ES2660180T3 - Sistemas y métodos para procesamiento de células - Google Patents

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ES2660180T3
ES2660180T3 ES08857318.3T ES08857318T ES2660180T3 ES 2660180 T3 ES2660180 T3 ES 2660180T3 ES 08857318 T ES08857318 T ES 08857318T ES 2660180 T3 ES2660180 T3 ES 2660180T3
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separation
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cell
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Stefan Miltenyi
Winfried Schimmelpfennig
Holger Lantow
Elmar Niklas NEUSCHÄFER
Martin Biehl
Eiad Kabaha
Jürgen Schulz
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Miltenyi Biotec GmbH
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Abstract

Un sistema (100), que comprende: a) una unidad de procesamiento de muestra (104, 332), que comprende un contenedor giratorio (500) que tiene al menos una cámara de muestra (128) para contener y procesar una muestra, en donde el contenedor giratorio (500) comprende un medio para detectar el progreso de la separación (188; 237; 810) de al menos un primer componente y un segundo componente de una muestra depositada en el contenedor giratorio (500), y un puerto de entrada y un puerto de salida acoplado al contenedor giratorio (500), en donde la unidad de procesamiento de muestras (104, 332) se configura - para girar el contenedor (500) para aplicar una fuerza centrífuga a la muestra depositada en la cámara (128) y separar al menos el primer componente y el segundo componente de la muestra depositada; y b) una unidad magnética de separación de muestra (106) acoplada al puerto de salida de la unidad de procesamiento de muestras (104, 332), la unidad de separación de muestras (106) comprende - un soporte de la columna de separación (42), - una bomba (64), y - una pluralidad de válvulas (1-11; 12, 14, 15, 16; 17; 18; 19; 110; 310, 311; 424, 425; 427, 428, 429) configurada para controlar al menos parcialmente el flujo de fluido a través de un circuito de fluido, y - una columna de separación (2; 40; 322) colocada en el soporte (42), en donde la columna de separación (2; 40; 322) se configura para separar los componentes de muestra marcados y no marcados magnéticamente que fluyen a través de la columna (2; 40; 322).

Description

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DESCRIPCIÓN
Sistemas y métodos para procesamiento de células Antecedentes de la invención
Una variedad de enfermedades humanas no puede tratarse actualmente de manera satisfactoria con los productos farmacéuticos estándar, lo que propone el uso de células humanas primarias como una alternativa u opción adicional para el tratamiento de diversas enfermedades. Esos procedimientos de terapia celular requieren usualmente una manipulación significativa y el procesamiento de los productos celulares para separar las funciones deseadas de las no deseadas, por ejemplo, la reducción de células en una reacción del hospedero no deseada y potencialmente peligrosa para la vida en el rechazo al trasplante, o el enriquecimiento de las células implicadas en los efectos deseados del trasplante contra la leucemia/tumor.
Los métodos conocidos en la técnica requieren de una infraestructura masiva en los hospitales para cumplir con los requerimientos regulatorios y de seguridad, lo que incluye los procedimientos de buenas prácticas de manufactura compatibles con habitaciones limpias y el personal para el mantenimiento de las habitaciones, instrumentos, producción, control de calidad, y procedimientos para el aseguramiento de la calidad. Usualmente, los productos celulares se procesan mediante el uso de una combinación de diversos dispositivos y material desechable con la transferencia manual de muestras entre esos sistemas.
La presente invención integra varias etapas de procesamiento de células en un dispositivo único y desechable, controlado en un proceso totalmente automatizado, que elimina los requerimientos de la transferencia manual de las células, los controles durante el proceso, los riesgos relacionados a los productos celulares, y medidas de reducción de riesgo, y por tanto, proporciona un dispositivo y método para la obtención de productos de terapia celular que están listos para el uso directo. Los productos celulares que se obtienen mediante el uso del sistema de la presente invención típicamente estarán listos para transferirse directamente al paciente.
La presente invención se relaciona generalmente con el procesamiento de materiales biológicos. Más específicamente, la presente invención proporciona sistemas, dispositivos, y métodos para el procesamiento de materiales biológicos para cultivar y/o separar los componentes de una muestra biológica, y para separar después los componentes de la muestra mediante técnicas de separación, que incluyen la aplicación de la separación magnética.
Varias técnicas se conocen para separar componentes de una muestra o material biológico, que hacen uso de técnicas de separación. Tales técnicas incluyen, pero no se limitan a la separación por cribado, separación magnética, centrifugación, filtración, separación por inmunoafinidad, separación por gravitación, separación por gradiente de densidad, y elutriación.
Los métodos de inmunoafinidad pueden incluir el marcado selectivo de ciertos componentes de una muestra (por ejemplo, marcado con anticuerpos) y la separación de los compuestos marcados y no marcados. Los métodos de separación magnética incluyen, típicamente, pasar una muestra a través de una columna de separación.
La separación magnética es un procedimiento para retener selectivamente los materiales magnéticos en una cámara o columna dispuesta en un campo magnético. Una sustancia objetivo, que incluye materiales biológicos, puede marcarse magnéticamente mediante la unión a una partícula magnética por medio de un par de unión específico, que se conjuga a la partícula. Después se aplica a la cámara una suspensión de la sustancia objetivo marcada. La sustancia objetivo es retenida en la cámara en presencia de un campo magnético. Después, la sustancia objetivo retenida puede ser eluida cambiando la fuerza, o eliminando el campo magnético.
Una matriz de material de susceptibilidad magnética adecuada puede colocarse en la cámara, de manera que cuando se aplica un campo magnético a la cámara se induce localmente un alto gradiente de campo magnético cerca de la superficie de la matriz. Esto permite la retención de las partículas magnetizadas débilmente y el procedimiento es referido como separación magnética de alto gradiente (HGMS).
El uso de HGMS en las separaciones biológicas requiere que las condiciones proporcionen un rendimiento alto con una pureza sustancial. En consecuencia, sería conveniente proporcionar separadores magnéticos de alto gradiente, dispositivos y métodos que sean relativamente fáciles de construir y usar, y que proporcionen gradientes de campo magnético máximos y uniformes y características de flujo durante su uso. Sería más ventajoso si tales separadores magnéticos, dispositivos y métodos pudieran usarse para realizar una variedad de clasificaciones celulares o procedimientos de ensayo con la selección del miembro de unión específico adecuado, para el que se marcará magnéticamente la sustancia objetivo.
En muchos ejemplos, las metodologías de separación deben llevarse a cabo en condiciones que aseguren la no contaminación de la muestra o que se mantenga la esterilidad. Por ejemplo, en muchas clínicas comunes los sistemas de separación de células necesitan operarse en habitaciones limpias de alta calidad para mantener la esterilidad de las muestras. Con frecuencia, asegurar la no contaminación es difícil, costoso y requiere instalaciones separadas y
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personal, así como también procedimientos complejos que requieren esfuerzos inmensos para mantener la reproducibilidad y la esterilidad. Adicionalmente, deben realizarse numerosos procesos y etapas de manipulación (por ejemplo, lavado, disminución del volumen, etc.) separados de los sistemas de separación con la introducción posterior en los sistemas de muestras procesadas, así como también la unión de fluidos y reactivos, complicando aún más el cumplimiento de la esterilidad. Como tal, se necesitan métodos y sistemas mejorados para asegurar la no contaminación de las muestras y/o disminuir la complejidad y los costos del procesamiento de muestra.
Los separadores magnéticos, dispositivos y métodos para procedimientos de separación magnética se describen en la patente de Estados Unidos US 5,691,208 A. Los dispositivos de separación contienen matrices, que proporcionan poros o canales uniformes que reducen el atrapamiento de aire o sustancias no objetivo, y disminuyen la pérdida de sustancias objetivo debido a la disrupción mecánica. Células objetivo, de varios sistemas y órganos, u otras sustancias biológicas objetivo están etiquetados junto con un miembro de unión específico adecuado y aislado usando los dispositivos y métodos de la presente invención. En su forma más simple, el sistema de separación celular de la presente invención tiene dos componentes principales: un separador magnético y un reactivo de separación celular. Un dispositivo de separación más complejo incluye pasajes de fluido, contenedores de recogida y almacenamiento y la columna de separación. El circuito de fluido puede construirse con válvulas integradas, o las válvulas pueden aplicarse externamente a las vías de fluido.
En el documento WO 90/04019 se describe un sistema para la separación selectiva de una población celular específica a partir de una mezcla celular heterogénea. Se proporcionan medios para obtener un concentrado de células selectivo de la mezcla de células heterogéneas mediante la separación del concentrado celular selectivo en base a las propiedades físicas o biológicas del concentrado. Esto se puede hacer por centrifugación, si se desea. Se proporciona un contenedor que tiene medios de partículas, los medios de partículas se unen a una sustancia que está activa para unirse a una célula deseada específica. Uno pone el concentrado de células en contacto con los medios de partículas dentro del contenedor, por ejemplo, proporcionando una conexión estéril entre el sitio donde se forma el concentrado de células y el contenedor. Esto permite la incubación del concentrado de células con los medios de partículas, para de este modo unir selectivamente una población celular específica desde el concentrado celular al medio de partículas, creando un conjugado de partículas/células. Después, se proporcionan medios magnéticos para separar el conjugado de partícula/célula del resto del concentrado de células. Se puede usar un sistema de dos imanes para formar la separación.
El documento US2002/144939 A1 describe una centrífuga para sangre accionada por correa con un motor de accionamiento montado lateralmente para hacer girar la centrífuga a una velocidad de rotación seleccionada para separar los componentes sanguíneos. La centrífuga incluye un conjunto de eje de accionamiento girado a una velocidad de rotación de entrada y un conjunto de rotor unido de manera giratoria al conjunto de árbol de accionamiento girado a una velocidad de rotación de salida dos veces la velocidad de rotación de entrada. Un motor de accionamiento está provisto de una polea de accionamiento para accionar una correa, una cadena y similares para proporcionar la fuerza motriz para hacer girar el árbol de accionamiento a la velocidad de rotación de entrada. En una modalidad, se provee una correa para contactar tanto la polea del motor de accionamiento como una superficie exterior de una carcasa giratoria del conjunto de eje de accionamiento. Se incluye una base en la centrífuga sobre la cual se monta el conjunto del eje de transmisión. El motor de accionamiento está posicionado adyacente al conjunto del eje de transmisión y montado sobre la base.
Breve resumen de la invención
La presente invención proporciona un sistema que comprende un procesamiento de muestra y una unidad de separación de muestra magnética. La invención se describe en las reivindicaciones adjuntas 1, 11 y 14. Un ejemplo proporciona mejoras en sistemas de separación magnética de alto gradiente, programas informáticos y métodos para la separación de materiales biológicos. Los sistemas objeto, programas informáticos y métodos permiten una mayor especificidad y eficiencia en el aislamiento de células particulares, proteínas, polisacáridos y otros materiales biológicos u otros materiales que son magnéticos o capaces de una interacción de unión específica con un miembro de unión marcado magnéticamente.
Se proporciona una columna de separación magnética que tiene una carcasa no magnética que define una cámara de separación, y una matriz permeable a líquidos de, por ejemplo, esferas metálicas dentro de la cámara. Las esferas forman una red estrechamente apilada, que crea canales sustancialmente uniformes para el flujo homogéneo durante las separaciones. Un dispositivo separador magnético puede usar la columna de separación en conjunto con un dispositivo prefiltro. El dispositivo puede usarse en un instrumento que tiene un magneto permanente o electromagneto para usar durante las separaciones, con un brazo retráctil opcional para mover el magneto, bombear los medios para los lavados y separar el material objetivo, y un microprocesador para controlar el flujo del fluido de separación.
En una modalidad, el sistema comprende a) una unidad de procesamiento de muestra que comprende un puerto de entrada y un puerto de salida acoplado a un contenedor giratorio (o cámara de centrifugación) que tiene al menos una cámara de muestra, en donde la unidad de procesamiento de muestra se configura para proporcionar una primera etapa de procesamiento a una muestra o para rotar el contenedor de manera que se aplica una fuerza centrífuga a una muestra depositada en la cámara y se separa al menos un primer componente y un segundo componente de la muestra
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depositada; y b) una unidad de separación de muestra acoplada al puerto de salida de la unidad de procesamiento de muestra, la unidad de separación de muestra comprende un soporte de la columna de separación, una bomba, y una pluralidad de válvulas configuradas para, al menos parcialmente, controlar el flujo del fluido a través de un circuito de líquidos y una columna de separación ubicada en el soporte, en donde la columna de separación se configura para separar el al menos primer componente y el segundo componente marcados de los no marcados de la muestra que fluye a través de la columna.
De acuerdo con la invención, el contenedor giratorio comprende un medio para detectar el progreso de la separación del al menos primer componente y el segundo componente de la muestra depositada en el contenedor giratorio.
Los medios para detectar el progreso de la separación pueden ubicarse de manera que la luz de una fuente de luz pueda penetrar al menos parcialmente a través de al menos una parte de la muestra que se está separando, y la luz que pasa a través de al menos una parte de la muestra pueda detectarse mediante un detector de luz.
Preferentemente, los medios para detectar el progreso de la separación pueden ubicarse en el contenedor giratorio, esencialmente perpendicular a un eje de rotación del contenedor giratorio.
Se prefiere además que los medios para detectar el progreso de la separación se coloquen en el contenedor giratorio que llega esencialmente desde un área adyacente al eje de rotación del contenedor giratorio a un área adyacente al perímetro del contenedor giratorio.
Los medios para detectar el progreso de la separación en el contenedor giratorio pueden ser una ventana, un prisma, o un espejo. La ventana, prisma, o espejo pueden ubicarse para cubrir un canal formado en la tapa o en el fondo del contenedor giratorio, en donde el canal se configura de manera que al menos una parte de la muestra pueda fluir dentro del canal durante la centrifugación. Además, puede usarse una ventana sin un canal, es decir, la separación de la muestra se detecta después a través de una ventana en la tapa o en la parte inferior de la cámara giratoria.
Preferentemente, el contenedor giratorio se configura de manera que pueda emplearse para células en cultivo. En ese caso, el contenedor giratorio comprende preferentemente al menos una capa para que las células crezcan sobre la misma. La al menos una capa puede ubicarse perpendicular al eje de rotación. Se prefiere disponer de una pluralidad de capas para cultivar las células que crecen sobre las mismas en el contenedor giratorio.
El contenedor giratorio puede fabricarse en forma desechable. Se prefiere, además, que el contenedor giratorio se pueda esterilizar para permitir el procesamiento de las células sin contaminación.
En particular, el contenedor giratorio comprende o puede fabricarse de un material se seleccionado del grupo que consiste en: plásticos, poliestirol (PS), poliestereno, polivinilcloruro, policarbonato, vidrio, poliacrilato, poliacrilamida, polimetilmetacrilato (PMMA), tereftalato de polietileno (PET), politetrafluoretileno (PTFE), poliuretano termoplástico (TPU), silicona. La cámara puede fabricarse, además, de polietileno (PE), colágeno, quitina, alginato, derivados de ácido hialurónico, poliactido (PLA), poliglicolido (PGA) y sus copolímeros, poliestirol (PS), poliestireno, policarbonato, poliacrilato, cerámicas, materiales de vidrio, como hidroxilapatita (HA), y fosfato de calcio, y composiciones que comprenden uno o más de los materiales mencionados anteriormente.
Típicamente, los puertos de entrada y salida comprenden al menos un filtro estéril.
Además, se describe un método que comprende o contiene las siguientes etapas:
a) proporcionar un sistema de las reivindicaciones 1 a 10 como se describió anteriormente y en la presente descripción;
b) realizar una etapa de separación para menos un primer componente y un segundo componente de una muestra; y c) realizar una etapa de separación a un componente procesado de la muestra, la separación comprende separar los componentes marcados y no marcados a partir del componente procesado de la muestra. La etapa de procesamiento puede llevarse a cabo, además, después de la etapa de separación.
Debido a la presencia de la cámara giratoria en el sistema, como se describió anteriormente y en la presente descripción, se prefiere que el método comprenda detectar el progreso de la separación, particularmente mediante la detección de la formación de capas de la muestra, el cambio del valor del pH, y/o el cambio en la temperatura.
El método puede llevarse a cabo, preferentemente, cuando la muestra es una muestra biológica, particularmente, sangre o médula ósea.
Además, se describe un programa de ordenador, particularmente cuando se ejecuta sobre un ordenador, para controlar un sistema de las reivindicaciones 1 a 10 como se describió anteriormente y en la presente descripción, particularmente para realizar un método de las reivindicaciones 11 a 13 como se describió anteriormente y en la presente descripción. El programa de ordenador puede almacenarse en un medio de almacenamiento, tal como un disco flexible.
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La descripción se refiere, además, a un instrumento integrado para el procesamiento de células que comprende una carcasa, al menos una unidad de magneto para la cámara de separación magnética desechable, al menos un accionamiento para una centrífuga/cámara de cultivo desechable, varias válvulas de pinza dispuestas de manera que se pueden montar diferentes disposiciones de un conjunto de tubos desechables sobre el instrumento. Además, el instrumento puede comprender una interfaz de usuario con monitor y/u ordenador integrados para almacenar y realizar diferentes operaciones de procesamiento de células. Para este propósito, al menos un controlador de la bomba puede operarse usando el ordenador. Puede estar presente un sistema de detección óptica para una centrífuga para medir densidades ópticas en diferentes posiciones en la cámara. La cámara centrífuga puede ser desechable y ubicarse en un área de temperatura controlada. Se pueden presentar medios para ajustar la temperatura del fluido en movimiento hacia la cámara (calentador, enfriador). Una cámara de cultivo celular puede colocarse en el contenedor giratorio, preferentemente ubicado en la parte inferior, posiblemente con medios para ajustar el enfoque de la cámara.
La descripción se refiere, además, a un conjunto de tubos estériles desechables para el procesamiento estéril de las células para usar con el sistema de la invención. Típicamente, se proporciona una bolsa o puerto para el inicio de las células. La tubería y/o el sistema pueden configurarse para permitir la transferencia directa de las células del paciente a una bolsa para la muestra. Además, lo siguiente puede ser parte de la tubería y/o el sistema: un puerto de entrada diferente para el medio de cultivo celular tampón, al menos un puerto de entrada para los reactivos del marcado magnético, los puertos de entrada, típicamente, con filtros estériles, un puerto de salida para desechos, y/o un puerto de salida para las células. El puerto de salida puede conectarse directamente con la bolsa de células para congelar. Además, un puerto de salida puede conectarse directamente con un contenedor para transfusión y/o inyección.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un diagrama esquemático de una columna de separación o prefiltración.
