CN114853902B

CN114853902B - 嵌合抗原受体及其表达基因、car修饰的nk细胞和应用

Info

Publication number: CN114853902B
Application number: CN202210345918.4A
Authority: CN
Inventors: 刘韬
Original assignee: Beijing Mercer Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Mercer Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-04-02
Filing date: 2022-04-02
Publication date: 2023-06-16
Anticipated expiration: 2042-04-02
Also published as: CN114853902A

Abstract

本申请涉及细胞免疫技术领域，提供了一种嵌合抗原受体，包括依次连接的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，该胞外结构域含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。该嵌合抗原受体可以特异性靶向识别并结合肿瘤细胞，避免肿瘤细胞的免疫逃逸，因而该上述嵌合抗原受体以及可以表达该嵌合抗原受体的表达基因、表达载体、CAR修饰的NK细胞可以用于制备抗肿瘤药物，显著缩减细胞治疗周期和治疗成本，在临床上具有很好的应用前景。

Description

嵌合抗原受体及其表达基因、CAR修饰的NK细胞和应用

技术领域

本申请属于细胞免疫技术领域，尤其涉及一种嵌合抗原受体及其表达基因、CAR修饰的NK细胞和应用。

背景技术

近年来，免疫细胞治疗技术已成为继传统的手术疗法、化疗和放疗后最具前景的研究方向之一。免疫细胞治疗是通过采集人体自身免疫细胞，经过体外培养扩增及改造使其靶向性及杀伤功能增强，后回输到患者体内实现治疗效果。目前，免疫细胞疗法主要包括自然杀伤细胞(Natural killer，NK)、嵌合抗原受体修饰NK细胞(CAR-NK)、T细胞受体修饰的T细胞(TCR-T)和嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T)等。截至2021年5月，全球已有近1300多项关于CAR-T的临床试验证明了CAR-T细胞疗法在癌症治疗特别是血液肿瘤治疗中的巨大优势，然而其对实体瘤的治疗效果却十分有限。不同于血液瘤，实体瘤能够构建具有免疫抑制特性的肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)，从而影响CAR-T疗法的功效。TME免疫抑制性改变会阻止免疫细胞向病灶的运输及T淋巴细胞对肿瘤的浸润，少数能够浸润实体瘤的T细胞免疫反应仍可能受到微环境中免疫抑制细胞或抑制因子的限制。基于CAR-T细胞疗法在临床应用中的优势，研究人员尝试并成功改造其他工程化CAR免疫细胞，试图克服CAR-T治疗的局限性，为实体瘤治疗提供新的方向。其中，嵌合抗原受体修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK)被认为是一种有前途的细胞类型。

自然杀伤细胞是人体先天免疫的核心组成部分，是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。NK细胞可非特异性直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex，MHC)限制。NK细胞不仅与抗肿瘤、抗病毒感染、清除体内衰老细胞和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。与T细胞相比，NK细胞的优点有：1)NK细胞通过MHC非限制性的方式杀伤肿瘤细胞，因此可以使用异体NK细胞进行治疗，而不会在受试者(患者)体内引起排异反应；2)NK细胞主要分泌IFN-γ和GM-CSF，不分泌IL-6、IL-10等炎症因子，不易引起细胞因子风暴；3)由于血脑屏障的存在，NK细胞无法进入人体大脑，不会攻击神经系统，神经毒性低；4)NK细胞可通过细胞表面的杀伤活化性受体和杀伤抑制性受体的平衡来调节杀伤功能，杀伤速度快，杀伤效率高，杀瘤谱广；5)NK细胞可通过其细胞表面的CD16分子发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)；6)NK细胞驻留部位主要是外周淋巴系统黏膜、淋巴道和血液，因此非常适用于治疗经淋巴道转移和血液转移的肿瘤；7)NK细胞不回胸腺，不受调节性Treg细胞的抑制。因此，将NK细胞作为效应细胞对于肿瘤的免疫治疗有着重要的临床意义。

尽管CAR-NK有很大的潜力成为一种强有力的肿瘤免疫治疗方法，但要达到预期的临床效果还需要克服许多障碍。(1)与健康人体内的NK细胞相比，肿瘤患者体内的NK细胞通常处于功能失调的状态。以髓系血液肿瘤为例，在调节性T细胞(Tregs)、骨髓源性抑制细胞(MDSC)和肿瘤细胞的参与下，NK细胞表面NKG2D等关键杀伤活化性受体下调或丢失；NK细胞内杀伤抑制性信号增强；肿瘤微环境中的活性氧(ROS)诱导NK细胞凋亡，导致NK细胞的细胞毒性和细胞因子分泌功能减弱，最终导致肿瘤的免疫逃逸。(2)NK细胞的增殖能力和体内持久性有限。(3)由于NK细胞对基因工程的抗性，因此如何将嵌合抗原受体(CAR)高效转导至NK细胞中是CAR-NK细胞免疫治疗的关键。(4)与CAR-T一样，实体瘤微环境对免疫细胞的阻碍和抑制也限制了CAR-NK在实体瘤中的应用。(5)实体瘤的异质性限制了靶向单一肿瘤抗原的CAR-NK细胞的疗效。

发明内容

本申请的目的在于提供一种嵌合抗原受体及其表达基因、CAR修饰的NK细胞和应用，旨在解决如何增强对PD-L1阳性肿瘤细胞的靶向性和杀伤活性，以提高肿瘤的免疫效果的技术问题。

为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：

第一方面，本申请提供一种嵌合抗原受体，包括依次连接的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述胞外结构域含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

在一实施例中，SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列编码得到。

在一实施例中，所述嵌合抗原受体由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成；或者，所述嵌合抗原受体由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成。

在一实施例中，SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的嵌合抗原受体由SEQ IDNo.5所示的核苷酸序列编码得到；或者，SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的嵌合抗原受体由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列编码得到。

第二方面，本申请提供一种表达基因，所述表达基因表达本申请所述的嵌合抗原受体。

第三方面，本申请提供一种表达载体，所述表达载体含有本申请所述的表达本申请嵌合抗原受体的表达基因。

在一实施例中，所述表达载体为慢病毒载体。

第四方面，本申请提供一种CAR修饰的NK细胞，所述NK细胞中能表达本申请所述的嵌合抗原受体，或者所述NK细胞中导入了本申请所述的表达基因，或者所述NK细胞中转染了本申请所述的表达载体。

