JP7372728B2 - 改変ｔ細胞に関する方法および組成物 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は米国特許法第119条(e)の下、全て2014年10月31日付で出願された米国仮特許出願第62/073,144号、同第62/073,343号、同第62/073,467号、同第62/073,540号および同第62/073,681号の優先権を有しており、それらの出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

連邦政府資金による研究または開発に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所によって助成されたCA120409の下での政府の支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

発明の背景
キメラ抗原受容体(CAR)改変T細胞を用いる養子細胞移入(ACT)は、がんの処置のための有望な戦略であることが示されている(Louis et al., 2011, Blood 118:6050-6056（非特許文献1）; Kochenderfer et al., 2010, Blood 116:3875-3886（非特許文献2）およびPorter et al., 2011, N Engl J Med 365:725-733（非特許文献3）)。

レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを用いた組み込みに関連する安全性の懸念は、ACTに用いられる細胞の改変にとって大きな懸案事項である。T細胞受容体(TCR)またはCAR RNAエレクトロポレーションによるT細胞のRNAトランスフェクションなど、オンターゲットまたはオフターゲットの望ましくない副作用を避けるために、いくつかの進歩がなされている(Zhao, 2006, Mol Ther 13:151-159（非特許文献4）; Mitchell et al., Smits et al., 2004, Leukemia 18:1898-1902（非特許文献5）)。RNAおよびT細胞の両方の投与量を最小化することによって、そのような方法は、複数の遺伝子の導入を効率的に可能にする。しかしながら、CARの一過性発現の主な制約は、RNAトランスフェクションされたT細胞の準最適なエフェクター活性および機能性である。機能を改善するため、複数回のT細胞注入および/または低用量化学療法のかなりの使用が用いられている(Barrett et al., 2013, Hum Gene Ther 24(8):717-27（非特許文献6）)。

併用療法および追加処置を避けながらエフェクター活性および機能性を改善するために、様々な試みがなされている。トランスフェクションプロセス中のRNAの増加は、T細胞機能、特にインビボでの抗腫瘍活性に悪影響を及ぼした(Barrett et al., 2011, Hum Gene Ther 22:1575-1586（非特許文献7）)。さらに、抗CD3抗原抗体断片を抗腫瘍抗原抗体断片に融合させた別の構築体もまた、がん処置のための臨床試験において試験されている(Bargou et al., 2008, Science 321:974-977（非特許文献8）; Klinger et al., 2012, Blood 119:6226-6233（非特許文献9）)。残念ながら、これらの構築体は、短い半減期、標的細胞部位への接近性不良、および適切な長期シグナル伝達機能の欠如により、機能が著しく制限されていた。

それゆえ、T細胞に基づく養子免疫療法のためにインビボで最大のエフェクター活性および機能性を有するT細胞を作製すると同時にT細胞を改変するいっそう安全な方法に対する必要性が存在している。

Louis et al., 2011, Blood 118:6050-6056 Kochenderfer et al., 2010, Blood 116:3875-3886 Porter et al., 2011, N Engl J Med 365:725-733 Zhao, 2006, Mol Ther 13:151-159 Mitchell et al., Smits et al., 2004, Leukemia 18:1898-1902 Barrett et al., 2013, Hum Gene Ther 24(8):717-27 Barrett et al., 2011, Hum Gene Ther 22:1575-1586 Bargou et al., 2008, Science 321:974-977 Klinger et al., 2012, Blood 119:6226-6233

本明細書において記述されるように、本発明は、T細胞を改変するための組成物および方法に関する。

1つの局面において、本発明は、標的細胞上の抗原に対する親和性を含むT細胞受容体(TCR)をコードする外因性核酸と、二重特異性抗体をコードするエレクトロポレーションされたRNAとを含む、改変T細胞であって、該TCRおよび二重特異性抗体をT細胞の表面上に発現する、該T細胞を含む。

別の局面において、本発明は、T細胞に、標的細胞上の抗原に対する親和性を含む改変T細胞受容体(TCR)をコードする核酸および二重特異性抗体をコードする核酸を導入する段階を含み、エレクトロポレーションされたT細胞がTCRおよび二重特異性抗体を発現できる、改変T細胞を作製するための方法を含む。

さらに別の局面において、本発明は、その必要のある対象における免疫応答の処置のための医薬の製造における、本明細書において記述されるT細胞の使用を含む。

さらに別の局面において、本発明は、エレクトロポレーションされた、改変T細胞受容体(TCR)をコードするRNAと二重特異性抗体をコードするRNAとを含む、有効量の改変T細胞を対象に投与する段階を含む、対象において標的細胞または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該改変T細胞が、該改変TCRおよび二重特異性抗体を発現する、該方法を含む。

別の局面において、本発明は、改変T細胞受容体(TCR)をコードするRNAおよび二重特異性抗体をコードするRNAを用いてエレクトロポレーションされている改変T細胞の集団を、対象に有害な免疫反応を予防または処置するためにその必要のある対象に投与する段階を含む、養子細胞移入療法のための方法を含む。

さらに別の局面において、本発明は、改変T細胞受容体(TCR)をコードするRNAおよび二重特異性抗体をコードするRNAを用いてエレクトロポレーションされている改変T細胞の集団を、その必要のある対象に投与する段階を含む、対象における免疫の亢進に関連する疾患または状態を処置する方法を含む。

さらに別の局面において、本発明は、本明細書において記述される改変T細胞を含む治療的有効量の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象における状態を処置する方法を含む。

別の局面において、本発明は、改変T細胞を含む組成物を含む。別の局面において、本発明は、請求項1記載の改変T細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を含む。

本明細書において描かれる本発明の上記局面または任意の他の局面の様々な態様において、TCRは、少なくとも1つのジスルフィド結合を含む。1つの態様において、TCRは少なくとも1つのマウス定常領域を含む。別の態様において、TCRは、野生型TCRの場合よりも標的細胞抗原に対する親和性が高い。さらに別の態様において、TCRは、TCRアルファ鎖およびベータ鎖を含む。1つの態様において、TCRは、前記鎖のうちの少なくとも1つの鎖のC末端に、4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインのような、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。1つの態様において、ベータ鎖は、少なくとも1つのN-脱グリコシル化を含む。1つの態様において、アルファ鎖は、少なくとも1つのN-脱グリコシル化を含む。

別の態様において、標的細胞抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、腫瘍細胞関連抗原(TAA)、疾患細胞関連抗原、およびそれらの任意の断片からなる群より選択される。

別の態様において、二重特異性抗体は、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、一本鎖可変断片、単一ドメイン抗体、その抗原結合断片、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される二重特異性抗原結合ドメインを含む。さらに別の態様において、二重特異性抗原結合ドメインは、第1のscFv分子が標的細胞上の少なくとも1つの抗原に特異的であり、かつ第2のscFv分子が活性化T細胞上の抗原に特異的であるような、第1および第2の一本鎖可変断片(scFv)分子を含む。

別の態様において、活性化T細胞抗原は、CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、TCR、PD1およびPD1Lからなる群より選択される。

別の態様において、本明細書において記述されるT細胞は、共刺激分子をコードするエレクトロポレーションされた核酸をさらに含む。さらに別の態様において、T細胞は、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、およびT細胞株からなる群より得られる。

別の態様において、共刺激分子は、CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1およびPD1Lからなる群より選択される。さらに別の態様において、本明細書において記述される方法は、CD3をコードするRNAをT細胞中にエレクトロポレーションする段階をさらに含む。1つの態様において、CD3 RNAは、TCR核酸とコエレクトロポレーションされる。

別の態様において、核酸は、インビトロで転写されたRNAまたは合成RNAを含む。さらに別の態様において、TCRをコードする核酸は、TCRアルファ鎖およびTCRベータ鎖をコードする核酸を含む。1つの態様において、核酸を導入する段階は、TCRアルファ鎖をコードするRNAおよびTCRベータ鎖をコードする別個のRNAをコエレクトロポレーションする段階を含む。

別の態様において、本明細書において記述される方法は、T細胞を拡大する段階をさらに含む。1つの態様において、拡大する段階は、flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3およびc-kitリガンドからなる群より選択される因子とともにT細胞を培養することを含む。1つの態様において、拡大する段階は、CD3に対する一本鎖可変断片(scFv)とCD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含むキメラ膜タンパク質などのキメラ膜タンパク質をコードするRNAを用いてT細胞にエレクトロポレーションを行うこと、およびエレクトロポレーションされたT細胞を培養することを含む。

別の態様において、本明細書において記述される方法は、T細胞を凍結保存する段階をさらに含む。1つの態様において、本明細書において記述される方法は、核酸をT細胞に導入する前に、凍結保存されたT細胞を解凍する段階をさらに含む。さらに別の態様において、本明細書において記述される方法は、TCR核酸を導入した後にT細胞を凍結保存する段階をさらに含む。さらに別の態様において、本明細書において記述される方法は、二重特異性抗体を膜タンパク質として発現させる段階をさらに含む。さらに別の態様において、本明細書において記述される方法は、二重特異性抗体を導入されたT細胞を凍結保存する段階をさらに含む。さらに別の態様において、本明細書において記述される方法は、標的細胞または組織の溶解を誘導する段階をさらに含む。1つの態様において、誘導される溶解は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)である。

別の態様において、状態は、後天性免疫不全症候群(AIDS)、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、内耳自己免疫病(AIED)、自己免疫性リンパ増殖症候群(ALPS)、自己免疫性血小板減少性紫斑病(ATP)、ベーチェット病、心筋症、セリアック病-疱疹状皮膚炎(celiac sprue-dermatitis hepetiformis); 慢性疲労免疫機能不全症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発神経炎(CIPD)、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎(スティル病)、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症(進行性全身性硬化症(PSS)、これは全身性硬化症(SS)としても知られる)、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される自己免疫疾患などの自己免疫疾患である。さらに別の態様において、状態は、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるがんのような、がんである。

1つの局面において、本発明は、標的細胞上の抗原およびT細胞上の抗原に対する二重特異性を含む二重特異性抗体をコードする核酸と、キメラリガンド改変活性化受容体(chimeric ligand engineered activation receptor：CLEAR)をコードする核酸とを含む、改変T細胞であって、該二重特異性抗体およびCLEARを発現する該T細胞を含む。

別の局面において、本発明は、その必要のある対象における免疫応答の処置のための医薬の製造における、本明細書において記述されるT細胞の使用を含む。

さらに別の局面において、本発明は、二重特異性抗体をコードする核酸とキメラリガンド改変活性化受容体(CLEAR)をコードする核酸とをT細胞に導入する段階を含む、改変T細胞を作製するための方法であって、該T細胞が該二重特異性抗体およびCLEARを発現できる、該方法を含む。

さらに別の局面において、本発明は、キメラリガンド改変活性化受容体(CLEAR)をコードする核酸と、標的細胞上の抗原およびT細胞上のCLEARに対する二重特異性を有する二重特異性抗体をコードする核酸とを含む、改変T細胞であって、該CLEARおよび二重特異性抗体を発現する有効量の該改変T細胞を対象に投与する段階を含む、対象において標的細胞または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法を含む。

別の局面において、本発明は、キメラリガンド改変活性化受容体(CLEAR)をコードする核酸と、標的細胞上の抗原およびT細胞上のCLEARに対する二重特異性を有する二重特異性抗体をコードする核酸とを含む、改変T細胞の集団を、対象に有害な免疫反応を予防または処置するためにその必要のある対象に投与する段階を含む、養子細胞移入療法のための方法を含む。

さらに別の局面において、本発明は、キメラリガンド改変活性化受容体(CLEAR)をコードする核酸と、標的細胞上の抗原およびT細胞上のCLEARに対する二重特異性を有する二重特異性抗体をコードする核酸とを含む、改変T細胞の集団を、その必要のある対象に投与する段階を含む、対象における免疫の亢進に関連する疾患または状態を処置する方法を含む。

さらに別の局面において、本発明は、本明細書において記述される改変T細胞を含む治療的有効量の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象における状態を処置する方法を含む。

別の局面において、本発明は、本明細書において記述される改変T細胞を含む組成物を含む。さらに別の局面において、本発明は、本明細書において記述される改変T細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を含む。

本明細書において描かれる本発明の上記局面または任意の他の局面の様々な態様において、CLEARは、細胞内活性化ドメインおよび細胞外ドメインを含む。1つの態様において、細胞内活性化ドメインは、CD3ゼータの細胞内活性化ドメインの一部分を含む。1つの態様において、細胞外ドメインは、抗体の抗原結合ドメイン、受容体のリガンド結合ドメイン、抗原、およびリガンドからなる群より選択される。1つの態様において、細胞外ドメインは、CD27、CD28、CD70、CD80、PD1およびPD-L1からなる群より選択される。1つの態様において、細胞外ドメインは腫瘍抗原に結合することができる。

別の態様において、CLEARは、共刺激ドメインをさらに含む。1つの態様において、共刺激ドメインは、CD4、CD8および4-1BBからなる群より選択される。

別の態様において、標的細胞抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、腫瘍細胞関連抗原(TAA)、疾患細胞関連抗原、およびそれらの任意の断片からなる群より選択される。

別の態様において、二重特異性抗体は、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、一本鎖可変断片、単一ドメイン抗体、その抗原結合断片、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される二重特異性抗原結合ドメインを含む。さらに別の態様において、二重特異性抗原結合ドメインは、第1のscFv分子が標的細胞上の少なくとも1つの抗原に特異的であり、かつ第2のscFv分子がT細胞上の抗原に特異的であるような、第1および第2の一本鎖可変断片(scFv)分子を含む。さらに別の態様において、二重特異性抗体は、標的細胞上の抗原およびT細胞上のCLEARに対する二重特異性を含む。

別の態様において、本明細書において記述されるT細胞は、CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1およびPD1Lからなる群より選択される共刺激分子のような、共刺激分子をコードする核酸をさらに含む。さらに別の態様において、本明細書において記述されるT細胞は、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、およびT細胞株からなる群より得られる。

別の態様において、核酸のうちの少なくとも1つは、T細胞の形質導入、T細胞のトランスフェクション、およびT細胞のエレクトロポレーションからなる群より選択される方法によって導入される。さらに別の態様において、核酸のうちの少なくとも1つは、インビトロで転写されたRNAまたは合成RNAを含む。

別の態様において、本明細書において記述される方法は、T細胞を拡大する段階をさらに含む。1つの態様において、拡大する段階は、flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3およびc-kitリガンドからなる群より選択される因子とともにT細胞を培養することを含む。1つの態様において、拡大する段階は、CD3に対する一本鎖可変断片(scFv)とCD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含むキメラ膜タンパク質などのキメラ膜タンパク質をコードするRNAを用いてT細胞にエレクトロポレーションを行うこと、およびエレクトロポレーションされたT細胞を培養することを含む。

別の態様において、本明細書において記述される方法は、T細胞を凍結保存する段階をさらに含む。1つの態様において、本明細書において記述される方法は、核酸をT細胞に導入する前に、凍結保存されたT細胞を解凍する段階をさらに含む。さらに別の態様において、本明細書において記述される方法は、CLEAR核酸を導入した後にT細胞を凍結保存する段階をさらに含む。さらに別の態様において、本明細書において記述される方法は、二重特異性抗体を膜タンパク質として発現させる段階をさらに含む。さらに別の態様において、本明細書において記述される方法は、二重特異性抗体を導入されたT細胞を凍結保存する段階をさらに含む。さらに別の態様において、本明細書において記述される方法は、標的細胞または組織の溶解を誘導する段階をさらに含む。1つの態様において、誘導される溶解は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)である。

別の態様において、状態は、後天性免疫不全症候群(AIDS)、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、内耳自己免疫病(AIED)、自己免疫性リンパ増殖症候群(ALPS)、自己免疫性血小板減少性紫斑病(ATP)、ベーチェット病、心筋症、セリアック病-疱疹状皮膚炎; 慢性疲労免疫機能不全症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発神経炎(CIPD)、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎(スティル病)、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症(進行性全身性硬化症(PSS)、これは全身性硬化症(SS)としても知られる)、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される自己免疫疾患などの自己免疫疾患である。さらに別の態様において、状態は、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるがんのような、がんである。

1つの局面において、本発明は、標的細胞上の抗原に対する親和性を有する小分子細胞外ドメインを含む親和性分子キメラ受容体をコードする核酸を含む、改変T細胞であって、親和性分子キメラ受容体を発現する該T細胞を含む。

別の局面において、本発明は、標的細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインと活性化T細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインとを含む二重特異性親和性分子をコードする核酸を含む改変細胞を含み、ここで、少なくとも1つの親和性ドメインは小分子抗原結合ドメインを含み、かつ、該細胞は二重特異性親和性分子を発現する。

さらに別の局面において、本発明は、親和性分子キメラ受容体を発現できるT細胞の集団に、標的細胞上の抗原に対する親和性を有する小分子細胞外ドメインを含む親和性分子キメラ受容体をコードする核酸を導入する段階を含む、改変T細胞を作製するための方法を含む。

さらに別の局面において、本発明は、標的細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインと活性化T細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインとを含む二重特異性親和性分子をコードする核酸を細胞の集団に導入する段階を含む、改変細胞を作製するための方法を含み、ここで、少なくとも1つの親和性ドメインは小分子抗原結合ドメインを含み、かつ、該細胞は二重特異性親和性分子を発現する。

別の局面において、本発明は、その必要のある対象における免疫応答の処置のための医薬の製造における、本明細書において記述される改変T細胞または本明細書において記述される改変細胞の使用を含む。

さらに別の局面において、本発明は、標的細胞上の抗原に対する親和性を有する小分子細胞外ドメインを含む親和性分子キメラ受容体をコードする核酸を含む改変T細胞の集団を、対象に有害な免疫反応を予防または処置するためにその必要のある対象に投与する段階を含む、養子細胞移入療法のための方法を含む。

さらに別の局面において、本発明は、標的細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインと活性化T細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインとを含む二重特異性親和性分子をコードする核酸を含む、改変細胞の集団を、対象に有害な免疫反応を予防または処置するためにその必要のある対象に投与する段階を含む、養子細胞移入療法のための方法を含み、ここで、少なくとも1つの親和性ドメインは、小分子抗原結合ドメインを含む。

別の局面において、本発明は、標的細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインと活性化T細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインとを含む二重特異性親和性分子をコードする核酸を含む改変細胞の集団を、その必要のある対象に投与する段階を含む、対象における免疫の亢進に関連する疾患または状態を処置する方法を含み、ここで、少なくとも1つの親和性ドメインは、小分子抗原結合ドメインを含む。

さらに別の局面において、本発明は、本明細書において記述されるT細胞または本明細書において記述される改変細胞を含む治療的有効量の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象における状態を処置する方法を含む。

別の局面において、本発明は、標的細胞上の抗原に対する親和性を有する小分子細胞外ドメインを含む親和性分子キメラ受容体をコードする核酸を含む有効量の改変T細胞を対象に投与する段階を含む、対象において標的細胞または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法を含む。

さらに別の局面において、本発明は、標的細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインと活性化T細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインとを含む二重特異性親和性分子をコードする核酸を含む有効量の改変細胞を対象に投与する段階を含む、対象において標的細胞または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法を含み、ここで、少なくとも1つの親和性ドメインは、小分子抗原結合ドメインを含む。

さらに別の局面において、本発明は、本明細書において記述される改変T細胞または本明細書において記述される改変細胞を含む組成物を含む。さらに別の局面において、本発明は、本明細書において記述される改変T細胞または本明細書において記述される改変細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を含む。

本明細書において描かれる本発明の上記局面または任意の他の局面の様々な態様において、標的細胞抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、腫瘍細胞関連抗原(TAA)、疾患細胞関連抗原、およびそれらの任意の断片からなる群より選択される。

1つの態様において、小分子細胞外ドメインは、ジスルフィド架橋を欠くヘリックス構造を含む。別の態様において、小分子細胞外ドメインは約10 kD未満である。

別の態様において、親和性分子キメラ受容体は、CD3シグナル伝達ドメインのような、細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。さらに別の態様において、親和性分子キメラ受容体は、4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインのような、共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。さらに別の態様において、親和性分子キメラ受容体は、CD8膜貫通ドメインのような、膜貫通ドメインをさらに含む。さらに別の態様において、親和性分子キメラ受容体は、TCR可変ドメインおよびTCR定常ドメインをさらに含む。

別の態様において、本明細書において記述されるT細胞は、共刺激分子が、CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1およびPD1Lからなる群より選択されるような、共刺激分子をコードする核酸をさらに含む。1つの態様において、CD3はCD3ゼータ鎖およびCD3イプシロン鎖のような、少なくとも2つの異なるCD3鎖を含む。

別の態様において、標的細胞抗原に結合できる親和性ドメインは、小分子抗原結合ドメイン、および抗体の抗原結合ドメインからなる群より選択される。さらに別の態様において、活性化T細胞抗原に結合できる親和性ドメインは、小分子抗原結合ドメイン、および抗体の抗原結合ドメインからなる群より選択される。

別の態様において、小分子抗原結合ドメインは、ジスルフィド架橋を欠くヘリックス構造を含む。さらに別の態様において、小分子抗原結合ドメインは各々、約10 kD未満である。

別の態様において、標的細胞抗原は、腫瘍関連抗原(TAA)、細菌抗原、寄生虫抗原、ウイルス抗原、およびそれらの任意の断片からなる群より選択される。さらに別の態様において、活性化T細胞抗原は、CD3、CD4、CD8、T細胞受容体(TCR)、CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、およびCD83特異的結合リガンド、ならびにそれらの任意の断片からなる群より選択される共刺激分子である。

別の態様において、本明細書において記述されるT細胞は、その必要のある対象において免疫応答を処置する方法において用いられる。さらに別の態様において、本明細書において記述される細胞は、その必要のある対象における免疫応答を処置する方法において用いられる。

別の態様において、核酸は、T細胞の集団の形質導入、T細胞の集団のトランスフェクション、およびT細胞の集団のエレクトロポレーションからなる群より選択される方法によって導入される。さらに別の態様において、核酸の導入は、親和性分子キメラ受容体をコードするRNAをエレクトロポレーションすることを含む。さらに別の態様において、核酸は、細胞の集団の形質導入、細胞の集団のトランスフェクション、および細胞の集団のエレクトロポレーションからなる群より選択される方法によって導入される。さらに別の態様において、核酸の導入は、二重特異性親和性分子をコードするRNAをエレクトロポレーションすることを含む。

別の態様において、本明細書において記述される細胞は、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、および抗原提示細胞からなる群より選択される。さらに別の態様において、T細胞は、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、およびT細胞株からなる群より得られる。

別の態様において、本明細書において記述される方法は、CD3をコードするRNAをT細胞中にエレクトロポレーションする段階をさらに含む。1つの態様において、CD3 RNAは、親和性分子キメラ受容体をコードする核酸とコエレクトロポレーションされる。

別の態様において、本明細書において記述される方法は、親和性分子キメラ受容体核酸を導入した後にT細胞を凍結保存する段階をさらに含む。さらに別の態様において、本明細書において記述される方法は、T細胞を凍結保存する段階をさらに含む。さらに別の態様において、本明細書において記述される方法は、親和性分子キメラ受容体核酸をT細胞に導入する前に、凍結保存されたT細胞を解凍する段階をさらに含む。

別の態様において、本明細書において記述される方法は、T細胞を拡大する段階をさらに含む。1つの態様において、拡大する段階は、flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3およびc-kitリガンドからなる群より選択される因子とともにT細胞を培養することを含む。1つの態様において、拡大する段階は、CD3に対する一本鎖可変断片(scFv)とCD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含むキメラ膜タンパク質などのキメラ膜タンパク質をコードするRNAを用いてT細胞にエレクトロポレーションを行うこと、およびエレクトロポレーションされたT細胞を培養することを含む。

別の態様において、本明細書において記述される方法は、活性化T細胞および標的細胞を二重特異性親和性分子と結合させる段階をさらに含む。

別の態様において、状態は、後天性免疫不全症候群(AIDS)、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、内耳自己免疫病(AIED)、自己免疫性リンパ増殖症候群(ALPS)、自己免疫性血小板減少性紫斑病(ATP)、ベーチェット病、心筋症、セリアック病-疱疹状皮膚炎; 慢性疲労免疫機能不全症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発神経炎(CIPD)、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎(スティル病)、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症(進行性全身性硬化症(PSS)、これは全身性硬化症(SS)としても知られる)、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される自己免疫疾患などの自己免疫疾患である。さらに別の態様において、状態は、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるがんのような、がんである。

別の態様において、本明細書において記述される方法は、標的細胞または組織の溶解を誘導する段階をさらに含む。1つの態様において、誘導される溶解は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)である。

1つの局面において、本発明は、二重特異性T細胞誘導(bispecific T-cell engager：BiTE)分子をコードするエレクトロポレーションされたRNAを含む改変T細胞であって、該BiTE分子が、標的細胞上の抗原ならびにCD3、CD4、CD8およびTCRからなる群より選択される活性化T細胞上の抗原に対する二重特異性を含む該T細胞を含む。

別の局面において、本発明は、T細胞の集団を拡大する段階、および二重特異性抗体をコードするRNAを用いて、拡大されたT細胞にエレクトロポレーションを行う段階を含み、エレクトロポレーションされたT細胞が該二重特異性抗体を発現できる、改変T細胞を作製するための方法を含む。

さらに別の局面において、本発明は、標的細胞上の抗原ならびにCD3、CD4、CD8およびTCRからなる群より選択される活性化T細胞上の抗原に対する二重特異性を含む二重特異性T細胞誘導(BiTE)分子をコードするエレクトロポレーションされたRNAを含む有効量の改変T細胞を対象に投与する段階を含む、対象において標的細胞または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法を含む。

さらに別の局面において、本発明は、改変T細胞の集団を、対象に有害な免疫反応を予防または処置するためにその必要のある対象に投与する段階を含む、養子細胞移入療法のための方法であって、該改変T細胞が、拡大されている、かつ標的細胞上の抗原ならびにCD3、CD4、CD8およびTCRからなる群より選択される活性化T細胞上の抗原に対する二重特異性を有する二重特異性T細胞誘導(BiTE)分子をコードするRNAを用いてエレクトロポレーションされている、該方法を含む。

別の局面において、本発明は、改変T細胞の集団を、その必要のある対象に投与する段階を含む、対象における免疫の亢進に関連する疾患または状態を処置する方法であって、該改変T細胞が、拡大されている、かつ標的細胞上の抗原ならびにCD3、CD4、CD8およびTCRからなる群より選択される活性化T細胞上の抗原に対する二重特異性を有する二重特異性T細胞誘導(BiTE)分子をコードするRNAを用いてエレクトロポレーションされている、該方法を含む。

さらに別の局面において、本発明は、本明細書において記述される改変T細胞を含む治療的有効量の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象における状態を処置する方法を含む。

さらに別の局面において、本発明は、その必要のある対象における免疫応答の処置のための医薬の製造における、請求項145記載の改変T細胞の使用を含む。

別の局面において、本発明は、本明細書において記述される改変T細胞を含む組成物を含む。さらに別の局面において、本発明は、本明細書において記述される改変T細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を含む。

本明細書において描かれる本発明の上記局面または任意の他の局面の様々な態様において、標的細胞抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、腫瘍細胞関連抗原(TAA)、疾患細胞関連抗原、およびそれらの任意の断片からなる群より選択される。

1つの態様において、二重特異性抗体は、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、一本鎖可変断片、単一ドメイン抗体、その抗原結合断片、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される二重特異性抗原結合ドメインを含む。別の態様において、二重特異性抗原結合ドメインは、第1のscFv分子が標的細胞上の少なくとも1つの抗原に特異的であり、かつ第2のscFv分子が活性化T細胞上の抗原に特異的であるような、第1および第2の一本鎖可変断片(scFv)分子を含む。

別の態様において、T細胞は、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、およびT細胞株からなる群より得られる。

別の態様において、RNAは、インビトロで転写されたRNAまたは合成RNAを含む。

別の態様において、拡大する段階は、flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3およびc-kitリガンドからなる群より選択される因子とともにT細胞を培養することを含む。さらに別の態様において、拡大は、CD3に対する一本鎖可変断片(scFv)とCD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含むキメラ膜タンパク質などのキメラ膜タンパク質をコードするRNAを用いてT細胞にエレクトロポレーションを行うこと、およびエレクトロポレーションされたT細胞を培養することを含む。

別の態様において、本明細書において記述される方法は、拡大されたT細胞を凍結保存する段階をさらに含む。さらに別の態様において、本明細書において記述される方法は、二重特異性抗体をコードするRNAを用いたエレクトロポレーションのために凍結保存されたT細胞を解凍する段階をさらに含む。さらに別の態様において、本明細書において記述される方法は、二重特異性抗体を膜タンパク質として発現させる段階をさらに含む。さらに別の態様において、本明細書において記述される方法は、二重特異性抗体をエレクトロポレーションしたT細胞を凍結保存する段階をさらに含む。

別の態様において、本明細書において記述される方法は、標的細胞または標的細胞を含む組織の溶解を誘導する段階をさらに含む。1つの態様において、誘導される溶解は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)である。

別の態様において、状態は、後天性免疫不全症候群(AIDS)、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、内耳自己免疫病(AIED)、自己免疫性リンパ増殖症候群(ALPS)、自己免疫性血小板減少性紫斑病(ATP)、ベーチェット病、心筋症、セリアック病-疱疹状皮膚炎; 慢性疲労免疫機能不全症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発神経炎(CIPD)、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎(スティル病)、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症(進行性全身性硬化症(PSS)、これは全身性硬化症(SS)としても知られる)、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される自己免疫疾患などの自己免疫疾患である。さらに別の態様において、状態は、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるがんのような、がんである。

1つの局面において、本発明は、標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含むT細胞受容体(TCR)をコードする外因性核酸と；共刺激分子をコードする核酸とを含む、改変T細胞であって、該TCRおよび共刺激分子を発現する、該T細胞を含む。

別の局面において、本発明は、標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含むT細胞受容体(TCR)をコードする核酸をT細胞に導入する段階、および共刺激分子をコードする核酸をT細胞に導入する段階を含み、該T細胞が該TCRおよび共刺激分子を発現できる、改変T細胞を作製するための方法を含む。

さらに別の局面において、本発明は、その必要のある対象における免疫応答の処置のための医薬の製造における、請求項173記載の改変T細胞の使用を含む。

さらに別の局面において、本発明は、有効量の改変T細胞を対象に投与する段階を含む、対象において標的細胞または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該T細胞が、拡大されている、かつ標的細胞上の表面抗原に対する親和性を有する改変T細胞受容体(TCR)をコードするRNAを用いてエレクトロポレーションされている、該方法を含む。

別の局面において、本発明は、改変T細胞の集団を、対象に有害な免疫反応を予防または処置するためにその必要のある対象に投与する段階を含む、養子細胞移入療法のための方法であって、該改変T細胞が、拡大されている、かつ標的細胞上の表面抗原に対する親和性を有する改変T細胞受容体(TCR)をコードするRNAを用いてエレクトロポレーションされている、該方法を含む。

さらに別の局面において、本発明は、改変T細胞の集団を、その必要のある対象に投与する段階を含む、対象における免疫の亢進に関連する疾患または状態を処置する方法であって、該改変T細胞が、拡大されており、かつ標的細胞上の表面抗原に対する親和性を有する改変T細胞受容体(TCR)をコードするRNAを用いてエレクトロポレーションされている、該方法を含む。

さらに別の局面において、本発明は、本明細書において記述される改変T細胞を含む治療的有効量の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象における状態を処置する方法を含む。

別の局面において、本発明は、本明細書において記述される改変T細胞を含む組成物を含む。さらに別の局面において、本発明は、本明細書において記述される改変T細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を含む。

本明細書において描かれる本発明の上記局面または任意の他の局面の様々な態様において、TCRは、少なくとも1つのジスルフィド結合を含む。1つの態様において、TCRは少なくとも1つのマウス定常領域を含む。別の態様において、TCRは、野生型TCRの場合よりも標的細胞抗原に対する親和性が高い。さらに別の態様において、TCRは、TCRアルファ鎖およびベータ鎖を含む。1つの態様において、TCRは、前記鎖のうちの少なくとも1つの鎖のC末端に、4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインのような、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。1つの態様において、ベータ鎖は、少なくとも1つのN-脱グリコシル化を含む。1つの態様において、アルファ鎖は、少なくとも1つのN-脱グリコシル化を含む。

別の態様において、共刺激分子をコードする核酸は、T細胞中にエレクトロポレーションされる。1つの態様において、共刺激分子は、CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1およびPD1Lからなる群より選択される。1つの態様において、CD3は、少なくとも2つの異なるCD3鎖を含む。1つの態様において、異なるCD3鎖は、CD3ゼータ鎖およびイプシロン鎖である。

別の態様において、標的細胞抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、腫瘍細胞関連抗原(TAA)、疾患細胞関連抗原、およびそれらの任意の断片からなる群より選択される。

別の態様において、核酸のうちの少なくとも1つは、T細胞の形質導入、T細胞のトランスフェクション、およびT細胞のエレクトロポレーションからなる群より選択される方法によって導入される。さらに別の態様において、核酸のうちの少なくとも1つは、インビトロで転写されたRNAまたは合成RNAを含む。

別の態様において、T細胞は、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、およびT細胞株からなる群より得られる。

別の態様において、本明細書において記述される方法は、T細胞を拡大する段階をさらに含む。1つの態様において、拡大する段階は、flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3およびc-kitリガンドからなる群より選択される因子とともにT細胞を培養することを含む。1つの態様において、拡大する段階は、CD3に対する一本鎖可変断片(scFv)とCD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含むキメラ膜タンパク質などのキメラ膜タンパク質をコードするRNAを用いてT細胞にエレクトロポレーションを行うこと、およびエレクトロポレーションされたT細胞を培養することを含む。

別の態様において、本明細書において記述される方法は、T細胞を凍結保存する段階をさらに含む。さらに別の態様において、本明細書において記述される方法は、TCRをコードする核酸をT細胞に導入する前に、凍結保存されたT細胞を解凍する段階をさらに含む。さらに別の態様において、本明細書において記述される方法は、TCR核酸を導入した後にT細胞を凍結保存する段階をさらに含む。

別の態様において、TCRをコードする核酸は、TCRアルファ鎖およびTCRベータ鎖をコードする核酸を含む。1つの態様において、核酸を導入する段階は、TCRアルファ鎖をコードするRNAおよびTCRベータ鎖をコードする別個のRNAをコエレクトロポレーションする段階を含む。さらに別の態様において、共刺激分子をコードする核酸を導入する段階は、CD3をコードするRNAをT細胞中にエレクトロポレーションする段階を含む。1つの態様において、CD3 RNAは、TCR核酸とコエレクトロポレーションされる。

別の態様において、本明細書において記述される方法は、標的細胞または組織の溶解を誘導する段階をさらに含む。1つの態様において、誘導される溶解は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)である。