La Figura 2 representa columnas de separación y prefiltración, junto con los contenedores de muestra y de recolección, interconectados por una serie de vías para líquidos o circuitos de líquidos. La figura muestra, además, la posición de las válvulas y una bomba peristáltica que se usa en la modalidad preferida del sistema de separación.
La Figura 3 representa una unidad controlada por ordenador en la que se añaden columnas estériles, tubería desechable, y contenedores para almacenamiento y recolección, como se ilustra en la Figura 2. En una modalidad preferida, la unidad controlada por ordenador contiene un magneto, válvulas y bomba peristáltica.
La Figura 4 representa el canal de flujo formado entre tres esferas conectadas.
Las Figuras 5 a 7 ilustran un sistema de acuerdo con un ejemplo.
La Figura 8 ilustra una cámara de un sistema de procesamiento, de acuerdo con un ejemplo.
La Figura 9 ilustra una cámara de un sistema de procesamiento, de acuerdo con un ejemplo.
La Figura 9A ilustra una cámara de un sistema de procesamiento, de acuerdo con un ejemplo.
La Figura 10 muestra una vista en sección transversal de una cámara de procesamiento, de acuerdo con un ejemplo.
La Figura 10A ilustra una vista en planta superior de una cámara de procesamiento, de acuerdo con un ejemplo.
La Figura 11 muestra una vista en sección transversal de una cámara de procesamiento, de acuerdo con un ejemplo.
La Figura 11A ilustra una vista enfocada de una porción de una cámara de procesamiento como se muestra en la figura 11.
La Figura 12 muestra una vista en sección transversal de una cámara de procesamiento, de acuerdo con aún otro ejemplo.
La Figura 12A muestra una vista sobre la parte inferior de la cámara de procesos con una abertura para el suministro de gas y una membrana hidrofóbica unida.
La Figura 12B muestra la parte inferior de la cámara con canales en espiral para la aireación a través de la membrana unida a la parte inferior de la cámara.
La Figura 13 ilustra un sistema de acuerdo con un ejemplo.
La Figura 14A a la 14N ilustran un ejemplo de método de procesamiento de la muestra de acuerdo con un ejemplo.
La Figura 15 ilustra un dispositivo de aireación que puede ser parte del sistema de acuerdo con un ejemplo.
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La Figura 16A muestra una cámara de mezclado de gases que puede ser parte del sistema de acuerdo con un ejemplo.
La Figura 16B muestra la parte inferior de la cámara de mezclado de gases que puede ser parte del sistema de acuerdo con un ejemplo.
La Figura 17 muestra una vista del interior de una tapa para la cámara giratoria con un canal o brecha en el cual la muestra fluye durante la centrifugación, con un medio para detectar el progreso de la separación de la muestra en forma de un prisma.
La Figura 18 muestra el curso de la luz a través de la muestra por medio de un prisma. El prisma (prisma doble) se configura de manera que la luz de una fuente de luz pueda penetrar, al menos parcialmente, a través de al menos una parte de la muestra que se separa a través de la centrifugación, y la luz que pasa a través de al menos una parte de la muestra puede detectarse mediante un detector de luz.
La Figura 19 muestra un prisma doble que es parte de una nervadura ubicada en la tapa de la cámara giratoria.
Las Figuras 20 a 29 muestran los resultados de experimentos realizados con un sistema de acuerdo con la presente invención, mediante el uso de un método de acuerdo con la presente invención.
La Figura 20 muestra médula ósea sin procesar (A, C) y células CD 133 seleccionadas (B, D).
La Figura 21 muestra productos de aféresis sin procesar (A, B) y productos enriquecidos en CD14 (C, D).
La Figura 22 muestra la recolección de aféresis sin procesar (izquierda) y enriquecido en PDC (derecha).
La Figura 23 muestra la selección de CD4 mediante el uso de la presente invención, la capa leucocitaria sin procesar (izquierda), células objetivo enriquecidas en CD4 (derecha).
La Figura 24 muestra la capa leucocitaria antes (izquierda) y después (derecha) de la reducción de CD8 mediante el uso de la presente invención.
La Figura 25 muestra el crecimiento de la línea celular K562 en la cámara de la centrífuga.
La Figura 26 muestra médula ósea sin procesar (izquierda) y células seleccionadas CD34 o CD133 después de la elución directa en 20 ml (derecha).
La Figura 27 muestra médula ósea sin procesar (izquierda) y células seleccionadas CD34 o CD133 después de la elución directa en un volumen pequeño de 6 ml (derecha).
La Figura 28 muestra médula ósea sin procesar (izquierda) y células seleccionadas CD34 o CD133 después de la reducción del volumen final por filtración (derecha).
La Figura 29 muestra médula ósea sin procesar (izquierda) y células seleccionadas CD34 o CD133 después de la elución directa en 20 ml (medio) y después de la reducción del volumen final por columna AutoMACS.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona sistemas de procesamiento de muestras que integra el sistema de separación y las técnicas de procesamiento de muestras. Un sistema puede incluir una unidad de procesamiento de muestra configurada para realizar ciertas etapas de procesamiento antes de los métodos de separación, tales como separación magnética, cultivo de células o manipulación de células. Como tal, la presente invención puede incluir un sistema de procesamiento de muestras y sistema de separación de muestra combinados. Los sistemas o unidades de procesamiento de muestras pueden proporcionar los procesamientos de la muestra tales como cultivo de células, lavado, preparación, incubación, marcado, y similares. Adicionalmente, las unidades/sistemas de procesamiento de muestras pueden incluir las técnicas basadas en la separación por centrifugación, donde se aplica una fuerza centrífuga a una muestra para separar al menos un primer componente y un segundo componente de una muestra.
Por tanto, un sistema de la presente invención típicamente incluirá ambos, una unidad de procesamiento de muestra y una unidad de separación de muestra. El sistema puede comprender o contener, además, una pluralidad de unidades de procesamiento de muestras y/o una pluralidad de unidades de separación de muestras. El sistema combinado de procesamiento/separación de la invención puede incluir un sistema cerrado que puede programarse para realizar automáticamente una variedad de etapas complejas de procesamiento de células, que incluyen la separación basada en la densidad, separación por inmunoafinidad, separación magnética que incluye las separaciones inmunomagnéticas, cultivo/estimulación/activación de células, lavado o etapas de formulación final. Para este propósito el sistema puede controlarse por un programa de ordenador que puede ejecutarse en un ordenador. Las etapas del procesamiento de
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células pueden incluir, además, el suministro a las células de ciertas sustancias, que incluyen citocinas, materiales genéticos como ADN, ARN, virus, factores de transcripción, antígenos u otras sustancias químicas.
La invención proporciona un sistema que minimiza los errores del usuario, mantiene la esterilidad, realiza etapas complejas de procesamiento de células que requieren poca o ninguna interacción manual, y minimiza la exposición del operario cuando se procesa un material infeccioso. Es posible el procesamiento en la cabecera de un enfermo o en un salón quirúrgico. El dispositivo puede operarse mientras está conectado a un paciente del cual se obtiene una muestra o al cual se le administra una muestra procesada o fracciones de esta. Por ejemplo, la médula ósea obtenida de un paciente puede procesarse directamente dentro de una bolsa de entrada del conjunto de tubos. Desde ahí, el ejemplo de la médula ósea puede procesarse, es decir, separarse en al menos dos componentes. Al menos uno de esos componentes puede administrarse al paciente, posiblemente después de procesar el componente en una forma adecuada.
Los procesos de separación basados en la densidad realizados con la unidad de procesamiento de muestra del sistema de la invención incluyen, sin limitación, lavado de células, generación de la capa leucocitaria, separación basada en la densidad mediante el uso de medios, por ejemplo, Ficoll™, Percoll™ (GE Healthcare), separación basada en la densidad del marcado (por ejemplo, Rosettesep (tecnologías de Células Madre), u otros procedimientos de densidad del marcado), separación por la velocidad de sedimentación, por ejemplo, la eliminación de trombocitos, elutriación, adhesión celular y similares. Las técnicas/etapas de procesamiento adicionales que pueden realizarse con una unidad de procesamiento de muestras del sistema de la invención incluyen el cultivo de células, incluyendo expansión, estimulación, diferenciación, nueva diferenciación, cargar antígenos, transfección, transducción, cultivos, de células adherentes o en suspensión, capas múltiples de varios tipos celulares o mixtos, cultivos estacionarios o con fuerzas de cizallamiento o mezclado. Los materiales de partida incluyen, pero no se limitan a sangre, leucaféresis, médula ósea, liposucción, leche, cualquier fluido corporal, células de tejidos, por ejemplo, células de diversos órganos, células tumorales, células únicas, grupos celulares, aglomeraciones celulares, tejido disecado mecánicamente o junto con enzimas.
Como se declaró anteriormente, un sistema de la invención incluirá, típicamente, una unidad/sistema de procesamiento de muestras y una unidad/sistema de separación de muestras. Los sistemas de separación incluirán, típicamente, sistemas de separación magnéticos. Uno de esos sistemas de separación magnéticos que puede incluirse en el sistema de la presente invención incluye los sistemas/procesos de separación magnética descritos, por ejemplo, en la amplia red mundial en el enlace "MiltenyiBiotec.com", y puede usarse para casi cualquier tipo celular. Los sistemas de separación magnética ilustrativos, que se describen en parte, más abajo, se describen, además, por ejemplo, en la descripción de la patente europea EP 0 869 838 B1 y en la patente de los Estados Unidos núm. 5,691,208.
Los métodos, dispositivos, y separadores magnéticos mejorados para los procedimientos de separación magnética se proporcionan y se describen en EP 0 869 838 B1. Las matrices de los separadores magnéticos proporcionan poros o canales uniformes que reducen el atrapamiento de aire o de sustancias no objetivo, disminuyen las pérdidas de las sustancias objetivo debido a la disrupción mecánica.
Las sustancias biológicas, tales como las células objetivo de diversos sistemas y órganos, se marcan magnéticamente con un miembro de unión específico adecuado, y se aíslan mediante el uso de dispositivos de la presente invención. Es de particular interés el aislamiento de células multipotentes tales como las células madre hematopoyéticas o progenitoras. Aunque la separación de células hematopoyéticas se usa en la presente descripción para proporcionar ejemplos de los procedimientos de separación de células, la presente invención puede aplicarse en una amplia variedad de tipos celulares u otras sustancias biológicas.
Las células procesadas con el uso de la presente invención pueden usarse para diversos propósitos, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades usando su potencial para proliferar y para diferenciarse, así como también sus funciones biológicas en organismos vivos, por ejemplo, sangre o tejidos.
Las aplicaciones de las células que pueden procesarse mediante el uso de la presente invención incluyen, pero no se limitan a
- ingeniería de trasplante, por ejemplo, junto con el trasplante de células madre
- trasplante de órganos
- tratamiento del cáncer que incluye, pero no se limita a leucemia incluyendo la leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, y tumores sólidos tales como el carcinoma de células renales, cáncer de mama, melanoma, cáncer de páncreas
- tratamiento de enfermedades autoinmunitarias refractarias tales como el lupus eritematoso sistémico o esclerodermia sistémica, Diabetes tipo 1, esclerosis múltiple
-terapia celular, incluyendo, pero sin limitarse al uso directamente de células efectoras
- tratamiento de enfermedades infecciosas
- regeneración de tejidos que incluye, pero no se limita a infarto del miocardio, daño del hígado, o enfermedades neurodegenerativas, y
- inducción de tolerancia que incluye, pero no se limita a enfermedades autoinmunitarias o por rechazo al trasplante.
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Los métodos de procesamiento que usan la presente invención pueden combinarse a partir de diversas operaciones básicas que incluyen el lavado de células, cambio de medio, concentración de células, incubación de las células con diversas sustancias (que incluyen anticuerpos, citocinas, reactivos para la separación magnética, medios), separación magnética de las células, filtración y cultivo de células.
Los métodos de separación magnética pueden comprender los procedimientos de enriquecimiento y de reducción (Bosio y otros, en "Engineering of Stem Cells", Springer 03/2009). Si las células objetivo pueden identificarse en base a proteínas de superficie, las células objetivo pueden enriquecerse con alta pureza. En algunas situaciones, las células no objetivo pueden identificarse en base a sus características funcionales no deseadas dentro de un contexto clínico específico. Estas células no objetivo pueden eliminarse del producto celular, lo que resulta en una mezcla heterogénea de diferentes células objetivo.
Los productos celulares procesados por la presente invención para las aproximaciones de ingeniería de injerto pueden enriquecerse para CD34, CD133 o reducirse para CD3, CD3 y CD19, CD6, CD4 y CD8, el receptor alfa/beta de células T (TCR alfa/beta) o CD3/CD19/CD16/CD14, lo que resulta en preparaciones celulares enriquecidas en células madre o células madre suplementadas con otras células inmunitarias tales como las células asesinas naturales y las células dendríticas.
Los productos celulares procesados por la presente invención para aproximaciones de terapia celular pueden enriquecerse, por ejemplo, para CD14 (monocitos), CD56 (células naturales asesinas), CD335 (células naturales asesinas, NKp46), CD4 (células T auxiliadoras), CD8 (células T citotóxicas), CD1c (subconjunto de células dendríticas de la sangre, BDCA-1), CD303 (BDCA-2), Cd304 (subconjunto de células dendríticas de la sangre, BDCA-4), NKp80 (células T naturales asesinas gamma/delta, células T efectoras/memoria), "6B 11" (células T naturales asesinas invariantes, Va24/Vb11), CD137 (células T activadas), CD25 (células T reguladoras) o reducirse para CD138 (células plasmáticas), CD4, cD8, CD19, CD25, CD45RA, CD45RO. Las células asesinas naturales, células T asesinas naturales, células T y sus subgrupos pueden usarse como células efectoras en los procedimientos de infusión linfocitaria de donantes para eliminar células infectadas por virus, células tumorales o bacterias. Las células dendríticas, ya sea generadas a partir de monocitos en cultivos celulares o aisladas directamente, pueden usarse para "vacunar" a los pacientes para promover la inmunidad con especificidad antigénica y natural contra células infectadas con virus, células tumorales, bacterias y/u hongos.
Ventajosamente, la presente invención permite fabricar productos celulares mediante la clasificación para dos o más parámetros que puede realizarse en un solo conjunto de tubos sin necesidad de transferir la suspensión celular de uno de los tubos del conjunto de tubos que se usa a otro, por lo que se evita el daño potencial al producto celular (infección, contaminación, aumento de la temperatura). Dos aplicaciones de clasificación de parámetros incluyen la generación de células T reguladoras altamente enriquecidas (primero se eliminan las células cD8 y/o CD19 y/o CD49d del producto celular y después queda enriquecido para CD25), de células asesinas naturales altamente enriquecidas (reducidas las CD3, enriquecidas con CD56) y de subgrupos de células dendríticas de la sangre altamente enriquecidas (reducidas las CD19, enriquecido en CD1c).
Las aproximaciones de regeneración de tejido usualmente usan células progenitoras de la sangre, médula ósea o tejidos para revascularizar los tejidos, promover la generación de tejido nuevo o proporcionar directamente tejido generado in vitro. Las células utilizadas pueden incluir productos celulares enriquecidos para CD133, CD34, CD271 (LNGFR, células madre mesenquimales), anti-MSCA-1 (W8B2, células madre mesenquimales), CD144 (células endoteliales).
Es una caracterización específica y novedosa de la presente descripción que la obtención de productos celulares mediante la separación celular y el cultivo pueda realizarse en un solo conjunto de tubos sin necesidad de transferir la suspensión celular de células de uno de los tubos que se usa del conjunto de la tubería a otro. Particularmente, la presente invención puede usarse para obtener células madre, células T, células dendríticas, células NK, células B, monocitos, células positivas para un marcador particular, tales como CD133, CD34, CD3, CD4, 8, 56, 19, 14, CD141 (BDCA-3), CD303 (BDCA-2), CD304 (BDCA-4), CD144, CD1c (BDCA-1), NKp46, NKp80, CD45RO, CD45RA, CD137, CD25, o CD138.
Composición/formulación:
Es una caracterización específica y novedosa de la presente invención que los productos celulares que se obtienen mediante operaciones básicas como se describió anteriormente pueden componerse para uso clínico directo. Los métodos conocidos en la técnica requieren un procesamiento manual posterior de los productos de las células transformadas para adaptarlos a los requerimientos clínicos. Con el sistema de la presente invención, el producto celular puede formularse directamente para su uso inmediato. Las etapas de formulación incluyen: el ajuste a un volumen o concentración celular deseado, el intercambio de los líquidos del procesamiento por los líquidos inyectables, la adición de estabilizadores (tales como plasma o suero autólogo, albúminas de suero, otras proteínas o polímeros sintéticos) o de adyuvantes, la suplementación con agentes crioprotectores tales como DMSO para el almacenamiento posterior, la extracción de muestras de retención para control de calidad, el suministro a combinaciones de bolsas o jeringuillas para
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infusión. Algunos componentes de la formulación final, por ejemplo, plasma, plaquetas o componentes de plaquetas pueden derivarse a partir de la muestra de origen.
El sistema de separación magnética de la presente invención puede usarse para marcar magnéticamente y aislar cualquier sustancia objetivo deseada. De particular interés es la separación de un componente específico a partir de una mezcla compleja. El sistema de separación de la presente invención tiene gran versatilidad, ya que casi cualquier sustancia objetivo puede separarse una vez que esté disponible un miembro de unión específico. La sustancia objetivo o analito puede ser cualquier miembro de un par de unión específico, o una sustancia asociada con un miembro de un par de unión específico. Como un ejemplo, puede usarse un par de unión antígeno de superficie celular y anticuerpo para aislar el propio antígeno, las células que expresan el antígeno, un organelo particular implicado en el procesamiento del antígeno, etc. Los dispositivos y métodos de la presente invención se aplican ventajosamente, además, a técnicas de diagnóstico que implican la unión de un receptor y un ligando, tales como los inmunoensayos, y similares.
En su forma más simple, un sistema de separación de células de la presente descripción tiene dos componentes principales: un separador magnético y un reactivo de separación de células. En la figura 1 se proporciona un diagrama esquemático de un dispositivo separador magnético. El diagrama muestra la construcción general del separador y el paso uniforme del fluido que resulta del uso de una matriz de esferas metálicas. La figura 2 representa un dispositivo de separación más complejo, que incluye las posiciones generales del paso del fluido, los contenedores de recolección y almacenamiento y la columna de separación. El circuito de fluido puede construirse con válvulas integradas, o las válvulas pueden aplicarse externamente a las vías de fluido.