在一实施例中，所述NK细胞通过利用本申请所述的表达基因修饰诱导性多能干细胞得到。

第五方面，本申请还提供本申请所述的嵌合抗原受体、本申请所述的表达基因、本申请所述的表达载体、或本申请所述的NK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

本申请提供一种嵌合抗原受体，其中胞外结构域含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，该特有的序列是对肿瘤细胞表面的PD-L1分子具有高亲和力的PD-L1 scFv抗体，这样，本申请的嵌合抗原受体靶向PD-L1，可以特异性靶向识别并结合肿瘤细胞，避免肿瘤的免疫逃逸，而且本申请还设计可以表达该嵌合抗原受体的表达基因，表达载体，CAR修饰的NK细胞；因此，本申请上述嵌合抗原受体、表达基因、表达载体、CAR修饰的NK细胞可以用于制备抗肿瘤药物，显著缩减细胞治疗周期和治疗成本，在临床上具有很好的应用前景。

附图说明

图1是本申请实施例提供的PD-L1-CAR慢病毒载体图谱；

图2是本申请实施例提供的PD-L1-GFP-CAR慢病毒载体图谱；

图3是本申请实施例提供的PD-L1-γδTCR-CAR慢病毒载体图谱；；

图4是本申请实施例提供的PD-L1-γδTCR-GFP-CAR慢病毒载体图谱；

图5是本申请实施例提供的PD-L1-CAR慢病毒表达质粒(图左a)和PD-L1-γδTCR-CAR慢病毒表达质粒(图右b)的酶切鉴定图；其中，M是DNA Marker泳道，1是质粒酶切前泳道，2是质粒酶切后泳道；

图6是本申请实施例提供的GFP⁺PD-L1-CAR-iPSCs(图左a)和GFP⁺PD-L1-γδTCR-CAR-iPSCs(图右b)的细胞流式检测图；

图7是本申请实施例提供的PD-L1-CAR-iPSCs细胞诱导分化HSCs细胞表型的流式检测图；其中，a是CD34⁺CD43⁺HSCs细胞表型的流式检测，b是CD34⁺CD45⁺HSCs细胞表型的流式检测；

图8是本申请实施例提供的PD-L1-γδTCR-CAR-iPSCs细胞诱导分化HSCs细胞表型的流式检测图；其中，a是CD34⁺CD43⁺HSCs细胞表型的流式检测，b是CD34⁺CD45⁺HSCs细胞表型的流式检测；

图9是本申请实施例提供的PD-L1-CAR-iNK(图左a)和PD-L1-γδTCR-CAR-iNK(图右b)细胞表型的流式检测图；

图10是本申请实施例提供的肺癌细胞表面PD-L1表达的流式检测图；其中，a是肺癌细胞A549的流式检测，b是肺癌细胞H1299的流式检测；

图11是本申请实施例提供的PD-L1-CAR-iNK细胞杀伤肺癌细胞的流式检测图；其中，a是肺癌细胞A549的流式检测，b是肺癌细胞H1299的流式检测；

图12是本申请实施例提供的PD-L1-γδTCR-CAR-iNK细胞杀伤肺癌细胞的流式检测图；其中，a是肺癌细胞A549的流式检测，b是肺癌细胞H1299的流式检测。

具体实施方式

为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。

本申请实施例提供一种嵌合抗原受体，包括依次连接的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，而胞外结构域含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

本申请实施例提供的嵌合抗原受体是一种靶向PD-L1的嵌合抗原受体，其中的该SEQ ID No.1所示的特有氨基酸序列可以作为PD-L1 scFv抗体，对肿瘤细胞表面的PD-L1分子具有高亲和力，这样，本申请的嵌合抗原受体可以特异性靶向识别并结合肿瘤细胞，避免肿瘤的免疫逃逸，而且能表达该嵌合抗原受体的相关表达基因、表达载体、CAR修饰的NK细胞，可以用于治理肿瘤，能显著缩减细胞治疗周期和治疗成本，在临床上具有很好的应用前景。

在一实施例中，上述嵌合抗原受体由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成，即该靶向PD-L1的嵌合抗原受体是由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。其中，第1号～第22号氨基酸是为信号肽(Signal Peptides，SP)片段，而第23号～284号氨基酸为SEQ IDNo.1所示的scFv抗体，第285号～第355号氨基酸为CD8α结构域，第356号～第397号氨基酸为41BB胞内结构域，第397号～第449号氨基酸为DAP12-ITAM结构域。该嵌合抗原受体可以很好地在CAR修饰的NK细胞中表达。

在一实施例中，上述嵌合抗原受体由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成，即该嵌合抗原受体是由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质，其特异性识别肿瘤细胞表面的PD-L1分子和磷酸化抗原分子，因此是双靶向的嵌合抗原受体。具体地，第1号～第22号氨基酸是为信号肽SP片段，第23号～556号氨基酸为肿瘤细胞表面高表达的磷酸化抗原小分子识别序列γδTCR，第557号～574号氨基酸为自裂解多肽T2A，第575号～596号氨基酸为SP片段，第597号～858号氨基酸为特异性识别肿瘤细胞表面的PD-L1标志物的PD-L1scFv抗体，第858号～第929号氨基酸为CD8α结构域，第930号～第971号氨基酸为41BB胞内结构域，第972号～第1023号氨基酸为DAP12-ITAM结构域。该嵌合抗原受体可以很好地在CAR修饰的NK细胞中表达。该双靶向的嵌合抗原受体表达后能够通过TCRγ链以及TCRδ链识别高代谢恶性肿瘤磷酸化抗原小分子，从而靶向结合肿瘤细胞，如此进一步激活CAR下游信号PD-L1scFv抗体，从而杀伤肿瘤细胞，通过两者的配合，使得该双靶向的嵌合抗原受体能够更快速、且特异性的识别肿瘤细胞，以避免肿瘤的免疫逃逸；因此，本申请实施例的上述双靶向的嵌合抗原受体、表达该双靶向的嵌合抗原受体的CAR修饰的NK细胞可以用于治疗肿瘤，大大缩减细胞治疗周期和治疗成本，在临床上具有很好的应用前景。

