BR112020008340A2 - processo para gerar composições terapêuticas de células modificadas - Google Patents

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Nathan Yee
Pascal BEAUCHESNE
Mark L. Bonyhadi
Ryan L. Crisman
Ryan P. LARSON
Mary MALLANEY
Christopher Glen RAMSBORG
Clinton WEBER
John Matthew WESNER
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Abstract

A presente invenção refere-se a métodos para geneticamente modificar células T, tais como células T CD4+, para uso em terapia celular. Em alguns aspectos, os métodos fornecidos incluem uma ou mais etapas para incubar as células sob condições de estimulação, introduzir um polipeptídeo recombinante às células através de transdução ou transfecção, e cultivar as células sob condições que promovam a proliferação e / ou expansão. Em alguns aspectos, a incubação e / ou o cultivo são realizados na presença de IL-2 recombinante. Em alguns aspectos, os métodos fornecidos são um meio eficiente, confiável para produzir células T geneticamente modificadas com um alto grau de sucesso.

Description

Relatório Descritivo da Patente e Invenção para "PRO- CESSO PARA GERAR COMPOSIÇÕES TERAPÊUTICAS DE CÉ- LULAS MODIFICADAS". Referência Cruzada a Pedidos Relacionados
[001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório Norte-americano 62/580.409, depositado em 1 de novembro de 2017, intitulado "PROCESS FOR GENERATING THERAPEUTIC COMPOSITIONS OF ENGINEERED CELLS," Pedido de Patente Pro- visório Norte-americano No. 62/596.771, depositado em 8 de dezem- bro de 2017, intitulado "PROCESS FOR GENERATING THERAPEU- TIC COMPOSITIONS OF ENGINEERED CELLS," e Pedido de Paten- te Provisório Norte-americano No. 62/721.603, depositado em 22 de agosto de 2018, intitulado "PROCESS FOR GENERATING THERA- PEUTIC COMPOSITIONS OF ENGINEERED CELLS," o teor dos quais é aqui incorporado por referência em sua íntegra para todos os propósitos. Incorporação por Referência de Listagem de Sequência
[002] O presente pedido está sendo deositado juntamente com uma Listagem de Sequência em formato eletrônico. A Listagem de Sequências é fornecidas como um arquivo intitulado 735042013240SeqList.txt, criado em 31 de outubro de 2018 que é de 35,994 bytes de tamanho. A informção no formato eletrônico da Lista- gem de Sequências é incorporada por referência em sua íntegra. Campo
[003] A presente invenção fornece métodos para geneticamente modificar células T, tais como células T CD4+ e / ou células T CD8+, para uso em terapia celular. Em alguns aspectos, os métodos forneci- dos incluem uma ou mais etapas para incubar as células sob condi- ções de estimulação, introduzir um polipeptídeo recombinante às célu- las através de transdução ou transfecção, e cultivar as células sob condições que promovem a proliferação e / ou expansão. Em alguns aspectos, a incubação e / ou o cultivo é realizado na presença de IL-2 recombinante. Em alguns aspectos, os métodos fornecidos sçai um meio eficiente, confiável para produzir células T geneticamente modifi- cadas com um alto grau de sucesso. Antecedente
[004] Vários métodos de terapia celular estão disponíveis para o tratamento de doenças e condições. Entre métodos de terapia celular estão métodos envolvendo células imunes, tais como células T, gene- ticamente modificadas com um receptor recombinante, tais como re- ceptores de antígeno quimérico. Métodos melhorados para fabrica- ção e / ou modificação tais como terapias celulares são necessários, incluindo prover um processo mais eficiente e / ou um produto de composição celular melhorado. São fornecidos métodos, kits e artigos de fabricação que atendem a tais necessidades. Sumário
[005] São fornecidos em alguns aspectos métodos para a produ- ção de uma composição de células modificadas, os métodos envol- vem: (a) incubar, sob condições de estimulação, uma composição de entrada contendo células T enriquecidas para células T humanas pri- márias CD4+, as referidas condições de estimulação incluindo a pre- sença de (i) um reagente estimulatório capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR e / ou um ou mais domínios de sinalização intrace- lular de uma ou mais moléculas coestimulatórias e (ii) uma ou mais citocinas, em que pelo menos uma citocina é ou inclui IL-2 humana recombinante, desse modo gerando uma composição estimulada; e (b) introduzir um receptor recombinante na composição estimulada, desse modo gerando uma composição modificada contendo células T modifi- cadas.
[006] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos aqui, a composição de entrada inclui mais que ou mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cer- ca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T humanas primárias CD4+; e / ou a composição de entrada consiste essencialmente em células T humanas primárias CD4+. Em algumas modalidades, a concentração de IL-2 recombinante é de 10 IU/mL a 200 IU/mL ou de cerca de 10 a cerca de 200 IU/mL. Em algumas modalidades dos métodos forneci- dos aqui, as referidas uma ou mais citocinas também incluem IL-7 e / ou IL-15, opcionalmente em que a concentração de IL-7 é de 100 IU/mL a 1000 IU/mL ou de cerca de 100 IU/mL a cerca de 1000 IU/mL e / ou a concentração de IL-15 é de 1 IU/mL a 50 IU/mL ou de cerca de 1 IU/mL a cerca de 50 IU/mL. Em algumas modalidades dos méto- dos fornecidos aqui, a incubação é realizada na presença de um ou mais antioxidantes.
[007] São fornecidos em alguns aspectos métodos para a produ- ção de uma composição de células modificadas, o método envolve: (a) incubar uma composição de entrada contendo células T enriquecidas para uma ou ambas as células T humanas primárias CD4+ e CD8+, desse modo gerando uma composição estimulada, em que a incuba- ção é realizada: (1) sob uma ou mais condições de estimulação, as referidas condições de estimulação incluindo a presença de (i) um re- agente estimulatório capaz de ativar um ou mais domínios de sinaliza- ção intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR e / ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimulatórias e (ii) uma ou mais citocinas; e / ou (2) na presença de um ou mais antioxidantes;e (b) introduzir um receptor recombinante na composição estimulada, desse modo gerando uma composição modificada contendo células T modificadas.
[008] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos aqui, a composição de entrada inclui mais que ou mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cer- ca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% CD4+ e / ou células T humanas primárias CD8+; e / ou a composição de entrada consiste essencial- mente em CD4+ e / ou células T humanas primárias CD8+. Em algu- mas modalidades dos métodos fornecidos aqui, as referidas uma ou mais citocinas são selecionadas de IL-2 recombinante, IL-7 recombi- nante e / ou IL-15 recombinante. Em algumas modalidades, a concen- tração de IL-2 recombinante é de 10 a 200 IU/mL ou de cerca de 10 a cerca de 200 IU/mL; a concentração de IL-7 recombinante é de 100 IU/mL a 1000 IU/mL ou de cerca de 100 IU/mL a cerca de 1000 IU/mL; e / ou a concentração de IL-15 recombinante é de 1 IU/mL a 25 IU/mL ou de cerca de 1 IU/mL a cerca de 25 IU/mL.
[009] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos aqui, a composição de entrada inclui mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cer- ca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T humanas primárias CD4+; e / ou a composição de entrada consiste essencialmente em células T hu- manas primárias CD4+. Em algumas modalidades, as referidas uma ou mais citocinas são selecionadas de IL-2 recombinante, IL-7 recom- binante e IL-15 recombinante. Em algumas modalidades, a composi- ção de entrada inclui mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de
90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T humanas primárias CD8+; e / ou a com- posição de entrada consiste essencialmente em células T humanas primárias CD8+. Em algumas modalidades dos métodos fornecidos aqui, as referidas uma ou mais citocinas são selecionadas de IL-2 re- combinante e IL-15 recombinante.
[0010] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos aqui, o reagente estimulatório inclui um agente primário que especificamente se liga a um membro de um complexo TCR, opcionalmente que espe- cificamente se liga a CD3. Em algumas modalidades, o reagente esti- mulatório também inclui um agente secundário que especificamente se liga a uma molécula coestimulatória de célula T, opcionalmente em que a molécula coestimulatória é selecionada de CD28, CD137 (4-1- BB), OX40, ou ICOS. Em algumas modalidades dos métodos forneci- dos aqui, os agentes primários e / ou secundários incluem um anticor- po, opcionalmente em que o reagente estimulatório inclui incubação com um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28, ou um fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o agente primário e / ou agente secundário estão presentes na superfí- cie de um suporte sólido.
[0011] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos aqui, o suporte sólido é ou inclui uma conta. Em algumas modalidades, a con- ta tem um diâmetro de mais que ou mais do que cerca de 3,5 µm, mas não mais do que cerca de 9 µm ou não mais do que cerca de 8 µm ou não mais do que cerca de 7 µm ou não mais do que cerca de 6 µm ou não mais do que cerca de 5 µm. Em algumas modalidades, a conta tem um diâmetro de, ou cerca de 4,5 µm. Em algumas modalidades, a conta é inerte. Em algumas modalidades, a conta é ou inclui uma su- perfície de poliestireno. Em algumas modalidades, a conta é magnéti- ca ou superparamagnética. Em algumas modalidades, a relação de contas para células é menor que 3:1 ou menor do que cerca de 3:1. Em algumas modalidades, a relação de contas para células é de 2:1 a 0,5:1 ou de cerca de 2:1 a cerca de 0,5:1. Em algumas modalidades, a relação de contas para células é de, ou de cerca de 1:1.
[0012] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos aqui, os referidos um ou mais antioxidantes incluem um antioxidante contendo enxofre. Em algumas modalidades, os referidos um ou mais antioxi- dantes incluem um precursor de glutationa. Em algumas modalidades, os referidos um ou mais antioxidantes incluem N-acetil cisteína (NAC), opcionalmente em que a NAC está em uma concentração de 0,2 mg/mL a 2,0 mg/mL ou de cerca de 0,2 mg/mL a cerca de 2,0 mg/mL.
[0013] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos aqui, a introdução inclui transduzir células da composição estimulada com um vetor viral contendo um polinucleotídeo codificando o receptor recom- binante. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor retroviral. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor lentiviral ou vetor gamaretroviral. Em algumas modalidades dos métodos fornecidos aqui, a introdução é realizada na presença de um adjuvante de trans- dução. Em algumas modalidades, o adjuvante de transdução é ou compreende sulfato de protamina, opcionalmente de 1 µg/ml a 50 µg/ml ou de cerca de 1 µg/ml a cerca de 50 µg/ml sulfato de protami- na; um adjuvante de transdução derivado de fibronectina; e / ou Re- troNectina. Em outras modalidades dos métodos fornecidos aqui, a introdução inclui transfectar as células da composição estimulada with a vector contendo um polinucleotídeo codificando o receptor recombi- nante. Em algumas modalidades, o vetor é um transposon, opcional- mente um transposon Sleeping Beauty (SB) ou um transposon Piggybac.
[0014] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos aqui, o método também inclui cultivar a composição modificada sob condições para promover proliferação ou expansão das células modificadas, des- se modo produzindo uma composição de saída contendo as células T modificadas. Em algumas modalidades, o cultivo é realizado na pre- sença de uma ou mais citocinas, em que pelo menos uma citocina é ou inclui IL-2 humana recombinante. Em algumas modalidades, o rea- gente estimulatório é removido da composição modificada antes do cultivo.
[0015] Em algumas modalidades, o agente estimulatório é removi- do dentro de, ou menos de 7 dias após o início da incubação. Em al- gumas modalidades, o reagente estimulatório é removido a partir de 3 dias a 6 dias ou de cerca de 3 dias a cerca de 6 dias após o início da incubação. Em algumas modalidades, o reagente estimulatório é re- movido em, ou em cerca de 4 dias após o início da incubação. Em al- gumas modalidades, remover as contas inclui expor as céluls da com- posição modificada a um campo magnético.
[0016] Em outros aspectos são fornecidos métodos para a produ- ção de uma composição de células modificadas, o método envolve cul- tivar, na presença de uma ou mais citocinas, uma composição celular modificada contendo células T humanas primárias CD4+ que incluem células modificadas com um receptor recombinante, em que pelo me- nos uma citocina é ou inclui IL-2 humana recombinante; em que o mé- todo resulta na proliferação ou expansão de células na composição para produzir uma composição de saída contendo células CD4+ modi- ficadas. Em algumas modalidades, a proliferação ou expansão resulta em, em cerca de, ou em pelo menos um aumento de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, ou maior que 5 vezes no número de células T CD4+ modificadas com um receptor recombinante.
[0017] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, a composição celular modificada inclui mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cer- ca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T huma- nas primárias CD4+ ou células expressando o receptor recombinante CD4+; e / ou a composição celular modificada consiste essencialmente em células T humanas primárias CD4+. Em algumas modalidades dos métodos fornecidos aqui, a concentração de IL-2 recombinante é de 50 IU/mL a 500 IU/ml ou de cerca de 50 IU/mL a cerca de 500 IU/ml. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, as referidas uma ou mais citocinas também incluem IL-7 e / ou IL-15, opcionalmente em que a concentração de IL-7 é de 500 IU/mL a 2000 IU/mL ou de cerca de 500 IU/mL a cerca de 2000 IU/mL e / ou a concentração de IL-15 é de 5 IU/mL a 50 IU/mL ou de cerca de 5 IU/mL a cerca de 50 IU/mL.
[0018] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, a composição celular modificada é produzida por um método que envolve: incubar, sob condições de estimulação, uma composição de entrada contendo células T primárias enriquecidas por células T humanas primárias CD4+, as referidas condições de estimu- lação incluindo a presença de (i) um reagente estimulatório capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR e / ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimulatórias e (ii) uma ou mais citocinas, em que pelo menos uma citocina é ou inclui IL-2 humana recombinante, desse modo gerando uma composição estimulada; e (b) introduzir um receptor recombinante na composição estimulada, desse modo gerando uma composição modificada conten- do células T modificadas.
[0019] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, a composição de entrada inclui mais que ou mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T humanas primárias CD4+; e / ou a composição de entrada consiste essencialmente em células T humanas primárias CD4+. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, as referi- das uma ou mais citocinas também incluem IL-7 e / ou IL-15. Em al- gumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, o cultivo é realizado na presença de um tensoativo. Em algumas modali- dades, pelo menos uma parte do cultivo é realizada com contínua mis- tura e / ou perfusão.
[0020] Em outro aspecto são fornecidos métodos para a produção de uma composição de células modificadas, envolvendo: cultivar, na presença de uma ou mais citocinas, uma composição celular modifica- da contendo uma ou ambas as células T humanas primárias CD4+ e CD8+ que incluem células modificadas com um receptor recombinan- te, em que o cultivo é realizado na presença de um tensoativo e / ou pelo menos uma parte do cultivo é realizada com contínua mistura e / ou perfusão; em que o método resulta na proliferação ou expansão de células na composição para produzir uma composição de saída con- tendo células T CD4+ e / ou CD8+ modificadas.
[0021] Em algumas modalidades de quaisquer destes métodos descritos acima, a composição celular modificada inclui mais que ou mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cer- ca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% de células T humanas primárias CD4+ e/ou CD8+ ou células T primárias expressando receptor recombinante CD4+ e/ou CD8+; e/ou a compo-
sição celular modificada consiste essencialmente em células T huma- nas primárias CD4+ e/ou CD8+.
[0022] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, a proliferação ou expansão resulta em, em cerca de, ou em pelo menos um aumento de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, ou maior que 5 vezes no número de células T CD4+ e/ou CD8+ modi- ficadas com um receptor recombinante.
[0023] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, as referidas uma ou mais citocinas são selecionadas de IL-2 recombinante, IL-7 recombinante e/ou IL-15 recombinante. Em algumas modalidades, a concentração de IL-2 recombinante é de 50 IU/mL a 500 IU/mL ou de cerca de 50 IU/mL a cerca de 500 IU/mL; a concentração de IL-7 recombinante é de 500 IU/mL a 2000 IU/mL ou de cerca de 500 IU/mL a cerca de 2000 IU/mL; e/ou a concentração de IL-15 recombinante é de 5 IU/mL a 50 IU/mL ou de cerca de 5 IU/mL a cerca de 50 IU/mL.
[0024] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, a composição celular modificada inclui mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cer- ca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% de células T humanas primárias CD4+ ou células T humanas primárias expressan- do andreceptor recombinante CD4+; e/ou a composição celular modifi- cada consiste essencialmente em células T humanas primárias CD4+.
[0025] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, a proliferação ou expansão resulta em, em cerca de, ou em pelo menos um aumento de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, ou maior que 5 vezes no número de células T CD8+ modificadas com um receptor recombinante. Em algumas modalidades, as referidas uma ou mais citocinas são selecionadas de IL-2 recombinante, IL-7 recombinante e IL-15 recombinante.
[0026] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, a composição celular modificada inclui mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cer- ca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% de células T humanas primárias CD8+ ou células T humanas primárias expressan- do and receptor recombinante CD8+; e/ou a composição celular modi- ficada consiste essencialmente em células T humanas primárias CD8+.
[0027] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, as referidas uma ou mais citocinas são selecionadas de IL-2 recombinante e IL-15 recombinante. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, o tensoativo inclui um poloxâmero, opcionalmente em que o poloxâmero está presente em uma concentração de 0,5 µL/mL a 5 µL/mL ou de cerca de 0,5 µL/mL a cerca de 5 µL/mL. Em algumas modalidades, o poloxâmero é poloxâ- mero 188.
[0028] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, a composição celular modificada é produzida por um método que envolve: incubar, sob condições de estimulação, uma composição de entrada contendo células T primárias enriquecidas por uma ou ambas as células T humanas primárias CD4+ e CD8+, as refe- ridas condições de estimulação incluindo a presença de (i) um rea- gente estimulatório capaz de ativar um ou mais domínios de sinaliza- ção intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR e/ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimulatórias e (ii) uma ou mais citocinas, desse modo gerando uma composição estimulada; e (b) introduzir um receptor re- combinante na composição estimulada, desse modo gerando uma composição modificada contendo células T modificadas.
[0029] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, a composição de entrada inclui mais que ou mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% de célu- las T humanas primárias CD4+ e/ou CD8+; e/ou a composição de en- trada consiste essencialmente em células T humanas primárias CD4+ e/ou CD8+. Em algumas modalidades, as referidas uma ou mais cito- cinas são selecionadas de IL-2 recombinante, IL-7 recombinante e/ou IL-15 recombinante.
[0030] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, a composição de entrada inclui mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% de células T humanas pri- márias CD4+; e/ou a composição de entrada consiste essencialmente em células T humanas primárias CD4+. Em algumas modalidades, as referidas uma ou mais citocinas são selecionadas de IL-2 recombinan- te, IL-7 recombinante e IL-15 recombinante.
[0031] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, a composição de entrada inclui mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% de células T humanas pri-
márias CD8+; e/ou a composição de entrada consiste essencialmente em células T humanas primárias CD8+. Em algumas modalidades, as referidas uma ou mais citocinas são selecionadas de IL-2 recombinan- te e IL-15 recombinante.
[0032] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, o reagente estimulatório inclui um agente primário que especificamente se liga a um membro de um complexo TCR, opcio- nalmente que especificamente se liga a CD3. Em algumas modalida- des, o reagente estimulatório também inclui um agente secundário que especificamente se liga a uma molécula coestimulatória de célula T, opcionalmente em que a molécula coestimulatória é selecionada de CD28, CD137 (4-1-BB), OX40 ou ICOS.
[0033] Em algumas modalidades, os agentes primários e/ou se- cundários incluem um anticorpo, opcionalmente em que o reagente estimulatório inclui incubação com um anticorpo anti-CD3 e um anti- corpo anti-CD28, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o agente primário e/ou agente secundário estão presentes na superfície de um suporte sólido. Em algumas mo- dalidades, o suporte sólido é ou inclui uma conta. Em algumas modali- dades, a conta tem um diâmetro de mais que ou mais do que cerca de 3,5 µm, mas não mais do que cerca de 9 µm ou não mais do que cerca de 8 µm ou não mais do que cerca de 7 µm ou não mais do que cerca de 6 µm ou não mais do que cerca de 5 µm. Em algumas modalida- des, a conta inclui um diâmetro de ou cerca de 4,5 µm. Em algumas modalidades, a conta é inerte. Em algumas modalidades, a conta é ou inclui uma superfície de poliestireno. Em algumas modalidades, a con- ta é magnética ou superparamagnética. Em algumas modalidades, a relação de contas para células é menor que ou menor do que cerca de 3:1. Em algumas modalidades, a relação de contas para células é de 2:1 a 0,5:1 ou de cerca de 2:1 a cerca de 0,5:1. Em algumas modali-
dades, a relação de contas para células é de, ou de cerca de 1:1.
[0034] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, a incubação é realizada na presença de um ou mais antioxidantes. Em algumas modalidades, os referidos um ou mais an- tioxidantes incluem um antioxidante contendo enxofre. Em algumas modalidades, os referidos um ou mais antioxidantes incluem um pre- cursor de glutationa. Em algumas modalidades, os referidos um ou mais antioxidantes incluem N-acetil cisteína (NAC), opcionalmente em que a NAC está em uma concentração de 0,2 mg/mL a 2,0 mg/mL ou de cerca de 0,2 mg/mL a cerca de 2,0 mg/mL.
[0035] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, a introdução inclui transduzir células da composição estimulada com um vetor viral contendo um polinucleotídeo codifican- do o receptor recombinante. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor retroviral. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor lentiviral ou vetor gamarretroviral. Em algumas modalidades de qual- quer um dos métodos fornecidos aqui, a introdução é realizada na pre- sença de um adjuvante de transdução. Em algumas modalidades, o adjuvante de transdução é ou compreende sulfato de protamina, opci- onalmente de 1 µg/ml a 50 µg/ml ou de cerca de 1 µg/ml a cerca de 50 µg/ml de sulfato de protamina; um adjuvante de transdução derivado de fibronectina; e/ou retronectina. Em algumas modalidades de qual- quer um dos métodos fornecidos aqui, a introdução inclui transfectar as células da composição estimulada com um vetor contendo um poli- nucleotídeo codificando o receptor recombinante. Em algumas modali- dades, o vetor é um transposon, opcionalmente um transposon Slee- ping Beauty (SB) ou um transposon Piggybac.
[0036] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, a composição celular modificada não inclui um rea- gente estimulatório e/ou o reagente estimulatório foi substancialmente removido da composição antes do cultivo, referido reagente estimula- tório contendo um reagente capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR e/ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimulatórias.
[0037] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, o cultivo é realizado pelo menos até a composição de saída incluir um número limite de células T. Em algumas modalidades, o cultivo é continuado durante pelo menos um dia após o número limi- te de células T ser atingido. Em algumas modalidades, o número limite é pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes ou maior do que o número da composição celular mo- dificada antes do cultivo. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, o cultivo é realizado durante 2 dias a 10 dias inclusive, e/ou o cultivo é realizado durante pelo menos 10 dias. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, subsequente ao cultivo, coletar células da composição de saída. Em algumas modalidades, a quantidade de tempo entre início da incu- bação e coleta de células da composição de saída é de 7 dias a 15 dias ou de cerca de 7 dias a cerca de 15 dias. Em algumas modalida- des, a quantidade de tempo entre início da incubação e a coleta de células da composição de saída é de 9 dias a 13 dias ou de cerca de 9 dias a cerca de 13 dias. Em algumas modalidades, a quantidade de tempo entre início da incubação e coleta de células da composição de saída é de 8 dias a 13 dias ou de cerca de 8 dias a cerca de 13 dias.
[0038] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, o método também envolve formular células da com- posição de saída para criopreservação e/ou administração a um indi- víduo, opcionalmente na presença de um excipiente farmaceuticamen- te aceitável. Em algumas modalidades, as células da composição de saída são formuladas na presença de um crioprotetor. Em algumas modalidades, o crioprotetor inclui DMSO. Em algumas modalidades, as células da composição de saída são formuladas em um recipiente, opcionalmente um frasco ou uma bolsa.
[0039] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, o método também envolve isolar as células T CD4+ e/ou CD8+ de uma amostra biológica antes da incubação. Em algumas modalidades, a isolação inclui selecionar células com base em expres- são de superfície de CD4 e/ou CD8, opcionalmente por seleção positi- va ou negativa. Em algumas modalidades, a isolação inclui realizar seleção com base em imunoafinidade. Em algumas modalidades, a amostra biológica inclui células T primárias obtidas de um indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo é um indivíduo humano. Em algumas modalidades, a amostra biológica é ou inclui uma amostra de sangue total, uma amostra da camada leucocitária, uma amostra de célula mononuclear de sangue periférico (PBMC), uma amostra de cé- lula T não fracionada, uma amostra de linfócito, uma amostra de gló- bulos brancos, um produto de aferese, ou um produto de leucaferese.
[0040] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, o receptor recombinante é capaz de ligar-se a um an- tígeno alvo que é associado com, específico a, e/ou expresso sobre uma célula ou tecido de uma doença, distúrbio ou condição. Em algu- mas modalidades, a doença, distúrbio ou condição é um distúrbio ou doença infecciosa, uma doença autoimune, uma doença inflamatória, ou um tumor ou um câncer. Em algumas modalidades, o antígeno alvo é um antígeno de tumor. Em algumas modalidades, o antígeno alvo é selecionado de 5T4, 8H9, integrina avb6, B7-H6, antígeno de matura- ção de célula B (BCMA), CA9, um antígeno de testes de câncer, ani- drase carbônica 9 (CAIX), CCL-1, CD19, CD20, CD22, CEA, antígeno de superfície de hepatite B, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44,
CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, antígeno carcinoembriô- nico (CEA), CE7, uma ciclina, ciclina A2, c-Met, antígeno duplo, EGFR, glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), EPHa2, efrinB2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, dímeros de erbB, EGFR vIII, receptor de estrogênio, AchR fetal, receptor de folato alfa, proteína de ligação ao folato (FBP), FCRL5, FCRH5, receptor de acetilcolina fetal, G250/CAIX, GD2, GD3, gp100, receptor 5D acoplado à proteína G (GPCR5D), Her2/neu (receptor de tirosina cinase erbB2), HMW-MAA, IL-22R-alfa, receptor IL-13 alfa 2 (IL-13Ra2), receptor de domínio de inserção de cinase (kdr), cadeia leve kappa, Lewis Y, molécula de adesão à célula L1 (L1-CAM), antígeno associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MART-1, mesotelina, CMV de mu- rino, mucina 1 (MUC1), MUC16, NCAM, NKG2D, ligantes de NKG2D, NY-ESO-1, GD2 O-acetilado (OGD2), antígeno oncofetal, antígeno preferencialmente expresso de melanoma (PRAME), PSCA, receptor de progesterona, survivina, ROR1, TAG72, tEGFR, receptores de VEGF, VEGF-R2, Tumor Wilms 1 (WT-1), um antígeno específico de patógeno e um antígeno associado com um marcador universal.
[0041] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, o receptor recombinante é ou inclui um receptor de antígeno de não TCR funcional ou um TCR ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, o receptor recombinante é um receptor de antígeno quimérico (CAR). Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, o receptor recombinante é um CAR anti- CD19. Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quimérico inclui um domínio extracelular contendo um domínio de ligação ao an- tígeno. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno é ou inclui um anticorpo ou um fragmento de anticorpo do mesmo, que opcionalmente é um fragmento de cadeia única. Em algumas modali-
dades, o fragmento inclui regiões variáveis de anticorpo juntas por um ligador flexível. Em algumas modalidades, o fragmento inclui um scFv.
[0042] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, o receptor de antígeno quimérico também inclui um espaçador e/ou uma região de articulação. Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quimérico inclui uma região de sinalização in- tracelular. Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelu- lar inclui um domínio de sinalização intracelular. Em algumas modali- dades, o domínio de sinalização intracelular é ou inclui um domínio de sinalização primária, um domínio de sinalização que é capaz de induzir um sinal de ativação primária em uma célula T, um domínio de sinali- zação de um componente de receptor de célula T (TCR), e/ou um do- mínio de sinalização contendo um motivo de ativação com base em tirosina de imunorreceptor (ITAM). Em algumas modalidades, o domí- nio de sinalização intracelular é ou inclui um domínio de sinalização intracelular de uma cadeia CD3, opcionalmente uma cadeia CD3-zeta (CD3ζ), ou uma porção de sinalização da mesma.
[0043] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, o receptor de antígeno quimérico também inclui um domínio de transmembrana disposto entre o domínio extracelular e a região de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular também inclui uma região de sinalização coestimulatória. Em algumas modalidades, a região de sinalização co- estimulatória inclui um domínio de sinalização intracelular de uma mo- lécula coestimulatória de célula T ou uma porção de sinalização da mesma. Em algumas modalidades, a região de sinalização coestimula- tória inclui um domínio de sinalização intracelular de uma CD28, uma 4-1BB ou um ICOS ou uma porção de sinalização dos mesmos. Em algumas modalidades, a região de sinalização coestimulatória é entre o domínio de transmembrana e a região de sinalização intracelular.
[0044] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos fornecidos aqui, a composição de saída contendo o número limite ou número maior de células é produzida entre mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90% ou mais que ou mais do que cerca de 95% das interações do método. Em algumas modalidades de quaisquer dos métodos descritos aqui, o método é realizado em menos do que 21 dias, inclusive.
[0045] São fornecidas em outros aspectos composições que con- têm células modificadas produzidas por um método descrito em quais- quer das modalidades aqui. Em algumas modalidades, a composição também inclui um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição inclui um crioprotetor, opcionalmente DMSO.
[0046] São fornecidos em outros aspectos artigos de fabricação que contêm quaisquer das composições descritas aqui, e instruções para administrar a composição de saída para um indivíduo. Em algu- mas modalidades do artigo de fabricação, o indivíduo tem uma doença ou condição, opcionalmente em que o receptor recombinante especifi- camente reconhece ou especificamente liga-se a um antígeno associ- ado com, ou expresso ou presente em células de, doença ou condi- ção. Em algumas modalidades, a composição de saída é uma compo- sição de células T CD4+ modificadas. Em algumas modalidades, a composição de saída é uma composição modificada de células T CD8+.
[0047] São fornecidos em alguns aspectos artigos de fabricação que contêm uma composição de células T CD4+ modificadas produzi- das por quaisquer dos métodos descritos aqui, uma composição de células T CD8+ modificadas produzidas por quaisquer dos métodos descritos aqui, e instruções para administrar as células T CD4+ modifi- cadas e as células T CD8+ modificadas a um indivíduo. Em algumas modalidades, as instruções especificam separadamente administrar as células T CD4+ e células T CD8+ ao indivíduo. Em outras modalida- des, as instruções especificam administrar as células T CD4+ e as cé- lulas T CD8+ ao indivíduo em uma relação desejada.
[0048] Em algumas modalidades de quaisquer dos métodos des- critos aqui, o método é realizado em menos do que 21 dias, inclusive. Breve Descrição das Figuras
[0049] FIG. 1 mostra um gráfico mostrando as contagens de célula total de composições de célula CD4+ (símbolos fechados) e CD8+ (símbolos abertos) obtidas da mesma amostra de leucaferese medidas em diferentes pontos de tempo durante a estimulação, transdução e expansão de células durante os processos alternativos (triângulos) e exemplares (círculos) para gerar receptor de antígeno quimérico anti- CD19 (CAR) expressando células descritas no Exemplo 1. A linha ho- rizontal tracejada indica a contagem de célula limite requerida para atender aos critérios de colheita.
[0050] FIGURAS 2A-2D retrata contagem de célula viável (VCC; x 106 células/mL) e viabilidade celular (%), avaliada usando monitora- mento contínuo por DHM diferencial (linhagem "contínua") ou amos- tragem manual ("manual", pontos, em células CD4+ de Experimento 1 Doador 1 (FIG. 2A), Experimento 1 Doador 2 (FIG. 2B) ou Experimen- to 2 Doador 3 (FIG. 2C), ou células CD8+ de Experimento 2 Doador 3 (FIG. 2D). Painéis superiores retratam as medições para cada, painéis inferiores retratam análise de regressão linear e o R2 e inclinação (s), para comparar o monitoramento contínuo e amostragem manual.
[0051] FIG. 3 retrata contagem de célula viável (VCC; x 106 célu- las/mL) e viabilidade celular (%), avaliada usando monitoramento con- tínuo por DHM diferencial, em um processo de expansão automatizado comparado a um processo de expansão manual. Descrição Detalhada
[0052] São fornecidos aqui métodos para gerar ou produzir com- posições de células modificadas, tais como, células T CD4+ e/ou CD8+ modificadas, que expressam um receptor recombinante. Em particulares modalidades, os métodos são usados em conexão com um processo que inclui incubação de células sob condições de estimu- lação; células geneticamente modificadas, por exemplo, introduzindo um polinucleotídeo codificando um receptor recombinante, e/ou culti- vando as células modificadas sob condições que promovem expansão e/ou proliferação celular. Em algumas modalidades, as células são uma composição de células enriquecidas para células T CD4+ (aqui após também requerida como uma composição de células T CD4+ en- riquecidas). Em algumas modalidades, as células são uma composi- ção de células enriquecidas para células T CD8+ (aqui também após requerida como uma composição de células T CD8+ enriquecidas). Em algumas modalidades, os métodos são realizados para gerar ou produzir duas ou separadas composições de células T modificadas, em que cada é modificada com o mesmo receptor recombinante de células da mesma amostra biológica (por exemplo, do mesmo indiví- duo), tais como, incubando separadamente, modificando, e cultivando composições de células T CD4+ e células T CD8+ separadas.
[0053] Diferentes processos são disponíveis para gerar popula- ções de célula T geneticamente modificadas, incluindo para gerar célu- las T modificadas que expressam um receptor de antígeno quimérico. Contudo, em algumas modalidades, alguns destes processos podem requerer uma longa ou relativamente longa quantidade de tempo para gerar as células modificadas. Em algumas modalidades, alguns dos processos existentes podem variar em um período de tempo requerida para gerar células T modificadas de amostras obtidas de diferentes indivíduos. Por exemplo, em algumas modalidades, o mesmo proces- so pode requerer 5, 6, 7, ou mais dias para gerar modificadas células para um indivíduo do que para outro indivíduo. Em certas modalida- des, alguns dos processos podem variar em sua capacidade para ge- rar com sucesso células modificadas adequadas para terapia de dife- rentes indivíduos. Em particulares modalidades, a variabilidade e/ou a falta de previsibilidade de alguns processos podem apresentar pro- blemas para clínicos, por exemplo, tais como, dificuldade em determi- nar se uma terapia de célula pode ser produzida para um dado indiví- duo, ou, por exemplo, dificuldade em planejar ou coordenar a adminis- tração de uma terapia de célula quando o tempo de sua disponibilida- de não é conhecido.
[0054] As fornecidas modalidades direcionam uma ou mais destas questões. Em particulares modalidades, os métodos fornecidos geram células T modificadas adequadas para terapia, por exemplo, terapia de célula autóloga, em uma curta ou relativamente curta quantidade de tempo quando comparados a alguns processos existentes. Além dis- so, em algumas modalidades, os métodos fornecidos resultam em um processo mais consistente e menos variável em termos de um período de tempo requerida para produzir células de amostras modificadas co- letadas de diferentes indivíduos. Em particulares modalidades, os mé- todos fornecidos são capazes de gerar com sucesso células T modifi- cadas adequadas para terapia celular de uma proporção elevada de indivíduos. Desse modo, em certas modalidades, os métodos descritos aqui fornecem um meio eficiente e relativamente rápido para gerar cé- lulas T modificadas para terapias. Estas características podem permi- tir indivíduos mais potenciais serem tratados com terapias de célula T, tais como, terapias de célula T autólogas, e podem melhorar algumas das dificultades associadas com planejamento e coordenação terapia de célula para um indivíduo.
[0055] Em algumas modalidades, os fornecidos processos encur- tam a duração de expansão e/ou são capazes de gerar produto dentro de uma janela mais estreita de duração quando comparados a outros produtos, através de uma faixa ampla de amostras de partida (incluin- do aquelas em que limiares de colheita podem não ser de outro modo atingidos), e em alguns aspectos podem reduzir falhas devido a fraca expansão celular.
[0056] Em certas modalidades, os métodos fornecidos são usados em conexão com um processo de gerar células T CD4+ modificadas que expressam um receptor recombinante, por exemplo, um receptor de antígeno quimérico. Em particulares modalidades, as células T CD4+ são incubadas e/ou cultivadas na presença de IL-2 recombinan- te. Geralmente, processos alternativos para gerar células T CD4+ mo- dificadas não envolvem ou requerem a adição de IL-2 recombinante com células T CD4+ porque, em algumas modalidades, células T CD4+ cultivadas são geralmente entendidas para produzir e/ou secre- tar IL-2. Contudo, sem querer ficar vinculado pela teoria, algumas mo- dalidades contemplam que células T CD4+ derivadas de mesmos pa- cientes, tais como, indivíduos doentes e/ou indivíduos cujas células T contêm uma ou mais características associadas com células não sau- dáveis, não produzem ou secretam IL-2 em quantidades suficientes. Em certas modalidades, tais células T CD4+ vão deixar de crescer, proliferar, e/ou expandir sem suplementação de IL-2 recombinante. Desse modo, em certas modalidades, por inclusão de IL-2 recombi- nante no processo para cultivar e modificar células T CD4+, os méto- dos fornecidos expandem o conjunto de indivíduos que podem forne- cer células T CD4+ que podem ser modificadas, e desse modo expan- dem o conjunto de indivíduos que podem ser tratados com uma terapia de célula autóloga contendo células T CD4+ modificadas.
[0057] Em certas modalidades, as células são incubadas sob con- dições de estimulação com um reagente estimulatório, por exemplo, um conta conjugada de anticorpo anti-CD3 e anti-CD28, antes de ge-
neticamente modificar, por exemplo, transduzir ou transfectar, as célu- las. Em algumas modalidades, o reagente estimulatório é separado ou removido das células antes do início da etapa de cultivo e dentro de 7 dias ou mais cedo, por exemplo, em ou em cerca de 4 dias ou 5 dias, após o início ou iniciação da incubação. Particulares modalidades con- templam que quando o reagente estimulatório for removido ou separa- do das células em um ponto no tempo mais cedo durante o processo, então as células melhoraram a sobrevivência e sofrerão proliferação e/ou expansão mais robustas durante a etapa de cultivo do que células que são cultivadas nos processos alternativos que não separam ou removem o reagente estimulatório ou fazem isso em um momento posterior durante o processo. Em tais modalidades, as células cultiva- das ativam uma contagem de célula-alvo ou limite, densidade, e/ou expansão mais rápidas do que células que são cultivadas nos proces- sos alternativos. Desse modo, em algumas modalidades, removendo ou separando o reagente estimulatório das células dentro de 7 dias ou mais cedo do início ou iniciação da incubação permite o processo de gerar ou produzir células modificadas para serem completadas em um período de tempo menor do que os processos alternativos.
[0058] Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos aqui usados em conexão com um processo que gera células T genetica- mente modificadas durante um curto período de tempo. Em certas modalidades, a curta duração do processo pode aumentar a taxa, ca- sos, e/ou probabilidade de gerar uma composição de células T modifi- cadas que pode ser administrada a um indivíduo para terapia celular. Em algumas modalidades, a fabricação de protocolos para composi- ções de célula terapêutica pode requerer que as composições de célu- la sejam produzidas e liberadas para infusão, por exemplo, verificadas e/ou determinadas ser adequadas para administração a um indivíduo, dentro de um determinado período de tempo. Em alguns aspectos, a curta duração do fornecido processo pode ser esperada reduzir ou eliminar falhas de processo que ocorreriam de composições de célula que não conseguem se expandir dentro da requerida quantidade de tempo.
[0059] Em particular modalidades, os métodos são fornecidos aqui usados em conexão com cultivo de células modificadas sob condições que promovem proliferação e/ou expansão. Em algumas modalidades, o cultivo é realizado em um cenário que permite constante mistura e/ou perfusão das células cultivadas, tais como, em ou em conexão com um biorreator. Em algumas modalidades, pelo menos uma por- ção do cultivo é realizada com constante mistura e com uma perfusão constante lenta para substituir meio usado com meio fresco. Em cer- tas modalidades, as células são inicialmente cultivadas sob condições estáticas, por exemplo, nenhuma perfusão ou mistura, e são então cul- tivadas com constante mistura e perfusão quando as células cultivadas atingem uma contagem de célula pré-determinada ou densidade, e/ou uma vez que as células foram inicialmente cultivadas durante um tem- po predeterminado. Em algumas tais modalidades, as células cultiva- das ativam uma contagem de célula-alvo ou limite, densidade, e/ou expansão mais rápidas do que células que são cultivadas nos proces- sos alternativos. Desse modo, em algumas modalidades, cultivo com constante mistura e/ou perfusão permite o processo de gerar ou pro- duzir células modificadas para serem completadas em um período de tempo mais curta do que um processo alternativo onde as células são cultivadas sob condições estáticas.
[0060] Em particulares modalidades, os métodos fornecidos são usados em conexão com um processo para eficientemente produzir ou gerar células modificadas que são adequadas para uso em uma tera- pia de célula. Em certas modalidades, o tempo, condições, e reagen- tes usados para cada etapa do processo melhoram a eficiência de ca-
da etapa subsequente e/ou o processo geral. Por exemplo, em algu- mas modalidades, as células podem ser incubadas com um reagente, por exemplo, um reagente estimulatório ou um adjuvante de transdu- ção, em concentrações que são elevadas o suficiente para ativar um efeito desejado, por exemplo, estimulação das células ou eficiência de transdução melhorada, porém, em concentrações que são baixas o suficiente para evitar desenvolvimento lento ou sobrevivência reduzida em subsequentes etapas de processamento. Além disso, em algumas modalidades, as etapas do processo são programadas para começar ou terminar em pontos de tempo específicos para melhorar a eficiência de subsequentes etapas de processo e/ou de processo geral. Por exemplo, em algumas modalidades, as etapas para incubação e modi- ficação (por exemplo, transduzindo ou transfectando, as células) são concluídas antes no processo do que em métodos alternativos, que, em certas modalidades, melhoram a sobrevivência e/ou saúde, e/ou a velocidade da proliferação e expansão das células durante subsequen- te etapa de cultivo. Desse modo, em um aspecto, os específicos tem- po, condições, e reagentes de cada etapa influenciam as células além da etapa individual e, em certas modalidades, influenciam o desempe- nho de todo o processo.
[0061] Em algumas modalidades, os métodos são usados em co- nexão com um processo que gera ou produz células geneticamente modificadas que são adequadas para terapia celular de uma maneira que pode ser mais rápida e mais eficiente do que os processos alter- nativos. Em certas modalidades, os métodos fornecidos aqui têm uma taxa elevada de sucesso para gerar ou produzir composições de célu- las modificadas de população mais ampla de indivíduos que o que po- de ser possível de processos alternativos. Em certas modalidades, as células modificadas produzidas ou geradas pelos métodos fornecidos podem ter melhores saúde, viabilidade, ativação, e podem ter melhor expressão do receptor recombinante do que células produzidas por métodos alternativos. Desse modo, em alguns aspectos, a velocidade e eficiência dos métodos fornecidos para gerar células modificadas para terapia celular permitem planejamento e coordenação mais fáceis de tratamentos de terapia de célula, tal como, terapia autóloga, a uma população mais ampla de indivíduos do que o que pode ser possível por alguns métodos alternativos.
[0062] A menos que definido de outro modo, todos os termos da técnica, notações e outras terminologia ou termos técnicos e científi- cos usados aqui são destinados a ter o mesmo significado como é comumente entendido por alguém versado na técnica a qual a matéria reivindicada pertence. Em alguns casos, os termos com significados comumente entendidos são definidos aqui para maior clareza e/ou pronta referência, e a inclusão de tais definições aqui não deve ser ne- cessariamente construída para representar uma diferença substancial sobre a qual é geralmente entendida na técnica.
[0063] Todas as publicações, incluindo documentos de patente, artigos científicos e bases de dados, referidos neste pedido são incor- porados por referência em sua totalidade para todos os propósitos na mesma extensão como se cada publicação individual fosse individual- mente incorporada por referência. Se uma definição estabelecida aqui for contrária a ou de outro modo inconsistente com uma definição es- tabelecida nas patentes, pedidos, pedidos publicados e outras publica- ções que são aqui incorporados por referência, a definição estabeleci- da aqui prevalece sobre a definição que é incorporada aqui por refe- rência.
[0064] Os títulos da seção usados aqui são para propósitos orga- nizacionais somente e não devem ser construídos como limitantes da matéria principal descrita. I. PROCESSO PARA GERAR CÉLULAS MODIFICADAS
[0065] São fornecidos aqui métodos para gerar uma composição de saída de células modificadas, tais como, células T CD4+ modifica- das e/ou células T CD8+ modificadas, que expressam uma proteína recombinante, por exemplo, um receptor recombinante, tais como, um receptor de célula T (TCR) ou um receptor de antígeno quimérico (CAR). Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos aqui usados em conexão com fabricação, geração ou produção de uma te- rapia de célula, e podem ser usados em conexão com etapas de pro- cessamento adicionais, tais como, etapas para a isolação, separação, seleção, ativação ou estimulação, transdução, lavagem, suspensão, diluição, concentração e/ou formulação das células.
Em algumas mo- dalidades, os métodos de gerar ou produzir células modificadas, por exemplo, células T CD4+ modificadas e/ou células T CD8+ modifica- das, incluem um ou mais de isolamento de células de um indivíduo, preparando, processando, incubando sob condições de estimulação e/ou modificando (por exemplo, transduzindo) as células.
Em algumas modalidades, o método inclui etapas de processamento realizadas em uma ordem em que: células de entrada, por exemplo, células primá- rias, são primeiro isoladas, tais como, selecionadas ou separadas, de uma amostra biológica; células de entrada são incubadas sob condi- ções de estimulação, modificadas com partículas de vetor, por exem- plo, partículas de vetor virais, para introduzir um polinucleotídeo re- combinante nas células, por exemplo, por transdução ou transfecção; cultivar as células modificadas, por exemplo, células transduzidas, tais como, para expandir as células; e coletar, colher e/ou carregar um re- cipiente com todas ou uma porção das células para formular as células em uma composição de saída.
Em algumas modalidades, as células da composição de saída gerada são novamente introduzidas no mes- mo indivíduo, antes ou após criopreservação.
Em algumas modalida- des, as composições de saída de células modificadas são adequadas para uso na terapia, por exemplo, uma terapia de célula autóloga.
[0066] Em particulares modalidades, os métodos fornecidos são usados em conexão com geração de composições de saída de células expressando um receptor recombinante de uma composição de entra- da ou inicial de células. Em algumas modalidades, a composição de células é uma composição de células T enriquecidas, células T CD4+ enriquecidas, e/ou células T CD8+ enriquecidas (aqui também após requerida como composições de células T enriquecidas, composições de células T CD4+ enriquecidas, e composições de células T CD8+ enriquecidas, respectivamente). Em algumas modalidades, os méto- dos fornecidos são usados em conexão com um ou mais de: ativação ou estimulação de uma composição de células enriquecidas para célu- las T; modificar geneticamente uma composição de células T enrique- cidas, por exemplo, para introduzir um polinucleotídeo codificando uma proteína recombinante por transdução ou transfecção; e/ou cultivar a composição modificada de células T enriquecidas, por exemplo, sob condições que promovem proliferação e/ou expansão. Em certas mo- dalidades, os métodos podem também ser usados em conexão com isolação ou seleção de células de uma amostra biológica para gerar uma composição de entrada de células T enriquecidas, tais como, de uma amostra biológica tomada, coletada, e/ou obtida de um indivíduo. Em particulares modalidades, os métodos fornecidos podem ser usa- dos em conexão com colheita, coleta e/ou formulação de composições de células T enriquecidas após as células serem incubadas, ativadas, estimuladas, modificadas, transduzidas, transfectadas e/ou cultivadas.
[0067] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos são usa- dos em associação com a isolação, separação, seleção, ativação ou estimulação, transdução, lavagem, suspensão, diluição, concentração, e/ou formulação de uma composição simples de células T enriqueci- das. Em algumas modalidades, a composição de células T enriqueci-
das é uma composição de células que inclui células T CD4+ enriqueci- das. Em certas modalidades, a composição de células T CD4+ enri- quecidas contém pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou 99,9% de células T CD4+. Em particulares moda- lidades, a composição de células T CD4+ enriquecidas contém 100% de células T CD4+ ou contém cerca de 100% de células T CD4+. Em certas modalidades, a composição de células T enriquecidas inclui ou contém menos do que 20%, menos do que 10%, menos do que 5%, menos do que 1%, menos do que 0,1%, ou menos do que 0,01% de células T CD8+, e/ou não contém nenhuma célula T CD8+ e/ou é livre ou substancialmente livre de células T CD8+. Em algumas modalida- des, as populações de células consistem essencialmente em células T CD4+.
[0068] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos são usa- dos em conexão com geração de duas ou mais composições de saída separadas de células T enriquecidas. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos são separadamente realizados em duas ou mais composições de células T enriquecidas separadas, por exemplo, uma ou mais composição separada de células T CD4+ enriquecidas e uma ou mais composição separada de células T CD8+ enriquecidas. Em certas modalidades, os métodos podem ser usados em conexão com separadamente ativação e/ou estimulação de duas ou mais composi- ções de células T enriquecidas; separadamente modificação de duas ou mais composições de células T enriquecidas; e/ou separadamente cultivo de duas ou mais composições de células T enriquecidas. Em certas modalidades, os métodos podem também ser usados em cone- xão com isolação ou seleção de diferentes células de uma amostra biológica para gerar composição de entrada separada de células T en- riquecidas, tais como, composições de células T CD4+ enriquecidas e células T CD8+ enriquecidas separadas. Em particulares modalidades,
os métodos fornecidos podem ser usados em conexão com separa- damente colheita, coleta e/ou formulação de composições de células T enriquecidas separadas após as células T serem incubadas, ativadas, estimuladas, modificadas, transduzidas, transfectadas e/ou cultivadas.
[0069] Em certas modalidades, os métodos podem ser usados em conexão com separadamente incubação de pelo menos uma composi- ção separada de células T CD4+ enriquecidas e pelo menos uma composição separada de células T CD8+ enriquecidas; separadamen- te ativação e/ou estimulação de pelo menos uma composição separa- da de células T CD4+ enriquecidas e pelo menos uma composição separada de células T CD8+ enriquecidas após a incubação; separa- damente modificando, transduzindo, e/ou transfectando pelo menos uma composição separada de células T CD4+ enriquecidas e pelo menos uma composição separada de células T CD8+ enriquecidas após a ativação e/ou estimulação; separadamente cultivo de pelo me- nos uma composição separada de células T CD4+ enriquecidas e pelo menos uma composição separada de células T CD8+ enriquecidas após a modificação, transdução e/ou transfecção; separadamente co- lheita e/ou coleta de pelo menos uma composição separada de células T CD4+ enriquecidas e pelo menos uma composição separada de cé- lulas T CD8+ enriquecidas após o cultivo; separadamente formulação de pelo menos uma composição separada de células T CD4+ enrique- cidas e pelo menos uma composição separada de células T CD8+ en- riquecidas após a colheita e/ou coleta; e/ou separadamente adminis- trar as composições formuladas a um indivíduo em necessidade das mesmas.
[0070] Em algumas modalidades, as duas ou mais composições de células T enriquecidas separadas incluem uma composição de cé- lulas T CD4+ enriquecidas. Em certas modalidades, as duas ou mais composições separadas incluem células T CD8+. Em algumas moda-
lidades, as duas ou mais composições separadas incluem uma com- posição de células T CD4+ enriquecidas e uma composição de células T CD8+ enriquecidas. Em particulares modalidades, a composição se- parada de células T CD4+ enriquecidas e a composição separada de células T CD8+ enriquecidas originadas, por exemplo, foram inicial- mente isoladas, selecionadas, e/ou enriquecidas, da mesma amostra biológica, tais como, a mesma amostra biológica obtida, coletada e/ou tomada de um único indivíduo. Em algumas modalidades, a mesma amostra biológica é primeiro submetida à seleção de células T CD4+, onde ambas as frações positivas e negativas são retidas, e a fração negativa é também submetida à seleção de células T CD8+. Em ou- tras modalidades, a mesma amostra biológica é primeiro submetida à seleção de células T CD8+, onde ambas as frações positivas e negati- vas são retidas, e a fração negativa é também submetida à seleção de células T CD4+.
[0071] Em algumas modalidades, a composição de células T enri- quecidas é uma composição de células T CD8+ enriquecidas. Em cer- tas modalidades, a composição de células T CD8+ enriquecidas con- tém pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou 99,9% de células T CD8+, ou contém ou contém cerca de 100% de células T CD8+. Em certas modalidades, a composição de células T CD8+ enriquecidas inclui ou contém menos do que 20%, menos do que 10%, menos do que 5%, menos do que 1%, menos do que 0,1%, ou menos do que 0,01% de células T CD4+, e/ou não con- tém nenhuma célula T CD4+, e/ou é livre ou substancialmente livre de células T CD4+. Em algumas modalidades, as populações de células consistem essencialmente em células T CD8+.
[0072] Em algumas modalidades, uma composição de células T CD4+ enriquecidas e/ou uma composição modificada de células T CD4+ enriquecidas, é incubada, ativada, estimulada, modificada,
transduzida, transfectada e/ou cultivada com e/ou na presença de IL-2 recombinante. Em particulares modalidades, os métodos são usados em conexão com incubação de uma composição de entrada de células T CD4+ enriquecidas sob condições de estimulação com e/ou na pre- sença de IL-2 recombinante. Em algumas modalidades, os métodos são usados em conexão com cultivo de uma composição modificada de células T CD4+ enriquecidas sob condições que promovam prolife- ração e/ou expansão com e/ou na presença de IL-2 recombinante.
[0073] Em algumas modalidades, incubação da composição de entradas de células T enriquecidas sob condições de estimulação é ou inclui incubação das células com um reagente estimulatório, por exemplo, um reagente estimulatório descrito na Seção I-B-1. Em cer- tas modalidades, o reagente estimulatório é removido ou separado das células antes de uma etapa de cultivo. Em certas modalidades, o rea- gente estimulatório é removido ou separado das células após uma modificação genética, por exemplo, transfecção ou transdução. Em algumas modalidades, o reagente estimulatório é removido a partir das células em um período de tempo do início ou iniciação da incubação com o reagente estimulatório, por exemplo, dentro de 7 ou menos dias do início ou iniciação da incubação. Em particulares modalidades, a incubação sob condições de estimulação é realizada na presença de um ou mais antioxidantes, por exemplo, um antioxidante contendo en- xofre e/ou um precursor de glutationa.
[0074] Em particulares modalidades, as composições de células T enriquecidas, por exemplo, composições estimuladas de células T en- riquecidas, são modificadas na presença de um policátion, por exem- plo, para melhorar a eficiência de transfecção ou transdução. Em cer- tas modalidades, o policátion está presente em uma quantidade baixa e/ou relativamente baixa e/ou concentração.
[0075] Em certas modalidades, pelo menos uma porção da etapa de cultivo é realizada com constante mistura e/ou perfusão, por exem- plo, com um biorreator em um sistema fechado. Em certas modalida- des, a mistura e/ou perfusão incorpora uma substituição constante e/ou gradual de solução ou meio celular velho ou usado com solução ou meio fresco. Em particulares modalidades, as células são cultiva- das na presença de um tensoativo e/ou um agente que reduz ou pre- vine cisalhamento celular, tais como, cisalhamento durante constante mistura e/ou perfusão.
[0076] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos são rea- lizados de tal modo que uma ou mais ou todas as etapas na prepara- ção de células para uso clínico, por exemplo, em terapia celular adoti- va, sejam realizados sem expor as células às condições não estéreis. Em algumas modalidades de tal processo, as células são isoladas, se- paradas ou selecionadas, transduzidas, lavadas, opcionalmente ativa- das ou estimuladas e formuladas, todas dentro de um sistema fecha- do. Em algumas modalidades, uma ou mais das etapas são realiza- das além do dispositivo ou sistema fechado. Em algumas tais modali- dades, as composições de células enriquecidas são transferidas além do dispositivo ou sistema fechado sob condições estéreis, tais como, por transferência estéril para um sistema fechado separado.
[0077] Em particulares modalidades, as composições de células T enriquecidas podem ser coletadas, formuladas para crioproteção, crio- congeladas e/ou armazenadas abaixo de 0 °C, abaixo de -20 °C, ou em ou abaixo de -70 oC ou -80 °C antes de, durante ou após qualquer estágio ou etapa do processo para gerar composições de saída de cé- lulas T enriquecidas expressando receptores recombinantes. Em al- gumas modalidades, as células podem ser armazenadas durante um período de tempo sob 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 dias, ou um perío- do de tempo sob 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 semanas, ou durante um período de tempo de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 semanas, ou durante mais do que 8 semanas. Após armazenamento, as composições de células T enriquecidas podem ser descongeladas e o processamento pode ser resumido do mesmo ponto no processo. Em algumas moda- lidades, composições de entrada de células T enriquecidas são crio- congeladas e armazenadas antes de outro processamento, por exem- plo, incubação sob condições de estimulação. Em particulares moda- lidades, composições cultivadas e/ou formuladas de células T enrique- cidas são congeladas e armazenadas antes de serem administradas a um indivíduo, por exemplo, como uma terapia de célula autóloga.
[0078] Em certas modalidades, as composições separadas de cé- lulas T enriquecidas são combinadas em uma composição simples. Por exemplo, em algumas modalidades, uma composição de células T CD4+ enriquecidas é combinada com uma composição de células T CD8+ enriquecidas em uma composição simples de células T CD4+ e CD8+ enriquecidas. Em certas modalidades, as composições separa- das originadas, por exemplo, foram inicialmente isoladas, seleciona- das, e/ou enriquecidas, da mesma amostra biológica, tais como, a mesma amostra biológica obtida, coletada, e/ou tomada de um único indivíduo. Em algumas modalidades, as composições separadas são separadamente processadas para uma ou mais etapas ou estágios de um processo para gerar composições de saída, por exemplo, um pro- cesso em conexão com os métodos fornecidos. Em algumas modali- dades, as composições separadas podem ser combinadas em uma composição simples antes de, durante, ou subsequente a qualquer etapa ou estágio do processo para gerar composições de saída. Des- se modo, em algumas modalidades, composições de entrada separa- das, estimuladas, modificadas, cultivadas, formuladas e/ou colhidas de células T enriquecidas da mesma amostra biológica são combinadas em uma composição simples e, em certas modalidades, são também processadas como uma composição simples. Em certas modalidades,
as composições de saída separadas de células enriquecidas são com- binadas em uma composição de saída simples antes de administrar as células a um indivíduo.
[0079] Em certas modalidades, em qualquer estágio ou etapa no processo, uma porção das células pode ser amostrada ou coletada, por exemplo, as células podem ser tomadas da composição de células T enriquecidas enquanto a composição permanece no sistema fecha- do, tais como, durante a isolação, incubação, modificação, cultivo e/ou formulação. Em certas modalidades, tais células podem ser analisa- das por fabricantes, aspectos, ou características incluindo, porém não limitados a, viabilidade, apoptose, ativação, estimulação, desenvolvi- mento, e/ou exaustão. Em algumas modalidades, as células são amostradas ou coletadas por um processo automatizado enquanto a composição de células T enriquecidas permanece no sistema fechado. Em algumas modalidades, a análise de células amostradas ou coleta- das é automatizada. Em particulares modalidades, a análise é reali- zada em um sistema fechado sob condições estéreis.
[0080] Em algumas modalidades, as células ou composições de células que são produzidas e/ou processadas pelos métodos forneci- dos podem ser comparadas às células ou composições de células processadas ou produzidas por um processo exemplar e/ou alternati- vo. Em algumas modalidades, o processo alternativo e/ou exemplar pode se diferenciar em um ou mais aspectos específicos, porém de outro modo contém similares ou mesmas características, aspectos, etapas, estágios, reagentes, e/ou condições da modalidade ou aspecto dos métodos fornecidos que são comparados. Por exemplo, quando os métodos fornecidos são usados em conexão com incubação de cé- lulas na presença de um reagente, tais células podem ser comparadas às células que não são incubadas com o reagente em um processo exemplar e/ou alternativo. Em algumas modalidades, a menos que de outro modo especificado, os métodos fornecidos e o processo exem- plar e/ou alternativo seriam de outro modo similares e/ou idênticos, tais como, com etapas similares ou idênticas para isolação, seleção, enri- quecimento, ativação, estimulação, modificação, transfecção, transdu- ção, cultivo e/ou formulação. Em algumas modalidades, a menos que de outro modo especificado, os métodos fornecidos e o processo al- ternativo isolam, selecionam e/ou enriquecem células dos mesmos ou similares tipos de amostras biológicas, e/ou células de processo e/ou células de entrada do mesmo tipo celular.
[0081] Também fornecidas são células e composições preparadas pelos métodos, incluindo formulações e composições farmacêuticas, e kits, sistemas, e dispositivos para realizar os métodos. Também for- necidos são métodos para uso das células e composições preparadas pelos métodos, incluindo métodos terapêuticos, tais como, métodos para terapia celular adotiva, e composições farmacêuticas para admi- nistração aos indivíduos. A. Amostras e Preparações Celulares
[0082] Em particulares modalidades, os métodos fornecidos são usados em conexão com isolação, seleção e/ou enriquecimento de células de uma amostra biológica para gerar uma ou mais composi- ções de entrada de células enriquecidas, por exemplo, células T. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos incluem isolamento de células ou composições das mesmas de amostras biológicas, tais co- mo, aquelas obtidas de ou derivadas de um indivíduo, tais como, aquele tendo uma particular doença ou condição ou em necessidade de uma terapia de célula ou ao qual terapia de célula será administra- da. Em alguns aspectos, o indivíduo é um humano, tais como, um indi- víduo que é um paciente em necessidade de uma particular interven- ção terapêutica, tal como, a terapia de célula adotiva para a qual as células estão sendo isoladas, processadas, e/ou modificadas. Ade-
quadamente, as células, em algumas modalidades, são células primá- rias, por exemplo, células humanas primárias. As amostras incluem tecido, fluido e outras amostras tomadas diretamente do indivíduo. A amostra biológica pode ser uma amostra obtida diretamente de uma fonte biológica ou uma amostra que é processada. Amostras biológi- cas incluem, porém não são limitados a, fluidos corporais, tais como, sangue, plasma, soro, fluido cerebroespinhal, fluido sinovial, urina e suor, tecido e amostras de órgão, incluindo amostras processadas de- rivadas deles.
[0083] Em alguns aspectos, a amostra é sangue ou uma amostra derivada de sangue, ou é derivada de um produto de aferese ou leuca- ferese. Amostras exemplares incluem sangue total, células mononu- cleares de sangue periférico (PBMCs), leucócitos, medula óssea, timo, biópsia de tecido, tumor, leucemia, linfoma, linfonodo, tecido linfóide associado ao intestino, tecido linfóide associado à mucosa, baço, ou- tros tecidos linfóides, fígado, pulmão, estômago, intestino, cólon, rim, pâncreas, mama, osso, próstata, colo do útero, testículos, ovários, amígdala, ou outro órgão e/ou células derivadas deles. As amostras incluem, no contexto de terapia de célula, por exemplo, terapia celular adotiva, amostras de fontes autólogas e alogeneicas.
[0084] Em alguns exemplos, as células do sangue circulante de um indivíduo são obtidas, por exemplo, por aferese ou leucaferese. As amostras, em alguns aspectos, contêm linfócitos, incluindo células T, monócitos, granulócitos, células B, outras células sanguíneas brancas nucleadas, células vermelhas do sangue, e/ou plaquetas, e em alguns aspectos contém células exceto células vermelhas do sangue e pla- quetas.
[0085] Em algumas modalidades, as células de sangue coletadas do indivíduo são lavadas, por exemplo, para remover a fração de plasma e colocar as células em um meio ou tampão apropriado para subsequentes etapas de processamento. Em algumas modalidades, as células são lavadas com salina tamponada por fosfato (PBS). Em algumas modalidades, a solução de lavagem carece de cálcio e/ou magnésio e/ou muitos ou todos os cátions divalentes. Em alguns as- pectos, uma etapa de lavagem é realizada em uma centrífuga "através de fluxo" semiautomatizada (por exemplo, o Cobe 2991 cell processor, Baxter) de acordo com as instruções do fabricante. Em alguns aspec- tos, a etapa de lavagem é realizada por filtração de fluxo tangencial (TFF) de acordo com as instruções do fabricante. Em algumas moda- lidades, as células são novamente suspensas em uma variedade de tampões biocompatíveis após lavagem, tal como, por exemplo, PBS livre de Ca++/Mg++. Em certas modalidades, os componentes de uma amostra de célula sanguínea são removidos e as células diretamente novamente suspensas em meio de cultura.
[0086] Em algumas modalidades, os métodos de preparação in- cluem etapas para congelamento, por exemplo, criopreservação, as células, antes ou após isolamento, seleção e/ou enriquecimento e/ou incubação para transdução e modificação, e/ou após cultivo e/ou co- lheita das células modificadas. Em algumas modalidades, o congela- mento e subsequente etapa de descongelamento remove granulócitos e, até certo ponto, monócitos na população celular. Em algumas mo- dalidades, as células são suspensas em uma solução de congelamen- to, por exemplo, após a etapa de lavagem para remover plasma e pla- quetas. Qualquer de uma variedade de soluções de congelamento co- nhecidas e parâmetros em alguns aspectos podem ser usados. Em algumas modalidades, as células são congeladas, por exemplo, con- geladas ou criopreservadas, em meio e/ou solução com uma concen- tração final de ou de cerca de 12,5%, 12,0%, 11,5%, 11,0%, 10,5%, 10,0%, 9,5%, 9. 0%, 8,5%, 8,0%, 7,5%, 7,0%, 6,5%, 6,0%, 5,5%, ou 5,0% de DMSO, ou entre 1% e 15%, entre 6% e 12%, entre 5% e
10%, ou entre 6% e 8% de DMSO. Em particulares modalidades, as células são congeladas, por exemplo, congeladas ou criopreservadas, em meio e/ou solução com uma concentração final de ou de cerca de 5,0%, 4,5%, 4,0%, 3,5%, 3,0%, 2,5%, 2,0%, 1,5%, 1,25%, 1,0%, 0,75%, 0,5%, ou 0,25% HSA, ou entre 0,1% e -5%, entre 0,25% e 4%, entre 0,5% e 2%, ou entre 1% e 2% de HSA. Um exemplo envolve uso de PBS contendo 20% de DMSO e 8% de albumina de soro humano (HSA), ou outros adequados meios de congelamento celular. Isto é então diluído 1:1 com meio de modo que a concentração final de DMSO e HSA seja 10% e 4%, respectivamente. As células são geral- mente então congeladas para ou a cerca de −80 °C em uma taxa de ou de cerca de 1° por minuto e armazenadas na fase de vapor de um tanque de armazenagem de nitrogênio líquido.
[0087] Em algumas modalidades, isolamento das células ou popu- lações inclui uma ou mais etapas de separação de célula com base em não afinidade e/ou preparação. Em alguns exemplos, as células são lavadas, centrifugadas e/ou incubadas na presença de um ou mais reagentes, por exemplo, para remover componentes indesejados, en- riquecer componentes desejados, lisar ou remover células sensíveis a reagentes particulares. Em alguns exemplos, as células são separadas com base em uma ou mais propriedade, tais como, densidade, propri- edades aderentes, tamanho, sensibilidade e/ou resistência a compo- nentes particulares. Em algumas modalidades, os métodos incluem métodos de separação de célula com base em densidade, tais como, a preparação de células brancas do sangue de sangue periférico lisando as células vermelhas do sangue e centrifugação por meio de um gra- diente Percoll ou Ficoll.
[0088] Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da eta- pa de seleção inclui incubação de células com um reagente de sele- ção. A incubação com um reagente de seleção ou reagentes, por exemplo, como parte de métodos de seleção que podem ser realiza- dos usando um ou mais reagentes de seleção para seleção de um ou mais diferentes tipos de célula com base na expressão ou presença em ou sobre a célula de uma ou mais moléculas específicas, tais co- mo, marcadores de superfície, por exemplo, proteínas de superfície, marcadores intracelulares ou ácido nucleico. Em algumas modalida- des, qualquer método conhecido usando um reagente de seleção ou reagentes para separação com base em tais marcadores pode ser usado. Em algumas modalidades, os reagentes ou reagente de sele- ção resultam na separação que é separação com base em afinidade ou imunoafinidade. Por exemplo, a seleção em alguns aspectos inclui incubação com um reagente ou reagentes para separação de células e populações celulares com base no nível de expressão ou expressão de células de um ou mais marcadores, tipicamente marcadores de su- perfície de célula, por exemplo, por incubação com um anticorpo ou parceiro de ligação que especificamente se liga a tais marcadores, se- guidos geralmente por etapas de lavagem e separação de células ten- do ligado o anticorpo ou parceiro de ligação, daquelas células não ten- do ligado ao anticorpo ou parceiro de ligação.
[0089] Em alguns aspectos de tais processos, um volume de célu- las é misturado com uma quantidade de um reagente de seleção com base em afinidade desejada. A seleção com base em imunoafinidade pode ser realizada usando qualquer sistema ou método que resulte em uma interação energética favorável entre as células sendo separadas e a molécula especificamente ligando-se ao marcador sobre a célula, por exemplo, o anticorpo ou outro parceiro de ligação sobre a superfí- cie sólida, por exemplo, partícula. Em algumas modalidades, os mé- todos são realizados usando partículas, tais como, contas, por exem- plo, contas magnéticas, que são revestidas com um agente de seleção (por exemplo, anticorpo) específico ao marcador das células. As partí-
culas (por exemplo, contas) podem ser incubadas ou misturadas com células em um recipiente, tais como, um tubo ou saco, enquanto agi- tando ou misturando, com uma relação de densidade para partícula de célula constante (por exemplo, conta) para auxiliar interações energe- ticamente favorecidas. Em outros casos, os métodos incluem seleção de células em que todas ou uma porção da seleção é realizada na ca- vidade interna de uma câmara centrífuga, por exemplo, sob rotação centrífuga. Em algumas modalidades, incubação de células com rea- gentes de seleção, tais como, reagentes de seleção com base em imunoafinidade, é realizada em uma câmara centrífuga. Em certas modalidades, a isolação ou separação é realizada usando um sistema, dispositivo ou aparato descrito no Pedido de Patente Internacional, Número de Publicação WO2009/072003, ou US 20110003380 A1. Em um exemplo, o sistema é um sistema como descrito no Número de Publicação Internacional WO2016/073602.
[0090] Em algumas modalidades, conduzindo tais etapas de sele- ção ou partes das mesmas (por exemplo, incubação com partículas revestidas por anticorpo, por exemplo, contas magnéticas) na cavida- de de uma câmara centrífuga, o usuário é capaz de controlar certos parâmetros, tais como, volume de várias soluções, adição de solução durante processamento e temporização das mesmas, que podem for- necer vantagens comparadas a outros métodos disponíveis. Por exemplo, a capacidade para diminuir o volume do líquido na cavidade durante a incubação pode aumentar a concentração das partículas (por exemplo, reagente de conta) usadas na seleção, e desse modo, o potencial químico da solução, sem afetar o número total de células na cavidade. Por sua vez, isso pode realçar as interações de pares entre as células sendo processadas e as partículas usadas para seleção. Em algumas modalidades, realização da etapa de incubação na câma- ra, por exemplo, quando associada com os sistemas, circuitos e con-
trole como descrito aqui, permite o usuário efetuar a agitação da solu- ção em tempo(s) desejado(s) durante a incubação, que também pode melhorar a interação.
[0091] Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da eta- pa de seleção é realizada em uma câmara centrífuga, que inclui incu- bação de células com um reagente de seleção. Em alguns aspectos de tais processos, um volume de células é misturado com uma quanti- dade de um reagente de seleção com base em afinidade desejada que é muito menos do que é normalmente empregado quando realizando seleções similares em um tubo ou recipiente para seleção do mesmo número de células e/ou volume de células de acordo com instruções do fabricante. Em algumas modalidades, uma quantidade de reagen- tes ou reagente de seleção que é/são não mais do que 5%, não mais do que 10%, não mais do que 15%, não mais do que 20%, não mais do que 25%, não mais do que 50%, não mais do que 60%, não mais do que 70% ou não mais do que 80% da quantidade do(s) mesmo(s) reagente(s) de seleção empregado(s) para seleção de células em uma incubação com base em recipiente ou tubo para o mesmo número de células e/ou o mesmo volume de células de acordo com instruções do fabricante é empregada.
[0092] Em algumas modalidades, para seleção, por exemplo, se- leção com base em imunoafinidade das células, as células são incu- badas na cavidade da câmara em uma composição que também con- tém o tampão de seleção com um reagente de seleção, tais como, uma molécula que especificamente se liga a um marcador de superfí- cie em uma célula que desejava enriquecer e/ou esgotar, porém não sobre outras células em uma composição, tal como, um anticorpo, que opcionalmente é acoplado a uma estrutura, tal como, um polímero ou superfície, por exemplo, conta, por exemplo, conta magnética, tais como, contas magnéticas acopladas a anticorpos monoclonais especí-
ficos para CD4 e CD8. Em algumas modalidades, como descrito, o reagente de seleção é adicionado às células na cavidade da câmara em uma quantidade que é substancialmente menos do que (por exemplo, é não mais do que 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou 80% da quantidade) quando comparada à quantidade do rea- gente de seleção que é tipicamente usado ou seria necessário para ativar cerca da mesma ou similar eficiência de seleção do mesmo nú- mero de células ou o mesmo volume de células quando seleção for realizada em um tubo com agitação ou rotação. Em algumas modali- dades, a incubação é realizada com a adição de um tampão de sele- ção às células e reagente de seleção para ativar um volume alvo com incubação do reagente de, por exemplo, 10 mL a 200 mL, tais como, pelo menos ou cerca de pelo menos ou cerca de 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 150 mL ou 200 mL. Em algumas modalidades, o tampão de seleção e reagente de seleção são pré-misturados antes da adição às células. Em algu- mas modalidades, o tampão de seleção e reagente de seleção são separadamente adicionados às células. Em algumas modalidades, a incubação de seleção é realizada com condição de suave mistura pe- riódica, que pode auxiliar na promoção de interações energeticamente favorecidas e desse modo permitir o uso de menos reagente de sele- ção geral enquanto ativando uma eficiência de seleção elevada.
[0093] Em algumas modalidades, a duração total da incubação com o reagente de seleção é de 5 minutes a 6 horas ou de cerca de 5 minutos a cerca de 6 horas, tais como, 30 minutos a 3 horas, por exemplo, pelo menos ou cerca de pelo menos 30 minutos, 60 minutos, 120 minutos ou 180 minutos.
[0094] Em algumas modalidades, a incubação geralmente é reali- zada sob condições de mistura, tais como, na presença de rotação, geralmente em velocidade ou força relativamente baixa, tal como, ve-
locidade menor do que aquela usada para peletizar as células, tais como, de 600 rpm a 1700 rpm ou de cerca de 600 rpm a cerca de 1700 rpm (por exemplo, em ou cerca de ou pelo menos 600 rpm, 1000 rpm, ou 1500 rpm ou 1700 rpm), tal como, em um RCF em uma amos- tra ou parede da câmara ou outro recipiente de 80 g a 100 g ou de cerca de 80 g a cerca de 100 g (por exemplo, em ou cerca de ou pelo menos 80 g, 85 g, 90 g, 95 g, ou 100 g). Em algumas modalidades, a rotação é realizada usando intervalos repetidos de uma rotação em tal baixa velocidade seguida por um período de descanso, tais como, uma rotação e/ou descanso durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 segundos, tais como, uma rotação em aproximadamente 1 ou 2 segundos segui- da por um descanso durante aproximadamente 5, 6, 7, ou 8 segundos.
[0095] Em algumas modalidades, tal processo é realizado dentro do sistema totalmente fechado ao qual a câmara é integral. Em algu- mas modalidades, este processo (e em alguns aspectos também uma ou mais etapa adicional, tal como, uma etapa de lavagem anterior la- vando uma amostra contendo as células, tal como, uma amostra de aferese) é realizado de um modo automatizado, de tal modo que, as células, reagente e outros componentes sejam atraídos e empurrados para fora da câmara em tempos apropriados e centrifugação efetuada, a fim de completar a etapa de ligação e lavagem em um sistema fe- chado simples usando um programa automatizado.
[0096] Em algumas modalidades, após a incubação e/ou mistura das células e reagente e/ou reagentes de seleção, as células incuba- das são submetida à separação para selecionar células com base na presença ou ausência dos particulares reagente ou reagentes. Em al- gumas modalidades, a separação é realizada no mesmo sistema fe- chado em que a incubação de células com o reagente de seleção foi realizada. Em algumas modalidades, após incubação com os reagen- tes de seleção, as células incubadas, incluindo células em que o rea-
gente de seleção ligou-se são transferidas em um sistema para sepa- ração das células com base em imunoafinidade. Em algumas modali- dades, o sistema para separação com base em imunoafinidade é ou contém uma coluna de separação magnética.
[0097] Tais etapas de separação podem ser com base em seleção positiva, em que as células que se ligaram aos reagentes, por exem- plo, anticorpo ou parceiro de ligação, são retidas para outro uso e/ou seleção negativa, em que as células que não se ligaram ao reagente, por exemplo, anticorpo ou parceiro de ligação, são retidas. Em alguns exemplos, ambas as frações são retidas para outro uso. Em alguns aspectos, a seleção negativa pode ser particularmente útil onde ne- nhum anticorpo está disponível o que especificamente identifica um tipo de célula em uma população heterogênea, de tal modo que sepa- ração seja melhor realizada com base em marcadores expressos por células, exceto a população desejada.
[0098] Em algumas modalidades, as etapas de processo também incluem seleção negativa e/ou positiva das células incubadas, tal co- mo, usando um sistema ou aparato que pode realizar uma seleção com base em afinidade. Em algumas modalidades, o isolamento é realizado por enriquecimento para uma particular população celular por seleção positiva, ou depleção de uma particular população celular, por seleção negativa. Em algumas modalidades, seleção negativa ou positiva é realizada por incubação de células com um ou mais anticor- pos ou outro agente de ligação que especificamente se liga a um ou mais marcadores de superfície expressos ou expressos (marcador+) em um nível relativamente mais elevado (marcadorelevado) sobre as cé- lulas positivamente ou negativamente selecionadas, respectivamente. Múltiplos ciclos da mesma etapa de seleção, por exemplo, etapa de seleção negativa ou positiva, podem ser realizados. Em certas moda- lidades, a fração positivamente ou negativamente selecionada subme-
tida ao processo para seleção, tal como, por repetição da etapa de se- leção negativa ou positiva. Em algumas modalidades, a seleção é re- petida duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, seis vezes, sete vezes, oito vezes, nove vezes ou mais do que nove vezes. Em certas modalidades, a mesma seleção é realizada até cinco vezes. Em certas modalidades, a mesma etapa de seleção é realizada três vezes.
[0099] A separação não precisa resultar em 100 % de enriqueci- mento ou remoção de uma particular população celular ou células ex- pressando um particular marcador. Por exemplo, seleção positiva de ou enriquecimento para células de um tipo particular, tais como, aque- las expressando um marcador, refere-se ao aumento do número ou porcentagem de tais células, porém, não precisa resultar em uma completa ausência de células não expressando o marcador. Da mes- ma forma, seleção negativa, remoção ou depleção de células de um tipo particular, tais como, aquelas expressando um marcador, refere- se à diminuição do número ou porcentagem de tais células, porém, não precisa resultar em uma completa remoção de todas tais células.
[00100] Em alguns exemplos, os Múltiplos ciclos de etapas de se- paração são realizadas, onde a fração positivamente ou negativamen- te selecionada de uma etapa é submetida a outra etapa de separação, tal como, uma subsequente seleção negativa ou positiva. Em alguns exemplos, uma etapa de separação simples pode esgotar células ex- pressando múltiplos marcadores simultaneamente, tal como, por incu- bação de células com uma pluralidade de anticorpos ou parceiros de ligação, cada específico para um marcador alvejado para seleção ne- gativa. Da mesma forma, múltiplos tipos de célula podem simultane- amente ser positivamente selecionados por incubação de células com uma pluralidade de anticorpos ou parceiros de ligação expressos so- bre os vários tipos celulares. Em certas modalidades, uma ou mais etapas de separação são repetidas e/ou realizadas mais do que uma vez. Em algumas modalidades, a fração positivamente ou negativa- mente selecionada resultando da etapa de separação é submetida à mesma etapa de separação, tal como, por repetição da etapa de sele- ção negativa ou positiva. Em algumas modalidades, uma etapa de separação simples é repetida e/ou realizada mais do que uma vez, por exemplo, para aumentar a produção de células positivamente selecio- nadas, para aumentar a pureza de células negativamente seleciona- das, e/ou para também remover as células positivamente selecionadas da fração negativamente selecionada. Em certas modalidades, uma ou mais etapas de separação são realizadas e/ou repetidas duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, seis vezes, sete vezes, oito ve- zes, nove vezes, dez vezes, ou mais do que dez vezes. Em certas modalidades, uma ou mais etapas de seleção são realizadas e/ou re- petidas entre uma e dez vezes, entre uma e cinco vezes, ou entre três e cinco vezes. Em certas modalidades, uma ou mais etapas de sele- ção são repetidas três vezes.
[00101] Por exemplo, em alguns aspectos, específicas subpopula- ções de células T, tais como, células positivas ou expressando níveis elevados de um ou mais marcadores de superfície, por exemplo, célu- las T CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ e/ou CD45RO+, são isoladas por técnicas de seleção posi- tiva ou negativa. Em algumas modalidades, tais células são selecio- nadas por incubação com um ou mais anticorpo ou parceiro de ligação que especificamente se liga a tais marcadores. Em algumas modali- dades, o anticorpo ou parceiro de ligação pode ser conjugado, tal co- mo, diretamente ou indiretamente, a uma matriz ou suporte sólido para efetuar seleção, tal como, uma conta magnética ou conta paramagné- tica. Por exemplo, células T CD3+, CD28+ podem ser positivamente selecionadas usando contas magnéticas conjugadas a CD3/CD28 (por exemplo, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander, e/ou Ex- pACT® contas).
[00102] Em algumas modalidades, as células T são separadas de uma amostra de PBMC por seleção negativa de marcadores expres- sos sobre células não T, tais como, células B, monócitos, ou outras células brancas do sangue, tal como, CD14. Em alguns aspectos, uma etapa de seleção CD4+ ou CD8+ é usada para separar células T citotóxicas CD4+ auxiliar e CD8+. Tais populações de CD4+ e CD8+ podem ser também ordenadas em subpopulações por seleção positiva ou negativa para marcadores expressos ou expressos em um grau re- lativamente maior sobre uma ou mais subpopulações de célula T nai- ve, de memória e/ou efetoras.
[00103] Em algumas modalidades, as células T CD8+ são também enriquecidas ou esgotadas de células tronco naive, de memória cen- tral, memória efetora e/ou memória central, tal como, por seleção posi- tiva ou negativa com base em antígenos de superfície associados com a respectiva subpopulação. Em algumas modalidades, enriquecimento para células T de memória central (TCM) é realizado para aumentar eficácia, tal como, para melhorar sobrevivência a longo prazo, expan- são, e/ou enxerto após administração, o que em alguns aspectos é particularmente robusto em tais subpopulações. Veja Terakura et al., (2012) Blood,1:72–82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-
701. Em algumas modalidades, combinar células T CD8+ de TCM en- riquecidas e células T CD4+ também realça a eficácia.
[00104] Em modalidades, células T de memória estão presentes em ambos subconjuntos CD62L+ e CD62L de linfócitos de sangue perifé- rico CD8+. PBMC pode ser enriquecido para ou esgotado de frações CD62L-CD8+ e/ou CD62L+CD8+, tais como, usando anticorpos anti- CD8 e anti-CD62L.
[00105] Em algumas modalidades, o enriquecimento para células T de memória central (TCM) é com base em expressão de superfície po- sitiva ou elevada CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, e/ou CD 127; em alguns aspectos, é com base em seleção negativa para células expressando ou elevadamente expressando CD45RA e/ou granzima B. Em alguns aspectos, isolamento de uma população de CD8+ enri- quecida para células TCM é realizada por depleção de células expres- sando CD4, CD14, CD45RA, e seleção positiva ou enriquecimento para células expressando CD62L. Em um aspecto, enriquecimento pa- ra células T de memória central (TCM) é realizado iniciando com uma fração negativa de células selecionadas com base em expressão de CD4, que é submetida à seleção negativa com base em expressão de CD14 e CD45RA, e a seleção positiva com base em CD62L.
[00106] Tais seleções em alguns aspectos são realizadas simulta- neamente e em outros aspectos são realizadas sequencialmente, em qualquer ordem. Em alguns aspectos, a mesma etapa de seleção com base em expressão de CD4 usada na preparação da população ou subpopulação de célula T CD8+, é também usada para gerar a popu- lação ou subpopulação de célula T CD4+, de tal modo que ambas as frações positivas e negativas da separação com base em CD4 sejam retidas e usadas em etapas subsequentes dos métodos, opcionalmen- te após uma ou mais outras etapas de seleção positivas ou negativas. Em algumas modalidades, a seleção para a população de célula T CD4+ e a seleção para a população de célula T CD8+ são realizadas simultaneamente. Em algumas modalidades, a população de célula T CD4+ e a seleção para a população de célula T CD8+ são realizadas sequencialmente, em qualquer ordem. Em algumas modalidades, os métodos para selecionar células podem incluir aquelos como descrito em pedido dos Estados Unidos publicado No. US20170037369. Em algumas modalidades, a população de célula T CD4+ selecionada e a população de célula T CD8+ selecionada podem ser combinadas sub-
sequente à seleção. Em alguns aspectos, a população de célula T CD4+ selecionada e a população de célula T CD8+ selecionada po- dem ser combinadas em um saco de biorreator como descrito aqui. Em algumas modalidades, a população de célula T CD4+ selecionada e a população de célula T CD8+ selecionada são separadamente pro- cessadas, através das quais a população de célula T CD4+ seleciona- da é enriquecida em células T CD4+ e incubada com um reagente es- tinulatório (por exemplo, contas magnéticas anti-CD3/anti-CD28), transduzida com um vetor viral codificando uma proteína recombinante (por exemplo, CAR) e cultivada sob condições para expandir células T e a população de célula T CD8+ selecionada é enriquecida em célula T CD8+ e incubada com um reagente estimulatório (por exemplo, con- tas magnéticas anti-CD3/anti-CD28), transduzida com um vetor viral codificando uma proteína recombinante (por exemplo, CAR), tal como, a mesma proteína recombinante como para modificação das células T CD4+ do mesmo doador, e cultivada sob condições para expandir cé- lulas T, tal como, de acordo com os métodos fornecidos.
