CN108135932A - 表达嵌合细胞内信号传导分子的细胞的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于增强T细胞代谢和活性用于更高效的过继性T细胞疗法的组合物和方法。通过在T细胞中表达嵌合抗原受体和双特异性抗体，T细胞被代谢增强，其具有改进的细胞毒性和对由肿瘤微环境施加的免疫抑制的抗性。某些方面包括修饰的T细胞和包括修饰的细胞的药物组合物，其用于过继性细胞疗法和治疗与增强的免疫力相关联的疾病或病症。

Description

表达嵌合细胞内信号传导分子的细胞的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请以35 U.S.C.§119(e)要求2015年8月28日提交的美国临时专利申请62/211,311的优先权，其通过引用以其全部并入本文。

关于联邦资助的研究或研发的声明

本发明在美国国立卫生研究院给予的CA120409-07下使用政府支持完成。政府具有本发明中的某些权利。

背景技术

在肿瘤的生长期间，肿瘤快速地生长而使其血液供应不足，使得部分肿瘤具有氧浓度显著低于健康组织的区域。实体瘤中的低氧微环境是快速增殖肿瘤细胞消耗可利用氧的结果，因而限制可用于进一步扩散入肿瘤组织的氧的量。为了支持在挑战性低氧环境中的继续生长和增殖，癌细胞已经发展出改变它们的代谢的机制。因而，低氧与增加的对化学疗法和放射治疗的肿瘤抗性相关联。

许多常规的反应性化学疗法不能够穿透入远离血管定位的低氧区。而且，慢性低氧限制癌细胞增殖，致使肿瘤的低氧区域中的休眠肿瘤细胞不易受常规的抗增殖剂——其通常主动地靶向紧密接近血管的分裂细胞——影响。在细胞低氧的条件下，基因组不稳定性可能导致肿瘤细胞变体，其可以通过克隆选择和扩展在缺氧环境中存活。此克隆扩展可能导致危害临床结果的肿瘤进展、转移、对化学疗法的获得性抗性和治疗失败。

考虑到低氧在肿瘤进展、转移和对疗法的抗性，以及最终地治疗失败中发挥的作用，对防治抵抗疗法的癌细胞的更有效的方法存在需要。本发明满足此需要。

发明内容

如本文描述的，本发明涉及代谢增强的肿瘤特异性T细胞的组合物、方法和用途。本发明的一方面包括在代谢上增强肿瘤特异性T细胞的方法。该方法包括将嵌合抗原受体(CAR)引入T细胞。CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激分子的细胞内结构域。以双特异性抗体装备CAR T细胞并且双特异性抗体结合至肿瘤细胞上的靶标和CAR T细胞。刺激装备的CAR T细胞上的至少一种共刺激分子。刺激活化共刺激分子的细胞内结构域，从而在代谢上增强肿瘤特异性T细胞。

在另一方面，本发明提供了代谢增强的肿瘤特异性T细胞，其包括嵌合抗原受体(CAR)和双特异性抗体。CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激分子的细胞内结构域。双特异性抗体结合至肿瘤细胞上的靶标和T细胞，并且T细胞在实体瘤部位处具有改进的细胞毒性和对免疫抑制的抗性。

在本文描绘的发明的上面的方面或任何其它方面的多种实施方式中，将CAR引入T细胞包括引入编码CAR的核酸序列。在另一个实施方式中，引入核酸序列包括电穿孔编码CAR的mRNA。

在其它实施方式中，装备CAR T细胞包括使CAR T细胞与双特异性抗体接触。在另一个实施方式中，装备CAR T细胞包括引入编码双特异性抗体的核酸序列。在又另一个实施方式中，装备CAR T细胞包括以两种或更多种双特异性抗体装备CAR T细胞，其中CAR T细胞展示两种或更多种双特异性抗体。在还另一个实施方式中，两种或更多种双特异性抗体特异性地结合CAR T细胞。在另一个实施方式中，双特异性抗体包括选自如下的抗体的组合：抗CD3、抗IgD Fc和抗IgA Fc。在某些实施方式中，双特异性抗体被化学地异源缀合至特异于肿瘤相关抗原(TAA)的多克隆抗体，其中T细胞特异性地结合TAA多克隆抗体。在其它实施方式中，引入核酸序列包括电穿孔编码双特异性抗体的mRNA。

在某些实施方式中，刺激装备的CAR T细胞改进装备的CAR T细胞的细胞毒性和当处于肿瘤微环境时对免疫抑制的抗性。某些实施方式进一步包括以高至2500拉德照射CART细胞，其中所述照射足以抑制CAR T细胞的增殖但是不足以抑制细胞因子分泌或细胞毒性。

另一个实施方式包括组合物，其包括根据本发明的方法生成的代谢增强的肿瘤特异性T细胞。又另一个实施方式包括药物组合物，其包括本发明的代谢增强的肿瘤特异性T细胞和药学上可接受的运载体。

在另一个实施方式中，本发明的T细胞包括编码CAR的核酸序列。在其它实施方式中，T细胞包括编码双特异性抗体的核酸序列。

另一个实施方式包括本发明的T细胞在制造用于治疗需要其的对象中的肿瘤或癌症的药物中的用途。又另一个实施方式包括治疗对象中与肿瘤或癌症相关联的疾病或病症的方法，其包括给对象施用治疗有效量的包括本发明的T细胞的药物组合物。另一个实施方式包括治疗对象中的实体瘤的方法，其包括给对象施用治疗有效量的包括本发明的T细胞的药物组合物。还另一个实施方式包括用于刺激针对对象中的靶标肿瘤细胞或肿瘤组织的T细胞介导的免疫应答的方法，其包括给对象施用治疗有效量的包括本发明的T细胞的药物组合物。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的优选实施方式的下列详细描述。出于说明本发明的目的，在附图中显示了当前优选的实施方式。然而，应当理解本发明不限于在附图中显示的实施方式的精确的布置和工具。

图1是显示取决于共刺激胞内结构域(endodomain)低氧差异地影响CAR T细胞存活的图组。

图2是显示用于测量修饰的T细胞的代谢特征的海马试验(sea horse assay)的图表。OCR——通过氧化磷酸化的线粒体呼吸；ECAR——ATP的糖酵解产生；备用呼吸能力(Spare Respriatory Capacity)与应激下增强的存活和持久性相关联。

图3是显示表达具有CD28或4-1BB信号传导结构域的CAR的修饰T细胞的代谢重编程的图。

图4是装备双特异性抗体(具有Fab抗靶标A或B的Fab CD3)的T细胞——其具有通过慢病毒载体引入的CAR——的图示。数据利用完整IgG分子，其具有Fc-Fc永久性共价键。

图5是装备双特异性抗体的T细胞——其具有通过mRNA电穿孔引入的CAR——的图示。

图6是显示未装备的或装备抗HER2双特异性抗体(HER2Bi)和抗EGFR双特异性抗体(EGFRBi)的CART19细胞或非CART19细胞(ATC)在针对表达HER2和EGFR的细胞系的⁵¹Cr释放试验中的比细胞毒性的图组。在10:1的效应物/靶标比下，使用装备的或未装备的CART19细胞针对表达HER2的SK-BR-3、表达EGFR的HCT-8或CD19⁺/CD20⁺(Daudi)和CD19^-/CD20^-(U266)细胞系以一式三份进行试验持续18小时以测量细胞毒性。

图7是显示在⁵¹Cr释放试验中以10:1的效应物/靶标比在第1、4、10、18和25天重复暴露于SK-BR-3肿瘤靶标(HER2和EGFR阳性乳腺癌细胞系)的过程内测量的装备的和未装备的CART19细胞的比细胞毒性的图组。右图组显示了CART19细胞在重复杀伤试验期间的增殖倍数变化。在第1、4、10、18和25天暴露于SK-BR-3靶标后，装备的对未装备的细胞的平均增殖倍数变化。在4周培养期间，使用锥虫蓝在指示的天数评估细胞计数和生存力。当存在适当的肿瘤相关抗原(TAA)时出现重复的细胞毒性(左图组)，并且当在CART细胞上存在适当的(HER2Bi)的衔接(engagement)时出现增殖。

图8A是显示未装备的或装备HER2Bi和EGFRBi的CART19细胞和非CART19细胞(ATC)针对表达HER2和EGFR的乳腺癌细胞的比细胞毒性的图。一式三份的平均数显示了装备的或未装备的细胞以10:1的效应物/靶标比平板接种在表达HER2和EGFR的乳腺癌细胞系上18小时的⁵¹Cr释放试验的细胞毒性。

图8B是显示未装备的或装备HER2Bi和EGFRBi的CART19细胞和非CART19细胞(ATC)针对表达HER2和EGFR的肺癌细胞的比细胞毒性的图。装备的或未装备的CART19细胞以10:1的效应物/靶标比一式三份平板接种在表达HER2和EGFR的肺细胞系上18小时的⁵¹Cr释放试验的细胞毒性。

图8C是显示未装备的或装备HER2Bi和EGFRBi的CART19细胞和非CART19细胞(ATC)针对表达HER2和EGFR的前列腺/卵巢癌细胞的比细胞毒性的图。装备的或未装备的CART19细胞以10:1的效应物/靶标比一式三份平板接种在表达HER2和EGFR的细胞系上18小时的⁵¹Cr释放试验的细胞毒性。

图8D是显示未装备的或装备HER2Bi和EGFRBi的CART19细胞和非CART19细胞(ATC)针对表达HER2和EGFR的胰腺癌细胞的比细胞毒性的图。装备的或未装备的CART19细胞以10:1的效应物/靶标比一式三份平板接种在表达HER2和EGFR的细胞系上18小时的⁵¹Cr释放试验的细胞毒性。

图8E是显示未装备的或装备HER2Bi和EGFRBi的CART19细胞和非CART19细胞(ATC)针对表达HER2和EGFR的黑素瘤/骨肉瘤/成胶质细胞瘤癌细胞的比细胞毒性的图。装备的或未装备的CART19细胞以10:1的效应物/靶标比一式三份平板接种在表达HER2和EGFR的细胞系上18小时的⁵¹Cr释放试验的细胞毒性。

图9是显示在耗尽的(缺少细胞毒性)、短期(24h)或长期(120h)抗原暴露于未装备的或装备的CART19细胞的情况下，CD4和CD8T细胞群上的活化性和抑制性共受体表达的图组。

图10是嵌合细胞内信号传导分子例如4-1BBz的序列和基本结构的图示。嵌合细胞内信号传导分子的一个实例包括具有可检测的标记、铰链/跨膜结构域和细胞内结构域的融合蛋白。

图11是具有豆蔻酰化信号的嵌合细胞内信号传导分子的图示。在细胞的表面上不可检测的嵌合细胞内信号传导分子将使用用于检测的替代标志物，比如作为荧光蛋白或细胞表面分子，其通过T2A或IRES元件具有关联的表达。

图12是具有用于检测的融合标记的嵌合细胞内信号传导分子的图示。可选地，使用T2A或IRES系统共同表达可检测的替代标志物，并且二者均是用于嵌合细胞内信号传导分子的可检测的标志物。

图13是具有通过慢病毒载体引入的嵌合细胞内信号传导分子的装备双特异性抗体的T细胞的图示。

图14是具有通过mRNA电穿孔引入的嵌合细胞内信号传导分子的装备双特异性抗体的T细胞的图示。

图15是图解以双特异性抗体装备T细胞对杀伤靶标细胞的能力的增强作用的图示。肿瘤微环境通过释放抑制调节性T细胞(T_regs)和骨髓源阻抑性细胞(MDSC)群的Th₁细胞因子和趋化因子被改变并且募集内源性免疫细胞以成为产生定向肿瘤的抗体的细胞毒性记忆效应细胞和记忆B细胞。

图16是显示当装备双特异性抗体的T细胞被结合至肿瘤靶标时照射该装备的T细胞阻断同种异体应答(左图)但是不抑制细胞毒性(右图)的图组。“r”表示效应器细胞(responder cell)，“s”表示刺激器细胞(stimulator cell)并且*表示照射的细胞。

图17是显示未装备的或装备抗CD20双特异性抗体(CD20Bi)、抗EGFR双特异性抗体(EGFRBi)、抗GD2双特异性抗体(GD2Bi)和抗HER2双特异性抗体(HER2Bi)的代谢增强的T细胞在针对表达HER2和EGFR的乳腺癌和胰腺/结肠直肠癌细胞系的⁵¹Cr释放试验中的比细胞毒性的图组。在10:1的效应物/靶标比下，使用装备的或未装备的T细胞以一式三份进行试验18小时以测量细胞毒性。

图18是显示培养上清液中的细胞因子概况的图组。在不存在靶标细胞或以E:T＝10:1存在靶标细胞(SKBR3)的情况下，过夜接种未装备的或装备的T细胞或非代谢增强的ATC。值被报告为pg/ml。通过Bio-Plex试验测定培养上清液是否存在细胞因子(上图)和趋化因子(下图)。

图19A是显示表达标签标记的(flag-tagged)嵌合细胞内信号传导分子——具有4-1BB的CD8跨膜结构域和CD3ζ细胞内结构域或膜锚固的豆蔻酰化的4-1BB和CD3ζ细胞内结构域——的T细胞的扩展的图组。

图19B是显示表达标签标记的嵌合细胞内信号传导分子的T细胞中的CD4表达增强的图组。正常供体ND317T细胞使用抗CD3/28珠活化并且转导以表达嵌合细胞内信号传导分子。这些细胞在CD4群体中被极大地增强。

图19C是显示在T细胞中转导160μl或400μl病毒以及标签标记的嵌合细胞内信号传导分子——具有4-1BB的CD8跨膜结构域和CD3ζ细胞内结构域——的扩展的图组。使用标签标记的嵌合细胞内信号传导分子转导正常供体ND317T细胞。表达标签标记的嵌合细胞内信号传导分子的T细胞从第6至8天在总群体的百分数中减小。‘160v’意思是在初始转导处160μl病毒/1e⁶个细胞。

图20是显示转导高(50％)和低(15％)病毒量以表达不同百分数的嵌合细胞内信号传导分子的正常供体ND444T细胞的表征的图组。随着时间标签标记的T细胞的检测失去。

图21A是显示转导标签标记的嵌合细胞内信号传导分子(BBz)或CAR19BBz的正常供体ND422T细胞的群体倍增和细胞大小的扩展的图组。T细胞被CD3x28珠活化、转导和通过库尔特计数器(coulter counter)测量监测扩展，并且显示类似的概况直到细胞变为静息的。

图21B是显示在第5天和第8天对转导标签标记的嵌合细胞内信号传导分子(BBz)或CAR19BBz的正常供体ND422T细胞表征的CD4和CD8表达的图组。总T细胞群显示了偏向CD4扩展，而没有任何观察到的通过嵌合细胞内信号传导分子的CD4+细胞的额外增强。显示的所有数据对活的CD3+细胞进行门控。

图21C是显示从第5天至第8天转导标签标记的嵌合细胞内信号传导分子(BBz)或CAR19BBz的正常供体ND422T细胞中标签标记的T细胞的百分数没有减小的图组。