別の態様において、状態は、後天性免疫不全症候群(AIDS)、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、内耳自己免疫病(AIED)、自己免疫性リンパ増殖症候群(ALPS)、自己免疫性血小板減少性紫斑病(ATP)、ベーチェット病、心筋症、セリアック病-疱疹状皮膚炎; 慢性疲労免疫機能不全症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発神経炎(CIPD)、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎(スティル病)、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症(進行性全身性硬化症(PSS)、これは全身性硬化症(SS)としても知られる)、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される自己免疫疾患などの自己免疫疾患である。さらに別の態様において、状態は、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるがんのような、がんである。
[本発明1001]
標的細胞上の抗原に対する親和性を含むT細胞受容体(TCR)をコードする外因性核酸と、二重特異性抗体をコードするエレクトロポレーションされたRNAとを含む、改変T細胞であって、該TCRおよび二重特異性抗体をT細胞の表面上に発現する、該T細胞。
[本発明1002]
前記TCRが、少なくとも1つのジスルフィド結合を含む、本発明1001の改変T細胞。
[本発明1003]
前記TCRが、TCRアルファ鎖およびベータ鎖を含む、本発明1001の改変T細胞。
[本発明1004]
前記TCRが、前記鎖のうちの少なくとも1つの鎖のC末端に共刺激シグナル伝達ドメインを含む、本発明1003の改変T細胞。
[本発明1005]
前記共刺激シグナル伝達ドメインが4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインである、本発明1004の改変T細胞。
[本発明1006]
前記ベータ鎖が、少なくとも1つのN-脱グリコシル化を含む、本発明1003の改変T細胞。
[本発明1007]
前記アルファ鎖が、少なくとも1つのN-脱グリコシル化を含む、本発明1003の改変T細胞。
[本発明1008]
前記TCRが、少なくとも1つのマウス定常領域を含む、本発明1001の改変T細胞。
[本発明1009]
前記TCRが、野生型TCRの場合よりも標的細胞抗原に対する親和性が高い、本発明1001の改変T細胞。
[本発明1010]
標的細胞抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、腫瘍細胞関連抗原(TAA)、疾患細胞関連抗原、およびそれらの任意の断片からなる群より選択される、本発明1001の改変T細胞。
[本発明1011]
前記二重特異性抗体が、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、一本鎖可変断片、単一ドメイン抗体、その抗原結合断片、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される二重特異性抗原結合ドメインを含む、本発明1001の改変T細胞。
[本発明1012]
前記二重特異性抗原結合ドメインが、第1および第2の一本鎖可変断片(scFv)分子を含む、本発明1011の改変T細胞。
[本発明1013]
第1のscFv分子が標的細胞上の少なくとも1つの抗原に特異的であり、かつ第2のscFv分子が活性化T細胞上の抗原に特異的である、本発明1012の改変T細胞。
[本発明1014]
活性化T細胞抗原が、CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、TCR、PD1およびPD1Lからなる群より選択される、本発明1013の改変T細胞。
[本発明1015]
共刺激分子をコードするエレクトロポレーションされた核酸をさらに含む、本発明1001の改変T細胞。
[本発明1016]
共刺激分子が、CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1およびPD1Lからなる群より選択される、本発明1015の改変T細胞。
[本発明1017]
TCRおよび二重特異性抗体を発現できるT細胞に、標的細胞上の抗原に対する親和性を含む改変T細胞受容体(TCR)をコードする核酸および二重特異性抗体をコードする核酸を導入する段階を含む、改変T細胞を作製するための方法。
[本発明1018]
T細胞が、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、およびT細胞株からなる群より得られる、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記核酸が、インビトロで転写されたRNAまたは合成RNAを含む、本発明1017の方法。
[本発明1020]
T細胞を拡大する段階をさらに含む、本発明1017の方法。
[本発明1021]
拡大する段階が、flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3およびc-kitリガンドからなる群より選択される因子とともにT細胞を培養することを含む、本発明1020の方法。
[本発明1022]
拡大する段階が、キメラ膜タンパク質をコードするRNAを用いてT細胞にエレクトロポレーションを行うこと、およびエレクトロポレーションされたT細胞を培養することを含む、本発明1020の方法。
[本発明1023]
キメラ膜タンパク質が、CD3に対する一本鎖可変断片(scFv)と、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含む、本発明1022の方法。
[本発明1024]
T細胞を凍結保存する段階をさらに含む、本発明1017の方法。
[本発明1025]
前記核酸をT細胞に導入する前に、凍結保存されたT細胞を解凍する段階をさらに含む、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記TCRをコードする核酸が、TCRアルファ鎖およびTCRベータ鎖をコードする核酸を含む、本発明1017の方法。
[本発明1027]
前記核酸を導入する段階が、TCRアルファ鎖をコードするRNAおよびTCRベータ鎖をコードする別個のRNAをコエレクトロポレーションすることを含む、本発明1026の方法。
[本発明1028]
CD3をコードするRNAをT細胞にエレクトロポレーションする段階をさらに含む、本発明1017の方法。
[本発明1029]
CD3 RNAが、TCR核酸とコエレクトロポレーションされる、本発明1028の方法。
[本発明1030]
TCR核酸を導入した後にT細胞を凍結保存する段階をさらに含む、本発明1017の方法。
[本発明1031]
二重特異性抗体を膜タンパク質として発現させる段階をさらに含む、本発明1017の方法。
[本発明1032]
二重特異性抗体を導入されたT細胞を凍結保存する段階をさらに含む、本発明1017の方法。
[本発明1033]
その必要のある対象における免疫応答の処置のための医薬の製造における、本発明1001のT細胞の使用。
[本発明1034]
エレクトロポレーションされた、改変T細胞受容体(TCR)をコードするRNAと二重特異性抗体をコードするRNAとを含む、有効量の改変T細胞
を対象に投与する段階を含む、対象において標的細胞または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該改変T細胞が、該改変TCRおよび二重特異性抗体を発現する、該方法。
[本発明1035]
標的細胞または組織の溶解を誘導する段階をさらに含む、本発明1034の方法。
[本発明1036]
誘導される溶解が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)である、本発明1035の方法。
[本発明1037]
改変T細胞受容体(TCR)をコードするRNAおよび二重特異性抗体をコードするRNAを用いてエレクトロポレーションされている改変T細胞の集団を、対象に有害な免疫反応を予防または処置するためにその必要のある対象に投与する段階を含む、養子細胞移入療法のための方法。
[本発明1038]
改変T細胞受容体(TCR)をコードするRNAおよび二重特異性抗体をコードするRNAを用いてエレクトロポレーションされている改変T細胞の集団を、その必要のある対象に投与する段階を含む、対象における免疫の亢進に関連する疾患または状態を処置する方法。
[本発明1039]
本発明1001の改変T細胞を含む治療的有効量の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象における状態を処置する方法。
[本発明1040]
前記状態が自己免疫疾患である、本発明1039の方法。
[本発明1041]
自己免疫疾患が、後天性免疫不全症候群(AIDS)、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、内耳自己免疫病(AIED)、自己免疫性リンパ増殖症候群(ALPS)、自己免疫性血小板減少性紫斑病(ATP)、ベーチェット病、心筋症、セリアック病-疱疹状皮膚炎(celiac sprue-dermatitis hepetiformis); 慢性疲労免疫機能不全症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発神経炎(CIPD)、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎(スティル病)、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症(進行性全身性硬化症(PSS)、これは全身性硬化症(SS)としても知られる)、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、本発明1040の方法。
[本発明1042]
前記状態が、がんである、本発明1039の方法。
[本発明1043]
がんが、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、本発明1042の方法。
[本発明1044]
本発明1001の改変T細胞を含む組成物。
[本発明1045]
本発明1001の改変T細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
[本発明1046]
標的細胞上の抗原およびT細胞上の抗原に対する二重特異性を含む二重特異性抗体をコードする核酸と、キメラリガンド改変活性化受容体(chimeric ligand engineered activation receptor：CLEAR)をコードする核酸とを含む、改変T細胞であって、該二重特異性抗体およびCLEARを発現する、該T細胞。
[本発明1047]
CLEARが、細胞内活性化ドメインおよび細胞外ドメインを含む、本発明1046の改変T細胞。
[本発明1048]
細胞内活性化ドメインが、CD3ゼータの細胞内活性化ドメインの一部分を含む、本発明1046の改変T細胞。
[本発明1049]
細胞外ドメインが、抗体の抗原結合ドメイン、受容体のリガンド結合ドメイン、抗原、およびリガンドからなる群より選択される、本発明1046の改変T細胞。
[本発明1050]
細胞外ドメインが、CD27、CD28、CD70、CD80、PD1およびPD-L1からなる群より選択される、本発明1046の改変T細胞。
[本発明1051]
細胞外ドメインが腫瘍抗原に結合することができる、本発明1046の改変T細胞。
[本発明1052]
CLEARが、共刺激ドメインをさらに含む、本発明1046の改変T細胞。
[本発明1053]
共刺激ドメインが、CD4、CD8および4-1BBからなる群より選択される、本発明1052の改変T細胞。
[本発明1054]
標的細胞抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、腫瘍細胞関連抗原(TAA)、疾患細胞関連抗原、およびそれらの任意の断片からなる群より選択される、本発明1046の改変T細胞。
[本発明1055]
前記二重特異性抗体が、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、一本鎖可変断片、単一ドメイン抗体、その抗原結合断片、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される二重特異性抗原結合ドメインを含む、本発明1046の改変T細胞。
[本発明1056]
前記二重特異性抗原結合ドメインが、第1および第2の一本鎖可変断片(scFv)分子を含む、本発明1055の改変T細胞。
[本発明1057]
第1のscFv分子が標的細胞上の少なくとも1つの抗原に特異的であり、かつ第2のscFv分子がT細胞上の抗原に特異的である、本発明1056の改変T細胞。
[本発明1058]
二重特異性抗体が、標的細胞上の抗原およびT細胞上のCLEARに対する二重特異性を含む、本発明1046の改変T細胞。
[本発明1059]
共刺激分子をコードする核酸をさらに含む、本発明1046の改変T細胞。
[本発明1060]
共刺激分子が、CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1およびPD1Lからなる群より選択される、本発明1058の改変T細胞。
[本発明1061]
その必要のある対象における免疫応答の処置のための医薬の製造における、本発明1045のT細胞の使用。
[本発明1062]
二重特異性抗体をコードする核酸およびキメラリガンド改変活性化受容体(CLEAR)をコードする核酸をT細胞に導入する段階を含む、改変T細胞を作製するための方法であって、該T細胞が該二重特異性抗体およびCLEARを発現できる、該方法。
[本発明1063]
前記核酸のうちの少なくとも1つが、T細胞の形質導入、T細胞のトランスフェクション、およびT細胞のエレクトロポレーションからなる群より選択される方法によって導入される、本発明1062の方法。
[本発明1064]
T細胞が、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、およびT細胞株からなる群より得られる、本発明1062の方法。
[本発明1065]
前記核酸のうちの少なくとも1つが、インビトロで転写されたRNAまたは合成RNAを含む、本発明1062の方法。
[本発明1066]
T細胞を拡大する段階をさらに含む、本発明1062の方法。
[本発明1067]
拡大する段階が、flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3およびc-kitリガンドからなる群より選択される因子とともにT細胞を培養することを含む、本発明1066の方法。
[本発明1068]
拡大する段階が、キメラ膜タンパク質をコードするRNAを用いてT細胞にエレクトロポレーションを行うこと、およびエレクトロポレーションされたT細胞を培養することを含む、本発明1066の方法。
[本発明1069]
キメラ膜タンパク質が、CD3に対する一本鎖可変断片(scFv)と、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含む、本発明1068の方法。
[本発明1070]
T細胞を凍結保存する段階をさらに含む、本発明1062の方法。
[本発明1071]
前記核酸をT細胞に導入する前に、凍結保存されたT細胞を解凍する段階をさらに含む、本発明1070の方法。
[本発明1072]
CLEAR核酸を導入した後にT細胞を凍結保存する段階をさらに含む、本発明1062の方法。
[本発明1073]
二重特異性抗体を膜タンパク質として発現させる段階をさらに含む、本発明1062の方法。
[本発明1074]
二重特異性抗体を導入されたT細胞を凍結保存する段階をさらに含む、本発明1062の方法。
[本発明1075]
キメラリガンド改変活性化受容体(CLEAR)をコードする核酸と、標的細胞上の抗原およびT細胞上のCLEARに対する二重特異性を有する二重特異性抗体をコードする核酸とを含む、改変T細胞であって、該CLEARおよび二重特異性抗体を発現する有効量の該改変T細胞
を対象に投与する段階を含む、対象において標的細胞または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法。
[本発明1076]
標的細胞または組織の溶解を誘導する段階をさらに含む、本発明1075の方法。
[本発明1077]
誘導される溶解が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)である、本発明1076の方法。
[本発明1078]
キメラリガンド改変活性化受容体(CLEAR)をコードする核酸と、標的細胞上の抗原およびT細胞上のCLEARに対する二重特異性を有する二重特異性抗体をコードする核酸とを含む、改変T細胞の集団を、対象に有害な免疫反応を予防または処置するためにその必要のある対象に投与する段階を含む、養子細胞移入療法のための方法。
[本発明1079]
キメラリガンド改変活性化受容体(CLEAR)をコードする核酸と、標的細胞上の抗原およびT細胞上のCLEARに対する二重特異性を有する二重特異性抗体をコードする核酸とを含む、改変T細胞の集団を、その必要のある対象に投与する段階を含む、対象における免疫の亢進に関連する疾患または状態を処置する方法。
[本発明1080]
本発明1046の改変T細胞を含む治療的有効量の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象における状態を処置する方法。
[本発明1081]
前記状態が自己免疫疾患である、本発明1080の方法。
[本発明1082]
自己免疫疾患が、後天性免疫不全症候群(AIDS)、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、内耳自己免疫病(AIED)、自己免疫性リンパ増殖症候群(ALPS)、自己免疫性血小板減少性紫斑病(ATP)、ベーチェット病、心筋症、セリアック病-疱疹状皮膚炎; 慢性疲労免疫機能不全症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発神経炎(CIPD)、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎(スティル病)、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症(進行性全身性硬化症(PSS)、これは全身性硬化症(SS)としても知られる)、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、本発明1081の方法。
[本発明1083]
前記状態が、がんである、本発明1080の方法。
[本発明1084]
がんが、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、本発明1083の方法。
[本発明1085]
本発明1046の改変T細胞を含む組成物。
[本発明1086]
本発明1046の改変T細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
[本発明1087]
標的細胞上の抗原に対する親和性を有する小分子細胞外ドメインを含む親和性分子キメラ受容体をコードする核酸を含む、改変T細胞であって、親和性分子キメラ受容体を発現する、該T細胞。
[本発明1088]
標的細胞抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、腫瘍細胞関連抗原(TAA)、疾患細胞関連抗原、およびそれらの任意の断片からなる群より選択される、本発明1087の改変T細胞。
[本発明1089]
小分子細胞外ドメインが、ジスルフィド架橋を欠くヘリックス構造を含む、本発明1087の改変T細胞。
[本発明1090]
小分子細胞外ドメインが約10 kD未満である、本発明1087の改変T細胞。
[本発明1091]
親和性分子キメラ受容体が、細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、本発明1087の改変T細胞。
[本発明1092]
細胞内シグナル伝達ドメインがCD3シグナル伝達ドメインである、本発明1091の改変T細胞。
[本発明1093]
親和性分子キメラ受容体が共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む、本発明1087の改変T細胞。
[本発明1094]
前記共刺激シグナル伝達ドメインが4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインである、本発明1093の改変T細胞。
[本発明1095]
親和性分子キメラ受容体が膜貫通ドメインをさらに含む、本発明1087の改変T細胞。
[本発明1096]
膜貫通ドメインがCD8膜貫通ドメインである、本発明1095の改変T細胞。
[本発明1097]
親和性分子キメラ受容体が、TCR可変ドメインおよびTCR定常ドメインをさらに含む、本発明1087の改変T細胞。
[本発明1098]
共刺激分子をコードする核酸をさらに含む、本発明1087の改変T細胞。
[本発明1099]
共刺激分子が、CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1およびPD1Lからなる群より選択される、本発明1098の改変T細胞。
[本発明1100]
CD3が、少なくとも2つの異なるCD3鎖を含む、本発明1099の改変T細胞。
[本発明1101]
前記異なるCD3鎖が、CD3ゼータ鎖およびCD3イプシロン鎖である、本発明1100の改変T細胞。
[本発明1102]
標的細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインと活性化T細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインとを含む二重特異性親和性分子をコードする核酸を含む、二重特異性親和性分子を発現する改変細胞であって、少なくとも1つの親和性ドメインが小分子抗原結合ドメインを含む、該細胞。
[本発明1103]
標的細胞抗原に結合できる親和性ドメインが、小分子抗原結合ドメイン、および抗体の抗原結合ドメインからなる群より選択される、本発明1102の改変細胞。
[本発明1104]
活性化T細胞抗原に結合できる親和性ドメインが、小分子抗原結合ドメイン、および抗体の抗原結合ドメインからなる群より選択される、本発明1102の改変細胞。
[本発明1105]
小分子抗原結合ドメインが、ジスルフィド架橋を欠くヘリックス構造を含む、本発明1102の改変細胞。
[本発明1106]
小分子抗原結合ドメインが各々、約10 kD未満である、本発明1102の改変細胞。
[本発明1107]
標的細胞抗原が、腫瘍関連抗原(TAA)、細菌抗原、寄生虫抗原、ウイルス抗原、およびそれらの任意の断片からなる群より選択される、本発明1102の改変細胞。
[本発明1108]
活性化T細胞抗原が、CD3、CD4、CD8、T細胞受容体(TCR)、CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、およびCD83特異的結合リガンド、ならびにそれらの任意の断片からなる群より選択される共刺激分子である、本発明1102の改変細胞。
[本発明1109]
その必要のある対象において免疫応答を処置する方法で用いるための、本発明1087の改変細胞。
[本発明1110]
その必要のある対象において免疫応答を処置する方法で用いるための、本発明1102の改変細胞。
[本発明1111]
T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、および抗原提示細胞からなる群より選択される、本発明1102の改変細胞。
[本発明1112]
親和性分子キメラ受容体を発現できるT細胞の集団に、標的細胞上の抗原に対する親和性を有する小分子細胞外ドメインを含む親和性分子キメラ受容体をコードする核酸を導入する段階を含む、改変T細胞を作製するための方法。
[本発明1113]
前記核酸が、T細胞の集団の形質導入、T細胞の集団のトランスフェクション、およびT細胞の集団のエレクトロポレーションからなる群より選択される方法によって導入される、本発明1112の方法。
[本発明1114]
核酸の導入が、親和性分子キメラ受容体をコードするRNAをエレクトロポレーションすることを含む、本発明1115の方法。
[本発明1115]
CD3をコードするRNAをT細胞にエレクトロポレーションすることをさらに含む、本発明1114の方法。
[本発明1116]
CD3 RNAが、親和性分子キメラ受容体をコードする核酸とコエレクトロポレーションされる、本発明1115の方法。
[本発明1117]
T細胞が、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、およびT細胞株からなる群より得られる、本発明1112の方法。
[本発明1118]
親和性分子キメラ受容体核酸を導入した後にT細胞を凍結保存する段階をさらに含む、本発明1112の方法。
[本発明1119]
T細胞を拡大する段階をさらに含む、本発明1112の方法。
[本発明1120]
拡大する段階が、flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3およびc-kitリガンドからなる群より選択される因子とともにT細胞を培養することを含む、本発明1119の方法。
[本発明1121]
拡大する段階が、キメラ膜タンパク質をコードするRNAを用いてT細胞にエレクトロポレーションを行うこと、およびエレクトロポレーションされたT細胞を培養することを含む、本発明1119の方法。
[本発明1122]
キメラ膜タンパク質が、CD3に対する一本鎖可変断片(scFv)と、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含む、本発明1121の方法。
[本発明1123]
T細胞を凍結保存する段階をさらに含む、本発明1112の方法。
[本発明1124]
親和性分子キメラ受容体核酸をT細胞に導入する前に、凍結保存されたT細胞を解凍する段階をさらに含む、本発明1123の方法。
[本発明1125]
標的細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインと活性化T細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインとを含む二重特異性親和性分子をコードする核酸を細胞の集団に導入する段階を含む、二重特異性親和性分子を発現する改変細胞を作製するための方法であって、少なくとも1つの親和性ドメインが小分子抗原結合ドメインを含む、該方法。
[本発明1126]
前記核酸が、細胞の集団の形質導入、細胞の集団のトランスフェクション、および細胞の集団のエレクトロポレーションからなる群より選択される方法によって導入される、本発明1125の方法。
[本発明1127]
前記細胞の集団が、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、または抗原提示細胞を含む、本発明1125の方法。
[本発明1128]
活性化T細胞および標的細胞を二重特異性親和性分子と結合させる段階をさらに含む、本発明1125の方法。
[本発明1129]
その必要のある対象における免疫応答の処置のための医薬の製造における、本発明1087の改変T細胞または本発明1102の改変細胞の使用。
[本発明1130]
標的細胞上の抗原に対する親和性を有する小分子細胞外ドメインを含む親和性分子キメラ受容体をコードする核酸を含む改変T細胞の集団を、対象に有害な免疫反応を予防または処置するためにその必要のある対象に投与する段階を含む、養子細胞移入療法のための方法。
[本発明1131]
標的細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインと活性化T細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインとを含む二重特異性親和性分子をコードする核酸を含む、改変細胞の集団を、対象に有害な免疫反応を予防または処置するためにその必要のある対象に投与する段階を含む、養子細胞移入療法のための方法であって、少なくとも1つの親和性ドメインが小分子抗原結合ドメインを含む、該方法。
[本発明1132]
標的細胞上の抗原に対する親和性を有する小分子細胞外ドメインを含む親和性分子キメラ受容体をコードする核酸を含む、改変T細胞の集団を、その必要のある対象に投与する段階を含む、対象における免疫の亢進に関連する疾患または状態を処置する方法。
[本発明1133]
標的細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインと活性化T細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインとを含む二重特異性親和性分子をコードする核酸を含む、改変細胞の集団を、その必要のある対象に投与する段階を含む、対象における免疫の亢進に関連する疾患または状態を処置する方法であって、少なくとも1つの親和性ドメインが小分子抗原結合ドメインを含む、該方法。
[本発明1134]
本発明1087のT細胞または本発明1102の改変細胞を含む治療的有効量の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象における状態を処置する方法。
[本発明1135]
前記状態が自己免疫疾患である、本発明1134の方法。
[本発明1136]
自己免疫疾患が、後天性免疫不全症候群(AIDS)、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、内耳自己免疫病(AIED)、自己免疫性リンパ増殖症候群(ALPS)、自己免疫性血小板減少性紫斑病(ATP)、ベーチェット病、心筋症、セリアック病-疱疹状皮膚炎; 慢性疲労免疫機能不全症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発神経炎(CIPD)、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎(スティル病)、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症(進行性全身性硬化症(PSS)、これは全身性硬化症(SS)としても知られる)、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、本発明1135の方法。
[本発明1137]
前記状態が、がんである、本発明1134の方法。
[本発明1138]
がんが、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、本発明1137の方法。
[本発明1139]
標的細胞上の抗原に対する親和性を有する小分子細胞外ドメインを含む親和性分子キメラ受容体をコードする核酸を含む有効量の改変T細胞を対象に投与する段階を含む、対象において標的細胞または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法。
[本発明1140]
標的細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインと活性化T細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインとを含む二重特異性親和性分子をコードする核酸を含む有効量の改変細胞を対象に投与する段階を含む、対象において標的細胞または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、少なくとも1つの親和性ドメインが小分子抗原結合ドメインを含む、該方法。
[本発明1141]
標的細胞または組織の溶解を誘導する段階をさらに含む、本発明1139または1140のいずれかの方法。
[本発明1142]
誘導される溶解が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)である、本発明1139または1140のいずれかの方法。
[本発明1143]
本発明1087の改変T細胞または本発明1102の改変細胞を含む組成物。
[本発明1144]
本発明1087の改変T細胞または本発明1102の改変細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
[本発明1145]
二重特異性T細胞誘導(bispecific T-cell engager：BiTE)分子をコードするエレクトロポレーションされたRNAを含む改変T細胞であって、該BiTE分子が、標的細胞上の抗原ならびにCD3、CD4、CD8およびTCRからなる群より選択される活性化T細胞上の抗原に対する二重特異性を含む、該T細胞。
[本発明1146]
標的細胞抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、腫瘍細胞関連抗原(TAA)、疾患細胞関連抗原、およびそれらの任意の断片からなる群より選択される、本発明1145の改変T細胞。
[本発明1147]
前記二重特異性抗体が、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、一本鎖可変断片、単一ドメイン抗体、その抗原結合断片、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される二重特異性抗原結合ドメインを含む、本発明1145の改変T細胞。
[本発明1148]
前記二重特異性抗原結合ドメインが、第1および第2の一本鎖可変断片(scFv)分子を含む、本発明1147の改変T細胞。
[本発明1149]
第1のscFv分子が標的細胞上の少なくとも1つの抗原に特異的であり、かつ第2のscFv分子が活性化T細胞上の抗原に特異的である、本発明1148の改変T細胞。
[本発明1150]
T細胞の集団を拡大する段階; および
二重特異性抗体をコードするRNAを用いて、拡大されたT細胞にエレクトロポレーションを行う段階
を含み、エレクトロポレーションされたT細胞が該二重特異性抗体を発現できる、改変T細胞を作製するための方法。
[本発明1151]
T細胞が、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、およびT細胞株からなる群より得られる、本発明1150の方法。
[本発明1152]
前記RNAが、インビトロで転写されたRNAまたは合成RNAを含む、本発明1150の方法。
[本発明1153]
拡大する段階が、flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3およびc-kitリガンドからなる群より選択される因子とともにT細胞を培養することを含む、本発明1450の方法。
[本発明1154]
拡大が、キメラ膜タンパク質をコードするRNAを用いてT細胞にエレクトロポレーションを行うこと、およびエレクトロポレーションされたT細胞を培養することを含む、本発明1150の方法。
[本発明1155]
キメラ膜タンパク質が、CD3に対する一本鎖可変断片(scFv)と、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含む、本発明1154の方法。
[本発明1156]
拡大されたT細胞を凍結保存する段階をさらに含む、本発明1150の方法。
[本発明1157]
二重特異性抗体をコードするRNAを用いたエレクトロポレーションのために凍結保存されたT細胞を解凍する段階をさらに含む、本発明1156の方法。
[本発明1158]
二重特異性抗体を膜タンパク質として発現させる段階をさらに含む、本発明1150の方法。
[本発明1159]
二重特異性抗体をエレクトロポレーションしたT細胞を凍結保存する段階をさらに含む、本発明1150の方法。
[本発明1160]
標的細胞上の抗原ならびにCD3、CD4、CD8およびTCRからなる群より選択される活性化T細胞上の抗原に対する二重特異性を含む二重特異性T細胞誘導(BiTE)分子をコードするエレクトロポレーションされたRNAを含む有効量の改変T細胞を対象に投与する段階を含む、対象において標的細胞または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法。
[本発明1161]
標的細胞または標的細胞を含む組織の溶解を誘導する段階をさらに含む、本発明1160の方法。
[本発明1162]
誘導される溶解が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)である、本発明1160の方法。
[本発明1163]
改変T細胞の集団を、対象に有害な免疫反応を予防または処置するためにその必要のある対象に投与する段階を含む、養子細胞移入療法のための方法であって、該改変T細胞が、拡大されている、かつ標的細胞上の抗原ならびにCD3、CD4、CD8およびTCRからなる群より選択される活性化T細胞上の抗原に対する二重特異性を有する二重特異性T細胞誘導(BiTE)分子をコードするRNAを用いてエレクトロポレーションされている、該方法。
[本発明1164]
改変T細胞の集団を、その必要のある対象に投与する段階を含む、対象における免疫の亢進に関連する疾患または状態を処置する方法であって、該改変T細胞が、拡大されている、かつ標的細胞上の抗原ならびにCD3、CD4、CD8およびTCRからなる群より選択される活性化T細胞上の抗原に対する二重特異性を有する二重特異性T細胞誘導(BiTE)分子をコードするRNAを用いてエレクトロポレーションされている、該方法。
[本発明1165]
本発明1145の改変T細胞を含む治療的有効量の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象における状態を処置する方法。
[本発明1166]
免疫応答が自己免疫疾患である、本発明1165の方法。
[本発明1167]
自己免疫疾患が、後天性免疫不全症候群(AIDS)、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、内耳自己免疫病(AIED)、自己免疫性リンパ増殖症候群(ALPS)、自己免疫性血小板減少性紫斑病(ATP)、ベーチェット病、心筋症、セリアック病-疱疹状皮膚炎; 慢性疲労免疫機能不全症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発神経炎(CIPD)、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎(スティル病)、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症(進行性全身性硬化症(PSS)、これは全身性硬化症(SS)としても知られる)、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、本発明1166の方法。
[本発明1168]
前記状態が、がんである、本発明1165の方法。
[本発明1169]
がんが、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、本発明1168の方法。
[本発明1170]
その必要のある対象における免疫応答の処置のための医薬の製造における、本発明1145の改変T細胞の使用。
[本発明1171]
本発明1145の改変T細胞を含む組成物。
[本発明1172]
本発明1145の改変T細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
[本発明1173]
標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含むT細胞受容体(TCR)をコードする外因性核酸と；共刺激分子をコードする核酸とを含む、改変T細胞であって、該TCRおよび共刺激分子を発現する、該T細胞。
[本発明1174]
前記TCRが、少なくとも1つのジスルフィド結合を含む、本発明1173の改変T細胞。
[本発明1175]
前記TCRが、TCRアルファ鎖およびベータ鎖を含む、本発明1173の改変T細胞。
[本発明1176]
前記TCRが、前記鎖のうちの少なくとも1つの鎖のC末端に共刺激シグナル伝達ドメインを含む、本発明1175の改変T細胞。
[本発明1177]
前記共刺激シグナル伝達ドメインが4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインである、本発明1176の改変T細胞。
[本発明1178]
前記ベータ鎖が、少なくとも1つのN-脱グリコシル化を含む、本発明1175の改変T細胞。
[本発明1179]
前記アルファ鎖が、少なくとも1つのN-脱グリコシル化を含む、本発明1175の改変T細胞。
[本発明1180]
前記TCRが、少なくとも1つのマウス定常領域を含む、本発明1173の改変T細胞。
[本発明1181]
共刺激分子をコードする核酸が、T細胞にエレクトロポレーションされる、本発明1173の改変T細胞。
[本発明1182]
共刺激分子が、CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1およびPD1Lからなる群より選択される、本発明1181の改変T細胞。
[本発明1183]
CD3が、少なくとも2つの異なるCD3鎖を含む、本発明1182の改変T細胞。
[本発明1184]
前記異なるCD3鎖が、CD3ゼータ鎖およびCD3イプシロン鎖である、本発明1183の改変T細胞。
[本発明1185]
前記TCRが、野生型TCRの場合よりも標的細胞抗原に対する親和性が高い、本発明1173の改変T細胞。
[本発明1186]
標的細胞抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、腫瘍細胞関連抗原(TAA)、疾患細胞関連抗原、およびそれらの任意の断片からなる群より選択される、本発明1173の改変T細胞。
[本発明1187]
標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含むT細胞受容体(TCR)をコードする核酸をT細胞に導入する段階; および
共刺激分子をコードする核酸をT細胞に導入する段階
を含み、該T細胞が該TCRおよび共刺激分子を発現できる、改変T細胞を作製するための方法。
[本発明1188]
前記核酸のうちの少なくとも1つが、T細胞の形質導入、T細胞のトランスフェクション、およびT細胞のエレクトロポレーションからなる群より選択される方法によって導入される、本発明1187の方法。
[本発明1189]
T細胞が、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、およびT細胞株からなる群より得られる、本発明1187の方法。
[本発明1190]
前記核酸のうちの少なくとも1つが、インビトロで転写されたRNAまたは合成RNAを含む、本発明1187の方法。
[本発明1191]
T細胞を拡大する段階をさらに含む、本発明1187の方法。
[本発明1192]
拡大する段階が、flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3およびc-kitリガンドからなる群より選択される因子とともにT細胞を培養することを含む、本発明1191の方法。
[本発明1193]
拡大する段階が、キメラ膜タンパク質をコードするRNAを用いてT細胞にエレクトロポレーションを行うこと、およびエレクトロポレーションされたT細胞を培養することを含む、本発明1191の方法。
[本発明1194]
キメラ膜タンパク質が、CD3に対する一本鎖可変断片(scFv)と、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含む、本発明1193の方法。
[本発明1195]
T細胞を凍結保存する段階をさらに含む、本発明1187の方法。
[本発明1196]
前記TCRをコードする核酸をT細胞に導入する前に、凍結保存されたT細胞を解凍する段階をさらに含む、本発明1195の方法。
[本発明1197]
前記TCRをコードする核酸が、TCRアルファ鎖およびTCRベータ鎖をコードする核酸を含む、本発明1187の方法。
[本発明1198]
前記核酸を導入する段階が、TCRアルファ鎖をコードするRNAおよびTCRベータ鎖をコードする別個のRNAをコエレクトロポレーションすることを含む、本発明1198の方法。
[本発明1199]
共刺激分子をコードする核酸を導入する段階が、CD3をコードするRNAをT細胞にエレクトロポレーションすることを含む、本発明1187の方法。
[本発明1200]
CD3 RNAが、TCR核酸とコエレクトロポレーションされる、本発明1199の方法。
[本発明1201]
TCR核酸を導入した後にT細胞を凍結保存する段階をさらに含む、本発明1187の方法。
[本発明1202]
その必要のある対象における免疫応答の処置のための医薬の製造における、本発明1173の改変T細胞の使用。
[本発明1203]
有効量の改変T細胞を対象に投与する段階を含む、対象において標的細胞または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該T細胞が、拡大されている、かつ標的細胞上の表面抗原に対する親和性を有する改変T細胞受容体(TCR)をコードするRNAを用いてエレクトロポレーションされている、該方法。
[本発明1204]
標的細胞または組織の溶解を誘導する段階をさらに含む、本発明1203の方法。
[本発明1205]
誘導される溶解が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)である、本発明1204の方法。
[本発明1206]
改変T細胞の集団を、対象に有害な免疫反応を予防または処置するためにその必要のある対象に投与する段階を含む、養子細胞移入療法のための方法であって、該改変T細胞が、拡大されており、かつ標的細胞上の表面抗原に対する親和性を有する改変T細胞受容体(TCR)をコードするRNAを用いてエレクトロポレーションされている、該方法。
[本発明1207]
改変T細胞の集団を、その必要のある対象に投与する段階を含む、対象における免疫の亢進に関連する疾患または状態を処置する方法であって、該改変T細胞が、拡大されており、かつ標的細胞上の表面抗原に対する親和性を有する改変T細胞受容体(TCR)をコードするRNAを用いてエレクトロポレーションされている、該方法。
[本発明1208]
本発明1173の改変T細胞を含む治療的有効量の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象における状態を処置する方法。
[本発明1209]
免疫応答が自己免疫疾患である、本発明1208の方法。
[本発明1210]
自己免疫疾患が、後天性免疫不全症候群(AIDS)、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、内耳自己免疫病(AIED)、自己免疫性リンパ増殖症候群(ALPS)、自己免疫性血小板減少性紫斑病(ATP)、ベーチェット病、心筋症、セリアック病-疱疹状皮膚炎; 慢性疲労免疫機能不全症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発神経炎(CIPD)、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎(スティル病)、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症(進行性全身性硬化症(PSS)、これは全身性硬化症(SS)としても知られる)、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、本発明1209の方法。
[本発明1211]
前記状態が、がんである、本発明1208の方法。
[本発明1212]
がんが、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、本発明1211の方法。
[本発明1213]
本発明1173の改変T細胞を含む組成物。
[本発明1214]
本発明1173の改変T細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。