对应，SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列编码得到，即SEQ ID No.4所示的核苷酸序列编码该靶向PD-L1的嵌合抗原受体中的PD-L1 scFv抗体。进一步地，该SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的嵌合抗原受体可以由SEQ ID No.5所示的核苷酸序列编码得到，即SEQ ID No.5所示的核苷酸序列编码该嵌合抗原受体整个蛋白。进一步地，该SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的嵌合抗原受体可以由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列编码得到，即SEQ ID No.6所示的核苷酸序列编码该嵌合抗原受体整个蛋白。

SEQ ID NO.1：

MKHLWFFLLLVAAPRWVLSEVKLQESGPSLVRPGASVKISCKASAYSFTSYWMHWVKQRPGQGLDWIGMIDPSDSEARLNQKFKDKATLTVDKSSSTTYIHLSSPTSEDSAVYYCARSYGYDGDYYLDVWGAGTTVTVSSGGGSGGGSGGGSGGGSDIVMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIQYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDYLRTFGGGTKLEIK。

SEQ ID NO.2：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPMKHLWFFLLLVAAPRWVLSEVKLQESGPSLVRPGASVKISCKASAYSFTSYWMHWVKQRPGQGLDWIGMIDPSDSEARLNQKFKDKATLTVDKSSSTTYIHLSSPTSEDSAVYYCARSYGYDGDYYLDVWGAGTTVTVSSGGGSGGGSGGGSGGGSDIVMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIQYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDYLRTFGGGTKLEIKAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKSPGG。

SEQ ID NO.3：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPMLSLLHASTLAVLGALCVYGAGHLEQPQISSTKTLSKTARLECVVSGITISATSVYWYRERPGEVIQFLVSISYDGTVRKESGIPSGKFEVDRIPETSTSTLTIHNVEKQDIATYYCALWEAQQELGKKIKVFGPGTKLIITDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWEEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEKSLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMDPKDNCSKDANDTLLLQMQRISSLIHLSLFWAGVMSAIELVPEHQTVPVSIGVPATLRCSMKGEAIGNYYINWYRKTQGNTMTFIYREKDIYGPGFKDNFQGDIDIAKNLAVLKILAPSERDEGSYYCACDTLGMGGEYTDKLIFGKGTRVTVEPRSQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFEVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEKEGRGSLLTCGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPMKHLWFFLLLVAAPRWVLSEVKLQESGPSLVRPGASVKISCKASAYSFTSYWMHWVKQRPGQGLDWIGMIDPSDSEARLNQKFKDKATLTVDKSSSTTYIHLSSPTSEDSAVYYCARSYGYDGDYYLDVWGAGTTVTVSSGGGSGGGSGGGSGGGSDIVMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIQYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDYLRTFGGGTKLEIKAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKSPGG。

SEQ ID NO.4：

atgaagcacctgtggttctttctgctgctggtggccgcccccagatgggtgctgtccgaggtgaagctgcaggagtcaggacctagcctggttaggcctggggcttcagtgaagatatcctgcaaggcttctgcttactcattcaccagctactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggtcttgactggattggcatgattgatccttccgacagtgaagctaggttaaatcagaagttcaaggacaaggccacattgactgtagacaaatcctccagtacaacctacattcacctcagcagcccgacatctgaggactctgcggtctattactgtgcaagatcttatggttacgacggggactactacctcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctcaggcggcggcagcggcggcggctctggaggaggatctggcggcggaagcgatattgtgatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctctgggaggcaaagtcaccatcacttgcaaggcaagccaagacattaacaaatatatagcttggtaccaacacaagcctggaaaaggtcctaggctgctcatacagtacacatctacattacagccaggcatcccatcaaggttcagtggaagtgggtctgggagagattattccttcagcatcagcaacctggagcctgaagatattgcaacttattattgtctacagtatgattatcttcggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa。

SEQ ID NO.5：

atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccaatgaagcacctgtggttctttctgctgctggtggccgcccccagatgggtgctgtccgaggtgaagctgcaggagtcaggacctagcctggttaggcctggggcttcagtgaagatatcctgcaaggcttctgcttactcattcaccagctactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggtcttgactggattggcatgattgatccttccgacagtgaagctaggttaaatcagaagttcaaggacaaggccacattgactgtagacaaatcctccagtacaacctacattcacctcagcagcccgacatctgaggactctgcggtctattactgtgcaagatcttatggttacgacggggactactacctcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctcaggcggcggcagcggcggcggctctggaggaggatctggcggcggaagcgatattgtgatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctctgggaggcaaagtcaccatcacttgcaaggcaagccaagacattaacaaatatatagcttggtaccaacacaagcctggaaaaggtcctaggctgctcatacagtacacatctacattacagccaggcatcccatcaaggttcagtggaagtgggtctgggagagattattccttcagcatcagcaacctggagcctgaagatattgcaacttattattgtctacagtatgattatcttcggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttacaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgcggctggtccctcgggggcgaggggctgcggaggcagcgacccggaaacagcgtatcactgagaccgagtcgccttatcaggagctccagggtcagaggtcggatgtctacagcgacctcaacacacagaggccgtattacaaatcccccggggga。