具体实施方式

定义

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文描述的那些类似或等价的任何方法和材料可以在实践中被用于测试本发明，但是本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明中，将使用下列术语。

还理解本文使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，并且不意图是限制性的。

本文使用冠词“一个”和“一种”，指的是一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法对象。举例而言，“一个要素”意思是一个要素或多于一个要素。

如本文使用的“大约”，当指的是可测量的值比如量、时间期间等时，意思是涵盖从规定值的±20％或±10％、更优选地±5％、甚至更优选地±1％、和还更优选地±0.1％的变化，只要这样的变化适于进行公开的方法。

如本文使用的“活化”指的是已经被充分地刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。活化也可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应物功能相关联。术语“活化的T细胞”指的是正经历细胞分裂的T细胞等。

如本文使用的术语“抗体”指的是与抗原特异性地结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是从自然来源或从重组来源衍生的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括，例如，多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)₂、以及单链抗体(scFv)和人源化抗体(Harlow et al.,1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,NY；Harlow et al.,1989In:Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor,New York；Houston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；Bird et al.,1988,Science 242:423-426)。

术语“抗体片段”指的是完整抗体的一部分，并且指的是完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段，线性抗体，scFv抗体，和由抗体片段形成的多特异性抗体。

如本文使用的“抗体重链”指的是以它们自然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较大的链。

如本文使用的“抗体轻链”指的是以它们自然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较小的链。α和β轻链指的是两种主要的抗体轻链同种型。

如本文使用的“双特异性抗体”指的是对至少两种不同的抗原表位具有结合特异性的抗体。在一个实施方式中，表位来自相同的抗原。在另一个实施方式中，表位来自两种不同的抗原。用于制造双特异性抗体的方法是本领域已知的。例如，可以使用两个免疫球蛋白重链/轻链对的共同表达来重组地产生双特异性抗体。参见，例如，Milstein et al.(1983)Nature 305:537-39。可选地，可以使用化学键合制备双特异性抗体。参见，例如，Brennan et al.(1985)Science 229:81。双特异性抗体包括双特异性抗体片段。参见，例如，Holliger et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6444-48,Gruber et al.(1994)J.Immunol.152:5368。

如本文使用的术语“合成抗体”的意思是使用重组DNA技术生成的抗体，比如，例如，如本文描述的由噬菌体表达的抗体。该术语也应当解释为意思是已经由DNA分子——其编码抗体并且该DNA分子表达抗体蛋白——或规定抗体的氨基酸序列的合成生成的抗体，其中DNA或氨基酸序列已经使用本领域可获得和熟知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。

如本文使用的术语“抗原”或“Ag”被定义为激发免疫应答的分子。此免疫应答可以涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或二者。技术人员将理解任何大分子——实际上包括所有蛋白质或肽——可以充当抗原。另外，抗原可以源自重组或基因组DNA。技术人员将理解任何DNA——其包括编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列——因此编码如本文使用的该术语“抗原”。另外，本领域技术人员将理解抗原不必唯一地由基因的全长核苷酸序列编码。容易显而易见的是本发明包括但不限于多于一个基因的部分核苷酸序列的用途，并且这些核苷酸序列以不同的组合布置以引起期望的免疫应答。而且，技术人员将理解抗原完全不必由“基因”编码。容易显而易见的是抗原可以被生成、合成或可以源自生物学样品。这样的生物学样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物学流体。

如本文使用的术语“抗肿瘤效应”指的是生物学效应，其可以由肿瘤体积的减小、肿瘤细胞数目的减少、转移数目的减少、预期寿命的增加、或与癌性病症相关联的多种生理学症状的改善显现。“抗肿瘤效应”也可以由本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防肿瘤在第一位置发生的能力显现。

如本文使用的术语“装备(arming)”指的是在细胞的表面上展示双特异性抗体。在一个实施方式中，双特异性抗体特异性地结合至待以双特异性抗体装备的细胞——比如T细胞——上的抗原表位，并且结合另一种抗原表位，比如靶标细胞——比如另一种细胞——上的抗原表位。

根据本发明，术语“自身抗原”意思是由免疫系统识别为异物(foreign)的任何自体抗原。自身抗原包括但不限于细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。

如本文使用的，术语“自身免疫疾病”被定义为由自身免疫反应导致的障碍。自身免疫疾病是对自体抗原的不适当和过度应答的结果。自身免疫疾病的实例包括但不限于阿狄森氏病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克罗恩病、糖尿病(I型)、营养不良性大疱性表皮松解、附睾炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、桥本氏病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、寻常天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、脊椎关节病、甲状腺炎、血管炎、白斑病、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等。

如本文使用的，术语“自体的”意思是指源自相同个体的任何物质，其随后被再引入该个体。

“同种异体的”指的是源自相同物种的不同动物的移植物。

“异种的”指的是源自不同物种的动物的移植物。

如本文使用的“双特异性”指的是对至少两种不同的结合表位具有结合特异性的分子。在一个实施方式中，表位来自相同的结合配偶体。在另一个实施方式中，表位来自两种不同的结合配偶体。具有对不同表位的双特异性的分子可以包括双特异性抗体。

如本文使用的术语“癌症”被定义为以畸变细胞的快速和失控生长为特征的疾病。癌细胞可以局部地扩散或通过血流和淋巴系统扩散至身体的其它部分。多种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。在某些实施方式中，癌症是甲状腺髓样癌。

如本文使用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”指的是被工程化以在免疫效应细胞上表达并特异性地结合抗原的人工T细胞受体。CAR可以被用作使用过继性细胞转移的疗法。T细胞从患者移出并且被修饰，使得它们表达特异于特定形式的抗原的受体。例如，在一些实施方式中，已经以对肿瘤相关抗原的特异性表达CAR。CAR还可以包括细胞内活化结构域、跨膜结构域和细胞外结构域，该细胞外结构域包括肿瘤相关抗原结合区。在一些方面，CAR包括融合单链可变片段(scFv)衍生的单克隆抗体，其被融合至CD3-ζ跨膜和细胞内结构域。CAR设计的特异性可以源自受体的配体(例如，肽)。在一些实施方式中，通过重定向表达特异于肿瘤相关抗原的CAR的T细胞的特异性，CAR可以靶向癌症。

术语“嵌合细胞内信号传导分子”指的是重组受体，其包括一个或多个共刺激分子的一个或多个细胞内结构域。嵌合细胞内信号传导分子基本上缺少细胞外配体-结合结构域，比如非抗原结合结构域，或基本上缺少细胞外结构域。在一些实施方式中，嵌合细胞内信号传导分子包括额外的结构域，比如跨膜结构域、可检测的标记和间隔结构域。

如本文使用的，术语“保守序列修饰”意图指的是如此氨基酸修饰，其不显著地影响或改变包含该氨基酸序列的抗体的结合特性。这样的保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术引入本发明的抗体，比如定点诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸置换是其中氨基酸残基被替换为具有类似侧链的氨基酸残基的置换。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支化侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因而，抗体的CDR区内的一种或多种氨基酸残基可以被替换为来自相同侧链家族的其它氨基酸残基，并且可以使用本文描述的功能性试验测试改变的抗体结合抗原的能力。

如本文使用的术语“共刺激配体”包括特异性地结合T细胞上的关联共刺激分子的抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B细胞等)上的分子，从而除通过例如将TCR/CD3复合体与使用肽负载的MHC分子结合提供的初级信号之外，还提供了介导T细胞应答的信号，该T细胞应答包括但不限于增殖、活化、分化等。共刺激配体可以包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导的共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性地结合的配体。共刺激配体也涵盖，特别是与存在于T细胞上的共刺激分子特异性地结合的抗体，比如，但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性地结合的配体。

“共刺激分子”指的是与共刺激配体特异性地结合从而介导通过T细胞的共刺激应答——比如但不限于增殖——的T细胞上的关联结合配偶体。共刺激分子包括但不限于TCR，CD3ζ，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD86，普通的FcRγ，FcRβ(FcεR1b)，CD79a，CD79b，FcγRIIa，DAP10，DAP12，T细胞受体(TCR)，CD27，CD28，4-1BB(CD137)，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3，与CD83特异性地结合的配体，CDS，ICAM-1，GITR，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRF1)，CD127，CD160，CD19，CD4，CD8α，CD8β，IL2Rβ，IL2Rγ，IL7Rα，ITGA4，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，TRANCE/RANKL，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244、2B4)，CD84，CD96(Tactile)，CEACAM1，CRTAM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CD100(SEMA4D)，CD69，SLAMF6(NTB-A、Ly108)，SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，LAT，GADS，SLP-76，PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46，NKG2D，本文描述的其它共刺激分子，其任何衍生物、变体或片段，具有相同功能能力的共刺激分子的任何合成序列，和其任意组合。

如本文使用的“共刺激信号”指的是与初级信号组合的信号，比如TCR/CD3连接，其导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调。

术语“细胞毒的”或“细胞毒性”指的是杀伤或损害细胞。在一个实施方式中，代谢增强的细胞的细胞毒性被提高，例如增加的T细胞的细胞溶解活性。

“疾病”是动物的如此健康状态，其中动物不能维持稳态，并且其中如果不改善疾病，则动物的健康继续恶化。相比之下，动物中的“障碍”是如此健康状态，其中动物能够维持稳态，但是其中动物的健康状态与它没有处于该障碍时相比不太有利。保持不治疗，障碍不必然引起动物健康状态的进一步降低。

“有效量”或“治疗有效量”在本文可交换地使用，并且指的是对实现具体的生物学结果或提供治疗或预防益处有效的如本文描述的化合物、制剂、材料或组合物的量。这样的结果可以包括但不限于抗肿瘤活性，如通过本领域适合的任何手段测定的。

“编码”指的是多核苷酸比如基因、cDNA或mRNA中的核苷酸的特异性序列充当模板来合成生物学过程中的其它聚合物和大分子的固有性质，该聚合物和大分子具有核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一种和由其产生的生物学性质。因而，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物学系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。其核苷酸序列同一于mRNA序列并且通常在序列表中提供的编码链，和用作基因或cDNA转录的模板的非编码链二者，可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其它产物。

如本文使用的“内源的”指的是来自生物体、细胞、组织或系统或在生物体、细胞、组织或系统内产生的任何物质。

如本文使用的，术语“外源的”指的是从生物体、细胞、组织或系统引入或在生物体、细胞、组织或系统外产生的任何物质。

如本文使用的术语“扩展”指的是数目的增加，如T细胞数目的增加。在一个实施方式中，离体扩展的T细胞的数目相对于培养物中原始存在的数目增加。在另一个实施方式中，离体扩展的T细胞的数目相对于培养物中的其它细胞类型的数目增加。如本文使用的术语“离体”指的是已经从活的生物体(例如，人)移出，并且在生物体外(例如，在培养皿、试管或生物反应器中)繁殖的细胞。

如本文使用的术语“表达”被定义为由它的启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

“表达载体”指的是包括重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。表达载体包括所有本领域已知的那些，比如并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。

如本文使用的“同源的”指的是两个聚合物分子之间，例如，两个核酸分子——比如，两个DNA分子或两个RNA分子——之间，或两个多肽分子之间的亚单元序列同一性。当两个分子二者中的亚单元位置被相同的单体亚单元占据时；例如，如果两个DNA分子的每个中的位置被腺嘌呤占据，则它们在该位置处是同源的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置的数目的直接函数；例如，如果两个序列中的一半位置(例如，长度为十个亚单位的聚合物中的五个位置)是同源的，则两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或同源的，则两个序列是90％同源的。如适用于核酸或蛋白质，如本文使用的“同源的”指的是具有大约50％序列同一性的序列。更优选地，同源序列具有大约75％序列同一性，甚至更优选地，具有至少大约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。

非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(比如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原-结合子序列)，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。就大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被替换为来自非人物种(供体抗体)比如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基，其具有期望的特异性、亲和力和能力。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被替换为对应的非人残基。另外，人源化抗体可以包括既没有在受体抗体中也没有在输入的CDR或框架序列中发现的残基。进行这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。一般而言，人源化抗体将包括基本上所有的至少一种和通常两种可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体最佳地还将包括至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的。进一步的细节参见Jones et al.,Nature,321:522-525,1986；Reichmann et al.,Nature,332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992。

“全人(fully human)”指的是免疫球蛋白，比如抗体，其中完整分子具有人起源或由同一于人形式的抗体的氨基酸序列构成。

如本文使用的“同一性”指的是两个聚合物分子之间，特别是两个氨基酸分子之间，比如，两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个氨基酸序列在相同的位置处具有相同的残基时；例如，如果两个多肽分子中的每个中的位置均被精氨酸占据，则它们在该位置处是同一的。在比对中，两个氨基酸序列在相同的位置处具有相同残基的同一性或程度经常表达为百分数。两个氨基酸序列之间的同一性是匹配或同一位置的直接函数；例如，如果两个序列中的一半位置(例如，十个氨基酸长度的聚合物中的五个位置)是同一的，则两个序列是50％同一的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或同一的，则两个氨基酸序列是90％同一的。

“基本上同一的”的意思是展现与参考氨基酸序列(例如，本文描述的氨基酸序列中的任一种)或核酸序列(例如，本文描述的核酸序列中的任一种)至少50％同一性的多肽或核酸分子。优选地，在氨基酸水平或核酸下，这样的序列至少60％，更优选地80％或85％，和更优选地90％、95％或甚至99％同一于用于比较的序列。

引导核酸序列可以与双链DNA靶标位点的一条链(核苷酸序列)互补。引导核酸序列和靶标序列之间的互补百分数可以是至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。引导核酸序列的长度可以是至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或更多个核苷酸。在一些实施方式中，引导核酸序列包括10至40个核苷酸的连续区段(stretch)。可变靶向结构域(variable targeting domain)可以由DNA序列、RNA序列、修饰的DNA序列、修饰的RNA序列(参见例如本文描述的修饰)或其任意组合组成。

通常使用序列分析软件(例如，1710University Avenue,Madison,Wis.53705威斯康星大学生物技术中心遗传学计算机组的序列分析软件程序包、BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)测量序列同一性。这样的软件通过向多种置换、缺失和/或其它修饰分配同源性程度来匹配同一的或相似的序列。保守性置换通常包括在下列组内的置换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在测定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中e^-3和e^-100之间的概率分数指示密切相关的序列。

如本文使用的术语“免疫球蛋白”或“Ig”被定义为起抗体作用的一类蛋白质。由B细胞表达的抗体有时被称为BCR(B细胞受体)或抗原受体。包括在此类蛋白质中的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于身体分泌物，比如唾液、泪液、母乳、胃肠分泌物和呼吸道与泌尿生殖道的粘液分泌物中的初次抗体。IgG是最常见的循环抗体。IgM是在大多数对象中的初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它在凝集、补体结合、和其它抗体应答中是最有效的免疫球蛋白，并且在抵御细菌和病毒方面是重要的。IgD是不具有已知抗体功能的免疫球蛋白，但是可以充当抗原受体。IgE是在暴露于过敏原之后，通过引起从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介体，介导速发过敏性的免疫球蛋白。

