CN112210007B - 一种cd19抗原高亲和力的抗体以及包含其cd19单链抗体区的嵌合抗原受体 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种特异性地与人CD19结合的单克隆抗体和杂交瘤细胞。本发明还提供一种包含CD19单链抗体区(scFv)的嵌合抗原受体(CAR)。本发明还涉及包括CD19单链抗体区(scFv)或CD19单链抗体区(scFv)的嵌合抗原受体(CAR)的药物组合物。

Description

一种CD19抗原高亲和力的抗体以及包含其CD19单链抗体区的 嵌合抗原受体

技术领域

本发明涉及一种具有高亲和力的CD19抗体及其抗原结合部分(CD19单链抗体区)，以及包含了该CD19单链抗体区的嵌合抗原受体。

背景技术

CD19是61kDa的膜受体，是免疫球蛋白(Ig)超家族的糖蛋白成员，是一种特异性表达于B淋巴细胞各个分化阶段的细胞表面抗原。在B细胞分化早期表达，并且继续表达直到B细胞被触发最终分化，是B细胞增殖、分化、活化及抗体产生有关的重要膜抗原。绝大多数B系来源的恶性肿瘤包括B细胞急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤细胞均高表达CD19，CD19抗原是诊断B细胞系肿瘤(白血病、淋巴瘤)和鉴定B 细胞最好的标记蛋白。

CAR-T全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。CAR-T是利用能够与特定抗原结合的抗体片段来识别肿瘤细胞表面的抗原。近年来,CD19抗原特异性CAR-T细胞用于治疗B细胞白血病和淋巴瘤已显示出持续的疾病缓解效果。嵌合抗原受体(以下简称为CAR)赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相对于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。基于CAR-T细胞疗法在急性B淋巴细胞白血病和淋巴瘤的治疗中呈现的显著临床疗效，CAR-T被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。

CAR分子的最常见形式是源自识别靶抗原的单克隆抗体的单链可变片段(scFv)经由间隔物和跨膜域融合到信号传导胞内域(endodomain)的融合物。此类分子响应由scFv对其关联靶物的识别，进而介导T细胞的活化。当T 细胞表达此类CAR分子时，可特异性识别并杀死表达靶抗原的靶细胞。目前CAR-T细胞疗法已经在血液肿瘤的临床应用中取得显著疗效，在实体肿瘤中的应用，也在不断的研究和开发中。

发明内容

上述信息仅仅用于增强对本发明背景的理解，因此可能包含不构成在本领域普通技术人员公知的现有技术的信息。

本发明的目的在于解决上述现有技术中存在的问题，提供一种具有高亲和力的CD19抗体及其抗原结合部分(CD19单链抗体区)，以及包含了该 CD19单链抗体区的嵌合抗原受体。

具体来说，本发明涉及如下内容：

1.一种单克隆抗体，其包括：

(a)如Seq ID NO：10(GFIFTDYE)所示的氨基酸序列的重链CDR1；

(b)如Seq ID NO：11(FHPGSGGS)所示的氨基酸序列的重链CDR2；

(c)如Seq ID NO：12(TRQLGPD)所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(d)如Seq ID NO：3(QSLLESDGKTY)所示的氨基酸序列的轻链CDR1；

(e)如Seq ID NO：4(LVS)所示的氨基酸序列的轻链CDR2；以及

(f)如Seq ID NO：5(WQGTQFPWT)所示的氨基酸序列的轻链CDR3，

所述抗体特异性地与人CD19结合。

2.根据项1所述的抗体，其包括：

如Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的VL结构域；以及

如Seq ID NO：2所示的氨基酸序列的VH结构域。

3.一种分离的核酸，其编码根据项1或2所述的单克隆抗体。

4.一种宿主细胞，其包含根据项3所述的核酸。

5.一种生产单克隆抗体的方法，所述方法包括培养根据项4所述的宿主细胞从而生产根据项1或2所述的单克隆抗体。

6.杂交瘤细胞334，其保藏号编号为CGMCC No.17095。

7.项6所述的杂交瘤细胞334分泌的单克隆抗体，其中，所述抗体特异性地与人CD19结合。

8.一种药物组合物，其包含根据项1或2或7所述的单克隆抗体和药学上可接受的载体。

9.包含CD19单链抗体区(scFv)的嵌合抗原受体(CAR)，所述CD19单链抗体区包括：

(a)如Seq ID NO：10(GFIFTDYE)所示的氨基酸序列的重链CDR1；

(b)如Seq ID NO：11(FHPGSGGS)所示的氨基酸序列的重链CDR2；

(c)如Seq ID NO：12(TRQLGPD)所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(d)如Seq ID NO：3(QSLLESDGKTY)所示的氨基酸序列的轻链CDR1；

(e)如Seq ID NO：4(LVS)所示的氨基酸序列的轻链CDR2；以及

(f)如Seq ID NO：5(WQGTQFPWT)所示的氨基酸序列的轻链CDR3。

10.根据项9所述的嵌合抗原受体，其中，所述CD19单链抗体区包括：

如Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的VL结构域；以及

如Seq ID NO：2所示的氨基酸序列的VH结构域。

11.根据项10所述的嵌合抗原受体，其中，所述CD19单链抗体区的 VL结构域和VH结构域通过连接体连接，所述连接体选自m218 Whitlow linker、(G4S)3 linker或(G4S)5linker中的任一种。

12.根据项9～11中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体包括：

信号肽、CD19单链抗体区、hinge区、跨膜区以及胞内T细胞信号传导域。

13.根据项12所述的嵌合抗原受体，其中，

所述hinge区选自CD8-hinge或IgG4 hinge中的任一种。

14.根据项12所述的嵌合抗原受体，其中，

所述跨膜区选自CD8_TM、CD28_TM、ICOS_TM、CD44_TM、TCRα， TCRβ、TCRδ、CD3ε、CD45、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、 CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、 CD27、LFA-1(CD11a，CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、 BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、 IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、 VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、 ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、 ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244,2B4)、CD84、 CD96(Tactile)、CEACAM、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、 CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A，Ly108)、SLAM(SLAMF1，CD150， IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、 NKp30、NKp46、NKG2D或NKG2C中的任一种。

15.根据项12所述的嵌合抗原受体，其中，

胞内T细胞信号传导域包括共刺激分子以及胞内区，

所述共刺激分子选自41BB、CD28、ICOS、OX40(Seq ID NO：98)、 CD27(Seq ID NO：99)、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、或PD-1中的任一种；

所述胞内区选自CD3(例如CD3δ(Seq ID NO：100)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、 FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεR1b)、CD79a、CD79b、FcγRIIa或DAP10中的任一种。

16.根据项12所述的嵌合抗原受体，其中，

所述信号肽选自GM-CSF或CD8α中的任一种。

17.一种分离的核酸，其编码项9～16中任一项所述的嵌合抗原受体。

18.一种载体，其包含项17所述的核酸。

19.一种宿主细胞，其包含项9～16中任一项所述的嵌合抗原受体。

20.根据项19所述的细胞，其选自T细胞、NK细胞、CTL、人胚胎干细胞、淋巴祖细胞和/或T细胞前体细胞。

21.根据项20所述的细胞，其中，所述T细胞选自细胞毒性T细胞、辅助T细胞或抑制T细胞。

22.一种细胞组合物，其包含多个项19～21中任一项所述的细胞。

23.用于制备项19～21中任一项所述的细胞的方法，其包括用项18所述的载体离体转导或转染来自受试者或健康供者的细胞样品的步骤。

24.一种药物组合物，其包含项19～21中任一项所述的细胞，或项22 所述的细胞组合物，以及药学可接受载体、稀释剂或赋形剂。

25.项1或2或7所述的单克隆抗体、项3所述的核酸、项4、5所述的细胞或项8所述的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

26.根据项25所述的用途，其中，所述癌症是白血病、霍其金淋巴瘤(HL)、非霍其金淋巴瘤(NHL)、Burkitt淋巴瘤、多发性骨髓瘤，具体可能包括：急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、慢性粒细胞白血病、弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等CD19阳性的B淋巴细胞系统恶性肿瘤和疾病。

27.项9-16所述的嵌合抗原受体(CAR)、项17所述的核酸、项18所述的载体或项19～21所述的细胞、项22所述的细胞组合物或项24所述的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

28.根据项27所述的用途，其中，所述癌症是白血病、霍其金淋巴瘤(HL)、非霍其金淋巴瘤(NHL)、Burkitt淋巴瘤、多发性骨髓瘤，具体可能包括：急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、慢性粒细胞白血病、弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等CD19阳性的B淋巴细胞系统恶性肿瘤和疾病。

29.用于治疗癌症的方法，其包括：向受试者施用项19～21中任一项所述的细胞、项22的细胞组合物或项24所述的药物组合物的步骤。

30.根据项29所述的方法，其包括：用项18的载体离体转导或转染来自受试者的细胞，然后将经转染的细胞施用回所述受试者的步骤。

31.根据项29或30所述的方法，其中，所述癌症是白血病、霍其金淋巴瘤(HL)、非霍其金淋巴瘤(NHL)、Burkitt淋巴瘤、多发性骨髓瘤，具体可能包括：急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、慢性粒细胞白血病、弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等CD19阳性的B淋巴细胞系统恶性肿瘤和疾病。

发明的效果

本发明涉及的一种具有高亲和力的CD19抗体，以及包含该CD19单链抗体区的嵌合抗原受体。本发明涉及的高亲和力的CD19抗体与已知的现有的抗体相比，具有明显的抗原特异性。本发明涉及的包含该CD19单链抗体区的嵌合抗原受体与现有的已知的CAR-T药物相比，具有相当的上膜表达能力，同时可呈显著的细胞因子表达和分泌，与阳性对照组介导的细胞因子分泌水平相当，提示其具有潜在的靶向CD19抗原的识别和结合能力，并能够发挥抗CD19抗原阳性肿瘤细胞生长的作用。

附图说明

图1为利用ELISA方法检测杂交瘤细胞上清与靶蛋白(CD19)和非靶蛋白(CD20)的结合能力。

图2为利用ELISA方法检测不同杂交瘤抗体克隆所得单链抗体与靶蛋白(CD19)和非靶蛋白(CD20)的结合能力。

图3为在实施例2中与不同CAR-T与靶细胞共孵育后，流式检测IFN-γ的结果。

图4为显示CD19-334抗体的筛选及验证的结果。图4A显示ELISA检测抗体亚型；图4B显示ELISA检测334抗体与靶蛋白(CD19)和非靶蛋白 (CD20)的结合能力；图4C显示WB检测抗体与人源CD19蛋白的识别能力；图4D显示CD19-334抗体通过亲和层析纯化后的杂质情况；图4E显示 CD19-334抗体与Raji细胞结合后得到的Kd值拟合曲线和Kd值大小；图 4F显示CD19-334抗体与人外周血B细胞特异性结合情况；图4G显示 CD19-334抗体与鼠脾脏细胞结合情况。