[00107] Em particulares modalidades, uma amostra biológica, por exemplo, uma amostra de PBMCs ou outras células brancas do san- gue, são submetidas à seleção de células T CD4+, onde ambas as frações positivas e negativas são retidas. Em certas modalidades, as células T CD8+ são selecionadas da fração negativa. Em algumas modalidades, uma amostra biológica é submetida à seleção de células T CD8+, onde ambas as frações positivas e negativas são retidas. Em certas modalidades, células T CD4+ são selecionadas de uma fração negativa.
[00108] Em um exemplo particular, uma amostra de PBMCs ou ou- tra amostra de célula branca do sangue é submetida à seleção de cé- lulas T CD4+, onde ambas as frações positivas e negativas são reti- das. A fração negativa então é submetida à seleção negativa com ba-
se em expressão de CD14 e CD45RA ou CD19, e seleção positiva com base em um marcador característico de células T de memória central, tais como, CD62L ou CCR7, onde as seleções positivas e ne- gativas são realizadas em qualquer ordem.
[00109] As células auxiliares T CD4+ podem ser ordenadas em cé- lulas naive, de memória central e efetoras identificando populações celulares que têm antígenos de superfície celular. Os linfócitos CD4+ podem ser obtidos por métodos padrão. Em algumas modalidades, linfócitos T CD4+ naive são células T CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ ou CD4+. Em algumas modalidades, células T CD4+ de memória cen- tral são CD62L+ e CD45RO+. Em algumas modalidades, células T CD4+ efetoras são CD62L- e CD45RO-.
[00110] Em um exemplo, para enriquecer células T CD4+ por sele- ção negativa, um coquetel de anticorpo monoclonal tipicamente inclui anticorpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, e CD8. Em al- gumas modalidades, o anticorpo ou parceiro de ligação é ligado a uma matriz ou suporte sólido, tal como, uma conta magnética ou conta pa- ramagnética, para permitir separação de células para seleção positiva e/ou negativa. Por exemplo, em algumas modalidades, as células e populações celulares são separadas ou isoladas usando técnicas de separação imunomagnética (ou afinidade magnética) (revisadas em Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Proto- cols, Vol. 2: Cell Behavior in vitro and in vivo, p 17-25 Editado por: S. A. Brooks e U. Schumacher © Humana Press Inc., Totowa, NJ).
[00111] Em alguns aspectos, a amostra incubada ou composição de células para ser separada é incubada com um reagente de seleção contendo material magnetizável ou magneticamente responsivo pe- queno, tais como, partículas ou micropartículas magneticamente res- ponsivas, tais como, contas paramagnéticas (por exemplo, tais como, contas Dynalbeads ou MACS®). O material magneticamente respon-
sivo, por exemplo, partícula, geralmente é diretamente ou indiretamen- te ligado a um parceiro de ligação, por exemplo, um anticorpo, que es- pecificamente se liga a uma molécula, por exemplo, marcador de su- perfície, presente sobre a célula, células, ou população de células que é desejada para separar, por exemplo, que é desejada para negativa- mente ou positivamente selecionar.
[00112] Em algumas modalidades, a conta ou partícula magnética compreende um material magneticamente responsivo ligado a um membro de ligação específico, tal como, um anticorpo ou outro parcei- ro de ligação. Muitos materiais magneticamente responsivos bem co- nhecidos para uso em métodos de separação magnética são conheci- dos, por exemplo, por aquelos descritos em Molday, Patente dos Es- tados Unidos No. 4.452.773, e em Especificação de Patente Europeia EP 452342 B, que são por este meio incorporados por referência. Par- tículas de tamanho coloidal, tais como, aquelas descritas em Patente dos Estados Unidos Owen No. 4.795.698, e Liberti et al., Patente dos Estados Unidos No. 5.200.084 também podem ser usadas.
[00113] A incubação geralmente é realizada sob condições através das quais os anticorpos ou parceiros de ligação, ou moléculas, tais como, anticorpos secundários ou outros reagentes, que especifica- mente se ligam tais anticorpos ou parceiros de ligação, que são liga- dos à conta ou partícula magnética, especificamente se ligam a molé- culas de superfície de célula se presentes em células dentro da amos- tra.
[00114] Em certas modalidades, as partículas magneticamente res- ponsivas são revestidas em anticorpos primários ou outros parceiros de ligação, anticorpos secundários, lectinas, enzimas, ou estreptavidi- na. Em certas modalidades, as partículas magnéticas são ligadas às células por meio de um revestimento de anticorpos primários específi- cos para um ou mais marcadores. Em certas modalidades, as células,
ao invés das contas, são marcadas com um anticorpo primário ou par- ceiro de ligação, e então anticorpo secundário específico de tipo celu- lar ou outras partículas magnéticas revestidas por parceiro de ligação (por exemplo, estreptavidina), são adicionados. Em certas modalida- des, partículas magnéticas revestidas por estreptavidina são usadas em conjunção com anticorpos primários ou secundários biotinilados.
[00115] Em alguns aspectos, a separação é ativada em um proce- dimento em que a amostra é colocada em um campo magnético, e aquelas células tendo partículas magnetizáveis ou magneticamente responsivas ligadas a isso serão atraídas ao magneto e separadas das células não marcadas. Para seleção positiva, as células que são atraí- das para o magneto são retidas; para seleção negativa, as células que não são atraídas (células não marcadas) são retidas. Em alguns as- pectos, uma combinação de seleção positiva e negativa é realizada durante a mesma etapa de seleção, onde as frações positivas e nega- tivas são retidas e também processadas ou submetidas a outras eta- pas de separação.
[00116] Em algumas modalidades, a seleção com base em afinida- de é por meio de classificação de célula ativada magnética (MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Classificação de célula ativada magné- tica (MACS), por exemplo, sistemas CliniMACS são capazes de sele- ção de alta pureza de células tendo partículas magnetizadas ligadas a isso. Em certas modalidades, MACS opera em um modo em que as espécies alvo e não alvo são sequencialmente eluídas após a aplica- ção do campo magnético externo. Isto é, as células ligadas às partícu- las magnetizadas são mantidas no lugar enquanto as espécies não ligadas são eluídas. Em seguida, após esta primeira etapa de eluição ser concluída, as espécies que foram presas no campo magnético e foram prevenidas de ser eluídas são liberadas de alguma maneira de tal modo que elas podem ser eluídas e recuperadas. Em certas moda-
lidades, as células não alvo são marcadas e esgotadas da população heterogênea de células.
[00117] Em algumas modalidades, as partículas magneticamente responsivas são deixadas ligadas às células que devem ser subse- quentemente incubadas, cultivadas e/ou modificadas; em alguns as- pectos, as partículas são deixadas ligadas às células para administra- ção a um paciente. Em algumas modalidades, as partículas magneti- záveis ou magneticamente responsivas são removidas das células. Métodos para remover partículas magnetizáveis de células são conhe- cidos e incluem, por exemplo, o uso de anticorpos não marcados con- correntes, partículas magnetizáveis ou anticorpos conjugados aos li- gadores cliváveis, etc. Em algumas modalidades, as partículas mag- netizáveis são biodegradáveis.
[00118] Em algumas modalidades, a isolação e/ou seleção resulta em uma ou mais composições de entrada de células T enriquecidas, por exemplo, células T CD3+, células T CD4+, e/ou células T CD8+. Em algumas modalidades, duas ou mais composições de entrada se- paradas são isoladas, selecionadas, enriquecidas ou obtidas de uma amostra biológica única. Em algumas modalidades, composições de entrada separadas são isoladas, selecionadas, enriquecidas e/ou obti- das de amostras biológicas separadas coletadas, tomadas e/ou obti- das de um mesmo indivíduo.
[00119] Em certas modalidades, uma ou mais composições de en- trada é ou inclui uma composição de células T enriquecidas que inclui pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo me- nos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,9%, ou em ou em cerca de 100% de células T CD3+. Em particular modalidade, a composição de entrada de células T enrique- cidas consiste essencialmente em células T CD3+.
[00120] Em certas modalidades, uma ou mais composições de en- trada é ou inclui uma composição de células T CD4+ enriquecidas que inclui pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo me- nos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,9%, ou em ou em cerca de 100% de células T CD4+. Em certas modalidades, a composição de entrada de células T CD4+ inclui menos do que 40%, menos do que 35%, menos do que 30%, menos do que 25%, menos do que 20%, menos do que 15%, menos do que 10%, menos do que 5%, menos do que 1%, menos do que 0,1%, ou menos do que 0,01% de células T CD8+, e/ou não contém nenhuma célula T CD8+, e/ou é livre ou substancialmente livre de cé- lulas T CD8+. Em algumas modalidades, a composição de células T enriquecidas consiste essencialmente em células T CD4+.
[00121] Em certas modalidades, uma ou mais composições é ou inclui uma composição de células T CD8+ que é ou inclui pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo me- nos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,9%, ou em ou em cerca de 100% de células T CD8+. Em certas modalida- des, a composição de células T CD8+ contém menos do que 40%, menos do que 35%, menos do que 30%, menos do que 25%, menos do que 20%, menos do que 15%, menos do que 10%, menos do que 5%, menos do que 1%, menos do que 0,1%, ou menos do que 0,01% de células T CD4+, e/ou não contém nenhuma célula T CD4+, e/ou é livre de ou substancialmente livre de células T CD4+. Em algumas modalidades, a composição de células T enriquecidas consiste essen- cialmente em células T CD8+.
[00122] Em algumas modalidades, uma ou mais composições de entrada de células T enriquecidas são congeladas, por exemplo, crio-
preservadas e/ou criocongeladas, após isolamento, seleção e/ou enri- quecimento. Em algumas modalidades, uma ou mais composições de entrada são congeladas, por exemplo, criopreservadas e/ou crioconge- ladas, antes de quaisquer etapas de incubação, ativação, estimulação, modificação, transdução, transfecção, cultivo, expansão, colheita e/ou formulação da composição de células. Em particulares modalidades, uma ou mais composições de entrada congeladas são armazenadas, por exemplo, em ou em cerca de -80 °C, durante entre 12 horas e 7 dias, entre 24 horas e 120 horas, ou entre 2 dias e 5 dias. Em particu- lares modalidades, uma ou mais composições de entrada congeladas são armazenadas em ou em cerca de -80 °C, durante um período de tempo de menos do que 10 dias, 9 dias, 8 dias, 7 dias, 6 dias, ou 5 di- as, 4 dias, 3 dias, 2 dias, ou 1 dia. Em algumas modalidades, uma ou mais composições de entrada congeladas são armazenadas em ou em cerca de -80 °C, durante ou durante cerca de 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias ou 6 dias. B. Ativação e Estimulação de células
[00123] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos são usa- dos em conexão com incubação de células sob condições de estimu- lação. Em algumas modalidades, as condições de estimulação inclu- em condições que ativam ou estimulam, e/ou são capazes de ativar ou estimular um sinal na célula, por exemplo, uma célula T CD4+ ou célu- la T CD8+, tal como, um sinal gerado de um TCR e/ou uma correcep- tor. Em algumas modalidades, as condições de estimulação incluem uma ou mais etapas de cultura, cultivo, incubação, ativação, propaga- ção das células com e/ou na presença de um reagente estimulatório, por exemplo, um reagente que ativa ou estimula, e/ou é capaz de ati- var ou estimular um sinal na célula. Em algumas modalidades, o rea- gente estimulatório estimula e/ou ativa um TCR e/ou um correceptor. Em particulares modalidades, o reagente estimulatório é um reagente descrito na Seção I-B-1.
[00124] Em certas modalidades, uma ou mais composições de célu- las T enriquecidas são incubadas sob condições de estimulação antes de modificar geneticamente as células, por exemplo, transfectando e/ou transduzindo a célula, tal como, por uma técnica fornecida na Se- ção I-C. Em particulares modalidades, uma ou mais composições de células T enriquecidas são incubadas sob condições de estimulação após uma ou mais composições serem isoladas, selecionadas, enri- quecidas ou obtidas de uma amostra biológica. Em particulares moda- lidades, uma ou mais composições são composições de entrada. Em particulares modalidades, uma ou mais composições de entrada foram anteriormente congeladas e armazenadas, e são descongeladas antes da incubação.
[00125] Em certas modalidades, uma ou mais composições de célu- las T enriquecidas são ou incluem duas composições separadas, por exemplo, composições de entrada separadas, de células T enriqueci- das. Em particulares modalidades, duas composições de células T enriquecidas separadas, por exemplo, duas composições de células T enriquecidas separadas selecionadas, isoladas, e/ou enriquecidas da mesma amostra biológica, são separadamente incubadas sob condi- ções de estimulação. Em certas modalidades, as duas composições separadas incluem uma composição de células T CD4+ enriquecidas. Em particulares modalidades, as duas composições separadas inclu- em uma composição de células T CD8+ enriquecidas. Em algumas modalidades, duas composições separadas de células T CD4+ enri- quecidas e células T CD8+ enriquecidas são separadamente incuba- das sob condições de estimulação.
[00126] Em algumas modalidades, uma composição simples de cé- lulas T enriquecidas é incubada sob condições de estimulação. Em certas modalidades, a composição simples é uma composição de célu-
las T CD4+ enriquecidas. Em algumas modalidades, a composição simples é uma composição de células T CD4+ e CD8+ enriquecidas que foram combinadas de composições separadas antes da incuba- ção.
[00127] Em algumas modalidades, a composição de células T CD4+ enriquecidas que é incubada sob condições de estimulação in- clui pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo me- nos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,9%, ou em ou em cerca de 100% de células T CD4+. Em certas modalidades, a composição de células T CD4+ enriquecidas que é incubada sob condições de estimulação inclui menos do que 40%, menos do que 35%, menos do que 30%, menos do que 25%, menos do que 20%, menos do que 15%, menos do que 10%, menos do que 5%, menos do que 1%, menos do que 0,1%, ou menos do que 0,01% de células T CD8+, e/ou não contém nenhuma célula T CD8+, e/ou é livre ou substancialmente livre de células T CD8+.
[00128] Em algumas modalidades, a composição de células T CD8+ enriquecidas que é incubada sob condições de estimulação in- clui pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo me- nos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,9%, ou em ou em cerca de 100% de células T CD8+. Em certas modalidades, a composição de células T CD8+ enriquecidas que é incubada sob condições de estimulação inclui menos do que 40%, menos do que 35%, menos do que 30%, menos do que 25%, menos do que 20%, menos do que 15%, menos do que 10%, menos do que 5%, menos do que 1%, menos do que 0,1%, ou menos do que 0,01% de células T CD4+, e/ou não contém nenhuma célula T CD4+, e/ou é livre ou substancialmente livre de células T CD4+.
[00129] Em algumas modalidades, as composições separadas de células T CD4+ e CD8+ enriquecidas são combinadas em uma com- posição simples e são incubadas sob condições de estimulação. Em certas modalidades, composições estimuladas separadas de células T CD4+ e CD8+ enriquecidas são combinadas em uma composição simples após a incubação ser realizada e/ou concluída. Em algumas modalidades, as composições estimuladas separadas de células T CD4+ estimuladas e CD8+ estimuladas são separadamente processa- das após a incubação ser realizada e/ou concluída, através da qual a população de célula T CD4+ estimulada (por exemplo, incubada com estimulação de um reagente estimulatório de conta magnética anti- CD3/anti-CD28) é transduzida com um vetor viral codificando uma pro- teína recombinante (por exemplo, CAR) e cultivada sob condições pa- ra expandir células T e a população de célula T CD8+ estimulada (por exemplo, incubada com estimulação de um reagente estimulatório de conta magnética anti-CD3/anti-CD28) é transduzida com um vetor viral codificando uma proteína recombinante (por exemplo, CAR), tal como, a mesma proteína recombinante como para modificação das células T CD4+ do mesmo doador, e cultivada sob condições para expandir cé- lulas T, tal como, de acordo com os métodos fornecidos.
[00130] Em algumas modalidades, a incubação sob condições de estimulação pode incluir cultura, cultivo, estimulação, ativação, propa- gação, incluindo incubação na presença de condições de estimulação, por exemplo, condições designadas para induzir proliferação, expan- são, ativação e/ou sobrevivência de células na população, para imitar a exposição ao antígeno, e/ou preparar as células para modificação genética, tais como, para a introdução de um receptor de antígeno re- combinante. Em particulares modalidades, as condições de estimula- ção podem incluir um ou mais de meio particular, temperatura, conteú- do de oxigênio, conteúdo de dióxido de carbono, tempo, agentes, por exemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, íons e/ou fatores esti- mulatórios, tais como, citocinas, quimiocinas, antígenos, parceiros de ligação, proteínas de fusão, receptores solúveis recombinantes, e quaisquer outros agentes designados para ativar as células.
[00131] Em alguns aspectos, a estimulação e/ou incubação sob condições de estimulação é realizada de acordo com técnicas, tais como, aquelas descritas em Patente dos Estados Unidos No. 6.040.1 77 em Riddell et al., Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651– 660, Terakura et al. (2012) Blood,1:72–82, e/ou Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.
[00132] Em algumas modalidades, as células, por exemplo, células T, composições de células e/ou populações celulares, tais como, célu- las T CD4+ e CD8+ ou composições, populações, ou subpopulações das mesmas, são expandidas adicionando-se às células alimentadoras de composição iniciadora de cultura, tais como, células mononucleares de sangue periférico não divididas (PBMCs) (por exemplo, de tal modo que a população de células resultante contenha pelo menos cerca de 5, 10, 20, ou 40 ou mais células alimentadoras de PBMC para cada linfócito T na população inicial a ser expandida); e incubando a cultura (por exemplo, durante um tempo suficiente para expandir os números de células T). Em alguns aspectos, as células alimentadoras não divi- didas podem compreender células alimentadoras de PBMC irradiadas por gama. Em algumas modalidades, as PBMC são irradiadas com raios gama na faixa de cerca de 3000 a 3600 rads para prevenir a divi- são celular. Em alguns aspectos, as células alimentadoras são adicio- nadas ao meio de cultura antes da adição das populações de células T.
[00133] Em algumas modalidades, as condições de estimulação incluem temperaturas adequadas para o desenvolvimento de linfócitos T humanos, por exemplo, pelo menos cerca de 25 graus Celsius, ge-
ralmente pelo menos cerca de 30 graus, e geralmente a ou cerca de 37 graus Celsius. Em algumas modalidades, a mudança de temperatu- ra é efetuada durante a cultura, tais como, de 37 graus Celsius a 35 graus Celsius. Opcionalmente, a incubação pode também compreen- der adicionar células linfoblastoides transformadas em EBV não dividi- das (LCL) como células alimentadoras. LCL podem ser irradiadas com raios gama na faixa de cerca de 6000 a 10.000 rads. As células ali- mentadoras de LCL, em alguns aspectos, são fornecidas em qualquer quantidade adequada, tal como, uma relação de células alimentadoras de LCL para linfócitos T iniciais de pelo menos cerca de 10:1.
[00134] Em modalidades, as populações de CD4+ e CD8+ que são específicas de antígeno podem ser obtidas por estimulação de linfóci- tos T específicos ao antígeno ou naive com antígeno. Por exemplo, clones ou linhagens de célula T específicas de antígeno podem ser gerados para antígenos de citomegalovírus isolando células T de indi- víduos infectados e estimulando as células in vitro com o mesmo antí- geno. As células T naive podem também ser usadas.
[00135] Em particulares modalidades, as condições de estimulação incluem incubação, cultura e/ou cultivo das células com um reagente estimulatório. Em particulares modalidades, o reagente estimulatório é um reagente descrito na Seção I-B-1. Em certas modalidades, o rea- gente estimulatório contém ou inclui uma conta. Um reagente estimula- tório exemplar é ou inclui contas magnéticas anti-CD3/anti-CD28. Em certas modalidades, o início e/ou iniciação da incubação, cultura e/ou cultivo das células sob condições de estimulação ocorrem quando as células entram em contato com e/ou são incubadas com o reagente estimulatório. Em particulares modalidades, as células são incubadas antes de, durante e/ou subsequente a modificar geneticamente as cé- lulas, por exemplo, introduzindo um polinucleotídeo recombinante em uma célula, tal como, por transdução ou transfecção.
[00136] Em algumas modalidades, as composições de células T enriquecidas são incubadas em uma relação de contas e/ou reagente estimulatório, por exemplo, contas magnéticas anti-CD3/anti-CD28, para células em ou em cerca de 3:1, 2,5:1, 2:1, 1,5:1, 1,25:1, 1,2:1, 1,1:1, 1:1, 0,9:1, 0,8:1, 0,75:1, 0,67:1, 0,5:1, 0,3:1, ou 0,2:1. Em parti- culares modalidades, a relação de contas e/ou reagente estimulatório para células é entre 2,5:1 e 0,2:1, entre 2:1 e 0,5:1, entre 1,5:1 e 0,75:1, entre 1,25:1 e 0,8:1, entre 1,1:1 e 0,9:1. Em particulares moda- lidades, a relação de reagente estimulatório para células é cerca de 1:1 ou é 1:1.
[00137] Em particulares modalidades, incubação das células em uma relação de menos do que 3:1 ou menos do que 3 reagentes esti- mulatórios, por exemplo, contas magnéticas anti-CD3/anti-CD28 por célula, tal como, uma relação de 1:1, reduz a quantidade de morte ce- lular que ocorre durante a incubação, por exemplo, tal como, por morte celular induzida por ativação. Em algumas modalidades, as células são incubadas com o reagente estimulatório, por exemplo, contas magnéticas anti-CD3/anti-CD28, em uma relação de contas para célu- las de menos do que 3 (ou 3:1 ou menos do que 3 contas por célula). Em particulares modalidades, incubação das células em uma relação de menos do que 3:1 ou menos do que 3 contas por célula, tal como, uma relação de 1:1, reduz a quantidade de morte celular que ocorre durante a incubação, por exemplo, tal como, morte celular induzida por ativação.
[00138] Em particulares modalidades, a composição de células T enriquecidas é incubada com o reagente estimulatório, por exemplo, contas magnéticas anti-CD3/anti-CD28, em uma relação de menos do que 3:1 de reagentes estimulatórios e/ou contas por célula, tal como, uma relação de 1:1, e pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo me-
nos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99%, ou pelo menos 99,9% de sobrevivência de células T, por exemplo, são viáveis e/ou não sofrem necrose, morte celular programada, ou apoptose, durante ou pelo me- nos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, ou mais do que 7 dias após a incubação ser concluída. Em particulares modalidades, a composição de células T enriquecidas é incubada com o reagente es- timulatório em uma relação de menos do que 3:1 de reagentes estimu- latórios e/ou contas por célula, por exemplo, uma relação de 1:1, e menos do que 50%, menos do que 40%, menos do que 30%, menos do que 25%, menos do que 20%, menos do que 15%, menos do que 10%, menos do que 5%, menos do que 1%, menos do que 0,1% ou menos do que 0,01% das células sofrem morte celular induzida por ativação durante a incubação.
[00139] Em certas modalidades, a composição de células T enri- quecidas é incubada com o reagente estimulatório, por exemplo, con- tas magnéticas anti-CD3/anti-CD28, em uma relação de menos do que 3:1 de contas por célula, por exemplo, uma relação de 1:1, e as célu- las da composição têm pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo me- nos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pe- lo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes ou pelo menos 100 vezes maior sobrevivência quando comparadas às células sofrendo um processo exemplar e/ou alternativo onde a com- posição de células T enriquecidas em incubação com o reagente esti- mulatório em uma relação de 3:1 ou maior.
[00140] Em algumas modalidades, a composição de células T enri- quecidas incubada com o reagente estimulatório compreende de 1,0 x 105 células/mL a 1,0 x 108 células/mL ou de cerca de 1,0 x 105 célu-
las/mL a cerca de 1,0 x 108 células/mL, tais como, pelo menos ou cer- ca de pelo menos ou cerca de 1,0 x 105 células/mL, 5 x 105 célu- las/mL, 1 x 106 células/mL, 5 x 106 células/mL, 1 x 107 células/mL, 5 x 107 células/mL ou 1 x 108 células/mL. Em algumas modalidades, a composição de células T enriquecidas incubada com o reagente esti- mulatório compreende cerca de 0,5 x 106 células/mL, 1 x 106 célu- las/mL, 1,5 x 106 células/mL, 2 x 106 células/mL, 2,5 x 106 células/mL, 3 x 106 células/mL, 3,5 x 106 células/mL, 4 x 106 células/mL, 4,5 x 106 células/mL, 5 x 106 células/mL, 5,5 x 106 células/mL, 6 x 106 célu- las/mL, 6,5 x 106 células/mL, 7 x 106 células/mL, 7,5 x 106 células/mL, 8 x 106 células/mL, 8,5 x 106 células/mL, 9 x 106 células/mL, 9,5 x 106 células/mL, ou 10 x 106 células/mL, tal como, cerca de 2,4 x 106 célu- las/mL.
[00141] Em algumas modalidades, a composição de células T enri- quecidas é incubada com o reagente estimulatório em uma temperatu- ra de cerca de 25 a cerca de 38 °C, tais como, de cerca de 30 a cerca de 37 °C, por exemplo, a ou cerca de 37 ºC ± 2 ºC. Em algumas mo- dalidades, a composição de células T enriquecidas é incubada com o reagente estimulatório em um nível de CO2 de cerca de 2,5% a cerca de 7,5%, tais como, de cerca de 4% a cerca de 6%, por exemplo em ou cerca de 5% ± 0,5%. Em algumas modalidades, a composição de células T enriquecidas é incubada com o reagente estimulatório em uma temperatura de ou cerca de 37 °C e/ou em um nível de CO2 de ou cerca de 5%.
[00142] Em particulares modalidades, as condições de estimulação incluem incubação, cultura e/ou cultivo de uma composição de células T enriquecidas com e/ou na presença de uma ou mais citocinas. Em particulares modalidades, as referidas uma ou mais citocinas são cito- cinas recombinantes. Em algumas modalidades, as referidas uma ou mais citocinas são citocinas recombinantes humanas. Em certas mo-
dalidades, as referidas uma ou mais citocinas ligam-se a e/ou são ca- pazes de se ligarem a receptores que são expressos por e/ou são en- dógenos às células T. Em particulares modalidades, as referidas uma ou mais citocinas é ou inclui um membro da família de pacote 4-alfa- helix de citocinas. Em algumas modalidades, membros da família de pacote 4-alfa-helix de citocinas incluem, porém não são limitados a, interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4), interleucina-7 (IL-7), interleu- cina-9 (IL-9), interleucina 12 (IL-12), interleucina 15 (IL-15), fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF) e fator de estimulação de colônia de macrófago de granulócito (GM-CSF). Em algumas mo- dalidades, as referidas uma ou mais citocinas é ou inclui IL-15. Em particulares modalidades, as referidas uma ou mais citocinas é ou in- clui IL-7. Em particulares modalidades, as referidas uma ou mais cito- cinas é ou inclui IL-2. Em algumas modalidades, as condições de es- timulação incluem incubação de composição de células T enriqueci- das, tais como, células T CD4+ enriquecidas ou células T CD8+ enri- quecidas, na presença de um reagente estimulatório, por exemplo, contas magnéticas anti-CD3/anti-CD28, como descrito e na presença ou uma ou mais citocinas recombinantes.
[00143] Em particulares modalidades, as composições de células T CD4+ enriquecidas são incubadas com IL-2, por exemplo, IL-2 recom- binante. Sem querer ficar vinculado pela teoria, particulares modalida- des contemplam que células T CD4+ que são obtidas de alguns indiví- duos não produzem, ou não suficientemente produzem, IL-2 em quan- tidades que permitem desenvolvimento, divisão e expansão ao longo do processo para gerar uma composição de células de saída, por exemplo, células modificadas adequadas para uso em terapia celular. Em algumas modalidades, incubando uma composição de células T CD4+ enriquecidas sob condições de estimulação na presença de IL-2 recombinante aumenta a probabilidade ou possibilidade de que as cé-
lulas T CD4+ da composição continuarão a sobreviver, desenvolver, expandir e/ou ativar durante a etapa de incubação e ao longo do pro- cesso. Em algumas modalidades, incubando a composição de células T CD4+ enriquecidas na presença de IL-2 recombinante aumenta a probabilidade e/ou possibilidade de que uma composição de saída de células T CD4+ enriquecidas, por exemplo, células T CD4+ modifica- das adequadas para terapia celular, será produzida da composição de células T CD4+ enriquecidas por pelo menos 0,5%, pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pe- lo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pe- lo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo me- nos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes quando comparada a um método alternativo e/ou exemplar que não incuba a composição de células T CD4+ enriqueci- das na presença de IL-2 recombinante.
[00144] Em certas modalidades, a quantidade ou concentração das referidas uma ou mais citocinas é medida e/ou quantificada com uni- dades internacionais (IU). Unidades internacionais podem ser usadas para quantificar vitaminas, hormônios, citocinas, vacinas, produtos de sangue, e similares substâncias biologicamente ativas. Em algumas modalidades, IU são ou incluem unidades de medição da potência de preparações biológicas por comparação a um padrão de referência internacional de um comprimento e peso específico, por exemplo, 1o padrão internacional WHO para IL-2 humano, 86/504. Unidades inter- nacionais são o método reconhecido e padronizado somente para re-
portar unidades de atividade biológica que são publicadas e são deri- vadas de um esforço internacional de pesquisa colaborativa. Em parti- culares modalidades, a IU para composição, amostra ou fonte de uma citocina pode ser obtida através de teste de comparação de produto com um produto padrão WHO análogo. Por exemplo, em algumas modalidades, a IU/mg de uma composição, amostra, ou fonte de IL-2, IL-7, ou IL-15 recombinante humano é comparada ao produto IL-2 pa- drão WHO (código de NIBSC: 86/500), o produto IL-17 padrão WHO (código de NIBSC: 90/530) e o produto IL-15 padrão WHO (código de NIBSC: 95/554), respectivamente.
[00145] Em algumas modalidades, a atividade biológica em IU/mg é equivalent a (ED50 em ng/ml)-1 x106. Em particulares modalidades, a ED50 de IL-2 ou IL-15 humano recombinante é equivalente à concen- tração requerida para a estimulação semimáxima de proliferação celu- lar (clivagem de XTT) com células CTLL-2. Em certas modalidades, a ED50 de IL-7 humano recombinante é equivalente à concentração re- querida para a estimulação semimáxima para proliferação de linfócitos de sangue periférico humano ativados por PHA. Detalhes relaciona- dos aos ensaios e cálculos de IU para IL-2 são discutidos em Wadhwa et al., Journal of Immunological Methods (2013), 379 (1-2): 1-7; e Gea- ring e Thorpe, Journal of Immunological Methods (1988), 114 (1-2): 3- 9; detalhes relacionados aos ensaios e cálculos de IU para IL-15 são discutidos em Soman et al. Journal of Immunological Methods (2009) 348 (1-2): 83-94; por este meio incorporados por referência em sua totalidade.
[00146] Em particulares modalidades, uma composição de células T CD8+ enriquecidas é incubada sob condições de estimulação na pre- sença de IL-2 e/ou IL-15. Em certas modalidades, uma composição de células T CD4+ enriquecidas é incubada sob condições de estimu- lação na presença de IL-2, IL-7, e/ou IL-15. Em algumas modalidades,
os IL-2, IL-7, e/ou IL-15 são recombinantes. Em certas modalidades, os IL-2, IL-7, e/ou IL-15 são humanos. Em particulares modalidades, as referidas uma ou mais citocinas são ou incluem IL-2, IL-7 e/ou IL-15 recombinante humano. Em alguns aspectos, a incubação da composi- ção de célula T enriquecida também inclui a presença de um reagente estimulatório, por exemplo, contas magnéticas anti-CD3/anti-CD28.
[00147] Em algumas modalidades, as células são incubadas com a citocina, por exemplo, uma citocina humana recombinante, em uma concentração de entre 1 IU/ml e 1,000 IU/ml, entre 10 IU/ml e 50 IU/ml, entre 50 IU/ml e 100 IU/ml, entre 100 IU/ml e 200 IU/ml, entre 100 IU/ml e 500 IU/ml, entre 250 IU/ml e 500 IU/ml, ou entre 500 IU/ml e 1,000 IU/ml.
[00148] Em algumas modalidades, uma composição de células T enriquecidas é incubada com IL-2, por exemplo, IL-2 recombinante humano, em uma concentração entre 1 IU/ml e 200 IU/ml, entre 10 IU/ml e 200 IU/ml, entre 10 IU/ml e 100 IU/ml, entre 50 IU/ml e 150 IU/ml, entre 80 IU/ml e 120 IU/ml, entre 60 IU/ml e 90 IU/ml, ou entre 70 IU/ml e 90 IU/ml. Em particulares modalidades, a composição de células T enriquecidas é incubada com IL-2 recombinante em uma concentração em ou em cerca de 50 IU/ml, 55 IU/ml, 60 IU/ml, 65 IU/ml, 70 IU/ml, 75 IU/ml, 80 IU/ml, 85 IU/ml, 90 IU/ml, 95 IU/ml, 100 IU/ml, 110 IU/ml, 120 IU/ml, 130 IU/ml, 140 IU/ml ou 150 IU/ml. Em algumas modalidades, a composição de células T enriquecidas é incu- bada na presença de ou de cerca de 85 IU/ml de IL-2 recombinante. Em algumas modalidades, a composição incubada com IL-2 recombi- nante é enriquecida para a população de células T, por exemplo, célu- las T CD4+ e/ou células T CD8+. Em algumas modalidades, a popula- ção de células T é a população de células T CD4+. Em algumas mo- dalidades, a composição de células T enriquecidas é uma composição de células T CD8+ enriquecidas. Em particulares modalidades, a com-
posição de células T enriquecidas é enriquecida para células T CD8+, onde células T CD4+ não são enriquecidas e/ou onde células T CD4+ são negativamente selecionadas ou esgotadas da composição. Em algumas modalidades, a composição de células T enriquecidas é uma composição de células T CD4+ enriquecidas. Em particulares modali- dades, a composição de células T enriquecidas é enriquecida para cé- lulas T CD4+, onde células T CD8+ não são enriquecidas e/ou onde células T CD8+ são negativamente selecionadas ou esgotadas da composição. Em algumas modalidades, uma composição de célula T CD4+ enriquecida incubada com IL-2 recombinante pode também ser incubada com IL-7 recombinante e/ou IL-15 recombinante, tais como, em quantidades descritas. Em algumas modalidades, uma composição de célula T CD8+ enriquecida incubada com IL-2 recombinante pode também ser incubada com IL-15 recombinante, tais como, em quanti- dades descritas.
[00149] Em algumas modalidades, uma composição de células T enriquecidas é incubada com IL-7 recombinante, por exemplo, IL-7 re- combinante humano, em uma concentração entre 100 IU/ml e 2,000 IU/ml, entre 500 IU/ml e 1,000 IU/ml, entre 100 IU/ml e 500 IU/ml, entre 500 IU/ml e 750 IU/ml, entre 750 IU/ml e 1,000 IU/ml, ou entre 550 IU/ml e 650 IU/ml. Em particulares modalidades, a composição de cé- lulas T enriquecidas é incubada com IL-7 recombinante em uma con- centração em ou em cerca de 50 IU/ml, 100 IU/ml, 150 IU/ml, 200 IU/ml, 250 IU/ml, 300 IU/ml, 350 IU/ml, 400 IU/ml, 450 IU/ml, 500 IU/ml, 550 IU/ml, 600 IU/ml, 650 IU/ml, 700 IU/ml, 750 IU/ml, 800 IU/ml, 750 IU/ml, 750 IU/ml, 750 IU/ml, ou 1,000 IU/ml. Em particula- res modalidades, a composição de células T enriquecidas é incubada na presença de ou de cerca de 600 IU/ml de IL-7 recombinante. Em algumas modalidades, a composição incubada com IL-7 recombinante é enriquecida para a população de células T, por exemplo, células T
CD4+. Em algumas modalidades, uma composição de célula T CD4+ enriquecida incubada com IL-7 recombinante pode também ser incu- bada com IL-2 recombinante e/ou IL-15 recombinante, tais como, em quantidades descritas. Em particulares modalidades, a composição de células T enriquecidas é enriquecida para células T CD4+, onde célu- las T CD8+ não são enriquecidas e/ou onde células T CD8+ são nega- tivamente selecionadas ou esgotadas da composição. Em algumas modalidades, uma composição de célula T CD8+ enriquecida não é incubada com IL-7 recombinante.
[00150] Em algumas modalidades, uma composição de células T enriquecidas é incubada com IL-15 recombinante, por exemplo, IL-15 recombinante humano, em uma concentração entre 0,1 IU/ml e 100 IU/ml, entre 1 IU/ml e 100 IU/ml, entre 1 IU/ml e 50 IU/ml, entre 5 IU/ml e 25 IU/ml, entre 25 IU/ml e 50 IU/ml, entre 5 IU/ml e 15 IU/ml, ou entre 10 IU/ml e 100 IU/ml. Em particulares modalidades, a composição de células T enriquecidas é incubada com IL-15 recombinante em uma concentração em ou em cerca de 1 IU/ml, 2 IU/ml, 3 IU/ml, 4 IU/ml, 5 IU/ml, 6 IU/ml, 7 IU/ml, 8 IU/ml, 9 IU/ml, 10 IU/ml, 11 IU/ml, 12 IU/ml, 13 IU/ml, 14 IU/ml, 15 IU/ml, 20 IU/ml, 25 IU/ml, 30 IU/ml, 40 IU/ml, ou 50 IU/ml. Em algumas modalidades, a composição de células T enri- quecidas é incubada em ou em cerca de 10 IU/ml de IL-15 recombi- nante. Em algumas modalidades, a composição incubada com IL-15 recombinante é enriquecida para a população de células T, por exem- plo, células T CD4+ e/ou células T CD8+. Em algumas modalidades, a população de células T é a população de células T CD4+. Em algu- mas modalidades, a composição de células T enriquecidas é uma composição de células T CD8+ enriquecidas. Em particulares modali- dades, a composição de células T enriquecidas é enriquecida para cé- lulas T CD8+, onde células T CD4+ não são enriquecidas e/ou onde células T CD4+ são negativamente selecionadas ou esgotadas da composição. Em algumas modalidades, a composição de células T enriquecidas é uma composição de células T CD4+ enriquecidas. Em particulares modalidades, a composição de células T enriquecidas é enriquecida para células T CD4+, onde células T CD8+ não são enri- quecidas e/ou onde células T CD8+ são negativamente selecionadas ou esgotadas da composição. Em algumas modalidades, uma com- posição de célula T CD4+ enriquecida incubada com IL-15 recombi- nante pode também ser incubada com IL-7 recombinante e/ou IL-2 re- combinante, tais como, em quantidades descritas. Em algumas moda- lidades, uma composição de célula T CD8+ enriquecida incubada com IL-15 recombinante pode também ser incubada com IL-2 recombinan- te, tais como, em quantidades descritas.
[00151] Em particulares modalidades, as células, tais como, células T CD4+ enriquecidas e/ou células T CD8+ enriquecidas, são incuba- das com o reagente estimulatório na presença de um ou mais antioxi- dantes. Em algumas modalidades, os antioxidantes incluem, porém não são limitados a, um ou mais antioxidantes que compreendem um tocoferol, um tocotrienol, alfa-tocoferol, beta-tocoferol, gama-tocoferol, delta-tocoferol, alfa-tocotrienol, beta-tocotrienol, alfa-tocoferolquinona, Trolox (ácido 6-hidróxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico), hidroxi- anisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), um flavonoide, um isoflavona, licopeno, beta-caroteno, selênio, ubiquinona, luetina, S- adenosilmetionina, glutationa, taurina, N-acetil cisteína (NAC), ácido cítrico, L-carnitina, BHT, monotioglicerol, ácido ascórbico, propil galato, metionina, cisteína, homocisteína, glutationa, cistamina e cistationina e/ou glicina-glicina-histidina. Em alguns aspectos, a incubação da composição de célula T enriquecida, tais como, células T CD4+ enri- quecidas e/ou células T CD8+ enriquecidas, com um antioxidante tam- bém inclui a presença de um reagente estimulatório, por exemplo, con- tas magnéticas anti-CD3/anti-CD28, e uma ou mais citocinas recombi-
nantes, tais como descrito.
[00152] Em algumas modalidades, os referidos um ou mais antioxi- dantes é ou inclui um oxidante contendo enxofre. Em certas modali- dades, um antioxidante contendo enxofre pode incluir antioxidantes contendo tiol e/ou antioxidantes que exibem uma ou mais porções de enxofre, por exemplo, dentro de uma estrutura de anel. Em algumas modalidades, os antioxidantes contendo enxofre podem incluir, por exemplo, N-acetilcisteína (NAC) e 2,3-dimercaptopropanol (DMP), L-2- oxo-4-tiazolidinacarboxilato (OTC) e ácido lipoico. Em particulares modalidades, o antioxidante contendo enxofre é um precursor de glu- tationa. Em algumas modalidades, o precursor de glutationa é uma molécula que pode ser modificada em uma ou mais etapas dentro de uma célula para glutationa derivada. Em particulares modalidades, um precursor de glutationa pode incluir, porém não é limitado a, N-acetil cisteína (NAC), ácido L-2-oxotiazolidina-4-carboxílico (Procisteína), ácido lipoico, S-alil cisteína ou cloreto de sulfônio de metilmetionina.
[00153] Em algumas modalidades, incubação das células, tais co- mo, células T CD4+ enriquecidas e/ou células T CD8+ enriquecidas, sob condições de estimulação inclui incubação das células na presen- ça de um ou mais antioxidantes. Em particulares modalidades, as célu- las são estimuladas com o reagente estimulatório na presença de um ou mais antioxidantes. Em algumas modalidades, as células são incu- badas na presença de entre 1 ng/ml e 100 ng/ml, entre 10 ng/ml e 1µg/ml, entre 100 ng/ml e 10 µg/ml, entre 1 µg/ml e 100 µg/ml, entre 10 µg/ml e 1 mg/ml, entre 100 µg/ml e 1 mg/ml, entre 1 500 µg/ml e 2 mg/ml, 500 µg/ml e 5 mg/ml, entre 1 mg/ml e 10 mg/ml, ou entre 1 mg/ml e 100 mg/ml de um ou mais antioxidantes. Em algumas moda- lidades, as células são incubadas na presença de ou de cerca de 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 µg/ml, 10 µg/ml, 100 µg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml,
5 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 200 mg/ml, 300 mg/ml, 400 mg/ml, 500 mg/ml de um ou mais antioxidan- tes. Em algumas modalidades, os referidos um ou mais antioxidantes é ou inclui um antioxidante contendo enxofre. Em particulares modali- dades, os referidos um ou mais antioxidantes é ou inclui um precursor de glutationa.
[00154] Em algumas modalidades, os referidos um ou mais antioxi- dantes é ou inclui N-acetil cisteína (NAC). Em algumas modalidades, incubação das células, tais como, células T CD4+ enriquecidas e/ou células T CD8+ enriquecidas, sob condições de estimulação inclui in- cubação das células na presença de NAC. Em particulares modalida- des, as células são estimuladas com o reagente estimulatório na pre- sença de NAC. Em algumas modalidades, as células são incubadas na presença de entre 1 ng/ml e 100 ng/ml, entre 10 ng/ml e 1µg/ml, entre 100 ng/ml e 10 µg/ml, entre 1 µg/ml e 100 µg/ml, entre 10 µg/ml e 1 mg/ml, entre 100 µg/ml e 1 mg/ml, entre 1 a 500 µg/ml e 2 mg/ml, 500 µg/ml e 5 mg/ml, entre 1 mg/ml e 10 mg/ml, ou entre 1 mg/ml e 100 mg/ml de NAC. Em algumas modalidades, as células são incuba- das na presença de ou de cerca de 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 µg/ml, 10 µg/ml, 100 µg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 200 mg/ml, 300 mg/ml, 400 mg/ml, 500 mg/ml de NAC. Em algumas modalidades, as células são incubadas com ou com cerca de 0,8 mg/ml.
[00155] Em particulares modalidades, incubação da composição de células T enriquecidas, tais como, células T CD4+ enriquecidas e/ou células T CD8+ enriquecidas, na presença de um ou mais antioxidan- tes, por exemplo, NAC, reduz a ativação nas células quando compara- das às células que são incubadas em processos alternativos e/ou exemplares sem a presença de antioxidantes. Em certas modalidades,
a ativação reduzida é medida pela expressão de um ou mais marcado- res de ativação na célula. Em certas modalidades, marcadores de ati- vação incluem, porém não são limitados a, complexidade intracelular aumentada (por exemplo, como determinado medindo dispersão late- ral (SSC), tamanho de célula aumentado (por exemplo, como determi- nado medindo diâmetro de célula e/ou dispersão direta (FSC)), ex- pressão aumentada de CD27 e/ou expressão diminuída de CD25. Em algumas modalidades, as células da composição têm expressão nega- tiva, reduzida ou baixa e/ou grau de marcadores de ativação quando examinadas durante ou após a incubação, modificação, transdução, transfecção, expansão ou formulação, ou durante ou após qualquer estágio do processo ocorrendo após a incubação. Em algumas moda- lidades, as células da composição têm expressão negativa, reduzida ou baixa e/ou grau de marcadores de ativação após o processo ser concluído. Em particulares modalidades, as células da composição de saída têm expressão negativa, reduzida ou baixa e/ou grau de marca- dores de ativação.
[00156] Em algumas modalidades, citometria de fluxo é usada para determinar tamanho relativo de células. Em particulares modalidades, os parâmetros de FSC e SSC são usados para analisar células e dis- tinguir as células de outro com base no tamanho e complexidade in- terna. Em particulares modalidades, a partícula ou conta de tamanho conhecido pode ser medida como um padrão para determinar o tama- nho real de células. Em algumas modalidades, citometria de fluxo é usada em combinação com uma mancha, por exemplo, um anticorpo marcado, para medir ou quantificar a expressão de uma proteína de superfície, tal como, um marcador de ativação, por exemplo, CD25 ou CD27.
[00157] Em algumas modalidades, a composição de células T enri- quecidas, tais como, células T CD4+ enriquecidas e/ou células T CD8+ enriquecidas, é incubada na presença de um ou mais antioxidantes, por exemplo, NAC, e um diâmetro de célula reduzido por pelo menos 0,25 µm, 0,5 µm, 0,75 µm, 1,0 µm, 1,5 µm, 2 µm, 2,5 µm, 3 µm, 3,5 µm, 4 µm, 4,5 µm, 5 µm, ou mais do que 5 µm quando comparado às células incubadas em um processo alternativo e/ou exemplar onde a incubação não é realizada na presença de antioxidantes. Em particula- res modalidades, a composição de células T enriquecidas é incubada na presença de um ou mais antioxidantes, por exemplo, NAC, e um tamanho de célula, como medido pelo FSC é reduzido por pelo menos 1%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo me- nos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, ou pe- lo menos 90% quando comparado às células incubadas em um pro- cesso alternativo e/ou exemplar onde a incubação não é realizada na presença de antioxidante.
[00158] Em algumas modalidades, a composição de células T enri- quecidas, tais como, células T CD4+ enriquecidas e/ou células T CD8+ enriquecidas, é incubada na presença de um ou mais antioxidantes, por exemplo, NAC, e a complexidade intracelular, como medido pelo SSC, é reduzido por pelo menos 1%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo me- nos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, ou pelo menos 90% quando comparada às células incubadas em um processo alternativo e/ou exemplar onde a incubação não é realizada na presença de antioxidantes.
[00159] Em particulares modalidades, a composição de células T enriquecidas, tais como, células T CD4+ enriquecidas e/ou células T CD8+ enriquecidas, é incubada na presença de um ou mais antioxi- dantes, por exemplo, NAC, e a expressão de CD27, por exemplo, co- mo medido pela citometria de fluxo, é reduzida por pelo menos 1%,
pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo me- nos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% quando comparada às células incubadas em um processo alternativo e/ou exemplar onde a incubação não é realizada na presença de antioxidantes.
[00160] Em certas modalidades, a composição de células T enri- quecidas, tais como, células T CD4+ enriquecidas e/ou células T CD8+ enriquecidas, é incubada na presença de um ou mais antioxidantes, por exemplo, NAC, e a expressão de CD25, por exemplo, como medi- do pela citometria de fluxo, é aumentada por pelo menos 1%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pe- lo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes quando comparadas às células incubadas em um processo alternativo e/ou exemplar onde a incubação não é reali- zada na presença de antioxidantes.
[00161] Em particulares modalidades, incubação da composição de células T enriquecidas, tais como, células T CD4+ enriquecidas e/ou células T CD8+ enriquecidas, na presença de um ou mais antioxidan- tes, por exemplo, NAC, aumenta a expansão, por exemplo, durante a etapa ou estágio de incubação ou cultivo como descrito na Seção I-D. Em algumas modalidades, uma composição de células enriquecidas ativa uma expansão de 2 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 3,5 vezes, 4 ve- zes, 4,5 vezes a 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 ve- zes, ou mais do que 10 vezes dentro de 14 dias, 12 dias, 10 dias, 9 dias, 8 dias, 7 dias, 6 dias, 5 dias, 4 dias, ou dentro de 3 dias do início do cultivo. Em algumas modalidades, a composição de células T enri- quecidas é incubada na presença de um ou mais antioxidantes e as células das composições sofrem uma taxa mais rápida pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo me- nos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 ve- zes de expansão durante o cultivo do que células cultivadas que foram incubadas em um processo alternativo e/ou exemplar onde a incuba- ção não é realizada na presença de antioxidantes.
[00162] Em particulares modalidades, incubação da composição de células enriquecidas, tais como, células T CD4+ enriquecidas e/ou cé- lulas T CD8+ enriquecidas, na presença de um ou mais antioxidantes, por exemplo, NAC, reduz a quantidade de morte celular, por exemplo, por apoptose. Em algumas modalidades, a composição de células T enriquecidas é incubada na presença de um ou mais antioxidantes, por exemplo, NAC, e pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo me- nos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99%, ou pelo menos 99,9% das células sobrevivem, por exemplo, não sofrem apoptose, durante ou pelo menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, ou mais do que 7 dias após a incubação ser concluída. Em algumas mo- dalidades, a composição é incubada na presença de um ou mais anti- oxidantes, por exemplo, NAC, e as células da composição têm pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pe- lo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes ou pelo menos 100 vezes mais sobrevivência quando comparadas às células sofrendo um processo exemplar e/ou alternativo onde células não são incubadas na presença de um ou mais antioxidantes.
[00163] Em particulares modalidades, a composição de células T enriquecidas, tais como, células T CD4+ enriquecidas e/ou células T CD8+ enriquecidas, é incubada na presença de um ou mais antioxi- dantes, por exemplo, NAC, e expressão de caspase, por exemplo, ex- pressão de caspase 3, é reduzida por pelo menos 1%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo me- nos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% quando comparada às células incu- badas em um processo alternativo e/ou exemplar onde a incubação não é realizada na presença de antioxidantes.
[00164] Em algumas modalidades, as composições ou células, tais como, células T CD4+ enriquecidas e/ou células T CD8+ enriquecidas, são incubadas na presença de condições de estimulação ou um agen- te estimulatório, tal como descrito. Tais condições incluem aquelas de- signadas para induzir proliferação, expansão, ativação e/ou sobrevi- vência de células na população, para imitar a exposição ao antígeno, e/ou para preparar as células para modificação genética, tal como, pa- ra a introdução de um receptor de antígeno recombinante. Exemplares reagentes estimulatórios, tais como, contas magnéticas anti-CD3/anti- CD28, são descritos abaixo. A incubação com o reagente estimulatório pode também ser realizada na presença de uma ou mais citocina es- timulatória, tal como, na presença de um ou mais de IL-2 recombinan- te, IL-7 recombinante e/ou IL-15 recombinante e/ou na presença de pelo menos um antioxidante, tal como, NAC, tal como descrito acima. Em algumas modalidades, uma composição de células T CD4+ enri-
quecidas é incubada sob condições estimulatórias com um agente es- timulatório, IL-2 recombinante, IL-7 recombinante, IL-15 recombinante e NAC, tais como, em quantidades como descrito. Em algumas moda- lidades, uma composição de células T CD8+ enriquecidas são incuba- das sob condições estimulatórias com um agente estimulatório, IL-2 recombinante, IL-15 recombinante e NAC, tais como, em quantidades como descrito.
[00165] Em algumas modalidades, as condições para estimulação e/ou ativação podem incluir um ou mais de meio particular, temperatu- ra, conteúdo de oxigênio, conteúdo de dióxido de carbono, tempo, agentes, por exemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, íons e/ou fatores estimulatórios, tais como, citocinas, quimiocinas, antígenos, parceiros de ligação, proteínas de fusão, receptores solúveis recombi- nantes e quaisquer outros agentes designados para ativar as células.
[00166] Em alguns aspectos, incubação é realizada de acordo com técnicas, tais como, aquelas descritas em Patente dos Estados Unidos No. 6.040.1 77 em Riddell et al., Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651–660, Terakura et al. (2012) Blood, 1:72–82, e/ou Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.
[00167] Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da in- cubação na presença de uma ou mais condições de estimulação ou um agente estimulatório é realizada na cavidade interna de uma câma- ra centrífuga, por exemplo, sob rotação centrífuga, tal como descrito em Número de Publicação Internacional WO2016/073602. Em algu- mas modalidades, pelo menos uma porção da incubação realizada em uma câmara centrífuga inclui mistura com um reagente ou reagentes para induzir estimulação e/ou ativação. Em algumas modalidades, cé- lulas, tais como, células selecionadas, são misturadas com uma condi- ção de estimulação ou agente estimulatório na câmara centrífuga. Em alguns aspectos de tais processos, um volume de células é misturado com uma quantidade de uma ou mais condições de estimulação ou agentes que é muito menos do que é normalmente empregado quando realizando estimulações similares em uma placa de cultura celular ou outro sistema.
[00168] Em algumas modalidades, o agente de estimulação é adici- onado às células na cavidade da câmara em uma quantidade que é substancialmente menos do que (por exemplo, é não mais do que 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou 80% da quantidade) quando comparada à quantidade do agente de estimulação que é tipicamente usado ou seria necessário para ativar cerca da mesma ou similar efici- ência de seleção do mesmo número de células ou o mesmo volume de células quando a seleção é realizada sem misturar em uma câmara centrífuga, por exemplo, em um tubo ou saco com rotação ou agitação periódica. Em algumas modalidades, a incubação é realizada com a adição de um tampão de incubação às células e agente de estimula- ção para ativar um volume alvo com incubação do reagente de, por exemplo, cerca de 10 mL a cerca de 200 mL, ou cerca de 20 mL a cerca de 125 mL, tais como, pelo menos ou cerca de pelo menos ou cerca de 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 105 mL, 110 mL, 115 mL, 120 mL, 125 mL, 130 mL, 135 mL, 140 mL, 145 mL, 150 mL, 160 mL, 170 mL, 180 mL, 190 mL ou 200 mL. Em algumas modalidades, um tampão de incubação e agente de estimulação são pré-misturados antes da adição às células. Em algumas modalidades, um tampão de incubação e agente de esti- mulação são separadamente adicionados às células. Em algumas mo- dalidades, a incubação de estimulação é realizada com condição de suave mistura periódica, que pode auxiliar em promover interações energeticamente favorecidas e desse modo permitir o uso de menos agente de estimulação geral enquanto ativando estimulação e ativação de células.
[00169] Em algumas modalidades, a incubação geralmente é reali- zada sob condições de mistura, tal como, na presença de rotação, ge- ralmente em velocidade ou força relativamente baixa, tal como, veloci- dade menor do que aquela usada para peletizar as células, tais como, de 600 rpm a 1700 rpm ou de cerca de 600 rpm a cerca de 1700 rpm (por exemplo, em ou cerca de ou pelo menos 600 rpm, 1000 rpm, ou 1500 rpm ou 1700 rpm), tal como, em um RCF em uma amostra ou parede da câmara ou outro recipiente de 80 g a 100 g ou de cerca de 80 g a cerca de 100 g (por exemplo, em ou cerca de ou pelo menos 80 g, 85 g, 90 g, 95 g, ou 100 g). Em algumas modalidades, a rotação é realizada usando intervalos repetidos de uma rotação em tal velocida- de baixa seguida por um período de descanso, tal como, uma rotação e/ou descanso durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 segundos, tal co- mo, uma rotação em aproximadamente 1 ou 2 segundos seguida por um descanso durante aproximadamente 5, 6, 7 ou 8 segundos.
[00170] Em algumas modalidades, a duração total da incubação, por exemplo, com o agente de estimulação, é entre ou entre cerca de 1 hora e 96 horas, 1 hora e 72 horas, 1 hora e 48 horas, 4 horas e 36 horas, 8 horas e 30 horas, 18 horas e 30 horas, ou 12 horas e 24 ho- ras, tais como, pelo menos ou cerca de pelo menos ou cerca de 6 ho- ras, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas ou 72 horas. Em algumas modalidades, a outra incubação é durante um tempo entre ou cerca de entre 1 hora e 48 horas, 4 horas e 36 horas, 8 horas e 30 horas ou 12 horas e 24 horas, inclusive.
[00171] Em algumas modalidades, as células são cultivadas, sub- metidas à cultura e/ou incubadas sob condições de estimulação antes de e/ou durante a etapa para introduzir um polinucleotídeo, por exem- plo, um polinucleotídeo codificando um receptor recombinante, às cé- lulas, por exemplo, por transdução e/ou transfecção, tal como descrito pela Seção I-C. Em certas modalidades, as células são cultivadas,
submeticas à cultura, e/ou incubadas sob condições de estimulação durante um período de tempo entre 30 minutos e 2 horas, entre 1 hora e 8 horas, entre 1 hora e 6 horas, entre 6 horas e 12 horas, entre 12 horas e 18 horas, entre 16 horas e 24 horas, entre 12 horas e 36 ho- ras, entre 24 horas e 48 horas, entre 24 horas e 72 horas, entre 42 ho- ras e 54 horas, entre 60 horas e 120 horas entre 96 horas e 120 horas, entre 90 horas e entre 1 dias e 7 dias, entre 3 dias e 8 dias, entre 1 dia e 3 dias, entre 4 dias e 6 dias, ou entre 4 dias e 5 dias antes da modifi- cação genética. Em algumas modalidades, as células são incubadas durante ou durante cerca de 2 dias antes da modificação.
[00172] Em certas modalidades, as células são incubadas com e/ou na presença do reagente estimulatório antes de e/ou durante modifica- ção genética das células. Em certas modalidades, as células são in- cubadas com e/ou na presença do reagente estimulatório durante um período de tempo entre 12 horas e 36 horas, entre 24 horas e 48 ho- ras, entre 24 horas e 72 horas, entre 42 horas e 54 horas, entre 60 ho- ras e 120 horas entre 96 horas e 120 horas, entre 90 horas e entre 2 dias e 7 dias, entre 3 dias e 8 dias, entre 1 dia e 8 dias, entre 4 dias e 6 dias, ou entre 4 dias e 5 dias. Em particulares modalidades, as célu- las são cultivadas, submetidas à cultura e/ou incubadas sob condições de estimulação antes de e/ou durante modificação genética das célu- las durante um período de tempo de menos do que 10 dias, 9 dias, 8 dias, 7 dias, 6 dias, ou 5 dias, 4 dias, ou durante um período de tempo menor do que 168 horas, 162 horas, 156 horas, 144 horas, 138 horas, 132 horas, 120 horas, 114 horas, 108 horas, 102 horas, ou 96 horas. Em particulares modalidades, as células são incubadas com e/ou na presença do reagente estimulatório durante ou durante cerca de 4 di- as, 5 dias, 6 dias, ou 7 dias. Em algumas modalidades, as células são incubadas com e/ou na presença do reagente estimulatório durante ou durante cerca de 4 dias. Em particulares modalidades, as células são incubadas com e/ou na presença do reagente estimulatório durante ou durante cerca de 5 dias. Em certas modalidades, as células são incu- badas com e/ou na presença do reagente estimulatório durante menos do que 7 dias.
[00173] Em algumas modalidades, incubação das células sob con- dições de estimulação inclui incubação das células com um reagente estimulatório que é descrito na Seção I-B-1. Em algumas modalida- des, o reagente estimulatório contém ou inclui a conta, tal como, uma conta paramagnética, e as células são incubadas com o reagente es- timulatório em uma relação de menos do que 3:1 (contas:células), tal como, uma relação de 1:1. Em particulares modalidades, as células são incubadas com o reagente estimulatório na presença de uma ou mais citocinas e/ou um ou mais antioxidantes. Em algumas modalida- des, uma composição de células T CD4+ enriquecidas é incubada com o reagente estimulatório em uma relação de 1:1 (contas:células) na presença de IL-2 recombinante, IL-7, IL-15, e NAC. Em certas modali- dades, uma composição de células T CD8+ enriquecidas é incubada com o reagente estimulatório em uma relação de 1:1 (contas:células) na presença de IL-2 recombinante, IL-15, e NAC. Em algumas moda- lidades, o reagente estimulatório é removido e/ou separado das célu- las em, dentro de, ou dentro de cerca de 6 dias, 5 dias, ou 4 dias do início ou iniciação da incubação, por exemplo, do tempo que o rea- gente estimulatório é adicionado ou contactado com as células.
1. Reagentes estimulatórios
[00174] Em algumas modalidades, incubação de uma composição de células enriquecidas sob condições de estimulação é ou inclui incu- bação e/ou contato da composição de células enriquecidas com um reagente estimulatório que é capaz de ativar e/ou expandir células T. Em algumas modalidades, o reagente estimulatório é capaz de estimu- lar e/ou ativar um ou mais sinais nas células. Em algumas modalida-
des, um ou mais sinais são mediados por um receptor. Em particulares modalidades, um ou mais sinais são ou são associados com uma mu- dança em transdução de sinal e/ou um nível ou quantidade de mensa- geiros secundários, por exemplo, cAMP e/ou cálcio intracelular, uma mudança na quantidade, localização celular, confirmação, fosforilação, ubiquitinação e/ou truncamento de uma ou mais proteínas celulares e/ou uma mudança em uma atividade celular, por exemplo, transcri- ção, tradução, degradação de proteína, morfologia celular, estado de ativação e/ou divisão celular. Em particulares modalidades, o reagente estimulatório ativa e/ou é capaz de ativar um ou mais domínios de si- nalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR e/ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimulatórias.
[00175] Em certas modalidades, o reagente estimulatório contém uma partícula, por exemplo, uma conta, que é conjugada ou ligada a um ou mais agentes, por exemplo, biomoléculas, que são capazes de ativar e/ou expandir células, por exemplo, células T. Em algumas mo- dalidades, um ou mais agentes são ligados a uma conta. Em algumas modalidades, a conta é biocompatível, isto é, composta de um material que é adequado para uso biológico. Em algumas modalidades, as con- tas são não tóxicas para células cultivadas, por exemplo, células T cul- tivadas. Em algumas modalidades, as contas podem ser quaisquer partículas que são capazes de ligar agentes de uma maneira que per- mita uma interação entre o agente e uma célula.
[00176] Em algumas modalidades, um reagente estimulatório con- tém um ou mais agentes que são capazes de ativar e/ou expandir cé- lulas, por exemplo, células T, que são ligadas a ou de outro modo liga- das a uma conta, por exemplo, à superfície da conta. Em certas mo- dalidades, a conta é uma partícula não celular. Em particulares moda- lidades, a conta pode incluir uma partícula coloidal, uma microsfera,
nanopartícula, uma conta magnética ou similares. Em algumas moda- lidades, as contas são contas de agarose. Em certas modalidades, as contas são contas de sefarose.
[00177] Em particulares modalidades, o reagente estimulatório con- tém contas que são monodispersas. Em certas modalidades, contas que são monodispersas compreendem dispersões de tamanho tendo um desvio padrão de diâmetro de menos do que 5% de uma para o outro.
[00178] Em algumas modalidades, a conta contém um ou mais agentes, tais como, um agente que é acoplado, conjugado ou ligado (diretamente ou indiretamente) à superfície da conta. Em algumas modalidades, um agente como contemplado aqui pode incluir, porém não é limitado a, RNA, DNA, proteínas (por exemplo, enzimas), antí- genos, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, fragmentos de anticorpo, carboidratos, lectinas lipídicas, ou qualquer outra biomolécu- la com uma afinidade para um alvo desejado. Em algumas modalida- des, o alvo desejado é um receptor de célula T e/ou um componente de um receptor de célula T. Em certas modalidades, o alvo desejado é CD3. Em certas modalidades, o alvo desejado é uma molécula coes- timulatória de célula T, por exemplo, CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, ou ICOS. Um ou mais agentes pode ser ligado diretamente ou indireta- mente a uma conta por uma variedade de métodos conhecidos e dis- poníveis na técnica. A ligação pode ser covalente, não covalente, ele- trostática ou hidrofóbica e pode ser realizada por uma variedade de meios de ligação, incluindo, por exemplo, um meio químico, um meio mecânico, ou um meio enzimático. Em algumas modalidades, a bio- molécula (por exemplo, um anticorpo anti-CD3 biotinilado) pode ser ligada indiretamente a uma conta por meio de outra biomolécula (por exemplo, anticorpo antibiotina) que é diretamente ligada à conta.
[00179] Em algumas modalidades, o reagente estimulatório contém uma conta e um ou mais agentes que diretamente interagem com uma macromolécula sobre a superfície de uma célula. Em certas modali- dades, a conta (por exemplo, a conta paramagnética) interage com uma célula por meio de um ou mais agentes (por exemplo, um anticor- po) específicos para uma ou mais macromoléculas sobre a célula (por exemplo, uma ou mais proteínas de superfície celular). Em certas modalidades, a conta (por exemplo, a conta paramagnética) é marca- da com um primeiro agente descrito aqui, tais como, um anticorpo pri- mário (por exemplo, um anticorpo antibiotina) ou outra biomolécula, e então um segundo agente, tais como, um anticorpo secundário (por exemplo, um anticorpo anti-CD3 biotinilado) ou outra segunda biomo- lécula (por exemplo, estreptavidina), é adicionado, através do qual o anticorpo secundário ou outra segunda biomolécula especificamente liga-se a tais anticorpos primários ou outra biomolécula sobre a partí- cula.
[00180] Em algumas modalidades, o reagente estimulatório contém um ou mais agentes (por exemplo, anticorpo) que é ligado a uma con- ta (por exemplo, uma conta paramagnética) e especificamente liga-se as referidas uma ou mais das seguintes macromoléculas sobre uma célula (por exemplo, uma célula T): CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD25, CD27, CD28, CD29, CD31, CD44, CD45RA, CD45RO, CD54 (ICAM- 1), CD127, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, PD-1, OX40, CD27L (CD70), 4-1BB (CD137), 4-1BBL, CD30L, LIGHT, IL-2R, IL-12R, IL-1R, IL-15R; IFN-gamaR, TNF-alfaR, IL-4R, IL- 10R, CD18/CDl la (LFA-1), CD62L (L-selectina), CD29/CD49d (VLA-4), ligante Notch (por exemplo, ¼ tipo Delta, Jagged 1/2, etc.), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, e CXCR3 ou fragmento dos mesmos incluindo os correspon- dentes ligantes a estas macromoléculas ou fragmentos das mesmas. Em algumas modalidades, um agente (por exemplo, anticorpo) ligado a uma conta especificamente liga-se as referidas uma ou mais das seguintes macromoléculas sobre uma célula (por exemplo, uma célula T): CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA e/ou CD45RO.
[00181] Em algumas modalidades, um ou mais dos agentes ligados a uma conta é um anticorpo. O anticorpo pode incluir um anticorpo policlonal, anticorpo monoclonal (incluindo anticorpos de comprimento total que têm uma região Fc de imunoglobulina), composições de anti- corpo com especificidade poliepitópica, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos, diacorpos, e moléculas de ca- deia única, bem como, fragmentos de anticorpo (por exemplo, Fab, F(ab')2, e Fv). Em algumas modalidades, o reagente estimulatório é um fragmento de anticorpo (incluindo fragmento de ligação ao antíge- no), por exemplo, um fragmento Fab, Fab′-SH, Fv, scFv, ou (Fab′)2. Será apreciado que regiões constantes de qualquer isotipo podem ser usadas para os anticorpos contemplados aqui, incluindo regiões cons- tantes IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE, e aquelas tais regiões constantes po- dem ser obtidas de qualquer espécie humana ou animal (por exemplo, espécies de murino). Em algumas modalidades, o agente é um anti- corpo que se liga a e/ou reconhece um ou mais componentes de um receptor de célula T. Em particulares modalidades, o agente é um an- ticorpo anti-CD3. Em certas modalidades, o agente é um anticorpo que se liga a e/ou reconhece um correceptor. Em algumas modalida- des, o reagente estimulatório compreende um anticorpo anti-CD28. Em algumas modalidades, a conta tem um diâmetro de mais do que cerca de 0,001 µm, mais do que cerca de 0,01 µm, mais do que cerca de 0,1 µm, mais do que cerca de 1,0 µm, mais do que cerca de 10 µm, mais do que cerca de 50 µm, mais do que cerca de 100 µm ou mais do que cerca de 1000 µm e não mais do que cerca de 1500 µm. Em al- gumas modalidades, a conta tem um diâmetro de cerca de 1,0 µm a cerca de 500 µm, cerca de 1,0 µm a cerca de 150 µm, cerca de 1,0 µm a cerca de 30 µm, cerca de 1,0 µm a cerca de 10 µm, cerca de 1,0 µm a cerca de 5,0 µm, cerca de 2,0 µm a cerca de 5,0 µm, ou cerca de 3,0 µm a cerca de 5,0 µm. Em algumas modalidades, a conta tem um di- âmetro de cerca de 3 µm a cerca de 5µm. Em algumas modalidades, a conta tem um diâmetro de pelo menos ou pelo menos cerca de ou cerca de 0,001 µm, 0,01 µm, 0,1 µm, 0,5 µm, 1,0 µm, 1,5 µm, 2,0 µm, 2,5 µm, 3,0 µm, 3,5 µm, 4,0 µm, 4,5 µm, 5,0 µm, 5,5 µm, 6,0 µm, 6,5 µm, 7,0 µm, 7,5 µm, 8,0 µm, 8,5 µm, 9,0 µm, 9,5 µm, 10 µm, 12 µm, 14 µm, 16 µm, 18 µm ou 20 µm. Em certas modalidades, a conta tem um diâmetro de, ou cerca de 4,5 µm. Em certas modalidades, a conta tem um diâmetro de, ou cerca de 2,8 µm.
[00182] Em algumas modalidades, as contas têm uma densidade de mais do que 0,001 g/cm3, mais do que 0,01 g/cm3, mais do que 0,05 g/cm3, mais do que 0,1 g/cm3, mais do que 0,5 g/cm3, mais do que 0,6 g/cm3, mais do que 0,7 g/cm3, mais do que 0,8 g/cm3, mais do que 0,9 g/cm3, mais do que 1 g/cm3, mais do que 1,1 g/cm3, mais do que 1,2 g/cm3, mais do que 1,3 g/cm3, mais do que 1,4 g/cm3, mais do que 1,5 g/cm3, mais do que 2 g/cm3, mais do que 3 g/cm3, mais do que 4 g/cm3, ou mais do que 5g/cm3. Em algumas modalidades, as contas têm um densidade de entre cerca de 0,001 g/cm3 e cerca de 100 g/cm3, cerca de 0,01 g/cm3 e cerca de 50 g/cm3, cerca de 0,1 g/cm3 e cerca de 10 g/cm3, cerca de 0,1 g/cm3 e cerca de 0,5 g/cm3, cerca de 0,5 g/cm3 e cerca de 1 g/cm3, cerca de 0,5 g/cm3 e cerca de 1,5 g/cm3, cerca de 1 g/cm3 e cerca de 1,5 g/cm3, cerca de 1 g/cm3 e cerca de 2 g/cm3, ou cerca de 1 g/cm3 e cerca de 5 g/cm3. Em algumas modali- dades, as contas têm um densidade de cerca de 0,5 g/cm3, cerca de 0,5 g/cm3, cerca de 0,6 g/cm3, cerca de 0,7 g/cm3, cerca de 0,8 g/cm3, cerca de 0,9 g/cm3, cerca de 1,0 g/cm3, cerca de 1,1 g/cm3, cerca de 1,2 g/cm3, cerca de 1,3 g/cm3, cerca de 1,4 g/cm3, cerca de 1,5 g/cm3, cerca de 1,6 g/cm3, cerca de 1,7 g/cm3, cerca de 1,8 g/cm3, cerca de
1,9 g/cm3, ou cerca de 2,0 g/cm3. Em certas modalidades, as contas têm um densidade de cerca de 1,6 g/cm3. Em particulares modalida- des, as contas ou partículas têm uma densidade de cerca de 1,5 g/cm3. Em certas modalidades, as partículas têm uma densidade de cerca de 1,3 g/cm3.
[00183] Em certas modalidades, uma pluralidade das contas tem uma densidade uniforme. Em certas modalidades, uma densidade uniforme compreende um desvio padrão de densidade de menos do que 10%, menos do que 5%, ou menos do que 1% da densidade de conta média.
[00184] Em algumas modalidades, as contas têm uma área de su- perfície de entre cerca de 0,001 m2 por cada grama de partículas (m2/g) a cerca de 1,000 m2/g, cerca de ,010 m2/g a cerca de 100 m2/g, cerca de 0,1 m2/g a cerca de 10 m2/g, cerca de 0,1 m2/g a cerca de 1 m2/g, cerca de 1 m2/g a cerca de 10 m2/g, cerca de 10 m2/g a cerca de 100 m2/g, cerca de 0,5 m2/g a cerca de 20 m2/g, cerca de 0,5 m2/g a cerca de 5 m2/g, ou cerca de 1 m2/g a cerca de 4 m2/g. Em algumas modalidades, as partículas ou contas têm uma área de superfície de cerca de 1 m2/g a cerca de 4 m2/g.
[00185] Em algumas modalidades, a conta contém pelo menos um material em ou próximo à superfície de conta que pode ser acoplado, ligado, ou conjugado a um agente. Em algumas modalidades, a conta é superfície funcionalizada, isto é, compreende grupos funcionais que são capazes de formar uma ligação covalente com uma molécula de ligação, por exemplo, um polinucleotídeo ou um polipeptídeo. Em par- ticulares modalidades, a conta compreende grupos carboxila, amino, hidroxila, tosila, epóxi e/ou clorometila expostos à superfície. Em parti- culares modalidades, as contas compreendem agarose e/ou sefarose expostas à superfície. Em certas modalidades, a superfície de conta compreende reagentes estimulatórios ligados que podem se ligar ou se anexarem à moléculas de ligação. Em particulares modalidades, as biomoléculas são polipeptídeos. Em algumas modalidades, as contas compreendem proteínas A, proteínas G ou biotina expostas à superfí- cie.
[00186] Em algumas modalidades, a conta reage em um campo magnético. Em algumas modalidades, a conta é uma conta magnéti- ca. Em algumas modalidades, a conta magnética é paramagnética. Em particulares modalidades, a conta magnética é superparamagnéti- ca. Em certas modalidades, as contas não mostram quaisquer propri- edades magnéticas a menos que elas sejam expostas a um campo magnético.
[00187] Em particulares modalidades, a conta compreende um nú- cleo magnético, um núcleo paramagnético, ou um núcleo superpara- magnético. Em algumas modalidades, o núcleo magnético contém um metal. Em algumas modalidades, o metal pode ser, porém não é limi- tado a, ferro, níquel, cobre, cobalto, gadolínio, manganês, tântalo, zin- co, zircônio ou quaisquer combinações dos mesmos. Em certas mo- dalidades, o núcleo magnético compreende óxidos de metal (por exemplo, óxidos de ferro), ferrites (por exemplo, ferrites de manganês, ferrites de cobalto, ferrites de níquel, etc.), hematite e ligas de metal (por exemplo, CoTaZn). Em algumas modalidades, o núcleo magnéti- co compreende um ou mais de um ferrite, um metal, uma liga de me- tal, um óxido de ferro ou dióxido de crômio. Em algumas modalidades, o núcleo magnético compreende ferro elementar ou um composto do mesmo. Em algumas modalidades, o núcleo magnético compreende um ou mais de magnetite (Fe3O4), maghemite (γFe2O3) ou greigite (Fe3S4). Em algumas modalidades, o núcleo interno compreende um óxido de ferro (por exemplo, Fe3O4).
[00188] Em certas modalidades, a conta contém um núcleo magné- tico, paramagnético e/ou superparamagnético que é coberto por um revestimento ou cobertura funcionalizado de superfície. Em algumas modalidades, o revestimento pode conter um material que pode incluir, porém não é limitado a, um polímero, um polissacarídeo, uma sílica, um ácido graxo, uma proteína, um carbono, agarose, sefarose, ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o polímero po- dem ser um polietileno glicol, poli(ácido lático-co-glicólico), poligluta- raldeído, poliuretano, poliestireno ou um álcool polivinílico. Em certas modalidades, a cobertura ou revestimento externo compreende polies- tireno. Em particulares modalidades, o revestimento externo é superfí- cie funcionalizada.
[00189] Em algumas modalidades, o reagente estimulatório com- preende uma conta que contém um núcleo de óxido de metal (por exemplo, um núcleo de óxido de ferro) e uma cobertura, em que o nú- cleo de óxido de metal compreende pelo menos um polissacarídeo (por exemplo, dextrano), e em que a cobertura compreende pelo me- nos um polissacarídeo (por exemplo, dextrano de amino), pelo menos um polímero (por exemplo, poliuretano) e sílica. Em algumas modali- dades, o núcleo de óxido de metal é um núcleo de óxido de ferro co- loidal. Em certas modalidades, um ou mais agentes incluem um anti- corpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em particulares modalidades, um ou mais agentes incluem um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28. Em algumas modalidades, o reagente esti- mulatório compreende um anticorpo anti-CD3, anticorpo anti-CD28 e um anticorpo antibiotina. Em algumas modalidades, o reagente estimu- latório compreende um anticorpo antibiotina. Em algumas modalida- des, a conta tem um diâmetro de cerca de 3 µm a cerca de 10 µm. Em algumas modalidades, a conta tem um diâmetro de cerca de 3 µm a cerca de 5 µm. Em certas modalidades, a conta tem um diâmetro de cerca de 3,5 µm.
[00190] Em algumas modalidades, o reagente estimulatório com-
preende um ou mais agentes que são ligados a uma conta compreen- dendo um núcleo de óxido de metal (por exemplo, um núcleo interno de óxido de ferro) e uma cobertura (por exemplo, uma cobertura prote- tiva), em que a cobertura compreende poliestireno. Em certas modali- dades, as contas são monodispersas, contas paramagnéticas (por exemplo, superparamagnéticas) compreendendo um núcleo de ferro paramagnético (por exemplo, superparamagnético), por exemplo, um núcleo compreendendo magnetite (Fe3O4) e/ou maghemite (γFe2O3) c e um revestimento ou cobertura de poliestireno. Em algumas modali- dades, a conta é não porosa. Em algumas modalidades, as contas contêm uma superfície funcionalizada a qual um ou mais agentes são ligados. Em certas modalidades, um ou mais agentes são covalente- mente ligados às contas na superfície. Em algumas modalidades, um ou mais agentes incluem um anticorpo ou fragmento de ligação ao an- tígeno do mesmo. Em algumas modalidades, um ou mais agentes in- cluem um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28. Em algumas modalidades, o reagente estimulatório é ou compreende contas mag- néticas anti-CD3/anti-CD28. Em algumas modalidades, um ou mais agentes incluem um anticorpo anti-CD3 e/ou um anticorpo anti-CD28, e um anticorpo ou fragmento de antígeno do mesmo capaz de ligar-se a um anticorpo marcado (por exemplo, anticorpo biotinilado), tal como, um anticorpo anti-CD3 ou anti-CD28 marcado. Em certas modalida- des, as contas têm uma densidade de cerca de 1,5 g/cm3 e uma área de superfície de cerca de 1 m2/g a cerca de 4 m2/g. Em particulares modalidades, as contas são contas superparamagnéticas monodisper- sas que têm um diâmetro de cerca de 4,5 µm e uma densidade de cerca de 1,5 g/cm3. Em algumas modalidades, as contas são contas superparamagnéticas monodispersas que têm um diâmetro médio de cerca de 2,8 µm e uma densidade de cerca de 1,3 g/cm3.
[00191] Em algumas modalidades, a composição de células T enri-
quecidas é incubada com reagente estimulatório em uma relação de contas para células em ou em cerca de 3:1, 2,5:1, 2:1, 1,5:1, 1,25:1, 1,2:1, 1,1:1, 1:1, 0,9:1, 0,8:1, 0,75:1, 0,67:1, 0,5:1, 0,3:1, ou 0,2:1. Em particulares modalidades, a relação de contas para células é entre 2,5:1 e 0,2:1, entre 2:1 e 0,5:1, entre 1,5:1 e 0,75:1, entre 1,25:1 e 0,8:1, entre 1,1:1 e 0,9:1. Em particulares modalidades, a relação de reagente estimulatório para células é cerca de 1:1 ou é 1:1.
2. Remoção do reagente estimulatório de células
[00192] Em certas modalidades, o reagente estimulatório, por exemplo, contas magnéticas anti-CD3/anti-CD28, é removido e/ou se- parado das células. Sem querer ficar vinculado pela teoria, particulares modalidades contemplam que a ligação e/ou associação entre um re- agente estimulatório e células podem, em algumas circunstâncias, ser reduzidas ao longo do tempo durante a incubação. Em certas modali- dades, um ou mais agentes podem ser adicionados para reduzir a li- gação e/ou associação entre o reagente estimulatório e as células. Em particulares modalidades, uma alteração em condições de cultura celular, por exemplo, temperatura média de pH, pode reduzir a ligação e/ou associação entre o reagente estimulatório e as células. Desse modo, em algumas modalidades, o reagente estimulatório pode ser removido de uma incubação, sistema de cultura celular e/ou a solução separadamente das células, por exemplo, sem remover as células da incubação, sistema de cultura celular, e/ou a solução também.
[00193] Métodos para remover reagentes estimulatórios (por exem- plo, reagentes estimulatórios que são ou contêm partículas, tais como, partículas de conta ou partículas magnetizáveis) de células são co- nhecidos. Em algumas modalidades, o uso de anticorpos de competi- ção, tais como, anticorpos não marcados, pode ser usado, os quais, por exemplo, se ligam a um anticorpo primário do reagente estimulató- rio e alteram sua afinidade para seu antígeno sobre a célula, desse modo permitindo suave destacamento. Em alguns casos, após desta- camento, os anticorpos de competição podem permanecer associados com a partícula (por exemplo, partícula de conta) enquanto o anticorpo não reagido é ou pode ser lavado e a célula é livre de isolamento, se- leção, enriquecimento e/ou ativação do anticorpo. Exemplos de um tal reagente é DETACaBEAD (Friedl et al. 1995; Entschladen et al. 1997). Em algumas modalidades, partículas (por exemplo, partículas de con- ta) podem ser removidas na presença de um ligador clivável (por exemplo, ligador de DNA), através do qual os anticorpos ligados às partículas são conjugados ao ligador (por exemplo, CELLection, Dynal). Em alguns casos, a região de ligador fornece um sítio clivável para remover as partículas (por exemplo, partículas de conta) das cé- lulas após isolamento, por exemplo, pela adição de DNase ou outro tampão de liberação. Em algumas modalidades, outros métodos en- zimáticos podem também ser empregados para liberação de uma par- tícula (por exemplo, partícula conta) de células. Em algumas modali- dades, as partículas (por exemplo, partículas de conta ou partículas magnetizáveis) são biodegradáveis.
[00194] Em algumas modalidades, o reagente estimulatório é mag- nético, paramagnético e/ou superparamagnético, e/ou contém uma conta que é magnética, paramagnética e/ou superparamagnético, e o reagente estimulatório pode ser removido das células por exposição das células a um campo magnético. Exemplos de adequado equipa- mento contendo magnetos para gerar o campo magnético incluem DynaMag CTS (Thermo Fisher), Magnetic Separator (Takara) e Easy- Sep Magnet (Stem Cell Technologies).
[00195] Em particulares modalidades, o reagente estimulatório é removido ou separado das células antes da conclusão dos fornecidos métodos, por exemplo, antes de colheita, coleta e/ou formulação de células modificadas produzida pelos métodos fornecidos aqui. Em al-
gumas modalidades, o reagente estimulatório é removido e/ou separa- do das células antes de modificação, por exemplo, transdução ou transfecção das células. Em particulares modalidades, o reagente es- timulatório é removido e/ou separado das células após a etapa de mo- dificação das células. Em certas modalidades, o reagente estimulatório é removido antes do cultivo das células, por exemplo, antes do cultivo das células modificadas, por exemplo, transfectadas ou transduzidas, sob condições para promover proliferação e/ou expansão.
[00196] Em certas modalidades, o reagente estimulatório é separa- do e/ou removido das células após um período de tempo. Em particu- lares modalidades, a quantidade de tempo é um período de tempo do início e/ou iniciação da incubação sob condições de estimulação. Em particulares modalidades, o início da incubação é considerado em ou em cerca do tempo das células serem contactadas com o reagente estimulatório e/ou um meio ou solução contendo o reagente estimula- tório. Em particulares modalidades, o reagente estimulatório é removi- do ou separado das células dentro de ou dentro de cerca de 10 dias, 9 dias, 8 dias, 7 dias, 6 dias, 5 dias, 4 dias, 3 dias, ou 2 dias após o iní- cio ou iniciação da incubação. Em particulares modalidades, o rea- gente estimulatório é removido e/ou separado das células em ou em cerca de 9 dias, 8 dias, 7 dias, 6 dias, 5 dias, 4 dias, 3 dias, ou 2 dias após o início ou iniciação da incubação. Em certas modalidades, o re- agente estimulatório é removido e/ou separado das células em ou em cerca de 168 horas, 162 horas, 156 horas, 144 horas, 138 horas, 132 horas, 120 horas, 114 horas, 108 horas, 102 horas, ou 96 horas após o início ou iniciação da incubação. Em particulares modalidades, o reagente estimulatório é removido e/ou separado das células em ou em cerca de 5 dias após o início e/ou iniciação da incubação. Em al- gumas modalidades, o reagente estimulatório é removido e/ou separa- do das células em ou em cerca de 4 dias após o início e/ou iniciação da incubação. C. Células Modificadas
[00197] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos envolvem administrar a um indivíduo tendo uma doença ou condição células ex- pressando um receptor de antígeno recombinante. Vários métodos pa- ra a introdução de componentes geneticamente modificados, por exemplo, receptores recombinantes, por exemplo, CARs ou TCRs, são bem conhecidos e podem ser usados com os métodos fornecidos e composições. Exemplares métodos incluem aqueles para transferên- cia de ácidos nucleicos codificando os receptores, incluindo por meio viral, por exemplo, retroviral ou lentiviral, transdução, transposons e eletroporação.