如本文使用的术语“免疫应答”被定义为当淋巴细胞将抗原分子识别为异物和诱发形成抗体和/或活化淋巴细胞以去除抗原时发生的对抗原的细胞应答。

如本文使用的，“指导材料”包括出版物、记录、图表、或任何其它可以用于传达本发明的组合物和方法的有用性的表达媒介。本发明的试剂盒的指导材料可以例如被附加至包含本发明的核酸、肽和/或组合物的容器，或与包含核酸、肽和/或组合物的容器一起运送。可选地，指导材料可以与容器分开地运送，目的是指导材料和化合物由接受者配合使用。

“分离的”意思是从自然状态改变或移出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是部分或完全与它的自然状态的共存物质分开的相同的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或可以存在于非自然环境，比如，例如，宿主细胞。

如本文使用的“慢病毒”指的是逆转录病毒科的一种属。在逆转录病毒中慢病毒是唯一能够感染非分裂细胞的；它们可以递送显著量的遗传信息进入宿主细胞的DNA，因此它们是基因递送载体的最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV是慢病毒的所有实例。源自慢病毒的载体提供了实现显著水平的基因体内转移的手段。

术语“配体”指的是具有结合位点——其具有对配体-结合结构域的结合特异性——的分子、化合物或其它结合配偶体。配体还可以被称为“抗原”。

如本文使用的术语“修饰的”意思是本发明的分子或细胞的改变的状态或结构。分子可以以许多方式被修饰，包括化学地、结构地和功能地。细胞可以通过引入核酸被修饰。

如本文使用的术语“调节”意思是与不存在治疗或化合物的对象中的应答水平相比，和/或与在其它方面相同但未治疗的对象中的应答水平相比，介导对象中的应答水平中的可检测的增加或减少。该术语涵盖扰乱和/或影响天然信号或应答，从而介导对象优选地人中的有益的治疗性应答。

在本发明的背景下，使用常见核酸碱基的下列缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷，和“U”指的是尿苷。

除非另外规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括是彼此的简并译本并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包括内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可以在一些译本中包含内含子(一个或多个)。

术语“可操作地连接”指的是调控序列和异源核酸序列之间的功能连接，其导致后者的表达。例如，当第一核酸序列处于与第二核酸序列的功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子被可操作地连接至该编码序列。通常地，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且当必须时在相同的阅读框中接合两个蛋白质编码区。

术语“过表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”意图指示相对于来自组织或器官的正常细胞的表达水平，来自疾病区域如患者的特定组织或器官内的实体瘤的细胞中的肿瘤抗原的异常表达水平。患有以肿瘤抗原的过表达为特征的实体瘤或血液学恶性肿瘤的患者可以由本领域已知的标准试验确定。

免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括，例如，皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)、或胸骨内注射，或输注技术。

如本文使用的术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。另外，核酸是核苷酸的聚合物。因而，如本文使用的核酸和多核苷酸是可交换的。本领域技术人员具有核酸是可以被水解为单体“核苷酸”的多核苷酸的一般知识。单体核苷酸可以被水解为核苷。如本文使用的多核苷酸包括但不限于通过本领域可获得的任何手段——非限制性地包括重组手段，即，使用普通克隆技术和PCR^TM等从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列，和通过合成手段——获得的所有核酸序列。

如本文使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可交换地使用，并且指的是由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对可以包括蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括任何肽或蛋白质，该肽或蛋白质包括通过肽键相互接合的两个或更多个氨基酸。如本文使用的，该术语指的是短链，其在本领域中也通常被称为例如肽、寡肽和寡聚物；和较长链二者，其在本领域中通常被称为蛋白质，其具有许多类型。“多肽”包括例如生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。

如本文使用的术语“启动子”被定义为起始多核苷酸序列的特异性转录需要的，由细胞的合成机器或引入的合成机器识别的DNA序列。

如本文使用的，术语“启动子/调控序列”意思是可操作地连接至启动子/调控序列的基因产物的表达需要的核酸序列。在一些情况下，此序列可以是核心启动子序列，并且在其它情况下，此序列还可以包括基因产物的表达需要的增强子序列和其它调控元件。例如，启动子/调控序列可以是以组织特异性方式表达基因产物的序列。

“组成型”启动子是如下核苷酸序列，当其与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，引起在细胞的大多数或所有生理学条件下在细胞中产生基因产物。

“诱导型”启动子是如下核苷酸序列，当其与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，引起在基本上仅当对应于启动子的诱导物存在于细胞中时，在细胞中产生基因产物。

“组织-特异性”启动子是如下核苷酸序列，当其与编码基因或由基因规定的多核苷酸可操作地连接时，引起基本上仅当细胞是对应于启动子的组织类型的细胞时，才在细胞中产生基因产物。

术语“对免疫抑制的抗性”指的是缺少免疫系统活性或活化的阻抑或降低免疫系统活性或活化的阻抑。

“信号转导途径”指的是各种信号转导分子——其在传递来自细胞的一部分的信号至细胞的另一部分中发挥作用——之间的生物化学关系。短语“细胞表面受体”包括分子和分子的复合体，其能够接收信号和跨越细胞的质膜传递信号。

“单链抗体”指的是通过重组DNA技术形成的抗体，其中免疫球蛋白重链和轻链片段经由工程化跨度的氨基酸连接至Fv区。生成单链抗体的多种方法是已知的，包括在美国专利号4,694,778；Bird(1988)Science 242:423-442；Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Ward et al.(1989)Nature 334:54454；Skerraet al.(1988)Science242:1038-1041中描述的那些。

如本文使用的关于抗体的术语“特异性地结合”意思是识别特异性抗原但是基本上不识别或结合样品中的其它分子的抗体。例如，特异性地结合至来自一个物种的抗原的抗体也结合至来自一个或多个物种的该抗原。但是，这样的跨物种反应性本身不将抗体的类别改变为特异性的。在另一个实例中，特异性地结合至抗原的抗体也可以结合至抗原的不同等位基因形式。然而，这样的交叉反应性本身不将抗体的类别改变为特异性的。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可以关于抗体、蛋白质或肽与第二化学种类的相互作用使用，意思是相互作用依赖化学种类上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别和结合至特异性蛋白质结构，而不是一般地识别和结合至蛋白质。如果抗体特异于表位“A”，则在包含标示的“A”和抗体的反应中存在包含表位A(或游离的、未标示的A)的分子将降低结合至抗体的标示的A的量。

术语“刺激”意思是通过结合刺激分子(例如，TCR/CD3复合体)与其关联配体，从而介导信号转导事件——比如，但不限于经由TCR/CD3复合体的信号转导——诱导的初次应答。刺激可以介导某些分子的改变的表达，比如TGF-β的下调、和/或细胞骨架结构的再组织等。

“刺激分子”，作为本文使用的术语，意思是与存在于抗原呈递细胞上的关联刺激配体特异性地结合的T细胞上的分子。

如本文使用的“刺激配体”意思是如下配体：其当存在于抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B细胞等)上时，可以与T细胞上的关联结合配偶体(在本文称为“刺激分子”)特异性地结合，从而介导T细胞的初次应答，其包括但不限于活化、起始免疫应答、增殖等。刺激配体在本领域是熟知的，并且涵盖，特别是使用肽、抗CD3抗体、超激动剂抗CD28抗体、和超激动剂抗CD2抗体负载的MHC I类分子。

术语“对象”意图包括其中可以引发免疫应答的活的生物体(例如，哺乳动物)。如其中使用的“对象”或“患者”可以是人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括，例如，家畜和宠物，比如羊、牛、猪、狗、猫和鼠哺乳动物。优选地，对象是人。

如本文使用的，术语“基本上缺少细胞外结构域”指的是大体上不含细胞外突出(extrude)的结构域的分子。在一个实施方式中，嵌合细胞内信号传导分子缺少通过细胞外结构域执行的任何功能，比如抗原结合。在另一个实施方式中，嵌合细胞内信号传导分子包括跨膜结构域但是缺少功能性细胞外结构域。

如本文使用的，术语“基本上缺少细胞外配体-结合结构域”指的是大体上不含特异性地结合至某分子的结合结构域的分子。在一个实施方式中，嵌合细胞内信号传导分子缺少细胞外结构域中的任何功能性配体-结合结构域，比如缺少抗原结合结构域。在另一个实施方式中，嵌合细胞内信号传导分子包括细胞外结构域但是缺少特异性地结合至配体比如抗原的能力。

如本文使用的，“基本上纯化的”细胞是大体上不含其它细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞也指的是已经与其它细胞类型——在其天然存在状态中与该其它细胞类型正常地相关联——分开的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群指的是均质细胞群。在其它情况下，此术语简单地指的是已经与如下细胞分开的细胞：在其天然状态中与该细胞正常地相关联。在一些实施方式中，在体外培养细胞。在其它实施方式中，不在体外培养细胞。

“靶标位点”或“靶标序列”指的是基因组核酸序列，其限定了在足以发生结合的条件下结合分子可以特异性地结合至的核酸的部分。

如本文使用的，术语“T细胞受体”或“TCR”指的是响应于抗原的呈递参与T细胞的活化的膜蛋白的复合体。TCR负责识别结合至主要组织相容性复合体分子的抗原。TCR由alpha(α)和beta(β)链的异二聚体组成，但是在一些细胞中，TCR由gamma和delta(γ/δ)链构成。TCR可以以α/β和γ/δ形式存在，其是结构上相似的，但是具有独特的解剖学位置和功能。每条链由两个细胞外结构域——可变和恒定结构域——组成。在一些实施方式中，TCR可以在包括TCR的任何细胞上被修饰，包括，例如，辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、自然杀伤T细胞和γδT细胞。

如本文使用的术语“治疗性的”意思是治疗和/或预防。治疗性效果通过疾病状态的阻抑、缓解或根除获得。

如本文使用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指的是如下过程：通过该过程外源性核酸被转移或引入宿主细胞。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代对象细胞和其子代。

“治疗”疾病，作为本文使用的术语，意思是降低对象经历的疾病或障碍的至少一种迹象或症状的频率或严重度。

如本文使用的术语“肿瘤”指的是异常生长的组织，其可以是良性的、癌前的、恶性的、或转移的。

如本文使用的短语“在转录控制下”或“可操作地连接的”意思是启动子处于与多核苷酸有关的正确的位置和取向，以控制通过RNA聚合酶的转录的起始和多核苷酸的表达。

“载体”是物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可以被用于递送分离的核酸至细胞内部。众多载体在本领域是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物相关联的多核苷酸、质粒和病毒。因而，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应当解释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，比如，例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。

范围：遍及本公开内容，本发明的多个方面可以以范围格式呈现。应当理解范围格式的描述仅仅出于方便和简洁，并且不应当解释为对本发明的范围的僵硬限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，比如1至6的范围的描述应当被认为已经具体地公开了子范围比如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度，这均适用。

描述

本发明包括用于增强T细胞代谢和活性以便提供对过继性T细胞疗法更有效的T细胞的方法和组合物。根据本发明，当它们表达嵌合细胞内信号传导分子或嵌合抗原受体时，T细胞是代谢增强的并且具有改进的细胞毒性和对由肿瘤微环境施加的免疫抑制的抗性。

本发明还包括通过以双特异性抗体(BiAb)装备代谢增强的T细胞的过继性细胞疗法的组合方法。调节性T细胞(CD4+/CD25^hi/CD127^lo)、粒细胞(CD14^-/HLA-DR^-/CD11b⁺/CD33⁺)和单核细胞(CD14⁺/HLA-DR^-/CD11b⁺/CD33⁺)骨髓源阻抑性细胞(MDSC)群的存在改变肿瘤微环境以妨害到来的免疫效应细胞的能力。体外模型已经显示以双特异性抗体装备的T细胞抑制MDSC分化和减弱T调节性和MDSC阻抑性活性(Thakur A,et al.,J Transl Med.,11:35,2013)。以双特异性抗体装备T细胞还诱导细胞分泌Th1细胞因子，杀伤靶标细胞，并且在肿瘤衔接后扩展以将肿瘤微环境转变为Th1环境(Grabert,R.C.,et al.,Clin.Canc.Res.,12:569-576,2006)和以它们自身的肿瘤抗原免疫接种患者。

基于这些修饰的T细胞的观察，T细胞疗法的新的模态已经被研发出并且在本文描述，其使用单独的代谢增强的T细胞或还编码BiAb的代谢增强的T细胞以改进治疗功效。

嵌合细胞内信号传导分子

本发明包括在T细胞内的嵌合细胞内信号传导分子。在一方面，本发明包括修饰的T细胞，其包括编码嵌合细胞内信号传导分子的分离的核酸序列，其中分离的核酸序列包括共刺激分子的细胞内结构域的核酸序列并且基本上缺少细胞外配体-结合结构域，其中T细胞表达嵌合细胞内信号传导分子。

在另一方面，本发明包括修饰的T细胞，其包括嵌合细胞内信号传导分子，其中嵌合细胞内信号传导分子包括共刺激分子的细胞内结构域并且基本上缺少细胞外配体-结合结构域。

在又另一方面，本发明包括细胞群，其包括编码嵌合细胞内信号传导分子的核酸，该嵌合细胞内信号传导分子包括细胞内结构域并且基本上缺少细胞外配体-结合结构域，其中细胞群表达嵌合细胞内信号传导分子。

在一个实施方式中，嵌合细胞内信号传导分子缺少细胞外结构域中的任何功能性配体-结合结构域，比如缺少抗原结合结构域。在另一个实施方式中，嵌合细胞内信号传导分子包括细胞外结构域，但是缺少特异性地结合至配体或分子的能力。在又另一个实施方式中，嵌合细胞内信号传导分子基本上缺少细胞外结构域。

在另一方面，本发明包括代谢增强的T细胞，其包括嵌合细胞内信号传导分子，该嵌合细胞内信号传导分子包括共刺激分子的细胞内结构域和包括抗体的非抗原结合结构域——比如单链片段，其包括非抗原结合部分并且缺少抗体的可变区或Fc部分，即，IgD或IgA——的细胞外结构域。

在又另一方面，本发明包括代谢增强的T细胞，其包括嵌合细胞内信号传导分子并且基本上缺少细胞外配体-结合结构域，该嵌合细胞内信号传导分子包括共刺激分子的细胞内结构域。代谢增强的T细胞表达嵌合细胞内信号传导分子。在某些实施方式中，嵌合细胞内信号传导分子的表达在代谢上增强T细胞。在一些实施方式中，嵌合细胞内信号传导分子的表达改进细胞毒性和当处于肿瘤微环境时对免疫抑制的抗性。

细胞内结构域

本发明的嵌合细胞内信号传导分子的细胞内结构域或另外的细胞质结构域负责活化其中表达嵌合细胞内信号传导分子的细胞。术语“细胞内结构域”因而意思是包括足以转导活化信号的任何截短部分的细胞内结构域。在一个实施方式中，细胞内结构域包括负责效应物功能的结构域。术语“效应物功能”指的是细胞的特化功能。T细胞的效应物功能，例如，可以是包括分泌细胞因子的细胞溶解活性或辅助性活性。