SEQ ID NO.6：

atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccaatgctgtcactgctccacgcatcaacgctggcagtccttggggctctgtgtgtatatggtgcaggtcacctagagcaacctcaaatttccagtactaaaacgctgtcaaaaacagcccgcctggaatgtgtggtgtctggaataacaatttctgcaacatctgtatattggtatcgagagagacctggtgaagtcatacagttcctggtgtccatttcatatgacggcactgtcagaaaggaatccggcattccgtcaggcaaatttgaggtggataggatacctgaaacgtctacatccactctcaccattcacaatgtagagaaacaggacatagctacctactactgtgccttgtgggaggcccagcaagagttgggcaaaaaaatcaaggtatttggtcccggaacaaagcttatcattacagataaacaacttgatgcagatgtttcccccaagcccactatttttcttccttcaattgctgaaacaaagctccagaaggctggaacatacctttgtcttcttgagaaatttttccctgatgttattaagatacattgggaagaaaagaagagcaacacgattctgggatcccaggaggggaacaccatgaagactaatgacacatacatgaaatttagctggttaacggtgccagaaaagtcactggacaaagaacacagatgtatcgtcagacatgagaataataaaaacggagttgatcaagaaattatctttcctccaataaagacagatgtcatcacaatggatcccaaagacaattgttcaaaagatgcaaatgatacactactgctgcagatgcagaggatctcctccctcatccatctctctctcttctgggcaggagtcatgtcagccattgagttggtgcctgaacaccaaacagtgcctgtgtcaataggggtccctgccaccctcaggtgctccatgaaaggagaagcgatcggtaactactatatcaactggtacaggaagacccaaggtaacacaatgactttcatataccgagaaaaggacatctatggccctggtttcaaagacaatttccaaggtgacattgatattgcaaagaacctggctgtacttaagatacttgcaccatcagagagagatgaagggtcttactactgtgcctgtgacaccttggggatggggggggaatacaccgataaactcatctttggaaaaggaacccgtgtgactgtggaaccaagaagtcagcctcataccaaaccatccgtttttgtcatgaaaaatggaacaaatgtcgcttgtctggtgaaggaattctaccccaaggatataagaataaatctcgtgtcatccaagaagataacagagtttgatcctgctattgtcatctctcccagtgggaagtacaatgctgtcaagcttggtaaatatgaagattcaaattcagtgacatgttcagttcaacacgacaataaaactgtgcactccactgactttgaagtgaagacagattctacagatcacgtaaaaccaaaggaaactgaaaacacaaagcaaccttcaaagagctgccataaacccaaagccatagttcataccgagaaggagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggacctatgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccaatgaagcacctgtggttctttctgctgctggtggccgcccccagatgggtgctgtccgaggtgaagctgcaggagtcaggacctagcctggttaggcctggggcttcagtgaagatatcctgcaaggcttctgcttactcattcaccagctactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggtcttgactggattggcatgattgatccttccgacagtgaagctaggttaaatcagaagttcaaggacaaggccacattgactgtagacaaatcctccagtacaacctacattcacctcagcagcccgacatctgaggactctgcggtctattactgtgcaagatcttatggttacgacggggactactacctcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctcaggcggcggcagcggcggcggctctggaggaggatctggcggcggaagcgatattgtgatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctctgggaggcaaagtcaccatcacttgcaaggcaagccaagacattaacaaatatatagcttggtaccaacacaagcctggaaaaggtcctaggctgctcatacagtacacatctacattacagccaggcatcccatcaaggttcagtggaagtgggtctgggagagattattccttcagcatcagcaacctggagcctgaagatattgcaacttattattgtctacagtatgattatcttcggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttacaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgcggctggtccctcgggggcgaggggctgcggaggcagcgacccggaaacagcgtatcactgagaccgagtcgccttatcaggagctccagggtcagaggtcggatgtctacagcgacctcaacacacagaggccgtattacaaatcccccggggga。

相应地，本申请实施例提供一种表达基因，该表达基因表达本申请实施例的上述靶向PD-L1的嵌合抗原受体。具体地，当靶向PD-L1的嵌合抗原受体含有SEQ ID No.1所示PD-L1 scFv抗体时，该表达基因含有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。而当靶向PD-L1的嵌合抗原受体为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白时，该表达基因含有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。而当双靶向的嵌合抗原受体为SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白时，该表达基因含有SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。

本申请实施例可以利用该表达基因对人iPSCs进行基因修饰，筛选出稳定表达PD-L1-CAR的iPSCs，大量扩增后作为后续CAR修饰的NK细胞的种子细胞。从而可避免使用肿瘤患者自体NK细胞，制备出通用型的CAR-NK细胞，大大缩减细胞治疗周期和治疗成本。

相应地，本申请实施例还提供一种表达载体，该表达载体含有本申请实施例的表达上述嵌合抗原受体的表达基因。进一步地，该表达载体为慢病毒载体。

相应地，本申请实施例还提供一种CAR修饰的NK细胞，该CAR修饰的NK细胞中能表达本申请实施例的嵌合抗原受体，或者该CAR修饰的NK细胞中导入了本申请实施例的表达基因，或者该CAR修饰的NK细胞中转染了本申请实施例的表达载体。

具体地，本申请实施例中的CAR修饰的NK细胞通过利用本申请实施例的表达基因修饰诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)得到。进一步地，可以通过健康的人外周血单个核细胞(PBMCs)来制备具有无限增殖能力的诱导性多能干细胞。人iPSCs来源的CAR修饰的NK细胞以PD-L1作为靶点，在体外可对PD-L1阳性的非小细胞肺癌细胞株发挥高效的识别和杀伤作用，避免肿瘤的免疫逃逸。本申请实施例可以利用表达上述靶向PD-L1的嵌合抗原受体的表达基因对人iPSCs进行基因修饰，筛选出稳定表达该嵌合抗原受体的iPSCs，大量扩增后作为后续CAR修饰的NK细胞的种子细胞；体外对种子细胞进行诱导分化，得到人iPSCs来源的CAR修饰的NK细胞(如PD-L1-CAR-iNK、PD-L1-γδTCR-CAR-iNK)，这样可避免使用肿瘤患者自体NK细胞，制备出通用型的CAR-NK细胞，从而缩减细胞治疗周期和治疗成本。

最后，本申请实施例还提供上述嵌合抗原受体、上述表达该嵌合抗原受体的表达基因、表达载体、CAR修饰的NK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

下面结合具体实施例进行说明。

实施例1慢病毒载体的构建和制备

(1)慢病毒载体的构建

通过筛选出PD-L1的高亲和力scFv抗体，测定其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的，对应编码的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，按照Genebank(NCBI)中CD8α、41BB及DAP12-ITAM序列设计合成PD-L1-CAR序列(如SEQ ID No.5所示)：从5’端到3’端依次为信号肽SP、PD-L1 scFv、CD8α、41BB、DAP12。将PD-L1-CAR序列分别克隆到pLVX-EF1α和pLVX-EF1α-AcGFP1-N1表达质粒载体中，获得PD-L1-CAR慢病毒载体(如图1所示)、PD-L1-GFP-CAR慢病毒载体(如图2所示)。

相应地，设计合成PD-L1-γδTCR-CAR序列(如SEQ ID No.6所示)：从5’端到3’端依次是信号肽SP、人γδTCR、裂解肽T2A、信号肽SP、PD-L1 scFv抗体、CD8α、41BB胞内功能区及DAP12-ITAM。并获得PD-L1-γδTCR-CAR慢病毒载体(图3)以及PD-L1-γδTCR-GFP-CAR慢病毒载体(图4)。