本発明の好ましい態様の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより一層理解されるであろう。本発明を例示する目的のために、図面には現在好ましい実施態様が示されている。しかしながら、本発明は、図面に示された実施態様の正確な構成および手段に限定されないことを理解すべきである。
図1は、TCRおよびBiTEを用いてコエレクトロポレーションされたT細胞におけるトランスジーン発現を示すグラフのパネルである。T細胞に、CD3ゼータおよびイプシロンと共にまたはなしで、CD19.CD3(上のパネル)または4D5.CD3 (ErbB2)(中のパネル)BiTEを用いてコエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの18時間後、T細胞をTCR vb13.1およびmIgG Fab(またはHer2-Fc)について染色した。下のパネルは、エレクトロポレーションの3日後のTCR (vb13.1)発現を示す。 図2は、腫瘍で刺激されたT細胞においてCD107aがアップレギュレートしたことを示すグラフのパネルである。示されるRNAを用いてT細胞にコエレクトロポレーションを行い、CD19およびNY-ESO-1 (ESO)について単一陽性または二重陽性の腫瘍細胞株で刺激した。CD107aのアップレギュレーションを4時間後に評価した。 図3は、腫瘍で刺激されたT細胞においてCD107aがアップレギュレートしたことを示すグラフのパネルである。示されるRNAを用いてT細胞にコエレクトロポレーションを行い、CD19およびNY-ESO-1 (ESO)について単一陽性または二重陽性の腫瘍細胞株で刺激した。CD107aのアップレギュレーションを4時間後に評価した。 図4は、腫瘍細胞株で刺激された、RNAエレクトロポレーションT細胞における、IFN-γ産生を示すグラフである。 図5は、腫瘍細胞株で刺激された、RNAエレクトロポレーションT細胞における、IL-2産生を示すグラフである。 図6は、腫瘍細胞で刺激された、NY-ESO-1 TCR (1G4)およびメソテリンBiTE(ss1.CD3)を発現するT細胞におけるCD107aのアップレギュレーションを示すグラフのパネルである。 図7は、Naml6-ESO-CBG細胞(2×10⁶個)を静脈内注入されたマウスにおける腫瘍増殖を示す画像のパネルである。腫瘍細胞注入の5日後、マウスを、示されるように、RNAエレクトロポレーションT細胞で治療した(マウス5匹/グループ）。腫瘍増殖を生物発光イメージングにより画像化した。 図8は、増強されたT細胞機能を有する、標的腫瘍関連抗原に対する二重特異性RNAを発現するT細胞を示すグラフである。 図9は、T細胞上のTCRが、該T細胞において二重特異性抗体と組み合わせることによって、HLA制限なしにコグネイトおよびMHC/ペプチド抗原と表面腫瘍抗原の両方を認識したことを示すグラフのパネルである。 図10は、図10Aおよび10Bを含み、T細胞にエレクトロポレーションされた二重特異性抗体RNAおよびTCR RNAの構築物のリストを示す。 図11は、T細胞が改変NY-ESO-1 TCRおよび二重特異性抗体によってコグネイト抗原(HLA-A2/NY-ESO-1)とCD19またはHer2の両方を認識したことを示すグラフのパネルである。 図12は、T細胞と標的腫瘍細胞との間の増強されたキメラリガンド改変活性化受容体(CLEAR)の結合、および同じ標的腫瘍細胞に結合する別のT細胞上の二重特異性抗体を示す図である。 図13は、図13Aおよび13Bを含み、本発明において作製されたCLEARおよび二重特異性抗体の構築物のリストである。 図14は、CD27-BBZまたはCD27-Z CLEAR RNAをエレクトロポレーションしてから18時間後のT細胞またはK562細胞におけるCD27発現(上のパネル)、および細胞株におけるCD70発現(下のパネル)を示すグラフのパネルである。 図15は、CD70陽性腫瘍細胞株で刺激されたCD27 CLEAR RNAエレクトロポレーションT細胞におけるCD107aのアップレギュレーションを示すグラフのパネルである。 図16は、PD1 CLEAR RNAエレクトロポレーションT細胞におけるPD1発現(上のパネル)、およびPD-L1陽性腫瘍細胞Nalm6-PD-L1で刺激した後の該T細胞におけるCD107aのアップレギュレーションを示すグラフのパネルである。 図17は、PD-L1陽性腫瘍細胞Nalm6-PD-L1で刺激されたPD1 CLEAR RNAエレクトロポレーションT細胞におけるサイトカイン産生を示すグラフである。 図18は、PD1-ZおよびaPD-ameso二重特異性抗体RNAを用いてコエレクトロポレーションされたT細胞におけるトランスジーン発現を示すグラフのパネルである。 図19は、MESO陽性腫瘍細胞(K562-meso、SK-OV3およびPC3)、またはMESO/PD-L1二重陽性腫瘍細胞(PC3-PDL1)で刺激された、PD1-ZおよびaPD-ameso二重特異性抗体RNAコエレクトロポレーションT細胞におけるCD107aのアップレギュレーションを示すグラフのパネルである。 図20は、MESO陽性腫瘍細胞(K562-mesoおよびSK-OV3)で刺激された、PD1-ZおよびaPD-ameso二重特異性抗体RNAコエレクトロポレーションT細胞のサイトカイン産生を示すグラフのパネルである。 図21は、CD27-ZおよびaCD27-aErbB2二重特異性抗体RNA(上のパネル)またはCD19二重特異性抗体RNA(下のパネル)を用いてコエレクトロポレーションされたT細胞におけるトランスジーン発現を示すグラフのパネルである。 図22は、CD70および/またはErbB2を発現する腫瘍細胞株で刺激された、CD27-ZおよびaCD27-aErbB2二重特異性抗体RNAエレクトロポレーションT細胞におけるCD107aのアップレギュレーションを示すグラフのパネルである。 図23は、CD70および/またはCD19を発現する腫瘍細胞株で刺激された、CD27-ZおよびaCD27-aCD19二重特異性抗体RNAエレクトロポレーションT細胞におけるCD107aのアップレギュレーションを示すグラフのパネルである。 図24は、示されるように、PD1-Zおよび抗PD1/抗ErbB2二重特異的抗体のRNAを用いてエレクトロポレーションされたT細胞を示すグラフのパネルである。18時間後、エレクトロポレーションされたT細胞を抗PD1および抗mIgG Fabについて染色した。 図25は、腫瘍細胞株(上のパネル)およびErbB2またはPd-L1 RNAをエレクトロポレーションされたK562細胞(下のパネル、エレクトロポレーションの18時間後)を示すグラフのパネルである。細胞をPD-L1およびErbB2発現について染色した。 図26は、腫瘍株で4時間刺激されたエレクトロポレーションT細胞を示すグラフのパネルである。CD107aのアップレギュレーションをフローサイトメトリーにより検出した。 図27は、腫瘍株で4時間刺激されたエレクトロポレーションT細胞を示すグラフのパネルである。CD107aのアップレギュレーションをフローサイトメトリーにより検出した。 図28は、親和性抗体模倣構築物の説明図を示す画像である。 図29は、抗His抗体で染色することによる親和性抗体模倣物再方向付け(redirected)T細胞(ART)の発現を示すグラフのパネルである。EGFR (955.BBZ、1853.BBZもしくは1970.BBZ)またはErbB2 (342.BBZ、432-15.BBZ、342-14.BBZもしくは342-4.BBZ)に対するARTをコードする10マイクログラムのRNAをT細胞にエレクトロポレーションして、R10中で一晩培養した。100マイクロリットルのエレクトロポレーションT細胞を、ART発現のフローサイトメトリー検出のために抗Hisタグ抗体で染色した(下のパネル)。エレクトロポレーションされなかったT細胞(EPなし)と比較して、全てのART RNAを用いてエレクトロポレーションされたT細胞は陽性に染色されることが示された。 図30は、EGFRおよびErbB2 ARTの特異的CD107aアップレギュレーションを示すグラフのパネルである。図29に示されるエレクトロポレーションT細胞を、各腫瘍の名前の下に示されるEGFRおよび/またはErbB2を発現する4種類の腫瘍細胞株で刺激した。4時間のインキュベーション後、CD107a-PE、CD3-APCおよびCD8-FITCで細胞を染色することによってCD107aのアップレギュレーションを測定した。図29に示されるように、全てのEGFR ARTは、EGFR陽性の腫瘍株(SK-OV3、MDA231およびMDA468)に対してのみ強く反応するが、EGFR陰性腫瘍MCF7には反応しない。一方、全てのErbB2 ARTはErbB2陽性の腫瘍株(SK-OV3、MDA231およびMCF7)に対して強く反応するが、ErbB2陰性腫瘍MDA468には反応しない。4D5.BBZおよび2224.BBZは、それぞれErbB2およびEGFRに対するCARであった。 図31は、EGFRおよびErbB2 ARTの特異的IFN-γ産生を示すグラフである。図29に示されるエレクトロポレーションT細胞を、各腫瘍の名前の下に示されるEGFRおよび/またはErbB2を発現する4種類の腫瘍細胞株で刺激した。一晩のインキュベーション後、上清を用いてELISAによりIFN-γ産生を測定した。この図に示されるように、IFN-γは、EGFR陽性の腫瘍株(SK-OV3、MDA231およびMDA468)で刺激された全てのEGFR ARTについて異なるレベルで検出できたが、EGFR陰性腫瘍MCF7では検出できなかった。一方、全てのErbB2 ARTは、ErbB2陽性の腫瘍株(SK-OV3、MDA231およびMCF7)に対して強く反応するが、ErbB2陰性腫瘍MDA468には反応しない。4D5.BBZおよび2224.BBZは、それぞれErbB2およびEGFRに対するCARであった。 図32は、EGFRおよびErbB2 ARTの特異的IL-2産生を示すグラフである。図29に示されるエレクトロポレーションT細胞を、各腫瘍の名前の下に示されるEGFRおよび/またはErbB2を発現する4種類の腫瘍細胞株で刺激した。一晩のインキュベーション後、上清を用いてELISAによりIL-2産生を測定した。この図に示されるように、IL-2は、EGFR陽性の腫瘍株(SK-OV3、MDA231およびMDA468)で刺激された全てのEGFR ARTについて異なるレベルで検出できたが、EGFR陰性腫瘍MCF7では検出できなかった。一方、全てのErbB2 ARTは、ErbB2陽性の腫瘍株(SK-OV3、MDA231およびMCF7)に対して強く反応するが、ErbB2陰性腫瘍MDA468には反応しない。4D5.BBZおよび2224.BBZは、それぞれErbB2およびEGFRに対するCARであった。 図33は、EGFRおよびErbB2 ARTの特異的溶解活性を示すグラフである。別々の実験において、EGFRとErbB2の両方について陽性である腫瘍細胞株SK-OV3に対する、2つのEGFR ARTおよび2つのErbB2 ARTの殺傷能力を、それらの関連するCARと比較して、試験する。この図に示されるように、ART T細胞は、関連するCAR T細胞と同じくらい効果的に腫瘍細胞を殺傷した。 親和性抗体模倣物改変TCRを示す画像のパネルである。図34Aは、TCRのアルファ鎖またはベータ鎖のいずれかのN'に親和性抗体模倣物およびHisタグ配列を付加することによる親和性抗体模倣物改変TCR (Affi-TCR)の概略図である。 親和性抗体模倣物改変TCRを示す画像のパネルである。図34Bは、親和性抗体模倣物再方向付けTCR (Affi-TCR) RNAエレクトロポレーションT細胞のVb13.1 TCRおよびHisタグ検出を示すグラフのパネルである。NY-ESO-1 (1G4) TCRアルファ(a)およびベータ(b)、またはそれらのErbB2親和性抗体模倣物(342、342.15、342または342.4)改変体を用いてT細胞にコエレクトロポレーションを行った。一晩後、vb13.1およびHisタグをフローサイトメトリーによって検出した。 親和性抗体模倣物改変TCRを示す画像のパネルである。図34Cは、ErbB2親和性抗体模倣物の配列を示す。 図35は、Affi-TCR RNAエレクトロポレーションT細胞のCD107aアップレギュレーションを示すグラフのパネルである。図34Bに示されるようにTCRアルファ(a)およびベータ(b)、またはそれらのErbB2親和性抗体模倣物(342、342.15、342または342.4)改変体を用いてT細胞にコエレクトロポレーションを行い、CD107aアッセイのために腫瘍株Nalm-6-ESO (NY-eso-1+, ErbB2-)、A549-ESO (NY-eso-1+, ErbB2+)、SK-OV3 (NY-eso-1-, ErbB2+)、A549 (NY-eso-1-, ErbB2+)、またはNalm6 (NY-eso-1-, ErbB2-)で刺激した。その結果は、ErbB2 Affi-TCRを有するT細胞がNy-ESO-1およびErbB2陽性腫瘍を特異的に認識できたことを示す。 親和性抗体模倣物改変CD3イプシロンを示す画像のパネルである。図36Aは、CD3イプシロンのN'に親和性抗体模倣物およびG4Sリンカーを付加することによる親和性抗体模倣物改変CD3イプシロンの概略図である。 親和性抗体模倣物改変CD3イプシロンを示す画像のパネルである。図36Bは、T細胞のエレクトロポレーションを示す表である。NY-ESO-1(1G4) TCRアルファ(a)およびベータ(b)を用いて、またはErbB2親和性抗体模倣物(342、342.15、342または342.4)改変CD3イプシロン(e)と一緒に、T細胞にコエレクトロポレーションを行った。 親和性抗体模倣物改変CD3イプシロンを示す画像のパネルである。図36Cは、親和性抗体模倣物改変CD3イプシロンの共送達によるTCR発現および二重ターゲティングの維持を示すグラフのパネルである。図36BのT細胞の一晩培養後、vb13.1発現をフローサイトメトリーによって検出した。 図37は、Affi-TCR RNAエレクトロポレーションT細胞のCD107aアップレギュレーションを示すグラフのパネルである。図36Bに示されるように、NY-ESO-1 (1G4) TCRアルファ(a)およびベータ(b)を用いて、またはErbB2親和性抗体模倣物(342、342.15、342または342.4)改変CD3イプシロン(e)と一緒に、T細胞にコエレクトロポレーションを行い、CD107aアッセイのために腫瘍株Nalm-6-ESO (NY-eso-1+, ErbB2-)、Nalm6 (NY-eso-1-, ErbB2-)、SK-OV3 (NY-eso-1-, ErbB2+)またはMDA231 (NY-eso-1-, ErbB2+)で刺激した。 図38は、図38A～38Cを含み、T細胞にエレクトロポレーションされた二重特異性抗体をコードするRNA (Bis-RNA)によって二重特異性抗体が分泌され得ることを実証する。T細胞に、CD19 CARをコードするRNA (CAR RNA)、ブリナツモマブBis-RNA (Bis-RNA)、もしくはGFPを用いてエレクトロポレーションを行うか、またはCD19 CARとブリナツモマブBis-RNAの両方(CAR RNA/Bis-RNA)を用いてコエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの18時間後、T細胞をヤギ抗マウスIgG Fab (mIgG Fab)で染色して、T細胞上に発現されたCD19 CAR、またはCD3との結合を介してT細胞表面につながれた二重特異性抗体を検出した(図38A、上のパネルは、エレクトロポレーションT細胞のmIgG Fab染色およびGFP発現を示す)。エレクトロポレーションの直後に、CAR RNAまたはBis-RNAを有するT細胞のアリコートを、同数のGFP RNA T細胞と混合し、18時間共培養した。次いで、mIgG FabおよびGFPを評価した(図38A、中のパネル)。エレクトロポレーションの18時間後、CAR RNAまたはBis-RNAを有するT細胞のアリコートを同数のGFP RNA T細胞と混合し、mIgG FabおよびGFPの検出のために染色した(図38A、下のパネル)。エレクトロポレーションの18時間後、異なるRNAを用いてエレクトロポレーションされたT細胞、またはCAR RNAもしくはBis-RNAを用いてエレクトロポレーションされたT細胞を、GFP RNAエレクトロポレーションT細胞と18時間(GFP T, 18h)または0時間(GFP T, 0h)混合し、次いでCD19を発現する細胞株(Nalm6、K562-CD19およびRaji)またはCD19陰性であるK562細胞で刺激した。その後、この混合物をCD107a染色について評価した(図38B)。エレクトロポレーションの18時間後、CD19 CAR RNA (CAR RNA)またはBis-RNAをエレクトロポレーションされたT細胞を単独で、あるいは同数のGFP RNAエレクトロポレーションT細胞(GFP-T)と混合して、エフェクター：標的比5：1で4時間フローベースの細胞傷害性Tリンパ球アッセイ後に溶解活性について分析した(図38C)。 図39は、図39A～39Dを含み、Bis-RNAエレクトロポレーションT細胞のT細胞活性化および腫瘍殺傷能力の増加を強調する。示されるように、ブリナツモマブBis-RNA (Bis-RNA)またはCD19 CAR RNA (CAR RNA)の異なる量(μg RNA/0.1ml T細胞)を用いて、T細胞にエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの18時間後、Bis-RNAまたはCAR RNAを有するT細胞を、同数のGFP RNAエレクトロポレーションT細胞(GFP-T)を添加してまたは添加せずに、CD19陽性細胞株で刺激し、CD107a発現について評価した(図39A)。上記のT細胞のエレクトロポレーションの18時間後、エレクトロポレーションT細胞をIFN-γおよびグランザイムBの細胞内染色に供した(図39B)。IFN-γについてのELISAは、CD19陽性細胞(Nalm6、K562-CD19およびRaji)またはCD19陰性(K562)細胞株でT細胞を一晩刺激した後に行った(図39C)。T細胞に、ブリナツモマブBis-RNA (Bis-RNA)またはCD19bbz CAR RNA (1、5または10μg/0.1ml T細胞のRNA用量のCAR RNA)のいずれかを用いてエレクトロポレーションを行うか、あるいは5μgずつのBis-RNAおよびCAR RNA (Bis-RNA＋CAR RNA)を用いてコエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの18時間後、示されたエフェクター：標的比で4時間フローベースの細胞傷害性Tリンパ球アッセイにより溶解活性を評価した(図39D)。 図40は、図40A～40Dを含み、Bis-RNAエレクトロポレーションT細胞の長期腫瘍反応性ならびにCAR RNA T細胞およびBis-RNA T細胞の感受性を実証する。1、5および10μg/0.1ml T細胞の異なる量のブリナツモマブBis-RNAを用いて、T細胞にエレクトロポレーションを行い、10μgのRNA用量のCD19BBZ CAR RNAを用いてエレクトロポレーションされたT細胞と比較した。エレクトロポレーション後の異なる日にCD107a染色を実施して、その結果を、3日目、8日目および12日目のCD107a/CD8発現のドットプロット(図40A)、平均蛍光強度(MFI)の値(図40B、上のパネル)、またはCD107a発現細胞の割合(図40B、下のパネル)として、エレクトロポレーション後の日数でプロットした。5または10μgのCD19BBZ (19BBZ)またはブリナツモマブ(Blina) RNAを用いてエレクトロポレーションされたT細胞をK562細胞で刺激して、該T細胞に、減少する量のCD19 mRNAを用いてエレクトロポレーションを行った。該細胞を18時間共培養し、上清をIFN-γ ELISAに供した(図40C)。10μgの4D5BBZまたは4D5-CD3 RNAを用いてエレクトロポレーションされたT細胞をK562細胞で刺激して、該T細胞を、減少する量のErbB2 (Her2) mRNAを用いてエレクトロポレーションした。該細胞を18時間共培養し、上清をIFN-γ ELISAに供した(図40D)。 図41は、図41A～41Dを含み、Bis-RNAエレクトロポレーションT細胞が共刺激への依存を少なくし、かつ分裂と増殖を強めたことを強調する。異なるRNA用量のブリナツモマブBis-RNAまたはCD19BBZ RNA (CAR RNA)を用いて、CFSE標識した休止CD4+ T細胞にエレクトロポレーションを行い、照射K562-CD19細胞(K562-CD86細胞の対照として同数の照射K562細胞と混合した)または照射K562-CD19細胞(同数の照射K562-CD86細胞と混合した)のいずれかで刺激した。6日目のCFSE染色(図41A)および刺激後の異なる日のT細胞数(図41B)をモニターした。異なるRNA用量のブリナツモマブBis-RNAまたはCD19BBZ RNA (CAR RNA)を用いて、CFSE標識したCD45RO+(メモリ細胞)またはCD45RO-(ナイーブ細胞)休止CD4 T細胞にエレクトロポレーションを行い、照射K562-CD19細胞(K562-CD86細胞の対照として同数の照射K562細胞と混合した)または照射K562-CD19細胞(同数の照射K562-CD86細胞と混合した)のいずれかで刺激した。6日目のCFSE染色(図41C)および刺激後の異なる日のT細胞数(図41D)をモニターした。 図42は、図42A～42Eを含み、Nalm-6異種移植片モデルにおけるBis-RNA T細胞の増強された抗腫瘍活性を示す。NOD/scid/yc(-/-)(NSG)マウス(n＝5)へのNalm6細胞(1×10⁶個、静脈内)の静脈内注入後に白血病が樹立された。腫瘍細胞注入の7日後、マウスを無作為化し、ブリナツモマブBis-RNAまたはCD19BBZ RNAのいずれかをエレクトロポレーションされたT細胞で治療した。抗メソテリンRNA CAR T細胞(ss1BBZ)で治療されたマウスを対照として使用した。T細胞を25e⁶の単回注入(1X)として静注するか、または週1回で3週間(3X)、1回目の注入については20e⁶、2回目と3回目の注入については5e⁶の用量でT細胞を静注した。注入後の示された時点で動物を画像化した(図42A)。この実験のBLIデータは、y軸上に示された全光子束-SEでプロットされる；1e⁵ p/sec/cm2/srは、ルシフェラーゼ含有細胞を有しないマウスに相当する(図42B)。上記の白血病が樹立されたNSGマウスまたは白血病のないNSGマウスに、CD19BBZもしくはBis-RNAのいずれかを用いてエレクトロポレーションされた、または対照のss1BBZ RNAを用いてエレクトロポレーションされた、20e⁶のT細胞を注入した。T細胞注入後1、3および7日目に、各グループの2匹のマウスから骨髄細胞および脾細胞を採取した。プールされた骨髄細胞および脾細胞からマウス細胞を枯渇させることにより、各マウスからT細胞を精製した。T細胞の機能は、CD19陽性細胞株K562-CD19で18時間(CD137およびIFN-γの分泌)および4時間(CD107a)それぞれ刺激した後に、CD137発現(*はp＜0.05を示す)(図42C)、サイトカイン産生(ELISAによる)(図42D)、およびCD107a発現(図42E)により評価した。 図43は、図43A～43Eを含み、異なる腫瘍抗原に対する異なるBis-RNAを示す。完全ヒト抗CD19 (21D4)抗体および完全ヒト抗CD3 scFv (28F11)抗体にそれぞれ由来する一本鎖可変フラグメント(scFv)を用いた完全ヒトCD19-CD3をコードするBis-RNAの7つの異なる構築物のうちの1つを用いてT細胞にエレクトロポレーションを行った。そのエレクトロポレーションT細胞をCD19陽性細胞株K562-CD19で4時間刺激した後、CD107aのアップレギュレーションをフローサイトメトリーによりモニターした(図43A)。エレクトロポレーションT細胞をCD19陽性細胞株Nalm6、K562-CD19およびRajiで18時間刺激した後、IFN-γ産生をELISAによって検出した。CD19BBZ CAR RNA (CAR RNA)、ブリナツモマブBis-RNA (Blina-Bis-RNA)、およびエレクトロポレーションなし(EPなし)を対照として用いた(図43B)。図43Cは、抗マウスIgG Fab抗体(メソテリンおよびGD2に対するscFvの場合)または抗ヒトIgG Fab (cMetおよびPSCAの場合)を用いて、メソテリン、cMet、PSCAおよびGD2に対するBis-RNAまたはCAR RNAを用いてエレクトロポレーションされたT細胞上のscFvの検出を示す。メソテリン、cMet、PSCAおよびGD2 Bis-RNAまたはCAR RNA (CAR)に対するBis-RNAまたはCAR RNAを用いてエレクトロポレーションされたT細胞を、メソテリン(K562-meso、SK-OV3)、PSCA (K562-PSCA)、cMet (SK-OV3)またはGD2 (LY5Y)を発現する細胞株で4時間刺激し、CD107aのアップレギュレーションをフローサイトメトリーによってモニターした(図43D)。NSGマウス(n＝6)に1e⁶のNalm6-CBGを静脈内注入し、7日後にCD19BBZもしくはD4F11をレンチウイルス形質導入された5e⁶のT細胞、またはCD19BBZもしくはD4F11 RNAを用いてエレクトロポレーションされた20e⁶のT細胞を注入した。ss1BBZ CAR RNAを用いてエレクトロポレーションされたT細胞で治療したマウスを対照として用いた。腫瘍注入後16日目と20日目に、RNAエレクトロポレーションT細胞を注入されたマウスにシトキサン(Cytoxan)を腹腔内投与した(40mg/kg、腹腔内)。翌日、該マウスに、記載されるように、RNAを用いてエレクトロポレーションされた5e⁶個のT細胞を注入した。T細胞注入の1日前およびそれぞれの後続注入の2日後に、生物発光を図42について記載されるように測定した(図43E)。 図44は、図44A～44Dを含み、Bis-RNAエレクトロポレーションT細胞がプログラム細胞死1(PD1)および制御性T細胞(Treg)誘導抑制に対してより抵抗性であったことを示す。T細胞に、異なる量のCD19BBZ RNAまたはCD19-CD3 Bis-RNAおよび5μgまたは10μgのPD1 RNAを用いてコエレクトロポレーションして、CD19陽性細胞株K652-CD19またはRajiで刺激した。CD107aの発現をフローサイトメトリーによって測定し(図44A)、IFN-γ産生をELISAによって検出した(図44B)。新鮮な休止CD4 T細胞から精製したTregを、CFSE標識されたブリナツモマブBis-RNAまたはCD19BBZ RNA (19BBZ)をエレクトロポレーションされた休止CD4+ T細胞に、異なるTエフェクター：Treg比で添加し、K562-CD19細胞により刺激した。刺激の6日後、細胞を抗CD3で染色した。CFSE染色をフローサイトメトリーによりモニターした(図44C～D)。 図45は、図45A～45Bを含み、Bis-RNAエレクトロポレーションT細胞からの上清でパルスされたT細胞の発現を示す。CD19BBZ RNA (CAR RNA)またはブリナツモマブ(Blina-Bis-RNA)もしくはD4F11 RNA (D4F11-Bis-RNA)のBis-RNAを用いて、T細胞にエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの18時間後、Bis-RNAエレクトロポレーションT細胞から上清を採取し、希釈した上清(10Xまたは100Xと示される)を、CD19陽性細胞株であるNalm6、K562-CD19またはRajiと共培養した非エレクトロポレーションT細胞に加えた。CAR RNAまたはBis-RNAを用いてエレクトロポレーションされたT細胞を対照とした。CD107aのアップレギュレーションを4時間の刺激後にモニターした。 図46は、Bis-RNAエレクトロポレーションT細胞が大幅に増強された溶解活性を有することを示すグラフである。0.1mlのT細胞当たり1、5または10μgのRNA用量のブリナツモマブBis-RNA (Bis-RNA)またはCD19bbz CAR RNAのいずれかを用いて、T細胞にエレクトロポレーションを行った。18時間後、4時間フローベースの細胞傷害性Tリンパ球アッセイを用いて、Tエフェクター：標的比30：1で溶解活性を測定した。 図47は、Bis-RNAエレクトロポレーションT細胞におけるCD107aアップレギュレーションを示すグラフのパネルである。10μgの4D5BBZまたは4D5-CD3 RNAのいずれかを用いて、T細胞にエレクトロポレーションを行い、示されるように減少する量のErbB2 (Her2) mRNAを用いてエレクトロポレーションされたK562細胞株を用いて、それらを4時間共培養することによって、刺激した。CD107aのアップレギュレーションをフローサイトメトリーにより検出した。 Bis-RNAエレクトロポレーションT細胞を示す。図48Aは、異なるRNA用量のブリナツモマブBis-RNAまたはCD19BBZ RNA (CAR RNA)を用いてエレクトロポレーションして、照射K562-CD19細胞(K562-CD86細胞の対照として同数の照射K562細胞と混合した)(W/O CD86)または照射K562-CD19細胞(同数の照射K562-CD86細胞と混合した)(W/ CD86)のいずれかで刺激した、休止CD4+ T細胞のCFSEラベリングを示すグラフのパネルである。6日目のCFSE希釈率が示された。左のパネルは、CFSEラベリングについての平均蛍光強度(MFI)を示す(より高いMFIは、より少ないT細胞分裂および増殖を示す）。右のパネルは、1μgのBis-RNAを用いてエレクトロポレーションされたT細胞の相対的CFSE希釈パーセントを示す。CD3/CD28ビーズで刺激したT細胞およびエレクトロポレーションなしのT細胞を、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。 Bis-RNAエレクトロポレーションT細胞を示す。図48Bは、異なるRNA用量のブリナツモマブBis-RNAまたはCD19BBZ RNA (CAR RNA)を用いてエレクトロポレーションして、照射K562-CD19細胞(K562-CD86細胞の対照として同数の照射K562細胞と混合した)(K562-CD19/K562)または照射K562-CD19細胞(同数の照射K562-CD86細胞と混合した)(K562-CD19/K562-CD86)のいずれかで刺激した、休止CD4+ T細胞のCFSEラベリングを示すグラフである。3日目に開始する相対的CFSE希釈率が示された(1μgのBis-RNAを用いてエレクトロポレーションして、K562-CD19/K562細胞で刺激した、6日目のT細胞を50％と設定した)。 Bis-RNAエレクトロポレーションT細胞を示す。図48Cは、異なるRNA用量のブリナツモマブBis-RNAまたはCD19BBZ RNA (CAR RNA)を用いてエレクトロポレーションして、照射K562-CD19細胞(K562-CD86細胞の対照として同数の照射K562細胞と混合した)(K562-CD19/K562)または照射K562-CD19細胞(同数の照射K562-CD86細胞と混合した)(K562-CD19/K562-CD86)のいずれかで刺激した、CD45RO+ (メモリ細胞)またはCD45RO- (ナイーブ細胞)休止CD4 T細胞のCFSEラベリングを示すグラフのパネルである。3日目に開始するCFSE希釈は、CFSEのMFIまたは相対的CFSE希釈率として示された(1μgのBis-RNAを用いてエレクトロポレーションして、K562-CD19/K562細胞で刺激した、6日目のCD45RO+ T細胞を50％と設定した)。 Bis-RNAエレクトロポレーションT細胞を示す。図48Dは、異なるRNA用量のブリナツモマブBis-RNAまたはCD19BBZ RNA (CAR RNA)を用いてエレクトロポレーションして、照射K562-CD19細胞(K562-CD86細胞の対照として同数の照射K562細胞と混合した)(K19/K562)または照射K562-CD19細胞(同数の照射K562-CD86細胞と混合した)(K19/K86)のいずれかで刺激した、休止CD4+ T細胞のCFSEラベリングを示すグラフのパネルである。刺激の8日後、培養物からの上清をIFN-γおよびIL-2検出のためのELISAに供した。 Bis-RNAエレクトロポレーションT細胞を示す。図48Eは、異なるRNA用量のブリナツモマブBis-RNAまたはCD19BBZ RNA (CAR RNA)を用いてエレクトロポレーションして、Raji (CD19+)またはK562 (Cd19-)細胞で18時間刺激した、CD45RO+ (メモリ細胞)またはCD45RO- (ナイーブ細胞)休止CD4 T細胞のCFSEラベリングを示すグラフである。IL-2分泌をELISAによってアッセイした。 Bis-RNAエレクトロポレーションT細胞を示す。図48Fは、1または5μgのCD19BBZ (19BBZ)またはCD19-28Z (19-28Z)またはブリナツモマブ(Blina) RNAを用いてエレクトロポレーションして、照射K562またはK562とK562-CD19の1：1混合物またはK562-CD19とK562-CD86の1：1混合物で刺激した、CFSE標識されたT細胞を示すグラフである。6日後、T細胞をCFSE希釈についてフローサイトメトリー分析にかけた。 Bis-RNAエレクトロポレーションT細胞を示す。図48Gは、5μgのCD19BBZ (19BBZ)またはCD19-28Z (19-28Z)またはブリナツモマブ(Blina) RNAを用いてエレクトロポレーションして、K562細胞とK562-CD19細胞の1：1混合物またはK562-CD19細胞とK562-CD86細胞の1：1混合物で刺激した、5×10⁵個のT細胞の6日目における全生存率を示すグラフである。 Bis-RNAエレクトロポレーションT細胞を示す。図48Hは、5μgのCD19BBZ (19BBZ)またはCD19-28Z (19-28Z)またはブリナツモマブ(Blina) RNAを用いてエレクトロポレーションして、フローベースの4時間の細胞傷害性Tリンパ球アッセイで分析したT細胞を示すグラフである。 Bis-RNAの種々の構築物を用いてエレクトロポレーションされたT細胞の発現のレベルを示す。図49Aは、完全ヒト抗CD19抗体(21D4)および完全ヒト抗CD3 scFv抗体(28F11)にそれぞれ由来するscFvを用いた完全ヒトCD19-CD3をコードするBis-RNAの7つの異なる構築物のうちの1つを用いてエレクトロポレーションされたT細胞を示すグラフである。そのエレクトロポレーションされたT細胞をCD19陽性細胞株Nalm6、K562-CD19およびRajiで18時間刺激した後、IL-2産生をELISAによって検出した。CD19BBZ CAR RNA (CAR RNA)、ブリナツモマブBis-RNA (Blina-Bis-RNA)およびエレクトロポレーションなし(EPなし)を対照として使用した。 Bis-RNAの種々の構築物をエレクトロポレーションされたT細胞の発現のレベルを示す。図49Bは、CD19BBZ RNA (CAR RNA)またはブリナツモマブBis-RNA (Blina-Bis-RNA)または完全ヒトCD19-CD3 Bis-RNA (D4F11)をエレクトロポレーションされたT細胞を示すグラフである。エレクトロポレーションの4時間後、T細胞をK562-CD19で18時間刺激し、上清を複数のサイトカイン/ケモカインの検出のためにLuminexに供した。データは、CAR RNA T細胞を100％に設定することにより標準化した。 Bis-RNAの種々の構築物をエレクトロポレーションされたT細胞の発現のレベルを示す。図49Cは、1μgまたは10μgのRNA用量のCD19BBZ、ブリナツモマブBis-RNA、D4BBZまたはD4F11 Bis-RNAのいずれかを用いてエレクトロポレーションされたT細胞を示すグラフである。該細胞をCD19陽性細胞株K562-CD19またはRajiで刺激し、サイトカイン産生(IFN-γおよびIL-2)をELISAによって検出した。 Bis-RNAの種々の構築物をエレクトロポレーションされたT細胞の発現のレベルを示す。図49Dは、1、5または10μgのRNA用量のCD19BBZ、ブリナツモマブBis-RNA、D4BBZまたはD4F11 Bis-RNAのいずれかを用いてエレクトロポレーションされたT細胞を示すグラフである。該細胞をCD19陽性細胞株K562-CD19、RajiまたはNalm6で刺激し、対照としてCD19陰性株K562-mesoで刺激した。CD107aの発現をフローサイトメトリーによって検出した。 Bis-RNAの種々の構築物をエレクトロポレーションされたT細胞の発現のレベルを示す。図49Eは、EGFRviii CAR (MR1-BBZもしくは139-BBZ)をコードするRNAまたはEGFRviii Bis-RNA (MR1-Bis-RNAもしくは139-Bis-RNA)を用いてエレクトロポレーションして、EGFRviii RNAエレクトロポレーションK562細胞またはK562細胞で刺激した、T細胞のCD107aアップレギュレーションを示すグラフである。 Bis-RNAの種々の構築物をエレクトロポレーションされたT細胞の発現のレベルを示す。図49Fは、CD19 CAR (CD19BBZ)もしくはErBB2 CAR (4D5-BBZ)をコードするRNAまたはErBB2 Bis-RNA (4D5-OKT3)を用いてエレクトロポレーションされたT細胞のCD107aアップレギュレーションを示すグラフである。上のパネルは、エレクトロポレーションの18時間後のErBB2融合タンパク質(Her2-Fc)を含むT細胞の染色を示す。下のパネルは、ErBB2陽性/CD19陰性腫瘍細胞株(SK-OV3)またはCD19陽性/ErBB2陰性腫瘍細胞株(Nalm6)のいずれかで刺激されたT細胞のCD107a染色を示す。 Bis-RNAの種々の構築物をエレクトロポレーションされたT細胞の発現のレベルを示す。図49Gは、ErBB2融合タンパク質(Her2-Fc)の発現を示すグラフのパネルである。 Bis-RNAの種々の構築物をエレクトロポレーションされたT細胞の発現のレベルを示す。図49Hは、CD8+細胞におけるCD107a発現を示すグラフのパネルである。 図50は、異なる量のCD19BBZ RNAまたはCD19-CD3 Bis-RNAおよび5μgもしくは10μgのPD1 RNAを用いてコエレクトロポレーションされたT細胞を示すグラフである。該細胞をCD19陽性細胞株Rajiで刺激し、IFN-γ分泌をELISAによって検出した。データは、PD1の共導入なしの細胞に対するT細胞のサイトカイン産生のパーセンテージとしてプロットした。 コエレクトロポレーションT細胞を特徴付けるグラフのパネルである。図51Aは、Bis-RNAエレクトロポレーションT細胞のT細胞活性化および腫瘍殺傷能力の増加を示すフローグラフのパネルである。T細胞に、示されるように、異なる量(μg RNA/0.1ml T細胞)のブリナツモマブBis-RNA (Bis-RNA)またはCD19 CAR RNA (CAR RNA)のいずれかを用いてエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの18時間後、Bis-RNAまたはCAR RNAを有するT細胞を、同数のGFP RNAエレクトロポレーションT細胞(GFP-T)を添加してまたは添加せずに、CD19陽性細胞株で刺激し、CD107a発現について評価した。 コエレクトロポレーションされたT細胞を特徴付けるグラフのパネルである。図51Bは、Bis-RNAエレクトロポレーション後のIFN-γおよびグランザイムBの発現を示すグラフのパネルである。上記のT細胞のエレクトロポレーションの18時間後、エレクトロポレーションT細胞をIFN-γおよびグランザイムBの細胞内染色に供した(図2B)。 コエレクトロポレーションされたT細胞を特徴付けるグラフのパネルである。図51Cは、IFN-γのELISA検出を示すグラフである。IFN-γに対するELISAは、CD19陽性細胞(Nalm6、K562-CD19およびRaji)またはCD19陰性(K562)細胞株でT細胞を一晩刺激した後に行った。 コエレクトロポレーションされたT細胞を特徴付けるグラフのパネルである。図51Dは、Bis-RNAのエレクトロポレーションおよび発現後のT細胞の特異性を示すグラフである。T細胞を、ブリナツモマブBis-RNA (Bis-RNA)またはCD19bbz CAR RNA (1、5または10μg/0.1ml T細胞のRNA用量のCAR RNA)のいずれかを用いてエレクトロポレーションするか、または5μgずつのBis-RNAとCAR RNA (Bis-RNA＋CAR RNA)を用いてコエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの18時間後、示されたエフェクター：標的比で4時間フローベースの細胞傷害性Tリンパ球アッセイにより溶解活性を評価した。 図52は、T細胞にエレクトロポレーションされた可溶性融合タンパク質RNAを列挙した表である。 図53は、抗PD-L1 scFvおよび抗CD28 scFvを用いた二重特異性抗体の構築を示す図である。 エレクトロポレーションT細胞におけるサイトカイン産生を示すグラフのパネルである。図54Aは、異なるRNAを用いてエレクトロポレーションして、腫瘍細胞とのインキュベーションにより活性化された、T細胞によるIL-2産生を示すグラフである。 エレクトロポレーションされたT細胞におけるサイトカイン産生を示すグラフのパネルである。図54Bは、異なるRNAを用いてエレクトロポレーションして、腫瘍細胞とのインキュベーションにより活性化された、T細胞によるIFN-γ産生を示すグラフである。 図55は、抗TGFb受容体II scFvおよび抗CD28 scFvを用いた二重特異性抗体の構築を示す図である。 エレクトロポレーションT細胞の反応性を示すグラフのパネルである。図56Aは、4D5-CD3 Bis-RNAを用いてエレクトロポレーションされたT細胞がErbB2を過剰発現する腫瘍細胞に反応したことを示すグラフである。ErbB2 CARまたはBis-RNAを用いてエレクトロポレーションされたT細胞を、高レベルのErbB2、SK-OV3およびN87、または低レベルのMFC-7、MDA-231、PC3およびA549を発現する腫瘍株で刺激した。CD107aアッセイは、4D5-6.CD3を発現するT細胞がErbB2過剰発現腫瘍細胞に対してのみ反応性であることを示した。 エレクトロポレーションT細胞の反応性を示すグラフのパネルである。図56Bは、図56Aの実験の繰り返しの結果を示すグラフのパネルである。 図57は、4D5-CD3 Bis-RNAを用いてエレクトロポレーションされたT細胞のErbB2過剰発現腫瘍細胞に対する溶解活性を示すグラフのパネルである。ErbB2 CARまたはBis-RNAを用いてエレクトロポレーションされたT細胞を、ErbB2過剰発現腫瘍細胞SK-OV3-CBGまたはErbB2低発現腫瘍細胞mel624 (624-CBG)に対するそれらの溶解活性について試験した。ルシフェラーゼに基づくCTLアッセイは、親和性を調節したBebB2 CAR、4D5-5.BBZおよび4D5-3.BBZと同様に、4D5-6.CD3を発現するT細胞がErbB2過剰発現腫瘍細胞SK-OV3に対してのみ反応性であることを示した。 図58は、4D5-CD3 Bis-RNAをレンチウイルスで形質導入されたT細胞が、ErbB2過剰発現腫瘍細胞に対して反応性であることを示すグラフのパネルである。ErbB2 CARまたはBis-RNAを形質導入したT細胞を、高レベルのErbB2、SK-OV3およびN87、または低レベルのMDA-231、PC3およびA549を発現する腫瘍株で刺激した。CD107aアッセイは、4D5-CD3を発現するT細胞がErbB2過剰発現腫瘍細胞に対してのみ反応性であることを示した。 図59は、4D5-CD3 Bis-RNAをレンチウイルスで形質導入されたT細胞が、ErbB2過剰発現腫瘍細胞に対して反応性であることを示すグラフのパネルである。示されるようにErbB2 CARまたはBis-RNAを形質導入したT細胞を、高レベルのErbB2、SK-OV3およびN87、または低レベルのMDA-231、PC3およびA549を発現する腫瘍株で刺激した。ELISAでアッセイされたサイトカイン産生は、T4D5-CD3を発現するT細胞がErbB2過剰発現腫瘍細胞に対してのみ反応性であることを示す。 T細胞で治療したマウスにおける進行性血管新生腫瘍の退縮を示す画像のパネルである。図60Aは、親和性を調節したErbB2 BiTE細胞が治療指数を増加させ、マウスにおいて進行性血管新生腫瘍の退縮を誘導することを示す画像のパネルである。レンチウイルス形質導入により異なる親和性のErbB2 CARまたはBiTEで改変されたT細胞を、二重腫瘍移植NSGマウスにおいて試験した。0日目にマウス(n＝4～5)の右脇腹にPC3-CBG腫瘍細胞(1×10⁶個/マウス、皮下)を移植した。5日目に、同じマウスの左脇腹にSK-OV3-CBG腫瘍細胞(5×10⁶個/マウス、皮下)を移植した。PC3腫瘍接種後23日目にマウスをT細胞(静脈内注入)で治療した。T細胞は、1×10⁷個/マウスの単回注入として投与した。非形質導入T細胞(TDなし)で治療したマウスを対照として使用した。PC3腫瘍接種後の示された時点で動物を画像化した。 T細胞で治療したマウスにおける進行性血管新生腫瘍の退縮を示す画像のパネルである。図60Bは、二重腫瘍移植NSGマウスモデルにおけるSK-OV3腫瘍サイズを示すグラフである。腫瘍サイズを測定し、腫瘍体積を計算して、プロットした。 T細胞で治療したマウスにおける進行性血管新生腫瘍の退縮を示す画像のパネルである。図60Cは、二重腫瘍移植NSGマウスモデルにおけるPC3腫瘍サイズを示すグラフである。腫瘍サイズを測定し、腫瘍体積を計算して、プロットした。 図61は、図61A～61Bを含み、PD1-CD28スイッチ受容体を示す画像のパネルである。図61Aは、PD1-CD28スイッチ受容体および親和性調節T4D5-6.CD3 BiTEを共発現させるための構築物の図である。図61Bは、PD1-CD28およびT4D5-CD3共発現ベクターをレンチウイルスで形質導入されたT細胞のPD1-CD28スイッチ受容体の検出を示すグラフのパネルである。 図62は、図62A～62Mを含み、画像のパネルである。図62Aは、PD1-CD28スイッチ受容体およびT4D5-6.CD3親和性調節BiTEの両方を共発現するT細胞の増大した溶解活性を示すグラフである。図62B～62Gは、インビボ抗白血病活性がさらに改善された、急速拡大プロトコル(rapid expansion protocol: REP)によって作製されたBis-RNAエレクトロポレーションT細胞を示す画像のパネルである。REPまたは抗CD3/抗CD28ビーズ(ビーズ)によって拡大されたT細胞の表現型を評価した(図62B)。REP T細胞または抗CD3/抗CD28ビーズT細胞に、異なる量のCAR RNAまたはBis-RNAを用いてエレクトロポレーションして、異なる細胞株で18時間刺激した。CD137のアップレギュレーションをフローサイトメトリー(CD3+ T細胞にゲーティング)によって分析した(図62C)。溶解活性は、異なる量のCAR RNAまたはブリナツモマブBis-RNAを用いてエレクトロポレーションされたREP T細胞(図62D、左のパネル)または抗CD3/抗CD28ビーズT細胞(図62D、右のパネル)において測定した。NSGマウスに1×10⁶個のNalm6-CBGを静脈内注入し、5日後に最初の治療のために30×10⁶個のCAR RNAまたはブリナツモマブBis-RNA (Blina) T細胞で治療し、続いてNalm6-CBG注入後8日目に開始して、5×10⁶個ずつで週2回、3週間治療した。示された時点に生物発光イメージング(BLI)を実施し(図62E)、BLIおよび生存率の結果をそれぞれ図62Fおよび図62Gにプロットした。図62H～62Iは、膜結合OKT3を発現するK562ベースの人工抗原提示細胞(aAPC)の作製を示す画像のパネルである。CD8ヒンジおよびトランスメンブレン(OKT3.8)、またはCD8ヒンジおよびCD28トランスメンブレン(OKT3.8.28)のいずれかを有するOKT3の膜形態のキメラタンパク質を発現するレンチウイルスベクター(pLENS)を図62Hに示す。K562ベースのaAPCであるK562-CD86-CD137L (KT)またはK562-CD137L (2D11)細胞株にレンチウイルスOKT3.8またはOKT3.8.28を形質導入し、膜結合OKT3の発現をマウスIgG Fabに対する抗体を用いて検出した(図62I)。図62Jは、膜結合OKT3形質導入K562 aAPCクローンの特性解析を示す画像のパネルである。限界希釈による該クローンの選択は、OKT3.8.28形質導入KT aAPCからの膜結合OKT3の発現に基づいた。図62K～62Mは、K562ベースの人工aAPCを用いたREPを示すグラフのパネルである。図62Kは、OKT3をロードしたK562-CD86-CD137L (KT)もしくはK562-CD137L (2D11)、または膜結合OKT3を発現するKT (KT.OKT)を照射し、1日間(D1)または2日間(D2)培養してからT細胞：aAPC比1：250でT細胞を刺激するために使用したことを示すグラフである。図62Lは、独立してREPにおいて拡大し、CD62LおよびCD28について染色された、拡大したT細胞を示すグラフのパネルである。図62Mは、KT細胞と比較した、REP実験における異なるB細胞株を示すグラフである。 図63は、1×10⁶個のNaml6-CBG細胞の静脈内注入により樹立された白血病を有するNSGマウスを示すグラフである。7日後、該マウスを20×10⁶個のRNAエレクトロポレーションT細胞で治療した。13日目と27日目に、RNAを用いてエレクトロポレーションされた5×10⁶個のT細胞を注入する24時間前に、該マウスを60mg/kgのシトキサンの腹腔内投与により治療した。注入後の示された時点で動物を画像化したが、その際全光子束をY軸上に示した(n＝5)。 図64は、1×10⁶個のNaml6-CBG細胞の静脈内注入により樹立された白血病を有するNSGマウスを示すグラフである。7日後、該マウスを20×10⁶個のRNAエレクトロポレーションT細胞で治療した。13日目と27日目に、RNAを用いてエレクトロポレーションされた5×10⁶個のT細胞を注入する24時間前に、該マウスを60mg/kgのシトキサンの腹腔内投与により治療した。注入後の示された時点で動物を画像化したが、その際全光子束をY軸上に示した(n＝5)。 図65は、TCR RNAエレクトロポレーションT細胞がレンチ-形質導入T細胞よりも良好に腫瘍増殖を制御したことを示すグラフである。2.5×10⁶個のA549-ESO/A2腫瘍細胞を0日目に静脈内注入した。5日目に治療を開始した。レンチ-T細胞を5日目に10×10⁶個の単回用量で投与し、RNAエレクトロポレーションT細胞は、5日目に開始して30×10⁶、10×10⁶、10×10⁶および10×10⁶個の4回用量を週2回注入した。 図66は、TCR RNAエレクトロポレーションT細胞が腫瘍細胞増殖を制御したことを示す画像のパネルである。 図67は、レンチ-形質導入T細胞が、TCR RNAエレクトロポレーションT細胞ほど効果的に腫瘍増殖を制御しなかったことを示す画像のパネルである。 図68は、腫瘍モデルにおいてレンチ-形質導入T細胞よりも効果的に腫瘍増殖を制御したことを示すグラフである。 図69は、CD3構築物の図を示す画像、ならびにTCRおよびCD3 RNAをエレクトロポレーションされたT細胞におけるTCRおよびCD3発現を示すグラフのパネルである。 図70は、エレクトロポレーションT細胞において検出されたTCR (vb13.1)、CD3およびTCR (vb13.1)/CD3の発現レベルを示すグラフである。 図71は、T細胞にエレクトロポレーションされたTCR RNAの発現を示すグラフのパネルである。 図72は、1G4野生型(1G4wt)および高親和性(1G4.LY95a)NY-ESO-1 TCRについてのレンチウイルスベクターの力価を示す表である。 図73は、1G4野生型(1G4wt)および高親和性(1G4.LY95a)NY-ESO-1 TCRについての異なるレンチウイルスベクターの力価を示す表である。 図74は、T細胞のウイルス感染効率を示す表である。 図75は、TCRおよびCD3を用いてコエレクトロポレーションされたT細胞におけるトランスジーン発現を示すグラフのパネルである。 図76は、TCRおよびCD3 RNAを用いてエレクトロポレーションされたT細胞におけるトランスジーン発現を示すグラフのパネルである。 図77は、TCRおよびCD3を用いてコエレクトロポレーションされたT細胞またはTCRを用いてエレクトロポレーションされかつCD3ビーズで刺激されたT細胞におけるトランスジーン発現を示すグラフのパネルである。 図78は、CD3と共にまたはCD3なしでTCR RNA (y軸)を用いてエレクトロポレーションして、Naml6腫瘍細胞(x軸)と共にインキュベートしたT細胞を示すフロー図のパネルである。 図79は、CD3と共にまたはCD3なしでTCR RNA (y軸)を用いてエレクトロポレーションして、OKTを発現するNaml6腫瘍細胞(x軸)と共にインキュベートしたT細胞を示すフロー図のパネルである。 図80は、CD3と共にまたはCD3なしでTCR RNA (y軸)を用いてエレクトロポレーションして、ND340を発現するNaml6腫瘍細胞(x軸)と共にインキュベートしたT細胞を示すフロー図のパネルである。 図81は、NY-ESO-1 TCR (1G4)アルファおよびベータ鎖RNAと一緒に、CD3デルタ、ガンマ、イプシロンおよびゼータを、全ユニット(4サブユニット)またはそれ未満(3サブユニット、2サブユニット、または1サブユニット)のいずれかを用いてエレクトロポレーションされたT細胞におけるTCRおよびCD3発現を示すフローグラフのパネルである。CD3およびTCR (vb13.1)をエレクトロポレーションの18時間後にフローサイトメトリーによって検出した。 図82は、CD3 RNAを293細胞株にエレクトロポレーションした後のCD3およびTCR発現の平均蛍光強度(MFI)を示す棒グラフである。 図83は、腫瘍細胞で刺激されたTCR RNAおよびCD3 RNAをコエレクトロポレーションされたT細胞におけるCD107aアップレギュレーションを示すフローグラフのパネルである。 図84は、異なる腫瘍細胞株と共にインキュベートされたRNAエレクトロポレーションT細胞におけるIFN-γ発現を示すグラフのパネルである。NY-ESO-1 TCRアルファおよびベータRNAを用いて、CD3 RNAの異なる組み合わせと共に、T細胞にエレクトロポレーションを行った。該細胞を、NY-ESO-1/HLA-A2陽性であるNaml6-ESOまたは624mel腫瘍細胞と共培養した。18時間後にIFN-γ産生レベルを測定した。 図85は、腫瘍細胞株と共にインキュベートされた異なるRNAエレクトロポレーションT細胞のIFN-γ発現を示すグラフである。 図86は、異なる腫瘍細胞株と共にインキュベートされたRNAエレクトロポレーションT細胞におけるIL-2発現を示すグラフのパネルである。NY-ESO-1 TCRアルファおよびベータRNAを用いて、CD3 RNAの異なる組み合わせと共に、T細胞にエレクトロポレーションを行った。該細胞を、NY-ESO-1/HLA-A2陽性であるNaml6-ESOまたは624mel腫瘍細胞と共に培養した。18時間後にIL-2産生レベルを測定した。 図87は、4-1BBを含むTCRまたはCD3 RNA構築物を用いてエレクトロポレーションされたT細胞によってTCRが発現されたことを示すグラフのパネルである。4-1BBと共にまたはなしで、1G4 TCRアルファ(もしくはアルファ.BB)およびベータ(アルファ/ベータもしくはアルファ.BB/ベータ)、またはCD3ゼータもしくはイプシロン(ゼータ、ゼータ.BB、イプシロン、もしくはイプシロン.BB)を有するアルファ/ベータを用いて、T細胞にコエレクトロポレーションを行った。18時間後、CD3およびvb13.1をフローサイトメトリーによって測定した。 図88は、異なる腫瘍細胞株と共にインキュベートされたRNAエレクトロポレーションT細胞が複数の腫瘍細胞株に対して効果的であったことを示すグラフのパネルである。TCRまたはCD3のC末端に共刺激シグナルを提供すると、T細胞機能が維持され、潜在的にT細胞に直接的な共刺激シグナルがもたらされた。4-1BBと共にまたはなしで、1G4 TCRアルファ(もしくはアルファ.BB)およびベータ(アルファ/ベータもしくはアルファ.BB/ベータ)、またはCD3ゼータもしくはイプシロン(ゼータ、ゼータ.BB、イプシロン、もしくはイプシロン.BB)を有するアルファ/ベータを用いて、T細胞にコエレクトロポレーションを行った。18時間後、T細胞を腫瘍細胞株Naml6-ESO (HLA-A2+/NY-ESO-1+)、A549ENA (HLA-A2+/NY-ESO-1+)、624mel (HLA-A2+/NY-ESO-1+)、526mel (HLA-A2+/NY-ESO-1+)、または888mel (HLA-A2+/NY-ESO-1+)で刺激し、CD107a産生を測定した。 図89は、Naml6腫瘍細胞(x軸)、およびCD3鎖と共にまたはなしで異なるTCR鎖をコードするRNAを用いてエレクトロポレーションされたT細胞(y軸)を示すフロー図のパネルである。 図90は、624腫瘍細胞(x軸)、およびCD3鎖と共にまたはなしで異なるTCR鎖をコードするRNAを用いてエレクトロポレーションされたT細胞(y軸)を示すフロー図のパネルである。 図91は、526腫瘍細胞(x軸)、およびCD3鎖と共にまたはなしで異なるTCR鎖をコードするRNAを用いてエレクトロポレーションされたT細胞(y軸)を示すフロー図のパネルである。 図92は、888腫瘍細胞(x軸)、およびCD3鎖と共にまたはなしで異なるTCR鎖をコードするRNAを用いてエレクトロポレーションされたT細胞(y軸)を示すフロー図のパネルである。 図93は、図93A～93Dを含み、ジスルフィド結合を有するTCRおよびジスルフィド結合とN-脱グリコシル化の両方を有するベータ鎖を用いたエレクトロポレーションT細胞の達成された最大トランスジーン発現(図93A)および機能を示すグラフのパネルである。TCRアルファ鎖のN-脱グリコシル化は、エレクトロポレーションT細胞の機能を損なった(図93A～93D)。 図94は、NOD/SCIDマウスへの静脈内注入後にNY-ESO-1とGFPの両方を発現する10×10⁶個のNaml6-CBG-ESO-GFP(クリックビートル緑色)細胞の発現を示すグラフである。腫瘍接種の5日後、最初にCBR(クリックビートル赤色)を形質導入して、RNAエレクトロポレーションT細胞を、示されるように静脈内注入した(n＝5)。wt1G4：野生型1G4 TCR、m1G4：第2ジスルフィド結合アルファ/第2ジスルフィド結合アルファおよびN-脱グリコシル化ベータ、CD19：CD19BBZ CAR、meso：ss1BBZ CAR、および生理食塩水。 図95は、TCRアルファ鎖におけるN-脱グリコシル化がRNAエレクトロポレーションT細胞の機能を損なったことを示す画像のパネルである。 図96は、マウス定常領域を含むハイブリッドTCRをコードするRNAを用いてエレクトロポレーションされたT細胞のトランスジーン発現および機能性を示す画像のパネルである。 図97は、マウスモデルに注入された腫瘍細胞およびハイブリッドTCR T細胞の蛍光を経時的に示す画像のパネルである。 図98は、図98A～98Dを含み、TCRのアルファ鎖とベータ鎖へのジスルフィド結合の付加、またはベータ鎖のN-脱グリコシル化が、TCRまたはハイブリッドTCRへのジスルフィド結合の付加と比較して、エレクトロポレーションT細胞のトランスジーン発現および機能を増強したことを示す画像のパネルである。 図99は、4-1BBを含むTCRまたはCD3を用いてエレクトロポレーションされたT細胞によってTCRが発現されることを示す画像のパネルである。4-1BBと共にまたはなしで、1G4 TCRアルファ(またはアルファ.BB)およびベータ(a/bまたはa.BB/b）、またはCD3ゼータもしくはイプシロン(z、z.BB、eまたはe.BB)を有するa/bを用いて、T細胞にコエレクトロポレーションを行った。18時間後、CD3およびvb13.1をフローサイトメトリーによって測定した。 図100は、4-1BBと共にまたはなしで、1G4 TCRアルファ(またはアルファ.BB)およびベータ(a/bまたはa.BB/b）、またはCD3ゼータもしくはイプシロン(z、z.BB、eまたはe.BB)を有するa/bを用いてコエレクトロポレーションされたT細胞を示す画像のパネルである。18時間後、T細胞を腫瘍株Nalm6-ESO (HLA-A2+/NY-ESO-1+)、A549-ESO (HLA-A2+/NY-ESO-1+)、624mel (HLA-A2+/NY-ESO-1+)、526mel (HLA-A2+/NY-ESO-1-)、または888mel (HLA-A2-/NY-ESO-1-)で刺激し、CD107aアッセイにおいて評価した。 図101は、CD27(またはCD28)と共にまたはなしで、1G4 TCRアルファおよびベータ、またはCD3イプシロン(E)および/もしくはゼータ(Z)を有するa/bを用いてコエレクトロポレーションされたT細胞を示す画像のパネルである。18時間後、T細胞を腫瘍株Nalm6-ESO (HLA-A2+/NY-ESO-1+)、624mel (HLA-A2+/NY-ESO-1+)、U266 (HLA-A2+/NY-ESO-1+)、または888mel (HLA-A2-/NY-ESO-1-)で刺激し、CD107aアッセイにおいて評価した。 図102は、PD1構築物、ならびにPD1-CD28スイッチ受容体およびCD27と共にまたはなしで1G4 TCRをレンチウイルス形質導入されたT細胞におけるPD1およびvb13.1の検出を示す画像のパネルである。 図103は、0日目に5E6 A549-ESO (HLA-A2およびNY-ESO-1形質導入A549)を皮下注入したことを示すグラフである。14日目に1×10⁶個の形質導入T細胞を注入し、腫瘍サイズを測定した。予備的結果は、TCR単独(1G4)では効果がないが、CD27共刺激シグナル(1G4.CD27)、またはPD1-CD28スイッチ受容体(PD1-CD28.1G4)、またはCD27共刺激シグナルとPD1-CD28スイッチ受容体の両方(PD1-CD28.1G4.CD27)では腫瘍の増殖が遅延したことを示した。 図104は、機能的コグネイト抗原認識と共に非MHC制限腫瘍抗原認識が可能な改変TCRの概略図である。 図105は、コエレクトロポレーションT細胞のトランスジーン発現を示す画像のパネルである。7アミノ酸インフルエンザ(HA1)ペプチド配列を、TCRアルファ鎖またはCD3ゼータもしくはイプシロン鎖のいずれかのN'末端に付加して、HA1.アルファ(HA1.a)、HA1.ゼータ(HA1.z)およびHA1.イプシロン(HA1.e)を作製した。改変TCRを用いて、インフルエンザHA1 (17-9または26-9)および腫瘍抗原(CD19またはHer2 (4D5))に対する二重特異性抗体をコードするRNAと一緒に、T細胞にコエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの18時間後、トランスジェニックTCR (vb13.1)発現をフローサイトメトリーによって調べた。 図106は、改変NY-ESO-1 TCRを有するT細胞がコグネイト抗原(HLA-A2/NY-ESO-1)をCD19またはHer2と共に認識したことを示す画像のパネルである。 図107は、bis-RNAと共に改変TCRを導入されたT細胞のIFN-γ分泌を示すグラフである。 図108は、bis-RNAと共に改変TCRを導入されたT細胞のIL-2分泌を示すグラフである。 図109は、腫瘍保持マウスに投与された、改変TCRとbis-RNAを有するT細胞の抗腫瘍活性を示す画像のパネルである。マウスにNalm6-ESOを静脈内注入して、示されるようにRNAを用いてエレクトロポレーションされたT細胞で治療した。 図110は、図110A～110Bを含み、改変TCRを有するT細胞を示す画像のパネルである。図110Aは、TCRのアルファ鎖またはベータ鎖のいずれかのN'末端に小分子(アフィボディ(AFFIBODY: 登録商標))およびHisタグ配列を付加することによる、小分子改変TCR (Affi-TCR)の概略図である。図110Bは、T細胞がNY-ESO-1 (1G4) TCRアルファ(a)およびベータ(b)、またはそれらのErbB2小分子(342、342.15、342または342.4)改変体を用いてコエレクトロポレーションされたことを示す画像のパネルである。一晩後、vb13.1およびHisタグをフローサイトメトリーによって検出した。 図111は、Affi-TCR RNAエレクトロポレーションT細胞のCD107アップレギュレーションを示す画像のパネルである。 図112は、図112A～112Cを含み、小分子改変CD3イプシロンを共送達することによるTCR発現および二重ターゲティングを示す画像のパネルである。図112Aは、CD3イプシロン鎖のN'末端に小分子およびG4Sリンカーを付加することによる小分子改変CD3イプシロンの概略図である。図112Bは、NY-ESO-1 (1G4) TCRアルファ(a)およびベータ(b)を用いて、またはErbB2小分子(342、342.15、342または342.4)改変CD3イプシロン(e)と一緒に、コエレクトロポレーションされたT細胞を示す表である。図112Cは、一晩のインキュベーション後にフローサイトメトリーによって検出されたvb13.1の発現を示す画像のパネルである。 図113は、Affi-TCR RNAエレクトロポレーションT細胞のCD107aアップレギュレーションを示す画像のパネルである。図101に示されるように、NY-ESO-1 (1G4) TCRアルファ(a)およびベータ(b)を用いて、またはErbB2小分子(342、342.15、342または342.4)改変CD3イプシロン(e)と一緒に、T細胞にコエレクトロポレーションを行い、腫瘍細胞Nalm-6-ESO (NY-eso-1+, ErbB2-)、Nalm6 (NY-eso-1-, ErbB2-)、SK-OV3 (NY-eso-1-, ErbB2+)またはMDA231 (NY-eso-1-, ErbB2+)で刺激して、CD107a発現について評価した。

詳細な説明
定義
他に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記述された方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料を本発明の試験の実践において用いることができるが、好ましい材料および方法が本明細書において記述される。本発明を記述および主張するうえで、以下の専門用語が用いられる。

本明細書において用いられる専門用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。

「1つの(a)」および「1つの(an)」という冠詞は本明細書において、その冠詞の文法的目的語の1つまたは2つ以上(すなわち、少なくとも1つ)をいうように用いられる。例として、「1つの(an)要素」は、1つの要素または2つ以上の要素を意味する。

量、時間的持続時間などのような測定可能な値をいう場合に本明細書において用いられる「約」は、規定値から±20%または±10%、より好ましくは±5%、さらにより好ましくは±1%、なおより好ましくは±0.1%のバラツキを包含するよう意図されるが、これはそのようなバラツキが、開示された方法を実施するのに適切なためである。