在一个实施方式中，细胞内结构域包括负责信号活化和/或转导的结构域。细胞内结构域可以经由蛋白质-蛋白质相互作用、生物化学变化或其它应答传递信号活化以改变细胞的代谢、形状、基因表达或针对嵌合细胞内信号传导分子活化的其它细胞应答。

在一个实施方式中，包括嵌合细胞内信号传导分子的细胞在代谢上被增强。在另一个实施方式中，包括嵌合细胞内信号传导分子的细胞具有改进的细胞毒性和对免疫抑制的抗性，比如当细胞处于肿瘤微环境时。

用于本发明的细胞内结构域的实例包括但不限于T细胞受体(TCR)的细胞质部分和一致作用以在抗原受体受体衔接之后引发信号转导的任何共刺激分子，以及这些元件的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。

细胞内结构域的实例包括来自一种或多种分子或受体的片段或结构域，该分子或受体包括但不限于TCR，CD3ζ，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD86，普通的FcRγ，FcRβ(FcεR1b)，CD79a，CD79b，FcγRIIa，DAP10，DAP12，T细胞受体(TCR)，CD27，CD28，4-1BB(CD137)，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3，与CD83特异性地结合的配体，CDS，ICAM-1，GITR，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRF1)，CD127，CD160，CD19，CD4，CD8α，CD8β，IL2Rβ，IL2Rγ，IL7Rα，ITGA4，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，TRANCE/RANKL，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244、2B4)，CD84，CD96(Tactile)，CEACAM1，CRTAM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CD100(SEMA4D)，CD69，SLAMF6(NTB-A、Ly108)，SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，LAT，GADS，SLP-76，PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46，NKG2D，本文描述的其它共刺激分子，其任何衍生物、变体或片段，具有相同功能能力的共刺激分子的任何合成序列，和其任意组合。

在一个实施方式中，嵌合细胞内信号传导分子的细胞内结构域包括任何部分的共刺激分子，比如至少一个信号传导结构域，其来自CD3、CD27、CD28、ICOS、4-1BB、PD-1、T细胞受体(TCR)、共刺激分子、这些序列的任何衍生物或变体、具有相同功能能力的任何合成序列和其任意组合。

嵌合细胞内信号传导分子的其它结构域

嵌合细胞内信号传导分子可以包括可检测的标记。如本文使用的，术语“蛋白质标记”或“可检测的标记”或“标记”通常意思是与嵌合细胞内信号传导分子连接以检测嵌合细胞内信号传导分子的任何寡肽或多肽。标记可以被附加至嵌合细胞内信号传导分子的细胞内结构域、铰链结构域、跨膜结构域或其它结构域。标记可以包括多至100个氨基酸，10至50个的之间氨基酸，或5至25个之间的氨基酸。可以通过化学剂或酶比如蛋白酶、内含肽剪接、肽酶等由嵌合细胞内信号传导分子去除或切割标记。标记还可以被用于嵌合细胞内信号传导分子的亲和纯化。标记的实例包括但不限于几丁质结合蛋白、麦芽糖结合蛋白、硫氧还蛋白-标记、荧光素标记抗体、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、poly(His)标记、V5-标记、Myc-标记、HA-标记、生物素或生物素样分子、链霉亲和素结合分子、标签标记、或本领域已知的其它标记。

嵌合细胞内信号传导分子可以包括间隔结构域。如本文使用的，术语“间隔结构域”通常意思是起连接任何结构域功能的任何寡肽或多肽，比如在肽链中将跨膜结构域连接至细胞外结构域或细胞质结构域中的任一种。间隔结构域可以在嵌合细胞内信号传导分子的一端或两端上。间隔结构域可以包括多至300个氨基酸，优选地10至100个氨基酸和最优选地25至50个氨基酸。

在一些实施方式中，嵌合细胞内信号传导分子进一步包括铰链和/或跨膜结构域。在一个实施方式中，嵌合细胞内信号传导分子进一步包括铰链和/或跨膜结构域，比如CD28跨膜结构域和CD8-α铰链结构域。铰链和/或跨膜结构域的实例包括但不限于如下的铰链和/或跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIR、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、NKG2C和其任意组合。

双特异性抗体

本发明还涵盖双特异性抗体。在一个实施方式中，本发明的代谢增强的细胞进一步包括双特异性抗体。双特异性抗体包括两种不同的结合特异性并且因而结合至两种不同的抗原。在这样的实施方式中，双特异性抗体包括结合至第一抗原的第一抗原结合结构域和结合至第二抗原的第二抗原结合结构域。双特异性抗体可以特异性地结合至相同靶标比如细胞或受体上的多于一个表位，或特异性地结合至不同靶标上的多于一个表位。在另一个实施方式中，双特异性抗体包括双特异性抗原结合结构域。

本发明不应当解释为限于任何具体的双特异性抗体。相反，任何双特异性抗体在本发明中是有用的。双特异性抗体可以由合成抗体、人抗体、人源化抗体、单链可变片段(scFv)、单结构域抗体、其抗原结合片段和其任意组合构建。在一个实施方式中，通过连接两种不同的抗体或其部分——比如来自两种不同抗体的Fab、F(ab’)₂、Fab’、scFv和sdAb——构建双特异性抗体。还在本文其它地方描述了用于制造人和人源化抗体的和抗体片段比如scFv的技术。在另一个实施方式中，双特异性抗体包括抗原结合结构域，其包括第一和第二单链可变片段(scFv)分子。

用于工程化和表达双特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共同表达(参见Milstein and Cuello,Nature 305:537(1983),WO93/08829,and Traunecker et al.,EMBO J.10:3655(1991))，和“杵臼(knob-in-hole)”工程化(参见，例如，美国专利号5,731,168)。也可以通过如下制造多特异性抗体：工程化用于制造抗体Fc-异二聚体分子的静电转向效应(electrostatic steeringeffect)(WO 2009/089004A1)；交联两种或更多种抗体或片段(参见，例如，美国专利号4,676,980，和Brennan et al.,Science229:81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny et al.,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992))；使用制造双特异性抗体片段的“双抗体”技术(参见，例如，Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(scFv)二聚体(参见，例如Gruber et al.,J.Immunol.,152:5368(1994))；和制备三特异性抗体，例如，如在Tutt et al.J.Immunol.147:60(1991)中描述的。具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体——其包括“章鱼抗体”——也包括在本文中(参见，例如US2006/0025576A1)。

本发明包括双特异性抗体，其具有结合至靶标细胞的抗原结合结构域。在一个实施方式中，双特异性抗体具有对靶标细胞抗原的特异性。在另一个实施方式中，双特异性抗体包括特异性地结合至靶标细胞抗原的抗体或其片段。靶标细胞抗原可以包括与T细胞受体结合的相同的靶标细胞抗原或可以包括不同的靶标细胞抗原。靶标细胞抗原可以包括在靶标细胞的表面上发现的任何类型的配体，包括T细胞上的配体(例如CD3、CD2、或在T细胞母细胞(T cell blast)上表达的其它抗原)。例如，靶标细胞抗原可以因为如下而被选择：它识别充当与特定疾病状态相关联的靶标细胞上的细胞标志物的配体。因而，可以充当双特异性抗体中的抗原部分结构域的配体的细胞标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染，自身免疫性疾病和癌细胞相关联的那些。在一个实施方式中，靶标细胞抗原包括任何肿瘤相关抗原(TAA)、任何病毒抗原或其任意片段。

在另一个实施方式中，双特异性抗体具有对T细胞——比如如本文其它地方描述的代谢增强的T细胞——上的至少一种抗原的特异性。T细胞抗原包括在T细胞的表面上发现的抗原。T细胞抗原可以包括如本文其它地方描述的共刺激分子。在一个实施方式中，T细胞抗原是CD3、CD4、CD8、T细胞受体(TCR)或其任意片段。在此实施方式中，双特异性抗体包括特异性地结合至T细胞抗原的抗体。双特异性抗体的实例包括抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗TCR、抗IgD Fc、抗IgA Fc、其任意片段和其任意组合。双特异性抗体的其它靶标抗原也可以是T细胞抗原比如CD3、CD4、CD8、TCR或其任意片段(例如抗CD3x抗CD3构建体)。在另一个实施方式中，双特异性抗体被化学地异源缀合至特异于肿瘤相关抗原(TAA)的多克隆抗体，并且T细胞特异性地结合TAA多克隆抗体。

本发明的另一个实施方式包括本文描述的代谢增强的T细胞，其中第一抗原结合结构域结合至靶标细胞并且第二抗原结合结构域结合至活化的T细胞。

可以以双特异性抗体装备在本文其它地方描述的代谢增强的T细胞。当以双特异性抗体装备细胞时，细胞与双特异性抗体接触并且双特异性抗体通过双特异性抗体的一个抗原结合结构域特异性地结合至细胞的表面上的抗原。在另一个实施方式中，以两种或更多种双特异性抗体装备T细胞并且T细胞展示两种或更多种双特异性抗体。在这样的实施方式中，T细胞特异性地结合至双特异性抗体中的至少两种。

可选地，可以由细胞表达和分泌双特异性抗体。当细胞表达双特异性抗体时，编码双特异性抗体的核酸序列可以被引入细胞。可以通过在本文其它地方描述的任何方法或本领域已知的其它方法引入核酸序列。在一个实施方式中，使用编码双特异性抗体的核酸序列电穿孔细胞。

嵌合抗原受体(CAR)

在本发明的另一方面，通过在其中表达CAR来生成代谢增强的T细胞。因而，本发明涵盖CAR和编码CAR的核酸构建体，其中CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。

CAR的一个或多个结构域或结构域的片段可以是人的。在一个实施方式中，本发明包括全人CAR。可以使用本领域已知的重组方法获得编码期望的结构域的核酸序列，比如，例如使用标准技术通过从表达该基因的细胞的文库筛选，通过从已知包括其的载体衍生该基因，或通过从包含其的细胞和组织直接分离。可选地，可以合成地产生感兴趣的基因，而不是作为克隆的分子。

在一方面，本发明包括代谢增强的肿瘤特异性T细胞，其包括嵌合抗原受体(CAR)和双特异性抗体，其中CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激分子的细胞内结构域，并且双特异性抗体结合至肿瘤细胞上的靶标和T细胞，并且其中T细胞在实体瘤部位具有改进的细胞毒性和对免疫抑制的抗性。在一个实施方式中，T细胞包括编码CAR的核酸序列，和任选地，编码双特异性抗体的核酸序列。

抗原结合结构域

在一个实施方式中，本发明的CAR包括结合至靶标细胞上的抗原的抗原结合结构域。可以充当结合至CAR的抗原结合结构域的抗原的细胞表面标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染，自身免疫性疾病和癌细胞相关联的那些。

抗原结合结构域的选择取决于在靶标细胞的表面上存在的抗原的类型和数目。例如，可以选择抗原结合结构域以识别充当与具体疾病状态相关联的靶标细胞上的细胞表面标志物的抗原。

在一个实施方式中，抗原结合结构域结合至肿瘤抗原，比如特异于感兴趣的肿瘤或癌症的抗原。在一个实施方式中，本发明的肿瘤抗原包括一种或多种抗原癌症表位。

抗原结合结构域可以包括结合至抗原的任何结构域并且可以包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体、非人抗体和其任意片段。因而，在一个实施方式中，抗原结合结构域部分包括哺乳动物抗体或其片段。

在一些情况下，抗原结合结构域源自CAR将最终用于其中的相同的物种是有利的。例如，对于用于人，可能有利的是，CAR的抗原结合结构域包括人抗体、如本文其它地方描述的人源化抗体或其片段。

还有利的是，抗原结合结构域被可操作地连接至CAR的另一个结构域，比如跨膜结构域或细胞内结构域——其均在本文其它地方描述，用于在细胞中表达。在一个实施方式中，编码抗原结合结构域的核酸被可操作地连接至编码跨膜结构域的核酸和编码细胞内结构域的核酸。

跨膜结构域

关于跨膜结构域，CAR可以被设计以包括将CAR的抗原结合结构域连接至细胞内结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，跨膜结构域天然地与CAR中的结构域中的一个或多个相关联。在一些情况下，可以选择跨膜结构域或通过氨基酸置换修饰跨膜结构域，以避免将这样的结构域结合至相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合体的其它成员的相互作用。

跨膜结构域可以源自天然来源或合成来源。当来源是天然的时，结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。具体用于本发明的跨膜区可以源自T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154(即至少包括上述中的跨膜区(一个或多个))。在一些情况下，也可以采用各种人铰链，包括人Ig(免疫球蛋白)铰链。

在一个实施方式中，跨膜结构域可以是合成的，在该情况下，它将包括占主导的疏水残基比如亮氨酸和缬氨酸。优选地，将在合成跨膜结构域的每端处发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。

细胞内结构域

CAR的细胞内结构域或另外的细胞质结构域包括与在本文其它地方描述的嵌合细胞内信号传导分子类似或相同的细胞内结构域，并且负责活化其中表达CAR的细胞。

在一个实施方式中，CAR的细胞内结构域包括负责信号活化和/或转导的结构域。

用于本发明的细胞内结构域的实例包括但不限于T细胞受体(TCR)的细胞质部分和一致作用以在抗原受体受体衔接之后引发信号转导的任何共刺激分子，以及这些元件的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。

细胞内结构域的实例包括来自一种或多种分子或受体的片段或结构域，该分子或受体包括但不限于TCR，CD3ζ，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD86，普通的FcRγ，FcRβ(FcεR1b)，CD79a，CD79b，FcγRIIa，DAP10，DAP12，T细胞受体(TCR)，CD27，CD28，4-1BB(CD137)，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3，与CD83特异性地结合的配体，CDS，ICAM-1，GITR，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRF1)，CD127，CD160，CD19，CD4，CD8α，CD8β，IL2Rβ，IL2Rγ，IL7Rα，ITGA4，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，TRANCE/RANKL，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244、2B4)，CD84，CD96(Tactile)，CEACAM1，CRTAM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CD100(SEMA4D)，CD69，SLAMF6(NTB-A、Ly108)，SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，LAT，GADS，SLP-76，PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46，NKG2D，本文描述的其它共刺激分子，其任何衍生物、变体或片段，具有相同功能能力的共刺激分子的任何合成序列，和其任意组合。

在一个实施方式中，CAR的细胞内结构域包括任何部分的共刺激分子，比如至少一个信号传导结构域，其来自CD3、CD27、CD28、ICOS、4-1BB、PD-1、T细胞受体(TCR)、其任何衍生物或变体、具有相同功能能力的其任何合成序列、和其任意组合。

在CAR的抗原结合结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的细胞内结构域和跨膜结构域之间，可以并入间隔结构域。如本文使用的，术语“间隔结构域”通常意思是起将任何结构域比如将跨膜结构域连接至多肽链中的抗原结合结构域或细胞内结构域作用的任何寡肽-或多肽。间隔结构域可以在CAR的一端或两端上。在一个实施方式中，间隔结构域可以包括多至300个氨基酸，优选地10至100个氨基酸和更优选地25至50个氨基酸。在另一个实施方式中，短的寡肽或多肽连接体，优选地长度在2和10个氨基酸之间，可以在CAR的跨膜结构域和细胞内结构域之间形成连接。连接体的实例包括甘氨酸-丝氨酸双联体。

