CN113832102A - Cd3/cd28/dll4磁珠及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种CD3/CD28/DLL4磁珠，所述磁珠表面耦连有抗人CD3抗体、抗人CD28抗体以及重组人DLL4蛋白。还公开了其制备方法和应用。本发明的CD3/CD28/DLL4磁珠在扩增T淋巴细胞时，T淋巴细胞表面TCR能与磁珠表面交联的抗‑CD3抗体结合，提供T淋巴细胞激活的第一信号；T淋巴细胞表面的CD28能与磁珠表面交联的抗‑CD28抗体结合，提供T淋巴细胞激活的第二信号；DLL4能有效的促进CD4+ T细胞分化为Th1效应细胞，促进CD8+ T细胞分化成为细胞毒CD8+ T效应细胞。CD3/CD28/DLL4磁珠培养产生的T细胞混合物中CD8+ T细胞占比超过传统CD3/CD28磁珠扩增得到的T细胞混合物，且产生的CD8+ T细胞遇到抗原刺激的时候能分泌更高水平的杀伤因子。

Description

CD3/CD28/DLL4磁珠及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种CD3/CD28/DLL4磁珠及其制备方法和应用，属于生物技术领域。
背景技术
传统化疗药治疗肿瘤存在易耐药、毒副作用严重的难题。免疫治疗作为新兴的前沿科学技术，已经在全球范围内成功治愈了多例难治易复发、无药可救的肿瘤患者，从而成为肿瘤治疗领域的新星。T细胞免疫治疗（嵌合抗原受体CAR-T、T细胞受体TCR-T等）是免疫治疗中的一个重要体系，与传统化疗药相比，其优势表现在特异性强、副作用低、治疗效果持久等方面。2017年，美国食品药监局在全球范围内批准了首个CAR-T用于临床治疗；2021年，中国食品药监局也批准了国内首个CAR-T用于临床治疗。
T细胞是机体内适应性免疫系统中重要的一类免疫细胞，在清除病原体入侵和杀伤肿瘤细胞过程中发挥关键作用。T细胞按照标志和功能不同，主要分为CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒T细胞。CD4+辅助T细胞主要的功能是辅助其他免疫细胞的活化和功能，包括辅助CD8+细胞毒T细胞的活化和杀伤功能，同时自身亦可发挥部分杀伤功能。CD8+细胞毒T细胞是体内发挥杀伤肿瘤细胞功能的主要效应细胞。研究发现，肿瘤患者体内的T细胞均存在不同程度的损伤，表现为不能有效活化、扩增和发挥杀伤功能，因此需要将患者体内的T细胞进行改造使其重新获得杀伤功能，如CAR-T。
T细胞在没有遇到活化信号的时候处于静息状态，不进行扩增和分裂。T细胞活化需要至少2个信号同时存在，第一信号是T细胞受体TCR信号，第二信号是CD28共刺激信号。两个信号同时存在的情况下，静息T细胞即可被活化进入增殖分裂的状态。活化的T细胞在合适的培养基条件下可在10天内扩增数百倍，从而满足临床治疗对细胞量的需求。CD3/CD28磁珠是指包被了CD3抗体和CD28抗体的功能磁珠，是目前用于体外扩增T细胞最常用的活化剂，该磁珠可同时给T细胞提供第一信号和第二信号，有效活化并扩增T细胞。CAR-T的制备流程为：①从患者体内获得外周血，在体外分离获得外周血单个核细胞或者总T细胞；②使用CD3/CD28磁珠活化T细胞；③在培养体系中加入嵌合抗原受体CAR的病毒颗粒，感染T细胞，使其表达CAR结构，获得特异性杀伤肿瘤细胞的功能；④体外扩增培养T细胞，得到足够数量；⑤制备T细胞成药悬液，质检，冻存。
按照分化的不同阶段，T细胞可分为不同的亚群，按照分化程度的加增，分别是幼稚型T细胞、干细胞样记忆T细胞、中央记忆型T细胞、效应记忆型T细胞和效应T细胞。T细胞发挥杀伤功能需先分化为效应T细胞，方可产生效应因子如干扰素γ等杀伤肿瘤细胞。诱导T细胞分化为不同亚群的信号称为第三信号。在IL-12的第三信号作用下，CD8+ T细胞可分化成为细胞毒CD8+ T效应细胞，CD4+ T细胞可分化为Th1效应细胞，这两种细胞均具备肿瘤杀伤作用。在其他因子如TGF-β和IL-6第三信号的作用下，CD8+ T细胞可分化成为调节性CD8+ T效应细胞，CD4+ T细胞可分化为调节性Treg效应细胞，这两种细胞均具备抑制免疫杀伤的作用。因此，在不同的第三信号作用下，T细胞可产生不同的功能亚群。
发明内容
本发明的目的是提供一种CD3/CD28/DLL4磁珠，可用于人T淋巴细胞的活化和扩增。
本发明采用的技术方案为：
一种CD3/CD28/DLL4磁珠，所述磁珠表面耦连有抗人CD3抗体、抗人CD28抗体以及重组人DLL4蛋白。
优选的，所述磁珠为超顺磁性磁珠，磁珠表面为二氧化硅涂层，涂层表面用羧基修饰，磁核为氧化铁，磁珠采用常规的用于制备CD3/CD28抗体偶联磁珠的磁珠即可。