图5显示334单链抗体对CD19和CD20抗原的结合能力。

图6显示Phage334-CAR-RFP载体结构示意图。

图7显示334-CAR上膜表达效果。

图8显示334-CAR-T细胞与靶细胞共孵育后，流式细胞技术检测CAR-T 细胞激活率及胞内染色方法检测IFN-γ的表达水平。图8(a)为334-CAR-T细胞激活情况(激活markerCD69)；图8(b)为CD8+的334-CAR-T中IFN-γ的表达水平。

图9显示334-CAR-T细胞与靶细胞共孵育后，ELISA方法检测细胞因子IFN-γ(图9(a))、IL-2(图9(b))和TNF-α(图9(c))的分泌水平。

图10显示334-CAR-T细胞对靶抗原阳性的肿瘤细胞的杀伤作用。

图11(a)和(b)显示334-CAR-T细胞在动物水平对靶抗原阳性的肿瘤细胞生长的抑制作用。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的具体实施例。虽然下文中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

除另有指明外，在本文中使用的“一种”或“一个”指“一个(种)或多个(种)”。

除另有指明外，按照其平常和普通的含义使用术语。

术语“CD19”是指，例如，人CD19的变体、同种型和物种同源物。在某些实施方案中，该抗体对于一种或多种人CD19蛋白可能是完全特异性的，并且可能不表现出物种或其他类型的非人交叉反应性。人CD19一个实例的完整氨基酸序列的Genbank登录号为AAB60697.1。

如本文所述，“抗体”指全长的(即，天然存在的或由正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分，如抗体片段。抗体包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包含通过二硫键互相连接在一起的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL) 组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可进一步再分为高变区，称为互补决定区(CDR)，CDR散布在被称为构架区(FR)的更加保守的区域中。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端向羧基端以如下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有可与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合。

本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指保留与抗原(例如CD19)特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。已证明抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来行使。术语抗体的“抗原结合部分”中所包括的结合片段的例子包括：(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1 结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)₂片段，即包含在铰链区处通过二硫键连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)Fab’片段，基本是具有铰链区部分的Fab； (iv)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(v)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(vi)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等(1989)Nature 341： 544-546)；(vii)分离的互补决定区(CDR)和(viii)纳米抗体(nanobody)，即含有单链可变域和两个恒定域的重链可变区。此外，尽管Fv片段(单链抗体区) 的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是它们可以利用重组方法通过合成连接体连接在一起，该连接体使它们能够制成一条蛋白质链，其中 VL和VH区配对构成单价分子(称为单链Fv(scFv)。这种单链抗体区也包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段用本领域技术人员公知的常规技术获得，并用与完整抗体相同的方法对这些片段的实用性进行筛选。

本文使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和性。

本文使用的术语“人抗体”包括具有如下可变区的抗体，在该可变区中，构架区和CDR区都源自人种系免疫球蛋白序列。而且，如果该抗体含有恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。

在本文的一个实施方式中，例如，人抗体可由转基因小鼠获得，改造该转基因小鼠以响应于抗原刺激而产生人抗体。在这种技术中，将人源重链和轻链基因座的元件导入源自胚胎干细胞系的小鼠品系中，该胚胎干细胞系包含鼠内源性重链和轻链基因座的定向破坏。转基因小鼠可合成对人抗原特异的人抗体，并且这些小鼠可用来产生分泌人抗体的杂交瘤。

术语“人单克隆抗体”是指表现单一结合特异性的抗体，其具有其中构架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。

在本文的一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括与无限增殖化细胞融合的B细胞，该B细胞从具有含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物(例如转基因小鼠)中获得。

在本文中，嵌合抗原受体(CAR)，也称为嵌合T细胞受体、人工T细胞受体和嵌合免疫受体，是将任意特异性植入免疫效应细胞上的工程化受体。在经典的CAR中，将单克隆抗体的特异性植入T细胞上。可以使用例如逆转录病毒载体将CAR编码核酸转移到T细胞。这样，可以产生大量癌症特异性T细胞用于过继细胞转移。该方法的I期临床研究显示功效。

CAR的靶抗原结合域通常通过间隔物和跨膜域融合到胞内域。胞内域可以包含胞内T细胞信号传导域或与胞内T细胞信号传导域结合。当CAR 结合靶抗原时，这导致将活化信号传送到上面有其表达的T细胞。

在本文中，CAR-T全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，目前已经在急性淋巴细胞白血病和淋巴瘤的临床应用中取得显著疗效，实体肿瘤的临床应用也在不断探索中，是目前最具前景的恶性肿瘤的免疫治疗方法。它的基本原理是利用患者自体或异体的免疫细胞来清除肿瘤细胞，是一种新型的基因修饰的细胞疗法。其中上述嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA 非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标抗原。

CAR分子结构的发展大致经历3-4代：第一代CAR只有一个胞内信号组分，主要是CD-3δ或FcRγ。当第一代CAR识别特异性抗原并被激发后，可为T细胞提供活化信号，并通过胞内结构域传导该信号，引起细胞的活化，表现为CAR依赖的细胞活化及细胞杀伤作用，分泌穿孔蛋白、颗粒酶及细胞因子，协同作用杀死肿瘤细胞。早期的实验证明了CAR-T的可行性，是首次不依赖HLA进行T细胞激活的尝试。然而，第一代CAR只能引起短暂地T细胞激活和较低水平的细胞因子分泌，并不能提供长时间的T细胞扩增信号和持续的体内抗肿瘤效应。为了解决这个问题，从第二代CAR开始引入了共刺激分子信号序列(costimulatorymolecule，CM)，如CD28、 CD137(4-1BB)。与第一代CAR相比，第二代CAR含有一个活化结构域和一个共刺激区域，在保持抗原特异性一致的情况下，增强了T细胞增殖和细胞因子分泌的功能。第三代CAR在第二代CAR基础上升级，胞内部分则由活化结构域和多重共刺激区域组成，具有三个胞内信号域，其中包括两个串联的共刺激域CD28、4-1BB或OX40和一个CD-3δ。这些结构域的增加不仅能够加强CAR-T细胞特异性识别肿瘤抗原及结合等能力，更能够显著扩大由胞外区传递的细胞信号，引起下级细胞杀伤作用的级联放大，抗肿瘤能力更强。第四代CAR是新型CAR，又称TRUCKs(fourth-generation CAR T-cells redirected foruniversal cytokine killing)，它的结构与前三代不同，引入促炎症细胞因子(如IL-12)和共刺激配体(4-1BBL和CD40L)，可以在具有免疫抑制性的肿瘤微环境中通过释放促炎性因子，招募并活化更多的免疫细胞而引起更为广泛的抗肿瘤免疫效应。同时，第四代CAR的出现可使患者免受回输前预处理治疗(如全身照射或大剂量化疗)的不良反应，减少回输细胞总量，拓宽了CAR-T细胞的临床应用范围。目前，临床广泛研究的多为第二代CAR结构，同时也伴随多种三代和四代CAR分子的临床前和临床研究开发，主要目的是开发靶向性更强，副作用更低的CAR-T细胞疗法。

<单克隆抗体>

本发明涉及一种特异性地与人CD19结合的单克隆抗体，其包括：如Seq ID NO：10(GFIFTDYE)所示的氨基酸序列的重链CDR1；如Seq ID NO： 11(FHPGSGGS)所示的氨基酸序列的重链CDR2；如Seq ID NO： 12(TRQLGPD)所示的氨基酸序列的重链CDR3；如Seq ID NO：3(QSLLESDGKTY)所示的氨基酸序列的轻链CDR1；如Seq ID NO：4(LVS) 所示的氨基酸序列的轻链CDR2；以及如Seq ID NO：5(WQGTQFPWT)所示的氨基酸序列的轻链CDR3。

本发明涉及一种特异性地与人CD19结合的单克隆抗体，其包括：如Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的VL结构域；以及如Seq ID NO：2所示的氨基酸序列的VH结构域。

进一步，本发明涉及的特异性地与人CD19结合的单克隆抗体其包括：如Seq IDNO：6所述的氨基酸序列的轻链FR1；如Seq ID NO：7所示的氨基酸序列的轻链FR2；如Seq IDNO：8所示的氨基酸序列的轻链FR3；如 Seq ID NO：9所示的氨基酸序列的轻链FR4；如SeqID NO：13所示的氨基酸序列的重链FR1；如Seq ID NO：14所示的氨基酸序列的重链FR2；如Seq ID NO：15所示的氨基酸序列的重链FR3；以及如Seq ID NO：16所示的氨基酸序列的重链FR4。

在一个具体的实施方式中，本发明的特异性地与人CD19结合的单克隆抗体为IgG1类型，轻链为κ链。

本发明涉及的特异性地与人CD19结合的单克隆抗体具有显著的CD19 靶抗原特异性结合，对非靶抗原CD20无结合能力。本发明涉及的特异性地与人CD19结合的单克隆抗体可识别人淋巴瘤细胞系Raji细胞中的CD19蛋白。

本发明涉及的特异性地与人CD19结合的单克隆抗体与阳性对照抗体 Mouse-Monoclonal CD19 antibody(FMC63)类似；而在小鼠脾脏细胞中，本发明涉及的特异性地与人CD19结合的单克隆抗体在不同细胞群中并无特异性结合，结果同样与阳性对照组相似。本发明涉及的特异性地与人CD19结合的单克隆抗体具有明显的抗原特异性。

<编码抗体的核酸分子>

本发明的另一方面涉及编码本发明的抗体的分离的核酸分子。该核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中，或以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳在内的标准技术和本领域公知的其他方法与其他细胞成分或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白质)分离纯化时，核酸是“分离的”或“基本上纯的”。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或者可以不含内含子序列。在一个优选实施方案中，该核酸是cDNA分子。

<杂交瘤细胞>

本发明的单克隆抗体(mAb)能够通过多种技术制备，包括常规的单克隆抗体方法，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature 256:495所述的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交技术，但是原则上，能使用制备单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化。

用于制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠系统。用小鼠产生杂交瘤是一种完善建立的程序。免疫程序和分离用于融合的被免疫脾细胞的技术是本领域公知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是公知的。

