83
Phe Trp Val Gln Arg Gly Ala Lys Lys
1 5
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28Q/R31A
<400> 84
Trp Val Gln Arg Gly Ala Lys Lys Leu
1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28Q/R31N
<400> 85
Ile Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly Asn
1 5
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28Q/R31N
<400> 86
Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly Asn Lys
1 5
<210> 87
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28Q/R31N
<400> 87
Phe Trp Val Gln Arg Gly Asn Lys Lys
1 5
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28Q/R31N
<400> 88
Trp Val Gln Arg Gly Asn Lys Lys Leu
1 5
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽L34S
<400> 89
Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Ser
1 5
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽L34A
<400> 90
Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Ala
1 5
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28Q/L34S
<400> 91
Trp Val Gln Arg Gly Asn Lys Lys Ser
1 5
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28Q/L34A
<400> 92
Trp Val Gln Arg Gly Asn Lys Lys Ala
1 5
<210> 93
<211> 255
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 4-1BB
<400> 93
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 94
<211> 255
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CD28
<400> 94
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 95
<211> 164
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CD3 ζ链
<400> 95
Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
1 5 10 15
Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
100 105 110
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
115 120 125
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
130 135 140
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
145 150 155 160
Leu Pro Pro Arg
<210> 96
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 96
Phe Ile Ile Phe Trp Val Asn Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys
1 5 10
<210> 97
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 97
Ile Phe Trp Val Asn Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
1 5 10
<210> 98
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 98
Phe Ile Ile Phe Trp Val Asn Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys
1 5 10
<210> 99
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 99
Ile Phe Trp Val Asn Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
1 5 10
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28R
<400> 100
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg
1 5
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28R
<400> 101
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Arg
1 5
<210> 102
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽K28A
<400> 102
Phe Ile Ile Phe Trp Val Ala Arg Gly
1 5
<210> 103
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CD28跨膜结构域
<400> 103
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 104
<211> 66
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CD28
<400> 104
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 105
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CD3 ζ
<400> 105
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 106
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 间隔子(IgG4铰链)
<400> 106
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 107
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 铰链-CH3间隔子
<400> 107
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 108
<211> 229
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 铰链-CH2-CH3间隔子
<400> 108
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 109
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> IgD-铰链-Fc
<400> 109
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 110
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> T2A
<400> 110
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 111
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> tEGFR
<400> 111
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 112
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CD28胞质结构域
<400> 112
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 113
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CD28胞质结构域
<400> 113
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 114
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 K28A
<400> 114
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Ala Arg Gly Arg Lys
20 25 30
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
35 40 45
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
50 55 60
Gly Gly Cys Glu Leu
65
<210> 115