本明細書において用いられる「活性化」は、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されたT細胞の状態をいう。活性化はまた、誘発されたサイトカイン産生および検出可能なエフェクター機能に関連しうる。「活性化T細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂を受けているT細胞をいう。

「親和性分子キメラ受容体」という語句は、高い親和性で標的タンパク質またはペプチドに結合する、小分子、抗体模倣体、Affibody(商標)、またはその任意の断片のような、親和性分子を含む組み換え受容体をいう。いくつかの態様において、親和性分子キメラ受容体は、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む。いくつかの他の態様において、親和性分子キメラ受容体は、定常ドメインおよび可変ドメインのような、T細胞受容体ドメインを含む。

本明細書において用いられる「抗体」という用語は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子をいう。抗体は、天然供給源または組み換え供給源から得られる無傷の免疫グロブリンであってもよく、無傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分であってもよい。抗体は、典型的には、免疫グロブリン分子の四量体である。四量体は、天然に存在してもよく、または一本鎖抗体もしくは抗体断片から再構築されてもよい。抗体は、天然に存在しうる二量体、または一本鎖抗体もしくは抗体断片から構築されうる二量体も含む。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、FabおよびF(ab')₂、ならびに一本鎖抗体(scFv)、ヒト化抗体およびヒト抗体を含む、種々の形態で存在しうる(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。

「抗体断片」という用語は、無傷の抗体の領域をいい、無傷の抗体の抗原決定可変領域をいう。抗体断片の例としては、Fab、Fab'、F(ab')₂およびFv断片、直鎖状抗体、scFv抗体、標的に対して十分な親和性を示すVLまたはVHドメインのいずれかで構成される、ラクダ抗体(Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38)のような、単一ドメイン抗体、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されることはない。抗体断片は、ヒト抗体もしくはヒト化抗体、またはそのヒト抗体もしくはヒト化抗体の断片も含む。

本明細書において用いられる「抗体重鎖」は、天然に存在する立体配座にある全抗体分子中に存在する2つのタイプのポリペプチド鎖のうち大きい方をいう。

本明細書において用いられる「抗体軽鎖」は、天然に存在する立体配座にある全抗体分子中に存在する2つのタイプのポリペプチド鎖のうち小さい方をいう。αおよびβ軽鎖は、2つの主要な抗体軽鎖アイソタイプをいう。

本明細書において用いられる「二重特異性抗体」は、少なくとも2つの異なる抗原エピトープに対する結合特異性を有する抗体をいう。1つの態様において、エピトープは同じ抗原由来である。別の態様において、エピトープは2つの異なる抗原由来である。二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、二重特異性抗体は、2つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の共発現を用いて組み換えにより産生されうる。例えば、Milstein et al. (1983) Nature 305: 537-39を参照されたい。あるいは、二重特異性抗体は化学結合を用いて調製することができる。例えば、Brennan et al. (1985) Science 229:81を参照されたい。二重特異性抗体は、二重特異性抗体断片を含む。例えば、Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-48, Gruber et al. (1994) J. Immunol. 152:5368を参照されたい。

本明細書において用いられる用語「合成抗体」とは、例えば、本明細書において記述されるバクテリオファージによって発現される抗体のような、組み換えDNA技術を用いて作製される抗体を意味する。この用語はまた、抗体タンパク質またはその抗体を規定するアミノ酸配列を発現する抗体コードDNA分子の合成によって作製された抗体であって、そのDNA配列またはアミノ酸配列が、利用可能でかつ当技術分野において周知であるDNA配列またはアミノ酸配列の合成技術を用いて得られた抗体も意味するとみなされるべきである。

本明細書において用いられる「抗原」または「Ag」という用語は、免疫応答を誘発する分子と定義される。この免疫応答には、抗体産生、または特異的免疫適格細胞の活性化のいずれかまたは両方が含まれうる。当業者は、事実上、全てのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原として働きうることを理解するであろう。さらに、抗原は、組み換えDNAまたはゲノムDNAから作製することができる。当業者は、免疫応答を惹起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のDNAが、それゆえ、本明細書においてその用語が用いられる通りの「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要はないことを理解するであろう。本発明が、2つ以上の遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を含むが、これに限定されないこと、およびこれらのヌクレオチド配列が、所望の免疫応答を誘発するために様々な組み合わせで配置されることは容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原が生体サンプルから作製され、合成されまたは得られうることは容易に明らかである。そのような生体サンプルは、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または生体液を含むことができるが、これらに限定されることはない。

本明細書において用いられる「抗腫瘍効果」という用語は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞の数の減少、転移の数の減少、平均余命の増加、またはがん性病状に付随する様々な生理的症状の改善によって明らかになりうる生物学的効果をいう。「抗腫瘍効果」は、腫瘍のそもそもの発生の予防における、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によっても明らかになりうる。

「自己抗原」という用語は、本発明によれば、免疫系によって外来性であると認識される任意の自己抗原を意味する。自己抗原には、細胞表面受容体を含めて、細胞タンパク質、リンタンパク質、細胞表面タンパク質、細胞脂質、核酸、糖タンパク質が含まれるが、これらに限定されることはない。

本明細書において用いられる「自己免疫疾患」という用語は、自己免疫応答から生じる障害と定義される。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切かつ過剰な応答の結果である。自己免疫疾患の例としては、とりわけ、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病(I型)、栄養障害性表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、尋常性白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎が挙げられるが、これらに限定されることはない。

本明細書において用いられる場合、「自己」という用語は、後にその個体に再び導入される、同じ個体に由来する任意の材料をいうよう意図される。

「同種」とは、同じ種の異なる動物に由来する移植片をいう。

「異種」とは、異なる種の動物に由来する移植片をいう。

「二重特異性親和性分子」とうい語句は、2つの異なる結合特異性を含む分子をいい、したがって、同時に2つの標的、分子、または抗原に結合することができる。二重特異性親和性分子は、標的細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインと、活性化T細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインとを含む。いくつかの態様において、1つまたは複数の親和性ドメインは、小分子抗原結合ドメインであり、小分子、抗体模倣体、Affibody(商標)、またはその任意の断片を含みうる。

本明細書において用いられる「二重特異性」は、少なくとも2つの異なる結合エピトープに対する結合特異性を有する分子をいう。1つの態様において、エピトープは同じ結合パートナー由来である。別の態様において、エピトープは2つの異なる結合パートナー由来である。異なるエピトープに対する二重特異性を有する分子は、二重特異性抗体を含みうる。

本明細書において用いられる「がん」という用語は、異常細胞の急速かつ制御不能な増殖によって特徴付けられる疾患と定義される。がん細胞は局所的に広がることもあれば、または血流およびリンパ系を通じて身体の他の部分に広がることもある。様々ながんの例としては、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん、甲状腺がんなどが挙げられるが、これらに限定されることはない。

本明細書において用いられる「キメラ抗原受容体」または「CAR」という用語は、免疫エフェクター細胞上で発現されるように操作され、抗原に特異的に結合する人工T細胞受容体をいう。CARは、養子細胞移入を伴う療法として用いられうる。T細胞を患者から取り出し、特定の形態の抗原に特異的な受容体を発現するように改変する。いくつかの態様において、CARは、例えば、腫瘍関連抗原に対する特異性をもって発現されている。CARは、細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメイン、および腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインも含みうる。いくつかの局面において、CARは、CD3ゼータ膜貫通および細胞内ドメインに融合された、一本鎖可変断片(scFv)由来モノクローナル抗体の融合体を含む。CARデザインの特異性は、受容体のリガンド(例えば、ペプチド)に由来しうる。いくつかの態様において、CARは、腫瘍関連抗原に特異的なCARを発現するT細胞の特異性を再度方向付けることによって、がんを標的とすることができる。

本明細書において用いられる場合、「キメラリガンド改変活性化受容体」または「CLEAR」という語句は、少なくともリガンド認識のための細胞外ドメインおよびT細胞内の活性化シグナル伝達のための細胞内ドメインを含む操作された受容体をいう。CLEARは、腫瘍もしくはウイルス抗原または他の分子のいずれかに結合する細胞外ドメインを含むよう操作され、一方、細胞内ドメインは、受容体の細胞外ドメインへのリガンドまたは抗原の結合後にT細胞内で活性化シグナルをもたらす。

「キメラ膜タンパク質」という用語は、細胞外ドメインと、1つもしくは複数のシグナル伝達分子および/もしくは受容体分子に由来する、または1つもしくは複数のシグナル伝達分子および/もしくは受容体分子を活性化できる細胞内ドメインとを有する操作された膜タンパク質をいう。例えば、本明細書において記述されるキメラ膜タンパク質はCD3に対する一本鎖可変断片(scFv)と、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメインとを含む。

本明細書において用いられる場合、「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響または変化を与えないアミノ酸改変をいうよう意図される。そのような保存的改変には、アミノ酸置換、付加および欠失が含まれる。改変は、部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介突然変異誘発のような、当技術分野において公知の標準的な技法によって、本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分枝側鎖を有するアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。したがって、抗体のCDR領域内の1つまたは複数のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基で置き換えることができ、この変化した抗体は、本明細書において記述される機能的アッセイ法を用い抗原結合能について試験することができる。

「共刺激リガンド」には、この用語が本明細書において用いられる場合、T細胞上の同族の共刺激分子と特異的に結合し、それにより、例えば、ペプチドが負荷されたMHC分子のTCR/CD3複合体への結合によって与えられる一次シグナルに加えて、増殖、活性化、分化などを含むが、これらに限定されない、T細胞応答を媒介するシグナルを与える、抗原提示細胞(例えば、aAPC、樹状細胞、B細胞など)上の分子が含まれる。共刺激リガンドは、CD7、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド(ICOS-L)、細胞内接着分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、リンホトキシンベータ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、Tollリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3と特異的に結合するリガンドを含むことができるが、これらに限定されることはない。共刺激リガンドはまた、とりわけ、限定されるものではないが、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3のようなT細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体、およびCD83と特異的に結合するリガンドも包含する。

「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、限定されるものではないが、増殖のような、T細胞による共刺激応答を媒介する、T細胞上の同族の結合パートナーをいう。共刺激分子は、MHCクラスI分子、BTLAおよびTollリガンド受容体を含むが、これらに限定されることはない。

本明細書において用いられる「共刺激シグナル」は、TCR/CD3ライゲーションのような、一次シグナルとの組み合わせで、T細胞増殖、および/または鍵となる分子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションを導くシグナルをいう。

「～に由来する」という用語は、由来物質が供給源に関連するような、特定の供給源から作製され、合成され、または得られることをいう。由来物質は特定の供給源と同一である必要はない。1つの態様において、抗原はタンパク質に由来する。別の態様において、一本鎖可変断片はモノクローナル抗体に由来する。

「疾患」は、動物が恒常性を維持できず、疾患が改善されなければその動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態である。対照的に、動物における「障害」は、その動物が恒常性を維持できるが、その動物の健康状態が障害のない場合よりも好ましくない健康状態である。未処置のまま放置されても、障害が必ずしも動物の健康状態のさらなる低下を引き起こすとは限らない。

「有効量」または「治療的有効量」は、本明細書において互換的に用いられ、特定の生物学的結果を達成するのに有効な、または治療的もしくは予防的利益をもたらす、本明細書において記述される化合物、製剤、材料もしくは組成物の量をいう。そのような結果には、当技術分野において適当な任意の手段によって判定されるような抗腫瘍活性が含まれうるが、これに限定されることはない。

「コードする」とは、定義されたヌクレオチド(すなわち、rRNA、tRNAおよびmRNA)配列または定義されたアミノ酸配列のいずれかを有する、生物学的過程において他の重合体および高分子の合成のための鋳型として働く、遺伝子、cDNAまたはmRNAのような、ポリヌクレオチドにおける特定のヌクレオチド配列の固有の特性ならびにそれに起因する生物学的特性をいう。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳によって細胞または他の生体系においてタンパク質が産生される場合、タンパク質をコードする。mRNA配列と同一であり通常は配列表に示されるヌクレオチド配列であるコード鎖も、遺伝子またはcDNAの転写のための鋳型として用いられる非コード鎖もともに、タンパク質、またはその遺伝子もしくはcDNAの他の産物をコードするということができる。

本明細書において用いられる場合、「内因性」とは、生物、細胞、組織もしくは系の内部に由来するか、またはそれらの内部で産生される、任意の材料をいう。

本明細書において用いられる場合、「外因性」という用語は、生物、細胞、組織もしくは系の外部から導入されるか、またはそれらの外部で産生される、任意の材料をいう。

本明細書において用いられる「拡大する」という用語は、T細胞の数の増加のように、数が増加することをいう。1つの態様において、エクスビボで拡大したT細胞は、培養物中に当初存在している数と比べて数が増加する。別の態様において、エクスビボで拡大したT細胞は、培養物中の他の細胞型と比べて数が増加する。本明細書において用いられる「エクスビボ」という用語は、生物(例えば、ヒト)から取り出され、生物の外側で(例えば、培養皿、試験管、またはバイオリアクタ中で)増殖された細胞をいう。

本明細書において用いられる「発現」という用語は、そのプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および/または翻訳と定義される。

「発現ベクター」とは、発現されるヌクレオチド配列に機能的に連結された発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含むベクターをいう。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用性エレメントを含む; 発現のための他のエレメントは宿主細胞によって、またはインビトロ発現系において供給されうる。発現ベクターには、組み換えポリヌクレオチドを組み入れたコスミド、プラスミド(例えば、裸のもの、またはリポソーム中に含まれるもの)ならびにウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)のような、当技術分野において公知の全てのものが含まれる。

非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含んだキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片(Fv、Fab、Fab'、F(ab')2または抗体の他の抗原結合部分配列のような)である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(CDR)由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種(ドナー抗体)のCDR由来の残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、持ち込まれたCDRまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含むことができる。これらの改変は、抗体性能をさらに改良かつ最適化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、CDR領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、かつFR領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも1つの、および典型的には2つの、可変ドメインの実質的に全てを含む。また、ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを含む。さらなる詳細については、Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992を参照されたい。

「完全ヒト」とは、分子全体がヒト由来であるか、または抗体のヒト形態と同一のアミノ酸配列からなる、抗体のような、免疫グロブリンをいう。

本明細書において用いられる「同一性」とは、2つのポリペプチド分子間のような、2つの重合体分子間の、特に2つのアミノ酸分子間のサブユニット配列同一性をいう。2つのアミノ酸配列が同じ位置に同じ残基を有する場合; 例えば、2つのポリペプチド分子の各々における位置がアルギニンによって占められているなら、それらはその位置で同一である。2つのアミノ酸配列がアライメントにおいて同じ位置に同じ残基を有する程度または同一性は、百分率として表現されることが多い。2つのアミノ酸配列間の同一性は、一致しているまたは同一である位置の数の一次関数である; 例えば、2つの配列における位置の半分(例えば、10アミノ酸長の重合体における5つの位置)が同一であるなら、2つの配列は50%同一であり; 位置の90% (例えば、10中9)が一致しているまたは同一であるなら、2つのアミノ酸配列は90%同一である。

本明細書において用いられる「免疫グロブリン」または「Ig」という用語は、抗体として機能するタンパク質のクラスと定義される。B細胞によって発現される抗体は、BCR (B細胞受容体)または抗原受容体といわれることもある。このタンパク質のクラスに含まれる5つの成員は、IgA、IgG、IgM、IgDおよびIgEである。IgAは、唾液、涙液、母乳、消化管分泌物、ならびに気道および泌尿生殖路の粘液分泌物のような、身体分泌物中に存在する主要な抗体である。IgGは、最も一般的な循環血中抗体である。IgMは、ほとんどの対象で一次免疫応答において産生される主要な免疫グロブリンである。これは凝集反応、補体固定および他の抗体応答において最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌およびウイルスに対する防御において重要である。IgDは抗体機能が判明していない免疫グロブリンであるが、抗原受容体として働いている可能性がある。IgEは、アレルゲンに対する曝露時に肥満細胞および好塩基球からのメディエータの放出を引き起こすことによって即時型過敏症を媒介する免疫グロブリンである。

本明細書において用いられる「免疫応答」という用語は、リンパ球が抗原分子を異物と同定し、抗体の形成を誘導し、および/またはリンパ球を活性化して抗原を除去する場合に起きる抗原に対する細胞応答と定義される。

「免疫学的に有効な量」、「抗免疫応答に有効な量」、「免疫応答を阻害する有効量」または「治療量」という語句は、対象に投与される本発明の組成物の量であって、所望の結果が対象において得られるように対象(患者)の年齢、体重、免疫応答、疾患/病状のタイプおよび健康状態の個体差を考慮して、医師により、任意で科学者と相談して、判定される該量をいう。

本明細書において用いられる場合、「説明材料（instructional material）」は、本発明の組成物および方法の有用性を伝えるために使用できる刊行物、記録、略図または他の任意の表現媒体を含む。本発明のキットの説明材料は、例えば、本発明の核酸、ペプチドおよび/もしくは組成物を含む容器に添付されてもよく、または核酸、ペプチドおよび/もしくは組成物を含む容器と一緒に出荷されてもよい。あるいは、説明材料および化合物がレシピエントによって共同的に用いられることを意図して、説明材料は容器とは別に出荷されてもよい。

「単離された」とは、天然の状態から変えられたまたは取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離されて」いないが、その天然状態の共存物質から部分的にまたは完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離されて」いる。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、または例えば、宿主細胞のような、非天然環境で存在することができる。

本明細書において用いられる「レンチウイルス」とは、レトロウイルス科(Retroviridae)ファミリーの属をいう。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染できるという点で、レトロウイルスの中でも独特である; それらはかなりの量の遺伝情報を宿主細胞のDNA中に送達することができるため、それらは遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の1つである。HIV、SIVおよびFIVは全て、レンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、インビボで有意なレベルの遺伝子移入を達成するための手段を与える。

本明細書において用いられる用語「改変された」とは、本発明の分子または細胞の変化した状態または構造を意味する。分子は化学的に、構造的に、および機能的になど、多くの方法で改変されうる。細胞は、核酸の導入によって改変されうる。

本明細書において用いられる用語「調節する」とは、処置もしくは化合物の非存在下での対象における応答のレベルと比較して、および/または他の点では同一であるが処置を受けていない対象における応答のレベルと比較して、対象における応答のレベルの検出可能な増加または減少を媒介することを意味する。この用語は対象、好ましくはヒトにおいて、天然のシグナルもしくは応答をかく乱させ、および/またはそれに影響を与え、それにより有益な治療応答を媒介することを包含する。

本発明の文脈において、一般的に存在する核酸塩基に関する以下の略語が用いられる。「A」はアデノシンをいい、「C」はシトシンをいい、「G」はグアノシンをいい、「T」はチミジンをいい、および「U」はウリジンをいう。

特別の定めのない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型である、かつ同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。RNAまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列という語句はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、型によっては、イントロンを含みうる程度までイントロンを含みうる。

特別の定めのない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型である、かつ同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。RNAおよびタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含みうる。

「機能的に連結された」という用語は、調節配列と異種核酸配列との間の、後者の発現を結果的にもたらす、機能的連結をいう。例えば、第1の核酸配列が第2の核酸配列との機能的関係の下で配置されている場合、第1の核酸配列は第2の核酸配列と機能的に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与えるなら、プロモーターはコード配列に機能的に連結されている。一般に、機能的に連結されたDNA配列は連続的であり、2つのタンパク質コード領域をつなぎ合わせることが必要な場合、同じ読み枠の中にある。

「過剰発現された」腫瘍抗原または腫瘍抗原の「過剰発現」という用語は、患者の特定の組織または臓器の内部にある固形腫瘍のような疾患領域からの細胞における腫瘍抗原の発現が、その組織または臓器からの正常細胞における発現のレベルと比べて異常なレベルであることを示すよう意図される。腫瘍抗原の過剰発現によって特徴付けられる固形腫瘍または血液悪性腫瘍を有する患者は、当技術分野において公知の標準的なアッセイ法によって判定することができる。

免疫原性組成物の「非経口」投与には、例えば、皮下(s.c.)、静脈内(i.v.)、筋肉内(i.m.)もしくは胸骨内注射、または輸注法が含まれる。

本明細書において用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖と定義される。さらに、核酸はヌクレオチドの重合体である。したがって、本明細書において用いられる核酸およびポリヌクレオチドは互換的である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、それらは単量体「ヌクレオチド」に加水分解されうるという一般知識を有する。単量体ヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解されうる。本明細書において用いられる場合、ポリヌクレオチドには、非限定的に、組み換え手段、すなわち通常のクローニング技術およびPCR(商標)などを用いた組み換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングを含む、当技術分野において利用可能な任意の手段により、ならびに合成手段により得られる全ての核酸配列が含まれるが、これらに限定されることはない。

本明細書において用いられる場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は互換的に用いられ、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基で構成される化合物をいう。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含まなくてはならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成しうるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって相互につなぎ合わされた2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書において用いられる場合、この用語は、例えば、当技術分野において一般的にはペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーともいわれる短鎖と、当技術分野において一般にタンパク質といわれる長鎖の両方をいい、そのなかには多くのタイプがある。「ポリペプチド」には、とりわけ、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変種、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。

本明細書において用いられる「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるために必要な、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるDNA配列と定義される。

本明細書において用いられる場合、「プロモーター/調節配列」という用語は、プロモーター/調節配列に機能的に連結された遺伝子産物の発現のために必要とされる核酸配列を意味する。ある場合には、この配列はコアプロモーター配列であってよく、他の場合には、この配列はエンハンサー配列および遺伝子産物の発現に必要とされる他の調節エレメントを含んでもよい。プロモーター/調節配列は、例えば、組織特異的な様式で遺伝子産物を発現させるものであってもよい。

「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合、細胞のほとんどまたは全ての生理学的条件の下で、遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。

「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合、実質的にはプロモーターに対応する誘導因子が細胞内に存在する場合にのみ遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。

「組織特異的」プロモーターは、遺伝子をコードするまたは遺伝子によって特定されるポリヌクレオチドと機能的に連結された場合、実質的には細胞が、プロモーターに対応する組織型の細胞である場合にのみ遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。

「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係をいう。「細胞表面受容体」という語句は、シグナルを受け取り、細胞の原形質膜を越えてシグナルを伝達しうる分子および分子の複合体を含む。「細胞表面受容体」の例はヒトFSHRである。

本明細書において用いられる「類似性」とは、2つの重合体分子間の、例えば、2つのDNA分子もしくは2つのRNA分子のような、2つの核酸分子間の、または2つのポリペプチド分子間のサブユニット配列同一性をいう。2つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じ単量体サブユニットによって占められている場合; 例えば、2つのDNA分子の各々における位置がアデニンによって占められているなら、それらはその位置で類似している。2つの配列間の類似性は、一致しているまたは類似している位置の数の一次関数である; 例えば、2つの配列における位置の半分(例えば、10サブユニット長の重合体における5つの位置)が類似しているなら、2つの配列は50%類似しており; 位置の90% (例えば、10中9)が一致しているまたは類似しているなら、2つの配列は90%類似している。

「一本鎖抗体」とは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖断片が、操作されたアミノ酸の長さを介してFv領域に連結されている、組み換えDNA技法によって形成された抗体をいう。米国特許第4,694,778号; Bird (1988) Science 242:423-442; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Ward et al. (1989) Nature 334:54454; Skerra et al. (1988) Science 242:1038-1041に記述されているものを含めて、一本鎖抗体を作製する様々な方法が知られている。

「小分子」という用語は、標的、例えば分子、または抗原に結合する能力を有する約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸を有するペプチドをいう。小分子は、低いモル質量、例えば約12 kD、11 kD、10 kD、9 kD、8 kD、7 kD、6 kD、5 kD未満、またはそれらの間の任意のモル質量もしくはそれ以下を含む。いくつかの態様において、小分子は、親和性分子キメラ受容体の小分子細胞外ドメインである。いくつかの態様において、小分子は、二重特異性親和性分子の小分子結合ドメインである。小分子は、標的に結合するその能力およびその構造によって特徴付けられうる。いくつかの態様において、小分子は、少なくとも1つのヘリックス、例えばアルファヘリックス、もしくは2つのヘリックス、3つのヘリックスまたはそれ以上を含む。小分子はまた、化学的に不活性であり、85℃またはそれ以上のような高温に耐えうる。

抗体に関して本明細書において用いられる用語「特異的に結合する」とは、特異的抗原を認識するが、サンプル中の他の分子を実質的に認識または結合しない抗体を意味する。例えば、1つの種由来の抗原に特異的に結合する抗体が、1つまたは複数の種由来のその抗原に結合してもよい。しかし、そのような異種間反応性はそれ自体で、特異的としての抗体の分類を変化させることはない。別の例において、抗原に特異的に結合する抗体が、その抗原の異なる対立遺伝子型に結合してもよい。しかし、そのような交差反応性はそれ自体で、特異的としての抗体の分類を変化させることはない。場合によっては、「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語を、抗体、タンパク質またはペプチドと第2の化学種との相互作用に関連して用い、相互作用が化学種上の特定の構造(例えば、抗原決定基またはエピトープ)の存在に依存することを意味してもよい; 例えば、抗体は、タンパク質全体ではなく特定のタンパク質構造を認識し、それに結合する。抗体がエピトープ「A」に特異的であるなら、エピトープAを含む分子(または遊離した、標識されていないA)の存在は、標識された「A」およびその抗体を含む反応において、その抗体に結合した標識されたAの量を減らすであろう。

用語「刺激」とは、刺激分子(例えば、TCR/CD3複合体)がその同族リガンドと結合し、それによって、限定されるものではないが、TCR/CD3複合体を介するシグナル伝達のような、シグナル伝達事象を媒介することにより誘導される、一次応答を意味する。刺激は、TGF-ベータのダウンレギュレーション、および/または細胞骨格構造の再編成などのような、ある特定の分子の発現の変化を媒介することができる。

「刺激分子」とは、この用語が本明細書において用いられる場合、抗原提示細胞上に存在する同族刺激リガンドと特異的に結合する、T細胞上の分子を意味する。

本明細書において用いられる「刺激リガンド」は、抗原提示細胞(例えば、aAPC、樹状細胞、B細胞など)上に存在する場合、T細胞上の同族結合パートナー(本明細書において「刺激分子」といわれる)と特異的に結合し、それによって活性化、免疫応答の開始、増殖などを含むが、これらに限定されない、T細胞による一次応答を媒介することのできるリガンドを意味する。刺激リガンドは当技術分野において周知であり、とりわけ、ペプチドが負荷されたMHCクラスI分子、抗CD3抗体、スーパーアゴニスト抗CD28抗体およびスーパーアゴニスト抗CD2抗体を包含する。

「対象」という用語は、免疫応答が誘発されうる生物(例えば、哺乳動物)を含むよう意図される。本明細書において用いられる「対象」または「患者」は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物でありうる。非ヒト哺乳動物には、例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコおよびネズミ哺乳動物のような、家畜およびペットが含まれる。好ましくは、対象はヒトである。

本明細書において用いられる場合、「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞である。また、実質的に精製された細胞とは、その天然の状態において通常結び付いている他の細胞型から分離された細胞をいう。ある例では、実質的に精製された細胞の集団とは、均質な細胞集団をいう。他の例では、この用語は、単に、天然の状態において通常結び付いている細胞から分離された細胞をいう。いくつかの態様において、細胞はインビトロで培養される。他の態様において、細胞はインビトロで培養されない。

「標的部位」または「標的配列」とは、結合が起きるのに十分な条件の下で結合分子が特異的に結合しうる核酸の領域を規定するゲノム核酸配列をいう。

本明細書において用いられる場合、「T細胞受容体」または「TCR」という用語は、抗原の提示に応答してT細胞の活性化に関与する膜タンパク質の複合体をいう。TCRは、主要組織適合遺伝子複合体分子に結合した抗原を認識する役割を担う。TCRは、アルファ(a)およびベータ(β)鎖のヘテロ二量体から構成されるが、一部の細胞ではTCRはガンマおよびデルタ(γ/δ)鎖からなる。TCRは、構造的に類似しているが、異なる解剖学的位置および機能を有するアルファ/ベータおよびガンマ/デルタ形態で存在しうる。各鎖は、2つの細胞外ドメイン、つまり可変ドメインおよび定常ドメインから構成される。いくつかの態様において、TCRは、TCRを含む任意の細胞（例えば、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、記憶T細胞、調節性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、およびガンマデルタT細胞を含む）上で改変されうる。

本明細書において用いられる「治療的」という用語は、処置および/または予防を意味する。治療効果は、疾患状態の抑制、寛解または根絶によって得られる。

本明細書において用いられる「トランスフェクションされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入される過程をいう。「トランスフェクションされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクションされた、形質転換された、または形質導入されたものである。この細胞には初代対象細胞およびその子孫が含まれる。

疾患を「処置する」とは、この用語が本明細書において用いられる場合、対象が被っている疾患または障害の少なくとも1つの徴候または症状の頻度または重症度を低減することを意味する。

本明細書において用いられる「転写制御下」または「機能的に連結された」という語句は、RNAポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するためにプロモーターがポリヌクレオチドに関して正しい位置および方向にあることを意味する。

「ベクター」は、単離された核酸を含み、かつ単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用できる組成物である。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結び付いたポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含むが、これらに限定されない、多数のベクターが当技術分野において公知である。したがって、「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、例えばポリリジン化合物、リポソームなどのような、細胞内への核酸の移入を容易にする非プラスミド性および非ウイルス性の化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されることはない。

範囲: 本開示の全体を通じて、本発明のさまざまな局面を範囲の形式で提示することができる。範囲の形式の記述は、単に簡便にするためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限と解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記述は、可能な全ての部分範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、1～6のような範囲の記述は、1～3、1～4、1～5、2～4、2～6、3～6などのような部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3および6を具体的に開示したものとみなされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。

説明
本発明は、二重特異性抗体を発現できる改変T細胞を作製するための方法および組成物を含む。いくつかの態様において、本発明は、改変T細胞を作製するための方法を含む。他の態様は、改変T細胞または改変T細胞の集団を含む。二重特異性抗体は、標的細胞上の抗原ならびにCD3、CD4、CD8およびTCRのような、活性化T細胞上の抗原に対する二重特異性を含む。

T細胞受容体
本発明は、外因性T細胞受容体(TCR)を有するT細胞を含む。1つの局面において、本発明は、T細胞の集団を拡大する段階、および標的細胞上の抗原に対する親和性を含む改変T細胞受容体(TCR)をコードする核酸を、拡大されたT細胞に導入する段階を含む、改変T細胞を作製するための方法を含む。この態様において、T細胞は、改変TCRを発現することができる。

別の局面において、本発明は、T細胞の集団を拡大する段階、および標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含む改変T細胞受容体(TCR)をコードする核酸を、拡大されたT細胞に導入する段階を含む、改変T細胞を作製するための方法を含む。この態様において、T細胞は、改変TCRを発現することができる。

T細胞受容体は、抗原の提示に応答してT細胞の活性化に関与する膜タンパク質の複合体である。TCRの刺激は、抗原ペプチドをT細胞に提示し、TCR複合体に結合して一連の細胞内シグナル伝達カスケードを誘導する、抗原提示細胞上の主要組織適合遺伝子複合体分子(MHC)によって誘発される。

TCRは、一般に、リガンド認識に関与するTCRヘテロ二量体を形成する6つの異なる膜結合鎖から構成される。TCRは、構造的に類似しているが、異なる解剖学的位置および機能を有するアルファ/ベータおよびガンマ/デルタ形態で存在する。1つの態様において、TCRは、TCRアルファ鎖およびベータ鎖を含み、したがってTCRをコードする核酸は、TCRアルファ鎖およびTCRベータ鎖をコードする核酸を含む。別の態様において、アルファ鎖もしくはベータ鎖またはその両方は、少なくとも1つのN-脱グリコシル化を含む。

各鎖は、2つの細胞外ドメイン、つまり可変ドメインおよび定常ドメインから構成される。1つの態様において、TCRは少なくとも1つのマウス定常領域を含む。定常ドメインは、細胞膜の近位にあり、続いて膜貫通ドメインおよび短い細胞質尾部がある。1つの態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは、4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインである。可変ドメインは、TCRが結合特異性を有する特定の抗原およびMHC分子の決定に寄与する。次に、固有の抗原-MHC複合体に対するT細胞の特異性は、T細胞によって発現される特定のTCRに存在する。

定常ドメインおよび可変ドメインの各々は、鎖内ジスルフィド結合を含みうる。1つの態様において、TCRは少なくとも1つのジスルフィド結合を含む。可変ドメインは、抗体の相補性決定領域(CDR)に類似した高度に多型性のループを含む。TCR配列の多様性は、リンクされた可変部(V)、多様性部(D)、結合部(J)および定常部遺伝子の体細胞再編成を介して作り出される。

機能的アルファ鎖およびガンマ鎖ポリペプチドは、再構成されたV-J-C領域により形成されるが、ベータ鎖およびデルタ鎖はV-D-J-C領域からなる。細胞外定常ドメインは、膜近位領域および免疫グロブリン領域を含む。

1つの態様において、TCRは、野生型TCR、高親和性TCR、およびキメラTCRを含む。TCRが改変される場合、それは野生型TCRよりも標的細胞抗原に対して高い親和性を有しうる。TCRがキメラTCRである態様において、TCRはキメラドメインを含んでもよく、例えば、TCRは少なくとも1つの鎖のC末端に共刺激シグナル伝達ドメインを含む。他の態様において、TCRは、改変されたアルファ鎖またはベータ鎖のような、改変された鎖を含みうる。そのような改変には、N-脱グリコシル化、変化したドメイン(特異的な抗原を標的とするまたは親和性を増加させるために操作された可変領域など)、1つまたは複数のジスルフィド結合の付加、異なる種に由来する鎖の全体または断片、およびそれらの任意の組み合わせが含まれうるが、これらに限定されることはない。

標的細胞関連抗原の例は、本明細書の他の箇所に記述されており、これらの全てが本発明のTCRによって標的とされうる。

1つの局面において、本発明は、標的細胞上の抗原に対する親和性を含む改変T細胞受容体(TCR)をコードするエレクトロポレーションされたRNAを含む、改変T細胞の集団であって、TCR RNAを用いたエレクトロポレーションの前に拡大された該T細胞の集団を含む。

別の局面において、本発明は、標的細胞上の抗原に対する親和性を含むT細胞受容体(TCR)をコードする外因性核酸と；共刺激分子をコードするエレクトロポレーションされた核酸とを含む、改変T細胞であって、該TCRおよび共刺激分子を発現する、該T細胞を含む。共刺激分子は、CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1およびPD1Lからなる群より選択されうる。

別の局面において、本発明は、標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含むT細胞受容体(TCR)をコードする外因性核酸と；共刺激分子をコードするエレクトロポレーションされた核酸とを含む、改変T細胞であって、該TCRおよび共刺激分子を発現する、該T細胞を含む。

さらに別の局面において、本発明は、改変T細胞受容体(TCR)が標的細胞上の抗原に対する親和性を含み、かつTCR RNAを用いたエレクトロポレーションの前にT細胞を拡大させた、改変T細胞受容体(TCR)をコードするエレクトロポレーションされたRNAを含む改変T細胞を含む。

さらに別の局面において、本発明は、改変T細胞受容体(TCR)が標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含み、かつTCR RNAを用いたエレクトロポレーションの前にT細胞を拡大させた、改変T細胞受容体(TCR)をコードするエレクトロポレーションされたRNAを含む改変T細胞を含む。

1つの態様において、本発明は、標的細胞上の抗原に対する親和性を含む改変T細胞受容体(TCR)をコードする核酸を、拡大させたT細胞に導入することを含む。この態様において、T細胞は、改変TCRを発現することができる。

T細胞受容体の操作および発現のための技法には、それぞれのサブユニットを連結する天然のジスルフィド架橋を含むTCRヘテロ二量体の産生が含まれるが、これに限定されることはない(Garboczi, et al., (1996), Nature 384(6605): 134-41; Garboczi, et al., (1996), J Immunol 157(12): 5403-10; Chang et al., (1994), PNAS USA 91: 11408-11412; Davodeau et al., (1993), J. Biol. Chem. 268(21): 15455-15460; Golden et al., (1997), J. Imm. Meth. 206: 163-169; 米国特許第6,080,840号)。

1つの態様において、TCRは、標的細胞抗原に対する特異性を含む。標的細胞抗原は、標的細胞に関連する任意のタイプのタンパク質を含みうる。例えば、標的細胞抗原は、標的細胞の特定の疾患状態を認識するように選択されうる。したがって、TCRの抗原結合ドメインに対するリガンドとして作用しうる細胞表面マーカーの例としては、ウイルス、細菌および寄生虫の感染、自己免疫疾患ならびにがん細胞に関連するものが挙げられる。1つの態様において、標的細胞抗原は、任意の腫瘍関連抗原(TAA)およびウイルス抗原、またはその任意の断片を含む。

標的細胞抗原は、主要組織適合遺伝子複合体によってプロセッシングされ提示されうる任意のタンパク質を含みうる。例えば、標的抗原は、特定の疾患状態に関連しうる。したがって、TCRの標的として作用しうる細胞マーカーの例としては、ウイルス、細菌および寄生虫の感染、自己免疫疾患ならびにがん細胞に関連するものが挙げられる。1つの態様において、標的抗原は、腫瘍関連抗原(TAA)およびウイルス抗原のいずれか、またはその任意の断片を含む。

二重特異性抗体
本発明は、二重特異性抗体を含む。二重特異性抗体は2つの異なる結合特異性を含み、したがって2つの異なる抗原に結合する。1つの態様において、二重特異性抗体は、第1の抗原に結合する第1の抗原結合ドメインおよび第2の抗原に結合する第2の抗原結合ドメインを含む。

別の態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の一本鎖可変断片(scFv)分子を含む抗原結合ドメインを含む。そのような態様において、第1および第2のscFvは、標的細胞上の抗原および活性化T細胞上の抗原に結合する。別の態様において、第1のscFv分子は標的細胞上の少なくとも1つの抗原に特異的であり、第2のscFv分子は活性化T細胞上の抗原に特異的である。例えば、活性化T細胞抗原は、CD3、CD4、CD8、またはTCRに結合することができる。これらの例において、二重特異性抗体はT細胞抗原を認識し、二重特異性T細胞誘導物(Bispecific T Cell Engager：BiTE)といわれる。

別の態様において、第1および第2のscFvは、標的細胞上の抗原およびT細胞上の抗原に結合する。例えば、T細胞抗原は、CLEAR、CD3、CD4、CD8、またはTCRを含むことができる。これらの例において、二重特異性抗体はCD3、CD4、CD8またはTCRのような、T細胞抗原を認識し、二重特異性T細胞誘導物(BiTE)といわれる。別の態様において、二重特異性抗体は、標的細胞上の抗原およびT細胞上のCLEARに対する二重特異性を含む。

しかしながら、本発明は、任意の特定の二重特異性抗体の使用によって制限されない。むしろ、任意の二重特異性抗体またはBiTEを用いることができる。二重特異性抗体またはBiTE分子はまた、少なくとも1つの標的細胞関連抗原に対する特異性を有する膜タンパク質として発現されうる。標的細胞関連抗原の例は、本明細書の他の箇所に記述されており、これらの全てが本発明の二重特異性抗体によって標的とされうる。ヒト抗体およびヒト化抗体を作製するための技法はまた、本明細書の他の箇所に記述されている。1つの態様において、二重特異性抗体またはBiTE分子は、二重特異性抗原結合ドメインを含む。この態様において、二重特異性抗原結合ドメインは、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、一本鎖可変断片、単一ドメイン抗体、その抗原結合断片、およびそれらの任意の組み合わせを含む。

1つの局面において、本発明は、標的細胞上の抗原およびT細胞上の抗原に対する二重特異性を含む二重特異性抗体をコードする、RNAのような、核酸を含む改変T細胞の集団を含む。T細胞の集団は、核酸の導入前に拡大される。

1つの局面において、本発明は、標的細胞上の抗原および活性化T細胞上の抗原に対する二重特異性を含む二重特異性抗体をコードするエレクトロポレーションされたmRNAを含む改変T細胞の集団を含む。T細胞の集団は、BiTEエレクトロポレーションの前に拡大された。

別の局面において、本発明は、二重特異性T細胞誘導(BiTE)分子をコードするエレクトロポレーションされたmRNAを含む改変T細胞を含む。この態様において、BiTE分子は、標的細胞上の抗原ならびにCD3、CD4、CD8およびTCRからなる群より選択される活性化T細胞上の抗原に対する二重特異性を含む。

さらに別の局面において、本発明は、標的細胞上の抗原およびT細胞上の抗原に対する二重特異性を含む二重特異性抗体をコードする、RNAのような、核酸を含む改変T細胞の集団を含む。T細胞の集団は、核酸の導入前に拡大されることができる。

さらに別の局面において、本発明は、二重特異性抗体をコードするエレクトロポレーションされたRNAを含む改変T細胞を含む。二重特異性抗体は、標的細胞上の抗原ならびにCD3、CD4、CD8およびTCRからなる群より選択される活性化T細胞上の抗原に対する二重特異性を含む。この態様はまた、二重特異性抗体mRNAを用いたエレクトロポレーションの前にT細胞が拡大されることを含む。

さらに別の局面において、本発明は、二重特異性抗体をコードする、RNAのような、核酸を含む改変T細胞を含む。二重特異性抗体は、標的細胞上の抗原およびCLEARのような、T細胞上の抗原に対する二重特異性を含む。この態様はまた、二重特異性抗体RNAを用いたエレクトロポレーションの前にT細胞を拡大することを含む。

1つの態様において、本発明は、BiTE分子のような、二重特異性抗体をコードするmRNAを、拡大されたT細胞にエレクトロポレーションすることを含む。別の態様において、本発明は、BiTE分子のような、二重特異性抗体をコードする核酸を、拡大されたT細胞に導入することを含む。そのような態様において、T細胞は、二重特異性抗体を発現することができる。二重特異性抗体を操作および発現するための技法には、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組み換え同時発現(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)、WO 93/08829およびTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照のこと)、および「ノブ・イン・ホール(knob-in-hole)」技術(例えば、米国特許第5,731,168号を参照のこと)が含まれるが、これらに限定されることはない。多重特異性抗体はまた、抗体Fc-ヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果(electrostatic steering effect)を操作すること(WO 2009/089004A1)により; 2つまたはそれ以上の抗体または断片を架橋すること(例えば、米国特許第4,676,980号およびBrennan et al., Science 229:81 (1985)を参照のこと)により; ロイシンジッパーを用いて二重特異性抗体を産生すること(例えば、Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)を参照のこと)により; 二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術を用いること(例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照のこと)により; ならびに一本鎖Fv (scFv)二量体を用いること(例えばGruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照のこと)により; ならびに例えば、Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記述されているように三重特異性抗体を調製することにより作製されうる。「オクトパス(Octopus)抗体」を含めて、3つまたはそれ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体も、本明細書に含まれる(例えば、US 2006/0025576A1を参照のこと)。二重特異性抗体は、2つの異なる抗体またはその一部分を連結することによって構築することができる。例えば、二重特異性抗体は、2つの異なる抗体由来のFab、F(ab')₂、Fab'、scFvおよびsdAbを含むことができる。

1つの態様において、二重特異性抗体および/またはBiTE分子は、第1および第2の一本鎖可変断片(scFv)分子を含む二重特異性抗原結合ドメインを含む。そのような態様において、二重特異性抗原結合ドメインは、第1のscFv分子が標的細胞上の少なくとも1つの抗原に特異的であり、かつ第2のscFv分子がT細胞上の少なくとも抗原に特異的であるような、標的細胞上の抗原およびT細胞上の抗原に対する二重特異性を含むことができる。別の態様において、二重特異性抗原結合ドメインは、第1のscFv分子が標的細胞上の少なくとも1つの抗原に特異的であり、かつ第2のscFv分子が活性化T細胞上の少なくとも1つの抗原に特異的であるなど、標的細胞上の抗原および活性化T細胞上の抗原に対する二重特異性を含むことができる。別の態様において、二重特異性抗体は、膜タンパク質として発現される。

1つの態様において、二重特異性抗体は、標的細胞抗原に対する特異性を含む。標的細胞抗原は、T細胞受容体が結合するのと同じ標的細胞抗原を含みうるか、または異なる標的細胞抗原を含みうる。標的細胞抗原は、標的細胞を規定する任意のタイプのリガンドを含みうる。例えば、標的細胞抗原は、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択されうる。したがって、BiTE分子における抗原部分ドメインに対するリガンドとして作用しうる細胞マーカーの例としては、ウイルス、細菌および寄生虫の感染、自己免疫疾患ならびにがん細胞に関連するものが挙げられる。

1つの態様において、標的細胞抗原は、任意の腫瘍関連抗原(TAA)およびウイルス抗原、またはその任意の断片を含む。この態様において、二重特異性抗体および/またはBiTE分子は、標的細胞抗原に特異的に結合する、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、一本鎖可変断片、単一ドメイン抗体、その抗原結合断片、およびそれらの任意の組み合わせのような、抗体を含む。活性化T細胞抗原の例としては、腫瘍抗原、ウイルス抗原、およびその断片が挙げられうる。標的細胞抗原の例としては、腫瘍抗原、ウイルス抗原、およびその断片が挙げられうる。