Un tercer componente opcional para el sistema de separación de células preferido es un instrumento de separación de células. La Figura 3 representa un instrumento de separación de células controlado preferentemente por un ordenador, que puede incorporar las válvulas junto con un control del magneto, bomba y teclado. Un dispositivo similar al de la figura 2, construido sin las válvulas, puede montarse directamente sobre el instrumento de la figura 3 para usar en la separación automatizada de células objetivo.
El reactivo de separación de células que puede mencionarse también como un conjugado, reactivo de anticuerpo/partícula magnética o marcador magnético, incluye un material magnéticamente sensible unido a un miembro de unión específico. Existen muchos materiales magnéticamente sensibles bien conocidos usados en los métodos de separación magnética. La presente invención implica el uso de partículas o micropartículas magnéticamente sensibles. Las partículas magnéticas adecuadas se describen en la patente de Estados Unidos núm. 4,452,773 de Molday, y en la descripción de la patente europea EP 452342 B. Las partículas de tamaño coloidal, tales como las descritas en la patente de Estados Unidos núm. 4,795,698 de Owen, y la patente de Estados Unidos Liberti y otros núm. 5,200,084, son también adecuadas.
El término "miembro de unión específico" como se usa en la presente descripción se refiere a un miembro de un par de unión específica, es decir, dos moléculas, usualmente dos moléculas diferentes, donde una de las moléculas se une específicamente a la otra molécula a través de medios químicos o físicos. Los miembros complementarios de un par de unión específica se denominan a veces como un ligando y receptor. Además de los pares antígeno y anticuerpo con especificidad de unión, los pares de receptor de células T y antígeno peptídico en el MHC; los pares con especificidad de unión alternativos de interés incluyen biotina y avidina o estreptavidina; carbohidratos y lectinas; secuencias de nucleótidos complementarias (que incluye secuencias de ácido nucleico usadas como sondas y agentes de captura en ensayos de hibridación de aDn); ligandos peptídicos y receptor; moléculas efectoras y receptoras; hormonas y proteínas de unión a hormonas; cofactores de enzimas y enzimas; inhibidores enzimáticos y enzimas; marcadores de secreción, tal como se describe en la solicitud Internacional PCT/US93/10126; anticuerpos monoclonales autólogos, y similares. Los pares con especificidad de unión pueden incluir análogos, derivados y fragmentos del miembro de unión específico original. Por ejemplo, un anticuerpo dirigido a un antígeno proteico puede reconocer, además, fragmentos peptídicos, miméticos peptídicos sintetizados químicamente, proteína marcada, proteína derivatizada, etc. siempre que haya un epítopo presente.
Los pares inmunológicos con especificidad de unión incluyen antígenos y anticuerpos con especificidad antigénica o antígenos de receptores de células T. Los antígenos adecuados pueden ser haptenos, proteínas, péptidos, carbohidratos, etc. Los pares inmunológicos con especificidad de unión incluyen antígenos y anticuerpos con especificidad antigénica o antígenos de receptores de células T. Los antígenos adecuados pueden ser haptenos, proteínas, péptidos, carbohidratos, etc. Pueden usarse métodos de ADN recombinante o síntesis de péptidos para producir análogos quiméricos, truncados o de cadena sencilla de cualquiera de los miembros del par de unión, donde las proteínas quiméricas pueden proporcionar mezcla(s) o fragmento(s) de estos, o una mezcla de un anticuerpo y otros miembros de unión específicos. Los anticuerpos y receptores de células T pueden ser monoclonales o policlonales, y pueden producirse por animales transgénicos, animales inmunizados, células B humanas o de animales inmortalizadas, células transfectadas con vectores de ADN que codifican el anticuerpo o el receptor de células T, etc. Los detalles de la preparación de anticuerpos y su adecuación para usar como miembros de unión específicos son bien conocidos por los expertos en la técnica.
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En aras de abreviar, el sistema de separación se describirá principalmente en términos de su capacidad para seleccionar y separar específicamente una población definida de células (células objetivo) a partir de una población heterogénea de células, tales como sangre periférica, médula ósea, sangre del cordón umbilical o placenta, sangre fetal o un producto de leucaféresis. Además, se apreciará que algunos tejidos pueden fragmentarse en una célula única o suspensión monodispersa para permitir el aislamiento de un subgrupo celular particular, tal como la separación de los linfocitos infiltrantes de tumor en una masa tumoral, la separación de islotes celulares a partir del tejido renal, etc. Por ejemplo, diversos tipos celulares pueden marcarse con un anticuerpo específico para permitir la depuración celular y/o el enriquecimiento celular. La población de células objetivo se identifica generalmente por un miembro de unión específico, como se describió anteriormente, que se une selectivamente a un antígeno de superficie celular presente en las células objetivo. Sin embargo, debe entenderse, que el presente aparato y método no se limita a tales usos.
Por simplicidad, el miembro de unión específica se ejemplificará en la presente descripción por un anticuerpo. El anticuerpo puede unirse directa o indirectamente a una partícula magnética. Si el anticuerpo se une directamente a la partícula magnética, entonces la población de células objetivo se marca magnéticamente cuando el anticuerpo se une al antígeno de superficie celular. Si el anticuerpo se une indirectamente a la partícula magnética, entonces la población de células objetivo es susceptible al marcado magnético cuando el anticuerpo se une a las células objetivo. La población de células unidas a anticuerpos se marca realmente por medio de un contacto posterior de las células con un miembro de unión específico para el anticuerpo, donde ese miembro de unión específico se une por sí mismo a una partícula magnética. Las células objetivo, identificadas mediante tal marcado magnético, se separan después de otras células por medio de un campo magnético. Por ejemplo, un miembro de unión específico tal como la avidina puede conjugarse a una partícula magnética donde la avidina se une a un anticuerpo biotinilado que a su vez se une específicamente a las células objetivo.
El miembro de unión específico puede unirse directamente a la partícula magnética. Esto puede lograrse por medio de grupos reactivos sobre el miembro de unión específico y la partícula magnética propiamente dicha. Alternativamente, el miembro de unión específico y la partícula magnética pueden unirse por medio de un agente de acoplamiento o un enlazador. Los términos "agente de acoplamiento" o "enlazador", como se usan en la presente descripción, incluyen varios agentes bifuncionales formadores de uniones cruzadas o de acoplamiento, es decir, moléculas que contienen dos grupos reactivos o "extremos", que pueden separarse por un espaciador.
Las matrices convencionales de separación magnética de alto gradiente se preparan, típicamente, a partir de materiales tales como alambres, fibra revestida con metal o lana de acero. En el dispositivo de separación magnética mejorado de la presente descripción, la matriz intensificadora de gradiente del separador magnético de alto gradiente se forma a partir de esferas pequeñas de material ferromagnético o magnéticamente susceptible. Tales materiales incluyen, pero no se limitan a hierro, acero, níquel de cobalto y otros metales ferromagnéticos de tierras raras o aleaciones de estos. Por ejemplo, el material de matriz puede incluir esferas metálicas ferromagnéticas tales como esferas de hierro (por ejemplo, MARABU Balls, Kugelfabrik Schulte & Co., Wermelskirchen, Alemania). Se conocen muchos métodos diferentes de fabricación de esferas. Usualmente las esferas tienen un diámetro promedio en el intervalo de aproximadamente 0,2 a 1,5 mm para la separación de células grandes o complejos celulares y de aproximadamente 0,05 a 0,2 mm de diámetro para material subcelular. Preferentemente, las esferas tienen un diámetro promedio que varía de aproximadamente 0,2 a 0,5 mm, y más preferentemente, las esferas se seleccionan para tener un diámetro promedio en el intervalo de aproximadamente 0,2 a 0,3 mm. Es deseable que el tamaño de las esferas sea relativamente homogéneo, que usualmente no varíe más de aproximadamente 15 % del tamaño promedio, más usualmente, por no más de aproximadamente 10 % y, preferentemente, por no más de aproximadamente 5 %.
La forma esférica sustancialmente simétrica y el tamaño sustancialmente uniforme de las esferas son deseables para la construcción de una matriz separadora magnética, ya que las esferas pueden asumir una configuración de red en donde las brechas entre las esferas forman canales o poros regulares en la matriz. La configuración de red es una estructura modelada de esferas que forma canales de tamaño regular entre las esferas adyacentes y a lo largo de la matriz. Después de la aplicación de un campo magnético al separador, se crean gradientes de campo magnético en las brechas entre las esferas. El tamaño uniforme, y por tanto el espaciado de las esferas proporciona un gradiente magnético sustancialmente uniforme a lo largo de la matriz, y características de flujo de fluido sustancialmente uniformes. En la figura 4 se representa un canal de flujo. Las dimensiones del canal pueden describirse por la bola o partícula de tamaño máximo que encajaría entre las esferas de la matriz. Con respecto a la figura 4, la relación geométrica es r= aproximadamente 0,155 R. Se apreciará a partir de las enseñanzas de la presente invención que el tamaño del canal puede ajustarse a un diámetro promedio óptimo para el proceso de separación deseado mediante la variación del tamaño de las esferas que se usan para formar la matriz.
La forma esférica proporciona la formación de una estructura de matriz sustancialmente estable cuando las esferas se envasan dentro de una carcasa que define una cámara de separación. Como se describe con detalle más abajo, la matriz se reviste también con un material sustancialmente impermeable a los fluidos tal como un polímero plástico. Cuando se aplica un recubrimiento de polímero plástico, se cierran las brechas estrechas entre las esferas, lo que resulta en una matriz hidrodinámicamente optimizada. La matriz ferromagnética resultante ocupará usualmente entre 60 % a 75 % del volumen total de la cámara de separación y será permeable a los líquidos. El recubrimiento impermeable ocupará aproximadamente de 1 a 5 % del volumen total. El volumen libre estará en el intervalo de aproximadamente 20
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% a 40 % del volumen total de la cámara de separación. En una modalidad preferida, la matriz total ocupará aproximadamente 75 % a 80 % del volumen total de la cámara de separación.
La Figura 1 presenta un esquema de una columna de separación ilustrativa. Las esferas no se representan a escala, sino para representar mejor la formación de una matriz tridimensional permeable a los líquidos 6. Las esferas se envasan en una carcasa 4 que se fabrica de un material no magnético. La carcasa del separador magnético sirve como el cuerpo de la columna de separación, y el interior de la carcasa define una cámara de separación. Las carcasas de varias longitudes, formas y diámetros se fabrican ventajosamente de plástico. Los materiales no magnéticos adecuados para la construcción de una carcasa del separador magnético incluyen acero inoxidable, vidrio, plástico, etc.
En una modalidad preferida, la carcasa del separador magnético es un plástico al que se adherirá el recubrimiento de matriz, lo que permite mejorar las propiedades hidrodinámicas en el límite de la matriz y la carcasa. Se apreciará que el material de recubrimiento y el material de la carcasa se seleccionarán por su compatibilidad entre sí, por ejemplo, debe seleccionarse un recubrimiento de laca que no dé como resultado la acumulación de residuos plásticos no adherentes en la columna. Se conocen diversos mecanismos mediante los cuales los materiales se adhieren entre sí y pueden explotarse para este propósito. Convenientemente, la selección para la compatibilidad puede realizarse con base en el disolvente que se usa junto con la laca. El disolvente será ligeramente reactivo con la carcasa de plástico, de manera que la laca se adhiere en el disolvente, pero no tan reactiva que se comprometa la integridad estructural de la columna durante el proceso de curado de la laca. Por ejemplo, el material de recubrimiento puede seleccionarse para incluir un disolvente que provoque una ligera disolución del interior de la carcasa de plástico. Después del curado, el material plástico se endurece y por consiguiente une o sella el material de recubrimiento y el material de la carcasa uno con otro. Un experto en la técnica apreciará que la información relativa a tal reactividad es disponible generalmente. Un ejemplo de una combinación adecuada de una carcasa y un disolvente es metiletilcetona y el plástico ULTEM® (General Electric).
Preferentemente, cada uno de los materiales seleccionados para la construcción de la columna de separación 2 será compatible también con los procedimientos de esterilización. Preferentemente, la carcasa tiene forma cilíndrica para facilitar el flujo de la muestra a través de la cámara de separación, así como también, la formación de la matriz tridimensional 6 dentro de la carcasa. Preferentemente, las paredes de la carcasa tienen un grosor de aproximadamente 1 a 3 mm. La columna de separación tiene puertos de entrada 12 y salida 14 para la introducción y descarga de fluidos. Generalmente, los puertos de entrada y salida son estructuras estrechas con relación al cuerpo principal de la carcasa. Esto facilita la unión del separador a los circuitos de fluido adicionales en un sistema de separación y ventajosamente mantiene el dispositivo como un sistema cerrado. Los puertos de entrada y de salida pueden ubicarse en sitios diferentes de los representados en la figura 1, pero se apreciará que la estructura general del separador proporcionará preferentemente una cámara de separación que tenga el menor número de curvas o esquinas que podrían de cualquier otra manera retardar el flujo del fluido o crear espacios donde la muestra podría acumularse.
En la entrada y salida de la columna, la columna se construye para tener un mecanismo de alimentación que asegure una distribución homogénea óptima y un flujo a través de la matriz. El mecanismo de distribución se compone del volumen delante de la capa de la tapa 8 y la propia capa de tapa, que sirve como resistencia de flujo. El volumen de distribución (en mililitros) puede definirse con relación al ancho de la columna (en milímetros), que tiene usualmente una relación de aproximadamente 0,1 a 10. El volumen de la cámara delante de la capa base 10, así como la propia capa de base, sirven también como mecanismos de alimentación para los fluidos que pasan a la cámara a través del orificio de salida.
Se prefiere contar con dimensiones de columna donde la relación de diámetro con respecto a la longitud es al menos 0,2 a 1. Las dimensiones reales de la columna dependerán del material que se va a separar, y del flujo deseado para la separación. Las dimensiones de la columna proporcionarán una cámara que aceptará una matriz que tenga un área superficial adecuada para crear gradientes de campo magnético suficientes en la cámara de separación y que permita una retención eficaz del material marcado magnéticamente. El volumen necesario para una separación dada puede determinarse empíricamente y variará con el tamaño, la densidad del antígeno en la superficie celular, la afinidad de anticuerpos, etc. Como un ejemplo, un área local de 3 cm2 permite un flujo de 5 a 40 ml/minuto. La capacidad de unión de una matriz de 2 x 4 cm es de aproximadamente 109 células marcadas.
Para facilitar la fabricación de la columna de separación, la capa de base de material poroso no magnético se coloca en la carcasa de manera que cuando las esferas ferromagnéticas se colocan en la cámara no pasan a través del puerto de salida 14. Los materiales porosos adecuados para la formación de la capa base incluyen, pero no se limitan a, plástico poroso, metales sinterizados o vidrio, rejillas, etc. Por ejemplo, pueden usarse diversas fritas porosas disponibles de Porex Singwitz, Alemania. Usualmente, el material poroso tendrá un tamaño de poro de aproximadamente 20 a 200 pm, preferentemente de 50 a 150 pm. Se seleccionará un tamaño de poro adecuado de acuerdo con las dimensiones de la sustancia objetivo y la composición del material de muestra. Además, el tamaño de poro no será tan grande como para permitir que las esferas llenen las aberturas porosas del material de la capa. Después de la inserción de las esferas en la cámara, la carcasa puede sacudirse o someterse a vibración para facilitar el asentamiento de las esferas en una configuración más uniforme. Opcionalmente, la capa de tapa 8 de material poroso no magnético se coloca en la carcasa sobre la matriz para mantener la configuración uniforme de la matriz durante el almacenamiento, manipulación y uso. Además, puede aplicarse presión a la capa de tapa 8 para envasar más firmemente las esferas dentro de la cámara. La
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parte superior 16 de la columna de separación, que incluye el puerto de entrada 12 en esta modalidad, se coloca después en la parte superior de la carcasa 4 y se une a la carcasa. Por ejemplo, cuando se usan materiales plásticos, la parte superior 16 puede pegarse o soldarse ultrasónicamente a la carcasa 4 para completar la formación de la columna de separación. Después de completar la carcasa, la matriz se recubre.
Con respecto a la Figura 1, se aplica un recubrimiento a la matriz permeable a los líquidos descrita anteriormente. El recubrimiento se selecciona para que sea sustancialmente impermeable a los iones, y por tanto proteja al material de la matriz metálica de la corrosión, así como también inhiba el escape de los cationes de la matriz, los que podrían dañar las células. Además de la formación de una capa protectora impermeable sobre el material de la matriz, un recubrimiento completo de la matriz cierra las brechas entre las esferas, lo que proporciona estabilidad mecánica de la matriz y una matriz optimizada hidrodinámicamente. Dicha estabilidad mecánica es particularmente ventajosa cuando la matriz se forma a partir de pequeñas esferas de metal, susceptibles o sensibles magnéticamente, como se describió anteriormente. Un material de recubrimiento tal como un recubrimiento de laca puede fluir hacia el puerto de entrada 12 de la columna de separación. La laca fluye a través de la capa de tapa 8, matriz 6 y capa de base 10, y por consiguiente recubre la superficie porosa de cada componente. El exceso de laca se deja pasar desde el puerto de salida 14 de la cámara. La columna de separación recubierta puede centrifugarse para expulsar además el exceso de material de recubrimiento de la cámara. Después, el recubrimiento se deja secar. La columna de separación puede calentarse para promover, adicionalmente, el secado del recubrimiento. Por ejemplo, la columna de separación recubierta puede colocarse en un horno a 110 °C durante cuatro a cinco horas seguido de secado continuo a temperatura ambiente durante tres a siete días.
Cuando se seca, el recubrimiento se endurece, y por consiguiente le proporciona un soporte mecánico a la matriz. Este soporte mecánico no sólo ayuda a mantener la integridad de la matriz durante el almacenamiento y manipulación de la columna de separación, sino que también proporciona a la matriz una estructura rígida que no presenta una elasticidad significativa. Esta rigidez es ventajosa porque de otra manera la matriz podría deformarse con la aplicación de un campo magnético externo a la columna de separación. La fuerza del campo magnético aplicada de los medios magnéticos externos está, típicamente, dentro de un intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,5 Tesla, y más preferentemente, entre aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,8 Tesla. El campo debe ser lo suficientemente grande y la distancia entre el magneto y la columna de separación debe ser lo suficientemente pequeña como para inducir gradientes intensificados del campo magnético dentro de la matriz. Para mantener gradientes magnéticos uniformes en el separador, el material de la matriz debe moverse o desplazarse en la cámara después de la aplicación del campo magnético. Los componentes metálicos esféricos, la carcasa y el recubrimiento se combinan ventajosamente en la presente invención para proporcionar una matriz mejorada con suficiente rigidez para resistir una deformación sustancial cuando la columna de separación se coloca dentro de un campo magnético.
