CN111320701A

CN111320701A - 表达肿瘤相关抗原的细胞及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN111320701A
Application number: CN201811580484.6A
Authority: CN
Inventors: 刘韬; 李加国; 张亚军; 金华君; 钱其军
Original assignee: Shanghai Chenghuang Nano Antibody Technology Co ltd; Shanghai Cell Therapy Group Co Ltd
Current assignee: Shanghai Chenghuang Nano Antibody Technology Co ltd; Shanghai Cell Therapy Group Co Ltd
Priority date: 2018-12-17
Filing date: 2018-12-17
Publication date: 2020-06-23

Abstract

本发明提供表达肿瘤相关抗原的细胞及其构建方法与应用。所述细胞能够表达如下融合蛋白：由肿瘤相关抗原或免疫检查点蛋白或其活性表位、胞外铰链区和跨膜区顺次连接而成；其中，所述胞外铰链区和跨膜区来自于CD8。本发明成功构建了表达肿瘤相关抗原的细胞，可应用于肿瘤免疫治疗领域(特别是CAR‑T技术)，一方面，在以表达肿瘤相关抗原的细胞免疫动物制备抗体方面具有较大优势，另一方面，膜表达抗原细胞可用于制备单克隆抗体的检测筛选。其可作为从细胞水平上验证靶向肿瘤相关抗原的抗体的亲和力的细胞模型。

Description

表达肿瘤相关抗原的细胞及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫治疗领域，具体地说，涉及表达肿瘤相关抗原的细胞及其构建方法与应用。

背景技术

免疫治疗(Immunotherapy)是继手术、放疗、化疗之后的第四种肿瘤治疗方法。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞技术是新近迅速发展的一种肿瘤细胞治疗技术，CAR-T技术是应用基因改造技术，将一段识别肿瘤抗原的单链抗体(singlechain fragment variable,scFv)和胞内活化基序重组基因转染至T淋巴细胞上以达到更好的识别及杀伤肿瘤的效果。CAR是一个人工合成的嵌合抗原受体，在结构上包括肿瘤相关抗原结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFv段)、胞外铰链区、跨膜区、胞内信号区。其中胞外区为识别肿瘤相关抗原的单克隆抗体可变区序列(single chain variablefragment，ScFv)；跨膜区连接胞外区与胞内区，常用的跨膜区主要来自于如CD8、CD28或4-1BB等分子的跨膜区；胞内信号区则主要来自于CD28、4-1BB、或CD27等T细胞传导信号分子的胞内段嵌合体。人们通过分子克隆方法将上述元件在体外进行重组，形成重组质粒，通过病毒载体、电穿孔等手段将重组质粒转导入T细胞并使之表达，这种经过基因修饰与改造的T细胞即称为CAR-T细胞。CAR-T细胞通过ScFV段识别并结合肿瘤抗原，一旦结合抗原，CAR的胞内段会传输活化以及共刺激信号给T细胞，激活的T细胞便有效靶向杀伤肿瘤细胞。

间皮素(mesothelin,MSLN)是近年来新发现的一种肿瘤分化抗原。其前体是糖磷脂酰基醇(GPI)锚定的、糖基化的细胞表面蛋白，可被furin蛋白酶水解为31kD的N-末端分泌型蛋白和40kD的C-末端蛋白，后者主要以膜结合的GPI锚定的形式存在，有限分布于正常间皮细胞及表面上皮细胞，因此命名为间皮素。间皮素在间皮瘤即肿瘤细胞、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、肺癌和子宫内膜癌中优势表达(过表达)。与此相反，其表达在正常细胞例如间皮细胞中受限。间皮素诱导肿瘤发生的机制可能包括以下三个方面：第一，间皮素可以通过与粘蛋白MUC16(即CA125)相互作用而促进肿瘤细胞的腹膜种植和转移；第二，间皮素能通过NF-κB信号通路促进肿瘤细胞的存活和增殖；最后，间皮素的表达会增强肿瘤细胞对某些特定的药物的耐受能力。由此可见，间皮素是一个用于肿瘤治疗的理想靶标。

虽然已知的许多间皮素单克隆抗体都是可用的，但是没有一个可以展现出针对于肿瘤细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)。因此，目前靶向间皮素的治疗由于缺乏具有强效的CDC的抗间皮素的单克隆抗体而被阻碍。CDC是治疗性抗体的重要的细胞杀伤机制。目前认为抗体结合位点靠近细胞膜时才可能有效介导补体依赖性细胞毒性(CDC)发生(Pawluczkowycz等，J Immunol 183:749-758，2009)。

Mucin 1是膜结合型粘蛋白家族成员，简称MUC1。在正常情况下，MUC1呈低水平表达在乳腺，胰腺，胃肠道，呼吸道及泌尿生殖道的上皮细胞的近管腔面，不能被机体免疫系统识别，其表达特点为极性表达，顶端分布，糖基化丰富。在大多数腺癌、血液系恶性肿瘤中MUC1呈异常过表达，可通过调控多个信号通路调节细胞恶性转化，是促进肿瘤发生与发展的重要癌基因。由于MUC1在肿瘤细胞中的表达糖基化不全，并失去极性，遍布于整个细胞表面，容易被抗体识别，因此，MUC1蛋白也可作为CAR-T细胞抗肿瘤治疗的一个理想靶点。

对于靶向肿瘤抗原的CAR-T细胞而言，其胞外抗原结合区与肿瘤细胞的亲和力对最终的杀伤肿瘤的效果至关重要。从这个意义上讲，仅仅测定分子之间的亲和力或分子与肿瘤细胞之间的亲和力还不能真实地反应CAR-T细胞的胞外抗原结合区单链抗体的具体效果，还需要在细胞与细胞之间相互作用的水平对CAR-T细胞的杀伤效果进行阐明和验证。因此，目前还需要能够从细胞与细胞之间相互作用的水平来验证靶向肿瘤抗原的抗体的亲和力的模型细胞系。

发明内容

本发明的目的是提供表达肿瘤相关抗原的细胞及其构建方法与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种融合蛋白，由肿瘤相关抗原或免疫检查点蛋白或其活性表位、胞外铰链区和跨膜区顺次连接而成；其中，所述胞外铰链区和跨膜区来自于CD8。

所述肿瘤相关抗原包括但不限于EGFR、Her2、间皮素、MUC1、GPC3。所述免疫检查点蛋白包括但不限于CTLA4、PD 1、PD-L1的胞外区全长或部分区段。

第二方面，本发明提供含有所述融合蛋白的编码基因的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。

第三方面，本发明提供表达肿瘤相关抗原的细胞的构建方法，包括以下步骤：

A、膜表达肿瘤相关抗原的载体的构建；

B、将A构建的载体导入细胞，筛选获得表达肿瘤相关抗原的细胞；

其中，A构建的载体携带有所述融合蛋白的编码基因，步骤B所述细胞包括但不限于HEK 293(293T)、CHO。

进一步地，所述方法包括以下步骤：

1)膜表达载体pmexS的构建；

2)膜表达肿瘤相关抗原的载体的构建；

3)利用脂质体转染法(PolyFect)将2)构建的载体导入HEK 293细胞，筛选获得表达肿瘤相关抗原的细胞。

其中，步骤1)具体如下：

①对pNB328-EGFP载体进行改造(载体pNB328-EGFP参见CN105154473)

首先，合成如SEQ ID NO:1所示的序列CFL，插入pNB328-EGFP的Asc I和Cla I酶切位点之间，得到pNB338CFL(-)；pNB328-EGFP经EcoR I和Sal I酶切，回收730bp的EGFP片段，插入pNB338CFL(-)的EcoR I和Sal I酶切位点之间得到pNB338CFL-EGFP(-)；之后，去掉HyPBase表达盒；

设计以下引物(SEQ ID NO:21-22)：

Pr1：5’-CTGATTAATTAACCCTAGAAAGATAGTC-3’

Pr2：5’-CAGTGGCGCGCCTTAACCCTAGAAAGATAATC-3’

以pNB338CFL-EGFP(-)载体为模板进行PCR扩增，扩增产物经Pac I和Asc I双酶切后插入pNB338CFL-EGFP(-)载体的Pac I和Asc I酶切位点之间，获得pS338CFL-EGFP(图2)；

②载体pS338CFL-CD8sigHTM的构建

设计并合成由CD8信号肽核酸序列、CD8铰链区核酸序列和CD8跨膜区核酸序列依次串联组成的DNA序列，且在CD8信号肽序列与CD8铰链区序列之间设计一个Afe I酶切位点(作为肿瘤相关抗原基因序列的克隆位点)，将该DNA序列插入载体pS338CFL-EGFP的EcoR I和BamH I酶切位点之间，得到载体pS338CFL-CD8sigHTM(图3)；

③载体pmexS的构建

载体pSin-EF2-hLIN28-pur(购自Addgene)以BamH I和Xho I双酶切回收1251bp大小的片段(IRES-PuroR)，将此片段插入pS338CFL-CD8sigHTM的BamH I和Sal I酶切位点之间，得到载体pmexS(图4)。