本发明涉及一种杂交瘤细胞334，其保藏号编号为CGMCC No.17095。本发明的杂交瘤细胞334分泌的单克隆抗体，其中，所述抗体特异性地与人 CD19结合。

本申请的发明人于2019年1月21日将该334号杂交瘤细胞株提交到地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，该334号杂交瘤的保藏编号为CGMCC No.17095。

本发明的人源化抗体可以基于如上所述获得的非人单克隆抗体的序列来制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从目标非人杂交瘤中获得，并且使用标准分子生物学技术将其改造为含有非鼠(例如人类)免疫球蛋白序列。

<嵌合抗原受体>

本发明涉及包含CD19单链抗体区的嵌合抗原受体(CAR)，所述CD19 单链抗体区包括：如Seq ID NO：10(GFIFTDYE)所示的氨基酸序列的重链 CDR1；如Seq ID NO：11(FHPGSGGS)所示的氨基酸序列的重链CDR2；如 Seq ID NO：12(TRQLGPD)所示的氨基酸序列的重链CDR3；如Seq ID NO： 3(QSLLESDGKTY)所示的氨基酸序列的轻链CDR1；如Seq ID NO：4(LVS) 所示的氨基酸序列的轻链CDR2；以及如Seq ID NO：5(WQGTQFPWT)所示的氨基酸序列的轻链CDR3，

本发明涉及包含CD19单链抗体区的嵌合抗原受体(CAR)，所述CD19 单链抗体区包括：如Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的VL结构域；以及如Seq ID NO：2所示的氨基酸序列的VH结构域。

在一个具体的实施方式中，VL结构域和VH结构域利用重组方法通过合成连接体连接在一起。

在一个具体的实施方式中，该连接体为m218 Whitlow linker，其序列如 Seq IDNO：86所示。

在一个具体的实施方式中，该连接体为(G4S)3 linker，其序列如Seq ID NO：87所示。

在一个具体的实施方式中，该连接体为(G4S)5 linker，其序列如Seq ID NO：88所示。

在一个具体的实施方式中，嵌合抗原受体包括：信号肽、上述CD19单链抗体区、hinge区、跨膜区以及胞内区。

本发明的嵌合抗原受体还包括hinge区，以连接CD19单链抗体区与跨膜域并且在空间上分开CD19单链抗体区与胞内域。hinge区允许CD19单链抗体区在不同方向上取向以实现CD19结合。

在一个具体的实施方式中，hinge区为CD8-hinge，其序列如Seq ID NO： 89所示。

在一个具体的实施方式中，hinge区为IgG4 hinge，其序列如Seq ID NO： 90所示。

本发明的嵌合抗原受体还可以包含跨膜的跨膜区。它可以包含疏水性α螺旋。

本发明的嵌合抗原受体的跨膜区可以是选自CD8_TM(Seq ID NO：91)、CD28_TM(Seq ID NO：92)、ICOS_TM(Seq ID NO：93)、CD44_TM(Seq ID NO： 94)、TCRα，TCRβ、TCRδ、CD3ε、CD45、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、 CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、 CD2、CD27、LFA-1(CD11a，CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、 CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、 CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、 ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、 LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、 LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244,2B4)、CD84、 CD96(Tactile)、CEACAM、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A，Ly108)、SLAM(SLAMF1，CD150， IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、 NKp30、NKp46、NKG2D或NKG2C中的任一种。

在一个具体的实施方式中，跨膜区可以源自CD8的跨膜区(CD8_TM)，其具有良好的受体稳定性，其序列如Seq ID NO：91所示。

在一个具体的实施方式中，跨膜区可以源自CD28的跨膜区(CD28_TM)，其具有良好的受体稳定性，其序列如Seq ID NO：92所示。

在一个具体的实施方式中，跨膜区可以源自ICOS的跨膜区(ICOS_TM)，其具有良好的受体稳定性，其序列如Seq ID NO：93所示。

在一个具体的实施方式中，跨膜区可以源自CD44的跨膜区(CD44_TM)，其具有良好的受体稳定性，其序列如Seq ID NO：94所示。

本发明的嵌合抗原受体还包含胞内T细胞信号传导域。胞内T细胞信号传导域是CAR的信号传送部分。在抗原识别后，受体簇和信号传送给细胞。最常用的胞内域组分是含有3个ITAM的CD3-zeta的组分。这在抗原结合后将活化信号传送给T细胞。CD3-zeta不能提供完全的活化信号，需要额外的共刺激信号传导。例如，来自CD28或OX40或41BB的共刺激分子可以与胞内域，例如CD3-Zeta一起使用以传送增殖/存活信号，或者所有三者可以一起使用。

早期的CAR设计具有从FcεR1或CD3δ的γ链的胞内部分衍生的胞内域。因此，这些第一代受体传送免疫信号1，其足以触发T细胞对关联靶细胞的杀伤，但不能完全活化T细胞以增殖和存活。为了克服这个限制，构建了复合胞内域。T细胞共刺激分子的细胞内部分与CD3δ的细胞内部分的融合产生第二代CAR载体，其可以在抗原识别之后同时传送活化和共刺激信号。最常用的共刺激域是CD28和41BB的共刺激域。这提供了最有力的共刺激信号，即免疫信号2，其触发T细胞增殖。还描述了一些受体，其包括传送存活信号的TNF受体家族胞内域，如OX40。

本发明的嵌合抗原受体的胞内T细胞信号传导域包括共刺激分子以及胞内区，其中上述共刺激分子选自41BB、CD28、ICOS、OX40、CD27、 4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40或PD-1中的任一种。

所述上述胞内区选自CD3、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεR1b)、CD79a、 CD79b、FcγRIIa或DAP10中的任一种，其中CD3包括CD3δ(CD3zeta)、CD3γ、CD3δ、CD3ε。

在一个具体的实施方式中，所述胞内区为CD3δ，其序列如Seq ID NO： 100所示。

在一个具体的实施方式中，所述共刺激分子为41BB，其序列如Seq ID NO：95所示。

在一个具体的实施方式中，所述共刺激分子为CD28，其序列如Seq ID NO：96所示。

在一个具体的实施方式中，所述共刺激分子为ICOS，其序列如Seq ID NO：97所示。

在一个具体的实施方式中，所述共刺激分子为OX40，其序列如Seq ID NO：98所示。

在一个具体的实施方式中，所述共刺激分子为CD27，其序列如Seq ID NO：99所示。

本发明的CAR可以包含信号肽，使得当CAR在诸如T细胞的细胞内表达时，将新生蛋白质引导到内质网并且随后到表达其的细胞表面。

信号肽的核心可以含有长的疏水性氨基酸区段，其具有形成单个α-螺旋的倾向。信号肽可以以氨基酸的短正电荷区段开始，这有助于在移位期间强制多肽的适当拓扑学。在信号肽的末端，通常有被信号肽酶识别和切割的氨基酸区段。信号肽酶可以在移位期间或完成后切割，以产生游离信号肽和成熟蛋白。然后，游离信号肽被特异性蛋白酶消化。信号肽可以在分子的氨基末端。

在一个具体的实施方式中，所述信号肽为GMCSF(GM-CSF)，其序列如 Seq ID NO：101所示。

在一个具体的实施方式中，所述信号肽为CD8α，其序列如Seq ID NO： 102所示。

本发明的CAR可以具有以下通式：信号肽-CD19单链抗体区-hinge区- 跨膜区和/或胞内T细胞信号传导域。

在一个具体的实施方式中，本发明的CAR具有如下结构：信号肽-CD19 单链抗体区-hinge区-跨膜区-胞内T细胞信号传导域。

在一个具体的实施方式中，本发明的CAR具有如下结构：信号肽-CD19 单链抗体区-hinge区-跨膜区-共刺激分子-CD3 zeta区域。

在一个具体的实施方式中，本发明的CAR具有如下结构： GM-CSF-CD19单链抗体区(334-scFv)-hinge区(CD8-hinge)-跨膜区(CD8TM)- 共刺激分子(41BB)-CD3 zeta区域。

本发明涉及的包含该CD19单链抗体区的嵌合抗原受体可呈显著的细胞因子表达和分泌，显著高于阳性对照组介导的细胞因子分泌水平，其具有潜在的靶向CD19抗原识别和结合能力，并能够发挥抗CD19抗原阳性肿瘤细胞的作用，可介导显著的靶细胞杀伤。

本发明涉及的包含该CD19单链抗体区的嵌合抗原受体与现有的已知的 CAR-T药物相比，具有相当的上膜表达能力，同时可呈显著的细胞因子表达和分泌，与阳性对照组介导的细胞因子分泌水平相当，提示其具有潜在的靶向CD19抗原的识别和结合能力，并能够发挥抗CD19抗原阳性肿瘤细胞生长的作用。

<核酸序列>

本发明还涉及编码上述本发明的CAR的核酸序列。

<载体>

本发明还提供了包含编码上述本发明的CAR的载体。可以使用此类载体将核酸序列导入宿主细胞中，使得其表达并产生根据本发明CAR分子。载体可以是例如质粒或病毒载体，如逆转录病毒载体或慢病毒载体。载体可以能够转染或转导细胞，如T细胞。

<细胞>

本发明还提供了包含根据本发明的核酸的细胞。本发明提供在细胞表面表达根据本发明的CAR的细胞。细胞可以是细胞溶解免疫细胞，如T细胞、 NK细胞、CTL、人胚胎干细胞、淋巴祖细胞和/或T细胞前体细胞。具体来说，T细胞选自细胞毒性T细胞、辅助T细胞或抑制T细胞。可以通过用 CAR编码核酸转导或转染细胞来制备能够表达根据本发明的CAR的细胞。本发明的CAR表达细胞可以离体产生。细胞可以来自细胞样品，如来自患者或供体的外周血单核细胞(PBMC)样品。在用CAR编码核酸转导之前，例如通过用抗CD3单克隆抗体处理，可以活化和/或扩增细胞。

<包含本发明的CAR的药物组合物>

本发明还涉及药物组合物，其含有本发明的一种CAR表达细胞或多种细胞以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，和任选地一种或多种另外的药学活性多肽和/或化合物。此类配制剂可以例如为适合用于静脉输注的形式。

<利用本发明的CAR的治疗方法>

本发明的CAR表达细胞可以能够杀死癌细胞，如人白血病和淋巴瘤细胞。CAR表达细胞，如T细胞或NK细胞可以从患者自体的外周血(第一方) 离体产生，或在来自供体外周血的造血干细胞移植物(第二方)中产生，或来自不相关供体的外周血(第三方)产生。或者，CAR表达细胞可以源自可诱导祖细胞或胚胎祖细胞离体分化成诸如T细胞的细胞。在这些情况中，通过多种手段之一，包括用病毒载体转导、用DNA或RNA转染导入编码CAR的 DNA或RNA产生CAR细胞。