优选的，所述抗人CD3抗体克隆号为OKT3，抗人CD28抗体克隆号为CD28.2。
优选的，所述重组人DLL4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
优选的，偶联到磁珠上的抗人CD3抗体：抗人CD28抗体：重组人DLL4蛋白重量比为10~50:10~50:1~15。
本发明还公开了上述的CD3/CD28/DLL4磁珠的制备方法，其步骤包括：1）洗涤磁珠，将磁珠和活化剂EDC混合进行活化反应；
2）将CD3抗体、CD28抗体和重组DLL4蛋白 分别加入磁珠悬液并共孵育一定时间，得到CD3/CD28/DLL4磁珠；
3）CD3/CD28/DLL4磁珠 洗涤后，放置于储存液中保存。
在该制备方法中，EDC首先通过酰胺化反应激活磁珠上的羧基官能团，活化的官能团与抗体和蛋白（Antibody）的氨基结合，形成偶联CD3/CD28/DLL4的磁珠。
优选的，步骤1）中洗涤采用洗涤液A，洗涤液A为MEST缓冲液 ；步骤3）中洗涤采用洗涤液B，洗涤液B为TBST缓冲液 。
优选的，储存液为细胞培养用磷酸盐缓冲液PBS。
本发明还公开了上述的CD3/CD28/DLL4磁珠在作为人T淋巴细胞的活化扩增剂中的应用。
本发明还公开了一种人T淋巴细胞的活化扩增剂，含有上述的CD3/CD28/DLL4磁珠。
CD3/CD28/DLL4磁珠扩增人T淋巴细胞的具体步骤为：
1）细胞提取：获得健康供体外周血单个核细胞PBMC，洗涤液洗涤并重悬，或进一步用相应的分选磁珠孵育样本细胞悬液，得到纯化的T淋巴细胞；
2）活化：洗涤液洗涤步骤1）中得到的PBMC或T淋巴细胞，用适量的CD3/CD28/DLL4磁珠共同培养；
3）扩增：将与CD3/CD28/DLL4磁珠共孵育的T淋巴细胞置于37℃，含5%的CO2细胞培养箱中培养，按需要扩增7-14天，及时扩增和补液。培养基组分为RPMI1640 + 10% FBS +10 ng/ml rhIL-2 + 50 μM 2-ME；
4）检测：使用流式检测培养物中CD4/CD8各自的占比；通过PMA和Ionomycin活化TCR信号，golgi-stop阻断胞内因子的分泌，流式检测T细胞效应因子的产生如IFN-γ、IL-17；
5）细胞收获：根据所需在特定时间点，收集细胞，即为扩增产生的人效应CD8+ T淋巴细胞。
本发明的CD3/CD28/DLL4磁珠在扩增T淋巴细胞时， T淋巴细胞表面TCR能与磁珠表面交联的抗-CD3抗体结合，提供T淋巴细胞激活的第一信号；T淋巴细胞表面的CD28能与磁珠表面交联的抗-CD28抗体结合，提供T淋巴细胞激活的第二信号；DLL4能有效的促进CD4+ T细胞分化为Th1效应细胞，促进CD8+ T细胞分化成为细胞毒CD8+ T效应细胞。CD3/CD28/DLL4磁珠培养产生的T细胞混合物中CD8+ T细胞占比超过传统CD3/CD28磁珠扩增得到的T细胞混合物，且产生的CD8+ T细胞遇到抗原刺激的时候能分泌更高水平的杀伤因子如IFN-γ。
本发明的有益效果如下：
1）本发明的方法制得的CD3/CD28/DLL4功能磁珠使用方便，只需添加磁珠与细胞共孵育，该磁珠即可发出协同刺激信号，无需抗原呈递细胞（APC）的参与；
2）9-14天培养后T淋巴细胞可扩增100-1000倍，活化扩增效果明显；
3）扩增得到的T细胞中与传统CD3/CD28磁珠相比，CD8+ T细胞占比更高，且分泌IFN-γ的效应CD8+ T淋巴细胞更多，对于临床免疫治疗具有重要意义；
4）由于磁珠自带磁性，可轻松实现磁性分离；
5）可实现大规模生产，产品质量可控。
附图说明
图1为本发明的流程示意图。
图2为未采用磁珠活化及CD3/CD28/DLL4磁珠活化后的T淋巴细胞培养照片。
图3为未采用磁珠活化及CD3/CD28/DLL4磁珠活化过夜的T淋巴细胞流式分析。
图4为未采用磁珠活化及CD3/CD28/DLL4磁珠活化10天后T淋巴细胞增殖结果。
图5为使用CD3/CD28/DLL4磁珠及对照CD3/CD28磁珠活化后，流式检测CD3+ T细胞中CD4+/CD8+ T细胞的占比。
图6为使用CD3/CD28/DLL4磁珠及对照CD3/CD28磁珠活化后，流式检测IFN-γ阳性细胞在CD8+ T细胞中的占比。
图7为不同剂量抗体和蛋白制备的CD3/CD28/DLL4磁珠活化T细胞后第二天克隆形成。
图8为不同剂量抗体和蛋白制备的CD3/CD28/DLL4磁珠活化T细胞后第二天活化标志物的表达。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
本发明的整体流程图如图1所示。