步骤2)具体如下：将肿瘤相关抗原的编码基因与经Afe I线性化的载体pmexS连接，得到膜表达肿瘤相关抗原的载体。

前述方法中，所述CD8信号肽核酸序列、CD8铰链区核酸序列和CD8跨膜区核酸序列分别如SEQ ID NO:2-4所示。

优选地，步骤②由CD8信号肽核酸序列、CD8铰链区核酸序列和CD8跨膜区核酸序列依次串联组成(且含有一个Afe I酶切位点)的DNA序列如SEQ ID NO:23所示。

前述方法中，所述肿瘤相关抗原的编码基因选自如下i～iv中任一项：

i.间皮素的编码基因，序列如SEQ ID NO:5所示；

ii.间皮素III区的编码基因，序列如SEQ ID NO:6所示；

iii.EGFR胞外区的编码基因，序列如SEQ ID NO:7所示；

iv.EGFR胞外区III-IV的编码基因，序列如SEQ ID NO:8所示；

v.GPC3的编码基因，序列如SEQ ID NO:10；

vi.HER2胞外区的编码基因，序列如SEQ ID NO:13所示；

vii.HER2胞外区IV区的编码基因，序列如SEQ ID NO:14所示；

viii.MUC1胞外区的编码基因，序列如SEQ ID NO:15所示。

第四方面，本发明提供按照所述方法构建得到的表达肿瘤相关抗原的细胞。

第五方面，本发明提供所述表达肿瘤相关抗原的细胞的以下任一应用：

(1)在抗体制备及筛选中的应用；

(2)从细胞水平上评价CAR-T细胞的杀伤效果；

(3)作为从细胞水平上验证靶向肿瘤相关抗原的抗体的亲和力的细胞模型。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明成功构建了表达肿瘤相关抗原的细胞，可应用于肿瘤免疫治疗领域(特别是CAR-T技术)，一方面，在以表达肿瘤相关抗原的细胞免疫动物制备抗体方面具有较大优势，另一方面，膜表达抗原细胞可用于制备单克隆抗体的检测筛选。

(二)将肿瘤相关抗原通过跨膜序列表达到细胞膜上；在跨膜区和抗原肽之间通过一段铰链区(Hinge)连接，从而增加抗原肽与细胞膜的距离，有利于抗原肽近细胞端表位的暴露和抗体识别。

(三)表达载体在信号肽与铰链区之间设计了Afe I平末端核酸内切酶，抗原肽克隆完成后不增加额外的氨基酸残基。

(四)将肿瘤相关抗原表达盒构建在PB转座子载体中，可以有效整合到293T、CHO等常用细胞系中，构建稳定表达膜抗原的细胞株。

(五)载体通过核糖体进入位点(IRES)连接抗性筛选基因，便于稳定表达抗原细胞株的筛选。

附图说明

图1为本发明载体pNB338CFL-EGFP(-)的结构示意图。

图2为本发明载体pS338CFL-EGFP的结构示意图。

图3为本发明载体pS338CFL-CD8sigHTM的结构示意图。

图4为本发明载体pmexS的结构示意图。

图5为本发明实施例1中质粒pS-PB的结构示意图。

图6为本发明实施例2中载体pmexS-MSLN的结构示意图。

图7为本发明实施例2中载体pmexS-MSLN-III的结构示意图。

图8为本发明实施例3中载体pmexS-EGFR的结构示意图。

图9为本发明实施例3中载体pmexS-EGFRiii-iv的结构示意图。

图10为本发明实施例4中载体pmexS-CTLA4的结构示意图。

图11为本发明实施例5中载体pmexS-GPC3的结构示意图。

图12为本发明实施例5中载体pmexS-GPC3(truncated)的结构示意图。

图13为本发明实施例6中载体pmexS-HER2的结构示意图。

图14为本发明实施例6中载体pmexS-HER2iv的结构示意图。

图15为本发明实施例7中载体pmexS-MUC1的结构示意图。

图16为本发明实施例8中载体pmexS-PD 1的结构示意图。

图17为本发明实施例9中载体pmexS-PDL1的结构示意图。

图18A为本发明实施例11中293T-MSLN抗原抗体结合control组检测结果。

图18B为本发明实施例11中293T-MSLN抗原抗体结合检测结果。

图19A为本发明实施例11中293T-MSLN-DomainⅢ抗原抗体结合control组检测结果。

图19B为本发明实施例11中293T-MSLN-DomainⅢ抗原抗体结合检测结果。

图20为本发明实施例12中Lineweaver-Burk法计算Anti-MSLN CAR1-Fc和Anti-MSLN CAR3-Fc的KD值结果。

图21为本发明实施例13中Western blot检测293T-GPC3细胞肿瘤抗原表达的结果。

图22为本发明实施例13中流式细胞术检测293T-GPC3细胞表达肿瘤抗原的结果。

图23为本发明实施例13中载体pNB328-GPC3CAR的结构示意图。

图24为本发明实施例13中GPC3 CAR T细胞对293T-GPC3的杀伤检测结果。

图25为本发明实施例14中流式细胞术检测293T-MUC1表达MUC1情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

膜抗原，一些重要抗体识别膜抗原近膜区域表位，如西妥昔(cetuximab)识别结合EGFR的近膜端结构域III，赫赛汀(Trastuzumab)识别结合Her2的近膜端结构域IV，以及识别间皮素(mesothelin)近膜端III区的抗体具有更好的抗肿瘤效果(CN201380060415.1)。

载体pmexS的全序列如SEQ ID NO:12所示。

实施例1膜表达载体pmexS的构建

1、pNB338CFL-EGFP(-)载体的改造

为了构建质粒pmexS，首先对载体pNB328-EGFP(参见CN105154473)进行改造，合成序列CFL(SEQ ID NO:1)，插入pNB328-EGFP的Asc I和Cla I酶切位点之间，得到pNB338CFL(-)；pNB328-EGFP经EcoR I和Sal I酶切，回收730bp的EGFP片段，插入pNB338CFL(-)的EcoRI和Sal I酶切位点之间得到pNB338CFL-EGFP(-)。(图1)

去掉HyPBase表达盒。为此设计并由苏州金唯智公司合成以下引物：

Pr1：5’-CTGATTAATTAACCCTAGAAAGATAGTC-3’

Pr2：5’-CAGTGGCGCGCCTTAACCCTAGAAAGATAATC-3’

Pr1下划线处为Pac I酶切位点，Pr2下划线处为Asc I酶切位点，以pNB338CFL-EGFP(-)为模板进行PCR扩增含EGFP表达盒的PB转座子序列2223bp，经Pac I和Asc I双酶切后定向插入pNB338CFL-EGFP(-)的Pac I和Asc I酶切位点之间，得到载体pS338CFL-EGFP(图2)。

2、载体pS338CFL-CD8sigHTM的构建

为了构建膜表达载体，设计由CD8signal peptide序列(SEQ ID NO:2)、CD8Hinge序列(SEQ ID NO:3)和CD8transmembrane序列(SEQ ID NO:4)串联组成的DNA序列，其中CD8signal peptide序列与CD8Hinge序列之间设计一个Afe I酶切位点，作为膜表达肽序列的克隆位点，由苏州金唯智公司合成序列(SEQ ID NO:23)，将该序列定向插入载体质粒pS338CFL-EGFP的EcoR I和BamH I酶切位点之间，得到载体pS338CFL-CD8sigHTM(图3)。

3、载体pmexS的构建

为上述载体pS338CFL-CD8sigHTM添加筛选标记基因，用BamH I和Xho I双酶切载体pSin-EF2-hLIN28-pur(购自Addgene)回收1251bp大小的片段IRES-PuroR，将此片段定向插入pS338CFL-CD8sigHTM的BamH I和Sal I酶切位点之间，得到载体pmexS(图4)。

4、PB转座酶表达质粒pS-PB的构建

为了构建表达高效PB转座酶质粒，设计Linker并由金唯智合成：

Linker-f：5’-CGCGCCCGGATCCTGCACTAGTGCTG-3’

Linker-r：5’-TCGACAGCACTAGTGCAGGATCCGGG-3’

上述寡核苷酸退火后得到双链Linker，质粒pNB328(参见CN105154473)经Asc I和Sal I双酶切后与上述双链Linker连接得到表达高效PB转座酶HyPBase的质粒pS-PB(图5)。

实施例2膜表达全长成熟间皮素和III区间皮素的载体的构建

1、为了构建膜表达全长成熟间皮素载体，设计并由苏州金唯智公司合成5’端磷酸化修饰的引物：

p-Pm-f：5’-GAAGTGGAGAAGACAGCCT-3’

p-Pm-r：5’-GGCCAGGGTGGAGGCT-3’

利用上述引物，以人MSLN(NM_005823)cDNA克隆(购自丰晖生物)为模板PCR扩增得到成熟间皮素全长序列981bp(SEQ ID NO:5)，将此片段与经Afe I线性化的载体pmexS连接，转化Top10后得到的克隆经BamH I酶切鉴定，正确克隆再送苏州金唯智测序，测序正确克隆命名为pmexS-MSLN(图6)。