表达本发明CAR分子的T细胞或NK细胞可用于治疗多种B细胞恶性肿瘤，如淋巴瘤和白血病，特别是与CD19高表达的恶性肿瘤，例如，白血病、霍其金淋巴瘤(HL)、非霍其金淋巴瘤(NHL)、Burkitt淋巴瘤、多发性骨髓瘤，具体可能包括：急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、慢性粒细胞白血病、弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等CD19阳性B淋巴细胞系统恶性肿瘤和疾病。

治疗疾病的方法涉及本发明的细胞或细胞群体的治疗用途。在这方面，可以向具有现有疾病或状况的受试者施用细胞以减轻、减少或改善与疾病相关的至少一种症状和/或减缓、减少或阻断疾病进展。本发明的方法可以引起或促进细胞介导的对表达CD19的细胞，如B细胞的杀伤。

实施例

以下通过实施例对本发明进行详细说明。在以下实施例中，如无特别说明，所用的各材料均可以通过商购获得，如无特别说明，所用的方法为本领域的常规方法。如无特别说明，百分比表示重量百分比。

实施例1.CD19鼠源抗体的制备

实施例1-1人源CD19抗原肽的制备

1.CD19抗原大肠杆菌原核表达载体的构建：

以人CD19高表达肿瘤细胞cDNA为模板，人源CD19蛋白胞外段DNA 序列如SEQ IDNo.17所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.18所示。设计PCR 引物(exCD19-1F(SEQ IDNo.19)/exCD19-1R(SEQ ID No.20)；exCD19-2F(SEQ ID No.21)/exCD19-2R(SEQ IDNo.22))，扩增得到CD19胞外段区域。通过酶切-连接的方法，将扩增得到的CD19胞外段区域连接入pET28a表达载体上，并转化入DH5α感受态细胞，提取单菌落或提取质粒，进行测序。

2.诱导表达：

经尝试不同的表达菌株(Rosseta(DE3)/BL21(DE3))和表达条件(0.2、0.5、 1mMIPTG，37℃(4-5h)或37℃(过夜)或20℃(过夜))小量试诱导表达后，对诱导前后的菌体进行蛋白样品制备，根据SDS-PAGE结果，确定CD19蛋白最优表达菌株为Rosseta(DE3)，最优表达条件为37℃，1mM IPTG诱导4-5h。

根据最优表达条件，将转入表达载体的Rosseta(DE3)菌液接种到6L的 2×YT培养基中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8时。加入1mM IPTG，37℃诱导 4-5h，然后收集菌液，4000rpm离心30min，弃上清，收集菌块于-80℃保存。

3.收集包涵体：

将菌块置于120mL含50mM Tris、300-500mM NaCl、pH＝7.0的菌体裂解液中，进行超声破碎。之后，4000rpm离心30min，收集包涵体沉淀。

4.洗涤包涵体：

将包涵体沉淀用含0.5％TritonX100、50mM Tris、300-500mM NaCl、2M 尿素，pH7.0和50mM Tris、300-500mM NaCl、2M尿素、pH7.0的溶液分别洗涤两次，8000rpm，离心30min，弃上清，收集洗涤后的包涵体。

5.溶解包涵体：

用8M尿素，50mM Tris、300-500mM NaCl、pH7.0的变性缓冲液溶解上述步骤中收集洗涤后的包涵体，在4℃过夜，搅拌，14000rpm，离心30min，收集溶解的包涵体。

6.镍柱纯化：

向溶解的包涵体中加入终浓度至20mM咪唑，充分混匀，加到镍柱中，流速rpm3-4，待UV instrument A值升高时，收集穿流液，用不含蛋白的20mM 咪唑溶液洗脱镍柱至A值不变；依次用含50mM、100mM和300mM咪唑的变性缓冲液洗脱镍柱，rpm6-7，待A值开始上升时，收集3-5个柱体积洗脱液，在A值最高点，吸取40ul洗脱液留电泳样。每次收集完洗脱液后，用相同咪唑浓度的变性缓冲液洗平A值。

7.透析与浓缩：

将含有目的蛋白的洗脱液加入终浓度5mM GSSH、0.5mM GSSG，4℃搅拌过夜后，装入透析袋中，用含有8M尿素、0.1MTris、0.4M精氨酸的复性缓冲液进行透析。每隔3h将复性缓冲液中的尿素浓度减半，直至减为0M 尿素。将透析后的蛋白溶液放入15kD的浓缩管中进行离心浓缩，将体积浓缩至1-1.5mL，从而获得纯化的人CD19蛋白。

8.测定蛋白浓度：

用BSA标准品分别配置浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml的蛋白样品，与蛋白染液进行混合，用比色皿测定吸光值，制作蛋白浓度标准曲线。根据曲线的测定范围，将所得蛋白稀释10倍与蛋白染液混合，用比色皿测定吸光值，与标准曲线对应，从而测出相应的纯化的人CD19蛋白的蛋白浓度，经过上述纯化过程得到的蛋白浓度为4mg/ml。

实施例1-2 CD19抗原肽免疫小鼠

采用上述实施例1-1获得的，利用原核系统表达并纯化的人CD19蛋白 (50-100μg)免疫健康Balb/c小鼠，佐剂包括完全弗氏佐剂(CFA，Sigma)和不完全弗氏佐剂(IFA，Sigma)。用PBS稀释上述表达和经纯化的CD19蛋白，然后与相应的佐剂1:1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳化剂，用注射器抽取抗原混合物，于小鼠皮肤下进行多点皮下注射。每点注射5-100μl，以保证免疫抗原持久存在，提高免疫应答能力。具体免疫动物流程如下：

1.选择6-8周雌性BALB/c小鼠，常规动物房培养2-4天，待小鼠适应培养环境；

2.第0天，从小鼠眼眶静脉丛采取阴性对照血样，静置后，提取血清， 50uL/只，-80℃分装保存；

2.第1天(第1次免疫)：采用完全弗氏佐剂(CFA)混合的CD19抗原 (120μg)皮下注射，免疫小鼠；

3.第14天(第2次免疫)：采用不完全弗氏佐剂(IFA)混合的CD19抗原 (60μg)皮下注射，免疫小鼠；

4.第28天(第3次免疫)：再次采用不完全弗氏佐剂(IFA)混合的CD19 抗原(60μg)皮下注射，免疫小鼠；

5.第35天(第1次采血清)：从小鼠眼眶静脉丛采取小鼠血样，提取血清，采用ELISA方法检测OD值，若1:4000稀释的血清OD值大于1.0，转阳，则融合前3天进行小鼠加强免疫；若低于1.0，继续免疫采血；

6.第41天(第2次采血清)：从小鼠眼眶静脉丛采取小鼠血样，提取血清，采用ELISA方法检测，若1:4000稀释的血清OD值大于1.0，转阳，则融合前3天进行小鼠加强免疫；若低于1.0，继续免疫采血；

7.第42天(第4次免疫)：免疫方法和免疫剂量同第3次免疫。

8.采血是1周采1次，免疫是2周免疫一次。当血清检测的结果阳性后，进行融合。融合前3天进行小鼠加强免疫，将溶解在PBS中的CD19抗原(60μg)皮下免疫小鼠。

实施例1-3细胞融合和保存

应用脾细胞融合技术，制备单克隆杂交瘤细胞株。具体方法如下：

1.脾淋巴细胞制备：将已经加强免疫3天之后的BALB/c小鼠，在无菌条件下，去除脾脏，进行脾淋巴细胞的制备。注意：在制备脾淋巴细胞的过程中，也需要进行小鼠摘眼球取血，将血清分离后作为抗体检测时阳性对照血清。

2.骨髓瘤细胞制备：骨髓瘤细胞F0与免疫小鼠属于同一品系，则杂交瘤融合效率高。应用DMEM，10-20％的小牛血清，细胞浓度控制在10⁴-10⁵为最佳。每3-5天传代一次，按1:3-1:10的比例传代。定期用8-氮鸟嘌呤处理，使生存细胞对HAT具有均一的敏感性。

3.细胞融合：将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10或1:5的比例混合，至于 50ml离心管中，用无血清培养基洗涤1次，离心，1200rpm，8min，弃上清，用移液器将残留液体吸干，轻弹管底，使细胞沉淀松散。用移液器吸取预热至40℃的50％的PEG(pH＝8.0)1mL，于60s内加入细胞沉淀，边加边轻轻搅拌。之后加入20mL预热的无血清培养基(终止PEG作用)，20-27℃静置10min。 1000rpm，离心6min，弃上清。加入5ml HAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，加入HAT培养基至80mL。将细胞分别至于96孔细胞培养板中，每孔100uL，37℃，5％CO₂培养箱内培养。5天后将HAT培养基换成1/2培养基，7-10天后，用HT培养基换HAT培养基。观察杂交瘤细胞的生长情况，待细胞生长至覆盖板底一定面积后，吸取上清，进行抗体检测。

4.杂交瘤细胞的筛选：用抗原对融合的杂交瘤克隆的上清进行筛选，检测它们的特异性和敏感性，一般进行初筛和复筛两次。

5.杂交瘤细胞的克隆化：针对抗原筛选出来的克隆，至少还需要2-3 次克隆化生长，甚至多次，采用有效稀释法，进行克隆化生长，最终得到稳定分泌抗体的单克隆杂交瘤细胞。

6.杂交瘤细胞的冻存：针对筛选得到的单克隆杂交瘤细胞，进行规模化生长，并进行细胞库的建立，冻存以备生产单克隆抗体和研究使用。

实施例1-4单克隆的筛选

经过初步单克隆抗体杂交和鉴定技术，针对实施例1-3中获得的9株单克隆杂交瘤细胞株，通过ELSIA方法，鉴定了不同杂交瘤细胞培养上清，与靶抗原(CD19)和非靶抗原(CD20)的识别和结合能力。具体过程如下：

用CD19/CD20抗原包被96孔ELISA细胞检测板，100ng/100ul，4℃过夜。3％BSA(牛血清白蛋白)封闭，300ul/well，37℃，孵育2h。PBST洗一次，加入梯度稀释(1：10-100)的杂交瘤细胞上清，100ul/well，37℃，孵育1h。 PBST洗3-5次。应用Anti-mouse IgG-HRP二抗，100ul/well，37℃，孵育 1h。PBST洗5次。TMB显色(100μl/孔)，10-20min，加2N硫酸终止显色。 OD₄₅₀和OD₅₆₂检测荧光强度。