[00198] Entre as células expressando os receptores e administra- das pelos métodos fornecidos estão células modificadas. A modifica- ção genética geralmente envolve introdução de um ácido nucleico co- dificando o componente recombinante ou modificado em uma compo- sição contendo as células, tais como, por transdução retroviral, trans- fecção ou transformação.
[00199] Em algumas modalidades, os métodos são fornecidos aqui usados em associação com modificação de uma ou mais composições de células T enriquecidas. Em certas modalidades, a modificação é ou inclui a introdução de um polinucleotídeo, por exemplo, um polinucleo- tídeo recombinante codificando uma proteína recombinante. Em parti- culares modalidades, as proteínas recombinantes são receptores re- combinantes, tais como, qualquer descrito na Seção II. Introdução das moléculas de ácido nucleico codificando a proteína recombinante, tal como, receptor recombinante, em uma célula pode ser realizada usan- do qualquer de alguns conhecidos vetores. Tais vetores incluem sis- temas virais e não virais, incluindo sistemas lentivirais e gamarretrovi- rais, bem como, sistemas com base em transposon, tais como, siste-
mas de transferência de gene com base em PiggyBac ou Sleeping Beauty. Exemplares métodos incluem aqueles para transferência de ácidos nucleicos codificando os receptores, incluindo por meio viral, por exemplo, retroviral ou lentiviral, transdução, transposons e eletro- poração. Em algumas modalidades, a modificação produz uma ou mais composições de células T enriquecidas modificadas.
[00200] Em certas modalidades, uma ou mais composições de célu- las T enriquecidas são modificadas, por exemplo, transduzidas ou transfectadas, antes de cultivar as células, por exemplo, sob condições que promovem proliferação e/ou expansão, tais como, por um método fornecido na Seção I-D. Em particulares modalidades, uma ou mais composições de células T enriquecidas são modificadas após uma ou mais composições serem estimuladas, ativadas e/ou incubadas sob condições de estimulação, tais como, descrito nos métodos fornecidos na Seção I.B. Em particulares modalidades, uma ou mais composi- ções são composições estimuladas. Em particulares modalidades, uma ou mais composições estimuladas foram anteriormente congela- das e armazenadas e são descongeladas antes de modificadas.
[00201] Em certas modalidades, uma ou mais composições de célu- las T estimuladas são ou incluem duas composições estimuladas se- paradas de células T enriquecidas. Em particulares modalidades, du- as composições de células T enriquecidas separadas, por exemplo, duas composições de células T enriquecidas separadas que foram se- lecionadas, isoladas e/ou enriquecidas da mesma amostra biológica, são separadamente modificadas. Em certas modalidades, as duas composições separadas incluem uma composição de células T CD4+ enriquecidas. Em particulares modalidades, as duas composições se- paradas incluem uma composição de células T CD8+ enriquecidas. Em algumas modalidades, duas composições separadas de células T CD4+ enriquecidas e células T CD8+ enriquecidas, tais como, após incubação sob condições de estimulação como descrito acima, são geneticamente modificadas separadamente. Em algumas modalida- des, uma composição simples de células T enriquecidas é genetica- mente modificada. Em certas modalidades, a composição simples é uma composição de células T CD4+ enriquecidas. Em algumas moda- lidades, a composição simples é uma composição de células T CD4+ e CD8+ enriquecidas que foram combinadas de composições separadas antes da modificação.
[00202] Em algumas modalidades, a composição de células T CD4+ enriquecidas, tais como, células T CD4+ estimuladas, que é modificada, por exemplo, transduzida ou transfectada, inclui pelo me- nos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pe- lo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,9%, ou em ou em cerca de 100% de células T CD4+. Em certas modalidades, a composição de células T CD4+ enriquecidas, tais co- mo, células T CD4+ estimuladas, que é modificada inclui menos do que 40%, menos do que 35%, menos do que 30%, menos do que 25%, menos do que 20%, menos do que 15%, menos do que 10%, menos do que 5%, menos do que 1%, menos do que 0,1%, ou menos do que 0,01% de células T CD8+, e/ou não contém nenhuma célula T CD8+, e/ou é livre ou substancialmente livre de células T CD8+.
[00203] Em algumas modalidades, a composição de células T CD8+ enriquecidas, tais como, células T CD8+ estimuladas, que é modificada, por exemplo, transduzida ou transfectada, inclui pelo me- nos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pe- lo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,9%, ou em ou em cerca de 100% de células T CD8+. Em certas modalidades, a composição de células T CD8+ enriquecidas, tais co-
mo, células T CD8+ estimuladas, que é modificada inclui menos do que 40%, menos do que 35%, menos do que 30%, menos do que 25%, menos do que 20%, menos do que 15%, menos do que 10%, menos do que 5%, menos do que 1%, menos do que 0,1%, ou menos do que 0,01% de células T CD4+, e/ou não contém nenhuma célula T CD4+, e/ou é livre ou substancialmente livre de células T CD4+.
[00204] Em algumas modalidades, as composições separadas de células T CD4+ e CD8+ enriquecidas são combinadas em uma com- posição simples e são geneticamente modificadas, por exemplo, transduzidas ou transfectadas. Em certas modalidades, composições modificadas separadas de células T CD4+ enriquecidas e CD8+ enri- quecidas são combinadas em uma composição simples após a modifi- cação genética ser realizada e/ou concluída. Em particulares modali- dades, composições separadas de células T CD4+ e CD8+ enriqueci- das, tais como, composições separadas de células T CD4+ e CD8+ estimuladas são separadamente modificadas e são separadamente processadas para cultivo e/ou expansão de células T após a modifica- ção genética ser realizada e/ou concluída.
[00205] Em algumas modalidades, a introdução de um polinucleotí- deo, por exemplo, um polinucleotídeo recombinante codificando uma proteína recombinante, é realizado contatando células enriquecidas T CD4+ ou CD8+, tais como células T CD4+ ou CD8+ estimuladas, com partículas virais contendo o polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o contato pode ser realizado com centrifugação, tal como espinocula- ção (por exemplo, inoculação centrífuga). Em algumas modalidades, a composição contendo células, partículas virais e reagentes podem ser centrifugadas, geralmente em força ou velocidade relativamente baixa tal como velocidade menor do que aquela usada para peletizar as cé- lulas, tal como de 600 rpm a 1700 rpm ou de cerca de 600 rpm a cerca de 1700 rpm (por exemplo, de ou cerca de ou pelo menos 600 rpm,
1000 rpm, ou 1500 rpm ou 1700 rpm). Em algumas modalidades, a rotação é realizada em uma força, por exemplo, uma força centrífuga relativa, de 100 g a 3200 g ou de cerca de 100 g a cerca de 3200 g (por exemplo, de ou cerca de ou pelo menos a, ou cerca de 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g ou 3200 g), tal como de ou cerca de 693 g, como medido, por exemplo, em uma parede interna ou externa da câmara ou cavidade. O termo "força centrífuga relativa" ou RCF é geralmente entendida ser a forma efetiva empregada sobre um objeto ou substância (tal como uma célu- la, amostra, ou pélete e/ou um ponto na câmara ou outro recipiente que está sendo submetido à rotação), relativa à força gravitacional da Terra, em um ponto particular em espaço quando comparado ao eixo de rotação. O valor pode ser determinado usando fórmulas bem co- nhecidas, levando em consideração a força gravitacional, velocidade de rotação e o raio de rotação (distância do eixo de rotação e o objeto, substância, ou partícula na qual RCF está sendo medida). Em algu- mas modalidades, pelo menos uma parte do contato, incubação, e/ou modificação das células, por exemplo, células de uma composição es- timulada de células T CD4+ enriquecidas ou células T CD8+ enrique- cidas com o vírus é realizada com uma rotação entre cerca de 100 g e 3200 g, 1000 g e 2000 g, 1000 g e 3200 g, 500 g e 1000 g, 400 g e 1200 g, 600g e 800 g, 600 e 700g, ou 500 g e 700 g. Em algumas mo- dalidades, a rotação é entre 600 g e 700 g, por exemplo, em ou cerca de 693 g.
[00206] Em certas modalidades, pelo menos uma parte da modifi- cação, transdução, e/ou transfecção é realizada com rotação, por exemplo, espinoculação e / ou centrifugação. Em algumas modalida- des, a rotação é realizada durante, durante cerca de, ou durante pelo menos ou cerca de 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas, 8 ho-
ras, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, ou durante pelo menos 7 dias. Em algumas modalidades, a rotação é realizada durante ou durante cerca de 60 minutos. Em cer- tas modalidades, a rotação é realizada durante cerca de 30 minutos. Em algumas modalidades, a rotação é realizada durante cerca de 30 minutos entre 600 g e 700 g, por exemplo, em ou cerca de 693 g.
[00207] Em certas modalidades, o númeroi de células viásveis a serem modificadas, transduzidas, e/ou transfectadas varia de cerca de 5 x 106 células a cerca de 100 x 107 células, tal como de cerca de 10 x 106 células a cerca de 100 x 106 células, de cerca de 100 x 106 células a cerca de 200 x 106 células, de cerca de 200 x 106 células a cerca de 300 x 106 células, de cerca de 300 x 106 células a cerca de 400 x 106 células, de cerca de 400 x 106 células a cerca de 500 x 106 células, ou de cerca de 500 x 106 células a cerca de 100 x 107 células. Em exem- plos particulares, o número de células viáveis a serem modificadas, transduzidas, e/ou transfectada é cerca de ou menor do que cerca de 300 x 106 células.
[00208] Em certas modalidades, pelo menos uma parte da modifi- cação, transdução, e/ou transfecção é conduzida em um volume (por exemplo, o volume de espinoculação) de cerca de 5 mL a cerca de 100 mL, tal como de cerca de 10 mL a cerca de 50 mL, de cerca de 15 mL a cerca de 45 mL, de cerca de 20 mL a cerca de 40 mL, de cer- ca de 25 mL a cerca de 35 mL, ou em ou a cerca de 30 mL. Em certas modalidades, o volume de pélete celulsar após espinoculação varia de cerca de 1 mL a cerca de 25 mL, tal como de cerca de 5 mL a cerca de 20 mL, de cerca de 5 mL a cerca de 15 mL, de cerca de 5 mL a cerca de 10 mL, ou em ou a cerca de 10 mL.
[00209] Em algumas modalidades, a transferência de gene é reali- zada primeiro estimulando a célula, tal como combinando-a com um estímulo que induz uma resposta tal como proliferação, sobrevivência,
e / ou ativação, por exemplo, como medido pela expressão de uma citocina ou marcador de ativação, seguido por transdução das células ativadas, e expansão em cultura para números suficientes para aplica- ções clínicas. Em certas modalidades, a transferência de gene é reali- zada primeiro incubando as célulass sob condições de estimulação, tal como por qualquer dos métodos descritos na Seção I-B.
[00210] Em algumas modalidades, métodos para modificação gené- tica são realizados contatando uma ou mais células de uma composi- ção com uma molécula de ácido nucleico codificando a proteína re- combinante, por exemplo, receptor recombinante. Em algumas moda- lidades, o contato pode ser realizado com centrifugação, tal como es- pinoculação (por exemplo, inoculação centrífuga). Tais métodos inclu- em qualquer desses como descrito na Publicação Internacional Núme- ro WO2016/073602. Câmaras centrífugas exemplares incluem aquelas produzidas e vendidas por Biosafe SA, incluindo aquelas para uso com os sistemas Sepax® e Sepax® 2, incluindo uma câmara centrífuga A- 200/F e A-200 e vários kits para uso com tais sistemas. Câmaras, sis- temas, e instrumentação de processamento exemplares e cabinetes são descritos, por exemplo, na Patente Norte-americana No.
6.123.655, Patente Norte-americana No. 6.733.433 e Pedido de Paten- te Norte-americano Publicado, Publicação No. US 2008/0171951, e Pedido de Patente Internacional Publicado, Publicação no. WO 00/38762, o teor de cada um dos quais é aqui incorporado por referên- cia em sua íntegra. Kits exemplares para uso com tais sistemas inclu- em, mas não estão limitados a, kits de único uso vendidos por BioSafe SA sob os nomes de produto CS-430.1, CS-490.1, CS-600.1 ou CS-
900.2.
[00211] Em algumas modalidades, o sistema é incluído com e/ou colocado em assoiação com outra instrumentação, incluindo instru- mentação para operar, automatizar, controlar e/ou monitorar aspectos da etapa de transdução e uma ou mais várias outras etapas de pro- cessamento realizadas no sistema, por exemplo, uma ou mais etapas de processamento que podem ser realizadas com ou em conexão com o sistema de câmara centrífuga como descrito aqui ou na Publicação Internacional Número WO2016/073602. Esta instrumentação em al- gumas modalidades está contida em um gabinete. Em algumas moda- lidades, a instrumentação inclui um gabinete, que inclui uma caixa con- tendo circuito de controle, uma centrífuga, uma tampa, motores, bom- bas, sensores, displays, e uma interface do usuário. Um dispositivo exemplasr é descrito na Patente Norte-americana No. 6.123.655, Pa- tente Norte-americana No. 6.733.433 e US 2008/0171951.
[00212] Em algumas modalidades, o sistema compreende uma sé- rie de recipientes, por exemplo, bolsas, tubulações, torneiras, braça- deiras, conectores e uma câmara de centrífuga. Em algumas modali- dades, os recipientes, tais como bolsas, incluem um ou mais recipien- tes, tais como bolsas, contendo as células a ser transduzidas e as par- tículas de vetor viral, no mesmo recipiente ou recipientes separados, tal como a mesma bolsa ou bolsas separadas. Em algumas modalida- des, o sistema também inclui um ou mais recipientes, tal como bolsas, contendo meio, tal como diluente e / ou solução de lavagem, que é empurada para dentro da câmara e/ou outros componentes para diluir, ressuspender, e/ou lavar componentes e/ou composições durante os métodos. Os recipientes podem ser conectados em uma ou mais posi- ções no sistema, tal como em uma posição que corresponde a uma linha de entrada, linha diluente, linha de lavagem e/ou linha de saída.
[00213] Em algumas modalidades, a câmara está associada com uma centrífuga, que é capaz de realizar a rotação da câmara, tal como em torno de seu eixo de rotação. A rotação pode oorrer antes, duran- te, e/oi após a incubação em conexão com transdução das células e/ou em uma ou mais das outras etapas de processamento. Desse modo, em algumas modalidades, uma ou mais das várias etapas de processamento é realizada sob rotação, por exemplo, em uma força particular. A câmara é tipicamente capaz de rotação vertical ou geral- mente vertical, de modo que a câmara fique na vertical durante a cen- trifugação e a parede lateral e o eixo sejam verticais ou geralmente verticais, com as paredes de extremidade horizontais ou geralmente horizontais.
[00214] Em algumas modalidades, a composição que contém célu- las e a composição que contém partículas de vetores virais, e opcio- nalmente ar, pode ser combinada ou misturada antes de fornecer as composições para a cavidade. Em algumas modalidades, a composi- ção contendo células e a composição contendo partículas de vetores virais, e opcionalmente ar, são fornecidas separadamente e combina- das e misturadas na cavidade. Em algumas modalidades, uma com- posição contendo células, uma composição contendo partículas de vetores virais e, opcionalmente, ar, pode ser fornecida à cavidade in- terna em qualquer ordem. Em qualquer uma dessas modalidades, uma composição contendo células e partículas de vetor viral é a composi- ção de entrada uma vez combinada ou misturada, seja ela combinada ou misturada dentro ou fora da câmara centrífuga e/ou se as células e partículas de vetor viral são enviadas para a câmara centrífuga em conjunto ou separadamente, como simultaneamente ou sequencial- mente.
[00215] Em algumas modalidades, a ingestão de um volume de gás, como o ar, ocorre antes da incubação das células e das partículas do vetor viral, como a rotação, no método de transdução. Em algumas modalidades, a ingestão do volume de gás, como o ar, ocorre durante a incubação das células e das partículas do vetor viral, como a rota- ção, no método de transdução.
[00216] Em algumas modalidades, o volume líquido das células ou partículas de vetores virais que compõem a composição de transdução e, opcionalmente, o volume de ar, pode ser um volume predetermina- do. O volume pode ser um volume programado e/ou controlado pelos circuitos associados ao sistema.
[00217] Em algumas modalidades, a entrada da composição de transdução e, opcionalmente, o gás, como o ar, é controlada manual- mente, semiautomática e/ou automaticamente até que um volume de- sejado ou predeterminado seja levado para dentro da cavidade interna da câmara. Em algumas modalidades, um sensor associado ao siste- ma pode detectar líquido e/ou gás fluindo de e para a câmara da cen- trífuga, como por meio de sua cor, taxa de fluxo e/ou densidade, e po- de se comunicar com os circuitos associados para interromper ou con- tinuar a entrada conforme necessário até que seja atingido o volume desejado ou predeterminado. Em alguns aspectos, um sensor que é programado ou capaz apenas de detectar líquido no sistema, mas não gás (por exemplo, ar), pode ser capaz de permitir a passagem de gás, como ar, para o sistema sem interromper a entrada. Em algumas des- sas modalidades, um pedaço de tubo não claro pode ser colocado na linha próxima ao sensor enquanto a entrada de gás, como o ar, é de- sejada. Em algumas modalidades, a entrada de gás, como o ar, pode ser controlada manualmente.
[00218] Em aspectos dos métodos fornecidos, a cavidade interna da câmara da centrífuga é submetida a rotação de alta velocidade. Em algumas modalidades, a rotação é efetuada antes, simultaneamente, subsequentemente ou intermitentemente da entrada da composição de entrada de líquido e, opcionalmente, do ar. Em algumas modalida- des, a rotação é efetuada após a ingestão da composição de entrada de líquido e, opcionalmente, do ar. Em algumas modalidades, a rota- ção é por centrifugação da câmara centrífuga a uma força centrífuga relativa na superfície interna da parede lateral da cavidade interna e/ou em uma camada superficial das células de cerca de ou pelo menos cerca de 800 g , 1000 g, 1100 g, 1500, 1600 g, 1800 g, 2000 g, 2200 g, 2500 g, 3000 g, 3500 g ou 4000 g. Em algumas modalidades, a ro- tação é por centrifugação a uma força maior que ou cerca de 1100 g, tal como maior que ou cerca de 1200 g, maior que ou cerca de 1400 g, maior que ou cerca de 1400 g, maior que ou cerca de 1600 g, maior que ou cerca de 1800 g, maior que ou cerca de 2000 g, maior que ou cerca de 2400 g, maior que ou cerca de 2800 g, maior que ou cerca de 3000 g ou maior que ou cerca de 3200 g. Em algumas modalidades, a rotação é por centrifugação a uma força que é ou é cerca de 1600 g.
[00219] Em algumas modalidades, o método de transdução inclui rotação ou centrifugação da composição de transdução e, opcional- mente, ar, na câmara centrífuga por mais de ou cerca de 5 minutos, como maior que ou cerca de 10 minutos, maior que ou cerca de 15 minutos, maiores que ou cerca de 20 minutos, maiores que ou cerca de 30 minutos, maiores que ou cerca de 45 minutos, maiores que ou cerca de 60 minutos, maiores que ou cerca de 90 minutos ou maiores que ou cerca de 120 minutos. Em algumas modalidades, a composi- ção de transdução, e opcionalmente o ar, é girada ou centrifugada na câmara centrífuga por mais de 5 minutos, mas por não mais que 60 minutos, não mais que 45 minutos, não mais que 30 minutos ou não mais que 15 minutos. Em modalidades particulares, a transdução inclui rotação ou centrifugação por ou por cerca de 60 minutos.
[00220] Em algumas modalidades, o método de transdução inclui rotação ou centrifugação da composição de transdução e, opcional- mente, ar, na câmara centrífuga por entre ou entre cerca de 10 minu- tos e 60 minutos, 15 minutos e 60 minutos, 15 minutos utes e 45 minu- tos, 30 minutos e 60 minutos ou 45 minutos e 60 minutos, cada um inclusive, e com uma força na superfície interna da parede lateral da cavidade interna e/ou em uma camada superficial das células de pelo menos ou superior ou igual a 1000 g, 1100 g, 1200 g, 1400 g, 1500 g, 1600 g, 1800 g, 2000 g, 2200 g, 2400 g, 2800 g, 3200 g, 3200 g ou 3600 g. Em modalidades particulares, o método de transdução inclui rotação ou centrifugação da composição de transdução, por exemplo, as células e as partículas de vetor viral, a ou a cerca de 1600 g por ou durante cerca de 60 minutos.
[00221] Em algumas modalidades, o gás, como o ar, na cavidade da câmara é expelido da câmara. Em algumas modalidades, o gás, como o ar, é expelido para um recipiente que está operacionalmente ligado como parte do sistema fechado à câmara centrífuga. Em algu- mas modalidades, o recipiente é um recipiente livre ou vazio. Em al- gumas modalidades, o ar, como gás, na cavidade da câmara é expeli- do através de um filtro que está operacionalmente conectado à cavi- dade interna da câmara através de uma linha de tubulação estéril. Em algumas modalidades, o ar é expelido usando processos manuais, semiautomáticos ou automáticos. Em algumas modalidades, o ar é expelido da câmara antes de, simultaneamente, intermitentemente ou subsequentemente, expressar a composição de saída contendo célu- las incubadas e partículas de vetores virais, como células nas quais a transdução foi iniciada ou células foram transduzidas com um vetor viral, da cavidade da câmara.
[00222] Em algumas modalidades, a transdução e/ou outra incuba- ção é realizada como ou como parte de um processo contínuo ou se- micontínuo. Em algumas modalidades, um processo contínuo envolve a ingestão contínua de células e partículas de vetores virais, por exemplo, a composição de transdução (como uma única composição pré-existente ou puxando continuamente para o mesmo vaso, por exemplo, cavidade e, assim, misturando, suas partes) e/ou a expres- são ou expulsão contínua de líquido e, opcionalmente, a expulsão de gás (por exemplo, ar), do vaso, durante pelo menos uma porção da incubação, por exemplo, durante a centrifugação. Em algumas modali- dades, a ingestão contínua e a expressão contínua são realizadas pelo menos em parte simultaneamente. Em algumas modalidades, a inges- tão contínua ocorre durante parte da incubação, por exemplo, durante parte da centrifugação, e a expressão contínua ocorre durante uma parte separada da incubação. As duas podem alternar. Assim, a inges- tão e expressão contínuas, durante a realização da incubação, podem permitir que um maior volume total de amostra seja processado, por exemplo, transduzido.
[00223] Em algumas modalidades, a incubação é parte de um pro- cesso contínuo, o método incluindo, durante pelo menos uma porção da incubação, efetuando a ingestão contínua da referida composição de transdução na cavidade durante a rotação da câmara e durante uma porção da incubação, efetuando expressão contínua de líquido e, opcionalmente, expulsando gás (por exemplo, ar), da cavidade através de pelo menos uma abertura durante a rotação da câmara.
[00224] Em algumas modalidades, a incubação semicontínua é rea- lizada alternando entre efetuar a ingestão da composição na cavidade, incubação, expressão de líquido da cavidade e, opcionalmente, expul- sar gás (por exemplo, ar) da cavidade, como quanto a um recipiente de saída e, em seguida, a ingestão de uma composição subsequente (por exemplo, segundo, terceiro, etc.) contendo mais células e outros reagentes para processamento, por exemplo, partículas de vetores virais e repetição do processo. Por exemplo, em algumas modalida- des, a incubação é parte de um processo semicontínuo, o método in- cluindo, antes da incubação, efetuando a ingestão da composição de transdução na cavidade através da dita pelo menos uma abertura e subsequente à incubação, efetuando expressão de fluido da cavidade; efetuar a ingestão de outra composição de transdução compreenden- do células e as partículas de vetor viral na referida cavidade interna; e incubar a outra composição de transdução na referida cavidade interna sob condições em que as referidas células na referida outra composi- ção de transdução são transduzidas com o referido vetor. O processo pode ser continuado de maneira iterativa por vários cilclos adicionais. A este respeito, os métodos semicontínuos ou contínuos podem permi- tir a produção de volume e/ou número de células ainda maior.
[00225] Em algumas modalidades, uma porção da incubação por transdução é realizada na câmara centrífuga, que é realizada sob con- dições que incluem rotação ou centrifugação.
[00226] Em algumas modalidades, o método inclui uma incubação na qual uma porção adicional da incubação das células e das partícu- las do vetor viral é realizada sem rotação ou centrifugação, que geral- mente é realizada após a pelo menos parte da incubação que inclui rotação ou centrifugação da câmara. Em certas modalidades, a incu- bação das células e das partículas do vetor viral é realizada sem rota- ção ou centrifugação durante pelo menos 1 hora, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 32 horas, 48 horas, 60 horas, 72 horas, 90 horas, 96 horas, 3 dias, 4 dias, 5 dias ou mais que 5 dias. Em certas modalidades, a in- cubação é realizada durante, ou durante cerca de 72 horas.
[00227] Em algumas dessas modalidades, a incubação adicional é efetuada sob condições que resultem na integração do vetor viral em um genoma hospedeiro de uma ou mais células. Está dentro do nível de alguém versado na técnica avaliar ou determinar se a incubação resultou na integração de partículas de vetores virais no genoma do hospedeiro e, portanto, determinar empiricamente as condições para uma incubação adicional. Em algumas modalidades, a integração de um vetor viral em um genoma hospedeiro pode ser avaliada medindo o nível de expressão de uma proteína recombinante, como uma proteína heteróloga, codificada por um ácido nucleico contido no genoma da partícula de vetor viral após a incubação. Um número de métodos bem conhecidos para avaliar o nível de expressão de moléculas recombi- nantes pode ser usado, como detecção por métodos baseados em afi- nidade, por exemplo, métodos baseados em imunoafinidade, por exemplo, no contexto de proteínas da superfície celular, como por ci- tometria de fluxo. Em alguns exemplos, a expressão é medida pela detecção de um marcador de transdução e/ou construção repórter. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica uma proteína de superfície truncada é incluído no vetor e usado como um marcador de expressão e/ou realce do mesmo.
[00228] Em algumas modalidades, a composição que contém célu- las, o vetor, por exemplo, partículas virais e reagente pode ser girada, geralmente em força ou velocidade relativamente baixa, como veloci- dade mais baixa que a usada para peletizar as células, como de 600 rpm a 1700 rpm ou de cerca de 600 rpm a cerca de 1700 rpm (por exemplo, a ou cerca de 600 rpm, 1000 rpm ou 1500 rpm ou 1700 rpm). Em algumas modalidades, a rotação é realizada com uma força, por exemplo, uma força centrífuga relativa, de 100 g a 3200 g ou de cerca de 100 g a cerca de 3200 g (por exemplo, a, cerca de, ou pelo menos, em ou cerca de 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g ou 3200 g), como medido, por exemplo, em uma parede interna ou externa da câmara ou cavidade. O termo "força centrífuga relativa" ou RCF é geralmente entendido como a força efeti- va transmitida a um objeto ou substância (como uma célula, amostra ou pélete e/ou um ponto na câmara ou outro recipiente sendo girado), em relação à força gravitacional da Terra, em um ponto específico do espaço em comparação com o eixo de rotação. O valor pode ser de- terminado usando fórmulas conhecidas, levando em consideração a força gravitacional, a velocidade de rotação e o raio de rotação (dis- tância do eixo de rotação e o objeto, substância ou partícula na qual o RCF está sendo medido).
[00229] Em algumas modalidades, durante pelo menos uma parte da engenharia genética, por exemplo, transdução e/ou subsequente à engenharia genética, as células são transferidas para o conjunto de sacos de biorreator para cultura das células geneticamente modifica- das, como para cultivo ou expansão das células, como descrito acima.
[00230] Em certas modalidades, uma composição de células T en- riquecidas é modificada, por exemplo, transduzida ou transfectada, na presença de um adjuvante de transdução. Em algumas modalidades, uma composição de células T enriquecidas é modificada na presença de um ou mais policátions. Em algumas modalidades, uma composi- ção de células T enriquecidas é transduzida, por exemplo, incubada com uma partícula de vetor viral, na presença de um ou mais adjuvan- tes de transdução. Em modalidades particulares, uma composição de células T enriquecidas é transfectada, por exemplo, incubada com um vetor não viral, na presença de um ou mais adjuvantes de transdução. Em certas modalidades, a presença de um ou mais adjuvantes de transdução aumenta a eficiência da liberação de genes, como aumen- tando a quantidade, porção e/ou percentagem de células da composi- ção que são modificadas (por exemplo, transduzidas ou transfecta- das). Em certas modalidades, a presença de um ou mais adjuvantes de transdução aumenta a eficiência da transfecção. Em certas modali- dades, a presença de um ou mais adjuvantes de transdução aumenta a eficiência da transdução. Em modalidades particulares, pelo menos 25 %, pelo menos 30%, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo me- nos 60%, pelo menos 70% pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95 % ou pelo menos 99 % das células que são modificadas na presença de um policátion contêm ou expressam o polinucleotídeo recombinante. Em algumas modalida- des, pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo me- nos 40%, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80%, pelo menos 90 %, pelo menos pelo menos 95 %, pelo menos 100%, pelo menos 150 %, pelo menos 1 vez, pelo menos 2 ve- zes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes ou pelo menos 100 vezes mais células de uma composição são modifica- das para conter ou expressar os adjuvantes de transdução recombi- nantes na presença de um policátion em comparação com um método alternativo e/ou exemplar de modificação de células sem a presença de um adjuvante de transdução.
[00231] Em algumas modalidades, a composição de células enri- quecidas é modificada na presença de menos de 100 µg/ml, menos de 90 µg/ml, menos de 80 µg/ml, menos de 80 µg/ml, menos de 75 µg/ml, menos de 70 µg/ml, menor que 60 µg/ml, menor que 50 µg/ml, menor que 40 µg/ml, menor que 30 µg/ml, menor que 25 µg/ml, menor que 20 µg/ml, menor que 20 µg/ml ou menor que µg/ml, menos de 10 µg/ml de um adjuvante de transdução. Em certas modalidades, adjuvantes de transdução adequados para uso com os métodos fornecidos incluem, mas não estão limitados a, policátions, fragmentos ou variantes deri- vados de fibronectina ou fibronectina, RetroNectin e combinações dos mesmos.
[00232] Em algumas modalidades, as células são modificadas na presença de uma citocina, por exemplo, uma citocina humana recom- binante, a uma concentração entre 1 IU/ml e 1.000 IU/ml, entre 10 IU/ml e 50 IU/ml, entre 50 IU/ml e 100 IU/ml, entre 100 IU/ml e 200 IU/ml, entre 100 IU/ml e 500 IU/ml, entre 250 IU/ml e 500 IU/ml ou en- tre 500 IU/ml e 1.000 IU/ml.
[00233] Em algumas modalidades, uma composição de células T enriquecidas é modificada na presença de IL-2, por exemplo, IL-2 re- combinante humana, a uma concentração entre 1 IU/ml e 200 IU/ml, entre 10 IU/ml e 100 IU/ml, entre 50 IU/ml e 150 IU/ml, entre 80 IU/ml e
120 IU/ml, entre 60 IU/ml e 90 IU/ml, ou entre 70 IU/ml e 90 IU/ml. Em modalidades particulares, a composição de células T enriquecidas é modificada na presença de IL-2 recombinante em uma concentração de 50 IU/ml, 55 IU/ml, 60 IU/ml, 65 IU/ml, 65 IU/ml, 70 IU/ml. ml, 75 IU/ml, 80 IU/ml, 85 IU/ml, 90 IU/ml, 95 IU/ml, 100 IU/ml, 110 IU/ml, 120 IU/ml, 130 IU/ml, 140 IU/ml ml ou 150 IU/ml. Em algumas modalida- des, a composição de células T enriquecidas é modificada na presen- ça de ou de cerca de 85 IU/ml. Em algumas modalidades, a população de células T é uma população de células T CD4+. Em modalidades particulares, a composição de células T enriquecidas é enriquecida para células T CD4+, em que as células T CD8+ não são enriquecidas e/ou onde as células T CD8+ são negativamente selecionadas ou es- gotadas da composição. Em modalidades particulares, a composição de células T enriquecidas é uma composição de células T CD8+ enri- quecidas. Em modalidades particulares, a composição de células T enriquecidas é enriquecida para células T CD8+, onde as células T CD4+ não são enriquecidas e/ou onde as células T CD4+ são negati- vamente selecionadas ou esgotadas da composição.
[00234] Em algumas modalidades, uma composição de células T enriquecidas é modificada na presença de IL-7 recombinante, por exemplo, IL-7 recombinante humana, a uma concentração entre 100 IU/ml e 2.000 IU/ml, entre 500 IU/ml e 1.000 IU/ml, entre 100 IU/ml e 500 IU/ml, entre 500 IU/ml e 750 IU/ml, entre 750 IU/ml e 1.000 IU/ml ou entre 550 IU/ml e 650 IU/ml. Em modalidades particulares, a com- posição de células T enriquecidas é modificada na presença de IL-7 em uma concentração de 50 IU/ml, 100 IU/ml, 100 IU/ml, 150 IU/ml, 200 IU/ml, 250 IU/ml , 300 IU/ml, 350 IU/ml, 400 IU/ml, 450 IU/ml, 500 IU/ml, 550 IU/ml, 600 IU/ml, 650 IU/ml, 700 IU/ml, 750 IU/ml , 800 IU/ml, 750 IU/ml, 750 IU/ml, 750 IU/ml ou 1.000 IU/ml. Em modalida- des particulares, a composição de células T enriquecidas é modificada na presença de ou de cerca de 600 IU/ml de IL-7. Em algumas moda- lidades, a composição modificada na presença de IL-7 recombinante é enriquecida para uma população de células T, por exemplo, células T CD4+. Em modalidades particulares, a composição de células T enri- quecidas é enriquecida para células T CD4+, em que as células T CD8+ não são enriquecidas e/ou onde as células T CD8+ são negati- vamente selecionadas ou esgotadas da composição.
[00235] Em algumas modalidades, uma composição de células T enriquecidas é modificada na presença de IL-15 recombinante, por exemplo, IL-15 recombinante humana, a uma concentração entre 0,1 IU/ml e 100 IU/ml, entre 1 IU/ml e 50 IU/ml, entre 5 IU/ml e 25 IU/ml, entre 25 IU/ml e 50IU/ml, entre 5 IU/ml e 15 IU/ml, ou entre 10 IU/ml e 100 IU/ml. Em modalidades particulares, a composição de células T enriquecidas é modificada na presença de IL-15 em uma concentração de cerca de 1 IU/ml, 2 IU/ml, 3 IU/ml, 4 IU/ml, 5 IU/ml , 6 IU/ml, 7 IU/ml, 8 IU/ml, 9 IU/ml, 10 IU/ml, 11 IU/ml, 12 IU/ml, 13 IU/ml, 14 IU/ml, 15 IU/ml 20 IU/ml, 25 IU/ml, 30 IU/ml, 40 IU/ml ou 50 IU/ml. Em algumas modalidades, a composição de células T enriquecidas é modificada em ou em cerca de 10 IU/ml de IL-15. Em algumas modalidades, a composição de células T enriquecidas é incubada em ou em cerca de 10 IU/ml de IL-15 recombinante. Em algumas modalidades, a compo- sição modificada na presença de IL-15 recombinante é enriquecida para uma população de células T, por exemplo, células T CD4+ e/ou células T CD8+. Em algumas modalidades, a composição a presença de um ou mais policátions. Em algumas modalidades, uma composi- ção de células T enriquecidas, como células T estimuladas, e. células T CD4+ estimuladas ou células T CD8+ estimuladas, são transduzi- das, por exemplo, incubadas com uma partícula de vetor viral, na pre- sença de um ou mais policátions. Em modalidades particulares, uma composição de células T enriquecidas, como células T estimuladas, e células T CD4+ estimuladas ou células T CD8+ estimuladas são trans- fectadas, por exemplo, incubadas com um vetor não viral, na presença de um ou mais policátions. Em certas modalidades, a presença de um ou mais policátions aumenta a eficiência da liberação de genes, como aumentando a quantidade, porção e/ou percentagem de células da composição que são modificadas (por exemplo, transduzidas ou trans- fectadas). Em certas modalidades, a presença de um ou mais policá- tions aumenta a eficiência da transfecção. Em certas modalidades, a presença de um ou mais policátions aumenta a eficiência da transdu- ção. Em modalidades particulares, pelo menos 25 %, pelo menos 30%, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo me- nos 70% pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90%, pelo menos 95 % ou pelo menos 99 % das células que são modificadas na presença de um policátion contêm ou expressam o polinucleotídeo recombinante. Em algumas modalidades, pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos pelo menos 95 %, pelo menos 100 %, pelo menos 150 %, pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo me- nos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes ou pelo menos 100 vezes mais células de uma composição são modificadas para conter ou expressar o polinucleotídeo recombinante na presença de um poli- cátion em comparação com um método alternativo e/ou exemplar de modificação de células sem a presença de um policátion.
[00236] Em certas modalidades, a composição de células enrique- cidas, por exemplo, a composição de células T CD4+ enriquecidas ou células T CD8+ enriquecidas, como células T estimuladas, é modifica- da na presença de uma baixa concentração ou quantidade de um poli- cátion, por exemplo, em relação a um método exemplar e/ou alternati-
vo de modificação de células na presença de um policátion. Em certas modalidades, a composição de células enriquecidas, como células T estimuladas, por exemplo, células T CD4+ estimuladas ou células T CD8+ estimuladas são modificadas na presença de menos de 90 %, menos de 80 %, menos de 75 %, menos de 70 %, menos de 60 %, menos de 50 %, menos de 40 %, menos de 30 %, menos de 25 %, menos de 20 %, menos de 10%, menos de 5 %, menos de 1 %, me- nos de 0,1 %, menos de 0,01% da quantidade e/ou concentração da policátion de um processo exemplar e/ou alternativo para modificação de células. Em algumas modalidades, a composição de células enri- quecidas, como células T estimuladas, por exemplo, células T CD4+ estimuladas ou células T CD8+ estimuladas, são modificadas na pre- sença de menos de 100 µg/ml, menos de 90 µg/ml, menos de 80 µg/ml, menos de 80 µg/ml, menos de 75 µg/ml, menos de 70 µg/ml, menos de 60 µg/ml, menos de 50 µg/ml, menos de 40 µg/ml, menos de 30 µg/ml, menos de 25 µg/ml, menos de 20 µg/ml ou inferior a µg/ml, menos de 10 µg/ml do policátion. Em modalidades particulares, a composição de células enriquecidas, como células T estimuladas, por exemplo, células T CD4+ estimuladas ou células T CD8+ estimu- ladas, são modificadas na presença de ou de cerca de 1 µg/ml, 5 µg/ml, 10 µg/ml, 15 µg/ml, 20 µg/ml, 25 µg/ml, 30 µg/ml, 35 µg/ml, 40 µg/ml, 45 µg/ml ou 50 µg/ml do policátion.
[00237] Em modalidades particulares, a modificação da composição de células enriquecidas, como células T estimuladas, por exemplo, cé- lulas T CD4+ estimuladas ou células T CD8+ estimuladas, na presen- ça de um policátion reduz a quantidade de morte celular, por exemplo, por necrose, morte celular programada ou apoptose. Em algumas mo- dalidades, a composição de células T enriquecidas, como células T estimuladas, por exemplo, células T CD4+ estimuladas ou células T CD8+ estimuladas, são modificadas na presença de uma baixa quanti-
dade de um policátion, por exemplo, menos de 100 µg/ml, 50 µg/ml ou 10 µg/ml e pelo menos 50%, em pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80%, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95%, pelo menos 99 % ou pelo menos 99,9 % das cé- lulas sobrevivem, por exemplo, não sofre necrose, morte celular pro- gramada ou apoptose durante ou pelo menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias ou mais de 7 dias após a conclusão da eta- pa de modificação. Em algumas modalidades, a composição é modifi- cada na presença de uma baixa concentração ou quantidade de poli- cátion em comparação com o método alternativo e/ou exemplar de modificação de células na presença de maior quantidade ou concen- tração de policátion, por exemplo, mais de 50 µg/ml, 100 µg/ml, 500 µg/ml ou 1.000 µg/ml, e as células da composição têm pelo menos 10%, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 30 %, pelo me- nos 40%, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 100 %, pelo menos 150 %, pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo me- nos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 25 vezes, pelo menos 50 vezes ou pelo menos 100 vezes maior sobrevivência em comparação com células submetidas ao processo exemplar e/ou alternativo.
[00238] Em algumas modalidades, o policátion é carregado positi- vamente. Em certas modalidades, o policátion reduz as forças de re- pulsão entre células e vetores, por exemplo, vetores virais ou não vi- rais, e media o contato e/ou a ligação do vetor à superfície celular. Em algumas modalidades, o policátion é polibreno, DEAE-dextrana, sulfato de protamina, poli-L-lisina ou lipossomas catiônicos.
[00239] Em modalidades particulares, o policátion é sulfato de pro- tamina. Em algumas modalidades, a composição de células T enrique- cidas, como células T estimuladas, por exemplo, células T CD4+ esti-
muladas ou células T CD8+ estimuladas, são modificadas na presença de menos de ou cerca de 500 µg/ml, menos de ou cerca de 400 µg/ml, menos de ou cerca de 300 µg/ml, menos de ou cerca de 200 µg/ml, menos de ou cerca de 150 µg/ml, menos de ou cerca de 100 µg/ml, menos de ou cerca de 90 µg/ml, menos de ou cerca de 80 µg/ml, me- nos de ou cerca de 75 µg/ml, menos de ou cerca de 70 µg/ml, menos que ou cerca de 60 µg/ml, menos que ou cerca de 50 µg/ml, menos que ou cerca de 40 µg/ml, menos que ou cerca de 30 µg/ml, menos de ou cerca de 25 µg/ml, menos de ou cerca de 20 µg/ml, ou menos de ou cerca de 15 µg/ml, ou menos de ou cerca de 10 µg/ml de sulfato de protamina. Em modalidades particulares, a composição de células en- riquecidas, como células T estimuladas, por exemplo, células T CD4+ estimuladas ou células T CD8+ estimuladas, são modificadas na pre- sença de ou de cerca de 1 µg/ml, 5 µg/ml, 10 µg/ml, 15 µg/ml, 20 µg/ml, 25 µg/ml, 30 µg/ml, 35 µg/ml, 40 µg/ml, 45 µg/ml, 50 µg/ml, 55 µg/ml, 60 µg/ml, 75 µg/ml, 80 µg/ml, 85 µg/ml, 90 µg/ml, 95 µg/ml, 100 µg/ml, 105 µg/ml, 110 µg/ml, 115 µg/ml, 120 µg/ml, 125 µg/ml, 130 µg/ml, 135 µg/ml, 140 µg/ml, 145 µg/ml ou 150 µg/ml de sulfato de pro- tamina.
[00240] Em algumas modalidades, a composição modificada de cé- lulas T CD4+ enriquecidas, como células T estimuladas, por exemplo, células T CD4+ estimuladas, inclui pelo menos 40, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,9 %, ou a ou a cerca de 100 % de células T CD4+. Em certas modalidades, a composição de células T CD4+ enriquecidas, como células T estimu- ladas, por exemplo, células T CD4+ estimuladas, que são modificadas incluem menos de 40%, menos de 35 %, menos de 30 %, menos de 25 %, menos de 20%, menos de 15 %, menos de 10 %, menos de 5
%, menos de 1%, menos de 0,1 % ou menos de 0,01 % de células T CD8+ e/ou não contém células T CD8+ e/ou está livre ou substancial- mente livre de células T CD8+.
[00241] Em algumas modalidades, a composição de células T CD8+ enriquecidas, como células T estimuladas, por exemplo, as célu- las T CD8+ estimuladas, que são modificadas incluem pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,9 % ou a ou em cerca de 100 % de células T CD8+. Em cer- tas modalidades, a composição de células T CD8+ enriquecidas, como células T estimuladas, por exemplo, células T CD8+ estimuladas, que são modificadas incluem menos de 40 %, menos de 35 %, menos de 30 %, menos de 25 %, menos de 20 %, menos de 15 %, menos de 10 %, menos de 5 %, menos de 1 %, menos de 0,1 % ou menos de 0,01 % de células T CD4+ e/ou não contém células T CD4+ e/ou está livre ou substancialmente livre de células T CD4+.
[00242] Em algumas modalidades, a modificação das células inclui uma cultura, contato ou incubação com o vetor, por exemplo, o vetor viral do vetor não viral. Em certas modalidades, a modificação inclui cultivar, entrar em contato e/ou incubar as células com o vetor é reali- zada por, cerca de ou pelo menos 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 40 horas, 48 horas, 54 horas, 60 horas, 72 horas, 84 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias ou 7 dias ou mais de 7 dias. Em modalidades particulares, a modificação inclui cultivar, entrar em contato e/ou incubar as células com o vetor por ou por cerca de 24 horas, 36 horas, 48 horas, 60 ho- ras, 72 horas ou 84 horas, ou por ou por cerca de 2 dias, 3 dias, 4 dias ou 5 dias. Em algumas modalidades, a etapa de modificação é reali- zada por ou durante cerca de 24 horas, 36 horas, 48 horas, 60 horas,
72 horas ou 84 horas. Em certas modalidades, a modificação é reali- zada por cerca de 60 horas ou cerca de 84 horas, durante, ou durante cerca de 72 horas, ou por ou por cerca de 2 dias.
[00243] Em algumas modalidades, a modificação é realizada a uma temperatura de cerca de 25 a cerca de 38 °C, como de cerca de 30 a cerca de 37 °C, de cerca de 36 a cerca de 38 °C ou a ou cerca de 37 ºC ± 2 ºC. Em algumas modalidades, a composição de células T enri- quecidas é modificada em um nível de CO2 de cerca de 2,5 % a cerca de 7,5 %, como cerca de 4 % para cerca de 6 %, por exemplo, a ou cerca de 5 % ± 0,5 %. Em algumas modalidades, a composição de cé- lulas T enriquecidas é modificada a uma temperatura de cerca de 37 °C e/ou a um nível de CO2 de cerca de 5 %.
[00244] Em algumas modalidades, as células, por exemplo, as célu- las T CD4+ e/ou CD8+, são cultivadas, depois que uma ou mais eta- pas são executadas por engenharia genética, por exemplo, transdução ou transfecção das células para conter um polinucleotídeo que codifica um recombinante receptor. Em algumas modalidades, o cultivo pode incluir cultura, incubação, estimulação, ativação, expansão e/ou pro- pagação. Em algumas dessas modalidades, o cultivo adicional é efe- tuado sob condições que resultem na integração do vetor viral em um genoma hospedeiro de uma ou mais células. A incubação e/ou modifi- cação pode ser realizada em um vaso de cultura, como uma unidade, câmara, cavidade, coluna, tubo, conjunto de tubulação, válvula, fras- conete, prato de cultura, saco ou outro recipiente para células de cultu- ra ou cultivo. Em algumas modalidades, as composições ou células são incubadas na presença de condições estimulantes ou de um agen- te estimulador. Tais condições incluem aquelas modificadas para indu- zir proliferação, expansão, ativação e/ou sobrevivência de células na população, para imitar a exposição ao antígeno e/ou preparar as célu- las para engenharia genética, como para a introdução de um receptor de antígeno recombinante.
[00245] Em algumas modalidades, a incubação adicional é realiza- da a temperaturas maiores que a temperatura ambiente, como maio- res ou maiores que cerca de 25 ºC, como geralmente maiores ou mai- ores que cerca de 32 ºC, 35 ºC ou 37 ºC. Em algumas modalidades, a incubação adicional é efetuada a uma temperatura de cerca de 37 ºC ± 2 ºC, tal como a uma temperatura de cerca de 37 ºC.
[00246] Em algumas modalidades, a incubação adicional é realiza- da sob condições de estimulação e/ou ativação de células, cujas con- dições podem incluir um ou mais meios específicos, temperatura, teor de oxigênio, teor de dióxido de carbono, tempo, agentes, por exemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, íons e/ou fatores estimuladores, como citocinas, quimiocinas, antígenos, parceiros de ligação, proteí- nas de fusão, receptores solúveis recombinantes e quaisquer outros agentes modificados para ativar as células.
[00247] Em algumas modalidades, as condições ou agentes estimu- lantes incluem um ou mais agentes (por exemplo, agentes estimulado- res e/ou acessórios), por exemplo, ligante, que é capaz de ativar um domínio de sinalização intracelular de um complexo de TCR. Em al- guns aspectos, o agente liga ou inicia a cascata de sinalização intrace- lular do TCR/CD3 em uma célula T, como agentes adequados para fornecer um sinal primário, por exemplo, para iniciar a ativação de um sinal induzido por ITAM, como aqueles específicos para um TCR com- ponente e/ou um agente que promove um sinal coestimulador, como um específico para um receptor coestimulador de células T, por exem- plo, anti-CD3, anti-CD28 ou anti-41-BB, por exemplo, opcionalmente ligado a suporte sólido como uma conta e/ou uma ou mais citocinas. Entre os agentes estimuladores estão as contas anti-CD3/anti-CD28 (por exemplo, contas DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expan- der e/ou ExpACT®). Opcionalmente, o método de expansão pode ain-
da compreender a etapa de adição de anticorpo anti-CD3 e/ou anti- CD28 ao meio de cultura. Em algumas modalidades, os agentes esti- mulantes incluem IL-2 e/ou IL-15, por exemplo, uma concentração de IL-2 de pelo menos cerca de 10 unidades/mL.
[00248] Em algumas modalidades, as condições ou agentes estimu- lantes incluem um ou mais agentes, por exemplo, ligante, que é capaz de ativar um domínio de sinalização intracelular de um complexo de TCR. Em alguns aspectos, o agente liga ou inicia a cascata de sinali- zação intracelular do TCR/CD3 em uma célula T. Tais agentes podem incluir anticorpos, tais como aqueles específicos para um componente TCR e/ou receptor coestimulador, por exemplo, anti-CD3, anti-CD28, por exemplo, ligados a suporte sólido, como uma conta, e/ou uma ou mais citocinas. Opcionalmente, o método de expansão pode ainda compreender a etapa de adição de anticorpo anti-CD3 e/ou anti-CD28 ao meio de cultura (por exemplo, a uma concentração de pelo menos cerca de 0,5 ng/ml). Em algumas modalidades, os agentes estimulan- tes incluem IL-2 e/ou IL-15, por exemplo, uma concentração de IL-2 de pelo menos cerca de 10 unidades/mL, pelo menos cerca de 50 unida- des/mL, pelo menos cerca de 100 unidades/mL ou pelo menos cerca de 200 unidades/mL.
[00249] As condições podem incluir um ou mais meios específicos, temperatura, teor de oxigênio, teor de dióxido de carbono, tempo, agentes, por exemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, íons e/ou fatores estimulantes, como citocinas, quimiocinas, antígenos, parceiros de ligação, proteínas de fusão, receptores solúveis recombinantes e quaisquer outros agentes modificados para ativar as células.
[00250] Em alguns aspectos, a incubação é realizada de acordo com técnicas como as descritas na patente US 6,040,177 de Riddell et al., Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 651–660, Terakura et al. (2012) Blood,1: 72–82, e/ou Wang et al. (2012) J. Immunother. 35
(9): 689-701.
[00251] Em algumas modalidades, a incubação adicional é realiza- da no mesmo recipiente ou aparelho em que o contato ocorreu. Em algumas modalidades, a incubação adicional é realizada sem rotação ou centrifugação, que geralmente é realizada após a pelo menos por- ção da incubação feita sob rotação, por exemplo, em conexão com centrifugação ou espinoculação. Em algumas modalidades, a incuba- ção adicional é realizada fora de uma fase estacionária, como fora de uma matriz de cromatografia, por exemplo, em solução.
[00252] Em algumas modalidades, a incubação adicional é realiza- da em um recipiente ou aparelho diferente daquele em que ocorreu o contato, como por transferência, por exemplo, transferência automáti- ca da composição celular para um recipiente ou aparelho diferente após o contato com as partículas virais e o reagente.
[00253] Em algumas modalidades, a cultura ou incubação adicional, por exemplo, para facilitar a expansão ex vivo, é realizada por mais de ou mais de 24 horas, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 di- as, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias ou 14 dias. Em algumas modalidades, a cultura ou incubação adicional é realizada por não mais que 6 dias, não mais que 5 dias, não mais que 4 dias, não mais que 3 dias, não mais que 2 dias ou não mais que 24 horas.
[00254] Em algumas modalidades, a duração total da incubação, por exemplo, com o agente estimulante, está entre 1 hora e 96 horas, 1 hora e 72 horas, 1 hora e 48 horas, 4 horas e 36 horas, 8 horas e 30 horas ou 12 horas e 24 horas, como pelo menos ou cerca de pelo me- nos ou cerca de 6 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas ou 72 horas. Em algumas modalidades, a incubação adicional é por um tem- po entre 1 hora e 48 horas, 4 horas e 36 horas, 8 horas e 30 horas ou 12 horas e 24 horas, inclusive.
[00255] Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos não incluem mais cultura ou incubação, por exemplo, não inclui etapa de expansão ex vivo ou inclui uma etapa de expansão ex vivo substanci- almente mais curta.
[00256] Em algumas modalidades, o reagente estimulador é remo- vido e/ou separado das células antes da modificação. Em modalidades particulares, o reagente estimulador é removido e/ou separado das células após a modificação. Em certas modalidades, o agente estimu- lador é removido e/ou separado das células após a modificação e an- tes do cultivo das células modificadas, por exemplo, sob condições que promovem proliferação e/ou expansão. Em certas modalidades, o reagente estimulador é um reagente estimulador descrito na Seção I- B-1. Em modalidades particulares, o reagente estimulador é removido e/ou separado das células, conforme descrito na Seção I-B-2.
1. Vetores e Métodos
[00257] Também são fornecidos um ou mais polinucleotídeos (por exemplo, moléculas de ácido nucleico) que codificam receptores re- combinantes, vetores para células de engenharia genética para ex- pressar tais receptores de acordo com os métodos fornecidos para produzir as células modificadas. Em algumas modalidades, o vetor contém o ácido nucleico que codifica o receptor recombinante. Em modalidades particulares, o vetor é um vetor viral, um vetor não viral. Em alguns casos, o vetor é um vetor viral, como um vetor retroviral, por exemplo, um vetor lentiviral ou um vetor gamarretroviral.
[00258] Em alguns casos, a sequência de ácido nucleico que codifi- ca o receptor recombinante, por exemplo, receptor de antígeno quimé- rico (CAR) contém uma sequência de sinal que codifica um peptídeo de sinal. Exemplos exemplares não limitativos de peptídeos de sinal incluem, por exemplo, o peptídeo de sinal da cadeia alfa de GMCSFR mencionado na SEQ ID NO: 61 e codificado pela sequência de nucleo- tídeos mencionada na SEQ ID NO: 60, o peptídeo de sinal alfa de CD8 mencionado na SEQ ID NO: 59, ou o peptídeo de sinal de CD33 men- cionado na SEQ ID NO: 58.
[00259] Em algumas modalidades, os vetores incluem vetores vi- rais, por exemplo, retrovirais ou lentivirais, vetores ou transposons não virais, por exemplo, sistema de transposons Sleeping Beauty, vetores derivados do vírus símio 40 (SV40), adenovírus, vírus adenoassociado (AAV), vetores lentivirais ou vetores retrovirais, como vetores gamarre- trovirais, vetor retroviral derivado do vírus da leucemia de murino de Moloney (MoMLV), vírus do sarcoma mieloproliferativo (MPSV), vírus das células tronco embrionárias de murino (MESV), vírus das células tronco de murino (MSCV), vírus formador do foco do baço (SFFV) ou vírus adenoassociado (AAV).
[00260] Em algumas modalidades, o vetor viral ou o DNA não viral contém um ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante he- teróloga. Em algumas modalidades, a molécula recombinante heteró- loga é ou inclui um receptor recombinante, por exemplo, um receptor de antígeno, transposons SB, por exemplo, para silenciamento de ge- nes, transposons fechados por capsídeo, ácido nucleico de cadeia du- pla homóloga, por exemplo, para recombinação genômica ou genes repórter (por exemplo, proteínas fluorescentes, como GFP) ou lucife- rase). a. Partículas de Vetores Virais
[00261] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinan- tes são transferidos para as células usando partículas de vírus infecci- osas recombinantes, como, por exemplo, vetores derivados do vírus símio 40 (SV40), adenovírus, vírus adenoassociado (AAV). Em algu- mas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes são transferidos para as células T usando vetores lentivirais recombinantes ou vetores retrovirais, como vetores gamarretrovirais (veja, por exemplo, Koste et al. (2014) Gene Therapy 3 de abril de 2014. doi: 10,1038/gt. 2014,25;
Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28 (10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 29 de novembro de 2011 (11)): 550-557.
[00262] Em algumas modalidades, o vetor retroviral possui uma se- quência de repetição terminal longa (LTR), por exemplo, um vetor re- troviral derivado do vírus da leucemia de murino de Moloney (MoMLV), vírus do sarcoma mieloproliferativo (MPSV), vírus da célula tronco em- brionária de murino (MESV ), vírus da célula tronco de murino (MSCV), vírus formador do foco do baço (SFFV) ou vírus adenoassociado (AAV). A maioria dos vetores retrovirais são derivados de retrovírus de murino. Em algumas modalidades, os retrovírus incluem aqueles deri- vados de qualquer fonte de células aviária ou de mamífero. Os retroví- rus são tipicamente anfotrópicos, o que significa que são capazes de infectar células hospedeiras de várias espécies, incluindo seres huma- nos. Em uma modalidade, o gene a ser expresso substitui as sequên- cias retrovirais de gag, pol e/ou env. Um número de sistemas retrovi- rais ilustrativos foi descrito (por exemplo, Patentes US 5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; Miller e Rosman (1989) BioTechniques 7: 980- 990; Miller, AD (1990) Human Gene Therapy 1: 5-14 Scarpa et al. (1991) Virology 180: 849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033-8037; e Boris-Lawrie e Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop,3: 102-109.
[00263] São conhecidos métodos de transdução lentiviral. Métodos exemplares são descritos em, por exemplo, Wang et al. (2012) J. Immunother. 35 (9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101: 1637- 1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; e Cava- lieri et al. (2003) Blood. 102 (2): 497-505.
[00264] Em algumas modalidades, as partículas de vetor viral con- têm um genoma derivado de um vetor com base em genoma retroviral, tal como derivado de um vetor com base em genoma lentiviral. Em al-
guns aspectos dos vetores virais fornecidos, o ácido nucleico heterólo- go que codifica um receptor recombinante, como um receptor de antí- geno, como um CAR, está contido e/ou localizado entre as sequências de LTR em 5’ e 3' LTR do genoma do vetor.
[00265] Em algumas modalidades, o genoma do vetor viral é um genoma do lentivírus, como um genoma do HIV-1 ou um genoma do SIV. Por exemplo, os vetores lentivirais foram gerados pela multiplica- ção de genes de virulência atenuantes, por exemplo, os genes env, vif, vpu e nef podem ser excluídos, tornando o vetor mais seguro para fins terapêuticos. Os vetores lentivirais são conhecidos. Veja Naldini et al., (1996 e 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, Pat. 6,013,516; e 5,994,136). Em algumas modalidades, esses vetores virais são ba- seados em plasmídeo ou em vírus e são configurados para transportar as sequências essenciais para incorporar ácido nucleico estranho, pa- ra seleção e para transferência do ácido nucleico para uma célula hospedeira. Os lentivírus conhecidos podem ser facilmente obtidos em depósitos ou coleções, como a American Type Culture Collection ("ATCC"; 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209), ou iso- lados de fontes conhecidas, usando técnicas geralmente disponíveis.
[00266] Exemplos não limitantes de vetores lentivirais incluem aqueles derivados de um lentivírus, como o Vírus de imunodeficiência humana 1 (HIV-1), HIV-2, um vírus de imunodeficiência símia (SIV), vírus linfotrópico T humano 1 (HTLV- 1), HTLV-2 ou vírus da anemia por infecção equina (E1AV). Por exemplo, os vetores lentivirais foram gerados pela atenuação múltipla dos genes de virulência do HIV, por exemplo, os genes env, vif, vpr, vpu e nef são excluídos, tornando o vetor mais seguro para fins terapêuticos. Os vetores lentivirais são co- nhecidos na técnica, veja, Naldini et al., (1996 e 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, Pat. 6,013,516; e 5,994,136). Em algumas modalidades, esses vetores virais são baseados em plasmídeo ou em vírus e são configurados para transportar as sequências essenciais para incorporar ácido nucleico estranho, para seleção e para transfe- rência do ácido nucleico para uma célula hospedeira. Os lentivírus co- nhecidos podem ser facilmente obtidos em depósitos ou coleções, como a American Type Culture Collection ("ATCC"; 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209), ou isolados de fontes conhecidas, usando técnicas geralmente disponíveis.
[00267] Em algumas modalidades, o vetor do genoma viral pode conter sequências das LTRs 5’ e 3' de um retrovírus, como um lentiví- rus. Em alguns aspectos, a construção do genoma viral pode conter sequências das LTRs 5’ e 3’ de um lentivírus e, em particular, pode conter as sequências R e U5 da LTR em 5’ de um lentivírus e uma LTR inativada ou autoinativadora 3’ de um lentivírus. As sequências de LTR podem ser sequências de LTR de qualquer lentivírus de qualquer espécie. Por exemplo, elas podem ser sequências de LTR do HIV, SIV, FIV ou BIV. Tipicamente, as sequências de LTR são sequências de LTR de HIV.
[00268] Em algumas modalidades, o ácido nucleico de um vetor vi- ral, como um vetor viral do HIV, carece de unidades transcricionais adicionais. O genoma do vetor pode conter uma LTR em 3’ inativada ou autoinativadora (Zufferey et al. J Virol 72: 9873, 1998; Miyoshi et al., J Virol 72: 8150, 1998). Por exemplo, a exclusão na região U3 da LTR em 3’ do ácido nucleico usado para produzir o RNA de vetor viral pode ser usada para gerar vetores autoinativadores (SIN). Esta dele- ção pode então ser transferida para a LTR em 5’ do DNA proviral du- rante a transcrição reversa. Um vetor de autoinativação geralmente tem uma deleção das sequências realçadora e promotora da repetição terminal longa em 3’ (LTR), que é copiada para a LTR em 5’ durante a integração do vetor. Em algumas modalidades, é possível eliminar uma sequência suficiente, incluindo a remoção de uma caixa TATA,
para abolir a atividade transcricional da LTR. Isso pode impedir a pro- dução de RNA de vetor de tamanho natural em células transduzidas. Em alguns aspectos, o elemento U3 da LTR em 3’ contém uma dele- ção de sua sequência realçadora, os sítios caixa TATA, Sp1 e NF- capa B. Como resultado da LTR em 3’ autoativada, o provírus que é gerado após a entrada e a transcrição reversa contém uma LTR em 5’ inativada. Isso pode melhorar a segurança, reduzindo o risco de mobi- lização do genoma do vetor e a influência da LTR nos promotores ce- lulares próximos. A LTR em 3’ autoativada pode ser construída por qualquer método conhecido na técnica. Em algumas modalidades, isso não afeta os títulos do vetor ou as propriedades in vitro ou in vivo do vetor.
[00269] Opcionalmente, a sequência U3 da LTR em 5′ lentiviral po- de ser substituída por uma sequência promotora na construção viral, como uma sequência promotora heteróloga. Isso pode aumentar o títu- lo do vírus recuperado da linhagem celular empacotadora. Uma se- quência realçadora também pode ser incluída. Qualquer combinação de realçador/promotor que aumente a expressão do genoma do RNA viral na linhagem celular empacotadora pode ser usada. Em um exemplo, é utilizada a sequência realçadora/promotora de CMV (Pa- tente Norte-americana No. 5,385,839 e Patente Norte-americana No. 5,168,062).
[00270] Em certas modalidades, o risco de mutagênese de inserção pode ser minimizado através da construção do genoma do vetor retro- viral, como o genoma do vetor lentiviral, como defeituoso na integra- ção. Uma variedade de métodos pode ser seguida para produzir um genoma vetorial não integrador. Em algumas modalidades, uma ou mais mutações podem ser modificadas por engenharia no componente da enzima integrase do gene pol, de modo que codifique uma proteína com uma integrase inativa. Em algumas modalidades, o próprio geno-
ma do vetor pode ser modificado para impedir a integração, por exem- plo, mutando ou excluindo um ou ambos os sítios de ligação, ou tor- nando o trato de polipurina proximal (PPT) LTR em 3’ não funcional através de deleção ou modificação. Em algumas modalidades, méto- dos não genéticos estão disponíveis; estes incluem agentes farmaco- lógicos que inibem uma ou mais funções da integrase. Os métodos não são mutuamente exclusivos; isto é, mais de um deles pode ser usado por vez. Por exemplo, a integrase e sítios de ligação podem não funcionar, ou a integrase e sítio de PPT podem não funcionar, ou os sítios de ligação e sítio PPT podem não funcionar, ou todos eles po- dem não funcionar. Tais métodos e genomas de vetores virais são co- nhecidos e disponíveis (veja, Philpott e Thrasher, Human Gene The- rapy 18: 483, 2007; Engelman et al., J Virol 69: 2729, 1995; Brown et al. J Virol 73: 9011 (1999); WO 2009/076524; McWilliams et al., J. Virol 77: 11150, 2003; Powell e Levin J. Virol 70: 5288, 1996).
[00271] Em algumas modalidades, o vetor contém sequências para propagação em uma célula hospedeira, como uma célula hospedeira procariótica. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do vetor viral contém uma ou mais origens de replicação para propagação em uma célula procariótica, como uma célula bacteriana. Em algumas modali- dades, os vetores que incluem uma origem de replicação procariótica também podem conter um gene cuja expressão confere um marcador detectável ou selecionável, como resistência a fármacos.
[00272] O genoma do vetor viral é tipicamente construído em uma forma de plasmídeo que pode ser transfectado para uma linhagem ce- lular empacotadora ou produtora. Qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos pode ser usado para produzir partículas retrovi- rais cujo genoma contém uma cópia de RNA do genoma do vetor viral. Em algumas modalidades, pelo menos dois componentes estão envol- vidos na fabricação de um sistema de liberação de genes com base em vírus: primeiro, plasmídeos empacotadores, abrangendo as proteí- nas estruturais, bem como as enzimas necessárias para gerar uma partícula de vetor viral, e segundo, o próprio vetor viral, ou seja, o ma- terial genético a ser transferido. As salvaguardas de biossegurança podem ser introduzidas no projeto de um ou de ambos os componen- tes.
[00273] Em algumas modalidades, o plasmídeo empacotador pode conter todas as proteínas retrovirais, como HIV-1, do que outras prote- ínas envelope (Naldini et al., 1998). Em outras modalidades, os veto- res virais podem não ter genes virais adicionais, como aqueles que estão associados à virulência, por exemplo, vpr, vif, vpu e nef, e/ou Tat, um transativador primário do HIV. Em algumas modalidades, os vetores lentivirais, como os vetores lentivirais com base em HIV, com- preendem apenas três genes do vírus parental: gag, pol e rev, o que reduz ou elimina a possibilidade de reconstituição de um vírus tipo sel- vagem por meio de recombinação.
[00274] Em algumas modalidades, o genoma do vetor viral é intro- duzido em uma linhagem celular empacotadora que contém todos os componentes necessários para empacotar o RNA genômico viral, transcrição do genoma do vetor viral, em partículas virais. Alternativa- mente, o genoma do vetor viral pode compreender um ou mais genes que codificam componentes virais, além de uma ou mais sequências, por exemplo, ácidos nucleicos recombinantes de interesse. Em alguns aspectos, para impedir a replicação do genoma na célula alvo, no en- tanto, os genes virais endógenos necessários para a replicação são removidos e fornecidos separadamente na linhagem celular empaco- tadora.
[00275] Em algumas modalidades, uma linhagem celular empaco- tadora é transfectada com um ou mais vetores de plasmídeo contendo os componentes necessários para gerar as partículas. Em algumas modalidades, uma linhagem celular empacotadora é transfectada com um plasmídeo contendo o genoma do vetor viral, incluindo as LTRs, a sequência empacotadora de ação cis e a sequência de interesse, isto é, um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno, como um CAR; e um ou mais plasmídeos auxiliares que codifica os componen- tes enzimáticos e/ou estruturais do vírus, tais como gag, pol e/ou rev. Em algumas modalidades, vários vetores são utilizados para separar os vários componentes genéticos que geram as partículas de vetor retrovirais. Em algumas dessas modalidades, o fornecimento de veto- res separados para a célula empacotadora reduz a chance de eventos de recombinação que poderiam gerar vírus competentes para replica- ção. Em algumas modalidades, um único vetor de plasmídeo com to- dos os componentes retrovirais pode ser usado.
[00276] Em algumas modalidades, a partícula de vetor retroviral, como partícula de vetor lentiviral, é pseudotipada para aumentar a efi- ciência de transdução das células hospedeiras. Por exemplo, uma par- tícula de vetor retroviral, como uma partícula de vetor lentiviral, em al- gumas modalidades é pseudotipada com uma glicoproteína VSV-G, que fornece uma ampla gama de hospedeiros celulares estendendo os tipos de células que podem ser transduzidos. Em algumas modalida- des, uma linhagem celular empacotadora é transfectada com um plasmídeo ou polinucleotídeo que codifica uma glicoproteína envelope não nativa, tal como incluir envelopes xenotrópicos, politrópicos ou an- fotrópicos, como envelope do vírus Sindbis, GALV ou VSV-G.
[00277] Em algumas modalidades, a linhagem celular empacotado- ra fornece os componentes, incluindo proteínas reguladoras e estrutu- rais virais, necessárias em trans para o empacotamento do RNA ge- nômico viral em partículas de vetor lentiviral. Em algumas modalida- des, a linhagem celular empacotadora pode ser qualquer linhagem ce- lular que seja capaz de expressar proteínas lentivirais e produzir partí-
culas funcionais do vetor lentiviral. Em alguns aspectos, as linhas celu- lares de embalagem adequadas incluem 293 (ATCC CCL X), 293T, HeLA (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) e Cf2Th (ATCC CRL 1430).
[00278] Em algumas modalidades, a linhagem celular empacotado- ra expressa de forma estável a (s) proteína (s) viral (is). Por exemplo, em alguns aspectos, pode ser construída uma linhagem celular empa- cotadora contendo os genes gag, pol, rev e/ou outros genes estrutu- rais, mas sem a LTR e os componentes empacotadores. Em algumas modalidades, uma linhagem celular empacotadora pode ser transien- temente transfectada com moléculas de ácido nucleico que codificam uma ou mais proteínas virais junto com o genoma do vetor viral con- tendo uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína hete- róloga e/ou um ácido nucleico que codifica uma glicoproteína envelo- pe.
[00279] Em algumas modalidades, os vetores virais e os plasmí- deos empacotadores e/ou auxiliar são introduzidos via transfecção ou infecção na linhagem celular empacotadora. A linhagem celular empa- cotadora produz partículas de vetor viral que contêm o genoma do ve- tor viral. Os métodos para transfecção ou infecção são bem conheci- dos. Exemplos não limitantes incluem métodos de fosfato de cálcio, DEAE-dextrana e lipofecção, eletroporação e microinjeção.
[00280] Quando um plasmídeo recombinante e a LTR retroviral e sequências empacotadora são introduzidos em uma linhagem celular especial (por exemplo, por precipitação com fosfato de cálcio, por exemplo), as sequências empacotadora podem permitir que a transcri- ção de RNA do plasmídeo recombinante seja empacotada em partícu- las virais , que podem ser secretados nos meios de cultura. O meio contendo os retrovírus recombinantes em algumas modalidades é en- tão coletado, opcionalmente concentrado e utilizado para transferência de genes. Por exemplo, em alguns aspectos, após a cotransfecção dos plasmídeos empacotadores e o vetor de transferência para a li- nhagem celular empacotadora, as partículas do vetor viral são recupe- radas do meio de cultura e tituladas por métodos padrão usados pelos versados na técnica.
[00281] Em algumas modalidades, um vetor retroviral, como um ve- tor lentiviral, pode ser produzido em uma linhagem celular empacota- dora, como uma linhagem celular exemplar HEK 293T, através da in- trodução de plasmídeos para permitir a geração de partículas lentivi- rais. Em algumas modalidades, uma célula empacotadora é transfec- tada e/ou contém um polinucleotídeo que codifica gag e pol, e um poli- nucleotídeo que codifica um receptor recombinante, como um receptor de antígeno, por exemplo, um CAR. Em algumas modalidades, a li- nhagem celular empacotadora é opcional e/ou adicionalmente trans- fectada com e/ou contém um polinucleotídeo que codifica uma proteí- na rev. Em algumas modalidades, a linhagem celular empacotadora é opcional e/ou adicionalmente transfectada com e/ou contém um poli- nucleotídeo que codifica uma glicoproteína envelope não nativa, como VSV-G. Em algumas dessas modalidades, cerca de dois dias após a transfecção de células, por exemplo, células HEK 293T, o sobrenadan- te celular contém vetores lentivirais recombinantes, que podem ser re- cuperados e titulados.
[00282] Partículas de vetores retrovirais recuperados e/ou produzi- dos podem ser usados para transduzir as células alvo usando os mé- todos descritos. Uma vez nas células alvo, o RNA viral é reversamente transcrito, importado para o núcleo e integrado de maneira estável no genoma do hospedeiro. Um ou dois dias após a integração do RNA viral, a expressão da proteína recombinante, por exemplo, receptor de antígeno, como CAR, pode ser detectada.
[00283] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos envolvem métodos de transdução de células entrando em contato, por exemplo, incubando, uma composição celular que compreende uma pluralidade de células com uma partícula viral. Em algumas modalidades, as célu- las a serem transfectadas ou transduzidas são ou compreendem célu- las primárias obtidas de um indivíduo, como células enriquecidas e/ou selecionadas de um indivíduo.
[00284] Em algumas modalidades, a concentração de células a se- rem transduzidas da composição é de 1,0 x 105 células/mL a 1,0 x 108 células/mL ou de cerca de 1,0 x 105 células/mL a cerca de 1,0 x 108 células/mL, tais como pelo menos ou cerca de pelo menos ou cerca de 1,0 x 105 células/mL, 5 x 105 células/mL, 1 x 106 células/mL, 5 x 106 células/mL, 1 x 107 células/mL, 5 x 107 células/mL ou 1 x 108 célu- las/mL.
[00285] Em algumas modalidades, as partículas virais são forneci- das em uma certa relação de cópias das partículas de vetor viral ou unidades infecciosas (IU), por número total de células a serem trans- duzidas (IU/célula). Por exemplo, em algumas modalidades, as partí- culas virais estão presentes durante o contato em ou sobre ou pelo menos em ou em torno de 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 ou 60 UI das partículas do vetor viral por uma das células.
[00286] Em algumas modalidades, o título de partículas de vetor viral está entre ou entre cerca de 1 x 106 IU/mL e 1 x 108 IU/mL, como entre ou entre cerca de 5 x 106 IU/mL e 5 x 107 IU/mL, como pelo me- nos 6 x 106 IU/mL, 7 x 106 IU/mL, 8 x 106 IU/mL, 9 x 106 IU/mL, 1 x 107 IU/mL, 2 x 107 IU/mL, 3 x 107 IU/mL, 4 x 107 IU/mL ou 5 x 107 IU/mL.
[00287] Em algumas modalidades, a transdução pode ser alcança- da em uma multiplicidade de infecção (MOI) inferior a 100, como ge- ralmente inferior a 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 ou menos.
[00288] Em algumas modalidades, o método envolve o contato ou a incubação das células com as partículas virais. Em algumas modalida-
des, o contato é de 30 minutos a 72 horas, como 30 minutos a 48 ho- ras, 30 minutos a 24 horas ou 1 hora a 24 horas, como pelo menos ou cerca de pelo menos ou cerca de 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas ou mais.
[00289] Em algumas modalidades, o contato é realizado em solu- ção. Em algumas modalidades, as células e as partículas virais são contatadas em um volume de 0,5 mL a 500 mL ou de cerca de 0,5 mL a cerca de 500 mL, como de ou de cerca de 0,5 mL a 200 mL, 0,5 mL a 100 mL, 0,5 mL a 50 mL, 0,5 mL a 10 mL, 0,5 mL a 5 mL, 5 mL a 500 mL, 5 mL a 200 mL, 5 mL a 100 mL, 5 mL a 50 mL, 5 mL a 10 mL, 10 mL a 500 mL, 10 mL a 200 mL, 10 mL a 100 mL, 10 mL a 50 mL, 50 mL a 500 mL, 50 mL a 200 mL, 50 mL a 100 mL, 100 mL a 500 mL, 100 mL a 200 mL ou 200 mL a 500 mL.
[00290] Em certas modalidades, as células de entrada são tratadas, incubadas ou contatadas com partículas que compreendem moléculas de ligação que se ligam ou reconhecem o receptor recombinante que é codificado pelo DNA viral.
[00291] Em algumas modalidades, a incubação das células com as partículas do vetor viral resulta ou produz uma composição de saída compreendendo células transduzidas com as partículas do vetor viral. b. Vetores não virais
[00292] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinan- tes são transferidos para as células T por eletroporação (veja, por exemplo, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 e Van Te- deloo et al. (2000) Gene Therapy 7 (16) ): 1431-1437). Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes são transferidos para as células T por transposição (veja, por exemplo, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21 (4): 427-437; Sharma er Nucl Acids 2, e74; e Hu- ang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126). Outros métodos de introdução e expressão de material genético em células imunes inclu-
em a transfecção de fosfato de cálcio (por exemplo, como descrito em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y), fusão de protoplastos, transfecção mediada por lipossomas ca- tiônicos; bombardeio de micropartículas facilitado por partículas de tungstênio (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); e coprecipitação de DNA de fosfato de estrôncio (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031- 2034 (1987)).
[00293] Outros métodos e vetores para transferência dos ácidos nucleicos que codificam os produtos recombinantes são os descritos, por exemplo, no Pedido de Patente Internacional, Publicação No.: WO2014055668 e Patente Norte-americana No. 7.446.190.
[00294] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinan- tes são transferidos para as células T através de transposons. Trans- posons (elementos transponíveis) são segmentos móveis de DNA que podem se mover de um locus para outro dentro dos genomas. Esses elementos se movem através de um mecanismo conservador de "re- cortar e colar": a transposase catalisa a excisão do transposon de sua localização original e promove sua reintegração em outras partes do genoma. Elementos deficientes em transposase podem ser mobiliza- dos se a transposase for fornecida por outro gene da transposase. As- sim, os transposons podem ser utilizados para incorporar um DNA es- tranho no genoma do hospedeiro sem o uso de um sistema de trans- dução viral. Exemplos de transposons adequados para uso com célu- las de mamífero, por exemplo, leucócitos primários humanos, incluem, mas não estão limitados a, Sleeping Beauty e Piggybac.
[00295] A transfecção baseada em transposon é um sistema de dois componentes que consiste em uma transposase e um transpo- son. Em algumas modalidades, o sistema compreende um transposon que é modificado para compreender um DNA estranho (também aqui referido como DNA de carga), por exemplo, um gene que codifica um receptor recombinante, que é flanqueado por sequências de repetição invertida/repetição direta (IR/DR) que são reconhecidos por um tran- posase acompanhante. Em algumas modalidades, um plasmídeo não viral codifica uma transposase sob o controle de um promotor. A trans- fecção do plasmídeo para uma célula hospedeira resulta em uma ex- pressão transitória da transposase, assim, por um período inicial após a transfecção, a transposase é expressa em níveis suficientes para integrar o transposon no DNA genômico. Em algumas modalidades, a própria transposase não está integrada no DNA genômico e, portanto, a expressão da transposase diminui com o tempo. Em algumas moda- lidades, a expressão da transposase é expressa pela célula hospedei- ra em níveis suficientes para integrar um transposon correspondente por menos de cerca de 4 horas, menos de cerca de 8 horas, menos de cerca de 12 horas, menos de cerca de 12 horas, menos de cerca de 24 horas, menos de cerca de 2 dias, menos de 3 dias, menos de 4 di- as, menos de 5 dias, menos de 6 dias, menos de 7 dias, menos de 2 semanas, menos de 3 semanas, menos de 4 semanas, menos de cer- ca de semanas ou menos de cerca de 8 semanas. Em algumas moda- lidades, o DNA da carga que é introduzido no genoma do hospedeiro não é subsequentemente removido do genoma do hospedeiro, pelo menos porque a dose do hospedeiro não expressa uma transposase endógena capaz de extrair o DNA da carga.
[00296] O Sleeping Beauty (SB) é um membro sintético da super- família Tc/1-mariner de transposons, reconstruída a partir de elemen- tos inativos armazenados no genoma de peixes salmonídeos. A trans- fecção baseada em transposon SB é um sistema de dois componentes que consiste em uma transposase e um transposon contendo sequên- cias de repetição invertida/repetição direta (IR/DR) que resultam em integração precisa em um dinucleotídeo TA. O transposon é modifica- do com uma cassete de expressão de interesse, ladeada por IR/DRs.
A transposase SB liga sítios específicos de ligação que estão localiza- dos na IR do transposon Sleeping Beauty. A transposase SB media a integração do transposon, um elemento móvel que codifica uma se- quência de carga flanqueada em ambos os lados por repetições termi- nais invertidas que abrigam sítios de ligação para a enzima catalítica (SB). A expressão estável resulta quando a SB insere sequências de genes nos cromossomos de vertebrados em um dinucleotídeo alvo de AT através de um mecanismo de cortar e colar. Este sistema foi usado para projetar uma variedade de tipos de células de vertebrados, inclu- indo leucócitos primários do sangue periférico humano. Em algumas modalidades, as células são contatadas, incubadas e/ou tratadas com um transposon SB compreendendo um gene de carga, por exemplo, um gene que codifica um receptor recombinante ou um CAR, flanque- ado por sequências SB IR. Em modalidades particulares, as células a serem transfectadas são contatadas, incubadas e/ou tratadas com um plasmídeo compreendendo um transposon SB compreendendo um gene de carga, por exemplo, um gene que codifica um CAR, flanquea- do por sequências SB IR. Em certas modalidades, o plasmídeo com- preende ainda um gene que codifica uma transposase SB que não é flanqueada por sequências SB IR.
[00297] PiggyBac (PB) é outro sistema de transposon que pode ser usado para integrar o DNA da carga no hospedeiro, por exemplo, DNA genômico de um ser humano. A PB transposase reconhece sequên- cias de repetição terminal invertidas (ITRs) específicas do transposon PB localizadas em ambas as extremidades do transposon e move efi- cientemente o conteúdo dos sítios originais e os integra de maneira eficiente nos sítios cromossômicos TTAA. O sistema de transposon PB permite que genes de interesse entre as duas ITRs no vetor PB sejam mobilizados nos genomas alvo. O sistema PB foi usado para projetar uma variedade de tipos de células de vertebrados, incluindo células humanas primárias. Em algumas modalidades, as células a serem transfectadas são contatadas, incubadas e/ou tratadas com um trans- poson PB compreendendo um gene de carga, por exemplo, um gene que codifica um CAR, flanqueado por sequências PB IR. Em modali- dades particulares, as células a serem transfectadas são contatadas, incubadas e/ou tratadas com um plasmídeo compreendendo um transposon PB compreendendo um gene de carga, por exemplo, um gene que codifica um CAR, flanqueado por sequências PB IR. Em cer- tas modalidades, o plasmídeo compreende ainda um gene que codifi- ca uma transposase SB que não é flanqueada por sequências PB IR.
[00298] Em algumas modalidades, os vários elementos do transpo- son/transposase utilizados nos métodos em questão, por exemplo, ve- tor (s) SB ou PB, podem ser produzidos por métodos padrão de cliva- gem enzimática de restrição, ligação e clonagem molecular. Um proto- colo para construir os vetores sujeitos inclui as seguintes etapas. Pri- meiro, os fragmentos de ácido nucleico purificados que contêm se- quências nucleotídicas componentes desejadas, bem como sequên- cias estranhas, são clivados com endonucleases de restrição de fontes iniciais, por exemplo, um vetor compreendendo o gene da transposa- se. Os fragmentos contendo as sequências nucleotídicas desejadas são então separados dos fragmentos indesejados de tamanho diferen- te usando métodos de separação convencionais, por exemplo, por ele- troforese em gel de agarose. Os fragmentos desejados são excisados do gel e ligados juntos na configuração apropriada, de modo a produzir um ácido nucleico circular ou plasmídeo contendo as sequências de- sejadas, por exemplo, sequências correspondentes aos vários elemen- tos dos vetores sujeitos, como descrito acima. Onde desejado, as mo- léculas circulares assim construídas são então amplificadas em um hospedeiro procariótico, por exemplo, E. coli. Os procedimentos de clivagem, construção de plasmídeo, transformação celular e produção de plasmídeo envolvidos nessas etapas são bem conhecidos dos ver- sados na técnica e as enzimas necessárias para restrição e ligação estão disponíveis comercialmente. (Veja, por exemplo, R. Wu, Ed., Methods in Enzymology, Vol. 68, Academic Press, NY (1979); T. Ma- niatis, EF Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Ma- nual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1982); Catálogo 1982-83, New England Biolabs, Inc.; Catálogo 1982- 83, Bethesda Research Laboratories, Inc. É fornecido um exemplo de como construir os vetores empregados nos métodos em questão. na secção Experimental, infra. A preparação de um sistema de transpo- son da Sleeping Beauty representativo também é divulgada em WO 98/40510 e WO 99/25817).
[00299] Em algumas modalidades, a transdução com transposons é realizada com um plasmídeo que compreende um gene da transposa- se e um plasmídeo que compreende um transposon que contém uma sequência de DNA de carga que é flanqueada por sequências de repe- tição invertida/repetição direta (IR/DR) que são reconhecido pela transposase. Em certas modalidades, a sequência de DNA de carga codifica uma proteína heteróloga, por exemplo, um receptor de célula T recombinante ou um CAR. Em algumas modalidades, o plasmídeo compreende transposase e o transposon. Em algumas modalidades, a transposase está sob controle de um promotor onipresente, ou qual- quer promotor adequado para dirigir a expressão da transposase na célula alvo. Os promotores ubíquos incluem, mas não estão limitados a, EF1a, CMB, SV40, PGK1, Ubc, β-actina humana, CAG, TRE, UAS, Ac5, CaMKIIa e U6. Em algumas modalidades, o DNA da carga com- preende uma cassete de seleção que permite a seleção de células com integração estável do DNA da carga no DNA genômico. Cassetes de seleção adequados incluem, mas não estão limitados a, cassetes de seleção que codificam um gene de resistência à canamicina, gene de resistência à espectinomicina, gene de resistência à estreptomicina, gene de resistência à ampicilina, gene de resistência à carbenicilina, gene de resistência à higromicina, gene de resistência à bleomicina, gene de resistência à eritromicina e polimixina B gene de resistência.