2、为了构建膜表达全长成熟间皮素III区载体，设计并由苏州金唯智公司合成5’端磷酸化修饰的引物：

p-PmIII-f：5’-ATGAACGGGTCCGAATACT-3’

p-PmIII-r：5’-CGAGAGGGCCTCTTGCA-3’

利用上述引物，以人MSLN(NM_005823)cDNA克隆(购自丰晖生物)为模板PCR扩增得到全长成熟间皮素III区序列336bp(SEQ ID NO:6)，将此片段与经Afe I线性化的载体pmexS连接，转化Top10后得到的克隆经BamH I酶切鉴定，正确克隆再送苏州金唯智测序，测序正确克隆命名为pmexS-MSLN-III(图7)。

实施例3膜表达全长EGFR胞外区和EGFR胞外区III-IV的载体的构建

1、为了构建膜表达成熟全长EGFR胞外区载体，设计并由苏州金唯智公司合成5’端磷酸化修饰的引物：

p-Pe-f：5’-CTGGAGGAAAAGAAAGTTTGCCA-3’

p-Pe-r：5’-CGGGATCTTAGGCCCATTC-3’

利用上述引物，以人EGFR(NM_005228)cDNA克隆(购自丰晖生物)为模板PCR扩增得到全长EGFR胞外区序列1860bp(SEQ ID NO:7)，将此片段与经Afe I线性化的载体pmexS连接，转化Top10后得到的克隆经EcoR I酶切鉴定，正确克隆再送苏州金唯智测序，测序正确克隆命名为pmexS-EGFR(图8)。

2、为了构建膜表达EGFR胞外III-IV区载体，设计并由苏州金唯智公司合成5’端磷酸化修饰的引物：

p-Peiii-f：5’-CGCAAGTGTAAGAAGTGCGAAG-3’

p-Pe-r：5’-CGGGATCTTAGGCCCATTC-3’

利用上述引物，以人EGFR(NM_005228)cDNA克隆(购自丰晖生物)为模板PCR扩增得到EGFR胞外III-IV区序列963bp(SEQ ID NO:8)，将此片段与经Afe I线性化的载体pmexS连接，转化Top10后得到的克隆经BamH I酶切鉴定，正确克隆再送苏州金唯智测序，测序正确克隆命名为pmexS-EGFRiii-iv(图9)。

实施例4膜表达CTLA4的载体的构建

为了构建膜表达全长CTLA4胞外区载体，设计并由苏州金唯智公司合成5’端磷酸化修饰的引物：

p-Pc-f：5’-GTCAGAATCTGGGCACGGTTCTGGATCA-3’

p-Pc-r：5’-AAAGCAATGCACGTGGCCCAGC-3’

利用上述引物，以人CTLA4(NM_005214)cDNA克隆(购自丰晖生物)为模板PCR扩增得到全长CTLA4胞外区序列378bp(SEQ ID NO:9)，将此片段与经Afe I线性化的载体pmexS连接，转化Top10后得到的克隆经EcoR I+Sac I酶切鉴定，正确克隆再送苏州金唯智测序，测序正确克隆命名为pmexS-CTLA4(图10)。

实施例5膜表达全长GPC3成熟肽和截短的GPC3的载体构建

1、为了构建膜表达全长GPC3载体，设计并由苏州金唯智公司合成5’端磷酸化修饰的引物：

p-Pg-f：5’-CAGCCACCACCACCGCCGCCGGA-3’

p-Pg-r：5’-GTGCACCAGGAAGAAGAAG-3’

利用上述引物，以人GPC3(NM_001164617)cDNA克隆(购自丰晖生物)为模板PCR扩增得到全长GPC3成熟肽编码序列1740bp(SEQ ID NO:10)，将此片段与经Afe I线性化的载体pmexS连接，转化Top10后得到的克隆经Sac I酶切鉴定，正确克隆再送苏州金唯智测序，测序正确克隆命名为pmexS-GPC3(图11)。

2、为了构建膜表达截短的GPC3载体，设计并由苏州金唯智公司合成5’端磷酸化修饰的引物：

p-Pgt-f：5’-TCTGCTTATTATCCTGAAGATCTC-3’

利用p-Pgt-f和p-Pg-r引物，以人GPC3(NM_001164617)cDNA克隆(购自丰晖生物)为模板PCR扩增得到截短的GPC3序列666bp(SEQ ID NO:11)，将此片段与经Afe I线性化的载体pmexS连接，转化Top10后得到的克隆经Sac I酶切鉴定，正确克隆再送苏州金唯智测序，测序正确克隆命名为pmexS-GPC3(truncated)(图12)。

实施例6膜表达HER2全长胞外区和HER2胞外IV区的载体构建

1、为了构建膜表达HER2全长胞外区载体，设计并由苏州金唯智公司合成5’端磷酸化修饰的引物：

p-Ph-f：5’-ACCCAAGTGTGCACCG-3’

p-Ph-r：5’-CGTCAGAGGGCTGGCTC-3’

利用上述引物，以Her2/ERBB2 cDNA ORF Clone(购自Sino Biological)为模板PCR扩增得到全长HER2胞外区序列1890bp(SEQ ID NO:13)，将此片段与经Afe I线性化的载体pmexS连接，转化Top10后得到的克隆经EcoR I酶切鉴定，正确克隆再送苏州金唯智测序，测序正确克隆命名为pmexS-HER2(图13)。

2、为了构建膜表达HER2胞外IV区载体，设计并由苏州金唯智公司合成5’端磷酸化修饰的引物：

p-Phiv-f：5’-TGCCACCAGCTGTGCGC-3’

p-Phiv-r：5’-GGGGCAGCCCTTGTCAT-3’

利用上述引物，以Her2/ERBB2 cDNA ORF Clone(购自Sino Biological)为模板PCR扩增得到HER2胞外IV区序列399bp(SEQ ID NO:14)，将此片段与经Afe I线性化的载体pmexS连接，转化Top10后得到的克隆经Pvu II酶切鉴定，正确克隆再送苏州金唯智测序，测序正确克隆命名为pmexS-HER2iv(图14)。

实施例7膜表达MUC1全长胞外区的载体构建

为了构建膜表达MUC1全长胞外区载体，设计并由苏州金唯智公司合成5’端磷酸化修饰的引物：

p-Pm-f：5’-TCTGGTCATGCAAGCTC-3’

p-Pm-r：5’-AGACTGGGCAGAGAAAG-3’

利用上述引物，以人MUC1(NM_001204286)cDNA克隆(购自Sino Biological)为模板PCR扩增得到全长MUC1胞外区编码序列(SEQ ID NO:15)，将此片段与经Afe I线性化的载体pmexS连接，转化Top10后得到的克隆经Pvu II酶切鉴定，正确克隆再送苏州金唯智测序，测序正确克隆命名为pmexS-MUC1(图15)。

实施例8膜表达PD 1胞外区的载体构建

为了构建膜表达PD1全长胞外区载体，设计并由苏州金唯智公司合成PD 1序列(SEQ ID NO:16)胞外区插入到载体pmexS的Afe I酶切位点，克隆命名为pmexS-PD 1(图16)。

实施例9膜表达PD-L1胞外区的载体构建

为了构建膜表达PD-L1全长胞外区载体，设计并由苏州金唯智公司合成5’端磷酸化修饰的引物：

p-Pl-f：5’-TTTACTGTCACCGTTCC-3’

p-Pl-r：5’-CTTTCTCAGTCTGAAGATG-3’

利用上述引物，以PD-L1cDNA ORF Clone(购自丰晖生物)为模板PCR扩增得到全长PD-L1胞外区序列(SEQ ID NO:17)，将此片段与经Afe I线性化的载体pmexS连接，转化Top10后得到的克隆经Apa I酶切鉴定，正确克隆再送苏州金唯智测序，测序正确克隆命名为pmexS-PDL1(图17)。

实施例10细胞的转染和稳定表达肿瘤相关抗原间皮素细胞系的建立

1、转染前一天，胰酶消化293T细胞并计数，以6×10⁵细胞铺到6孔板中，使其在转染时汇合度达到60-80％。细胞铺板在3ml含10％血清的DMEM培养基中。

2、将实施例2得到的载体DNA(pmexS-MSLN、pmexS-MSLN-III)分别与质粒pS-PB按摩尔比1:1混合，对于每孔细胞，使用100μl无血清DMEM培养基稀释2μg质粒混合物，蜗旋震荡数秒混匀。

3、在上述稀释的DNA中加入20μl PolyFect试剂(购自Qiagen)，蜗旋震荡数秒混匀，室温孵育5-10分钟。

4、吸去6孔板中的培养基，更换新鲜培养基，每孔1.5ml。

5、向上述第3步混合物中加入0.6ml培养基，混匀后加到细胞培养板的各孔中，摇动培养板，轻轻混匀。

6、在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养48小时，用胰蛋白酶消化后进行传代，培养基中添加2μg/ml的嘌呤霉素进行筛选。