结果显示，不同杂交瘤上清呈现不同程度的靶抗原识别能力。其中编号为758、847和334的三株杂交瘤细胞株分泌的抗体结合能力较强，如图1 所示。

经过单链抗体克隆和亲和能力筛选，最终筛选得到334号杂交瘤细胞株，其分泌的抗体以及对应的单链抗体具有CD19抗原特异性识别和结合能力。本申请的发明人于2019年1月21日将该334号杂交瘤细胞株提交到地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，该334号杂交瘤的保藏编号为CGMCC No.17095。

实施例2.CD19-334抗体的发现

如上述实施例1所述，经过杂交瘤细胞单抗筛选，发现了几种可在蛋白水平识别CD19抗原的单抗，为了进一步确定这些单抗的单链抗体(scFv)形式，是否也能识别CD19靶抗原，以用于单链抗体蛋白药物或CAR-T等细胞治疗产品的开发，在实施例2中，进一步克隆了所有单链抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，具体方法如下：

实施例2-1.CD19单链抗体VH和VL的克隆：

(1)杂交瘤细胞复苏：

1.杂交瘤细胞采用IMDM+10％FBS进行常规培养，按照1:3-1:5进行传代培养。

2.杂交瘤细胞属于悬浮细胞，细胞生长较满后，会有一层细胞沉积于培养皿底部。传代时，将细胞轻轻吹起，重悬。收集细胞离心，沉淀。

(2)杂交瘤细胞总RNA提取

收集5×10⁶个杂交瘤细胞，加入1ml Trizol，采用Trizol法提取RNA。

(3)cDNA第一链的合成

采用Promega逆转录试剂盒，进行cDNA的合成(40μl体系)。

第一步：取一定模板RNA，加入Oligo(dT)₁₅Primer(序列如SEQ ID No.23 所示)

组分	体积(μl)
		RNA(<5ug/reaction)	19
Oligo(dT)<sub>15</sub>Primer	1
		总体积	20

第二步：将模板RNA与Oligo(dT)₁₅Primer(序列如SEQ ID No.23所示) 的混合物，至于70℃、5min预变性，完成后至于冰上。

第三步：待预变性时，可提前配制RT-Mix，每管20μl。

第四步：设置反转录程序，退火、延伸、逆转录酶失活三步。程序完成后即得到cDNA。

25℃，5min；42℃，60min；70℃，15min；4℃，10min。

(4)第1次PCR：IgG重链可变区基因和轻链基因克隆

第1步：配制反应体系

重链可变区：

轻链可变区：

第2步：PCR条件

(5)第2次PCR

若第一次PCR未得到特异性条带，或者无条带，则可将第一次PCR产物进行纯化(也可不纯化)，作为模板进行第二次PCR。建议采用大体积进行 PCR，效果会好。

(6)琼脂糖凝胶电泳

将PCR产物，采用1.5％的Gel跑胶，120V，35min。检测是否可见明显VH和VL条带，大小为400-500bp(引物设计位置不同会导致大小不同)。

(7)胶回收或者PCR纯化

若条带较单一，则采用PCR纯化kit进行纯化。若可见多条PCR产物，则根据产物大小，进行胶回收。

(8)连接-转化

将PCR产物，与pEasy-Blunt载体进行连接(平末端连接)，转化T1感受态细胞。

(9)菌落PCR鉴定及测序

采用pEasy-Blunt载体通用引物M13F和M13R(序列分别如SEQ ID No.24所示和SEQID No.25所示)进行菌落PCR鉴定。挑选大小正确克隆送测序。一般可挑选5-10个克隆送测序，采用M13F进行测序。

(10)序列比对

将测序结果于IgBLAST网站上进行比对。首先，确定一种杂交瘤克隆是否得到的是一个单一的VH和VL。若不是，首先排除是否为融合细胞基因序列；若非单一序列为正常VH或VL，则应全部克隆，进行后续实验。其次，比对VH和VL匹配区域，是否含有完整CDR1-3以及FR1。最后，确定小鼠VH和VL特征性序列。

表1.鼠源抗体重链和轻链PCR引物

实施例2-2.CD19单链抗体的表达：

(1)首先确定正确的VH和VL序列。

(2)合成带有酶切位点(Nhe I和Not I)，以及linker((G4S)3)-over-lap的 VH和VL正向引物和逆向引物(针对各杂交瘤的引物如表2所示)，按照 VH-VL方向进行连接CMV-Fc抗体表达载体。

(3)首先PCR获得不同杂交瘤的VH和VL区域序列，纯化或者胶回收 PCR产物。采用T4DNA连接或同源重组酶将PCR片段和酶切后的CMV-Fc 载体连接，连接产物转化T1细胞，涂平板(A+)，菌落PCR鉴定阳性克隆后，送测序，确定正确克隆后，保存甘油菌和质粒。

(4)将构建的不同scFv-CMV-Fc质粒，转染293T细胞，转染8h后换液，培养72h后，收集上清，进行ELISA鉴定与CD19靶抗原的识别。

表2实施例2-2中使用的linker((G4S)3)-over-lap的VH和VL引物

实施例2-3.CD19单链抗体的鉴定：

采用ELISA方法鉴定不同单链抗体与CD19抗原和非靶抗原的结合和识别能力。具体方法如下：

用CD19/CD20抗原包被96孔ELISA细胞检测板，100ng/100ul，4℃过夜。3％BSA(牛血清白蛋白)封闭，300ul/well，37℃，孵育2h。PBST洗一次，加入293T细胞上清，100ul/well，37℃，孵育1h。PBST洗3-5次。应用 Anti-human-IgG-HRP二抗，100ul/well，37℃，孵育1h。PBST洗5次。TMB 显色(100μl/孔)，10-20min，加2N硫酸终止显色。OD₄₅₀和OD₅₆₂检测荧光强度。

经过单链抗体克隆和表达筛选，最终共筛选到4种单链抗体(scFv)可呈现 CD19抗原特异性识别作用，其中包括334、564和453在蛋白水平呈现较强的结合能力(如图2所示)。

实施例2-4.CD19单链抗体功能的初步鉴定

首先，我们将经过ELISA鉴定证明，靶向CD19抗原的单克隆抗体的 scFv-Fc与CD19抗原结合的阳性的克隆，构建二代CAR载体，以检测其是否可以介导与人CD19高表达肿瘤细胞的识别、结合和功能的发挥。

首先采用同源重组的方法将多种单链抗体区域(具体步骤参照试剂盒说明书，试剂盒为seamless assembly cloning kit，厂家：clone smarter，货号:C5891-50)连入慢病毒载体Phage-CAR-RFP，得到表达不同scFv-CAR的质粒(Phage-scFv-CAR-RFP)。将无菌抽提的Phage-scFv-CAR-RFP质粒利用转染试剂PEI转染293T细胞，收取48小时病毒上清，感染对数生长期的人源T细胞。将表达不同scFv-CAR的T细胞与表达CD19抗原的人淋巴瘤 Raji细胞共孵育，通过流式染色方法检测细胞因子IFN-γ的表达和分泌情况。试验结果显示，与靶细胞共孵育后，只有334-CAR-T可呈显著的IFN-γ细胞因子表达(如图3所示)，提示其可能具有潜在的抗CD19阳性肿瘤作用。

实施例3、CD19-334抗体类型和特异性鉴定

实施例3-1.CD19-33抗体亚型的鉴定

采用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定ELISA检测试剂盒：包括GAM IgG1-FITC、 GAMIgG2a-FITC、GAM IgG2b-FITC、GAM IgG3-FITC、GAM IgM-FITC、 GAM IgKappa-FITC和GAMIgLambda-FITC(购自于北京博奥龙免疫技术公司)。

首先将单克隆抗体特异结合的对应Ag用PBS缓冲液稀释，包被酶标微孔板，每孔100μl，100ng/100ul，置37℃孵育2小时或4℃过夜。甩去包被液，用PBST洗1遍。加入待测杂交瘤细胞培养上清，每孔100μl，置37℃孵育30min-1h，3个复孔。PBST洗5遍。孵育二抗：8种酶标记物，每孔 100ul，置37℃孵育30min。PBST洗5遍。加TMB显色液，50-100ul/孔， 37℃(室温)避光显色20min。加入2N硫酸终止反应，用酶标仪检测OD₄₅₀、 OD₆₃₀读数。结果分析：参看高OD值孔对应所加的酶标二抗，确定此株单抗的Ig类别。

结果显示，334号抗体为IgG1类型，轻链为κ链(如图4A所示)；

实施例3-2.CD19-334靶抗原特异性结合

其次，采用ELISA方法鉴定了334抗体与靶抗原CD19和非靶抗原CD20 的识别能力，结果显示，CD19-334杂交瘤细胞上清可呈现显著的CD19靶蛋白(体外原核细胞纯化蛋白)特异性识别和结合能力，对非靶蛋白CD20抗原无识别作用(如图4B所示)。

为了验证克隆所得单链抗体是否具备CD19抗原特异性识别能力，将无菌抽提的334-CMV-Fc质粒利用转染试剂PEI转染293T细胞，72小时后，收取细胞上清，采用ELISA方法检测抗原抗体的特异性结合能力。实验结果显示，334单链抗体呈现显著的CD19靶抗原特异性结合，对非靶抗原CD20 无结合能力(如图5所示)。

实施例3-3.CD19-334抗体与人源CD19抗体的特异性结合鉴定(WB试验)

为了进一步验证CD19-334抗体可以特异性识别人源细胞表达的CD19 抗原，采用WB试验，检测CD19-334抗体与人源CD19抗原的识别能力。

(1)CD19阳性蛋白样本的制备：

常规培养人淋巴瘤细胞系Raji细胞(CD19抗原阳性高表达)，待细胞融合至90％，取6cm dish的悬浮细胞，离心后，收集细胞沉淀于1.5mL离心管内。加入200uL总蛋白提取裂解试剂(RIPA)，充分吹打混匀后，冰上裂解 15分钟。将离心管置于4℃预冷的低温冷冻离心机内，4℃，12000rpm，15min，收集上清。加入5×loading buffer，100℃，5min，蛋白变性。将样本离心后，冰上预冷待进行WB电泳(采用人肾癌细胞系M62作为CD19阴性对照组细胞)。