人抗体

当使用双特异性抗体或CAR的抗原结合结构域时，可以优选地使用人抗体或其片段。完全人抗体对于人对象的治疗性处理是特别期望的。可以通过各种本领域已知的方法制造人抗体，该方法包括使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法，包括对这些技术的改进。还参见美国专利号4,444,887和4,716,111；和PCT公布WO 98/46645、WO98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO91/10741；其每篇通过引用以其全部并入本文。双特异性抗体还可以包括其中重链和轻链由源自一种或多种人DNA来源的核苷酸序列编码的抗体。

还可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人抗体。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合体可以被随机地或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞。可选地，除人重链和轻链基因之外，人可变区、恒定区、和多变区也可以被引入小鼠胚胎干细胞。通过同源重组，可以单独地或与引入人免疫球蛋白基因座同时地，使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因非功能性。例如，已经描述了在嵌合和种系突变小鼠中纯合缺失抗体重链J区(JH)基因导致内源性抗体产生的完全抑制。修饰的胚胎干细胞被扩展并且显微注射入胚泡以产生嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合后代。转基因小鼠以正常的方式使用选择的抗原——例如，本发明的多肽的全部或部分——进行免疫。针对选择的靶标的抗体可以使用常规的杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠获得。由转基因小鼠聚藏(harbor)的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，并且随后经历类别转换和体细胞突变。因而，使用这样的技术，可能产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体，其包括但不限于IgG1(γ1)和IgG3。对于此技术用于产生人抗体的综述，参见Lonberg and Huszar(Int.Rev.Immunol.,13:65-93(1995))。对于此技术用于产生人抗体和人单克隆抗体以及用于生产这样的抗体的方案的详细讨论，参见，例如，PCT公布号WO98/24893、WO 96/34096、和WO 96/33735；和美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；和5,939,598，其每篇通过引用以其全部并入本文。此外，可以与公司比如Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)和Genpharm(San Jose,Calif.)签订合同以使用与上面描述的类似的技术提供针对选择的抗原的人抗体。对于在种系突变小鼠中转移人类种系免疫球蛋白基因阵列在抗原攻击之后将导致产生人抗体的具体讨论，参见，例如，Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits et al.,Nature,362:255-258(1993)；Bruggermann et al.,Year inImmunol.,7:33(1993)；和Duchosal et al.,Nature,355:258(1992)。

人抗体也可以源自噬菌体展示文库(Hoogenboom et al.,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)；Vaughan et al.,NatureBiotech.,14:309(1996))。噬菌体展示技术(McCafferty et al.,Nature,348:552-553(1990))可以被用于从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因所有组成成分在体外产生人抗体和抗体片段。根据此技术，将抗体V结构域基因符合读框地克隆入丝状噬菌体比如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因，并且在噬菌体颗粒的表面上作为功能性抗体片段展示。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能性质的选择也导致选择编码展示那些性质的抗体的基因。因而，噬菌体模拟了B细胞的一些性质。噬菌体展示可以以各种形式进行；对于其综述，参见，例如，Johnson,Kevin S,and Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3:564-571(1993)。数种来源的V基因区段可以被用于噬菌体展示。Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)从源自未免疫小鼠脾脏的V基因的小的随机组合文库分离了抗唑酮抗体的多样化阵列。可以构建来自未免疫人供体的V基因所有组成成分，并且抗原(包括自体抗原)的多样化阵列的抗体可以大体上遵循由下列描述的技术进行分离：Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)或Griffith et al.,EMBO J.,12:725-734(1993)。还参见美国专利号5,565,332和5,573,905，其每篇通过引用以其全部并入本文。

人抗体也可以通过体外活化的B细胞生成(参见，美国专利号5,567,610和5,229,275，其每篇通过引用以其全部并入本文)。人抗体也可以使用杂交瘤技术体外生成，比如，但不限于由Roder et al.(Methods Enzymol.,121:140-167(1986))描述的。

人源化抗体

可选地，在一些实施方式中，非人抗体可以是人源化的，其中抗体的特异性序列或区域被修饰以增加与人中天然产生的抗体的相似性。例如，在本发明中，抗体或其片段可以包括非人哺乳动物scFv。在一个实施方式中，抗原结合结构域部分是人源化的。

可以使用本领域已知的各种技术产生人源化抗体，该技术包括但不限于CDR-移植(参见，例如，欧洲专利号EP 239,400；国际公布号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089，其每篇通过引用以其全部并入本文)、贴面(veneering)或表面重建(resurfacing)(参见，例如，欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka et al,1994,ProteinEngineering,7(6):805-814；和Roguska et al,1994,PNAS,91:969-973，其每篇通过引用以其全部并入本文)、链改组(参见，例如，美国专利号5,565,332，其通过引用以其全部并入本文)和在如下中公开的技术：例如，美国专利申请公布号US2005/0042664、美国专利申请公布号US2005/0048617、美国专利号6,407,213、美国专利号5,766,886、国际公布号WO9317105、Tan et al.,J.Immunol.,169:1119-25(2002)、Caldas et al.,Protein Eng.,13(5):353-60(2000)、Morea et al.,Methods,20(3):267-79(2000)、Baca et al.,J.Biol.Chem.,272(16):10678-84(1997)、Roguska et al.,Protein Eng.,9(10):895-904(1996)、Couto et al.,Cancer Res.,55(23Supp):5973s-5977s(1995)、Couto et al.,Cancer Res.,55(8):1717-22(1995)、Sandhu J S,Gene,150(2):409-10(1994)和Pedersenet al.,J.Mol.Biol.,235(3):959-73(1994)，其每篇通过引用以其全部并入本文。通常，框架区中的框架残基将被置换为来自CDR供体抗体的相应残基以改变优选地改进抗原结合。这些框架置换通过本领域熟知的方法鉴定，例如，通过建模CDR和框架残基的相互作用以鉴定对抗原结合重要的框架残基和通过序列比较鉴定特定位置处的不常见的框架残基(参见，例如，Queen et al.，美国专利号5,585,089；和Riechmann et al.,1988,Nature,332:323，其通过引用以其全部并入本文)。

人源化抗体具有从非人来源引入其的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。因而，人源化抗体包括来自非人免疫球蛋白分子的一个或多个CDR和来自人的框架区。抗体的人源化是本领域熟知的，并且可以大体上遵循Winter与合作者的方法进行(Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988))，其通过将啮齿动物CDR或CDR序列置换为相应的人抗体序列，即CDR-移植(EP239,400；PCT公布号WO 91/09967；和美国专利号4,816,567；6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；6,548,640，其内容通过引用以其全部并入本文)。在这样的人源化嵌合抗体中，实质上小于完整人可变结构域已经被来自非人物种的相应的序列置换。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些框架(FR)残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基置换的人抗体。抗体的人源化也可以通过贴面或表面重建(EP 592,106；EP519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka et al.,Protein Engineering,7(6):805-814(1994)；and Roguska et al.,PNAS,91:969-973(1994))或链改组(美国专利号5,565,332)实现，其内容通过引用以其全部并入本文。

用于制造人源化抗体的人可变结构域——轻和重二者——的选择是为了降低抗原性。根据所谓的“最佳拟合”方法，啮齿动物抗体的可变结构域的序列针对已知的人可变结构域序列的整个文库进行筛选。最接近于啮齿动物的序列的人序列然后被接受为用于人源化抗体的人框架(FR)(Sims et al.,J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia et al.,J.Mol.Biol.,196:901(1987)，其内容通过引用以其全部并入本文)。另一种方法使用源自特定的轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可以被用于数种不同的人源化抗体(Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta etal.,J.Immunol.,151:2623(1993)，其内容通过引用以其全部并入本文)。

抗体可以被人源化，并且保留对靶标抗原的高亲和力和其它有利的生物学性质。根据本发明的一个方面，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和多种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是一般可获得的并且是本领域技术人员熟悉的。图解和展示选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可获得的。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合靶标抗原的能力的残基。以此方式，FR残基可以从接受者和输入序列选择并组合，使得实现期望的抗体特性，比如对靶标抗原的增加的亲和力。一般而言，CDR残基直接地和最实质性地参与影响抗原结合。

人源化抗体保留与原始抗体相似的抗原特异性。然而，使用人源化的某些方法，可以使用“定向进化”的方法增加抗体对靶标抗原的结合亲和力和/或特异性，如由Wu etal.,J.Mol.Biol.,294:151(1999)描述的，其内容通过引用以其全部并入本文。

载体

载体可以被用于将嵌合细胞内信号传导分子或CAR引入如本文其它地方描述的T细胞。在一方面，本发明包括载体，其包括编码嵌合细胞内信号传导分子的核酸序列和任选地编码如本文描述的双特异性抗体的核酸序列。在另一方面，本发明包括载体，其包括编码CAR的核酸序列和任选地编码如本文描述的双特异性抗体的核酸序列。在一个实施方式中，载体包括质粒载体、病毒载体、逆转录转座子(例如背驮式(piggyback)、睡美人(sleepingbeauty))、定点插入载体(例如CRISPR、锌指核酸酶、TALEN)、或自杀表达载体、或本领域其它已知的载体。

上面提及的所有构建体能够与批准用于人细胞的第3代慢病毒载体质粒、其它病毒载体或RNA一起使用。在一个实施方式中，载体是病毒载体，比如慢病毒载体。在另一个实施方式中，载体是RNA载体。

可以通过测序验证本文描述的任何分子的产生。可以使用免疫印迹、免疫组织化学、流式细胞术或本领域熟知和可利用的其它技术验证全长蛋白质的表达。

本发明也提供了其中插入本发明的DNA的载体。载体，包括源于逆转录病毒比如慢病毒的那些，是实现长期基因转移的合适工具，这是由于它们允许转基因的长期、稳定整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒比如鼠白血病病毒的载体的额外优点，因为它们可转导非增殖的细胞，比如肝细胞。它们也具有在将其引入的对象中导致低免疫原性的附加优点。

通常通过可操作地连接核酸或其部分至启动子，并且将构建体并入表达载体来实现天然或合成核酸的表达。载体是通常能够在哺乳动物细胞中复制和/或还能够整合入哺乳动物的细胞基因组的载体。典型的载体包含对调节期望的核酸序列的表达有用的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

核酸可以被克隆入任何数目的不同类型的载体。例如，核酸可以被克隆入如下载体：其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。

表达载体可以以病毒载体的形式被提供至细胞。病毒载体技术是本领域熟知的并且例如在Sambrook et al.2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,volumes1-4,Cold Spring Harbor Press,NY和其它病毒学和分子生物学手册中描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般而言，合适的载体包含在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标志物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。

额外的启动子元件例如增强子调控转录起始的频率。通常地，这些位于起始位点上游30-110bp的区域，但是最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，使得当元件相对于另一个被反向或移动时保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加至隔开50bp，然后活性才开始下降。取决于启动子，显示出单个元件可以合作地或独立地起作用以启动转录。

启动子的实例是即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。此启动子序列是能够驱动可操作地连接至其的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。然而，也可以使用其它组成型启动子序列，其包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、延伸因子-1α启动子，以及人基因启动子，比如，但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步，本发明应当不限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当期望这样的表达时，开启可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当不期望表达时关闭该表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估多肽或其部分的表达，引入细胞的表达载体也可以包含可选择的标记物基因或报道基因中的任一种或二者，以促进从寻求通过病毒载体被转染或感染的细胞群鉴定和选择表达细胞。在其它方面，可选择的标志物可以被携带在DNA的单独段上并且用于共转染程序。可选择的标志物和报道基因二者均可以侧接适当的调控序列，以使得能够在宿主细胞中表达。有用的可选择的标志物包括例如抗生素抗性基因，比如neo等。

报道基因被用于鉴定潜在转染的细胞并且用于评价调控序列的功能性。一般而言，报道基因是如下基因：其不存在于受体生物体或组织或由受体生物体或组织表达，并且编码如此多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶促活性显现。在DNA已经被引入受体细胞后，在合适的时间评估报道基因的表达。合适的报道基因可以包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因，或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei et al.,2000FEBS Letters 479:79-82)。合适的表达系统是熟知的并且可以使用已知的技术制备或商购。一般而言，显示最高水平的报道基因表达的具有最小5’侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可以被连接至报道基因并且被用于评价试剂调节启动子驱动的转录的能力。

核酸的引入

将基因——比如嵌合细胞内信号传导分子或CAR——引入细胞和表达该基因的方法是本领域已知的。在表达载体的上下文中，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物学手段被转移入宿主细胞。

用于将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包括载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见，例如，Sambrook et al.,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,volumes 1-4,Cold Spring Harbor Press,NY。可以使用商业上可获得的方法将核酸引入靶标细胞，该方法包括电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))、ECM830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或Gene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.)、Multiporator(Eppendort,Hamburg Germany)。还可以如下将核酸引入细胞：使用阳离子脂质体介导的转染、使用脂质转染、使用聚合物封装、使用肽介导的转染或使用生物射弹粒子递送系统比如“基因枪”(参见，例如，Nishikawa,et al.Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001)。

用于将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。RNA载体包括具有RNA启动子和/或用于产生RNA转录物的其它相关结构域的载体。病毒载体，并且尤其是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其它病毒载体可以源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒和腺伴随病毒等。参见，例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。

用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，比如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，其包括水包油乳液、胶团、混合胶团和脂质体。用作体外和体内递送媒介的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊)。

在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介是脂质体。预期将脂质制剂用于将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一方面，核酸可以与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可以被封装在脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经由与脂质体和寡核苷酸二者均缔合的连接分子附加至脂质体，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液包含在脂质中，包含胶团或与胶团复合，或以其它方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体缔合的组合物不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可以存在于双分子层结构中，作为胶团，或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪液滴——其在细胞质中天然存在——以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物比如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的化合物类别。

适于使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从Sigma,St.Louis,MO获得；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)可以从K&K Laboratories(Plainview,NY)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质可以从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)获得。氯仿或氯仿/甲醇中的脂质原液可以被储存在大约-20℃下。氯仿被用作唯一的溶剂，这是由于它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，其涵盖通过生成封闭的脂双层或聚集体而形成的各种单一和多层脂质媒介。脂质体可以被表征为具有含有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水性溶液中时，它们自发地形成。在形成封闭结构和在脂双层之间包埋水和溶解的溶质前，脂质组分经历自我重排(Ghosh et al.,1991Glycobiology 5:505-10)。然而，也涵盖与正常的囊泡结构相比在溶液中具有不同结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶团结构或仅作为脂质分子的非均一聚集体存在。同样考虑脂质转染胺-核酸复合物。