7、经过连续两周的嘌呤霉素筛选后建立的稳定细胞系分别命名为293T-MSLN和293T-MSLN-Domain III。

实施例11测定稳定转染的293T细胞全长间皮素或间皮素III区的膜表达情况

1、间皮素抗体scFv-Fc融合蛋白的构建

为了获得结合间皮素I区的CAR1-Fc融合蛋白，构建表达载体pcDNA3.4-MSLN-CAR1-Fc

由苏州金唯智公司合成MSLN-CAR1-Fc序列(SEQ ID NO:18)，其中，识别间皮素I区抗体的CAR1序列参见美国专利US10040846，Fc段序列来自IgG4。将MSLN-CAR1-Fc序列克隆至载体pcDNA3.4(Invitrogen)中得到pcDNA3.4-MSLN-CAR1-Fc。

将载体pcDNA3.4-MSLN-CAR1-Fc转入真核表达细胞ExpiCHO(ThermoFisherSCIENTIFIC)中，得到scFv-Fc融合蛋白anti-MSLN-CAR1-Fc。

为了获得结合间皮素III区的CAR3-Fc融合蛋白，构建表达载体pcDNA3.4-MSLN-CAR3-Fc，由苏州金唯智公司合成MSLN-CAR3-Fc序列(SEQ ID NO:19)，其中，识别间皮素III区抗体的CAR3序列参见美国专利US9803022，Fc段序列来自IgG4，将MSLN-CAR3-Fc序列克隆至载体pcDNA3.4(invitrogen)中得到pcDNA3.4-MSLN-CAR3-Fc。

将载体pcDNA3.4-MSLN-CAR3-Fc转入真核表达细胞ExpiCHO(ThermoFisherSCIENTIFIC)中，得到scFv-Fc融合蛋白anti-MSLN-CAR3-Fc。

2、流式细胞术检测293T-MSLN和293T-MSLN-domain III膜抗原

2.1向100mL DPBS液中加入1mL FBS(胎牛血清)混合后，置于冰上预冷，作为溶液I。

2.2实验开始前半小时，打开37℃水浴锅，将DPBS液放入水浴锅平衡；开启生物安全柜。

2.3取出水浴中的DPBS液，喷洒酒精后，放入安全柜中；从细胞培养箱中取出含有293T-MSLN和293T-MSLN-DomainⅢ的细胞各一瓶，放入安全柜。取酒精棉球擦拭瓶盖周围后开盖，吸掉旧培养基，各留取大约10mL放置于15mL离心管中，剩余旧培养基弃掉。

2.4加入10mL DPBS液，用移液管吸取DPBS液轻轻吹过细胞表面，洗掉培养基残留。

2.5吸掉DPBS液，加入2mL胰酶消化液，盖上瓶盖，来回晃动，使胰酶覆盖细胞表面。将细胞放入培养箱消化2分钟。

2.6从培养箱中取出消化的细胞，立即加入10mL旧培养基终止反应。用移液器轻轻吹打使细胞从壁上脱落，并使细胞均匀悬浮。

2.7取20μL细胞悬液进行计数，将10mL细胞悬液转移到15ml离心管中，200g离心5min。

2.8根据计数结果加入溶液I调整活细胞数至1×10⁷个/mL，50μL/管分装到1.5mLEP管中，每个细胞各自分装4管，每种细胞各标记一管为control，一管为control-PE(不孵育一抗，仅孵育PE标记荧光二抗，用于排除非特异性结合)，一管为CAR1-Fc(一抗孵育Fc标记抗人间皮素一区抗体，用于验证存在人间皮素蛋白一区)，一管为CAR3-Fc(一抗孵育Fc标记抗人间皮素三区抗体，用于验证存在人间皮素三区)。

2.9用溶液I将anti-MSLN-CAR1-Fc稀释到5μg/ml后取200μL加入到两种细胞的CAR1-Fc管中，用溶液I将anti-MSLN-CAR3-Fc稀释到5μg/ml后取200μL加入到两种细胞的CAR3-Fc管中，两种细胞的control管和control-PE管直接加入200μL溶液I。所有样品在旋涡振荡器上轻轻重悬起细胞后，于4℃孵育40min。

2.10 200g离心，弃上清液；各加入500μL预冷的溶液I，用手指轻弹重悬细胞，200g离心3min，弃上清液。

2.11除control管外，其余管均加入150μL用溶液I按照1：100稀释的PEStreptavidin，重悬细胞，4℃孵育30min。

2.12离心，去上清；各加入500μL预冷的溶液I，用手指轻弹重悬细胞，200g离心，弃上清液。

2.13重复步骤2.12一次。

2.14向每管中加入300μL溶液I重悬细胞后，将细胞液转移到流式管中进行流式细胞分析。

2.15先上control管中样品，并根据该管，调节仪器参数，设门选择目标细胞群。

2.16依次选择“运行”——“记录”，每完成一个样品的检测，更换流式管，点击“下一个流式管”，命名新流式管，开始运行检测。

2.17在Kaluza Analysis分析软件中分析检测结果，293T-MSLN抗原抗体结合检测结果见图18A(control组)和图18B，293T-MSLN-DomainⅢ抗原抗体结合检测结果见图19A(control组)和图19B。

从以上结果可以看出，结合MSLN胞外I区的anti-MSLN-CAR1-Fc可以结合检测到293T-MSLN表达的全长胞外区MSLN，而不能检测到293T-MSLN-Domain III表达的MSLN III区肽(缺乏MSLN胞外I区和II区)，相反，anti-MSLN-CAR3-Fc可以同时检测到293T-MSLN表达的全长胞外区MSLN和293T-MSLN-Domain III表达的MSLN III区肽。

实施例12应用293T-MSLN检测CAR亲和力

1.含1％FBS的1×PBS：向300mL DPBS中加入3mL FBS混合后，放置于冰上冰浴预冷。

2.实验开始前半小时，打开37℃水浴锅，将DPBS放入水浴锅平衡；开启生物安全柜。

3.取出水浴中的DPBS，喷洒酒精后，放入安全柜中；从细胞培养箱中取出含有293T-MSLN的细胞，放入安全柜。取酒精棉球擦拭瓶盖周围后开盖，吸掉旧培养基，留取大约10mL放置于15mL离心管中，剩余旧培养基弃掉。

4.加入10mL DPBS，用移液管吸取DPBS轻轻吹过细胞表面，洗掉培养基残留。

5.吸掉DPBS，加入2mL胰酶消化液，盖上瓶盖，来回晃动，使胰酶覆盖细胞表面。将细胞放入培养箱消化1分钟。

6.从培养箱中取出消化的细胞，立即加入10mL旧培养基终止反应。用移液器轻轻吹打使细胞从壁上脱落，并使细胞均匀悬浮。

7.取20μL细胞悬液进行计数，将10mL细胞悬液转移到15ml离心管中200g,离心5min。

8.根据计数结果加入含1％FBS的1×PBS调整活细胞数至1×10⁷个/mL，50μL/管分装到96孔板中。

9.稀释Anti-MSLN CAR1-Fc和Anti-MSLN CAR3-Fc以及无关抗体对照Keytruda(购自默沙东)。所有样品均根据各自分子量换算为nM，起始浓度为64nM，8倍比稀释，一共6个梯度。稀释液为预冷的含1％FBS的1×PBS。

10.每孔细胞中加入上述稀释好的150μL样品，加入的同时用枪头轻柔吹打细胞，使细胞重悬。然后在4℃孵育40min。

11.220g离心5min，弃上清液；各加入200μL预冷的含1％FBS的1×PBS洗涤液，加入的同时用枪头轻柔吹打细胞，使细胞重悬，220g离心5min，弃上清液。

12.在Anti-MSLN CAR1-Fc和Anti-MSLN CAR3-Fc以及Keytruda的样品中，加入150μL用含1％FBS的1×PBS按照1：100稀释的PE Goat anti-human IgG重悬细胞，4℃孵育30min。

13.离心，去上清；各加入200μL预冷的含1％FBS的1×PBS洗涤液。

14.上述样品用与之前相同的条件洗涤3次后，用300μL预冷的含1％FBS的1×PBS重悬细胞上机检测。

15.在Kaluza Analysis分析软件中分析检测结果。

使用OriginPro 8.6软件作图，利用Lineweaver-Burk法计算KD值。Anti-MSLNCAR1-Fc KD值为0.73nM,Anti-MSLN CAR3-Fc KD值为0.69nM(图20)。

实施例13稳定表达肿瘤相关抗原GPC3的细胞系的建立

细胞转染和筛选：

2、将实施例5得到的载体DNA(pmexS-GPC3、pmexS-GPC3(truncated))分别与质粒pS-PB按1:1摩尔比混合，对于每孔细胞，使用100μl无血清DMEM培养基稀释2μg质粒混合物，蜗旋震荡数秒混匀。

4、吸去6孔板中的培养基，更换新鲜培养基，每孔1.5ml。

7、经过连续两周的嘌呤霉素筛选后建立的稳定细胞系分别命名为293T-GPC3和293T-GPC3(truncated)。

Western blot检测细胞肿瘤抗原表达：

为了检测293T-GPC3的肿瘤抗原表达，通过Western blot法进行测定，参见Hu等，Onco Targets Ther 11:193-200,2018。