1つの態様において、二重特異性抗体および/またはBiTE分子は、活性化T細胞上の少なくとも1つの抗原に対する特異性を含む。活性化T細胞抗原は、別の細胞を活性化できるT細胞の表面に見られる抗原を含む。活性化T細胞抗原は、共刺激分子を含みうる。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体でもそのリガンドでもない細胞表面分子である。そのような分子の例としては、CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3およびCD83特異的結合リガンドなどが挙げられる。他の共刺激エレメントも本発明の範囲内である。

1つの態様において、活性化T細胞抗原は、CD3、CD4、CD8、T細胞受容体(TCR)、またはその任意の断片である。この態様において、二重特異性抗体および/またはBiTE分子は、活性化T細胞抗原に特異的に結合する、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、一本鎖可変断片、単一ドメイン抗体、その抗原結合断片、およびそれらの任意の組み合わせのような、抗体を含む。活性化T細胞抗原の例としては、抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗TCR、およびその断片が挙げられうる。

別の態様において、二重特異性抗体および/またはBiTE分子は、T細胞上の少なくとも1つの抗原に対する特異性を含む。T細胞抗原には、CLEARのような、T細胞の表面上に見出される抗原が含まれる。T細胞抗原は、共刺激シグナルまたはドメインを含みうる。共刺激シグナルまたはドメインは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体でもそのリガンドでもない細胞表面分子由来である。そのような分子の例としては、CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、およびCD83特異的結合リガンドなどが挙げられる。他の共刺激エレメントも本発明の範囲内である。1つの態様において、二重特異性抗体は、標的細胞上の抗原およびT細胞上のCLEARに対する二重特異性を含む。

別の態様において、T細胞抗原は、CD3、CD4、CD8、T細胞受容体(TCR)、またはその任意の断片である。この態様において、二重特異性抗体および/またはBiTE分子は、T細胞抗原に特異的に結合する、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、一本鎖可変断片、単一ドメイン抗体、その抗原結合断片、およびそれらの任意の組み合わせのような、抗体を含む。活性化T細胞抗原の例としては、抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗TCR、およびその断片が挙げられうる。

親和性分子キメラ受容体
本発明は、親和性分子キメラ受容体を有する改変T細胞を含む。1つの局面において、本発明は、親和性分子キメラ受容体を発現できるT細胞の集団に、標的細胞上の抗原に対する親和性を有する小分子細胞外ドメインを含む親和性分子キメラ受容体をコードする核酸を導入する段階を含む、改変T細胞を作製するための方法を含む。

親和性分子キメラ受容体は、一般に、標的細胞上の抗原に対する親和性を有する細胞外ドメインのような、抗原認識のための小分子細胞外ドメインから構成される。いくつかの態様において、小分子細胞外ドメインは抗体模倣体に由来する。二重特異性親和性分子の小分子細胞外ドメインは一般に、約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸を有するペプチドである。小分子細胞外ドメインのモル質量は、約10 kD未満のような、単一ドメイン抗体に満たなくてもよい。1つの態様において、親和性分子キメラ受容体は、約10 kD未満である小分子細胞外ドメインを含む。小分子細胞外ドメインのモル質量は、約12 kD、11 kD、10 kD、9 kD、8 kD、7 kD、6 kD、5 kDもしくはそれらの間の任意のモル質量未満であり得、またはそれ未満であり得る。小分子細胞外ドメインはまた、ジスルフィド架橋を欠くヘリックス構造を含んでもよい。いくつかの小分子細胞外ドメインは、少なくとも1つのアルファヘリックス、2つのアルファヘリックス、3つのアルファヘリックスまたはそれ以上を含む。小分子細胞外ドメインはまた、化学的に不活性であり、約85℃またはそれ以上のような高温に耐えることが可能でありうる。

1つの態様において、親和性分子キメラ受容体は、CD3シグナル伝達ドメインのような、細胞内シグナル伝達ドメイン; CD8膜貫通ドメインのような、膜貫通ドメイン; および4-1BB共刺激ドメインのような、共刺激ドメインをさらに含む。

親和性分子キメラ受容体はまた、T細胞受容体(TCR)に基づいてもよい。この態様において、親和性分子キメラ受容体は、標的細胞上の抗原に対する親和性を有する小分子細胞外ドメイン、TCR可変ドメイン、およびTCR定常ドメインを含む。TCR可変ドメインは、アルファ鎖もしくはベータ鎖または両鎖のキメラに由来しうる。同様に、TCR定常ドメインは、アルファ鎖もしくはベータ鎖または両鎖のキメラに由来しうる。定常ドメインおよび可変ドメインの各々は、鎖内ジスルフィド結合を含みうる。1つの態様において、TCRは少なくとも1つのジスルフィド結合を含む。可変ドメインは、抗体の相補性決定領域(CDR)に類似した高度に多型性のループを含む。TCR配列の多様性は、リンクされた可変部(V)、多様性部(D)、結合部(J)および定常部遺伝子の体細胞再編成を介して作り出される。

標的細胞関連抗原の例は、本明細書の他の箇所に記述されており、これらの全てが本発明の親和性分子キメラ受容体によって標的とされうる。

1つの局面において、本発明は、標的細胞上の抗原に対する親和性を有する小分子細胞外ドメインを含む親和性分子キメラ受容体をコードする核酸を含む改変T細胞の集団であって、親和性分子キメラ受容体を発現する該T細胞の集団を含む。

別の局面において、本発明は、標的細胞上の抗原に対する親和性を有する小分子細胞外ドメインを含む親和性分子キメラ受容体をコードする核酸を含む、改変T細胞であって、親和性分子キメラ受容体を発現する該T細胞を含む。

1つの態様において、小分子細胞外ドメインは、標的細胞抗原に対する特異性を含む。標的細胞抗原は、標的細胞に関連する任意のタイプのタンパク質を含みうる。例えば、標的細胞抗原は、標的細胞の特定の疾患状態を認識するように選択されうる。したがって、細胞表面マーカーの例は、ウイルス、細菌および寄生虫の感染、自己免疫疾患ならびにがん細胞に関連する抗原などの抗原に対する小分子細胞外ドメインに結合するよう作用しうる。1つの態様において、標的細胞抗原は、任意の腫瘍関連抗原(TAA)、細菌抗原、寄生虫抗原、ウイルス抗原、またはその任意の断片を含む。

標的細胞抗原は、主要組織適合遺伝子複合体によってプロセッシングされ提示されうる任意のタンパク質を含みうる。例えば、標的抗原は、特定の疾患状態に関連しうる。したがって、TCRの標的として作用しうる細胞マーカーの例としては、ウイルス、細菌および寄生虫の感染、自己免疫疾患ならびにがん細胞に関連するものが挙げられる。1つの態様において、標的抗原は、腫瘍関連抗原(TAA)およびウイルス抗原のいずれか、またはその任意の断片を含む。

二重特異性親和性分子
本発明は、二重特異性親和性分子も含む。二重特異性親和性分子は2つの異なる結合特異性を含み、したがって2つの標的、分子、または抗原に結合することができる。1つの局面において、本発明は、標的細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインと活性化T細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインとを含む二重特異性親和性分子をコードする核酸を含む改変細胞を含む。この態様において、少なくとも1つの親和性ドメインは、小分子抗原結合ドメインを含み、該細胞は二重特異性親和性分子を発現する。別の態様において、活性化T細胞および標的細胞は、二重特異性親和性分子と結合する。

二重特異性親和性分子のいずれかの親和性ドメインは、標的細胞抗原または活性化T細胞抗原に対する親和性を有しうるような、小分子抗原結合ドメインを含みうる。1つの態様において、標的細胞抗原に結合できる親和性ドメインは、小分子抗原結合ドメイン、および抗体の抗原結合ドメインからなる群より選択される。別の態様において、活性化T細胞抗原に結合できる親和性ドメインは、小分子抗原結合ドメイン、および抗体の抗原結合ドメインからなる群より選択される。さらに別の態様において、二重特異性親和性分子は、標的細胞抗原に対する親和性を有する小分子抗原結合ドメインおよび活性化T細胞抗原に対する親和性を有する小分子抗原結合ドメインを含む。1つの態様において、二重特異性親和性分子は、標的細胞抗原に対する親和性を有する小分子抗原結合ドメイン、および活性化T細胞抗原に対する親和性を有する抗体の抗原結合ドメインを含む。別の態様において、二重特異性親和性分子は、標的細胞抗原に対する親和性を有する抗体の抗原結合ドメインおよび活性化T細胞抗原に対する親和性を有する小分子抗原結合ドメインを含む。

いくつかの態様において、二重特異性親和性分子の小分子抗原結合ドメインは、抗体模倣体またはその断片を含む。二重特異性親和性分子の小分子抗原結合ドメインは一般に、約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸を有するペプチドである。小分子のモル質量は、約10 kD未満のような、単一ドメイン抗体に満たなくてもよい。1つの態様において、二重特異性親和性分子は、約10 kD未満である小分子抗原結合ドメインを含む。

親和性ドメインが小分子抗原結合ドメインである場合、小分子は、約12 kD、11 kD、10 kD、9 kD、8 kD、7 kD、6 kD、5 kDもしくはそれらの間の任意のモル質量未満であるか、またはそれ未満のモル質量を有しうる。標的細胞抗原に対する親和性を有する小分子抗原結合ドメインのモル質量は、活性化T細胞抗原に対する親和性を有する小分子抗原結合ドメインのモル質量よりも多くてもまたは少なくてもよい。小分子抗原結合ドメインはまた、ジスルフィド架橋を欠くヘリックス構造を含んでもよい。いくつかの小分子抗原結合ドメインは、少なくとも1つのアルファヘリックス、2つのアルファヘリックス、3つのアルファヘリックスまたはそれ以上を含む。小分子抗原結合ドメインはまた、化学的に不活性であり、約85℃またはそれ以上のような高温に耐えることが可能でありうる。

別の態様において、二重特異性親和性分子をコードする核酸は、親和性ドメイン間にリンカーまたはスペーサーをさらに含みうる。本明細書において用いられる場合、「リンカー」または「スペーサー」という用語は一般に、1つの親和性ドメインを別の親和性ドメインに、どちらかの小分子抗原結合ドメインを別の小分子抗原結合ドメインにまたは小分子抗原結合ドメインを抗体抗原結合ドメインに連結するよう機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。スペーサーまたはリンカーは、300個までのアミノ酸、好ましくは10～100個のアミノ酸、最も好ましくは25～50個のアミノ酸を含みうる。

本発明は、特定の親和性ドメインのみの使用によって限定されない。むしろ、任意の親和性ドメインを用いることができる。二重特異性親和性分子はまた、少なくとも1つの標的細胞抗原に対する特異性を有する膜タンパク質として発現されうる。標的細胞抗原の例は、本明細書の他の箇所に記述されており、これらの全てが本発明の二重特異性親和性分子によって標的とされうる。

1つの態様において、二重特異性親和性分子は、抗体の抗原結合ドメインを含む。ヒト抗体およびヒト化抗体またはその断片を作製するための技法は、本明細書の他の箇所にも記述されている。この態様において、抗体抗原結合ドメインは、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、一本鎖可変断片、単一ドメイン抗体、その抗原結合断片、およびそれらの任意の組み合わせを含む。

1つの局面において、本発明は、標的細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインと活性化T細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインとを含む二重特異性親和性分子をコードする核酸を含む改変細胞の集団を含み、ここで、少なくとも1つの親和性ドメインは小分子抗原結合ドメインを含み、かつ、該細胞の集団は二重特異性親和性分子を発現する。改変細胞の集団は、T細胞、B細胞もしくはナチュラルキラー細胞のような、リンパ球; 抗原提示細胞、または非リンパ球を含む。1つの態様において、細胞の集団は、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、または抗原提示細胞を含む。

別の局面において、本発明は、標的細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインと活性化T細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインとを含む二重特異性親和性分子をコードする核酸を含む改変細胞を含み、ここで、少なくとも1つの親和性ドメインは小分子抗原結合ドメインを含み、かつ、該細胞は二重特異性親和性分子を発現する。改変細胞は、T細胞、B細胞もしくはナチュラルキラー細胞のような、リンパ球; 抗原提示細胞; または非リンパ球より選択されうる。1つの態様において、細胞は、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、または抗原提示細胞である。

さらに別の局面において、本発明は、細胞の集団に、標的細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインと活性化T細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインとを含む二重特異性親和性分子をコードする核酸を導入する段階を含む、改変細胞を作製する方法を含む。この態様において、少なくとも1つの親和性ドメインは小分子抗原結合ドメインを含み、かつ該細胞は二重特異性親和性分子を発現する。1つの態様において、細胞の集団は、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、または抗原提示細胞を含む。二重特異性親和性分子を操作および発現するための技法には、Affibody(商標)分子の操作(Lofblom et. al., FEBS Letters 584: 2670 (2010); Feldwisch et. al., J Mol Biol, 398(2): 232 (2010); 米国特許第8,501,909号、同第8,426,557号、同第8,247,375号および同第7,993,650号; ならびに米国特許出願公開第2014/0295521号を参照のこと)、および「ノブ・イン・ホール」技術(例えば、米国特許第5,731,168号を参照のこと)が含まれるが、これらに限定されることはない。多重特異性抗体はまた、抗体Fc-ヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果(electrostatic steering effect)を操作すること(WO 2009/089004A1)により; 2つまたはそれ以上の抗体または断片を架橋すること(例えば、米国特許第4,676,980号およびBrennan et al., Science 229:81 (1985)を参照のこと)により; ロイシンジッパーを用いて二重特異性抗体を産生すること(例えば、Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)を参照のこと)により; 二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術を用いること(例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照のこと)により; ならびに一本鎖Fv (scFv)二量体を用いること(例えばGruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照のこと)により; ならびに例えば、Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記述されているように三重特異性抗体を調製することにより作製されうる。「オクトパス(Octopus)抗体」を含めて、3つまたはそれ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体も、本明細書に含まれる(例えば、US 2006/0025576A1を参照のこと)。二重特異性抗体は、2つの異なる抗体またはその一部分を連結することによって構築することができる。例えば、二重特異性親和性分子の親和性ドメインの1つは、抗体由来のFab、F(ab')₂、Fab'、scFvまたはsdAbを含むことができる。

1つの態様において、二重特異性親和性分子は、標的細胞抗原に結合できる親和性ドメインを含む。標的細胞抗原は、標的細胞を規定する任意のタイプのリガンドまたは抗原を含みうる。例えば、標的細胞抗原は、標的細胞上の細胞マーカーとして作用し、かつ特定の疾患状態に関連するリガンドを認識するように選択されうる。したがって、標的細胞抗原の例としては、ウイルス、細菌および寄生虫の感染、病的状態、自己免疫疾患ならびにがん細胞に関連するものが挙げられる。

1つの態様において、標的細胞抗原は、任意の腫瘍関連抗原(TAA)、細菌抗原、寄生虫抗原、ウイルス抗原、およびその任意の断片を含む。親和性ドメインが抗体の抗原結合ドメインである場合、抗体の抗原結合ドメインは、標的細胞抗原に特異的に結合する、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、一本鎖可変断片、単一ドメイン抗体、その抗原結合断片、およびそれらの任意の組み合わせのような、抗体を含みうる。

別の態様において、二重特異性親和性分子は、活性化T細胞抗原に結合できる親和性ドメインを含む。活性化T細胞抗原は、別の細胞を活性化できるT細胞の表面に見られる抗原を含む。活性化T細胞抗原は、共刺激分子を含みうる。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体でもそのリガンドでもない細胞表面分子である。そのような分子の例としては、CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3およびCD83特異的結合リガンドなどが挙げられる。他の共刺激エレメントも本発明の範囲内である。

さらに別の態様において、活性化T細胞抗原は、CD3、CD4、CD8、T細胞受容体(TCR)、またはその任意の断片である。この態様において、二重特異性抗体および/またはBiTE分子は、活性化T細胞抗原に特異的に結合する、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、一本鎖可変断片、単一ドメイン抗体、その抗原結合断片、およびそれらの任意の組み合わせのような、抗体を含む。活性化T細胞抗原の例としては、抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗TCR、およびその断片が挙げられうる。

キメラリガンド改変活性化受容体
本発明は、キメラリガンド改変活性化受容体を有するT細胞を含む。1つの局面において、本発明は、T細胞の集団を拡大する段階、およびキメラリガンド改変活性化受容体(CLEAR)をコードする核酸を導入する段階を含む、改変T細胞を作製するための方法を含む。この態様において、T細胞はCLEARを発現することができる。

CLEARは、一般に、リガンド認識のための細胞外ドメインおよび活性化シグナル伝達のための細胞内ドメインから構成される。1つの態様において、CLEARは、細胞内活性化ドメインおよび細胞外ドメインを含む。

細胞外ドメインは、抗体、受容体、リガンド、または他の結合分子による認識のために操作することができる。1つの態様において、細胞外ドメインは、健常な細胞または組織によって正常に発現されない腫瘍抗原または分子のいずれかに特異的に結合する。腫瘍抗原または異常な分子の例としては、ウイルス抗原、細菌抗原および寄生虫抗原、腫瘍関連抗原(TAA)またはその任意の断片が挙げられるが、これらに限定されることはない。1つの態様において、細胞外ドメインは、抗体の抗原結合ドメイン、受容体のリガンド結合ドメイン、抗原、またはリガンドより選択される。別の態様において、細胞外ドメインは、CD27、CD28、CD70、CD80、PD1、またはPD-L1より選択される。さらに別の態様において、細胞外ドメインは腫瘍抗原に結合することができる。

細胞内ドメインは、T細胞内で活性化シグナルをもたらすように操作することができる。細胞内ドメインの例としては、CD3由来の細胞内ドメイン、共刺激シグナルを有するまたは有しないCD3ゼータ、CD28、CD4、CD8、4-1BB、TCRアルファ鎖および/もしくはベータ鎖、またはそれらの細胞内ドメインのいずれかの断片が挙げられるが、これらに限定されることはない。1つの態様において、細胞内活性化ドメインは、CD3ゼータの細胞内活性化ドメインを含む。別の態様において、T細胞内でもたらされる活性化シグナルは、増殖、サイトカイン産生、溶解活性、およびT細胞の他の活性を誘導する陽性シグナルでありうる。さらに別の態様において、T細胞内でもたらされる活性化シグナルは、増殖を阻害する、老化および/またはアネルギーを誘導する、サイトカイン産生を阻害するような、T細胞内の活性、ならびにT細胞の他の活性をシャットダウンする陰性シグナルでありうる。

別の態様において、CLEARは共刺激ドメインを含む。分子由来の共刺激ドメインには、CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3およびCD83特異的結合リガンドなどが含まれるが、これらに限定されることはない。他の共刺激エレメントも本発明の範囲内である。

共刺激分子
1つの態様において、本発明の改変T細胞は、改変T細胞が共刺激分子を発現するような、共刺激分子をコードする核酸をさらに含む。核酸は、T細胞に形質導入を行うか、T細胞にトランスフェクションを行うか、またはT細胞にエレクトロポレーションを行うことにより、T細胞に導入されうる。別の態様において、共刺激分子は、CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1およびPD1Lより選択される。さらに別の態様において、共刺激分子はCD3であり、かつCD3はCD3ゼータ鎖およびCD3イプシロン鎖のような、少なくとも2つの異なるCD3鎖を含む。例示的な態様において、CD3のような、共刺激分子をコードするRNAは、T細胞中または細胞中にエレクトロポレーションされる。別の態様において、CD3 RNAのような、共刺激分子をコードする核酸は、親和性分子キメラ受容体をコードする核酸またはRNAのような、別の核酸とコエレクトロポレーションされる。

別の態様において、TCRは、CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1およびPD1L由来の少なくとも1つのドメインより選択される共刺激ドメインを含むように改変される。

核酸の導入
細胞に核酸を導入する方法には、物理的方法、生物学的方法および化学的方法が含まれる。RNAのような、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。エレクトロポレーション(Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany))、(ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.)またはGene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.)、Multiporator (Eppendort, Hamburg Germany)を含む市販の方法を用いて、RNAを標的細胞に導入することができる。リポフェクションを用いたカチオン性リポソーム媒介トランスフェクションを用いて、ポリマーカプセル化を用いて、ペプチド媒介トランスフェクションを用いて、または「遺伝子銃」のような微粒子銃粒子送達系を用いて、RNAを細胞に導入することもできる(例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)を参照のこと)。

関心対象のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法には、DNAおよびRNAベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、および特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞に遺伝子を挿入するための最も広く使われている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来しうる。例えば、米国特許第5,350,674号および同第5,585,362号を参照されたい。

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段には、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズのような、コロイド分散系、ならびに水中油型乳剤、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含めて脂質に基づく系が含まれる。インビトロおよびインビボでの送達媒体として用いるための例示的なコロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。

使用に適した脂質は、商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(「DMPC」)は、Sigma, St. Louis, MOから得ることができ; リン酸ジセチル(「DCP」)は、K & K Laboratories (Plainview, NY)から得ることができ; コレステロール(「Choi」)は、Calbiochem-Behringから得ることができ; ジミリスチルホスファチジルグリセロール(「DMPG」)および他の脂質は、Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL)から得られうる。クロロホルムまたはクロロホルム/メタノール中の脂質のストック溶液は、約-20℃で保存することができる。クロロホルムはメタノールよりも容易に蒸発するので、唯一の溶媒として用いられる。「リポソーム」は、密閉された脂質二重層または凝集体の生成によって形成される種々の単層状および多層状脂質媒体を包含する一般用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部水性媒体を有する小胞構造を有すると特徴付けることができる。多層状リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質を過剰の水溶液に懸濁させると、自発的に形成される。脂質成分は閉鎖構造の形成前に自己再構成を受け、脂質二重層の間に水および溶解溶質を閉じ込める(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10)。しかしながら、通常の小胞構造とは溶液中で異なる構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造をとり、または脂質分子の不均一な凝集体として単に存在しうる。リポフェクトアミン-核酸複合体も企図される。

外因性核酸を宿主細胞に導入するために、またはその他の方法で本発明の阻害剤に細胞を曝露するために用いられる方法にかかわらず、宿主細胞における核酸の存在を確認するために、種々のアッセイ法が実施されうる。そのようなアッセイ法には、例えば、サザンおよびノザンブロッティング、RT-PCRおよびPCRのような、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ法; 例えば、免疫学的手段(ELISAおよびウエスタンブロット)によって、または本発明の範囲に入る薬剤を同定するための本明細書において記述されるアッセイ法によって、特定のペプチドの存在または非存在を検出するような「生化学的」アッセイ法が含まれる。

1つの態様において、標的細胞上の抗原に対する親和性を含むT細胞受容体(TCR)をコードする核酸がT細胞に導入される。核酸は、拡大されたT細胞の形質導入、拡大されたT細胞のトランスフェクション、および拡大されたT細胞のエレクトロポレーションのような、任意の手段によって導入されうる。

別の態様において、親和性分子キメラ受容体または二重特異性親和性分子をコードする核酸は、細胞集団の形質導入、細胞集団のトランスフェクション、および細胞集団のエレクトロポレーションからなる群より選択される方法によって導入される。

別の態様において、細胞集団の形質導入、細胞集団のトランスフェクション、および細胞集団のエレクトロポレーションからなる群より選択される方法により、細胞集団へ、標的細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインと活性化T細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインとを含む二重特異性親和性分子をコードする核酸を入れる。

さらに別の態様において、BiTE分子のような、二重特異性抗体をコードする核酸がT細胞に導入される。核酸は、拡大されたT細胞の形質導入、拡大されたT細胞のトランスフェクション、および拡大されたT細胞のエレクトロポレーションのような、任意の手段によって導入されうる。

RNA
1つの態様において、T細胞に導入される核酸はRNAである。別の態様において、RNAは、インビトロで転写されたRNAまたは合成RNAを含むmRNAである。RNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)生成された鋳型を用いたインビトロ転写によって産生される。任意の供給源由来の関心対象のDNAは、適切なプライマーおよびRNAポリメラーゼを用いてインビトロmRNA合成のための鋳型にPCRによって直接変換することができる。DNA供給源は、例えば、ゲノムDNA、プラスミドDNA、ファージDNA、cDNA、合成DNA配列または任意の他の適切なDNA供給源であることができる。インビトロ転写のための所望の鋳型は、キメラ膜タンパク質である。例として、鋳型は、抗体、抗体の断片または抗体の一部分をコードする。別の例として、鋳型は、抗CD3のような、抗体の一本鎖可変ドメインを含む細胞外ドメイン、および共刺激分子の細胞内ドメインを含む。1つの態様において、RNAキメラ膜タンパク質の鋳型は、共刺激分子に対する抗体に由来する抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインと、CD28および4-1BBの細胞内ドメインの一部分に由来する細胞内ドメインとを含むキメラ膜タンパク質をコードする。

PCRを用いてインビトロでのmRNA転写のための鋳型を作製することができ、これが次いで、細胞に導入される。PCRを実施するための方法は、当技術分野において周知である。PCRで用いるためのプライマーは、PCRの鋳型として用いられるDNAの領域に実質的に相補的な領域を有するようにデザインされる。本明細書において用いられる「実質的に相補的」とは、プライマー配列中の塩基の大部分または全部が相補的であるか、または1つもしくは複数の塩基が非相補的である、もしくはミスマッチであるヌクレオチドの配列をいう。実質的に相補的な配列は、PCRに用いられるアニーリング条件の下で、意図されたDNA標的とアニールまたはハイブリダイズすることができる。プライマーは、DNA鋳型の任意の部分に実質的に相補的であるようにデザインすることができる。例えば、プライマーは、5'および3' UTRを含む、細胞内で通常転写される遺伝子の部分(読み取り枠)を増幅するようにデザインすることができる。プライマーは、関心対象の特定ドメインをコードする遺伝子の一部分を増幅するようにデザインすることもできる。1つの態様において、プライマーは、5'および3' UTRの全部または一部分を含むヒトcDNAのコード領域を増幅するようにデザインされる。PCRに有用なプライマーは、当技術分野において周知である合成方法によって作製される。「フォワードプライマー」は、増幅されるDNA配列の上流にあるDNA鋳型上のヌクレオチドと実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「上流」とは、コード鎖に対して増幅されるDNA配列の、5'側の位置をいうように本明細書において用いられる。「リバースプライマー」は、増幅されるDNA配列の下流にある二本鎖DNA鋳型と実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「下流」とは、コード鎖に対して増幅されるDNA配列の、3'側の位置をいうように本明細書において用いられる。

RNAの安定性および/または翻訳効率を促進する能力を有する化学構造が用いられてもよい。RNAは、好ましくは5'および3' UTRを有する。1つの態様において、5' UTRは長さが0～3000ヌクレオチドである。コード領域に付加される5'および3' UTR配列の長さは、UTRの異なる領域にアニールするPCRのためのプライマーをデザインすることを含むが、これに限定されない、異なる方法によって変化させることができる。この手法を用いて、当業者は、転写されたRNAのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を達成するために必要とされる5'および3' UTRの長さを変えることができる。

5'および3' UTRは関心対象の遺伝子の、天然に存在する内因性5'および3' UTRであることができる。あるいは、関心対象の遺伝子に対して内因性ではないUTR配列を、フォワードプライマーおよびリバースプライマーにUTR配列を組み入れることによって、または鋳型の他の任意の改変によって付加することができる。関心対象の遺伝子に対して内因性ではないUTR配列の使用は、RNAの安定性および/または翻訳効率を変化させるのに有用であることができる。例えば、3' UTR配列中のAUに富むエレメントはmRNAの安定性を低下させうることが知られている。それゆえ、当技術分野において周知であるUTRの特性に基づいて転写されたRNAの安定性を増加させるように、3' UTRを選択またはデザインすることができる。

1つの態様において、5' UTRは、内因性遺伝子のコザック(Kozak)配列を含むことができる。あるいは、関心対象の遺伝子に対して内因性ではない5' UTRが上記のようにPCRによって付加される場合、コンセンサスコザック配列は、5' UTR配列を付加することによって再デザインすることができる。コザック配列は、いくつかのRNA転写産物の翻訳効率を高めることができるが、効率的な翻訳を可能にするために全てのRNAに必要とされるようではない。多くのmRNAに対してのコザック配列の必要性は、当技術分野において公知である。他の態様において、5' UTRは、そのRNAゲノムが細胞内で安定なRNAウイルスに由来することができる。他の態様において、mRNAのエキソヌクレアーゼ分解を妨げるために、様々なヌクレオチド類似体を3'または5' UTRにおいて用いることができる。

遺伝子クローニングを必要とせずにDNA鋳型からRNAの合成を可能にするために、転写のプロモーターはDNA鋳型に対して、転写される配列の上流に付け加えられるべきである。RNAポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの5'末端に付加される場合、RNAポリメラーゼプロモーターは、転写される読み取り枠の上流でPCR産物に組み入れられるようになる。1つの態様において、プロモーターは、本明細書の他の箇所に記述されるように、T7ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターには、T3およびSP6 RNAポリメラーゼプロモーターが含まれるが、これらに限定されることはない。T7、T3およびSP6プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は、当技術分野において公知である。

1つの態様において、mRNAは、リボソーム結合、細胞内でのmRNAの翻訳開始および安定性を決定する5'末端のキャップおよび3'ポリ(A)尾部の両方を有する。環状DNA鋳型、例えば、プラスミドDNAでは、RNAポリメラーゼは真核細胞での発現には適さない長い鎖状体の生成物を産生する。3' UTRの末端で線状化されたプラスミドDNAの転写は、転写後にポリアデニル化されても真核生物のトランスフェクションにおいて効果的ではない正常なサイズのmRNAをもたらす。

直鎖状DNA鋳型上で、ファージT7 RNAポリメラーゼは鋳型の最後の塩基を越えて転写産物の3'末端を伸長させることができる(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)。

DNA鋳型へのポリA/Tストレッチの組み込みの従来の方法は、分子クローニングである。しかしながら、プラスミドDNAに組み込まれたポリA/T配列は、プラスミドの不安定性を引き起こすことがあり、その理由は、細菌細胞から得られたプラスミドDNA鋳型が、欠失および他の異常で高度に損なわれていることが多いためである。これにより、クローニング手順は面倒で時間がかかるだけでなく、信頼できないことも多い。それが、クローニングなしにポリA/T 3'ストレッチを有するDNA鋳型の構築を可能にする方法が非常に望ましいという理由である。

転写DNA鋳型のポリA/Tセグメントは、100T尾部(サイズは50～5000 Tであることができる)のようなポリT尾部を含むリバースプライマーを用いることによってPCR中に、またはDNAライゲーションもしくはインビトロ組み換えを含むが、これらに限定されない、任意の他の方法によってPCR後に産生することができる。ポリ(A)尾部はまた、RNAに安定性を与え、RNAの分解を低減させる。一般に、ポリ(A)尾部の長さは、転写されたRNAの安定性と正の相関がある。1つの態様において、ポリ(A)尾部は、100～5000個のアデノシンである。

RNAのポリ(A)尾部は、大腸菌(E. coli)ポリAポリメラーゼ(E-PAP)のような、ポリ(A)ポリメラーゼを用いてインビトロ転写後にさらに伸長することができる。1つの態様において、ポリ(A)尾部の長さを100ヌクレオチドから300～400ヌクレオチドに増加させると、RNAの翻訳効率が約2倍増加する。さらに、異なる化学基の3'末端への結合は、mRNA安定性を増加させることができる。そのような結合は改変された/人工のヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含むことができる。例えば、ATP類似体は、ポリ(A)ポリメラーゼを用いてポリ(A)尾部に組み入れることができる。ATP類似体はRNAの安定性をさらに増すことができる。

5'キャップもRNA分子に安定性をもたらす。好ましい態様において、本明細書において開示される方法により産生されるRNAは、5'キャップを含む。5'キャップは、当技術分野において知られ、本明細書において記述されている技法を用いて提供される(Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005))。

本明細書において開示される方法によって産生されるRNAは、内部リボソーム侵入部位(IRES)配列を含むこともできる。IRES配列は、mRNAとのキャップ非依存性リボソーム結合を開始させ、翻訳の開始を容易にする任意のウイルス配列、染色体配列または人為的にデザインされた配列でありうる。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、酸化防止剤、および界面活性剤のような細胞透過性および生存性を促進する因子を含有できる、細胞エレクトロポレーションに適した任意の溶質を含めることができる。

開示された方法は、遺伝子操作されたT細胞が標的がん細胞を死滅させる能力の評価を含めて、がん、幹細胞、急性および慢性感染症ならびに自己免疫疾患の分野において、基礎研究および療法におけるT細胞活性の調節に適用することができる。

本方法はまた、例えば、プロモーターまたは投入RNAの量を変化させることにより、広範囲にわたって発現レベルを制御する能力を提供し、発現レベルを個別に調節することを可能にする。さらに、PCRに基づくmRNA産生の技法は、異なる構造およびそれらのドメインの組み合わせを有するキメラ受容体mRNAのデザインを非常に容易にする。例えば、同じ細胞内の複数のキメラ受容体上の異なる細胞内エフェクター/共刺激因子ドメインの変動は、多抗原標的に対する最高レベルの細胞傷害性、および同時に正常細胞に対する最低の細胞傷害性を評価する受容体の組み合わせの構造の判定を可能にする。

本発明のRNAトランスフェクション方法の1つの利点は、RNAトランスフェクションが本質的に一過性で、ベクター不含であることである。RNA導入遺伝子は、いかなる追加のウイルス配列も必要とせずに最小の発現カセットとして、リンパ球に送達され、簡単なインビトロでの細胞活性化後にその中で発現されることができる。これらの条件下では、宿主細胞ゲノムへの導入遺伝子の組み込みは起こる可能性が低い。RNAのトランスフェクションの効率およびリンパ球集団全体を均一に改変する能力のため、細胞のクローニングは必要ではない。

インビトロで転写されたRNA (IVT-RNA)を用いたT細胞の遺伝的改変では、2つの異なる戦略を利用し、そのどちらも様々な動物モデルにおいて逐次的に試験されている。リポフェクションまたはエレクトロポレーションによって細胞に、インビトロで転写されたRNAをトランスフェクションする。移入されたIVT-RNAの長期発現を達成するために、様々な改変を用いてIVT-RNAを安定化することが望ましい。

いくつかのIVTベクターは、文献において公知であり、これはインビトロ転写のための鋳型として標準化された様式で利用され、安定化されたRNA転写産物が産生されるように遺伝子操作されている。現在、当技術分野において用いられているプロトコルは、以下の構造: RNA転写を可能にする5' RNAポリメラーゼプロモーター、その後に非翻訳領域(UTR)が3'側および/または5'側のいずれかで隣接した関心対象の遺伝子、ならびに50～70個のAヌクレオチドを含む3'ポリアデニルカセットを有するプラスミドベクターに基づく。インビトロ転写に先立ち、環状プラスミドは、II型制限酵素によってポリアデニルカセットの下流で線状化される(認識配列は切断部位に対応する)。したがってポリアデニルカセットは、転写産物中の後のポリ(A)配列に対応する。この手順の結果として、一部のヌクレオチドは、線状化後に酵素切断部位の一部として残り、3'末端でポリ(A)配列を伸長またはマスクする。この非生理的な突出部が、そのような構築体から細胞内に産生されるタンパク質の量に影響を与えるかどうかは、明らかではない。

RNAは、より伝統的なプラスミドまたはウイルス手法に比べていくつかの利点を有する。RNA供給源からの遺伝子発現は転写を必要とせず、タンパク質産物はトランスフェクション後に迅速に産生される。さらに、RNAは核ではなく、細胞質に接近しさえすればよいため、ゆえに、典型的なトランスフェクション法で極めて高いトランスフェクション率が得られる。さらに、プラスミドに基づく手法では、関心対象の遺伝子の発現を駆動するプロモーターが、研究中の細胞において活性であることが必要とされる。

別の局面において、RNA構築体はエレクトロポレーションによって細胞に送達される。例えば、米国特許第2004/0014645号、米国特許第2005/0052630A1号、米国特許第2005/0070841A1号、米国特許第2004/0059285A1号、米国特許第2004/0092907A1号に教示されているように哺乳動物細胞への核酸構築体のエレクトロポレーションの製剤および方法論を参照されたい。任意の既知の細胞型のエレクトロポレーションに必要な電場強度を含む様々なパラメータは、関連する研究文献ならびに当技術分野における多数の特許および出願において一般的に知られている。例えば、米国特許第6,678,556号、米国特許第7,171,264号、および米国特許第7,173,116号を参照されたい。エレクトロポレーションの治療的適用のための装置は、例えばMedPulser(商標) DNAエレクトロポレーション治療システム(DNA Electroporation Therapy System) (Inovio/Genetronics, San Diego, Calif.)のように市販されており、米国特許第6,567,694号; 米国特許第6,516,223号、米国特許第5,993,434号、米国特許第6,181,964号、米国特許第6,241,701号、および米国特許第6,233,482号のような特許に記述されており; エレクトロポレーションは、例えば米国特許第20070128708A1号に記述されているようにインビトロでの細胞のトランスフェクションのために用いることもできる。エレクトロポレーションは、インビトロで細胞に核酸を送達するために利用することもできる。したがって、当業者に公知の多くの利用可能な装置およびエレクトロポレーションシステムのいずれかを利用する発現構築体を含めて核酸の細胞へのエレクトロポレーション介在性の投与は、関心対象のRNAを標的細胞に送達するための素晴らしい新たな手段となる。

いくつかの態様において、TCRをコードするRNAが細胞中にエレクトロポレーションされる。1つの態様において、TCRをコードするRNAは、インビトロで転写されたRNAである。いくつかの態様において、二重特異性抗体をコードするmRNAが細胞にエレクトロポレーションされる。別の態様において、二重特異性抗体をコードするmRNAは、インビトロで転写されたmRNAである。

いくつかの態様において、二重特異性抗体をコードするRNAが細胞にエレクトロポレーションされる。1つの態様において、二重特異性抗体をコードするRNAは、インビトロで転写されたRNAである。

いくつかの態様において、親和性分子キメラ受容体または二重特異性親和性分子をコードするRNAが細胞にエレクトロポレーションされる。1つの態様において、親和性分子キメラ受容体または二重特異性親和性分子をコードするRNAは、インビトロで転写されたRNAである。

1つの態様において、本方法は、TCRアルファ鎖およびベータ鎖をコードするRNAをエレクトロポレーションする段階を含む。TCRアルファ鎖およびベータ鎖は、TCRアルファ鎖をコードするRNAおよびTCRベータ鎖をコードする別個のRNAをコエレクトロポレーションするような、同じまたは別個のRNA上にコードされることができる。アルファおよびベータが別個のRNAによってコードされる場合、RNAはコエレクトロポレーションされうる。

いくつかの態様において、本方法は、二重特異性抗体またはBiTE分子をコードする核酸をエレクトロポレーションする段階をさらに含む。二重特異性抗体核酸は、TCR RNAとコエレクトロポレーションされうる。

別の態様において、本方法は、共刺激分子をコードする核酸をエレクトロポレーションする段階をさらに含みうる。共刺激分子核酸は、TCR RNAとコエレクトロポレーションされうる。

1つの態様において、本方法は、親和性分子キメラ受容体をコードするRNAをエレクトロポレーションする段階を含む。別の態様において、本方法は、CD3のような、共刺激分子をコードするRNAをエレクトロポレーションする段階をさらに含む。親和性分子キメラ受容体および共刺激分子は、同じRNAまたは別個のRNA上にコードされることができる。親和性分子キメラ受容体および共刺激分子が別個のRNAによってコードされる場合、RNAはコエレクトロポレーションされうる。

別の態様において、本方法は、二重特異性親和性分子をコードする核酸をエレクトロポレーションする段階を含む。共刺激分子核酸はまた、二重特異性親和性分子核酸とコエレクトロポレーションされうる。

キメラ膜タンパク質
1つの態様において、改変T細胞は、核酸の導入前に拡大される。別の態様において、改変T細胞は、TCRまたは二重特異性抗体またはBiTE分子をコードするRNAでエレクトロポレーションする前に拡大される。T細胞の拡大は、キメラ膜タンパク質をコードするRNAを用いてT細胞にエレクトロポレーションを行うこと、およびエレクトロポレーションされたT細胞を培養することを含みうる。本発明のキメラ膜タンパク質は、細胞外および細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインは、抗体のような、標的特異的結合エレメントを含む。1つの態様において、キメラ膜タンパク質の細胞外ドメインは、TCR、CD3、CD28などを含むが、これらに限定されない、T細胞上の分子を標的とする。

細胞外ドメイン
本発明は、T細胞上の分子に対する抗体またはその断片を含む抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む。この分子は、限定されるものではないが、TCR、CD3、CD28またはそれらの組み合わせのような、T細胞を共刺激する任意の分子を含むことができる。1つの態様において、細胞外ドメインは、抗CD3抗体、抗TCR抗体、抗CD28抗体またはそれらの組み合わせのCD3結合ドメインを含む抗原結合ドメインを含むことができる。

別の態様において、細胞外ドメインは、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、一本鎖可変断片、およびそれらの断片の抗原結合ドメインを含むが、これらに限定されない、抗原に結合する抗体の任意の断片を含むことができる。場合によっては、細胞外ドメインは、キメラ膜タンパク質が最終的に使用される同一種に由来することが有益である。例えば、ヒトで用いる場合、キメラ膜タンパク質の細胞外ドメインは、ヒト抗体またはその断片を含むことが有益でありうる。したがって、1つの態様において、細胞外ドメインは、ヒト抗体またはその断片を含む。

1つの態様において、抗体は、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、一本鎖可変断片、およびそれらの抗原結合断片である。

細胞内ドメイン
細胞内ドメインまたは細胞質ドメインは、共刺激シグナル伝達領域を含む。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインをいう。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体でもそのリガンドでもない細胞表面分子である。

キメラ膜タンパク質の細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、T細胞のエフェクター機能の少なくとも1つの活性化に関与している。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊化した機能をいう。例えば、T細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性でありうる。したがって「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊化した機能を細胞に行わせるタンパク質の部分をいう。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を利用することができるが、多くの場合には、鎖全体を用いる必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が用いられる限り、そのような切断部分は、エフェクター機能シグナルを伝達しさえすれば、無傷の鎖の代わりに用いられうる。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むよう意図される。

キメラ膜タンパク質で用いるための細胞内シグナル伝達ドメインの非限定的な例としては、CD28、4-1BB、T細胞受容体(TCR)、共刺激分子、これらの配列の任意の誘導体または変種、同じ機能的能力を有する任意の合成配列、およびそれらの任意の組み合わせの細胞内ドメインの任意の断片が挙げられる。

キメラ膜タンパク質の他のドメイン
キメラ膜タンパク質の細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間に、またはキメラ膜タンパク質の細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間に、スペーサードメインが組み入れられてもよい。本明細書において用いられる場合、「スペーサードメイン」という用語は一般に、膜貫通ドメインを細胞外ドメインまたは、ポリペプチド鎖中の細胞質ドメインのいずれかに連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、300個までのアミノ酸、好ましくは10～100個のアミノ酸および最も好ましくは25～50個のアミノ酸を含みうる。

いくつかの態様において、キメラ膜タンパク質は膜貫通ドメインをさらに含む。いくつかの態様において、キメラ膜タンパク質はヒンジドメインをさらに含む。1つの態様において、キメラ膜タンパク質をコードするmRNAは、CD28膜貫通ドメインおよびCD8アルファヒンジドメインのような、膜貫通ドメインおよびヒンジドメインをさらに含む。

ヒト抗体
ヒトにおける抗体のインビボでの使用のためには、ヒト抗体を用いることが好ましい場合がある。完全ヒト抗体は、ヒト対象の治療的処置に特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いるファージディスプレイ法を含む当技術分野において公知の種々の方法により、これらの技法の改良を含めて、作製することができる。また、米国特許第4,444,887号および同第4,716,111号; ならびにPCT公開WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735およびWO 91/10741を参照されたく; これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。ヒト抗体はまた、重鎖および軽鎖が、ヒトDNAの1つまたは複数の供給源に由来するヌクレオチド配列によってコードされる抗体であることができる。

ヒト抗体はまた、機能的な内因性免疫グロブリンを発現できないが、しかしヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを用いて産生することができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、マウス胚性幹細胞へ無作為にまたは相同組み換えにより導入されうる。あるいは、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域がマウス胚性幹細胞に導入されうる。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組み換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別個にまたは同時に非機能的にされうる。例えば、キメラおよび生殖系列変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子のホモ接合体欠失が、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記述されている。改変された胚性幹細胞を拡大させ、胚盤胞にマイクロインジェクションしてキメラマウスを作製する。次いで、キメラマウスを飼育して、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を産生する。トランスジェニックマウスに、選択された抗原、例えば、本発明のポリペプチドの全部または一部を通常の様式で免疫する。選択の標的に対して作製された抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて、免疫されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスが持つヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、B細胞分化の間に再配列し、引き続いてクラススイッチおよび体細胞突然変異を受ける。したがって、そのような技法を用いて、IgG1 (ガンマ1)およびIgG3を含むが、これらに限定されない、治療的に有用なIgG、IgA、IgMおよびIgE抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、Lonberg and Huszar (Int. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995))を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術ならびにそのような抗体を産生するためのプロトコルに関する詳細な考察については、例えばPCT公開番号WO 98/24893、WO 96/34096およびWO 96/33735; ならびに米国特許第5,413,923号; 同第5,625,126号; 同第5,633,425号; 同第5,569,825号; 同第5,661,016号; 同第5,545,806号; 同第5,814,318号; および同第5,939,598号を参照されたく、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。さらに、Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.)およびGenpharm (San Jose, Calif.)のような企業は、上記と同様の技術を用いて、選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに従事しうる。抗原攻撃によってヒト抗体の産生を引き起こす生殖系列変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入に関する具体的な考察については、例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993); およびDuchosal et al., Nature, 355:258 (1992)を参照されたい。

ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーに由来することもできる(Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan et al., Nature Biotech., 14:309 (1996))。ファージディスプレイ技術(McCafferty et al., Nature, 348:552-553 (1990))を用いて、免疫を受けていないドナー由来の免疫グロブリン可変(V)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体および抗体断片を産生することができる。この技法によれば、抗体Vドメイン遺伝子は、M13またはfdのような、糸状バクテリオファージの主または副コートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片として提示される。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含むので、抗体の機能的特性に基づく選択も、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択をもたらす。したがって、ファージはB細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレイは、種々の形式で行うことができる; その概説については、例えば、Johnson, Kevin S, and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)を参照されたい。V遺伝子セグメントのいくつかの供給源をファージディスプレイに用いることができる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)では、非免疫マウスの脾臓に由来するV遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーから多種多様な抗オキサゾロン抗体が単離された。免疫を受けていないヒトドナー由来のV遺伝子のレパートリーを構築することができ、多種多様な抗原(自己抗原を含む)に対する抗体を、本質的にはMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)またはGriffith et al., EMBO J., 12:725-734 (1993)により記述されている技法にしたがって単離することができる。また、米国特許第5,565,332号および同第5,573,905号を参照されたく、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

ヒト抗体はまた、インビトロで活性化されたB細胞によって作製されうる(米国特許第5,567,610号および同第5,229,275号を参照されたく、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。ヒト抗体はまた、限定されるものではないが、Roderら(Methods Enzymol., 121:140-167 (1986))により記述されているものなどの、ハイブリドーマ技法を用いてインビトロで作製されうる。

ヒト化抗体
あるいは、いくつかの態様において、非ヒト抗体がヒト化され、ここでは抗体の特定の配列または領域が改変されて、ヒトにおいて天然に産生される抗体との類似性を増加させる。1つの態様において、抗原結合ドメインはヒト化される。

「ヒト化」抗体は、元の抗体と同様の抗原特異性を保持する。しかしながら、ヒト化の特定の方法を用いて、ヒトCD3抗原に対する抗体の結合の親和性および/または特異性は、Wu et al., J. Mol. Biol., 294:151 (1999)により記述されているように、「定向進化」の方法を用いて増加されうる。その文献の内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

ヒト化抗体は、ヒトのものではない供給源から、それに導入された1つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「持ち込み(import)」残基といわれることが多く、これは典型的には「持ち込み」可変ドメインから取られる。したがって、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリン分子由来の1つまたは複数のCDRおよびヒト由来のフレームワーク領域を含む。抗体のヒト化は、当技術分野において周知であり、本質的には、Winterおよび共同研究者らの方法(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))にしたがって、げっ歯類CDRまたはCDR配列を、ヒト抗体の対応する配列に置き換えること、すなわち、CDR移植によって行うことができる(EP 239,400; PCT公開番号WO 91/09967; および米国特許第4,816,567号; 同第6,331,415号; 同第5,225,539号; 同第5,530,101号; 同第5,585,089号; 同第6,548,640号、これらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。そのようなヒト化キメラ抗体においては、無傷のヒト可変ドメインに実質的に満たないものが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのCDR残基および場合によってはいくつかのFR残基が、げっ歯類抗体における類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。抗体のヒト化は、ベニアリングもしくは再表面(EP 592,106; EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); およびRoguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994))または鎖シャッフリング(米国特許第5,565,332号)によって達成することもでき、それらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

ヒト化抗体を作製する際に用いられる、軽鎖および重鎖の両方の、ヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減させることである。いわゆる「最良適合」法によれば、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる。げっ歯類のものに最も近いヒト配列が次いで、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク(FR)として受け入れられる(Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)、これらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを用いる。同じフレームワークがいくつかの異なるヒト化抗体に用いられうる(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)、これらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。

抗体は、標的抗原に対する高い親和性および他の好ましい生物学的特性を保持してヒト化することができる。本発明の1つの局面によれば、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列および様々な概念的ヒト化産物の分析プロセスにより調製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の、可能性のある三次元立体配座構造を例示かつ表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらのディスプレイの検査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、標的抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を与える残基の分析が可能になる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増大のような、所望の抗体特性が達成されるように、FR残基をレシピエントおよび持ち込みの配列から選択して組み合わせることができる。一般に、CDR残基は、抗原結合に影響を与えるうえで直接的かつ最も実質的に関与する。

T細胞の供給源
拡大の前に、T細胞の供給源が対象から得られる。対象の非限定的な例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が挙げられる。好ましくは、対象はヒトである。T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、臍帯および腫瘍を含む、いくつかの供給源から得ることができる。ある特定の態様において、当技術分野において利用可能な任意の数のT細胞株が用いられうる。ある特定の態様において、T細胞は、フィコール(Ficoll)分離のような、当業者に公知の任意の数の技法を用いて、対象から収集された血液の単位から得ることができる。1つの態様において、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスまたは白血球除去輸血によって得られる。アフェレーシス生成物は、典型的には、T細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球および血小板を含めて、リンパ球を含む。アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)のような、適切な緩衝液もしくは培地またはその後の加工処理段階のため、カルシウムを欠くかつマグネシウムを欠きうるか、もしくは全部ではないが多くの二価陽イオンを欠きうる洗浄溶液の中に細胞を配してもよい。洗浄後、細胞は、例えば、Ca不含、Mg不含PBSのような、種々の生体適合性緩衝液に再懸濁されうる。あるいは、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分が除去され、細胞は培地に直接再懸濁されうる。

別の態様において、T細胞は、赤血球を溶解し、例えばパーコール(PERCOLL)(商標)勾配を通じた遠心分離によって単球を枯渇させることにより、末梢血から単離される。あるいは、T細胞は臍帯から単離することができる。いずれにせよ、T細胞の特定の亜集団は、陽性または陰性選択技法によってさらに単離することができる。

このように単離された臍帯血単核細胞は、CD34、CD8、CD14、CD19およびCD56を含むが、これらに限定されない、特定の抗原を発現する細胞を枯渇させることができる。これらの細胞の枯渇は、単離された抗体、腹水のような、抗体を含む生体サンプル、物理的支持体に結合した抗体、および細胞結合抗体を用いて達成することができる。

陰性選択によるT細胞集団の濃縮は、陰性選択細胞に特有の表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせを用いて達成することができる。好ましい方法は、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを用いる陰性磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および/または選択である。例えば、陰性選択によりCD4+細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、およびCD8に対する抗体を含む。

陽性または陰性選択による所望の細胞集団の単離のため、細胞および表面(例えば、ビーズのような粒子)の濃度を変えることができる。ある特定の態様において、細胞およびビーズの最大の接触を確実にするために、ビーズおよび細胞が一緒に混合される体積を有意に減少させる(すなわち、細胞の濃度を増加させる)ことが望ましい場合がある。例えば、1つの態様において、20億個の細胞/mlの濃度が用いられる。1つの態様において、10億個の細胞/mlの濃度が用いられる。さらなる態様において、1億個超の細胞/mlが用いられる。さらなる態様において、10、15、20、25、30、35、40、45、または50百万個の細胞/mlの細胞濃度が用いられる。さらに別の態様において、75、80、85、90、95、または100百万個の細胞/mlの細胞濃度が用いられる。さらなる態様において、125または150百万個の細胞/mlの濃度を用いることができる。高濃度を用いることで、細胞収量、細胞活性化、および細胞拡大の増加をもたらすことができる。

T細胞は、単球除去段階を必要としない、洗浄段階の後に凍結することもできる。理論によって束縛されることを望むわけではないが、凍結およびその後の解凍段階は、顆粒球およびある程度は単球を細胞集団中で除去することにより、いっそう均一な生成物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄段階の後、細胞は凍結用溶液中に懸濁されうる。多くの凍結用溶液およびパラメータが当技術分野において公知であり、この文脈において有用であるが、非限定的な例において、1つの方法は、20% DMSOおよび8%ヒト血清アルブミンを含有するPBS、または他の適当な細胞凍結用培地を用いることを伴う。次に、細胞を毎分1℃の割合で-80℃まで凍結させ、液体窒素貯蔵タンクの気相中に貯蔵する。制御凍結の他の方法、ならびに-20℃でまたは液体窒素中での瞬時の無制御凍結が用いられうる。

1つの態様において、T細胞の集団は、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、およびT細胞株のような細胞内に含まれる。別の態様において、末梢血単核細胞は、T細胞の集団を含む。さらに別の態様において、精製されたT細胞は、T細胞の集団を含む。

別の態様において、T細胞は、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、およびT細胞株のような細胞から単離される。別の態様において、本明細書において記述される方法は、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、またはT細胞株からT細胞の集団を単離する段階をさらに含む。

T細胞の拡大
1つの態様において、T細胞を拡大することは、エレクトロポレーションされたT細胞を培養することをさらに含む。別の態様において、エレクトロポレーションされ拡大されるT細胞の供給源は、末梢血単核細胞である。

一般に、T細胞は、CD3/TCR複合体関連シグナルを刺激する作用物質およびT細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを付着させた表面との接触によって拡大する。本発明は、集団内のエレクトロポレーションされたT細胞が少なくとも10倍に拡大するエレクトロポレーションされた集団を培養する段階を含む、エレクトロポレーションされたT細胞の集団を拡大する新規な方法を含む。キメラ膜タンパク質の発現により、集団内の他の細胞との相互作用が、エレクトロポレーションされたT細胞の拡大を刺激かつ活性化することが可能になる。1つの態様において、細胞集団中の少なくとも1つの細胞がCD3を発現する。いずれかの特定の理論に拘束されるわけではないが、CD3を発現する細胞は、エレクトロポレーションされた細胞の表面上に発現されるキメラ膜タンパク質と接触し、結合しうる。キメラ膜タンパク質を発現する少なくとも1つの細胞は、CD3を発現する別の細胞と相互作用しうる。この相互作用は、エレクトロポレーションされたT細胞の拡大を刺激しうる。

あるいは、細胞は、米国特許第5,199,942号(参照により本明細書に組み入れられる)に記述されている方法を用いてエクスビボで拡大することができる。米国特許第5,199,942号に記述されているような、拡大は、本明細書において記述される他の拡大方法に代わるものまたは加えるものであることができる。簡潔には、T細胞のエクスビボ培養および拡大は、米国特許第5,199,942号に記述されているものなどの、細胞成長因子、または急速拡大プロトコル(REP)の場合、例えばDudley et al., J. Immunol., 26(4):332-342, 2003に記述されているものなどの、flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3およびc-kitリガンドのような、他の因子の添加を含む。1つの態様において、T細胞を拡大することは、flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3およびc-kitリガンドからなる群より選択される因子とともにT細胞を培養することを含む。

本明細書において開示されるデータによって実証されるように、本明細書において開示される方法によりエレクトロポレーションされたT細胞を拡大することは、約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍またはそれ以上、ならびにそれらの間の任意のおよび全ての全体的または部分的な整数だけ倍化されうる。1つの態様において、T細胞は約20倍～約50倍の範囲内で拡大する。

培養後、T細胞は培養装置内の細胞培地中で一定時間、または細胞を別の培養装置に通す前に最適な継代のため細胞が集密もしくは高い細胞密度に達するまでインキュベートすることができる。培養装置は、インビトロで細胞を培養するために一般に使用される任意の培養装置のものであることができる。一定時間は、インビトロでの細胞の培養に適した任意の時間であることができる。T細胞培地は、T細胞の培養中にいつでも交換されうる。好ましくは、T細胞培地は約2～3日ごとに交換される。次いでT細胞を培養装置から採取し、T細胞を直ちに使用するか、または凍結保存して後で使用するために貯蔵することができる。1つの態様において、本発明は、拡大されたT細胞を凍結保存することを含む。凍結保存された、拡大されたT細胞は次に、RNAを用いたエレクトロポレーションの前に解凍される。別の態様において、凍結保存されたT細胞は、核酸をT細胞に導入する前に解凍される。

1つの局面において、T細胞を拡大する方法は、T細胞を単離する段階、それに続き、培養する段階に先立ってエレクトロポレーションをさらに含むことができる。別の態様において、本発明は、拡大されたT細胞を凍結保存することをさらに含む。さらに別の態様において、凍結保存されたT細胞は、二重特異性抗体またはBiTE分子をコードするRNAを用いたエレクトロポレーションのために解凍される。さらに別の態様において、凍結保存されたT細胞は、親和性分子キメラ受容体または二重特異性親和性分子核酸を用いた導入のために解凍される。さらに別の態様において、凍結保存されたT細胞は、TCRをコードするRNAを用いたエレクトロポレーションのために解凍される。

本明細書において記述される培養段階(本明細書において記述される作用物質との接触)は、非常に短くてもよく、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22または23時間のような、24時間未満であってもよい。本明細書においてさらに記述される培養段階(本明細書において記述される作用物質との接触)は、もっと長くてもよく、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14またはそれ以上の日数であってもよい。

培養細胞を記述するために、様々な用語が用いられる。細胞培養は、一般に、生物から採取され、制御された条件下で増殖された細胞をいう。初代細胞培養は、生物から直接採取された、かつ最初の継代培養前の、細胞、組織または臓器の培養である。細胞は、細胞増殖および/または分裂を促進する条件の下で増殖培地に入れられた場合、培養で拡大され、より大きな細胞集団をもたらす。細胞が培養で拡大される場合、細胞増殖の速度は、典型的には、倍加時間としても知られる、細胞が倍になるのに必要な時間量によって測定される。

継代培養の各回は、継代といわれる。細胞が継代培養される場合、その細胞は継代されたといわれる。特定の細胞集団、または細胞株は、継代された回数によって言及されるか、または特徴付けられることもある。例えば、10回継代された培養細胞集団は、P10培養といわれうる。初代培養、すなわち、組織からの細胞単離後の最初の培養はP0に指定される。最初の継代培養の後に、細胞は二次培養(P1または継代1)として記述される。第2の継代培養後、細胞は三次培養(P2または継代2)となる、など。継代中に多くの集団倍加が存在しうることが当業者によって理解されよう; それゆえ培養の集団倍加数は継代数よりも多い。継代間の期間中の細胞の拡大(すなわち、集団倍加の数)は、播種密度、基質、培地および継代間の時間を含むが、これらに限定されない、多くの因子に依存する。

1つの態様において、細胞は数時間(約3時間)～約14日間、またはその間の任意の時間単位の整数値の間、培養されうる。T細胞培養に適切な条件には、血清(例えば、ウシ胎仔血清もしくはヒト血清)、インターロイキン-2 (IL-2)、インスリン、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF-βおよびTNF-α、または当業者に公知の細胞増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖および生存に必要な因子を含有しうる適切な培地(例えば、最小必須培地もしくはRPMI培地1640または、X-vivo 15, (Lonza))が含まれる。細胞増殖のための他の添加剤には、界面活性剤、プラスマネート、ならびにN-アセチル-システインおよび2-メルカプトエタノールのような還元剤が含まれるが、これらに限定されることはない。培地は、RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、およびX-Vivo 20、Optimizerにアミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンを添加したものであって、無血清であるか、適切な量の血清(もしくは血漿)もしくは規定のホルモン群、ならびに/またはT細胞の増殖および拡大に十分な量のサイトカインを補充したかのいずれかのものを含むことができる。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的培養物にのみ含められ、対象に注入しようとする細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度(例えば、37℃)および雰囲気(例えば、空気に加えて5% CO₂)の下で維持される。

T細胞を培養するために用いられる培地は、T細胞を共刺激できる作用物質を含みうる。例えば、CD3を刺激できる作用物質はCD3に対する抗体であり、CD28を刺激できる作用物質はCD28に対する抗体である。これは、本明細書において開示されるデータによって実証されるように、本明細書において開示される方法によって単離された細胞は、約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍、またはそれ以上拡大されうるからである。1つの態様において、T細胞は、エレクトロポレーションされた集団を培養することにより約20倍～約50倍、またはそれ以上の範囲内で拡大する。

1つの態様において、本方法は、標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含むT細胞受容体(TCR)をコードする核酸を、拡大されたT細胞に導入する段階、および共刺激分子をコードするRNAをT細胞中にエレクトロポレーションする段階を含み、ここでエレクトロポレーションされたT細胞は、TCRおよび共刺激分子を発現することができる。

1つの態様において、本方法は、CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1およびPD1Lからなる群より選択される少なくとも1つの共刺激分子で、拡大されたT細胞を刺激する段階をさらに含む。刺激は、共刺激分子をコードするRNAとのコエレクトロポレーションを含みうる。そのような態様において、拡大されたT細胞は、CD3をコードするRNAでさらにエレクトロポレーションされまたはコエレクトロポレーションされる。CD3には、CD3ゼータ鎖およびイプシロン鎖のような、少なくとも2つの異なるCD3鎖が含まれる。

別の態様において、T細胞を拡大する方法は、さらなる適用のために拡大されたT細胞を単離する段階をさらに含むことができる。さらに別の態様において、拡大する方法は、培養する段階に先立って拡大されたT細胞の、引き続いてのエレクトロポレーションをさらに含むことができる。引き続いてのエレクトロポレーションは、二重特異性抗体またはBiTE分子のような、作用物質をコードするRNAを、拡大されたT細胞集団にエレクトロポレーションすることを含むことができ、ここで作用物質がT細胞をさらに刺激する。別の態様において、引き続いてのエレクトロポレーションは、TCRをコードする核酸を用いて、拡大されたT細胞に形質導入を行うこと、拡大されたT細胞にトランスフェクションを行うこと、または拡大されたT細胞にエレクトロポレーションを行うことなど、拡大されたT細胞集団に、作用物質をコードする核酸を導入することを含むことができ、該作用物質が、T細胞をさらに刺激する。

作用物質は、さらなる拡大、エフェクター機能、または別のT細胞機能を刺激するなどして、T細胞を刺激しうる。1つの態様において、作用物質核酸は、キメラ膜タンパク質RNAとコエレクトロポレーションされる。別の態様において、二重特異性抗体またはBiTE分子RNAもしくはTCR RNAのような、作用物質核酸は、エレクトロポレーションされた集団を培養した後にエレクトロポレーションされる。

さらなる態様において、二重特異性抗体またはBiTE分子RNAのような、作用物質RNAは、凍結保存されていた拡大されたT細胞にエレクトロポレーションされる。別の態様において、TCR RNAのような、作用物質核酸は、エレクトロポレーションされた集団を培養した後にエレクトロポレーションされる。さらなる態様において、TCR RNなどの作用物質核酸は、凍結保存されていた拡大されたT細胞にエレクトロポレーションされる。

さらに別の態様において、改変T細胞は、二重特異性抗体またはBiTE分子をコードするRNAを用いたエレクトロポレーションの後に凍結保存される。

さらに別の態様において、改変T細胞は、TCRをコードする核酸を用いた導入の後に凍結保存される。

さらに別の態様において、改変T細胞は、キメラリガンド改変活性化受容体(CLEAR)をコードする核酸を用いた導入の後に凍結保存される。

さらに別の態様において、改変T細胞は、親和性分子キメラ受容体をコードする核酸を用いた導入の後に凍結保存される。

さらに別の態様において、改変細胞は、二重特異性親和性分子をコードする核酸を用いた導入の後に凍結保存される。

治療
本明細書において記述される改変T細胞は、治療のための組成物中に含まれうる。組成物は、薬学的組成物を含み、薬学的に許容される担体をさらに含みうる。改変T細胞を含む薬学的組成物の治療的有効量が投与されうる。

1つの局面において、本発明は、有効量の改変T細胞を対象に投与する段階を含む、対象において標的細胞または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法を含む。別の局面において、本発明は、改変T細胞の集団を、対象に有害な免疫反応を予防または処置するためにその必要のある対象に投与する段階を含む、養子細胞移入療法のための方法を含む。さらに別の局面において、本発明は、改変T細胞の集団を、その必要のある対象に投与する段階を含む、対象における免疫の亢進に関連する疾患または状態を処置する方法を含む。

上記局面の1つの態様において、改変T細胞は、拡大されている、かつ標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含む改変T細胞受容体(TCR)をコードするRNAを用いてエレクトロポレーションされている。別の態様において、改変T細胞は、拡大されている、かつ、改変T細胞受容体(TCR)をコードするRNA、ならびに標的細胞上の抗原ならびにCD3、CD4、CD8およびTCRからなる群より選択される活性化T細胞上の抗原に対する二重特異性を含む二重特異性T細胞誘導(BiTE)分子などの二重特異性抗体をコードするRNAを用いて、エレクトロポレーションされている。別の態様において、改変T細胞は、標的細胞上の抗原に対する親和性を有する小分子細胞外ドメインを含む親和性分子キメラ受容体をコードする核酸を含む。別の態様において、改変細胞は、標的細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインと活性化T細胞上の抗原に結合できる親和性ドメインとを含む二重特異性親和性分子をコードする核酸を含み、ここで、少なくとも1つの親和性ドメインは、小分子抗原結合ドメインを含む。別の態様において、改変T細胞は、拡大されている、かつ、キメラリガンド改変活性化受容体(CLEAR)をコードする核酸と、標的細胞上の抗原およびT細胞上のCLEARに対する二重特異性を有する二重特異性抗体をコードする核酸とを導入されている。別の態様において、改変T細胞は、拡大されている、かつ標的細胞上の抗原、ならびにCD3、CD4、CD8およびTCRからなる群より選択される活性化T細胞上の抗原に対する二重特異性を含む二重特異性T細胞誘導(BiTE)分子をコードするRNAを用いてエレクトロポレーションされている。

改変T細胞は、誘導される溶解が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)である場合など、標的細胞または組織の溶解を誘導するために投与されうる。

本明細書において記述されるように作製された改変T細胞は、T細胞機能を保有する。さらに、改変T細胞は、糖尿病、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、GVHD、同種移植寛容誘導増強、移植片拒絶反応などの自己免疫疾患に共通する免疫反応等の免疫反応を抑制するために、哺乳動物、好ましくはヒトに投与することができる。さらに、本発明の細胞は、疾患を処置または緩和するために、減弱されたまたはさもなければ阻害された免疫応答、特に細胞媒介性免疫応答が望ましい任意の状態の処置に用いることができる。1つの局面において、本発明は、改変T細胞の集団を含む治療的有効量の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象において、自己免疫疾患などの状態を処置することを含む。

自己免疫疾患の例としては、後天性免疫不全症候群(AIDS、これは自己免疫成分を伴うウイルス性疾患である)、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、内耳自己免疫病(AIED)、自己免疫性リンパ増殖症候群(ALPS)、自己免疫性血小板減少性紫斑病(ATP)、ベーチェット病、心筋症、セリアック病-疱疹状皮膚炎; 慢性疲労免疫機能不全症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発神経炎(CIPD)、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎(スティル病)、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症(進行性全身性硬化症(PSS)、これは全身性硬化症(SS)としても知られる)、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑ならびにヴェーゲナー肉芽腫症が挙げられるが、これらに限定されることはない。

本明細書において記述されるように作製された改変T細胞は、炎症性障害を処置するために拡大され使用されることもできる。炎症性障害の例としては、慢性および急性炎症性障害が挙げられるが、これらに限定されることはない。炎症性障害の例としては、アルツハイマー病、喘息、アトピー性アレルギー、アレルギー、アテローム性動脈硬化症、気管支喘息、湿疹、糸球体腎炎、移植片対宿主病、溶血性貧血、骨関節炎、敗血症、卒中、組織および臓器の移植、血管炎、糖尿病性網膜症ならびに人工呼吸器誘発肺損傷が挙げられる。

別の態様において、本明細書において記述されるT細胞は、その必要のある対象における免疫応答の処置のための医薬の製造に用いられうる。別の態様において、本発明は、その必要のある対象において免疫応答を処置する方法で用いるための、本明細書において記述される改変細胞を含む。

本発明の細胞は、がんを処置するために、動物、好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくはヒトに投与することができる。さらに、本発明の細胞は、疾患を処置または緩和することが望ましいような、がんに関連する任意の状態の処置、特に腫瘍細胞に対する細胞媒介性免疫応答に用いることができる。がんの例としては、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん、甲状腺がんなどが挙げられるが、これらに限定されることはない。

本発明の細胞は、適切な前臨床および臨床の実験および試験において判定される投与量および経路でならびに時間で投与することができる。細胞組成物は、これらの範囲内の投与量で複数回投与されうる。本発明の細胞の投与は、当業者によって判定される所望の疾患または状態を処置するのに有用な他の方法と組み合わされてもよい。

投与される本発明の細胞は、治療を受けている対象に関して自家、同種異系または異種でありうる。

本発明の細胞の投与は、当業者に公知の任意の簡便な様式で行われうる。本発明の細胞はエアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、植込みまたは移植により対象に投与されうる。本明細書において記述される組成物は患者へ経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、リンパ節内に(intranodally)、髄内に、筋肉内に、静脈内(i.v.)注射により、または腹腔内に投与されうる。他の例では、本発明の細胞は、対象における炎症部位、対象における局所疾患部位、リンパ節、臓器、腫瘍などに直接注射される。

本明細書において記述される細胞は、多くのマトリックスを用いて投与することもできる。本発明では、そのようなマトリックスを、人工リンパ系器官として、典型的にはT細胞の調節によって免疫系を支持、維持または調節するように作用するという新しい状況のなかで利用する。したがって、本発明は、組織工学において有用性が実証されているマトリックス組成物および製剤を利用することができる。したがって、本発明の組成物、装置および方法において使用されうるマトリックスのタイプは、実質的に無限であり、生物学的マトリックスおよび合成マトリックスの両方を含みうる。1つの特定の例では、米国特許第5,980,889号; 同第5,913,998号; 同第5,902,745号; 同第5,843,069号; 同第5,787,900号; または同第5,626,561号によって記載されている組成物および装置が利用され、したがってこれらの特許は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。マトリックスは哺乳動物宿主に投与した場合に生体適合性であることに一般に関係する特徴を含む。マトリックスは天然材料および/または合成材料から形成されてもよい。マトリックスは、インプラントのような、動物の体内に永久的な構造もしくは除去可能な構造を残すことが望ましい場合には、非生分解性であっても; または生分解性であってもよい。マトリックスはスポンジ、インプラント、管、テルファパッド(telfa pad)、繊維、中空糸、凍結乾燥成分、ゲル、粉末、多孔性組成物、またはナノ粒子の形態をとりうる。さらに、マトリックスは、播種された細胞または産生されたサイトカインもしくは他の活性剤の持続放出を可能にするようにデザインすることができる。ある特定の態様において、本発明のマトリックスは可撓性および伸縮性であり、無機塩、水性液および酸素を含む溶存気体剤のような物質を透過させる半固体足場と記述されうる。

本明細書ではマトリックスを生体適合性物質の一例として用いる。しかしながら、本発明はマトリックスに限定されるわけではないので、マトリックスという用語が出てきた場合、これらの用語はいずれも、細胞の保持または細胞の横断を許し、生体適合性であり、その物質の中を高分子が直接横断することを許すのでその物質そのものが半透過性膜であるか、または特定の半透過性物質と一緒に用いることができる、装置および他の物質を含むと読み取られるべきである。

薬学的組成物
本発明の薬学的組成物は、本明細書において記述される改変T細胞集団を、1つまたは複数の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含みうる。そのような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などのような緩衝液; グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストランのような炭水化物、マンニトール; タンパク質; ポリペプチドまたはグリシンのようなアミノ酸; 抗酸化剤; EDTAまたはグルタチオンのようなキレート剤; アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム); および保存料を含みうる。本発明の組成物は、好ましくは、静脈内投与のために製剤化される。

本発明の薬学的組成物は、処置される(または予防される)疾患に適切な様式で投与されうる。臨床試験によって適切な投与量が判定されうるが、投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度のような因子によって判定されよう。

本明細書において記述される改変T細胞を含む薬学的組成物は、10⁴～10⁹個の細胞/kg体重、好ましくは10⁵～10⁶個の細胞/kg体重の投与量で、それらの範囲内の全ての整数値を含めて、投与されうると一般に言及することができる。T細胞組成物はまた、これらの投与量で複数回投与されうる。細胞は、免疫療法において一般に知られている注入技法を用いることにより投与することができる(例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988を参照のこと)。特定の患者に対する最適な投与量および処置計画は、疾患の徴候について患者を監視し、それに応じて処置を調整することにより、医学分野の当業者によって容易に判定されることができる。

ある特定の態様において、活性化T細胞を対象に投与し、続いて血液を再び採血し(またはアフェレーシスを行い)、本発明にしたがってそれからT細胞を活性化し、これらの活性化および拡大されたT細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは数週間ごとに複数回行うことができる。ある特定の態様において、T細胞は、10 ml～400 mlの採血から活性化されうる。ある特定の態様において、T細胞は、20 ml、30 ml、40 ml、50 ml、60 ml、70 ml、80 ml、90 mlまたは100 mlの採血から活性化される。理論によって束縛されるべきではないが、この複数の採血/複数の再注入プロトコルを用いて、T細胞のある特定の集団を選び出すことができる。

本発明のある特定の態様において、本明細書において記述される方法、またはT細胞が治療レベルにまで拡大される当技術分野において公知の他の方法を用いて拡大され改変された細胞は、抗ウイルス療法、シドフォビルおよびインターロイキン-2、シタラビン(ARA-Cとしても公知)またはMS患者に対するナタリズマブ処置もしくは乾癬患者に対するエファリズマブ処置もしくはPML患者に対する他の処置のような薬剤による処置を含むが、これらに限定されない多くの関連処置法と一緒に(例えば、その前に、それと同時にまたはその後に)患者に投与される。さらなる態様において、本発明のT細胞は、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えばサイクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノレートおよびFK506、抗体、または他の免疫除去剤、例えばCAMPATH、抗CD3抗体もしくは他の抗体療法、サイトキシン(cytoxin)、フルダリビン(fludaribine)、サイクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、ならびに放射線照射と併用されてもよい。これらの薬物はカルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害し(サイクロスポリンおよびFK506)、または増殖因子によって誘導されるシグナル伝達に重要なp70S6キナーゼを阻害する(ラパマイシン)。(Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993)。さらなる態様において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、化学療法剤、例えばフルダラビンを用いたT細胞除去療法、外部ビーム放射線療法(XRT)、シクロホスファミド、または抗体、例えばOKT3もしくはCAMPATHと一緒に(例えば、その前に、それと同時にまたはその後に)患者に投与される。別の態様において、本発明の細胞組成物は、CD20と反応する薬剤、例えば、リツキサンのようなB細胞除去療法の後に投与される。例えば、1つの態様において、対象は、高用量化学療法を用いた標準的な処置の後に末梢血幹細胞移植を受けてもよい。ある特定の態様において、移植後に、対象は本発明の拡大された免疫細胞の注入を受ける。さらなる態様において、外科手術の前または後に、拡大された細胞が投与される。

患者に投与される前記処置の投与量は、処置される状態および処置のレシピエントの正確な性質によって変化する。ヒト投与のための投与量の拡大縮小は、当技術分野において認められている実践にしたがって行うことができる。CAMPATHの用量は、例えば、一般的に、成人患者については1～約100 mgの範囲であり、通常、1～30日間、毎日投与される。好ましい一日用量は1～10 mg/日であるが、場合によっては、40 mg/日までの高用量が用いられてもよい(米国特許第6,120,766号に記述されている)。

本発明において有用な方法および組成物は、実施例に記載の特定の製剤に限定されないことが理解されるべきである。以下の実施例は当業者に、本発明の、細胞を作製および使用する方法、拡大および培養方法、ならびに治療方法の完全な開示かつ記述を提供するために記載されており、本発明者らがその発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。

本発明の実践には、別段の指示がない限り、分子生物学(組み換え技法を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技法が利用され、それらは十分に当業者の認識範囲内である。そのような技法は、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, fourth edition (Sambrook, 2012);「Oligonucleotide Synthesis」(Gait, 1984);「Culture of Animal Cells」(Freshney, 2010);「Methods in Enzymology」「Handbook of Experimental Immunology」(Weir, 1997);「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(Miller and Calos, 1987);「Short Protocols in Molecular Biology」(Ausubel, 2002);「Polymerase Chain Reaction: Principles, Applications and Troubleshooting」, (Babar, 2011);「Current Protocols in Immunology」(Coligan, 2002)のような、文献のなかで十分に説明されている。これらの技法は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に適用可能であり、したがって、本発明の形成(making)および実践において考慮されうる。特定の態様に特に有用な技法は、以下の項で論じられる。

実験的実施例
本発明は、以下の実験的実施例を参照して、さらに詳細に説明される。これらの実施例は、例示のみを目的として提供されており、特記しない限り、限定することを意図したものではない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供された教示の結果として明らかになる、ありとあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。

さらなる説明なしに、当業者は、上記の説明および以下の実施例を用いて、本発明の化合物を作製して利用し、かつ特許請求の範囲に記載の方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい態様を具体的に指し示したものであり、本開示の残りの部分を多少なりとも限定するものとして解釈されるべきではない。

実施例1の実験に用いた材料および方法を以下に説明する。

初代ヒトリンパ球：
初代リンパ球を、記載されるように(Human gene therapy 2011, 22(12):1575-1586)、CD3およびCD28刺激性抗体でコーティングされたマイクロビーズ(Life Technologies社, Grand Island, NY, カタログ)により刺激した。T細胞を、10日目に90％ウシ胎児血清と10％ジメチルスルホキシド(DMSO)の溶液中に1×10⁸細胞/バイアルで凍結保存した。

mRNAエレクトロポレーションとレンチウイルス形質導入のためのTCR構築物の作製：
異なる変異を有する1G4 NY-ESO-1 TCRを、関連する刊行物(The Journal of experimental medicine 2005, 201(8):1243-1255; J Immunol 2008, 180(9):6116-6131)により提供される配列決定情報に基づいて、PCRにより合成し、かつ/または増幅して、pGEM.64A RNAベースのベクターまたはpTRPEレンチウイルスベクターにサブクローニングした。

mRNAインビトロ転写およびT細胞エレクトロポレーション：
T7 mscript systemsキット(CellScript社)を用いて、インビトロ転写(IVT) RNAを作製した。CD3/CD28ビーズで刺激したT細胞に、以前に記載されるように(Cancer research 2010, 70(22):9053-9061)、BTX EM830 (Harvard Apparatus BTX社)を用いて、IVT RNAをエレクトロポレーションした。簡単に述べると、T細胞を3回洗浄し、OPTI-MEM (Invitrogen社)中に最終濃度1～3×10⁸細胞/mlで再懸濁した。続いて、0.1mlの細胞を10μgのIVT RNAと(または示されるように)混合して、2mmキュベット内でエレクトロポレーションを行った。

ELISAアッセイ：
CD19を発現する種々の腫瘍細胞株である標的細胞を洗浄し、R10培地(10％ウシ胎児血清を補充したRPMI 1640; Invitrogen社)中に1×10⁶細胞/mlで懸濁した。各標的細胞タイプ100μlを96ウェル丸底プレート(Corning社)に2つ組で加えた。エフェクターT細胞を洗浄し、R10培地中に1×10⁶細胞/mlで再懸濁した後、100μlのT細胞を、示されたウェル中の標的細胞と一緒にした。また、T細胞のみを含むウェルを対照として用意した。このプレートを37℃で18～20時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を採取して、ELISAアッセイ(eBioscience社, 88-7316-77; 88-7025-77)に供した。

CD107a染色：
96ウェルプレートで160μlの完全RPMI培地中にエフェクター細胞：T細胞比1：1 (1×10⁵個のエフェクター対1×10⁵個の標的)で細胞をまいた。20μlのフィコエリトリン標識抗CD107a抗体(BD Biosciences社, 555801)を加え、プレートを37℃で1時間インキュベートした後、Golgi Stop (RPMI培地3ml中に2μlのGolgi Stop、20μｌ/ウェル; BD Biosciences社, 51-2092KZ)を加えて、プレートをさらに2.5時間インキュベートした。次いで、5μlのFITC-抗CD8および5μlのAPC-抗CD3を添加して、37℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルをFACS緩衝液で洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。

ルシフェラーゼに基づくCTLアッセイ：
Naml6-CBG腫瘍細胞を作製し、ルシフェラーゼに基づく細胞傷害性Tリンパ球アッセイの修正バージョンにおいて使用した。簡単に述べると、クリックビートル緑色ルシフェラーゼ(CBG)をpELNSベクターにクローニングし、レンチウイルスにパッケージングし、Naml6腫瘍細胞に形質導入して、CBG発現により選別した。得られたNaml6-CBG細胞を洗浄し、R10培地に1×10⁵細胞/mlで再懸濁し、100μlのCBG標識細胞を異なる比のT細胞(例えば30：1、15：1など)と共に37℃で一晩インキュベートした。その混合物100μlを96ウェルの白色ルミノメータプレートに移した。基質100μlを該細胞に添加して、発光を直ちに測定した。

マウス異種移植研究：
研究は、いくつかの変更を加えて以前に記載されたように行った(Human gene therapy 2011, 22(12):1575-1586; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2009, 106(9):3360-3365)。簡単に説明すると、0日目に、6～10週齢のNOD/SCIDガンマ(NSG)マウスの右脇腹に1×10⁶個のPC3-CBG腫瘍細胞を皮下注入し、5日目に同じマウスの左脇腹にSK-OV3-CBG腫瘍細胞(5×10⁶細胞/マウス)を皮下投与した。このマウスを、PC3-CBG腫瘍の接種後23日目に尾静脈を介してT細胞で治療したところ、両方の腫瘍とも体積が約200mm³となった。レンチウイルスで形質導入されたT細胞は、1×10⁷細胞/マウス(10M)または3×10⁶細胞/マウス(3M)で投与した。

実施例2の実験に用いた材料および方法を以下に説明する。

CARのためのインビトロ転写(IVT) mRNAおよびレンチウイルスベクターの構築：
全ての遺伝子は、一般に公開された配列情報を用いてPCRで合成し、かつ/または増幅して、アセンブルした。このPCR産物を、pGEM-GFP.64AのGFPと置換することによってpGEM.64Aベースのベクターにサブクローニングし、一般に公開された配列情報に基づいてpGEM.64AベースのIVTベクターを作製した。

RNAインビトロ転写(IVT)：
mRNAを合成するためのインビトロ転写は、mMESSAGE mMACHINE(登録商標)T7 Ultra (Ambion社)などのキットを用いて行い、アンチリバースキャップアナログ(Anti-Reverse Cap Analog: ARCA, 7-メチル(3'-Oメチル)GpppG)m7G(5')ppp(5')G)を有するIVT RNAを作製した。IVT RNA産物をRNeasy Mini Kit (Qiagen社, Valencia, CA)を用いて精製し、精製されたRNAをRNaseフリーの水中に1～2mg/mlで溶出した。

T細胞のRNAエレクトロポレーション：
精製した休止T細胞またはCD3/CD28ビーズで刺激したT細胞は、BTX EM830 (Harvard Apparatus BTX社, Holliston, MA, 米国)を用いてエレクトロポレーションされた。エレクトロポレーションを受けるT細胞をOPTI-MEM (Invitrogen社)で3回洗浄し、OPTI-MEM中に最終濃度1～3×10⁸細胞/mlで再懸濁した。続いて、0.1mlの該細胞を10μgのIVT RNAと(または示されるように)混合し、記載されるように(Zhao et al., 2010, Cancer Res 70:9053-9061)、2mmキュベット内でエレクトロポレーションを行った。

エレクトロポレーションされたT細胞上のCLEAR検出：
細胞を洗浄し、フロー活性化細胞ソーティング(FACs)緩衝液(PBS＋0.1％アジ化ナトリウムおよび0.4％BSA)中に懸濁させた。抗PD1 (APC)および抗CD27 (PE)を、それぞれ、PD1またはCD27に基づくCLEAR検出に用いた。ビオチン標識したポリクローナルヤギ抗マウスF(ab)2抗体(マウスscFvの場合)または抗ヒト抗F(ab)2(ヒトscFvの場合)(Jackson Immunoresearch社, West Grove, PA)を細胞に添加し、該細胞を4℃で25分間インキュベートして2回洗浄した。その後、該細胞をフィコエリトリン標識ストレプトアビジン(BD Pharmingen社, San Diego, CA)で染色した。

ELISAおよびLuminexアッセイ：
標的細胞を洗浄し、R10中に10⁶細胞/mLで懸濁させた。96ウェル丸底プレート(Corning社)の2つのウェルの各々に、10万個の各標的細胞タイプを加えた。エフェクターT細胞培養物を洗浄し、R10中に10⁶細胞/mLで懸濁させた。10万個のエフェクターT細胞を、96ウェルプレートの示されたウェル中の標的細胞と一緒にした。また、T細胞のみを含むウェルも用意した。このプレートを37℃で18～20時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を採取し、標準的な方法を用いてELISAアッセイ(Pierce社, Rockford, IL)に供した。

CD107a染色：
96ウェルプレートで160μlの完全RPMI培地中にE：T比1：1 (10⁵個のエフェクター対10⁵個の標的)で細胞をまいた。20μlのフィコエリトリン標識抗CD107a抗体(BD Pharmingen社, San Diego, CA)を加え、プレートを37℃で1時間インキュベートした後、Golgi Stopを加えて、さらに2.5時間インキュベートした。2.5時間後、10μlのFITC-抗CD8およびAPC-抗CD3を添加して、37℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルをFACS緩衝液で1回洗浄した。フローサイトメトリーの取得は、BD FacsCalibur (BD Biosciences社)を用いて行い、FlowJo (Treestar社, Ashland, OR)を用いて解析を行った。

実施例3の実験に用いた材料および方法を以下に説明する。

初代ヒトリンパ球：
初代リンパ球を、以前に記載されるように(Barrett, et al., Human gene therapy 2011, 22(12):1575-1586)、CD3およびCD28刺激性抗体(Life Technologies社, Grand Island, NY, カタログ)でコーティングされたマイクロビーズにより刺激した。10日目に、T細胞を90％ウシ胎児血清と10％ジメチルスルホキシド(DMSO)の溶液中に1×10⁸細胞/バイアルで凍結保存した。

mRNAエレクトロポレーションのためのART構築物の作製：
EGFR (Friedman et al., Journal of molecular biology 2008, 376(5):1388-1402; およびFriedman et al., Protein engineering, design & selection : PEDS 2007, 20(4):189-199)またはErbB2 (Fedwisch et al., Journal of molecular biology 2010, 398(2):232-247)に対する以下の親和性抗体模倣物再方向付けT細胞(ART)配列を用いてARTを作製した。

EGFRに対して：

ErbB2に対して：

(表1) 親和性抗体模倣物の親和性

図28に示されるように、3種類のARTを構築した。

第1のものはCARベースのARTである(図28、上のパネル)。これは、ヒトCD8アルファ由来のシグナルペプチド(SP)、親和性抗体模倣物、6×Hisタグ(Hisタグ)、ヒトCD8アルファヒンジおよびトランスメンブレン(CD8ヒンジ&TM)、4-1BB細胞質ドメイン(4-1BB Cyto)、およびCD3ゼータ細胞質ドメイン(ゼータCyto)からなる。第2のものはTCRベースのARTである(図28、下のパネル)。これは、潜在的に複数の腫瘍抗原を同時に標的とすることができ、ヒトCD8アルファ由来のシグナルペプチド(SP)、ErbB2親和性抗体模倣物(ZHER2.342、ZHER2.342-15、ZHER2.342-14またはZHER2.342-4)、および全長1G4 NY-ESO-1 TCRアルファまたはベータ鎖からなる。第3のものは二重特異性T細胞誘導物(BiTE)ベースのARTである。これは、ヒトCD8アルファ由来のシグナルペプチド(SP)、ErbB2親和性抗体模倣物(ZHER2.342、ZHER2.342-15、ZHER2.342-14またはZHER2.342-4)、GSリンカー(またはEGFR親和性抗体模倣物とGSリンカー)、およびCD3親和性抗体模倣物(またはscFv)からなる。

全ての(以下の)親和性抗体模倣物DNA配列は、DNAコドン最適化アルゴリズムのアプリケーションUpGeneによって作製された。該アルゴリズムを用いることにより、上記のタンパク質配列情報に基づいてPCRプライマー配列を作製し、pGEM.64AベースのRNAインビトロ転写(IVT)ベクター中で(オーバーラッピングPCRにより)全てのART構築物を合成した(Zhao, et al., Cancer research 2010, 70(22):9053-9061)。

mRNAインビトロ転写およびT細胞エレクトロポレーション：
mMESSAGE mMACHINE(登録商標)T7 ULTRA転写キット(Invitrogen社)を用いてIVT RNAを作製した。CD3/CD28ビーズで刺激したT細胞に、以前に記載されるように(Zhao, et al., Cancer research 2010, 70(22):9053-9061)、BTX EM830 (Harvard Apparatus BTX社)を用いて、IVT RNAをエレクトロポレーションした。簡単に述べると、T細胞を3回洗浄し、OPTI-MEM (Invitrogen社)中に最終濃度1～3×10⁸細胞/mlで再懸濁した。続いて、0.1mlの細胞を10μgのIVT RNAと(または示されるように)混合して、2mmキュベット内でエレクトロポレーションを行った。

ELISAアッセイ：
標的細胞を洗浄し、R10培地(10％ウシ胎児血清を補充したRPMI 1640; Invitrogen社)中に1×10⁶細胞/mlで懸濁した。100μlずつの標的細胞タイプを96ウェル丸底プレート(Corning社)に2つ組で加えた。エフェクターT細胞を洗浄し、R10培地中に1×10⁶細胞/mlで再懸濁した後、100μlのT細胞を、示されたウェル中の標的細胞と一緒にした。また、T細胞のみを含むウェルも用意した。このプレートを37℃で18～20時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を採取して、ELISAアッセイ(eBioscience社, 88-7316-77; 88-7025-77)に供した。