[00300] Em algumas modalidades, os componentes para a transdu- ção com um transposon, por exemplo, plasmídeos compreendendo um transposase SB e transposon SB, são introduzidos na célula alvo. Qualquer protocolo conveniente pode ser empregado, em que o proto- colo pode proporcionar a introdução in vitro ou in vivo dos componen- tes do sistema na célula alvo, dependendo da localização da célula alvo. Por exemplo, onde a célula alvo é uma célula isolada, o sistema pode ser introduzido diretamente na célula sob condições de cultura celular permissivas de viabilidade da célula alvo, por exemplo, usando técnicas de transformação padrão. Tais técnicas incluem, não estão necessariamente limitados a: infecção viral, transformação, conjuga- ção, fusão de protoplastos, eletroporação, tecnologia de pistola de par- tículas, precipitação de fosfato de cálcio, microinjeção direta, liberação de vetor viral e similares. A escolha do método é geralmente depen- dente tipo de célula que está sendo transformada e das circunstâncias nas quais a transformação está ocorrendo (isto é, in vitro, ex vivo ou in vivo). Uma discussão geral desses métodos pode ser encontrada em Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3ª ed., Wiley & Sons, 1995.
[00301] Em algumas modalidades, o transposon SB e a fonte de transposase SB são introduzidos em uma célula alvo de um organismo multicelular, por exemplo, um mamífero ou um humano, sob condições suficientes para excisão do ácido nucleico flanqueado por repetição invertida do vetor o transposon e subsequente integração do ácido nu- cleico excisado no genoma da célula alvo. Algumas modalidades com- preendem ainda uma etapa de garantir que a atividade necessária da transposase esteja presente na célula alvo juntamente com o transpo- son introduzido. Dependendo da estrutura do próprio vetor de transpo- son, isto é, se o vetor inclui ou não uma região que codifica um produ- to com atividade de transposase, o método pode ainda incluir a intro- dução de um segundo vetor na célula alvo que codifica a atividade de transposase necessária.
[00302] Em algumas modalidades, a quantidade de ácido nucleico do vetor compreendendo o transposon e a quantidade de ácido nuclei- co do vetor que codifica a transposase que é introduzida na célula é suficiente para fornecer a excisão e inserção desejadas do ácido nu- cleico do transposon no alvo genoma celular. Como tal, a quantidade de ácido nucleico do vetor introduzida deve fornecer uma quantidade suficiente de atividade da transposase e um número suficiente de có- pias do ácido nucleico que se deseja que seja inserido na célula alvo. A quantidade de ácido nucleico do vetor que é introduzida na célula alvo varia dependendo da eficiência do protocolo de introdução espe- cífico que é empregado, por exemplo, o protocolo de administração ex vivo específico que é empregado.
[00303] Depois que o DNA do vetor entra na célula alvo em combi- nação com a transposase necessária, a região de ácido nucleico do vetor que é flanqueada por repetições invertidas, ou seja, o ácido nu- cleico do vetor posicionado entre a transposase Sleeping Beauty reco- nhece repetições invertidas, é excisada a partir do vetor via transposa- se fornecida e inserida no genoma da célula alvo. Como tal, a introdu- ção do DNA do vetor na célula alvo é seguida por excisão subsequen- te mediada pela transposase e inserção do ácido nucleico exógeno transportado pelo vetor no genoma da célula alvo. Em modalidades particulares, o vetor é integrado aos genomas de pelo menos 1 %, pe- lo menos 2 %, pelo menos 3 %, pelo menos 4 %, pelo menos 5 %, pe- lo menos 6 % pelo menos 7 % pelo menos 8 %, pelo menos 9 %, pelo menos 10 %, pelo menos 15 % ou pelo menos 20 % das células que são transfectadas com o transposon SB e/ou transposase SB. Em al- gumas modalidades, a integração do ácido nucleico no genoma da cé- lula alvo é estável, ou seja, o ácido nucleico do vetor permanece pre- sente no genoma da célula alvo por mais de um período transitório e é passado a uma parte do material genético cromossômico para a pro- gênie da célula alvo.
[00304] Em certas modalidades, os transposons são usados para integrar ácidos nucleicos, isto é, polinucleotídeos, de vários tamanhos no genoma da célula alvo. Em algumas modalidades, o tamanho do DNA que é inserido no genoma da célula alvo usando os métodos em questão varia de cerca de 0,1 kb a 200 kb, de cerca de 0,5 kb a 100 kb, de cerca de 1,0 kb a cerca de 8,0 kb, de cerca de 1,0 a cerca de 200 kb, de cerca de 1,0 a cerca de 10 kb, de cerca de 10 kb a cerca de 50 kb, de cerca de 50 kb a cerca de 100 kb ou de cerca de 100 kb a cerca de 200 kb. Em algumas modalidades, o tamanho do DNA que é inserido no genoma da célula alvo usando os métodos sujeitos varia de cerca de 1,0 kb a cerca de 8,0 kb. Em algumas modalidades, o ta- manho do DNA que é inserido em um genoma da célula alvo usando os métodos em questão varia de cerca de 1,0 a cerca de 200 kb. Em modalidades particulares, o tamanho do DNA que é inserido em um genoma da célula alvo usando os métodos em questão varia de cerca de 1,0 kb a cerca de 8,0 kb. D. Cultivo e/ou Expansão de Células
[00305] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos incluem uma ou mais etapas para o cultivo de células, por exemplo, o cultivo de células sob condições que promovem a proliferação e/ou expansão. Em algumas modalidades, as células são cultivadas sob condições que promovem proliferação e/ou expansão subsequentes a uma etapa de modificação genética, por exemplo, a introdução de um polipeptí-
deo recombinante nas células por transdução ou transfecção. Em mo- dalidades particulares, as células são cultivadas após as células terem sido incubadas sob condições estimulantes e transduzidas ou transfec- tadas com um polinucleotídeo recombinante, por exemplo, um polinu- cleotídeo que codifica um receptor recombinante. Em algumas modali- dades, o cultivo produz uma ou mais composições cultivadas de célu- las T enriquecidas.
[00306] Em certas modalidades, uma ou mais composições de célu- las T enriquecidas, incluindo células T estimuladas e transduzidas, como composições separadas dessas células T CD4+ e CD8+, são cultivadas, por exemplo, sob condições que promovem proliferação e/ou expansão, antes de formular as células. Em alguns aspectos, os métodos de cultivo, como para promover a proliferação e/ou expansão, incluem métodos aqui fornecidos, como na Seção I-F. Em modalida- des particulares, uma ou mais composições de células T enriquecidas são cultivadas após a modificação de uma ou mais composições, por exemplo, transduzidas ou transfectadas. Em modalidades particulares, as referidas uma ou mais composições são composições modificadas. Em modalidades particulares, as referidas uma ou mais composições de engenharia foram congeladas e armazenadas previamente e são descongeladas antes do cultivo.
[00307] Em certas modalidades, as referidas uma ou mais compo- sições de células T modificadas são ou incluem duas composições se- paradas de células T enriquecidas. Em modalidades particulares, duas composições separadas de células T enriquecidas, por exemplo, duas composições separadas de células T enriquecidas selecionadas, iso- ladas e/ou enriquecidas da mesma amostra biológica, que são introdu- zidas com um receptor recombinante (por exemplo, CAR), são cultiva- das separadamente sob condições que promovem a proliferação e/ou expansão das células. Em algumas modalidades, as condições são condições estimulantes. Em certas modalidades, as duas composições separadas incluem uma composição de células T CD4+ enriquecidas, como células T CD4+ modificadas que foram introduzidas com o ácido nucleico que codifica o receptor recombinante e/ou que expressa o receptor recombinante. Em modalidades particulares, as duas compo- sições separadas incluem uma composição de células T CD8+ enri- quecidas, como células T CD8+ modificadas que foram introduzidas com o ácido nucleico que codifica o receptor recombinante e/ou que expressa o receptor recombinante. Em algumas modalidades, duas composições separadas de células T CD4+ enriquecidas e células T CD8+ enriquecidas, como células T CD4+ modificadas e células T CD8+ modificadas, são cultivadas separadamente, por exemplo, sob condições que promovem proliferação e/ou expansão. Em algumas modalidades, uma única composição de células T enriquecidas é culti- vada. Em certas modalidades, a composição única é uma composição de células T CD4+ enriquecidas. Em algumas modalidades, a compo- sição única é uma composição de células T CD4+ e CD8+ enriqueci- das que foram combinadas a partir de composições separadas antes do cultivo.
[00308] Em algumas modalidades, a composição de células T CD4+ enriquecidas, como células T CD4+ modificadas, que é cultiva- da, por exemplo, sob condições que promovem proliferação e/ou ex- pansão, inclui pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, em pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,9 % ou a ou a cerca de 100 % de célu- las T CD4+. Em algumas modalidades, a composição inclui pelo me- nos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos
99,9 %, ou a cerca de 100 % de células T CD4+ que expressam o re- ceptor recombinante e/ou foram transduzidas ou transfectadas com o polinucleotídeo recombinante que codifica o receptor recombinante. Em certas modalidades, a composição de células T CD4+ enriqueci- das que são cultivadas inclui menos de 40 %, menos de 35 %, menos de 30 %, menos de 25 %, menos de 20 %, menos de 15 %, menos de 10 %, menor que 5 %, menor que 1 %, menor que 0,1 % ou menor que 0,01 % de células T CD8+ e/ou não contém células T CD8+ e/ou está livre ou substancialmente livre de células T CD8+.
[00309] Em algumas modalidades, a composição de células T CD8+ enriquecidas, como células T CD8+ modificadas, que é cultiva- da, por exemplo, sob condições que promovem proliferação e/ou ex- pansão, inclui pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, em pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,9 % ou a ou a cerca de 100 % de célu- las T CD8+. Em modalidades particulares, a composição inclui pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 %, pelo me- nos 99,9 % ou a ou a cerca de 100 % de células T CD8+ que expres- sam o receptor recombinante e/ou foram transduzidas ou transfecta- das com o polinucleotídeo recombinante que codifica o receptor re- combinante. Em certas modalidades, a composição de células T CD8+ enriquecidas que é incubada sob condições estimulantes inclui menos de 40 %, menos de 35 %, menos de 30 %, menos de 25 %, menos de 20 %, menos de 15 %, menos de 10 %, menos de 5 %, menos de 1 %, menos de ha 0,01 % de células T CD4+ e/ou não contém células T CD4+ e/ou está livre ou substancialmente livre de células T CD4+.
[00310] Em algumas modalidades, composições separadas de célu-
las T CD4+ e CD8+ enriquecidas, como composições separadas de células T CD4+ e CD8+ modificadas, são combinadas em uma única composição e são cultivadas, por exemplo, sob condições que promo- vem proliferação e/ou expansão. Em certas modalidades, composi- ções cultivadas separadas de células T CD4+ e CD8+ enriquecidas são combinadas em uma única composição após a realização e/ou conclusão da cultura. Em modalidades particulares, composições se- paradas de células T CD4+ e CD8+ enriquecidas, como composições separadas de células T CD4+ e CD8+ modificadas, são cultivadas se- paradamente, por exemplo, sob condições que promovem proliferação e/ou expansão.
[00311] Em algumas modalidades, as células, por exemplo, as célu- las modificadas são cultivadas em um volume médio que é, é cerca de ou é pelo menos 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL, 1.000 mL, 1,200 mL, 1,400 mL, 1,600 mL, 1,800 mL, 2.000 mL, 2,200 mL ou 2,400 mL. Em algumas modalida- des, as células são cultivadas em um volume inicial que é posterior- mente ajustado para um volume diferente. Em modalidades particula- res, o volume é ajustado posteriormente durante o cultivo. Em modali- dades particulares, o volume é aumentado a partir do volume inicial durante o cultivo. Em certas modalidades, o volume é aumentado quando as células atingem uma densidade durante o cultivo. Em certa modalidade, o volume inicial é ou é de cerca de 500 mL.
[00312] Em modalidades particulares, o volume é aumentado a par- tir do volume inicial quando as células atingem uma densidade ou con- centração durante o cultivo. Em modalidades particulares, o volume é aumentado quando as células atingem uma densidade e/ou concen- tração de, cerca de, ou de pelo menos 0,1 x 106 células/ml, 0,2 x 106 células/ml, 0,4 x 106 células/ml, 0,6 x 106 células/ml, 0,8 x 106 célu- las/ml, 1 x 106 células/ml, 1,2 x 106 células/ml, 1,4 x 106 células/ml, 1,6 x 106 células/ml, 1,8 x 106 células/ml, 2,0 x 106 células/ml, 2,5 x 106 células/ml, 3,0 x 106 células/ml, 3,5 x 106 células/ml, 4,0 x 106 célu- las/ml, 4,5 x 106 células/ml, 5,0 x 106 células/ml, 6 x 106 células/ml, 8 x 106 células/ml ou 10 x 106 células/ml. Em algumas modalidades, o vo- lume é aumentado a partir do volume inicial quando as células atingem uma densidade e/ou concentração de, pelo menos, ou de cerca de 0,6 x 106 células/ml. Em algumas modalidades, a densidade e/ou concen- tração é de células viáveis na cultura. Em modalidades particulares, o volume é aumentado quando as células atingem uma densidade e/ou concentração de, cerca de, ou de pelo menos 0,1 x 106 células viá- veis/ml, 0,2 x 106 células viáveis/ml, 0,4 x 106 células viáveis/ml, 0,6 x 106 células viáveis/ml, 0,8 x 106 células viáveis/ml, 1 x 106 células viá- veis/ml, 1,2 x 106 células viáveis/ml, 1,4 x 106 células viáveis/ml, 1,6 x 106 células viáveis/ml, 1,8 x 106 células viáveis/ml, 2,0 x 106 viável cé- lulas/ml, 2,5 x 106 células viáveis/ml, 3,0 x 106 células viáveis/ml, 3,5 x 106 células viáveis/ml, 4,0 x 106 células viáveis/ml, 4,5 x 106 células viáveis/ml, 5,0 x 106 células viáveis/ml, 6 x 106 células viáveis/ml, 8 x 106 células viáveis/ml ou 10 x 106 células viáveis/ml. Em algumas mo- dalidades, o volume é aumentado a partir do volume inicial quando as células viáveis atingem uma densidade e/ou concentração de, pelo menos, ou de cerca de 0,6 x 106 células viáveis/ml. Em algumas mo- dalidades, a densidade e/ou concentração das células ou células viá- veis pode ser determinada ou monitorada durante o cultivo, como o uso de métodos descritos, incluindo métodos ópticos, incluindo mi- croscopia de holografia digital (DHM) ou microscopia de holografia di- gital diferencial (DDHM).
[00313] Em algumas modalidades, as células atingem uma densi- dade e/ou concentração, e o volume é aumentado em, cerca de, ou pelo menos 100 mL, 200 mL, 300 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL, 1.000 mL, 1,200 mL, 1,400 mL, 1,600 mL, 1,800 mL, 2.000 mL, 2,200 mL ou 2,400 mL. Em algumas modali- dades, o volume é aumentado em 500 mL. Em modalidades particula- res, o volume é aumentado para um volume de, de cerca de ou pelo menos 500 mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL, 1.000 mL, 1,200 mL, 1,400 mL, 1,600 mL, 1,800 mL, 2.000 mL, 2,200 mL ou 2,400 mL. Em certas modalidades, o volume é aumentado para um volume de
1.000 mL. Em certas modalidades, o volume é aumentado a uma taxa de, pelo menos, ou de cerca de 5 mL, 10 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 75 mL, 80 mL, 90 mL ou 100 mL, a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 minutos. Em certas modalidades, a taxa é ou é de cerca de 50 mL a cada 8 minutos.
[00314] Em algumas modalidades, uma composição de células T enriquecidas, como células T modificadas, é cultivada sob condições que promovem proliferação e/ou expansão. Em algumas modalidades, essas condições podem ser modificadas para induzir proliferação, ex- pansão, ativação e/ou sobrevivência de células na população. Em mo- dalidades particulares, as condições estimulantes podem incluir um ou mais meios específicos, temperatura, teor de oxigênio, teor de dióxido de carbono, tempo, agentes, por exemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, íons e/ou fatores estimuladores, como citocinas, quimioci- nas, antígenos, parceiros de ligação, proteínas de fusão, receptores solúveis recombinantes e quaisquer outros agentes modificados para promover o crescimento, divisão e/ou expansão das células.
[00315] Em algumas modalidades, o cultivo é realizado sob condi- ções que geralmente incluem uma temperatura adequada para o cres- cimento de células imunes primárias, como linfócitos T humanos, por exemplo, pelo menos cerca de 25 graus Celsius, geralmente pelo me- nos cerca de 30 graus, e geralmente a cerca de 37 graus Celsius. Em algumas modalidades, a composição de células T enriquecidas é incu- bada a uma temperatura de 25 a 38 °C, como 30 a 37 °C, por exem-
plo, a cerca de 37 ºC ± 2 ºC. Em algumas modalidades, a incubação é realizada por um período de tempo até a cultura, por exemplo, cultivo ou expansão, resulta em densidade, concentração, número ou dose desejada ou limiar de células. Em algumas modalidades, a incubação é realizada por um período de tempo até a cultura, por exemplo, culti- vo ou expansão, resulta em densidade, concentração, número ou dose desejada ou limiar de células viáveis. Em algumas modalidades, a in- cubação é maior ou maior que cerca de ou é por cerca de 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias ou mais. Em algumas modalidades, a densidade, concentração e/ou número ou dose das células podem ser determinadas ou monitoradas durante o cultivo, como usando métodos descritos, incluindo métodos ópticos, incluindo microscopia de holografia digital (DHM) ou microscopia de holografia digital diferencial (DDHM).
[00316] Em algumas modalidades, o reagente estimulador é remo- vido e/ou separado das células antes do cultivo. Em certas modalida- des, o agente estimulador é removido e/ou separado das células sub- sequentemente à modificação e antes do cultivo das células modifica- das, por exemplo, sob condições que promovem proliferação e/ou ex- pansão. Em algumas modalidades, o reagente estimulador é um rea- gente estimulador que é descrito aqui, por exemplo, na Seção I-B-1. Em modalidades particulares, o reagente estimulador é removido e/ou separado das células como aqui descrito, por exemplo, na Seção I-B-
2.
[00317] Em modalidades particulares, uma composição de células T enriquecidas, como células T modificadas, por exemplo, composições separadas de células T CD4+ modificadas e células T CD8+ modifica- das, é cultivada na presença de uma ou mais citocinas. Em certas mo- dalidades, as referidas uma ou mais citocinas são citocinas recombi- nantes. Em modalidades particulares, as referidas uma ou mais citoci-
nas são citocinas recombinantes humanas. Em certas modalidades, as referidas uma ou mais citocinas se ligam e/ou são capazes de se ligar a receptores que são expressos por e/ou são endógenos às células T. Em modalidades particulares, as referidas uma ou mais citocinas é ou inclui um membro da família de citocinas de feixe 4-alfa-hélice. Em al- gumas modalidades, os membros da família de citocinas de feixe 4- alfa-hélice incluem, entre outros, interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4), interleucina-7 (IL-7) , interleucina-9 (IL-9), interleucina 12 (IL- 12), interleucina 15 (IL-15), fator estimulador de colônias de granulóci- tos (G-CSF) e fator estimulador de colônias de granulócitos e macró- fagos (GM-CSF). Em algumas modalidades, as referidas uma ou mais citocinas é ou inclui IL-15. Em modalidades particulares, as referidas uma ou mais citocinas é ou inclui IL-7. Em modalidades particulares, as referidas uma ou mais citocinas é ou inclui IL-2 recombinante.
[00318] Em modalidades particulares, a composição de células T CD4+ enriquecidas, como células T CD4+ modificadas, é cultivada com IL-2 recombinante. Em algumas modalidades, cultivar uma com- posição de células T CD4+ enriquecidas, como células T CD4+ modifi- cadas, na presença de IL-2 recombinante aumenta a probabilidade ou probabilidade de que as células T CD4+ da composição continuem a sobreviver, crescer, expandir, e/ou ativar durante a etapa de cultivo e durante todo o processo. Em algumas modalidades, cultivar a compo- sição de células T CD4+ enriquecidas, como células T CD4+ modifica- das, na presença de IL-2 recombinante aumenta a probabilidade e/ou probabilidade de que uma composição de saída de células T CD4+ enriquecidas, por exemplo, CD4+ T modificada células adequadas pa- ra terapia celular, serão produzidas a partir da composição de células T CD4+ enriquecidas em pelo menos 0,5 %, pelo menos 1 %, pelo menos 2 %, pelo menos 3 %, pelo menos 4 %, pelo menos 5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 7 %, pelo menos 8 %, pelo menos 9 %, pelo menos 10 %, pelo menos 11 %, pelo menos 12 %, pelo menos 13 %, pelo menos 14 %, pelo menos 15 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 100 % ou pelo menos pelo menos 200 % de CD4+ em compa- ração com um método alternativo e/ou exemplar que não cultiva a composição de células T CD4+ enriquecidas presença de IL-2 recom- binante.
[00319] Em algumas modalidades, as células, como composições separadas de células T CD4+ modificadas e células T CD8+ modifica- das, são cultivadas com uma citocina, por exemplo, uma citocina hu- mana recombinante, a uma concentração entre 1 IU/ml e 2.000 IU/ml, entre 10 IU/ml e 100 IU/ml, entre 50 IU/ml e 500 IU/ml, entre 100 IU/ml e 200 IU/ml, entre 500 IU/ml e 1400 IU/ml, entre 250 IU/ml e 500 IU/ml, ou entre 500 IU/ml e 2,500 IU/ml.
[00320] Em algumas modalidades, uma composição de células T enriquecidas, como composições separadas de células T CD4+ e célu- las T CD8+ modificadas, é cultivada com IL-2 recombinante, por exemplo, IL-2 recombinante humana, a uma concentração entre 2 IU/ml e 500 IU/ml, entre 10 IU/ml e 250 IU/ml, entre 100 IU/ml e 500 IU/ml, ou entre 100 IU/ml e 400 IU/ml. Em modalidades particulares, a composição de células T enriquecidas é cultivada com IL-2 em uma concentração de 50 IU/ml, 75 IU/ml, 100 IU/ml, 125 IU/ml, 125 IU/ml, 150 IU/ml, 175 IU/ml, 200 IU/ml, 225 IU/ml, 250 IU/ml, 300 IU/ml ou 400 IU/ml. Em algumas modalidades, a composição de células T enri- quecidas é cultivada com IL-2 recombinante a uma concentração de 200 IU/ml. Em algumas modalidades, a composição de células T enri- quecidas é uma composição de células T CD4+ enriquecidas, como uma composição de células T CD4+ modificadas. Em modalidades particulares, a composição de células T enriquecidas é uma composi-
ção de células T CD8+ enriquecidas, como uma composição de célu- las T CD8+ modificadas.
[00321] Em algumas modalidades, uma composição de células T enriquecidas, como composições separadas de células T CD4+ e célu- las T CD8+ modificadas, é cultivada com IL-7, por exemplo, IL-7 re- combinante humana, em uma concentração entre 10 IU/ml e 5.000 IU/ml, entre 500 IU/ml e 2.000 IU/ml, entre 600 IU/ml e 1,500 IU/ml, entre 500 IU/ml e 2,500 IU/ml, entre 750 IU/ml e 1,500 IU/ml ou entre
1.000 IU/ml e 2.000 IU/ml. Em modalidades particulares, a composição de células T enriquecidas é cultivada com IL-7 em uma concentração de 100 IU/ml, 200 IU/ml, 300 IU/ml, 300 IU/ml, 400 IU/ml, 500 IU/ml, 600 IU/ml, 700 IU/ml, 800 IU/ml, 900 IU/ml, 1.000 IU/ml, 1,200 IU/ml, 1,400 IU/ml ou 1,600 IU/ml. Em algumas modalidades, as células são cultivadas na presença de IL-7 recombinante em uma concentração de cerca de 1,200 IU/ml. Em algumas modalidades, a composição de cé- lulas T enriquecidas é uma composição de células T CD4+ enriqueci- das, como células T CD4+ modificadas.
[00322] Em algumas modalidades, uma composição de células T enriquecidas, como composições separadas de células T CD4+ modi- ficadas e células T CD8+, é cultivada com IL-15, por exemplo, IL-15 recombinante humana, a uma concentração entre 0,1 IU/ml e 200 IU/ml, entre 1 IU/ml e 50 IU/ml, entre 5 IU/ml e 25 IU/ml, entre 25 IU/ml e 50 IU/ml, entre 5 IU/ml e 15 IU/ml ou entre 10 IU/ml e 00 IU/ml. Em modalidades particulares, a composição de células T enriquecidas é cultivada com IL-15 em uma concentração de cerca de 1 IU/ml, 2 IU/ml, 3 IU/ml, 4 IU/ml, 5 IU/ml, 6 IU/ml, 7 IU/ml, 8 IU/ml, 9 IU/ml, 10 IU/ml, 11 IU/ml, 12 IU/ml, 13 IU/ml, 14 IU/ml, 15 IU/ml, 20 IU/ml, 25 IU/ml, 30 IU/ml, 40 IU/ml, 50 IU/ml, 100 IU/ml ou 200 IU/ml. Em moda- lidades particulares, uma composição de células T enriquecidas é cul- tivada com IL-15 recombinante a uma concentração de 20 IU/ml. Em algumas modalidades, a composição de células T enriquecidas é uma composição de células T CD4+ enriquecidas, como células T CD4+ modificadas. Em modalidades particulares, a composição de células T enriquecidas é uma composição de células T CD8+ enriquecidas, co- mo células T CD8+ modificadas.
[00323] Em modalidades particulares, uma composição de células T CD8+ enriquecidas, como células T CD8+ modificadas, é cultivada na presença de IL-2 e/ou IL-15, como nas quantidades descritas. Em cer- tas modalidades, uma composição de células T CD4+ enriquecidas, como células T CD4+ modificadas, é cultivada na presença de IL-2, IL- 7 e/ou IL-15, como nas quantidades descritas. Em algumas modalida- des, a IL-2, IL-7 e/ou IL-15 são recombinantes. Em certas modalida- des, a IL-2, IL-7 e/ou IL-15 são humanas. Em modalidades particula- res, as referidas uma ou mais citocinas são ou incluem IL-2, IL-7 e/ou IL-15 recombinantes humanas.
[00324] Em modalidades particulares, o cultivo é realizado em um sistema fechado. Em certas modalidades, o cultivo é realizado em um sistema fechado sob condições estéreis. Em modalidades particulares, o cultivo é realizado no mesmo sistema fechado que uma ou mais eta- pas dos sistemas fornecidos. Em algumas modalidades, a composição de células T enriquecidas é removida de um sistema fechado e colo- cada e/ou conectada a um biorreator para o cultivo. Exemplos de bior- reatores adequados para o cultivo incluem, mas não estão limitados a, GE Xuri W25, GE Xuri W5, Sartorius BioSTAT RM 20 | 50, sistemas de biorreatores SmartRocker Finesse e sistemas de biorreatores Pall XRS. Em algumas modalidades, o biorreator é usado para perfundir e/ou misturar as células durante pelo menos uma porção da etapa de cultivo.
[00325] Em algumas modalidades, as células cultivadas enquanto fechadas, conectadas e/ou sob controle de um biorreator sofrem ex-
pansão durante o cultivo mais rapidamente do que as células que são cultivadas sem um biorreator, por exemplo, células que são cultivadas sob condições estáticas, como sem mistura, agitação, movimento e/ou perfusão. Em algumas modalidades, as células cultivadas enquanto fechadas, conectadas e/ou sob controle de um biorreator atingem ou atingem um limiar de expansão, contagem de células e/ou densidade em 14 dias, 10 dias, 9 dias, 8 dias, 7 dias, 6 dias, 5 dias, 4 dias, 3 dias, 2 dias, 60 horas, 48 horas, 36 horas, 24 horas ou 12 horas. Em algu- mas modalidades, as células cultivadas enquanto fechadas, conecta- das e/ou sob controle de um biorreator alcançam ou atingem um limite de expansão, contagem de células e/ou densidade de pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 100 %, pelo menos 150 %, pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes do que as células cultivadas em um pro- cesso exemplar e/ou alternativo, onde as células não são cultivadas enquanto fechadas, conectadas e/ou sob controle de um biorreator.
[00326] Em algumas modalidades, a mistura é ou inclui agitação e/ou movimento. Em alguns casos, o biorreator pode estar sujeito a movimento ou agitação, o que, em alguns aspectos, pode aumentar a transferência de oxigênio. A movimentação do biorreator pode incluir, mas não se limita a, girar ao longo de um eixo horizontal, girar ao lon- go de um eixo vertical, um movimento de agitação ao longo de um eixo horizontal inclinado ou inclinado do biorreator ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da incubação é realizada com agitação. A velocidade e o ângulo de agita- ção podem ser ajustados para alcançar a agitação desejada. Em al- gumas modalidades, o ângulo de agitação é 20°, 19°, 18°, 17°, 16°, 15°, 14°, 13°, 12°, 11°, 10°, 9°, 8°, 7°, 6°, 5°, 4°, 3°, 2°ou 1°. Em certas modalidades, o ângulo de agitação está entre 6-16°. Em outras moda-
lidades, o ângulo de agitação está entre 7-16°. Em outras modalida- des, o ângulo de agitação está entre 8-12°. Em algumas modalidades, a taxa de agitação é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 1 12, 13, 14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 rpm. Em algumas modalidades, a taxa de agitação está entre 4 e 12 rpm, como entre 4 e 6 rpm, inclusive.
[00327] Em algumas modalidades, o biorreator mantém a tempera- tura em ou próximo a 37 °C e os níveis de CO2 em ou próximo a 5 % com um fluxo de ar constante a, cerca de, ou pelo menos 0,01 L/min, 0,05 L/min, 0,1 L/min, 0,2 L/min, 0,3 L/min, 0,4 L/min, 0,5 L/min, 1,0 L/min, 1,5 L/min ou 2,0 L/min ou maior que 2,0 L/min. Em certas moda- lidades, pelo menos uma porção do cultivo é realizada com perfusão, como uma taxa de 290 ml/dia, 580 ml/dia e/ou 1160 ml/dia, por exem- plo, dependendo do tempo em relação ao início do cultivo e/ou densi- dade das células cultivadas. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da expansão da cultura de células é realizada com um movimento de agitação, como em um ângulo entre 5°e 10°, como 6°, a uma velocidade de agitação constante, como uma velocidade entre 5 e 15 RPM, como 6 RMP ou 10 RPM.
[00328] Em algumas modalidades, a pelo menos uma porção da etapa de cultivo é realizada sob perfusão constante, por exemplo, uma perfusão a uma taxa lenta e constante. Em algumas modalidades, a perfusão é ou inclui uma saída de líquido, por exemplo, mídia usada e uma entrada de mídia nova. Em certas modalidades, a perfusão subs- titui meios usados por meios frescos. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção do cultivo é realizada sob perfusão a uma taxa constante de ou de cerca de ou de pelo menos 100 ml/dia, 200 ml/dia, 250 ml/dia, 250 ml/dia, 275 ml/dia, 290 ml/dia, 300 ml/dia, 350 ml/dia, 400 ml/dia, 450 ml/dia, 500 ml/dia, 550 ml/dia, 575 ml/dia, 580 ml/dia, 600 ml/dia, 650 ml/dia dia, 700 ml/dia, 750 ml/dia, 800 ml/dia, 850 ml/dia, 900 ml/dia, 950 ml/dia, 1000 ml/dia, 1100 ml/dia, 1160 ml/dia, 1200 ml/dia dia, 1400 ml/dia, 1600 ml/dia, 1800 ml/dia, 2000 ml/dia, 2200 ml/dia ou 2400 ml/dia.
[00329] Em modalidades particulares, o cultivo é iniciado sob condi- ções sem perfusão e a perfusão é iniciada após um período definido e/ou predeterminado de tempo, como ou por cerca de ou pelo menos 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 60 horas, 72 horas ou mais de 72 horas após o início ou início do cultivo. Em modalidades particula- res, a perfusão é iniciada quando a densidade ou concentração das células atinge um conjunto ou densidade ou concentração predetermi- nada. Em algumas modalidades, a perfusão é iniciada quando as célu- las cultivadas atingem uma densidade ou concentração de, cerca de, ou pelo menos 0,1 x 106 células/ml, 0,2 x 106 células/ml, 0,4 x 106 célu- las/ml, 0,6 x 106 células/ml, 0,8 x 106 células/ml, 1 x 106 células/ml, 1,2 x 106 células/ml, 1,4 x 106 células/ml, 1,6 x 106 células/ml, 1,8 x 106 células/ml, 2,0 x 106 células/ml, 2,5 x 106 células/ml, 3,0 x 106 célu- las/ml, 3,5 x 106 células/ml, 4,0 x 106 células/ml, 4,5 x 106 células/ml, 5,0 x 106 células/ml, 6 x 106 células/ml, 8 x 106 células/ml ou 10 x 106 células/ml. Em modalidades particulares, a perfusão é iniciada quando a densidade ou concentração de células viáveis atinge um conjunto ou densidade ou concentração predeterminada. Em algumas modalida- des, a perfusão é iniciada quando as células viáveis cultivadas atin- gem uma densidade ou concentração de, cerca de, ou pelo menos 0,1 x 106 células viáveis/ml, 0,2 x 106 células viáveis ml, 0,4 x 106 células viáveis/ml, 0,6 x 106 viável células/ml, 0,8 x 106 células viáveis/ml, 1 x 106 células viáveis/ml, 1,2 x 106 células viáveis/ml, 1,4 x 106 células viáveis/ml, 1,6 x 106 células viáveis/ml, 1,8 x 106 células viáveis/ml, 2,0 x 106 células viáveis/ml, 2,5 x 106 células viáveis/ml, 3,0 x 106 células viáveis/ml, 3,5 x 106 células viáveis/ml, 4,0 x 106 células viáveis/ml, 4,5 x 106 células viáveis/ml, 5,0 x 106 células viáveis/ml, 6 x 106 células viáveis/ml, 8 x 106 células viáveis/ml ou 10 x 106 células viáveis/ml.
[00330] Em modalidades particulares, a perfusão é realizada em diferentes velocidades durante o cultivo. Por exemplo, em algumas modalidades, a taxa de perfusão depende da densidade e/ou concen- tração das células cultivadas. Em certas modalidades, a taxa de perfu- são é aumentada quando as células atingem um conjunto ou densida- de ou concentração predeterminada. A taxa de perfusão pode mudar, por exemplo, mudar de uma taxa de perfusão constante para uma taxa de perfusão constante aumentada, uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, mais de cinco vezes, mais de dez vezes, mais de 15 vezes, mais 20 vezes, mais de 25 vezes, mais de 50 vezes ou mais de 100 vezes durante o cultivo. Em algumas modalidades, a taxa de perfusão constante aumenta quando as células atingem um conjunto ou densidade celular predeterminada ou concentração de, cerca de, ou pelo menos 0,6 x 106 células/ml, 0,8 x 106 células/ml, 1 x 106 células/ml, 1,2 x 106 células/ml, 1,4 x 106 células/ml, 1,6 x 106 célu- las/ml, 1,8 x 106 células/ml, 2,0 x 106 células/ml, 2,5 x 106 células/ml, 3,0 x 106 células/ml, 3,5 x 106 células/ml, 4,0 x 106 células/ml, 4,5 x 106 células/ml, 5,0 x 106 células/ml, 6 x 106 células/ml, 8 x 106 células/ml ou 10 x 106 células/ml. Em algumas modalidades, a taxa de perfusão constante aumenta quando as células atingem uma densidade ou con- centração celular predeterminada ou predeterminada de, cerca de, ou pelo menos 0,6 x 106 células viáveis/ml, 0,8 x 106 células viáveis /ml, 1 x 106 células viáveis /ml , 1,2 x 106 células viáveis/ml, 1,4 x 106 células viáveis /ml, 1,6 x 106 células viáveis /ml, 1,8 x 106 células viáveis/ml, 2,0 x 106 células viáveis/ml, 2,5 x 106 células viáveis/ml, 3,0 x 106 célu- las viáveis/ml, 3,5 x 106 células viáveis/ml, 4,0 x 106 células viáveis /ml, 4,5 x 106 células viáveis /ml, 5,0 x 106 células viáveis/ml, 6 x 106 célu- las viáveis /ml, 8 x 106 células viáveis /ml ou 10 x 106 células viáveis /ml. Em algumas modalidades, a densidade e/ou concentração das células ou das células viáveis durante o cultivo, como sob perfusão, pode ser determinada ou monitorada, como usando os métodos des- critos, incluindo métodos ópticos, incluindo microscopia de holografia digital (DHM ) ou microscopia de holografia digital diferencial (DDHM).
[00331] Em algumas modalidades, o cultivo é iniciado sob condi- ções sem perfusão e a perfusão é iniciada quando a densidade ou concentração das células atinge um conjunto ou densidade ou concen- tração predeterminada. Em algumas modalidades, a perfusão é inicia- da a uma taxa de, de cerca de ou pelo menos 100 ml/dia, 200 ml/dia, 250 ml/dia, 275 ml/dia, 290 ml/dia, 300 ml/dia, 350 ml/dia, 400 ml/dia, 450 ml/dia, 500 ml/dia, 550 ml/dia, 575 ml/dia, 580 ml/dia, 600 ml/dia, 650 ml/dia, 650 ml/dia, 700 ml/dia, 750 ml/dia, 800 ml/dia, 850 ml/dia, 900 ml/dia, 950 ml/dia, 1000 ml/dia, 1100 ml/dia, 1160 ml/dia, 1200 ml/dia, 1200 ml/dia, 1400 ml/dia, 1600 ml/dia, 1800 ml/dia, 2000 ml/dia, 2200 ml/dia ou 2400 ml/dia quando a densidade ou concentração das células atingir um conjunto ou densidade ou concentração predetermi- nada. Em algumas modalidades, a perfusão é iniciada quando as célu- las cultivadas ou células viáveis cultivadas atingem uma densidade ou concentração de, cerca de, ou pelo menos 0,1 x 106 células/ml, 0,2 x 106 células/ml, 0,4 x 106 células/ml, 0,6 x 106 células/ml, 0,8 x 106 célu- las/ml, 1 x 106 células/ml, 1,2 x 106 células/ml, 1,4 x 106 células/ml, 1,6 x 106 células/ml, 1,8 x 106 células/ml, 2,0 x 106 células/ml, 2,5 x 106 células/ml, 3,0 x 106 células/ml, 3,5 x 106 células/ml, 4,0 x 106 célu- las/ml, 4,5 x 106 células/ml, 5,0 x 106 células/ml, 6 x 106 células/ml, 8 x 106 células/ml ou 10 x 106 células/ml.
[00332] Em certas modalidades, pelo menos parte do cultivo é rea- lizada com perfusão a uma determinada taxa, e a taxa de perfusão é aumentada para, para cerca de ou pelo menos 100 ml/dia, 200 ml/dia, 200 ml/dia, 250 ml/dia, 275 ml/dia, 290 ml/dia, 300 ml/dia, 350 ml/dia, 400 ml/dia, 450 ml/dia, 500 ml/dia, 550 ml/dia, 575 ml/dia, 580 ml/dia dia, 600 ml/dia, 650 ml/dia, 700 ml/dia, 750 ml/dia, 800 ml/dia, 850 ml/dia, 900 ml/dia, 950 ml/dia, 1000 ml/dia, 1000 ml/dia, 1100 ml/dia dia, 1160 ml/dia, 1200 ml/dia, 1400 ml/dia, 1600 ml/dia, 1800 ml/dia, 2000 ml/dia, 2200 ml/dia ou 2400 ml/dia quando a densidade ou con- centração das células atingem um conjunto ou densidade ou concen- tração predeterminada. Em algumas modalidades, a perfusão é inicia- da quando as células cultivadas ou células viáveis cultivadas atingem uma densidade ou concentração de, cerca de, ou pelo menos 0,1 x 106 células/ml, 0,2 x 106 células/ml, 0,4 x 106 células/ml, 0,6 x 106 célu- las/ml, 0,8 x 106 células/ml, 1 x 106 células/ml, 1,2 x 106 células/ml, 1,4 x 106 células/ml, 1,6 x 106 células/ml, 1,8 x 106 células/ml, 2,0 x 106 células/ml, 2,5 x 106 células/ml, 3,0 x 106 células/ml, 3,5 x 106 célu- las/ml, 4,0 x 106 células/ml, 4,5 x 106 células/ml, 5,0 x 106 células/ml, 6 x 106 células/ml, 8 x 106 células/ml ou 10 x 106 células/ml. Em algumas modalidades, a perfusão é realizada quando as células são cultivadas em um volume de, cerca de, ou pelo menos 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 800 mL, 900 mL ou 1000 mL. Em algumas modalidades, o volume é de 1000 mL.
[00333] Em certas modalidades, o cultivo é iniciado sob condições sem perfusão ou perfusão a uma determinada taxa, e a taxa de perfu- são é aumentada para, para cerca de ou para 290 ml/dia quando a densidade ou concentração das células atinge uma concentração de, de cerca de ou de pelo menos 0,61 x 106 células/ml. Em certas moda- lidades, as células são perfundidas a uma taxa de, de cerca de, ou pe- lo menos 290 ml/dia, quando a densidade ou concentração das células atinge uma concentração de, de cerca de, ou de pelo menos 0,61 x 106 células/ml, quando a as células são cultivadas em um volume de, cerca de, ou pelo menos 1000 mL. Em algumas modalidades, a taxa de perfusão é aumentada para, para cerca de ou para 580 ml/dia quando a densidade ou concentração das células atinge uma concen-
tração de cerca de ou de pelo menos 0,81 x 106 células/ml. Em certas modalidades, a taxa de perfusão é aumentada para, para cerca de ou para 1160 ml/dia quando a densidade ou concentração das células atinge uma concentração de, de cerca de ou de pelo menos 1,01 x 106 células/ml. Em algumas modalidades, a taxa de perfusão é aumentada para, para cerca de ou para 1160 ml/dia quando a densidade ou con- centração das células atinge uma concentração de, de cerca ou de pelo menos 1,2 x 106 células/ml.
[00334] Em aspectos das modalidades fornecidas, a taxa de perfu- são, incluindo o momento em que é iniciada ou aumentada, como des- crito aqui e acima, é determinada a partir da avaliação da densidade e/ou concentração das células ou da densidade e/ou concentração de células viáveis durante o cultivo. Em algumas modalidades, a densida- de e/ou concentração das células pode ser determinada usando méto- dos como descrito, incluindo métodos ópticos, incluindo microscopia de holografia digital (DHM) ou microscopia de holografia digital dife- rencial (DDHM).
[00335] Em algumas modalidades, uma composição de células en- riquecidas, como células T modificadas, por exemplo, células T CD4+ modificadas ou células T CD8+ modificadas, são cultivadas na presen- ça de um tensoativo. Em modalidades particulares, o cultivo das célu- las da composição reduz a quantidade de tensão de cisalhamento que pode ocorrer durante o cultivo, por exemplo, devido à mistura, agita- ção, movimento e/ou perfusão. Em modalidades particulares, a com- posição de células T enriquecidas, como células T modificadas, por exemplo, células T CD4+ modificadas ou células T CD8+ modificadas, são cultivadas com o tensoativo e pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 99 % ou pelo me- nos 99,9 % das células T sobrevivem, por exemplo, são viáveis e/ou não sofrem necrose, morte celular programada ou apoptose, durante ou pelo menos 1 dia, 2 dias , 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias ou mais de 7 dias após o término do cultivo. Em modalidades particulares, a composição de células T enriquecidas, como células T modificadas, por exemplo, células T CD4+ modificadas ou células T CD8+ modifi- cadas, são cultivadas na presença de um tensoativo e menor que 50 %, menor que 40 %, menor que 30 %, menor que 25 %, menor que 20 %, menor que 15 %, menor 10 %, menos de 5 %, menos de 1 %, me- nos de 0,1 % ou menos de 0,01 % das células sofrem morte celular, por exemplo, morte celular programada, apoptose e/ou necrose, como por causa de cisalhamento ou cisalhamento induzido por estresse.
[00336] Em modalidades particulares, uma composição de células T enriquecidas, como células T modificadas, por exemplo, células T CD4+ modificadas ou células T CD8+ modificadas, são cultivadas na presença entre 0,1 µl/ml e 10,0 µl/ml, entre 0,2 µl/ml e 2,5 µl/ml, entre 0,5 µl/ml e 5 µl/ml, entre 1 µl/ml e 3 µl/ml, ou entre 2 µl/ml e 4 µl/ml do tensoativo. Em algumas modalidades, a composição de células T enri- quecidas, como células T modificadas, por exemplo, células T CD4+ modificadas ou células T CD8+ modificadas, são cultivadas na presen- ça de, cerca de, ou pelo menos 0,1 µl/ml, 0,2 µl/ml, 0,2 µl/ml, 0,4 µl/ml, 0,6 µl/ml, 0,8 µl/ml, 1 µl/ml, 1,5 µl/ml, 2,0 µl/ml, 2,5 µl/ml, 5,0 µl/ml, 10 µl/ml, 25 µl/ml ou 50 µl/ml do tensoativo. Em certas modalidades, a composição de células T enriquecidas é cultivada na presença de ou de cerca de 2 µl/ml do tensoativo.
[00337] Em algumas modalidades, o tensoativo é ou inclui um agente que reduz a tensão superficial de líquidos e/ou sólidos. Por exemplo, um tensoativo inclui um álcool graxo (por exemplo, álcool esterílico), um éter de polioxietileno glicol octilfenol (por exemplo, Tri- ton X-100) ou um alquil éster de polioxietileno glicol sorbitano (por exemplo, polissorbato 20, 40, 60). Em certas modalidades, o tensoati-
vo é selecionado a partir do grupo que consiste em Polissorbato 80 (PS80), polissorbato 20 (PS20), poloxâmero 188 (P188). Em uma mo- dalidade exemplar, a concentração do tensoativo no meio de alimenta- ção quimicamente definido é de cerca de 0,0025 % a cerca de 0,25 % (v/v) de PS80; cerca de 0,0025 % a cerca de 0,25 % (v/v) de PS20; ou cerca de 0,1 % a cerca de 5,0 % (p/v) de P188.
[00338] Em algumas modalidades, o tensoativo é ou inclui um ten- soativo aniônico, um tensoativo catiônico, um tensoativo zwiteriônico ou um tensoativo não iônico adicionado a ele. Os tensoativos aniôni- cos adequados incluem, mas não estão limitados a, alquil sulfonatos, alquil fosfatos, alquil fosfonatos, laurato de potássio, estearato de trie- tanolamina, lauril sulfato de sódio, dodecilsulfato de sódio, alquil poli- oxietileno sulfatos, alginato de sódio, dioctil sulfossuccinato de sódio, fosfatidilglicerol, fosfatidilglicerol, difosfatidilglicerol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico e seus sais, carboximetilcelulose de sódio, ácido cóli- co e outros ácidos biliares (por exemplo, ácido cólico, ácido desoxicóli- co, ácido glicocólico, ácido taurocólico, ácido glicodoxicólico) e seus sais (por exemplo, desoxicolato de sódio).
[00339] Em algumas modalidades, os tensoativos não iônicos ade- quados incluem: ésteres de glicerila, éteres de álcool graxo de polioxi- etileno, ésteres de ácidos graxos de polioxietileno sorbitano (polissor- batos), ésteres de ácidos graxos de polioxietileno, ésteres de sorbita- no, monoestearato de glicerol, polietilenoglicóis, álcool de polipropileno glicóis, cetilpropileno glicóis, cetilpropileno glicóis, ésteres de ácidos graxos de polioxietileno sorbitano (polissorbatos), ésteres de ácidos graxos de polioxietileno, polissorbatos) álcool, álcool estearílico, al- coóis de poliéter arilalquilalquílico, copolímeros de polioxietileno- polioxipropileno (poloxâmeros), poloxaminas, metilcelulose, hidroxime- til celulose, hidroxipropil celulose, hidroxipropilmetil celulose, celulose não cristalina, polissacarídeos incluindo amido e derivados de amido,
tais como amido de hidroxietila (HES), álcool polivinílico e polivinilpirro- lidona. Em certas modalidades, o tensoativo não iônico é um copolí- mero de polioxietileno e polioxipropileno e, de preferência, um copolí- mero de bloco de propileno glicol e etileno glicol. Esses polímeros são vendidos com o nome comercial POLOXAMER, também conhecido como PLURONIC® F68 ou Kolliphor® P188. Entre os ésteres de áci- dos graxos de polioxietileno estão incluídos aqueles com cadeias al- quila curtas. Um exemplo desse tensoativo é o SOLUTOL® HS 15, polietileno-660-hidroxiestearato.
[00340] Em algumas modalidades, tensoativos catiônicos adequa- dos podem incluir, mas não estão limitados a, fosfolipídeos naturais, fosfolipídeos sintéticos, compostos de amônio quaternário, cloreto de benzalcônio, brometo de cetiltrimetil amônio, quitosanas, cloreto de lauril dimetil benzil amônio, cloridratos de acil carnitina, brometo de dimetil dioctadecil amônio (DDAB), propano dioleioltrimetil amônio (DOTAP), propano de dimiristoil trimetil amônio (DMTAP), dimetil ami- no etano carbamoil colesterol (DC-col), 1,2-diacilglicerol-3-(O- alquil)fosfocolina, O-alquilfosfatidilcolina, haletos de alquilpiridínio ou alquilaminas de cadeia longa, tais como, por exemplo, n-octilamina e oleilamina.
[00341] Os tensoativos zuiteriônicos são eletricamente neutros, mas possuem cargas locais positivas e negativas na mesma molécula. Os tensoativos zwiteriônicos adequados incluem, mas não estão limitados a, fosfolipídeos zwiteriônicos. Os fosfolipídeos adequados incluem fos- fatidilcolina, fosfatidiletanolamina, diacil-glicerofosfoetanolamina (como dimiristoil-glicero-fosfoetanolamina (DMPE), dipalmitoil- glicerofosfoetanolamina (DPPE), distearoil-glicerol-fosfoetanolamina (DSPE), e dioleolil-glicero-fosfoetanolamina (DOPE)). As misturas de fosfolipídeos que incluem fosfolipídeos aniônicos e zuiteriônicos po- dem ser empregados nesta invenção. Tais misturas incluem, mas não estão limitadas a, lisofosfolipídeos, fosfolipídeos de ovo ou soja ou qualquer combinação dos mesmos. O fosfolipídeo, aniônico, zwiteriô- nico ou uma mistura de fosfolipídeos, pode ser salgado ou dessalini- zado, hidrogenado ou parcialmente hidrogenado ou semissintético ou sintético natural.
[00342] Em certas modalidades, o tensoativo é poloxâmero, por exemplo, poloxâmero 188. Em algumas modalidades, uma composi- ção de células T enriquecidas é cultivada na presença entre 0,1 µl/ml e 10,0 µl/ml, entre 0,2 µl/ml e 2,5 µl/ml, entre 0,5 µl/ml e 5 µl/ml, entre 1 µl/ml e 3 µl/ml, ou entre 2 µl/ml e 4 µl/ml de poloxâmero. Em algumas modalidades, a composição de células T enriquecidas é cultivada na presença de, cerca de, ou pelo menos 0,1 µl/ml, 0,2 µl/ml, 0,4 µl/ml, 0,6 µl/ml, 0,8 µl/ml, 1 µl/ml, 1,5 µl/ml, 2,0 µl/ml, 2,5 µl/ml, 5,0 µl/ml, 10 µl/ml, 25 µl/ml ou 50 µl/ml do tensoativo. Em certas modalidades, a composição de células T enriquecidas é cultivada na presença de ou de cerca de 2 µl/ml de poloxâmero.
[00343] Em modalidades particulares, o cultivo termina, como pela colheita de células, quando as células atingem uma quantidade limiar, concentração e/ou expansão. Em modalidades particulares, o cultivo termina quando a célula alcança ou alcança cerca de ou pelo menos uma expansão de 1,5 vezes, uma expansão de 2 vezes, uma expan- são de 2,5 vezes, uma expansão de 3 vezes, uma expansão de 3,5 vezes, uma expansão de 4 vezes, uma expansão de 4,5 vezes, uma expansão de 5 vezes, uma expansão de 6 vezes, uma expansão de 7 vezes, uma expansão de 8 vezes, uma expansão de 9 vezes, uma ex- pansão de 9 vezes, uma expansão de 10 vezes ou maior que uma ex- pansão de 10 vezes, por exemplo, com respeito e/ou em relação à quantidade de densidade das células no início ou início do cultivo. Em algumas modalidades, a expansão do limiar é uma expansão de 4 ve- zes, por exemplo, com respeito e/ou em relação à quantidade de den-
sidade das células no começo ou início do cultivo.
[00344] Em algumas modalidades, o cultivo termina, como pela co- lheita de células, quando as células atingem uma quantidade total limi- te de células, por exemplo, contagem de células limite. Em algumas modalidades, o cultivo termina quando as células atingem uma conta- gem-limite total de células nucleadas (TNC). Em algumas modalida- des, o cultivo termina quando as células atingem uma quantidade viá- vel limite de células, por exemplo, contagem de células viável limite. Em algumas modalidades, a contagem de células limiar ou é cerca de ou é pelo menos 50 x 106 células, 100 x 106 células, 200 x 106 células, 300 x 106 células, 400 x 106 células, 600 x 106 células, 800 x 106 célu- las, 1000 x 106 células, 1200 células x 106, 1400 x 106 células, 1600 x 106 células, 1800 x 106 células, 2000 x 106 células, 2500 x 106 células, 3000 x 106 células, 4000 x 106 células, 5000 x 106 células, 10.000 x 106 células, 12.000 x 106 células, 15.000 x 106 células ou 20.000 x 106 células, ou qualquer um dos limiares precedentes de células viáveis. Em modalidades particulares, o cultivo termina quando as células atin- gem uma contagem limite de células. Em algumas modalidades, o cul- tivo termina em, cerca de, ou dentro de 6 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias ou 7 dias ou mais, após a contagem limiar de células ser atingida. Em modalidades parti- culares, o cultivo é finalizado cerca de 1 dia após a contagem de célu- las limiar ser alcançada. Em certas modalidades, a densidade do limiar é, cerca de 0,1 x 106 células/ml, 0,5 x 106 células/ml, 1 x 106 célu- las/ml, 1,2 x 106 células/ml, 1,5 x 106 células/ml, 1,6 x 106 células/ml, 1,8 x 106 células/ml, 2,0 x 106 células/ml, 2,5 x 106 células/ml, 3,0 x 106 células/ml, 3,5 x 106 células/ml, 4,0 x 106 células/ml, 4,5 x 106 célu- las/ml, 5,0 x 106 células/ml, 6 x 106 células/ml, 8 x 106 células/ml ou 10 x 106 células/ml ou qualquer um dos limiares precedentes de células viáveis. Em modalidades particulares, o cultivo termina quando as cé-
lulas atingem uma densidade limiar. Em algumas modalidades, o culti- vo termina em, cerca de, ou dentro de 6 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias ou 7 dias ou mais, após a densidade limiar ser atingida. Em modalidades particulares, o cultivo é finalizado cerca de 1 dia após a densidade limiar ser alcança- da.
[00345] Em algumas modalidades, a etapa de cultivo é realizada pela quantidade de tempo necessária para as células atingirem uma quantidade limiar, densidade e/ou expansão. Em algumas modalida- des, o cultivo é realizado por, cerca de, ou por menos de 6 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 60 horas, 72 horas, 2 dias, 3 dias 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas ou 4 semanas. Em modalidades particulares, a quantidade média de tempo necessária para as células de várias composições separadas de células T enriquecidas que foram isoladas, enriquecidas e/ou selecionadas a partir de diferentes amos- tras biológicas para atingir a densidade limiar é, é ou é menor de 6 ho- ras, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 60 horas, 72 horas, 2 dias, 3 dias 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias , 10 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas ou 4 semanas. Em certas modalidades, a quantidade média de tempo necessária para as células de várias composições separadas de células T enriquecidas que foram isoladas, enriquecidas e/ou selecionadas a partir de diferentes amos- tras biológicas para atingir a densidade limite é, ou é menor de 6 ho- ras, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 60 horas, 72 horas, 2 dias, 3 dias 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas ou 4 semanas.
[00346] Em certas modalidades, a etapa de cultivo é realizada por um período mínimo de 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias ou 10 dias e/ou até 12 horas, 24 horas , 36 horas, 1 dia, 2 dias ou
3 dias após as células ativarem uma contagem (ou número) de células limite (ou número) ou número viável de células viável (ou número) de ou cerca de 1000 x 106 células, 1200 x 106 células, 1400 x 106 células, 1600 x 106 células, 1800 x 106 células, 2000 x 106 células, 2500 x 106 células, 3000 x 106 células, 4000 x 106 células ou 5000 x 106 células.
Em algumas modalidades, a etapa de cultivo é realizada até 1 dia após as células atingirem uma contagem limite de células de ou de cerca de 1200 x 106 células e são cultivadas por um período mínimo de 10 dias e/ou até 1 dia após as células atingirem um limite contagem de células ou de cerca de 5000 x 106 células.
Em algumas modalida- des, a etapa de cultivo é realizada até 1 dia após as células atingirem uma contagem limite de células de cerca de 1200 x 106 células e são cultivadas por um período mínimo de 9 dias e/ou até 1 dia após as cé- lulas atingirem um limite contagem de células ou de cerca de 5000 x 106 células.
Em algumas modalidades, a etapa de cultivo é realizada até 1 dia após as células atingirem uma contagem limite de células de cerca de 1000 x 106 células e são cultivadas por um período mínimo de 8 dias e/ou até 1 dia após as células atingirem um limite contagem de células ou de cerca de 4000 x 106 células.
Em certas modalidades, o cultivo é uma etapa de expansão e é realizado por um período míni- mo de 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias ou 10 dias e/ou até 12 horas, 24 horas, 36 horas, 1 dia, 2 dias ou 3 dias após as células ativarem uma contagem (ou número) de células limiares (ou número) ou número viável (ou número) de células de ou de cerca de 1000 x 106 células, 1200 x 106 células, 1400 x 106 células , 1600 x 106 células, 1800 x 106 células, 2000 x 106 células, 2500 x 106 células, 3000 x 106 células, 4000 x 106 células ou 5000 x 106 células.
Em al- gumas modalidades, a etapa de expansão é realizada até 1 dia após as células atingirem uma contagem limite de células de cerca de 1200 x 106 células e são expandidas por um período mínimo de 10 dias e/ou até 1 dia após as células atingirem um limite contagem de células ou de cerca de 5000 x 106 células. Em algumas modalidades, a etapa de expansão é realizada até 1 dia após as células atingirem uma conta- gem limite de células de ou de cerca de 1200 x 106 células e são ex- pandidas por um período mínimo de 9 dias e/ou até 1 dia após as célu- las atingirem um limite contagem de células ou de cerca de 5000 x 106 células. Em algumas modalidades, a etapa de expansão é realizada até 1 dia após as células atingirem uma contagem limite de células de ou de cerca de 1000 x 106 células e são expandidas por um período mínimo de 8 dias e/ou até 1 dia após as células atingirem um limite contagem de células ou de cerca de 4000 x 106 células. Em algumas modalidades, a etapa de expansão é realizada até 1 dia após as célu- las atingirem uma contagem limite de células de cerca de 1400 x 106 células e são expandidas por um período mínimo de 5 dias e/ou até 1 dia após as células atingirem um limite contagem de células ou de cer- ca de 4000 x 106 células.
[00347] Em algumas modalidades, o cultivo é realizado por pelo menos uma quantidade mínima de tempo. Em algumas modalidades, o cultivo é realizado por pelo menos 14 dias, pelo menos 12 dias, pelo menos 10 dias, pelo menos 7 dias, pelo menos 6 dias, pelo menos 5 dias, pelo menos 4 dias, pelo menos 3 dias, pelo menos pelo menos 2 dias, pelo menos 36 horas, pelo menos 24 horas, pelo menos 12 horas ou pelo menos 6 horas, mesmo que o limite seja atingido antes da quantidade mínima de tempo. Em algumas modalidades, aumentar a quantidade mínima de tempo em que o cultivo é realizado pode, em alguns casos, reduzir a ativação e/ou reduzir o nível ou um ou mais marcadores de ativação nas células cultivadas, células formuladas e/ou células da composição de saída. Em algumas modalidades, o tempo mínimo de cultivo conta, a partir de um ponto determinado, de um processo exemplar (por exemplo, uma etapa de seleção; uma eta-
pa de degelo; e/ou uma etapa de ativação) até o dia em que as células são colhidas.
[00348] Em aspectos das modalidades fornecidas, a densidade e/ou concentração das células ou das células viáveis durante o cultivo é monitorada ou realizada durante o cultivo, como até que uma quanti- dade-limite, densidade e/ou expansão seja alcançado como descrito. Em algumas modalidades, tais métodos incluem os descritos, incluindo métodos ópticos, incluindo microscopia de holografia digital (DHM) ou microscopia de holografia digital diferencial (DDHM).
[00349] Em certas modalidades, as células cultivadas são células de saída. Em algumas modalidades, uma composição de células T en- riquecidas, como células T modificadas, que foi cultivada é uma com- posição de saída de células T enriquecidas. Em modalidades particula- res, as células T CD4+ e/ou células T CD8+ que foram cultivadas são células T CD4+ e/ou CD8+ de saída. Em modalidades particulares, uma composição de células T CD4+ enriquecidas, como células T CD4+ modificadas, que foram cultivadas é uma composição de saída de células T CD4+ enriquecidas. Em algumas modalidades, uma com- posição de células T CD8+ enriquecidas, como células T CD8+ modifi- cadas, que foram cultivadas é uma composição de saída de células T CD8+ enriquecidas.
[00350] Em algumas modalidades, as células são cultivadas sob condições que promovem proliferação e/ou expansão na presença de uma ou mais citocinas. Em modalidades particulares, pelo menos uma porção do cultivo é realizada com mistura e/ou perfusão constantes, como mistura ou perfusão controlada por um biorreator. Em algumas modalidades, as células são cultivadas na presença ou em uma ou mais citocinas e com um tensoativo, por exemplo, poloxâmero, como o poloxâmero 188, para reduzir a tensão de cisalhamento e/ou cisalha- mento da mistura e/ou perfusão constantes. Em algumas modalidades,
uma composição de células T CD4+ enriquecidas, como células T CD4+ modificadas, é cultivada na presença de IL-2, IL-7, IL-15 e po- loxâmero recombinante, em que pelo menos uma porção do cultivo é realizada com mistura e/ou perfusão constantes. Em certas modalida- des, uma composição de células T CD8+ enriquecidas, como células T CD8+ modificadas, é cultivada na presença de IL-2, IL-15 e poloxâme- ro recombinante, em que pelo menos uma porção do cultivo é realiza- da com mistura constante e/ou perfusão. Em algumas modalidades, o cultivo é realizado até que as células atinjam o limite de expansão de pelo menos 4 vezes, por exemplo, em comparação com o início do cul- tivo. Monitoramento das Células durante o Cultivo
[00351] Em algumas modalidades, as células são monitoradas du- rante a etapa de cultivo. O monitoramento pode ser realizado, por exemplo, para determinar (por exemplo, medir, quantificar) a morfolo- gia celular, viabilidade celular, morte celular e/ou concentração celular (por exemplo, concentração celular viável). Em algumas modalidades, o monitoramento é realizado manualmente, como por um operador humano. Em algumas modalidades, o monitoramento é realizado por um sistema automatizado. O sistema automatizado pode exigir uma entrada manual mínima ou nenhuma para monitorar as células cultiva- das. Em algumas modalidades, o monitoramento é realizado manual- mente e por um sistema automatizado.
[00352] Em certas modalidades, as células são monitoradas por um sistema automatizado que não requer entrada manual. Em algumas modalidades, o sistema automatizado é compatível com um biorreator, por exemplo, um biorreator como aqui descrito, de modo que as célu- las em cultivo possam ser removidas do biorreator, monitoradas e subsequentemente retornadas ao biorreator. Em algumas modalida- des, o monitoramento e o cultivo ocorrem em uma configuração de cir-
cuito fechado. Em alguns aspectos, em uma configuração de circuito fechado, o sistema automatizado e o biorreator permanecem estéreis. Nas modalidades, o sistema automatizado é estéril. Em algumas mo- dalidades, o sistema automatizado é um sistema em linha.
[00353] Em algumas modalidades, o sistema automatizado inclui o uso de técnicas ópticas (por exemplo, microscopia) para detectar mor- fologia celular, viabilidade celular, morte celular e/ou concentração ce- lular (por exemplo, concentração celular viável). Qualquer técnica ópti- ca adequada para determinar, por exemplo, características celulares, viabilidade e concentração, é considerada aqui. Exemplos não limitan- tes de técnicas ópticas úteis incluem microscopia de campo claro, mi- croscopia de fluorescência, microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC), microscopia de contraste de fase, microscopia de holografia digital (DHM), microscopia de holografia digital diferencial (DDHM) ou uma combinação das mesmas. A microscopia de hologra- fia digital diferencial, DDHM e DHM diferencial podem ser aqui utiliza- das de forma intercambiável. Em certas modalidades, o sistema auto- matizado inclui um microscópio diferencial de holografia digital. Em certas modalidades, o sistema automatizado inclui um microscópio di- ferencial de holografia digital incluindo meios de iluminação (por exemplo, laser, led). Descrições da metodologia e uso do DDHM po- dem ser encontradas, por exemplo, nos US 7,362,449; EP 1,631,788; US 9,904,248; e US 9,684,281, que são incorporadas aqui por refe- rência na sua totalidade.
[00354] A DDHM permite imagens não destrutivas e sem marcação de células, resultando em imagens holográficas de alto contraste. As imagens podem sofrer segmentação de objetos e análise adicional pa- ra obter uma pluralidade de características morfológicas que descre- vem quantitativamente os objetos fotografados (por exemplo, células cultivadas, detritos celulares). Como tais, várias características (por exemplo, morfologia celular, viabilidade celular, concentração celular) podem ser diretamente avaliadas ou calculadas a partir de DDHM usando, por exemplo, as etapas de aquisição de imagens, processa- mento de imagens, segmentação de imagens e extração de caracterís- ticas. Em algumas modalidades, o sistema automatizado inclui um dis- positivo de gravação digital para gravar imagens holográficas. Em al- gumas modalidades, o sistema automatizado inclui um computador incluindo algoritmos para analisar imagens holográficas. Em algumas modalidades, o sistema automatizado inclui um monitor e/ou computa- dor para exibir os resultados da análise de imagem holográfica. Em algumas modalidades, a análise é automatizada (isto é, capaz de ser executada na ausência de entrada do usuário). Um exemplo de um sistema automatizado adequado para monitorar células durante a eta- pa de cultivo inclui, mas não está limitado a, Ovizio iLine F (Ovizio Imaging Systems NV/SA, Brussels, Belgium).
[00355] Em certas modalidades, o monitoramento é realizado conti- nuamente durante a etapa de cultivo. Em algumas modalidades, o monitoramento é realizado em tempo real durante a etapa de cultivo. Em algumas modalidades, o monitoramento é realizado em momentos discretos durante a etapa de cultivo. Em algumas modalidades, o mo- nitoramento é realizado pelo menos a cada 15 minutos pela duração da etapa de cultivo. Em algumas modalidades, o monitoramento é rea- lizado pelo menos a cada 30 minutos durante a etapa de cultivo. Em algumas modalidades, o monitoramento é realizado pelo menos a ca- da 45 minutos durante a etapa de cultivo. Em algumas modalidades, o monitoramento é realizado pelo menos a cada hora durante a etapa de cultivo. Em algumas modalidades, o monitoramento é realizado pelo menos a cada 2 horas durante a etapa de cultivo. Em algumas modali- dades, o monitoramento é realizado pelo menos a cada 4 horas duran- te a etapa de cultivo. Em algumas modalidades, o monitoramento é realizado pelo menos a cada 6 horas durante a etapa de cultivo.
Em algumas modalidades, o monitoramento é realizado pelo menos a ca- da 8 horas durante a etapa de cultivo.
Em algumas modalidades, o monitoramento é realizado pelo menos a cada 10 horas durante a eta- pa de cultivo.
Em algumas modalidades, o monitoramento é realizado pelo menos a cada 12 horas durante a etapa de cultivo.
Em algumas modalidades, o monitoramento é realizado pelo menos a cada 14 ho- ras durante a etapa de cultivo.
Em algumas modalidades, o monitora- mento é realizado pelo menos a cada 16 horas durante a etapa de cul- tivo.
Em algumas modalidades, o monitoramento é realizado pelo me- nos a cada 18 horas durante a etapa de cultivo.
Em algumas modali- dades, o monitoramento é realizado pelo menos a cada 20 horas du- rante a etapa de cultivo.
Em algumas modalidades, o monitoramento é realizado pelo menos a cada 22 horas durante a etapa de cultivo.
Em algumas modalidades, o monitoramento é realizado pelo menos uma vez por dia durante a etapa de cultivo.
Em algumas modalidades, o monitoramento é realizado pelo menos uma vez a cada dois dias du- rante a etapa de cultivo.
Em algumas modalidades, o monitoramento é realizado pelo menos uma vez a cada três dias durante a etapa de cul- tivo.
Em algumas modalidades, o monitoramento é realizado pelo me- nos uma vez a cada quatro dias durante a etapa de cultivo.
Em algu- mas modalidades, o monitoramento é realizado pelo menos uma vez a cada cinco dias durante a etapa de cultivo.
Em algumas modalidades, o monitoramento é realizado pelo menos uma vez a cada seis dias du- rante a etapa de cultivo.
Em algumas modalidades, o monitoramento é realizado pelo menos uma vez a cada sete dias durante a etapa de cultivo.
Em algumas modalidades, o monitoramento é realizado pelo menos uma vez a cada oito dias durante a etapa de cultivo.
Em algu- mas modalidades, o monitoramento é realizado pelo menos uma vez a cada nove dias durante a etapa de cultivo.
Em algumas modalidades,
o monitoramento é realizado pelo menos uma vez a cada dez dias du- rante o período da etapa de cultivo. Em algumas modalidades, o moni- toramento é realizado pelo menos uma vez durante a etapa de cultivo.
[00356] Em algumas modalidades, as características das células que podem ser determinadas pelo monitoramento, incluindo o uso de técnicas óticas como DHM ou DDHM, incluem viabilidade celular, con- centração celular, número de células e/ou densidade celular. Em al- gumas modalidades, a viabilidade celular é caracterizada ou determi- nada. Em algumas modalidades, a concentração, densidade e/ou nú- mero de células é caracterizada ou determinada. Em algumas modali- dades, a concentração de células viáveis, número de células viáveis e/ou densidade de células viáveis é caracterizada ou determinada. Em algumas modalidades, as células cultivadas são monitoradas pelo sis- tema automatizado até que um limiar de expansão seja alcançado, como descrito acima. Em algumas modalidades, uma vez atingido um limiar de expansão, as células cultivadas são colhidas, como por mé- todos automáticos ou manuais, por exemplo, por um operador huma- no. O limiar de expansão pode depender da concentração total, densi- dade e/ou número de células cultivadas determinadas pelo sistema automatizado. Alternativamente, o limiar de expansão pode depender da concentração, densidade e/ou número de células viáveis.
[00357] Em algumas modalidades, as células colhidas são formula- das como descrito, como na presença de um transportador farmaceu- ticamente aceitável. Em algumas modalidades, as células colhidas são formuladas na presença de um crioprotetor. E. Formulação das células
[00358] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos para fa- bricar, gerar ou produzir uma terapia celular e/ou células modificadas podem incluir a formulação de células, como a formulação de células geneticamente modificadas resultantes das etapas de processamento fornecidas antes ou depois da incubação, modificação e cultivo e/ou uma ou mais outras etapas de processamento, conforme descrito. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos associados à formula- ção de células incluem o processamento de células transduzidas, co- mo células transduzidas e/ou expandidas usando as etapas de pro- cessamento descritas acima, em um sistema fechado. Em algumas modalidades, a dose de células compreendendo células modificadas com um receptor de antígeno recombinante, por exemplo, CAR ou TCR, é fornecida como uma composição ou formulação, tal como uma composição ou formulação farmacêutica. Tais composições podem ser usadas de acordo com os métodos fornecidos, como na prevenção ou tratamento de doenças, condições e distúrbios, ou nos métodos de detecção, diagnóstico e prognóstico.
[00359] Em alguns casos, as células são processadas em uma ou mais etapas (por exemplo, realizadas na câmara centrífuga e/ou sis- tema fechado) para fabricar, gerar ou produzir uma terapia celular e/ou células modificadas podem incluir a formulação de células, tal como a formulação de células geneticamente modificadas resultantes das eta- pas de processamento de transdução fornecidas antes ou depois da cultura, por exemplo, cultivo e expansão e/ou uma ou mais outras eta- pas de processamento, conforme descrito. Em alguns casos, as célu- las podem ser formuladas em uma quantidade para administração de dosagem, tal como para uma única administração de dose unitária ou administração de múltiplas dosagens. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos associados à formulação de células incluem o processamento de células transduzidas, como células transduzidas e/ou expandidas usando as etapas de processamento descritas acima, em um sistema fechado.
[00360] Em certas modalidades, uma ou mais composições de célu- las T enriquecidas, como células T modificadas e cultivadas, por exemplo, células T de saída, são formuladas. Em modalidades particu- lares, uma ou mais composições de células T enriquecidas, tais como células T modificadas e cultivadas, por exemplo, células T de saída, são formuladas após as referidas uma ou mais composições terem sido modificadas e/ou cultivadas. Em modalidades particulares, as re- feridas uma ou mais composições são composições de entrada. Em algumas modalidades, as referidas uma ou mais composições de en- trada foram previamente criocongeladas e armazenadas e são des- congeladas antes da incubação.
[00361] Em certas modalidades, as referidas uma ou mais compo- sições de células T enriquecidas, como células T modificadas e culti- vadas, por exemplo, células T de saída, são ou incluem duas compo- sições separadas, por exemplo, composições modificadas e/ou culti- vadas separadas, de células T enriquecidas. Em modalidades particu- lares, duas composições separadas de células T enriquecidas, por exemplo, duas composições separadas de células T CD4+ enriqueci- das e células T CD8+ selecionadas, isoladas e/ou enriquecidas da mesma amostra biológica, modificadas separadamente e cultivadas separadamente, são formuladas separadamente. Em certas modalida- des, as duas composições separadas incluem uma composição de cé- lulas T CD4+ enriquecidas, como uma composição de células T CD4+ modificadas e/ou cultivadas. Em modalidades particulares, as duas composições separadas incluem uma composição de células T CD8+ enriquecidas, como uma composição de células T CD8+ modificadas e/ou cultivadas. Em algumas modalidades, duas composições separa- das de células T CD4+ enriquecidas e células T CD8+ enriquecidas, tais como composições separadas de células T CD4+ modificadas e cultivadas e células T CD8+ modificadas e cultivadas, são formuladas separadamente. Em algumas modalidades, uma única composição de células T enriquecidas é formulada. Em certas modalidades, a compo-
sição única é uma composição de células T CD4+ enriquecidas, como uma composição de células T CD4+ modificadas e/ou cultivadas. Em algumas modalidades, a composição única é uma composição de cé- lulas T CD4+ e CD8+ enriquecidas que foram combinadas a partir de composições separadas antes da formulação.
[00362] Em algumas modalidades, composições separadas de célu- las T CD4+ e CD8+ enriquecidas, como composições separadas de células T CD4+ e CD8+ modificadas e cultivadas, são combinadas em uma única composição e são formuladas. Em certas modalidades, composições formuladas separadas de células T CD4+ enriquecidas e CD8+ enriquecidas são combinadas em uma única composição após a formulação ter sido realizada e/ou concluída. Em modalidades particu- lares, composições separadas de células T CD4+ e CD8+ enriqueci- das, como composições separadas de células T CD4+ e CD8+ modifi- cadas e cultivadas, são formuladas separadamente como composi- ções separadas.
[00363] Em algumas modalidades, a composição de células T CD4+ enriquecidas, como células T CD4+ modificadas e cultivadas, por exemplo, as células T CD4+ de saída, que são formuladas, inclu- em pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo me- nos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,9 %, ou a ou a cerca de 100 % de células T CD4+. Em algumas modalidades, a composição inclui pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,9 % ou a ou a cerca de 100 % de células T CD4+ que expressam um receptor re- combinante e/ou foram transduzidas ou transfectadas com o polinu- cleotídeo recombinante. Em certas modalidades, a composição de cé-
lulas T CD4+ enriquecidas, como células T CD4+ modificadas e culti- vadas, por exemplo, células T CD4+ de saída, que é formulada inclui menos de 40 %, menos que 35 %, menos que 30 %, menos que 25 %, menos que 20 %, menos que 15 %, menos que 10 %, menos que 5 %, menos que 1 %, menos que 0,1 % ou menos de 0,01 % de células T CD8+ e/ou não contém células T CD8+ e/ou está livre ou substancial- mente livre de células T CD8+.
[00364] Em algumas modalidades, a composição de células T CD8+ enriquecidas, como células T CD8+ modificadas e cultivadas, por exemplo, as células T CD8+ de saída, formuladas, incluem pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 %, pelo me- nos 99,9 %, ou a ou a cerca de 100 % de células T CD8+. Em certas modalidades, a composição inclui pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,9 % ou a ou a cerca de 100 % de células T CD8+ que expressam o receptor recombinante e/ou foram transduzidas ou transfectadas com o polinucleotídeo recombi- nante. Em certas modalidades, a composição de células T CD8+ enri- quecidas, como células T CD8+ modificadas e cultivadas, por exem- plo, células T CD8+ de saída, que são incubadas em condições esti- mulantes incluem menos de 40 %, menos de 35 %, menos de 30 %, menos de 25 %, menos de 20 %, menos de 15 %, menos de 10 %, menos de 5 %, menos de 1 %, menos de 0,1 % ou menos de 0,01 % de células T CD4+ e/ou não contém células T CD4+ e/ou estão livres ou substancialmente livres de células T CD4+.
[00365] Em certas modalidades, as células formuladas são células de saída. Em algumas modalidades, uma composição formulada de células T enriquecidas, como uma composição formulada de células T modificadas e cultivadas, é uma composição de saída de células T en- riquecidas. Em modalidades particulares, as células T CD4+ formula- das e/ou células T CD8+ formuladas são as células T CD4+ e/ou CD8+ de saída. Em modalidades particulares, uma composição formu- lada de células T CD4+ enriquecidas é uma composição de saída de células T CD4+ enriquecidas. Em algumas modalidades, uma compo- sição formulada de células T CD8+ enriquecidas é uma composição de saída de células T CD8+ enriquecidas.
[00366] Em algumas modalidades, as células podem ser formula- das em um recipiente, como uma bolsa ou frasconete. Em algumas modalidades, as células são formuladas entre 0 dia e 10 dias, entre 0 e 5 dias, entre 2 dias e 7 dias, entre 0,5 dias e 4 dias, ou entre 1 dia e 3 dias após a contagem, densidade e/ou expansão limiar de células terem sido alcançadas durante o cultivo. Em certas modalidades, as células são formuladas dentro ou dentro de cerca de 12 horas, 18 ho- ras, 24 horas, 1 dia, 2 dias ou 3 dias após a contagem, densidade e/ou expansão limiar de células terem sido alcançadas durante o cultivo. Em algumas modalidades, as células são formuladas dentro ou dentro de cerca de 1 dia após a contagem, densidade e/ou expansão limiar de células terem sido alcançadas durante o cultivo.
[00367] Modalidades particulares contemplam que as células estão em um estado mais ativado nos estágios iniciais do cultivo do que em estágios posteriores do cultivo. Além disso, em algumas modalidades, pode ser desejável formular células que estejam em um estado menos ativado do que a ativação de pico que ocorre ou pode ocorrer durante o cultivo. Em certas modalidades, as células são cultivadas por uma duração ou quantidade mínima de tempo, por exemplo, para que as células sejam colhidas em um estado menos ativado do que se fossem formuladas em um ponto de tempo anterior durante o cultivo, indepen-
dentemente de quando o limite for alcançado. Em algumas modalida- des, as células são cultivadas entre o 1 dia e 3 dias após a contagem, densidade e/ou expansão limiar de células terem sido alcançadas du- rante o cultivo. Em certas modalidades, as células atingem a conta- gem, densidade e/ou expansão limiar das células e permanecem culti- vadas por um tempo ou duração mínima antes da formulação. Em al- gumas modalidades, as células que atingiram o limiar não são formu- ladas até serem cultivadas por um período mínimo e/ou quantidade de tempo, como um tempo ou duração mínima entre 1 dia e 14 dias, 2 dias e 7 dias, ou 3 dias e 6 dias, ou um tempo ou duração mínima de cultivo de cerca de 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias ou mais de 7 dias. Em algumas modalidades, o tempo ou duração mínima do cultivo é entre 3 dias e 6 dias.
[00368] Em algumas modalidades, as células são formuladas em um tampão farmaceuticamente aceitável, que pode, em alguns aspec- tos, incluir um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o processamento inclui a troca de um meio em um meio ou tampão de formulação que é farmaceuticamente aceitável ou desejado para administração a um indivíduo. Em algumas modali- dades, as etapas de processamento podem envolver a lavagem das células transduzidas e/ou expandidas para substituir as células em um tampão farmaceuticamente aceitável que pode incluir um ou mais transportadores ou excipientes farmaceuticamente opcionais. Exem- plos de tais formas farmacêuticas, incluindo transportadores ou excipi- entes farmaceuticamente aceitáveis, podem ser descritos abaixo em conjunto com formas aceitáveis para administrar as células e composi- ções a um indivíduo. A composição farmacêutica em algumas modali- dades contém as células em quantidades eficazes para tratar ou pre- venir a doença ou condição, como uma quantidade terapeuticamente eficaz ou profilaticamente eficaz.
[00369] Um "transportador farmaceuticamente aceitável" refere-se a um ingrediente em uma formulação farmacêutica, que não seja um in- grediente ativo, que não seja tóxico para um indivíduo. Um transporta- dor farmaceuticamente aceitável inclui, porém, não está limitado a, um tampão, excipiente, estabilizador ou conservante.
[00370] Em alguns aspectos, a escolha do transportador é determi- nada em parte pela célula específica e/ou pelo método de administra- ção. Por conseguinte, existe uma variedade de formulações adequa- das. Por exemplo, a composição farmacêutica pode conter conservan- tes. Conservantes adequados podem incluir, por exemplo, metilpara- beno, propilparabeno, benzoato de sódio e cloreto de benzalcônio. Em alguns aspectos, uma mistura de dois ou mais conservantes é usada. O conservante ou suas misturas estão tipicamente presentes em uma quantidade de cerca de 0,0001 % a cerca de 2 % em peso da compo- sição total. Os transportadores são descritos, por exemplo, pela Re- mington's Pharmaceutical Sciences 16a. edição, Osol, A. Ed. (1980). Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis são geralmente não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações emprega- das e incluem, porém, não estão limitados a: tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascór- bico e metionina; conservantes (como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos como metil ou propil parabeno; catecol; ressorcinol; ciclo-hexanol; 3- pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tal como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, inclu- indo glicose, manose ou dextrinas; agentes de quelação tal como
EDTA; açúcares tal como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; con- traíons formadores de sal, como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de proteína de Zn); e/ou tensoativos não iônicos, como polietilenoglicol (PEG).
[00371] Agentes de tamponamento em alguns aspectos estão inclu- ídos nas composições. Os agentes de tamponamento adequados in- cluem, por exemplo, ácido cítrico, citrato de sódio, ácido fosfórico, fos- fato de potássio e vários outros ácidos e sais. Em alguns aspectos, uma mistura de dois ou mais agentes de tamponamento é usada. O agente de tamponamento ou suas misturas estão tipicamente presen- tes em uma quantidade de cerca de 0,001 % a cerca de 4 % em peso da composição total. Métodos para preparar composições farmacêuti- cas administráveis são conhecidos. Métodos exemplares são descritos em mais detalhes, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21ª. ed. (1 de maio de 2005).
[00372] As formulações podem incluir soluções aquosas. A formu- lação ou composição também pode conter mais de um ingrediente ati- vo útil para a indicação, doença ou condição particular sendo tratada com as células, preferencialmente aquelas com atividades comple- mentares às células, onde as atividades respectivas não afetam ad- versamente uma à outra. Tais ingredientes ativos estão adequada- mente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para a finalidade pretendida. Assim, em algumas modalidades, a com- posição farmacêutica inclui ainda outros agentes ou fármacos farma- ceuticamente ativos, como agentes quimioterápicos, por exemplo, as- paraginase, bussulfano, carboplatina, cisplatina, daunorrubicina, do- xorrubicina, fluorouracila, gencitabina, hidroxiureia, metotrexato, pacli- taxel, rituximabe, vinitubebe e/ou vincristina.
[00373] As composições em algumas modalidades são fornecidas como preparações líquidas estéreis, por exemplo, soluções aquosas isotônicas, suspensões, emulsões, dispersões ou composições visco- sas, que podem em alguns aspectos ser tamponadas para um pH se- lecionado. As composições líquidas podem compreender veículos, que podem ser um solvente ou meio dispersante contendo, por exemplo, água, solução salina, solução salina tamponada por fosfato, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido) e suas mis- turas adequadas. Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando-se as células em um solvente, como em mistura com um transportador, diluente ou excipiente adequado, como água estéril, so- lução salina fisiológica, glicose, dextrose ou similares. As composições podem conter substâncias auxiliares, como agentes umectantes, dis- persantes ou emulsificantes (por exemplo, metilcelulose), agentes de tamponamento de pH, gelificação ou aditivos de realce de viscosidade, conservantes, agentes aromatizantes e/ou cores dependendo da rotina de administração e da preparação desejada. Os textos padrão podem em alguns aspectos ser consultados para preparar os preparativos adequados.
[00374] Vários aditivos que realçam a estabilidade e esterilidade das composições, incluindo conservantes antimicrobianos, antioxidan- tes, agentes quelantes e tampões, podem ser adicionados. A preven- ção da ação de micro-organismos pode ser assegurada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clo- robutanol, fenol e ácido sórbico. A absorção prolongada da forma far- macêutica injetável pode ser provocada pelo uso de agentes que re- tardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelati- na.