结果如图21所示，293T-GPC3高表达GPC3抗原。

流式细胞术检测表达肿瘤抗原比例：

为了检测293T-GPC3的肿瘤抗原表达阳性率，通过流式细胞术进行测定，参见Cartier等，Oncotarget 8(25)：41211-41226,2017。

结果如图22所示，293T-GPC3表达肿瘤抗原GPC3的比例为99.3％。

实施例14检测GPC3 CAR T对293T-GPC3的杀伤作用

1、GPC3 CAR表达载体的构建

为了构建表达靶向GPC3的CAR表达载体，设计以CD8信号肽、GPC3抗体scFv段(参见EP1795592)、CD8hinge区、CD8跨膜区、CD28胞内区和CD3ζ链胞内区顺次连接，N端添加EcoRI酶切位点和Kozak序列，C端添加Sal I酶切位点的DNA序列(SEQ ID NO:20)委托苏州金唯智公司合成，EcoR I和Sal I酶切后克隆到载体pNB328中，得到载体pNB328-GPC3CAR(图23)。

2、GPC3 CAR T细胞的构建

准备1×10⁷新鲜分离获得的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcell，PBMC)，使用Lonza 2b-Nucleofector将6μg质粒pNB328-GPC3CAR电转到PBMC中，置37℃、5％CO₂培养箱中培养；6小时后转移到用5μg/ml anti-CD3抗体和5μg/ml antiCD28抗体(购自Novoprotein)包被的培养板中，培养基为AIM-V(Gibco)，添加2％胎牛血清(Gibco)和250IU/ml IL-2(购自Novoprotein)，培养13天。

3、GPC3 CAR T细胞对293T-GPC3的杀伤检测

胰蛋白酶消化收集293T和293T-GPC3，计数细胞后用培养基调整细胞浓度至2×10⁵cells/ml，在E-Plate 96的孔中加入50μl DMEM培养基。将E-Plate 96放到RTCAStation上。在RTCA程序中设定相应孔中需要加入的细胞，并按Step 1检测基线(backgroud)确定所选择的孔接触正常，所有孔的Cell Index低于0.063。取出E-Plate16，在孔中加入50μl混合均匀的细胞悬液，使每孔中细胞数目为1×10⁴cells。将E-Plate 16置于超净台中室温放置几分钟。将E-Plate 16放到培养箱中的RTCA Station上。在系统自动扫描“Scan Plate”后，开始Step2，培养细胞。24h后加入GPC3 CAR T细胞，按照效应细胞：靶细胞为8:1、4:1、2:1的比例制备效应细胞悬液，即分别每孔8×10⁴cells、4×10⁴、2×10⁴。以未转质粒的T细胞作为对照，效靶比为8:1。终止step2，将E-Plate 96从RTCA Station上取出。将配好的效应细胞悬液加入靶细胞孔中。将E-Plate 16置于超净台中室温放置几分钟。将E-Plate 16放到培养箱中的RTCA Station上。开始Step3，观察增殖曲线，确定杀伤效果。

RTCA程序设置：

结果如图24所示，GPC3 CAR T细胞可以有效杀伤膜表达GPC3抗原的293T-GPC3细胞，而不能有效杀伤GPC3阴性的293T细胞。

实施例15膜表达肿瘤抗原MUC1细胞系293T-MUC1的建立

1、转染前一天，胰酶消化293T细胞并计数，以6×10⁵细胞铺到6孔板中，使其在转染时汇合度达到60-80％。细胞铺板在3ml含10％血清，不含抗生素的DMEM培养基中。

2、将实施例7得到的载体DNA(pmexS-MUC1)分别与质粒pS-PB按1:1摩尔比混合，对于每孔细胞，使用100μl无血清DMEM培养基稀释2μg载体DNA质粒混合物，蜗旋震荡数秒混匀。

3、在上述稀释的DNA中加入20μl PolyFect试剂(购自Qiagen)。蜗旋震荡数秒混匀，室温孵育5-10分钟。

4、吸去6孔板中的培养基，更换新鲜培养基，每孔1.5ml。

6、在37℃，5％CO₂细胞培养箱中保温培养48小时，用胰蛋白酶消化后进行传代，培养基中添加2μg/ml的嘌呤霉素进行筛选。

7、经过连续两周的嘌呤霉素筛选后建立的稳定细胞系命名为293T-MUC1。

8、收集细胞进行流式细胞术检测293T-MUC1表达MUC1情况，参见Jeong等，Exp MolMed,50(1):e424，2018。

结果如图25所示，293T-MUC1高表达MUC1，但显示2个峰，可能与MUC1的不同糖基化程度差异有关。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 上海细胞治疗集团有限公司

上海乘黄纳米抗体科技有限公司

<120> 表达肿瘤相关抗原的细胞及其构建方法与应用

<130> KHP181118373.3

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1480

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggcgcgcctt taaccctaga aagataatca tattgtgacg tacgttaaag ataatcatgc 60

gtaaaattga cgcatgtgtt ttatcggtct gtatatcgag gtttatttat taatttgaat 120

agatattaag ttttattata tttacactta catactaata ataaattcaa caaacaattt 180

atttatgttt atttatttat taaaaaaaaa caaaaactca aaatttcttc tataaagtaa 240

caagttaacc aattgttgtt gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa 300

gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt 360

tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctggtcgac agcgaattcg taggcgccgg 420

tcacagcttg gatctgtaac ggcgcagaac agaaaacgaa acaaagacgt agagttgagc 480

aagcagggtc aggcaaagcg tggagagccg gctgagtcta ggtaggctcc aagggagcgc 540

cggacaaagg cccggtctcg acctgagctt taaacttacc tagacggcgg acgcagttca 600

ggaggcacca caggcgggag gcggcagaac gcgactcaac cggcgtggat ggcggcctca 660

ggtagggcgg cgggcgcgtg aaggagagat gcgagcccct cgaagcttca gctgtgttct 720

ggcggcaaac ccgttgcgaa aaagaacgtt cacggcgact actgcactta tatacggttc 780

tcccccaccc tcgggaaaaa ggcggagcca gtacacgaca tcactttccc agtttacccc 840

gcgccacctt ctctaggcac ccgttcaatt gccgacccct ccccccaact tctcggggac 900

tgtgggcgat gtgcgctctg cccactgacg ggcaccggag cgatcgcaga tccttggttg 960

ctgactaatt gagatgcatg ctttgcatac ttctgcctgc tggggagcct ggggactttc 1020

cacacctggt tgctgactaa ttgagatgca tgctttgcat acttctgcct gctggggagc 1080

ctggggactt tccacacctc tagacacaca aaaaaccaac acacagatgt aatgaaaata 1140

aagatatttt attatcgatg aggtatctat aacaagaaaa tatatatata ataagttatc 1200

acgtaagtag aacatgaaat aacaatataa ttatcgtatg agttaaatct taaaagtcac 1260

gtaaaagata atcatgcgtc attttgactc acgcggtcgt tatagttcaa aatcagtgac 1320

acttaccgca ttgacaagca cgcctcacgg gagctccaag cggcgactga gatgtcctaa 1380

atgcacagcg acggattcgc gctatttaga aagagagagc aatatttcaa gaatgcatgc 1440

gtcaatttta cgcagactat ctttctaggg ttaaatcgat 1480

<210> 2

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgagc 66

<210> 3

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 4

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atctacatct gggcgcccct ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gc 72

<210> 5

<211> 981

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaagtggaga agacagcctg tccttcaggc aagaaggccc gcgagataga cgagagcctc 60

atcttctaca agaagtggga gctggaagcc tgcgtggatg cggccctgct ggccacccag 120

atggaccgcg tgaacgccat ccccttcacc tacgagcagc tggacgtcct aaagcataaa 180

ctggatgagc tctacccaca aggttacccc gagtctgtga tccagcacct gggctacctc 240

ttcctcaaga tgagccctga ggacattcgc aagtggaatg tgacgtccct ggagaccctg 300

aaggctttgc ttgaagtcaa caaagggcac gaaatgagtc ctcaggtggc caccctgatc 360

gaccgctttg tgaagggaag gggccagcta gacaaagaca ccctagacac cctgaccgcc 420

ttctaccctg ggtacctgtg ctccctcagc cccgaggagc tgagctccgt gccccccagc 480

agcatctggg cggtcaggcc ccaggacctg gacacgtgtg acccaaggca gctggacgtc 540

ctctatccca aggcccgcct tgctttccag aacatgaacg ggtccgaata cttcgtgaag 600

atccagtcct tcctgggtgg ggcccccacg gaggatttga aggcgctcag tcagcagaat 660

gtgagcatgg acttggccac gttcatgaag ctgcggacgg atgcggtgct gccgttgact 720

gtggctgagg tgcagaaact tctgggaccc cacgtggagg gcctgaaggc ggaggagcgg 780

caccgcccgg tgcgggactg gatcctacgg cagcggcagg acgacctgga cacgctgggg 840

ctggggctac agggcggcat ccccaacggc tacctggtcc tagacctcag catgcaagag 900

gccctctcgg ggacgccctg cctcctagga cctggacctg ttctcaccgt cctggcactg 960

ctcctagcct ccaccctggc c 981

<210> 6

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgaacgggt ccgaatactt cgtgaagatc cagtccttcc tgggtggggc ccccacggag 60