利用限制性内切酶EcoRI和BamHI对构建的两种慢病毒载体进行切割，用1.2％琼脂糖凝胶在120V的电压下电泳40分钟进行检测，分析电泳条带以判断重组的PD-L1-CAR慢病毒表达质粒和PD-L1-γδTCR-CAR慢病毒表达质粒是否分别正确插入PD-L1基因片段和PD-L1-γδTCR基因片段，电泳检测结果如图5所示；a的结果表明PD-L1-CAR慢病毒表达质粒已成功插入PD-L1片段，b的结果表明PD-L1-γδTCR-CAR慢病毒表达质粒已成功插入PD-L1-γδTCR片段。

(2)慢病毒的制备

PD-L1-CAR慢病毒的制备：将上述得到的PD-L1-CAR慢病毒载体、PD-L1-GFP-CAR慢病毒载体与慢病毒包装载体pMD2.G、psPAX2一起共转染293T细胞，制备PD-L1-CAR慢病毒和PD-L1-GFP-CAR慢病毒。当293T细胞融合度为70％-80％时进行慢病毒的包装。在慢病毒包装的24h，48h时收集病毒上清，4000rpm离心10min，0.45um滤膜过滤除去细胞碎片，4℃，25000rpm超高速离心2h，获得慢病毒浓缩液，分装后置于-80℃保存。PD-L1-γδTCR-CAR慢病毒的制备与上述PD-L1-CAR慢病毒的制备方法相同。

实施例2 PD-L1-CAR-iPSCs和PD-L1-γδTCR-CAR-iPSCs的制备

利用上述制备的PD-L1-CAR慢病毒感染iPSCs细胞：选取本实验室已成功重编程的健康志愿者PBMCs来源iPSCs，复苏并扩增培养后，利用PD-L1-CAR慢病毒感染iPSCs细胞(感染复数MOI＝60)，并在感染后48小时用嘌呤霉素(0.25μg/ml)处理3天，以筛选出稳定表达PD-L1-CAR的iPSCs克隆，构建PD-L1-CAR-iPSCs稳定细胞系，大量扩增后，冻存至液氮中备用。此外，利用上述制备的PD-L1-GFP-CAR慢病毒通过相同方法感染iPSCs细胞，对获得的PD-L1-CAR-GFP-iPSCs进行流式检测，以确定PD-L1-CAR慢病毒的感染效率。

利用上述制备的PD-L1-γδTCR-CAR慢病毒感染iPSCs细胞：利用PD-L1-CAR慢病毒感染iPSCs细胞(MOI＝50)，并在感染后48小时用嘌呤霉素(0.2μg/ml)处理3天，以筛选出稳定表达PD-L1-CAR的iPSCs克隆，构建PD-L1-CAR-iPSCs稳定细胞系，大量扩增后，冻存至液氮中备用。利用PD-L1-γδTCR-GFP-CAR慢病毒通过相同方法感染iPSCs细胞。

通过检测GFP⁺PD-L1-CAR-iPSCs和GFP⁺PD-L1-γδTCR-CAR-iPSCs细胞的比例，间接检测PD-L1-CAR慢病毒和PD-L1-γδTCR-CAR慢病毒对iPSCs细胞的感染效率，结果如图6所示，从图可以看出，GFP⁺PD-L1-CAR-iPSCs细胞的比例达到79.82％，GFP⁺PD-L1-γδTCR-CAR-iPSCs细胞的比例达到79.34％。

实施例3 CAR修饰的NK细胞的制备

(1)造血干细胞(HSC)的诱导及鉴定

1)包被

第-1天：用10μg/mL人源重组层粘连蛋白Laminin-521(BioLamina，LN521-03)包被六孔板，封口膜封好后，平放至2-8℃冰箱中，过夜包被。

2)诱导

第0天：取出六孔板中培养的PD-L1-CAR-iPSCs细胞(或者PD-L1-γδTCR-CAR-iPSCs细胞)，弃培养基上清，杜氏磷酸盐缓冲液DPBS洗1遍，加入1mL含10μM Rho相关激酶(ROCK)抑制剂Y-27632的胚胎干细胞专用无血清完全培养基NutriStem hESC XF(Biological Industries，05-100-1A)。在显微镜下用5号胰岛素注射针头将一个克隆团划分成5-8块，再用200μL枪头吸取克隆团碎片，均匀滴入上述准备好的包被容器中，接种密度10-20个克隆/cm²。置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂培养箱中培养；

第1天：弃去上清，加入1mL造血干细胞诱导分化培养基(Stem CellTechnologies，05310)Medium A；第2天：Medium A半量换液；第3天：用造血干细胞诱导分化培养基(Stem Cell Technologies，05310)Medium B全量换液；第5天：用Medium B半量换液；第7天：用Medium B半量换液；第10天：用Medium B半量换液；第21天：造血干细胞收获。

3)流式检测表型

将1×10⁶个上述收获的诱导分化造血干细胞用DPBS洗涤一次后，分别用CD34-APC/CD43-PE、CD34-APC/CD45-PE流式抗体室温避光孵育20min，1200rpm 5min离心，弃上清，DPBS洗涤1次后，0.5mL DPBS重悬，流式细胞仪检测CD34⁺CD43⁺、CD34⁺CD45⁺细胞比例。

结果如图7所示，PD-L1-CAR-iPSCs细胞向造血干细胞的诱导中，CD34⁺CD43⁺HSCs细胞比例为67.17％，CD34⁺CD45⁺HSCs细胞比例为66.39％；如图8所示，PD-L1-γδTCR-CAR-iPSCs细胞向造血干细胞的诱导中，CD34⁺CD43⁺HSCs细胞比例为80.96％，CD34⁺CD45⁺HSCs细胞比例为80.08％。结果证明本实施例通过诱导分化成功获得了人iPSCs来源的HSCs。