(2)WB电泳：制备浓缩胶为4％，分离胶为10％的SDS-PAGE电泳胶。每孔加入提取的CD19阳性蛋白样本和CD19阴性的蛋白样本40uL。80V， 20min电泳，后调整电压为120V，40-60min(根据分离胶分离情况)。

(3)转膜：采用半干转系统，将目的蛋白转印至0.45μm的PVDF膜上。转膜条件为15V，1h。

(4)封闭：将转印完成的PVDF膜，置于5％的脱脂奶粉中封闭，室温，摇床1h。

(5)一抗孵育：将PVDF采用PBST将残留的奶粉洗净，并采用滤纸将残留buffer吸干，置于含有CD19抗原杂交瘤上清(5-8mL)的一抗孵育盒中。4℃，孵育过夜。

(6)PBST冲洗：5min3

(7)二抗孵育：将PVDF置于HRP标记的抗鼠(1：20000)单抗中。室温，孵育1h。

(8)PBST冲洗：5min3

(9)凝胶成像仪显色，拍照。

试验结果显示，334号抗体可识别人淋巴瘤细胞系Raji细胞中的CD19 蛋白，目标条带大小为95kD(如图4C所示)。

实施例4、CD19-334抗体解离常数Kd和种属细胞特异性鉴定

为了进一步验证CD19-334抗体可以特异性识别人源细胞表达的CD19 抗原，采用流式细胞术检测CD19-334抗体与人源CD19抗原的识别能力，以及CD19-334抗体与不同种属细胞的非特异性结合情况。

实施例4-1.杂交瘤细胞复苏：

1.杂交瘤细胞采用IMDM+10％FBS进行常规培养，按照1:3-1:5进行传代培养，细胞传代数次后，采用hybridoma-SFM培养液(无蛋白培养液)逐步替换IMDM+10％FBS培养液。

2.待杂交瘤细胞完全适应hybridoma-SFM培养液后，培养细胞至90％的汇合度收集细胞，将细胞轻轻吹起，重悬，收集细胞离心，弃细胞沉淀，保留杂交瘤培养上清，并将上清置于4℃预冷的低温冷冻离心机内，4℃， 12000rpm，10min，弃培养液中的杂质。

实施例4-2.CD19-334抗体的纯化：

1.将杂交瘤培养液上清置于Vivaspin6(50kDa MWCO PES)蛋白浓缩管中，4℃预冷的低温冷冻离心机内，4℃，12000rpm，将100mL培养液上清离心浓缩至5ml，置于4℃准备下一步纯化。

2.蛋白G层析纯化柱(购自于上海翊圣生物技术有限公司，产品编号 36413ES03)利用3-5倍体积去离子水冲洗层析柱中储存液，随后用5倍柱体积的结合缓冲液平衡层析柱，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。

3.培养上清液加入至层析柱前，利用结合缓冲液稀释培养上清液至原来体积的5倍(目的是使上清液pH值与结合缓冲液相近)。稀释完成后将样品加到平衡的层析柱中，收集流出液。当样品完全通过层析柱后，用10-15 倍柱体积的洗杂缓冲液对柱体进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，并在随后利用洗脱缓冲液将目的蛋白洗脱下来，并用收集管收集洗脱液，该洗脱液中获得的蛋白即为CD19-334抗体的纯化样品。

4.将上述获得的纯化的CD19-334抗体利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。

SDS-PAGE电泳结果显示收集得到的CD19-334抗体主要集中于前四管洗脱液中，并且CD19-334抗体目标条带大小约为50kD(如图4D所示)。

实施例4-3.CD19-334抗体的Kd值检测：

1.常规培养人淋巴瘤细胞系Raji细胞(CD19抗原阳性高表达)，待细胞融合至90％，取6cm dish的悬浮细胞，离心后，收集细胞沉淀于1.5mL离心管内，并用PBS重悬细胞沉淀并调整细胞密度为5×10⁶个细胞/mL。

2.取5×10⁶个Raji细胞平均加入至96孔板中，并稀释纯化得到的 CD19-334抗体为375nM、187.5nM、30nM、3nM、0.3nM、0.03nM、0.003nM 和0nM，并加入至96孔板中的Raji细胞中，4℃孵育30min后，2000rpm，离心5min，弃上清，加入PBS清洗细胞一次后，加入goat-anti mouse Alexa Fluor 555荧光二抗孵育Raji细胞30min。4℃孵育30min，2000rpm，离心5min，弃上清，加入PBS清洗细胞一次后，加入200μL PBS重悬细胞，并采用流式细胞术检测不同CD19-334抗体浓度下Raji细胞的荧光强度，并通过GraphPad软件计算得到CD19-334抗体的Kd值。

检测结果如图4E显示，不同抗体浓度下Raji细胞的荧光强度所拟合出的结合曲线，并通过GraphPad软件计算得到CD19-334抗体的Kd值为 1.528±0.25nM。

实施例4-4.CD19-334抗体特异性检测

1.从液氮中取出保存的健康志愿者外周血细胞(PBMC)，复苏并用 RPMI-1640+10％FBS进行过夜培养，24小时后收集于15mL离心管内，4℃， 1500rpm离心5min后，收集细胞沉淀，并用PBS重悬细胞沉淀并调整细胞密度为1×10⁶个细胞/mL，置于冰上待用。

2.取野生型小鼠一只，通过颈椎脱臼法处死小鼠，解剖并获得小鼠脾脏，通过在70μm滤膜中研磨分离得到小鼠脾脏细胞混合液，随后在细胞混合液中加入红细胞裂解液(RBC)处理2min，4℃，1500rpm离心5min后，弃上清，收集细胞沉淀，并用PBS重悬细胞沉淀并调整细胞密度为1×10⁶个细胞/mL，置于冰上待用。

3.为了检测CD19-334抗体对不同种属标记特异性，利用 Mouse-Monoclonal CD19antibody(FMC63)作为阳性对照抗体，与CD19-334 抗体冰上孵育人外周血细胞和小鼠脾脏细胞30min。孵育完成后，4℃， 1500rpm离心5min，弃上清，并用PBS洗涤细胞两次。接着在人外周血细胞中孵育PE-cy7anti-human CD3(区分T细胞)、APC anti-human CD20(区分 B细胞)、Fixable Viability Dye eFluor 506(区分死亡细胞)、goat-anti mouse AlexaFluor 488；而在鼠脾脏细胞中则孵育Anti-Mouse CD3-BV421(区分T 细胞)和FixableViability Dye eFluor 506(区分死亡细胞)，以上抗体孵育30min 后，4℃，1500rpm离心5min，弃上清，并用PBS洗涤细胞两次，利用流式细胞检测CD19-334抗体在各细胞中的结合情况。

检测结果如图4F和图4G所示，在人外周血细胞中，通过不同抗体的区分，可以得到不同的细胞分区，分别是T细胞(无CD19表达)、B细胞(CD19 表达)和非TB细胞群(无CD19表达)，检测各细胞群的荧光强度(MFI)的变化可发现，CD19-334抗体能够特异性结合人B细胞，而对T细胞和非TB细胞群无非特异性结合，结果与阳性对照抗体Mouse-MonoclonalCD19 antibody(FMC63)类似；而在小鼠脾脏细胞中，CD19-334抗体在不同细胞群中并无特异性结合，结果同样与阳性对照组相似。以上结果显示CD19-334 抗体具有明显的抗原特异性。

实施例5.334单链抗体介导的CD19-CAR-T细胞的功能

实施例5-1.CD19-334-CAR-T细胞上膜情况检测

为了进一步验证334抗体是否可介导靶向CD19的肿瘤细胞识别和杀伤作用，构建了334-CAR表达载体。首先采用同源重组的方法将334单链抗体区域(具体步骤参照试剂盒说明书(试剂盒名称：Seamless assembly cloning kit，厂家：clone smarter，货号:C5891-50))连入慢病毒载体Phage-CAR-RFP，得到表达334-CAR的质粒(Phage-334-CAR-RFP)(如图6所示)。

将无菌抽提的Phage-334-CAR-RFP质粒利用转染试剂PEI转染293T细胞，收取48小时病毒上清，感染对数生长期的人源T细胞。采用流式细胞术检测CAR的上膜表达情况。试验结果如图7所示，图7显示，334-CAR 可呈现显著的上膜表达，与FMC63-CAR(阳性对照)效果相似。

实施例5-2.CD19-334-CAR-T细胞介导的细胞因子分泌

将表达334-CAR的T细胞与CD19抗原阳性的人淋巴瘤细胞系和CD19 抗原阴性的Jurkat细胞共孵育，通过流式细胞胞内染色方法和ELISA方法检测细胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-α的表达和分泌情况，试验结果如图8和9 所示，试验结果显示，与靶细胞共孵育后，334-CAR-T可呈显著的细胞因子表达和分泌，显著高于阳性对照组FMC-CAR-T介导的细胞因子分泌水平，提示其具有潜在的靶向CD19抗原识别和结合能力，并能够发挥抗CD19抗原阳性肿瘤细胞的作用。

实施例5-3.CD19-334-CAR-T细胞介导的靶细胞杀伤作用

采用LDH方法，检测334-CAR-T与CD19抗原阳性的人淋巴瘤细胞(Raji 细胞)共培养，对CD19抗原阳性的人淋巴瘤细胞系(Raji细胞)的杀伤作用。试验结果如图10所示，图10显示，334-CAR-T细胞可介导显著的靶细胞杀伤，并且与FMC-CAR-T细胞效果相似。

实施例6 334-CAR-T细胞在动物水平对CD19抗原阳性的人淋巴瘤细胞生长的影响

采用免疫缺陷的小鼠模型，检测334-CAR-T细胞在动物水平对CD19 抗原阳性的人淋巴瘤细胞生长的影响。

1.新鲜血液中分离外周血单核细胞(PBMC)

(1)从献血者中抽取10mL新鲜血液并用抗凝管保存于4℃中；

(2)把血液转移至50ml的离心管中，并加入15mL PBS稀释血液，轻柔吹打均匀后，缓慢加入15mL Ficoll-PaqueTM Plus至PBS-血液稀释液中；

(3)把50mL离心管轻柔至于离心机中，调节离心机升降速度各为零，在室温下600g离心30分钟，分离PBMC；

(4)离心结束后，把PBMC从分层的溶液(PBMC在溶液中层)中缓慢吸取并转移至新的50mL的离心管中，并加入PBS至50mL；

(5)在4℃下，400g离心10分钟，离心完毕后弃上清，并重复洗涤一次；

(6)PBMC洗涤完成后，用1mL 1640基础培养液重悬并计数；

(7)计数完毕后，把PBMC以每孔2×10⁶的数量加入至CD3/CD28/Fibronectin溶液包被过夜的6孔板中，置于37℃的细胞培养箱中激活48小时。

2.细胞转染

(1)转染前一晚，将长至90％-95％密度的Lenti-X-293T按照1:5的比例铺至10cm培养皿中，每皿11mL培养基。置于37℃的细胞培养箱中培养48 小时；