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 K28H
<400> 115
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val His Arg Gly Arg Lys
20 25 30
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
35 40 45
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
50 55 60
Gly Gly Cys Glu Leu
65
<210> 116
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 K28L
<400> 116
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Leu Arg Gly Arg Lys
20 25 30
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
35 40 45
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
50 55 60
Gly Gly Cys Glu Leu
65
<210> 117
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 K28Q
<400> 117
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly Arg Lys
20 25 30
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
35 40 45
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
50 55 60
Gly Gly Cys Glu Leu
65
<210> 118
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 K28S
<400> 118
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Ser Arg Gly Arg Lys
20 25 30
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
35 40 45
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
50 55 60
Gly Gly Cys Glu Leu
65
<210> 119
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 R31A
<400> 119
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Ala Lys
20 25 30
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
35 40 45
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
50 55 60
Gly Gly Cys Glu Leu
65
<210> 120
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 R31H
<400> 120
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly His Lys
20 25 30
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
35 40 45
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
50 55 60
Gly Gly Cys Glu Leu
65
<210> 121
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 R31L
<400> 121
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Leu Lys
20 25 30
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
35 40 45
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
50 55 60
Gly Gly Cys Glu Leu
65
<210> 122
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 R31N
<400> 122
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Asn Lys
20 25 30
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
35 40 45
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
50 55 60
Gly Gly Cys Glu Leu
65
<210> 123
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 L34A
<400> 123
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys
20 25 30
Lys Ala Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
35 40 45
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
50 55 60
Gly Gly Cys Glu Leu
65
<210> 124
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 L34S
<400> 124
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys
20 25 30
Lys Ser Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
35 40 45
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
50 55 60
Gly Gly Cys Glu Leu
65
<210> 125
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 K28Q/R31A
<400> 125
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly Ala Lys
20 25 30
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
35 40 45
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
50 55 60
Gly Gly Cys Glu Leu
65
<210> 126
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 K28Q/R31N
<400> 126
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly Asn Lys
20 25 30
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
35 40 45
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
50 55 60
Gly Gly Cys Glu Leu
65
<210> 127
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 K28Q/R31S
<400> 127
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly Ser Lys
20 25 30
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
35 40 45
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
50 55 60
Gly Gly Cys Glu Leu
65
<210> 128
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 K28Q/L34A
<400> 128
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly Arg Lys
20 25 30
Lys Ala Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
35 40 45
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
50 55 60
Gly Gly Cys Glu Leu
65
<210> 129
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 K28Q/L34S
<400> 129
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly Arg Lys
20 25 30
Lys Ser Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
35 40 45
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
50 55 60
Gly Gly Cys Glu Leu
65
<210> 130