实施例中应用的抗人CD3单抗选用Purified anti-human CD3 Antibody （克隆号OKT3），抗人CD28单抗选用Purified anti-human CD28 Antibody (克隆号CD28.2)。
实施例中应用的活化剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）；比重是1.077±0.001的聚蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺（Urografin）（F/H）分层液。
本发明利用健康供体PBMC通过以下实施例对本磁珠对T淋巴细胞的激活效率进行具体描述；以下实施例仅为说明性验证，并非限制性条件。
图5-图6中的CD3/CD28磁珠的试验结果系采用与CD3/CD28/DLL4磁珠完全一致的试验条件得到得，区别仅在于将CD3/CD28/DLL4磁珠替换为CD3/CD28磁珠。
实施例1：一种用于扩增产生人效应CD8+ T淋巴细胞的CD3/CD28/DLL4磁珠的制备方法及其应用；
1）CD3/CD28/DLL4功能磁珠的制备：取1*10^6~5*10^6磁珠，用MEST缓冲液洗涤磁珠2次（每次1mL），加入预先配置好的EDC溶液，旋涡混匀，25℃孵育20-60分钟，将活化后的磁珠与以下蛋白溶液混合并孵育：25μg抗人-CD3抗体溶液 + 25μg抗人-CD28抗体 + 10μgDLL4重组蛋白溶液中25℃继续孵育2-4小时，孵育期间避免磁珠沉降，接着用含有BSA的MEST溶液封闭磁珠0.5-2小时，封闭温度25℃，最后用TBST洗涤磁珠3次（每次1mL），再用储存液洗涤磁珠3次后悬浮于适量储存液中备用，储存液采用细胞培养用磷酸盐缓冲液PBS，品牌：Solarbio 货号:P1010。
2）T淋巴细胞的分离与纯化：采购获得健康供体PBMC，向PBMC细胞悬浮液中加入适量抗人CD4单抗耦连磁珠和抗人CD8单抗耦连磁珠，置于4℃孵育30分钟，用含有2.5% FBS的PBS溶液（F-PBS）洗涤磁珠2次，然后用1mL F-PBS重悬细胞沉淀，在配套磁力架上聚集磁珠，反复洗涤除去未被磁珠结合的阴选细胞，取下磁力架后洗出阳选T淋巴细胞，经F-PBS洗涤即分离得到纯化的全血T淋巴细胞。
3）全血T淋巴细胞的激活培养：向2）中分离纯化好的全血T淋巴细胞中，按细胞与磁珠比例1:1加入的CD3/CD28/DLL4功能磁珠，接着将细胞磁珠混合物重悬于适量RPMI1640完全培养基（10% FBS，5 ng/mL IL-2，50 μM 2-ME）重悬细胞后加入到合适的培养板或培养瓶中。
实施例2：CD3/CD28/DLL4功能磁珠活化效率测试；
1）取纯化后的T淋巴细胞0.2M，加入T细胞专用培养基调整至细胞悬液总体积200μL；
2）加入实施例1所制备的CD3/CD28/DLL4磁珠，磁珠使用前需用1mL F-PBS清洗一次；
3）将细胞与磁珠的混合液铺于96孔板，置于37℃的CO2培养箱中培养过夜；
4）次日，在显微镜下观察细胞状态以及克隆形成情况，拍照结果如附图2所示。图2显示，经CD3/CD28/DLL4磁珠激活，磁珠结合在细胞周边形成细胞-磁珠结合体，且T淋巴细胞出现明显的增殖克隆群，而未添加磁珠的孔中细胞形貌不变，同时无增殖克隆群，表明其未被活化；
5）用流式细胞仪检测CD3/CD28/DLL4磁珠孵育后活化T淋巴细胞的比例（CD25/CD69），流式检测结果如附图3所示。图3显示，利用流式细胞仪检测过夜活化后的T淋巴细胞，通过染色活化指标CD25/CD69鉴定结果显示，T细胞已被显著活化。
实施例3：CD3/CD28/DLL4磁珠激活T淋巴细胞后细胞扩增情况验证；
1）实施例2中收集到的经CD3/CD28/DLL4磁珠激活过夜后的T淋巴细胞继续置于37℃的CO2培养箱中培养；
2）培养第三天取出细胞，计数，取0.1M细胞重悬于1.5mL T细胞专用培养基，铺于全新24孔板继续置于37℃的CO2培养箱中培养；
3）培养第七天取出细胞，计数，取0.1M细胞重悬于1.5mL T细胞专用培养基，铺于全新24孔板继续置于37℃的CO2培养箱中培养；
4）培养第十天取出细胞，计数，计算细胞扩增倍数，扩增结果如附图4所示；图4显示， CD3/CD28/DLL4磁珠活化培养人CD3+ T细胞，磁珠与细胞比例1:1，10天内扩增倍数，达100倍以上。
实施例4：CD3/CD28/DLL4磁珠扩增CD8+ T淋巴细胞比例的验证；
1）实施例3中扩增培养的T细胞，在第7天的时候收集细胞进行表面染色；
2）各取0.1M细胞于1.5 mL离心管中，离心去除培养基；
3）使用0.5 mL F-PBS重悬细胞沉淀，洗涤细胞，离心去除洗涤液；