不管用于将外源核酸引入宿主细胞或以其它方式将细胞暴露于本文描述的分子的方法如何，为了确认在宿主细胞中存在该核酸，可以进行各种试验。这样的试验包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”试验，比如DNA印迹和RNA印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”试验，比如例如通过免疫学手段(ELlSA和蛋白质印迹)或通过本文描述的鉴定落入本发明范围内的试剂的试验来检测特定肽的存在或不存在。

在一个实施方式中，通过选自如下的方法引入在本文其它地方描述的核酸序列中的一种或多种：转导细胞群、转染细胞群和电穿孔细胞群。在一个实施方式中，细胞群包括本文描述的核酸序列中的一种或多种。

在一个实施方式中，引入细胞的核酸是RNA。在另一个实施方式中，RNA是包括体外转录的RNA或合成RNA的mRNA。使用聚合酶链式反应(PCR)生成的模板通过体外转录产生RNA。来自任何来源的感兴趣的DNA可以通过PCR直接转化为使用适当的引物和RNA聚合酶的体外mRNA合成的模板。DNA的来源可以是，例如，基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其它适当的DNA来源。期望的体外转录模板是嵌合细胞内信号传导分子和/或双特异性抗体。

PCR可以被用于生成体外转录mRNA——其随后被引入细胞——的模板。用于进行PCR的方法是本领域熟知的。用于PCR的引物被设计为具有与待用作PCR模板的DNA的区域基本上互补的区域。如本文使用的“基本上互补的”指的是引物序列中的大部分或所有碱基是互补的、或一个或多个碱基是非互补的或错配的核苷酸的序列。基本上互补的序列能够与目标DNA靶标在用于PCR的退火条件下退火或杂交。引物可以被设计为与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，引物可以被设计为扩增在细胞中正常转录的部分基因(开放阅读框)，包括5'和3'UTR。引物还可以被设计为扩增编码感兴趣的特定结构域的部分基因。在一个实施方式中，引物被设计为扩增包括所有或部分5'和3'UTR的人cDNA的编码区。通过本领域熟知的合成方法生成可用于PCR的引物。“正向引物”是包含与待扩增的DNA序列上游的DNA模板上的核苷酸基本上互补的核苷酸区域的引物。本文使用的“上游”指的是待扩增的DNA序列相对于编码链的5'位置。“反向引物”是包含与待扩增的DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补的核苷酸区域的引物。本文使用的“下游”指的是待扩增的DNA序列相对于编码链的3'位置。

还可以使用具有促进RNA的稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。RNA优选地具有5'和3'UTR。在一个实施方式中，5'UTR的长度在零和3000个核苷酸之间。待添加至编码区的5'和3'UTR序列的长度可以通过不同的方法改变，其包括但不限于设计用于PCR的引物，其退火至UTR的不同区域。使用此方法，本领域普通技术人员可以修改实现转染转录的RNA之后最佳翻译效率所需要的5'和3'UTR长度。

5'和3'UTR可以是感兴趣的基因的天然存在的内源性5'和3'UTR。可选地，可以通过将UTR序列并入正向和反向引物或通过模板的任何其它修饰添加对感兴趣的基因非内源性的UTR序列。使用对感兴趣的基因非内源性的UTR序列对修改RNA的稳定性和/或翻译效率可以是有用的。例如，已知3'UTR序列中的富AU元件可以降低mRNA的稳定性。因此，3'UTR可以被选择或设计以基于本领域熟知的UTR的性质增加转录的RNA的稳定性。

在一个实施方式中，5'UTR可以包含内源基因的Kozak序列。可选地，当正在通过如上面描述的PCR添加对感兴趣的基因非内源性的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列重新设计共有的Kozak序列。Kozak序列可以增加一些RNA转录物的翻译效率，但是似乎不是所有RNA能够高效翻译所必需的。许多mRNA的Kozak序列的要求是本领域已知的。在其它实施方式中，5'UTR可以源自其RNA基因组在细胞中稳定的RNA病毒。在其它实施方式中，多种核苷酸类似物可以被用于3'或5'UTR中以阻碍mRNA的核酸外切酶降解。

为了使得能够从DNA模板合成RNA而不需要基因克隆，转录的启动子应当被附加至待转录的序列上游的DNA模板。当作为RNA聚合酶的启动子起作用的序列被添加至正向引物的5'端时，RNA聚合酶启动子并入待转录的开放阅读框上游的PCR产物。在一个实施方式中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文其它地方描述的。其它有用的启动子包括但不限于T3和SP6RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有的核苷酸序列是本领域已知的。

在一个实施方式中，mRNA具有5'端上的帽和3'聚腺苷酸尾二者，其决定核糖体结合、翻译起始和mRNA在细胞中的稳定性。在环状DNA模板例如质粒DNA上，RNA聚合酶产生不适于在真核细胞中表达的长的多联体产物(concatameric product)。在3'UTR的端处线性化的质粒DNA的转录产生正常大小的mRNA，其在真核转染中无效，即使其在转录后被聚腺苷酸化。

在线性DNA模板上，噬菌体T7RNA聚合酶可以使转录物的3'端延伸超过模板的最后一个碱基(Schenborn and Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nacheva andBerzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003))。

将聚A/T区段整合入DNA模板的常规方法是分子克隆。然而，整合入质粒DNA的聚A/T序列可能引起质粒不稳定，这就是为什么从细菌细胞获得的质粒DNA模板经常被缺失和其它畸变高度污染。这使得克隆程序不仅费力和耗时，并且经常不可靠。这就是为什么允许构建具有聚A/T 3'区段的DNA模板而没有克隆的方法是高度期望的。

转录的DNA模板的聚A/T区段可以在PCR期间通过使用包含聚T尾——比如100个T尾(大小可以是50-5000个T)——的反向引物产生，或在PCR后通过任何其它方法产生，该方法包括但不限于DNA连接或体外重组。聚腺苷酸尾还给RNA提供稳定性并且减少它们的降解。通常地，聚腺苷酸尾的长度与转录的RNA的稳定性正相关。在一个实施方式中，聚腺苷酸尾在100和5000个腺苷之间。

可以在体外转录之后使用聚腺苷酸聚合酶比如大肠杆菌聚腺苷酸聚合酶(E-PAP)进一步延伸RNA的聚腺苷酸尾。在一个实施方式中，使聚腺苷酸尾的长度从100个核苷酸增加至300和400个之间的核苷酸导致RNA的翻译效率增加大约两倍。另外地，不同的化学基团附加至3'端可以增加mRNA稳定性。这样的附加可以包含修饰的/人工的核苷酸、适配体和其它化合物。例如，ATP类似物可以使用聚腺苷酸聚合酶并入聚腺苷酸尾。ATP类似物可以进一步增加RNA的稳定性。

5'帽也给RNA分子提供稳定性。在优选的实施方式中，通过本文公开的方法产生的RNA包括5'帽。使用本领域已知的和本文描述的技术提供5'帽(Cougot,et al.,Trends inBiochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski,et al.,RNA,7:1468-95(2001)；Elango,etal.,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。

通过本文公开的方法产生的RNA还可以包含内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是起始帽-独立性核糖体结合至mRNA并且促进翻译起始的任何病毒序列、染色体序列或人工设计的序列。可以包括适于细胞电穿孔的任何溶质，其可以包含促进细胞通透性和生存力的因子，比如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。

一些体外转录的RNA(IVT-RNA)载体是文献中已知的，其以标准化方式被用作体外转录的模板并且已经以如此方式被基因修饰：该方式产生稳定的RNA转录物。当前，用于本领域的方案基于具有下列结构的质粒载体：使得能够RNA转录的5'RNA聚合酶启动子，接着是由非翻译区域(UTR)在3'和/或5'侧接的感兴趣的基因，和包含50-70个A核苷酸的3'聚腺嘌呤基盒。在体外转录之前，环状质粒在聚腺嘌呤基盒下游通过II型限制酶(识别序列对应于切割位点)线性化。聚腺嘌呤基盒因而对应于转录物中的后面的聚腺苷酸序列。作为此程序的结果，一些核苷酸在线性化后仍作为部分酶切割位点保留并且延伸或掩盖3'端处的聚腺苷酸序列。尚不清楚此非生理学突出端是否影响从这样的构建体细胞内产生的蛋白质的量。

在一方面，RNA构建体通过电穿孔被递送入细胞。参见，例如，如在US 2004/0014645、US 2005/0052630A1、US 2005/0070841A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1中教导的将核酸构建体电穿孔入哺乳动物细胞的制剂和方法。包括电穿孔任何已知的细胞类型所需要的电场强度在内的多个参数在相关的研究文献以及该领域的众多专利和申请中通常是已知的。参见例如，美国专利号6,678,556、美国专利号7,171,264和美国专利号7,173,116。用于电穿孔的治疗性应用的设备是商业上可获得的，例如，MedPulser^TMDNA电穿孔治疗系统(Inovio/Genetronics,San Diego,Calif.)，并且在专利比如美国专利号6,567,694；美国专利号6,516,223、美国专利号5,993,434、美国专利号6,181,964、美国专利号6,241,701和美国专利号6,233,482中描述；电穿孔也可以被用于细胞体外转染，例如，如在US20070128708A1中描述的。电穿孔也可以被用于将核酸体外递送入细胞。因此，利用本领域技术人员已知的许多可用的装置和电穿孔系统中的任一种将包括核酸的表达构建体电穿孔介导的施用入细胞提供了令人激动的将感兴趣的RNA递送至靶标细胞的新手段。

生成代谢增强的T细胞

本发明包括在代谢上增强肿瘤特异性T细胞的方法，其包括将CAR引入T细胞，其中CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激分子的细胞内结构域，以双特异性抗体装备CAR T细胞，其中双特异性抗体结合至肿瘤细胞上的靶标和CAR T细胞，并且刺激装备的CART细胞上的至少一种共刺激分子，其中刺激活化共刺激分子的细胞内结构域，从而在代谢上增强装备的T细胞。在一个实施方式中，将CAR引入T细胞包括引入编码CAR的核酸序列，比如通过电穿孔编码CAR的mRNA。在另一个实施方式中，装备CAR T细胞包括使CAR T细胞与双特异性抗体接触。在又另一个实施方式中，装备CAR T细胞包括引入编码双特异性抗体的核酸序列，比如通过电穿孔编码双特异性抗体的mRNA。在还另一个实施方式中，刺激装备的CART细胞改进装备的CAR T细胞的细胞毒性和当处于肿瘤微环境时对免疫抑制的抗性。在又另一个实施方式中，方法进一步包括以高至2500拉德照射CAR T细胞以抑制CAR T细胞的增殖而不抑制细胞因子分泌或诱导细胞毒性。

在又另一个实施方式中，装备CAR T细胞包括以两种或更多种双特异性抗体装备CAR T细胞，其中CAR T细胞展示两种或更多种双特异性抗体。在还另一个实施方式中，两种或更多种双特异性抗体特异性地结合CAR T细胞。在另一个实施方式中，双特异性抗体包括选自如下的抗体的组合：抗CD3、抗IgD Fc和抗IgA Fc。在某些实施方式中，双特异性抗体被化学地异源缀合至特异于肿瘤相关抗原(TAA)的多克隆抗体，其中T细胞特异性地结合TAA多克隆抗体。

T细胞的来源

代谢增强的T细胞可以由任何来源的T细胞生成。在一个实施方式中，T细胞的来源从对象获得。对象的非限制性实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。优选地，对象是人。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾脏组织、脐带和肿瘤。在某些实施方式中，可以使用本领域中可利用的任意数目的T细胞系。在某些实施方式中，可以使用技术人员已知的任意数目的技术比如Ficoll分离从由对象收集的单位血液获得T细胞。在一个实施方式中，通过单采血液成分术或白细胞提取法获得来自个体的循环血液的细胞。单采血液成分术产物通常包含淋巴细胞，其包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它成核的白细胞、红细胞和血小板。可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆部分并且将细胞放置在适当的缓冲液或介质中，用于后续处理步骤，该缓冲液或介质比如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或洗涤液，其缺少钙并且可能缺少镁或可能缺少很多——如果不是全部的话——二价阳离子。在洗涤后，细胞可以被重悬在各种生物相容性缓冲液中，比如，例如，无Ca、无Mg PBS。可选地，可以去除单采血液成分术样品的非期望组分，并且将细胞直接重悬在培养基中。

在另一个实施方式中，通过溶解红细胞和耗尽单核细胞从外周血分离T细胞，例如，通过经由PERCOLL^TM梯度的离心。可选地，可以从脐带分离T细胞。无论如何，可以通过正或负选择技术进一步分离T细胞的特定亚群。

如此分离的脐带血单核细胞可以被耗尽表达某些抗原——包括但不限于CD34、CD8、CD14、CD19和CD56——的细胞。可以使用分离的抗体、包括抗体的生物学样品比如腹水、结合至物理支持体(support)的抗体和细胞结合的抗体完成这些细胞的耗尽。

可以使用针对对负选择的细胞独特的表面标志物的抗体的组合完成通过负选择富集T细胞群。优选的方法是细胞分选和/或选择，其经由负磁性免疫粘附或使用针对在负选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物的流式细胞术。例如，为了通过负选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。

对于通过正或负选择分离期望的细胞群，可以改变细胞和表面(例如，颗粒比如珠)的浓度。在某些实施方式中，可能期望的是，显著地降低珠和细胞被混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方式中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在进一步的实施方式中，使用大于1亿个细胞/ml。在进一步的实施方式中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50×10⁶个细胞/ml的细胞浓度。在又另一个实施方式中，使用75、80、85、90、95或100×10⁶个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方式中，可以使用125或150×10⁶个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以产生增加的细胞产率、细胞活化和细胞扩展。

在洗涤步骤后，还可以冷冻T细胞，其不需要单核细胞-去除步骤。虽然不希望被理论束缚，但是通过去除细胞群中的粒细胞和一定程度的单核细胞，冷冻和后续的解冻步骤提供了更均一的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤后，细胞可以被悬浮在冷冻液中。虽然许多冷冻液和参数是本领域已知的并且将在此背景下是有用的，但是在非限制性实例中，一种方法涉及使用包含20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或其它合适的细胞冷冻培养基。细胞然后以1°/分钟的速率被冷冻至-80℃，并且储存在液氮储罐的蒸汽相中。可以使用受控冷冻的其它方法以及在-20℃下或在液氮中不受控的即刻冷冻。

在一个实施方式中，细胞群包括本发明的T细胞。细胞群的实例包括但不限于外周血单核细胞、脐带血细胞、纯化的T细胞群和T细胞系。在另一个实施方式中，外周血单核细胞包括T细胞群。在又另一个实施方式中，纯化的T细胞包括T细胞群。

T细胞的扩展

可以离体扩展通过本文描述的任何方法生成的T细胞。在一个实施方式中，培养T细胞或包括T细胞的细胞群进行扩展。通常地，在存在或不存在IL-2的情况下，T细胞通过与表面接触被扩展，该表面具有附加至其的刺激CD3/TCR复合体相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。

本文描述了用于扩展T细胞的方法，例如，T细胞可以被扩展大约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更大，和其间的任何和所有全部或部分整数。在一个实施方式中，T细胞以大约20倍至大约50倍的范围扩展。