Se prefiere recubrir la matriz mientras que los componentes metálicos esféricos estén dentro de la columna de separación en la carcasa. El recubrimiento de la matriz dentro de la carcasa evita la interrupción de la matriz después que se aplica el recubrimiento. Además, la matriz dentro de la carcasa sirve para llenar o sellar pequeños espacios huecos, hendiduras intersticiales formadas cerca de los puntos de contacto entre las esferas, así como también entre las esferas y la carcasa, mientras que proporciona simultáneamente una superficie uniforme a los canales o formada por los puntos separados de las esferas. Estos canales o poros resultan en la permeabilidad de la matriz. Mediante el sellado de los espacios vacíos, hay una disminución en las áreas donde las células u otros componentes sólidos de la muestra pudieran formar una cuña o quedar atrapados físicamente, incluso en ausencia de un campo magnético.
En la columna de separación terminada, la selección de materiales de recubrimiento de la matriz resultará, preferentemente, en canales o vías a través de la matriz permeable con un diámetro promedio en el intervalo de 20 a 60 |jm y una ocupación de aproximadamente 60 % a 80 % del volumen total de la cámara de separación. Por ejemplo, una columna de separación para la separación de las células de la sangre puede tener un tamaño de canal recubierto final con un promedio de 20 jm, donde la matriz ocupa aproximadamente 80 % del volumen total de la cámara.
Después de la preparación del recubrimiento sustancialmente impermeable, la matriz y otras superficies interiores de la cámara de separación se tratan, además, preferentemente, mediante la adición de un material hidrófilo tal como polividona (BASF, Ludwigshafen, Alemania). Otros materiales de recubrimiento hidrófilos adecuados incluyen, pero no se limitan a, polivinilpirrolidina, polietilenglicol, hidroxietilalmidón, y recubrimientos hidrófilos, tales como acrilamidas, surfactantes o agentes humectantes de tipo detergente, y material biológico que incluye, pero no se limita a, heparina y albúmina de suero humano. La superficie interior de la cámara de separación puede hacerse también hidrófila mediante grabado por plasma o en corona de la superficie. El recubrimiento hidrófilo proporciona el interior de la columna de separación y la matriz permeable a los líquidos con una superficie fácilmente humectable. Con la mejora de la humectabilidad de estas superficies, la introducción de fluido en la columna de separación producirá un frente de fluido uniforme cuando este pase a través de la cámara. Esto facilita la eliminación de burbujas de aire de la matriz permeable y otros espacios vacíos en la cámara de separación. Es deseable mantener la columna de separación y otros componentes del dispositivo como un sistema cerrado sustancialmente libre de aire durante el proceso de separación. La presencia de aire en el sistema durante la separación de las células objetivo afecta las tensiones superficiales interiores y las áreas no ventiladas, lo que puede conducir a la destrucción celular.
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Con respecto a la Figura 2, que representa un dispositivo de separación, la columna de separación 40 puede estar precedida por un dispositivo de prefiltración. La figura representa el dispositivo de prefiltración como una columna 30, sin embargo, debe entenderse que pueden usarse otras configuraciones, tales como el prefiltro. Generalmente, la columna de prefiltración es una estructura tridimensional que puede ser sustancialmente idéntica a la columna de separación en términos de su composición estructural. Sin embargo, la columna de prefiltración puede tener dimensiones diferentes, la matriz puede fabricarse de esferas que tienen una composición diferente, por ejemplo, un material no ferromagnético o la matriz puede fabricarse de esferas que tienen un diámetro diferente al que se usa en la columna de separación, lo que proporciona de esta manera un tamaño de poro o canal diferente del que se encuentra en la columna de separación. En una modalidad, la columna de prefiltración es idéntica a la columna de separación. El paso de la muestra a través de la columna de prefiltración sirve para atrapar y eliminar los componentes del fluido que no se desean en el producto de separación final. Por ejemplo, en las separaciones de células de la sangre, las células "pegajosas" tales como monocitos, granulocitos y plaquetas pueden eliminarse de la suspensión celular por la columna de prefiltración. Alternativamente, la columna de prefiltración puede construirse para que tenga un tamaño de poro promedio que es menor que el que se encuentra en la columna de separación. Por ejemplo, el tamaño de poro de la matriz permeable puede seleccionarse para eliminar células tumorales grandes de la muestra antes del paso del fluido a través de la columna de separación. El paso de fluido de la muestra a través de la columna de prefiltración puede servir también para separar agregados, tales como agregados celulares, que pueden existir en el fluido. Además, debido a que la columna de prefiltración contiene materiales sustancialmente idénticos a los de la columna de separación, los componentes de la muestra que podrían unirse no específicamente a la columna de separación son atraídos ventajosamente por la columna de prefiltración. Por tanto, la columna de prefiltración reduce la posibilidad de ensuciar la columna de separación durante el proceso de separación, y esto reduce la recolección de células o componentes del fluido no deseados en el producto de separación final.
Con respecto a la Figura 2, se representa una modalidad preferida del dispositivo de separación 25. El contenedor de muestra 81 se conecta a un filtro de suspensión opcional 35. El filtro de suspensión puede usarse para eliminar las partículas componentes no deseadas del fluido de la muestra y se selecciona para que tenga un tamaño de poro suficiente para eliminar partículas por encima de un cierto tamaño. Por ejemplo, el filtro de suspensión puede ser un filtro Pall (Pall SQ40S, Pall Biomedical, Inc., Puerto Rico) que tiene un tamaño de poro seleccionado para eliminar partículas mayores de 40 pm, tales como coágulos y conglomerados de células en muestras de células hematopoyéticas. El filtro de suspensión se conecta por la vía de fluido dos 12 al puerto de entrada 32 de la columna de prefiltración 30.
El puerto de salida 34 de la columna de prefiltración se conecta por la vía de fluido cinco al puerto de entrada 42 de la columna de separación 40 a la que se aplicará el campo magnético durante el proceso de separación. El puerto de salida 44 de la columna de separación se conecta por la vía de fluido ocho 18 al canal de distribución 88 que conduce al contenedor de recolección de producto 83, al contenedor de desecho de lavado final 84 y al contenedor de muestra no marcada 85. Las vías de fluido separadas, nueve 19, diez 20, y once 21 conducen a estos contenedores, respectivamente.
Este dispositivo de separación incluye, además, un contenedor 80 de lavado o tampón y un contenedor 82 de desecho del lavado inicial, los cuales se conectan por las vías de fluido uno 16 y tres 17, respectivamente, a la vía de fluido dos 12. El contenedor tampón 80 se conecta, además, a través de la línea de lavado o tampón 90 (vía de fluido seis) al canal de distribución 88. La línea de tampón se conecta, además, a la vía de fluido cinco 15 por medio de la vía de fluido cuatro 14. Las vías de fluidos, contenedores, filtros y columnas pueden acoplarse entre sí por medio de cualquier medio adecuado tal como espigas estándar, cerraduras Luer, conectares macho-hembra, conectores en T, conectores en Y, y conectores de 4 vías u otros accesorios como se usan comúnmente en los conjuntos de suministro de solución intravenosa.
El flujo de fluido a través de los circuitos de fluido del dispositivo de separación puede controlarse por medio de válvulas ubicadas dentro de la(s) vía(s) de fluido. Las vías de fluido uno a once se asocian con las válvulas correspondientes uno a once (1-11). Las válvulas pueden estar dentro de las mismas vías o pueden ser externas a las vías. El flujo de fluido puede controlarse, además, por una bomba. Por ejemplo, cuando las vías de fluido se fabrican de un material flexible, tal como un tubo flexible, las válvulas adecuadas para el control del transporte de fluido incluyen válvulas de pinza. Las válvulas de pinza cierran la vía del fluido mediante la presión de las paredes de la tubería una contra la otra. Los expertos en la técnica apreciarán que tales válvulas de pinza se seleccionarán para acomodar el tamaño de la tubería seleccionada para usar como una vía de fluido. Además, la fuerza de compresión de la válvula de pinza se seleccionará para lograr la compresión de la tubería seleccionada y así incidir en el cierre de la vía de fluido. Las especificaciones de la válvula, por tanto, se adaptarán a las especificaciones de suavidad o dureza (durómetro) de la tubería seleccionada.
Un ejemplo del dispositivo de separación incluye, además, el lazo de recirculación 92 (vía de fluido siete) de manera que el fluido que ya pasó a través de la columna de separación 40 puede recircularse a través de la columna de separación. Típicamente, una bomba 64 se conectará al lazo de recirculación para facilitar el reciclado del fluido a través de la columna de separación, así como también para controlar el flujo a través de la columna. Los expertos en la técnica apreciarán que puede usarse una variedad de bombas. Una bomba ilustrativa es una bomba peristáltica que puede controlar el paso de fluido a través del lazo de recirculación en ambas direcciones y a velocidades variables. El dispositivo de separación que tiene un lazo de recirculación permite separaciones secuenciales en una columna, por un
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proceso de unión y elución, seguido por un segundo proceso de unión y elución. Las separaciones secuenciales proporcionan una pureza mejorada en la población objetivo final.
La Figura 2 representa esquemáticamente un ejemplo de un dispositivo de separación. Sin embargo, se apreciará que puede lograrse un proceso de separación mediante el uso de los componentes básicos del sistema, es decir, el separador magnético mejorado y los contenedores de recolección.
Los expertos en la técnica apreciarán que los medios de recirculación y las vías de flujo del fluido de la presente invención son adecuados, además, para usar en sistemas de separación alternativos. Por ejemplo, los medios de recirculación pueden usarse, ventajosamente, en un sistema en donde los medios de separación implican técnicas de centrifugación, columnas de absorción o medios químicos como alternativas a los medios de separación magnética o electromagnética.
En un proceso de separación de células ilustrativo, las vías de fluido y las columnas se ceban para permitir que un líquido de lavado fluya a través de todas las vías y columnas de fluido, preferentemente, a velocidades de flujo y presiones variables. El líquido de lavado puede contener materiales tal como una proteína fisiológicamente aceptable, tal como albúmina de suero humano (HSA), que inhibe la adhesión de las células a las superficies interiores de los componentes plásticos del dispositivo. El líquido de lavado puede contener, además, pequeñas cantidades de surfactantes o detergentes fisiológicamente aceptables, para mejorar la humectación de las superficies interiores.
Se encontró que las grandes burbujas de aire en las vías de fluido son perjudiciales para la recuperación de células viables. Los métodos para eliminar las burbujas de aire de las vías de fluido se conocen en la técnica, y pueden emplearse para este propósito. Un método de particular interés hace uso de la observación de que una frita permeable, tal como las que se usan en la capa de tapa y/o la capa de base, no permitirá el paso de burbujas de aire a una velocidad del flujo de los fluidos menor que aproximadamente 400 ml/minuto. Una columna puede liberarse de burbujas de aire mediante la circulación del líquido de lavado a través de un lazo de recirculación a velocidades de flujo menores que aproximadamente 400 ml/minuto. Así, las burbujas de aire se acumulan fuera de la columna en las capas de base y/o tapa. Después, se invierte la dirección del flujo y las burbujas se eliminan del sistema dentro de una bolsa de desecho adecuada. Preferentemente, la secuencia se repite para asegurar la eliminación de todas las burbujas. Las burbujas existentes pueden ampliarse intencionalmente por la generación de presión negativa.
En tal proceso ilustrativo, pueden usarse anticuerpos conjugados magnéticamente para dirigirse específicamente a las células deseadas en una población heterogénea de células. El reactivo magnético se incuba con la población celular mixta, después las partículas no unidas se eliminan por lavado por cualquier medio conveniente, por ejemplo, centrifugación, etc. Cuando se desea la esterilidad celular, las incubaciones y lavados de anticuerpos se pueden realizar en un proceso de recipiente cerrado, donde los anticuerpos y líquidos de lavado se agregan a un recipiente estéril por medio de una jeringa estéril o dispositivo similar. De esta manera, se minimiza la contaminación por microorganismos transmitidos por aire de las células deseadas. En un sistema cerrado de este tipo, particularmente cuando el contenedor es una bolsa flexible, la mezcla de células y anticuerpos puede mejorarse mediante la inyección de una pequeña cantidad de aire estéril, en una relación de aproximadamente 0,5 a 2 de aire a líquido, dentro del contenedor.
La suspensión de células incubadas, que ahora contiene células objetivo marcadas magnéticamente, se pasa a través del dispositivo de separación.
El sistema transporta las células a través de un separador magnético que se ubica dentro o es adyacente a un campo magnético. La fuente del campo magnético puede ser un magneto permanente o un electromagneto. La columna de separación se construye, preferentemente, para incluir una matriz ferromagnética de esferas ferromagnéticas apiladas, como se describió anteriormente. Opcionalmente, la muestra se pasa a través de una columna de prefiltración, que se construye, además, como se describió anteriormente, antes de pasarla a través de la columna de separación. Si la columna de separación contiene una matriz compuesta de esferas diferentes a las ferromagnéticas, entonces la muestra puede pasarse primero a través de una columna de prefiltración que es sustancialmente idéntica a esa columna de separación. Las células marcadas magnéticamente se acumulan en la columna de separación en respuesta al campo magnético. Las células no marcadas y otros componentes de la suspensión pasan a través de la columna de separación y hacia un contenedor de muestra no marcada y/o contenedor de desecho. Después, las células marcadas o purificadas pueden eluirse de la columna de separación mediante la eliminación de la columna de separación del campo magnético o por eliminación del campo magnético de la columna de separación. una solución de lavado, tal como un líquido tamponado, se pasa a través de la columna de separación para lavar las células marcadas de la columna de separación y hacia un contenedor de recolección del producto. El contenedor de recolección puede usarse para el procesamiento posterior de las células objetivo o la crioconservación de las células objetivo. La columna de separación es una columna de separación magnética de alto gradiente que se construye a partir de esferas ferromagnéticas, como se describió anteriormente. Los contenedores mencionados en la presente descripción son, típicamente, bolsas de plástico, tales como las que se usan para el almacenamiento y el suministro de fluidos intravenosos, pero puede usarse cualquiera de los contenedores adecuados. Los contenedores se seleccionarán por su volumen de almacenamiento o de recolección necesario, su capacidad para la esterilización y su capacidad para usarse en un sistema cerrado, es decir, un sistema de separación del que puede eliminarse sustancialmente todo el aire antes de usar.
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En otra modalidad, las células marcadas magnéticamente se recirculan a través de la columna de separación para mejorar la selección de las células objetivo y eliminar las células u otros componentes no deseados de la suspensión. Algunas modalidades preferidas incluyen, además, el uso de una columna de prefiltración. Sin embargo, la columna de prefiltración no se somete a un campo magnético. En su lugar, el paso preliminar de la suspensión celular a través de la columna de prefiltración resulta en la captura de componentes de la suspensión o materiales que de cualquier otra manera podrían unirse no específicamente a la columna de separación. Tales uniones no específicas pueden provocar el bloqueo o la suciedad de la columna de separación, lo que, a su vez, podría inhibir o reducir la separación y recolección de la población de células marcadas.
Las vías de fluido, los contenedores de recolección, los filtros de la suspensión, la columna de prefiltración y la columna de separación, pueden construirse, interconectarse y suministrarse como un dispositivo de separación desechable. Las células objetivo se recolectan, preferentemente, en un contenedor de transferencia de sangre estéril a partir del cual las células pueden trasplantarse al paciente o en el que las células pueden almacenarse o someterse a procesamiento adicional. El dispositivo completo de separación de células puede pre-envasarse en contenedores adecuados. El dispositivo de envasado puede esterilizarse y proporcionarse listo para usar en el proceso de separación magnética mejorado de la presente invención. Los reactivos necesarios para el proceso de separación deseado pueden proporcionarse también en forma de estuche. Por ejemplo, un conjugado específico para la población de células objetivo u otro analito puede proporcionarse por separado, o con el dispositivo. El estuche puede incluir también soluciones de lavado, por ejemplo, solución salina estéril estándar, y/u otros líquidos tamponados, tales como solución salina tamponada con fosfato, EDTA 1 mmol/l y albúmina de suero humano al 0,5 %. Estos reactivos u otras soluciones pueden proporcionarse en contenedores tales como bolsas de plástico que pueden conectarse a los pasos de fluido adecuados del dispositivo de separación de células. El sistema de separación mejorado de la presente invención puede automatizarse totalmente. En el sistema automatizado, un ordenador controla el flujo de los fluidos a través de los circuitos de fluido y la columna de separación, controla la fuerza del campo magnético o la colocación del magneto y/o la columna de separación para proporcionar la retención y liberación de las células objetivo o analitos marcados magnéticamente, y dirige los productos de recolección final hacia los contenedores adecuados.
Un ejemplo de un instrumento automatizado de separación de células, como se representa en la Figura 3, incluye componentes mecánicos, electromecánicos y magnéticos. Los componentes mecánicos pueden incluir: una cubierta exterior o carcasa 15 del instrumento; soporte del contenedor ajustable 21; bomba peristáltica 64; el soporte de la columna de prefiltración 32 y el soporte de la columna de separación 42. Los componentes electromecánicos pueden incluir: válvulas de pinza solenoide 1-11; un motor interno (no mostrado) para accionar la bomba peristáltica 64; un motor interno (no mostrado) para mover el soporte de la columna de separación 42 (y de esa manera mover la columna de separación 40) dentro o fuera del campo magnético, o para mover el magneto 50; y un detector de burbujas (sensor ultrasónico) 65, que se usa para detectar la presencia de fluido en los circuitos de fluido. Los medios magnéticos pueden incluir magnetos permanentes y electromagnetos. Se apreciará que estos componentes individuales se pueden seleccionar a partir de varias alternativas fácilmente disponibles y se pueden combinar en una variedad de configuraciones sin apartarse de la descripción general del sistema mejorado de separación magnética de la presente invención.