CD107a染色：
96ウェルプレートで160μlの完全RPMI培地中にE：T比1：1 (1×10⁵個のエフェクター：1×10⁵個の標的)で細胞をまいた。20μlのフィコエリトリン標識抗CD107a抗体(BD Biosciences社, 555801)を加え、プレートを37℃で1時間インキュベートした後、Golgi Stop (RPMI培地3ml中に2μlのGolgi Stop、20μｌ/ウェル; BD Biosciences社, 51-2092KZ)を加えて、プレートをさらに2.5時間インキュベートした。次いで、5μlのFITC-抗CD8および5μlのAPC-抗CD3を添加して、37℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルをFACS緩衝液で洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。

ルシフェラーゼに基づくCTLアッセイ：
SK-OV3-CBG腫瘍細胞を作製し、ルシフェラーゼに基づくCTLアッセイの修正版において次のように使用した。クリックビートル緑色ルシフェラーゼ(CBG)をpELNSベクターにクローニングし、レンチウイルスにパッケージングし、SK-OV3腫瘍細胞に形質導入して、CBG発現により選別した。得られたSK-OV3-CBG細胞を洗浄し、R10培地に1×10⁵細胞/mlで再懸濁し、100μlのCBG標識細胞を異なる比のT細胞(例えば30：1、15：1など)と共に37℃で8時間インキュベートした。その混合物100μlを96ウェルの白色ルミノメータプレートに移した。基質100μlを添加して、発光を直ちに測定した。

実施例4の実験に用いた材料および方法を以下に説明する。

CARのためのインビトロ転写(IVT) mRNAおよびレンチウイルスベクターの構築：
全てのCAR (CD19、メソテリン、cMet、GD2、PSCA、EGFRviiiおよびErBB2)および同じ分子に対する二重特異性抗体をコードするRNA (Bis-RNA)をPCRで合成し、かつ/または増幅して、アセンブルした。このPCR産物を、pGEM-GFP.64A (Zhao et al., 2003, Blood 102:4137-4142)のGFPと置換することによってpGEM.64Aベースのベクターにサブクローニングし、pGEM.64AベースのCARまたはBis-RNAベクターを作製した。ブリナツモマブをコードするDNAならびに完全ヒトCD19 CAR (21D4-BBZ)およびBis-RNA (21D4-F11)は、公開特許番号US2013/050275から提供される配列決定情報に基づいてPCRにより合成して、アセンブルした。

RNAインビトロ転写(IVT)：
mRNAを合成するためのインビトロ転写は、mMESSAGE mMACHINE(登録商標)T7 Ultra (Ambion社)などのキットを用いて行い、アンチリバースキャップアナログ(ARCA, 7-メチル(3'-Oメチル)GpppG)m7G(5')ppp(5')G)を有するIVT RNAを作製した。IVT RNA産物をRNeasy Mini Kit (Qiagen社, Valencia, CA)を用いて精製し、精製されたRNAをRNaseフリーの水中に1～2mg/mlで溶出した。

T細胞のRNAエレクトロポレーション：
精製した休止T細胞またはCD3/CD28ビーズで刺激したT細胞は、BTX EM830 (Harvard Apparatus BTX社, Holliston, MA, 米国)を用いてエレクトロポレーションされた。エレクトロポレーションを受けるT細胞をOPTI-MEM (Invitrogen社)で3回洗浄し、OPTI-MEM中に最終濃度1～3×10⁸細胞/mlで再懸濁した。続いて、0.1mlの細胞を10μgのIVT RNAと(または示されるように)混合し、記載されるように(Zhao et al., 2010, Cancer Res 70:9053-9061)、2mmキュベット内でエレクトロポレーションを行った。

エレクトロポレーションされたT細胞上のCAR検出：
細胞を洗浄し、フロー活性化細胞ソーティング(FACs)緩衝液(PBS＋0.1％アジ化ナトリウムおよび0.4％BSA)中に懸濁させた。ビオチン標識したポリクローナルヤギ抗マウスF(ab)2抗体(マウスscFvの場合)または抗ヒト抗F(ab)2(ヒトscFvの場合)(Jackson Immunoresearch社, West Grove, PA)を細胞に添加し、該細胞を4℃で25分間インキュベートして2回洗浄した。その後、該細胞をフィコエリトリン標識ストレプトアビジン(BD Pharmingen社, San Diego, CA)で染色した。

ELISAおよびLuminexアッセイ：
標的細胞を洗浄し、R10中に10⁶細胞/mLで懸濁させた。96ウェル丸底プレート(Corning社)の2つのウェルの各々に、10万個の各標的細胞タイプを加えた。エフェクターT細胞培養物を洗浄し、R10中に10⁶細胞/mLで懸濁させた。10万個のエフェクターT細胞を、96ウェルプレートの示されたウェル中の標的細胞と一緒にした。また、T細胞のみを含むウェルも用意した。このプレートを37℃で18～20時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を採取し、標準的な方法を用いてELISAアッセイ(Pierce社, Rockford, IL)に供した。

CD107a染色：
96ウェルプレートで160μlの完全RPMI培地中にE：T比1：1 (10⁵個のエフェクター：10⁵個の標的)で細胞をまいた。20μlのフィコエリトリン標識抗CD107a抗体(BD Pharmingen社, San Diego, CA)を加え、プレートを37℃で1時間インキュベートした後、Golgi Stopを加えて、プレートをさらに2.5時間インキュベートした。2.5時間後、10μlのFITC-抗CD8およびAPC-抗CD3を添加して、37℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルをFACS緩衝液で1回洗浄した。フローサイトメトリーの取得はBD FacsCalibur (BD Biosciences社)を用いて行い、FlowJo (Treestar社, Ashland, OR)を用いて解析を行った。

CFSEベースのT細胞増殖アッセイ：
PBS中の10×10⁶個/mLの濃度のT細胞を、3μMのCFSEで3分30秒間室温にて標識した。標識付けを5％FBS (PBS中)で停止させ、R10で2回洗浄し、10IU/mlのIL-2を含むR10中で培養した。一晩培養した後、CFSE標識されたT細胞のエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの2～4時間後、照射した腫瘍またはK562細胞株をT細胞：刺激細胞1：1で用いてT細胞を刺激した。フローサイトメトリーによりCFSE希釈を調べ、示された時間に細胞数をカウントした。

フローCTL：
フローサイトメトリー細胞傷害性アッセイの若干の修正版を、以前に記載されたように使用した(Zhao et al., 2010, Cancer Res 70:9053-9061, Hermans et al., 2004, J Immunol Methods 285:25-40)。クリックビートル緑色ルシフェラーゼ(CBG)腫瘍細胞を作製し、ルシフェラーゼに基づくCTLアッセイで次のように使用した。CBGをpELNSベクターにクローニングし、レンチウイルスにパッケージングし、腫瘍細胞に形質導入した。CBG腫瘍細胞をCBG発現により選別した。得られたCBG腫瘍細胞を洗浄し、R10培地に1×10⁵細胞/mlで再懸濁し、100μlのCBG標識細胞を異なる比のT細胞(例えば30：1、15：1など)と共に37℃で一晩インキュベートした。その混合物100μlを96ウェルの白色ルミノメータプレートに移した。基質100μlを各ウェルに添加して、発光を直ちに測定した。

マウス異種移植研究：
研究は、以前に記載されたように、いくつかの変更を加えて行った(Barrett et al., Hum Gene Ther 22:1575-1586)。簡単に説明すると、6～10週齢のNOD-SCID-?c-/- (NSG)マウスをJackson Laboratory (Bar Harbor, ME)から入手するか、または承認された動物実験委員会(institutional animal care and use committee: IACUC)プロトコルの下に社内で飼育し、病原体フリーの条件下で維持した。CD19+ヒトALL株であるNalm-6にCBGを形質導入し(Nalm6-CBG)、0.2mlの滅菌PBS中100万個の細胞用量で尾静脈から注入した。Nalm-6-CBG注入の7日後にT細胞を尾静脈から注入した。

生物発光イメージング(BLI)：
腫瘍の増殖をBLIによってモニターした。麻酔したマウスを、Xenogen SpectrumシステムおよびLiving Image v3.2ソフトウェアを用いて画像化した。D-ルシフェリン(Caliper Life Sciences社, Hopkinton, MA)を滅菌PBS中に15mg/mLの濃度で再懸濁し(100μLルシフェリン溶液/10gマウス体重)、マウスに150mg/kg体重の割合で腹腔内(IP)注射により投与した。M108-Lucの以前の滴定は、光子放出のピークまでの時間が約5分であり、ピーク放出が約6～10分間持続することを示した。ルシフェリン注射後の同じ相対時点(6分)に、各動物を前後方向の腹臥位にして、単独で(光子定量の場合)または5匹までのグループで(表示目的の場合)画像化した。線形スケールの中間域に達するまで(600～60000カウント)、または最大露光設定値に達するまで(f/stop 1、大きなビニングおよび1～2秒)、データを収集し、その後、露光時間、f/stop、ビニングおよび動物サイズについて各画像を標準化するために、photons/秒/cm2/ステラジアンに変換した。解剖学的局在のために、光強度を表す疑似カラーマップをグレースケール体表参照画像の上に重ね合わせた。データ表示目的のために、ルシフェラーゼ含有細胞を持たないマウスを最大設定で画像化し、3.6×10⁵ p/s/cm2/srの平均値を得た。

実施例5の実験に用いた材料および方法を以下に説明する。

初代ヒトリンパ球：
初代リンパ球を、記載されるように(Human gene therapy 2011, 22(12):1575-1586)、CD3およびCD28刺激性抗体(Life Technologies社, Grand Island, NY, カタログ)でコーティングされたマイクロビーズにより刺激した。10日目に、T細胞を90％ウシ胎児血清と10％ジメチルスルホキシド(DMSO)の溶液中に1×10⁸細胞/バイアルで凍結保存した。

mRNAエレクトロポレーションおよびレンチウイルス形質導入のための構築物の作製：
異なる変異を有する1G4 NY-ESO-1 TCRを、関連する刊行物(The Journal of experimental medicine 2005, 201(8):1243-1255; J Immunol 2008, 180(9):6116-6131)により提供される配列決定情報に基づいて、PCRで合成し、かつ/または増幅して、pGEM.64A RNAベースのベクターまたはpTRPEレンチウイルスベクターにサブクローニングした。

ErbB2アフィボディ配列：

mRNAインビトロ転写およびT細胞エレクトロポレーション：
T7 mscript systemsキット(CellScript社)を用いて、インビトロ転写(IVT) RNAを作製した。CD3/CD28ビーズで刺激したT細胞に、以前に記載されるように(Cancer research 2010, 70(22):9053-9061)、BTX EM830 (Harvard Apparatus BTX社)を用いて、IVT RNAをエレクトロポレーションした。簡単に述べると、T細胞を3回洗浄し、OPTI-MEM (Invitrogen社)中に最終濃度1～3×10⁸細胞/mlで再懸濁した。続いて、0.1mlの細胞を10μgのIVT RNAと(または示されるように)混合して、2mmキュベット内でエレクトロポレーションを行った。

ELISAアッセイ：
標的細胞である、CD19を発現する異なる腫瘍細胞株を洗浄し、R10培地(10％ウシ胎児血清を補充したRPMI 1640; Invitrogen社)中に1×10⁶細胞/mlで懸濁した。100μlの各標的細胞タイプを96ウェル丸底プレート(Corning社)に2つ組で加えた。エフェクターT細胞を洗浄し、R10培地中に1×10⁶細胞/mlで再懸濁した後、100μlのT細胞を、示されたウェル中の標的細胞と一緒にした。また、T細胞のみを含むウェルを対照として用意した。このプレートを37℃で18～20時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を採取して、ELISAアッセイ(eBioscience社, 88-7316-77; 88-7025-77)に供した。

CD107a染色：
96ウェルプレートで160μlの完全RPMI培地中にエフェクター細胞：T細胞比1：1 (1×10⁵個のエフェクター対1×10⁵個の標的)で細胞をまいた。20μlのフィコエリトリン標識した抗CD107a抗体(BD Biosciences社, 555801)を加え、プレートを37℃で1時間インキュベートした後、Golgi Stop (RPMI培地3ml中に2μlのGolgi Stop、20μｌ/ウェル; BD Biosciences社, 51-2092KZ)を加えて、プレートをさらに2.5時間インキュベートした。次いで、5μlのFITC-抗CD8および5μlのAPC-抗CD3を添加して、37℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルをFACS緩衝液で洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。

ルシフェラーゼに基づくCTLアッセイ：
Naml6-CBG腫瘍細胞を作製し、ルシフェラーゼに基づく細胞傷害性Tリンパ球アッセイの修正版において使用した。簡単に述べると、クリックビートル緑色ルシフェラーゼ(CBG)をpELNSベクターにクローニングし、レンチウイルスにパッケージングし、Naml6腫瘍細胞に形質導入して、CBG発現により選別した。得られたNaml6-CBG細胞を洗浄し、R10培地に1×10⁵細胞/mlで再懸濁し、100μlのCBG標識細胞を異なる比のT細胞(例えば30：1、15：1など)と共に37℃で一晩インキュベートした。その混合物100μlを96ウェルの白色ルミノメータプレートに移した。基質100μlを細胞に添加して、発光を直ちに測定した。

マウス異種移植研究：
研究は、以前に記載されたように、いくつかの変更を加えて行った(Human gene therapy 2011, 22(12):1575-1586; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2009, 106(9):3360-3365)。簡単に説明すると、0日目に、6～10週齢のNOD/SCIDガンマ(NSG)マウスの右脇腹に1×10⁶個のPC3-CBG腫瘍細胞を皮下注入し、5日目に同じマウスの左脇腹にSK-OV3-CBG腫瘍細胞(5×10⁶細胞/マウス、皮下)を投与した。このマウスを、PC3-CBG腫瘍の接種後23日目に尾静脈を介してT細胞で治療したところ、両方の腫瘍とも体積が約200mm³となった。レンチウイルスにより形質導入されたT細胞は、1×10⁷細胞/マウス(10M)または3×10⁶細胞/マウス(3M)で投与した。

次に、実験の結果について説明する。

実施例1：TCRおよび二重特異性抗体を発現するT細胞
レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターによって抗腫瘍抗原TCR再方向付けTリンパ球で治療されたがん患者は、期待できる結果を示す。この研究では、がんの養子免疫療法の効果的な治療法を開発できるかどうかを判断するために、T細胞にRNAをエレクトロポレーションした。該T細胞を比較することによって、外因性TCRと二重特異性抗体を発現するTリンパ球のインビボ効力をNam16白血病およびA549肺がんマウスモデルにおいて評価した。

TCR再方向付けT細胞養子免疫療法を改善するために、T細胞にTCR RNAおよび二重特異性T細胞誘導物(BiTE)をエレクトロポレーションした。図1は、TCRおよびBiTEをコエレクトロポレーションされたT細胞におけるトランスジーン発現を示す。T細胞に、CD3ゼータおよびイプシロンと共にまたはなしで、CD19.CD3(上のパネル)または4D5.CD3 (ErbB2)(中のパネル)BiTEをコエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの18時間後、T細胞をTCR vb13.1およびmIgG Fab(またはHer2-Fc)について染色した。下のパネルは、エレクトロポレーションの3日後のTCR (vb13.1)発現を示す。

コエレクトロポレーションされたT細胞では機能性が改善された。図2および3は、腫瘍細胞で刺激した後のT細胞ではCD107aがアップレギュレートされたことを示す。T細胞にTCR RNAおよびBiTE RNAをコエレクトロポレーションし、次にCD19およびNY-ESO-1 (ESO)に対して単一陽性または二重陽性である腫瘍細胞株で刺激した。IFN-γおよびIL-2産生はどちらも、コエレクトロポレーションされたT細胞において増加した(図4および5)。さらに、CD107aは、腫瘍で刺激された、NY-ESO-1 TCR (1G4)およびメソテリンBiTE (ss1.CD3)を発現するT細胞においてアップレギュレートされた(図6)。

TCRおよびBiTEを共発現する前記細胞を白血病マウスモデルに注入した。NOD/SCID (NSG)マウスモデルでは、NY-EOS-1野生型TCRおよびCD19.CD3 BiTEを発現するRNAをエレクトロポレーションされたT細胞を、腫瘍細胞注入の5日後に注入した(図7)。NY-ESO-1野生型TCR RNAおよびCD19.CD3 BiTEをエレクトロポレーションされたT細胞は強力な抗腫瘍活性を示したが、NY-ESO-1 TCRを有するT細胞は効力がはるかに低いことが判明した(図8)。

改変TCRを発現するT細胞はまた、該T細胞において二重特異性抗体と組み合わせた場合、HLA制限なしにコグネイトおよびMHC/ペプチド抗原と表面腫瘍抗原の両方を認識した(図9)。T細胞にエレクトロポレーションされた二重特異性抗体RNAおよびTCR RNAの構築物のリストを図10Aおよび10Bに示す。改変NY-ESO-1 TCRおよび二重特異性抗体を発現するT細胞は、コグネイト抗原(HLA-A2/NY-ESO-1)とCD19またはHer2の両方を認識した(図11)。

実施例2：二重特異性抗体およびCLEARにより改変されたT細胞
キメラ抗原受容体(CAR)またはT細胞受容体(TCR)が改変されたT細胞を用いたがんの養子免疫療法は、がんを治療するための有望な戦略であることが示されている。がん、特に固形腫瘍、の不均質な性質のため、がんを治療するために単一の腫瘍抗原を標的とすることは、標的抗原に対して陰性であるかまたは標的抗原をダウンレギュレートする腫瘍細胞の免疫回避につながる可能性がある。したがって、複数の腫瘍抗原を同時に標的とすることは、治療を高める可能性がある。構造的類似性のために互いに干渉する可能性がある複数の一本鎖可変フラグメント(scFv) CARをプールする代わりに、2つの分子の共導入によって複数の腫瘍抗原を標的とする新規な方法が開発された。この新規分子は、「キメラリガンド改変活性化受容体(CLEAR）」(標的-1)と命名され、共刺激シグナルを含むまたは含まないCD3ゼータなどの細胞内T細胞活性化シグナル伝達ドメインと、細胞外ドメインとから構成された。細胞外ドメインは、1)抗体または特異的受容体/リガンドを認識し、かつ2)腫瘍抗原または健常組織上には発現されない他の分子に特異的に結合する、ように選択された。該細胞はまた、一方の側で腫瘍抗原(標的2)に、他方の側ではCLEARの細胞外ドメインに結合する、二重特異性抗体または融合タンパク質を発現するように作製された。それは、第2の腫瘍発現標的のT細胞による認識を可能にするためであった(図12)。

これら2つの分子がTリンパ球に導入された後、CLEARは標的-1を標的とし、同時に、分泌された二重特異性抗体(または融合タンパク質)に結合した。T細胞は、標的-1の直接的な認識によって、かつ/または腫瘍細胞上の標的-2でのCLEARと分泌された二重特異性抗体(または融合タンパク質)との同時結合によって、トリガーされた。

概念の証明として、がんの免疫療法において重要な標的である2つの受容体/リガンド標的であるPD1/PD-L1およびCD27/CD70を選択して、PD1またはCD27 CLEARを作製した。メソテリン、ErbB2およびCD19を標的2抗原として使用した。PD1 (2D3、4A11および4H1)(5)またはCD27 (C2177、M709およびM708)(6)に対して異なる親和性を有する3種のscFvを選択し、上記の標的2リガンドの全てに対するscFvを用いて、二重特異性構築物を作製した。

異なる共刺激または共受容体シグナル伝達ドメインを有するPD1 CLEARをも構築した。CD27 CLEARは、CD27 (CD27-Z)(7)またはCD27-4-1BB (CD27-BBZ)シグナル伝達ドメインのいずれかを用いて構築した(図13Aおよび13B)。全ての構築物はインビトロ転写(IVT)ベクターを介してRNAにされ、IVT RNAを作製して、CD3/CD28ビーズで刺激されたT細胞にエレクトロポレーションするために使用した。

PDL1またはCD70陽性腫瘍を標的とするPD1またはCD27 CLEAR再方向付けT細胞：
CD27またはPD1 CLEAR単独を発現するT細胞の機能を試験した。CD27 CLEARは細胞表面上に発現され得ることが見出された(図14)。T細胞がCD70を発現する腫瘍株で刺激されると、T細胞は特異的に活性化されたが、これはCD107a発現の顕著なアップレギュレーションによって証明された(図15)。

異なる共刺激分子(CD28もしくは4-1BB)または共受容体分子(CD4もしくはCD8)を用いることによってT細胞が機能するかどうかを試験するために、5つのPD1 CLEARがT細胞上でのそれらの発現によって試験され(図16)、かつPDL1陽性細胞株Nalm6-PD-L1に対するそれらの反応性が測定された。全てのPD1 CLEARを有するT細胞は、約50％～約70％のCD107aアップレギュレーションおよびサイトカイン産生によって証明されるように、PD-L1陽性腫瘍に強く応答した。興味深いことに、CD4またはCD8共受容体シグナル伝達を有するT細胞PD1 CLEARは、他のPD1 CLEAR：CD28もしくは4-1BBまたは共シグナル伝達なし(ゼータ単独、PD1-Z)と同等のCD107a発現を示した。IFN-γおよびIL-2の分泌はどちらも著しく低かった(図17)が、これは、CD4またはCD8共シグナル伝達を有するPD1 CLEAR T細胞が他とは異なって挙動し、サイトカインストームによる毒性がより少ない治療に有益であり得ることを示している。

PD1 CLEARと二重特異性抗体を組み合わせたeCLEARによる複数の腫瘍抗原のターゲティング：
PD1 eCLEARを有するT細胞は、PD1 CLEAR (PD1-Z)のRNAと、PD1およびメソテリンに対する二重特異性抗体(2D3-ss1、4A11-ss1および4H1-ss1)のRNAの両方をT細胞にコエレクトロポレーションすることによって試験された。フローサイトメトリー染色は、CLEARと二重特異性抗体の両方が検出され得ることを示した(図18)。さらに重要なことに、これらのT細胞を、単一または二重の標的抗原を発現する異なる細胞株で刺激したとき、それらは、抗原特異的様式で、単一抗原陽性腫瘍株または二重陽性腫瘍株を認識した。

CARc ss1.BBZと比較して、CLEAR (PD1Z & 4A11.ss1)を有するT細胞は、CD107aアップレギュレーションアッセイにおいて、メソテリン単一陽性細胞株K562-mesoに対して同等の溶解能力を示した。しかし、PD-L1をレンチウイルスで形質導入された、メソテリンに対して弱陽性の腫瘍細胞株PC3-PDL1の場合には、eCLEARを有するT細胞が、ss1.bbz CARを有するT細胞よりもはるかに高いCD107aアップレギュレーションを有していた(図19)。

刺激されたT細胞のサイトカイン産生(IFN-γおよびIL-2)をELISAによって試験した。CLEAR RNAを導入されたT細胞は、ss1.BBZ CAR導入T細胞と同程度の、またはそれ以上に高いサイトカイン産生を示したが、単一陽性または二重陽性標的細胞株で刺激されたCLEAR導入T細胞では、IL-2とIFN-γの両方について検出可能なサイトカインがほとんど存在しなかった。対照的に、ss1.bbz CARを導入されたT細胞は、高レベルのIL-2およびIFN-γを分泌した(図20)。低サイトカイン産生を伴う高溶解能力の特性は、有害なサイトカインストームを発症する機会を減らす可能性があるため、がん患者を治療する上で有益であり得る。

CLEARがメソテリン以外の腫瘍抗原を効果的に標的とできるかどうかを試験するために、ErbB2 (4D5)、またはCD19、またはPSCA (2B3)のいずれかを有するPD1に対する二重特異性抗体構築物を作製した。これらの新しい二重特異性抗体のRNAをT細胞にコエレクトロポレーションし、それらの関連するCAR (4D5.BBZ、19.BBZまたは2B3.BBZ)と比較した。これらのT細胞を腫瘍株で刺激した後にCD107a発現を調べたところ、その結果は、PD1/CD19 CLEAR (PD1-Z/2D3-CD19、PD1-Z/4A11-CD19)がCD19単一陽性腫瘍細胞Nalm6をCD19 CAR (19.BBZ)と同じく有効に認識できたことを示した。CD19 CAR T細胞は、CD19/PDL1二重陽性Nalm6-PDL1細胞に対するその反応性を低下させた(CD107a+/CD8+について52.2％対56.6％)。PD1/CD19 CLEAR T細胞ではCD107aもわずかに増加した。これらの結果はまた、PD1/4D5およびPD1/2B3 CLEARの両方について、T細胞を二重陽性腫瘍で刺激した場合に、関連するCARを有するT細胞よりも、CLEARを有するT細胞においてCD107aが高発現されることを示した(図21)。

2つの腫瘍抗原ErbB2およびCD19に対するCD27 CLEARについても試験した。図22に示されるように、CD27とmIgG Fabの両方の表面染色(ErbB2標的を有するCD27-zについては上のパネル、CD19標的を有するCD27-zについては下のパネル)は、異なるレベルでT細胞に結合したCD27および分泌された二重特異性抗体の両方のトランスジーン発現を示した。T細胞を、CD70およびErbB2について単一または二重陽性である腫瘍株で刺激した場合、抗原特異的T細胞活性化が観察された。特に、CD70-/ErbB2+腫瘍MDA231、CD27-Z/M708-4D5は、約3％のバックグラウンドレベルに対して、約33.2％で、大幅に増加したCD107a発現を示した（図23）。CD27/CD19 CLEARを有するT細胞をCD70およびCD19について単一または二重陽性である細胞株で刺激した場合(図24)、CD27/ErbB2について見られたのと同じ、抗原特異的T細胞活性化が観察され、CD27/CD17 CLEARは、CD27/CD19二重陽性細胞またはCD70もしくはCD19単一陽性細胞に対して明らかな抗腫瘍活性を示した。PD1/メソテリン eCLEARからの結果と合わせると、ここに示されたデータは、腫瘍抗原がCLEARと二重特異性抗体を用いて間接的に標的とされ得ることを示している。したがって、2つの腫瘍抗原は、互いに干渉することなく同時に標的とされ得る。

PD1 CLEARと二重特異性抗体とを組み合わせたeCLEARによる、親和性低下抗ErbB2 scFv (4D5-5、4D5-4、4D4-3および4D5-2)を用いた、ErbB2のターゲティング：
抗ErbB2 4D5は、T細胞ベースのがん治療には使用しない高親和性scFvである。PD1 eCLEARを有するT細胞は、PD1 CLEAR (PD1-Z)と、PD1 (2D3、4A11または4H1)およびErbB2 (4D5、4D5-2、4D5-3、4D5-4または4D5-5)に対する二重特異性抗体との両方のRNAをコエレクトロポレーションすることによって試験された。フローサイトメトリー染色は、コエレクトロポレーションされたT細胞のほとんどにおいてPD1 CLEARと二重特異性抗体の両方が検出可能であることを示した(図24)。

次に、T細胞を、単一もしくは二重の標的抗原を発現する異なる腫瘍細胞株またはErbB2および/もしくはPD-L1 RNAをエレクトロポレーションされたK562細胞で刺激した(図25)。図26および27に示されるように、PD1 CLEARおよび抗PD1/抗ErbB2二重特異性抗体の両方をコエレクトロポレーションされたT細胞は、ErbB2高発現細胞株SK-OV3およびErbB2 RNAエレクトロポレーションK562に対して、親和性に関連したT細胞活性を示すことが見出された。4H1-4D5、4H1-4D5-4および4D5-2は、確定するには不十分な親和性を有することが分かった。

PD1 CLEARと、ErbB2 scFv (4D5)に対して高い親和性を有する二重特異性抗体2D3-4D5および4A11-4D5とをコエレクトロポレーションされたT細胞は、PD1陰性および低レベルErbB2発現腫瘍細胞MCF7に対する反応性を示した。PD1 CLEARと、ErbB2 scFv (4D5、4D5-5、4D5-4および4D5-3)に対してより低い親和性を有する二重特異性抗体とをコエレクトロポレーションされたT細胞は、PD1陰性および低レベルErbB2発現腫瘍細胞MCF7に対する反応性をまったく示さなかった。このことから、ErbB2過剰発現腫瘍を有するがん患者を治療するためにCLEARと二重特異性抗体を安全に使用し得ることが示唆された。

実施例3：親和性分子キメラ受容体または二重特異性抗体を発現するT細胞
図29は、抗His抗体で染色することにより親和性抗体模倣物再方向付けT細胞(ART)の発現を示すグラフのパネルである。EGFR (955.BBZ、1853.BBZもしくは1970.BBZ)またはErbB2 (342.BBZ、432-15.BBZ、342-14.BBZもしくは342-4.BBZ)に対するARTをコードする10マイクログラムのRNAをT細胞にエレクトロポレーションして、R10中で一晩培養した。100マイクロリットルのエレクトロポレーションされたT細胞を、ART発現のフローサイトメトリー検出のために抗Hisタグ抗体で染色した(下のパネル)。エレクトロポレーションされなかったT細胞(EPなし)と比較して、全てのART RNAをエレクトロポレーションされたT細胞は陽性に染色されたことが示された。

図30は、EGFRおよびErbB2 ARTの特異的CD107aアップレギュレーションを示すグラフのパネルである。図29に示されるエレクトロポレーションされたT細胞を、各腫瘍の名前の下に示されるEGFRおよび/またはErbB2を発現する4種類の腫瘍細胞株で刺激した。4時間のインキュベーション後、CD107aのアップレギュレーションを、CD107a-PE、CD3-APCおよびCD8-FITCで細胞を染色することによって測定した。図29に示されるように、全てのEGFR ARTは、EGFR陽性の腫瘍株(SK-OV3、MDA231およびMDA468)に対してのみ強く反応するが、EGFR陰性腫瘍MCF7には反応しない。全てのErbB2 ARTはErbB2陽性の腫瘍株(SK-OV3、MDA231およびMCF7)に対して強く反応するが、ErbB2陰性腫瘍MDA468には反応しない。4D5.BBZおよび2224.BBZは、それぞれErbB2およびEGFRに対するCARであった。

図31は、EGFRおよびErbB2 ARTの特異的IFN-γ産生を示すグラフである。図29に示されるエレクトロポレーションされたT細胞を、各腫瘍の名前の下に示されるEGFRおよび/またはErbB2を発現する4種類の腫瘍細胞株で刺激した。一晩のインキュベーション後、上清を用いてELISAによりIFN-γ産生を測定した。IFN-γは、EGFR陽性の腫瘍株(SK-OV3、MDA231およびMDA468)で刺激された全てのEGFR ARTについて異なるレベルで検出できたが、EGFR陰性腫瘍MCF7では検出できなかった。一方、全てのErbB2 ARTは、ErbB2陽性の腫瘍株(SK-OV3、MDA231およびMCF7)に対して強く反応するが、ErbB2陰性腫瘍MDA468には反応しない。4D5.BBZおよび2224.BBZは、それぞれErbB2およびEGFRに対するCARであった。

図32は、EGFRおよびErbB2 ARTの特異的IL-2産生を示すグラフである。図29に示されるエレクトロポレーションされたT細胞を、各腫瘍の名前の下に示されるEGFRおよび/またはErbB2を発現する4種類の腫瘍細胞株で刺激した。一晩のインキュベーション後、上清を用いてELISAによりIL-2産生を測定した。IL-2は、EGFR陽性の腫瘍株(SK-OV3、MDA231およびMDA468)で刺激された全てのEGFR ARTについて異なるレベルで検出できたが、EGFR陰性腫瘍MCF7では検出できなかった。一方、全てのErbB2 ARTは、ErbB2陽性の腫瘍株(SK-OV3、MDA231およびMCF7)に対して強く反応するが、ErbB2陰性腫瘍MDA468には反応しない。4D5.BBZおよび2224.BBZは、それぞれErbB2およびEGFRに対するCARであった。

図33は、EGFRおよびErbB2 ARTの特異的溶解活性を示すグラフである。別々の実験において、EGFRとErbB2の両方について陽性である腫瘍細胞株SK-OV3に対する、2つのEGFR ARTおよび2つのErbB2 ARTの殺傷能力を、それらの関連するCARと比較して、試験する。ART T細胞は、関連するCAR T細胞と同じくらい効果的に腫瘍細胞を殺傷した。

図34Aは、TCRのアルファ鎖またはベータ鎖のいずれかのN'に親和性抗体模倣物およびHisタグ配列を付加することによる親和性抗体模倣物改変TCR (Affi-TCR)の概略図である。

図34Bは、親和性抗体模倣物再方向付けTCR (Affi-TCR) RNAをエレクトロポレーションされたT細胞の、Vb13.1 TCRおよびHisタグ検出を示すグラフのパネルである。T細胞に、NY-ESO-1 (1G4) TCRアルファ(a)およびベータ(b)、またはそれらのErbB2親和性抗体模倣物(342、342.15、342または342.4)改変体をコエレクトロポレーションした。一晩後、vb13.1およびHisタグをフローサイトメトリーによって検出した。

図34Cは、ErbB2親和性抗体模倣物の配列を示す。

図35は、Affi-TCR RNAをエレクトロポレーションされたT細胞のCD107aアップレギュレーションを示すグラフのパネルである。T細胞に、図34Bに示されるようにTCRアルファ(a)およびベータ(b)、またはそれらのErbB2親和性抗体模倣物(342、342.15、342または342.4)改変体をコエレクトロポレーションし、腫瘍株Nalm-6-ESO (NY-eso-1+, ErbB2-)、A549-ESO (NY-eso-1+, ErbB2+)、SK-OV3 (NY-eso-1-, ErbB2+)、A549 (NY-eso-1-, ErbB2+)、またはNalm6 (NY-eso-1-, ErbB2-)で刺激して、CD107aアッセイに供した。その結果は、ErbB2 Affi-TCRを有するT細胞がNy-ESO-1およびErbB2陽性腫瘍を特異的に認識できたことを示す。

図36Aは、CD3イプシロンのN'に親和性抗体模倣物およびG4Sリンカーを付加することによる親和性抗体模倣物改変CD3イプシロンの概略図である。

図36Bは、T細胞のエレクトロポレーションを示す表である。T細胞に、NY-ESO-1(1G4) TCRアルファ(a)およびベータ(b)を、またはErbB2親和性抗体模倣物(342、342.15、342または342.4)改変CD3イプシロン(e)と一緒に、コエレクトロポレーションした。

図36Cは、親和性抗体模倣物改変CD3イプシロンの共送達によるTCR発現および二重ターゲティングの維持を示すグラフのパネルである。図36BのT細胞の一晩培養後、vb13.1発現をフローサイトメトリーによって検出した。

これらの結果は、CD3イプシロンへの親和性抗体模倣物の付加がNY-ESO-1 TCR発現に与える影響は最小限であることを示し、親和性抗体模倣物改変TCR (EP2)での44.5％と比較して、全てのAffi-イプシロンをコエレクトロポレーションされたT細胞(EP3～EP6)では76.5％～82.9％のCD8/vb13.1二重陽性が示された。

図37は、Affi-TCR RNAをエレクトロポレーションされたT細胞のCD107aアップレギュレーションを示すグラフのパネルである。図36Bに示されるように、T細胞に、NY-ESO-1 (1G4) TCRアルファ(a)およびベータ(b)を、またはErbB2親和性抗体模倣物(342、342.15、342または342.4)改変CD3イプシロン(e)と一緒に、コエレクトロポレーションし、腫瘍株Nalm-6-ESO (NY-eso-1+, ErbB2-)、Nalm6 (NY-eso-1-, ErbB2-)、SK-OV3 (NY-eso-1-, ErbB2+)またはMDA231 (NY-eso-1-, ErbB2+)で刺激して、CD107aアッセイに供した。

これらの結果は、CD3イプシロンへの親和性抗体模倣物の付加がNY-ESO-1単一陽性腫瘍Nalm6-ESOを認識するNY-ESO-1 TCR機能に与える影響は最小限であることを示唆し、親和性抗体模倣物改変TCR (EP2)での33.1％と比較して、全てのAffi-イプシロンをコエレクトロポレーションされたT細胞(EP3～EP6)では約49.5％～53.3％のCD8/ CD107a二重陽性が示された。さらに、これらのAffi-イプシロンをコエレクトロポレーションされたT細胞(EP3～EP6)は、ErbB2陽性腫瘍であるSK-OV3およびMDA231細胞に対して親和性抗体模倣物改変TCR (EP2)よりも高い抗腫瘍活性を実証した。

実施例4：二重特異性T細胞誘導物(BiTE)、二重特異性抗体を有する改変T細胞
機能的なBiTEは、Bis-RNAをエレクトロポレーションされたT細胞から分泌されて、特異的な腫瘍反応性を伴ってT細胞に結合(engage)し得る：
Bis-RNAを導入されたT細胞(Bis-RNA T)は、機能的二重特異性T細胞誘導物(BiTE)を分泌する能力について試験され、Bis-RNAをエレクトロポレーションされたT細胞と非Bis-RNAエレクトロポレーションT細胞の両方において結合されたBiTEの役割が同定された。また、CAR RNAおよびBis-RNAを共導入したときの、T細胞の抗腫瘍活性の増加の可能性が評価された。

最初に、マウス由来のFab (mIgG Fab)を検出できる抗体を用いて、T細胞の表面染色を行った。陽性染色は、CAR (CAR RNA)またはBis-RNAをエレクトロポレーションされたT細胞に見出された(図38A、上のパネル)。Bis-RNA Tにより分泌されたブリナツモマブが他のT細胞にもロードされ得るかどうかを試験するために、GFP RNAをエレクトロポレーションされたT細胞(GFP T細胞)を、エレクトロポレーションの直後に(図38A、中のパネル)または染色前に(図38A、下のパネル)、Bis-RNA TまたはCAR-RNA Tと混合した。GFP-RNA T細胞は、Bis-RNA T細胞と共インキュベートされたときだけ、mIgG Fabについて陽性に染色され得るが、CAR19-RNA Tと共インキュベートした場合はそうでなかったことが見出され、Bis-RNA Tから分泌されたブリナツモマブはBis-RNA T細胞にだけでなく、他のT細胞にも結合され得ることが示唆された。

Bis-RNA T細胞、またはBis-RNA T細胞と共インキュベートされたGFP T細胞の機能は、該T細胞をCD19陽性腫瘍株(Nalm6、K562-CD19およびRaji)で刺激することによって、4時間のCD107aアッセイにおいて試験された。図38Bに示されるように、Bis-RNA T細胞の抗原特異的CD107aアップレギュレーションは、CAR-RNA T細胞の場合と同じくらい効果的であった。さらに、CAR-RNA T細胞およびBis-RNA T細胞での同様のレベルで、顕著な抗原特異的CD107aアップレギュレーションが、Bis-RNA-Tと共インキュベートされたGFP-RNA T細胞についても証明されたが、CAR-RNA T細胞と共インキュベートした場合はそうでなかった。

4時間の細胞傷害性Tリンパ球殺傷アッセイでは、Bis-RNA T細胞は、CAR19-RNA T細胞(CD19)と同じくらい効果的に腫瘍を殺傷することが判明した(図38C)。しかし、これらのT細胞を等量の非腫瘍反応性GFP-RNA T細胞と混合した場合、GFP-RNA T細胞と混合されたBis-RNA T細胞(Bis-RNA/GFP-T細胞)は、GFP RNA T細胞と混合されたCAR19-RNA T細胞(CD19/GFP-T細胞)よりも顕著に高い溶解能力を示した。これは、CAR19-RNA T細胞をGFP-RNA T細胞と混合したときにE：T比が低下したことに起因する可能性がある。一方、Bis-RNA T細胞をGFP-RNA T細胞と混合した場合には、GFP-RNA T細胞をBis-RNA T細胞から分泌されたブリナツモマブと結合させることによってGFP-RNA T細胞の特異的腫瘍反応性を可能にすることで、E：T比が維持された。ブリナツモマブBis-RNA T細胞は、CD19陽性細胞株、例えばK562-CD19、Nalm6およびRajiなど、によって刺激された場合にのみ活性化され、CD19陰性細胞株K562では活性化されなかったことは注目に値する。このことから、Bis-RNAの形態で導入されたBiTEは、抗原特異的様式でのみT細胞を活性化することが示された。

BiTEがBis-RNAをエレクトロポレーションされたT細胞によって産生され得ることをさらに確認するために、エレクトロポレーションT細胞から採取した10倍または100倍希釈した上清を、非エレクトロポレーションT細胞に添加し、CD107aアッセイのために腫瘍と混合した。非エレクトロポレーション非腫瘍反応性T細胞は、Bis-RNA T細胞から回収された上清を添加することにより、高度に腫瘍反応性になることが分かった(図45Aおよび45B)。

Bis-RNAエレクトロポレーションT細胞の増大した特異的T細胞活性化感受性および腫瘍殺傷能力ならびに長期腫瘍反応性：
腫瘍認識に対するBis-RNA T細胞の感受性を試験するために、T細胞に異なる用量のBis-RNAをエレクトロポレーションし、CD19 CAR RNAと比較した。同様の結果がCD107aアップレギュレーションから得られた(図39A)。

IFN-γ/グランザイムB細胞内染色(図39B)およびELISAでアッセイされたIFN-γ産生(図39C)の実験では、0.5μgほどの低用量のBis-RNAを使用した場合に顕著なT細胞活性化が観察された。さらに、1～2μgのBis-RNAは、依然として5～10μgのCD19 CAR RNAに匹敵していた。Bis-RNAが0.5μgの低用量であるにもかかわらず、Bis-RNA T細胞および共インキュベートされたGFP-RNA T細胞は、なおも有効な抗腫瘍活性を示した。

4時間細胞傷害性Tリンパ球アッセイでは、ブリナツモマブBis-RNAまたはCD19BBZ CAR RNAを1、5および10μg用量の異なるRNA量で含むT細胞の溶解能力が比較された。図39Dに示されるように、T細胞の殺傷能力は、Bis-RNAとCAR RNAのいずれにおいてもRNA用量との相関を示した。さらに、1μgのBis-RNAを有するT細胞は、1：1から30：1のエフェクター対標的比で10μgのCD19BBZ CAR RNAを有するT細胞と同様のレベルで腫瘍を殺傷した(図46)。

ブリナツモマブRNAをエレクトロポレーションされたT細胞の機能持続性を試験するために、CD19 CAR RNAとの比較で、増加する用量のRNAをT細胞にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後の異なる時間にCD19+腫瘍株でT細胞を刺激することによる抗原特異的なT細胞再活性化は、CD107aのアップレギュレーションレベルを調べることによって追跡した。エレクトロポレーション後の1日目について図39Aにすでに示されるように、RNA用量が1μgを超えてさえいれば、Bis-RNA T細胞は5～10μgのCD19-CAR-T細胞と同じくらい効果的に活性化され得る。

エレクトロポレーション後3日目に開始して、エレクトロポレーション後14日目まで、T細胞の機能持続性を追跡するために、新しい実験が設定された(図40Aおよび40B)。エレクトロポレーション後3日目に、5μgおよび10μgのRNAを有するBis-RNA T細胞は、高いCD107aアップレギュレーションによって証明されるように、非常に強い抗腫瘍反応性を依然として示したが、10μg CAR19-RNA T細胞の抗腫瘍反応性は1μg Bis-RNA T細胞レベルにまで低下することが見出された。8日目に、10μg CAR19-RNA T細胞の腫瘍反応性は、1μg Bis-RNA T細胞よりもはるかに低く、ほぼ陰性レベルに低下したが、5μgおよび10μgのRNAを有するBis-RNA T細胞では、その腫瘍反応性が依然として高レベルのままである。最も顕著には、エレクトロポレーション後12日目に、5μgおよび10μgのRNA用量のBis-RNA T細胞では、かなりの量のCD107aが依然として検出可能であった。これらの結果から、RNAエレクトロポレーションによって導入されてT細胞上に発現された機能的CARと比較して、BiTEは低い回転率でT細胞に安定してロードされ、T細胞の腫瘍反応性を比較的長時間維持し得ることが示される。

Bis-RNAを介してT細胞に提供されたBiTEの認識感受性を試験するために、CD19を異なるレベルで発現するK562細胞株を用いて、それぞれ5μgまたは10μgのCAR RNAまたはBis-RNAをエレクトロポレーションされたT細胞を刺激した。図40Cに示されるように、CAR RNAおよびBis-RNAの両T細胞は、0.001μgの同レベルでCD19を認識した。また、ErbB2を異なるレベルで発現するK562細胞株を用いて、4D5BBZ CAR RNAまたは4D5-CD3 Bis-RNAをエレクトロポレーションされたT細胞を刺激した。CD19抗原試験の場合に見出されたものと同様に、ErbB2 (4D5) CAR RNAおよびBis-RNAはどちらも、IFN-γ分泌(図40D)とCD107aアップレギュレーション(図47)の両方によって証明されるように、0.1μgレベルで該抗原を認識することができた。

Bis-RNAエレクトロポレーションT細胞の、より低い、共刺激依存性の分裂および増殖：
T細胞の分裂および増殖は、ブリナツモマブBis-RNA T細胞またはCD19 CAR-RNA T細胞を、CD19発現K562およびK562 (K562-CD19/K562)で、またはK562-CD19およびCD86発現K562 (K562-CD19/K562-CD86)で刺激することによって試験された。T細胞をK562-CD19で共刺激を与えずに刺激した場合、Bis-RNA T細胞は、1μgという低いRNA用量でさえも、効率よく分裂することができた。対照的に、CAR-RNA T細胞の分裂は、効率がずっと低いままであり、これは、1μgのRNA用量でT細胞の分裂がほとんど検出されなかったという事実により証明された。10μgのRNA用量でさえ、CAR-RNA T細胞は、1μgのRNA用量でのBis-RNA T細胞ほど効率よく分裂しなかった(図41Aおよび48A)。