[00375] Em algumas modalidades, o tampão de formulação contém um criopreservativo. Em algumas modalidades, a célula é formulada com uma solução criopreservativa que contém 1,0 % a 30 % de solu-
ção de DMSO, como uma solução de 5 % a 20 % de DMSO ou uma solução de 5 % a 10 % de DMSO. Em algumas modalidades, a solu- ção de criopreservação é ou contém, por exemplo, PBS contendo 20 % de DMSO e 8 % de albumina sérica humana (HSA) ou outro meio de congelamento celular adequado. Em algumas modalidades, a solu- ção criopreservativa é ou contém, por exemplo, pelo menos ou cerca de 7,5 % de DMSO. Em algumas modalidades, as etapas de proces- samento podem envolver a lavagem das células transduzidas e/ou ex- pandidas para substituir as células em uma solução criopreservativa. Em algumas modalidades, as células são congeladas, por exemplo, criocongeladas ou criopreservadas, em meio e/ou solução com uma concentração final de ou de cerca de 12,5 %, 12,0 %, 11,5 %, 11,0 %, 10,5 %, 10,0 %, 9,5 %, 9. 0 %, 8,5 %, 8,0 %, 7,5 %, 7,0 %, 6,5 %, 6,0 %, 5,5 % ou 5,0 % de DMSO ou entre 1 % e 15 %, entre 6 % e 12 %, entre 5 % e 10 % ou entre 6 % e 8 % de DMSO. Em modalidades par- ticulares, as células são congeladas, por exemplo, criocongeladas ou criopreservadas, em meio e/ou solução com uma concentração final de cerca de 5,0 %, 4,5 %, 4,0 %, 3,5 %, 3,0 %, 2,5 %, 2,0 %, 1,5 %, 1,25 %, 1,0 %, 0,75 %, 0,5 % ou 0,25 % de HSA, ou entre 0,1 % e -5 %, entre 0,25 % e 4 %, entre 0,5 % e 2 %, ou entre 1 % e 2 % de HSA.
[00376] Em modalidades particulares, a composição de células T enriquecidas, por exemplo, células T que foram estimuladas, modifica- das e/ou cultivadas, são formuladas, criocongeladas e depois armaze- nadas por um período de tempo. Em certas modalidades, as células criocongeladas, formuladas são armazenadas até que as células se- jam liberadas para infusão. Em modalidades particulares, as células criocongeladas, formuladas são armazenadas entre 1 dia e 6 meses, entre 1 mês e 3 meses, entre 1 dia e 14 dias, entre 1 dia e 7 dias, en- tre 3 dias e 6 dias, entre 6 meses e 12 meses ou mais de 12 meses. Em algumas modalidades, as células são criocongeladas e armazena-
das por, por cerca de, ou menos de 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias ou 7 dias. Em certas modalidades, as células são descongela- das e administradas a um indivíduo após o armazenamento. Em certas modalidades, as células são armazenadas por ou por cerca de 5 dias.
[00377] Em algumas modalidades, a formulação é realizada usando uma ou mais etapas de processamento, incluindo lavagem, diluição ou concentração das células, como as células cultivadas ou expandidas. Em algumas modalidades, o processamento pode incluir diluição ou concentração das células até uma concentração ou número desejado, como composições de forma de dose unitária incluindo o número de células para administração em uma dada dose ou fração da mesma. Em algumas modalidades, as etapas de processamento podem incluir uma redução de volume para, assim, aumentar a concentração de cé- lulas, conforme desejado. Em algumas modalidades, as etapas de processamento podem incluir uma adição de volume para, assim, di- minuir a concentração de células, conforme desejado. Em algumas modalidades, o processamento inclui adicionar um volume de um tam- pão de formulação a células transduzidas e/ou expandidas. Em algu- mas modalidades, o volume do tampão de formulação é de 10 mL a 1000 mL ou de cerca de 10 mL a cerca de 1000 mL, como pelo menos ou cerca de pelo menos ou cerca de 50 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL , 500 mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL ou 1000 mL.
[00378] Em algumas modalidades, estas etapas de processamento para formular uma composição celular são realizadas em um sistema fechado. Exemplos de tais etapas de processamento podem ser reali- zados usando uma câmara centrífuga em conjunto com um ou mais sistemas ou kits associados a um sistema de processamento celular, como uma câmara centrífuga produzida e vendida por Biosafe SA, in- cluindo aquelas para uso com os sistemas de processamento de célu- las Sepax® ou Sepax 2®. Um sistema e processo exemplares são descrito no Número da Publicação Internacional WO2016/073602. Em algumas modalidades, o método inclui realizar a expressão da cavida- de interna da câmara centrífuga de uma composição formulada, que é a composição resultante de células formuladas em um tampão de for- mulação, tal como um tampão farmaceuticamente aceitável, em qual- quer uma das modalidades acima, conforme descrito. Em algumas modalidades, a expressão da composição formulada é para um recipi- ente, como os frasconetes dos vasos de material biomédico aqui des- critos, que está operacionalmente ligado como parte de um sistema fechado com a câmara centrífuga. Em algumas modalidades, os vasos de material biomédico são configurados para integração e/ou conexão operacional e/ou são integrados ou conectados operacionalmente, a um sistema ou dispositivo fechado que executa uma ou mais etapas de processamento. Em algumas modalidades, o recipiente de material biomédico é conectado a um sistema em uma linha de saída ou posi- ção de saída. Em alguns casos, o sistema fechado é conectado ao frasconete do vaso de material biomédico no tubo de entrada. Siste- mas de fechamento exemplares para uso com os vasos de material biomédico aqui descritos incluem o sistema Sepax® e Sepax® 2.
[00379] Em algumas modalidades, o sistema fechado, como asso- ciado a uma câmara centrífuga ou sistema de processamento de célu- las, inclui um kit de saída de várias portas contendo um coletor de tu- bos de várias vias associado em cada extremidade de uma linha de tubulação com uma porta na qual um ou uma pluralidade de recipien- tes pode ser conectado para expressão da composição formulada. Em alguns aspectos, um número ou pluralidade de frasconetes desejado pode ser conectado de maneira estéril a um ou mais, geralmente dois ou mais, como pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais das portas da saída de múltiplas portas. Por exemplo, em algumas modalidades, um ou mais recipientes, por exemplo, vasos de material biomédico, podem ser conectados às portas, ou a menos do que todas as portas. Assim, em algumas modalidades, o sistema pode realizar a expressão da composição de saída várias frasconetes dos vasos de material biomé- dico.
[00380] Em alguns aspectos, as células podem ser expressas as referidas uma ou mais dentre a pluralidade de recipientes de saída, por exemplo, frasconetes dos vasos de material biomédico, em uma quantidade para administração de dosagem, como para uma única administração de dosagem unitária ou administração de múltiplas do- sagens. Por exemplo, em algumas modalidades, os frasconetes dos vasos de material biomédico, podem conter cada qual o número de células para administração em uma dada dose ou fração da mesma. Assim, cada frasconete, em alguns aspectos, pode conter uma única dose unitária para administração ou pode conter uma fração de uma dose desejada, de modo que mais de um dentre a pluralidade de fras- conetes, como dois dos frasconetes, ou 3 dos frasconetes, juntos constituam uma dose para administração.
[00381] Assim, os frasconetes descritos aqui, geralmente contêm as células a serem administradas, por exemplo, uma ou mais doses unitá- rias das mesmas. A dose unitária pode ser uma quantidade ou número de células a serem administradas ao indivíduo ou duas vezes o núme- ro (ou mais) de células a serem administradas. Pode ser a dose mais baixa ou a menor dose possível das células que seriam administradas ao indivíduo.
[00382] Em algumas modalidades, cada um dos recipientes, por exemplo, sacos de frasconetes para injetáveis, compreende individu- almente uma dose unitária das células. Assim, em algumas modalida- des, cada um dos recipientes compreende o mesmo ou cerca de ou substancialmente o mesmo número de células. Em algumas modali- dades, cada dose unitária contém pelo menos ou cerca de 1 x 106, 2 x
106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107 ou 1 x 108 células modificadas, células totais, células T ou PBMCs. Em algumas modalidades, o volume da composição celular formulada em cada recipiente, por exemplo, saco ou frasconete, é de 10 mL a 100 mL, como pelo menos ou cerca de pelo menos 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 80 mL, 90 mL ou 100 mL. Em algumas modalidades, as células no recipi- ente, por exemplo, saco ou frasconetes para injetáveis, pode ser crio- preservado. Em algumas modalidades, o recipiente, por exemplo, fras- conetes, podem ser armazenados em nitrogênio líquido até serem uti- lizados novamente.
[00383] Em algumas modalidades, essas células produzidas pelo método, ou uma composição compreendendo essas células, são ad- ministradas a um indivíduo para o tratamento de uma doença ou con- dição. F. Características Exemplares do Processo e/ou Composição de Saída
[00384] Em modalidades particulares, os métodos fornecidos são utilizados em conexão com um processo que produz uma ou mais composições de saída de células T enriquecidas a partir de uma ou mais composições de entrada e/ou de uma única amostra biológica. Em certas modalidades, as referidas uma ou mais composições de saída contêm células que expressam um receptor recombinante, por exemplo, um TCR ou um CAR. Em modalidades particulares, as célu- las das composições de saída são adequadas para administração a um indivíduo como uma terapia, por exemplo, uma terapia celular au- tóloga. Em algumas modalidades, as referidas uma ou mais composi- ção de saída é uma composição de células T CD4+ e CD8+ enriqueci- das. Em certas modalidades, as referidas uma ou mais composições de saída incluem uma composição de células T CD4+ enriquecidas. Em modalidades particulares, as referidas uma ou mais composições de saída incluem uma composição de células T CD8+ enriquecidas. Em algumas modalidades, as referidas uma ou mais composições de saída incluem uma composição de saída de células T CD4+ enriqueci- das e uma composição de saída de células T CD8+ enriquecidas.
[00385] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos são usa- dos em conexão com um processo inteiro para gêneros para geração e/ou produção de células de saída e/ou composições de saída de célu- las T enriquecidas, como um processo que inclui algumas ou todas as etapas de: coletar ou obter uma amostra biológica; isolar, selecionar ou enriquecer células de entrada da amostra biológica; congelar e ar- mazenar as células de entrada; descongelar e/ou incubar as células de entrada sob condições estimulantes; projetar as células estimuladas para expressar ou conter um polinucleotídeo recombinante, por exem- plo, um polinucleotídeo que codifica um receptor recombinante, como um CAR; cultivar as células modificadas até uma quantidade, densida- de ou expansão limiar; formular as células cultivadas em uma compo- sição de saída; e/ou criocongelar e armazenar as células de saída formuladas até que as células sejam liberadas para infusão e/ou admi- nistração a um indivíduo. Em algumas modalidades, todo o processo é realizado com uma única composição de células T enriquecidas, por exemplo, células T CD4+ ou células T CD4+ e CD8+. Em modalidades particulares, todo o processo é realizado com duas ou mais composi- ções de células T enriquecidas, por exemplo, uma composição de cé- lulas T CD4+ enriquecidas e uma composição de células T CD8+ enri- quecidas. Em certas modalidades, o processo é realizado com duas ou mais composições de entrada de células T enriquecidas que são combinadas antes e/ou durante o processo para gerar ou produzir uma única composição de saída de células T enriquecidas.
[00386] Em algumas modalidades, pelo menos uma composição separada de células T CD4+ enriquecidas e pelo menos uma compo-
sição separada de células T CD8+ enriquecidas são isoladas, selecio- nadas e/ou enriquecidas a partir da mesma amostra biológica (por exemplo, o mesmo produto de aférese ou leucaferese contendo PBMCs autólogas) que são obtidas, coletadas e/ou retiradas do mes- mo indivíduo, como um paciente ou doador saudável.
Em um aspecto, a mesma amostra biológica é primeiro submetida à seleção positiva de células T CD4+, onde as frações positiva e negativa são retidas e a fração negativa é ainda submetida à seleção positiva de células T CD8+. Em outro aspecto, a mesma amostra biológica é primeiro sub- metida à seleção positiva de células T CD8+, onde são mantidas as frações positiva e negativa, e a fração negativa é ainda submetida à seleção positiva de células T CD4+. Em alguns aspectos, uma compo- sição separada de células T CD4+ enriquecidas e uma composição separada de células T CD8+ enriquecidas do mesmo doador são con- geladas separadamente, por exemplo, criocongeladas ou criopreser- vadas em um meio de criopreservação.
Em alguns aspectos, as com- posições de células criopreservadas separadamente são armazenadas e/ou enviadas em recipientes separados.
Em outros aspectos, as composições celulares criopreservadas são descongeladas e opcio- nalmente lavadas.
Em alguns aspectos, duas ou mais composições separadas de células T enriquecidas, pelo menos uma sendo uma composição de células T CD4+ enriquecidas e pelo menos uma sendo uma composição separada de células T CD8+ enriquecidas do mesmo doador, são ativadas e/ou estimuladas separadamente entrando em contato com um reagente estimulante (por exemplo, por incubação com contas magnéticas conjugadas CD3/CD28 para ativação das cé- lulas T), e os volumes das composições de células enriquecidas sepa- radas após a ativação/estimulação são opcionalmente ajustados, por exemplo, reduzidos, a fim de obter um volume alvo.
Em alguns aspec- tos, as composições de células enriquecidas ativadas/estimuladas são modificadas, transduzidas e/ou transfectadas separadamente, por exemplo, usando o mesmo vetor retroviral que codifica uma proteína recombinante (por exemplo, CAR), para expressar a mesma proteína recombinante na célula T CD4+ separada e composições de células T CD8+. Em alguns aspectos, os volumes das composições de células enriquecidas separadas após a modificação são opcionalmente ajus- tados, por exemplo, reduzidos, a fim de atingir um volume alvo.
Em alguns aspectos, o método pode compreender a remoção do reagente estimulante, por exemplo, contas magnéticas, das composições sepa- radas.
Em alguns aspectos, a composição que contém as células T CD4+ modificadas separadamente e a composição que contém as cé- lulas T CD8+ modificadas separadamente são cultivadas separada- mente, por exemplo, para expansão da população de células T CD4+ ou CD8+ nas mesmas.
Em certas modalidades, as composições celu- lares separadas após o cultivo são colhidas e/ou coletadas separada- mente e/ou formuladas separadamente, por exemplo, lavando as composições celulares em um tampão de formulação.
Em certas mo- dalidades, pelo menos uma composição de células T CD4+ enriqueci- da formulada separadamente e pelo menos uma composição de célu- las T CD8+ enriquecida formulada separadamente são congeladas, por exemplo, criocongeladas ou criopreservadas em um meio de crio- preservação.
Em alguns aspectos, as formulações criopreservadas separadamente podem ser armazenadas e/ou enviadas em recipientes separados.
Em alguns aspectos, pelo menos uma formulação de célu- las T CD4+ e pelo menos uma formulação de células T CD8+ se origi- naram do mesmo doador e expressam a mesma proteína de recombi- nação (por exemplo, CAR) são administradas separadamente a um indivíduo em necessidade.
Em alguns aspectos, as administrações separadas são realizadas simultaneamente equivalentemente, em qualquer ordem.
[00387] Em algumas modalidades, uma composição de saída de células T CD4+ enriquecidas inclui pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,9 % ou em ou em cerca de 100 % de células T CD4+. Em certas modalidades, a compo- sição de saída inclui pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,9 %, ou a cerca de 100 % de célu- las T CD4+ que expressam o receptor recombinante e/ou foram trans- duzidos ou transfectados com o polinucleotídeo recombinante. Em cer- tas modalidades, a composição de saída de células T CD4+ enriqueci- das inclui menos de 40 %, menos que 35 %, menos que 30 %, menos que 25 %, menos que 20 %, menos que 15 %, menos que 10 %, me- nos que 5 %, menos de 1 %, menos de 0,1 % ou menos de 0,01 % de células T CD8+ e/ou não contêm células T CD8+ e/ou estão livres ou substancialmente livres de células T CD8+.
[00388] Em algumas modalidades, uma composição de saída de células T CD8+ enriquecidas inclui pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,9 % ou em ou em cerca de 100 % de células T CD8+. Em modalidades particulares, a composição inclui pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,9 % ou a ou a cerca de 100 % de célu- las T CD8+ que expressam o receptor recombinante e/ou foram trans- duzidas ou transfectadas com o polinucleotídeo recombinante. Em cer-
tas modalidades, a composição de saída de células T CD8+ enriqueci- das inclui menos de 40 %, menos que 35 %, menos que 30 %, menos que 25 %, menos que 20 %, menos que 15 %, menos que 10 %, me- nos que 5 %, menos de 1 %, menos de 0,1 % ou menos de 0,01 % de células T CD4+ e/ou não contêm células T CD4+ e/ou estão livres ou substancialmente livres de células T CD4+.
[00389] Em algumas modalidades, o processo associado aos méto- dos fornecidos é comparado a um processo exemplar e/ou alternativo. Em modalidades particulares, o processo alternativo e/ou exemplar pode diferir em um ou mais aspectos específicos, mas de outra forma contém características, aspectos, etapas, estágios, reagentes e/ou condições semelhantes ou iguais, do processo associado aos métodos fornecidos. Em algumas modalidades, o processo alternativo e/ou exemplar é semelhante ou igual ao processo associado aos métodos fornecidos, com a exceção de que: as composições de células T CD4+ enriquecidas não são incubadas e/ou cultivadas com IL-2 recombinan- te; as células são incubadas com um reagente estimulante a uma rela- ção superior a 3 (ou 3:1) reagentes estimulantes para as células; o re- agente estimulante não é removido ou separado das células antes do cultivo e/ou dentro de 6, 5 ou 4 dias após o início da incubação sob condições estimulantes; as células não são incubadas na presença de um antioxidante; as células não são modificadas com uma quantidade ou concentração baixa, por exemplo, entre 1 µg/ml e 50 µg/ml, de um policátion; as células não são cultivadas com tensoativo; e/ou células não são cultivadas sob condições com perfusão e/ou mistura consis- tentes.
[00390] Em certas modalidades, o processo é concluído dentro de uma duração e/ou quantidade de tempo de cerca de 35 dias, 34 dias, 33 dias, 32 dias, 31 dias, 30 dias, 29 dias, 28 dias, 27 dias , 26 dias, 25 dias, 24 dias, 23 dias, 22 dias, 21 dias, 20 dias, 19 dias, 18 dias, 17 dias, 16 dias, 15 dias, 14 dias, 13 dias, 12 dias, 11 dias, 10 dias, 9 dias ou menos de 9 dias. Em certas modalidades, o processo é concluído dentro de 21 dias. Em algumas modalidades, o processo é considera- do concluído quando a composição é colhida e/ou formulada; a com- posição está pronta para ser colhida e/ou formulada; a composição atingiu um valor limiar alvo para a colheita; e/ou a composição é libe- rada e/ou pronta para teste pós-formulação.
[00391] Em algumas modalidades, o processo é concluído dentro de uma duração e/ou quantidade de tempo de cerca de 35 dias, 34 dias, 33 dias, 32 dias, 31 dias, 30 dias, 29 dias, 28 dias, 27 dias, 26 dias, 25 dias, 24 dias, 23 dias, 22 dias, 21 dias, 20 dias, 19 dias, 18 dias, 17 dias, 16 dias, 15 dias, 14 dias, 13 dias, 13 dias, 12 dias, 11 dias, 10 dias , 9 dias ou menos de 9 dias, medidos desde o início ou a coleta da amostra biológica e/ou o isolamento, seleção, estimulação e/ou enriquecimento das células de entrada da amostra biológica até o momento em que as células de saída são liberadas para infusão; as células de saída são colhidas e/ou formuladas; as células de saída es- tão prontas para serem colhidas e/ou formuladas; as células de saída atingiram um valor limite de destino para a colheita; e/ou as células de saída são liberadas e/ou prontas para os testes pós-formulação, inclu- indo os tempos de armazenamento dos composições congeladas. Em modalidades particulares, quando o processo é realizado em mais de uma composição de células T enriquecidas obtidas da mesma amostra biológica, o processo é concluído quando pelo menos uma amostra representativa de cada composição da mesma amostra biológica con- cluiu o processo. Em algumas modalidades, o processo é concluído dentro de 21 dias, medido desde o início ou a coleta da amostra bioló- gica e/ou o isolamento, seleção, estimulação e/ou enriquecimento das células de entrada da amostra biológica até o momento em que as cé- lulas de saída são liberadas para infusão.
[00392] Em algumas modalidades, o processo é concluído dentro de uma duração e/ou quantidade de tempo de cerca de 35 dias, 34 dias, 33 dias, 32 dias, 31 dias, 30 dias, 29 dias, 28 dias, 27 dias , 26 dias, 25 dias, 24 dias, 23 dias, 22 dias, 21 dias, 20 dias, 19 dias, 18 dias, 17 dias, 16 dias, 15 dias, 14 dias, 13 dias, 12 dias, 11 dias, 10 dias, 9 dias ou menos de 9 dias, medidos desde o início ou a coleta da amostra biológica, por exemplo, uma amostra de aferese ou leucafere- se, até quando a composição de saída for administrada ou pronta para ser administrada ao indivíduo, as células de saída são colhidos e/ou formulados; as células de saída estão prontas para serem colhidas e/ou formuladas; as células de saída atingiram um valor limite de des- tino para a colheita; e/ou a composição de saída é liberada para teste, incluindo os tempos de armazenamento para composições de criocon- gelamento. Em algumas modalidades, o processo é concluído dentro de 21 dias, conforme medido desde o início ou a coleta da amostra biológica até quando as células de saída estão prontas para serem e/ou são liberadas para infusão em um indivíduo.
[00393] Em certas modalidades, a duração e/ou quantidade de tempo para concluir o processo é entre 10 dias e 35 dias, entre 12 dias e 33 dias, entre 17 dias e 25 dias, entre ou entre 19 dias e 23 dias, por exemplo, quando o tempo de armazenamento é incluído, para amos- tras obtidas de um indivíduo, para amostras de vários indivíduos e/ou para pelo menos certa percentagem de indivíduos, como aqueles com uma indicação ou doença específica, como pelo menos 90, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % ou mais desses indivíduos. Em certas modalida- des, a quantidade mediana de tempo e/ou duração para concluir o processo (como medido desde a retirada da amostra do indivíduo até quando o produto está pronto ou liberado para infusão no indivíduo) em várias composições iniciais de diferentes amostras biológicas é entre 15 dias e 27 dias, entre 17 dias e 25 dias, ou entre 19 dias e 23 dias ou é ou é de cerca de 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias ou 23 di- as, por exemplo, quando tempo de armazenamento está incluído. Em modalidades particulares, a quantidade média de tempo e/ou duração para concluir o processo em várias composições de diferentes amos- tras biológicas é entre 15 dias e 27 dias, entre 17 dias e 25 dias ou en- tre 19 dias e 23 dias ou é ou é de cerca de 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias ou 23 dias, por exemplo, quando o tempo de transporte e/ou armazenamento está incluído. Em modalidades particulares, a duração para concluir o processo em várias composições de diferentes amos- tras biológicas é entre 15 dias e 27 dias, entre 17 dias e 25 dias, ou entre 19 dias e 23 dias ou é ou é cerca de 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias ou 23 dias, por exemplo, quando o tempo de armazenamento es- tá incluído. Em certas modalidades, a duração do processo, como em várias composições iniciais, como de diferentes amostras biológicas e/ou indivíduos com diferentes doenças, é menor ou não maior que 21 dias; em alguns aspectos, esse resultado é alcançado com uma taxa de sucesso superior a 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % ou 95 % de sucesso na fabricação de produtos nessas amostras ou pacientes.
[00394] Em algumas modalidades, a duração e/ou quantidade de tempo para concluir o processo é entre 7 dias e 27 dias, entre 9 dias e 25 dias, entre 11 dias e 18 dias, entre ou entre 11 dias e 15 dias quan- do o tempo de armazenamento de células criocongeladas não é inclu- ído ou leva em consideração. Em certas modalidades, a quantidade mediana de tempo e/ou duração necessária para concluir o processo em várias composições de diferentes amostras biológicas é entre 7 dias e 27 dias, entre 9 dias e 25 dias, entre 11 dias e 18 dias, entre 11 dias e 15 dias, ou é cerca de 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias ou 15 dias quando o tempo de armazenamento das células congeladas não está incluído ou leva em consideração. Em modalidades particulares, a quantidade média de tempo e/ou duração necessária para concluir o processo em várias composições de diferentes amostras biológicas é entre 7 dias e 27 dias, entre 9 dias e 25 dias, entre 11 dias e 18 dias, entre ou entre 11 dias a 15 dias ou é ou é cerca de 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias ou 15 dias quando o tempo de armazenamento de célu- las criocongeladas não é incluído ou é fator. Em algumas modalida- des, a quantidade média de tempo e/ou duração necessária para con- cluir o processo em várias composições de diferentes amostras bioló- gicas é inferior a 21 dias quando o tempo de armazenamento das célu- las criocongeladas não é incluído.
[00395] Em modalidades particulares, a quantidade de tempo para concluir o processo em pelo menos 10 % de várias composições obti- das de diferentes fontes, por exemplo, diferentes amostras biológicas e/ou diferentes composições de entrada de células T enriquecidas iso- ladas, enriquecidas e/ou selecionado a partir de diferentes amostras biológicas, é entre 7 dias e 18 dias, entre 10 dias e 17 dias, ou entre 11 dias e 15 dias ou é ou é cerca de 11 dias, 12 dias ou 13 dias quan- do o tempo de armazenamento de células criocongeladas não está incluídas ou é fatorado. Em modalidades particulares, a quantidade de tempo necessária para concluir o processo em pelo menos 50 % de várias composições de diferentes fontes biológicas é entre 7 dias e 27 dias, entre 9 dias e 25 dias, entre 11 dias e 18 dias, entre, ou entre 11 dias e 15 dias, ou é ou é cerca de 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias ou 15 dias quando o tempo de armazenamento de células criocongeladas não está incluído ou fatorado. Em certas modalidades, a quantidade de tempo requerido para concluir o processo em pelo menos 90 % de várias composições de diferentes fontes, é entre 7 dias e 27 dias, en- tre 9 dias e 25 dias, entre 11 dias e 18 dias, entre ou entre 11 dias e 15 dias, ou é ou é cerca de 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias ou 15 di- as quando o tempo de armazenamento de células criocongeladas não é incluído ou leva em consideração. Em certas modalidades, a quanti-
dade de tempo necessária para concluir o processo em pelo menos 90 % de várias composições de diferentes fontes é inferior a 21 dias quando o tempo de armazenamento de células criocongeladas não é incluído.
[00396] Em algumas modalidades, a duração e/ou quantidade de tempo durante o processo que ocorre desde o começo ou início da in- cubação sob condições estimulantes até o momento em que uma quantidade limite, densidade e/ou grau de expansão (como uma ex- pansão de vezes específica, como quatro vezes ou uma dose especí- fica), é alcançada durante o cultivo entre 5 dias e 25 dias, entre 7 dias e 18 dias, entre 8 e 15 dias, entre 8 e 14 dias ou entre 8 e 15 dias, como entre 8 e 13 dias ou entre 9 e 13 dias. Em certas modalidades, a quantidade mediana de tempo e/ou duração do processo que ocorre desde o começo ou início da incubação até o momento em que o limite é alcançado é entre 5 dias e 25 dias, entre 7 dias e 18 dias, ou entre 9 dias e 13 dias, ou é ou é cerca de 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias ou 13 dias. Em modalidades particulares, a quantidade média de tempo e/ou duração do processo que ocorre desde o começo ou início da incubação até o momento em que o limite é alcançado é entre 5 dias e 25 dias, entre 7 dias e 18 dias, entre 8 dias e 13 dias ou entre 9 dias e 13 dias, ou é ou é cerca de 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias ou 13 dias.
[00397] Em certas modalidades, a duração e/ou quantidade de tempo durante o processo que ocorre desde o começo ou início da in- cubação sob condições estimulantes até o momento em que as célu- las de saída são coletadas, formuladas e/ou criodongeladas é entre 5 dias e 25 dias, entre 7 dias e 18 dias entre 8 e 15 dias, entre 8 e 14 dias ou entre 8 e 15 dias, como entre 8 e 13 dias ou entre 9 dias e 13 dias. Em certas modalidades, a quantidade mediana de tempo e/ou duração do processo que ocorre desde o começo ou início da incuba-
ção até o momento em que o limite é alcançado é entre 5 dias e 25 dias, entre 7 dias e 18 dias, ou entre 9 dias e 13 dias, ou é ou é cerca de 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias ou 13 dias. Em modalidades particulares, a quantidade média de tempo e/ou duração do processo que ocorre desde o começo ou início da incubação até o momento em que o limite é atingido é entre 5 dias e 25 dias, entre 7 dias e 18 dias, entre 8 dias e 13 dias ou entre 9 dias e 13 dias, ou é ou é cerca de 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias ou 13 dias. Em algumas modali- dades, a duração e/ou quantidade de tempo durante o processo que ocorre desde o começo ou início da incubação sob condições estimu- lantes até o momento em que as células de saída são coletadas, for- muladas e/ou criodongeladas é entre 9 dias e 15 dias para, por cerca de ou pelo menos 85 %, 90 %, 95 % dos indivíduos.
[00398] Em algumas modalidades, a duração e/ou quantidade de tempo durante o processo que ocorre a partir do isolamento, enrique- cimento e/ou seleção das composições de células CD4+ e CD8+ enri- quecidas de uma amostra biológica, por exemplo, aférese e/ou leuca- ferese, no momento em que as células de saída são coletadas, formu- ladas e/ou congeladas, entre 5 dias e 25 dias, entre 7 dias e 18 dias, entre 8 e 19 dias. Entre 8 e 14 dias, ou entre 10 e 16 dias. Em certas modalidades, as células de saída são coletadas, formuladas e colhidas entre 10 e 16 dias após o isolamento, enriquecimento e/ou seleção para pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % dos indi- víduos.
[00399] Em algumas modalidades, a duração e/ou quantidade de tempo do processo desde o começo ou início da incubação sob condi- ções estimulantes até o momento em que a quantidade limite, a densi- dade e/ou a expansão são alcançadas durante o cultivo é pelo menos 5 %, pelo menos 10 %, pelo menos 15 %, pelo menos 20 %, pelo me- nos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, em pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 % ou pelo menos 90 % menos tempo que o de um processo exemplar e/ou alternativo. Em modalidades particulares, a duração e/ou quantidade de tempo durante o processo, desde o co- meço ou início da incubação sob condições estimulantes até o mo- mento em que a quantidade limite, a densidade e/ou a expansão são alcançadas durante o cultivo é menor que a duração e/ou quantidade de tempo de um processo exemplar e/ou alternativo por, cerca de, ou pelo menos 0,5 dias, 1 dia, 1,5 dias, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias ou mais de 14 dias.
[00400] Em certas modalidades, a quantidade de tempo necessária para pelo menos 10 % de várias composições de diferentes amostras biológicas para atingir a quantidade limite, densidade e/ou expansão desde o começo ou início da incubação sob condições estimulantes para o tempo em que a quantidade limite, densidade e/ou expansão é atingida durante o cultivo é entre 5 dias e 20 dias, entre 7 dias e 15 dias, ou entre 9 dias e 11 dias, ou é ou é cerca de 7 dias, 8 dias, 9 dias ou 10 dias. Em modalidades particulares, a quantidade de tempo ne- cessária para pelo menos 50 % de várias composições de diferentes amostras biológicas para atingir a quantidade limite, densidade e/ou expansão desde o começo ou início da incubação sob condições esti- mulantes é de 5 a 5 dias e 25 dias, entre 7 dias e 18 dias, ou entre 9 dias e 13 dias, ou é ou é cerca de 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, de 13 dias. Em algumas modalidades, a quantidade de tempo necessária para pelo menos 90 % de várias composições de diferentes amostras biológicas para atingir a quantidade limite, densi- dade e/ou expansão desde o começo ou início da incubação sob con- dições estimulantes é de 5 a 5 dias e 25 dias, entre 7 dias e 18 dias,
ou entre 9 dias e 13 dias, ou é ou é cerca de 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, de 13 dias.
[00401] Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos são usados em conexão com um processo que gera células T modificadas por engenharia genética por um período de tempo inferior a um pro- cesso alternativo exemplar. Em algumas modalidades, a curta duração do processo pode aumentar a taxa, instâncias e/ou probabilidade de gerar uma composição de células T modificadas que podem ser admi- nistradas a um indivíduo para terapia celular. Em certas modalidades, protocolos de fabricação para composições celulares terapêuticas po- dem exigir que as composições celulares sejam produzidas e liberadas para infusão dentro de um certo período de tempo. Assim, em algumas modalidades, pode esperar-se que a menor duração do processo re- duza ou elimine falhas do processo que ocorreriam a partir de compo- sições de células que não conseguem se expandir dentro da quantida- de de tempo necessária.
[00402] Em algumas modalidades do processo aqui fornecido, a quantidade de tempo necessária para uma composição celular atingir uma quantidade limiar, densidade e/ou expansão desde o começo ou início da incubação sob condições estimulantes até o momento em que o limiar quantidade, densidade e/ou expansão é alcançada duran- te o cultivo é entre cerca de 9 dias e cerca de 13 dias, ou entre 9 dias e 13 dias ou 9 dias, enquanto no processo alternativo, a quantidade correspondente de tempo é entre cerca de 12 dias e cerca de 23 dias, ou entre 12 dias e 23 dias, ou cerca de 15 dias ou 15 dias. Em algu- mas modalidades, a quantidade de tempo necessária para a coleta de amostras, o isolamento das composições celulares e o criocongela- mento no processo fornecido e no processo alternativo é entre cerca de 1 dia e cerca de 2 dias ou entre 1 dia e 2 dias. Em algumas modali- dades, as composições de células criocongeladas no processo forne-
cido e no processo alternativo são armazenadas por cerca de 3 dias ou por 3 dias. Em algumas modalidades, a quantidade de tempo ne- cessária a partir do momento em que a quantidade limite, a densidade e/ou a expansão são alcançadas ou a partir do momento em que as composições de células são colhidas até quando a composição de sa- ída é administrada ou pronta para ser administrada ao indivíduo em ambos os fornecidos processo eo processo alternativo é de cerca de 5 dias. Em algumas modalidades, a quantidade total de tempo equivale da coleta de amostras ao momento em que a composição de saída é administrada ou está pronta para ser administrada ao indivíduo no processo fornecido é de cerca de 19 dias, enquanto no processo alter- nativo, a quantidade total correspondente de tempo é de cerca de 25 dias.
[00403] Em certas modalidades, a quantidade total de tempo ne- cessária para 50 % ou cerca de 50 % de várias composições de célu- las, desde a coleta de amostras até quando as composições de saída são administradas ou prontas para serem administradas ao indivíduo (o que exigiria a célula composições para atingir a quantidade limite, densidade e/ou expansão) no processo fornecido é de cerca de 19 di- as, enquanto no processo alternativo, a quantidade total de tempo cor- respondente é de cerca de 25 dias. Em certas modalidades, a quanti- dade total de tempo necessária para 80 % ou cerca de 80 % de várias composições celulares desde a coleta de amostras até quando as composições de saída são administradas ou prontas para serem ad- ministradas ao indivíduo (o que exigiria que as composições celulares atingissem a quantidade limite, densidade e/ou expansão) no processo fornecido é de cerca de 21 dias, enquanto no processo alternativo, a quantidade total de tempo correspondente é de cerca de 27 dias. Em certas modalidades, a quantidade total de tempo necessária para 90 % ou cerca de 90 % de várias composições celulares desde a coleta de amostras até quando as composições de saída são administradas ou prontas para serem administradas ao indivíduo (o que exigiria que as composições celulares atingissem a quantidade limite, densidade e/ou expansão) no processo fornecido é de cerca de 21 dias, enquanto no processo alternativo, a quantidade total de tempo correspondente é de cerca de 33 dias.
[00404] Desde o começo ou início da incubação sob condições es- timulantes até o momento em que a quantidade limite, a densidade e/ou a expansão são alcançadas durante o cultivo.
[00405] Em certas modalidades, os métodos fornecidos são usados em conexão com a geração ou produção com sucesso de composi- ções de saída de células T modificadas que são adequadas para uso em terapia celular. Em algumas modalidades, uma composição de sa- ída é gerada com sucesso se as células da composição atingirem a contagem, densidade e/ou expansão de células limiares durante o cul- tivo. Em modalidades particulares, uma composição de saída é gerada com sucesso se as células de pelo menos 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % das células expressam o receptor recombinan- te. Em modalidades particulares, uma composição de saída é produzi- da ou gerada com sucesso se a composição de saída é adequada pa- ra uso terapêutico, por exemplo, como uma terapia celular autóloga. Em modalidades particulares, uma composição de saída é adequada para uso terapêutico se as células das composições de saída atende- rem a um ou mais critérios. Em algumas modalidades, as células e/ou composições de células que são adequadas para uso em terapia celu- lar são estéreis (por exemplo, falta de contaminação microbiana detec- tável), livres de endotoxina, vírus competente para replicação, viáveis, ativas (por exemplo, possuem atividade citolítica e/ou libera citocina em resposta a um antígeno alvo) e/ou contém uma porção alta de cé- lulas que expressam o receptor recombinante.
[00406] Em modalidades particulares, os métodos fornecidos têm pelo menos 80 %, pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de probabilidade ou possibilidade de gerar ou produzir com êxito uma composição de saída de células T enriqueci- das a partir de uma composição de células de entrada e/ou de uma amostra biológica. Em certas modalidades, a probabilidade ou possibi- lidade está entre 85 % e 100 %, entre 90 % e 95 %, ou entre 92 % e 94 %. Em certas modalidades, os métodos fornecidos geram ou pro- duzem com êxito uma composição de saída de células T enriquecidas de pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, em pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo me- nos 99 % de composições e/ou amostras de várias composições de células de entrada e/ou de uma pluralidade de amostras biológicas. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos geram ou produzem com sucesso uma composição de saída de células T enriquecidas en- tre 85 % e 100 %, entre 90 % e 95 %, ou entre 92 % e 94 % de com- posições e/ou amostras de várias composições de células de entrada e/ou de uma pluralidade de amostras biológicas.
[00407] Em certas modalidades, o processo é concluído em 21 dias e tem uma taxa de sucesso de pelo menos 85 %, 90 %, 95 % ou mai- or. Em algumas modalidades, o processo é considerado completo quando as células de saída são administradas e/ou prontas para se-
rem administradas ao indivíduo. Em algumas modalidades, o processo é considerado completo quando a composição de saída foi colhida e/ou está pronta para ser testada e/ou avaliada, por exemplo, como para um ensaio de liberação.
[00408] Em modalidades particulares, o processo associado aos métodos fornecidos tem uma probabilidade ou possibilidade de gerar ou produzir com sucesso uma composição de saída que é maior que a probabilidade ou possibilidade de um processo alternativo e/ou exem- plar de gerar ou produzir um resultado com sucesso composição em pelo menos 0,5 %, pelo menos 1 %, pelo menos 1,5 %, pelo menos 2 %, pelo menos 2,5 %, pelo menos 3 %, pelo menos 3,5 %, pelo menos 4,0 %, pelo menos 4,5 %, pelo menos 5 %, pelo menos 5,5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 6,5 %, pelo menos 7 %, pelo menos 7,5 %, pelo menos 8 %, pelo menos 8,5 %, pelo menos 9 %, pelo menos 9,5 % ou pelo menos 10 % ou mais de 10 %.
[00409] Em certas modalidades, o processo associado aos métodos fornecidos tem uma probabilidade ou possibilidade de gerar ou produ- zir com sucesso uma composição de saída de células T CD4+ enri- quecidas que é maior que a probabilidade ou possibilidade de um pro- cesso alternativo e/ou exemplar de obter sucesso, gerar ou produzir uma composição de saída de células T CD4+ enriquecidas em pelo menos 0,5 %, pelo menos 1 %, pelo menos 1,5 %, pelo menos 2 %, pelo menos 2,5 %, pelo menos 3 %, pelo menos 3,5 %, pelo menos 4,0 %, pelo menos 4,5 %, pelo menos 5 %, pelo menos 5,5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 6,5 %, pelo menos 7 %, pelo menos 7,5 %, pelo menos 8 %, pelo menos 8,5 %, pelo menos 9 %, pelo menos 9,5 %, ou pelo menos 10 %, ou em mais de 10 %.
[00410] Em modalidades particulares, o processo associado aos métodos fornecidos tem uma probabilidade ou possibilidade de gerar ou produzir com sucesso uma composição de saída de células T CD8+ enriquecidas que é maior que a probabilidade ou possibilidade de um processo alternativo e/ou exemplar de obter sucesso, gerar ou produ- zir uma composição de saída de células T CD8+ enriquecidas em pelo menos 0,5 %, pelo menos 1 %, pelo menos 1,5 %, pelo menos 2 %, pelo menos 2,5 %, pelo menos 3 %, pelo menos 3,5 %, pelo menos 4,0 %, pelo menos 4,5 %, pelo menos 5 %, pelo menos 5,5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 6,5 %, pelo menos 7 %, pelo menos 7,5 %, pelo menos 8 %, pelo menos 8,5 %, pelo menos 9 %, pelo menos 9,5 %, ou pelo menos 10 %, ou em mais de 10 %.
[00411] Em algumas modalidades, as referidas uma ou mais com- posições de saída geradas ou produzidas em conexão com os méto- dos fornecidos contêm células que expressam um receptor recombi- nante, por exemplo, um TCR ou um CAR. Em algumas modalidades, expressar um receptor recombinante pode incluir, mas não está limita- do a, ter uma ou mais proteínas receptoras recombinantes localizadas na membrana celular e/ou superfície celular, tendo uma quantidade detectável de proteína receptora recombinante, tendo uma quantidade detectável de mRNA codificando o receptor recombinante, possuindo ou contendo um polinucleotídeo recombinante que codifica o receptor recombinante e/ou possuindo ou contendo um mRNA ou proteína que é um marcador substituto para a expressão do receptor recombinante.
[00412] Em algumas modalidades, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, pelo menos 99 % ou mais de 99 % das células das uma ou mais composições de saída expressam o recombinante receptor. Em modalidades particulares, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %,
pelo menos pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, pelo menos 99 % ou mais de 99 % das células T CD4+ de uma composição de saída expressam o receptor recombi- nante. Em algumas modalidades, entre 30 % e 90 %, entre 40 % e 85 %, entre 50 % e 80 %, ou entre 60 % e 80 % das células T CD4+ ex- pressam o receptor recombinante. Em modalidades particulares, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 % ou pelo menos 99 % das células de uma composição de saída de células T CD4+ en- riquecidas expressam o receptor recombinante. Em certas modalida- des, entre 30 % e 90 %, entre 40 % e 85 %, entre 50 % e 80 %, ou en- tre 60 % e 80 % das células de uma composição de saída de células T CD4+ enriquecidas expressam o receptor recombinante.
[00413] Em certas modalidades, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, pelo menos 99 % ou mais de 99 % das células T CD8+ de uma composição de saída expressam o receptor recombi- nante. Em algumas modalidades, entre 30 % e 90 %, entre 40 % e 85 %, entre 50 % e 80 %, ou entre 60 % e 80 % das células T CD8+ ex- pressam o receptor recombinante. Em modalidades particulares, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos r pelo menos 99 % das células de uma composição de saída de células T CD8+ enriquecidas expressam o receptor recombinante. Em certas modalidades, entre 30 % e 90 %,
entre 40 % e 85 %, entre 50 % e 80 %, ou entre 60 % e 80 % das célu- las de uma composição de saída de células T CD8+ enriquecidas ex- pressam o receptor recombinante.
[00414] Em algumas modalidades, a percentagem de células da composição de saída que expressam o receptor recombinante é maior que a percentagem de células que expressam o receptor recombinan- te que foram produzidas ou geradas por um processo alternativo e/ou exemplar, como por pelo menos 0,5 %, pelo menos 1 %, pelo menos 1,5 %, pelo menos 2 %, pelo menos 2,5 %, pelo menos 3 %, pelo me- nos 3,5 %, pelo menos 4,0 %, pelo menos 4,5 %, pelo menos 5 %, pe- lo menos 5,5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 6,5 %, pelo menos 7 %, pelo menos 7,5 %, pelo menos 8 %, pelo menos 8,5 %, pelo menos 9 %, pelo menos 9,5 % ou pelo menos 10 %, ou em mais de 10 %.
[00415] Em certas modalidades, a percentagem de células T CD4+ da composição de saída que expressa o receptor recombinante é mai- or que a percentagem de células T CD4+ que expressam o receptor recombinante que foram produzidas ou geradas por um processo al- ternativo e/ou exemplar, como em pelo menos 0,5 %, pelo menos 1 %, pelo menos 1,5 %, pelo menos 2 %, pelo menos 2,5 %, pelo menos 3 %, pelo menos 3,5 %, pelo menos 4,0 %, pelo menos 4,5 %, pelo me- nos 5 %, pelo menos 5,5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 6,5 %, pelo menos 7 %, pelo menos 7,5 %, pelo menos 8 %, pelo menos 8,5 %, pelo menos 9 %, pelo menos 9,5 % ou pelo menos 10 % ou mais de 10 %.
[00416] Em algumas modalidades, a percentagem de células T CD8+ da composição de saída que expressa o receptor recombinante é maior que a percentagem de células T CD8+ que expressam o re- ceptor recombinante que foram produzidas ou geradas por um proces- so alternativo e/ou exemplar, como em pelo menos 0,5 %, pelo menos 1 %, pelo menos 1,5 %, pelo menos 2 %, pelo menos 2,5 %, pelo me-
nos 3 %, pelo menos 3,5 %, pelo menos 4,0 %, pelo menos 4,5 %, pe- lo menos 5 %, pelo menos 5,5 %, pelo menos 6 %, pelo menos 6,5 %, pelo menos 7 %, pelo menos 7,5 %, pelo menos 8 %, pelo menos 8,5 %, pelo menos 9 %, pelo menos 9,5 % ou pelo menos 10 % ou mais de 10 %.
[00417] Em algumas modalidades, as referidas uma ou mais com- posições de saída geradas ou produzidas pelos métodos fornecidos contêm células ativadas e/ou contêm células que têm ou exibem um ou mais marcadores de ativação. Em modalidades particulares, as cé- lulas das composições de saída produzidas ou geradas pelos métodos fornecidos são mais ativadas e/ou têm ou exibem uma quantidade ou grau maior de um ou mais marcadores de ativação do que as células que são geradas ou produzidas por um exemplo e/ou processo alter- nativo. Os marcadores de ativação podem incluir qualquer marcador conhecido que indique, esteja correlacionado e/ou associado a um es- tado de ativação em uma célula imune, como uma célula T. Em algu- mas modalidades, os marcadores de ativação incluem, porém, não estão limitados a, complexidade intracelular aumentada (por exemplo, conforme determinado pela medição da dispersão lateral (SSC), tama- nho celular aumentado (por exemplo, conforme determinado pela me- dição do diâmetro da célula e/ou dispersão anterógrada (FSC), ex- pressão aumentada de CD27 e/ou expressão diminuída de CD25.
[00418] Em algumas modalidades, as células de saída que são ge- radas ou produzidas pelos métodos fornecidos são maiores do que as células geradas ou produzidas pelo processo alternativo e/ou exem- plar. Em algumas modalidades, os parâmetros de FSC e/ou SSC são medidos e comparados a uma referência e/ou a um padrão para avali- ar o tamanho das células, como por citometria de fluxo. Em certas mo- dalidades, o parâmetro de FSC é medido e comparado a uma referên- cia ou padrão para avaliar o tamanho das células. Em algumas moda-
lidades, o diâmetro da célula, por exemplo, o diâmetro da célula medi- ano ou médio, das células da composição de saída é de pelo menos 0,25 µm, 0,5 µm, 0,75 µm, 1,0 µm, 1,5 µm, 2 µm, 2,5 µm, 3 µm , 3,5 µm, 4 µm, 4,5 µm, 5 µm ou mais que 5 µm maiores que o diâmetro das células geradas ou produzidas pelo processo alternativo e/ou exem- plar.
[00419] Em certas modalidades, as células de saída são ativas e se expandem, e/ou são capazes de ativação e expansão, in vivo, quando administradas a um indivíduo. Em modalidades particulares, as células de saída exibem aspectos e/ou características que indicam e/ou estão associadas à eficácia, atividade e/ou expansão in vivo. Por exemplo, em algumas modalidades, estes aspectos ou caracteres podem incluir a expressão de uma proteína, como uma proteína de superfície, que está associada à ativação, proliferação e/ou expansão. Em algumas modalidades, tais aspectos ou características podem incluir produção ou secreção de fatores como citocinas, por exemplo, em resposta à exposição a um antígeno.
[00420] Em certas modalidades, as células de saída que são gera- das ou produzidas pelos métodos fornecidos têm maior expressão de CD25 do que as células que são geradas ou produzidas pelo processo alternativo e/ou exemplar. Em algumas modalidades, as células T CD4+ de saída têm uma expressão maior de CD25 do que as células T CD4+ que são geradas ou produzidas pelo processo alternativo e/ou exemplar. Em algumas modalidades, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos pelo menos 90 %, pelo menos 100 % das células da composi- ção de saída são positivas para o manchamento de CD25, por exem- plo, expressam uma quantidade detectável de CD25. Em modalidades particulares, a composição de saída contém uma porção maior de cé-
lulas que são positivas para CD25 do que uma composição de células produzidas ou geradas pelo processo alternativo e/ou exemplar. Em algumas modalidades, as células da composição de saída expressam pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 100 %, pelo menos 150 %, pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes ou pelo menos 5 vezes, mais CD25, por exemplo, como indicado medindo a expressão média ou mediana de CD25 nas células da composição de saída por citometria de fluxo, em comparação a células produzidas ou geradas pelo processo alternativo e/ou exemplar.
[00421] Em algumas modalidades, a expressão de CD27 pelas cé- lulas de saída que são geradas ou produzidas pelos métodos forneci- dos é reduzida em comparação à expressão de CD27 em células que são geradas ou produzidas pelo processo alternativo e/ou exemplar. Em algumas modalidades, uma porção maior das células da composi- ção de saída é CD27 negativa e/ou tem níveis baixos ou indetectáveis de CD27 do que a porção de células geradas ou produzidas pelo pro- cesso alternativo e/ou exemplar. Em algumas modalidades, a expres- são de CD27, por exemplo, a expressão média ou mediana de CD27 conforme medida pela citometria de fluxo, pelas células da composi- ção de saída é reduzida em pelo menos 1 %, pelo menos 5 %, pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 99 % em comparação às células geradas ou pro- duzidas no processo alternativo e/ou exemplar.
[00422] Em certas modalidades, as células de saída que são gera- das ou produzidas pelos métodos fornecidos têm maior expressão de marcadores associados à divisão celular do que as células geradas ou produzidas pelo processo alternativo e/ou exemplar. Em algumas mo- dalidades, as células de saída expressam Ki67. Em algumas modali- dades, uma porção maior de células T CD4+ de saída expressa Ki67 do que a porção de células T CD4+ que são geradas ou produzidas pelo processo alternativo e/ou exemplar. Em certas modalidades, uma porção maior de células T CD8+ de saída expressa Ki67 do que a por- ção de células T CD8+ que são geradas ou produzidas pelo processo alternativo e/ou exemplar. Em modalidades particulares, a composição de saída contém uma porção maior de células que são positivas para Ki67 do que uma composição de células produzidas ou geradas pelo processo alternativo e/ou exemplar. Em algumas modalidades, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos pelo menos 90 %, pelo menos 100 %, das células da composição de saída são positivas para o mancha- mento com Ki67, por exemplo, expressam uma quantidade detectável de ki67. Em algumas modalidades, as células da composição de saída expressam pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 100 %, pelo menos 150 %, pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, mais Ki67, por exemplo, conforme indicado pela medição da expressão mé- dia ou mediana de Ki67 nas células da composição de saída por cito- metria de fluxo, em comparação às células produzidas ou geradas pe- lo processo alternativo e/ou exemplar.
[00423] Em algumas modalidades, as células de saída têm produ- ção e/ou secreção aumentadas e/ou são capazes de aumentar a pro- dução e/ou secreção de uma ou mais citocinas, por exemplo, em res-
posta à exposição a um antígeno. Em algumas modalidades, as célu- las de saída têm a produção e/ou secreção aumentadas e/ou são ca- pazes de aumentar a produção e/ou secreção de IFN-gama em com- paração às células que são produzidas ou geradas por um processo alternativo e/ou exemplar. Em algumas modalidades, as células T CD8+ da composição de saída, por exemplo, células T CD8+ que ex- pressam o receptor recombinante, têm produção e/ou secreção au- mentadas e/ou são capazes de aumentar a produção e/ou secreção de IFN-gama em comparação às células que são produzidas ou gera- das por um processo alternativo e/ou exemplar. Em algumas modali- dades, a produção ou secreção pelas células de saída é de pelo me- nos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 100 %, pelo menos 150 %, pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes ou pelo menos 5 vezes maior que a produção ou secreção por células produzidas por um processo alternativo e/ou exemplar.
[00424] Em certas modalidades, as células de saída têm produção e/ou secreção aumentadas e/ou são capazes de aumentar a produção e/ou secreção de TNF-alfa em comparação às células que são produ- zidas ou geradas por uma alternativa e/ou exemplo processo. Em al- gumas modalidades, as células T CD8+ da composição de saída, por exemplo, células T CD8+ que expressam o receptor recombinante, têm produção e/ou secreção aumentadas e/ou são capazes de au- mentar a produção e/ou secreção de TNF-alfa em comparação às cé- lulas que são produzidas ou geradas por um processo alternativo e/ou exemplar. Em algumas modalidades, a produção ou secreção pelas células de saída é de pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 100 %, pelo menos 150 %, pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes ou pelo menos 5 vezes maior que a produção ou secreção por células produzidas por um processo alternativo e/ou exemplar.
[00425] Em certas modalidades, as células de saída têm produção e/ou secreção diminuídas de uma ou mais citocinas, por exemplo, em resposta à exposição a um antígeno em comparação às células que são produzidas ou geradas por um processo alternativo e/ou exemplar. Em modalidades particulares, as células de saída têm produção e/ou secreção diminuídas de INF-gama. Em certas modalidades, as células T CD4+ da composição de saída, por exemplo, células T CD4+ que expressam o receptor recombinante, têm produção e/ou secreção di- minuídas de INF-gama em comparação às células T CD4+ que são produzidas ou geradas por um processo alternativo e/ou exemplar. Em algumas modalidades, a produção ou secreção de INF-gama pelas células de saída, por exemplo, as células T CD4+ que expressam o receptor recombinante são reduzidas em pelo menos 20 %, pelo me- nos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 99 % em comparação à produção ou secreção por células produzidas por um processo alternativo e/ou exemplar.
[00426] Em modalidades particulares, as células de saída têm pro- dução e/ou secreção diminuídas de IL-2. Em algumas modalidades, as células T CD4+ da composição de saída, por exemplo, células T CD4+ que expressam o receptor recombinante, têm produção e/ou secreção diminuídas de IL-2 em comparação às células T CD4+ que são produ- zidas ou geradas por um processo alternativo e/ou exemplar. Em al- gumas modalidades, a produção ou secreção de IL-2 pelas células de saída, por exemplo, as células T CD4+ que expressam o receptor re- combinante, é reduzida em pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 99 % em comparação à produção ou secreção por células produzidas por um processo alternativo e/ou exemplar.
[00427] Em certas modalidades, as células de saída têm produção e/ou secreção diminuídas de GM-CSF. Em modalidades particulares, as células T CD4+ da composição de saída, por exemplo, células T CD4+ que expressam o receptor recombinante, produção e/ou secre- ção diminuídas de GM-CSF em comparação às células T CD4+ que são produzidas ou geradas por um processo alternativo e/ou exemplar. Em certas modalidades, a produção ou secreção de GM-CSF pelas células de saída, por exemplo, as células T CD4+ que expressam o receptor recombinante são reduzidas em pelo menos 20 %, pelo me- nos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 99 % em comparação à produção ou secreção por células produzidas por um processo alternativo e/ou exemplar.
[00428] Em modalidades particulares, as células de saída têm pro- dução e/ou secreção diminuídas de MIP1-alfa. Em algumas modalida- des, as células T CD4+ da composição de saída, por exemplo, células T CD4+ que expressam o receptor recombinante, têm produção e/ou secreção diminuídas de MIP1-alfa em comparação às células T CD4+ que são produzidas ou geradas por um processo alternativo e/ou exemplar. Em certas modalidades, a produção ou secreção de MIP1- alfa pelas células de saída, por exemplo, as células T CD4+ que ex- pressam o receptor recombinante, é reduzida em pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60
%, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 99 % em comparação à produ- ção ou secreção por células produzidas por um processo alternativo e/ou exemplar.
[00429] Em modalidades particulares, as células de saída que são geradas ou produzidas pelos métodos fornecidos têm menos expres- são de marcadores associados à apoptose, por exemplo, níveis de caspases ativadas e/ou manchamento positivo com Anexina V, do que as células que são geradas ou produzidas pelo processo alternativo e/ou exemplar.
[00430] Em algumas modalidades, as células T CD4+ de saída con- têm menos células de Anexina V+ do que as células T CD4+ que são geradas ou produzidas pelo processo alternativo e/ou exemplar. Em algumas modalidades, menos de 25 %, menos de 20 %, menos de 18 %, menos de 16 %, menos de 15 %, menos de 14 %, menos de 13 %, menos de 12 %, menos de 11 %, menos de 10 %, menos de 8 %, me- nos de 6 %, menos de 5 %, menos de 3 %, menos de 1 % ou menos de 0,1 % das células CD4+ da composição de saída são positivas para o manchamento com Anexina V, por exemplo, se ligam e/ou são capa- zes de se ligar à Anexina V, como a Anexina recombinante e/ou mar- cada. Em certas modalidades, menos de 25 %, menos de 20 %, me- nos de 18 %, menos de 16 %, menos de 15 %, menos de 14 %, me- nos de 13 %, menos de 12 %, menos de 11 %, menos de 10 %, me- nos de 8 %, menos de 6 %, menos de 5 %, menos de 3 %, menos de 1 % ou menos de 0,1 % das células CD4+ da composição de saída que expressam o receptor recombinante são positivas para o man- chamento com Anexina V.
[00431] Em certas modalidades, as células T CD8+ de saída con- têm menos células de Anexina V+ do que as células T CD4+ que são geradas ou produzidas pelo processo alternativo e/ou exemplar. Em modalidades particulares, menos de 25 %, menos de 20 %, menos de 18 %, menos de 16 %, menos de 15 %, menos de 14 %, menos de 13 %, menos de 12 %, menos de 11 %, menor 10 %, menos de 8 %, me- nos de 6 %, menos de 5 %, menos de 3 %, menos de 1 % ou menos de 0,1 % das células CD8+ da composição de saída são positivas para o manchamento com Anexina V. Em certas modalidades, menos de 25 %, menos de 20 %, menos de 18 %, menos de 16 %, menos de 15 %, menos de 14 %, menos de 13 %, menos de 12 %, menos de 11 %, menos de 10 %, menos de 8 %, menos de 6 %, menos de 5 %, menos de 3 %, menos de 1 % ou menos de 0,1 % das células CD8+ da com- posição de saída que expressam o receptor recombinante são positi- vas para o manchamento com anexina V.
[00432] Em certas modalidades, as células T CD4+ de saída con- têm menos células positivas para uma caspase ativada, por exemplo, caspase ativada 3, do que células T CD4+ que são geradas ou produ- zidas pelo processo alternativo e/ou exemplar. Em modalidades parti- culares, menos de 25 %, menos de 20 %, menos de 18 %, menos de 16 %, menos de 15 %, menos de 14 %, menos de 13 %, menos de 12 %, menos de 10 %, menos de 8 %, menos de 6 %, menos de 5 %, menos de 3 %, menos de 1 % ou menos de 0,1 % das células CD4+ da composição de saída são positivas para uma caspase ativada, por exemplo, caspase ativada 3. Em certas modalidades, menos de 25 %, menos de 20 %, menos de 18 %, menos de 16 %, menos de 15 %, menos de 14 %, menos de 13 %, menos de 12 %, menos de 11 %, menos de 10 %, menos de 8 %, menos de 6 %, menos de 5 %, menos de 3 %, menos de 1 % ou menos de 0,1 % das células CD4+ da com- posição de saída que expressam o receptor recombinante são positi- vas para uma caspase ativada, por exemplo, caspase ativada 3.
[00433] Em algumas modalidades, as células T CD8+ de saída con- têm menos células positivas para uma caspase ativada, por exemplo,
caspase ativada 3, do que as células T CD4+ que são geradas ou pro- duzidas pelo processo alternativo e/ou exemplar. Em certas modalida- des, menos de 25 %, menos de 20 %, menos de 18 %, menos de 16 %, menos de 15 %, menos de 14 %, menos de 13 %, menos de 12 %, menos de 11 %, menor 10 %, menos de 8 %, menos de 6 %, menos de 5 %, menos de 3 %, menos de 1 % ou menos de 0,1 % das células CD8+ da composição de saída são positivas para uma caspase ativa- da, por exemplo, caspase ativada 3. Em certas modalidades, menos de 25 %, menos de 20 %, menos de 18 %, menos de 16 %, menos de 15 %, menos de 14 %, menos de 13 %, menos de 12 %, menos de 11 %, menos de 10 %, menos de 8 %, menos de 6 %, menos de 5 %, menos de 3 %, menos de 1 % ou menos de 0,1 % das células CD8+ da composição de saída que expressam o receptor recombinante são positivas para uma caspase ativada, por exemplo, caspase ativada 3.
[00434] Em certas modalidades, as células da composição de saída são administradas a um indivíduo. Em algumas modalidades, as célu- las da composição de saída são administradas para tratar uma doença ou condição. Em algumas modalidades, a doença ou condição é cân- cer. Em algumas modalidades, as células das composições de saída são administradas ao indivíduo, e o indivíduo experimenta uma redu- ção nas células cancerígenas e/ou no volume do tumor. Em algumas modalidades, o indivíduo tem, tem cerca de ou tem pelo menos 25 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 % de redução da quantidade de células cancerígenas e/ou redu- ção do tumor após a administração das células da composição de saí- da, por exemplo, em comparação à quantidade de células canceríge- nas e/ou volume do tumor no indivíduo antes da administração. Em algumas modalidades, a administração de células da composição de saída resulta em uma redução aumentada do volume do tumor e/ou na quantidade de células cancerígenas no indivíduo em comparação à redução do volume do tumor e/ou na quantidade de células canceríge- nas no indivíduo após administração de células de saída produzidas por um processo alternativo exemplar.
[00435] Em modalidades particulares, a administração de células da composição de saída resulta em um aumento na redução do volume do tumor e/ou da quantidade de células cancerígenas no indivíduo de, de cerca de ou de pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 125 %, 150 %, 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, de 5 vezes, em comparação à redução do volume do tumor e/ou da quantidade de células cancerígenas no indivíduo após a admi- nistração de células produzidas por um processo alternativo exemplar.
[00436] Em modalidades particulares, as células da composição de saída, por exemplo, uma porção e/ou uma dose de células da compo- sição de saída, são administradas a um indivíduo. Em algumas moda- lidades, o indivíduo ao qual são administradas células da composição de saída tem uma probabilidade e/ou uma possibilidade de alcançar e/ou experimentar uma resposta completa (CR). Em certas modalida- des, a possibilidade e/ou probabilidade de alcançar e/ou experimentar CR é de pelo menos 10 %, pelo menos 15 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 % ou pelo me- nos 95 %. Em certas modalidades, a probabilidade e/ou possibilidade de alcançar e/ou experimentar a CR é de pelo menos 25 %. Em moda- lidades particulares, a probabilidade e/ou possibilidade de atingir a CR é de pelo menos 50 %.
[00437] Em certas modalidades, o indivíduo ao qual são adminis- tradas células da composição de saída tem uma probabilidade e/ou uma possibilidade de atingir e/ou experimentar ORR. Em certas moda- lidades, a probabilidade e/ou possibilidade de atingir e/ou experimentar
ORR é pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 95 %. Em certas modalidades, a pro- babilidade e/ou possibilidade de atingir e/ou experimentar ORR é de pelo menos 80 %. Em modalidades particulares, a probabilidade e/ou possibilidade de atingir ORR é de pelo menos 90 %. Em certas moda- lidades, a probabilidade e/ou possibilidade de atingir ORR é ou é de cerca de 100 %.
[00438] Em algumas modalidades, a eficácia das células de saída, por exemplo, a probabilidade de um indivíduo que um indivíduo atingi- rá e/ou experimentará CR ou ORR após a administração de células da composição de saída, é maior que a de uma composição de célula te- rapêutica contendo células que expressam um receptor recombinante que são produzidos por um processo alternativo. Em certas modalida- des, há pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 125 %, 150 %, 1 vez, 2 vezes, 5 ve- zes, 10 vezes, 50 vezes ou 100 vezes maior probabilidade de atingir CR ou ORR após a administração das células de saída em compara- ção à administração das células da composição de célula terapêutica produzida pelo processo alternativo.
[00439] Em algumas modalidades, as células de saída produzidas pelos métodos aqui fornecidos têm um alto e/ou um grau relativamente alto de segurança. Em algumas modalidades, as células da composi- ção de saída, por exemplo, uma porção e/ou uma dose de células da composição de saída, são administradas a um indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo ao qual são administradas células da compo- sição de saída tem um risco, probabilidade e/ou uma possibilidade de experimentar uma toxicidade, por exemplo, CRS ou neurotoxicidade, que é menor que 80 %, 75 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 % ou 5 %. Em algumas modalidades, a toxicidade é qualquer grau de neurotoxicidade ou CRS. Em certas modalidades, as células administradas objeto da composição de saída têm um risco, probabilidade e/ou possibilidade de menos de 80 % para experimentar qualquer grau de CRS ou neurotoxicidade. Em modalidades particula- res, as células administradas objeto da composição de saída têm um risco, probabilidade e/ou possibilidade de menos de 80 % para expe- rimentar qualquer grau de CRS ou neurotoxicidade.
[00440] Em algumas modalidades, as células da composição de saída, por exemplo, uma porção e/ou uma dose de células da compo- sição de saída, são mais seguras do que as células de uma composi- ção de saída produzida por um processo alternativo. Em algumas mo- dalidades, a incidência ou probabilidade de experimentar qualquer grau de neurotoxicidade, grau 3 ou superior, grau 3 prolongado ou su- perior, grau 4 ou superior ou grau 5, é menor que 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou menor que 95 % da in- cidência e/ou probabilidade após a administração de células de saída produzidas por um processo alternativo.
[00441] Em certas modalidades, os métodos fornecidos são usados em conexão com um processo que gera uma ou mais composições de saída de células T enriquecidas que são modificadas para expressar um receptor recombinante com uma taxa de sucesso de pelo menos 85 % (por exemplo, gera com sucesso composições de células de saí- da de pelo menos 85 % de uma pluralidade de diferentes amostras biológicas e/ou composições de células de entrada), como uma taxa de sucesso dentre 92 % e 94 %. Em algumas modalidades, o proces- so inclui as etapas de incubar células sob condições estimulantes; modificar as células estimuladas para expressar ou conter um polinu- cleotídeo recombinante, por exemplo, um polinucleotídeo que codifica um receptor recombinante, como um CAR; e cultivar as células modifi- cadas a uma quantidade, densidade ou expansão limiar. Em algumas modalidades, a duração e/ou quantidade de tempo necessária para concluir estas etapas está entre 8 e 15 dias ou entre 9 e 13 dias. Em certas modalidades, o processo inclui etapas para coletar ou obter uma amostra biológica; isolar, selecionar ou enriquecer células de en- trada da amostra biológica; criocongelar e armazenar as células de entrada; descongelar e/ou incubar as células de entrada sob condi- ções estimulantes; modificar as células estimuladas para expressar ou conter um polinucleotídeo recombinante, por exemplo, um polinucleo- tídeo que codifica um receptor recombinante, como um CAR; cultivar as células modificadas até uma quantidade, densidade ou expansão limiar; formular as células cultivadas em uma composição de saída; e criocongelar e armazenar as células de saída formuladas até que as células sejam liberadas para infusão e/ou administração a um indiví- duo. Em algumas modalidades, o processo é concluído dentro de 19 a 23 dias a partir da obtenção ou coleta da amostra biológica.
[00442] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos são usa- dos em conexão com um processo que gera uma ou mais composi- ções de células T enriquecidas, como de uma única fonte, por exem- plo, uma amostra biológica e/ou composições de entrada isoladas, se- lecionadas ou enriquecidas a partir de uma amostra biológica. Em mo- dalidades particulares, as referidas uma ou mais composições de célu- las T enriquecidas é ou inclui uma composição de células T CD4+ en- riquecidas que contêm pelo menos 80 % de células T CD4+ e pelo menos 50 % de células T CD4+ que expressam o receptor recombi- nante. Em algumas modalidades, as referidas uma ou mais composi- ções de células T enriquecidas incluem uma composição de T CD4+ enriquecida e uma composição de células T CD8+ enriquecidas que contêm pelo menos 80 % de células T CD8+ e pelo menos 50 % de células T CD8+ que expressam o receptor recombinante. II. PROTEÍNAS RECOMBINANTES
[00443] Em algumas modalidades, as células que são tratadas, processadas, modificadas e/ou produzidas pelos métodos aqui forne- cidos contêm ou expressam ou são modificadas para conter ou ex- pressar uma proteína recombinante, como um receptor recombinante, por exemplo, um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um recep- tor de células T (TCR). Em certas modalidades, os métodos aqui for- necidos produzem e/ou são capazes de produzir células, ou popula- ções ou composições contendo e/ou enriquecidas para células, que são modificadas para expressar ou conter uma proteína recombinante. Em algumas modalidades, as células T CD4+, ou populações ou com- posições de células T CD4+, são tratadas, processadas, modificadas e/ou produzidas
[00444] Em algumas modalidades, as células incluem um ou mais ácidos nucleicos introduzidos por engenharia genética e, assim, ex- pressam produtos recombinantes ou geneticamente modificados de tais ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, a transferência de genes é realizada estimulando-se primeiro as células, como combi- nando-as com um estímulo que induz uma resposta como proliferação, sobrevivência e/ou ativação, por exemplo, conforme medido pela ex- pressão de uma citocina ou marcador de ativação, seguido por trans- dução das células ativadas e expansão em cultura para números sufi- cientes para aplicações clínicas.
[00445] As células geralmente expressam receptores recombinan- tes, como receptores de antígeno, incluindo receptores de antígeno não TCR funcionais, por exemplo, receptores de antígeno quiméricos (CARs) e outros receptores de ligação ao antígeno, como receptores de células T transgênicos (TCRs). Também entre os receptores estão outros receptores quiméricos A. Receptores de Antígeno Quiméricos
[00446] Em algumas modalidades dos métodos e usos fornecidos,
os receptores quiméricos, como os receptores de antígeno quiméricos, contêm um ou mais domínios que combinam um domínio de ligação ao ligante (por exemplo, anticorpo ou fragmento de anticorpo) que for- nece especificidade para um antígeno desejado (por exemplo, antíge- no tumoral) com domínios de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular é uma porção de domínio intracelular de ativação, como um domínio de ativação de cé- lulas T, fornecendo um sinal de ativação primário. Em algumas moda- lidades, o domínio de sinalização intracelular contém ou adicionalmen- te contém um domínio de sinalização coestimulador para facilitar as funções efetoras. Em algumas modalidades, os receptores quiméricos, quando geneticamente modificados em células imunes, podem modu- lar a atividade das células T e, em alguns casos, podem modular a di- ferenciação ou homeostasia das células T, resultando, assim, em célu- las geneticamente modificadas com maior longevidade, sobrevivência e/ou persistência in vivo, como para uso em métodos de terapia celular adotiva.
[00447] Receptores de antígeno exemplares, incluindo CARs, e mé- todos para modificação e introdução de tais receptores nas células, incluem aqueles descritos, por exemplo, nas Publicações de Pedido de Patente Internacional Números WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, Publicações de Pedido de Patente Norte-americanos Números US2002131960, US2013287748, US20130149337, Patentes Norte-americanas Nos. 6.451.995,
7.446.190, 8.252.592, 8.339.645, 8.398.282, 7.446.179, 6.410.319,
7.070.995, 7.265.209, 7.354.762, 7.446.191, 8.324.353, e 8.479.118, e pedido de patente Europeu número EP2537416, e/ou aqueles descri- tos por Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388–398; Davi- la et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin.
Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75. Em alguns aspectos, os receptores de antígeno incluem um CAR, como descrito na Patente Norte-americana No. 7.446.190, e aqueles descritos na Publicação de Pedido de Patente Internacional: WO/2014055668 A1. Exemplos dos CARs incluem CARs, conforme descrito em quaisquer das publicações anteriormente mencionadas, como WO2014031687, US 8.339.645, US 7.446.179, US 2013/0149337, Patente Norte-americana No. 7.446.190, Patente Nor- te-americana No. 8.389.282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Revi- ews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; e Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177). Veja, também WO2014031687, US 8.339.645, US 7.446.179, US 2013/0149337, Patente Norte-americana No. 7.446.190 e Patente Norte-americana No. 8.389.282.
[00448] Os receptores quiméricos, como CARs, geralmente incluem um domínio de ligação ao antígeno extracelular, como uma porção de uma molécula de anticorpo, geralmente uma região variável de cadeia pesada (VH) e/ou região variável de cadeia leve (VL) do anticorpo, por exemplo, um fragmento de anticorpo scFv.
[00449] Em algumas modalidades, o antígeno direcionado pelo re- ceptor é um polipeptídeo. Em algumas modalidades, é um carboidrato ou outra molécula. Em algumas modalidades, o antígeno é seletiva- mente expresso ou superexpresso nas células da doença ou condição, por exemplo, o tumor ou células patogênicas, em comparação às célu- las ou tecidos normais ou não direcionados. Em outras modalidades, o antígeno é expresso nas células normais e/ou é expresso nas células modificadas.
[00450] Em algumas modalidades, o antígeno é ou inclui integrina αvβ6 (integrina avb6), antígeno de maturação de células B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecida como
CAIX ou G250), um um antígeno câncer-testículo 1B (CTAG, também conhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembrionário (CEA), uma ciclina, ciclina A2, Ligante de Quimiocina de Motivo C-C 1 (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteogli- cano de sulfato de condroitina 4 (CSPG4), proteína do fator de cresci- mento epidérmico (EGFR), mutação do receptor do fator de cresci- mento epidérmico tipo III mutação (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinaB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrogênio, receptor Fc semelhante a 5 (FCRL5; também conhecido como homólogo de receptor de Fc 5 ou FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), uma proteína de ligação ao folato (FBP), receptor alfa de folato, gangliosídeo GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp100), gli- picano-3 (GPC3) , Receptor Acoplado à Proteína G 5D (GPRC5D), Her2/neu (tirosina cinase receptora erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb- B4), dímeros de erbB, antígeno associado ao melanoma de alto peso molecular humano (HMW-MAA), antígeno de superfície da hepatite B, Antígeno leucocitário humano A1 (HLA-A1), Antígeno leucocitário hu- mano A2 (HLA-A2), receptor alfa de IL-22 (IL-22Rα), receptor alfa de IL-13 2 (IL- 13Rα2), receptor do domínio de inserção de cinase (kdr), cadeia leve capa, molécula de adesão de células L1 (L1-CAM), epíto- po CE7 de L1-CAM, Membro da Família 8 Contendo Repetição Rica em Leucina A (LRRC8A), Lewis Y, Antígeno associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesotelina (MSLN), c- Met, citomegalovírus de murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes do membro do grupo 2 exterminador natural D (NKG2D ) li- gantes, melana A (MART-1), molécula de adesão celular neural (NCAM), Antígeno oncofetal, antígeno preferencialmente expresso de melanoma (PRAME), receptor de progesterona, um antígeno específi-
co da próstata, antígeno de células tronco da próstata (PSCA), antíge- no da membrana específica da próstata (PSMA), Receptor Órfão de Tirosina Cinase Receptora 1 (ROR1), survivina, Glicoproteína trofo- blástica (TPBG também conhecida como 5T4), glicoproteína associada ao tumor 72 (TAG72), Proteína relacionada à tirocinase 1 (TRP1, tam- bém conhecida como TYRP1 ou gp75), Proteína relacionada à tiroci- nase 2 (TRP2, também conhecida como dopacromo tautomerase, do- pacromo delta-isomerase ou DCT), receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), receptor do fator de crescimento endote- lial vascular 2 ( VEGFR2), Tumor de Wilms 1 (WT-1), um antígeno es- pecífico de patógeno ou expresso por patógeno ou um antígeno asso- ciado a um marcador universal e/ou moléculas biotiniladas e/ou molé- culas expressas por HIV, HCV, HBV ou outros patógenos. Os antíge- nos direcionados pelos receptores em algumas modalidades incluem antígenos associados a uma malignidade de células B, como qualquer um de vários marcadores de células B conhecidos. Em algumas moda- lidades, o antígeno é ou inclui CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igcapa, Iglambda, CD79a, CD79b ou CD30.
[00451] Em algumas modalidades, o antígeno é ou inclui um antí- geno específico de patógeno ou expresso por patógeno. Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno viral (como um antígeno viral do HIV, HCV, HBV, etc.), antígenos bacterianos e/ou antígenos parasi- tários. Os antígenos direcionados pelos receptores em algumas moda- lidades incluem antígenos associados a uma malignidade de células B, como qualquer um de vários marcadores de células B conhecidos. Em algumas modalidades, o antígeno direcionado pelo receptor é CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igcapa, Iglambda, CD79a, CD79b ou CD30.
[00452] Em algumas modalidades, o antígeno ou domínio de liga- ção ao antígeno é CD19. Em algumas modalidades, o scFv contém uma VH e uma VL derivadas de um anticorpo ou um fragmento de an- ticorpo específico para CD19. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga CD19 é um anticorpo derivado de camundongo, como FMC63 e SJ25C1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo é um anticorpo humano, por exemplo, como descrito na Publicação de Patente Norte-americana No. US 2016/0152723.
[00453] O termo "anticorpo" aqui é usado no sentido mais amplo e inclui anticorpos policlonais e monoclonais, incluindo anticorpos intac- tos e fragmentos de anticorpos funcionais (ligação ao antígeno), inclu- indo fragmentos de ligação ao antígeno (Fab), fragmentos F(ab')2, fra- gmentos Fab', fragmentos Fv, fragmentos de IgG recombinantes (rIgG), regiões variáveis de cadeia pesada (VH) capazes de se ligar especificamente ao antígeno, fragmentos de anticorpos de cadeia úni- ca, incluindo fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) e anticorpos de domínio único (por exemplo, sdAb, sdFv, nanocorpo). O termo abrange formas de imunoglobulinas geneticamente modificadas e/ou modificadas de outra forma, tais como anticorpos, pepticorpos, anti- corpos quiméricos, anticorpos totalmente humanos, anticorpos huma- nizados e anticorpos heteroconjugados, anticorpos multiespecíficos, por exemplo, biespecíficos ou triespecíficos, diacorpos, triaborpos e tetracorpos, di-scFv tandem, tri-scFv tandem. A menos que de outra maneira declarado, o termo "anticorpo" deve ser entendido como abrangendo fragmentos de anticorpos funcionais do mesmo, também aqui referidos como "fragmentos de ligação ao antígeno". O termo também abrange anticorpos intactos ou de tamanho natural, incluindo anticorpos de qualquer classe ou subclasse, incluindo IgG e suas sub- classes, IgM, IgE, IgA e IgD.
[00454] Os termos "região determinante de complementaridade" e "CDR", sinônimo de "região hipervariável" ou "HVR", são conhecidos na técnica por se referirem a sequências não contíguas de aminoáci- dos dentro de regiões variáveis de anticorpos, que conferem especifi- cidade de antígeno e/ou afinidade de ligação. Em geral, existem três CDRs em cada região variável de cadeia pesada (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) e três CDRs em cada região variável de cadeia leve (CDR- L1, CDR-L2, CDR-L3). "Regiões de estrutura" e "FR" são conhecidas na técnica por se referirem às porções não CDR das regiões variáveis das cadeias pesada e leve. Em geral, existem quatro FRs em cada região variável de cadeia pesada de tamanho natural (FR-H1, FR-H2, FR-H3 e FR-H4) e quatro FRs em cada região variável de cadeia leve de tamanho natural (FR- L1, FR-L2, FR-L3 e FR-L4).
[00455] Os limites precisos da sequência de aminoácidos de uma determinada CDR ou FR podem ser facilmente determinados usando qualquer um de vários esquemas bem conhecidos, incluindo os descri- tos por Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5a. Edição Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (esquema de numeração "Kabat"); Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (esquema de numeração "Chothia"); MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography," J. Mol. Bi- ol. 262, 732-745." (esquema de numeração "Contact"); Lefranc MP et al., "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27(1):55-77 (esquema de numeração "IMGT"); Ho- negger A and Pluckthun A, "Yet another numbering scheme for immu- noglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool," J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3):657-70, (esquema de numeração "Aho"); e Martin et al., "Modeling antibody hypervariable loops: a combined algorithm," PNAS, 1989, 86(23):9268-9272, (esquema de numeração "AbM").
[00456] Os limites de uma determinada CDR ou FR podem variar dependendo do esquema usado para identificação. Por exemplo, o esquema Kabat é com base em alinhamentos estruturais, enquanto o esquema Chothia é com base em informações estruturais. A numera- ção para os esquemas de Kabat e Chothia baseia-se nos comprimen- tos de sequência da região de anticorpo mais comuns, com inserções acomodadas por letras de inserção, por exemplo, "30a" e exclusões que aparecem em alguns anticorpos. Os dois esquemas colocam de- terminadas inserções e exclusões ("indels") em posições diferentes, resultando em numeração diferencial. O esquema de Contact é base- ado na análise de estruturas de cristal complexas e é semelhante em muitos aspectos ao esquema de numeração de Chothia. O esquema de AbM é um compromisso entre as definições de Kabat e Chothia com base no usado pelo software de modelagem de anticorpos AbM de Oxford Molecular.
[00457] A Tabela 1, abaixo, lista limites de posição exemplares de CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 e CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, conforme identificados pelos esquemas de Kabat, Chothia, AbM e Contact, res- pectivamente. Para CDR-H1, a numeração de resíduos é listada usan- do os esquemas de numeração Kabat e Chothia. FRs estão localiza- dos entre CDRs, por exemplo, com FR-L1 localizado antes de CDR- L1, FR-L2 localizado entre CDR-L1 e CDR-L2, FR-L3 localizado entre CDR-L2 e CDR-L3 e assim por diante. Note-se que, como o esquema de numeração Kabat mostrado coloca inserções em H35A e H35B, o final da alça Chothia CDR-H1 quando numerada usando a convenção de numeração Kabat mostrada varia entre H32 e H34, dependendo do comprimento da alça.
Tabela 1. Limites de CDRs de acordo com vários esquemas de nume- ração. CDR Kabat Chothia AbM Contato CDR-L1 L24--L34 L24--L34 L24--L34 L30--L36 CDR-L2 L50--L56 L50--L56 L50--L56 L46--L55 CDR-L3 L89--L97 L89--L97 L89--L97 L89--L96 CDR-H1 (Nume- H31--H35B H26-- H26--H35B H30--H35B ração Kabat1) H32..34 CDR-H1 (Nume- H31--H35 H26--H32 H26--H35 H30--H35 ração Chothia2) CDR-H2 H50--H65 H52--H56 H50--H58 H47--H58 CDR-H3 H95--H102 H95--H102 H95--H102 H93--H101 1 - Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Inte- rest," 5a. Edição Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 2 - Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948
[00417] Assim, a menos de especificado de outra maneira, uma "CDR" ou "região determinante complementar" ou CDRs especificadas individuais (por exemplo, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) de um determinado anticorpo ou região do mesmo, como uma região variável da mesma, deve ser entendida como abrangendo uma (ou específica) região determinante complementar, conforme definido por qualquer um dos esquemas anteriormente mencionados, ou outros esquemas conhecidos. Por exemplo, onde é declarado que uma CDR particular (por exemplo, uma CDR-H3) contém a sequência de aminoácidos de uma CDR correspondente em uma determinada sequência de aminoácidos da região VH ou VL, entende-se que esta CDR tem uma sequência da CDR correspondente (por exemplo, CDR-H3) dentro da região variável, conforme definido por qualquer um dos esquemas anteriormente mencionados, ou outros esquemas conhecidos. Em algumas modalidades, sequências CDR específicas são especificadas. Sequências CDR exemplares de anticorpos fornecidos são descritas usando vários esquemas de numeração, embora seja entendido que um anticorpo fornecido pode incluir CDRs como descrito de acordo com qualquer um dos outros esquemas de numeração anteriormente mencionados ou outros esquemas de numeração conhecidos por alguém versado.
[00418] Da mesma forma, a menos que de outra maneira especifi- cado, uma FR ou FRs especificada(s) individuais (por exemplo, FR- H1, FR-H2, FR-H3, FR-H4) de um determinado anticorpo ou região do mesmo, como uma região variável do mesmo, deve ser entendida co- mo abrangendo uma região de estrutura (ou a específica) conforme definida por qualquer um dos esquemas conhecidos. Em alguns ca- sos, o esquema para identificação de uma CDR, FR ou FR ou CDRs particular(es) é especificado, como a CDR, conforme definida pelo mé- todo Kabat, Chothia, AbM ou Contact, ou outros esquemas conheci- dos. Em outros casos, a sequência de aminoácidos particular de uma CDR ou FR é determinada.
[00419] O termo "região variável" ou "domínio variável" refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvi- da na ligação do anticorpo ao antígeno. As regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões de estrutura conservadas (FRs) e três CDRs. (Veja, por exemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., WH Freeman and Co., page 91 (2007). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, anticorpos que ligam um antígeno particular pode ser iso- lado usando um domínio VH ou VL de um anticorpo que liga o antígeno para rastrear uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Veja, por exemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 ( 1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991).
[00420] Entre os anticorpos incluídos nos CARs fornecidos estão fragmentos de anticorpos. Um "fragmento de anticorpo" ou "fragmento de ligação ao antígeno" refere-se a uma molécula que não seja um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que liga o antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, porém, não estão limitados a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacorpos; anticorpos lineares; regiões va- riáveis de cadeia pesada (VH), moléculas de anticorpo de cadeia única, como scFvs e anticorpos de domínio único, compreendendo apenas a região VH; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmen- tos de anticorpo. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno nos CARs fornecidos é ou compreende um fragmento de an- ticorpo compreendendo uma região de cadeia pesada variável (VH) e uma de cadeia leve variável (VL). Em modalidades particulares, os an- ticorpos são fragmentos de anticorpo de cadeia única compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e/ou uma região variável de cadeia leve (VL), como scFvs.