(2)造血干细胞向NK细胞的诱导分化及鉴定

1)诱导分化

取1×10⁴个PD-L1-CAR-iPSCs(或PD-L1-γδTCR-CAR-iPSCs)细胞诱导分化获得的HSCs细胞，离心后用500μL新鲜配制的NK细胞分化完全培养基(无血清扩增培养基SFEM培养基+5ng/mL IL-3(该成分只在第一周添加)+10ng/mL IL-15+20ng/mL IL-7+10ng/mL SCF+10ng/mL FLT3L)重悬，接种至24孔板中。每周半量换液，28-32天诱导分化为NK细胞，收获CAR修饰的NK细胞(分别是PD-L1-CAR-iNK和PD-L1-γδTCR-CAR-iNK)进行后续实验。

2)CAR修饰的NK细胞的扩增

利用NK细胞处理试剂盒(默赛尔生物)对上述获得的CAR修饰的NK细胞进行扩增，具体步骤参考使用说明书。

3)流式检测表型

取1×10⁶个CAR修饰的NK细胞用DPBS洗涤一次后，用CD3-FITC、CD56-PE流式抗体室温避光孵育20min，1200rpm 5min离心，弃上清，DPBS洗涤1次后，0.5mL DPBS重悬，流式细胞仪检测CD3^-CD56⁺NK细胞比例。

结果如图9所示，PD-L1-CAR-iNK细胞表面CD3、CD56的表达中，CD3^-CD56⁺NK细胞比例为71.61％；PD-L1-γδTCR-CAR-iNK细胞表面CD3、CD56的表达中，CD3^-CD56⁺NK细胞比例为76.78％。如此证明本实施例通过诱导分化成功获得了人iPSCs来源的NK细胞。

实施例4体外肺癌细胞的杀伤试验

(1)肺癌细胞A549和H1299表面PD-L1表达的检测

收集肺癌细胞A549和H1299，用PD-L1-FITC抗体(393605，Biolegend)在室温下避光孵育20分钟后，利用流式细胞仪检测并分析A549和H1299细胞表面PD-L1的表达。结果如图10所示，PD-L1⁺A549细胞比例为7.56％，PD-L1⁺H1299细胞比例为86.18％。结果表明：肺癌细胞A549表面低表达PD-L1分子，而肺癌细胞H1299细胞表面高表达PD-L1分子。

(2)体外对肺癌细胞的杀伤功能检测

肺癌细胞A549和H1299用DIO染料标记，与CAR修饰的NK细胞(PD-L1-CAR-iNK细胞或PD-L1-γδTCR-CAR-iNK细胞)以1:5的比例(细胞数量比)共培养。4小时后，用胰蛋白酶处理细胞，转移到流式管中，1200rpm离心5min，弃上清，PBS洗涤一遍后用500uL PBS重悬细胞，每管各加10uL PI染液(浓度0.5mg/ml)，4℃染色15分钟，用流式细胞仪检测并分析PD-L1-CAR-iNK对肺癌细胞的杀伤功能。

结果如图11所示，PD-L1-CAR-iNK细胞对PD-L1低表达A549细胞的杀伤比例为40.04％，对PD-L1高表达H1299细胞的杀伤比例为69.45％；如图12所示：PD-L1-γδTCR-CAR-iNK细胞对PD-L1低表达A549细胞的杀伤比例为52.67％，对PD-L1高表达H1299细胞的杀伤比例为86.47％。如此说明：PD-L1-CAR-iNK细胞和PD-L1-γδTCR-CAR-iNK细胞对PD-L1阳性的肺癌细胞有更强大、更特异性的细胞毒性。

以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 北京默赛尔生物科技有限责任公司

<120> 嵌合抗原受体及其表达基因、CAR修饰的NK细胞和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 262

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Val Leu Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Ala Tyr Ser Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Asp Trp Ile Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Ala Arg Leu Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Thr Tyr Ile His Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Gly Tyr Asp Gly Asp Tyr Tyr Leu Asp

115 120 125

Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr

165 170 175

Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr

180 185 190

Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile Gln Tyr Thr Ser

195 200 205

Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala

225 230 235 240

Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Tyr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly

245 250 255

Thr Lys Leu Glu Ile Lys

260

<210> 2

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu

20 25 30

Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser

35 40 45

Gly Pro Ser Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys

50 55 60

Ala Ser Ala Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln

65 70 75 80

Arg Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp

85 90 95

Ser Glu Ala Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr

100 105 110

Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Thr Tyr Ile His Leu Ser Ser Pro Thr

115 120 125

Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Gly Tyr Asp

130 135 140

Gly Asp Tyr Tyr Leu Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly

165 170 175

Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser

180 185 190

Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn

195 200 205

Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu

210 215 220

Leu Ile Gln Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe

225 230 235 240

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu

245 250 255

Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Tyr Leu

260 265 270

Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ala Lys Pro Thr

275 280 285

Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser

290 295 300

Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly

305 310 315 320

Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp

325 330 335

Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile

340 345 350

Thr Leu Tyr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

355 360 365

Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser

370 375 380

Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Leu Val

385 390 395 400

Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile

405 410 415

Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp

420 425 430

Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr Lys Ser Pro Gly

435 440 445

Gly

<210> 3

<211> 1023

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Met Leu Ser Leu Leu His Ala Ser Thr Leu

20 25 30

Ala Val Leu Gly Ala Leu Cys Val Tyr Gly Ala Gly His Leu Glu Gln

35 40 45

Pro Gln Ile Ser Ser Thr Lys Thr Leu Ser Lys Thr Ala Arg Leu Glu

50 55 60

Cys Val Val Ser Gly Ile Thr Ile Ser Ala Thr Ser Val Tyr Trp Tyr

65 70 75 80

Arg Glu Arg Pro Gly Glu Val Ile Gln Phe Leu Val Ser Ile Ser Tyr

85 90 95

Asp Gly Thr Val Arg Lys Glu Ser Gly Ile Pro Ser Gly Lys Phe Glu

100 105 110

Val Asp Arg Ile Pro Glu Thr Ser Thr Ser Thr Leu Thr Ile His Asn

115 120 125

Val Glu Lys Gln Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Glu Ala

130 135 140

Gln Gln Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Val Phe Gly Pro Gly Thr Lys