Bis-RNA T細胞のT細胞分裂の程度は、細胞の増殖および拡大(T細胞の分裂と生存の両方に依拠する)と相関した。図41Bの左のパネルに示されるように、Bis-RNA T細胞のみが、1μgのRNA用量でさえ、T細胞の拡大を示した。CAR-RNA T細胞は、全てのRNA用量でT細胞の拡大を示さなかった。5μgおよび10μgのRNA用量でのCAR-RNA T細胞はかなりのCFSE希釈を示したが、T細胞の拡大は検出されなかった。これらの結果から、刺激プロセスの間に追加の共刺激シグナルを供給することなく、Bis-RNA T細胞は、T細胞の分裂、増殖および生存を維持するのに十分な刺激シグナルを受け取ることがまだ可能であったが、CAR-RNA T細胞によって受け取られた刺激シグナルは、分裂している細胞の大部分が生存するには不十分であったことが示唆される。

共刺激にCD28シグナルを追加することによって、CD28共刺激は、CAR-RNA T細胞の分裂(全てのRNA用量で)および増殖(10μgのRNA用量でのみ)を大幅に高めることが見出された。一方、CD28共刺激は、全てのBis-RNA用量で、細胞増殖を高めると共に、Bis-RNA T細胞の分裂をわずかに増加させた(図41B、48Aおよび48B)。

T細胞が減少する量のBis-RNAで効果的に活性化され得るかどうか、ならびに刺激に対するT細胞状態の影響をさらに試験するために、CD45RO+メモリまたはCD45RO-ナイーブT細胞のCFSE希釈および細胞増殖が、RNAの異なる用量を用いて評価された。0.2μgという低用量のRNAをエレクトロポレーションされたT細胞は、T細胞のCFSE希釈、およびK562-CD86で共刺激されたCD45RO-ナイーブ細胞またはCD45RO+メモリ細胞の細胞拡大によって証明されるように(ほとんどの場合に5μgのCD19BBZ RNAを有するT細胞と同等)、効果的に活性化され得ることが見出された(図41C、41D、および48C)。これにより、Bis-RNAを有するT細胞は、CAR RNAを有するT細胞よりも、T細胞活性化に対して感受性であり、かつ共刺激への依存が低いことがさらに確証される。

興味深いことに、Bis-RNA T細胞およびCAR-RNA T細胞のCFSE希釈とIFN-γレベルとの間に正の相関が認められたが、CFSE希釈とIL-2レベルとの間には逆の相関が見られた。CFSE標識T細胞の刺激の8日後、培養上清中のサイトカインを調べた(図41Aおよび48D)。その結果、Bis-RNA T細胞はより高いIFN-γ産生を示し、より完成したT細胞活性化を示した。Bis-RNA T細胞はまた、培地に補充されたIL-2 (10IU/mL)のより高い消費を示し、より高いレベルのT細胞増殖を示唆した(図48E)。Bis-RNA T細胞の増大したT細胞活性化はまた、サイトカインおよびケモカインのパネルを調べることによっても証明され、偏光依存性(polarization preference)なしで、アッセイされたほとんどのサイトカインおよびケモカインの全体的増加が示された(図49B)。

CAR RNA T細胞のCD28共刺激依存性は、CD28シグナル伝達部分が存在しないBBZ構成の使用に起因したことを排除するために、CD19-28Z CAR RNAを加えて、CAR RNAおよびBis-RNAをエレクトロポレーションされたT細胞の分裂および増殖能力を評価した。CD19-28Z CAR RNA T細胞のCFSE希釈(図48F)およびT細胞拡大(図48G)は、追加のCD28共刺激を含むまたは含まないCD19+腫瘍株で刺激した際に、CD19BBZ CAR RNA T細胞と比較して、わずかに増加したことが見出された。

5μg CD19-28BBZ CAR RNA T細胞のCFSE希釈および細胞拡大の評価は、追加のCD28共刺激の存在下でさえ、1μg Bis-RNA T細胞よりも大幅に低かった。4時間の細胞傷害性Tリンパ球アッセイでは、CD19BBZおよびCD19-28Z RNAをエレクトロポレーションされたT細胞は両方とも同様の溶解能力を有するが、ブリナツモマブRNA (Blina)を有するT細胞はCAR RNA T細胞よりも強力な殺傷能力を示すことが分かった(図48H)。

白血病マウスモデルにおけるBis-RNA Tの増強された抗腫瘍活性：
上記の知見は、Bis-RNA T細胞が、CAR RNA T細胞と比較して、増加したCD107aアップレギュレーション、サイトカイン産生、腫瘍溶解能力、および細胞分裂・増殖能力によって実証された、インビボでの増強された機能性を有し得ることを示唆している。NOD-SCID-γc-/- (NSG)マウスが緑色ルシフェラーゼ形質導入Nalm6細胞(Nalm6-CBG)を受け取ってから7日後、該マウスは、示されるようにCD19BBZ RNA CAR (RNA CAR)および/またはブリナツモマブBis-RNAをエレクトロポレーションされたT細胞により治療された(図42Aおよび42B)。

単回用量のT細胞で治療されたマウスでは、CAR RNA T細胞は、対照CAR RNA T細胞(ss1BBZ)で治療されたマウスと比較して、顕著な腫瘍組織量の減少を示した。Bis-RNA T細胞、またはCAR RNAとBis-RNAの両方をコエレクトロポレーションされたT細胞で治療されたマウスは、約1～2 log腫瘍密度減少によって証明されるように、増強された腫瘍退縮を示した。腫瘍担持マウスを複数回のT細胞注入により治療した場合、CAR RNA T細胞およびBis-RNA T細胞で治療された両グループのマウスの腫瘍組織量は、バックグラウンドレベルにまで低下した。

インビボでのBis-RNA T細胞の増強された抗腫瘍活性が該細胞の持続性の増加によるものかどうかを評価するために、ヒトT細胞を単回注入されたマウスを安楽死させて、骨髄および脾臓由来の細胞を機能解析のために精製した。T細胞を、CD19陽性細胞株K562-CD19で刺激した後、CD137発現(図42C)、IFN-γ産生(図42D)、およびCD107a発現(図42E)について解析した。CD19BBZ CAR T細胞(CAR RNA T)およびCD19 Bis-RNA T細胞(Bis-RNA T)は、3つの機能アッセイの全てにおいてT細胞注入後1日目に特異的抗原刺激に対する高い反応性を示した。注入後3日目に、CAR RNA T細胞はまだ若干の抗腫瘍活性を示したが、注入後7日目には、CAR RNA T細胞とBis-RNA T細胞のどちらにも抗腫瘍活性がほとんど存在しなかった。

異なる腫瘍抗原を標的とする異なるscFvを用いたBis-RNAの作製：
マウスscFvに由来するCARの免疫原性は、CAR治療を脅かす潜在的な制限である。有害な免疫反応が惹起される場合には、しばしば、その免疫応答はマウスモノクローナル抗体に通常由来する細胞外抗原認識ドメインに対して向けられる(Lamer et al., Blood 117:72-82, 2011)。完全ヒトCD19-CD3 Bis-RNAを作製するために、ヒト抗CD19 scFv (21D4)およびヒト抗CD3 scFv (28F11)を選択した。VHおよびVL鎖の各一本鎖可変フラグメント(scFv)を作製することの初期の試みは、完全ヒトCD19-CD3 Bis-RNAが検出可能な機能を欠いていることを示した。異なるVL/VH配列であるD4-F11HLHLを有する新しい構築物が作製された。

図43Aに示されるように、D4-F11HLHL Bis-RNAの発現は、90％を超えるCD107aのアップレギュレーションを示したのに対して、CD19 CAR RNA (CD19BBZ)およびブリナツボマブBis-RNA (Blina-Bis-RNA)のいずれかをエレクトロポレーションされたT細胞は、CD107aをそれぞれ78.89％および80.96％アップレギュレートした。

完全ヒトD4-F11HLHL Bis-RNAの機能性をさらに確認するために、エレクトロポレーションされたT細胞を異なるCD19陽性細胞株で刺激した。CD19細胞と一晩共培養した後に、IFN-γおよびIL-2レベル(図49A)を検出した。D4-F11 HLHLを発現するT細胞は、CD19 CAR RNAまたはブリナツボマブBis-RNAを発現するT細胞と比較して、顕著に高いレベルのIFN-γを産生した(図43B)。サイトカイン産生プロファイルは、TNF-α、IL-2、IL-10、IFN-γおよびGM-CSFについてCD19 CAR RNA T細胞と比較したとき、D4-F11 Bis-RNA T細胞からはサイトカイン産生の約2～5倍増加が観察されたことを示した(図49B)。これらの結果から、CD19-CD3 Bis-RNAをエレクトロポレーションされたT細胞ではT細胞機能の全体的な増強が示された。

FMC63抗CD19 scFvベースのCARは、CD19 CAR RNAとブリナツボマブベースのBis-RNAとの比較の多くに使用された。FMC63 scFvからBis-RNAを作製することの困難性にもかかわらず、FMC63 scFvからのCAR RNAは、ブリナツボマブ抗CD19 svFc (HD37)由来のBis-RNAよりも高い機能性を示した。

CAR RNA T細胞とBis-RNA T細胞との機能的差異が、CARおよび二重特異性抗体において使用された異なるscFvによるのかどうかを判断するために、抗CD19 scFv (21D4)を用いて完全ヒトCAR、D4BBZを作製し、1μgおよび10μgのRNA用量の2つのCD19 CAR (FMC63 CARおよび21D4 CAR)および2つのCD19-CD3 Bis-RNA (HD37 Bis-RNAおよび21D4 Bis-RNA)と比較した。IFN-γおよびIL-2のサイトカイン産生(図49C)およびCD107a発現は、21D4 CARがFMC63 CARに匹敵し、それよりわずかに機能的であることを示した。21D4 Bis-RNA (D4-F11)を有するT細胞は、特に低RNA用量で、大幅に増加したサイトカイン産生およびCD107a発現によって証明されるように(図49D)、はるかに強い抗腫瘍活性を示した。

完全ヒトCD19 Bis-RNA (D4-F11)の抗腫瘍活性を試験するために、Nalm6-CBG細胞を担持するNSGマウス(N＝6)を、CD19BBZもしくはD4F11レンチウイルス形質導入T細胞、または19BBZもしくはD4F11 RNAをエレクトロポレーションされたT細胞で治療した(図43E)。CD19BBZまたはD4F11レンチウイルス形質導入T細胞を比較すると、D4F11を用いたレンチウイルス形質導入は、CD19BBZレンチウイルス形質導入よりもT細胞のより高い抗腫瘍活性をもたらした。CD19BBZ CAR RNAまたはD4F11 Bis-RNAをエレクトロポレーションされたT細胞は、当初は動物において腫瘍増殖を制御した(図49E)。しかし、両グループの動物には残存疾患が依然として存在していたが、レンチウイルス形質導入T細胞を受け取った動物には残存疾患がなかった。

他の腫瘍抗原特異的scFvをBis-RNAに変換することの実施可能性を試験し、かつBis-RNAが作製され得るかどうかを試験するために、メソテリン、cMet、PSCAまたはGD2 CARからのscFvを用いてBis-RNAを作製した。これらのBis-RNAをエレクトロポレーションされたT細胞上のscFvの表面染色は、メソテリン、cMetおよびPSCAについて陽性染色を示したが、GD2については示さなかった(図43C)。同様に、抗原特異的CD107aアップレギュレーションは、関連するCAR RNAを有するT細胞、ならびにメソテリン、cMetおよびPSCA Bis-RNAをエレクトロポレーションされたT細胞において観察されたが、GD2 Bis-RNAでは見られなかった(図43D)。

さらに、EGFRviii (MR-1および139)およびErbB2 (4D5)の3つの機能的Bis-RNAを作製した(図49F、49Gおよび49H)。したがって、8つのCARのうち7つをBis-RNAに変換することができた。

さらに、メソテリンBis-RNAをエレクトロポレーションされたT細胞をメソテリン陰性細胞株K562-PSCA、LY5YおよびK562と共にインキュベートした場合、非特異的T細胞活性化はほとんど見られないことが判明した。ところが、メソテリンCAR RNAを有するT細胞は、非特異的T細胞活性化をしばしば示し、CD107a発現が陰性対照に対して46％～55％で残存した(図43D)。これらのデータは、CARをBis-RNAに変換することが、一部のCARに関連するオンターゲットまたはオフターゲットの毒性を予防するなどの、潜在的な治療効果を有する可能性があることを示唆している。

Bis-RNA T細胞における腫瘍関連抑制に対する抵抗性：
Bis-RNA T細胞は、CAR-RNA T細胞と比較したとき、より高いサイトカイン産生、増大した増殖、溶解能力の増加、およびより少ない共刺激依存性を示した。このような特性は、Bis-RNA T細胞が完全に機能的であり、制御性T細胞による抑制およびプログラム細胞死1 (PD1)受容体-リガンド相互作用からの影響など、腫瘍関連抑制を受けにくいことを示している。

T細胞機能に対するPD1の影響を試験するために、T細胞にCD19 Bis-RNAまたはCAR RNAおよびPD1 RNAを異なるRNA用量でコエレクトロポレーションし、CD19陽性腫瘍細胞で刺激した。その結果は、5μgまたは10μgのPD1 RNAをコエレクトロポレーションされたT細胞が、特異的抗原刺激に対するCAR-RNA T細胞応答を顕著に減少させ、CD107a発現(図44A)およびサイトカイン産生(IFN-γおよびIL-2)(図44Bおよび50)を低下させることを示した。しかしながら、T細胞機能は、10μgのPD1 RNAを含む1μgおよび5μgのBis-RNAではPD1による影響が最小限であり、10μgのBis-RNAではT細胞機能への明らかな負の影響はなかった。

Bis-RNA T細胞が制御性T細胞(Treg)誘導抑制に対してより多くの抵抗性を示すかどうかを試験するために、精製TregをCFSE標識Tエフェクター細胞に添加した。Tエフェクター細胞にBis-RNAまたはCAR RNAをエレクトロポレーションし、異なるTエフェクター：Treg比でCD19陽性細胞株により刺激した。増殖の抑制は、CFSEシグナルの経時的希釈を示す非Treg抑制細胞と比較して、CFSE標識細胞の維持として証明された(図44D)。CFSEシグナルの減少から、Tregは4：1および8：1のTエフェクター：Treg比でCD19 CAR (19BBZ)をエレクトロポレーションされたT細胞の増殖を抑制したことが示された。しかし、ブリナツモマブBis-RNA (Bis-RNA)をエレクトロポレーションされたT細胞では(4：1のTエフェクター：Treg比)、より少ないTreg抑制がはっきりと認められた。Bis-RNA T細胞の場合、8：1のTエフェクター：Treg比以上では有意なTreg抑制が観察されなかった(図44C)。

刺激(細胞表面に発現された抗CD3 scFv)および共刺激(CD28および4-1BB)を単一分子において組み合わせることは、効率的なT細胞の拡大および活性化を支援するための必須成分を提供する。共刺激分子を共導入することにより、新規なT細胞集団は、T細胞治療効果にとって重要な2つの特性である、強力な溶解能力を備えたセントラルメモリ表現型を有しており、これは現在のT細胞方法論には欠けている。

腫瘍認識に対するブリナツモマブRNA (Bis-RNA) T細胞の感受性を試験するために、T細胞に異なる用量のBis-RNAをエレクトロポレーションし、CD19 CAR RNAと比較した。同様の結果がCD107aアップレギュレーションから得られた(図51A)。

IFN-γ/グランザイムB細胞内染色(図51B)およびELISAでアッセイされるIFN-γ産生(図51C)を用いた実験では、わずか0.5μgのBis-RNAをエレクトロポレーションした場合でも顕著なT細胞活性化が観察された。さらに、1～2μgのBis-RNAは、該アッセイにおいて5～10μgのCD19 CAR RNAに匹敵していた。0.5μgという少量のBis-RNAでさえ、Bis-RNA T細胞および共インキュベートされたGFP-RNA T細胞は、依然として効果的な抗腫瘍活性を示した。

4時間細胞傷害性Tリンパ球アッセイでは、Bis-RNAまたはCD19BBZ CAR RNAの1、5および10μg用量での異なる量のRNAを有するT細胞の溶解能力が比較された。図51Dに示されるように、T細胞の殺傷能力は、Bis-RNAとCAR RNAのいずれにおいてもRNA用量と相関していた。

Bis-RNAをエレクトロポレーションされたT細胞の機能持続性を試験するために、CD19 CAR RNAと比較して、増加する用量のRNAをT細胞にエレクトロポレーションした。CD107aアップレギュレーションレベルは、エレクトロポレーション後の異なる時点でCD19+腫瘍細胞株によるT細胞の抗原特異的再活性化後に評価した。エレクトロポレーション後1日目に、RNA用量が1μgを超えさえすれば、Bis-RNA T細胞は、5～10μgのCD19-CAR RNAをエレクトロポレーションされたT細胞と同じくらい効果的に活性化された(図51A)。

PD-L1をブロックする一本鎖可変フラグメント(scFv)(特許番号AU2006265108A1から)と抗CD28 scFv (1412、US7,585,960 B2)を有する4つの二重特異性抗体の構築物を設計し、PCRにより合成した(図52)。配列確認されたDNAをpGEM.64AベースのRNAインビトロ転写ベクターに適切にクローニングしてpGEM.10A5-1-1412、pGEM.13G4-1412、pGEM.1b12-1412およびpGEM.12A4-1412を作製した；図53を参照されたい。

ELISAで検出されたサイトカイン(IL2、図54AおよびIFN-γ、図54B)産生は、PD1-CD28スイッチ受容体、10A5-1412 (aPDL1-aCD28二重RNA)、および13G4-1412 (aPDL1-aCD28二重RNA)が、IL-2とIFN-γの両方の分泌を増加させることによってT細胞機能を顕著に改善することを示した。機能のスイッチは、PD1陰性シグナルがCD28陽性シグナルに切り替えられたことを示唆する。Bis-RNAスイッチ受容体、10A5-1412 (aPDL1-aCD28二重RNA)、および13G4-1412 (aPDL1-aCD28二重RNA)を有するT細胞は、増加したサイトカイン産生を示し、これらの操作されたT細胞が、T細胞機能をプラスに改善する活性化分子を送達したことを示唆する。

抗aTGFbRII-1、抗aTGFbRII-3 (米国特許第8,147,834号から)および抗CD28 scFv (1412、米国特許第7,585,960号)を含む構築物を設計し、PCRにより合成した。配列確認されたDNAをpGEM.64AベースのRNAインビトロ転写ベクターに適切にクローニングしてpGEM.aTGFbR-1-1412およびpGEM.aTGFbR-3-1412を作製した；図55を参照されたい。

図56Aは、4D5-CD3 Bis-RNAをエレクトロポレーションされたT細胞が、ErbB2を過剰発現する腫瘍細胞に反応したことを示すグラフである。ErbB2 CARまたはBis-RNAをエレクトロポレーションされたT細胞を、高レベルのErbB2、SK-OV3およびN87、または低レベルのMFC-7、MDA-231、PC3およびA549を発現する腫瘍株で刺激した。CD107aアッセイは、4D5-6.CD3を発現するT細胞がErbB2過剰発現腫瘍細胞に対してのみ反応性であることを示した。図56Bは、図56Aの実験の繰り返しの結果を示すグラフのパネルである。

図57は、4D5-CD3 Bis-RNAをエレクトロポレーションされたT細胞のErbB2過剰発現腫瘍細胞に対する溶解活性を示すグラフのパネルである。ErbB2 CARまたはBis-RNAをエレクトロポレーションされたT細胞を、ErbB2過剰発現腫瘍細胞SK-OV3-CBGまたはErbB2低発現腫瘍細胞mel624 (624-CBG)に対するそれらの溶解活性について試験した。ルシフェラーゼに基づくCTLアッセイは、親和性を調節したBebB2 CAR、4D5-5.BBZおよび4D5-3.BBZと同様に、4D5-6.CD3を発現するT細胞がErbB2過剰発現腫瘍細胞SK-OV3に対してのみ反応性であることを示した。

図58は、4D5-CD3 Bis-RNAをレンチウイルスで形質導入されたT細胞が、ErbB2過剰発現腫瘍細胞に対して反応性であることを示すグラフのパネルである。ErbB2 CARまたはBis-RNAを形質導入したT細胞を、高レベルのErbB2、SK-OV3およびN87、または低レベルのMDA-231、PC3およびA549を発現する腫瘍株で刺激した。CD107aアッセイは、4D5-CD3を発現するT細胞がErbB2過剰発現腫瘍細胞に対してのみ反応性であることを示した。

図59は、4D5-CD3 Bis-RNAをレンチウイルスで形質導入されたT細胞が、ErbB2過剰発現腫瘍細胞に対して反応性であることを示すグラフのパネルである。示されるようにErbB2 CARまたはBis-RNAを形質導入したT細胞を、高レベルのErbB2、SK-OV3およびN87、または低レベルのMDA-231、PC3およびA549を発現する腫瘍株で刺激した。ELISAでアッセイされたサイトカイン産生は、T4D5-CD3を発現するT細胞が、ErbB2過剰発現腫瘍細胞に対してのみ反応性であることを示す。

図60Aは、親和性を調節したErbB2 BiTE細胞が治療指数を増加させ、マウスにおいて進行性血管新生腫瘍の退縮を誘導することを示す画像のパネルである。レンチウイルス形質導入により異なる親和性のErbB2 CARまたはBiTEで改変されたT細胞を、二重腫瘍移植NSGマウスにおいて試験した。0日目にマウス(n＝4～5)の右脇腹にPC3-CBG腫瘍細胞(1×10⁶個/マウス、皮下)を移植した。5日目に、同じマウスの左脇腹にSK-OV3-CBG腫瘍細胞(5×10⁶個/マウス、皮下)を投与した。PC3腫瘍接種後23日目にマウスをT細胞(静脈内)で治療した。T細胞は、1×10⁷個/マウスの単回注入として投与した。非形質導入T細胞(TDなし)で治療されたマウスを対照として使用した。PC3腫瘍接種後の示された時点で動物を画像化した。図60Bは、二重腫瘍移植NSGマウスモデルにおけるSK-OV3腫瘍サイズを示すグラフである。腫瘍サイズを測定し、腫瘍体積を計算して、プロットした。図60Cは、二重腫瘍移植NSGマウスモデルにおけるPC3腫瘍サイズを示すグラフである。腫瘍サイズを測定し、腫瘍体積を計算して、プロットした。

図61Aは、PD1-CD28スイッチ受容体および親和性調節T4D5-6.CD3 BiTEを共発現させるための構築物の図である。図61Bは、PD1-CD28およびT4D5-CD3共発現ベクターをレンチウイルスで形質導入されたT細胞のPD1-CD28スイッチ受容体の検出を示すグラフのパネルである。

図62Aは、PD1-CD28スイッチ受容体およびT4D5-6.CD3親和性調節BiTEの両方を共発現するT細胞の増大した溶解活性を示すグラフである。

図62B～62Gは、正常ドナーから直接単離されたT細胞のために変更されたDudley et al., J. Immunol., 26(4):332-342, 2003の急速拡大プロトコル(REP)によって作製されたBis-RNAエレクトロポレーションT細胞を示す画像のパネルである。Bis-RNAをエレクトロポレーションされたT細胞はインビボでの抗白血病活性をさらに改善した。REP条件下で、flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3およびc-kitリガンドなどの、1つ以上の因子と共にT細胞を培養する。REPまたは抗CD3/抗CD28ビーズ(ビーズ)によって拡大されたT細胞の表現型を評価した(図62B)。REP T細胞または抗CD3/抗CD28ビーズT細胞に、異なる量のCAR RNAまたはBis-RNAをエレクトロポレーションして、異なる細胞株で18時間刺激した。CD137のアップレギュレーションをフローサイトメトリー(CD3+ T細胞にゲーティング)によって解析した(図62C)。溶解活性は、異なる量のCAR RNAまたはブリナツモマブBis-RNAをエレクトロポレーションされたREP T細胞(図62D、左のパネル)または抗CD3/抗CD28ビーズT細胞(図62D、右のパネル)において測定した。NSGマウスに1×10⁶個のNalm6-CBGを静脈内注入し、5日後に最初の治療のために30×10⁶個のCAR RNAまたはブリナツモマブBis-RNA (Blina) T細胞で治療し、続いてNalm6-CBG注入後8日目に開始して、5×10⁶個ずつで週2回、3週間治療した。示された時点に生物発光イメージング(BLI)を実施し(図62E)、BLIおよび生存率の結果をそれぞれ図62Fおよび図62Gにプロットした。

図62H～62Iは、膜結合OKT3を発現するK562ベースの人工抗原提示細胞(aAPC)の作製を示す画像のパネルである。CD8ヒンジおよびトランスメンブレン(OKT3.8)またはCD8ヒンジおよびCD28トランスメンブレン(OKT3.8.28)のいずれかを有するOKT3の膜形態のキメラタンパク質を発現するレンチウイルスベクター(pLENS)を図62Hに示す。K562ベースのaAPC、K562-CD86-CD137L (KT)またはK562-CD137L (2D11)細胞株にレンチウイルスOKT3.8またはOKT3.8.28を形質導入し、膜結合OKT3の発現をマウスIgG Fabに対する抗体を用いて検出した(図62I)。

図62Jは、膜結合OKT3を形質導入したK562 aAPCクローンの特性解析を示す画像のパネルである。限界希釈による該クローンの選択は、OKT3.8.28形質導入KT aAPCからの膜結合OKT3の発現に基づいた。

図62K～62Mは、K562ベースの人工aAPCを用いたREPを示すグラフのパネルである。図62Kは、OKT3をロードしたK562-CD86-CD137L (KT)もしくはK562-CD137L (2D11)、または膜結合OKT3を発現するKT (KT.OKT)を照射し、1日間(D1)または2日間(D2)培養してからT細胞：aAPC比1：250でT細胞を刺激するために使用したことを示すグラフである。図62Lは、独立してREPにおいて拡大し、CD62LおよびCD28について染色された、拡大されたT細胞を示すグラフのパネルである。図62Mは、KT細胞と比較した、REP実験における異なるB細胞株を示すグラフである。

実施例5：改変TCRを発現するT細胞
レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターにより抗腫瘍抗原TCR再方向付けTリンパ球で治療されたがん患者は、期待できる結果を示す。この研究では、がんの養子免疫療法の効果的な治療法を開発できるかどうかを判断するために、T細胞にRNAをエレクトロポレーションした。該T細胞を比較することによって、1)腫瘍抗原(NY-ESO-1)に対する野生型(wt)TCRまたは高親和性TCRを発現するTリンパ球のインビボ効力、および2)レンチウイルスベクター形質導入T細胞のインビボ効力を、野生型(wt)TCRまたは高親和性TCRを発現するRNAエレクトロポレーションT細胞と比較して、Naml6白血病およびA549肺がんマウスモデルにおいて評価した。

TCR再方向付けT細胞養子免疫療法を改善するために、T細胞にTCR RNAをエレクトロポレーションし、該細胞を白血病マウスモデルに注入した。NOD/SCID (NSG)マウスモデルでは、NY-EOS-1野生型TCRを発現する、レンチウイルス形質導入T細胞およびRNAをエレクトロポレーションされたT細胞はどちらも、より高い親和性のTCRと同様の治療効力を有する(図63、64および65)。HLA-A2+, CD19+白血病細胞株Naml6にNY-ESO-1を形質導入してNaml6-ESO腫瘍細胞を作製した。100万個のNaml6-ESO細胞をNSGマウスに注入し、腫瘍接種後5日目または7日目(示される通り)に該マウスにT細胞を注入した。腫瘍担持マウスを、NY-ESO-1(1G4)野生型TCR RNA (wt1G4)またはその高親和性形態(LY95a)のいずれかをエレクトロポレーションされたT細胞で治療した。NY-ESO-1野生型TCR RNAをエレクトロポレーションされたT細胞は強力な抗腫瘍活性を示したが、高親和性NY-ESO-1 TCRを有するT細胞はそれほど強力でないことが分かった(図63)。

Naml6-ESO白血病およびA549肺がんNSGモデルの両方において、TCR(高親和性または野生型)RNAをエレクトロポレーションされたT細胞は、高親和性または野生型TCRを有するレンチ-形質導入T細胞よりもかなり良好ながん治療効力を示した(図64および65)。TCR RNAをエレクトロポレーションされたT細胞の複数回注入は、高親和性TCRまたは野生型TCRのいずれかを発現するレンチウイルス形質導入T細胞の単回投与よりも長く腫瘍増殖を制御した。これは、エレクトロポレーションされたT細胞による一過性にすぎない治療効果を示した(図64)。レンチ-形質導入またはRNAエレクトロポレーションのいずれかによって野生型TCRまたは高親和性TCRを導入されたT細胞を、A549肺がんモデルにおいて試験した。野生型および高親和性TCR RNA T細胞はどちらも腫瘍を制御したが、レンチウイルスで形質導入された野生型または高親和性TCRを有するT細胞は、TCR RNA T細胞と比較して、ごくわずかな最小限の治療を示したにすぎないことが見出された(図65)。図66～68は、TCR RNAをエレクトロポレーションされたT細胞がレンチ-形質導入T細胞よりも効果的に腫瘍細胞増殖を制御したことをさらに示している。

前臨床動物データに基づくと、野生型および高親和性の両方の、レンチ-TCR形質導入T細胞はRNAの単回投与で発現し(図64および65)、レンチ-TCR RNA T細胞はレンチ-CAR T細胞ほど効果的に増殖しかつ持続することができないことを示している。これは、適切な共刺激シグナルの欠如に起因する可能性がある。TCRとCD3 RNAとのコエレクトロポレーションは、図69～80に示されるように、T細胞の抗腫瘍活性をさらに増強した。図69は、CD3構築物の図、ならびにTCRおよびCD3 RNAをエレクトロポレーションされたT細胞におけるTCRおよびCD3発現を示すグラフのパネルである。図70および71は、エレクトロポレーションされたT細胞において検出されたTCR (vb13.1)、CD3およびTCR (vb13.1)/CD3の発現レベルを示すグラフである。図72～74は、感染効率を示す表を示す。図75～80は、CD3と共にまたはCD3なしでTCR RNA (y軸)をエレクトロポレーションされ、異なる腫瘍細胞株(x軸)とインキュベートされたT細胞を示す。

CD3は、TCR媒介性のT細胞機能にとって非常に重要な成分である。CD3/TCR複合体は、6つの異なる分子から構成される。TCRのアルファ鎖とベータ鎖に加えて、次の4つのCD3ユニットが存在する：ガンマ、デルタ、イプシロンおよびゼータ。CD3サブユニットの異なる組み合わせと共に抗NY-ESO-1 TCR (1G4)からのTCRアルファおよびベータ鎖をコードするRNAの293細胞へのコエレクトロポレーションによって、最大TCR/CD3発現は、4つ全てのCD3サブユニットを導入することによって達成されることが見出された。図81および82に示されるように、最大T細胞機能は、CD3の4つのサブユニットの全てをTCR RNAと共導入することによって達成された。CD3およびTCRサブユニットのさまざまな組み合わせは多かれ少なかれT細胞機能の増強を示したが、イプシロンとゼータが最も高い機能性を備えていた。CD3ゼータとTCR RNAは、TCR単独またはTCRと他のサブユニットに比較して、かなりの機能増強を示した。例えば、CD3/TCRは、デルタ＋イプシロン＋ゼータ、ガンマ＋イプシロン＋ゼータ、イプシロン＋ゼータなど、3つまたは2つのサブユニットのみをコエレクトロポレーションした場合に発現され、イプシロンとゼータはTCR/CD3発現にとって相対的に必須であることが示される(図81および82)。腫瘍特異的なT細胞機能は、1G4アルファ/ベータTCRを、CD3サブユニットの異なる組み合わせと共導入することによって試験した。図83は、腫瘍細胞で刺激されたTCR RNAおよびCD3 RNAコエレクトロポレーションT細胞におけるCD107aアップレギュレーションを示すフローグラフのパネルである。図84、85および86は、異なる腫瘍細胞株とのインキュベーション後の、TCR RNAおよびCD3 RNAの異なる組み合わせをエレクトロポレーションされたT細胞におけるIFN-γおよびIL-2発現を示す。

したがって、複数のRNA鎖のコエレクトロポレーションが技術上の難題を提起する場合には、4つ全てのサブユニットの代わりに、CD3イプシロンおよびゼータ、またはゼータ単独を最小限に共導入することが、可能性のある治療手段であり得る。

1G4 TCRアルファ-41BB、CD3ゼータ-41-BB、およびCD3イプシロン-4-1BB構築物は、4-1BB細胞内部分を1G4 TCRアルファ、CD3ゼータまたはCD3イプシロンのC末端に直接融合することによって作製された。これらの改変されたTCRまたはCD3構築物のRNAエレクトロポレーションは、TCR複合体への4-1BBの組み込みがTCRの発現および機能性を可能にすることを示した(図87および88)。TCRアルファおよび/もしくはベータ鎖またはCD3ゼータおよび/もしくはCD3イプシロンのC末端への共刺激シグナルの付加は、T細胞機能を依然として維持し(図89～92)、かつT細胞に直接的な共刺激シグナルを潜在的にもたらした。

TCRへの第2ジスルフィド結合の付加、およびTCRベータ鎖からのN-グリコシル化部位の除去は、TCR RNAをエレクトロポレーションされたT細胞のインビトロおよびインビボの両機能をさらに増強した(図93および94)。図93に示されるように、TCRのアルファ鎖および/またはベータ鎖に変異を生じさせ、アルファ鎖とベータ鎖の異なる組み合わせをT細胞にエレクトロポレーションした。最大のトランスジーン発現(図93A)および機能性(溶解能力)(図93Cおよび93D)は、第2ジスルフィド結合を付加し、かつベータ鎖から特定のN-グリコシル化部位を除去することにより(Sa/S-Db)、見出されることが分かった(図93B)。動物実験では、アルファ鎖またはベータ鎖(m1G4)のいずれかに第2ジスルフィド結合を有するT細胞が、野生型TCR (wt1G4)をエレクトロポレーションされたT細胞またはCD19 CAR T細胞と比較された(図94)。改変TCR (m1G4)を有するT細胞は、野生型TCR (wt1G4)を有するT細胞よりも良好な治療を示したことが見出され、第2ジスルフィド結合および/またはN-脱グリコシル化でTCRを改変することによって治療が改善され得ることが示される。

興味深いことに、TCRアルファ鎖にジスルフィド結合を付加すると、T細胞機能が損なわれた。図95は、TCRアルファ鎖におけるN-脱グリコシル化が、TCRまたはハイブリッドTCRへのジスルフィド結合の付加と比較して、RNAをエレクトロポレーションされたT細胞の機能を損なったことを示す画像のパネルである。

マウスTCR定常領域に由来する定常領域を有するハイブリッドTCRが機能性に影響を与えるかどうかを調べるために、マウス定常領域を含むハイブリッドTCRをT細胞にエレクトロポレーションした。図96は、マウス定常領域を含むハイブリッドTCRをコードするRNAをエレクトロポレーションされたT細胞のトランスジーン発現および機能性を示す画像のパネルである。図97は、マウスモデルに注入された腫瘍細胞およびハイブリッドTCR T細胞の蛍光を経時的に示す画像のパネルである。図98は、アルファ鎖およびベータ鎖へのジスルフィド結合の付加、またはTCRのベータ鎖のN-脱グリコシル化が、TCRまたはハイブリッドTCRへのジスルフィド結合の付加と比較して、エレクトロポレーションされたT細胞のトランスジーン発現および機能を増強したことを示す画像のパネルである。

TCRまたはCD3鎖のいずれかのC末端に共刺激シグナルを付加すると、T細胞機能が維持され、CARと同様の共刺激シグナルがT細胞にもたらされた(図99～101)。図102は、PD1-CD28 RNAおよび1G4 TCR RNAをCD27と共にまたはCD27なしでレンチウイルス形質導入したT細胞において、PD1およびvb13.1が検出されたことを示す。

図103は、0日目に5E6 A549-ESO (HLA-A2およびNY-ESO-1を形質導入されたA549)を皮下注入したことを示すグラフである。14日目に1×10⁶個の形質導入T細胞を注入し、腫瘍サイズを測定した。予備的結果は、TCR単独(1G4)では効果がないことを示したが、CD27共刺激シグナル(1G4.CD27)、またはPD1-CD28スイッチ受容体(PD1-CD28.1G4)、またはCD27共刺激シグナルとPD1-CD28スイッチ受容体の両方(PD1-CD28.1G4.CD27)では腫瘍の増殖が遅延した。

機能的コグネイト抗原認識と共に非MHC制限腫瘍抗原認識が可能な改変TCRの概略図を図104に示す。図105および106は、TCRが、Bis-RNA技術と組み合わせた場合、HLA制限なしに(CAR分子のように)コグネイトMHC/ペプチド抗原と表面腫瘍抗原の両方を認識したことを示す。さらに、IFN-γ(図107)およびIL-2 (図108)の分泌は、bis-RNAと共導入されたTCRで改変されたT細胞において上昇した。

Nalm6-ESOを静脈内注入し、かつ改変TCRをエレクトロポレーションされたT細胞を用いて治療したマウスは、野生型TCR (a+b)、野生型TCR＋HA1改変CD3イプシロン(a+b HA1-e)または高親和性TCR (TCR ly95)と比較して、改変TCRをHA1およびCD19に対するbis-RNAと共送達した場合(a+b/HA1-e/aHA1-aCD19、またはHA1-A+b/aHA1-aCD19)、改善された有効性を示す(図109)。

T細胞に、TCRアルファ(a)およびベータ(b)、またはErbB2小分子(342、342.15、342または342.4)をコエレクトロポレーションした。図110に示されるように、Vb13.1 TCRおよびHisタグは、小分子再方向付けTCR (Affi-TCR) RNAをエレクトロポレーションされたT細胞において検出された。このエレクトロポレーションされたT細胞を腫瘍細胞株Nalm-6-ESO (NY-eso-1+, ErbB2-)、A549-ESO (NY-eso-1+, ErbB2+)、SK-OV3 (NY-eso-1-, ErbB2+)、A549 (NY-eso-1-, ErbB2+)、またはNalm6 (NY-eso-1-, ErbB2-)で刺激した。次いで、該細胞をCD107a発現について評価した。その結果は、ErbB2 Affi-TCRを有するT細胞が、Ny-ESO-1およびErbB2陽性腫瘍を特異的に認識したことを示す(図111)。CD3イプシロンに特異的な小分子を付加することは、図112に示されるように、NY-ESO-1 TCR発現に最小限の影響を及ぼした。Affi-CD3イプシロンをコエレクトロポレーションされたT細胞は、76.5％～82.9％のCD8/vb13.1二重陽性(EP3～EP6)であるのに対して、小分子改変TCR T細胞(EP2)では44.5％であることが見出された。CD3イプシロンに特異的な小分子を付加することは、図113に示されるように、NY-ESO-1単一陽性腫瘍Nalm6-ESOを認識するNY-ESO-1 TCRの能力に最小限の影響を及ぼした。Affi-CD3イプシロンをコエレクトロポレーションされたT細胞は、49.5％～53.3％のCD8/CD107a二重陽性(EP3～EP6)であるのに対して、小分子改変TCR T細胞(EP2)では33.1％であることが見出された。

さらに、Affi-CD3イプシロンをコエレクトロポレーションされたT細胞(EP3～EP6)は、ErbB2陽性腫瘍SK-OV3およびMDA231に対してアフィボディ改変TCR (EP2)よりも高い抗腫瘍活性を示した(図113)。

他の態様
本明細書で引用した各特許、特許出願および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本発明は特定の態様に関連して開示されているが、本発明の他の態様および変形は、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、当業者によって考案され得ることが明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのそのような態様および同等の変形を包含するように解釈されることが意図される。

Claims (14)

1. (a)標的細胞上の抗原に対する親和性を有するT細胞受容体(TCR)をコードする外因性核酸と
   (b)
   (b1)PD1-CD28スイッチ受容体をコードする外因性核酸、
   (b2)PD1-CD28スイッチ受容体をコードする外因性核酸およびCD3分子をコードする外因性核酸、
   (b3)PD1-CD28スイッチ受容体をコードする外因性核酸およびCD27分子をコードする外因性核酸、または
   (b4)PD1-CD28スイッチ受容体をコードする外因性核酸、CD3分子をコードする外因性核酸、およびCD27分子をコードする外因性核酸
   の1つと
   (c)
   (i)CD3に対する一本鎖可変断片(scFv)、ならびに
   (ii)CD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメイン
   を含む、キメラ膜タンパク質をコードする外因性核酸と
   を含む、改変T細胞であって、
   該T細胞が、該TCR、該キメラ膜タンパク質、および(b1)～(b4)のいずれか1つを発現する、
   該改変T細胞。
2. (a)前記TCRが、少なくとも1つのジスルフィド結合を含む、
   (b)前記TCRが、TCRアルファ鎖およびベータ鎖を含み、任意で、該ベータ鎖が、少なくとも1つのN-脱グリコシル化を含むかもしくは該アルファ鎖が、少なくとも1つのN-脱グリコシル化を含む、
   (c)前記TCRが、少なくとも1つのマウス定常領域を含む、
   (d)前記TCRが、野生型TCRの標的細胞抗原に対する親和性と比べた場合、該標的細胞抗原に対する高い親和性を有する、または
   (e)標的細胞抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、腫瘍細胞関連抗原(TAA)、疾患細胞関連抗原、およびそれらの任意の断片からなる群より選択される、
   請求項1記載の改変T細胞。
3. 前記TCRが、前記鎖のうちの少なくとも1つの鎖のC末端に共刺激シグナル伝達ドメインを含み、任意で、該共刺激シグナル伝達ドメインが4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインである、請求項1または2記載の改変T細胞。
4. CD3分子が、少なくとも2つの異なるCD3鎖を含み、かつ任意で、該異なるCD3鎖が、CD3ゼータ鎖およびCD3イプシロン鎖である、請求項1～3のいずれか一項記載の改変T細胞。
5. (a)標的細胞上の抗原に対する親和性を有するT細胞受容体(TCR)をコードする外因性核酸を用いてT細胞にエレクトロポレーションを行う段階と
   (b)
   (b1)PD1-CD28スイッチ受容体をコードする外因性核酸を用いてT細胞にエレクトロポレーションを行う段階、
   (b2)PD1-CD28スイッチ受容体をコードする外因性核酸およびCD3分子をコードする外因性核酸を用いてT細胞にエレクトロポレーションを行う段階、
   (b3)PD1-CD28スイッチ受容体をコードする外因性核酸およびCD27分子をコードする外因性核酸を用いてT細胞にエレクトロポレーションを行う段階、
   または
   (b4)PD1-CD28スイッチ受容体をコードする外因性核酸、CD3分子をコードする外因性核酸、およびCD27分子をコードする外因性核酸を用いてT細胞にエレクトロポレーションを行う段階
   のうちの1つと
   (c)キメラ膜タンパク質をコードする外因性核酸を用いてT細胞にエレクトロポレーションを行う段階であって、該キメラ膜タンパク質が、
   (i)CD3に対する一本鎖可変断片(scFv)、ならびに
   (ii)CD28および4-1BBの細胞内ドメインの断片を含む細胞内ドメイン
   を含む、段階と
   を含み、
   該T細胞が該TCR、該キメラ膜タンパク質、および(b1)～(b4)のいずれか1つの外因性核酸を発現する、
   改変T細胞を作製するための方法。
6. (a)T細胞が、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、精製されたT細胞集団、およびT細胞株からなる群より得られる、または
   (b)前記外因性核酸のうちの少なくとも1つが、インビトロで転写されたRNAまたは合成RNAを含む、
   請求項5記載の方法。
7. (a)前記TCRをコードする外因性核酸が、TCRアルファ鎖およびTCRベータ鎖をコードする核酸を含む、または
   (b)前記外因性核酸が、RNAである、
   請求項5記載の方法。
8. (a)T細胞を拡大する段階をさらに含む、
   (b)T細胞を凍結保存する段階をさらに含み、任意で、前記TCRをコードする核酸をT細胞にエレクトロポレーションする前に、凍結保存されたT細胞を解凍する段階をさらに含む、または
   (c)TCR核酸をエレクトロポレーションした後にT細胞を凍結保存する段階をさらに含む、
   請求項5記載の方法。
9. (a)T細胞を拡大する段階が、flt3-L、IL-1、IL-2、IL-3およびc-kitリガンドからなる群より選択される因子とともにT細胞を培養することを含む、または
   (b)T細胞を拡大する段階が、エレクトロポレーションされたT細胞を培養することを含む、
   請求項8記載の方法。
10. 免疫応答の処置のための医薬の製造における、請求項1～4のいずれか一項記載の改変T細胞の使用。
11. 請求項1～4のいずれか一項記載の改変T細胞を含む、状態を処置するための医薬。
12. 前記状態が、がんであり、任意で、がんが、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項11記載の医薬。
13. 請求項1～4のいずれか一項記載の改変T細胞を含む組成物。
14. 請求項1～4のいずれか一項記載の改変T細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。

Images