En un ejemplo del dispositivo de separación, las vías de fluido, los contenedores de solución y de recolección, el filtro de suspensión, la columna de prefiltración, la columna de separación y los conectores se proporcionan como un componente desechable preensamblado al sistema de separación. El dispositivo de separación se monta sobre el instrumento de separación para realizar el proceso de separación. Una vez completado el proceso de separación, el contenedor de recolección de producto puede retirarse y los componentes restantes del dispositivo de separación se desechan.
Preferentemente, un microprocesador incorporado (no mostrado) controla todos los componentes electromecánicos del instrumento, y el programa dirige al sistema para realizar las operaciones apropiadas en una secuencia estándar. Una pantalla 62 y el teclado del operario 60 permiten al operario monitorear el funcionamiento automático del sistema y controlar el funcionamiento del instrumento en un modo manual. Una impresora (no mostrada) puede conectarse al microprocesador para imprimir la información de proceso, etiquetas, etc.
La Figura 3 representa un instrumento de separación y un dispositivo de separación montado. En esta modalidad, el dispositivo de separación se monta o instala sobre el instrumento mediante el posicionamiento de la tubería de las vías de fluido en sus válvulas de pinza externas respectivas 1-11, como se describió anteriormente. La columna de prefiltración 30 se coloca dentro del soporte 32 de la columna de prefiltración. La columna de separación 40 se coloca dentro del soporte de la columna de separación 42 que se mueve con relación al magneto 50 por medio del brazo retráctil 44. La manija ajustable 20 se usa para asegurar el brazo de suspensión 21 en una posición elevada. Hay monturas o clavijas 22 en el brazo de suspensión sobre las cuales se coloca el contenedor de desecho de lavado inicial 82 y los contenedores de tampón y muestra (no mostrados) según sea adecuado. El aparato puede incluir, además, el compartimento de almacenamiento 70 para separar el contenedor de desecho final y el contenedor de muestra no marcada del contenedor de recolección de producto (no mostrado).
Como se mencionó anteriormente, los sistemas de separación como se describió anteriormente pueden integrarse adicionalmente con varios sistemas de procesamiento de muestras/células para realizar las etapas de preparación de la
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muestra antes de la separación del componente de la muestra mediante las técnicas de separación magnética descritas. La Figura 5 ilustra un sistema de acuerdo con una modalidad de la presente invención. Como se describió anteriormente, un sistema de la presente invención puede incluir varios componentes mecánicos, electromecánicos y magnéticos. El sistema 100 incluye una unidad de separación 106 y una unidad de procesamiento 104 integradas en un sistema único que contiene una cubierta exterior o carcasa 105. El sistema 100 puede incluir un sistema o unidad de separación magnética similar a las descritas anteriormente. El sistema 100 incluye una unidad de separación magnética 106 que incluye una carcasa para colocar una columna de separación (por ejemplo, una columna de separación magnética como se describió anteriormente, figura 1) en la unidad de separación magnética 106. El sistema 100 incluye también una bomba 108 y una pluralidad de medios o válvulas de control del flujo de fluido, como se ilustra por medio de la válvula 110. Se observa que, mientras que solamente la válvula 110 se identifica específicamente por un número, el sistema 100, como se muestra en la figura 5, ilustra un número de válvulas que son identificables al tener una estructura ilustrada idéntica a esa de la válvula 110. Además, se reconocerá que, mientras que cada uno de la pluralidad de medios/válvulas de control de flujo son idénticos en la figura 5 con propósitos ilustrativos, los medios de control de flujo de acuerdo con la presente invención pueden tomar una variedad de modalidades y pueden incluir uno o más tipos diferentes de medios/válvulas en un sistema único. Los componentes del sistema 100 (por ejemplo, válvulas, bomba, unidad de separación, etc.) pueden acoplarse o conectarse por una o más vías de flujo para formar una serie de vías de fluido o circuitos de fluido similares a los descritos anteriormente. El sistema incluye, además, un sistema de control por ordenador o unidad 112 que proporciona la supervisión y/o el control de uno o más aspectos del sistema 100.
El sistema de control por ordenador 112, tal como se describió anteriormente, puede incluir uno o más dispositivos de entrada y/o salida, pantallas gráficas, interfaces de usuario y puede permitir el control manual y/o automático del funcionamiento y las funciones del sistema 100. El sistema de control por ordenador 112 puede incluir un módulo o sistema para procesar información (por ejemplo, información de flujo, etc.) dentro del sistema 100, y puede incluir una amplia variedad de ordenadores, componentes o electrónicos patentados y/o disponibles comercialmente que tienen una o más estructuras de procesamiento y similares, con tales sistemas que a menudo comprenden un equipo y/o programa de procesamiento de datos configurados para implementar cualquiera o una combinación de las etapas de los métodos como se describió en la presente descripción. El programa comprenderá, típicamente, un código de instrucciones de programación, legible por la máquina, incorporadas en un medio tangible tal como una memoria, medios de grabación digital u ópticos, señales telemétricas ópticas, eléctricas, o inalámbricas, o similares, y una o más de estas estructuras pueden usarse, además, para emitir o transmitir datos, señales o información entre los componentes del sistema en cualquiera de una amplia variedad de arquitecturas de procesamiento de señales.
El sistema puede incluir también varios soportes, sensores, carcasas, etc. para diversos componentes que pueden acoplarse con el presente sistema para realizar los métodos como se describió en la presente descripción. El sistema 100 incluye, además, una o más estructuras de soporte 114 configuradas para sostener y/o soportar varios fluidos, reactivos, muestras de depósitos de fluido, filtros y similares, que pueden usarse con el sistema 100 de acuerdo con la presente invención. Las estructuras de soporte pueden incluir varias configuraciones de gancho o suspensión, o soporte (por ejemplo, soporte de filtro o carcasa) y no se limitan a ningún diseño particular. Los fluidos, tampones, reactivos, etc. colocados sobre un soporte 114 pueden acoplarse a una vía de fluido o tubería, que puede conectarse a su vez a más o más componentes del sistema 100. El sistema 100 puede incluir sensores para supervisar y/o controlar adicionalmente el flujo de fluido a través del sistema. Los sensores pueden incluir, por ejemplo, sensores de líquido, que pueden incluir detectores de burbujas (detector ultrasónico), sensores de presión y similares. Se muestra el detector de burbujas 116 y los sensores de presión 118. Se muestra un soporte 120, que puede configurarse para contener un filtro o unidad de reducción de volumen. El área de recolección 122 puede soportar contenedores de recolección, reactivos, etc.
El sistema 100 se ilustra adicionalmente con respecto a la Figura 6. La unidad de procesamiento 104 puede incluir una carcasa o cubierta 124, que puede moverse (por ejemplo, extraerse) alrededor de una o más bisagras. La cubierta 124 define, al menos parcialmente, un área de procesamiento 126 que puede controlarse por temperatura y acoplarse a componentes de supervisión y control de temperatura que pueden alojarse dentro de la carcasa 105 del sistema 100. La unidad de procesamiento 104 incluye una cámara de muestra 128 configurada para el soporte y procesamiento de una muestra (por ejemplo, centrifugación, cultivo, separación de los componentes de muestra, etc.). La cámara de muestra 128 que se muestra es una cámara giratoria, que se mantiene en su posición alrededor de un eje, que puede incluir un bloqueo antirotación 130. La unidad de procesamiento 104 puede incluir uno o más sistemas de detección, tal como un detector óptico 132 ubicado dentro de la cubierta 124 y configurado para detectar o supervisar el procesamiento de una muestra en la cámara 128. Una o más líneas de entrada/salida de fluido pueden acoplarse a la cámara 128 y pueden mantenerse en posición mediante un soporte 134.
La Figura 7 ilustra una vista trasera del sistema 100. La unidad de control por ordenador 112 se muestra con un componente acoplado a la carcasa del sistema 105 alrededor de un pivote rotacional, y la unidad 112 que tiene una ranura 138 de entrada de medios de almacenamiento (por ejemplo, tarjeta de programación). Se muestra el gancho 140, que puede proporcionar soporte para componentes externos, equipos de recolección, etc. El sistema 100 incluye conexión de energía y conmutador 142 y varias conexiones de interfaz 144 (por ejemplo, conexión de lector de código de barras, conexión de impresora, conexión de red, etc.); ventilación 146; y el disipador de calor 148 que proporciona un componente de los sistemas de control interno de temperatura.
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Los componentes de una unidad de procesamiento, incluyendo una cámara de muestra, se describen adicionalmente con respecto a las Figuras 8 a 12. Con respecto a la Figura 8, se ilustra la cámara de procesamiento 150 con una porción superior 152 y una porción de base inferior 154. La porción superior 152 puede incluir una estructura de refuerzo o soporte 156. La cámara 150 incluye, además, un eje 158 alrededor del cual gira la cámara 150, el eje 158 tiene una cerradura rotacional y el eje 158 se extiende a través del centro de la cámara 150 y se extiende hacia fuera de la parte superior 152. Los medios de rotación o cojinete 160 proporcionan un movimiento de rotación de la cámara 150 alrededor del eje 158. La cámara 150 incluye, además, puertos de fluido o conexiones de línea 162, 164 acoplados a una estructura de carcasa que rodea el eje 158, y los puertos 162, 164 conectados de manera fluida a uno o más compartimentos internos de la cámara de procesamiento 150.
Uno de los puertos puede usarse como ventilación para el intercambio de gases.
Una cámara de procesamiento de acuerdo con otra modalidad de la presente invención se describe con respecto a la figura 9. La cámara 170 incluye una porción superior 172 y una porción inferior 174, con un eje de rotación 176 y los puertos 178, 180 configurados de manera similar como se describió anteriormente. La porción superior 172 incluye una estructura de soporte 182, así como también la estructura 184 que incluye un canal 186 que puede incluir al menos una porción visible a través de una ventana o prisma 188.
El canal 186 puede acoplarse de manera fluida a un compartimiento que contiene la muestra en la cámara 170 y configurarse para la supervisión externa o la detección del procesamiento de la muestra. Por ejemplo, un componente (por ejemplo, células) en el fluido en el canal 186 puede separarse visiblemente durante las etapas de procesamiento, lo que indica, de esta manera, la separación de las células o de los componentes de muestra en uno o más compartimentos internos de la cámara.
La cámara 170 puede comprender, además, al menos una ventilación, que comprende preferentemente una membrana o tapón hidrófobo estéril. Preferentemente, estas membranas o tampones pueden situarse en la parte superior o inferior de la cámara. La al menos una ventilación en la cámara tiene la ventaja particular que el volumen en la cámara puede cambiarse fácilmente sin cambiar la presión en la cámara o proporcionar puertos adicionales de entrada y/o salida para el intercambio de aire o gas.
Las centrífugas de la presente invención permiten una centrifugación por lotes, así como también una continua: las muestras, medios, gases y otros materiales pueden entrar y salir del sistema, por ejemplo, a través de los puertos de entrada y salida (por ejemplo, 178 y 180 en la Fig. 1) sin necesidad de detener la rotación de la cámara de centrifugación y rellenar la centrífuga (centrifugación por lotes). Esto permite una concentración continua de la muestra y el producto puede eliminarse sólo una vez al final de la centrifugación, por tanto, se evita la contaminación potencial debido a la manipulación adicional.
En la figura 9a, se muestra un contenedor giratorio o cámara de centrifugación 500. En la parte inferior de la cámara giratoria 500 se coloca una zona de enfoque de microscopio 505 que comprende al menos una almohadilla de sensor 504. Debajo de la cámara giratoria 500 se encuentra un módulo de cámara de microscopio 503 que comprende un microscopio óptico 501 y un motor para accionar el microscopio 502 para enfocar la óptica. El microscopio óptico 501 se configura de manera que puede enfocarse automáticamente para detectar la muestra que se separa en al menos dos componentes durante la centrifugación. De esta manera, el módulo de la cámara de microscopio 503 puede usarse para detectar diferentes capas formadas por la muestra separada en la cámara 500 debido a las fuerzas centrífugas. Además, puede medirse el valor de pH de los componentes de la muestra. Para este propósito, se usa un indicador en la cámara 500 que cambia su color en dependencia del valor de pH que está presente. Además, es posible medir la temperatura de la muestra en la cámara se mediante el uso de cristales líquidos que se ubican en la cámara de manera que su posición pueda detectarse con un módulo de cámara de microscopio 503 desde el exterior. Así, puede determinarse la temperatura en la cámara 500.
El módulo de cámara de microscopio 503 puede montarse de forma móvil, de manera que el módulo 503 puede dirigirse con su microscopio óptico 501 a diferentes sensores de almohadilla 504 ubicados en la pared de la cámara 500. Esto facilita la detección de varias capas formadas en la cámara 500 o la detección del pH o la temperatura en diferentes posiciones dentro de la cámara 500.
La Figura 10 ilustra una vista en sección transversal de una cámara de procesamiento de muestras de acuerdo con una modalidad de la presente descripción. La cámara 190 incluye una porción superior 192 y una porción de base 194, y uno o más compartimentos internos. La cámara 190 se configura para girar alrededor de un eje para aplicar una fuerza centrífuga a una muestra dispuesta en uno o más compartimentos en la cámara, con lo cual se separan al menos dos componentes de la muestra. La cámara incluye la línea central 196 conectada de manera fluida a al menos un compartimento de la cámara. Los componentes de la cámara 190 incluyen, además, la línea externa 198; el cojinete giratorio 200, las juntas giratorias 202, 204, 206; la línea de entrada exterior a la cámara 205; el canal radial inferior 208; la línea de entrada interior 210 a un compartimento de la cámara; inclinación 212 y deflector 214. El retenedor de cámara 216 se incluye y configura para un posicionamiento/acoplamiento seguro de la cámara 190 con los otros componentes de un sistema de la invención. La cámara de centrifugación 190 comprende, preferentemente, una junta giratoria, opcionalmente con dos líneas de fluido, preferentemente, con dos líneas de fluido. Las líneas de fluido pueden
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entrar en la cámara 190 en diferente posición. Por ejemplo, es posible colocar una primera línea de fluido en el perímetro exterior de la parte superior 192 (tapa). Una segunda línea de fluido podría situarse más hacia adentro, por ejemplo, de 2 mm a 20 mm más hacia el centro de la cámara 190. Opcionalmente, puede situarse una ventilación en la porción superior 192, por ejemplo, en forma de una membrana.
Generalmente, la posición de las aberturas tales como puertos o entradas de línea en la cámara de centrifugación puede configurarse de manera que sea la más adecuada para la centrifugación de una muestra particular. En dependencia de los componentes de una muestra particular, y del volumen relativo de cada componente en la muestra, las aberturas pueden ubicarse de manera que pueda lograrse la eliminación y/o la detección de un componente particular.
La Figura 10A ilustra una vista en planta superior de una cámara 201. La cámara 201 incluye una línea interna 203, un canal radial inferior 205, una entrada de la línea interior 207 a la cámara, opcionalmente un deflector 209, una inclinación 211 y un paso de luz 209.
La Figura 11 ilustra una vista en sección transversal de una cámara de acuerdo otra modalidad de la presente invención. La cámara 220 incluye un eje alrededor del cual, rota la cámara, una conexión de línea central 222 y una conexión de línea exterior 224, y uno o más compartimentos internos. Se ilustran, además, el cojinete giratorio 226, así como también el sello giratorio 228, 230, 232; el canal interior 234, el canal de detección óptica 236 (similar a lo descrito anteriormente); la línea de entrada interior 238 a la cámara; la línea interior 240, y el canal radial inferior 242. La cámara incluye también un refuerzo interior 246 y un retenedor de la cámara 248. La Figura 11A ilustra una vista enfocada de la parte de una cámara 220 que se ha descrito anteriormente. Se muestran un canal de detección óptico 236, un prisma 237, y un paso de luz 239 (indicado además por flechas).
En otra modalidad de la presente invención, la parte inferior de la cámara puede tener una o más aberturas (Fig. 12A, 291) cubiertas con una membrana hidrófoba 292. Estas aberturas pueden usarse para suministrar gases dentro o eliminarlos de la cámara, por ejemplo, para los procesos de cultivos de células. La membrana puede pegarse térmicamente, ultrasónicamente o unirse por otros medios a la parte inferior de la cámara en una forma que asegure la conexión estéril con la cámara.
En otro ejemplo (Fig. 12B), la cámara puede tener un sistema de canales para el flujo de gases, por ejemplo, canales ensamblados como un sistema en espiral 293, que asegura un área de contacto grande entre los gases y la membrana unida sobre los canales (no mostrado). Estos canales pueden ubicarse en la parte inferior o en la parte superior de la cámara. El sistema de canales tiene al menos una entrada (abertura) 294 y una salida opcional (abertura) 295 para los gases.
Las entradas o puertos de los canales de las Figs. 8-11A pueden variar en número y ubicación dentro del canal.
La Figura 12 muestra una vista en sección transversal de una cámara de acuerdo con otro ejemplo. La construcción de la cámara 250 es similar en muchos aspectos a las cámaras descritas anteriormente, pero incluye, además, una pluralidad de estructuras estratificadas 252. Las estructuras estratificadas 252 pueden configurarse para proporcionar estructuras o capas para el cultivo de células. En uso, la muestra que incluye células puede introducirse en la cámara y fluir sobre las capas 252. El proceso de separación puede incluir la rotación de la cámara de manera que las células que se adhieren a las capas se separan de estas con menor afinidad por las capas. La rotación y/o rotura intermitente durante la rotación pueden desunir adicionalmente las células cultivadas de la superficie de las estructuras estratificadas 252 para el procesamiento de separación. Sorprendentemente, se encontró también que este proceso intermitente es capaz de suspender el material biológico unido o agrupado, como las células después del cultivo. La cámara incluye, además, la línea central ilustrada 251, la línea externa 253, el cojinete 255, los sellos giratorios 257, la entrada de la línea exterior 259 a la cámara, la porción superior 261, el canal interior 263, la porción de la base 265, el retenedor. 267, el canal radial inferior 269 y la línea de entrada 271 a la cámara.