[00421] Em algumas modalidades, o scFv é derivado de FMC63. FMC63 geralmente refere-se a um anticorpo IgG1 monoclonal de ca- mundongo aumentado contra células Nalm-1 e -16 que expressam CD19 de origem humana (Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). Em algumas modalidades, o anticorpo FMC63 compreende CDRH1 e H2 mencionadas em SEQ ID NOS: 38 e 39, respectivamen- te, e CDRH3 mencionada em SEQ ID NO: 40 ou 54 e CDRL1 mencio- nada em SEQ ID NO: 35 e CDR L2 mencionada em SEQ ID NO: 36 ou 55 e CDR L3 mencionada em SEQ ID NO: 37 ou 34. Em algumas mo- dalidades, o anticorpo FMC63 compreende a região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e a região variável de cadeia leve (VL) compreendendo a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42.
[00422] Em algumas modalidades, o scFv compreende uma cadeia leve variável contendo a sequência de CDRL1 de SEQ ID NO: 35, uma sequência de CDRL2 de SEQ ID NO: 36 e uma sequência de CDRL3 de SEQ ID NO: 37 e/ou uma cadeia pesada variável contendo uma sequência de CDRH1 de SEQ ID NO: 38, uma sequência de CDRH2 de SEQ ID NO: 39 e uma sequência de CDRH3 de SEQ ID NO: 40. Em algumas modalidades, o scFv compreende uma região de cadeia pesada variável mencionada em SEQ ID NO: 41 e uma região de ca- deia leve variável mencionada em SEQ ID NO: 42. Em algumas moda- lidades, as cadeias pesada variável e leve variável são conectadas por um ligante. Em algumas modalidades, o ligante é mencionado na SEQ ID NO: 56. Em algumas modalidades, o scFv compreende, em ordem, uma VH, um ligante, e um VL. Em algumas modalidades, o scFv com- preende, em ordem, uma VL, um ligante, e uma VH. Em algumas mo- dalidades, o scFv é codificado por uma sequência de nucleotídeos mencionada em SEQ ID NO:57 ou uma sequência que exibe pelo me- nos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO:57. Em algumas modalidades, o scFv compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 43 ou uma sequência que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 43.
[00423] Em algumas modalidades, o scFv é derivado de SJ25C1. SJ25C1 é um anticorpo IgG1 monoclonal de camundongo criado con- tra células Nalm-1 e -16 que expressam CD19 de origem humana (Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). Em algumas mo- dalidades, o anticorpo SJ25C1 compreende CDRH1, H2 e H3 mencio- nadas em SEQ ID NOS: 47-49, respectivamente, e as sequências CDRL1, L2 e L3 mencionadas em SEQ ID NOS: 44-46, respectiva-
mente. Em algumas modalidades, o anticorpo SJ25C1 compreende a região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 50 e a região variável de cadeia leve (VL) compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51.
[00424] Em algumas modalidades, o scFv compreende uma cadeia leve variável contendo a sequência de CDRL1 da SEQ ID NO: 44, uma sequência de CDRL2 da SEQ ID NO: 45 e uma sequência de CDRL3 da SEQ ID NO: 46 e/ou uma cadeia pesada variável contendo uma sequência de CDRH1 da SEQ ID NO: 47, uma sequência de CDRH2 da SEQ ID NO: 48 e uma sequência de CDRH3 da SEQ ID NO: 49. Em algumas modalidades, o scFv compreende uma região de cadeia pesada variável mencionada em SEQ ID NO: 50 e uma região de ca- deia leve variável mencionada em SEQ ID NO: 51. Em algumas moda- lidades, a cadeia pesada variável e leve variável são conectadas por um ligante. Em algumas modalidades, o ligante é mencionado em SEQ ID NO: 52. Em algumas modalidades, o scFv compreende, em ordem, uma VH, um ligante e uma VL. Em algumas modalidades, o scFv compreende, em ordem, uma VL, um ligante e uma VH. Em algu- mas modalidades, o scFv compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 53 ou uma sequência que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO:
53.
[00425] Em algumas modalidades, o antígeno ou domínio de liga- ção ao antígeno é BCMA. Em algumas modalidades, o scFv contém uma VH e uma VL derivadas de um anticorpo ou um fragmento de an- ticorpo específico para BCMA. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga ao BCMA é ou contém uma VH e uma VL de um anticorpo ou fragmento de anticorpo mencionado nos Pedidos de Patentes Internacionais, Número de Publicação WO
2016/090327 e WO 2016/090320.
[00426] Em algumas modalidades, o antígeno ou domínio de liga- ção ao antígeno é GPRC5D. Em algumas modalidades, o scFv contém uma VH e uma VL derivadas de um anticorpo ou um fragmento de an- ticorpo específico para GPRC5D. Em algumas modalidades, o anticor- po ou fragmento de anticorpo que se liga a GPRC5D é ou contém uma VH e uma VL de um anticorpo ou fragmento de anticorpo mencionado nos Pedidos de Patentes Internacionais, Número de Publicação WO 2016/090329 e WO 2016/090312.
[00427] Em algumas modalidades, o antígeno é CD20. Em algumas modalidades, o scFv contém uma VH e uma VL derivadas de um anti- corpo ou um fragmento de anticorpo específico para CD20. Em algu- mas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a CD20 é um anticorpo que é ou é derivado de Rituximabe, tal como o Rituximabe scFv.
[00428] Em algumas modalidades, o antígeno é CD22. Em algumas modalidades, o scFv contém uma VH e uma VL derivadas de um anti- corpo ou um fragmento de anticorpo específico para CD22. Em algu- mas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a CD22 é um anticorpo que é ou é derivado de m971, como é scFv de m971.
[00429] Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quiméri- co inclui uma porção extracelular contendo um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em alguns aspectos, o receptor de antígeno quimérico inclui uma porção extracelular contendo o anticorpo ou fragmento e um domínio de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o anti- corpo ou fragmento inclui um scFv.
[00430] Em algumas modalidades, a porção de anticorpo do recep- tor recombinante, por exemplo, CAR, inclui ainda pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, como uma região de articulação, por exemplo, uma região de articulação de IgG4 e/ou uma região CH1/CL e/ou Fc. Em algumas modalidades, a região ou porção constante é de uma IgG humana, como IgG4 ou IgG1. Em al- guns aspectos, a porção da região constante serve como uma região espaçadora entre o componente de reconhecimento de antígeno, por exemplo, scFv e domínio de transmembrana. O espaçador pode ter um comprimento que proporcione responsividade aumentada da célula após a ligação ao antígeno, em comparação à ausência do espaçador. Espaçadores exemplares incluem, porém, não estão limitados aos descritos em Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19: 3153, núme- ro de publicação do Pedido de Patente internacional WO2014031687, Patente Norte-americana No. 8.822.647 ou pedido publicado No. US2014/0271635.
[00431] Em algumas modalidades, a região ou porção constante é de uma IgG humana, como IgG4 ou IgG1. Em algumas modalidades, o espaçador tem a sequência ESKYGPPCPPCP (mencionada em SEQ ID NO: 1) e é codificado pela sequência mencionada em SEQ ID NO:
2. Em algumas modalidades, o espaçador tem a sequência menciona- da em SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o espaçador tem a sequência mencionada em SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, a região ou porção constante é de IgD. Em algumas modalidades, o espaçador tem a sequência mencionada em SEQ ID NO: 5. Em algu- mas modalidades, o espaçador tem uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência para qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 3, 4 ou 5. Em algumas modalidades, o espaçador tem a sequência mencionada em SEQ ID NOS: 25-33. Em algumas modalidades, o espaçador tem uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %,
99 % ou mais de identidade de sequência para qualquer uma das SEQ ID NOS: 25-33.
[00432] Em algumas modalidades, o receptor de antígeno compre- ende um domínio intracelular ligado direta ou indiretamente ao domínio extracelular. Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quimé- rico inclui um domínio de transmembrana ligando o domínio extracelu- lar e o domínio de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular compreende um ITAM. Por exem- plo, em alguns aspectos, o domínio de reconhecimento de antígeno (por exemplo, domínio extracelular) geralmente está ligado a um ou mais componentes de sinalização intracelular, como componentes de sinalização que imitam a ativação através de um complexo do receptor de antígeno, como um complexo de TCR, no caso de um CAR e/ou sinal através de outro receptor de superfície celular. Em algumas mo- dalidades, o receptor quimérico compreende um domínio de trans- membrana ligado ou fundido entre o domínio extracelular (por exem- plo, scFv) e o domínio de sinalização intracelular. Assim, em algumas modalidades, o componente de ligação ao antígeno (por exemplo, an- ticorpo) está ligado a um ou mais domínios de sinalização de trans- membrana e intracelular.
[00433] Em uma modalidade, um domínio de transmembrana que naturalmente está associado a um dos domínios no receptor, por exemplo, CAR, é usado. Em alguns casos, o domínio de transmem- brana é selecionado ou modificado por substituição de aminoácidos para evitar a ligação de tais domínios aos domínios de transmembrana da mesma ou de diferentes proteínas de membrana de superfície para minimizar as interações com outros membros do complexo de recep- tor.
[00434] O domínio de transmembrana em algumas modalidades é derivado de uma fonte natural ou de uma sintética. Onde a fonte é na-
tural, em alguns aspectos, o domínio é derivado de qualquer proteína ligada à membrana ou de transmembrana. As regiões de transmem- brana incluem aquelas derivadas (isto é, compreendem pelo menos a(s) região(ões) de transmembrana da cadeia alfa, beta ou zeta do re- ceptor de células T, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Alternativamente, o domínio de transmembrana em algumas modalidades é sintético. Em alguns aspectos, o domínio de trans- membrana sintético compreende resíduos predominantemente hidro- fóbicos, como leucina e valina. Em alguns aspectos, um tripleto de fe- nilalanina, triptofano e valina será encontrado em cada extremidade de um domínio de transmembrana sintético. Em algumas modalidades, a ligação é por ligantes, espaçadores e/ou domínio(s) de transmembra- na. Em alguns aspectos, o domínio de transmembrana contém uma porção de transmembrana de CD28.
[00435] Em algumas modalidades, o domínio extracelular e o domí- nio de transmembrana podem ser ligados direta ou indiretamente. Em algumas modalidades, o domínio extracelular e a transmembrana es- tão ligados por um espaçador, como qualquer um aqui descrito. Em algumas modalidades, o receptor contém porção extracelular da molé- cula a partir da qual o domínio de transmembrana é derivado, como uma porção extracelular de CD28.
[00436] Entre os domínios de sinalização intracelular estão aqueles que imitam ou aproximam um sinal através de um receptor de antíge- no natural, um sinal através deste receptor em combinação com um receptor coestimulador e/ou um sinal através de um único receptor co- estimulador. Em algumas modalidades, um ligante oligo- ou polipeptí- dico curto, por exemplo, um ligante dentre 2 a 10 aminoácidos no comprimento, como um contendo glicinas e serinas, por exemplo, du- bleto de glicina-serina, está presente e forma uma ligação entre o do-
mínio de transmembrana e do domínio de sinalização citoplasmático do CAR.
[00437] A ativação de células T é, em alguns aspectos, descrita como mediada por duas classes de sequências de sinalização cito- plasmática: aquelas que iniciam a ativação primária dependente de antígeno através do TCR (sequências de sinalização citoplasmática primárias) e aquelas que agem de maneira independente de antígeno para fornecer um sinal secundário ou coestimulador (sequências de sinalização citoplasmática secundárias). Em alguns aspectos, o CAR inclui um ou ambos os componentes de sinalização.
[00438] O receptor, por exemplo, o CAR, geralmente inclui pelo menos um componente ou componentes de sinalização intracelular. Em alguns aspectos, o CAR inclui uma sequência de sinalização cito- plasmática primária que regula a ativação primária do complexo de TCR. As sequências de sinalização citoplasmática primárias que atu- am de maneira estimuladora podem conter motivos de sinalização que são conhecidos como motivos de ativação à base de tirosina imunor- receptora ou ITAMs. Exemplos de ITAM contendo sequências de sina- lização citoplasmática primárias incluem aquelas derivadas da cadeia CD3 zeta, FcR gama, CD3 gama, CD3 delta e CD3 epsilon. Em algu- mas modalidades, a(s) molécula(s) de sinalização citoplasmática no CAR contém(contêm) um domínio de sinalização citoplasmática, uma porção do mesmo ou uma sequência derivada de CD3 zeta.
[00439] Em algumas modalidades, o receptor inclui um componente intracelular de um complexo de TCR, como uma cadeia de CD3 de TCR que medeia a ativação e citotoxicidade de células T, por exemplo, cadeia de CD3 zeta. Assim, em alguns aspectos, a porção de ligação ao antígeno está ligada a um ou mais módulos de sinalização celular. Em algumas modalidades, os módulos de sinalização celular incluem o domínio de transmembrana de CD3, domínios de sinalização intracelu-
lar de CD3 e/ou outros domínios de transmembrana de CD3. Em al- gumas modalidades, o receptor, por exemplo, CAR, inclui ainda uma porção de uma ou mais moléculas adicionais, como o receptor de Fc , CD8, CD4, CD25 ou CD16. Por exemplo, em alguns aspectos, o CAR ou outro receptor quimérico inclui uma molécula quimérica entre CD3- zeta (CD3-ζ) ou receptor de Fc  e CD8, CD4, CD25 ou CD16.
[00440] Em algumas modalidades, na ligação do CAR ou outro re- ceptor quimérico, o domínio citoplasmático ou o domínio de sinaliza- ção intracelular do receptor ativa pelo menos uma das funções ou res- postas efetoras normais da célula imune, por exemplo, célula T modifi- cada para expressar o CAR. Por exemplo, em alguns contextos, o CAR induz uma função de uma célula T, como atividade citolítica ou atividade de T auxiliar, como secreção de citocinas ou outros fatores. Em algumas modalidades, uma porção truncada de um domínio de sinalização intracelular de um componente dp receptor de antígeno ou molécula coestimuladora é usada no lugar de uma cadeia imunoesti- muladora intacta, por exemplo, se ela transduz o sinal da função efeto- ra. Em algumas modalidades, o domínio ou domínios de sinalização intracelular incluem as sequências citoplasmáticas do receptor de célu- las T (TCR) e, em alguns aspectos, também os de correceptores que no contexto natural agem em conjunto com tais receptores para iniciar a transdução de sinal após o envolvimento do receptor de antígeno.
[00441] No contexto de um TCR natural, a ativação completa ge- ralmente requer não apenas a sinalização através do TCR, porém, também um sinal coestimulador. Assim, em algumas modalidades, pa- ra promover a ativação completa, um componente para gerar sinal se- cundário ou coestimulador também é incluído no CAR. Em outras mo- dalidades, o CAR não inclui um componente para gerar um sinal coes- timulador. Em alguns aspectos, um CAR adicional é expresso na mesma célula e fornece o componente para gerar o sinal secundário ou coestimulador.
[00442] Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quiméri- co contém um domínio intracelular de uma molécula coestimuladora de células T. Em algumas modalidades, o CAR inclui um domínio de sinalização e/ou porção de transmembrana de um receptor coestimu- lador, como CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 e ICOS. Em alguns aspec- tos, o mesmo CAR inclui ambos componentes ativadores e coestimu- ladores. Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quimérico contém um domínio intracelular derivado de uma molécula coestimula- dora de células T ou uma sua variante funcional, tal como entre o do- mínio de transmembrana e o domínio de sinalização intracelular. Em alguns aspectos, a molécula coestimuladora de células T é CD28 ou 41BB.
[00443] Em algumas modalidades, o domínio de ativação é incluído dentro de um CAR, enquanto o componente coestimulador é fornecido por outro CAR que reconhece outro antígeno. Em algumas modalida- des, os CARs incluem CARs ativadores ou estimuladores, CARs coes- timuladores, ambos expressos na mesma célula (veja, WO2014/055668). Em alguns aspectos, as células incluem um ou mais CAR estimuladores ou ativadores e/ou um CAR coestimulador. Em algumas modalidades, as células incluem ainda CARs inibidores (iCARs, veja Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December, 2013), como um CAR que reconhece um antígeno diferente daquele associado a e/ou específico para a doença ou condição pela qual um sinal de ativação liberado através do CAR de direcionamento da doen- ça é diminuído ou inibido pela ligação do CAR inibidor ao seu ligante, por exemplo, para reduzir os efeitos fora do alvo.
[00444] Em algumas modalidades, os dois receptores induzem, respectivamente, um sinal de ativação e um inibidor à célula, de modo que a ligação de um dos receptores ao seu antígeno ativa a célula ou induz uma resposta, porém, a ligação do segundo receptor inibidor ao seu antígeno induz um sinal que suprime ou diminui esta resposta. Exemplos são combinações de CARs ativadores e CARs inibidores (iCARs). Esta estratégia pode ser usada, por exemplo, para reduzir a possibilidade de efeitos fora do alvo no contexto em que o CAR ativa- dor liga um antígeno expresso em uma doença ou condição, porém, que também é expresso em células normais, e o receptor inibidor liga- se a um antígeno separado que é expresso nas células normais, po- rém, não nas células da doença ou condição.
[00445] Em alguns aspectos, o receptor quimérico é ou inclui um CAR inibidor (por exemplo, iCAR) e inclui componentes intracelulares que diminuem ou suprimem uma resposta imune, como uma resposta promovida por ITAM coestimulador e/ou ITAM na célula. Exemplos de tais componentes de sinalização intracelular são aqueles encontrados nas moléculas de ponto de checagem imune, incluindo PD-1, CTLA4, LAG3, BTLA, OX2R, TIM-3, TIGIT, LAIR-1, receptores de PGE2, re- ceptores de EP2/4 de adenosina, incluindo A2AR. Em alguns aspec- tos, a célula modificada inclui um CAR inibidor, incluindo um domínio de sinalização de ou derivado de uma tal molécula inibitória, de modo que sirva para diminuir a resposta da célula, por exemplo, aquela in- duzida por um CAR ativador e/ou coestimulador.
[00446] Em certas modalidades, o domínio de sinalização intracelu- lar compreende um domínio de transmembrana e de sinalização de CD28 ligado a um domínio intracelular de CD3 (por exemplo, CD3- zeta). Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular compreende domínios coestimuladores de CD28 e de CD137 (4-1BB, TNFRSF9) quiméricos, ligados a um domínio intracelular de CD3 zeta.
[00447] Em algumas modalidades, o CAR abrange um ou mais, por exemplo, dois ou mais domínios coestimuladores e um domínio de ati- vação, por exemplo, domínio de ativação primário, na porção cito-
plasmática. CARs exemplares incluem componentes intracelulares de CD3-zeta, CD28 e 4-1BB.
[00448] Em algumas modalidades, o receptor de antígeno inclui ainda um marcador e/ou células que expressam o CAR ou outro re- ceptor de antígeno inclui ainda um marcador substituto, como um mar- cador de superfície celular, que pode ser usado para confirmar a transdução ou modificação da célula para expressar o receptor. Em alguns aspectos, o marcador inclui todo ou parte (por exemplo, forma truncada) de CD34, um NGFR ou receptor do fator de crescimento epidérmico, como a versão truncada deste receptor de superfície celu- lar (por exemplo, tEGFR). Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o marcador está operacionalmente ligado a um polinu- cleotídeo que codifica para uma sequência de ligante, como uma se- quência de ligante clivável, por exemplo, T2A. Por exemplo, um mar- cador e, opcionalmente, uma sequência de ligante, podem ser qual- quer como descrito no pedido de patente publicado No. WO2014031687. Por exemplo, o marcador pode ser um EGFR trunca- do (tEGFR) que é, opcionalmente, ligado a uma sequência de ligante, como uma sequência de ligante clivável de T2A.
[00449] Um polipeptídeo exemplar para um EGFR truncado (por exemplo, tEGFR) compreende a sequência de aminoácidos mencio- nada em SEQ ID NO: 7 ou 16 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência para SEQ ID NO: 7 ou 16. Uma sequência de ligante de T2A exemplar compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 6 ou 17 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de se- quência para SEQ ID NO: 6 ou 17.
[00450] Em algumas modalidades, o marcador é uma molécula, por exemplo, proteína da superfície celular, não encontrada naturalmente nas células T ou não encontrada naturalmente na superfície das célu- las T ou uma porção das mesmas. Em algumas modalidades, a molé- cula é uma molécula não própria, por exemplo, proteína não própria, isto é, uma que não é reconhecida como "própria" pelo sistema imune do hospedeiro no qual as células serão transferidas adotivamente.
[00451] Em algumas modalidades, o marcador não tem função te- rapêutica e/ou não produz outro efeito além de ser usado como um marcador para engenharia genética, por exemplo, para selecionar cé- lulas modificadas com sucesso. Em outras modalidades, o marcador pode ser uma molécula terapêutica ou molécula que de outra maneira exerce algum efeito desejado, como um ligante para uma célula a ser encontrada in vivo, como uma molécula do ponto de checagem coes- timuladora ou imune para realçar e/ou diminuir as respostas das célu- las na transferência adotiva e encontrar com o ligante.
[00452] Em alguns casos, os CARs são referidos como CARs de primeira, segunda e/ou terceira geração. Em alguns aspectos, um CAR de primeira geração é aquele que apenas fornece um sinal indu- zido pela cadeia de CD3 na ligação ao antígeno; em alguns aspectos, um CAR de segunda geração é aquele que fornece um tal sinal e sinal coestimulador, como aquele que inclui um domínio de sinalização in- tracelular de um receptor coestimulador como CD28 ou CD137; em alguns aspectos, um CAR de terceira geração é aquele que inclui múl- tiplos domínios coestimuladores de diferentes receptores coestimula- dores.
[00453] Por exemplo, em algumas modalidades, o CAR contém um anticorpo, por exemplo, um fragmento de anticorpo, como um scFv, específico para um antígeno, incluindo qualquer um como descrito, um domínio de transmembrana que é ou contém uma porção de trans-
membrana de CD28 ou uma variante funcional da mesma, e um domí- nio de sinalização intracelular contendo uma porção de sinalização de CD28 ou uma variante funcional da mesmo e uma porção de sinaliza- ção de CD3 zeta ou sua variante funcional. Em algumas modalidades, o CAR contém um anticorpo, por exemplo, fragmento de anticorpo, como um scFv, específico para um antígeno, incluindo qualquer um como descrito, um domínio de transmembrana que é ou contém uma porção de transmembrana de CD28 ou uma variante funcional da mesma, e um domínio de sinalização intracelular contendo uma por- ção de sinalização de uma variante de 4-1BB ou sua variante funcional e uma porção de sinalização de CD3 zeta ou sua variante funcional. Em algumas destas modalidades, o receptor inclui ainda um espaça- dor contendo uma porção de uma molécula de Ig, tal como uma molé- cula de Ig humana, tal como uma articulação de Ig, por exemplo, uma articulação de IgG4, como um espaçador apenas de articulação.
[00454] Em algumas modalidades, o domínio de transmembrana do receptor recombinante, por exemplo, o CAR, é ou inclui um domínio de transmembrana do CD28 humano (por exemplo, Acesso No. P01747.1) ou sua variante, como um domínio de transmembrana que compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência para SEQ ID NO: 8; em algumas modalidades, a porção contendo domínio de transmembrana do receptor recombinante compreende a sequência de aminoácidos mencionada em SEQ ID NO: 9 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência.
[00455] Em algumas modalidades, o(s) componente(s) de sinaliza-
ção intracelular do receptor recombinante, por exemplo, o CAR, con- tém um domínio de sinalização coestimulador intracelular de CD28 humano ou uma variante funcional ou porção do mesmo, como um domínio com uma substituição de LL para GG nas posições 186-187 de uma proteína CD28 nativa. Por exemplo, o domínio de sinalização intracelular pode compreender a sequência de aminoácidos mencio- nada em SEQ ID NO: 10 ou 11 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência para SEQ ID NO: 10 ou 11. Em algumas modalidades, o domínio intracelular compreende um domínio de sinalização coestimu- lador intracelular de 4-1BB (por exemplo, Acesso No. Q07011.1) ou variante funcional ou porção da mesma, como a sequência de amino- ácidos mencionada em SEQ ID NO: 12 ou uma sequência de aminoá- cidos que exibe pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de iden- tidade de sequência para SEQ ID NO: 12.
[00456] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intrace- lular do receptor recombinante, por exemplo, o CAR, compreende um domínio de sinalização estimulador de CD3 zeta humano ou sua vari- ante funcional, como um domínio citoplasmático 112 AA da isoforma 3 de CD3ζ humano (Acesso No.: P20963.2) ou um domínio de sinaliza- ção de CD3 zeta como descrito na Patente Norte-americana No. 7,446,190 ou Patente Norte-americana No. 8,911,993. Por exemplo, em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular com- preende a sequência de aminoácidos como mencionada em SEQ ID NO: 13, 14 ou 15 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência para SEQ ID NO: 13, 14 ou 15.
[00457] Em alguns aspectos, o espaçador contém apenas uma re- gião de articulação de um IgG, como apenas uma articulação de IgG4 ou IgG1, como a articulação apenas do espaçador mencionado em SEQ ID NO: 1. Em outras modalidades, o espaçador é ou contém uma articulação de Ig, por exemplo, uma articulação derivada de IgG4, op- cionalmente ligada a um domínio CH2 e/ou CH3. Em algumas modali- dades, o espaçador é uma articulação de Ig, por exemplo, uma articu- lação de IgG4, ligada aos domínios CH2 e CH3, como mencionado em SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o espaçador é uma articula- ção de Ig, por exemplo, uma articulação de IgG4, ligada apenas a um domínio CH3, tal como mencionado em SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o espaçador é ou compreende uma sequência rica em glicina-serina ou outro ligante flexível, como ligantes flexíveis conheci- dos.
[00458] Por exemplo, em algumas modalidades, o CAR inclui um anticorpo, como um fragmento de anticorpo, incluindo scFvs, um es- paçador, como um espaçador que contém uma porção de uma molé- cula de imunoglobulina, como uma região de articulação e/ou uma ou mais regiões constantes de uma molécula de cadeia pesada, como um espaçador contendo articulação de Ig, um domínio de transmembrana contendo todo ou uma porção de um domínio de transmembrana deri- vado de CD28, um domínio de sinalização intracelular derivado de CD28 e um domínio de sinalização de CD3 zeta. Em algumas modali- dades, o CAR inclui um anticorpo ou fragmento, como scFv, um espa- çador como qualquer um dos espaçadores que contêm articulações de Ig, um domínio de transmembrana derivado de CD28, um domínio de sinalização intracelular derivado de 4-1BB e um domínio de sinaliza- ção derivado de CD3.
[00459] Marcadores substitutos exemplares podem incluir formas truncadas de polipeptídeos de superfície celular, como formas trunca-
das que não são funcionais e que não transduzem ou não são capa- zes de transduzir um sinal ou um sinal normalmente transduzido pela forma de tamanho natural do polipeptídeo de superfície celular e/ou não são ou não são capazes de internalizar.
Polipeptídeos de superfí- cie celular truncados exemplares, incluindo formas truncadas de fato- res de crescimento ou outros receptores, como um receptor de fator de crescimento epidérmico humano truncado 2 (tHER2), um receptor de fator de crescimento epidérmico truncado (tEGFR, sequência de tEGFR exemplar mencionada em 7 ou 16) ou um antígeno de mem- brana específico de próstata (PSMA) ou sua forma modificada.
O tEGFR pode conter um epítopo reconhecido pelo anticorpo cetuximabe (Erbitux®) ou outro anticorpo terapêutico anti-EGFR ou molécula de ligação, que pode ser usado para identificar ou selecionar células que foram modificadas para expressar a construção de tEGFR e uma pro- teína exógena codificada, e/ou eliminar ou separar células que expres- sam a proteína exógena codificada.
Veja, Patente Norte-americana No. 8.802.374 e Liu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434). Em alguns aspectos, o marcador, por exemplo, marcador substituto, inclui todo ou parte (por exemplo, forma truncada) de CD34, um NGFR, um CD19 ou um CD19 truncado, por exemplo, um CD19 não humano truncado ou receptor do fator de crescimento epidérmico (por exemplo, tEGFR). Em algumas modalidades, o marcador é ou com- preende uma proteína fluorescente, como proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente verde realçada (EGFP), como GFP su- per-duplicada (sfGFP), proteína fluorescente vermelha (RFP), como tdTomato , mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed ou DsRed2, prote- ína fluorescente de ciano (CFP), proteína fluorescente azul verde (BFP), proteína fluorescente azul realçada (EBFP) e proteína fluores- cente amarela (YFP) e suas variantes, incluindo variantes de espécies, variantes monoméricas e variantes otimizadas e/ou realçadas por có-
don das proteínas fluorescentes. Em algumas modalidades, o marca- dor é ou compreende uma enzima, como uma luciferase, o gene lacZ de E. coli, fosfatase alcalina, fosfatase alcalina embrionária secretada (SEAP), cloranfenicol acetil transferase (CAT). Exemplos de genes re- pórteres emissores de luz incluem luciferase (luc), β-galactosidase, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), β-glicuronidase (GUS) ou suas variantes.
[00460] Em algumas modalidades, o marcador é um marcador de seleção. Em algumas modalidades, o marcador de seleção é ou com- preende um polipeptídeo que confere resistência a agentes ou fárma- cos exógenos. Em algumas modalidades, o marcador de seleção é um gene de resistência a antibióticos. Em algumas modalidades, o marca- dor de seleção é um gene de resistência a antibióticos que confere re- sistência a antibióticos a uma célula de mamífero. Em algumas moda- lidades, o marcador de seleção é ou compreende um gene de resis- tência à Puromicina, um gene de resistência à Higromicina, um gene de resistência à Blasticidina, um gene de resistência à Neomicina, um gene de resistência à Geneticina ou um gene de resistência à Zeocina ou uma forma modificada dos mesmos.
[00461] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o marcador está operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que codi- fica para uma sequência de ligante, como uma sequência de ligante clivável, por exemplo, um T2A. Por exemplo, um marcador e, opcio- nalmente, uma sequência de ligante, pode ser qualquer como descrito em PCT Pub. WO2014031687.
[00462] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico que codificam estas construções de CAR incluem ainda uma sequên- cia que codifica um elemento de salto de ribossoma T2A e/ou uma se- quência de tEGFR, por exemplo, a jusante da sequência que codifica o CAR. Em algumas modalidades, a sequência codifica um elemento de salto ribossômico T2A mencionado em SEQ ID NO: 6 ou 17, ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de sequência para SEQ ID NO: 6 ou 17.
[00463] Em algumas modalidades, as células T que expressam um receptor de antígeno (por exemplo, CAR) também podem ser geradas para expressar um EGFR truncado (EGFRt) como um epítopo de sele- ção não imunogênico (por exemplo, por introdução de uma construção que codifica o CAR e EGFRt separados por um comutador de ribos- soma T2A para expressar duas proteínas da mesma construção), que, então, pode ser usado como um marcador para detectar tais células (veja, por exemplo, Patente Norte-americana No. 8.802.374). Em al- gumas modalidades, a sequência codifica uma sequência de tEGFR mencionada em SEQ ID NO: 7 ou 16, ou uma sequência de aminoáci- dos que exibe pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de identi- dade de sequência para SEQ ID NO: 7 ou 16. Em alguns casos, o peptídeo, como T2A, pode fazer com que o ribossoma pule (salto do ribossomo) a síntese de uma ligação de peptídeo no C-terminal de um elemento 2A, levando à separação entre o final da sequência 2A e o próximo peptídeo a jusante (veja, por exemplo, de Felipe. Genetic Va- ccines and Ther. 2:13 (2004) e deFelipe et al. Traffic 5: 616-626 (2004)). Muitos elementos 2A são conhecidos. Exemplos de sequên- cias 2A que podem ser usadas nos métodos e ácidos nucleicos aqui descritos, sem limitação, sequências 2A do vírus da doença do pé e boca (F2A, por exemplo, SEQ ID NO: 21), vírus da rinite equina A (E2A, por exemplo, SEQ ID NO: 20), vírus Thosea asigna (T2A, por exemplo, SEQ ID NO: 6 ou 17) e teschovirus-1 de porcino (P2A, por exemplo, SEQ ID NO: 18 ou 19 ) como descrito na Publicação de Pa- tente Norte-americana No. 20070116690.
[00464] Os receptores recombinantes, como CARs, expressos pe- las células administradas ao indivíduo geralmente reconhecem ou se ligam especificamente a uma molécula que é expressa em, associada a e/ou específica para a doença ou condição ou células da mesma a serem tratadas. Na ligação específica à molécula, por exemplo, antí- geno, o receptor geralmente libera um sinal imunoestimulador, como um sinal transduzido por ITAM, na célula, promovendo assim uma res- posta imune direcionada à doença ou condição. Por exemplo, em al- gumas modalidades, as células expressam um CAR que se liga espe- cificamente a um antígeno expresso por uma célula ou tecido da do- ença ou condição ou associado à doença ou condição. B. TCRs
[00465] Em algumas modalidades, são fornecidas células modifica- das, como células T, que expressam um receptor de célula T (TCR) ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo que reconhece um epí- topo peptídico ou epítopo da célula T de um polipeptídeo alvo, como um antígeno de um tumor, proteína viral ou autoimune.
[00466] Em algumas modalidades, um "receptor de célula T" ou "TCR" é uma molécula que contém cadeias α e β variáveis (também conhecidas como TCRα e TCRβ, respectivamente) ou cadeias γ e δ variáveis (também conhecidas como TCRα e TCRβ, respectivamente), ou suas porções de ligação ao antígeno, e que é capaz de se ligar es- pecificamente a um peptídeo ligado a uma molécula de MHC. Em al- gumas modalidades, o TCR está na forma αβ. Tipicamente, os TCRs que existem nas formas αβ e γδ são geralmente estruturalmente se- melhantes, mas as células T que as expressam podem ter sítios ou funções anatômicas distintas. Um TCR pode ser encontrado na super- fície de uma célula ou na forma solúvel. Geralmente, um TCR é encon- trado na superfície das células T (ou linfócitos T), onde geralmente é responsável pelo reconhecimento de antígenos ligados às moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC).
[00467] Salvo indicação em contrário, o termo "TCR" deve ser en- tendido como abrangendo TCRs completos, bem como porções de ligação ao antígeno ou seus fragmentos de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o TCR é um TCR intacto ou completo, incluindo TCRs na forma αβ ou γδ. Em algumas modalidades, o TCR é uma porção de ligação a antígeno que é menor que um TCR de tamanho natural, mas que se liga a um peptídeo específico ligado a uma molé- cula de MHC, como se liga a um complexo de peptídeo de MHC. Em alguns casos, uma porção ou fragmento de ligação ao antígeno de um TCR pode conter apenas uma porção dos domínios estruturais de um TCR de tamanho natural ou intacto, mas ainda é capaz de ligar o epí- topo peptídico, como o complexo MHC-peptídeo, ao qual o TCR com- pleto se liga. Em alguns casos, uma porção de ligação ao antígeno contém os domínios variáveis de um TCR, como a cadeia α variável e a cadeia β variável de um TCR, suficientes para formar um sítio de li- gação para a ligação a um complexo MHC-peptídeo específico. Ge- ralmente, as cadeias variáveis de um TCR contêm regiões determinan- tes de complementaridade envolvidas no reconhecimento do peptídeo, MHC e/ou complexo MHC-peptídeo.
[00468] Em algumas modalidades, os domínios variáveis do TCR contêm alças hipervariáveis, ou regiões determinantes de complemen- taridade (CDRs), que geralmente são os principais contribuintes para o reconhecimento de antígenos e capacidades e especificidade de liga- ção. Em algumas modalidades, uma CDR de um TCR ou uma combi- nação dos mesmos forma todo ou substancialmente todo o sítio de ligação ao antígeno de uma dada molécula de TCR. As várias CDRs dentro de uma região variável de uma cadeia de TCR geralmente são separadas por regiões estruturais (FRs), que geralmente exibem me- nos variabilidade entre as moléculas de TCR em comparação com as
CDRs (veja, por exemplo, Jores et al., Proc. Nat'l Acad Sci. USA 87: 9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7: 3745, 1988; veja, também Le- franc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003). Em algumas modali- dades, a CDR3 é a principal CDR responsável pela ligação ou especi- ficidade do antígeno ou é o mais importante entre as três CDRs em uma determinada região variável do TCR para reconhecimento do an- tígeno e/ou para interação com a porção peptídica processada do complexo peptídeo-MHC. Em alguns contextos, a CDR1 da cadeia alfa pode interagir com a parte N-terminal de certos peptídeos antigênicos. Em alguns contextos, CDR1 da cadeia beta pode interagir com a parte C-terminal do peptídeo. Em alguns contextos, a CDR2 contribui mais fortemente para ou é a principal CDR responsável pela interação ou reconhecimento da porção MHC do complexo MHC-peptídeo. Em al- gumas modalidades, a região variável da cadeia β pode conter uma região hipervariável adicional (CDR4 ou HVR4), que geralmente está envolvida na ligação de superantígenos e não no reconhecimento de antígenos (Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8: 411-426) .
[00469] Em algumas modalidades, um TCR também pode conter um domínio constante, um domínio de transmembrana e/ou uma cau- da citoplasmática curta (veja, por exemplo, Janeway et al., Immunobio- logy: The Immune System in Disease, 3rd Ed., Current Biology Publi- cations, por exemplo, 4:33, 1997). Em alguns aspectos, cada cadeia do TCR pode possuir um domínio variável da imunoglobulina N- terminal, um domínio constante da imunoglobulina, uma região de transmembrana e uma cauda citoplasmática curta na extremidade C- terminal. Em algumas modalidades, um TCR está associado a proteí- nas invariantes do complexo CD3 envolvidas na mediação da transdu- ção de sinal.
[00470] Em algumas modalidades, uma cadeia de TCR contém um ou mais domínio constante. Por exemplo, a porção extracelular de uma determinada cadeia de TCR (por exemplo, cadeia α ou cadeia β) pode conter dois domínios tipo imunoglobulina, como um domínio vari- ável (por exemplo, Vα ou Vβ; tipicamente os aminoácidos 1 a 116 so- bre a numeração de Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunolo- gical Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health 1991, 5ª ed.) e um domínio cons- tante (por exemplo, domínio constante da cadeia α ou Cα, tipicamente posições 117 a 259 da cadeia com base na numeração de Kabat ou domínio constante da cadeia β ou ou Cβ, tipicamente posições 117 a 295 da cadeia com base em Kabat) adjacente à membrana celular. Por exemplo, em alguns casos, a porção extracelular do TCR formada pelas duas cadeias contém dois domínios constantes proximais à membrana e dois domínios variáveis distais à membrana, cujos domí- nios variáveis contêm CDRs. O domínio constante do TCR pode con- ter sequências de conexão curtas nas quais um resíduo de cisteína forma uma ligação de dissulfeto, ligando assim as duas cadeias do TCR. Em algumas modalidades, um TCR pode ter um resíduo de cis- teína adicional em cada uma das cadeias α e β, de modo que o TCR contenha duas ligações de dissulfeto nos domínios constantes.
[00471] Em algumas modalidades, as cadeias de TCR contêm um domínio de transmembrana. Em algumas modalidades, o domínio de transmembrana é carregado positivamente. Em alguns casos, a cadeia de TCR contém uma cauda citoplasmática. Em alguns casos, a estru- tura permite que o TCR se associe a outras moléculas como CD3 e suas subunidades. Por exemplo, um TCR contendo domínios constan- tes com uma região de transmembrana pode ancorar a proteína na membrana celular e associar-se a subunidades invariantes do apare- lho ou complexo de sinalização de CD3. As caudas intracelulares das subunidades de sinalização de CD3 (por exemplo, cadeias CD3γ, CD3δ, CD3ε e CD3ζ) contêm um ou mais motivos de ativação à base de tirosina imunorreceptora ou ITAM que estão envolvidos na capaci- dade de sinalização do complexo de TCR.
[00472] Em algumas modalidades, o TCR pode ser um heterodíme- ro de duas cadeias α e β (ou opcionalmente γ e δ) ou pode ser uma construção de TCR de cadeia única. Em algumas modalidades, o TCR é um heterodímero contendo duas cadeias separadas (cadeias α e β ou cadeias γ e δ) que estão ligadas, como por uma ligação de dissulfe- to ou ligações de dissulfeto.
[00473] Em algumas modalidades, o TCR pode ser gerado a partir de uma sequência conhecida de TCR, como sequências de cadeias Vα, β, para as quais uma sequência de codificação substancialmente completa está facilmente disponível. Os métodos para obter sequên- cias de TCR de tamanho natural, incluindo sequências da cadeia V, de fontes celulares são bem conhecidos. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos que codificam o TCR podem ser obtidos a partir de uma variedade de fontes, como por amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) de ácidos nucleicos que codificam o TCR dentro ou isolados de uma determinada célula ou células, ou síntese de se- quências de DNA de TCR disponível publicamente.
[00474] Em algumas modalidades, o TCR é obtido a partir de uma fonte biológica, como células de uma célula T (por exemplo, célula T citotóxica), hibridomas de células T ou outra fonte publicamente dispo- nível. Em algumas modalidades, as células T podem ser obtidas a par- tir de células isoladas in vivo. Em algumas modalidades, o TCR é um TCR tipicamente selecionado. Em algumas modalidades, o TCR é um TCR restrito a neoepítopos. Em algumas modalidades, as células T podem ser um hibridoma ou clone de célula T cultivado. Em algumas modalidades, o TCR ou sua porção de ligação ao antígeno ou seu fra- gmento de ligação ao antígeno pode ser gerado sinteticamente a partir do conhecimento da sequência do TCR.
[00475] Em algumas modalidades, o TCR é gerado a partir de um TCR identificado ou selecionado a partir do rastreamento de uma bibli- oteca de TCRs candidatos contra um antígeno polipeptídico alvo ou seu epítopo de célula T alvo.
As bibliotecas de TCR podem ser gera- das por amplificação do repertório de Vα e Vβ a partir de células T iso- ladas de um indivíduo, incluindo células presentes em PBMCs, baço ou outro órgão linfoide.
Em alguns casos, as células T podem ser am- plificadas a partir de linfócitos infiltrantes de tumores (TILs). Em algu- mas modalidades, as bibliotecas de TCR podem ser geradas a partir de células T CD4+ ou CD8+. Em algumas modalidades, os TCRs po- dem ser amplificados a partir de uma fonte de células T de um indiví- duo saudável normal, isto é, bibliotecas normais de TCR.
Em algumas modalidades, os TCRs podem ser amplificados a partir de uma fonte de células T de um indivíduo doente, isto é, bibliotecas de TCR doen- tes.
Em algumas modalidades, os iniciadores degenerados são usados para amplificar o repertório genético de Vα e Vβ, como por RT-PCR em amostras, como células T, obtidas de seres humanos.
Em algumas modalidades, a biblioteca scTv s podem ser montados a partir de bibli- otecas Vα e Vβ ingênuas nas quais os produtos amplificados são clo- nados ou montados para serem separados por um ligante.
Dependen- do da fonte do assunto e das células, as bibliotecas podem ser especí- ficas do alelo HLA.
Alternativamente, em algumas modalidades, as bi- bliotecas de TCR podem ser geradas por mutagênese ou diversifica- ção de uma molécula de TCR parental ou de andaime.
Em alguns as- pectos, os TCRs são sujeitos a evolução direcionada, como por muta- gênese, por exemplo, da cadeia α ou β.
Em alguns aspectos, resíduos específicos nas CDRs do TCR são alterados.
Em algumas modalida- des, os TCRs selecionados podem ser modificados por maturação por afinidade.
Em algumas modalidades, as células T específicas do antí- geno podem ser selecionadas, como por meio de triagem para avaliar a atividade de CTL contra o peptídeo. Em alguns aspectos, TCRs, por exemplo, presente nas células T específicas do antígeno, pode ser se- lecionado, como por atividade de ligação, por exemplo, afinidade ou avidez particular para o antígeno.
[00476] Em algumas modalidades, o TCR ou sua porção de ligação ao antígeno é aquela que foi modificada ou construída. Em algumas modalidades, métodos de evolução direcionada são usados para gerar TCRs com propriedades alteradas, como com maior afinidade para um complexo específico de MHC-peptídeo. Em algumas modalidades, a evolução direcionada é alcançada por métodos de exibição, incluindo, mas não limitado a, exibição de leveduras (Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA, 97, 5387-92), exibição de fagos (Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349- 54), ou exibição de células T (Chervin et al. (2008) J Immunol Me- thods, 339, 175-84). Em algumas modalidades, as métodos de exibi- ção envolvem manipulação ou modificação de um TCR conhecido, de origem ou referência. Por exemplo, em alguns casos, um TCR tipo selvagem pode ser usado como modelo para produzir TCRs mutage- nizados nos quais um ou mais resíduos das CDRs são mutados, e mu- tantes com uma propriedade alterada desejada, como maior afinidade por um antígeno-alvo desejado, são selecionados.
[00477] Em algumas modalidades, peptídeos de um polipeptídeo alvo para uso na produção ou geração de um TCR de interesse são conhecidos ou podem ser facilmente identificados. Em algumas moda- lidades, peptídeos adequados para uso na geração de TCRs ou por- ções de ligação ao antígeno podem ser determinados com base na presença de um motivo restrito a HLA em um polipeptídeo alvo de inte- resse, como um polipeptídeo alvo descrito abaixo. Em algumas moda- lidades, os peptídeos são identificados usando modelos de previsão de computador disponíveis. Em algumas modalidades, para a previsão de sítios de ligação ao MHC classe I, esses modelos incluem, mas não estão limitados a, ProPred1 (Singh e Raghava (2001) Bioinformatics 17 (12): 1236-1237 e SYFPEITHI (veja, Schuler et al. (2007) ) Immu- noinformtics Methods in Molecular Biology, 409 (1): 75-93, 2007. Em algumas modalidades, o epítopo restrito ao MHC é HLA-A0201, que é expresso em cerca de 39-46 % de todos os caucasianos e, portanto, representa um escolha adequada do antígeno MHC para uso na pre- paração de um TCR ou outra molécula de ligação ao MHC-peptídeo.
[00478] São conhecidos motivos de ligação ao HLA-A0201 e os sí- tios de clivagem para proteassomas e imunoproteassomas usando modelos de previsão para computador. Para prever sítios de ligação ao MHC classe I, esses modelos incluem, mas não estão limitados a, ProPred1 (descrito em mais detalhes em Singh e Raghava, ProPred: previsão de sítios de ligação a HLA-DR. BIOINFORMATICS 17 (12): 1236-1237 2001) e SYFPEITHI (veja, Schuler et al. SYFPEITHI, Data- base for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoinforma- tics Methods in Molecular Biology, vol 409 (1): 75-93 2007)
[00479] Em algumas modalidades, o TCR ou sua porção de ligação ao antígeno pode ser uma proteína natural produzida de forma recom- binante ou uma forma mutada da mesma na qual uma ou mais propri- edades, como característica de ligação, foram alteradas. Em algumas modalidades, um TCR pode ser derivado de uma de várias espécies animais, como humano, camundongo, rato ou outro mamífero. Um TCR pode estar ligado à célula ou na forma solúvel. Em algumas mo- dalidades, para fins dos métodos fornecidos, o TCR está na forma li- gada à célula, expressa na superfície de uma célula.
[00480] Em algumas modalidades, o TCR é um TCR de tamanho natural. Em algumas modalidades, o TCR é uma porção de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o TCR é um TCR dimérico (dTCR). Em algumas modalidades, o TCR é um TCR de cadeia única
(sc-TCR). Em algumas modalidades, um dTCR ou scTCR tem as es- truturas descritas em WO 03/020763, WO 04/033685, WO2011/044186.
[00481] Em algumas modalidades, o TCR contém uma sequência correspondente à sequência de transmembrana. Em algumas modali- dades, o TCR contém uma sequência correspondente às sequências citoplasmáticas. Em algumas modalidades, o TCR é capaz de formar um complexo de TCR com CD3. Em algumas modalidades, qualquer um dos TCRs, incluindo um dTCR ou scTCR, pode ser ligado a domí- nios de sinalização que produzem um TCR ativo na superfície de uma célula T. Em algumas modalidades, o TCR é expresso na superfície das células.
[00482] Em algumas modalidades, um dTCR contém um primeiro polipeptídeo em que uma sequência correspondente a uma sequência de região variável da cadeia de TCR α é fundida ao N-terminal de uma sequência correspondente a uma sequência extracelular da região constante da cadeia de TCR α e um segundo polipeptídeo em que uma sequência correspondente a uma sequência de região variável da cadeia de TCR β é fundida ao N-terminal a sequência correspondente a uma sequência extracelular da região constante da cadeia de TCR β, sendo o primeiro e o segundo polipeptídeos ligados por uma ligação de dissulfeto. Em algumas modalidades, a ligação pode corresponder à ligação de dissulfeto intercadeia nativa presente nos TCRs αβ dimé- ricos nativos. Em algumas modalidades, as ligações de dissulfeto in- tercadeia não estão presentes em um TCR nativo. Por exemplo, em algumas modalidades, uma ou mais cisteínas podem ser incorporadas nas sequências extracelulares da região constante do par de polipep- tídeo dTCR. Em alguns casos, uma ligação de dissulfeto nativa e uma não nativa pode ser desejável. Em algumas modalidades, o TCR con- tém uma sequência de transmembrana para ancorar na membrana.
[00483] Em algumas modalidades, um dTCR contém uma cadeia α de TCR contendo um domínio α variável, um domínio α constante e um primeiro motivo de dimerização ligado ao C-terminal do domínio α constante e uma cadeia de TCR β compreendendo uma variável β domínio, um domínio β constante e um primeiro motivo de dimerização anexado ao C-terminal do domínio β constante, em que o primeiro e o segundo motivos de dimerização interagem facilmente para formar uma ligação covalente entre um aminoácido no primeiro motivo de di- merização e um aminoácido no segundo motivo de dimerização que liga a cadeia de TCR α e a cadeia de TCR β juntas.
[00484] Em algumas modalidades, o TCR é um scTCR. Tipicamen- te, um scTCR pode ser gerado usando métodos conhecidos, Ver, por exemplo, Soo Hoo, W. F. et al. PNAS (USA) 89, 4759 (1992); Wulfing, C. e Pluckthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994); Kurucz, I. et al. PNAS (USA) 90 3830 (1993); PCT internacional publicado nos. WO 96/13593, WO 96/18105, WO99/60120, WO99/18129, WO 03/020763, WO2011/044186; e Schlueter, C.J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996). Em algumas modalidades, um scTCR contém uma ligação intercadeia de dissulfeto não nativa introduzida para facilitar a associação das ca- deias de TCR (veja, por exemplo, a publicação internacional publicada PCT No. WO 03/020763). Em algumas modalidades, um scTCR é um TCR truncado não ligado a dissulfeto no qual zíperes de leucina hete- rólogos fundidos com seus C-terminais facilitam a associação de ca- deias (veja, por exemplo, o PCT internacional publicado No. WO99/ 60120). Em algumas modalidades, um scTCR contém um domínio va- riável de TCRα covalentemente ligado a um domínio variável de TCRβ por meio de um ligante peptídico (veja, por exemplo, PCT internacional publicado No. WO99/18129).
[00485] Em algumas modalidades, um scTCR contém um primeiro segmento constituído por uma sequência de aminoácidos correspon-
dente a uma região variável da cadeia do TCR α, um segundo seg- mento constituído por uma sequência de aminoácidos correspondente a uma sequência da região variável da cadeia do TCR β fundida ao N terminal de uma sequência de aminoácidos correspondente a uma se- quência extracelular de domínio constante da cadeia de TCR β e uma sequência ligante que liga o C-terminal do primeiro segmento ao N- terminal do segundo segmento.
[00486] Em algumas modalidades, um scTCR contém um primeiro segmento constituído por uma sequência de região variável da cadeia α fundida ao N-terminal de uma sequência de domínio constante ex- tracelular da cadeia α e um segundo segmento constituído por uma sequência de região variável da cadeia β fundida ao N-terminal de uma constante extracelular da cadeia β da sequência e sequência de transmembrana e, opcionalmente, uma sequência ligante que liga o C- terminal do primeiro segmento ao N-terminal do segundo segmento.
[00487] Em algumas modalidades, um scTCR contém um primeiro segmento constituído por uma sequência de região variável da cadeia de TCR β fundida ao N-terminal de uma sequência de domínio cons- tante extracelular da cadeia β e um segundo segmento constituído por uma sequência de região variável da cadeia α fundida ao N-terminal de uma sequência extracelular constante da cadeia α e sequência de transmembrana e, opcionalmente, uma sequência ligante que liga o C- terminal do primeiro segmento ao N-terminal do segundo segmento.
[00488] Em algumas modalidades, o ligante de um scTCRs que liga o primeiro e o segundo segmentos de TCR pode ser qualquer ligante capaz de formar uma única fita de polipeptídeo, mantendo a especifi- cidade de ligação ao TCR. Em algumas modalidades, a sequência do ligante pode, por exemplo, ter a fórmula -P-AA-P- em que P é prolina e AA representa uma sequência de aminoácidos em que os aminoácidos são glicina e serina. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo segmentos são emparelhados de modo que as sequências da região variável dos mesmos sejam orientadas para essa ligação. Portanto, em alguns casos, o ligante tem um comprimento suficiente para abranger a distância entre o C-terminal do primeiro segmento e o N- terminal do segundo segmento, ou vice-versa, mas não é muito longo para bloquear ou reduzir a ligação do scTCR para o ligante alvo. Em algumas modalidades, o ligante pode conter de 10 a 45 aminoácidos ou de cerca de 10 a cerca de 45 aminoácidos, como 10 a 30 aminoá- cidos ou 26 a 41 aminoácidos e 29, 30, 31 ou 32 aminoácidos. Em al- gumas modalidades, o ligante tem a fórmula -PGGG-(SGGGG)5-P-, em que P é prolina, G é glicina e S é serina (SEQ ID NO: 28). Em al- gumas modalidades, o ligante tem a sequência GSADDAKKDAAKK- DGKS (SEQ ID NO: 29).
[00489] Em algumas modalidades, o scTCR contém uma ligação de dissulfeto covalente que liga um resíduo da região de imunoglobulina do domínio constante da cadeia α a um resíduo da região de imuno- globulina do domínio constante da cadeia β. Em algumas modalida- des, a ligação de dissulfeto intercadeia em um TCR nativo não está presente. Por exemplo, em algumas modalidades, uma ou mais cisteí- nas podem ser incorporadas nas sequências extracelulares da região constante dos primeiro e segundo segmentos do polipeptídeo de scTCR. Em alguns casos, uma ligação de dissulfeto nativa e uma não nativa pode ser desejável.
[00490] Em algumas modalidades de um dTCR ou scTCR contendo ligações de dissulfeto intercadeia introduzidas, as ligações de dissulfe- to nativas não estão presentes. Em algumas modalidades, as referidas uma ou mais das cisteínas nativas que formam uma ligação de dissul- feto intercadeia nativa são substituídas por outro resíduo, como uma serina ou alanina. Em algumas modalidades, uma ligação de dissulfeto introduzida pode ser formada pela mutação de resíduos não cisteína no primeiro e segundo segmentos em cisteína. Exemplos de ligações de dissulfeto não nativas de um TCR são descritas no PCT Internatio- nal publicado No. WO2006/000830.
[00491] Em algumas modalidades, o TCR ou seu fragmento de li- gação ao antígeno exibe uma afinidade com uma constante de ligação de equilíbrio para um antígeno alvo entre ou entre cerca de 10-5 e 10- 12 M e todos os valores e faixas individuais nele. Em algumas modali- dades, o antígeno alvo é um ligante ou complexo de MHC-peptídeo.
[00492] Em algumas modalidades, o ácido nucleico ou ácidos nu- cleicos que codificam um TCR, como as cadeias α e β, podem ser am- plificados por PCR, clonagem ou outros meios adequados e clonados em um vetor ou vetores de expressão adequados. O vetor de expres- são pode ser qualquer vetor de expressão recombinante adequado e pode ser usado para transformar ou transfectar qualquer hospedeiro adequado. Os vetores adequados incluem aqueles modificados para propagação e expansão ou expressão ou ambos, como plasmídeos e vírus.
[00493] Em algumas modalidades, o vetor pode ser um vetor da série pUC (Fermentas Life Sciences), da série pBluescript (Stratagene, LaJolla, Calif.), da série pET (Novagen, Madison, Wis.), da série pGEX ( Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) ou a série pEX (Clontech, Pa- lo Alto, Calif.). Em alguns casos, vetores de bacteriófagos, como λG10, λGT11, λZapII (Stratagene), λEMBL4 e λNM1149, também podem ser utilizados. Em algumas modalidades, os vetores de expressão de plan- tas podem ser usados e incluem pBI01, pBI101,2, pBI101,3, pBI121 e pBIN19 (Clontech). Em algumas modalidades, os vetores de expres- são animal incluem pEUK-Cl, pMAM e pMAMneo (Clontech). Em al- gumas modalidades, um vetor viral é usado, como um vetor retroviral.
[00494] Em algumas modalidades, os vetores de expressão recom- binantes podem ser preparados usando técnicas padrão de DNA re-
combinante. Em algumas modalidades, os vetores podem conter se- quências reguladoras, como códons de iniciação e terminação da transcrição e translação, que são específicos para o tipo de hospedei- ro (por exemplo, bactéria, fungo, planta ou animal) no qual o vetor de- ve ser introduzido, como apropriado e levando em consideração se o vetor é baseado em DNA ou RNA. Em algumas modalidades, o vetor pode conter um promotor não nativo operacionalmente ligado à se- quência de nucleotídeos que codifica o TCR ou a porção de ligação ao antígeno (ou outra molécula de ligação ao MHC-peptídeo). Em algu- mas modalidades, o promotor pode ser um promotor não viral ou um promotor viral, como um promotor de citomegalovírus (CMV), um pro- motor SV40, um promotor de RSV e um promotor encontrado na repe- tição terminal longa do vírus de célula tronco de murino. Outros promo- tores conhecidos também são considerados.
[00495] Em algumas modalidades, para gerar um vetor que codifica um TCR, as cadeias α e β são amplificadas por PCR a partir de cDNA total isolado de um clone de células T que expressa o TCR de interes- se e clonadas em um vetor de expressão. Em algumas modalidades, as cadeias α e β são clonadas no mesmo vetor. Em algumas modali- dades, as cadeias α e β são clonadas em diferentes vetores. Em al- gumas modalidades, as cadeias α e β geradas são incorporadas a um vetor retroviral, por exemplo, lentiviral. III. MÉTODOS DE ADMINSITRAÇÃO
[00496] Em algumas modalidades, composições de saída de célu- las T enriquecidas, como composições separadas de composições de saída CD4+ e CD8, produzidas pelos métodos fornecidos, como o for- necido na Seção I, são administradas como uma terapia celular, por exemplo, uma célula adotiva terapia. Em modalidades particulares, uma ou mais composições de células, por exemplo, composições de células de saída descritas aqui são administradas como uma terapia celular. Em algumas modalidades, métodos de terapia de células T adotivos são descritos, por exemplo, na Publicação de Pedido de Pa- tente US No. 2003/0170238 de Gruenberg et al; Patente US No. 4,690,915 de Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8 (1 0): 577-85). Veja, por exemplo, Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31 (10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438 (1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8 (4): e61338.
[00497] Em certas modalidades, os métodos aqui fornecidos produ- zem uma composição de saída única de células T enriquecidas a partir de células de entrada isoladas, selecionadas e/ou enriquecidas a partir de uma única amostra biológica que é administrada como uma terapia celular. Em modalidades particulares, a composição de saída única é uma composição de células T CD4+ enriquecidas. Em certas modali- dades, a composição de saída única é uma composição de células T CD4+ e CD8+ enriquecidas. Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos produzem duas ou mais composições de saída de uma única fonte, por exemplo, uma amostra biológica e/ou composições de entrada isoladas, selecionadas ou enriquecidas a partir de uma amos- tra biológica, que são administradas a um indivíduo. Em algumas mo- dalidades, as duas ou mais composições de saída são administradas ao indivíduo separadamente. Em certas modalidades, as duas ou mais composições de saída são combinadas em uma única composição e administradas ao indivíduo. Em certas modalidades, as duas ou mais composições de saída incluem uma composição de saída de células T CD4+ enriquecidas e uma composição de saída de células T CD8+ enriquecidas.
[00498] Em algumas modalidades, uma composição de saída de células T CD4+ enriquecidas que é administrada a um indivíduo inclui pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos
95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,9 % ou pelo menos ou 100 % de células T CD4+. Em certas modalidades, a composição de saída inclui pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,9 %, ou a cerca de 100 % de células T CD4+ que expressam o receptor recom- binante e/ou foram transduzidas ou transfectadas com o polinucleotí- deo recombinante. Em certas modalidades, a composição de saída de células T CD4+ enriquecidas que é administrada ao indivíduo inclui menos de 40 %, menos de 35 %, menos de 30 %, menos de 25 %, menos de 20 %, menos de 15 %, menos de 10 %, menos de 5 %, me- nos de 1 %, menos de 0,1 % ou menos de 0,01 % de células T CD8+ e/ou não contêm células T CD8+ e/ou estão livres ou substancialmente livres de células T CD8+.
[00499] Em algumas modalidades, uma composição de saída de células T CD8+ enriquecidas que é administrada a um indivíduo inclui pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,9 % ou pelo menos ou 100 % de células T CD8+. Em moda- lidades particulares, a composição inclui pelo menos 30 %, pelo me- nos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60%, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95%, pelo menos 98 %, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,9 % ou a ou a cerca de 100 % de células T CD8+ que expressam o receptor recom- binante e/ou foram transduzidas ou transfectadas com o polinucleotí- deo recombinante. Em certas modalidades, a composição de saída de células T CD8+ enriquecidas que é administrada ao indivíduo inclui menos de 40 %, menos de 35 %, menos de 30 %, menos de 25 %,
menos de 20 %, menos de 15 %, menos de 10 %, menos de 5 %, me- nos de 1 %, menos de 0,1 % ou menos de 0,01 % de células T CD4+ e/ou não contêm células T CD4+ e/ou estão livres ou substancialmente livres de células T CD4+.
[00500] A doença ou condição tratada pode ser qualquer uma na qual a expressão de um antígeno esteja associada e/ou envolvida na etiologia de uma condição ou distúrbio de doença, por exemplo, causa, exacerba ou de outra forma está envolvido em tal doença, condição ou distúrbio. Doenças e condições exemplares podem incluir doenças ou condições associadas a malignidade ou transformação de células (por exemplo, câncer), doença autoimune ou inflamatória ou uma doença infecciosa, por exemplo, causada por um patógeno bacteriano, viral ou outro. Antígenos exemplares, que incluem antígenos associados a vá- rias doenças e condições que podem ser tratadas, são descritos aci- ma. Em modalidades particulares, o receptor de antígeno quimérico ou TCR transgênico se liga especificamente a um antígeno associado à doença ou condição.
[00501] Entre as doenças, condições e distúrbios estão os tumores, incluindo tumores sólidos, neoplasias hematológicas e melanomas, e incluindo tumores localizados e metastáticos, doenças infecciosas, como infecção por um vírus ou outro patógeno, por exemplo, HIV, HCV, HBV, CMV, HPV e doença parasitária e doenças autoimunes e inflamatórias. Em algumas modalidades, a doença, distúrbio ou condi- ção é um tumor, câncer, malignidade, neoplasia ou outra doença ou distúrbio proliferativo. Tais doenças incluem, entre outras, leucemia, linfoma, por exemplo, leucemia mieloide aguda (ou mielogenosa) (AML), leucemia mieloide crônica (ou mielogenosa) (CML), leucemia linfocítica aguda (ou linfoblástica) (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia de células pilosas (HCL), linfoma linfocítico pequeno (SLL), linfoma de células de revestimento (MCL), linfoma da zona marginal, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin (HL), linfoma não Ho- dgkin (NHL), Linfoma anaplásico de grandes células (ALCL), linfoma folicular, linfoma folicular refratário, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) e mieloma múltiplo (MM). Em algumas modalidades, doença ou condição é uma neoplasia de células B selecionada entre leucemia linfoblástica aguda (ALL), ALL adulta, leucemia linfoblástica crônica (CLL), linfoma não Hodgkin (NHL) e linfoma difuso de células B gran- des (DLBCL). Em algumas modalidades, a doença ou condição é NHL e o NHL é selecionado do grupo que consiste em NHL agressivo, lin- foma difuso de células B grandes (DLBCL), NOS (de novo e transfor- mado a partir de indolente), linfoma mediastinal primário de células B grandes (PMBCL) ), Linfoma de células B grandes rico em células T/histócitos (TCHRBCL), linfoma de Burkitt, linfoma de células de re- vestimento (MCL) e/ou linfoma folicular (FL), opcionalmente, linfoma folicular Grau 3B (FL3B).
[00502] Em algumas modalidades, a doença ou condição é uma doença ou condição infecciosa, como, entre outras, infecções virais, retrovirais, bacterianas e protozoárias, imunodeficiência, citomegaloví- rus (CMV), vírus de Epstein-Barr (EBV), adenovírus, poliomavírus BK. Em algumas modalidades, a doença ou condição é uma doença ou condição autoimune ou inflamatória, como artrite, por exemplo, artrite reumatoide (RA), diabetes tipo I, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), doença inflamatória intestinal, psoríase, esclerodermia, doença tireoide autoimune, doença de Grave, doença de Crohn, esclerose múltipla, asma e/ou uma doença ou condição associada ao transplante.
[00503] Em algumas modalidades, o antígeno associado à doença ou distúrbio é selecionado dentre integrina αvβ6 (integrina avb6), antí- geno de maturação de células B (BCMA), B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecida como CAIX ou G250), um antígeno câncer- testículo, antígeno câncer/testículo 1B (CTAG, também conhecido co-
mo NY-ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembrionário (CEA), uma ciclina, ciclina A2, Ligante 1 de Quimiocina de Motivo C-C (CCL- 1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, proteína do fator de cres- cimento epidérmico (EGFR), proteína do fator de crescimento epidér- mico truncado (tEGFR), mutação do receptor do fator de crescimento epidérmico tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glico- proteína epitelial 40 (EPG-40), efrinaB2, receptor da efrina A2 (EPHa2), receptor de estrogênio, receptor de Fc como 5 (FCRL5; co- nhecido como homólogo 5 do receptor de Fc ou FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), uma proteína de ligação ao folato (FBP), receptor alfa de folato, receptor alfa de folato, receptor de acetilcolina fetal, grupo liosídeo GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glicoproteína 100 (gp100), Receptor 5D acoplado à proteína G (GPCR5D), Her2/neu (erbB2 de tirosina cinase receptora), Her3 (erb- B3), Her4 (erb-B4), dímeros erbB, antígeno humano associado ao me- lanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), antígeno de superfície da hepatite B, antígeno leucocitário humano A1 (HLA-AI), antígeno leuco- citário humano A2 (HLA-A2), receptor alfa de IL-22 (IL-22Ra), receptor alfa 2 de IL-13 (IL-13Ra2), receptor de domínio de inserção de cinase (kdr), cadeia leve capa, molécula de adesão de células L1 (L1CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, Membro da Família 8 Contendo Repetição Rica em Leucina A (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado ao mela- noma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, mesotelina, c-Met, citomega- lovírus de murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes do membro do grupo 2 exterminador natural D (NKG2D), melana A (MART-1), molécula de adesão celular neural (NCAM), antígeno onco- fetal, antígeno preferencialmente expresso do melanoma (PRAME), receptor de progesterona, antígeno específico da próstata, antígeno de células tronco da próstata (PSCA), antígeno da membrana específica da próstata (PSMA), Receptor Órfão de Tirosina Cinase Receptora 1 (ROR1), survivina, glicoproteína trofoblástica (TPBG também conheci- da como 5T4), glicoproteína associada ao tumor 72 (TAG72), receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), receptor do fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGFR2), Tumor de Wilms 1 (WT-1), um antígeno específico de patógeno ou um antígeno associa- do a um marcador universal e/ou moléculas biotiniladas e/ou molécu- las expressas por HIV, HCV, HBV ou outros patógenos. Os antígenos direcionados pelos receptores em algumas modalidades incluem antí- genos associados a uma malignidade de células B, como qualquer um de vários marcadores conhecidos de células B. Em algumas modali- dades, o antígeno direcionado pelo receptor é CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igcapa, Iglambda, CD79a, CD79b ou CD30. Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno especí- fico do patógeno. Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno viral (como um antígeno viral do HIV, HCV, HBV, etc.), antígenos bac- terianos e/ou antígenos parasitários.
[00504] Em algumas modalidades, a doença ou condição é uma malignidade de células B. Em algumas modalidades, a malignidade das células B é uma leucemia ou um linfoma. Em alguns aspectos, a doença ou condição é leucemia linfoblástica aguda (ALL), ALL adulta, leucemia linfoblástica crônica (CLL), linfoma não Hodgkin (NHL) ou linfoma difuso de células B grandes (DLBCL). Em alguns casos, a do- ença ou condição é um NHL, como ou incluindo um NHL agressivo, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), NOS (de novo e trans- formado a partir de indolente), linfoma mediastinal primário de células B grandes (PMBCL), linfoma de células B grandes rico em células T/histócitos (TCHRBCL), linfoma de Burkitt, linfoma de células de re- vestimento (MCL) e/ou linfoma folicular (FL), opcionalmente, linfoma folicular Grau 3B (FL3B). Em alguns aspectos, o receptor recombinan-
te, como um CAR, liga-se especificamente a um antígeno associado à doença ou condição ou expresso nas células do ambiente de uma le- são associada à malignidade das células B. Os antígenos direcionados pelos receptores em algumas modalidades incluem antígenos associ- ados a uma malignidade de células B, como qualquer um de vários marcadores conhecidos de células B. Em algumas modalidades, o an- tígeno direcionado pelo receptor é CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igcapa, Iglambda, CD79a, CD79b ou CD30, ou combinações dos mesmos.
[00505] Em algumas modalidades, a doença ou condição é um mi- eloma, como um mieloma múltiplo. Em alguns aspectos, o receptor recombinante, como um CAR, liga-se especificamente a um antígeno associado à doença ou condição ou expresso nas células do ambiente de uma lesão associada ao mieloma múltiplo. Antígenos direcionados pelos receptores em algumas modalidades incluem antígenos associ- ados ao mieloma múltiplo. Em alguns aspectos, o antígeno, por exem- plo, o segundo ou antígeno adicional, como o antígeno específico da doença e/ou o antígeno relacionado, é expresso no mieloma múltiplo, como o antígeno de maturação das células B (BCMA), membro D do grupo 5 de receptores acoplados à proteína G classe C (GPRC5D), CD38 (ADP ribose hidrolase cíclica), CD138 (sindecana-1, sindecana, SYN-1), CS-1 (CS1, CD2 subconjunto 1, CRACC, SLAMF7, CD319 e 19A24), BAFF-R, TACI e/ou FcRH5. Outros antígenos de mieloma múltiplo exemplares incluem CD56, TIM-3, CD33, CD123, CD44, CD20, CD40, CD74, CD200, EGFR, β2-Microglobulina, HM1,24, IGF- 1R, IL-6R, TRAIL-R1 e o receptor de ativina tipo IIA (ActRIIA). Veja, Benson e Byrd, J. Clin. Oncol. (2012) 30 (16): 2013-15; Tao e Ander- son, Bone Marrow Research (2011): 924058; Chu et al., Leucemia (2013) 28 (4): 917-27; Garfall et al., Discov Med. (2014) 17 (91): 37-46. Em algumas modalidades, os antígenos incluem aqueles presentes em tumores linfoides, mieloma, linfoma associado à AIDS e/ou linfo- proliferações pós-transplante, como CD38. Os anticorpos ou fragmen- tos de ligação ao antígeno direcionados a esses antígenos são conhe- cidos e incluem, por exemplo, os descritos na Patente Norte- americana No. 8,153,765; 8,603477, 8,008,450; Pub. U.S. US20120189622 ou US20100260748; e/ou Publicações PCT Interna- cional Nos. WO2006099875, WO2009080829 ou WO2012092612 ou WO2014210064. Em algumas modalidades, esses anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno (por exemplo, scFv) estão contidos em anticorpos multiespecíficos, receptores quiméricos multiespecífi- cos, como CARs multiespecíficos e/ou células multiespecíficas.
[00506] Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno espe- cífico ao patógeno ou expresso ao patógeno. Em algumas modalida- des, o antígeno é um antígeno viral (como um antígeno viral do HIV, HCV, HBV, etc.), antígenos bacterianos e/ou antígenos parasitários.
[00507] Em algumas modalidades, a terapia celular, por exemplo, terapia adotiva de células T, é realizada por transferência autóloga, na qual as células são isoladas e/ou preparadas de outro modo a partir do indivíduo que deve receber a terapia celular ou de um amostra deriva- da de tal indivíduo. Assim, em alguns aspectos, as células são deriva- das de um indivíduo, por exemplo, paciente, necessitando de um tra- tamento e as células, após isolamento e processamento, são adminis- tradas ao mesmo indivíduo.
[00508] Em algumas modalidades, a terapia celular, por exemplo, terapia adotiva de células T, é realizada por transferência alogênica, na qual as células são isoladas e/ou preparadas de outro modo a partir de um indivíduo que não seja um indivíduo que deve receber ou que finalmente recebe a terapia celular, por exemplo, um primeiro indiví- duo. Em tais modalidades, as células são então administradas a um indivíduo diferente, por exemplo, um segundo indivíduo, da mesma espécie. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo indivíduos são geneticamente idênticos. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo indivíduos são geneticamente semelhantes. Em algumas modalidades, o segundo indivíduo expressa a mesma classe ou super- tipo HLA que o primeiro indivíduo.
[00509] As células, por exemplo, células modificadas geradas por um método aqui fornecido, como descrito na Seção I, podem ser ad- ministradas por qualquer meio adequado. Em modalidades particula- res, as células de duas ou mais composições de saída separadas, por exemplo, composições de células T enriquecidas produzidas pelos métodos aqui fornecidos, como descrito na Seção I, são combinadas em uma única composição de células a serem administradas. Em cer- tas modalidades, as células de composições de saída separadas são cada qual administradas separadamente ao indivíduo. Em certas mo- dalidades, as células T CD4+ são administradas separadamente das células T CD8+.
[00510] Em algumas modalidades, as células podem ser adminis- tradas por infusão em bolo, por injeção, por exemplo, injeções intrave- nosas ou subcutâneas, injeção intraocular, injeção periocular, injeção subretiniana, injeção intravítrea, injeção trans-septal, injeção subscle- ral, injeção intracoroidal, injeção intracameral, injeção subconjuntival, injeção subconjuntival, injeção sub-Tenon, injeção retrobulbar, injeção peribulbar ou liberação justascleral posterior. Em algumas modalida- des, eles são administrados por administração parentérica, intrapul- monar e intranasal e, se desejado para o tratamento local, administra- ção intralesional. As infusões parentéricas incluem administração in- tramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. Em algumas modalidades, uma dada dose é administrada por uma única administração em bolo das células. Em algumas modalidades, é administrado por múltiplas administrações em bolo das células, por exemplo, durante um período não superior a 3 dias, ou por administra- ção de infusão contínua das células. Em algumas modalidades, a ad- ministração da dose celular ou de quaisquer terapias adicionais, por exemplo, a terapia de eliminação de linfonodos, terapia de intervenção e/ou terapia combinada, é realizada via liberação ambulatorial.
[00511] Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada pode depender do tipo de doença a ser tratada, tipo de cé- lulas ou receptores recombinantes, da gravidade e do curso da doen- ça, se as células são administradas para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, histórico clínico e resposta do indivíduo às células e a critério do médico assistente. As composições e células são, em algumas modalidades, administradas adequadamente ao indi- víduo ao mesmo tempo ou ao longo de uma série de tratamentos.
[00512] Em algumas modalidades, as células são administradas como parte de um tratamento combinado, como simultaneamente ou sequencialmente com, em qualquer ordem, outra intervenção terapêu- tica, como um anticorpo ou célula ou receptor ou agente modificado, como um citotóxico ou agente terapêutico. As células em algumas mo- dalidades são coadministradas com um ou mais agentes terapêuticos adicionais ou em conexão com outra intervenção terapêutica, simulta- neamente ou sequencialmente em qualquer ordem. Em alguns contex- tos, as células são coadministradas com outra terapia suficientemente próxima no tempo, de modo que as populações celulares aumentam o efeito de um ou mais agentes terapêuticos adicionais, ou vice-versa. Em algumas modalidades, as células são administradas antes de um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em algumas modalidades, as células são administradas após um ou mais agentes terapêuticos adi- cionais. Em algumas modalidades, os referidos um ou mais agentes adicionais incluem uma citocina, como IL-2, por exemplo, para melho- rar a persistência. Em algumas modalidades, os métodos compreen-
dem a administração de um agente quimioterápico.
[00513] Em algumas modalidades, os métodos compreendem a administração de um agente quimioterápico, por exemplo, um agente quimioterápico condicionador, por exemplo, para reduzir a carga tumo- ral antes da administração.
[00514] O pré-condicionamento de indivíduos com terapias imuno- depletadoras (por exemplo, linfodepletadoras) em alguns aspectos po- de melhorar os efeitos da terapia celular adotiva (ACT).
[00515] Assim, em algumas modalidades, os métodos incluem a administração de um agente de pré-condicionamento, como um agen- te quimioterápico ou quimioterápico, como ciclofosfamida, fludarabina ou combinações dos mesmos, a um indivíduo antes do início da tera- pia celular. Por exemplo, ao indivíduo pode ser administrado um agen- te de pré-condicionamento pelo menos 2 dias antes, como pelo menos 3, 4, 5, 6 ou 7 dias antes, para o início da terapia celular. Em algumas modalidades, ao indivíduo é administrado um agente de pré- condicionamento não mais que 7 dias antes, como não mais que 6, 5, 4, 3 ou 2 dias antes, para o início da terapia celular.
[00516] Em algumas modalidades, ao indivíduo é pré-condicionado com ciclofosfamida em uma dose entre ou entre cerca de 20 mg/kg e 100 mg/kg, como entre ou entre cerca de 40 mg/kg e 80 mg/kg. Em alguns aspectos, ao indivíduo é pré-condicionado com ou com cerca de 60 mg/kg de ciclofosfamida. Em algumas modalidades, a ciclofos- famida pode ser administrada em uma dose única ou várias doses, como as administradas diariamente, a cada dois dias ou a cada três dias. Em algumas modalidades, a ciclofosfamida é administrada uma vez ao dia por um ou dois dias. Em algumas modalidades, onde o agente linfodepletor compreende ciclofosfamida, ao indivíduo é admi- nistrado ciclofosfamida em uma dose entre ou entre cerca de 100 mg/m2 e 500 mg/m2, como entre ou entre cerca de 200 mg/m2 e 400 mg/m2, ou 250 mg/m2 e 350 mg/m2, inclusive. Em alguns casos, ao indivíduo é administrado cerca de 300 mg/m2 de ciclofosfamida. Em algumas modalidades, a ciclofosfamida pode ser administrado em uma dose única ou pode ser administrado várias doses, como as adminis- tradas diariamente, a cada dois dias ou a cada três dias. Em algumas modalidades, a ciclofosfamida é administrada diariamente, como por 1-5 dias, por exemplo, por 3 a 5 dias. Em alguns casos, ao indivíduo é administrado cerca de 300 mg/m2 de ciclofosfamida, diariamente por 3 dias, antes do início da terapia celular.
[00517] Em algumas modalidades, onde o agente linfodepletor compreende fludarabina, ao indivíduo é administrado fludarabina em uma dose entre ou entre cerca de 1 mg/m2 e 100 mg/m2, como entre ou entre cerca de 10 mg/m2 e 75 mg/m2, 15 mg/m2 e 50 mg/m2, 20 mg/m2 e 40 mg/m2, ou 24 mg/m2 e 35 mg/m2, inclusive. Em alguns ca- sos, ao indivíduo é administrado em torno de 30 mg/m2 de fludarabina. Em algumas modalidades, a fludarabina pode ser administrada em uma dose única ou várias doses, como as administradas diariamente, a cada dois dias ou a cada três dias. Em algumas modalidades, a flu- darabina é administrada diariamente, como por 1-5 dias, por exemplo, por 3 a 5 dias. Em alguns casos, ao indivíduo é administrado cerca de 30 mg/m2 de fludarabina, diariamente por 3 dias, antes do início da terapia celular.
[00518] Em algumas modalidades, o agente linfodepletor compre- ende uma combinação de agentes, como uma combinação de ciclofos- famida e fludarabina. Assim, a combinação de agentes pode incluir ciclofosfamida em qualquer dose ou esquema de administração, como os descritos acima, e fludarabina em qualquer dose ou esquema de administração, como os descritos acima. Por exemplo, em alguns as- pectos, ao indivíduo é administrado 60 mg/kg (~ 2 g/m2) de ciclofosfa- mida e 3 a 5 doses de 25 mg/m2 de fludarabina antes da primeira ou da dose subsequente.
[00519] Após a administração das células, a atividade biológica das populações de células modificadas em algumas modalidades é medi- da, por exemplo, por qualquer um de vários métodos conhecidos. Os parâmetros para avaliar incluem a ligação específica de uma célula T modificada ou natural ou outra célula imune ao antígeno, in vivo, por exemplo, por imagem ou ex vivo, por exemplo, por ELISA ou citometria de fluxo. Em certas modalidades, a capacidade das células modifica- das para destruir as células alvo pode ser medida usando quaisquer métodos conhecidos adequados, como ensaios de citotoxicidade des- critos em, por exemplo, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32 (7): 689-702 (2009) e Herman et al. J. Immunological Methods, 285 (1): 25- 40 (2004). Em certas modalidades, a atividade biológica das células é medida testando a expressão e/ou secreção de uma ou mais citocinas, como CD107a, IFNγ, IL-2 e TNF. Em alguns aspectos, a atividade bio- lógica é medida pela avaliação do resultado clínico, como redução na sobrecarga ou carga do tumor.
[00520] Em certas modalidades, as células modificadas são ainda modificadas de várias maneiras, de modo que sua eficácia terapêutica ou profilática seja aumentada. Por exemplo, o CAR ou TCR modificado expresso pela população pode ser conjugado direta ou indiretamente através de um ligante a uma fração de direcionamento. A prática de conjugar compostos, por exemplo, o CAR ou TCR, para porções alvo é conhecida. Veja, por exemplo, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995) e Patente Norte-americana 5,087,616.
[00521] Em algumas modalidades, uma dose de células é adminis- trada a indivíduos de acordo com os métodos fornecidos e/ou com os artigos de fabricação ou composições fornecidos. Em algumas modali- dades, o tamanho ou o momento das doses é determinado em função da doença ou condição específica no indivíduo. Em alguns casos, o tamanho ou o momento das doses para uma doença específica, em vista da descrição fornecida, pode ser determinado empiricamente.
[00522] Em algumas modalidades, a dose de células compreende entre cerca de 2 x 105 das células/kg e cerca de 2 x 106 das células/kg, como entre ou cerca de 4 x 105 das células/kg e em ou cerca de 1 x 106 das células/kg ou entre ou em torno de 6 x 105 das células/kg e em ou cerca de 8 x 105 das células/kg. Em algumas modalidades, a dose de células compreende não mais que 2 x 105 das células (por exem- plo, células de expressão de antígeno, como de expressão de CAR) por quilograma de peso corporal do indivíduo (células/kg), como não mais do que a ou cerca de 3 x 105 células/kg, não mais do que a ou cerca de 4 x 105 células/kg, não mais do que a ou cerca de 5 x 105 cé- lulas/kg, não mais do que a ou cerca de 6 x 105 células/kg, não mais igual ou superior a 7 x 105 células/kg, não mais do que ou cerca de 8 x 105 células/kg, não mais do que ou cerca de 9 x 105 células/kg, ou não mais do que ou cerca de 1 x 106 células/kg, ou não mais do que a cer- ca de 2 x 106 células/kg. Em algumas modalidades, a dose de células compreende pelo menos ou pelo menos cerca de 2 x 105 das células (por exemplo, células de expressão de antígeno, como de expressão de CAR) por quilograma de peso corporal do indivíduo (células/kg), como pelo menos ou pelo menos cerca de 3 x 105 células/kg, pelo me- nos ou pelo menos cerca de 4 x 105 células/kg, pelo menos ou pelo menos cerca de ou a cerca de 5 x 105 células/kg, pelo menos ou pelo menos cerca de ou a cerca de 6 x 105 células/kg, pelo menos ou pelo menos cerca de ou a cerca de 7 x 105 células/kg, pelo menos ou a pe- lo menos cerca de ou em cerca de 8 x 105 células/kg, pelo menos ou pelo menos cerca de ou em ou cerca de 9 x 105 células/kg, pelo me- nos ou pelo menos cerca de ou em ou cerca de 1 x 106 células/kg, ou pelo menos ou pelo menos cerca de 2 x 106 células/kg.
[00523] Em certas modalidades, as células, ou populações indivi-
duais de subtipos de células, são administradas ao indivíduo a uma faixa de cerca de um milhão a cerca de 100 bilhões de células e/ou essa quantidade de células por quilograma de peso corporal, como, por exemplo, 1 milhão a cerca de 50 bilhões de células (por exemplo, cerca de 5 milhões de células, cerca de 25 milhões de células, cerca de 500 milhões de células, cerca de 1 bilhão de células, cerca de 5 bilhões de células, cerca de 20 bilhões de células, cerca de 30 bilhões de células, cerca de 40 bilhões de células, ou um intervalo definido por dois dos valores anteriores), como cerca de 10 a 100 bilhões de célu- las (por exemplo, cerca de 20 milhões de células, cerca de 30 milhões de células, cerca de 40 milhões de células, cerca de 60 milhões de cé- lulas, cerca de 70 milhões de células, cerca de 80 milhões de células, cerca de 90 milhões de células, cerca de 10 bilhões de células, cerca de 25 bilhões de células, cerca de 50 bilhões de células, cerca de 75 bilhões de células, cerca de 90 bilhões de células ou um intervalo defi- nido por dois valores anteriores) e, em alguns casos, cerca de 100 mi- lhões de células a cerca de 50 bilhões de células (por exemplo, cerca de 120 milhões de células, cerca de 250 milhões de células, cerca de 350 milhões de células, cerca de 450 milhões de células, cerca de 650 milhões de células, cerca de 800 milhões de células, cerca de 900 mi- lhões de células, cerca de 3 bilhões de células, cerca de 30 bilhões de células, cerca de 45 bilhões de células) ou qualquer valor entre essas faixas e/ou por quilograma de peso corporal. As dosagens podem va- riar dependendo dos atributos particulares da doença ou distúrbio e/ou paciente e/ou outros tratamentos.