4）配制抗体工作液：在每50 μL F-PBS中加入0.5 μg CD4-Pacific blue和0.5 μgCD8-FITC抗体；
5）使用抗体工作液重悬细胞沉淀，在4℃孵育30min；
6）加入0.5 mL F-PBS洗涤细胞，离心去除未结合抗体；
7）使用0.4 mL F-PBS重悬细胞沉淀，上机检测流式信号，以确定其中CD8+ T细胞的占比；
8）流式结果如附图5所示。图5显示：使用CD3/CD28/DLL4功能磁珠或对照CD3/CD28磁珠活化培养人CD3+ T细胞，培养7天后检测CD3/CD28/DLL4功能磁珠扩增产物中CD8+ T细胞的占比显著升高。
实施例5：CD3/CD28/DLL4磁珠扩增CD8+ T淋巴细胞功能的验证；
1）实施例3中扩增培养的T细胞，在第7天的时候收集细胞；
2）取0.5M细胞铺于24孔板，加入PMA+Ionomycin活化TCR信号，1小时后加入高尔基阻断剂，以达到将细胞因子滞留在细胞内从而利于检测的效果；
3）4-6小时后，收集细胞，按照胞内染色试剂盒（BD Biosciences，货号554714）说明书进行细胞固定和胞内染色；
4）所使用表面和胞内的抗体分别为：CD4-Pacific blue、CD8-FITC、IFN-γ-PE/CY7；
5）使用0.2 mL染色液重悬细胞，上机检测流式信号，
6）结果如附图6所示。从图6可以看出，使用CD3/CD28/DLL4功能磁珠或对照CD3/CD28磁珠活化培养人CD3+ T细胞，培养7天后活化TCR信号，能检测出CD3/CD28/DLL4功能磁珠扩增产物中IFN-γ阳性细胞在CD8+ T细胞中的占比显著升高。
实施例6：不同抗体剂量下CD3/CD28/DLL4磁珠的制备和活化测试；
1）CD3/CD28/DLL4功能磁珠的制备：制备流程同实施例1一致，抗体剂量调整为：10μg抗人-CD3抗体溶液 + 10μg抗人-CD28抗体 + 1μg DLL4重组蛋白，以及50μg抗人-CD3抗体溶液 + 50μg抗人-CD28抗体 + 15μg DLL4重组蛋白。
2）T淋巴细胞的分离与纯化：采购获得健康供体PBMC，向PBMC细胞悬浮液中加入适量抗人CD4单抗耦连磁珠和抗人CD8单抗耦连磁珠，置于4℃孵育30分钟，用含有2.5% FBS的PBS溶液（F-PBS）洗涤磁珠2次，然后用1mL F-PBS重悬细胞沉淀，在配套磁力架上聚集磁珠，反复洗涤除去未被磁珠结合的阴选细胞，取下磁力架后洗出阳选T淋巴细胞，经F-PBS洗涤即分离得到纯化的全血T淋巴细胞。
3）全血T淋巴细胞的激活培养：向2）中分离纯化好的全血T淋巴细胞中，按细胞与磁珠比例1:1加入各个CD3/CD28/DLL4功能磁珠，接着将细胞磁珠混合物重悬于适量RPMI1640完全培养基（10% FBS，5 ng/mL IL-2，50 μM 2-ME）重悬细胞后加入到合适的培养板或培养瓶中。
4）次日，在显微镜下观察细胞状态以及克隆形成情况，拍照结果如附图7所示。
5）用流式细胞仪检测CD3/CD28/DLL4磁珠孵育后活化T淋巴细胞的比例（CD25/CD69），流式检测结果如附图8所示。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 苏州东岭生物技术有限公司
苏州大学附属儿童医院
<120> CD3/CD28/DLL4磁珠及其制备方法和应用
<141> 2021-09-02
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 685
<212> PRT
<213> human
<400> 1
Met Ala Ala Ala Ser Arg Ser Ala Ser Gly Trp Ala Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Val Ala Leu Trp Gln Gln Arg Ala Ala Gly Ser Gly Val Phe Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Gln Glu Phe Ile Asn Glu Arg Gly Val Leu Ala Ser Gly Arg
35 40 45
Pro Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys His
50 55 60
Phe Gln Ala Val Val Ser Pro Gly Pro Cys Thr Phe Gly Thr Val Ser
65 70 75 80
Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Ala Val Arg Asp Asp Ser Ser