La cámara puede comprender o puede fabricarse de diversos materiales. En un ejemplo, se usan materiales transparentes como plásticos, poliestirol (PS), poliestereno, cloruro de polivinilo, policarbonato, vidrio, poliacrilato, poliacrilamida, polimetilmetacrilato (PMMA) y/o tereftalato de polietileno (PET). Politetrafluoretileno (PTFE) y/o poliuretano termoplástico (TPU), silicona o composiciones que comprenden uno o más de los materiales mencionados anteriormente. Además, la cámara puede fabricarse de polietileno (PE). En un ejemplo, las capas en la cámara comprenden o se fabrican de derivados de colágeno, quitina, alginato y/o ácido hialurónico. Además, son posibles poliactida (PLA), poliglicólido (PGA) y sus copolímeros, que son biodegradables. Alternativamente, pueden usarse materiales no biodegradables, tales como poliestirol (PS), poliestereno, policarbonato, poliacrilato, polietileno (PE), polimetilmetacrilato (PMMA) y/o tereftalato de polietileno (PET). Pueden usarse, además, politetrafluoroetileno (PTFE) y/o poliuretano termoplástico (TPU). Otras alternativas incluyen materiales de cerámica y de vidrio, como hidroxilapatita (HA) o fosfato de calcio. Las capas en la cámara pueden ser de material sólido o poroso.
En un ejemplo, la cámara tiene un tamaño de 2 cm a 50 cm de diámetro y una altura de 5 mm a 50 cm. La centrifugación se realiza, preferentemente, hasta 1000 xg.
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El número de capas y la distancia entre las capas es variable.
En un ejemplo, la cámara puede calentarse y enfriarse para proporcionar una temperatura adecuada para centrifugar la muestra. Para este propósito, un medio de calentamiento y/o enfriamiento se ubica en el sistema.
Como se muestra en la Figura 17, la cámara de centrífuga de forma cilíndrica puede estar limitada en su lado superior por una tapa 800, que puede llevar una o más nervaduras de estabilización 805 sobre la superficie superior plana. Al menos una de estas nervaduras radiales 805 puede cubrir una brecha estrecha o canal 801, abierto al volumen interior de la centrífuga cuando la tapa 800 se ajusta sobre la cámara de centrífuga. La brecha 801 se extiende en dirección axial desde la superficie de la tapa interior pasando la tapa 800 algunos milímetros hacia la nervadura 805. Por tanto, cuando se usa material transparente puede verse desde el exterior dentro de la nervadura 805. En la extensión radial, la brecha 801 alcanza desde cerca del centro hasta la pared cilíndrica de la centrífuga (Fig. 17).
Durante la centrifugación, las mismas fuerzas surten efecto en la brecha 801 como en la cámara de centrifugación completa. Las capas de suspensión en forma de anillos colindantes se extienden paralelas en la brecha 801 y se muestran como zonas delgadas en posición colindante al eje, como una capa fina cortada en cruz, bien detectable por los sensores ópticos externos.
El ancho de la brecha 801 puede determinarse libremente, también lo suficientemente pequeño para un análisis de luz transmitida de todas las áreas asociadas a la capa en la brecha. Así, es posible cuantificar las densidades ópticas y los colores de todas las capas de la suspensión en la cámara de centrífuga de una manera "sin contacto" desde el exterior a través de mediciones de transmisión óptica.
Para permitir una iluminación vertical y la posición del sensor para observar los movimientos de las capas en la brecha, puede añadirse una ventana, un espejo o, preferentemente, un prisma sobre ambos lados de la nervadura, que puede preformarse, preferentemente, por el propio material de la carcasa transparente.
El prisma 810 refracta el haz luminoso vertical generado a través de la brecha (horizontal) y regresa a la parte superior, de nuevo vertical (Fig. 18). Durante la centrifugación, una luz de destello electrónico activada por posición síncrona puede transmitir luz a un lado del prisma 810, por ejemplo, el prisma izquierdo, que ilumina la brecha por refracción. El resultado de la transmisión se refracta por el otro lado del prisma 810, por ejemplo, el prisma derecho, de vuelta a un sensor o cámara montada verticalmente, posiblemente cerca de la fuente de destello superior en la parte superior. La unidad de sensor óptico resultante es fácil de manejar como un sensor reflejo, pero al mismo tiempo permite realizar mediciones de transmisión a escala completa.
La disposición de los ángulos del prisma asegura la "reflexión total" sobre la superficie interior del prisma por los rayos de destellos de iluminación y evitan los reflejos directos sobre sus superficies exteriores entre la fuente de luz y la cámara. Por tanto, no es necesario el recubrimiento de espejos y las tecnologías de moldeo por inyección pueden usarse sin el remodelado de las instalaciones que se requieren (Fig. 19).
Otro ejemplo se describe con referencia a la Figura 13. Como se ilustra, un sistema de procesamiento incluye diversos componentes acoplados, canales de flujo, tampones, reactivos, etc. Se reconocerá que existen numerosas configuraciones disponibles y que la configuración actual se proporciona con fines ilustrativos. Con respecto a la Figura 13, los componentes incluyen un sistema tampón 300, puerto de espiga 301, filtro estéril 302, bolsa de plasma/en proceso 303, contenedor de reactivo para marcado magnético 304, puerto de espiga 305, filtro estéril para el reactivo magnético 306, filtro estéril 307, bolsa de medio/tampón 308, puerto para el medio de cultivo de células, puerto auxiliar 309, válvula de única dirección hacia abajo 310 que posiblemente incluye un filtro, válvula de única dirección hacia arriba 311, bolsa de muestra 312, conector de bolsa de muestras 313, filtro de muestras 314, puerto de muestra 315, filtro 316, filtro de separación previa 320, bolsa de almacenamiento en proceso 321, columna de separación magnética 322, bolsa de desecho 323, unidad de reducción de volumen 324, bolsa de fracción positiva 325, bolsa de fracción negativa 326, filtro de aire estéril 327, bomba 328, filtro de aire para el sensor de presión 1 329, filtro de aire para el sensor de presión 2 330, unidad de procesamiento de muestra/células 332.
Un uso típico de un sistema como el que se ilustra en la Figura 13 y se describe anteriormente, se discute con respecto a las figuras 14A a 14N. La activación de varios componentes del sistema puede seleccionarse para dirigir el flujo a lo largo de una vía deseada. El flujo seleccionado se ilustra con respecto a las Figuras 14A a 14N y se muestra por las vías de flujo oscurecidas y flechas de dirección de flujo. La Figura 14A ilustra la carga de la muestra en una cámara de procesamiento/giratoria de la unidad de procesamiento de muestra. La muestra fluye desde la fuente de la muestra a través de las válvulas abiertas 5, 9, 16 y a través de la bomba y hacia la unidad de procesamiento. La Figura 14B ilustra el aclarado de las líneas/componentes del sistema, con el tampón que fluye a través de las válvulas abiertas 1, 9, 16, bomba y hacia la unidad de procesamiento. La muestra y el tampón pueden fluir como se ilustra, la muestra se centrifuga en la unidad de procesamiento para separar los componentes y se repite el proceso de aclarado. La Figura 14C ilustra la reducción y la eliminación de las células rojas de la sangre de la muestra. Como se indicó anteriormente, la muestra puede centrifugarse en la unidad de procesamiento para separar los componentes, incluyendo la formación de una capa leucocitaria para la separación de las células rojas de la sangre. Después, el componente de células rojas de la sangre puede eliminarse de la unidad de procesamiento y fluye a través del sistema por las válvulas abiertas 17,
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12 y hacia el contenedor de desecho. La Figura 14D ilustra la eliminación del plasma de la cámara en la unidad de procesamiento, donde el enjuague del plasma/componente fluye a través del sistema por las válvulas abiertas 16, 12 y hacia el contenedor de desecho. La Figura 14E ilustra la recolección de plasma, cuando el plasma se elimina de la unidad de procesamiento, fluye a través del sistema por las válvulas abiertas 16, 9, 4 y hacia un contenedor de recolección de plasma. La Figura 14F ilustra la carga del reactivo en la cámara y el marcado de las células. El reactivo (por ejemplo, el marcado magnético) fluye a través del sistema por las válvulas abiertas 2, 9, 16 y hacia la cámara. Las células pueden procesarse (por ejemplo, agitarse, reconstituirse, mezclarse con reactivo, etc.) para la incubación con el reactivo de marcado. La Figura 14G ilustra la adición de plasma dentro de la cámara. El plasma procedente del contenedor de plasma fluye a través del sistema por las válvulas abiertas 4, 9, 16 y hacia la cámara. Pueden preformarse etapas de procesamiento, aclarado adicionales etc. (por ejemplo, como se ilustra en la figura 14B). La Figura 14H ilustra la separación magnética de componentes marcados y no marcados de la muestra. La muestra/células marcadas suspendidas fluye a través del sistema a través de la válvula abierta 16, a través de un filtro o (pre-)columna (por ejemplo, un filtro de separación basado en el tamaño, para eliminar las aglomeraciones de células), válvulas abiertas 7, 11, a través de la columna magnética donde se unen las células marcadas, con células primariamente no marcadas que fluyen a través de la válvula abierta 19 y hacia el contenedor para células no marcadas/negativas. La Figura 14I ilustra el lavado de la columna donde el tampón fluye a través del sistema por las válvulas abiertas 1, 15, 7, 11, 19 y hacia el contenedor de células. Las etapas de lavado se seleccionan para lavar las células no marcadas de la columna de separación magnética/sistema. La Figura 14J ilustra la elución de células de la columna y la nueva aplicación. La aplicación magnética se desactiva y el fluido fluye como se ilustra a través de las válvulas abiertas 11, 10, 14, por ejemplo, a altas velocidades, para lavar las células de la columna. La aplicación del campo magnético se vuelve a activar para volver a unir las células marcadas a la columna de separación magnética. La Figura 14K ilustra el aclarado de la columna con un tampón de elución. El tampón fluye como se ilustra para lavar preferentemente las células no marcadas de la columna de separación y hacia el contenedor de desecho. La Figura 14L ilustra el lavado de la columna para eliminar las células marcadas desde la columna y hacia la bolsa para una nueva aplicación. Como se muestra, el campo magnético se desactiva para liberar las células marcadas de la columna. La Figura 14M ilustra las etapas de reducción de volumen. La solución que contiene las células fluye como se ilustra para pasar la solución a través del filtro F7. El filtro incluye un filtro de membrana que recoge las células a medida que la solución fluye. La Figura 14N ilustra la elución final y la recolección del producto en el contenedor de recolección. El plasma fluye como se ilustra a través de las válvulas abiertas 4, 9, 14, 18, y el fluido pasa a través del filtro F7 para lavar las células desde el filtro y hacia el contenedor de recolección positivo.
El conjunto de tubos de la presente invención puede usarse para la administración de medio nutriente, citoquinas, factores de crecimiento, suero y otras sustancias necesarias para el cultivo de las células, o para extraer muestras de la cámara de cultivo. El medio nutriente puede suministrarse continuamente o periódicamente dentro de la cámara o retirarse de la cámara a través de los puertos 222 y 224 (Fig. 11) con el uso de la bomba 328 (Fig. 13) o con el uso de jeringas adicionales que se conectan al conjunto de tubos. El medio puede intercambiarse total o parcialmente con medio fresco durante el proceso de cultivo de células. El medio puede enriquecerse con O2, CO2, N2, aire u otros gases necesarios para el crecimiento de las células. El enriquecimiento del medio puede realizarse por inyección directa de los gases en la cámara de cultivo a través de los puertos 222 o 224 (Fig. 11), a través de una abertura adicional en la parte inferior de la cámara de cultivo recubierta con una membrana hidrófoba (Fig. 12A y 12B) y/o mediante el uso de un dispositivo de aireación, situado fuera de la cámara de cultivo (Fig. 15).
Un ejemplo de tal dispositivo de aireación se representa en la Figura 15. Este consta de dos partes (415 y 416) fabricadas, por ejemplo, de policarbonato (PC) o polimetacrilato (PMMA) con canales grabados en un lado. Las dos partes se unen para formar un espacio hueco entre ellas, separado en dos o más compartimentos por al menos una membrana (417). La membrana puede unirse a una de las partes o varias membranas pueden unirse en ambas partes. Los compartimentos contienen al menos un puerto de entrada (418) y un puerto de salida (419) para la conexión con el conjunto de tubos. El primer compartimento se usa para la mezcla de gases. El segundo compartimento se usa para el medio nutriente, que tiene que enriquecerse con los componentes de la mezcla de gases. La membrana ubica entre los dos compartimientos es permeable para los gases y no es permeable para los líquidos. Preferentemente, esta es una membrana hidrófoba, por ejemplo, membrana hidrófoba de nailon. Preferentemente, los poros de la membrana hidrófoba son más pequeños que 0,2 pm, lo que asegura una conexión estéril entre el medio nutriente y la mezcla de gases. En otra modalidad del dispositivo de aireación, una o más membranas adicionales pueden unirse a cualquiera de las partes representadas en la Fig. 15, de manera que el gas fluye entre los compartimentos que contienen el medio. En este caso, la superficie de contacto entre el medio y la mezcla de gases es mayor en función del número del número de membranas usadas.
Las membranas del dispositivo de aireación pueden unirse a las partes por medio de unión térmica, unión ultrasónica o pegado, u otro proceso de unión adecuado, que permita una conexión estéril entre las partes plásticas y la membrana.
El dispositivo de aireación puede esterilizarse por medio de irradiación (por ejemplo, radiación gamma, beta), plasma (por ejemplo, peróxido de hidrógeno), vapor/vapor caliente (por ejemplo, autoclave) o esterilización con óxido de etileno (EtO). Preferentemente, el dispositivo de aireación se usa como parte del conjunto de tubos desechables.
La composición de gas usada para el dispositivo de aireación se compone, preferentemente, mediante el uso de una cámara de mezcla de gases. Una modalidad preferida de la cámara de mezcla de gases se muestra en la Fig. 16 A.
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Esta consiste en dos partes (421 y 422), preferentemente fabricadas de material plástico, por ejemplo, POM (polioximetileno), que se conectan con pernos, se pegan térmicamente o se unen ultrasónicamente entre sí, de manera que formen un espacio hueco entre ellas. Preferentemente, una de las partes contiene un canal para un anillo de obturación, que asegura el sellado entre ambas partes (433, Fig. 16B). La cámara de mezcla de gases tiene al menos un puerto de entrada y al menos un puerto de salida (423). Esta comprende un puerto (430) para la conexión de un dispositivo sensor de presión para medir la presión dentro de la cámara. La cámara de mezcla de gases contiene opcionalmente otro puerto (432, Fig. 16b) para la conexión con una válvula de seguridad, que se abre automáticamente, cuando la presión en la cámara sube sobre un cierto valor. La cámara de mezcla de gases tiene entradas y salidas (435) para la conexión con al menos una válvula de entrada y al menos una válvula de salida, así como también perforaciones roscadas (436) para la conexión de las válvulas de entrada y de salida a las paredes de la cámara de mezcla de gases.
Para la reducción del régimen de flujo de los gases en y/o fuera de la cámara de mezcla de gases, las mezclas pueden estar opcionalmente incluidas en las paredes.
Principio de funcionamiento de la cámara de mezcla de gases: los puertos de entrada de la cámara de mezcla de gases se conectan con un suministro de gases. El suministro de los gases de entrada debe tener una presión superior a la presión atmosférica, por ejemplo, 2 bar. El operario debe proporcionar el contenido de la composición de gases deseada mediante el uso de un programa de ordenador de medición y automatización. El contenido de cada uno de los gases de la composición deseada se da como la presión parcial de ese gas en la mezcla de gases. El proceso de composición de gases comienza con el primer componente de la mezcla de gases, el que se controla por la válvula de entrada 424 (Fig. 16A). La válvula de entrada se abre durante un período de tiempo, por lo general entre 50 ms y 200 ms, y después se cierra y se lee el sensor de presión. La presión que se mide en la cámara es Pm. Si la presión Pm < P1, donde P1 es la presión dada por el operario, la válvula de entrada se abre otra vez. El proceso se repite hasta Pm >= P1. Después, se abre la válvula de entrada 425 y la composición del segundo componente de gas tiene lugar como se describió en el caso de la válvula de entrada 424. Cuando todos los gases de entrada están compuestos en la cámara de mezcla, la válvula de salida 427 se abre hasta que la presión en la cámara de mezcla de gases alcanza un valor Psalida, proporcionado por el operario de manera preliminar. Psalida es siempre igual a la presión atmosférica o más alto. El tiempo y la frecuencia de la abertura de la válvula de salida pueden proporcionarse, además, por el operario. Después, el proceso de composición de gases comienza de nuevo con la abertura de la primera válvula de entrada (424). Las válvulas de salida 428 y 429 pueden usarse opcionalmente para la aireación de otras cámaras de cultivo de células, bolsas u otros recipientes usados en la presente descripción. La cámara de muestras permite realizar una amplia variedad de métodos de cultivo de células, tales como el crecimiento de células, la separación, el lavado, el enriquecimiento de células o diferentes tipos de células, u otros. Además, el sistema de la descripción puede usarse para formular fármacos.
La obtención de preparaciones celulares necesarias para la terapia celular puede incluir varias combinaciones de operaciones básicas para obtener un producto celular definido con características definidas. Es único en la invención que todas estas operaciones básicas pueden realizarse en un único conjunto de tubos cerrados, lo que elimina los riesgos de las etapas manuales para la transferencia de muestras, requeridas de cualquier otra manera.
Las condiciones de cultivo de células para los ejemplos son conocidas en la técnica.
Las características descritas en la presente descripción pueden ser de relevancia para la realización de la presente invención en cualquier combinación.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar, pero no limitan la invención.
Ejemplo 1: Obtención de injertos de células madre y progenitoras de la sangre del cordón umbilical.
La sangre del cordón umbilical humano se diluye con tampón CliniMACS PBS/EDTA, el volumen de marcado definido se ajusta por centrifugación, se añade el reactivo CD34 o CD133 de CliniMACS y se deja incubar con la muestra de células durante el tiempo de marcado especificado, el reactivo de acceso se elimina mediante lavado en la cámara de centrifugación, las células positivas a CD34 o CD133 se enriquecen a partir de la suspensión celular y se eluyen directamente de la columna MACS con el medio de cultivo celular y se transfieren a la cámara de cultivo de células. Los suplementos de medios (albúmina de suero humano, citoquinas) se añaden automáticamente desde el frasco unido al conjunto de tubos. Las células madre enriquecidas o aisladas se cultivan hasta por tres semanas. El medio de cultivo de células suplementado se añade intermitentemente. Las células de la sangre de cordón umbilical expandidas se lavan por centrifugación para eliminar el medio de cultivo celular y las células se resuspenden en solución de infusión (solución salina) suplementada con albúmina de suero humano y se transfieren al contenedor del producto final (bolsa de infusión o jeringa).