gatttgaagg cgctcagtca gcagaatgtg agcatggact tggccacgtt catgaagctg 120

cggacggatg cggtgctgcc gttgactgtg gctgaggtgc agaaacttct gggaccccac 180

gtggagggcc tgaaggcgga ggagcggcac cgcccggtgc gggactggat cctacggcag 240

cggcaggacg acctggacac gctggggctg gggctacagg gcggcatccc caacggctac 300

ctggtcctag acctcagcat gcaagaggcc ctctcg 336

<210> 7

<211> 1860

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctggaggaaa agaaagtttg ccaaggcacg agtaacaagc tcacgcagtt gggcactttt 60

gaagatcatt ttctcagcct ccagaggatg ttcaataact gtgaggtggt ccttgggaat 120

ttggaaatta cctatgtgca gaggaattat gatctttcct tcttaaagac catccaggag 180

gtggctggtt atgtcctcat tgccctcaac acagtggagc gaattccttt ggaaaacctg 240

cagatcatca gaggaaatat gtactacgaa aattcctatg ccttagcagt cttatctaac 300

tatgatgcaa ataaaaccgg actgaaggag ctgcccatga gaaatttaca ggaaatcctg 360

catggcgccg tgcggttcag caacaaccct gccctgtgca acgtggagag catccagtgg 420

cgggacatag tcagcagtga ctttctcagc aacatgtcga tggacttcca gaaccacctg 480

ggcagctgcc aaaagtgtga tccaagctgt cccaatggga gctgctgggg tgcaggagag 540

gagaactgcc agaaactgac caaaatcatc tgtgcccagc agtgctccgg gcgctgccgt 600

ggcaagtccc ccagtgactg ctgccacaac cagtgtgctg caggctgcac aggcccccgg 660

gagagcgact gcctggtctg ccgcaaattc cgagacgaag ccacgtgcaa ggacacctgc 720

cccccactca tgctctacaa ccccaccacg taccagatgg atgtgaaccc cgagggcaaa 780

tacagctttg gtgccacctg cgtgaagaag tgtccccgta attatgtggt gacagatcac 840

ggctcgtgcg tccgagcctg tggggccgac agctatgaga tggaggaaga cggcgtccgc 900

aagtgtaaga agtgcgaagg gccttgccgc aaagtgtgta acggaatagg tattggtgaa 960

tttaaagact cactctccat aaatgctacg aatattaaac acttcaaaaa ctgcacctcc 1020

atcagtggcg atctccacat cctgccggtg gcatttaggg gtgactcctt cacacatact 1080

cctcctctgg atccacagga actggatatt ctgaaaaccg taaaggaaat cacagggttt 1140

ttgctgattc aggcttggcc tgaaaacagg acggacctcc atgcctttga gaacctagaa 1200

atcatacgcg gcaggaccaa gcaacatggt cagttttctc ttgcagtcgt cagcctgaac 1260

ataacatcct tgggattacg ctccctcaag gagataagtg atggagatgt gataatttca 1320

ggaaacaaaa atttgtgcta tgcaaataca ataaactgga aaaaactgtt tgggacctcc 1380

ggtcagaaaa ccaaaattat aagcaacaga ggtgaaaaca gctgcaaggc cacaggccag 1440

gtctgccatg ccttgtgctc ccccgagggc tgctggggcc cggagcccag ggactgcgtc 1500

tcttgccgga atgtcagccg aggcagggaa tgcgtggaca agtgcaacct tctggagggt 1560

gagccaaggg agtttgtgga gaactctgag tgcatacagt gccacccaga gtgcctgcct 1620

caggccatga acatcacctg cacaggacgg ggaccagaca actgtatcca gtgtgcccac 1680

tacattgacg gcccccactg cgtcaagacc tgcccggcag gagtcatggg agaaaacaac 1740

accctggtct ggaagtacgc agacgccggc catgtgtgcc acctgtgcca tccaaactgc 1800

acctacggat gcactgggcc aggtcttgaa ggctgtccaa cgaatgggcc taagatcccg 1860

<210> 8

<211> 963

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgcaagtgta agaagtgcga agggccttgc cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt 60

gaatttaaag actcactctc cataaatgct acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc 120

tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg gtggcattta ggggtgactc cttcacacat 180

actcctcctc tggatccaca ggaactggat attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg 240

tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta 300

gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg 360

aacataacat ccttgggatt acgctccctc aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt 420

tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc 480

tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc 540

caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc 600

gtctcttgcc ggaatgtcag ccgaggcagg gaatgcgtgg acaagtgcaa ccttctggag 660

ggtgagccaa gggagtttgt ggagaactct gagtgcatac agtgccaccc agagtgcctg 720

cctcaggcca tgaacatcac ctgcacagga cggggaccag acaactgtat ccagtgtgcc 780

cactacattg acggccccca ctgcgtcaag acctgcccgg caggagtcat gggagaaaac 840

aacaccctgg tctggaagta cgcagacgcc ggccatgtgt gccacctgtg ccatccaaac 900

tgcacctacg gatgcactgg gccaggtctt gaaggctgtc caacgaatgg gcctaagatc 960

ccg 963

<210> 9

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaagcaatgc acgtggccca gcctgctgtg gtactggcca gcagccgagg catcgccagc 60

tttgtgtgtg agtatgcatc tccaggcaaa gccactgagg tccgggtgac agtgcttcgg 120

caggctgaca gccaggtgac tgaagtctgt gcggcaacct acatgatggg gaatgagttg 180

accttcctag atgattccat ctgcacgggc acctccagtg gaaatcaagt gaacctcact 240

atccaaggac tgagggccat ggacacggga ctctacatct gcaaggtgga gctcatgtac 300

ccaccgccat actacctggg cataggcaac ggaacccaga tttatgtaat tgatccagaa 360

ccgtgcccag attctgac 378

<210> 10

<211> 1740

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggccggga ccgtgcgcac cgcgtgcttg gtggtggcga tgctgctcag cttggacttc 60

ccgggacagg cgcagccccc gccgccgccg ccggacgcca cctgtcacca agtccgctcc 120

ttcttccaga gactgcagcc cggactcaag tgggtgccag aaactcccgt gccaggatca 180

gatttgcaag tatgtctccc taagggccca acatgctgct caagaaagat ggaagaaaaa 240

taccaactaa cagcacgatt gaacatggaa cagctgcttc agtctgcaag tatggagctc 300

aagttcttaa ttattcagaa tgctgcggtt ttccaagagg cctttgaaat tgttgttcgc 360

catgccaaga actacaccaa tgccatgttc aagaacaact acccaagcct gactccacaa 420

gcttttgagt ttgtgggtga atttttcaca gatgtgtctc tctacatctt gggttctgac 480

atcaatgtag atgacatggt caatgaattg tttgacagcc tgtttccagt catctatacc 540

cagctaatga acccaggcct gcctgattca gctttggaca tcaatgagtg cctccgagga 600

gcaagacgtg acctgaaagt atttgggaat ttccccaagc ttattatgac ccaggtttcc 660

aagtcactgc aagtcactag gatcttcctt caggctctga atcttggaat tgaagtgatc 720

aacacaactg atcacctgaa gttcagtaag gactgtggcc gaatgctcac cagaatgtgg 780

tactgctctt actgccaggg actgatgatg gttaaaccct gtggcggtta ctgcaatgtg 840

gtcatgcaag gctgtatggc aggtgtggtg gagattgaca agtactggag agaatacatt 900

ctgtcccttg aagaacttgt gaatggcatg tacagaatct atgacatgga gaacgtactg 960

cttggtctct tttcaacaat ccatgattct atccagtatg tccagaagaa tgcaggaaag 1020

ctgaccacca ctattggcaa gttatgtgcc cattctcaac aacgccaata tagatctgct 1080

tattatcctg aagatctctt tattgacaag aaagtattaa aagttgctca tgtagaacat 1140

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ttctatagtg ctttgcctgg ctacatctgc agccatagcc ctgtggcgga aaacgacacc 1260

ctttgctgga atggacaaga actcgtggag agatacagcc aaaaggcagc aaggaatgga 1320

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caaattattg acaaactgaa gcacattaac cagctcctga gaaccatgtc tatgcccaaa 1440

ggtagagttc tggataaaaa cctggatgag gaagggtttg aaagtggaga ctgcggtgat 1500

gatgaagatg agtgcattgg aggctctggt gatggaatga taaaagtgaa gaatcagctc 1560

cgcttccttg cagaactggc ctatgatctg gatgtggatg atgcgcctgg aaacagtcag 1620

caggcaactc cgaaggacaa cgagataagc acctttcaca acctcgggaa cgttcattcc 1680

ccgctgaagc ttctcaccag catggccatc tcggtggtgt gcttcttctt cctggtgcac 1740

<210> 11

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tctgcttatt atcctgaaga tctctttatt gacaagaaag tattaaaagt tgctcatgta 60