[00524] Em algumas modalidades, a dose de células é uma dose plana de células ou dose fixa de células, de modo que a dose de célu- las não esteja ligada a ou com base na área da superfície corporal ou no peso de um indivíduo.
[00525] Em algumas modalidades, a dose de células geneticamente modificadas compreende de ou de cerca de 1 x 105 a 5 x 108 células T de expressão de CAR totais, 1 x 105 a 2,5 x 108 células T de expres- são de CAR totais, 1 x 105 a 1 x 108 células T de expressão de CAR totais, 1 x 105 a 5 x 107 células T de expressão de CAR totais, 1 x 105 a 2,5 x 107 células T de expressão de CAR totais, 1 x 105 a 1 x 107 cé- lulas T de expressão de CAR totais, 1 x 105 a 5 x 106 células T de ex- pressão de CAR totais, 1 x 105 a 2,5 x 106 células T de expressão de CAR totais, 1 x 105 a 1 x 106 células T de expressão de CAR totais, 1 x 106 a 5 x 108 células T de expressão de CAR totais, 1 x 106 a 2,5 x 108 células T de expressão de CAR totais, 1 x 106 a 1 x 108 células T de expressão de CAR totais, 1 x 106 a 5 x 107 células T de expressão de CAR totais, 1 x 106 a 2,5 x 107 células T de expressão de CAR totais, 1 x 106 a 1 x 107 células T de expressão de CAR totais, 1 x 106 a 5 x 106 células T de expressão de CAR totais, 1 x 106 a 2,5 x 106 células T de expressão de CAR totais, 2,5 x 106 a 5 x 108 células T de expressão de CAR totais, 2,5 x 106 a 2,5 x 108 células T de expressão de CAR totais, 2,5 x 106 a 1 x 108 células T de expressão de CAR totais, 2,5 x 106 a 5 x 107 células T de expressão de CAR totais, 2,5 x 106 a 2,5 x 107 células T de expressão de CAR totais, 2,5 x 106 a 1 x 107 células T de expressão de CAR totais, 2,5 x 106 a 5 x 106 células T de expres- são de CAR totais, 5 x 106 a 5 x 108 células T de expressão de CAR totais, 5 x 106 a 2,5 x 108 células T de expressão de CAR totais, 5 x 106 a 1 x 108 células T de expressão de CAR totais, 5 x 106 a 5 x 107 células T de expressão de CAR totais, 5 x 106 a 2,5 x 107 células T de expressão de CAR totais, 5 x 106 a 1 x 107 células T de expressão de CAR totais, 1 x 107 a 5 x 108 células T de expressão de CAR totais, 1 x 107 a 2,5 x 108 células T de expressão de CAR totais, 1 x 107 a 1 x 108 células T de expressão de CAR totais, 1 x 107 a 5 x 107 células T de expressão de CAR totais, 1 x 107 a 2,5 x 107 células T de expressão de CAR totais, 2,5 x 107 a 5 x 108 células T de expressão de CAR to-
tais, 2,5 x 107 a 2,5 x 108 células T de expressão de CAR totais, 2,5 x 107 a 1 x 108 células T de expressão de CAR totais, 2,5 x 107 a 5 x 107 células T de expressão de CAR totais, 5 x 107 a 5 x 108 células T de expressão de CAR totais, 5 x 107 a 2,5 x 108 células T de expressão de CAR totais, 5 x 107 a 1 x 108 células T de expressão de CAR totais, 1 x 108 a 5 x 108 células T de expressão de CAR totais, 1 x 108 a 2,5 x 108 células T de expressão de CAR totais, ou 2,5 x 108 a 5 x 108 célu- las T de expressão de CAR totais.
[00526] Em algumas modalidades, por exemplo, onde o indivíduo é um humano, a dose inclui menos de cerca de 1 x 108 células totais de expressão de receptor recombinante (por exemplo, CAR), células T ou células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), por exemplo, na faixa de cerca de 1 x 106 a 1 x 108 dessas células, como 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107 ou 1 x 108 ou o total de tais células ou no inter- valo entre dois dos valores anteriores. Em algumas modalidades, onde o indivíduo é um humano, a dose inclui entre cerca de 1 x 106 e 3 x 108 células totais de expressão de receptor recombinante (por exemplo, CAR), por exemplo, na faixa de cerca de 1 x 107 a 2 x 108, tais células, como 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108 ou 1,5 x 108 total de tais células, ou a faixa entre quaisquer dois dos anteriores valores. Em algumas modali- dades, o paciente recebe doses múltiplas e cada uma das doses ou a dose total pode estar dentro de qualquer um dos valores anteriores. Em algumas modalidades, a dose de células compreende a adminis- tração de 1 x 105 a 5 x 108 ou de cerca de 1 x 105 a cerca de 5 x 108 células T de expressão de receptores recombinantes totais ou células T totais, de 1 x 105 a 1 x 108 ou de cerca de 1 x 105 a cerca de 1 x 108 células T de expressão de receptores recombinantes totais ou células T totais, de 5 x 105 a 1 x 107 ou de cerca de 5 x 105 a cerca de 1 x 107 células T de expressão de receptores recombinantes totais ou células T totais, ou de 1 x 106 a 1 x 107 ou de cerca de 1 x 106 a cerca de 1 x
107 células T de expressão de receptores recombinantes totais ou cé- lulas T totais, cada uma inclusive.
[00527] Em algumas modalidades, as células T da dose incluem células T CD4+, células T CD8+ ou células T CD4+ e CD8+.
[00528] Em algumas modalidades, por exemplo, onde ao indivíduo é humano, as células T CD8+ da dose, incluindo em uma dose incluin- do células T CD4+ e CD8+, incluem entre cerca de 1 x 106 e 1 x 108 células CD8+ totais de expressão de receptor recombinante (por exemplo, CAR), por exemplo, na faixa de cerca de 5 x 106 a 1 x 108 tais células, tais células 1 x 107, 2,5 x 107, 5 x 107, 7,5 x 107 ou 1 x 108 total de tais células ou a faixa entre dois dos valores anteriores. Em algumas modalidades, o paciente recebe doses múltiplas e cada uma das doses ou a dose total pode estar dentro de qualquer um dos valo- res anteriores. Em algumas modalidades, a dose de células compre- ende a administração de 1 x 107 a 0,75 x 108 ou de cerca de 1 x 107 a cerca de 0,75 x 108 células T CD8+ totais de expressão de receptores recombinantes, a partir de 1 x 107 a 2,5 x 107 ou de cerca de 1 x 107 a cerca de 2,5 x 107 células T CD8+ totais de expressão de receptores recombinantes, a partir de 1 x 107 a 0,75 x 108 ou de cerca de 1 x 107 a cerca de 0,75 x 108 células T CD8+ totais de expressão de recepto- res recombinantes, cada um inclusive. Em algumas modalidades, a dose de células compreende a administração de cerca de 1 x 107, 2,5 x 107, 5 x 107 7,5 x 107 ou 1 x 108 células T CD8+ totais de expressão de receptores recombinantes.
[00529] Em algumas modalidades, por exemplo, onde ao indivíduo é humano, as células T CD4+ da dose, inclusive em uma dose incluin- do células T CD4+ e CD8+, incluem entre cerca de 1 x 106 e 1 x 108 células CD4+ totais de expressão de receptor recombinante (por exemplo, CAR), por exemplo, na faixa de cerca de 5 x 106 a 1 x 108 células, tais células 1 x 107, 2,5 x 107, 5 x 107, 7,5 x 107 ou 1 x 108 total de tais células ou a faixa entre dois dos valores anteriores. Em algu- mas modalidades, o paciente recebe doses múltiplas e cada uma das doses ou a dose total pode estar dentro de qualquer um dos valores anteriores. Em algumas modalidades, a dose de células compreende a administração de 1 x 107 a 0,75 x 108 ou de cerca de 1 x 107 a cerca de 0,75 x 108 células T CD4+ totais de expressão de receptores re- combinantes, de 1 x 107 a 2,5 x 107 ou de cerca de 1 x 107 a cerca de 2,5 x 107 células T CD4+ totais de expressão de receptores recombi- nantes, de 1 x 107 a 0,75 x 108 ou de cerca de 1 x 107 a cerca de 0,75 x 108 células T CD4+ totais de expressão de receptores recombinan- tes, cada um inclusive. Em algumas modalidades, a dose de células compreende a administração de cerca de 1 x 107, 2,5 x 107, 5 x 107 7,5 x 107 ou 1 x 108 células T CD4+ totais de expressão de receptores re- combinantes.
[00530] Em algumas modalidades, a dose de células, por exemplo, células T de expressão de receptores recombinantes, é administrada ao indivíduo como uma dose única ou é administrada apenas uma vez dentro de um período de duas semanas, um mês, três meses, seis meses, 1 ano ou mais.
[00531] No contexto da terapia celular adotiva, a administração de uma determinada "dose" abrange a administração da quantidade ou número de células especificadas como uma composição única e/ou administração ininterrupta única, por exemplo, como uma injeção única ou infusão contínua, e também abrange a administração da quantida- de ou número dado de células como uma dose dividida ou como várias composições, fornecidas em múltiplas composições ou infusões indivi- duais, durante um período de tempo especificado, como por um perío- do não superior a 3 dias. Assim, em alguns contextos, a dose é uma administração única ou contínua do número especificado de células, administrado ou iniciado em um único momento. Em alguns contextos,
no entanto, a dose é administrada em várias injeções ou infusões por um período não superior a três dias, como uma vez ao dia por três di- as ou por dois dias ou por múltiplas infusões durante um único dia.
[00532] Assim, em alguns aspectos, as células da dose são admi- nistradas em uma única composição farmacêutica. Em algumas moda- lidades, as células da dose são administradas em várias composições, contendo coletivamente as células da dose.
[00533] Em algumas modalidades, o termo "dose dividida" refere-se a uma dose que é dividida para que seja administrado por mais de um dia. Este tipo de dosagem é abrangido pelos presentes métodos e é considerado uma dose única.
[00534] Assim, a dose de células pode ser administrada como uma dose dividida, por exemplo, uma dose dividida administrada ao longo do tempo. Por exemplo, em algumas modalidades, a dose pode ser administrada ao indivíduo durante 2 dias ou durante 3 dias. Métodos exemplares para dosagem dividida incluem administrar 25 % da dose no primeiro dia e administrar os 75 % restantes da dose no segundo dia. Em outras modalidades, 33 % da dose pode ser administrada no primeiro dia e os restantes 67 % administrados no segundo dia. Em alguns aspectos, 10 % da dose são administrados no primeiro dia, 30 % da dose são administrados no segundo dia e 60 % da dose são ad- ministrados no terceiro dia. Em algumas modalidades, a dose dividida não é espalhada por mais de 3 dias.
[00535] Em algumas modalidades, as células da dose podem ser administradas pela administração de várias composições ou soluções, como uma primeira e uma segunda, opcionalmente mais, cada uma contendo algumas células da dose. Em alguns aspectos, a pluralidade de composições, cada uma contendo uma população diferente e/ou subtipos de células, é administrada separadamente ou independente- mente, opcionalmente dentro de certo período de tempo. Por exemplo,
as populações ou subtipos de células podem incluir células T CD8+ e CD4+, respectivamente, e/ou populações enriquecidas com CD8+ e CD4+, respectivamente, por exemplo, células T CD4+ e/ou CD8+, ca- da uma delas individualmente, incluindo células geneticamente modifi- cadas para expressar o receptor recombinante. Em algumas modali- dades, a administração da dose compreende a administração de uma primeira composição compreendendo uma dose de células T CD8+ ou uma dose de células T CD4+ e a administração de uma segunda com- posição compreendendo a outra dose da célula T CD4+ e as células T CD8+ .
[00536] Em algumas modalidades, a administração da composição ou dose, por exemplo, administração da pluralidade de composições celulares, envolve a administração das composições celulares separa- damente. Em algumas modalidades, as composições de células são composições de saída separadas produzidas pelos métodos forneci- dos, como descrito na Seção I. Em alguns aspectos, as administra- ções separadas são realizadas simultaneamente ou sequencialmente, em qualquer ordem. Em algumas modalidades, a dose compreende uma primeira composição e uma segunda composição, e a primeira composição e a segunda composição são administradas com intervalo de 0 a 12 horas, intervalo de 0 a 6 horas ou intervalo de 0 a 2 horas. Em algumas modalidades, o início da administração da primeira com- posição e o início da administração da segunda composição são reali- zados não mais que 2 horas, não mais que 1 hora ou não mais que 30 minutos separados, não mais que 15 minutos, não mais que 10 minu- tos ou não mais que 5 minutos. Em algumas modalidades, a iniciação e/ou conclusão da administração da primeira composição e a conclu- são e/ou iniciação da administração da segunda composição são reali- zadas não mais que 2 horas, não mais que 1 hora ou não mais que 30 minutos separados, não mais que 15 minutos, não mais que 10 minu-
tos ou não mais que 5 minutos.
[00537] Em algumas composições, a primeira composição, por exemplo, primeira composição da dose, compreende células T CD4+. Em alguma composição, a primeira composição, por exemplo, a pri- meira composição da dose, compreende células T CD8+. Em algumas modalidades, a primeira composição é administrada antes da segunda composição.
[00538] Em algumas modalidades, a dose ou composição de célu- las inclui uma relação definida ou alvo de células T CD4+ que expres- sam um receptor recombinante para células T CD8+ que expressam um receptor recombinante e/ou de células T CD4+ para células T CD8+, cuja relação é opcional é cerca de 1:1 ou está entre cerca de 1: 3 e cerca de 3:1, como cerca de 1:1. Em alguns aspectos, a adminis- tração de uma composição ou dose com a relação desejada ou dese- jada de diferentes populações celulares (como a relação CD4+ : CD8+ ou a relação CAR+ CD4+ : CAR+ CD8+, por exemplo, 1:1) envolve a administração de uma célula composição contendo uma das popula- ções e, em seguida, administração de uma composição celular sepa- rada compreendendo a outra das populações, em que a administração está no ou cerca de no alvo ou na relação desejada. Em alguns aspec- tos, a administração de uma dose ou composição de células em uma relação definida leva a uma expansão melhorada, persistência e/ou atividade antitumoral da terapia com células T.
[00539] Em algumas modalidades, ao indivíduo é administrado do- ses múltiplas, por exemplo, duas ou mais doses ou doses consecuti- vas múltiplas, das células. Em algumas modalidades, duas doses são administradas a um indivíduo. Em algumas modalidades, ao indivíduo é administrada a dose consecutiva, por exemplo, segunda dose, é administrada cerca de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20 ou 21 dias após a primeira dose. Em algumas modalidades,
várias doses consecutivas são administradas após a primeira dose, de modo que uma dose ou doses adicionais sejam administradas após a administração da dose consecutiva. Em alguns aspectos, o número de células administradas ao indivíduo na dose adicional é igual ou seme- lhante à primeira dose e/ou dose consecutiva. Em algumas modalida- des, a dose ou doses adicionais são maiores que as doses anteriores.
[00540] Em alguns aspectos, o tamanho da primeira e/ou dose con- secutiva é determinado com base em um ou mais critérios, como res- posta do indivíduo ao tratamento anterior, por exemplo. quimioterapia, carga de doença no indivíduo, como carga tumoral, volume, tamanho ou grau, extensão ou tipo de metástase, estágio e/ou probabilidade ou incidência do indivíduo desenvolver resultados tóxicos, por exemplo, SRC, síndrome de ativação de macrófagos, síndrome de lise tumoral, neurotoxicidade e/ou uma resposta imune do hospedeiro contra as cé- lulas e/ou receptores recombinantes sendo administrados.
[00541] Em alguns aspectos, o tempo entre a administração da pri- meira dose e a administração da dose consecutiva é de cerca de 9 a cerca de 35 dias, cerca de 14 a cerca de 28 dias ou 15 a 27 dias. Em algumas modalidades, a administração da dose consecutiva é em um ponto no tempo maior de cerca de 14 dias após e menos de cerca de 28 dias após a administração da primeira dose. Em alguns aspectos, o tempo entre a primeira e a dose consecutiva é de cerca de 21 dias. Em algumas modalidades, uma dose ou doses adicionais, por exem- plo, doses consecutivas, são administradas após a administração da dose consecutiva. Em alguns aspectos, a dose ou doses consecutivas adicionais são administradas pelo menos cerca de 14 e menos de cer- ca de 28 dias após a administração de uma dose anterior. Em algumas modalidades, a dose adicional é administrada menos de cerca de 14 dias após a dose anterior, por exemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 dias após a dose anterior. Em algumas modalidades, nenhuma do-
se é administrada menos de cerca de 14 dias após a dose anterior e/ou nenhuma dose é administrada mais de cerca de 28 dias após a dose anterior.
[00542] Em algumas modalidades, a dose de células, por exemplo, células de expressão de receptores recombinantes, compreende duas doses (por exemplo, uma dose dupla), compreendendo uma primeira dose das células T e uma dose consecutiva das células T, em que uma ou ambas da primeira dose e a segunda dose compreende a ad- ministração da dose dividida de células T.
[00543] Em algumas modalidades, a dose de células é geralmente grande o suficiente para ser eficaz na redução da carga da doença.
[00544] Em algumas modalidades, as células são administradas na dosagem desejada, que em alguns aspectos inclui uma dose ou núme- ro desejado de células ou tipo (s) de célula e/ou uma relação desejada de tipos de célula. Assim, a dosagem de células em algumas modali- dades é baseada em um número total de células (ou número por kg de peso corporal) e uma relação desejada das populações ou subtipos individuais, como a relação CD4+ para CD8+. Em algumas modalida- des, a dosagem de células é baseada em um número total desejado (ou número por kg de peso corporal) de células nas populações indivi- duais ou nos tipos de células individuais. Em algumas modalidades, a dosagem é baseada em uma combinação de tais características, como um número desejado de células totais, relação desejada e número to- tal desejado de células nas populações individuais.
[00545] Em algumas modalidades, as populações ou subtipos de células, como as células T CD8+ e CD4+, são administradas na ou dentro de uma diferença tolerada de uma dose desejada do total de células, como uma dose desejada de células T. Em alguns aspectos, a dose desejada é um número desejado de células ou um número dese- jado de células por unidade de peso corporal do indivíduo ao qual as células são administradas, por exemplo, células/kg. Em alguns aspec- tos, a dose desejada é igual ou superior a um número mínimo de célu- las ou número mínimo de células por unidade de peso corporal. Em alguns aspectos, entre as células totais, administradas na dose dese- jada, as populações ou subtipos individuais estão presentes em uma taxa de saída desejada ou próxima a ela (como a relação CD4+ a CD8+), por exemplo, dentro de certa diferença tolerada ou erro dessa relação.
[00546] Em algumas modalidades, as células são administradas a uma diferença tolerada de uma dose desejada de uma ou mais das populações individuais ou subtipos de células, como uma dose dese- jada de células T CD4+ e/ou uma dose desejada de células T CD8+. Em alguns aspectos, a dose desejada é um número desejado de célu- las do subtipo ou população, ou um número desejado dessas células por unidade de peso corporal do indivíduo ao qual as células são ad- ministradas, por exemplo, células/kg. Em alguns aspectos, a dose de- sejada é igual ou superior a um número mínimo de células da popula- ção ou subtipo ou número mínimo de células da população ou subtipo por unidade de peso corporal.
[00547] Assim, em algumas modalidades, a dosagem é baseada em uma dose fixa desejada de células totais e em uma relação dese- jada, e/ou em uma dose fixa desejada de um ou mais, por exemplo, cada um dos subtipos individuais ou subpopulações. Assim, em algu- mas modalidades, a dosagem é baseada em uma dose fixa ou mínima desejada de células T e uma relação desejada de células T CD4+ para CD8+ e/ou é baseada em uma dose fixa ou mínima desejada de célu- las T CD4+ e/ou CD8+.
[00548] Em algumas modalidades, as células são administradas em ou dentro de um intervalo tolerado de uma taxa de saída desejada de várias populações ou subtipos de células, como células T CD4+ e
CD8+ ou subtipos. Em alguns aspectos, a relação desejada pode ser uma relação específica ou uma faixa de relações. por exemplo, em algumas modalidades, a relação desejada (por exemplo, relação de células T CD4+ para CD8+) está entre cerca de 5:1 e cerca de 5:1 (ou maior que 5:1 (ou maior que 1:5 e menor que 5) : 1) ou entre cerca de 1:3 e cerca de 3:1 (ou maior que 1:3 e menor que cerca de 3:1), como entre cerca de 2:1 e cerca de 1:3:5 (ou superior a cerca de 1:5 e inferi- or a cerca de 2:1, como em ou cerca de 5:1, 4,5:1, 4: 1, 3,5:1, 3:1, 2,5:1, 2:1, 1,9:1, 1,8:1, 1,7:1, 1,6:1, 1,5:1, 1,4:1, 1,3:1, 1,2:1, 1,1:1, 1:1, 1:1,1, 1:1,2, 1:1,3, 1:1,4, 1:1,5, 1:1,6, 1:1,7, 1:1,8, 1:1,9:1: 2, 1: 2,5, 1:3, 1:3,5, 1:4, 1:4,5 , ou 1:5. Em alguns aspectos, a diferença tolerada é de cerca de 1 %, cerca de 2 %, cerca de 3 %, cerca de 4 % cerca de 5 %, cerca de 10 %, cerca de 15 %, cerca de 20 %, cerca de 25 %, cerca de 30 %, cerca de 35 %, cerca de 40 %, cerca de 45 %, cerca de 50 % da relação desejada, incluindo qualquer valor entre esses in- tervalos. Em certas modalidades, as composições de células T CD4+ enriquecidas e células T CD8+ enriquecidas são combinadas na rela- ção desejada e administrada ao indivíduo como uma composição celu- lar única. Em uma modalidade particular, as composições de células T CD4+ enriquecidas e células T CD8+ enriquecidas são administradas como composições separadas na relação desejada.
[00549] Em modalidades particulares, os números e/ou concentra- ções de células se referem ao número de células de expressão de re- ceptores recombinantes (por exemplo, CAR). Em outras modalidades, os números e/ou concentrações de células se referem ao número ou concentração de todas as células, células T ou células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) administradas.
[00550] Em alguns aspectos, o tamanho da dose é determinado com base em um ou mais critérios, como resposta do indivíduo ao tra- tamento anterior, por exemplo, quimioterapia, carga de doença no in-
divíduo, como carga tumoral, volume, tamanho ou grau, extensão ou tipo de metástase, estágio e/ou probabilidade ou incidência do indiví- duo desenvolver resultados tóxicos, por exemplo, SRC, síndrome de ativação de macrófagos, síndrome de lise tumoral, neurotoxicidade e/ou uma resposta imune do hospedeiro contra as células e/ou recep- tores recombinantes sendo administrados.
[00551] Em algumas modalidades, os métodos também incluem a administração de uma ou mais doses adicionais de células que ex- pressam um receptor de antígeno quimérico (CAR) e/ou terapia para linfonodos, e/ou uma ou mais etapas dos métodos são repetidas. Em algumas modalidades, as referidas uma ou mais doses adicionais é a mesma que a dose inicial. Em algumas modalidades, as referidas uma ou mais doses adicionais é diferente da dose inicial, por exemplo, mais alta, como 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 ve- zes , 9 vezes ou 10 vezes ou mais que a dose inicial ou mais baixa, como por exemplo, mais alta, como 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 ve- zes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes ou 10 vezes ou mais que a dose inicial. Em algumas modalidades, a administração de uma ou mais doses adicionais é determinada com base na resposta do indiví- duo ao tratamento inicial ou a qualquer tratamento anterior, carga de doença no indivíduo, como carga tumoral, volume, tamanho ou grau, extensão ou tipo de metástase, estágio e/ou probabilidade ou incidên- cia do indivíduo desenvolver resultados tóxicos, por exemplo, SRC, síndrome de ativação de macrófagos, síndrome de lise tumoral, neuro- toxicidade e/ou uma resposta imune do hospedeiro contra as células e/ou receptores recombinantes sendo administrados. A. Resposta, Atividade e Sobrevivência
[00552] Em algumas modalidades, células, por exemplo, células de saída, produzidas pelos métodos aqui fornecidos, por exemplo, como descrito na Seção I, são administradas a um indivíduo, e ao indivíduo é monitorado quanto à resposta, sobrevivência e/ou sinais ou sintomas de toxicidade.
[00553] Em algumas modalidades, pelo menos 35 %, pelo menos 40 % ou pelo menos 50 % dos indivíduos tratados com composições de células, por exemplo, composições de células terapêuticas conten- do células T CAR+ CD4+ e CD8+, produzem remissão (CR); e/ou pelo menos 50 %, pelo menos 60 % ou pelo menos 70 % dos indivíduos tratados de acordo com o método atingem taxa de resposta objetiva (ORR). Em algumas modalidades, pelo menos ou cerca de 50 % dos indivíduos, pelo menos ou cerca de 60 % dos indivíduos, pelo menos ou cerca de pelo menos 70 % dos indivíduos, pelo menos ou cerca de 80 % dos indivíduos ou pelo menos ou cerca de pelo menos 90 % dos indivíduos tratados de acordo com o método atingem CR e/ou alcan- çam uma resposta objetiva (OR). Em algumas modalidades, os crité- rios avaliados para o tratamento eficaz incluem taxa de resposta geral (ORR), resposta completa (CR), duração da resposta (DOR) de sobre- vida livre de progressão (PFS) e/ou sobrevida global (OS).
[00554] Em algumas modalidades, pelo menos 40 % ou pelo menos 50 % dos indivíduos tratados de acordo com os métodos aqui forneci- dos alcançam remissão completa (CR), exibem sobrevida livre de pro- gressão (PFS) e/ou sobrevida global (OS) superior a cerca de 3 me- ses, 6 meses ou 12 meses; em média, indivíduos tratados de acordo com o método exibem uma PFS ou OS mediana superior a cerca de 6 meses, 12 meses ou 18 meses; e/ou o indivíduo exibe PFS ou OS após a terapia por pelo menos cerca de 6, 12, 18 ou mais meses.
[00555] Em alguns aspectos, as taxas de resposta em indivíduos, como indivíduos com LNH, são baseadas nos critérios de Lugano. (Cheson et al., (2014) JCO 32 (27): 3059-3067; Johnson et al., (2015) Radiology 2: 323–338; Cheson, BD (2015) Chin Clin Oncol 4 (1): 5). Em alguns aspectos, a avaliação da resposta utiliza qualquer método clínico, hematológico e/ou molecular. Em alguns aspectos, a resposta avaliada usando os critérios de Lugano envolve o uso da tomografia computadorizada (CT) por tomografia de emissão de pósitrons (PET) e/ou CT, conforme apropriado. As avaliações de PET-CT podem ainda compreender o uso de fluorodeoxiglucose (FDG) para linfomas ávidos por FDG. Em alguns aspectos, onde a PET-CT será usada para avali- ar a resposta em histologias ávidas por FDG, uma escala de 5 pontos pode ser usada. Em alguns aspectos, a escala de 5 pontos compreen- de os seguintes critérios: 1, sem captação acima da base; 2, captação ≤ mediastino; 3, captação > mediastino, porém ≤ fígado; 4, captação moderada > fígado; 5, captação acentuadamente superior ao fígado e/ou novas lesões; X, é improvável que novas áreas de captação este- jam relacionadas ao linfoma.
[00556] Em alguns aspectos, uma resposta completa, conforme descrito usando os critérios de Lugano, envolve uma resposta metabó- lica completa e uma resposta radiológica completa em vários sítios mensuráveis. Em alguns aspectos, esses sítios incluem linfonodos e sítios extralinfáticos, em que uma CR é descrita como uma pontuação de 1, 2 ou 3 com ou sem uma massa residual na escala de 5 pontos, quando a PET-CT é usada. Em alguns aspectos, no anel de Waldeyer ou em sítios extranodais com alta captação fisiológica ou com ativação no baço ou na medula (por exemplo, com quimioterapia ou fatores es- timuladores de colônias mieloides), a captação pode ser maior que o mediastino e/ou o fígado normais. Nessa circunstância, a resposta me- tabólica completa pode ser inferida se a captação nos sítios de envol- vimento inicial não for maior do que o tecido normal circundante, mesmo que o tecido tenha uma captação fisiológica alta. Em alguns aspectos, a resposta é avaliada nos linfonodos usando a CT, em que uma CR é descrita como nenhum local extralinfático da doença e os nodos/massas nodais alvo devem regredir para ≤ 1,5 cm no maior di-
âmetro transversal de uma lesão (LDi). Outros sítios de avaliação in- cluem a medula óssea em que a avaliação baseada em PET-CT deve indicar uma falta de evidência de doença ávida por FDG na medula e uma avaliação baseada em CT deve indicar uma morfologia normal que, se indeterminada, deve ser negativa para IHC. Outros sítios po- dem incluir a avaliação do aumento de órgãos, que deve regredir ao normal. Em alguns aspectos, lesões não mensuradas e novas lesões são avaliadas, as quais, no caso de CR, devem estar ausentes (Che- son et al., (2014) JCO 32 (27): 3059-3067; Johnson et al., (2015) Ra- diology 2 : 323-338; Cheson, BD (2015) Chin Clin Oncol 4 (1): 5).
[00557] Em alguns aspectos, uma resposta parcial (PR; também conhecida em alguns casos como remissão parcial), conforme descrito usando os critérios de Lugano, envolve uma resposta metabólica e/ou radiológica parcial em vários sítios mensuráveis. Em alguns aspectos, esses sítios incluem linfonodos e sítios extralinfáticos, em que uma PR é descrita como uma pontuação de 4 ou 5 com captação reduzida em comparação com as massa (s) residual (is) ou de referência de qual- quer tamanho, quando PET-CT é usada. Nesse ínterim, essas desco- bertas podem indicar a resposta da doença. No final do tratamento, essas descobertas podem indicar doença residual. Em alguns aspec- tos, a resposta é avaliada nos linfonodos usando CT, em que uma PR é descrita como uma redução de ≥ 50 % no SPD de até 6 nodos men- suráveis alvo e sítios extranodais. Se uma lesão for muito pequena para ser medida na CT, 5 mm × 5 mm são atribuídos como valor pa- drão; se a lesão não estiver mais visível, o valor é 0 mm × 0 mm; para um nodo > 5 mm × 5 mm, porém menor que o normal, as medidas re- ais são usadas para o cálculo. Outros sítios de avaliação incluem a medula óssea em que a avaliação baseada em PET-CT deve indicar uma captação residual superior à captação na medula normal, mas reduzida em comparação com a referência (captação difusa compatí-
vel com alterações reativas da quimioterapia permitida). Em alguns aspectos, se houver alterações focais persistentes na medula no con- texto de uma resposta nodal, deve-se considerar uma avaliação mais aprofundada com ressonância magnética ou biópsia ou uma varredura com intervalo. Em alguns aspectos, outros sítios podem incluir a avali- ação do aumento de órgãos, onde o baço deve ter regredido em > 50 % em comprimento além do normal. Em alguns aspectos, são avalia- das lesões não medidas e novas lesões, que no caso de PR devem estar ausentes/normais, regredidas, mas sem aumento. Doença sem resposta/estável (SD) ou a doença progressiva (PD) também pode ser medida usando PET-CT e/ou avaliações baseadas em CT. (Cheson et al., (2014) JCO 32 (27): 3059-3067; Johnson et al., (2015) Radiology 2: 323–338; Cheson, BD (2015) Chin Clin Oncol 4 (1): 5) .
[00558] Em alguns aspectos, a sobrevida livre de progressão (PFS) é descrita como o período de tempo durante e após o tratamento de uma doença, como o câncer, em que um indivíduo vive com a doença, mas não piora. Em alguns aspectos, a resposta objetiva (OR) é descri- ta como uma resposta mensurável. Em alguns aspectos, a taxa de resposta objetiva (ORR) é descrita como a relação de pacientes que atingiram CR ou PR. Em alguns aspectos, a sobrevida global (OS) é descrita como o período de tempo a partir da data do diagnóstico ou do início do tratamento de uma doença, como o câncer, em que os in- divíduos diagnosticados com a doença ainda estão vivos. Em alguns aspectos, a sobrevida livre de eventos (EFS) é descrita como o perío- do de tempo após o término do tratamento de um câncer para que o indivíduo permaneça livre de certas complicações ou eventos que o tratamento pretendia impedir ou retardar. Esses eventos podem incluir o retorno do câncer ou o aparecimento de certos sintomas, como dor óssea por câncer que se espalhou para o osso ou morte.
[00559] Em algumas modalidades, a medida da duração da respos-
ta (DOR) inclui o tempo desde a documentação da resposta do tumor até a progressão da doença. Em algumas modalidades, o parâmetro para avaliar a resposta pode incluir resposta durável, por exemplo, resposta que persiste após um período de tempo desde o início da te- rapia. Em algumas modalidades, a resposta durável é indicada pela taxa de resposta em cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18 ou 24 meses após o início da terapia. Em algumas modalidades, a res- posta é durável por mais de 3 meses ou mais de 6 meses.
[00560] Em alguns aspectos, o critério de RECIST é usado para determinar a resposta objetiva do tumor; em alguns aspectos, em tu- mores sólidos. (Eisenhauer et al., European Journal of Cancer 45 (2009) 228-247). Em alguns aspectos, o critério de RECIST é usado para determinar a resposta objetiva do tumor para lesões alvo. Em al- guns aspectos, uma resposta completa, conforme determinada pelo critério de RECIST, é descrita como o desaparecimento de todas as lesões alvo e qualquer linfonodo patológico (alvo ou não alvo) deve ter redução no eixo curto para < 10 mm. Em outros aspectos, uma respos- ta parcial, determinada pelo critério de RECIST, é descrita como uma redução de pelo menos 30 % na soma dos diâmetros das lesões alvo, tomando como referência os diâmetros da soma da referência. Em ou- tros aspectos, a doença progressiva (PD) é descrita como um aumento de pelo menos 20 % na soma dos diâmetros das lesões alvo, tomando como referência a menor soma no estudo (isso inclui a soma da refe- rência, se for a menor no estudo). Além do aumento relativo de 20 %, a soma também deve demonstrar um aumento absoluto de pelo me- nos 5 mm (em alguns aspectos, o aparecimento de uma ou mais no- vas lesões também é considerado progressão). Em outros aspectos, a doença estável (SD) não é descrita como retração suficiente para se qualificar para PR nem aumento suficiente para se qualificar para PD, tomando como referência os menores diâmetros de soma durante o estudo.
[00561] A carga da doença pode abranger um número total de célu- las da doença no indivíduo ou em um órgão, tecido ou fluido corporal do indivíduo, como o órgão ou tecido do tumor ou outro local, por exemplo, o que indicaria metástase. Por exemplo, as células tumorais podem ser detectadas e/ou quantificadas no sangue ou na medula ós- sea no contexto de certas neoplasias hematológicas. A carga da do- ença pode incluir, em algumas modalidades, a massa de um tumor, o número ou extensão de metástases e/ou a percentagem de células blásticas presentes na medula óssea.
[00562] Em algumas modalidades, um indivíduo tem leucemia. A extensão da carga da doença pode ser determinada pela avaliação da leucemia residual no sangue ou na medula óssea.
[00563] Em alguns aspectos, as taxas de resposta em indivíduos, como indivíduos com CLL, são baseadas nos critérios de resposta do Workshop Internacional sobre Leucemia Linfocítica Crônica (IWCLL) (Hallek, et al., Blood 2008, 15 de junho; 111 (12) : 5446-5456). Em al- guns aspectos, esses critérios são descritos a seguir: remissão com- pleta (CR; também conhecida em alguns casos como resposta com- pleta), que em alguns aspectos requer a ausência de linfócitos clonais do sangue periférico por imunofenotipagem, ausência de linfadenopa- tia, ausência de hepatomegalia ou esplenomegalia, ausência de sin- tomas constitucionais e contagem sanguínea satisfatória; remissão completa com recuperação medular incompleta (CRi), que em alguns aspectos é descrita como CR acima, mas sem hemograma; remissão parcial (PR; também conhecida em alguns casos como resposta parci- al), que em alguns aspectos é descrita como ≥ 50 % de queda na con- tagem de linfócitos, ≥ 50 % de redução na linfadenopatia ou ≥ 50 % de redução no fígado ou baço, juntamente com melhora na hemograma periférico; doença progressiva (PD), que em alguns aspectos é descri-
ta como aumento de ≥ 50 % na contagem de linfócitos para > 5 x 109/L, aumento de ≥ 50 % na linfadenopatia, aumento de ≥ 50 % no tamanho do fígado ou baço, transformação de Richter ou novas cito- penias devido à CLL; e doença estável, que em alguns aspectos é descrita como não atendendo aos critérios de CR, CRi, PR ou PD.
[00564] Em algumas modalidades, os indivíduos exibem uma CR ou OR se, dentro de 1 mês após a administração da dose das células, os linfonodos no indivíduo tiverem menos do que cerca de 20 mm de tamanho, menos do que 10 ou cerca de 10 mm ou menor que ou igual a 10 mm.
[00565] Em algumas modalidades, um clone índice da CLL não é detectado na medula óssea do indivíduo (ou na medula óssea superior a 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais dos indivíduos tratados de acordo com os métodos. Em algumas modalidades, um clone índice da CLL é avaliado por sequenciamento profundo de IgH. Em algumas modalidades, o clone índice não é detectado em um momento que é igual ou próximo a, ou pelo menos igual a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 18 ou 24 meses após a administração das células.
[00566] Em algumas modalidades, um indivíduo exibe doença mor- fológica se houver blastos maiores ou iguais a 5 % na medula óssea, por exemplo, como detectado por microscopia óptica, como blastos maiores ou iguais a 10 % no osso medula óssea, maior ou igual a 20 % dos blastos na medula óssea, maior ou igual a 30 % dos blastos na medula óssea, maior ou igual a 40 % dos blastos na medula óssea ou maior ou igual a 50 % dos blastos na medula óssea a medula óssea. Em algumas modalidades, um indivíduo exibe remissão completa ou clínica se houver menos de 5 % de blastos na medula óssea.
[00567] Em algumas modalidades, um indivíduo tem leucemia. A extensão da carga da doença pode ser determinada pela avaliação da leucemia residual no sangue ou na medula óssea.
[00568] Em algumas modalidades, um indivíduo exibe doença mor- fológica se houver blastos maiores ou iguais a 5 % na medula óssea, por exemplo, como detectado por microscopia óptica, como blastos maiores ou iguais a 10 % dos blastos na medula óssea, maior ou igual a 20 % dos blastos na medula óssea, maior ou igual a 30 % dos blas- tos na medula óssea, maior ou igual a 40 % dos blastos na medula óssea ou maior ou igual a 50 % dos blastos na medula óssea a medu- la óssea. Em algumas modalidades, um indivíduo exibe remissão completa ou clínica se houver menos de 5 % de blastos na medula ós- sea.
[00569] Em algumas modalidades, um indivíduo pode exibir remis- são completa, mas uma pequena relação de células leucêmicas resi- duais morfologicamente indetectáveis (por técnicas de microscopia óptica) está presente. Diz-se que um indivíduo exibe doença residual mínima (MRD) se o indivíduo exibir menos de 5 % de blastos na me- dula óssea e exibir câncer molecularmente detectável. Em algumas modalidades, o câncer molecularmente detectável pode ser avaliado usando qualquer uma de uma variedade de técnicas moleculares que permitem a detecção sensível de um pequeno número de células. Em alguns aspectos, essas técnicas incluem ensaios de PCR, que podem determinar rearranjos únicos de genes de receptores de células Ig/T ou transcrições de fusão produzidos por translocações cromossômi- cas. Em algumas modalidades, a citometria de fluxo pode ser usada para identificar células cancerígenas com base em imunofenótipos es- pecíficos de leucemia. Em algumas modalidades, a detecção molecu- lar de câncer pode detectar até 1 célula de leucemia em 100.000 célu- las normais. Em algumas modalidades, um indivíduo exibe MRD que é molecularmente detectável se pelo menos ou maior que 1 célula de leucemia em 100.000 células for detectada, como por PCR ou citome- tria de fluxo. Em algumas modalidades, a carga de doença de um indi-
víduo é molecularmente indetectável ou MRD-, de modo que, em al- guns casos, nenhuma célula de leucemia seja capaz de ser detectada no indivíduo usando técnicas de PCR ou citometria de fluxo.
[00570] Em algumas modalidades, um clone índice da leucemia, por exemplo, CLL, não é detectado na medula óssea do indivíduo (ou na medula óssea superior a 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais dos indivíduos tratados de acordo com os métodos. Em algumas mo- dalidades, um clone de índice da leucemia, por exemplo, CLL, é avali- ado por sequenciamento profundo de IGH. Em algumas modalidades, o clone de índice não é detectado em um momento que é igual ou su- perior a 1, 2, 3, 4, 5 , 6, 12, 18 ou 24 meses após a administração das células.
[00571] Em alguns aspectos, a MRD é detectada por citometria de fluxo. A citometria de fluxo pode ser usada para monitorar amostras de medula óssea e de sangue periférico de células cancerígenas. Em as- pectos particulares, a citometria de fluxo é usada para detectar ou mo- nitorar a presença de células cancerígenas na medula óssea. Em al- guns aspectos, a detecção imunológica multiparâmetros por citometria de fluxo é usada para detectar células cancerígenas (veja, por exem- plo, Coustan-Smith et al., (1998) Lancet 351:550-554). Em alguns as- pectos, a detecção imunológica multiparâmetros por citometria de massa é usada para detectar células cancerígenas. Em alguns exem- plos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 parâmetros podem ser usado para detectar células cancerí- genas. Os antígenos usados para detecção são selecionados com ba- se no câncer que está sendo detectado (Foon e Todd (1986) Blood 68:1-31).
[00572] Em algumas modalidades, a administração de uma dose ou composição de células produzidas pelos métodos aqui fornecidos re- duz a carga da doença ou condição, por exemplo, número de células tumorais, tamanho do tumor, duração da sobrevivência do paciente ou sobrevida livre de eventos, em maior grau e/ou por um período maior de tempo em comparação com a redução que seria observada com um método comparável usando células geradas por um processo al- ternativo. Em algumas modalidades, a carga de uma doença ou condi- ção no indivíduo é detectada, avaliada ou medida. A carga de doença pode ser detectada em alguns aspectos pela detecção do número total de doenças ou células associadas a doenças, por exemplo, células tumorais, no indivíduo, ou em um órgão, tecido ou fluido corporal do indivíduo, como sangue ou soro. Em alguns aspectos, a sobrevivência do indivíduo, a sobrevivência dentro de um determinado período de tempo, a extensão da sobrevivência, a presença ou a duração da so- brevida livre de eventos ou sem sintomas, ou sobrevida livre de recaí- da, é avaliada. Em algumas modalidades, qualquer sintoma da doença ou condição é avaliado. Em algumas modalidades, a medida da carga de doença ou condição é especificada.
[00573] Em algumas modalidades, a taxa de sobrevivência livre de eventos ou taxa de sobrevivência geral do indivíduo é melhorada pela administração de células produzidas a partir dos métodos fornecidos, por exemplo, os métodos descritos na Seção-I, em comparação com a célula gerada por métodos alternativos. Por exemplo, em algumas modalidades, a taxa ou probabilidade de sobrevida livre de eventos para indivíduos tratados pelos métodos aos 6 meses após a dose é maior que cerca de 40 %, maior que cerca de 50 %, maior que cerca de 60 %, maior que cerca de 70 %, superior a cerca de 80 %, superior a cerca de 90 % ou superior a cerca de 95 %. Em alguns aspectos, a taxa de sobrevivência geral é superior a cerca de 40 %, superior a cer- ca de 50 %, superior a cerca de 60 %, superior a cerca de 70 %, supe- rior a cerca de 80 %, superior a cerca de 90 % ou superior a cerca de 95 %. Em algumas modalidades, o indivíduo tratado com as células produzidas pelos métodos fornecidos exibe sobrevida livre de eventos, sobrevida livre de recaída ou sobrevida por pelo menos 6 meses ou pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 anos. Em algumas modalida- des, o tempo para progressão é melhorado, como um tempo para pro- gressão superior a cerca de 6 meses ou pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 anos.
[00574] Em algumas modalidades, após o tratamento pelo método, a probabilidade de recaída é reduzida em comparação com outros mé- todos, por exemplo, métodos nos quais ao indivíduo é administrado uma terapia celular contendo células produzidas por métodos alterna- tivos. Por exemplo, em algumas modalidades, a probabilidade de reca- ída aos 6 meses após a primeira dose é menor que cerca de 80 %, menor que cerca de 70 %, menor que cerca de 60 %, menor que cerca de 50 %, menor que cerca de 40 %, menor cerca de 30 %, menos de cerca de 20 % ou menos de cerca de 10 %. B. Toxicidade
[00575] Em certas modalidades, células, por exemplo, células de saída, produzidas pelos métodos aqui fornecidos, por exemplo, como descrito na Seção I, são administradas a um indivíduo, e ao indivíduo é monitorado quanto a sinais ou sintomas de toxicidade.
[00576] Em certas modalidades, a dose ou composição de células, por exemplo, células de saída produzidas pelos métodos fornecidos, resulta em uma taxa mais baixa e/ou menor grau de toxicidade, resul- tado ou sintoma tóxico, perfil, fator ou propriedade de promoção de toxicidade, como um sintoma ou resultado associado ou indicativo da síndrome de liberação de citocinas (SRC) ou neurotoxicidade, por exemplo, em comparação com a administração de uma terapia celular alternativa, como uma composição de células T CAR+ produzida por um processo alternativo.
[00577] Em algumas modalidades, a administração de células pro-
duzidas pelos métodos fornecidos não resulta em uma alta taxa ou probabilidade de toxicidade ou resultados tóxicos, nem reduz a taxa ou probabilidade de toxicidade ou resultados tóxicos, como neurotoxici- dade (NT), síndrome de liberação de citocinas (SRC), como em com- paração com outras terapias celulares e/ou células produzidas por mé- todos alternativos.
Em algumas modalidades, a administração das cé- lulas, por exemplo, células de saída, produzidas pelos métodos forne- cidos, resulta ou não aumenta o risco de NT grave (sNT), CRS grave (sCRS), síndrome de ativação de macrófagos, síndrome de lise tumo- ral, febre de pelo menos 38 graus Celsius por cerca de três dias ou mais e um nível plasmático de CRP de pelo menos 20 mg/dL.
Em al- gumas modalidades, maior ou maior que cerca de 30 %, 35 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 % ou mais dos indivíduos tratados de acordo com os métodos fornecidos não exibem nenhum grau de CRS ou qualquer grau de neurotoxicidade.
Em algumas modalidades, não mais de 50 % dos indivíduos tratados (por exemplo, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 % ou mais dos indivíduos tra- tados) exibem uma síndrome de liberação de citocinas (SRC) maior que grau 2 e/ou neurotoxicidade superior ao grau 2. Em algumas mo- dalidades, pelo menos 50 % dos indivíduos tratados de acordo com o método, por exemplo, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo me- nos 80 %, pelo menos 90 % ou mais dos indivíduos tratados) não apresentam um resultado tóxico grave (por exemplo, SRC grave ou neurotoxicidade grave), como não expõem o grau 3 ou superior neuro- toxicidade e/ou não exibe SRC grave ou não ocorre dentro de um cer- to período de tempo após o tratamento, como dentro de uma semana, duas semanas ou um mês após a administração das células.
Em al- gumas modalidades, os parâmetros avaliados para determinar certas toxicidades incluem eventos adversos (AEs), toxicidades limitantes da dose (DLTs), CRS e NT.
[00578] A administração de terapia de células T adotiva, como tra- tamento com células T de expressão de receptores de antígeno qui- méricos, pode induzir efeitos ou resultados tóxicos, como síndrome de liberação de citocinas e neurotoxicidade. Em alguns exemplos, esses efeitos ou resultados são paralelos aos altos níveis de citocinas circu- lantes, que podem estar subjacentes à toxicidade observada.
[00579] [574] Em alguns aspectos, o resultado tóxico é ou está as- sociado ou é indicativo de síndrome de liberação de citocinas (CRS) ou CRS grave (sCRS). A CRS, por exemplo, sCRS, pode ocorrer em alguns casos após a terapia e administração de células T adotivas a indivíduos de outros produtos biológicos. Veja, Davila et al., Sci Transl Med 6, 224ra25 (2014); Brentjens et al., Sci. Transl. Med. 5, 177ra38 (2013); Grupp et al., N. Engl. J. Med. 368, 1509-1518 (2013); e Ko- chenderfer et al., Blood 119, 2709-2720 (2012); Xu et al., Cancer Let- ters 343 (2014) 172-78.
[00580] Normalmente, a CRS é causada por uma resposta imune sistêmica exagerada mediada por, por exemplo, células T, células B, células NK, monócitos e/ou macrófagos. Tais células podem liberar uma grande quantidade de mediadores inflamatórios, como citocinas e quimiocinas. As citocinas podem desencadear uma resposta inflamató- ria aguda e/ou induzir danos aos órgãos endoteliais, que podem resul- tar em vazamento microvascular, insuficiência cardíaca ou morte. A CRS grave e com risco de vida pode levar a infiltração pulmonar e le- são pulmonar, insuficiência renal ou coagulação intravascular dissemi- nada. Outras toxicidades graves e com risco de vida podem incluir to- xicidade cardíaca, dificuldade respiratória, toxicidade neurológica e/ou insuficiência hepática.
[00581] A CRS pode ser tratada usando terapia anti-inflamatória, como uma terapia anti-IL-6, por exemplo, anticorpo anti-IL-6, por exemplo, tocilizumabe ou antibióticos ou outros agentes, conforme descrito. Resultados, sinais e sintomas da CRS são conhecidos e in- cluem os aqui descritos. Em algumas modalidades, onde um regime de dosagem ou administração em particular afeta ou não afeta um da- do resultado, sinal ou sintoma associado à CRS, resultados, sinais e sintomas particulares e/ou quantidades ou graus dos mesmos podem ser especificados.
[00582] No contexto da administração de células de expressão de CAR, a CRS normalmente ocorre 6 a 20 dias após a infusão de células que expressam um CAR. Veja, Xu et al., Cancer Letters 343 (2014) 172-78. Em alguns casos, a CRS ocorre menos de 6 dias ou mais de 20 dias após a infusão de células CAR T. A incidência e o momento da CRS podem estar relacionados aos níveis basais de citocinas ou carga tumoral no momento da infusão. Comumente, a CRS envolve níveis séricos elevados de interferon (IFN)-γ, fator de necrose tumoral (TNF)- α e/ou interleucina (IL)-2. Outras citocinas que podem ser rapidamente induzidas na CRS são IL-1β, IL-6, IL-8 e IL-10.
[00583] Resultados exemplares associados à CRS incluem febre, rigidez, calafrios, hipotensão, dispneia, síndrome da angústia respira- tória aguda (ARDS), encefalopatia, elevação de ALT/AST, insuficiência renal, distúrbios cardíacos, hipoxia, distúrbios neurológicos e morte. As complicações neurológicas incluem delírio, atividade convulsiva, con- fusão, dificuldade em encontrar palavras, afasia e/ou obturação. Ou- tros resultados relacionados à CRS incluem fadiga, náusea, dor de ca- beça, convulsão, taquicardia, mialgias, erupção cutânea, síndrome do vazamento vascular agudo, comprometimento da função hepática e insuficiência renal. Em alguns aspectos, a CRS está associada a um aumento de um ou mais fatores como ferritina sérica, dímero-d, amino- transferases, lactato desidrogenase e triglicerídeos, ou hipofibrinoge- nemia ou hepatoesplenomegalia.
[00584] Foram desenvolvidos critérios de CRS que parecem corre-
lacionar-se com o início da CRS para prever quais pacientes têm mai- or risco de desenvolver sCRS (veja, Davilla et al.
Science translational science. 2014; 6 (224): 224ra25). Os fatores incluem febre, hipoxia, hipotensão, alterações neurológicas, níveis séricos elevados de citoci- nas inflamatórias, como um conjunto de sete citocinas (IFNγ, IL-5, IL-6, IL-10, Flt-3L, fractalquina e GM-CSF) cuja elevação induzida pelo tra- tamento pode se correlacionar bem com a carga tumoral pré- tratamento e com os sintomas de sCRS.
Outras diretrizes sobre o di- agnóstico e tratamento da CRS são conhecidas (veja, por exemplo, Lee et al, Blood. 2014; 124 (2): 188-95). Em algumas modalidades, os critérios que refletem o grau de CRS são os detalhados na Tabela 2 abaixo.
Tabela 2: Critérios de Classificação Exemplares para CRS Grau Descrição dos Sintomas 1 Não apresenta risco de vida, requer apenas tra- Brando tamento sintomático, como antipiréticos e antie- méticos (por exemplo, febre, náusea, fadiga, dor de cabeça, mialgias, mal-estar) 2 Exigir e responder a intervenções moderadas: Moderado • Necessidade de oxigênio <40 %, ou • Hipotensão responsiva a fluidos ou baixa dose de um único vasopressor, ou • Toxicidade para órgãos de grau 2 (por CTCAE v4,0)
3 Exigir e responder a intervenções agressivas: Grave • Exigência de oxigênio ≥ 40 %, ou • Hipotensão que requer alta dose de um vaso- pressor único (por exemplo, noradrenalina ≥ 20 µg/kg/min, dopamina ≥ 10 µg/kg/min, fenilefrina ≥ 200 µg/kg/min ou epinefrina ≥ 10 µg/kg/min), ou • Hipotensão que requer múltiplos vasopressores (por exemplo, vasopressina + um dos agentes acima, ou vasopressores combinados equivalen- tes a ≥ 20 µg/kg/min de noradrenalina), ou • Toxicidade para órgãos grau 3 ou transaminite grau 4 (por CTCAE v4,0) 4 Com risco de vida: Com risco de vi- • Requisito para suporte do ventilador, ou da • Toxicidade para órgãos grau 4 (excluindo tran- saminite) 5 Morte Fatal
[00585] Em algumas modalidades, um indivíduo é considerado co- mo desenvolvendo "CRS grave" ("sCRS") em resposta ou secundário à administração de uma terapia celular ou dose de células da mesma, se, após a administração, o indivíduo exibir: (1) febre de pelo menos 38 graus Celsius por pelo menos três dias; (2) elevação de citocinas que inclui (a) uma alteração máxima de pelo menos 75 por pelo menos dois dos sete grupos seguintes de sete citocinas em comparação com o nível imediatamente após a administração: interferon gama (IFNγ), GM-CSF, IL-6, IL-10, Flt-3L, fractalcina e IL-5 e/ou (b) uma alteração máxima de pelo menos 250 para pelo menos um dos sete grupos de sete citocinas a seguir ao nível imediatamente após a administração: interferon gama (IFNγ), GM-CSF, IL-6, IL-10, Flt-3L, fractalcina e IL-5; e (c) pelo menos um sinal clínico de toxicidade, como hipotensão (exi- gindo pelo menos um pressor vasoativo intravenoso) ou hipoxia (PO2 <90 %) ou um ou mais distúrbios neurológicos (incluindo alterações do estado mental, obtundação e/ou convulsões). Em algumas modalida- des, a CRS grave inclui uma CRS com um grau de 3 ou superior, co- mo mencionado na Tabela 2.
[00586] Em algumas modalidades, os resultados associados a CRS grave ou CRS de grau 3 ou superior, como o grau 4 ou superior, inclu- em um ou mais dos seguintes: febre persistente, por exemplo, febre em uma temperatura especificada, por exemplo, maior que ou próximo a 38 graus Celsius, por dois ou mais, por exemplo, três ou mais, por exemplo, quatro ou mais dias ou por pelo menos três dias consecuti- vos; febre maior ou igual a 38 graus Celsius; elevação de citocinas, como uma alteração máxima de vezes, por exemplo, de pelo menos cerca de 75, em comparação com os níveis pré-tratamento de pelo menos duas citocinas (por exemplo, pelo menos dois do grupo que consiste em interferon gama (IFNγ), GM -CSF, IL-6, IL-10, Flt-3L, frac- talcina e IL-5 e/ou fator de necrose tumoral alfa (TNFα)) ou uma alte- ração máxima vezes, por exemplo, de pelo menos pelo menos cerca de 250 pelo menos uma dessas citocinas; e/ou pelo menos um sinal clínico de toxicidade, como hipotensão (por exemplo, conforme medido por pelo menos um pressor vasoativo intravenoso); níveis de hipoxia (por exemplo, níveis plasmáticos de oxigênio (PO2) inferiores a cerca de 90 %); e/ou um ou mais distúrbios neurológicos (incluindo altera- ções do estado mental, obtundação e convulsões). Em algumas moda- lidades, a CRS grave inclui a CRS que requer gerenciamento ou cui- dados na unidade de terapia intensiva (UTI).
[00587] Em algumas modalidades, a CRS, como a CRS grave, abrange uma combinação de (1) febre persistente (febre de pelo me- nos 38 graus Celsius por pelo menos três dias) e (2) um nível sérico de CRP de pelo menos a cerca de 20 mg/dL. Em algumas modalida- des, a CRS engloba hipotensão que requer o uso de dois ou mais va- sopressores ou insificiência respiratória que requer ventilação mecâni-
ca. Em algumas modalidades, a dosagem de vasopressores é aumen- tada em uma segunda administração ou subsequente.
[00588] Em algumas modalidades, a CRS grave ou a CRS de grau 3 engloba um aumento na alanina aminotransferase, um aumento na aspartato aminotransferase, calafrios, neutropenia febril, dor de cabe- ça, disfunção ventricular esquerda, encefalopatia, hidrocefalia e/ou tremor.
[00589] O método de medir ou detectar os vários resultados pode ser especificado.
[00590] Em alguns aspectos, o resultado tóxico é ou está associado à neurotoxicidade. Em algumas modalidades, os sintomas associados a um risco clínico de neurotoxicidade incluem confusão, delírio, afasia expressiva, obtundação, mioclonia, letargia, estado mental alterado, convulsões, atividade convulsiva, convulsões (opcionalmente como confirmado pelo eletroencefalograma [EEG]), elevação níveis de beta amiloide (Aβ), níveis elevados de glutamato e níveis elevados de radi- cais de oxigênio. Em algumas modalidades, a neurotoxicidade é clas- sificada com base na gravidade (por exemplo, usando uma escala de grau 1-5 (consulte, por exemplo, Guido Cavaletti e Paola Marmiroli Na- ture Reviews Neurology 6, 657-666 (dezembro de 2010); National Cancer Institute – Common Toxicity Criteria versão 4.03 (NCI-CTCAE v4.03).
[00591] Em alguns casos, os sintomas neurológicos podem ser os primeiros sintomas do sCRS. Em algumas modalidades, os sintomas neurológicos são vistos iniciando 5 a 7 dias após a infusão da terapia celular. Em algumas modalidades, a duração das alterações neuroló- gicas pode variar de 3 a 19 dias. Em alguns casos, a recuperação das alterações neurológicas ocorre após a resolução de outros sintomas do sCRS. Em algumas modalidades, o tempo ou o grau de resolução das alterações neurológicas não é acelerado pelo tratamento com anti-
IL-6 e/ou esteroide (s).
[00592] Em algumas modalidades, considera-se que um indivíduo desenvolve "neurotoxicidade grave" em resposta ou secundária à ad- ministração de uma terapia celular ou dose de células dela, se, após a administração, o indivíduo exibir sintomas que limitam o autocuidado (por exemplo, tomar banho, vestir e despir, alimentar, usar o banheiro, tomar medicamentos) dentre: 1) sintomas de neuropatia motora perifé- rica, incluindo inflamação ou degeneração dos nervos motores perifé- ricos; 2) sintomas da neuropatia sensorial periférica, incluindo inflama- ção ou degeneração dos nervos sensoriais periféricos, disestesia, co- mo distorção da percepção sensorial, resultando em uma sensação anormal e desagradável, neuralgia, como sensação dolorosa intensa ao longo de um nervo ou grupo de nervos e/ou parestesia, como dis- túrbios funcionais dos neurônios sensoriais, resultando em sensações cutâneas anormais de formigamento, dormência, pressão, frio e calor na ausência de estímulo. Em algumas modalidades, a neurotoxicidade grave inclui neurotoxicidade com um grau de 3 ou superior, como mencionado na Tabela 3. Tabela 3: Critérios de Classificação Exemplares para Neurotoxi- cidade Grau Descrição dos Sintomas 1 Sintomas leves ou assintomáticos Assintomático ou Brando 2 Presença de sintomas que limitam as atividades Moderado instrumentais da vida diária (ADL), como prepa- rar refeições, fazer compras ou comprar roupas, usar o telefone, administrar dinheiro 3 Presença de sintomas que limitam as ADLs de Grave autocuidado, como tomar banho, vestir-se e despir-se, alimentar-se, usar o banheiro, tomar medicamentos
Tabela 3: Critérios de Classificação Exemplares para Neurotoxi- cidade Grau Descrição dos Sintomas 4 Sintomas com risco de vida, exigindo interven- Com risco de vida ção urgente 5 Morte Fatal
[00593] Em algumas modalidades, os métodos reduzem os sinto- mas associados à CRS ou neurotoxicidade em comparação com ou- tros métodos. Em alguns aspectos, os métodos fornecidos reduzem sintomas, resultados ou fatores associados à CRS, incluindo sintomas, resultados ou fatores associados à CRS grave ou CRS de grau 3 ou superior, em comparação com outros métodos. Por exemplo, os indi- víduos tratados de acordo com os presentes métodos podem não ter detectáveis e/ou apresentar sintomas, resultados ou fatores reduzidos de CRS, por exemplo. CRS grave ou CRS de grau 3 ou superior, como qualquer um descrito, por exemplo, mencionado na Tabela 2. Em al- gumas modalidades, os indivíduos tratados de acordo com os presen- tes métodos podem ter sintomas reduzidos de neurotoxicidade, como fraqueza ou dormência nos membros, perda de memória, visão e/ou intelecto, comportamentos obsessivos e/ou compulsivos incontrolá- veis, delírios, dor de cabeça, problemas cognitivos e comportamentais, incluindo perda de controle motor, deterioração cognitiva e disfunção do sistema nervoso autônomo e disfunção sexual, em comparação com indivíduos tratados por outros métodos. Em algumas modalida- des, os indivíduos tratados de acordo com os presentes métodos po- dem ter sintomas reduzidos associados à neuropatia motora periférica, neuropatia sensorial periférica, disetesia, neuralgia ou parestesia.
[00594] Em algumas modalidades, as células de administração pro- duzidas pelos métodos fornecidos reduzem os resultados associados à neurotoxicidade, incluindo danos ao sistema nervoso e/ou cérebro,
como a morte de neurônios. Em alguns aspectos, os métodos redu- zem o nível de fatores associados à neurotoxicidade, como beta- amiloide (Aβ), glutamato e radicais de oxigênio.
[00595] Em algumas modalidades, uma ou mais intervenções ou agentes para o tratamento da toxicidade, como terapias de direciona- mento de toxicidade, são administrados no momento em que ou ime- diatamente após o qual ao indivíduo é determinado ou confirmado (como é o primeiro determinado ou confirmado) exibe febre prolonga- da, por exemplo, conforme medido de acordo com qualquer uma das modalidades mencionadas acima. Em algumas modalidades, as refe- ridas uma ou mais terapias de direcionamento de toxicidade é adminis- trada dentro de certo período de tempo de tal confirmação ou determi- nação, como 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas ou 8 horas da mesma. IV. ARTIGOS DE FABRICAÇÃO
[00596] Também são fornecidos artigos de fabricação e kits con- tendo células modificadas que expressam um receptor recombinante produzido pelos métodos aqui fornecidos, como os métodos descritos na Seção I e/ou as composições de saída das células descritas na Se- ção I-F e, opcionalmente, instruções para uso, por exemplo, instruções para administrar as células modificadas a um indivíduo, como pelos métodos descritos na Seção III.
[00597] Em algumas modalidades, são aqui fornecidos artigos de fabricação e/ou kits que incluem uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das células modificadas aqui descritas, e instruções para administrar, a um indiví- duo para tratamento de uma doença ou condição. Em algumas moda- lidades, as instruções podem especificar alguns ou todos os elementos dos métodos para administrar as células que são aqui fornecidas. Em algumas modalidades, as instruções especificam instruções particula-
res para administração das células para terapia celular, por exemplo, doses, tempo, seleção e/ou identificação de indivíduos para adminis- tração e condições para administração. Em algumas modalidades, os artigos de fabricação e/ou kits compreendem ainda um agente para a terapia para nodos e, opcionalmente, incluem ainda instruções para administrar a terapia para linfócitos. Em algumas modalidades, as ins- truções podem ser incluídas como uma marcação ou encarte da em- balagem que acompanha as composições para administração.
[00598] Em algumas modalidades, o artigo de fabricação pode ter um recipiente, opcionalmente um frasconete, contendo uma composi- ção de células T CD4+ enriquecidas que expressam um receptor re- combinante. Em algumas modalidades, o artigo de fabricação ou kit compreende opcionalmente um segundo recipiente, opcionalmente um segundo frasconete, contendo uma composição de células T CD8+ enriquecidas que expressam um receptor recombinante. Em algumas modalidades, um crioprotetor é incluído nas células. Em alguns aspec- tos, o recipiente é um frasco ou uma bolsa. Em algumas modalidades, o recipiente contém uma composição de células T CD4+ e CD8+ enri- quecidas.
[00599] Em algumas modalidades, a composição de células T CD4+ enriquecidas dentro do recipiente inclui pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,9 % ou em ou em torno de 100 % de células T CD4+. Em certas modalidades, a composição do recipiente inclui pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,9 % ou em ou cerca de 100 % de células T CD4+ que expressam o receptor recombinante e/ou foram transduzidas ou transfectadas com o polinucleotídeo recombi- nante. Em certas modalidades, a composição de células T CD4+ enri- quecidas dentro do recipiente inclui menos de 40 %, menos de 35 %, menos de 30 %, menos de 25 %, menos de 20 %, menos de 15 %, menos de 10 %, menos que 5 %, menos que 1 %, menos que 0,1 % ou menos que 0,01 % de células T CD8+ e/ou não contém células T CD8+ e/ou está livre ou substancialmente livre de células T CD8+.
[00600] Em algumas modalidades, a composição de células T CD8+ enriquecidas dentro do recipiente inclui pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,9 % ou pelo menos ou 100 % de células T CD8+. Em modalidades particulares, a composição com o recipiente pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pe- lo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,9 % ou a ou a cerca de 100 % de células T CD8+ que expressam o receptor recom- binante e/ou foram transduzidas ou transfectadas com o polinucleotí- deo recombinante. Em certas modalidades, a composição de saída de células T CD8+ enriquecidas que é administrada ao indivíduo inclui menos de 40 %, menos de 35 %, menos de 30 %, menos de 25 %, menos de 20 %, menos de 15 %, menos de 10 %, menos de 5 %, me- nos de 1 %, menos de 0,1 % ou menos de 0,01 % de células T CD4+ e/ou não contêm células T CD4+ e/ou estão livres ou substancialmente livres de células T CD4+.
[00601] Em algumas modalidades, as instruções especificam a do- se de células a serem administradas. Por exemplo, em algumas moda- lidades, a dose especificada nas instruções inclui um total de células de expressão de receptores recombinantes (por exemplo, CAR) entre cerca de 1 x 106 e 3 x 108, por exemplo, na faixa de cerca de 1 x 107 a 2 x 108 essas células, como 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108 ou 1,5 x 108 total de tais células ou a faixa entre dois dos valores anteriores. Em algu- mas modalidades, o paciente recebe doses múltiplas e cada uma das doses ou a dose total pode estar dentro de qualquer um dos valores anteriores.
[00602] Em algumas modalidades, o recipiente, como o frasconete, compreende mais ou mais que cerca de 10 x 106 células T ou células T de expressão de receptores recombinantes, mais que ou mais que cerca de 15 x 106 células T ou células T de expressão de receptores recombinantes, mais ou mais que cerca de 25 x 106 células T ou célu- las T de expressão de receptores recombinantes. Em alguns aspectos, o frasconete compreende entre cerca de 10 milhões de células por ml e cerca de 70 milhões de células por ml, entre cerca de 10 milhões de células por ml e cerca de 50 milhões de células por ml, entre cerca de 10 milhões de células por ml e cerca de 25 milhões de células por ml, entre cerca de 10 milhões de células por ml e cerca de 15 milhões de células por ml, 15 milhões de células por ml e cerca de 70 milhões de células por ml, entre cerca de 15 milhões de células por ml e cerca de 50 milhões de células por ml, entre cerca de 15 milhões de células por ml e cerca de 25 milhões de células por ml, entre cerca de 25 milhões de células por ml e cerca de 70 milhões de células por ml, entre cerca de 25 milhões de células por ml e cerca de 50 milhões de células por ml e entre cerca de 50 milhões de células por ml e cerca de 70 milhões de células por ml.
[00603] Em algumas modalidades, a pluralidade de frasconetes ou pluralidade de células ou dose unitária de células especificada para administração, coletivamente, compreende uma dose de células com- preendendo de 1 x 105 a 5 x 108 ou de cerca de 1 x 105 a cerca de 5 x 108 células T de expressão de receptores recombinantes totais ou cé-
lulas T totais, de 1 x 105 a 1 x 108 ou de cerca de 1 x 105 a cerca de 1 x 108 células T de expressão de receptores recombinantes totais ou células T totais, de 5 x 105 a 1 x 107 ou de cerca de 5 x 105 a cerca de 1 x 107 células T de expressão de receptores recombinantes totais ou células T totais, ou de 1 x 106 a 1 x 107 ou de cerca de 1 x 106 a cerca de 1 x 107 células T de expressão de receptores recombinantes totais ou células T totais, cada uma inclusive.
Em alguns aspectos, o artigo compreende uma ou mais doses unitárias das células T CD4+ e CD8+ ou das células T CD4+ receptor+ e células T CD8+ receptor+, em que a dose unitária compreende entre ou cerca de 1 x 107 e em ou cerca de 2 x 108 células T de expressão de receptores recombinantes, entre cerca de 5 x 107 e cerca de 1,5 x 108 células T de expressão de recep- tores, cerca de 5 x 107 células T de expressão de receptores recombi- nantes, cerca de 1 x 108 células T de expressão de receptores recom- binantes, ou em cerca de 1,5 x 108 células T de expressão de recepto- res recombinantes, opcionalmente em que as informações no artigo especificam a administração de uma ou de uma pluralidade de doses unitárias e/ou um volume correspondente a essa ou pluralidade de do- ses unitárias.
Em alguns casos, o artigo compreende uma ou mais do- ses unitárias das células T CD8+, em que a dose compreende entre 5 x 106 ou cerca de 1 x 108 células T CD8+ de expressão de receptores recombinantes, a dose compreende entre ou cerca de 1 x 107 e em ou cerca de 0,75 x 108 células T CD8+ de expressão de receptores re- combinantes, a dose compreende cerca de 2,5 x 107 células T CD8+ de expressão de receptores recombinantes, ou a dose compreende cerca de 5 x 107 células T CD8+ de expressão de receptores recombi- nantes, ou a dose compreende cerca de 0,75 x 108 células T CD8+ de expressão de receptores recombinantes, opcionalmente em que as informações no artigo especifica a administração de uma ou de uma pluralidade de doses unitárias e/ou um volume correspondente a essa ou a pluralidade de doses unitárias. Em algumas modalidades, as cé- lulas no artigo, coletivamente, compreendem uma dose de células compreendendo não mais de 1 x 108 células T de expressão de recep- tores recombinantes totais ou células T totais, não mais que 1 x 107 células T de expressão de receptores recombinantes totais ou células T totais, não mais que 0,5 x 107 células T de expressão de receptores recombinantes totais ou células T totais, não mais que 1 x 106 células T de expressão de receptores recombinantes totais ou células T totais, não mais que 0,5 x 106 células T de expressão de receptores recombi- nantes totais ou células T totais.
[00604] Em algumas modalidades, as instruções podem especificar regime de dosagem e tempo da administração. Por exemplo, em al- gumas modalidades, as instruções podem especificar a administração ao indivíduo de doses múltiplas, por exemplo, duas ou mais doses, das células. Em algumas modalidades, as instruções especificam o momento das doses múltiplas, por exemplo, a segunda dose sendo administrada cerca de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 dias após a primeira dose; e/ou a quantidade de dosa- gem em cada dose.
[00605] Em algumas modalidades, o artigo de fabricação ou kit compreende uma composição de células T CD4+ enriquecidas que expressam um receptor recombinante e instruções para administrar a um indivíduo com uma doença ou condição, toda ou uma parte da composição de células T CD4+ enriquecidas e administração adicional de células T CD8+ que expressam um receptor recombinante. Em al- gumas modalidades, as instruções especificam a administração das células T CD4+ antes de administrar as células T CD8+. Em alguns casos, as instruções especificam a administração das células T CD8+ antes de administrar as células T CD4+. Em algumas modalidades, o artigo de fabricação ou kit compreende uma pluralidade de células T
CD8+ que expressam um receptor recombinante e instruções para administrar a um indivíduo com uma doença ou condição, toda ou uma parte da pluralidade de células T CD8+ e células CD4+ T que expres- sam um receptor recombinante. Em algumas modalidades, as instru- ções especificam o regime de dosagem e o momento da administra- ção das células.
[00606] Em alguns aspectos, as instruções especificam a adminis- tração de todas ou uma parte das células T CD4+ e a totalidade ou uma parte das células T CD8+ com 0 a 12 horas de intervalo, 0 a 6 horas de intervalo ou 0 a 2 horas de intervalo. Em alguns casos, as instruções especificam a administração das células T CD4+ e CD8+ não mais de 2 horas, não mais de 1 hora, não mais de 30 minutos, não mais de 15 minutos, não mais de 10 minutos ou não mais de 5 minutos de intervalo.
[00607] Em algumas modalidades, as instruções especificam a do- se ou número de células ou tipo (s) de célula e/ou uma relação de ti- pos de células, por exemplo, populações ou subtipos individuais, como a relação CD4+ para CD8+. Em algumas modalidades, as populações ou subtipos de células, como células T CD8+ e CD4+. Por exemplo, em algumas modalidades, as instruções especificam que as células são administradas dentro ou dentro de um intervalo tolerado de uma taxa de saída de várias populações ou subtipos de células, como célu- las T CD4+ e CD8+ ou subtipos, entre ou cerca de 5:1 e a ou cerca de 5:1 (ou maior que cerca de 1:5 e menor que cerca de 5:1), ou entre cerca de 1:3 e cerca de 3:1 (ou maior que cerca de 1:3 e menor que cerca de 3:1), como entre cerca de 2:1 e cerca de 1:5 (ou superior a cerca de 1:5 e menor que cerca de 2:1, como cerca de 5:1, 4,5:1, 4:1, 3,5:1, 3:1, 2,5:1, 2:1, 1,9:1, 1,8:1, 1,7:1, 1,6:1, 1,5:1, 1,4:1, 1,3:1, 1,2:1, 1,1:1, 1:1, 1:1,1, 1:1,2, 1:1,3, 1:1,4, 1:1,5, 1:1,6, 1:1,7, 1:1,8, 1:1,9 : 1: 2, 1: 2,5, 1:3, 1:3,5, 1:4, 1:4,5 ou 1:5. Em certas modalidades, as ins-
truções especificam que as composições de células T CD4+ enrique- cidas e células T CD8+ enriquecidas são combinadas na relação dese- jada e administradas ao indivíduo como uma única composição celu- lar. Em modalidades particulares, as instruções especificam as com- posições de células T CD4+ enriquecidas e as células T CD8+ enri- quecidas são administradas como composições separadas na relação desejada. Em alguns aspectos, a diferença tolerada é de cerca de 1 %, cerca de 2 %, cerca de 3 %, cerca de 4 % cerca de 5 %, cerca de 10 %, cerca de 15 %, cerca de 20 %, cerca de 25 %, cerca de 30 %, cerca de 35 %, cerca de 40 %, cerca de 45 %, cerca de 50 % da rela- ção desejada, incluindo qualquer valor entre esses intervalos. V. DEFINIÇÕES
[00608] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados alterna- damente para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos e não estão limitados a um comprimento mínimo. Os polipeptídeos, in- cluindo os receptores e outros polipeptídeos fornecidos, por exemplo, ligantes ou peptídeos, podem incluir resíduos de aminoácidos, incluin- do resíduos de aminoácidos naturais e/ou não naturais. Os termos também incluem modificações pós-expressão do polipeptídeo, por exemplo, glicosilação, sialilação, acetilação e fosforilação. Em alguns aspectos, os polipeptídeos podem conter modificações em relação a uma sequência nativa ou natural, desde que a proteína mantenha a atividade desejada. Essas modificações podem ser deliberadas, como por meio de mutagênese direcionada ao sítio, ou podem ser aciden- tais, como por meio de mutações de hospedeiros que produzem as proteínas ou erros devido à amplificação por PCR.
[00609] Quando aqui usado, um "indivíduo" é um mamífero, como um humano ou outro animal, e normalmente é humano. Em algumas modalidades, o indivíduo, por exemplo, paciente, a quem o agente ou agentes, células, populações de células ou composições são adminis-
trados, é um mamífero, tipicamente um primata, como um humano. Em algumas modalidades, o primata é um macaco ou um macaco. O indivíduo pode ser homem ou mulher e pode ter qualquer idade ade- quada, incluindo indivíduos infantis, juvenis, adolescentes, adultos e geriátricos. Em algumas modalidades, ao indivíduo é um mamífero não primata, como um roedor.
[00610] Quando aqui usado, "tratamento" (e variações gramaticais dos mesmos, como "tratar" ou "tratando") refere-se à melhoria ou re- dução completa ou parcial de uma doença ou condição ou distúrbio, ou um sintoma, efeito adverso ou resultado, ou fenótipo associado a ele. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem, entre outros, preven- ção da ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, dimi- nuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástases, diminuição da taxa de progressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença e remissão ou prognóstico melhorado. Os termos não implicam a cura completa de uma doença ou a eliminação completa de qualquer sintoma ou efeito (s) em todos os sintomas ou resultados.
[00611] Quando aqui usado, "retardar o desenvolvimento de uma doença" significa adiar, impedir, diminuir, retardar, estabilizar, suprimir e/ou adiar o desenvolvimento da doença (como câncer). Esse retardo pode ser de duração variável, dependendo da história da doença e/ou do indivíduo a ser tratado. Em algumas modalidades, o retardo sufici- ente ou significativo pode, com efeito, abranger a prevenção, na medi- da em que o indivíduo não desenvolve a doença. Por exemplo, um câncer em estágio avançado, como o desenvolvimento de metástases, pode ser retardado.
[00612] "Prevenção", quando aqui usado, inclui o fornecimento de profilaxia com relação à ocorrência ou recorrência de uma doença em um indivíduo que pode estar predisposto à doença, mas ainda não foi diagnosticado com a doença. Em algumas modalidades, as células e composições fornecidas são usadas para retardar o desenvolvimento de uma doença ou para retardar a progressão de uma doença.
[00613] Quando aqui usado, "suprimir" uma função ou atividade é reduzir a função ou atividade quando comparado com as mesmas condições, exceto por uma condição ou parâmetro de interesse, ou alternativamente, em comparação com outra condição. Por exemplo, as células que suprimem o crescimento do tumor reduzem a taxa de crescimento do tumor em comparação com a taxa de crescimento do tumor na ausência das células.
[00614] Uma "quantidade eficaz" de um agente, por exemplo, uma formulação, células ou composição farmacêutica, no contexto da ad- ministração, refere-se a uma quantidade eficaz, em dosa- gens/quantidades e por períodos de tempo necessários, para atingir o desejado resultado, como um resultado terapêutico ou profilático.
[00615] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um agente, por exemplo, uma formulação ou células farmacêuticas, refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo neces- sários, para alcançar um resultado terapêutico desejado, como para o tratamento de uma doença, condição ou distúrbio e/ou efeito farmaco- cinético ou farmacodinâmico do tratamento. A quantidade terapeuti- camente eficaz pode variar de acordo com fatores como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo e as populações de células administradas. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos en- volvem a administração de células e/ou composições em quantidades efetivas, por exemplo, quantidades terapeuticamente eficazes.
[00616] Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, uma vez que uma dose profilática é usada em indi-
víduos antes ou em uma fase anterior da doença, a quantidade profila- ticamente eficaz será menor que a quantidade terapeuticamente efi- caz. No contexto de menor carga tumoral, a quantidade profilaticamen- te eficaz em alguns aspectos será maior que a quantidade terapeuti- camente eficaz.
[00617] O termo "cerca de", quando aqui usado, refere-se à faixa de erro usual para o respectivo valor facilmente conhecido pela pessoa versada neste campo técnico. A referência a "cerca de" um valor ou parâmetro aqui inclui (e descreve) modalidades que são direcionadas a esse valor ou parâmetro per se.
[00618] Quando aqui usadas, as formas singulares "um", "uma" e "o(a)" incluem referentes plurais, a menos do contexto indique clara- mente o contrário. Por exemplo, "um" ou "uma" significa "pelo menos um" ou "um ou mais".
[00619] Ao longo desta descrição, vários aspectos do assunto rei- vindicado são apresentados em um formato de faixa. Deve-se enten- der que a descrição no formato de faixa é meramente por conveniên- cia e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação infle- xível no escopo do assunto reivindicado. Por conseguinte, a descrição de uma faixa deve ser considerada como tendo descrito especifica- mente todas as subfaixas possíveis, bem como valores numéricos in- dividuais dentro dessa faixa. Por exemplo, quando é fornecida uma faixa de valores, entende-se que cada valor intermediário, entre o limi- te superior e inferior dessa faixa e qualquer outro valor declarado ou interveniente nessa faixa declarada, é abrangido pelo assunto reivindi- cado. Os limites superior e inferior desses faixas menores podem ser incluídos independentemente nas faixas menores e também estão in- cluídos no assunto reivindicado, sujeitos a qualquer limite excluído es- pecificamente na faixa indicado. Quando a faixa declarada inclui um ou ambos os limites, as faixas excluindo um ou ambos os limites incluídos também são incluídas no assunto reivindicado. Isso se aplica indepen- dentemente da amplitude da faixa.
[00620] Quando aqui usado, uma composição refere-se a qualquer mistura de dois ou mais produtos, substâncias ou compostos, incluindo células. Pode ser uma solução, uma suspensão, líquido, pó, uma pas- ta, aquosa, não aquosa ou qualquer combinação dos mesmos.
[00621] Quando aqui usado, "enriquecer" ao se referir a um ou mais tipos de células ou populações de células em particular, refere-se ao aumento do número ou percentagem tipo ou população de células, por exemplo, comparado ao número total de células ou volume de células. A composição, ou em relação a outros tipos de células, como por sele- ção positiva com base em marcadores expressos pela população ou célula, ou por seleção negativa com base em um marcador não pre- sente na população de células ou célula a ser esgotada. O termo não requer remoção completa de outras células, tipo de célula ou popula- ções da composição e não requer que as células tão enriquecidas es- tejam presentes em ou mesmo próximo a 100 % na composição enri- quecida.
[00622] Quando aqui usado, uma declaração de que uma célula ou população de células é "positiva" para um marcador específico refere- se à presença detectável na célula ou dentro de um marcador especí- fico, normalmente um marcador de superfície. Quando se refere a um marcador de superfície, o termo refere-se à presença de expressão da superfície como detectada por citometria de fluxo, por exemplo, pelo manchamento com um anticorpo que se liga especificamente ao mar- cador e pela detecção do referido anticorpo, em que o manchamento é detectável por citometria de fluxo em um nível substancialmente acima do manchamento detectado executando o mesmo procedimento com um controle pareado por isótipo ou controle de obstrução de fluores- cência menos um (FMO) sob condições idênticas e/ou em um nível substancialmente semelhante ao da célula conhecida como positiva para o marcador, e/ou em um nível substancialmente mais alto que o de uma célula que se sabe ser negativa para o marcador.
[00623] Quando aqui usada, uma declaração de que uma célula ou população de células é "negativa" para um marcador específico refere- se à ausência de presença detectável substancial na ou na célula de um marcador específico, tipicamente um marcador de superfície. Quando se refere a um marcador de superfície, o termo refere-se à ausência de expressão da superfície como detectada por citometria de fluxo, por exemplo, pelo manchamento com um anticorpo que se liga especificamente ao marcador e pela detecção do referido anticorpo, em que a manchamento não é detectada pela citometria de fluxo em um nível substancialmente acima do manchamento detectado execu- tando o mesmo procedimento com um controle pareado por isótipo ou controle de obstrução de fluorescência menos um (FMO) sob condi- ções idênticas, e/ou em um nível substancialmente inferior ao da célu- la conhecida como positiva para o marcador e/ou em um nível subs- tancialmente semelhante em comparação com o de uma célula que se sabe ser negativa para o marcador.
[00624] O termo "vetor", quando aqui usado, refere-se a uma molé- cula de ácido nucleico capaz de propagar outro ácido nucleico ao qual está ligado. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nuclei- co autorreplicante, bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual foi introduzido. Certos vetores são capazes de direcionar a expressão de ácidos nucleicos aos quais eles estão operacionalmente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "veto- res de expressão". VI. MODALIDADES EXEMPLARES
[00672] Entre as modalidades fornecidas estão:
1. Método para a produção de uma composição de células modifica- das, o método compreendendo:
(a) incubar, sob condições de estimulação, uma composi- ção de entrada compreendendo células T enriquecidas por células T humanas primárias CD4+, as referidas condições de estimulação compreendendo a presença de (i) um reagente estimulatório capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR e / ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimulatórias e (ii) uma ou mais citocinas, em que pelo menos uma citocina é ou com- preende IL-2 humana recombinante, desse modo gerando uma com- posição estimulada; e (b) introduzir um receptor recombinante na composição es- timulada, desse modo gerando uma composição modificada compre- endendo células T modificadas.
2. O método de modalidade 1, em que: a composição de entrada compreende mais que ou mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T humanas primárias CD4+; e/ou a composição de entrada consiste essencialmente em célu- las T humanas primárias CD4+.
3. O método de modalidade 1 ou 2, em que a concentração de IL-2 recombinante é de 10 IU/mL a 200 IU/mL ou de cerca de 10 IU/mL a cerca de 200 IU/mL.
4. Método de qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que as referi- das uma ou mais citocinas também compreendem IL-7 e / ou IL-15, opcionalmente em que a concentração de IL-7 é de 100 IU/mL a 1000 IU/mL ou de cerca de 100 IU/mL a cerca de 1000 IU/mL e / ou a con- centração de IL-15 é de 1 IU/mL a 50 IU/mL ou de cerca de 1 IU/mL a cerca de 50 IU/mL.
5. Método de qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que a incuba- ção é realizada na presença de um ou mais antioxidantes.