145 150 155 160

Leu Ile Ile Thr Asp Lys Gln Leu Asp Ala Asp Val Ser Pro Lys Pro

165 170 175

Thr Ile Phe Leu Pro Ser Ile Ala Glu Thr Lys Leu Gln Lys Ala Gly

180 185 190

Thr Tyr Leu Cys Leu Leu Glu Lys Phe Phe Pro Asp Val Ile Lys Ile

195 200 205

His Trp Glu Glu Lys Lys Ser Asn Thr Ile Leu Gly Ser Gln Glu Gly

210 215 220

Asn Thr Met Lys Thr Asn Asp Thr Tyr Met Lys Phe Ser Trp Leu Thr

225 230 235 240

Val Pro Glu Lys Ser Leu Asp Lys Glu His Arg Cys Ile Val Arg His

245 250 255

Glu Asn Asn Lys Asn Gly Val Asp Gln Glu Ile Ile Phe Pro Pro Ile

260 265 270

Lys Thr Asp Val Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp

275 280 285

Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln Met Gln Arg Ile Ser Ser Leu Ile

290 295 300

His Leu Ser Leu Phe Trp Ala Gly Val Met Ser Ala Ile Glu Leu Val

305 310 315 320

Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly Val Pro Ala Thr Leu

325 330 335

Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn Tyr Tyr Ile Asn Trp

340 345 350

Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Met Thr Phe Ile Tyr Arg Glu Lys

355 360 365

Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe Gln Gly Asp Ile Asp

370 375 380

Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu Ala Pro Ser Glu Arg

385 390 395 400

Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Thr Leu Gly Met Gly Gly

405 410 415

Glu Tyr Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr Val

420 425 430

Glu Pro Arg Ser Gln Pro His Thr Lys Pro Ser Val Phe Val Met Lys

435 440 445

Asn Gly Thr Asn Val Ala Cys Leu Val Lys Glu Phe Tyr Pro Lys Asp

450 455 460

Ile Arg Ile Asn Leu Val Ser Ser Lys Lys Ile Thr Glu Phe Asp Pro

465 470 475 480

Ala Ile Val Ile Ser Pro Ser Gly Lys Tyr Asn Ala Val Lys Leu Gly

485 490 495

Lys Tyr Glu Asp Ser Asn Ser Val Thr Cys Ser Val Gln His Asp Asn

500 505 510

Lys Thr Val His Ser Thr Asp Phe Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp

515 520 525

His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser

530 535 540

Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Glu Gly Arg Gly

545 550 555 560

Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu

565 570 575

Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe

580 585 590

Leu Leu Ile Pro Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala

595 600 605

Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro

610 615 620

Ser Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser

625 630 635 640

Ala Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro

645 650 655

Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu

660 665 670

Ala Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp

675 680 685

Lys Ser Ser Ser Thr Thr Tyr Ile His Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu

690 695 700

Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Gly Tyr Asp Gly Asp

705 710 715 720

Tyr Tyr Leu Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

725 730 735

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

740 745 750

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

755 760 765

Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

770 775 780

Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile

785 790 795 800

Gln Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

805 810 815

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro

820 825 830

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Tyr Leu Arg Thr

835 840 845

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ala Lys Pro Thr Thr Thr

850 855 860

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

865 870 875 880

Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

885 890 895

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

900 905 910

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

915 920 925

Tyr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

930 935 940

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

945 950 955 960

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Leu Val Pro Arg

965 970 975

Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu

980 985 990

Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr

995 1000 1005

Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr Lys Ser Pro Gly Gly

1010 1015 1020

<210> 4

<211> 786

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

atgaagcacc tgtggttctt tctgctgctg gtggccgccc ccagatgggt gctgtccgag 60

gtgaagctgc aggagtcagg acctagcctg gttaggcctg gggcttcagt gaagatatcc 120

tgcaaggctt ctgcttactc attcaccagc tactggatgc actgggtgaa gcagaggcct 180

ggacaaggtc ttgactggat tggcatgatt gatccttccg acagtgaagc taggttaaat 240

cagaagttca aggacaaggc cacattgact gtagacaaat cctccagtac aacctacatt 300

cacctcagca gcccgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag atcttatggt 360

tacgacgggg actactacct cgatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctcctca 420

ggcggcggca gcggcggcgg ctctggagga ggatctggcg gcggaagcga tattgtgatg 480

acccagtctc catcctcact gtctgcatct ctgggaggca aagtcaccat cacttgcaag 540

gcaagccaag acattaacaa atatatagct tggtaccaac acaagcctgg aaaaggtcct 600

aggctgctca tacagtacac atctacatta cagccaggca tcccatcaag gttcagtgga 660

agtgggtctg ggagagatta ttccttcagc atcagcaacc tggagcctga agatattgca 720

acttattatt gtctacagta tgattatctt cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa 780

atcaaa 786

<210> 5

<211> 1347

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccaatga agcacctgtg gttctttctg ctgctggtgg ccgcccccag atgggtgctg 120

tccgaggtga agctgcagga gtcaggacct agcctggtta ggcctggggc ttcagtgaag 180

atatcctgca aggcttctgc ttactcattc accagctact ggatgcactg ggtgaagcag 240

aggcctggac aaggtcttga ctggattggc atgattgatc cttccgacag tgaagctagg 300

ttaaatcaga agttcaagga caaggccaca ttgactgtag acaaatcctc cagtacaacc 360

tacattcacc tcagcagccc gacatctgag gactctgcgg tctattactg tgcaagatct 420

tatggttacg acggggacta ctacctcgat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc 480

tcctcaggcg gcggcagcgg cggcggctct ggaggaggat ctggcggcgg aagcgatatt 540

gtgatgaccc agtctccatc ctcactgtct gcatctctgg gaggcaaagt caccatcact 600

tgcaaggcaa gccaagacat taacaaatat atagcttggt accaacacaa gcctggaaaa 660

ggtcctaggc tgctcataca gtacacatct acattacagc caggcatccc atcaaggttc 720

agtggaagtg ggtctgggag agattattcc ttcagcatca gcaacctgga gcctgaagat 780

attgcaactt attattgtct acagtatgat tatcttcgga cgttcggtgg aggcaccaag 840

ctggaaatca aagcgaagcc caccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 900

accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 960

gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc 1020

gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttacaaacg gggcagaaag 1080

aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 1140

gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gcggctggtc 1200

cctcgggggc gaggggctgc ggaggcagcg acccggaaac agcgtatcac tgagaccgag 1260

tcgccttatc aggagctcca gggtcagagg tcggatgtct acagcgacct caacacacag 1320

aggccgtatt acaaatcccc cggggga 1347

<210> 6

<211> 3069

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccaatgc tgtcactgct ccacgcatca acgctggcag tccttggggc tctgtgtgta 120