gaacatgaag aaaccttatc cagccgaaga agggaactaa ttcagaagtt gaagtctttc 120

atcagcttct atagtgcttt gcctggctac atctgcagcc atagccctgt ggcggaaaac 180

gacacccttt gctggaatgg acaagaactc gtggagagat acagccaaaa ggcagcaagg 240

aatggaatga aaaaccagtt caatctccat gagctgaaaa tgaagggccc tgagccagtg 300

gtcagtcaaa ttattgacaa actgaagcac attaaccagc tcctgagaac catgtctatg 360

cccaaaggta gagttctgga taaaaacctg gatgaggaag ggtttgaaag tggagactgc 420

ggtgatgatg aagatgagtg cattggaggc tctggtgatg gaatgataaa agtgaagaat 480

cagctccgct tccttgcaga actggcctat gatctggatg tggatgatgc gcctggaaac 540

agtcagcagg caactccgaa ggacaacgag ataagcacct ttcacaacct cgggaacgtt 600

cattccccgc tgaagcttct caccagcatg gccatctcgg tggtgtgctt cttcttcctg 660

gtgcac 666

<210> 12

<211> 4626

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggcgcgcctt aaccctagaa agatagtctg cgtaaaattg acgcatgcat tcttgaaata 60

ttgctctctc tttctaaata gcgcgaatcc gtcgctgtgc atttaggaca tctcagtcgc 120

cgcttggagc tcccgtgagg cgtgcttgtc aatgcggtaa gtgtcactga ttttgaacta 180

taacgaccgc gtgagtcaaa atgacgcatg attatctttt acgtgacttt taagatttaa 240

ctcatacgat aattatattg ttatttcatg ttctacttac gtgataactt attatatata 300

tattttcttg ttatagatac ctcatcgata ataaaatatc tttattttca ttacatctgt 360

gtgttggttt tttgtgtgtc tagaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa 420

gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc 480

cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccaag gatctgcgat 540

cgctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 600

ggaggggtcg gcaattgaac gggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 660

gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 720

gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca gctgaagctt 780

cgaggggctc gcatctctcc ttcacgcgcc cgccgcccta cctgaggccg ccatccacgc 840

cggttgagtc gcgttctgcc gcctcccgcc tgtggtgcct cctgaactgc gtccgccgtc 900

taggtaagtt taaagctcag gtcgagaccg ggcctttgtc cggcgctccc ttggagccta 960

cctagactca gccggctctc cacgctttgc ctgaccctgc ttgctcaact ctacgtcttt 1020

gtttcgtttt ctgttctgcg ccgttacaga tccaagctgt gaccggcgcc tacgaattcg 1080

ccaccatggc cttaccagtg accgccttgc tcctgccgct ggccttgctg ctccacgccg 1140

ccaggccgag cgctaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg cccaccatcg 1200

cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg ggcgcagtgc 1260

acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccctg gccgggactt 1320

gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg ctgaggatcc gcatgcatct 1380

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cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg 1620

aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac 1680

ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct gcaaaggcgg 1740

cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa tggctctcct 1800

caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt atgggatctg 1860

atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa aaacgtctag 1920

gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac acgatgataa gcttgccaca 1980

acccacaagg agacgacctt ccatgaccga gtacaagccc acggtgcgcc tcgccacccg 2040

cgacgacgtc ccccgggccg tacgcaccct cgccgccgcg ttcgccgact accccgccac 2100

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gacccgcaag cccggtgcct gataataggc ggccgctcga ccagacatga taagatacat 2640

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caattggtta acttgttact ttatagaaga aattttgagt ttttgttttt ttttaataaa 2820

taaataaaca taaataaatt gtttgttgaa tttattatta gtatgtaagt gtaaatataa 2880

taaaacttaa tatctattca aattaataaa taaacctcga tatacagacc gataaaacac 2940

atgcgtcaat tttacgcatg attatcttta acgtacgtca caatatgatt atctttctag 3000

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atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 3360

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ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 3480

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ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 3600

ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 3660

agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 3720

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agaactcgtc aagaaggcga tagaaggcga tgcgctgcga atcgggagcg gcgataccgt 3840

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ccaacgctat gtcctgatag cggtccgcca cacccagccg gccacagtcg atgaatccag 3960

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gatcctcgcc gtcgggcatg ctcgccttga gcctggcgaa cagttcggct ggcgcgagcc 4080

cctgatgctc ttcgtccaga tcatcctgat cgacaagacc ggcttccatc cgagtacgtg 4140

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gcagccgccg cattgcatca gccatgatgg atactttctc ggcaggagca aggtgagatg 4260

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caacgtcgag tacagctgcg caaggaacgc ccgtcgtggc cagccacgat agccgcgctg 4380

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gttcaatcat aatattattg aagcatttat cagggttcgt ctcgtcccgg tctcctccca 4620

tgcatg 4626

<210> 13

<211> 1890

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acccaagtgt gcaccggcac agacatgaag ctgcggctcc ctgccagtcc cgagacccac 60

ctggacatgc tccgccacct ctaccagggc tgccaggtgg tgcagggaaa cctggaactc 120

acctacctgc ccaccaatgc cagcctgtcc ttcctgcagg atatccagga ggtgcagggc 180

tacgtgctca tcgctcacaa ccaagtgagg caggtcccac tgcagaggct gcggattgtg 240

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ctgaacaata ccacccctgt cacaggggcc tccccaggag gcctgcggga gctgcagctt 360

cgaagcctca cagagatctt gaaaggaggg gtcttgatcc agcggaaccc ccagctctgc 420

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ctgatagaca ccaaccgctc tcgggcctgc cacccctgtt ctccgatgtg taagggctcc 540

cgctgctggg gagagagttc tgaggattgt cagagcctga cgcgcactgt ctgtgccggt 600

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ggctgcacgg gccccaagca ctctgactgc ctggcctgcc tccacttcaa ccacagtggc 720

atctgtgagc tgcactgccc agccctggtc acctacaaca cagacacgtt tgagtccatg 780

cccaatcccg agggccggta tacattcggc gccagctgtg tgactgcctg tccctacaac 840

tacctttcta cggacgtggg atcctgcacc ctcgtctgcc ccctgcacaa ccaagaggtg 900

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tatggtctgg gcatggagca cttgcgagag gtgagggcag ttaccagtgc caatatccag 1020

gagtttgctg gctgcaagaa gatctttggg agcctggcat ttctgccgga gagctttgat 1080

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ctggaagaga tcacaggtta cctatacatc tcagcatggc cggacagcct gcctgacctc 1200

agcgtcttcc agaacctgca agtaatccgg ggacgaattc tgcacaatgg cgcctactcg 1260

ctgaccctgc aagggctggg catcagctgg ctggggctgc gctcactgag ggaactgggc 1320

agtggactgg ccctcatcca ccataacacc cacctctgct tcgtgcacac ggtgccctgg 1380

gaccagctct ttcggaaccc gcaccaagct ctgctccaca ctgccaaccg gccagaggac 1440

gagtgtgtgg gcgagggcct ggcctgccac cagctgtgcg cccgagggca ctgctggggt 1500

ccagggccca cccagtgtgt caactgcagc cagttccttc ggggccagga gtgcgtggag 1560

gaatgccgag tactgcaggg gctccccagg gagtatgtga atgccaggca ctgtttgccg 1620

tgccaccctg agtgtcagcc ccagaatggc tcagtgacct gttttggacc ggaggctgac 1680

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<210> 14

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgccaccagc tgtgcgcccg agggcactgc tggggtccag ggcccaccca gtgtgtcaac 60

tgcagccagt tccttcgggg ccaggagtgc gtggaggaat gccgagtact gcaggggctc 120

cccagggagt atgtgaatgc caggcactgt ttgccgtgcc accctgagtg tcagccccag 180

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<210> 15

<211> 1047

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tctggtcatg caagctctac cccaggtgga gaaaaggaga cttcggctac ccagagaagt 60

tcagtgccca gctctactga gaagaatgct gtgagtatga ccagcagcgt actctccagc 120

cacagccccg gttcaggctc ctccaccact cagggacagg atgtcactct ggccccggcc 180

acggaaccag cttcaggttc agctgccacc tggggacagg atgtcacctc ggtcccagtc 240

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tctgcatcag gctcagcttc tactctggtg cacaacggca cctctgccag ggctaccaca 540

accccagcca gcaagagcac tccattctca attcccagcc accactctga tactcctacc 600

acccttgcca gccatagcac caagactgat gccagtagca ctcaccatag cacggtacct 660

cctctcacct cctccaatca cagcacttct ccccagttgt ctactggggt ctctttcttt 720

ttcctgtctt ttcacatttc aaacctccag tttaattcct ctctggaaga tcccagcacc 780

gactactacc aagagctgca gagagacatt tctgaaatgt ttttgcagat ttataaacaa 840

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tataaaacgg aagcagcctc tcgatataac ctgacgatct cagacgtcag cgtgagtgat 1020