Ejemplo 2: Obtención de vacuna de células dendríticas
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La cosecha de sangre entera humana o aféresis se diluye con tampón CliniMACS PBS/EDTA, el volumen de marcado definido se ajusta por centrifugación, se añade el reactivo CD14 de CliniMACS y se deja incubar con la muestra de células durante el tiempo de marcado especificado, se retira el reactivo de acceso mediante lavado en la cámara de centrifugación, los monocitos positivos para CD14 se enriquecen a partir de la suspensión celular y se eluyen de la columna MACS directamente con el medio de cultivo celular y se transfieren a la cámara de cultivo de células. Los suplementos de medios (albúmina de suero humano, citoquinas) se añaden automáticamente desde el frasco unido al conjunto de tubos. Los monocitos enriquecidos o aislados se cultivan en células dendríticas inmaduras derivadas de monocitos. Los medios se intercambian por centrifugación y se añaden automáticamente suplementos adicionales desde el contenedor unido al conjunto de tubos. Las células se cultivan y después de la maduración se añaden automáticamente antígenos (proteína recombinante, péptidos, lisados celulares, ADN) desde el frasco unido al conjunto de tubos. Las células dendríticas derivadas de monocitos se cultivan para el procesamiento de antígenos. El medio de cultivo celular se elimina mediante centrifugación y las células se resuspenden en solución de infusión (solución salina) suplementada con albúmina de suero humano y se transfieren al contenedor de producto final (bolsa de infusión o jeringa).
Ejemplo 3: Obtención de una vacuna de células dendríticas de la sangre mDC y pDC
La cosecha de la aféresis se diluye con tampón CliniMACS PBS/EDTA automáticamente reducido en CD19 y posteriormente se enriquecen para CD304 (BDCA-4, CD1c, Neurofilina-1) o CD1c (BDCA-1) a través de la columna MACS. Las DC se eluyen directamente de la columna MACS con el medio de cultivo celular y se transfieren a la cámara de cultivo de células. Los suplementos de medios (albúmina de suero humano, citoquinas, componentes activadores como proteína recombinante, péptidos, lisados celulares, ADN) se añaden automáticamente desde el contenedor unido al conjunto de tubos y las células se cultivan durante 24 horas para lograr una maduración y activación óptimas. El medio de cultivo celular se elimina mediante centrifugación y las células se resuspenden en solución de infusión (solución salina), opcionalmente suplementada con albúmina de suero humano, y se transfieren al contenedor del producto final (bolsa de infusión o jeringa). El contenedor del producto se elimina del conjunto de tubos de la invención para usar posteriormente.
Ejemplo 4: Obtención de células T con especificidad antigénica
La cosecha de sangre entera humana o aféresis se lava y se diluye con medio de cultivo celular y se transfiere a la cámara de cultivo celular. El antígeno (proteína recombinante, conjunto de péptidos o lisado de células tumorales) y suplementos de medios (albúmina de suero humano, citoquinas) se añaden automáticamente desde los frascos unidos al conjunto de tubos. Las células y el antígeno se cultivan durante 3-16 horas para estimular nuevamente a las células T con especificidad antigénica. El volumen de la suspensión celular definido para el marcado se ajusta por centrifugación, se añade el reactivo IFN-gamma Catchmatrix de CliniMACS y se deja incubar con la muestra de células durante el tiempo de marcado especificado y el reactivo de acceso se elimina mediante lavado en la cámara de centrifugación. Las células se transfieren hacia contenedor de cultivo de células y se incuban para la liberación de citoquinas. El volumen de la suspensión de células definido para el marcado se ajusta mediante centrifugación, se añade el Reactivo de Enriquecimiento IFN-gamma de CliniMACS y se deja incubar con la muestra de células durante el tiempo especificado para el marcado, se elimina el reactivo de acceso mediante lavado en la cámara de centrifugación, las células con especificidad antigénica se enriquecen magnéticamente a partir de la suspensión de células, y se concentran hasta un pequeño volumen inyectable por elución directa de la columna MACS mediante el uso de una solución de infusión suplementada, y se transfieren al contenedor del producto final (bolsa de infusión o jeringa).
Ejemplo 5: Obtención de células asesinas naturales activadas
La cosecha de sangre entera o aféresis se diluye con tampón PBS/EDTA de CliniMACS, se ajusta al volumen de marcado definido por centrifugación, se añade el reactivo CD3 de CliniMACS y se deja incubar con la muestra de células durante el tiempo de marcado especificado, se retira el reactivo de acceso mediante lavado en la cámara de centrifugación, las células positivas para CD3 se eliminan de la suspensión de células. Las células objetivo negativas para CD3 se ajustan al volumen de marcado, se añade el reactivo cD56 de CliniMACS y se deja incubar con la muestra de células durante el tiempo de marcado especificado, se elimina el reactivo de acceso mediante lavado en la cámara de centrifugación, se enriquecen las células positivas para CD56 y se eluyen directamente de la columna MACS con el medio de cultivo celular y se transfiere a la cámara de cultivo celular. Los suplementos de medios (albúmina de suero humano, citoquinas tales como IL-2 y/o IL-15) se añaden automáticamente desde el frasco unido al conjunto de tubos. Las células NK enriquecidas o aisladas se cultivan durante 8-48 horas. El medio de cultivo celular se elimina del producto celular mediante centrifugación y las células se resuspenden en solución de infusión (solución salina) suplementada con albúmina de suero humano y se transfieren al contenedor del producto final (bolsa de infusión o jeringa).
Ejemplo 6: Obtención de células naturales asesinas expandidas
La cosecha de sangre entera o aféresis se diluye con tampón PBS/EDTA de CliniMACS, se ajusta al volumen de marcado definido por centrifugación, se añade el reactivo CD3 de CliniMACS y se deja incubar con la muestra de células durante el tiempo de marcado especificado, se retira el reactivo de acceso mediante lavado en la cámara de
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centrifugación, las células positivas para CD3 se eliminan de la suspensión de células. Las células objetivo negativas para CD3 se ajustan al volumen de marcado, se añade el reactivo cD56 de CliniMACS y se deja incubar con la muestra de células durante el tiempo de marcado especificado, se elimina el reactivo de acceso mediante lavado en la cámara de centrifugación, se enriquecen las células positivas para CD56 y se eluyen directamente de la columna MACS con el medio de cultivo celular y se transfiere a la cámara de cultivo celular. Los suplementos de medios (albúmina de suero humano, citoquinas) se añaden automáticamente desde el frasco unido al conjunto de tubos. Las Perlas para la Expansión Celular cargadas con anticuerpos dirigidos contra CD2 y CD335 (NKp46) o CD314 (NKG2D) y CD335 (NKp46) se transfieren desde el frasco al compartimiento de cultivo celular. Las células NK enriquecidas o aisladas se cultivan durante una semana, comenzando el día 7, el medio de cultivo celular suplementado se añade cada 3 días en una relación de 1:1 y las células se cultivan hasta el día 14-21.
Las células NK expandidas se pasan por la columna MACS para eliminar las perlas de expansión celular. Opcionalmente, las células NK expandidas se purifican adicionalmente por reducción de CD3 o enriquecimiento de CD56 (ver más arriba). El medio de cultivo celular se elimina del producto celular mediante centrifugación y las células se resuspenden en solución de infusión (solución salina) suplementada con albúmina de suero humano y se transfieren al contenedor del producto final (bolsa de infusión o jeringa).
Ejemplo 7: Obtención de células T auxiliadoras expandidas
La cosecha de sangre entera o aféresis se diluye con tampón PBS/EDTA de CliniMACS, se ajusta al volumen de marcado definido por centrifugación, se añade el reactivo CD4 de CliniMACS y se deja incubar con la muestra de células durante el tiempo de marcado especificado, el reactivo de acceso se elimina por lavado en la cámara de centrifugación, las células positivas para CD4 se enriquecen y se eluyen directamente de la columna MACS con medio de cultivo celular y se trasfieren hacia la cámara de cultivo de células. Los suplementos de medios (albúmina de suero humano, citoquinas) se añaden automáticamente desde el frasco unido al conjunto de tubos. Las Perlas para la Expansión Celular cargadas con anticuerpos dirigidos contra CD2, CD3 y CD28 o alternativamente CD3 y CD28 se transfieren desde el frasco al compartimiento de cultivo de células. Las células T auxiliadoras aisladas se cultivan, comenzando el día 3, se añade medio de cultivo celular suplementado cada 2 días en una relación 1:1 y las células se cultivan hasta el día 14. Las células T expandidas se pasan por la columna MACS para eliminar las perlas de expansión celular. El medio de cultivo celular se elimina del producto celular por centrifugación y las células se resuspenden en solución de infusión (solución salina) opcionalmente suplementada con albúmina de suero humano y se transfiere al contenedor del producto final (bolsa de infusión o jeringa). El contenedor del producto se elimina del conjunto de tubos de la invención para usar posteriormente.
Ejemplo 10: Selección de células madre positivas para CD133
El antígeno CD133 es un marcador de células madre y se expresa específicamente en un subgrupo de células CD34+ inmaduras, en células progenitoras endoteliales circulantes y en un subgrupo de células madre CD34- (De Wynter y otros, 1998). Las células positivas para CD133 enriquecidas o aisladas mediante el uso del sistema CliniMACS para CD133 se usan para la expansión ex vivo de células progenitoras hematopoyéticas de sangre del cordón umbilical, y en trasplantes autólogos (Pasino y otros, 2000) y alogénicos (Kohl y otros, 2002).
Las células madre CD133+ pueden usarse en aplicaciones no hematológicas para medicina regenerativa. Las células CD133 seleccionadas de la médula ósea han devenido en foco de atención, por ejemplo, con respecto al tratamiento de las enfermedades cardiacas isquémicas (Stamm y otros, 2003).
El enriquecimiento o el aislamiento de células CD133+ resulta en una eliminación de células no deseadas de más de 99,4 % (2,2 log). Ver Tabla 1.
Tabla 1: Las células positivas para CD133 se aislaron a partir de médula ósea mediante el uso de la presente invención:
Volumen de partida [ml]
Frecuencia de partida CD133+ Pureza Final CD133+ Reducción logarítmica de CD133- Número final de células CD133+ Rendimiento de CD133+
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0,51% 56,54% 2,2 5,5E5 60,89%*
42
0,26% 51,15% 2,5 1,3E6 87,32%*
53
0,62% 66,16% 2,7 2,5E6 56,65%
34
0,26% 48,89% 2,3 8,4E5 77,96%*
62
0,55% 60,51% 2,7 1,8E6 54,04%
(* calculado en relación a las células CD133 recuperadas en todas las bolsas)
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Para la comparación, todos los productos de médula ósea se procesaron, además, con el uso del Sistema CliniMACS® CD133 con resultados similares.
Los diagramas de puntos en la Figura 20 muestran las características de la muestra antes (izquierda) y después (derecha) del procesamiento automatizado mediante el uso de la presente invención.
Ejemplo 11: Selección de Células Positivas para CD14
El antígeno CD14 pertenece al complejo del receptor de LPS y los monocitos expresan fuertemente el antígeno. Los monocitos CD14 seleccionados pueden usarse para la generación posterior de células dendríticas derivadas de monocitos humanos (MoDCs; Campbell y otros, 2005). Las células dendríticas tienen un gran potencial como vacunas celulares para varias enfermedades, que incluyen tumores sólidos, neoplasias malignas hematológicas, infecciones virales y enfermedades autoinmunitarias.
Se aislaron monocitos a partir de la cosecha de dos leucaféresis mediante el uso de la presente invención y el reactivo CD14 de CliniMACS. Los monocitos se enriquecieron de 19,7 % / 31,8% (cosechas sin procesar) a 98,2% / 99,7% (producto celular final) con un rendimiento de 58 % / 21 % (ver la Figura 21).
Las MoDC se generaron a partir de monocitos aislados mediante el uso de la presente invención y mostraron características idénticas a las MoDC generadas de monocitos aislados con CliniMACS.
Los monocitos se aislaron también de la capa leucocitaria de sangre entera humana mediante el uso de la presente invención y pudieron enriquecerse desde 9,8 % (capa leucocitaria no procesada) hasta 98,9 % de pureza (producto celular final) con un rendimiento de monocitos del 64 %.
Ejemplo 12: Selección de CD304
En la sangre periférica, las CD304 (BDCA-4, Neurofilina-1) se expresa en células dendríticas plasmacitoide humanas (PDC). Las PDC son las células productoras más potentes de Interferón Tipo I (Dzionek y otros, 2002). Las células CD304 puede usarse directamente para enriquecer o aislar células dendríticas de sangre periférica sin un período de cultivo (como para MoDC).
El enriquecimiento o el aislamiento de células objetivo positivas para CD304 requiere etapas de lavado prolongadas que consumen tiempo usando el procedimiento de preparación de muestras CliniMACS en una centrífuga de bolsa de sangre. El procesamiento automatizado de muestras facilitará el uso de células CD304 aisladas en ensayos de vacunación.
Se aislaron o se enriquecieron células positivas para CD304 a partir de la cosecha de dos leucaféresis mediante el uso de la presente invención y el reactivo CD304 de CliniMA CS. Las PDC se enriquecieron de 0,29 % a 34,4 % con un rendimiento de 30 % y de 0,43 % a 80,5 % con un rendimiento de 39 %.
Las Células Dendríticas Plasmacitoides del segundo procedimiento se cultivaron durante 24 horas con CPG C (ODN2395) e IL-3 o solamente con IL-3 para inducir la maduración. Las células cultivadas se analizaron para determinar los marcadores de maduración CD40 y CD80 y el perfil de marcadores fue idéntico a las PDC positivas para CD304 aisladas mediante el uso del sistema CliniMACS para CD304 tras el cultivo.
Ejemplo 13: Selección de células positivas para CD4
CD4 es una molécula accesoria en el reconocimiento de antígenos extraños por las células T en asociación con los antígenos del MHC clase II. Las células T auxiliadoras y en un menor grado los monocitos y las células dendríticas expresan CD4.
Para ciertos contextos oncológicos, los datos preliminares sugieren que las células T en un injerto o como infusión de linfocitos donantes pueden ser beneficiosas (Falkenburg y otros, 1999). En estas configuraciones puede desearse una selección de CD4 o reducción de CD8 (ver el ejemplo 5) en la configuración de trasplante alogénico. Las células T auxiliadoras pueden ser capaces de generar respuestas antitumorales, reducir el riesgo de Enfermedad del Injerto contra el Huésped (Alyea y otros. 1998), y reconstituir el sistema inmune del receptor (Bellucci y otros, 2002).
Las células T auxiliadoras positivas para CD4 desempeñan, además, un papel significativo en la infección y progresión del HIV. Las células T auxiliadoras seleccionadas (potencialmente después de una modificación genética) pueden desearse para el tratamiento de las complicaciones del HIV.
Se aislaron o se enriquecieron células positivas para CD4 a partir de tres productos de capa leucocitaria de sangre entera humana mediante el uso de la presente invención y el reactivo CD4 de CliniMACS. Las células T auxiliadoras se enriquecieron de 27 % / 8,6 % /15,9 % a 90 % / 80 % / 81,3 % de pureza con un rendimiento de 93 % / 98 % / 51 %.
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Estos resultados se encuentran bien adentro del intervalo de los resultados que se obtienen mediante el uso del Sistema CliniMACS para CD4.
Ejemplo 14: Reducción de Células Positivas para CD8
El antígeno CD8, un correceptor para las moléculas del MHC de clase I, se expresa en células T citotóxicas y débilmente en un subgrupo de las células NK.
En el contexto de trasplante alogénico, las células T CD8 pueden eliminarse de una infusión de linfocitos de injerto o donante con el objetivo de prevenir la Enfermedad del Injerto contra el Huésped a la vez que se mantienen los efectos del Injerto contra la Leucemia (Meyer y otros, 2007).
Las células T citotóxicas positivas para CD8 se redujeron de tres productos de capa leucocitaria mediante el uso de la presente invención y el reactivo CD8 de CliniMACS. Las células T citotóxicas se redujeron de 11.5 % / 8 % / 12 % a
0. 005.% / 0,004 % / 0,002 %, respectivamente. Esto representa una reducción de >99,97 % (>3,5 log) de células no deseadas. Las células objetivo negativas para CD8 se recuperaron casi completamente (85,1 % / 90,9 % / 94,4 %).
Ejemplo 15: Preparación de células mononucleares de sangre periférica mediante centrifugación con gradiente de densidad
El Ficoll-Paque™ es un medio de densidad estéril para el aislamiento de células mononucleares a partir de médula ósea, sangre periférica y sangre del cordón umbilical. Es una solución acuosa de densidad 1,077 g/ml, que consiste en Ficoll PM400 (un polisacárido altamente ramificado, de alta masa, hidrófilo), diatrizoato de sodio y EDTa disódico de calcio. Los eritrocitos y los granulocitos tienen una densidad mayor que 1,077 g/ml, mientras que los linfocitos y los monocitos tienen una densidad más baja. Cuando la sangre humana se estratifica en la parte superior del Ficoll-Paque, los linfocitos y monocitos pueden separarse de los eritrocitos y granulocitos bajo la fuerza centrífuga.
La presente invención ha sido usada para la preparación de células mononucleares de sangre periférica por centrifugación en gradiente de densidad. La capa leucocitaria de sangre entera humana se estratificó sobre un anillo de Ficoll-Paque al mismo tiempo que rotaba la cámara de centrifugación. La velocidad de rotación se ajustó a 2,900 giros por minuto y se mantuvo durante 20 minutos. Pudo detectarse un anillo externo de eritrocitos y granulocitos, un anillo de Ficoll-Paque, un anillo de células objetivo (células mononucleares de sangre periférica, es decir, linfocitos y monocitos) y un anillo interno de plaquetas que contenía plasma sanguíneo y tampón PBS. Las diferentes capas se eliminaron de la cámara de centrifugación de la presente invención a través de los puertos luer y se analizaron para determinar el contenido de las diferentes células. Se recuperó el 70 % de las PBMC del producto sanguíneo original a partir de la capa de PBMC. Esta suspensión celular contenía solamente 1,1 % de las células rojas de la sangre originales. Por tanto, la presente invención puede usarse para la preparación automatizada de células mononucleares de sangre periférica (segundo anillo) o plasma rico en plaquetas (anillo interno).