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 R31N/L34A
<400> 130
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Asn Lys
20 25 30
Lys Ala Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
35 40 45
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
50 55 60
Gly Gly Cys Glu Leu
65
<210> 131
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 R31N/L34S
<400> 131
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Asn Lys
20 25 30
Lys Ser Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
35 40 45
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
50 55 60
Gly Gly Cys Glu Leu
65
<210> 132
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 K28Q/R31N/L34A
<400> 132
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly Asn Lys
20 25 30
Lys Ala Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
35 40 45
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
50 55 60
Gly Gly Cys Glu Leu
65
<210> 133
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 K28Q/R31N/L34S
<400> 133
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly Asn Lys
20 25 30
Lys Ser Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
35 40 45
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
50 55 60
Gly Gly Cys Glu Leu
65
<210> 134
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> NN插入
<400> 134
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Asn Asn Lys Arg Gly
20 25 30
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
35 40 45
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
50 55 60
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
65 70
<210> 135
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 135
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg
20 25 30
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
35 40 45
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
50 55 60
Glu Gly Gly Cys Glu Leu
65 70
<210> 136
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 136
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
65 70 75 80
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
85 90 95
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
100 105
<210> 137
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 接合区域
<400> 137
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly
1 5 10 15
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
20 25
<210> 138
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 接合区域 K14A
<400> 138
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Ala Arg Gly
1 5 10 15
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
20 25
<210> 139
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 接合区域 K14H
<400> 139
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val His Arg Gly
1 5 10 15
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
20 25
<210> 140
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 接合区域 K14L
<400> 140
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Leu Arg Gly
1 5 10 15
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
20 25
<210> 141
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 接合区域 K14Q
<400> 141
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly
1 5 10 15
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
20 25
<210> 142
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 接合区域 K14S
<400> 142
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Ser Arg Gly
1 5 10 15
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
20 25
<210> 143
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 接合区域 R17A
<400> 143
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly
1 5 10 15
Ala Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
20 25
<210> 144
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 接合区域 R17H
<400> 144
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly
1 5 10 15
His Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
20 25
<210> 145
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 接合区域 R17L
<400> 145
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly
1 5 10 15
Leu Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
20 25
<210> 146
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 接合区域 R17N
<400> 146
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly
1 5 10 15
Asn Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
20 25
<210> 147
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 接合区域 L20A
<400> 147
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly
1 5 10 15
Arg Lys Lys Ala Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
20 25
<210> 148
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 接合区域 L20S
<400> 148
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly
1 5 10 15
Arg Lys Lys Ser Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
20 25
<210> 149
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 接合区域 K14Q/R17A
<400> 149
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly
1 5 10 15
Ala Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
20 25
<210> 150
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 接合区域 K14Q/R17N
<400> 150
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly
1 5 10 15
Asn Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
20 25
<210> 151
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 接合区域 K14Q/R17S
<400> 151
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly
1 5 10 15
Ser Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
20 25
<210> 152
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 接合区域 K14Q/L20A
<400> 152
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly
1 5 10 15
Arg Lys Lys Ala Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
20 25
<210> 153
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 接合区域 K14Q/L20S
<400> 153
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly
1 5 10 15
Arg Lys Lys Ser Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
20 25
<210> 154
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 接合区域 R17N/L20A
<400> 154
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly
1 5 10 15
Asn Lys Lys Ala Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
20 25
<210> 155
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 接合区域 R17N/L20S
<400> 155
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly
1 5 10 15
Asn Lys Lys Ser Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
20 25
<210> 156
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 接合区域 K14Q/R17N/L20A
<400> 156
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly
1 5 10 15
Asn Lys Lys Ala Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
20 25
<210> 157
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 接合区域 K14Q/R17N/L20S
<400> 157
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Gln Arg Gly
1 5 10 15
Asn Lys Lys Ser Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
20 25
<210> 158
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 间隔子(IgG4铰链)
<400> 158
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 159
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> CD3 ζ
<400> 159
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 160
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 160
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys
1 5 10 15
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
20 25 30
Pro Val Gln Thr
35
<210> 161
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 161
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
1 5 10 15
<210> 162
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 162
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly
1 5 10 15
<210> 163
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 163
Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys
1 5 10 15
<210> 164
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 164
Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 165
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 165
Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
1 5 10 15
<210> 166
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 166
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
1 5 10 15
<210> 167
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 167
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
1 5 10 15
<210> 168
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 168
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
1 5 10 15
<210> 169
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31H
<400> 169
Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly His Lys Lys
1 5 10 15
<210> 170
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31H
<400> 170
Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly His Lys Lys Leu Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 171
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31H
<400> 171
Phe Trp Val Lys Arg Gly His Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
1 5 10 15
<210> 172
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31H
<400> 172
Lys Arg Gly His Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
1 5 10 15
<210> 173
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31H
<400> 173
His Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
1 5 10 15
<210> 174
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31N
<400> 174
Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Asn Lys Lys
1 5 10 15
<210> 175
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31N
<400> 175
Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Asn Lys Lys Leu Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 176
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31N
<400> 176
Phe Trp Val Lys Arg Gly Asn Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
1 5 10 15
<210> 177
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31N
<400> 177
Lys Arg Gly Asn Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
1 5 10 15
<210> 178
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽R31N
<400> 178
Asn Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
1 5 10 15
<210> 179
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽L34A
<400> 179
Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Ala Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 180
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽L34A
<400> 180
Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Ala Leu Tyr Ile Phe Lys
1 5 10 15
<210> 181
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽L34A
<400> 181
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Ala Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
1 5 10 15
<210> 182
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽L34A
<400> 182
Arg Lys Lys Ala Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
1 5 10 15
<210> 183
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 R31S
<400> 183
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Ser Lys
20 25 30
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
35 40 45
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
50 55 60
Gly Gly Cys Glu Leu
65
<210> 184
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<223> 接合区域 R31S
<400> 184
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly
1 5 10 15
Ser Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
20 25

Claims (79)

1.一种变体嵌合受体，其包含与参考嵌合受体的接合区域相比具有一个或多个氨基酸序列修饰的经修饰的接合区域，其中：
所述参考嵌合受体包含：(a)包含CD28跨膜结构域的第一结构域，所述CD28跨膜结构域包括SEQ ID NO：2、103或104中所示的氨基酸序列；和(b)包含4-1BB信号传导结构域的第二结构域，所述4-1BB信号传导结构域包括SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，其中所述第一结构域和第二结构域在接合处以连续序列接合，其中参考嵌合受体的接合区域包含直接在所述接合的C-末端的多至15个连续氨基酸和直接在所述接合的N-末端的多至15个连续氨基酸；
且其中：
a)所述一个或多个氨基酸序列修饰是在结构域之间的接合处附近的氨基酸残基之间的两个天冬酰胺(N)的插入，其对应于氨基酸残基27和28，参考SEQ ID NO: 5所示的编号；
b)所述一个或多个氨基酸序列修饰是氨基酸替代，其对应于选自下组的替代：K28Q/R31A、K28Q/R31N、K28Q/R31S、K28Q/L34A、K28Q/L34S、R31N/L34A、R31N/L34S、K28Q/R31N/L34A、K28Q/R31N/L34S，参考SEQ ID NO: 5所示编号；或
c)其中所述变体嵌合受体包含选自SEQ ID NO: 114-134和138-157中任一项所示氨基酸序列的经修饰的接合区域。
2.如权利要求1所述的变体嵌合受体，其在给予人对象后表现出比参考嵌合受体低的免疫原性。
3.如权利要求1所述的变体嵌合受体，其中，具有经修饰的接合区域的8-15个氨基酸部分的序列的肽片段对人白细胞抗原(HLA)分子的结合亲和性低于具有参考嵌合受体的接合区域的对应部分的序列的肽片段对相同HLA分子的结合亲和性。
4.如权利要求3所述的变体嵌合受体，其中参考嵌合受体的接合区域的对应部分的肽片段具有小于1000nM的结合亲和性。
5.如权利要求3所述的变体嵌合受体，其中参考嵌合受体的接合区域的对应部分的肽片段具有小于500nM的结合亲和性。
6.如权利要求3所述的变体嵌合受体，其中参考嵌合受体的接合区域的对应部分的肽片段具有小于50nM的结合亲和性。
7.如权利要求3所述的变体嵌合受体，其中所述结合亲和性或平均结合亲和性低超过2倍。
8.如权利要求3所述的变体嵌合受体，其中所述结合亲和性或平均结合亲和性低超过5倍。
9.如权利要求3所述的变体嵌合受体，其中所述结合亲和性或平均结合亲和性低超过10倍。
10.如权利要求3所述的变体嵌合受体，其中所述结合亲和性或平均结合亲和性低超过25倍。
11.如权利要求3所述的变体嵌合受体，其中所述结合亲和性或平均结合亲和性低超过50倍。
12.如权利要求3所述的变体嵌合受体，其中所述结合亲和性或平均结合亲和性低超过100倍。
13.如权利要求3所述的变体嵌合受体，其中：
对HLA具有小于500 nM的结合亲和性的经修饰的接合区域内的肽片段的数量减少。
14.如权利要求3所述的变体嵌合受体，其中：
对HLA具有小于50 nM的结合亲和性的经修饰的接合区域内的肽片段的数量减少。
15.如权利要求3所述的变体嵌合受体，其中结合亲和性是IC50，并且经修饰的接合区域的肽片段与参考嵌合受体的接合区域的肽片段的结合的比较参考相同的标准肽有所降低。
16.如权利要求1所述的变体嵌合受体，其中：
参考嵌合受体从其N至C末端依次包括：胞外配体结合结构域，第一结构域，第二结构域，和活化性胞质信号传导结构域；和/或
变体嵌合受体从其N到C末端依次包括：胞外配体结合结构域，包含经修饰的接合区域的胞内共刺激结构域和跨膜结构域，和活化性胞质信号传导结构域。
17.如权利要求1-16中任一项所述的变体嵌合受体，其中所述参考嵌合受体中的第一结构域和第二结构域一起包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。
18.如权利要求1-16中任一项所述的变体嵌合受体，其中所述变体嵌合受体包含在对应于49-52的位置处的氨基酸TTQE和/或在对应于残基60-63的位置处的氨基酸PEEE，各自参考SEQ ID NO：5所述的编号。
19.如权利要求3-15中任一项所述的变体嵌合受体，其中HLA是I类HLA和/或II类HLA。
20.如权利要求19所述的变体嵌合受体，其中I类HLA等位基因选自HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*11:01 和 HLA-B*08:01。
21.如权利要求1-16中任一项所述的变体嵌合受体，其中HLA包括多个HLA分子，并且对多个HLA分子中的一个或多个的平均结合亲和性较低和/或与多个HLA分子中的一个或多个单独结合的肽片段的数量减少。
22.如权利要求21所述的变体嵌合受体，其中所述多个HLA分子选自：
多个I类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于50％的I类HLA分子；
多个II类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于50％的II类HLA分子；或
多个I类HLA分子和II类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于50％的I类HLA分子和II类HLA分子。
23.如权利要求21所述的变体嵌合受体，其中所述多个HLA分子选自：
多个I类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于60％的I类HLA分子；
多个II类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于60％的II类HLA分子；或
多个I类HLA分子和II类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于60％的I类HLA分子和II类HLA分子。
24.如权利要求21所述的变体嵌合受体，其中所述多个HLA分子选自：