6. Método para a produção de uma composição de células modifica- das, o método compreendendo: (a) incubar uma composição de entrada compreendendo células T enriquecidas por uma ou ambas as células T humanas pri- márias CD4+ e CD8+, desse modo gerando uma composição estimu- lada, em que a incubação é realizada: (1) sob uma ou mais condições de estimulação, as referidas condições de estimulação compreendendo a presença de (i) um rea- gente estimulatório capaz de ativar um ou mais domínios de sinaliza- ção intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR e / ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimulatórias e (ii) uma ou mais citocinas; e/ou (2) na presença de um ou mais antioxidantes; e (b) introduzir um receptor recombinante na composição es- timulada, desse modo gerando uma composição modificada compre- endendo células T modificadas.
7. O método de modalidade 6, em que: a composição de entrada compreende mais que ou mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T humanas primárias CD4+ e / ou CD8+; e/ou a composição de entrada consiste essencialmente em célu- las T humanas primárias CD4+ e / ou CD8+.
8. O método de modalidade 6 ou 7, em que as referidas uma ou mais citocinas são selecionadas de IL-2 recombinante, IL-7 recombinante e
/ ou IL-15 recombinante.
9. O método de modalidade 8, em que: a concentração de IL-2 recombinante é de 10 IU/mL a 200 IU/mL ou de cerca de 10 IU/mL a cerca de 200 IU/mL; a concentração de IL-7 recombinante é de 100 IU/mL a 1000 IU/mL ou de cerca de 100 IU/mL a cerca de 1000 IU/mL; e/ou a concentração de IL-15 recombinante é de 1 IU/mL a 25 IU/mL ou de cerca de 1 IU/mL a cerca de 25 IU/mL.
10. O método de modalidade 6, em que: a composição de entrada compreende mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T humanas primá- rias CD4+; e/ou a composição de entrada consiste essencialmente em célu- las T humanas primárias CD4+.
11. O método de modalidade 6 ou 10, em que as referidas uma ou mais citocinas são selecionadas de IL-2 recombinante, IL-7 recombi- nante e IL-15 recombinante.
12. O método de modalidade 6, em que: a composição de entrada compreende mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T humanas primá- rias CD8+; e/ou a composição de entrada consiste essencialmente em célu- las T humanas primárias CD8+.
13. O método de modalidade 6 ou 12, em que as referidas uma ou mais citocinas são selecionadas de IL-2 recombinante e IL-15 recom- binante.
14. Método de qualquer uma das modalidades 1 a 13, em que o rea- gente estimulatório compreende um agente primário que especifica- mente se liga a um membro de um complexo TCR, opcionalmente que especificamente se liga a CD3.
15. O método de modalidade 14, em que o reagente estimulatório também compreende um agente secundário que especificamente se liga a uma molécula coestimulatória de célula T, opcionalmente em que a molécula coestimulatória é selecionada de CD28, CD137 (4-1- BB), OX40, ou ICOS.
16. O método de modalidade 14 ou 15, em que os agentes primários e / ou secundários compreendem um anticorpo, opcionalmente em que o reagente estimulatório compreende incubação com um anticorpo an- ti-CD3 e um anticorpo anti-CD28, ou um fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo.
17. Método de qualquer uma das modalidades 14 a 16, em que o agente primário e / ou agente secundário estão presentes na superfí- cie de um suporte sólido.
18. O método de modalidade 17, em que o suporte sólido é ou com- preende uma conta.
19. O método de modalidade 18, em que a conta compreende um di- âmetro de mais que ou mais do que cerca de 3,5 µm, mas não mais do que cerca de 9 µm ou não mais do que cerca de 8 µm ou não mais do que cerca de 7 µm ou não mais do que cerca de 6 µm ou não mais do que cerca de 5 µm.
20. O método de modalidade 18 ou 19, em que a conta compreende um diâmetro de ou cerca de 4,5 µm.
21. Método de qualquer uma das modalidades 18 a 20, em que a con- ta é inerte.
22. Método de qualquer uma das modalidades 18 a 21, em que a con- ta é ou compreende uma superfície de poliestireno.
23. Método de qualquer uma das modalidades 18 a 22, caracterizado pelo fato de que a conta é magnética ou superparamagnética.
24. Método de qualquer uma das modalidades 18 a 23, em que a rela- ção de contas para células é menor que 3:1.
25. Método de qualquer uma das modalidades 18 a 24, em que a rela- ção de contas para células é de 2:1 a 0,5:1 ou de cerca de 2:1 a cerca de 0,5:1.
26. Método de qualquer uma das modalidades 18 a 25, em que a rela- ção de contas para células é de, ou de cerca de 1:1.
27. Método de qualquer uma das modalidades 5 a 26, em que os refe- ridos um ou mais antioxidantes compreendem um antioxidante con- tendo enxofre.
28. Método de qualquer uma das modalidades 5 a 27, em que os refe- ridos um ou mais antioxidantes compreendem um precursor de glutati- ona.
29. Método de qualquer uma das modalidades 5 a 28, em que os refe- ridos um ou mais antioxidantes compreendem N-acetil cisteína (NAC), opcionalmente em que a NAC está em uma concentração de 0,2 mg/mL a 2,0 mg/mL ou de cerca de 0,2 mg/mL a cerca de 2,0 mg/mL.
30. Método de qualquer uma das modalidades 1 a 29, em que a intro- dução compreende transduzir células da composição estimulada com um vetor viral compreendendo um polinucleotídeo codificando o recep- tor recombinante.
31. O método de modalidade 30, em que o vetor viral é um vetor retro- viral.
32. O método de modalidade 30 ou modalidade 31, em que o vetor viral é um vetor lentiviral ou vetor gamarretroviral.
33. Método de qualquer uma das modalidades 30-32, caracterizado pelo fato de que a introdução é realizada na presença de um adjuvante de transdução.
34. O método de modalidade 33, em que o adjuvante de transdução é ou compreende sulfato de protamina, opcionalmente de 1 µg/ml a 50 µg/ml ou de cerca de 1 µg/ml a cerca de 50 µg/ml sulfato de protami- na; um adjuvante de transdução derivado de fibronectina; e / ou Re- troNectina.
35. Método de qualquer uma das modalidades 1 a 34, em que a intro- dução compreende transfectar as células da composição estimulada com um vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando o recep- tor recombinante.
36. O método de modalidade 35, em que o vetor é um transposon, op- cionalmente um transposon Sleeping Beauty (SB) ou um transposon Piggybac.
37. Método de qualquer uma das modalidades 1 a 36, também com- preendendo cultivar a composição modificada sob condições para promover proliferação ou expansão das células modificadas, desse modo produzindo uma composição de saída compreendendo as célu- las T modificadas.
38. O método de modalidade 37, em que o cultivo é realizado na pre- sença de uma ou mais citocinas, em que pelo menos uma citocina é ou compreende IL-2 humana recombinante.
39. O método de modalidade 37 ou modalidade 38, em que o reagente estimulatório é removido da composição modificada antes do cultivo.
40. O método de modalidade 39, em que o agente estimulatório é re- movido dentro de, ou menos de 7 dias após o início da incubação.
41. O método de modalidade 39 ou 40, em que o reagente estimulató- rio é removido a partir de 3 dias a 6 dias ou de cerca de 3 dias a cerca de 6 dias após o início da incubação.
42. Método de qualquer uma das modalidades 37 a 41, em que o rea-
gente estimulatório é removido em, ou em cerca de 4 dias após o iní- cio da incubação.
43. Método de qualquer uma das modalidades 39 a 42, caracterizado pelo fato de que a remoção das contas compreende expor as células da composição modificada a um campo magnético.
44. Método para a produção de uma composição de células modifica- das, o método compreendendo cultivar, na presença de uma ou mais citocinas, uma composição celular modificada compreendendo células T humanas primárias CD4+ compreendendo células modificadas com um receptor recombinante, em que pelo menos uma citocina é ou compreende IL-2 humana recombinante; em que o método resulta na proliferação ou expansão de células na composição para produzir uma composição de saída compreendendo células CD4+ modificadas.
45. O método de modalidade 44, em que a proliferação ou expansão resulta em, em cerca de, ou em pelo menos um aumento de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, ou maior que 5 vezes no número de células T CD4+ modificadas com um receptor recombinante.
46. O método de modalidade 44 ou 45, em que: a composição celular modificada compreende mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cer- ca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T huma- nas primárias CD4+ ou células expressando o receptor recombinante CD4+; e/ou a composição celular modificada consiste essencialmente em células T humanas primárias CD4+.
47. Método de qualquer uma das modalidades 44 a 46, em que a con- centração de IL-2 recombinante é de 50 IU/mL a 500 IU/ml ou de cerca de 50 IU/mL a cerca de 500 IU/ml.
48. Método de qualquer uma das modalidades 38 a 47, em que as re- feridas uma ou mais citocinas também compreendem IL-7 e / ou IL-15, opcionalmente em que a concentração de IL-7 é de 500 IU/mL a 2000 IU/mL ou de cerca de 500 IU/mL a cerca de 2000 IU/mL e / ou a con- centração de IL-15 é de 5 IU/mL a 50 IU/mL ou de cerca de 5 IU/mL a cerca de 50 IU/mL.
49. Método de qualquer uma das modalidades 44 a 48, em que a composição celular modificada é produzida por um método compreen- dendo: (a) incubar, sob condições de estimulação, uma composi- ção de entrada compreendendo células T primárias enriquecidas por células T humanas primárias CD4+, as referidas condições de estimu- lação compreendendo a presença de (i) um reagente estimulatório ca- paz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR e / ou um ou mais domí- nios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimula- tórias e (ii) uma ou mais citocinas, em que pelo menos uma citocina é ou compreende IL-2 humana recombinante, desse modo gerando uma composição estimulada; e (b) introduzir um receptor recombinante na composição es- timulada, desse modo gerando uma composição modificada compre- endendo células T modificadas.
50. O método de modalidade 49, em que: a composição de entrada compreende mais que ou mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T humanas primárias CD4+; e/ou a composição de entrada consiste essencialmente em célu- las T humanas primárias CD4+.
51. O método de modalidade 49 ou 50, em que as referidas uma ou mais citocinas também compreendem IL-7 e / ou IL-15.
52. Método de qualquer uma das modalidades 37 a 51, em que o culti- vo é realizado na presença de um tensoativo.
53. Método de qualquer uma das modalidades 37 a 52, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma parte do cultivo é realizada com con- tínua mistura e / ou perfusão.
54. Método para a produção de uma composição de células modifica- das, o método compreendendo cultivar, na presença de uma ou mais citocinas, uma composição celular modificada compreendendo uma ou ambas as células T humanas primárias CD4+ e CD8+ compreendendo células modificadas com um receptor recombinante, em que o cultivo é realizado na presença de um tensoativo e / ou pelo menos uma parte do cultivo é realizada com contínua mistura e / ou perfusão; em que o método resulta na proliferação ou expansão de células na composição para produzir uma composição de saída com- preendendo células T CD4+ e / ou CD8+ modificadas.
55. O método de modalidade 48, em que: a composição celular modificada compreende mais que ou mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cer- ca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% célu- las T humanas primárias CD4+ e / ou CD8+ ou células T primárias ex- pressando o receptor recombinante CD4+ e / ou CD8+; e/ou a composição celular modificada consiste essencialmente em células T humanas primárias CD4+ e / ou CD8+.
56. O método de modalidade 48, em que a proliferação ou expansão resulta em, em cerca de, ou em pelo menos um aumento de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, ou maior que 5 vezes no número de células T CD4+ e/ou CD8+ modificadas com um receptor recombinante.
57. O método de modalidade 55, em que as referidas uma ou mais ci- tocinas são selecionadas de IL-2 recombinante, IL-7 recombinante e / ou IL-15 recombinante.
58. O método de modalidade 56 ou 57, em que: a concentração de IL-2 recombinante é de 50 IU/mL a 500 IU/mL ou de cerca de 50 IU/mL a cerca de 500 IU/mL; a concentração de IL-7 recombinante é de 500 IU/mL a 2000 IU/mL ou de cerca de 500 IU/mL a cerca de 2000 IU/mL; e/ou a concentração de IL-15 recombinante é de 5 IU/mL a 50 IU/mL ou de cerca de 5 IU/mL a cerca de 50 IU/mL.
59. O método de modalidade 54, em que: a composição celular modificada compreende mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cer- ca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T huma- nas primárias CD4+ ou CD4+ e células T humanas primárias expres- sando receptor recombinante; e/ou a composição celular modificada consiste essencialmente em células T humanas primárias CD4+.
60. O método de modalidade 59, em que a proliferação ou expansão resulta em, em cerca de, ou em pelo menos um aumento de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, ou maior que 5 vezes no número de células T CD8+ modificadas com um receptor recombinante.
61. O método de modalidade 54 ou modalidade 55, em que as referi- das uma ou mais citocinas são selecionadas de IL-2 recombinante, IL- 7 recombinante e IL-15 recombinante.
62. O método de modalidade 54, em que: a composição celular modificada compreende mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cer- ca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T huma- nas primárias CD8+ ou CD8+ e células T humanas primárias expres- sando receptor recombinante; e/ou a composição celular modificada consiste essencialmente em células T humanas primárias CD8+.
63. O método de modalidade 54 ou 62, em que as referidas uma ou mais citocinas são selecionadas de IL-2 recombinante e IL-15 recom- binante.
64. Método de qualquer uma das modalidades 52 a 63, em que o ten- soativo compreende um poloxâmero, opcionalmente em queo poloxâ- mero está presente em uma concentração de 0,5 µL/mL a 5µL/mL ou de cerca de 0,5 µL/mL a cerca de 5µL/mL.
65. O método de modalidade 64, em que o poloxâmero é Poloxâmero
188.
66. Método de qualquer uma das modalidades 54 a 65, em que a composição celular modificada é produzida por um método compreen- dendo: (a) incubar, sob condições de estimulação, uma composi- ção de entrada compreendendo células T primárias enriquecidas por uma ou ambas as células T humanas primárias CD4+ e CD8+, as refe- ridas condições de estimulação compreendendo a presença de (i) um reagente estimulatório capaz de ativar um ou mais domínios de sinali- zação intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR e / ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimulatórias e (ii) uma ou mais citocinas, desse modo gerando uma composição estimulada; e (b) introduzir um receptor recombinante na composição es- timulada, desse modo gerando uma composição modificada compre- endendo células T modificadas.
67. O método de modalidade 66, em que: a composição de entrada compreende mais que ou mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T humanas primárias CD4+ e / ou CD8+; e/ou a composição de entrada consiste essencialmente em célu- las T humanas primárias CD4+ e / ou CD8+.
68. O método de modalidade 66 ou modalidade 67, em que as referi- das uma ou mais citocinas são selecionadas de IL-2 recombinante, IL- 7 recombinante e / ou IL-15 recombinante.
69. O método de modalidade 66, em que: a composição de entrada compreende mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T humanas primá- rias CD4+; e/ou a composição de entrada consiste essencialmente em célu- las T humanas primárias CD4+.
70. O método de modalidade 66 ou modalidade 69, em que as referi- das uma ou mais citocinas são selecionadas de IL-2 recombinante, IL- 7 recombinante e IL-15 recombinante.
71. O método de modalidade 66, em que: a composição de entrada compreende mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T humanas primá- rias CD8+; e/ou a composição de entrada consiste essencialmente em célu- las T humanas primárias CD8+.
72. O método de modalidade 66 ou modalidade 71, em que as referi- das uma ou mais citocinas são selecionadas de IL-2 recombinante e IL-15 recombinante.
73. Método de qualquer uma das modalidades 49-53 e 66-72, caracte- rizado pelo fato de que o reagente estimulatório compreende um agen- te primário que especificamente se liga a um membro de um complexo TCR, opcionalmente que especificamente se liga a CD3.
74. O método de modalidade 73, em que o reagente estimulatório também compreende um agente secundário que especificamente se liga a uma molécula coestimulatória de célula T, opcionalmente em que a molécula coestimulatória é selecionada de CD28, CD137 (4-1- BB), OX40, ou ICOS.
75. O método de modalidade 73 ou modalidade 74, em que os agen- tes primários e / ou secundários compreendem um anticorpo, opcio- nalmente em que o reagente estimulatório compreende incubação com um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
76. Método de qualquer uma das modalidades 73-75, em que o agen- te primário e / ou agente secundário estão presentes na superfície de um suporte sólido.
77. O método de modalidade 76, em que o suporte sólido é ou com- preende uma conta.
78. O método de modalidade 77, em que a conta compreende um di-
âmetro de mais que ou mais do que cerca de 3,5 µm, mas não mais do que cerca de 9 µm ou não mais do que cerca de 8 µm ou não mais do que cerca de 7 µm ou não mais do que cerca de 6 µm ou não mais do que cerca de 5 µm.
79. O método de modalidade 77 ou modalidade 78, em que a conta compreende um diâmetro de ou cerca de 4,5 µm.
80. Método de qualquer uma das modalidades 77 a 79, em que a con- ta é inerte.
81. Método de qualquer uma das modalidades 77 a 80, em que a con- ta é ou compreende uma superfície de poliestireno.
82. Método de qualquer uma das modalidades 77 a 81, em que a con- ta é magnética ou superparamagnética.
83. Método de qualquer uma das modalidades 77 a 82, caracterizado pelo fato de que a relação de contas para células é menor que 3:1.
84. Método de qualquer uma das modalidades 77 a 83, em que a rela- ção de contas para células é de 2:1 a 0,5:1 ou de cerca de 2:1 a cerca de 0,5:1.
85. Método de qualquer uma das modalidades 77 a 84, em que a rela- ção de contas para células é de, ou de cerca de 1:1.
86. Método de qualquer uma das modalidades 49 a 53 e 66 a 85, em que a incubação é realizada na presença de um ou mais antioxidantes.
87. O método de modalidade 86, em que os referidos um ou mais anti- oxidantes compreendem um antioxidante contendo enxofre.
88. O método de modalidade 86 ou modalidade 87, em que os referi- dos um ou mais antioxidantes compreendem um precursor de glutatio- na.
89. Método de qualquer uma das modalidades 86 a 88, em que os re- feridos um ou mais antioxidantes compreendem N-acetil cisteína (NAC), opcionalmente em que a NAC está em uma concentração de 0,2 mg/mL a 2,0 mg/mL ou de cerca de 0,2 mg/mL a cerca de 2,0 mg/mL.
90. Método de qualquer uma das modalidades 49 a 53 e 66 a 89, em que a introdução compreende transduzir células da composição esti- mulada com um vetor viral compreendendo um polinucleotídeo codifi- cando o receptor recombinante.
91. O método de modalidade 90, em que o vetor viral é um vetor retro- viral.
92. O método de modalidade 90 ou modalidade 91, em que o vetor viral é um vetor lentiviral ou vetor gamarretroviral.
93. Método de qualquer uma das modalidades 49 a 53 e 66 a 92, ca- racterizado pelo fato de que a introdução é realizada na presença de um adjuvante de transdução.
94. O método de modalidade 93, em que o adjuvante de transdução é ou compreende sulfato de protamina, opcionalmente de 1 µg/ml a 50 µg/ml ou de cerca de 1 µg/ml a cerca de 50 µg/ml sulfato de protami- na; um adjuvante de transdução derivado de fibronectina; e / ou Re- troNectina.
95. Método de qualquer uma das modalidades 49 a 53 e 66 a 89, em que a introdução compreende transfectar as células da composição estimulada com um vetor compreendendo um polinucleotídeo codifi- cando o receptor recombinante.
96. O método de modalidade 95, em que o vetor é um transposon, op- cionalmente um transposon Sleeping Beauty (SB) ou um transposon Piggybac.
97. Método de qualquer uma das modalidades 44 a 69, em que a composição celular modificada que não compreende um reagente es- timulatório e / ou o reagente estimulatório foi substancialmente remo- vido da composição antes do cultivo, o referido reagente estimulatório compreendendo um reagente capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo
TCR e / ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimulatórias.
98. Método de qualquer uma das modalidades 37 a 97, em que o culti- vo é realizado pelo menos até a composição de saída compreender a número limite de células T.
99. O método de modalidade 98, em que o cultivo é continuado duran- te pelo menos um dia após o número limite de células T ser atingido.
100. O método de modalidade 98 ou modalidade 99, em que o número limite é pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes ou mais, maior do que o número da composição celular modificada antes do cultivo.
101. Método de qualquer uma das modalidades 37 a 100, em que o cultivo é realizado durante 2 dias a 10 dias inclusive, e / ou o cultivo é realizado durante pelo menos 10 dias.
102. Método de qualquer uma das modalidades 37 a 101, em que subsequente ao cultivo, coletar células da composição de saída.
103. O método de modalidade 102, caracterizado pelo fato de que o período de tempo entre o início da incubação e a coleta de células da composição de saída é de 7 dias a 15 dias ou de cerca de 7 dias a cerca de 15 dias.
104. O método de modalidade 102 ou modalidade 102, caracterizado pelo fato de que o período de tempo entre o início da incubação e a coleta de células da composição de saída é de 9 dias a 13 dias ou de cerca de 9 dias a cerca de 13 dias.
105. Método de qualquer uma das modalidades 102 a 104, em que o período de tempo entre o início da incubação e a coleta de células da composição de saída é de 8 dias a 13 dias ou de cerca de 8 dias a cerca de 13 dias.
106. Método de qualquer uma das modalidades 37 a 105, também compreendendo formular células da composição de saída para crio-
preservação e / ou administração a um indivíduo, opcionalmente na presença de um excipiente farmaceuticamente aceitável.
107. O método de modalidade 106, em que as células da composição de saída são formuladas na presença de um crioprotetor.
108. O método de modalidade 107, em que o crioprotetor compreende DMSO.
109. Método de qualquer uma das modalidades 106 a 108, em que as células da composição de saída são formuladas em um recipiente, op- cionalmente um frasconete ou uma bolsa.
110. Método de qualquer uma das modalidades 1 a 43 e 49 a 53 e 66 a 89, também compreendendo isolar as células T CD4+ e/ou CD8+ de uma amostra biológica antes da incubação.
111. O método de modalidade 110, em que o isolamento compreen- de selecionar células com base na expressão de superfície de CD4 e / ou CD8, opcionalmente por seleção positiva ou negativa.
112. O método de modalidade 110 ou modalidade 111, em que o iso- lamento compreende realizar seleção com base em imunoafinidade.
113. Método de qualquer uma das modalidades 110 a 112, caracteri- zado pelo fato de que a amostra biológica compreende células T pri- márias obtidas de um indivíduo.
114. O método de modalidade 113, em que o indivíduo é um indivíduo humano.
115. Método de qualquer uma das modalidades 110 a 112, caracteri- zado pelo fato de que a amostra biológica é ou compreende uma amostra de sangue total, uma amostra da camada leucocitária, uma amostra de célula mononuclear de sangue periférico (PBMC), uma amostra de célula T não fracionada, uma amostra de linfócito, uma amostra de glóbulos brancos, um produto de aferese, ou um produto de leucaferese.
116. Método de qualquer uma das modalidades 1 a 115, em que o re-
ceptor recombinante é capaz de se ligar a um antígeno alvo que é as- sociado com, específico para, e / ou expresso em uma célula ou tecido de uma doença, distúrbio ou condição.
117. O método de modalidade 116, em que a doença, distúrbio ou condição é uma doença ou distúrbio infeccioso, uma doença autoimu- ne, uma doença inflamatória, ou um tumor ou um câncaer.
118. O método de modalidade 116 ou 117, em que o antígeno alvo é um antígeno de tumor.
119. Método de qualquer uma das modalidades 116 a 118, em que o antígeno alvo é selecionado dentre 5T4, 8H9, avb6 integrina, B7-H6, antígeno de maturação de célula B (BCMA), CA9, um antígeno de tes- tículos de câncer, anidrase 9 carbônica (CAIX), CCL-1, CD19, CD20, CD22, CEA, antígeno de superfície de hepatite B, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, an- tígeno carcinoembriônico (CEA), CE7, uma ciclina, ciclina A2, c-Met, antígeno dual, EGFR, glicoproteína 2 epitelial (EPG-2), glicoproteína 40 epitelial (EPG-40), EPHa2, efrinaB2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, díme- ros erbB, EGFR vIII, receptor de estrogênio, AchR fetal, receptor alfa de folato, proteína de ligação de folato (FBP), FCRL5, FCRH5, recep- tor de acetilcolina fetal, G250/CAIX, GD2, GD3, gp100, Receptor 5D Acoplado à Proteína G (GPCR5D), Her2/neu (erbB2 de tirosina cinase receptora), HMW-MAA, IL-22R-alfa, receptor alfa 2 de IL-13(IL-13Ra2), receptor de domínio de inserção de cinase (kdr), cadeia leve kappa, Lewis Y, Molécula de adesão de célula L1 (L1-CAM), Antígeno associ- ado com melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MART-1, me- sotelina, CMV de murino, mucina 1 (MUC1), MUC16, NCAM, NKG2D, ligantes NKG2D, NY-ESO-1, GD2 O-acetilado (OGD2), antígeno on- cofetal, antígeno preferencialmente expresso de melanoma (PRAME), PSCA, receptor de progesterona, survivina, ROR1, TAG72, tEGFR, receptores VEGF, VEGF-R2, Tumor Wilms 1 (WT-1), um antígeno es-
pecífico de patógeno e um antígeno associado com um marcador uni- versal.
120. Método de qualquer uma das modalidades 1 a 119, em que o re- ceptor recombinante é ou compreende um receptor de antígeno não TCR funcional ou um TCR ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
121. Método de qualquer uma das modalidades 1 a 120, em que o re- ceptor recombinante é um receptor de antígeno quimérico (CAR).
122. Método de qualquer uma das modalidades 1 a 121, em que o re- ceptor recombinante é um CAR anti-CD19.
123. O método de modalidade 121, em que o receptor de antígeno quimérico compreende um domínio extracelular compreendendo um domínio de ligação a antígeno.
124. O método de modalidade 123, em que o domínio de ligação ao antígeno é ou compreende um anticorpo ou um fragmento de anticor- po do mesmo, que opcionalmente é um fragmento de cadeia única.
125. O método de modalidade 124, em que o fragmento compreende regiões variáveis de anticorpo unidas por um ligante flexível.
126. O método de modalidade 124 ou modalidade 125, em que o fra- gmento compreende uma scFv.
127. Método de qualquer uma das modalidades 123 a 126, em que o receptor de antígeno quimérico também compreende um espaçador e / ou uma região de articulação.
128. Método de qualquer uma das modalidades 123 a 127, em que o receptor de antígeno quimérico compreende uma região de sinalização intracelular.
129. O método de modalidade 128, em que a região de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização intracelular.
130. O método de modalidade 129, em que o domínio de sinalização intracelular é ou compreende um domínio de sinalização primário, um domínio de sinalização que é capaz de induzir um sinal de ativação primário em uma célula T, um domínio de sinalização de um compo- nente de receptor de célula T (TCR), e / ou um domínio de sinalização compreendendo um motivo de ativação com base em tirosina imunor- receptora (ITAM).
131. O método de modalidade 130, em que o domínio de sinalização intracelular é ou compreende um domínio de sinalização intracelular de uma cadeia CD3, opcionalmente uma cadeia CD3-zeta (CD3ζ), ou uma porção de sinalização do mesmo.
132. Método de qualquer uma das modalidades 128 a 131, em que o receptor de antígeno quimérico também compreende um domínio de transmembrana disposto entre o domínio extracelular e a região de sinalização intracelular.
133. Método de qualquer uma das modalidades 128 a 132, caracteri- zado pelo fato de que a região de sinalização intracelular também compreende uma região de sinalização coestimulatória.
134. O método de modalidade 133, em que a região de sinalização coestimulatória compreende um domínio de sinalização intracelular de uma molécula coestimulatória de célula T ou uma porção de sinaliza- ção do mesmo.
135. O método de modalidade 133 ou 134, em que a região de sinali- zação coestimulatória compreende um domínio de sinalização intrace- lular de uma CD28, um 4-1BB ou um ICOS ou uma porção de sinaliza- ção do mesmo.
136. Método de qualquer uma das modalidades 133 a 135, em que a região de sinalização coestimulatória é entre o domínio de transmem- brana e a região de sinalização intracelular.
137. Método de qualquer uma das modalidades 98 a 101, em que a composição de saída compreendendo o número limite ou número mai- or de células é produzida entre mais que ou mais do que cerca de
85%, mais que ou mais do que cerca de 90% ou mais que ou mais do que cerca de 95% das iterações do método.
138. Uma composição compreendendo células modificadas produzi- das por um método de qualquer uma das modalidades 1 a 137.
139. A composição de modalidade 138, também compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável.
140. A composição de modalidade 138 ou 139, compreendendo um crioprotetor, opcionalmente DMSO.
141. Um artigo de fabricação, compreendendo a composição de qual- quer uma das modalidades 138 a 140, e instruções para a administra- ção da composição de saída a um indivíduo.
142. O artigo de fabricação de modalidade 141, em que o indivíduo tem uma doença ou condição, opcionalmente em que o receptor re- combinante especificamente reconhece ou especificamente se liga a um antígeno associado com, ou expresso ou presente em células da doença ou condição.
143. O artigo de fabricação de modalidade 141 ou 142, em que a composição de saída é uma composição de células T CD4+ modifica- das.
144. O artigo de fabricação de modalidade 141 ou 142, caracterizado pelo fato de que a composição de saída é uma composição de células T CD8+ modificadas.
145. Um artigo de fabricação compreendendo uma composição de cé- lulas T CD4+ modificadas produzida pelo método de qualquer uma das modalidades 1 a 11, 13 a 60, 63 a 70, ou 72 a 137, uma composição de células T CD8+ modificadas produzida pelo método de qualquer uma das modalidades 6 a 8, 11 a 43, 54 a 58, 60 a 68, ou 70 a 137, e instruções para a administração das células T CD4+ modificadas e das células T CD8+ modificadas a um indivíduo.
146. O artigo de fabricação de modalidade 145, em que as instruções especificam separadamente administrar as células T CD4+ e células T CD8+ ao indivíduo.
147. O artigo de fabricação de modalidade 145 ou 146, em que as ins- truções especificam administrar as células T CD4+ e as células T CD8+ ao indivíduo em uma relação desejada.
148. Método de qualquer uma das modalidades 1 a 137, em que o mé- todo é realizado durante menos de 21 dias, inclusive. VII. EXEMPLOS
[00673] Os exemplos a seguir são incluídos apenas para fins ilus- trativos e não se destinam a limitar o escopo da invenção. Exemplo 1: Processos para Gerar Composições Terapêuticas de Células CD4+ e CD8+ que Expressam um CAR anti-CD19.
[00674] As células T CD4+ modificadas e células T CD8+ modifica- das, cada qual expressando o mesmo receptor de antígeno quimérico anti-CD19 (CAR), foram produzidas por um processo que envolve submeter populações de células CD4+ e CD8+ enriquecidas, separa- damente, a etapas do processo. As células CD4+ e CD8+ foram sele- cionadas separadamente das células mononucleares do sangue peri- férico humano (PBMCs) que foram obtidas por leucaferese, gerando composições de células CD4+ enriquecidas e CD8+ enriquecidas se- paradas, que depois foram congeladas. As composições de CD4+ e CD8+ foram posteriormente descongeladas e separadamente subme- tidas a etapas de estimulação, transdução e expansão.
[00675] As células CD4+ e CD8+ descongeladas foram estimuladas separadamente na presença de contas revestidas com poliestireno paramagnético acopladas a anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 em uma relação 1:1 de conta para célula. a estimulação foi realizado em meios contendo IL-2 recombinante humano, IL-15 recombinante humano e N- acetilcisteína (NAC). Os meios de células CD4+da mesma forma inclu- íram IL-7 recombinante humana.
[00676] Após a introdução das esferas, as células CD4+ e CD8+ foram transduzidas separadamente com um vetor lentiviral codificando o mesmo CAR anti-CD19. O CAR continha um scFv anti-CD19 deriva- do de um anticorpo de murino, um espaçador de imunoglobulina, um domínio de transmembrana derivado de CD28, uma região coestimu- ladora derivada de 4-1BB e um domínio de sinalização intracelular CD3-zeta. O vetor da mesma forma codificou um EGFR truncado (EGFRt) que serviu como um marcador substituto para a expressão de CAR que estava conectado à construção de CAR por uma sequência de T2A. As células foram transduzidas na presença de 10 µg / ml de sulfato de protamina.
[00677] Após a transdução, as contas foram removidas das compo- sições celulares por exposição a um campo magnético. As composi- ções de células CD4+ e CD8+ foram em seguida cultivadas separa- damente para expansão com mistura contínua e transferência de oxi- gênio por um biorreator (biorreator Xuri W25). O poloxâmero foi adici- onado aos meios. Ambas as composições de célula foram cultivadas na presença de IL-2 e IL-15. O meio de célula CD4+ da mesma forma incluiu IL-7. As células CD4+ e CD8+ foram cultivadas, antes da co- lheita, para uma expansão de 4 vezes. Um dia após atingir o limiar, as células de cada composição foram separadamente colhi- das,formuladas e congeladas. O processo exemplar é resumido na Tabela E1.
Tabela E1: Resumo do processo exemplar para gerar células CAR-T CD4+ e CD8+ Estágio Células CD4+ Células CD8+ Estímulo  Contas conjugadas de an-  Contas conjugadas de (dia 1-2) ticorpo anti-CD3/CD28 anticorpo anti-  relação 1:1 de conta para CD3/CD28 célula  relação 1:1 de conta pa-  meio: IL-2, IL-7, IL-15, e ra célula NAC  meio: IL-2, IL-15, e NAC Transdu-  Adjuvante de transdução  Adjuvante de transdução ção (por exemplo, 10 µg/ml de (por exemplo, 10 µg/ml (dia 2-5) sulfato de protamina) de sulfato de protamina) Remoção  remoção de conta magné-  remoção de conta mag- de Conta tica nética (dia 5*) Expansão  biorreator em movimento  biorreator em movimento (dia 5* – de balanço e/ou mistura de balanço e/ou mistura Colheita) contínua contínua  meios: IL-2, IL-7, IL15, e  meios: IL-2, IL15, e po- poloxâmero loxâmero *Aproximado
[00678] O processo exemplar resumido na Tabela E1 foi compara- do a um processo alternativo exemplar. O processo alternativo diferiu- se na medida em que: NAC não foi adicionado aos meios durante a estimulação; os meios de célula CD4+ não continham IL-2; as células foram estimuladas em uma relação 3:1 de conta para célula; as célu- las foram transduzidas com uma maior concentração de sulfato de pro- tamina; remoção de conta ocorreu em cerca do dia 7; e a expansão foi realizada em uma configuração estática, isto é, sem mistura ou perfu- são contínua (por exemplo, perfusão semicontínua e/ou por etapas) e sem poloxâmero. Exemplo 2: Avaliação da Duração do Processo para gerar Com- posições Terapêuticas de Células CAR-T CD4+ e CD8+.
[00679] Vários atributos dos processos exemplares e alternativos descritos no Exemplo 1 foram avaliados. Em uma experiência, ciclos do processo foram realizados para os processos exemplares e alterna- tivos com composições de células CD4+ e CD8+ separadas, obtidas da mesma amostra de leucaferese humana DLBCL. As contagens de células totais foram medidas em momentos diferentes durante as fa- ses de estimulação, transdução e expansão de cada processo. Como mostrado na FIG. 1, as composições de células CD4+ e CD8+ subme- tidas ao processo exemplar expandiram-se mais rapidamente e alcan- çaram um grau de expansão exemplar (expansão de 4 vezes), que neste estudo foi designado para atingir antes da colheita, em um perí- odo de tempo mais curto do que observado com o processo alternati- vo.
[00680] Durações da fase de expansão (executada até a expansão de 4 vezes neste estudo) do processo exemplar no Exemplo 1 e o pro- cesso alternativo foi avaliado a partir de várias execuções do processo de composições de células CD4+ e CD8+ separadas, obtidas a partir de amostras de leucaferese coletadas de indivíduos com DLBCL. A duração desta fase do processo exemplar foi avaliada com base em um conjunto de ciclos exemplares com composições de células CD4+ e CD8+ separadas, obtidas a partir de amostras de leucaferese cole- tadas de indivíduos saudáveis e indivíduos com DLBCL. A duração foi medida como o período de tempo entre o início da estimulação até a colheita (que neste estudo exemplar ocorreu um dia após atingir uma expansão de quatro vezes). Neste estudo, ciclos do processo exem- plar foram observados ter duração mais curta, do início da expansão à expansão ou colheita de quatro vezes, com uma distribuição mais es- treita (como entre 9 e 13 dias em um estudo) entre diferentes ciclos para essa duração, como comparado com a duração alternativa do processo.
[00681] Durações de protocolos de fabricação exemplares utilizan- do processos exemplares e alternativos (protocolos de fabricação exemplares e alternativos, respectivamente) foram modelados. Em ge- ral, os resultados da modelagem foram consistentes com a interpreta- ção de que o processo exemplar é capaz de atingir durações de proto- colo comparativamente mais curtas, com menor variabilidade, do que outros protocolos de fabricação. Exemplo 3: Avaliação de processos para gerar composições tera- pêuticas de células CAR-T CD4+ e CD8+.
[00682] Um conjunto exemplar de composições de células CD4+ e CD8+ obtidas a partir de amostras (incluindo aquelas que em um pro- cesso alternativo, exibiram uma fase de expansão (expansão para co- lheita (expansão 4 vezes)) com duração superior a 17 dias e aquelas que exibiram uma a duração da fase de expansão igual ou inferior a 17 dias foi processada usando o processo exemplar. As contagens totais de células foram medidas em diferentes momentos durante as fases de estimulação, transdução e expansão até que o limiar da colheita fosse alcançado.
[00683] As composições de células CD4+ e CD8+ tendo expandido 4 vezes foram geradas com o processo exemplar, a partir de amostras de ambos os tipos de composições (aquelas observadas para expandir 4 vezes em menos de 17 dias ou mais e as observadas fazê-las em mais de 17 dias, em outro processo), com baixa faixa de variabilidade na duração. Exemplo 4: Geração de composições terapêuticas de células CAR-T CD4+ e CD8+ a partir de uma amostra biológica obtida de um indivíduo com leucemia linfocítica crônica.
[00684] As composições separadas de células T CD4+ e CD8+ que foram selecionadas de PBMCs isoladas de uma amostra de leucafere- se humana obtida de um indivíduo com leucemia linfocítica crônica
(CLL) foram incubadas, transduzidas e cultivadas pelo processo exemplar descrito no Exemplo I. Composições separadas de células T CD4+ modificadas e células T CD8+ modificadas, cada qual expres- sando o mesmo CAR anti-CD19 foram geradas. Exemplo 5: Imageamento Em Linha Contínua para Determinação da Viabilidade Celular Durante o Cultivo.
[00685] Vários parâmetros óticos de células T no processo de modi- ficação para expressão de um receptor recombinante foram obtidos usando microscopia de holografia digital diferencial em linha (DHM).O DHM diferencial permite imagens livres de rótulos de células, com imagens de alto contraste para segmentação de objetos e obtenção de uma pluralidade de características óticas ou morfológicas que descre- vem quantitativamente os objetos fotografados, por exemplo, para de- terminar a contagem e a viabilidade das células.
[00686] As células T primárias de doadores humanos saudáveis foram projetadas para expressar um receptor de antígeno quimérico anti-CD19 (CAR) usando um processo de modificação exemplar, ge- ralmente como descrito nos Exemplos 1 acima. Duas experiências fo- ram realizadas: a experiência 1 com dois ciclos experimentais de célu- las CD4+ de dois doadores saudáveis diferentes (doador 1 ou doador 2) e a experiência 2 com um ciclo experimental, cada uma das células CD4+ e células CD8+ de um terceiro doador (doador 3). As células foram cultivadas para expansão por transferência para um biorreator (por exemplo, um biorreator em movimento de agitação). O cultivo in- cluiu a substituição do meio com perfusão semicontínua e mistura con- tínua.
[00687] Imagens holográficas e parâmetros óticos das células foram capturados continuamente por até aproximadamente 120 horas de cul- tura usando um sistema de imagem diferencial DHM em linha ("contí- nuo"), por exemplo, um OvizioiLine F (OvizioImaging Systems NV / SA,
Bruxelas, Bélgica). O sistema DHM diferencial em linha continha um sistema de tubulação descartável conectado ao biorreator, de modo que uma amostra possa fluir do biorreator, através do sistema de tubu- lação, onde um sistema de imagem captura imagens holográficas e parâmetros óticos das células que percorrem e retornam da amostra para o biorreator. A viabilidade celular e a contagem de células viáveis (VCC) foram determinadas a partir de imagens. A viabilidade das célu- las modificadas foi da mesma forma comparada aos resultados por amostragem manual ("manual") e contagem de células usando um contador de células automatizado, amostrado em vários momentos durante até aproximadamente 120 horas de cultura. Os dois métodos foram comparados com base na análise do curso do tempo e regres- são linear.
[00688] As FIGURAS 2A-2D mostram a comparação da contagem de células viáveis (VCC) e da viabilidade, avaliada usando o monito- ramento contínuo por DHM diferencial ou amostragem manual, em cé- lulas CD4+ da experiência 1 doador 1 (FIG. 2A), experiência 1 doador 2 (FIG. 2B) ou experiência 2 doador 3 (FIG. 2C) ou células CD8+ da experiência 2 doador 3 (FIG. 2D). O R2 e Declividade da comparação são mostrados na Tabela E2 abaixo. Tabela E2. R2 e Declividade de comparação entre os métodos de amostragem. Experiência R2 Declividade VCC Viabilidade VCC Viabilidade Experiência 1, 0,98 0,99 1,29 1,02 Doador 1, CD4+ Experiência 1, 0,98 1,00 1,49 1,01 Doador 2, CD4+ Experiência 2, 0,71 0,92 1,11 0,98 Doador 3, CD4+ Experiência 2, 0,99 0,99 1,49 0,95 Doador 3, CD8+
[00689] Os resultados mostraram que a VCC e a viabilidade como monitoramento contínuo e amostragem manual estavam altamente correlacionadas, para células CD4+ e CD8+ e células de diferentes doadores. Os resultados foram consistentes com a utilidade do monito- ramento contínuo por DHM diferencial durante o cultivo para expansão das células no processo de modificação de célula. Exemplo 6: Comparação de Expansão Manual e Automatizada Usando Imageamento Em Linha Contínua.
[00690] Um método de expansão celular totalmente automatizado e sem operador, com monitoramento contínuo das células por imagea- mento em linha e perfusão automatizada, foi comparado a um método de expansão manual.
[00691] As células T primárias de um doador humano saudável fo- ram ativadas e transduzidas com um vetor para expressar um exemplo de receptor de antígeno quimérico (CAR), usando um processo de modificação exemplar. Após a transdução, as células foram reunidas e inoculadas para duas culturas diferentes, uma expansão automatizada com base em imagens em linha contínuas usando DHM diferencial e um método de expansão manual.
[00692] Na cultura de expansão automatizada, as células foram cul- tivadas em um biorreator em movimento de agitação, com substituição do meio com perfusão e mistura contínua. A viabilidade celular e a contagem de células viáveis (VCC) foram monitoradas usando um sis- tema de imagem diferencial automatizado DHM, geralmente como descrito no Exemplo 5 acima. O VCC inicial no momento da inocula- ção foi similar a duas culturas (0,12 x 106 células/mL para cultura au- tomatizada, 0,14 x 106 células/mL para cultura manual). A perfusão na expansão automatizada foi baseada em uma média rotação de quatro horas de VCC calculada por um algoritmo de software, onde uma mé- dia de VCC maior que a VCC de destino era necessária para a pro-
gressão do método. A VCC alvo foi de 0,6 x 106 células/mL, 1 x 106 células/mL e 4 x 106 células/mL para 3 etapas de perfusão. Nenhuma intervenção adicional do operador ocorreu após a inoculação. Na cul- tura de expansão manual, a perfusão foi realizada com base na amos- tragem manual e na avaliação de VCC, com um volume específico de meio adicionado após atingir o limiar da VCC. As células foram da mesma forma avaliadas quanto à expressão de marcadores na super- fície celular por fluxo citometria.
[00693] Como mostrado na FIG. 3, foi observado maior crescimento de células T com o sistema de expansão automatizado. A viabilidade celular, avaliada por imagens diferenciais contínuas de DHM, e os fe- nótipos celulares, avaliados por citometria de fluxo, foram similares entre os processos de expansão automatizados versus manuais.
[00694] Os resultados foram consistentes com a utilidade do pro- cesso contínuo de imagem e expansão automática de imagens DHM, para cultivo e monitoramento de células durante um processo de modi- ficação de células T, sem a necessidade de um operador humano. Em alguns aspectos, este método pode ser usado para determinar a ciné- tica de crescimento das células T primárias e determinar o tempo para a colheita das células para modificação de administração.
[00695] A presente invenção não é pretendida ser limitada no esco- po das modalidades particulares descritas, as quais são fornecidas, por exemplo, para ilustrar vários aspectos da invenção. Várias modifi- cações nas composições e métodos descritos tornar-se-ão evidentes a partir da descrição e dos ensinamentos aqui contidos. Tais variações podem ser praticadas sem afastar-se do verdadeiro escopo e espírito da descrição e pretende-se que se incluam no escopo da presente descrição.
SEQUÊNCIAS SEQ ID NO. SEQUÊNCIA DESCRIÇÃO 1 ESKYGPPCPPCP espaçador (articulação IgG4) (aa) Homo sapiens 2 GAATCTAAGTACGGACCGCCCTGCCC espaçador (articulação CCCTTGCCCT IgG4) (nt) homo sapiens 3 ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPS Espaçador articulação- QEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW CH3
ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS RLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHN Homo sapiens
HYTQKSLSLSLGK 4 ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPP Espaçador articulação- KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPE CH2-CH3
VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS Homo sapiens
NKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEA
LHNHYTQKSLSLSLGK 5 RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAK IgD-articulação-Fc
ATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQ EERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQ Homo sapiens
DLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWE VAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQH SRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPP QRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDP PEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQ REVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWS VLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTL
LNASRSLEVSYVTDH 6 LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR T2A artificial
SEQ ID NO. SEQUÊNCIA DESCRIÇÃO 7 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGI tEGFR
GIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDL HILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKT artificial
VKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEII RGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSL KEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLF GTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHA LCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGR ECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHP ECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYID GPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADA GHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTN
GPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM 8 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV CD28 (aminoácidos 153- 179 de Número de Acesso P10747) Homo sapiens 9 IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLC CD28 (aminoácidos 114- PSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSL 179 de Número de Acesso LVTVAFIIFWV P10747) Homo sapiens 10 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKH CD28 (aminoácidos 180- YQPYAPPRDFAAYRS 220 de P10747) Homo sapiens 11 RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRK CD28 (LL a GG)
HYQPYAPPRDFAAYRS Homo sapiens 12 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDG 4-1BB (aminoácidos 214- CSCRFPEEEEGGCEL 255 de Q07011.1) Homo sapiens 13 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNL CD3 zeta
GRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRR KNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK Homo sapiens
GERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDA LHMQALPPR
SEQ ID NO. SEQUÊNCIA DESCRIÇÃO 14 RVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNL CD3 zeta
GRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRR KNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK Homo sapiens
GERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDA
LHMQALPPR 15 RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNL CD3 zeta
GRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRR KNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK Homo sapiens
GERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDA
LHMQALPPR 16 RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNC tEGFR
TSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQ ELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHA artificial
FENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSL GLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTIN WKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATG QVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRN VSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSE CIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQ CAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLV WKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGL EGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVA
LGIGLFM 17 EGRGSLLTCGDVEENPGP T2A artificial 18 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP P2A 19 ATNFSLLKQAGDVEENPGP P2A 20 QCTNYALLKLAGDVESNPGP E2A 21 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP F2A 22 PGGG-(SGGGG)5-P- em que P é Ligante exemplar prolina, G é glicina e S é serina 23 GSADDAKKDAAKKDGKS Ligante exemplar 24 GSTSGSGKPGSGEGSTKG Ligante exemplar 25 Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Articulação IgG Exemplar Pro Pro Cys Pro 26 X1PPX2P Articulação IgG Exemplar X1 é glicina, cisteína ou arginina X2 é cisteína ou treonina 27 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Articulação IgG Exemplar Cys Pro Pro Cys Pro 28 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Articulação IgG Exemplar Pro Cys Pro
SEQ ID NO. SEQUÊNCIA DESCRIÇÃO 29 ELKTPLGDTHTCPRCPEPKSCDTPPPC Articulação IgG Exemplar
PRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDT
PPPCPRCP 30 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Articulação IgG Exemplar Cys Pro 31 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Articulação IgG Exemplar Cys Pro 32 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Articulação IgG Exemplar 33 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Articulação IgG Exemplar 34 QQGNTLPYT CDR L3 35 RASQDISKYLN CDR L1 36 SRLHSGV CDR L2 37 GNTLPYTFG CDR L3 38 DYGVS CDR H1 39 VIWGSETTYYNSALKS CDR H2 40 YAMDYWG CDR H3 41 EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGV VH
SLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWG SETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLK MNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAM
DYWGQGTSVTVSS 42 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQ VL
DISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLH SGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDI
ATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT 43 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQ scFv
DISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLH SGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDI ATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGST SGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGL VAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIR QPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKS RLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYY CAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVS
S 44 KASQNVGTNVA CDR L1 45 SATYRNS CDR L2 46 QQYNRYPYT CDR L3 47 SYWMN CDR H1 48 QIYPGDGDTNYNGKFKG CDR H2
SEQ ID NO. SEQUÊNCIA DESCRIÇÃO 49 KTISSVVDFYFDY CDR H3 50 EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGY VH
AFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYP GDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTA YMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVD
FYFDYWGQGTTVTVSS 51 DIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQ VL
NVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATY RNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQS KDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIK
R 52 GGGGSGGGGSGGGGS Linker 53 EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGY scFv
AFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYP GDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTA YMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVD FYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGG SGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSV TCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPL IYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTI TNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGG
TKLEIKR 54 HYYYGGSYAMDY CDR H3 55 HTSRLHS CDR L2 56 GSTSGSGKPGSGEGSTKG Linker
SEQ ID NO.
SEQUÊNCIA DESCRIÇÃO 57 gacatccagatgacccagaccacctccagcctgagc Sequência codificando gccagcctgggcgaccgggtgaccatcagctgccgg scFv gccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatc agcagaagcccgacggcaccgtcaagctgctgatct accacaccagccggctgcacagcggcgtgcccagc cggtttagcggcagcggctccggcaccgactacagc ctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgcca cctacttttgccagcagggcaacacactgccctacacc tttggcggcggaacaaagctggaaatcaccggcagc acctccggcagcggcaagcctggcagcggcgaggg cagcaccaagggcgaggtgaagctgcaggaaagc ggccctggcctggtggcccccagccagagcctgagc gtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgcccgact acggcgtgagctggatccggcagccccccaggaag ggcctggaatggctgggcgtgatctggggcagcgag accacctactacaacagcgccctgaagagccggctg accatcatcaaggacaacagcaagagccaggtgttc ctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgc catctactactgcgccaagcactactactacggcggc agctacgccatggactactggggccagggcaccagc gtgaccgtgagcagc 58 MPLLLLLPLLWAGALA Peptídeo sinal CD33 59 MALPVTALLLPLALLLHA Peptídeo sinal alfa CD8 60 atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttacc Sequência sinal de cadeia acacccagcattcctcctgatccca alfa GMCSFR 61 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP Sequência sinal de cadeia alfa GMCSFR

Claims (158)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para a produção de uma composição de células modificadas, caracterizado pelo fato de que o método compreende: (a) incubar, sob condições de estimulação, uma composi- ção de entrada compreendendo células T enriquecidas por células T humanas primárias CD4+, as referidas condições de estimulação compreendendo a presença de (i) um reagente estimulatório capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR e / ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimulatórias e (ii) uma ou mais citocinas, em que pelo menos uma citocina é ou com- preende IL-2 humana recombinante, desse modo gerando uma com- posição estimulada; e (b) introduzir umreceptor recombinante na composição es- timulada, desse modo gerando uma composição modificada compre- endendo células T modificadas.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: a composição de entrada compreende mais que ou mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T humanas primárias CD4+; e/ou a composição de entrada consiste essencialmente em célu- las T humanas primárias CD4+.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que a concentração de IL-2 recombinante é de 10 IU/mL a 200 IU/mL, ou de cerca de 10 IU/mL a cerca de 200 IU/mL.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações
1 a 3, caracterizado pelo fato de que as referidas uma ou mais citoci- nas também compreendem IL-7 e / ou IL-15, opcionalmente em que a concentração de IL-7 é de 100 IU/mL a 1000 IU/mL ou de cerca de 100 IU/mL a cerca de 1000 IU/mL e / ou a concentração de IL-15 é de 1 IU/mL a 50 IU/mL ou de cerca de 1 IU/mL a cerca de 50 IU/mL.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a incubação é realizada na pre- sença de um ou mais antioxidantes.
6. Método para a produção de uma composição de células modificadas, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) incubar uma composição de entrada compreendendo células T enriquecidas por uma ou ambas as células T humanas pri- márias CD4+ e CD8+, desse modo gerando uma composição estimu- lada, em que a incubação é realizada: (1) sob uma ou mais condições de estimulação, as referidas condições de estimulação compreendendo a presença de (i) um rea- gente estimulatório capaz de ativar um ou mais domínios de sinaliza- ção intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR e / ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimulatórias e (ii) uma ou mais citocinas; e/ou (2) na presença de um ou mais antioxidantes; e (b) introduzir um receptor recombinante na composição es- timulada, desse modo gerando uma composição modificada compre- endendo células T modificadas.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que: a composição de entrada compreende mais que ou mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T humanas primárias CD4+ e / ou CD8+; e/ou a composição de entrada consiste essencialmente em célu- las T humanas primárias CD4+ e / ou CD8+.
8. Método de acordo com a reivindicação 6 ou reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as referidas uma ou mais citocinas são selecionadas de IL-2 recombinante, IL-7 recombinante e / ou IL-15 recombinante.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que: a concentração de IL-2 recombinante é de 10 IU/mL a 200 IU/mL ou de cerca de 10 IU/mL a cerca de 200 IU/mL; a concentração de IL-7 recombinante é de 100 IU/mL a 1000 IU/mL ou de cerca de 100 IU/mL a cerca de 1000 IU/mL; e/ou a concentração de IL-15 recombinante é de 1 IU/mL a 25 IU/mL ou de cerca de 1 IU/mL a cerca de 25 IU/mL.
10. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que: a composição de entrada compreende mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T humanas primá- rias CD4+; e/ou a composição de entrada consiste essencialmente em célu- las T humanas primárias CD4+.
11. Método de acordo com a reivindicação 6 ou reivindica- ção 10, caracterizado pelo fato de que as referidas uma ou mais cito- cinas são selecionadas de IL-2 recombinante, IL-7 recombinante e IL- 15 recombinante.
12. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que: a composição de entrada compreende mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T humanas primá- rias CD8+; e/ou a composição de entrada consiste essencialmente em célu- las T humanas primárias CD8+.
13. Método de acordo com a reivindicação 6 ou reivindica- ção 12, caracterizado pelo fato de que as referidas uma ou mais cito- cinas são selecionadas de IL-2 recombinante e IL-15 recombinante.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o reagente estimulatório compreende um agente primário que especificamente se liga a um membro de um complexo TCR, opcionalmente que especificamente se liga a CD3.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que o reagente estimulatório também compreende um agente secundário que especificamente se liga a uma molécula coes- timulatória de célula T, opcionalmente em que a molécula coestimula- tória é selecionada de CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, ou ICOS.
16. Método de acordo com a reivindicação 14 ou reivindica- ção 15, caracterizado pelo fato de que os agentes primários e / ou se- cundários compreendem um anticorpo, opcionalmente em que o rea- gente estimulatório compreende incubação com um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindica-
ções 14 a 16, caracterizado pelo fato de que o agente primário e / ou agente secundário estão presentes na superfície de um suporte sólido.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracteriza- do pelo fato de que o suporte sólido é ou compreende uma conta.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracteriza- do pelo fato de que a conta compreende um diâmetro de mais que ou mais do que cerca de 3,5 µm, mas não mais do que cerca de 9 µm ou não mais do que cerca de 8 µm ou não mais do que cerca de 7 µm ou não mais do que cerca de 6 µm ou não mais do que cerca de 5 µm.
20. Método de acordo com a reivindicação 18 ou 19, carac- terizado pelo fato de que a conta compreende um diâmetro de ou cer- ca de 4,5 µm.
21. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 18 a 20, caracterizado pelo fato de que a conta é inerte.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 18 a 21, caracterizado pelo fato de que a conta é ou compreende uma superfície de poliestireno.
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 18 a 22, caracterizado pelo fato de que a conta é magnética ou superparamagnética.
24. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 18 a 23, caracterizado pelo fato de que a relação de contas para células é menor que ou menor do que cerca de 3:1.
25. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 18 a 24, caracterizado pelo fato de que a relação de contas para células é de 2:1 a 0,5:1, ou de cerca de 2:1 a cerca de 0,5:1.
26. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 18 a 25, caracterizado pelo fato de que a relação de contas para células é de, ou de cerca de 1:1.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindica-
ções 5 a 26, caracterizado pelo fato de que os referidos um ou mais antioxidantes compreendem um antioxidante contendo enxofre.
28. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 5 a 27, caracterizado pelo fato de que os referidos um ou mais antioxidantes compreendem um precursor de glutationa.
29. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 5 a 28, caracterizado pelo fato de que os referidos um ou mais antioxidantes compreendem N-acetil cisteína (NAC), opcionalmente em que a NAC está em uma concentração de 0,2 mg/mL a 2,0 mg/mL, ou de cerca de 0,2 mg/mL a cerca de 2,0 mg/mL.
30. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 29, caracterizado pelo fato de que a introdução compreende transduzir células da composição estimulada com um vetor viral com- preendendo um polinucleotídeo codificando o receptor recombinante.
31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracteriza- do pelo fato de que o vetor viral é um vetor retroviral.
32. Método de acordo com a reivindicação 30 ou 31, carac- terizado pelo fato de que o vetor viral é um vetor lentiviral ou vetor ga- marretroviral.
33. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 30 a 32, caracterizado pelo fato de que a introdução é realizada na presença de um adjuvante de transdução.
34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracteriza- do pelo fato de que o adjuvante de transdução é ou compreende sulfa- to de protamina, opcionalmente de 1 µg/ml a 50 µg/ml ou de cerca de 1 µg/ml a cerca de 50 µg/ml sulfato de protamina; um adjuvante de transdução derivado de fibronectina; e / ou RetroNectina.
35. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 34, caracterizado pelo fato de que a introdução compreende transfectar as células da composição estimulada com um vetor com-
preendendo um polinucleotídeo codificando o receptor recombinante.
36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracteriza- do pelo fato de que o vetor é um transposon, opcionalmente um trans- poson Sleeping Beauty (SB) ou um transposon Piggybac.
37. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 36, caracterizado pelo fato de também compreender cultivar a composição modificada sob condições para promover proliferação ou expansão das células modificadas, desse modo produzindo uma com- posição de saída compreendendo as células T modificadas.
38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracteriza- do pelo fato de que o cultivo é realizado na presença de uma ou mais citocinas, em que pelo menos uma citocina é ou compreende IL-2 hu- mana recombinante.
39. Método de acordo com a reivindicação 37 ou reivindica- ção 38, caracterizado pelo fato de que o reagente estimulatório é re- movido da composição modificada antes do cultivo.
40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracteriza- do pelo fato de que o agente estimulatório é removido dentro de, ou menos de 7 dias após o início da incubação.
41. Método de acordo com a reivindicação 39 ou reivindica- ção 40, caracterizado pelo fato de que o reagente estimulatório é re- movido a partir de 3 dias a 6 dias ou de cerca de 3 dias a cerca de 6 dias após o início da incubação.
42. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 37 a 41, caracterizado pelo fato de que o reagente estimulatório é removido em, ou em cerca de 4 dias após o início da incubação.
43. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 39 a 42, caracterizado pelo fato de que a remoção das contas compreende expor as células da composição modificada a um campo magnético.
44. Método para a produção de uma composição de células modificadas, caracterizado pelo fato de que o método compreender cultivar, na presença de uma ou mais citocinas, uma composição celu- lar modificada compreendendo células T humanas primárias CD4+ compreendendo células modificadas com um receptor recombinante, em que pelo menos uma citocina é ou compreende IL-2 humana re- combinante; em que o método resulta na proliferação ou expansão de células na composição para produzir uma composição de saída com- preendendo células CD4+ modificadas.
45. Método de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que a proliferação ou expansão resulta em, em cerca de, ou em pelo menos um aumento de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, ou maior que 5 vezes no número de células T CD4+ modifica- das com um receptor recombinante.
46. Método de acordo com a reivindicação 44 ou 45, carac- terizado pelo fato de que: a composição celular modificada compreende mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cer- ca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T huma- nas primárias CD4+ ou células expressando o receptor recombinante CD4+; e/ou a composição celular modificada consiste essencialmente em células T humanas primárias CD4+.
47. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 44 a 46, caracterizado pelo fato de que a concentração de IL-2 recombinante é de 50 IU/mL a 500 IU/ml ou de cerca de 50 IU/mL a cerca de 500 IU/ml.
48. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 38 a 47, caracterizado pelo fato de que as referidas uma ou mais citocinas também compreendem IL-7 e / ou IL-15, opcionalmente em que a concentração de IL-7 é de 500 IU/mL a 2000 IU/mL ou de cerca de 500 IU/mL a cerca de 2000 IU/mL e / ou a concentração de IL-15 é de 5 IU/mL a 50 IU/mL ou de cerca de 5 IU/mL a cerca de 50 IU/mL.
49. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 44 a 48, caracterizado pelo fato de que a composição celular modificada é produzida por um método compreendendo: (a) incubar, sob condições de estimulação, uma composi- ção de entrada compreendendo células T primárias enriquecidas por células T humanas primárias CD4+, as referidas condições de estimu- lação compreendendo a presença de (i) um reagente estimulatório ca- paz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR e / ou um ou mais domí- nios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimula- tórias e (ii) uma ou mais citocinas, em que pelo menos uma citocina é ou compreende IL-2 humana recombinante, desse modo gerando uma composição estimulada; e (b) introduzir umreceptor recombinante na composição es- timulada, desse modo gerando uma composição modificada compre- endendo células T modificadas.
50. Método de acordo com a reivindicação 49, caracteriza- do pelo fato de que: a composição de entrada compreende mais que ou mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T humanas primárias CD4+; e/ou a composição de entrada consiste essencialmente em célu- las T humanas primárias CD4+.
51. Método de acordo com a reivindicação 49 ou 50, carac- terizado pelo fato de que as referidas uma ou mais citocinas também compreendem IL-7 e / ou IL-15.
52. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 37 a 51, caracterizado pelo fato de que o cultivo é realizado na presença de um tensoativo.
53. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 37 a 52, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma parte do cultivo é realizada com contínua mistura e / ou perfusão.
54. Método para a produção de uma composição de células modificadas, caracterizado pelo fato de que o método compreende cul- tivar, na presença de uma ou mais citocinas, uma composição celular modificada compreendendo uma ou ambas as células T humanas pri- márias CD4+ e CD8+ compreendendo células modificadas com um receptor recombinante, em que o cultivo é realizado na presença de um tensoativo e / ou pelo menos uma parte do cultivo é realizada com contínua mistura e / ou perfusão; pelo fato de o método resulta na proliferação ou expansão de células na composição para produzir uma composição de saída compreendendo células T CD4+ e / ou CD8+ modificadas.
55. Método de acordo com a reivindicação 54, caracteriza- do pelo fato de que: a composição celular modificada compreende mais que ou mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cer- ca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% célu- las T humanas primárias CD4+ e / ou CD8+ ou células T primárias ex-
pressando o receptor recombinante CD4+ e / ou CD8+; e/ou a compo- sição celular modificada consiste essencialmente em células T huma- nas primárias CD4+ e / ou CD8+.
56. Método de acordo com a reivindicação 54 ou reivindica- ção 55, caracterizado pelo fato de que a proliferação ou expansão re- sulta em, em cerca de, ou em pelo menos um aumento de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, ou maior que 5 vezes no número de células T CD4+ e/ou CD8+ modificadas com um receptor recombinante.
57. Método de acordo com a reivindicação 55, caracteriza- do pelo fato de que as referidas uma ou mais citocinas são seleciona- das de IL-2 recombinante, IL-7 recombinante e / ou IL-15 recombinan- te.
58. Método de acordo com a reivindicação 56 ou reivindica- ção 57, caracterizado pelo fato de que: a concentração de IL-2 recombinante é de 50 a 500 IU/mL ou de cerca de 50 a cerca de 500 IU/mL; a concentração de IL-7 recombinante é de 500 IU/mL a 2000 IU/mL ou de cerca de 500 IU/mL a cerca de 2000 IU/mL; e/ou a concentração de IL-15 recombinante é de 5 IU/mL a 50 IU/mL ou de cerca de 5 IU/mL a cerca de 50 IU/mL.
59. Método de acordo com a reivindicação 54, caracteriza- do pelo fato de que: a composição celular modificada compreende mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cer- ca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T huma- nas primárias CD4+ ou CD4+ e células T humanas primárias expres- sando receptor recombinante; e/ou a composição celular modificada consiste essencialmente em células T humanas primárias CD4+.
60. Método de acordo com a reivindicação 59, caracteriza- do pelo fato de que a proliferação ou expansão resulta em, em cerca de, ou em pelo menos um aumento de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, ou maior que 5 vezes no número de células T CD8+ modifica- das com um receptor recombinante.
61. Método de acordo com a reivindicação 54 ou 55, carac- terizado pelo fato de que as referidas uma ou mais citocinas são sele- cionadas de IL-2 recombinante, IL-7 recombinante e IL-15 recombinan- te.
62. Método de acordo com a reivindicação 54, caracteriza- do pelo fato de que: a composição celular modificada compreende mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cer- ca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T huma- nas primárias CD8+ ou CD8+ e células T humanas primárias expres- sando receptor recombinante; e/ou a composição celular modificada consiste essencialmente em células T humanas primárias CD8+.
63. Método de acordo com a reivindicação 54 ou reivindica- ção 62, caracterizado pelo fato de que as referidas uma ou mais cito- cinas são selecionadas de IL-2 recombinante e IL-15 recombinante.
64. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 52 a 63, caracterizado pelo fato de que o tensoativo compreende um poloxâmero, opcionalmente em que o poloxâmero está presente em uma concentração de 0,5 µL/mL a 5 µL/mL ou de cerca de 0,5 µL/mL a cerca de 5µL/mL.
65. Método de acordo com a reivindicação 64, caracteriza-
do pelo fato de que o poloxâmero é Poloxâmero 188.
66. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 54 a 65, caracterizado pelo fato de que a composição celular modificada é produzida por um método compreendendo: (a) incubar, sob condições de estimulação, uma composi- ção de entrada compreendendo células T primárias enriquecidas por uma ou ambas as células T humanas primárias CD4+ e CD8+, as refe- ridas condições de estimulação compreendendo a presença de (i) um reagente estimulatório capaz de ativar um ou mais domínios de sinali- zação intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR e / ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimulatórias e (ii) uma ou mais citocinas, desse modo gerando uma composição estimulada; e (b) introduzir um receptor recombinante na composição es- timulada, desse modo gerando uma composição modificada compre- endendo células T modificadas.
67. Método de acordo com a reivindicação 66, caracteriza- do pelo fato de que: a composição de entrada compreende mais que ou mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T humanas primárias CD4+ e / ou CD8+; e/ou a composição de entrada consiste essencialmente em célu- las T humanas primárias CD4+ e / ou CD8+.
68. Método de acordo com a reivindicação 66 ou 67, carac- terizado pelo fato de que que as referidas uma ou mais citocinas são selecionadas de IL-2 recombinante, IL-7 recombinante e / ou IL-15 re- combinante.
69. Método de acordo com a reivindicação 66, caracteriza- do pelo fato de que: a composição de entrada compreende mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T humanas primá- rias CD4+; e/ou a composição de entrada consiste essencialmente em célu- las T humanas primárias CD4+.
70. Método de acordo com a reivindicação 66 ou 69, carac- terizado pelo fato de que as referidas uma ou mais citocinas são sele- cionadas de IL-2 recombinante, IL-7 recombinante e IL-15 recombinan- te.
71. Método de acordo com a reivindicação 66, caracteriza- do pelo fato de que: a composição de entrada compreende mais do que cerca de 70%, mais que ou mais do que cerca de 75%, mais que ou mais do que cerca de 80%, mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90%, mais que ou mais do que cerca de 95% ou mais que ou mais do que cerca de 98% células T humanas primá- rias CD8+; e/ou a composição de entrada consiste essencialmente em célu- las T humanas primárias CD8+.
72. Método de acordo com a reivindicação 66 ou 71, carac- terizado pelo fato de que as referidas uma ou mais citocinas são sele- cionadas de IL-2 recombinante e IL-15 recombinante.
73. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 49 a 53 e 66 a 72, caracterizado pelo fato de que o reagente es- timulatório compreende um agente primário que especificamente se liga a um membro de um complexo TCR, opcionalmente que especifi- camente se liga a CD3.
74. Método de acordo com a reivindicação 73, caracteriza- do pelo fato de que o reagente estimulatório também compreende um agente secundário que especificamente se liga a uma molécula coes- timulatória de célula T, opcionalmente em que a molécula coestimula- tória é selecionada de CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, ou ICOS.
75. Método de acordo com a reivindicação 73 ou 74, carac- terizado pelo fato de que os agentes primários e / ou secundários compreendem um anticorpo, opcionalmente em que o reagente esti- mulatório compreende incubação com um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
76. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 73 a 75, caracterizado pelo fato de que o agente primário e / ou agente secundário estão presentes na superfície de um suporte sólido.
77. Método de acordo com a reivindicação 76, caracteriza- do pelo fato de que o suporte sólido é ou compreende uma conta.
78. Método de acordo com a reivindicação 77, caracteriza- do pelo fato de que a conta compreende um diâmetro de mais que ou mais do que cerca de 3,5 µm, mas não mais do que cerca de 9 µm ou não mais do que cerca de 8 µm ou não mais do que cerca de 7 µm ou não mais do que cerca de 6 µm ou não mais do que cerca de 5 µm.
79. Método de acordo com a reivindicação 77 ou 78, carac- terizado pelo fato de que a conta compreende um diâmetro de ou cer- ca de 4,5 µm.
80. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 77 a 79, caracterizado pelo fato de que a conta é inerte.
81. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 77 a 80, caracterizado pelo fato de que a conta é ou compreende uma superfície de poliestireno.
82. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 77 a 81, caracterizado pelo fato de que a conta é magnética ou superparamagnética.
83. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 77 a 82, caracterizado pelo fato de que a relação de contas para células é menor que 3:1 ou menor do que cerca de 3:1.
84. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 77 a 83, caracterizado pelo fato de que a relação de contas para células é de 2:1 a 0,5:1 ou de cerca de 2:1 a cerca de 0,5:1.
85. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 77 a 84, caracterizado pelo fato de que a relação de contas para células é de, ou de cerca de 1:1.
86. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 49 a 53 e 66 a 85, caracterizado pelo fato de que a incubação é realizada na presença de um ou mais antioxidantes.
87. Método de acordo com a reivindicação 86, caracteriza- do pelo fato de que os referidos um ou mais antioxidantes compreen- dem um antioxidante contendo enxofre.
88. Método de acordo com a reivindicação 86 ou 87, carac- terizado pelo fato de que os referidos um ou mais antioxidantes com- preendem um precursor de glutationa.
89. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 86 a 88, caracterizado pelo fato de que os referidos um ou mais antioxidantes compreendem N-acetil cisteína (NAC), opcionalmente em que a NAC está em uma concentração de 0,2 mg/mL a 2,0 mg/mL ou de cerca de 0,2 mg/mL a cerca de 2,0 mg/mL.
90. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 49 a 53 e 66 a 89, caracterizado pelo fato de que a introdução compreende transduzir células da composição estimulada com um ve-
tor viral compreendendo um polinucleotídeo codificando o receptor re- combinante.
91. Método de acordo com a reivindicação 90, caracteriza- do pelo fato de que o vetor viral é um vetor retroviral.
92. Método de acordo com a reivindicação 90 ou 91, carac- terizado pelo fato de que o vetor viral é um vetor lentiviral ou vetor ga- marretroviral.
93. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 49 a 53 e 66 a 92, caracterizado pelo fato de que a introdução é realizada na presença de um adjuvante de transdução.
94. Método de acordo com a reivindicação 93, caracteriza- do pelo fato de que o adjuvante de transdução é ou compreende sulfa- to de protamina, opcionalmente de 1 µg/ml a 50 µg/ml ou de cerca de 1 µg/ml a cerca de 50 µg/ml sulfato de protamina; um adjuvante de transdução derivado de fibronectina; e / ou RetroNectina.
95. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 49 a 53 e 66 a 89, caracterizado pelo fato de que a introdução compreende transfectar as células da composição estimulada com um vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando o receptor re- combinante.
96. Método de acordo com a reivindicação 95, caracteriza- do pelo fato de que o vetor é um transposon, opcionalmente um trans- poson Sleeping Beauty (SB) ou um transposon Piggybac.
97. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 44 a 69, caracterizado pelo fato de que a composição celular modificada não compreende um reagente estimulatório e / ou o rea- gente estimulatório foi substancialmente removido da composição an- tes do cultivo, o referido reagente estimulatório compreendendo um reagente capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intrace- lular de um ou mais componentes de um complexo TCR e / ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimulatórias.
98. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 37 a 97, caracterizado pelo fato de que o cultivo é realizado pelo menos até a composição de saída compreender a número limite de células T, número limite de célula T viáveis, concentração limite de cé- lulas T, ou concentração limite de células T viáveis.
99. Método de acordo com a reivindicação 98, caracteriza- do pelo fato de que o cultivo é continuado durante pelo menos um dia após o número limite de célula T, número limite de célula T viáveis, concentração limite de células T, ou concentração limite de células T viáveis ser atingido.
100. Método de acordo com a reivindicação 98 ou 99, ca- racterizado pelo fato de que o número limite de célula T, número limite de célula T viáveis, concentração limite de células T, ou concentração limite de células T viáveis é pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes ou mais, maior do que o nú- mero ou concentração, ou número viável ou concentração, da compo- sição celular modificada antes do cultivo.
101. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 37 a 100, caracterizado pelo fato de que o cultivo é realizado du- rante 2 dias a 10 dias inclusive, e / ou o cultivo é realizado durante pelo menos 10 dias.
102. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 37 a 100, caracterizado pelo fato de que o cultivo é realizado du- rante 2 dias a 10 dias inclusive, e / ou o cultivo é realizado até pelo menos 9 dias após o início da incubação.
103. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 37 a 100, caracterizado pelo fato de que o cultivo é realizado du- rante pelo menos 4 dias.
104. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 37 a 101, caracterizado pelo fato de que subsequente ao cultivo, coletar células da composição de saída.
105. Método de acordo com a reivindicação 104, caracteri- zado pelo fato de que o período de tempo entre o início da incubação e a coleta de células da composição de saída é de 7 dias a 15 dias ou de cerca de 7 dias a cerca de 15 dias.
106. Método de acordo com a reivindicação 104 ou 105, em que o período de tempo entre o início da incubação e a coleta de célu- las da composição de saída é de 9 dias a 13 dias ou de cerca de 9 di- as a cerca de 13 dias.
107. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 104 a 106, caracterizado pelo fato de que o período de tempo entre o início da incubação e a coleta de células da composição de saída é de 8 dias a 13 dias ou de cerca de 8 dias a cerca de 13 dias.
108. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 37 a 107, caracterizado pelo fato de que também compreende formular células da composição de saída para criopreservação e / ou administração a um indivíduo, opcionalmente na presença de um exci- piente farmaceuticamente aceitável.
109. Método de acordo com a reivindicação 108, caracteri- zado pelo fato de que as célulass da composição de saída são formu- ladas na presença de um crioprotetor.
110. Método de acordo com a reivindicação 109, caracteri- zado pelo fato de que o crioprotetor compreende DMSO.
111. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 108 a 110, caracterizado pelo fato de que as células da composi- ção de saída são formuladas em um recipiente, opcionalmente um frasconete ou uma bolsa.
112. Método de acordo com qualquer uma das reivindica-
ções 1 a 43 e 49 a 53 e 66 a 89, caracterizado pelo fato de que tam- bém compreende isolar as células T CD4+ e/ou CD8+ de uma amostra biológica antes da incubação.
113. Método de acordo com a reivindicação 112, caracteri- zado pelo fato de que o isolamento compreende selecionar células com base na expressão de superfície de CD4 e / ou CD8, opcional- mente por seleção positiva ou negativa.
114. Método de acordo com a reivindicação 112 ou reivindi- cação 113, caracterizado pelo fato de que o isolamento compreende realizar seleção com base em imunoafinidade.
115. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 112 a 114, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica compreende células T primárias obtidas de um indivíduo.
116. Método de acordo com a reivindicação 115, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é um indivíduo humano.
117. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 112 a 114, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é ou compreende uma amostra de sangue total, uma amostra da cama- da leucocitária, uma amostra de célula mononuclear de sangue perifé- rico (PBMC), uma amostra de célula T não fracionada, uma amostra de linfócito, uma amostra de glóbulos brancos, um produto de aferese, ou um produto de leucaferese.
118. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 117, caracterizado pelo fato de que o receptor recombinante é capaz de se ligar a um antígeno alvo que é associado com, específi- co para, e / ou expresso em uma célula ou tecido de uma doença, dis- túrbio ou condição.
119. Método de acordo com a reivindicação 118, caracteri- zado pelo fato de que a doença, distúrbio ou condição é uma doença ou distúrbio infeccioso, uma doença autoimune, uma doença inflama-
tória, ou um tumor ou um câncaer.
120. Método de acordo com a reivindicação 118 ou 119, caracterizado pelo fato de que o antígeno alvo é um antígeno de tu- mor.
121. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 118 a 120, caracterizado pelo fato de que o antígeno alvo é sele- cionado dentre 5T4, 8H9, avb6 integrina, B7-H6, antígeno de matura- ção de célula B (BCMA), CA9, um antígeno de testículos de câncer, anidrase 9 carbônica (CAIX), CCL-1, CD19, CD20, CD22, CEA, antí- geno de superfície de hepatite B, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, antígeno carci- noembriônico (CEA), CE7, uma ciclina, ciclina A2, c-Met, antígeno du- al, EGFR, glicoproteína 2 epitelial (EPG-2), glicoproteína 40 epitelial (EPG-40), EPHa2, efrinaB2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, dímeros erbB, EGFR vIII, receptor de estrogênio, AchR fetal, receptor alfa de folato, proteína de ligação de folato (FBP), FCRL5, FCRH5, receptor de aceti- lcolina fetal, G250/CAIX, GD2, GD3, gp100, Receptor 5D Acoplado à Proteína G (GPCR5D), Her2/neu (erbB2 de tirosina cinase receptora), HMW-MAA, IL-22R-alfa, receptor alfa 2 de IL-13(IL-13Ra2), receptor de domínio de inserção de cinase (kdr), cadeia leve kappa, Lewis Y, Molécula de adesão de célula L1 (L1-CAM), Antígeno associado com melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MART-1, mesotelina, CMV de murino, mucina 1 (MUC1), MUC16, NCAM, NKG2D, ligantes NKG2D, NY-ESO-1, GD2 O-acetilado (OGD2), antígeno oncofetal, antígeno preferencialmente expresso de melanoma (PRAME), PSCA, receptor de progesterona, survivina, ROR1, TAG72, tEGFR, recepto- res VEGF, VEGF-R2, Tumor Wilms 1 (WT-1), um antígeno específico de patógeno e um antígeno associado com um marcador universal.
122. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 121, caracterizado pelo fato de que o receptor recombinante é ou compreende um receptor de antígeno não TCR funcional ou um TCR ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
123. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 122, caracterizado pelo fato de que o receptor recombinante é um receptor de antígeno quimérico (CAR).
124. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 123, caracterizado pelo fato de que o receptor recombinante é um CAR anti-CD19.
125. Método de acordo com a reivindicação 123, caracteri- zado pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico compreende um domínio extracelular compreendendo um domínio de ligação a an- tígeno.
126. Método de acordo com a reivindicação 125, caracteri- zado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno é ou compre- ende um anticorpo ou um fragmento de anticorpo do mesmo, que op- cionalmente é um fragmento de cadeia única.
127. Método de acordo com a reivindicação 126, caracteri- zado pelo fato de que o fragmento compreende regiões variáveis de anticorpo unidas por um ligante flexível.
128. Método de acordo com a reivindicação 126 ou 127, caracterizado pelo fato de que o fragmento compreende uma scFv.
129. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 125 a 128, caracterizado pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico também compreende um espaçador e / ou uma região de articulação.
130. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 125 a 129, caracterizado pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico compreende uma região de sinalização intracelular.
131. Método de acordo com a reivindicação 130, caracteri- zado pelo fato de que a região de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização intracelular.
132. Método de acordo com a reivindicação 131, caracteri- zado pelo fato de que o domínio de sinalização intracelular é ou com- preende um domínio de sinalização primário, um domínio de sinaliza- ção que é capaz de induzir um sinal de ativação primário em uma célu- la T, um domínio de sinalização de um componente de receptor de cé- lula T (TCR), e / ou um domínio de sinalização compreendendo um motivo de ativação com base em tirosina imunorreceptora (ITAM).
133. Método de acordo com a reivindicação 132, caracteri- zado pelo fato de que o domínio de sinalização intracelular é ou com- preende um domínio de sinalização intracelular de uma cadeia CD3, opcionalmente uma cadeia CD3-zeta (CD3ζ), ou uma porção de sinali- zação do mesmo.
134. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 130 a 133, caracterizado pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico também compreende um domínio de transmembrana dis- posto entre o domínio extracelular e a região de sinalização intracelu- lar.
135. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 130 a 134, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização intracelular também compreende uma região de sinalização coestimu- latória.
136. Método de acordo com a reivindicação 135, caracteri- zado pelo fato de que a região de sinalização coestimulatória compre- ende um domínio de sinalização intracelular de uma molécula coesti- mulatória de célula T ou uma porção de sinalização do mesmo.
137. Método de acordo com a reivindicação 135 ou 136, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização coestimulatória compreende um domínio de sinalização intracelular de uma CD28, um 4-1BB ou um ICOS ou uma porção de sinalização do mesmo.
138. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 135 a 137, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização coestimulatória é entre o domínio de transmembrana e a região de si- nalização intracelular.
139. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 98 a 101, caracterizado pelo fato de que a composição de saída compreendendo o número limite ou número maior de células é produ- zida entre mais que ou mais do que cerca de 85%, mais que ou mais do que cerca de 90% ou mais que ou mais do que cerca de 95% das iterações do método.
140. Composição caracterizada pelo fato de compreender células modificadas produzidas por um método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 137.
141. Composição de acordo com a reivindicação 140, ca- racterizada pelo fato de também compreender um veículo farmaceuti- camente aceitável.
142. Composição de acordo com a reivindicação 140 ou 141, caracterizada pelo fato de compreender um crioprotetor, opcio- nalmente DMSO.
143. Artigo de fabricação, caracterizado pelo fato de com- preender a composição como definida em qualquer uma das reivindi- cações 138 a 140, e instruções para a administração da composição de saída a um indivíduo.
144. Artigo de fabricação de acordo com a reivindicação 143, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem uma doença ou condição, opcionalmente pelo fato de que o receptor recombinante es- pecificamente reconhece ou especificamente se liga a um antígeno associado com, ou expresso ou presente em células da doença ou condição.
145. Artigo de fabricação de acordo com a reivindicação
143 ou 144, caracterizado pelo fato de que a composição de saída é uma composição de células T CD4+ modificadas.
146. Artigo de fabricação de acordo com a reivindicação 143 ou 144, caracterizado pelo fato de que a composição de saída é uma composição de células T CD8+ modificadas.
147. Artigo de fabricação caracterizado pelo fato de com- preender uma composição de células T CD4+ modificadas produzida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, 13 a 60, 63 a 70, ou 72 a 139, uma composição de células T CD8+ modificadas produzida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 8, 11 a 43, 54 a 58, 60 a 68, ou 70 a 139, e ins- truções para a administração das células T CD4+ modificadas e das células T CD8+ modificadas a um indivíduo.
148. Artigo de fabricação de acordo com a reivindicação 147, caracterizado pelo fato de que as instruções especificam separa- damente administrar as células T CD4+ e células T CD8+ ao indivíduo.
149. Artigo de fabricação de acordo com a reivindicação 147 ou 148, caracterizado pelo fato de que as instruções especificam administrar as células T CD4+ e as células T CD8+ ao indivíduo em uma relação desejada.
150. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 139, caracterizado pelo fato de que o método é realizado du- rante menos de 21 dias, inclusive.
151. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 139, caracterizado pelo fato de que o método produz uma composição de saída que é administrada e/ou está pronta para ser administrada a um indivíduo dentro de um intervalo de confidência de 95% confidence menor que 21 dias, inclusive.
152. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 37 a 137, caracterizado pelo fato de que durante pelo menos uma parte do cultivo, as células são monitoradas quanto à viabilidade, concentração, densidade, número celular, ou combinação dos mes- mos.
153. Método de acordo com a reivindicação 152, caracteri- zado pelo fato de que a monitoração é realizada por um método ótico, opcionalmente microscopia.
154. Método de acordo com a reivindicação 152 ou 153, caracterizado pelo fato de que a monitoração é realizada por micros- copia de campo brilhante, microscopia por fluorescência, microscopia de contraste de interferência diferencial, microscopia de contraste de fase, microscopia de holografia digital (DHM), microscopia de hologra- fia digital diferencial (DDHM), ou uma combinação das mesmas.
155. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 152 a 154, caracterizado pelo fato de que a monitoração é reali- zada por microscopia de holografia digital diferencial (DDHM).
156. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 152 a 155, caracterizado pelo fato de que a monitoração é reali- zada intermitentemente ou continuamente durante a referida pelo me- nos uma parte do cultivo, opcionalmente é realizada pelo menos a ca- da 1 hora, 6 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, ou 26 hours durante o cultivo.
157. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 152 a 156, caracterizado pelo fato de que a monitoração é reali- zada até as células atingirem o número limite de células T, o número limite de células T viáveis, a concentração limite de células T ou a concentração limite de células T viáveis.
158. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 152 a 157, caracterizado pelo fato de que a monitoração e o cul- tivo são realizados em um sistema fechado.
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