(2)Lenti-X-293T长至90％时，开始包装逆转录病毒。按照如下配比，预先配制mix1和mix 2溶液。

Mix 1：无血清DMEM(500μL)+PEI(先配置，静置5min)；

Mix 2：无血清DMEM(500μL)+质粒；

(用量如下表所示)

组分	用量
		无血清DMEM	1mL
pHAGE-334/FMC63-CAR-RFP	9ug
		pMD2.G	3ug
psPAXz	6ug
		PEI(1:2.5)	45ul

将Mix 1缓慢加入Mix 2，轻轻吹打2-3次混匀，室温静置25min，缓慢逐滴加入细胞中，轻摇混匀；

(3)转染后12-18小时换入新鲜10％FBS-DMEM；

(4)转染后48小时和72小时，用荧光显微镜观察转染效率，收取病毒上清，3000rpm离心5min，用0.45um滤膜过滤至提前准备的病毒浓缩管中；

(5)将过滤好的病毒用无血清DMEM补至35mL，并配平，置于超速离心机中；

(6)4℃，20000rpm，离心2h；

(7)弃上清，用无血清1640培养基重悬沉淀，-80℃冻存或直接用于感染。

3.PBMC感染及细胞培养

(1)PBMC感染

PBMC激活48h后，以MOI＝20-40直接向细胞中加入病毒，轻摇混匀， 32℃，1500rpm/分钟离心感染90min，置于37℃的细胞培养箱中培养8-12 小时后每孔离心换液为800μl新鲜的完全培养基(完全培养基:1640培养基 +10％FBS+100IU/mL IL-2)。

(2)根据细胞密度和状态进行相应补液或扩增传代，维持细胞密度在 1-2×10⁶/mL，使用流式细胞仪对T细胞感染效率进行检测。

(3)感染效果监测完成后，利用无感染T细胞对各组别细胞进行感染效率的调整，使各组别细胞感染效率达到一致。

4.Raji细胞(B淋巴细胞瘤)的培养

从液氮罐中取出保存的Raji细胞，置于37℃水浴锅中融化，把冻存的 Raji的细胞转移至15mL离心管中，室温，1500转/分钟，离心5min，弃上清，用含10％FBS的1640完全培养基重悬细胞，并于10cm培养皿中培养扩增。

5.B淋巴细胞瘤移植瘤模型的建立

常规培养肿瘤细胞Raji细胞至合适的数量后，收集细胞并计数，并重悬于PBS中，细胞浓度为3×10⁵个/200μL，并通过尾静脉注射的方法于NSG 小鼠尾静脉注射3×10⁵个细胞悬液，应用小动物活体成像系统观察肿瘤生长情况，待肿瘤生长至荧光强度到5×10⁵P/sec/cm²/sr时，即表明移植瘤模型构建成功。

6.CAR-T细胞对B淋巴细胞瘤移植瘤模型治疗效果研究

经预先培养的334-CAR-T细胞通过尾静脉注射注射方法回输3×10⁶个 CAR-T细胞于NSG小鼠体内。应用小动物活体成像系统观察CAR-T细胞作用肿瘤不同时间段后的生长情况和小鼠体重的变化。

试验结果如图11(a)和(b)所示，图11(a)和(b)显示，334-CAR-T细胞可显著抑制靶细胞的生长，并且与FMC-CAR-T细胞效果相似。

本申请接受各种修改和可替换的形式，具体的实施方式已经在附图中借助于实施例来显示并且已经在本申请详细描述。但是，本申请不意在受限于公开的特定形式。相反，本申请意在包括本申请范围内的所有修改形式、等价物、和可替换物，本申请的范围由所附权利要求及其法律等效物限定。

本发明中列举的数值范围均包括该数值范围的两个端点的数据，也包括该数值范围中具体的每一个数值，并且该数值可以与端点任意组合组成新的小范围。

序列表

<110> 华夏英泰（北京）生物技术有限公司

清华大学

<120> 一种CD19抗原高亲和力的抗体以及包含其CD19单链抗体区的嵌合抗原受体

<130> TPC00482

<141> 2019-07-11

<160> 102

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr Gln Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 2

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu Gly Phe Ile Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Ile His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Phe His Pro Gly Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr His Cys

85 90 95

Thr Arg Gln Leu Gly Pro Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Gln Ser Leu Leu Glu Ser Asp Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Leu Val Ser