Ejemplo 16: Cultivo de células
La cámara de centrifugación de la presente invención puede usarse para el cultivo de células, de manera similar a los frascos o bolsas de cultivo de células. A una cámara de centrifugación se aplicaron 3,2E5/ml células de la línea de células humanas K562, en un volumen de 30 ml de medio de cultivo celular RPMI1640 suplementado con suero fetal bovino al 10 %. La cámara se colocó en una incubadora de CO2 a 5 % de CO2. Se retiraron alícuotas del contenido de la cámara para el recuento celular y la evaluación de la viabilidad después de 24, 48 y 70 horas. Las células sembradas se expandieron a 4,1 E5/ml, 6,4E5/ml y 9,2E5/ml de células viables a 80 %, 95 % y 95 % de viabilidad.
Ejemplo 17: Método para la separación de células CD133+ mediante el uso de un sistema de la presente invención.
El procedimiento completo de separación de células CD133+ comprende diversas etapas con las siguientes tareas:
1. Cebar el conjunto de tubos con tampón
2. Transferir la muestra de médula ósea a la cámara de centrifugación
3. Preparar la muestra de médula ósea en la cámara de centrifugación.
4. Realizar la separación magnética de las células CD133+
5. Reducir el volumen final
En lo que sigue, se describirán en detalle varias etapas.
1. Cebar el conjunto de tubos con tampón
En una primera etapa, el conjunto de tubos se ceba con PEB (solución salina tamponada con fosfato suplementada con 2 mmol/l de EDTA, HSA al 0,5 %).
2. Transferir la muestra de médula ósea a la cámara de centrifugación
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Después de cebar el conjunto de tubos, la muestra de médula ósea se transfiere de la bolsa de muestras 312 a la cámara de centrifugación 332.
3. Preparar la muestra de médula ósea en la cámara de centrifugación.
La preparación de la muestra en la cámara de centrifugación incluye varias etapas donde el sobrenadante se elimina de la cámara. Durante la eliminación del sobrenadante sólo debe transferirse el sobrenadante libre de células o el sobrenadante con plaquetas, en el caso del lavado de plaquetas. El objetivo de esto es evitar que las células blancas de la sangre (WBC), y por tanto las células CD133+ se eliminen junto con el sobrenadante. La preparación de la muestra incluye las siguientes etapas:
- generar el plasma
- reducir las plaquetas
- incubar con Microperlas CD133 (Miltenyi Biotec, Alemania)
- eliminar Microperlas CD133 sin unir
Generación del plasma:
El plasma que se genera al comienzo del proceso de preparación de la muestra cumple las dos funciones siguientes:
1. actuar como un reactivo de bloqueo que bloquea los receptores Fc de monocitos e impide que la porción Fc de los anticuerpos anti CD133 unidos a las microperlas se unan a los monocitos. Esto conduciría a una reducción de la pureza del producto del proceso de separación inmunomagnética por monocitos, y
2. actuar como un suplemento para el tampón en el que se suspende el producto celular final. Esto proporciona un entorno más fisiológico para el producto celular que el tampón usado solo. Para la generación y recolección de plasma, la muestra se centrifuga hasta que la mayoría de los componentes celulares del material, como eritrocitos (RBC), células blancas (WBC) y plaquetas sedimentan. El sobrenadante libre de células es el que se transfiere a un contenedor (303) que actúa como un depósito.
Para la generación de plasma, el material celular se centrifuga a 2000 rpm en la cámara de centrifugación hasta que todos los componentes celulares del material como WBC, RBC y las plaquetas sedimentan. La generación de plasma requiere una centrifugación que conduce a un sobrenadante con concentraciones celulares tan bajas como sea posible y por tanto una sedimentación casi completa de todos los componentes celulares de la sangre. El tiempo de sedimentación depende del volumen de la muestra que se determina automáticamente durante la transferencia de la muestra a la cámara de centrifugación. El tiempo de sedimentación para diferentes volúmenes de muestra se muestra en la tabla 2:
Tabla 2:
Tiempo de sedimentación para diferentes volúmenes de suspensión en el proceso de generación de plasma
Intervalo de volumen
Volumen máximo Radio de capa límite aire/líquido Tiempo de sedimentación
< 100 ml
100 ml 5,21 cm 8,01 min “ 8 min
100 ml < V < 125 ml
125 ml 4,99 cm 11,82 min = 12 min
125 ml < V < 150 ml
150 ml 4,77 cm 15,98 min = 16 min
150 ml < V < 175 ml
175 ml 4,53 cm 20,57 min = 21 min
175 ml < V < 200 ml
200 ml 4,28 cm 25,69 min “ 26 min
Después de la centrifugación a 2000 rpm, la velocidad de rotación se redujo suavemente a 1000 rpm con una velocidad de desaceleración de 632 rpm/min. Después se elimina el plasma con una velocidad de la bomba de 6 ml/min hasta que se bombea aire fuera de la cámara. El sobrenadante libre de células se transfiere a un contenedor que actúa como un depósito. Después, el plasma puede transferirse desde el contenedor al sitio en el proceso en el que se usa el flujo a través de un filtro con 0,2 pm para eliminar todas las células residuales que no se eliminaron durante la centrifugación.
Reducción de plaquetas:
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Ya que la generación de plasma elimina el sobrenadante completo en la cámara, un volumen residual de 70 ml está en la cámara. Se añaden 150 ml de PEB para diluir la suspensión lo que resulta en un volumen total de 220 ml. Después, el tambor se acelera hasta 2000 rpm y la sedimentación se ejecuta durante 100 segundos para sedimentar los RBC y WBC antes de que el tambor se desacelere a 1000 rpm con una velocidad de desaceleración de 632 rpm/min. Dentro de este tiempo de sedimentación, solo una pequeña porción de las plaquetas llega al gránulo cuando comienza la desaceleración de la cámara. Luego, el sobrenadante completo se elimina a una velocidad de 6 ml / min. El análisis de la muestra y del sobrenadante eliminado mostró una eliminación plaquetaria determinada experimentalmente de 50,8 %. Las plaquetas restantes se eliminan mediante el uso de un filtro (310).
Incubación con Microperlas CD133
Las microperlas CD133 se proporcionan en frascos de vidrio que tienen un tabique. Para asegurar condiciones asépticas, se integra un filtro con tamaño de poro de 0,2 pm (306) dentro de la rama del conjunto de tubos conectados al contenedor. El frasco se conecta al conjunto de tubos mediante un adaptador de contenedor ventilado (305). Cuando el reactivo se bombea a la cámara, se controla la presión dentro de la parte del conjunto de tubos situada delante del tambor. Cuando el frasco funciona vacío, el aire se mueve al filtro. Como el filtro se humedece por el reactivo, los poros aún están llenos de líquido cuando el aire se mueve dentro del filtro. Debido a las fuerzas capilares el aire no puede pasar la membrana del filtro. Como la bomba continúa su funcionamiento, la caída de presión se detecta por el sensor de presión (329) y el programa detiene la bomba. De este modo combinado con una etapa de aclarado para eliminar el reactivo residual, el reactivo se transfiere automáticamente a la suspensión celular en la cámara.
Después de la transferencia de plasma para los propósitos de bloqueo, el volumen se ajusta a un volumen de marcado de 95 ml y comienza la incubación. En el proceso de preparación de muestras convencional, la bolsa de preparación de muestras tiene que colocarse en un agitador orbital e incubarse durante 30 minutos a temperatura ambiente. El proceso de incubación con el sistema de la presente invención se realiza como sigue:
1. El tambor se acelera a una velocidad de 300 rpm. Esto hace que el líquido se mueva a la pared de la cámara.
2. Se realiza la centrifugación durante 10 segundos.
3. Después de esto, el tambor se detiene. El líquido retrocede y tiene una superficie alineada horizontalmente.
4. La cámara continúa hasta detenerse durante 50 segundos.
5. Las Etapas 1 - 4 se repiten hasta que transcurre el tiempo de incubación de 30 minutos.
Este proceso conduce a un mezclado eficaz del líquido en la cámara.
Eliminación de las microperlas anti-CD133 no unidas:
El lavado de las microperlas se realiza para eliminar el reactivo no unido después del marcado e incubación. En el proceso de lavado se repiten las siguientes etapas tres veces:
1. PEB se transfiere a la centrífuga para diluir la suspensión, lo que resulta en un volumen total de 230 ml
2. La sedimentación de RBC y WBC se lleva a cabo a 2000 rpm durante 140 segundos
3. La velocidad de la cámara se reduce de 2000 rpm a 1000 rpm
4. El sobrenadante se elimina completamente a una velocidad de 20 ml/min
El proceso de lavado de las perlas consistirá en tres etapas de lavado y se eliminará al menos el 97,2 % del reactivo no unido.
4. Separación magnética de las células CD133+
Después del proceso de lavado de las perlas, las células CD133+ se separan mediante el uso de una columna de separación magnética (columna CliniMACS, Miltenyi Biotec GmbH, Alemania). Por lo tanto, la suspensión celular se transfiere a la columna de separación con una velocidad de carga de 5 ml/min. Las células marcadas magnéticamente se retienen en la columna magnetizada y se separan de las células no marcadas mediante el aclarado de la columna con PEB. Las células CD133+ retenidas se eluyen mediante la eliminación del campo magnético de la columna. Las células CD133+ se bombean en un lazo del conjunto de tubos y se vuelven a cargar en la columna de separación. Este proceso se repite una vez más y después del tercer proceso de recarga, las células CD133+ se eluyen finalmente en 20 ml de tampón de elución (ver la tabla 3 y la Fig. 26). La velocidad de elución es 600 ml/min.
5. Reducir el volumen final
Para la terapia cardiaca con células madre, las células CD133+ deben disponerse en un pequeño volumen final de 6 ml como máximo. Normalmente, las células CD133+ se eluyen finalmente de la columna CliniMACS en 20 ml de tampón de elución. Para la reducción del volumen final, son posibles tres métodos: El volumen final de células CD133+ aisladas o enriquecidas puede reducirse mediante
1. elución de la columna en un pequeño volumen,
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2. filtrar después de la separación magnética, o
3. usar la columna AutoMACS (Miltenyi Biotec GmbH, Alemania).
Elución de la columna en un pequeño volumen:
En lugar de la elución en 20 ml de tampón de elución, las células CD133+ pueden eluirse de la columna CliniMACS en 6 ml de tampón de elución. La velocidad de elución es de 600 ml/min. Este método se probó mediante el enriquecimiento de células CD133+ a partir de la médula ósea. Las células enriquecidas se determinaron mediante análisis de FACS (ver la tabla 4 y Fig. 27).
Filtración después de la separación magnética
Después de la elución de la columna de separación CliniMACS en 20 ml de tampón de elución, las células CD133+ pueden transferirse sobre un filtro (Pall IV-5, 0,2 pm o RoweFil 24, 1.2 pm) a una velocidad de 4 ml/min. Posteriormente, las células se eluyen del filtro en 2 ml. Este método se probó por enriquecimiento de células CD133+ a partir de la médula ósea. Las células enriquecidas se determinaron por análisis de FACS (ver la tabla 5 y la Fig. 28).
Reducción de volumen final mediante el uso de la columna AutoMACS
Después de la elución de la columna CliniMACS, las células CD133+ pueden cargarse en una columna autoMACS a una velocidad de 4 ml/min. Posteriormente, las células CD133+ retenidas se eluyen en 4 ml de la columna autoMACS. Este método se probó por enriquecimiento de células CD133+ a partir de la médula ósea. Las muestras enriquecidas se determinaron mediante análisis de FACS (ver la tabla 6 y la Fig. 29).
Tabla 3: Elución directa de las células CD133+ en 20 ml.
Volumen de partida [ml]
Frecuencia de partida CD133+ Pureza Final CD133+ Reducción log, de CD133- Número final de células CD133+ Rendimiento de CD133+*
91
0,39% 82,95% 3,4 2,89E6 49,57%
86
0,67% 66,99% 2,8 5,72E6 56,67%
129
0,31% 82,6% 3,4 4,11E6 43,42%
57
0,76% 59,18% 2,3 5,1E6 72,24%
61
0,14% 74,72% 3,2 4,25E5 84,32%
114
0,37% 88,19% 3,4 1,79E6 50,08%
77
0,74% 83,5% 3 2,12E6 58,56%
Tabla 4: Elución directa de las células CD133+ en 6 ml.
Volumen de partida [ml]
Frecuencia de partida CD133+ Pureza Final CD133+ Reducción log de CD133- Número final de células CD133+ Rendimiento de CD133+*
87
0,67% 62,79% 2,7 2,78E6 51,22%
129
0,31% 81,12% 3,6 1,25E6 33,6%
128
0,66% 57,25% 2,6 2,31E6 26,86%
Tabla 5: Concentración de células CD133+ mediante filtración después de la separación magnética.
Volumen de partida / volumen final [ml]
Frecuencia de partida CD133+ Pureza Final CD133+ Reducción log de CD133- Número final de células CD133+ Rendimiento de CD133+*
91 / 3,79
0,39% 66,08% 1,2 6,27E5 25,3%
86 / 3,67
0,67% 60,1% 1,5 1,59E6 31,6%
129 / 3,66
0,31% 76,04% 1,2 8,18E5 26,6%
Tabla 6: Concentración de las células CD133+ mediante el uso de la columna AutoMACS.
Volumen de partida / volumen final [ml]
Frecuencia de partida CD133+ Pureza Final CD133+ Reducción log de CD133- Número final de células CD133+ Rendimiento de CD133+*
57/ 2,78
0,76% 71,3% 0,9 2,35E6 39,9%
61 / 5,68
0,14% 82,84% 0,4 1,73E5 43,1%
114 / 5,64
0,37% 93,57% 0,7 8,51E5 28,6%
(* calculado en relación a las células CD133+ recuperadas en todas las bolsas)

Claims (10)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    Reivindicaciones
    1. Un sistema (100), que comprende:
    a) una unidad de procesamiento de muestra (104, 332), que comprende
    un contenedor giratorio (500) que tiene al menos una cámara de muestra (128) para contener y procesar una muestra, en donde el contenedor giratorio (500) comprende un medio para detectar el progreso de la separación (188; 237; 810) de al menos un primer componente y un segundo componente de una muestra depositada en el contenedor giratorio (500), y
    un puerto de entrada y un puerto de salida acoplado al contenedor giratorio (500), en donde la unidad de procesamiento de muestras (104, 332) se configura
    - para girar el contenedor (500) para aplicar una fuerza centrífuga a la muestra depositada en la cámara (128) y separar al menos el primer componente y el segundo componente de la muestra depositada; y
    b) una unidad magnética de separación de muestra (106)
    acoplada al puerto de salida de la unidad de procesamiento de muestras (104, 332), la unidad de separación de muestras (106) comprende
    - un soporte de la columna de separación (42),
    - una bomba (64), y
    - una pluralidad de válvulas (1-11; 12, 14, 15, 16; 17; 18; 19; 110; 310, 311; 424, 425; 427, 428, 429) configurada para controlar al menos parcialmente el flujo de fluido a través de un circuito de fluido, y
    - una columna de separación (2; 40; 322) colocada en el soporte (42),
    en donde la columna de separación (2; 40; 322) se configura para separar los componentes de muestra marcados y no marcados magnéticamente que fluyen a través de la columna (2; 40; 322).
  2. 2. El sistema (100) de acuerdo con la reivindicación 1, en donde
    los medios para detectar el progreso de la separación (188; 237; 810) se ubican de manera que
    - la luz de una fuente de luz puede penetrar al menos parcialmente a través de al menos una parte de la muestra que se está separando, y
    - la luz que pasa a través de al menos una parte de la muestra puede ser detectada por un detector de luz (132).
  3. 3. El sistema (100) de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde
    los medios para detectar el progreso de la separación (188; 237; 810) se ubican en el contenedor giratorio (500) esencialmente perpendicular a un eje de rotación del contenedor giratorio (500).
  4. 4. El sistema (100) de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en donde
    los medios para detectar el progreso de la separación (188; 237; 810) se ubican en el contenedor giratorio (500) que llega esencialmente desde un área adyacente al eje de rotación del contenedor giratorio (500) a un área adyacente al perímetro del contenedor giratorio (500).
  5. 5. El sistema (100) de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, en donde
    los medios para detectar el progreso de la separación en el contenedor giratorio (500) es una ventana, un prisma (188; 237; 810) o un espejo.
  6. 6. El sistema (100) de acuerdo con la reivindicación 5, en donde
    el prisma (188; 237; 810) o espejo se ubican para cubrir un canal (186; 205; 236; 801) formado en la tapa (192; 800) del contendor giratorio (500), en donde el canal (186; 205; 236; 801) se configura de manera que al menos una parte de la muestra pueda fluir dentro del canal durante la centrifugación.
  7. 7. El sistema (100) de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, en donde
    el contenedor giratorio (500) se configura de manera que pueda usarse para cultivar células.
  8. 8. El sistema (100) de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, en donde
    el contenedor giratorio (500) comprende al menos una capa para que las células crezcan sobre la misma.
  9. 9. El sistema (100) de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, en donde el contenedor giratorio (500) es desechable y/o puede ser esterilizado.
  10. 10. El sistema (100) de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9, en donde
    el contenedor giratorio (500) comprende un material seleccionado del grupo que consiste en: plásticos, poliestireno, cloruro de polivinilo, policarbonato, vidrio, poliacrilato, poliacrilamida, polimetilmetacrilato,
    30
    5
    10
    15
    20
    25
    tereftalato de polietileno, politetrafluoretileno, poliuretano termoplástico, silicona, polietileno, colágeno, quitina, alginato, derivados del ácido hialurónico, poliácido, poliglicólido y sus copolímeros, cerámicas, materiales de vidrio, como hidroxilapatita y fosfato de calcio, y composiciones que comprenden uno o más de los materiales mencionados anteriormente.
    Un método que comprende:
    - proporcionar un sistema (100) de las reivindicaciones 1 a 10;
    - realizar una etapa de procesamiento para separar al menos un primer componente y un segundo componente de una muestra; y
    - realizar una etapa de separación a un componente procesado de la muestra, la separación comprende separar los componentes marcados y no marcados magnéticamente a partir del componente procesado de la muestra
    mientras el sistema no está conectado a un paciente.
    El método de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende, además:
    detectar el progreso de la separación, particularmente mediante la detección de la formación de capas de la muestra, el cambio del valor de pH y/o el cambio de temperatura.
    El método de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en donde
    la muestra es una muestra biológica, particularmente, sangre, médula ósea, células, componentes celulares, productos de leucoféresis, tumores o fragmentos de los mismos, tejido, microorganismos, bacterias, hongos o virus.
    Un programa de ordenador, particularmente cuando se ejecuta en un ordenador, para controlar un sistema de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10 para realizar un método de acuerdo con las reivindicaciones 11 a 13.
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