在将细胞传代至另一个培养设备前，T细胞可以在培养设备中的细胞培养基中培育一段时间或直到细胞达到进行最佳传代的汇合或高细胞密度。培养设备可以具有一般用于体外培养细胞的任何培养设备。优选地，在将细胞传代至另一个培养设备前，汇合水平是70％或更大。更优选地，汇合水平是90％或更大。一段时间可以是适于细胞体外培养的任何时间。可以在T细胞培养的任何时间替换T细胞培养基。优选地，大约每2至3天替换T细胞培养基。然后从培养设备采集T细胞，于是T细胞可以被立即使用或冷藏储存以备后用。在一个实施方式中，本发明包括冷藏扩展的T细胞。在将在本文其它地方描述的分子中的一种或多种引入T细胞之前解冻冷藏的T细胞。

如本文描述的培养步骤(与试剂接触，如本文描述的)可以非常短，例如小于24小时比如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时。如本文进一步描述的培养步骤(与试剂接触，如本文描述的)可以较长，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。

在一个实施方式中，T细胞可以被培养数小时(大约3小时)至大约14天或其间的任何小时的整数值。适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15，(Lonza))，其可以包含增殖和生存力必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF-β、和TNF-α、或技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂比如N-乙酰-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、和X-Vivo 20、Optimizer(具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或限定的激素组)、和/或足够T细胞的生长和扩展的量的细胞因子(一种或多种)。抗生素例如青霉素和链霉素仅包括在实验培养物中，而不在被注入对象的细胞培养物中。靶标细胞被维持在支持生长必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO₂)。

T细胞培养基可以包括可以共刺激T细胞的试剂。例如，可以刺激CD3的试剂是CD3的抗体，并且可以刺激CD28的试剂是CD28的抗体。这是因为，如由本文公开的数据展现的，通过本文公开的方法分离的细胞可以被扩展大约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更大。在一个实施方式中，通过培养电穿孔的群体以大约20倍至大约50倍或更大的范围扩展T细胞。

疗法

本文描述的代谢增强的T细胞在用于治疗大量疾病状态的各种治疗模态中是有用的，无论T细胞借助表达嵌合细胞内信号传导分子或CAR中的任一种在代谢上是否被增强。因而，不考虑T细胞是否表达嵌合细胞内信号传导分子或CAR，T细胞在本文被称为代谢增强的T细胞。根据在本文其它地方描述的方法可以生成包括代谢增强的T细胞的组合物。此代谢增强的T细胞可以被包括在组合物中用于如现在描述的疗法。

在一方面，组合物包括代谢增强的T细胞，其包括本文描述的嵌合细胞内信号传导分子或CAR。在另一方面，组合物包括代谢增强的细胞，其进一步包括本文描述的双特异性抗体。组合物可以包括药物组合物并且进一步包括药学上可接受的运载体。可以施用治疗有效量的包括修饰的细胞的药物组合物。

在一方面，本发明包括治疗对象中与增强的免疫力相关联的疾病或病症的方法，其包括给对象施用治疗有效量的包括本文描述的代谢增强的T细胞的药物组合物。在另一方面，本发明包括治疗对象中病症的方法，其包括给对象施用治疗有效量的包括本文描述的代谢增强的T细胞的药物组合物。在另一方面，本发明包括用于刺激针对对象中的靶标细胞或组织的T细胞介导的免疫应答的方法，其包括给对象施用治疗有效量的包括本文描述的代谢增强的T细胞的药物组合物。在又另一方面，本发明包括本文描述的代谢增强的T细胞在制造用于治疗需要其的对象中的免疫应答的药物中的用途。在这些实施方式中，T细胞包括嵌合细胞内信号传导分子，其中嵌合细胞内信号传导分子包括共刺激分子的细胞内结构域并且基本上缺少细胞外配体-结合结构域。在另一个实施方式中，T细胞进一步包括双特异性抗体。在又另一个实施方式中，T细胞进一步包括CAR。

在一方面，本发明包括治疗对象中与肿瘤或癌症相关联的疾病或病症的方法，其包括给对象施用治疗有效量的包括本文描述的代谢增强的T细胞的药物组合物。在另一方面，本发明包括治疗对象中实体瘤的方法，其包括给对象施用治疗有效量的包括本文描述的代谢增强的T细胞的药物组合物。在另一方面，本发明包括用于刺激针对对象中的靶标肿瘤细胞或肿瘤组织的T细胞介导的免疫应答的方法，其包括给对象施用治疗有效量的包括本文描述的代谢增强的T细胞的药物组合物。在又另一方面，本发明包括本文描述的代谢增强的T细胞在制造用于治疗需要其的对象中的肿瘤或癌症的药物中的用途。在这些实施方式中，T细胞包括CAR和双特异性抗体，其中CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激分子的细胞内结构域，并且双特异性抗体结合至肿瘤细胞上的靶标和T细胞。另一个实施方式包括用于刺激针对对象中的靶标肿瘤细胞或肿瘤组织的T细胞介导的免疫应答的方法，其包括给对象施用治疗有效量的包括本发明的T细胞的药物组合物。

如本文描述的代谢增强的T细胞可以被施用至动物，优选地哺乳动物，甚至更优选地人，以阻抑免疫反应，比如自身免疫性疾病比如糖尿病、牛皮癣、类风湿性关节炎、多发性硬化、GVHD、增强性同种异体移植耐受诱导(enhancing allograft toleranceinduction)、移植排斥等共有的那些。此外，本发明的代谢增强的T细胞可以被用于任何病症的治疗，其中减弱的或另外抑制的免疫应答，尤其是细胞介导的免疫应答，期望地治疗或减轻该疾病。在一方面，本发明包括治疗对象中的病症，比如自身免疫性疾病，其包括给对象施用治疗有效量的包括本文描述的细胞群的药物组合物。

自身免疫性疾病的实例包括但不限于获得性免疫缺陷综合征(AIDS，其是具有自身免疫组分的病毒性疾病)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、贝切特氏病、心肌病、乳糜泻-疱疹样皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、疤痕性类天疱疮、冷凝集素疾病、CREST综合征、克罗恩病、德戈斯氏病、青少年型皮肌炎、盘状狼疮、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维变性、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、少年慢性关节炎(斯蒂尔氏病)、青少年型类风湿性关节炎、美尼尔氏病、混合结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、恶性贫血、结节性多动炎症、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺氏现象、莱特尔综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病(进行性全身性硬化症(PSS)，还称为全身性硬化症(SS))、斯耶格伦氏综合征、僵体综合征、系统性红斑狼疮、安高氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、眼葡萄膜炎、白斑病和韦格纳氏肉芽肿病。

本文描述的代谢增强的T细胞还可以被用于治疗炎性障碍。炎性障碍的实例包括但不限于慢性和急性炎性障碍。炎性障碍的实例包括阿尔茨海默病、哮喘、特异性变态反应、变态反应、动脉粥样硬化、支气管哮喘、湿疹、肾小球性肾炎、移植物抗宿主疾病、溶血性贫血、骨关节炎、败血症、中风、组织和器官移植、血管炎、糖尿病性视网膜病和呼吸机所致肺损伤(ventilator induced lung injury)。

本发明的代谢增强的T细胞可以被用于治疗癌症。癌症包括没有被血管化或还没有显著被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可以包括非实体瘤(比如血液学肿瘤，例如，白血病和淋巴瘤)或可以包括实体瘤。待使用本发明的细胞治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤、和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如，肉瘤、癌、和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

血液学癌症是血液或骨髓的癌症。血液学(或血源性)癌症的实例包括白血病，其包括急性白血病(比如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(比如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病、和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的组织的异常肿块。实体瘤可以是良性的或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(比如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤比如肉瘤和癌的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯氏肿瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤、和CNS肿瘤(比如神经胶质瘤(比如脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤(也已知为多形性成胶质细胞瘤)、星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移)。

可以以多种剂量和途径施用本发明的代谢增强的T细胞，并且有时在适当的临床前和临床实验和试验中确定。细胞组合物可以在这些范围内的剂量下被施用多次。本发明的代谢增强的T细胞的施用可以与如本领域技术人员确定的对治疗期望的疾病或病症有用的其它方法组合。

本发明的代谢增强的T细胞可以关于经历疗法的其中施用的对象是自体的、同种异体的或异种的。

本发明的代谢增强的T细胞的施用可以以本领域技术人员已知的任何常规方式实施。本发明的代谢增强的T细胞可以通过雾化吸入、注射、吞咽、输注、植入或移植被施用至对象。本文描述的组合物可以经动脉、皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射、或腹膜内施用至患者。在其它情况下，本发明的代谢增强的T细胞被直接注入对象中的炎症部位、对象中的局部疾病部位、淋巴结、器官、肿瘤等。

药物组合物

本发明的药物组合物可以包括如本文描述的代谢增强的T细胞，其与一种或多种药学上或生理学上可接受运载体、稀释剂或赋形剂组合。这样的组合物可以包括缓冲液比如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物比如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸比如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂比如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选地配制用于静脉内施用。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用数量和频率将通过如下因素确定，比如患者的状况以及患者疾病的类型和严重度，但是可以通过临床试验确定适当的剂量。

当指示“免疫有效量”、“抗免疫应答有效量”、“免疫应答-抑制有效量”、或“治疗量”时，可以由医师考虑个体年龄、重量、免疫应答、和患者(对象)的状况的差异确定待施用的本发明的组合物的精确量。通常可以规定可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重，优选地10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量——包括那些范围内的所有整数值——施用包括本文描述的T细胞的药物组合物。也可以以这些剂量多次施用T细胞组合物。可以通过使用免疫疗法中公知的输注技术(参见，例如，Rosenberg et al.,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)施用细胞。具体患者的最佳剂量和治疗方案可以通过监测患者的疾病迹象和相应地调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

在某些实施方式中，可以期望给对象施用代谢增强的T细胞，并且随后重新抽取(redraw)血液(或进行单采血液成分术)，根据本发明在代谢上增强来自其的T细胞，并且使用这些代谢增强的T细胞再输注患者。此过程可以每几周实施多次。在某些实施方式中，可以从大约10ml至大约400ml的血液抽取物获得代谢增强的T细胞。在某些实施方式中，从大约20ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml或100ml的血液抽取物获得代谢增强的T细胞。不被理论束缚，使用此多次血液抽取/多次再输注方案，可以选择出某些T细胞群。

在本发明的某些实施方式中，使用本文描述的方法在代谢上增强T细胞，并且使用本文描述的方法或本领域已知的其它方法刺激、活化或扩展T细胞，其中T细胞被扩展至治疗水平，其连同任意数目的相关治疗模态(例如，之前、同时或之后)被施用至患者，该治疗模态包括但不限于使用药剂的治疗比如用于MS患者或用于PML患者的抗病毒疗法，西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也称为ARA-C)或那他珠单抗(natalizumab)治疗。在进一步的实施方式中，本发明的代谢增强的T细胞可以与如下组合使用：化疗，辐射，免疫抑制剂比如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯、和FK506，抗体，或其它免疫消除剂(immunoablative agent)比如CAM PATH、抗CD3抗体或其它抗体疗法，细胞毒素，氟达拉滨，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，麦考酚酸，类固醇类，FR901228，细胞因子，和照射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙依赖磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)。(Liu et al.,Cell 66:807-815,1991；Henderson et al.,Immun.73:316-321,1991；Bierer et al.,Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)。在进一步的实施方式中，本发明的代谢增强的T细胞组合物连同骨髓移植，使用化学治疗剂比如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺、或抗体比如OKT3或CAMPATH的T细胞消除疗法(例如，之前、同时或之后)被施用至患者。在另一个实施方式中，本发明的细胞组合物在B细胞消除疗法——比如与CD20反应的药剂例如美罗华(Rituxan)——之后被施用。例如，在一个实施方式中，对象可以经历高剂量化学疗法的标准治疗，接着进行外周血干细胞移植。在某些实施方式中，在移植之后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的输注。在另外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术之前或之后被施用。

施用给患者的上面的治疗的剂量将随着正在治疗的病症的精确性质和治疗的接受者而变化。用于人施用的剂量比例可以根据本领域接受的实践进行。例如，CAMPATH的剂量对于成年患者将通常在1至大约100mg的范围中，经常每天施用，持续1和30天之间的时期。虽然在一些情况下可以使用高至40mg/天的较大的剂量(在美国专利号6,120,766中描述)，但是优选的日剂量是1至10mg/天。

应当理解将在本发明中有用的方法和组合物不限于在实施例中陈述的具体制剂。下列实施例被提出以便为本领域普通技术人员提供如何制造和使用细胞，扩展和培养方法，和本发明的治疗方法的完整的公开内容和描述，并且不意图限制本发明人视为其发明的范围。

除非另外指示，本发明的实践采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其充分在技术人员的见识内。这样的技术在如下文献中充分地说明，比如，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,fourth edition(Sambrook et al.,(2012)Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory)；“Oligonucleotide Synthesis”(Gait,M.J.(1984).Oligonucleotide synthesis.IRLpress)；“Culture of Animal Cells”(Freshney,R.(2010).Culture of animalcells.Cell proliferation,15(2.3),1)；“Methods in Enzymology”“Weir’sHandbook ofExperimental Immunology”(Wiley-Blackwell；5edition(January 15,1996)；“GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells”(Miller and Carlos,(1987)Cold SpringHarbor Laboratory,New York)；“Short Protocols in Molecular Biology”(Ausubel,etal.,Current Protocols；5edition,November 5,2002)；“Polymerase Chain Reaction:Principles,Applications and Troubleshooting”,(Babar,M.,VDM Verlag Dr.Müller,August 17,2011)；“Current Protocols in Immunology”(Coligan,John Wiley&Sons,Inc.,November 1,2002)。这些技术适用于产生本发明的多核苷酸和多肽，并且因此，可以考虑用于完成和实践本发明。将在下列部分中讨论具体实施方式的特别有用的技术。

实验实施例

通过参考下列实验实施例进一步详细地描述本发明。除非另外规定，这些实施例仅出于说明目的提供，并且不意图是限制性的。因而，本发明决不应当解释为限制于下列实施例，而是应当解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有的变型。

在没有进一步描述的情况下，认为使用在先的描述和下列说明性实施例，本领域普通技术人员可以制造和利用本发明的化合物，并且实践要求保护的方法。因此，下列工作实施例具体地指出本发明的优选的实施方式，并且不解释为以任何方式限制本公开内容的其余部分。

现在描述在这些实验中采用的材料和方法。

产生双特异性抗体。通过如描述的OKT3和美罗华(人源化的抗CD20IgG1，Genentech Inc.,South San Francisco,CA)、OKT3和爱必妥(Erbitux)(人源化的抗表皮生长因子受体(EGFR)IgG1，ImClone LLC.,Branchburg,NJ)或OKT3和赫赛汀(Herceptin)(人源化的抗HER2IgG1，Genentech Inc.,South San Francisco,CA)的化学异源缀合产生双特异性抗体(BiAb)(Gall JM,et al.,Experimental Hematology 2005,33:452-459；ReuschU,et al.,Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research 2001,10:247-260)。