85 90 95
Gly Gly Gly Arg Asn Pro Leu Gln Leu Pro Phe Asn Phe Thr Trp Pro
100 105 110
Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Trp His Ala Pro Gly Asp Asp
115 120 125
Leu Arg Pro Glu Ala Leu Pro Pro Asp Ala Leu Ile Ser Lys Ile Ala
130 135 140
Ile Gln Gly Ser Leu Ala Val Gly Gln Asn Trp Leu Leu Asp Glu Gln
145 150 155 160
Thr Ser Thr Leu Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Tyr Arg Val Ile Cys Ser
165 170 175
Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn Cys Ser Arg Leu Cys Lys Lys Arg Asn
180 185 190
Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gln Pro Asp Gly Asn Leu Ser Cys
195 200 205
Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr Cys Gln Gln Pro Ile Cys Leu Ser
210 215 220
Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser Lys Pro Ala Glu Cys Leu
225 230 235 240
Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg Leu Cys Asn Glu Cys Ile Pro His
245 250 255
Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Ser Thr Pro Trp Gln Cys Thr Cys
260 265 270
Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp Gln Asp Leu Asn Tyr Cys
275 280 285
Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys Ser Asn Ser Gly
290 295 300
Gln Arg Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Val Asp
305 310 315 320
Cys Glu Leu Glu Leu Ser Glu Cys Asp Ser Asn Pro Cys Arg Asn Gly
325 330 335
Gly Ser Cys Lys Asp Gln Glu Asp Gly Tyr His Cys Leu Cys Pro Pro
340 345 350
Gly Tyr Tyr Gly Leu His Cys Glu His Ser Thr Leu Ser Cys Ala Asp
355 360 365
Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg Glu Arg Asn Gln Gly Ala
370 375 380
Asn Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe Thr Gly Ser Asn Cys Glu
385 390 395 400
Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Gln
405 410 415
Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser Arg Met Cys Arg Cys Arg Pro Gly Phe
420 425 430
Thr Gly Thr Tyr Cys Glu Leu His Val Ser Asp Cys Ala Arg Asn Pro
435 440 445
Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp Leu Glu Asn Gly Leu Met Cys