tatggtgcag gtcacctaga gcaacctcaa atttccagta ctaaaacgct gtcaaaaaca 180

gcccgcctgg aatgtgtggt gtctggaata acaatttctg caacatctgt atattggtat 240

cgagagagac ctggtgaagt catacagttc ctggtgtcca tttcatatga cggcactgtc 300

agaaaggaat ccggcattcc gtcaggcaaa tttgaggtgg ataggatacc tgaaacgtct 360

acatccactc tcaccattca caatgtagag aaacaggaca tagctaccta ctactgtgcc 420

ttgtgggagg cccagcaaga gttgggcaaa aaaatcaagg tatttggtcc cggaacaaag 480

cttatcatta cagataaaca acttgatgca gatgtttccc ccaagcccac tatttttctt 540

ccttcaattg ctgaaacaaa gctccagaag gctggaacat acctttgtct tcttgagaaa 600

tttttccctg atgttattaa gatacattgg gaagaaaaga agagcaacac gattctggga 660

tcccaggagg ggaacaccat gaagactaat gacacataca tgaaatttag ctggttaacg 720

gtgccagaaa agtcactgga caaagaacac agatgtatcg tcagacatga gaataataaa 780

aacggagttg atcaagaaat tatctttcct ccaataaaga cagatgtcat cacaatggat 840

cccaaagaca attgttcaaa agatgcaaat gatacactac tgctgcagat gcagaggatc 900

tcctccctca tccatctctc tctcttctgg gcaggagtca tgtcagccat tgagttggtg 960

cctgaacacc aaacagtgcc tgtgtcaata ggggtccctg ccaccctcag gtgctccatg 1020

aaaggagaag cgatcggtaa ctactatatc aactggtaca ggaagaccca aggtaacaca 1080

atgactttca tataccgaga aaaggacatc tatggccctg gtttcaaaga caatttccaa 1140

ggtgacattg atattgcaaa gaacctggct gtacttaaga tacttgcacc atcagagaga 1200

gatgaagggt cttactactg tgcctgtgac accttgggga tgggggggga atacaccgat 1260

aaactcatct ttggaaaagg aacccgtgtg actgtggaac caagaagtca gcctcatacc 1320

aaaccatccg tttttgtcat gaaaaatgga acaaatgtcg cttgtctggt gaaggaattc 1380

taccccaagg atataagaat aaatctcgtg tcatccaaga agataacaga gtttgatcct 1440

gctattgtca tctctcccag tgggaagtac aatgctgtca agcttggtaa atatgaagat 1500

tcaaattcag tgacatgttc agttcaacac gacaataaaa ctgtgcactc cactgacttt 1560

gaagtgaaga cagattctac agatcacgta aaaccaaagg aaactgaaaa cacaaagcaa 1620

ccttcaaaga gctgccataa acccaaagcc atagttcata ccgagaagga gggcagagga 1680

agtctgctaa catgcggtga cgtcgaggag aatcctggac ctatgcttct cctggtgaca 1740

agccttctgc tctgtgagtt accacaccca gcattcctcc tgatcccaat gaagcacctg 1800

tggttctttc tgctgctggt ggccgccccc agatgggtgc tgtccgaggt gaagctgcag 1860

gagtcaggac ctagcctggt taggcctggg gcttcagtga agatatcctg caaggcttct 1920

gcttactcat tcaccagcta ctggatgcac tgggtgaagc agaggcctgg acaaggtctt 1980

gactggattg gcatgattga tccttccgac agtgaagcta ggttaaatca gaagttcaag 2040

gacaaggcca cattgactgt agacaaatcc tccagtacaa cctacattca cctcagcagc 2100

ccgacatctg aggactctgc ggtctattac tgtgcaagat cttatggtta cgacggggac 2160

tactacctcg atgtctgggg cgcagggacc acggtcaccg tctcctcagg cggcggcagc 2220

ggcggcggct ctggaggagg atctggcggc ggaagcgata ttgtgatgac ccagtctcca 2280

tcctcactgt ctgcatctct gggaggcaaa gtcaccatca cttgcaaggc aagccaagac 2340

attaacaaat atatagcttg gtaccaacac aagcctggaa aaggtcctag gctgctcata 2400

cagtacacat ctacattaca gccaggcatc ccatcaaggt tcagtggaag tgggtctggg 2460

agagattatt ccttcagcat cagcaacctg gagcctgaag atattgcaac ttattattgt 2520

ctacagtatg attatcttcg gacgttcggt ggaggcacca agctggaaat caaagcgaag 2580

cccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 2640

ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 2700

ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt 2760

ctcctgtcac tggttatcac cctttacaaa cggggcagaa agaaactcct gtatatattc 2820

aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga 2880

tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgcggctgg tccctcgggg gcgaggggct 2940

gcggaggcag cgacccggaa acagcgtatc actgagaccg agtcgcctta tcaggagctc 3000

cagggtcaga ggtcggatgt ctacagcgac ctcaacacac agaggccgta ttacaaatcc 3060

cccggggga 3069

Claims

1. 一种嵌合抗原受体，包括依次连接的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其特征在于，所述胞外结构域含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

2. 如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列编码得到。

3. 如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成；或者，

所述嵌合抗原受体由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成。

4. 如权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的嵌合抗原受体由SEQ ID No.5所示的核苷酸序列编码得到；或者，

SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的嵌合抗原受体由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列编码得到。

5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子表达权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求5所述的核酸分子。

7.如权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒载体。

8.一种CAR修饰的NK细胞，其特征在于，所述NK细胞表达如权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体，或者所述NK细胞中导入了如权利要求5所述的核酸分子，或者所述NK细胞中转染了如权利要求6-7任一项所述的表达载体。

9.如权利要求8所述CAR修饰的NK细胞，其特征在于，所述NK细胞通过利用权利要求5所述的核酸分子修饰诱导性多能干细胞得到。

10.如权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体、如权利要求5所述的核酸分子、如权利要求6-7任一项所述的表达载体、或如权利要求8-9任一项所述的NK细胞在制备PD-L1靶向的抗肿瘤药物中的应用。