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<210> 16

<211> 441

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 60

ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 120

gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 180

gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 240

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tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 360

gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 420

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<210> 17

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tttactgtca ccgttcccaa ggacctgtat gtggtggagt atggcagcaa tatgacaatt 60

gagtgcaagt tcccagtgga gaagcagctg gacctggctg cactgattgt ctattgggag 120

atggaggata agaacattat tcagtttgtg cacggagagg aggacctgaa ggttcagcac 180

agtagctaca gacagagggc ccggctgttg aaggaccagc tctccctggg aaatgctgca 240

cttcagatca cagatgtgaa gttgcaggat gcaggggtgt accgctgcat gatcagctat 300

ggcggcgccg actacaagag aattactgtg aaggtcaatg ccccatacaa caagatcaac 360

cagagaattt tggttgtgga cccagtcacc tctgagcacg agctgacatg tcaggctgag 420

ggctacccca aggccgaggt catctggaca agcagtgacc accaggtcct gagtggcaag 480

accaccacca ccaattccaa gagagaggag aagctcttca atgtgaccag cacactgaga 540

atcaacacaa caactaatga gattttctac tgcactttta ggagactgga ccctgaggag 600

aaccacacag ctgagttggt catcccagag ctgcctctgg cacaccctcc aaatgagagg 660

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ttcagactga gaaag 735

<210> 18

<211> 1470

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60

caggtacaac tgcagcagtc tgggcctgag ctggagaagc ctggcgcttc agtgaagata 120

tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctacacca tgaactgggt gaagcagagc 180

catggaaaga gccttgagtg gattggactt attactcctt acaatggtgc ttctagctac 240

aaccagaagt tcaggggcaa ggccacatta actgtagaca agtcatccag cacagcctac 300

atggacctcc tcagtctgac atctgaagac tctgcagtct atttctgtgc aagggggggt 360

tacgacggga ggggttttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggt 420

ggaggcggtt caggcggagg tggcagcggc ggtggcgggt cggacatcga gctcactcag 480

tctccagcaa tcatgtctgc atctccaggg gagaaggtca ccatgacctg cagtgccagc 540

tcaagtgtaa gttacatgca ctggtaccag cagaagtcag gcacctcccc caaaagatgg 600

atttatgaca catccaaact ggcttctgga gtcccaggtc gcttcagtgg cagtgggtct 660

ggaaactctt actctctcac aatcagcagc gtggaggctg aagatgatgc aacttattac 720

tgccagcagt ggagtaagca ccctctcacg tacggtgctg ggacaaagtt ggaaatcaaa 780

gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 840

tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 900

gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 960

gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 1020

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1080

tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 1140

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gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 1380

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<210> 19

<211> 1500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

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ctgtatctgc aaatgaacag tctgagagcc gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga 360

tctactgcta atactagaag tacttattat cttaacttgt ggggccaagg caccctggtc 420

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aaagttccca agctcctgat ctatggtgca tccactctgg catctggggt cccctcgcgg 660

ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcagcagcct gcagcctgaa 720

gatgttgcca cttactactg tcagagttat gcttattttg atagtaataa ttggcatgct 780

ttcggcggag ggaccaaggt ggagatcaaa gagtccaaat atggtccccc atgcccacca 840

tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag 900

gacactctca tgatctcccg gacccctgag gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag 960

gaagaccccg aggtccagtt caactggtac gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag 1020

acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 1080

ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc 1140

ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg 1200

tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 1260

gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1320

aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 1380

aggctaaccg tggacaagag caggtggcag gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg 1440

catgaggctc tgcacaacca ctacacacag aagagcctct ccctgtctct gggtaaatga 1500

<210> 20

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggatgttg tgatgaccca gactccactc actttgtcgg ttaccattgg acaaccagcc 120

tccatctctt gcaagtcaag tcagagcctc ttagatagtg atggaaagac atatttgaat 180

tggttgttac agaggccagg ccagtctcca aagcgcctaa tctatctggt gtctaaattg 240

gactctggag cccctgacag gttcactggc agtggatcag ggacagattt cacactgaaa 300

atcagtagag tggaggctga ggatttggga atttattatt gctggcaagg tacacatttt 360

ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaag gtggaggcgg ttcaggcgga 420

ggtggcagcg gcggtggcgg gtcggaggtg caactggtgg agtctggggg aggcttagtg 480

aagcctggag gatccctgaa actctcctgt gcagcctctg gattcacttt cagtcgctat 540

gccatgtctt gggttcgcca gattccagag aagatactgg agtgggtcgc agccattgat 600

agtagtggtg gtgacaccta ctatttagac actgtgaagg accgattcac catctccaga 660

gacaatgcca ataataccct gcacctgcaa atgcgcagtc tgaggtctga ggacacagcc 720

ttgtattact gtgtaagaca ggggggggct tactggggcc aagggactct ggtcactgtc 780

tctgcaacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 840

cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 900

gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgcccc tggccgggac ttgtggggtc 960

cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaaacggg gcagaaagaa gctcctgtat 1020

atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 1080

tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc 1140

gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1200

cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1260

aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1320

gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1380

ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1440

gccctgcccc ctcgctga 1458

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ctgattaatt aaccctagaa agatagtc 28

<210> 22

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cagtggcgcg ccttaaccct agaaagataa tc 32

<210> 23

<211> 279

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgagcgcta ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 120

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 180

agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccctggccgg gacttgtggg 240

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgctga 279

Claims

1.融合蛋白，其特征在于，由肿瘤相关抗原或免疫检查点蛋白或其活性表位、胞外铰链区和跨膜区顺次连接而成；

其中，所述胞外铰链区和跨膜区来自于CD8。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述肿瘤相关抗原包括EGFR、Her2、间皮素、MUC1、GPC3；和/或

所述免疫检查点蛋白包括CTLA4、PD 1、PD-L1的胞外区全长或部分区段。

3.含有权利要求1或2所述融合蛋白的编码基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。

4.表达肿瘤相关抗原的细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、膜表达肿瘤相关抗原的载体的构建；

其中，A构建的载体携带有权利要求1或2所述融合蛋白的编码基因，步骤B所述细胞包括HEK 293、CHO。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)膜表达载体pmexS的构建；

2)膜表达肿瘤相关抗原的载体的构建；

3)利用脂质体转染法将2)构建的载体导入HEK 293细胞，筛选获得表达肿瘤相关抗原的细胞；

其中，步骤1)具体如下：

①对pNB328-EGFP载体进行改造

设计以下引物：

Pr1：5’-CTGATTAATTAACCCTAGAAAGATAGTC-3’

Pr2：5’-CAGTGGCGCGCCTTAACCCTAGAAAGATAATC-3’

以pNB338CFL-EGFP(-)载体为模板进行PCR扩增，扩增产物经Pac I和Asc I双酶切后插入pNB338CFL-EGFP(-)载体的Pac I和Asc I酶切位点之间，获得pS338CFL-EGFP；

②载体pS338CFL-CD8sigHTM的构建

设计并合成由CD8信号肽核酸序列、CD8铰链区核酸序列和CD8跨膜区核酸序列依次串联组成的DNA序列，且在CD8信号肽序列与CD8铰链区序列之间设计一个Afe I酶切位点，将该DNA序列插入载体pS338CFL-EGFP的EcoR I和BamH I酶切位点之间，得到载体pS338CFL-CD8sigHTM；

③载体pmexS的构建

载体pSin-EF2-hLIN28-pur以BamH I和Xho I双酶切回收1251bp大小的片段，将此片段插入pS338CFL-CD8sigHTM的BamH I和Sal I酶切位点之间，得到载体pmexS；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)所述CD8信号肽核酸序列、CD8铰链区核酸序列和CD8跨膜区核酸序列分别如SEQ ID NO:2-4所示。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)所述由CD8信号肽核酸序列、CD8铰链区核酸序列和CD8跨膜区核酸序列依次串联组成的DNA序列，其核酸序列如SEQ ID NO:23所示。

8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)所述肿瘤相关抗原的编码基因选自如下i～viii中任一项：

i.间皮素的编码基因，序列如SEQ ID NO:5所示；

ii.间皮素III区的编码基因，序列如SEQ ID NO:6所示；

iii.EGFR胞外区的编码基因，序列如SEQ ID NO:7所示；

iv.EGFR胞外区III-IV的编码基因，序列如SEQ ID NO:8所示；

v.GPC3的编码基因，序列如SEQ ID NO:10；

vi.HER2胞外区的编码基因，序列如SEQ ID NO:13所示；

vii.HER2胞外区IV区的编码基因，序列如SEQ ID NO:14所示；

viii.MUC1胞外区的编码基因，序列如SEQ ID NO:15所示。

9.根据权利要求4-8任一项所述方法构建得到的表达肿瘤相关抗原的细胞。

10.权利要求9所述细胞的以下任一应用：

(1)在抗体制备及筛选中的应用；

(2)从细胞水平上评价CAR-T细胞的杀伤效果；