450 455 460
Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg Cys Glu Val Arg Thr Ser
465 470 475 480
Ile Asp Ala Cys Ala Ser Ser Pro Cys Phe Asn Arg Ala Thr Cys Tyr
485 490 495
Thr Asp Leu Ser Thr Asp Thr Phe Val Cys Asn Cys Pro Tyr Gly Phe
500 505 510
Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly Leu Pro Pro Ser Phe Pro
515 520 525
Trp Val Ala Val Ser Leu Gly Val Gly Leu Ala Val Leu Leu Val Leu
530 535 540
Leu Gly Met Val Ala Val Ala Val Arg Gln Leu Arg Leu Arg Arg Pro
545 550 555 560
Asp Asp Gly Ser Arg Glu Ala Met Asn Asn Leu Ser Asp Phe Gln Lys
565 570 575
Asp Asn Leu Ile Pro Ala Ala Gln Leu Lys Asn Thr Asn Gln Lys Lys
580 585 590
Glu Leu Glu Val Asp Cys Gly Leu Asp Lys Ser Asn Cys Gly Lys Gln
595 600 605
Gln Asn His Thr Leu Asp Tyr Asn Leu Ala Pro Gly Pro Leu Gly Arg
610 615 620
Gly Thr Met Pro Gly Lys Phe Pro His Ser Asp Lys Ser Leu Gly Glu
625 630 635 640
Lys Ala Pro Leu Arg Leu His Ser Glu Lys Pro Glu Cys Arg Ile Ser
645 650 655
Ala Ile Cys Ser Pro Arg Asp Ser Met Tyr Gln Ser Val Cys Leu Ile
660 665 670
Ser Glu Glu Arg Asn Glu Cys Val Ile Ala Thr Glu Val
675 680 685

Claims (10)

1.一种CD3/CD28/DLL4磁珠，其特征在于所述磁珠表面耦连有抗人CD3抗体、抗人CD28抗体以及重组人DLL4蛋白。
2.根据权利要求1所述的CD3/CD28/DLL4磁珠，其特征在于：所述磁珠为超顺磁性磁珠，磁珠表面为聚苯乙烯涂层，涂层表面用羧基修饰，磁核为氧化铁。
3.根据权利要求1所述的CD3/CD28/DLL4磁珠，其特征在于：所述抗人CD3抗体克隆号为OKT3，抗人CD28抗体克隆号为CD28.2。
4.根据权利要求1所述的CD3/CD28/DLL4磁珠，其特征在于：所述重组人DLL4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的CD3/CD28/DLL4磁珠，其特征在于：偶联到磁珠上的抗人CD3抗体：抗人CD28抗体：重组人DLL4蛋白重量比为10~50:10~50:1~15。
6.权利要求1-5中任一项所述的CD3/CD28/DLL4磁珠的制备方法，其特征在于其步骤包括：1）洗涤磁珠，将磁珠和活化剂EDC混合进行活化反应；
2）将CD3抗体、CD28抗体和重组DLL4蛋白分别加入磁珠悬液并共孵育一定时间，得到CD3/CD28/DLL4磁珠；
3）CD3/CD28/DLL4磁珠洗涤后，放置于储存液中保存。
7.根据权利要求6所述的CD3/CD28/DLL4磁珠的制备方法，其特征在于：步骤1）中洗涤采用洗涤液A，洗涤液A为MEST缓冲液；步骤3）中洗涤采用洗涤液B，洗涤液B为TBST缓冲液。
8.根据权利要求7所述的CD3/CD28/DLL4磁珠的制备方法，其特征在于：储存液为细胞培养用磷酸盐缓冲液PBS。
9.权利要求1-5中任一项所述的CD3/CD28/DLL4磁珠在作为人T淋巴细胞的活化扩增剂中的应用。
10.一种人T淋巴细胞的活化扩增剂，其特征在于：含有权利要求1-5中任一项所述的CD3/CD28/DLL4磁珠。
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