装备T细胞。使用先前优化的浓度(50ng/10⁶ATC)，以抗OKT3x抗CD20BiAb(CD20Bi)或抗OKT3x抗EGFR BiAb(EGFRBi)装备活化的T细胞(Sen M,et al.,Journal ofHematotherapy and Stem Cell Research 2001,10:247-260)。

细胞毒性/⁵¹Cr释放试验。为了靶向粘附细胞，以4×10⁴个细胞/孔在96孔平底微量滴定板中平板接种细胞并且使得粘附过夜。在标记培养基(完全RPMI-1640中的50％FBS)中在37℃下以20μCi/mL的⁵¹Cr标记细胞5小时，并且使用完全RPMI-1640洗涤以去除未并入的同位素。对于非粘附细胞靶向，在15mL圆锥管中在37℃下以100μCi/10⁶个细胞使用⁵¹Cr标记Daudi细胞2小时，使用完全RPMI-1640洗涤，并且以1×10⁴个细胞/孔平板接种在96孔圆底微量滴定板中。然后添加效应物(未装备的CART19或ATC和装备的CART19或ATC)以取得10:1的效应物：靶标(E:T)比。共同培养物被培育4小时(Daudi)或18小时(粘附细胞系)，并且收集上清液进行液体闪烁记数以量化释放的⁵¹Cr的量。如下计算百分比细胞毒性：(实验的cpm–自发的cpm)/(最大的cpm–自发的cpm)×100。由四至六个重复/样品计算平均值和标准误差。

现在描述实验的结果。

当暴露于低氧条件时，使用CAR修饰的T细胞能够具有细胞内信号传导和令人惊讶的存活效果。图1是显示CART细胞在低氧条件中的存活的图组。取决于在T细胞中表达的CAR结构的类型差异地影响存活。存活差异取决于共刺激胞内结构域。如图2中显示的，在海马试验中测试不同的共刺激胞内结构域对表达CAR的T细胞中的代谢活性的作用。

图3中显示了表达CAR的CD28z或4-1BBz共刺激胞内结构域的T细胞的代谢活性。4-1BBz CAR T细胞具有配体独立性信号传导并且被重编程为中心记忆T(Tcm)细胞，而CD28zCAR T细胞被重编程为效应记忆(Tem)细胞。4-1BBz CAR T细胞具有较低水平的表面分子，比如PD1、TIM3和LAG3，这通常与耗尽相关联。它们还在替代抗原活化后具有较高的代谢活性，并且在严格的低氧条件下存活更久(图3)。

使用CAR显示在代谢上增强修饰的T细胞并且可能降低修饰的T细胞的同种异体反应性。这样的发现支持使用“通用的T细胞”或甚至第三方T细胞。CAR可以经由多种方法被引入T细胞，比如使用慢病毒载体(图4)或mRNA电穿孔(图5)。CAR的潜在靶标包括任何肿瘤相关抗原，比如EGFR、HER2/NEU、PSMA、BCMA、GD2、间皮素等。在本文描述的试验中使用的CAR的细胞内部分可以包括一个或多个信号传导结构域，其被选择以针对任何给定的肿瘤微环境增强T细胞代谢，例如4-1BB、CD27、Ox40、ICOS或CD28。通过就在输注入患者之前暴露于抗体或“装备”，展示双特异性scFv或将双特异性抗体共价偶联至CART细胞上对增强T细胞的细胞溶解活性也可以是有用的。

作为使用慢病毒载体的替代方案，可以通过电穿孔引入编码CAR的mRNA来在代谢上增强短寿命的T细胞(图5)。简言之，在存在或不存在IL-2的情况下，培养和使用抗CD3和抗CD28抗体共刺激T细胞。然后使用体外转录的mRNA电穿孔T细胞以引入CAR。然后以双特异性抗体装备CART细胞。可选地，编码双特异性scFv或双特异性抗体的体外转录的mRNA可以就在输注之前被电穿孔入CART细胞。装备双特异性抗体的CART细胞然后可以被静脉内或瘤内注入患者。

图6中显示了装备的(具有双特异性抗体)或未装备的(不具有双特异性抗体)CART细胞和非CART细胞的比细胞毒性。效应细胞包括未装备的CART19细胞和以抗HER2、抗EGFR或抗CD20双特异性抗体装备的CART19细胞(上图)，以及未装备的非CART细胞和以抗HER2、抗EGFR或抗CD20双特异性抗体装备的非CART细胞(下图)。CART19细胞和非CART细胞二者均展现了针对靶标细胞的比细胞毒性。

在第1、4、10、18、和25天重复暴露于SKBR3的过程内测量的未装备的和装备的CART19细胞的比细胞毒性(图7的左图)展现了针对靶标细胞的高水平的细胞毒性，这甚至在杀伤试验(不存在IL-2)的多个轮次之后。图7的右图组显示了在重复杀伤试验期间由CART19细胞展现的增强的增殖。

图8A-8E显示了装备的或未装备的CART19细胞和非CAR T细胞针对多种表达HER2或EGFR的靶标细胞的比细胞毒性。以抗HER2或抗EGFR双特异性抗体装备效应细胞。以抗HER2双特异性抗体装备的CART19细胞对杀伤甚至低表达HER2(MCF-7)或非表达HER2的乳腺癌细胞系(三阴性[HER2/ER/PR阴性细胞系]MB231和BT-20)是有效的，即～20-50％。

图9显示了装备(HER2双特异性抗体)的CART19细胞增加活化性和抑制性共受体的表达，例如，CD4和CD8T细胞上的4-1BB、ICOS、OX40和PD1。

来自其它共刺激分子的细胞内信号传导结构域也可以对T细胞中的代谢活性具有积极作用。嵌合细胞内信号传导分子(图10)(SEQ ID NO:1)的细胞内结构域可以选自共刺激分子，其针对任何给定的肿瘤微环境增强T细胞代谢，例如4‐1BB、CD27、Ox40、ICOS或CD28。

预期嵌合细胞内信号传导分子包括用于表面检测的可检测的标记(图10)，否则它不能在T细胞的表面上被检测到。可选地，替代标志物可以代替可检测的标记使用，比如通过T2A或IRES系统共同表达的荧光蛋白或细胞表面分子(图11)。可检测的标记也可以与替代标志物一起使用(图12)。

嵌合细胞内信号传导分子还可以通过慢病毒载体(图13)或mRNA电穿孔(图14)被引入T细胞。类似于CART细胞，通过就在输注入患者之前蛋白质负载或装备，嵌合细胞内信号传导分子修饰的T细胞可以展示双特异性scFv或与双特异性抗体偶联。

嵌合细胞内信号传导分子还可以通过mRNA电穿孔被引入T细胞(图14)。体外转录的mRNA在输注入患者之前被电穿孔入T细胞以使用双特异性scFv或双特异性抗体装备T细胞。

假设以双特异性抗体(BiAb)装备的T细胞展示增强的针对靶标细胞的细胞毒性。图15图解了以双特异性抗体——其通过抗CD3(鼠单克隆抗体-CD3，OKT3)的化学异源缀合产生——装备T细胞的机制和该双特异性抗体对选择的任何抗原(肿瘤、病毒、细菌或寄生虫)的特异性。以双特异性抗体装备T细胞应当再活化装备的T细胞以展示针对靶标细胞的非MHC限制性细胞毒性。装备双特异性抗体的T细胞然后将在与靶标细胞衔接之后产生细胞因子和趋化因子。

当结合至肿瘤靶标时，照射装备双特异性抗体的T细胞阻断同种异体应答(图16的左图)但是不抑制装备的T细胞的细胞毒性(图16的右图)。“r”表示效应器细胞，“s”表示刺激器细胞并且*表示照射的细胞。

图17中显示了未装备的或装备抗CD20双特异性抗体(CD20Bi)、抗EGFR双特异性抗体(EGFRBi)、抗GD2双特异性抗体(GD2Bi)和抗HER2双特异性抗体(HER2Bi)的代谢增强的T细胞在针对表达HER2和EGFR的乳腺癌和胰腺/结肠直肠癌细胞系的⁵¹Cr释放试验中的比细胞毒性。在10:1的效应物/靶标比下，使用装备的或未装备的代谢增强的T细胞以一式三份进行试验18小时以测量细胞毒性。

在不存在靶标或以E:T＝10:1存在靶标细胞(SKBR3)的情况下，过夜接种未装备的或装备的T细胞或非代谢增强的ATC。通过Bio-Plex试验测定培养上清液是否存在细胞因子(图18的上图)和趋化因子(图18的下图)。值被报道为pg/ml。

为了确定是否表达嵌合细胞内信号传导分子代谢上增强T细胞，正常供体ND317T细胞被转导160μl或400μl病毒以表达标签标记的嵌合细胞内信号传导分子，其包括CD8跨膜结构域以及4-1BB和CD3ζ细胞内结构域。此转导的结果轻微地慢于扩展速率(细胞大小和倍增的较缓慢的降低)(图19A)。针对CD4+细胞富集表达标签标记的嵌合细胞内信号传导分子的代谢增强的T细胞(图19B)。表达标签标记的嵌合细胞内信号传导分子的T细胞从第6至8天在总群体的百分数中减小(图19C)。

图19C中显示了表达标签标记的嵌合细胞内信号传导分子——具有4-1BB的CD8跨膜结构域和CD3ζ细胞内结构域或膜锚固的豆蔻酰化4-1BB和CD3ζ细胞内结构域——的T细胞的扩展概况。

图20中显示了以高(50％)和低(15％)病毒量转导的正常供体ND444T细胞。随着时间标签标记的T细胞的检测失去。然而，针对CD4+细胞富集表达(标签+)的代谢增强的T细胞。

在转导标签标记的嵌合细胞内信号传导分子(BBz)或CAR19BBz的细胞之间比较正常供体ND422T细胞的扩展(图21A)。在转导标签-BBz的细胞中可见轻微较慢的群体倍增速率和细胞大小降低。CD4背景表达的百分数对于此供体是高的，如在第5天由未转导的可见的。第8天观察到CD4群体的轻微％(图21B)。然而，此供体显示从第5天至第8天没有观察到标签标记的T细胞的百分数减小(图21C)。

其它实施方式

本文对变量的任何定义中要素列表的叙述包括该变量作为任何单个要素或列出的要素的组合(或子组合)的定义。本文对实施方式的叙述包括该实施方式作为任何单个实施方式或与任何其它实施方式或其部分组合。

本文引用的每个和每种专利、专利申请和出版物的公开内容由此通过引用以其全部并入本文。虽然已经参照具体的实施方式公开了本发明，但是明显的是，本领域技术人员可以设计本发明的其它实施方式和变型而不背离本发明的真实精神和范围。所附权利要求意图解释为包括所有这样的实施方式和等价变型。

序列表

<110> 宾夕法尼亚大学董事会和韦恩州立大学

C·H·祝恩

M·米洛

Y·赵

L·鲁姆

A·萨库

<120> 表达嵌合细胞内信号传导分子的细胞的方法和组合物

<130> 046483-7086WO1(01204)

<150> 62/211,311

<151> 2015-08-28

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工生成的

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

20 25 30

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

35 40 45

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

50 55 60

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

65 70 75 80

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Ser Ala Lys Arg

85 90 95

Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro

100 105 110

Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu

115 120 125

Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala

130 135 140

Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

145 150 155 160

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

165 170 175

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

180 185 190

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

195 200 205

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

210 215 220

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

225 230 235 240

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

245

Claims (21)

1.在代谢上增强肿瘤特异性T细胞的方法，其包括：

将嵌合抗原受体(CAR)引入T细胞，其中所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激分子的细胞内结构域；

以双特异性抗体装备所述CAR T细胞，其中所述双特异性抗体结合至肿瘤细胞上的靶标和所述CAR T细胞；和

刺激所述装备的CAR T细胞上的至少一种共刺激分子，其中所述刺激活化所述共刺激分子的所述细胞内结构域，从而在代谢上增强所述肿瘤特异性T细胞。

2.权利要求1所述的方法，其中将所述CAR引入所述T细胞包括引入编码所述CAR的核酸序列。

3.权利要求2所述的方法，其中引入所述核酸序列包括电穿孔编码所述CAR的mRNA。

4.权利要求1所述的方法，其中装备所述CAR T细胞包括使所述CAR T细胞与所述双特异性抗体接触。

5.权利要求1所述的方法，其中装备所述CAR T细胞包括引入编码所述双特异性抗体的核酸序列。

6.权利要求5所述的方法，其中装备所述CAR T细胞包括以两种或更多种双特异性抗体装备所述CAR T细胞，其中所述CAR T细胞展示所述两种或更多种双特异性抗体。

7.权利要求6所述的方法，其中所述两种或更多种双特异性抗体特异性地结合所述CART细胞。

8.权利要求6所述的方法，其中所述双特异性抗体包括选自如下的抗体的组合：抗CD3、抗IgD Fc和抗IgA Fc。

9.权利要求1所述的方法，其中所述双特异性抗体被化学地异源缀合至特异于肿瘤相关抗原(TAA)的多克隆抗体，其中所述T细胞特异性地结合所述TAA多克隆抗体。

10.权利要求5所述的方法，其中引入所述核酸序列包括电穿孔编码所述双特异性抗体的mRNA。

11.权利要求1所述的方法，其中刺激所述装备的CAR T细胞改进所述装备的CAR T细胞的细胞毒性和当处于肿瘤微环境时对免疫抑制的抗性。

12.权利要求1所述的方法，进一步包括以高至2500拉德照射所述CAR T细胞，其中所述照射足以抑制所述CAR T细胞的增殖但是不足以抑制细胞因子分泌或细胞毒性。

13.组合物，其包括根据权利要求1所述的方法生成的代谢增强的肿瘤特异性T细胞。

14.代谢增强的肿瘤特异性T细胞，其包括嵌合抗原受体(CAR)和双特异性抗体，其中所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激分子的细胞内结构域，并且所述双特异性抗体结合至肿瘤细胞上的靶标和所述T细胞，并且其中所述T细胞在实体瘤部位处具有改进的细胞毒性和对免疫抑制的抗性。

15.权利要求14所述的T细胞，其中所述T细胞包括编码所述CAR的核酸序列。

16.权利要求14所述的T细胞，其中所述T细胞包括编码所述双特异性抗体的核酸序列。

17.药物组合物，其包括权利要求14所述的T细胞和药学上可接受的运载体。

18.权利要求14所述的T细胞在制造用于治疗需要其的对象中的肿瘤或癌症的药物中的用途。

19.治疗对象中与肿瘤或癌症相关联的疾病或病症的方法，其包括给所述对象施用治疗有效量的包括权利要求14所述的T细胞的药物组合物。

20.治疗对象中实体瘤的方法，其包括给所述对象施用治疗有效量的包括权利要求14所述的T细胞的药物组合物。

21.用于刺激针对对象中的靶标肿瘤细胞或肿瘤组织的T细胞介导的免疫应答的方法，其包括给对象施用治疗有效量的包括权利要求14所述的T细胞的药物组合物。