1

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 5

Trp Gln Gly Thr Gln Phe Pro Trp Thr

1 5

<210> 6

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 6

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser

20 25

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 7

Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 8

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 8

Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 9

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 10

Gly Phe Ile Phe Thr Asp Tyr Glu

1 5

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 11

Phe His Pro Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 12

Thr Arg Gln Leu Gly Pro Asp

1 5

<210> 13

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 13

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu

20 25

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 14

Ile His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10 15

Ala

<210> 15

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 15

Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys

1 5 10 15

Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp

20 25 30

Ser Ala Val Tyr His Cys

35

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 16

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

1 5 10

<210> 17

<211> 546

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

atgggatctg agaaggcctg gcagcctggc tggacagtca atgtggaggg cagcggggag 60

ctgttccggt ggaatgtttc ggacctaggt ggcctgggct gtggcctgaa gaacaggtcc 120

tcagagggcc ccagctcccc ttccgggaag ctcatgagcc ccaagctgta tgtgtgggcc 180

aaagaccgcc ctgagatctg ggagggagag cctccgtgtc tcccaccgag ggacagcctg 240

aaccagagcc tcagccagga cctcaccatg gcccctggct ccacactctg gctgtcctgt 300

ggggtacccc ctgactctgt gtccaggggc cccctctcct ggacccatgt gcaccccaag 360

gggcctaagt cattgctgag cctagagctg aaggacgatc gcccggccag agatatgtgg 420

gtaatggaga cgggtctgtt gttgccccgg gccacagctc aagacgctgg aaagtattat 480

tgtcaccgtg gcaacctgac catgtcattc cacctggagc tcgagcacca ccaccaccac 540

cactga 564

<210> 18

<211> 181

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 18

Met Gly Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu

1 5 10 15

Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu

20 25 30

Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser

35 40 45

Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro

50 55 60

Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser Leu

65 70 75 80

Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu

85 90 95

Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu

100 105 110

Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu

115 120 125

Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr

130 135 140

Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr

145 150 155 160

Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Leu Glu His

165 170 175

His His His His His

180

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

catgggatct gagaaggcct ggcag 25

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

gctccaggtg gaatgacatg 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

ggatctgaga aggcctggca g 21

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

tcgagctcca ggtggaatga catg 24

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

tttttttttt ttttttttvn 20

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

caggaaacag ctatgacc 18

<210> 26

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

ggccagtgga tagtcagatg ggggtgtcgt tttggc 36

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 27

gatgtgaagc ttcaggagtc 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

caggtgcagc tgaaggagtc 20

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 29

aggttactct gaaagagtc 19

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 30

gaggtccagc tgcaacaatc t 21

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 31

gaggtccagc tgcagcagtc 20

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 32

caggtccaac tgcagcagcc t 21

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 33

gaggtgaagc tggtggagtc 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 34

gaggtgaagc tggtggaatc 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 35

gatgtgaact tggaagtgtc 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 36

gaggtgcagc tggaggagtc 20

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 37

ggatacagtt ggtgcagcat c 21

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 38

gatgttttga tgacccaaac t 21

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 39

gatattgtga tgacgcaggc t 21

<210> 40

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 40

gatattgtga taacccag 18

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 41

gacattgtgc tgacccaatc t 21

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 42

gacattgtga tgacccagtc t 21

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 43

gatattgtgc taactcagtc t 21

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 44

gatatccaga tgacacagac t 21

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 45

gacatccagc tgactcagtc t 21

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 46

caaattgttc tcacccagtc t 21

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 47

gacattctga tgacccagtc t 21

<210> 48

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 48

ggtgagtgtg ggagtggact tggctg 26

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 49

caggctgttg tgactcagga a 21

<210> 50

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 50

accggtgtac attctgctag ccaggttcaa ctgcagcagt ctggg 45

<210> 51

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 51

ggaaccacca ccgccgctgc caccgccacc agagacagtg accagagt 48

<210> 52

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 52

ggcggtggtg gttccggagg cggcggttct gatgttgtga tgacccag 48

<210> 53

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 53

gggctcagaa ccaccaccac cgcggccgct tttgatttcc agcttggt 48

<210> 54

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 54

actgcaaccg gtgtacattc tgctagcgag gtgatgctgg tggag 45

<210> 55

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 55

gcctccggaa ccaccaccgc cgctgccacc gccaccagag acagtgacca gagt 54

<210> 56

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 56

agcggcggtg gtggttccgg aggcggcggt tctattgttc tcacccagtc tcca 54

<210> 57

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 57

ctcagaacca ccaccaccgc ggccgctctc cagcttggtc ccagc 45

<210> 58

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 58

gtagcaactg caaccggtgt acattctgct agccaggtcc aactgcag 48

<210> 59

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 59

ctccggaacc accaccgccg ctgccaccgc cacctgcaga gacagtgac 49

<210> 60

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 60

agcggcggtg gtggttccgg aggcggcggt tctgacatcc agctgactca g 51

<210> 61

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 61

acaagatttg ggctcagaac caccaccacc gcggccgctt ttcagctcca gctt 54

<210> 62

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 62

tagtagcaac tgcaaccggt gtacattctg ctagccaggt gcagttgaag 50

<210> 63

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 63

tccggaacca ccaccgccgc tgccaccgcc accctgagga gacggtgact gag 53

<210> 64

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 64

ggcggtggtg gttccggagg cggcggttct gatattgtga tgacgcag 48

<210> 65

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 65

tttgggctca gaaccaccac caccgcggcc gctttccagc ttggtccccc c 51

<210> 66

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 66

actgcaaccg gtgtacattc tgctagcgag gtccagctgc agcagtct 48

<210> 67

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 67

ggaaccacca ccgccgctgc caccgccacc tgcagagaca gtgaccagag t 51

<210> 68

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 68

gcagcggcgg tggtggttcc ggaggcggcg gttctgacat tctgatgacc cagtct 56

<210> 69

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 69

agatttgggc tcagaaccac caccaccgcg gccgcttttt atctccaact ttgtccc 57

<210> 70

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 70

actgcaaccg gtgtacattc tgctagcgag gtgaagctgg tg 42

<210> 71

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 71

tccggaacca ccaccgccgc tgccaccgcc accagagaca gtgaccag 48

<210> 72

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 72

agcggcggtg gtggttccgg aggcggcggt tctgatattg tgatgacg 48

<210> 73

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 73

tttgggctca gaaccaccac caccgcggcc gcttttcagc tccagctt 48

<210> 74

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 74

actgcaaccg gtgtacattc tgctagcgaa gtgaagctgg tggag 45

<210> 75

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 75

tccggaacca ccaccgccgc tgccaccgcc acctgaggag actgtgag 48

<210> 76

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 76

ggcggtggtg gttccggagg cggcggttct gatattgtga tgacgcag 48

<210> 77

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 77

agaaccacca ccaccgcggc cgctttttat ttccagcttg gt 42

<210> 78

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 78

gcaactgcaa ccggtgtaca ttctgctagc caggtgcagc tgaag 45

<210> 79

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 79

tccggaacca ccaccgccgc tgccaccgcc acctgaggag acggtgac 48

<210> 80

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 80

agcggcggtg gtggttccgg aggcggcggt tctgtgatga cccagtct 48

<210> 81

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 81

tttgggctca gaaccaccac caccgcggcc gcgtttcagt tccagctt 48

<210> 82

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 82

actgcaaccg gtgtacattc tgctagccag gttcaactgc agcagtct 48

<210> 83

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 83

ggaaccacca ccgccgctgc caccgccacc agagacagtg accagagt 48

<210> 84

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 84

ggcggtggtg gttccggagg cggcggttct gacattgtga tgacccag 48

<210> 85

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 85

agaaccacca ccaccgcggc cgcttttgat ttccagcttg gt 42

<210> 86

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 86

ggcagcacca gcggcagcgg caagcccggc agcggcgagg gcagcaccaa gggc 54

<210> 87

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 87

ggtggcggtg gcagcggcgg tggtggttcc ggaggcggcg gttct 45

<210> 88

<211> 75

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 88

ggtggcggtg gcagcggcgg tggtggttcc ggaggcggcg gttctggcgg tggtggttcc 60

ggtggcggtg gcagc 75

<210> 89

<211> 183

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 89

agccacttcg tgccggtctt cctgccagcg aagcccacca cgacgccagc gccgcgacca 60

ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg 120

ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tatctacatc 180

tgg 183

<210> 90

<211> 687

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 90

gagtccaaat atggtccccc atgcccatca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 60

tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 120

gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 180

gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 240

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgar cggcaaggag 300

tacaagtgca aggtctccar caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaam 360

gccamagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 420

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 480

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 540

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag cagktggcag 600

gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 660

aagagcctct ccctgtctct gggtaaa 687

<210> 91

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 91

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

acc 63

<210> 92

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 92

ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt g 81

<210> 93

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 93

ttctggttac ccataggatg tgcagccttt gttgtagtct gcattttggg atgcatactt 60

att 63

<210> 94

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 94

tggctgatca tcttggcatc cctcttggcc ttggctttga ttcttgcagt ttgcattgca 60

gtc 63

<210> 95

<211> 126

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 95

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 96

<211> 123

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 96

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 97

<211> 102

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 97

aaaaagaagt attcatccag tgtgcacgac cctaacggtg aatacatgtt catgagagca 60

gtgaacacag ccaaaaaatc tagactcaca gatgtgaccc ta 102

<210> 98

<211> 111

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 98

cggagggacc agaggctgcc ccccgatgcc cacaagcccc ctgggggagg cagtttccgg 60

acccccatcc aagaggagca ggccgacgcc cactccaccc tggccaagat c 111

<210> 99

<211> 144

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 99

caacgaagga aatatagatc aaacaaagga gaaagtcctg tggagcctgc agagccttgt 60

cgttacagct gccccaggga ggaggagggc agcaccatcc ccatccagga ggattaccga 120

aaaccggagc ctgcctgctc cccc 144

<210> 100

<211> 336

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 100

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 101

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 101

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atccca 66

<210> 102

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 102

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

Claims (31)

1.一种单克隆抗体及其任何抗原结合片段，其包括：

(a)如Seq ID NO：10(GFIFTDYE)所示的氨基酸序列的重链CDR1；

(b)如Seq ID NO：11(FHPGSGGS)所示的氨基酸序列的重链CDR2；

(c)如Seq ID NO：12(TRQLGPD)所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(d)如Seq ID NO：3(QSLLESDGKTY)所示的氨基酸序列的轻链CDR1；

(e)如Seq ID NO：4(LVS)所示的氨基酸序列的轻链CDR2；以及

(f)如Seq ID NO：5(WQGTQFPWT)所示的氨基酸序列的轻链CDR3，

所述抗体特异性地与人CD19结合。

2.根据权利要求1所述的抗体及其任何抗原结合片段，其包括：

如Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的VL结构域；以及

如Seq ID NO：2所示的氨基酸序列的VH结构域。

3.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1或2所述的单克隆抗体及其任何抗原结合片段。

4.一种宿主细胞，其包含根据权利要求3所述的核酸。

5.一种生产单克隆抗体及其任何抗原结合片段的方法，所述方法包括培养根据权利要求4所述的宿主细胞从而生产根据权利要求1或2所述的单克隆抗体及其任何抗原结合片段。

6.杂交瘤细胞334，其保藏号编号为CGMCC No. 17095。

7.权利要求6所述的杂交瘤细胞334分泌的单克隆抗体，其中，所述抗体特异性地与人CD19结合。

8.一种药物组合物，其包含根据权利要求1或2单克隆抗体及其任何抗原结合片段或权利要求7所述的单克隆抗体和药学上可接受的载体。

9.包含CD19单链抗体区(scFv)的嵌合抗原受体(CAR)，所述CD19单链抗体区包括：

(a)如Seq ID NO：10(GFIFTDYE)所示的氨基酸序列的重链CDR1；

(b)如Seq ID NO：11(FHPGSGGS)所示的氨基酸序列的重链CDR2；

(c)如Seq ID NO：12(TRQLGPD)所示的氨基酸序列的重链CDR3；

(d)如Seq ID NO：3(QSLLESDGKTY)所示的氨基酸序列的轻链CDR1；

(e)如Seq ID NO：4(LVS)所示的氨基酸序列的轻链CDR2；以及

(f)如Seq ID NO：5(WQGTQFPWT)所示的氨基酸序列的轻链CDR3。

10.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体，其中，所述CD19单链抗体区包括：

如Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的VL结构域；以及

如Seq ID NO：2所示的氨基酸序列的VH结构域。

11.根据权利要求10所述的嵌合抗原受体，其中，所述CD19单链抗体区的VL结构域和VH结构域通过连接体连接，所述连接体选自m218 Whitlow linker、(G4S)3 linker或(G4S)5linker中的任一种。

12.根据权利要求9~11中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体包括：

信号肽、CD19单链抗体区、hinge区、跨膜区以及胞内T细胞信号传导域。

13.根据权利要求12所述的嵌合抗原受体，其中，

所述hinge区选自CD8-hinge或IgG4 hinge中的任一种。

14.根据权利要求12所述的嵌合抗原受体，其中，

所述跨膜区选自CD8_TM、CD28_TM、ICOS_TM、CD44_TM、TCRα，TCRβ、TCRζ、CD3ε、CD45、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a，CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244,2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A，Ly108)、SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)、BLAME( SLAMF8 )、SELPLG( CD162 )、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D或NKG2C中的任一种。

15.根据权利要求12所述的嵌合抗原受体，其中，

胞内T细胞信号传导域包括共刺激分子以及胞内区，

所述共刺激分子选自41BB、CD28、ICOS、CD27、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、或PD-1中的任一种；

所述胞内区选自CD3、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεR1b)、CD79a、CD79b、FcγRIIa或DAP10中的任一种。

16.根据权利要求15所述的嵌合抗原受体，其中，OX40的序列如Seq ID NO：98所示；CD27的序列如Seq ID NO：99所示；CD3选自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε中的任一种，CD3ζ的序列如Seq ID NO：100所示。

17.根据权利要求12所述的嵌合抗原受体，其中，

所述信号肽选自GM-CSF或CD8α中的任一种。

18.一种分离的核酸，其编码权利要求9~17中任一项所述的嵌合抗原受体。

19.一种载体，其包含权利要求18所述的核酸。

20.一种宿主细胞，其包含权利要求9~17中任一项所述的嵌合抗原受体。

21.根据权利要求20所述的细胞，其选自T细胞、NK细胞、CTL、人胚胎干细胞、淋巴祖细胞和/或T细胞前体细胞。

22.根据权利要求21所述的细胞，其中，所述T细胞选自细胞毒性T细胞、辅助T细胞或抑制T细胞。

23.一种细胞组合物，其包含多个权利要求20~22中任一项所述的细胞。

24.用于制备权利要求20~22中任一项所述的细胞的方法，其包括用权利要求19所述的载体离体转导或转染来自受试者或健康供者的细胞样品的步骤。

25.一种药物组合物，其包含权利要求20~22中任一项所述的细胞，或权利要求23所述的细胞组合物，以及药学可接受载体、稀释剂或赋形剂。

26.权利要求1或2所述的单克隆抗体及其任何抗原结合片段、权利要求7所述的单克隆抗体、权利要求3所述的核酸、权利要求4所述的细胞、权利要求5所述的方法生产的单克隆抗体及其任何抗原结合片段或权利要求8所述的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述癌症是白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤。

27.根据权利要求26所述的用途，其中，所述淋巴瘤是霍其金淋巴瘤(HL)、非霍其金淋巴瘤(NHL)、Burkitt淋巴瘤。

28.根据权利要求26所述的用途，其中，所述白血病包括：急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、慢性粒细胞白血病，所述淋巴瘤包括：弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤。

29.权利要求9-17中任一项所述的嵌合抗原受体(CAR)、权利要求18所述的核酸、权利要求19所述的载体、权利要求20~22中任一项所述的细胞、权利要求23所述的细胞组合物或权利要求25所述的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述癌症是白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤。

30.根据权利要求29所述的用途，其中，所述淋巴瘤是霍其金淋巴瘤(HL)、非霍其金淋巴瘤(NHL)、Burkitt淋巴瘤。

31.根据权利要求29所述的用途，其中，所述白血病包括：急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、慢性粒细胞白血病，所述淋巴瘤包括：弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤。

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