多个I类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于70％的I类HLA分子；
多个II类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于70％的II类HLA分子；或
多个I类HLA分子和II类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于70％的I类HLA分子和II类HLA分子。
25.如权利要求21所述的变体嵌合受体，其中所述多个HLA分子选自：
多个I类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于80％的I类HLA分子；
多个II类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于80％的II类HLA分子；或
多个I类HLA分子和II类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于80％的I类HLA分子和II类HLA分子。
26.如权利要求21所述的变体嵌合受体，其中所述多个HLA分子选自：
多个I类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于90％的I类HLA分子；
多个II类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于90％的II类HLA分子；或
多个I类HLA分子和II类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于90％的I类HLA分子和II类HLA分子。
27.如权利要求21所述的变体嵌合受体，其中所述多个HLA分子选自：
多个I类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于95％的I类HLA分子；
多个II类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于95％的II类HLA分子；或
多个I类HLA分子和II类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于95％的I类HLA分子和II类HLA分子。
28.如权利要求21所述的变体嵌合受体，其中所述多个HLA分子选自：
多个I类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于98％的I类HLA分子；
多个II类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于98％的II类HLA分子；或
多个I类HLA分子和II类HLA分子，其代表全世界人群或高加索人群中大于98％的I类HLA分子和II类HLA分子。
29.如权利要求3-15中任一项所述的变体嵌合受体，其中结合亲和性是体外测定的。
30.如权利要求2的变体嵌合受体，其中降低的免疫原性包括降低的CD4+ T细胞免疫应答和/或降低的CD8+ T细胞免疫应答。
31.如权利要求1-16中任一项所述的变体嵌合受体，其中：
参考嵌合受体还包括胞外配体结合结构域。
32.如权利要求1-15中任一项所述的变体嵌合受体，其中，变体嵌合受体还包括胞外配体结合结构域。
33.如权利要求32所述的变体嵌合受体，其中所述配体结合结构域是抗原结合结构域。
34.如权利要求16所述的变体嵌合受体，其中所述配体结合结构域是抗原结合结构域。
35.如权利要求33所述的变体嵌合受体，其中所述抗原结合结构域是抗体或抗体片段。
36.如权利要求34所述的变体嵌合受体，其中所述抗原结合结构域是抗体或抗体片段。
37.如权利要求35所述的变体嵌合受体，其中所述抗体片段为单链片段和/或包含由接头连接的抗体可变区。
38.如权利要求36所述的变体嵌合受体，其中所述抗体片段包含单链片段和/或包含由接头连接的抗体可变区。
39.如权利要求37所述的变体嵌合受体，其中所述抗体片段包含scFv。
40.如权利要求38所述的变体嵌合受体，其中所述抗体片段包含scFv。
41.如权利要求16所述的变体嵌合受体，其中所述配体结合结构域特异性结合与疾病或病症相关的抗原。
42.如权利要求41所述的变体嵌合受体，其中：
所述疾病或病症是感染性疾病或病症，自身免疫性疾病，或肿瘤。
43.如权利要求41所述的变体嵌合受体，其中：
所述疾病或病症是炎性疾病或癌症。
44.如权利要求41所述的变体嵌合受体，其中：配体结合结构域特异性结合至肿瘤抗原。
45.如权利要求41所述的变体嵌合受体，其中：配体结合结构域特异性结合选自下述的抗原：ROR1，Her2，L1-CAM，CD19，CD20，CD22，间皮素，CEA，乙型肝炎表面抗原，抗叶酸受体，CD23，CD24，CD30，CD33，CD38，CD44，EGFR，EGP-2，EGP-4，EPHa2，ErbB2，ErbB3，ErbB4，FBP，胎儿乙酰胆碱e受体，GD2，GD3，HMW-MAA，IL-22R-α，IL-13R-α2，kdr，κ轻链，Lewis Y，L1-细胞粘附分子，MAGE-A1，MUC1，MUC16，PSCA，NKG2D配体，NY-ESO-1，MART-1，gp100，癌胚抗原，TAG72，VEGF-R2，癌胚抗原（CEA），前列腺特异性抗原，PSMA，雌激素受体，孕酮受体，肝配蛋白B2，CD123，CS-1，c-Met，GD-2，MAGE A3，CE7，肾母细胞瘤1（WT-1）和细胞周期蛋白A1（CCNA1）。
46.如权利要求32所述的变体嵌合受体，其中所述配体结合结构域特异性结合与疾病或病症相关的抗原。
47.如权利要求46所述的变体嵌合受体，其中：
所述疾病或病症是感染性疾病或病症，自身免疫性疾病或肿瘤。
48.如权利要求46所述的变体嵌合受体，其中：
所述疾病或病症是炎性疾病或癌症。
49.如权利要求46所述的变体嵌合受体，其中：配体结合结构域特异性结合至肿瘤抗原。
50.如权利要求46所述的变体嵌合受体，其中：配体结合结构域特异性结合选自下述的抗原：ROR1，Her2，L1-CAM，CD19，CD20，CD22，间皮素，CEA，乙型肝炎表面抗原，抗叶酸受体，CD23，CD24，CD30，CD33，CD38，CD44，EGFR，EGP-2，EGP-4，EPHa2，ErbB2，ErbB3，ErbB4，FBP，胎儿乙酰胆碱e受体，GD2，GD3，HMW-MAA，IL-22R-α，IL-13R-α2，kdr，κ轻链，Lewis Y，L1-细胞粘附分子，MAGE-A1，MUC1，MUC16，PSCA，NKG2D配体，NY-ESO-1，MART-1，gp100，癌胚抗原，TAG72，VEGF-R2，癌胚抗原（CEA），前列腺特异性抗原，PSMA，雌激素受体，孕酮受体，肝配蛋白B2，CD123，CS-1，c-Met，GD-2，MAGE A3，CE7，肾母细胞瘤1（WT-1）和细胞周期蛋白A1（CCNA1）。
51.如权利要求1-15中任一项所述的变体嵌合受体，其中：
所述参考嵌合受体还包括活化性胞质信号传导结构域;和/或
所述变体嵌合受体还包含活化性胞质信号传导结构域。
52.如权利要求51所述的变体嵌合受体，其中所述活化性胞质结构域包含T细胞受体（TCR）组分和/或包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序（ITAM）。
53.如权利要求16所述的变体嵌合受体，其中所述活化性胞质结构域包含T细胞受体（TCR）组分和/或包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序（ITAM）。
54.如权利要求52所述的变体嵌合受体，其中所述活化性胞质信号传导结构域是或包含CD3-ζ (CD3ζ)链的胞质信号传导结构域或其功能变体或信号传导部分。
55.如权利要求53所述的变体嵌合受体，其中所述活化性胞质信号传导结构域是或包含CD3-ζ链的胞质信号传导结构域或其功能变体或信号传导部分。
56.一种编码权利要求1-55中任一项所述的变体嵌合受体的核酸分子。
57.一种包含权利要求56所述核酸分子的载体。
58.如权利要求57所述的载体，其是病毒载体。
59.如权利要求57或58所述的载体，其为逆转录病毒载体。
60.如权利要求59所述的载体，所述逆转录病毒为慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
61.一种工程改造的细胞，其包含权利要求56所述的核酸或权利要求57-60中任一项所述的载体或其表达权利要求1-55中任一项所述的嵌合受体。
62.如权利要求61所述的工程改造的细胞，其是T细胞。
63.如权利要求62所述的工程改造的细胞，其是CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞。
64.一种包含权利要求61-63中任一项所述的工程改造的细胞和任选药学上可接受的缓冲剂的组合物。
65.权利要求61-63中任一项所述的细胞或权利要求64所述的组合物在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途。
66.如权利要求65所述的用途，其中所述嵌合受体特异性结合至与所述疾病或病症相关的配体或抗原。
67.如权利要求65所述的用途，其中，所述疾病或病症是癌症、自身免疫性疾病或病症，或感染性疾病。
68.如权利要求65所述的用途，其中，所述疾病或病症是肿瘤。
69.如权利要求65所述的用途，其中所述基因工程改造的T细胞在所述对象中表现出比在给予相同或约相同剂量的表达参考嵌合受体的参考细胞组合物的对象中增加或更长的扩增和/或持久性。
70.如权利要求69所述的用途，其中所述增加是至少1.2倍。
71.如权利要求69所述的用途，其中所述增加是至少1.5倍。
72.如权利要求69所述的用途，其中所述增加是至少2倍。
73.如权利要求69所述的用途，其中所述增加是至少3倍。
74.如权利要求69所述的用途，其中所述增加是至少4倍。
75.如权利要求69所述的用途，其中所述增加是至少5倍。
76.如权利要求69所述的用途，其中在给予所述细胞的一个月内观察到或存在所述增加。
77.如权利要求69所述的用途，其中在给予所述细胞的两个月内观察到或存在所述增加。
78.如权利要求69所述的用途，其中在给予所述细胞的六个月内观察到或存在所述增加。
79.如权利要求69所述的用途，其中在给予所述细胞的一年内观察到或存在所述增加。
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